CN116323965A - 使用染料的用于生物分析的组合物、系统和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包括通过接头将供体染料共价连接至受体染料的能量转移染料对，这些能量转移染料对例如在与猝灭剂和分析物(例如，寡核苷酸)共价连接的能量转移染料对的缀合物中用于生物应用的用途，这些生物应用包括例如扩增测定，诸如定量聚合酶链反应(qPCR)和数字聚合酶链反应(dPCR)。系统和方法包括(1)具有相同的激发波长范围但不同的发射波长范围的两种染料和/或(2)具有相同的发射波长范围但不同的激发波长范围的两种染料中的那些系统和方法。

Description

使用染料的用于生物分析的组合物、系统和方法
相关申请的交叉引用
本申请根据35U.S.C.§119(e)要求于2020年7月23日提交的美国临时申请号62/705,935的权益，该美国临时申请的公开内容以引用方式并入本文，如同完全阐述一样。
技术领域
本公开整体涉及能量转移染料缀合物对，这些能量转移染料缀合物对包含与受体染料共价连接的供体染料。本公开还涉及能量转移染料缀合物对的用途，例如作为与具有或不具有猝灭剂部分的分析物共价连接的能量转移染料缀合物报道基因部分以用于生物应用，这些生物应用包括例如定量聚合酶链反应(qPCR)和数字PCR(dPCR)。本公开还涉及用于通过qPCR来观察、测试和/或分析一个或多个生物样品的系统、装置和方法，并且更具体地涉及包括用于通过qPCR使用本文所公开的能量转移染料缀合物对来观察、测试和/或分析一个或多个生物样品的光学系统的系统、装置和方法。
背景技术
目前对细胞和组织功能性的分析通常需要从通常有限的材料中提取尽可能多的信息。例如，样品诸如肿瘤活组织检查难以收集并且通常仅产生少量的可用核酸。对单个目标分析物的PCR检测和测量(称为单重测定)一直是用于在核酸水平上分析临床研究样品的黄金标准，并且在超过四分之一个世纪的时间里，该标准在扩展生物学知识的范围方面具有不可估量的价值。
然而，从临床研究样品获得的有限量的核酸通常迫使人们做出关于如何最好地利用这些珍贵样品的选择。此外，如果样品受到限制，则可分析的基因座的数量也受到限制，从而减少了可从单个样品提取的信息量。最后，建立多个单一测定反应所需的额外时间和材料可能显著增加复杂项目的费用。
用于定量PCR(qPCR)的实时系统经常用于对细胞和组织样品进行测定。核酸检测/扩增方法，诸如在实时聚合酶链反应中，经常使用双标记探针来检测和/或定量靶核酸(如特定基因序列或表达的信使RNA序列)。用于此类方法的荧光探针通常用报道基因部分和猝灭剂部分两者进行标记。在这种情况下，当这两个部分经由寡核苷酸探针与核酸模板的杂交以及/或者经由从寡核苷酸探针去除猝灭剂部分或报道基因部分组分中的一者的核酸酶活性而被物理分离时，来自报道基因的荧光未被猝灭。
双标记寡核苷酸探针内的荧光共振能量转移(FRET)广泛用于遗传分析的测定中。FRET已被用于研究DNA杂交和扩增、蛋白质折叠动力学、蛋白水解降解以及其他生物分子之间的相互作用。FRET可发生在报道基因与猝灭剂基团之间，并且可涉及不同模式的能量转移(ET)。例如，能量转移可涉及荧光猝灭机制，由此当供体与受体之间存在相互作用时，激发电子可经由非辐射路径从供体分子转移至受体分子。当激发从供体分子转移至受体分子而不发射光子时，FRET还可发生在两种染料分子之间。
核酸的多重PCR分析是一种从单个样品等分试样中扩增和定量多于一种靶标的策略，是与运行多个单重测定相关的问题的有吸引力的解决方案。在多重PCR中，在单个PCR反应中用含有荧光染料的多个探针查询样品等分试样。这增加了可从该样品提取的信息的量。使用多重PCR，可实现样品和材料的显著节约。为了提高该方法的实用性，已经开发了使用数对基因特异性引物和探针来同时扩增和测量多个靶序列的多重PCR。多重PCR提供了以下优点：1)效率：多重PCR通过将数种PCR测定组合到单一反应中有助于节省样品材料并避免孔与孔之间的变化。多重化使得更有效地使用有限的样品，诸如那些含有稀有靶标的样品，这些样品无法在不影响灵敏度的情况下被分成多个等分试样；2)经济性：即使这些靶标被一致地扩增，每个靶标也可通过使用具有独特报道基因染料的基因特异性探针进行独立检测，以基于它们的荧光信号来区分这些扩增。一旦经优化，则多重测定比独立扩增的相同测定更节省成本。
然而，目前对可在单次多重PCR测定中分析的靶标的数量存在限制。多重PCR的实验设计比单一反应更复杂。用于检测各个靶标的探针必须含有具有不同光谱的独特报道基因部分。实时检测系统的激发和发射滤光器的设置随制造商的变化而变化；因此，作为实验优化过程的一部分，仪器必须针对每个染料部分进行校准。因此，在多重PCR测定的发展中的一个限制是荧光团的数量，以及从而可在单一反应中有效地测量的探针的数量。多重PCR中的另一个限制来自不同荧光报道基因之间的信号干扰(“串扰”)，这可能会影响定量或者导致假阳性或不准确的定量。因此，使用传统系统，重要的是选择具有最小光谱重叠的荧光团。因此，当设计多重反应时，不同的靶标应用避免重叠激发谱和/或发射谱的荧光团进行标记，以避免可能的串扰问题。附加地，荧光团的发射和激发光谱必须与待使用的PCR仪器兼容，并且特别是与每个滤光器组的带通规格兼容。
信号串扰还可通过使用猝灭良好的探针来最小化。当设计荧光探针时，考虑到检测化学方法的类型，必须确保报道基因部分和猝灭剂部分是相容的。先前，用于TaqMan探针的最常见的染料/猝灭剂组合是具有TAMRA猝灭剂的FAM荧光团。然而，最近“暗猝灭剂”诸如Dabcyl和Black Hole Quencher(BHQ)已经在很大程度上取代了荧光猝灭剂诸如TAMRA。暗猝灭剂将它们从荧光团吸收的能量发射为热而不是不同波长的光。“暗猝灭剂”倾向于给出具有较低背景的结果，并且在多重反应中是特别有用的，其中重要的是避免从猝灭剂发射的光与报道基因染料中的一种报道基因染料产生串扰信号。因此，高效的“暗猝灭剂”显著减少了来自荧光团和猝灭剂部分的背景荧光，从而导致增加的灵敏度和终端信号。这对于多重反应是特别有用的，因为在同一管中具有数个荧光团会导致更高的背景荧光。
通常，多重PCR反应由于例如当大量不同探针存在于单一反应混合物中时引入的化学方法复杂性而受到限制。例如，在双重反应中，最常用的组合是FAM和HEX
Figure SMS_1
在三重反应中，通常使用染料诸如FAM、HEX
Figure SMS_2
NED或Cy5；并且在四重反应中，通常使用染料诸如FAM、HEX
Figure SMS_3
Texas
Figure SMS_4
和Cy5染料。直到最近，最常见的多重PCR仪器仅能利用四个独特的染料-猝灭剂对。然而，某些商业仪器具有执行更高水平的多重化的光学能力，例如6重PCR、8重PCR、10重PCR、20重PCR等。
尽管存在化学复杂性，但更高重的qPCR测定还受到仪器能力或利用现有仪器的方式的限制。目前可用的qPCR仪器将宽的激发和发射光谱分成不同光谱(EX/EM“通道”)，这些不同光谱与对应的染料或探针组的激发/发射光谱相容。例如，匹配的EX/EM通道组通常用于适应四重反应，如上所述。然而，至少部分地由于合适探针的不可利用性，更完整范围的EX/EM通道组合尚未用于提供对能够定量共同样品中多于4个靶标的测定。
因此，需要提供包括独特的荧光团/猝灭剂组合的附加探针，这允许通过已经可在一些商业仪器上获得的附加光谱通道来增加多重反应和检测。此外，需要具有独特光学特性的新荧光团以及荧光团/猝灭剂组合，一旦具有附加通道的仪器以及其他相关硬件和软件改善变得可用，就可促进甚至更高阶的多重化。
发明内容
在一个方面，本公开提供了一种能量转移荧光染料缀合物，该能量转移荧光染料缀合物包含：i.供体染料，该供体染料能够吸收第一波长处的光并且发射激发能量作为响应；ii.受体染料，该受体染料能够吸收由供体染料发射的激发能量并且发射第二波长处的光作为响应；和iii.接头，该接头将供体染料共价连接至受体染料，其中该接头包括以下项中的一者或多者：烷基部分、氨基-烷基部分、氧基-亚烷基部分、氨基-亚烷基-二烷氧基部分、亚烯基部分、亚炔基部分、聚醚部分、亚芳基部分、酰胺部分或磷酸二酯部分。
在某些实施方案中，本文所述的能量转移染料缀合物可与分析物连接并且具有选自以下项中的一者的基本结构：
Figure SMS_5
Figure SMS_6
其中L1为第一接头，其中L1通过共价键或通过包含一个或多个居间原子的间隔区与D1、D2和A连接；
其中L2为第二接头，其中L2通过共价键或通过包含一个或多个居间原子的间隔区与D2和D3中的每一者连接；
其中L3为第三接头，其中L3通过共价键或通过包含一个或多个居间原子的间隔区与每个PO4H和D1连接；
其中L4为第四接头，其中L4通过共价键或通过包含一个或多个居间原子的间隔区与PO4H和D2连接；
其中A为分析物；
其中D1、D2和D3中的每一者可互换地为供体染料或受体染料；
其中LI和LIII中的D1和D2与LII中的D2和D3的组合形成能量转移染料对。
供体染料的代表性示例包括但不限于呫吨染料、花青染料、吡咯硼染料、嵌二萘染料、焦宁染料和香豆素染料。受体染料的代表性示例包括但不限于荧光素染料、花青染料、罗丹明染料、吡咯硼染料、嵌二萘染料、焦宁染料和香豆素染料。
在另一个方面，描述了一种寡核苷酸探针，该寡核苷酸探针包含：i.寡核苷酸；和ii.如本文所述的能量转移染料缀合物，其与寡核苷酸共价连接。
在又一个方面，描述了一种包含荧光标记的寡核苷酸探针的组合物，该荧光标记的寡核苷酸探针包括：与如本文所述的能量转移染料缀合物共价连接的寡核苷酸探针。在一些实施方案中，该组合物包括与能量转移染料缀合物连接的寡核苷酸探针，以及水性介质诸如缓冲液、主混合物或反应混合物。在一些实施方案中，该组合物包括与能量转移染料缀合物连接的寡核苷酸探针，以及非水性介质诸如冻干的或冷冻干燥的缓冲液、主混合物或反应混合物
在另一个方面，描述了一种检测或定量样品中靶核酸分子的方法，该方法包括：
(i)使包含一种或多种靶核酸分子的样品与如本文所公开的至少一种寡核苷酸探针接触，该至少一种寡核苷酸探针具有与靶核酸分子至少部分互补的序列，其中该至少一种探针在与该一种或多种靶核酸分子杂交时经历可检测的荧光变化；以及；
(ii)通过测量该探针的荧光来检测靶核酸分子的存在或不存在，或者定量该靶核酸分子的量。
在又一个方面，描述了一种通过聚合酶链反应(PCR)检测或定量样品中的靶核酸分子的方法，该方法包括：
(i)使包含一种或多种靶核酸分子的样品与a)如本文所公开的至少一种寡核苷酸探针接触，该至少一种寡核苷酸探针具有与靶核酸分子至少部分互补的序列，其中该至少一种探针在扩增该一种或多种靶核酸分子时经历可检测的荧光变化；以及与b)至少一种寡核苷酸引物对接触；
(ii)在足以扩增该一种或多种靶核酸分子的条件下将步骤(i)的混合物与DNA聚合酶一起孵育；以及
(iii)通过测量该探针的荧光来检测所扩增的靶核酸分子的存在或不存在，或者定量所扩增的靶核酸分子的量。
在又一个方面，描述了一种用于聚合酶链反应(PCR)的试剂盒，该试剂盒包括：i.一种或多种缓冲剂、核酸合成酶；和ii.如本文所述的寡核苷酸探针；和iii.用于执行PCR测定的说明书，以及任选的纯化介质或有机溶剂。
在又一个方面，本文提供了组合物。例如，该组合物可包含：a)第一标记寡核苷酸，该第一标记寡核苷酸包括如本文所述的能量转移染料缀合物；和b)聚合酶。在另一个实施方案中，该组合物可包含：a)如本文所公开的荧光能量转移染料缀合物；和b)核酸分子。在又一个实施方案中，该组合物可包含：a)如本文所公开的荧光能量转移染料缀合物；和b)酶。在又一个实施方案中，该组合物可包含：a)如本文所公开的荧光能量转移染料缀合物；和b)荧光团，该荧光团具有在能量转移染料缀合物中供体染料的激发波长的20nm内或在能量转移染料缀合物中受体染料的发射波长的20nm内的激发波长。
在又一个方面，一种包括第一辐射源、任选的第二辐射源、检测器、第一发射光谱元件和任选的第二发射光谱元件的系统。该系统还可包括至少一个处理器，该至少一个处理器包括至少一个存储器，该至少一个存储器包括指令。第一辐射源是特征在于第一平均激发波长的源，而第二辐射源(当存在时)的特征在于与该第一平均激发波长不同的第二平均激发波长。样品被设置成接收来自辐射源的辐射，其中该样品包含第一染料、第二染料和任选的第三染料。检测器被构造成测量来自样品的发射。第一发射光谱元件的特征在于第一平均发射波长，并且任选的第二发射光谱元件的特征在于与该第一平均发射波长不同的第二平均发射波长。存储器包括用于以下的指令：用第一辐射源照射样品，并且作为响应，(1)使用检测器和第一发射光谱元件测量来自样品的发射，以及(2)任选地使用检测器和第二发射光谱元件测量来自样品的发射。当存在时，存储器还包括用于以下的指令：用第二辐射源照射样品，并且作为响应，使用检测器和第二发射光谱元件测量来自样品的发射。第一染料包括第一吸收光谱，该第一吸收光谱包括第一最大吸收波长，并且第二染料包括第二吸收光谱，该第二吸收光谱包括与第一最大吸收波长相等或基本上相等的第二最大吸收波长。附加地或另选地，第二染料包括第二发射光谱，该第二发射光谱包括第二最大发射波长，并且第三染料包括第三发射光谱，该第三发射光谱包括与第二最大发射波长相等或基本上相等的第三最大发射波长。
根据以下详细描述并且通过本公开的实践，本公开的附加实施方案、特征和优点将是显而易见的。应当理解，本文所述的实施方案中的任一个实施方案可与本文所述的任何其他实施方案结合使用，只要这些实施方案不彼此矛盾。
附图说明
当结合附图阅读时，根据以下详细描述可更好地理解本公开的实施方案。仅出于说明目的的此类实施方案描述了本公开的新颖且非显而易见的方面。这些附图包括以下附图：
图1是根据本公开的实施方案的系统的示意图。
图2是根据本公开的实施方案的另一个系统的示意图。
图3是根据本公开的实施方案的另一个系统的示意图。
图4是根据本公开的实施方案的系统的透视图。
图5是根据本公开的实施方案的系统的示意图，该系统可包括图1至图4中示出的系统中的任一个系统。
图6是根据本公开的实施方案的一组ex-em通道和染料的表格表示。
图7是根据本公开的实施方案的方法。
图8是根据本公开的实施方案的一对染料的吸收或激发光谱以及相关发射光谱。
图9是根据本公开的实施方案的包括图8中示出的染料的一组ex-em通道和染料的表格表示。
图10是图8中示出的染料的ex-em通道空间的图。
图11是根据本公开的实施方案的方法。
图12是根据本公开的实施方案的三种染料的吸收或激发光谱以及相关发射光谱。
图13是根据本公开的实施方案的包括图12中示出的染料的一组ex-em通道和染料的表格表示。
图14是图12中示出的染料的ex-em通道空间的图。
图15是根据本公开的实施方案的三种染料的吸收或激发光谱以及相关发射光谱。
图16是根据本公开的实施方案的五种染料的吸收或激发光谱以及相关发射光谱。
图17是根据本公开的实施方案的包括图16中示出的染料的一组ex-em通道和染料的表格表示。
图18是图16中示出的染料的ex-em通道空间的图。
图19是根据本公开的实施方案的包括一组10种染料的一组ex-em通道和染料的表格表示。
图20是根据本公开的实施方案的方法
图21是用于制备具有接头L1的能量转移染料缀合物的反应方案(方案1)，其中D1和D2分别是指染料1和染料2。
图22是用于制备具有接头L2的能量转移染料缀合物的反应方案(方案2)，其中D2和D3分别是指染料2和染料3。
图23是用于制备具有两个接头L3和L4的能量转移染料缀合物的反应方案(方案3)，其中D1和D2分别是指染料1和染料2。
图24是含有接头的前体和使用每种类型的前体制备的能量转移染料缀合物的列表。
图25是与寡核苷酸探针连接的能量转移缀合物的图。
图26A是与寡核苷酸探针连接的能量转移缀合物的图，其中探针与猝灭剂连接。
图26B是在qPCR反应期间置换和切割寡核苷酸探针后的图26A的能量转移缀合物的图。
具体实施方式
现在将详细参考本公开的某些实施方案，这些实施方案的示例在附图中示出。应当理解，本文所述的实施方案的一般性描述和详细描述两者一般涉及用于核酸合成的装置、系统、组合物和方法，诸如聚合酶链反应(PCR)装置、系统、组合物和方法，包括例如实时PCR(qPCR)装置、系统、组合物和方法以及终端PCR装置、系统、组合物和方法，包括但不限于数字PCR(dPCR)或熔解曲线分析装置、系统、组合物或方法。应当理解，本文所提供的一般描述和详细描述两者仅是示例性和说明性的，而不是对教导内容的限制。虽然将结合所说明的实施方案来描述本公开，但应当理解，这并非旨在将本公开限制在那些实施方案中。相反，本公开旨在覆盖可包括在如所附权利要求书所限定的本公开内的所有替代方案、修改和等同物。
出于解释本说明书的目的，将应用以下定义，并且在适当的情况下，以单数使用的术语还将包括复数，反之亦然。在下文列出的任何定义与该词在任何其他文献(包括以引用方式并入本文的任何文献)中的使用冲突的情况下，除非明确地意指相反的含义(例如在最初使用该术语的文献中)，否则出于解释本说明书及其相关权利要求书的目的，应始终以下文列出的定义为准。应当注意，如在本说明书和所附内容以及权利要求书中所使用的，除非清楚且明确地限于一个指代物，否则单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指代物。除非另有说明，否则“或”的使用是指“和/或”。“容纳”、“由…组成”、“包括”、“包含”和“含有”的使用是可互换的并且并非旨在进行限制。此外，在使用术语“包括”描述一个或多个实施方案的情况下，本领域技术人员将理解，在一些具体情况下，该一个或多个实施方案可另选地使用语言“基本上由…组成”和/或“由…组成”进行描述。
出于本说明书和所附权利要求书的目的，除非另有说明，否则在本说明书和权利要求书中使用的表示数量、百分比或比例的所有数字以及其他数值应当理解为在所有情况下都被术语“约”修饰，只要它们还未进行如此修饰。“约”表示基本上不影响所述主题的特性的变化程度，例如在10％、5％、2％或1％内。因此，除非有相反的说明，否则在以下说明书和所附权利要求书中列出的数值参数是近似值，这些近似值可根据试图获得的期望特性而变化。最低程度上说，而不是试图将等同原则的应用限制在权利要求书的范围中，每个数值参数至少应当被解释为考虑所报告的有效数位的位数并且通过应用惯常的四舍五入法。
本文中使用的章节标题仅出于组织目的，并且不应被解释为以任何方式限制期望的主题。在以引用方式并入的任何文献与本说明书中定义的任何术语矛盾的情况下，以本说明书为准。尽管本教导内容结合各种实施方案来描述，但并非旨在将本教导内容限制在此类实施方案中。相反，如本领域技术人员应当理解的，本教导内容涵盖各种替代方案、修改和等同物。
定义
为了便于理解本公开，下文定义了多个术语。除非另有说明，否则如本文所用的以下术语和短语旨在具有以下含义。
如本文所用，“能量转移(ET)”是指FRET或Dexter能量转移。如本文所用，“FRET”(也称为荧光共振能量转移或
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共振能量转移)是指分子能量转移(MET)的一种形式，通过该形式，能量在供体分子与受体分子之间非辐射地传递。不受理论的约束，据信当激发光谱与发射光谱重叠的两个荧光团紧密接近时，一个荧光团的激发可导致第一荧光团将其吸收的能量转移至第二荧光团，继而导致第二荧光团发出荧光。换句话说，第一(供体)荧光团的激发态能量通过有时称为共振诱导的偶极-偶极相互作用的过程转移至相邻的第二(受体)荧光团。因此，供体分子的寿命缩短并且其荧光被猝灭，而受体分子的荧光强度增强并且发生去极化。当供体的激发态能量转移至非荧光团受体(诸如猝灭剂)时，供体的荧光被猝灭，而受体随后不发射荧光。可接合ET的分子对被称为ET对。为了发生能量转移，供体分子和受体分子通常必须紧密接近(例如，高达70埃至100埃)。如本文所用，“Dexter能量转移”是指荧光猝灭机制，由此激发电子可经由非辐射路径从供体分子转移至受体分子。当供体与受体之间存在相互作用时，Dexter能量转移可发生。在一些实施方案中，Dexter能量转移可发生在供体与受体之间的约10埃或更小的距离处。在一些实施方案中，在Dexter能量转移中，激发态可在单个步骤中交换。在一些实施方案中，在Dexter能量转移中，激发态可在两个单独的步骤中交换。
用于检测核酸扩增产物的常用方法需要将所扩增的产物(即，扩增子)与未反应的引物分离。这通常通过使用凝胶电泳(其基于大小差异将所扩增的产物与引物分离)或通过固定产物(允许洗掉游离引物)来实现。已经描述了用于监测扩增过程而不会将引物与扩增子分离的其他方法，诸如用于实时检测。一些示例包括
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探针(罗氏分子系统公司(Roche Molecular Systems))、分子信标、双链嵌入剂染料诸如
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GREEN指示剂染料(生命技术公司(Life Technologies Corporation))、LUX引物等。PCR产物积累的基于嵌入剂的检测(诸如使用
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GREEN指示剂染料)的主要缺点是特异性产物和非特异性产物两者都产生信号。通常，嵌入剂用于单重检测分析，不适用于多重检测。
用于定量PCR(qPCR)的实时系统经常用于对细胞和组织样品(例如，血液、唾液、精液、尿液)进行测定。基于探针的定量PCR测定提供了相对于基于嵌入剂的PCR产物检测的显著改善。一种用于检测扩增产物而不与引物分离的基于探针的方法是5'核酸酶PCR测定(也称为
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测定或水解探针测定)。该替代方法提供了用于仅检测特定扩增产物的实时方法。在扩增期间，检测器探针(有时称为“TaqMan探针”(例如，5'核酸酶探针)或水解探针)与其靶序列退火产生底物，当酶从上游引物延伸至该探针的区域中时，该底物被DNA聚合酶(诸如水生栖热菌(Thermus aquaticus)(Taq)DNA聚合酶)的5'核酸酶活性切割。这种对聚合的依赖性确保了探针的切割仅在靶序列被扩增时发生。
术语“报道基因”、“报道基因基团”或“报道基因部分”在本文中以广义使用，并且是指任何可鉴定的标签、标记或部分。在一些实施方案中，报道基因是荧光报道基因部分或染料。
一般来讲，TaqMan检测器探针可包括与荧光报道基因部分或染料以及猝灭剂部分或染料共价连接的寡核苷酸。报道基因染料和猝灭剂染料紧密接近，使得猝灭剂通过FRET极大地减少了由报道基因染料发射的荧光。探针设计和合成已被简化，这是因为发现对于具有5'末端处的报道基因和3'末端处的猝灭剂的探针，通常观察到足够的猝灭。
在PCR的延伸阶段期间，如果靶序列存在，则检测器探针从引物位点中的一个引物位点的下游退火，并在该引物延伸时被具有此类活性的DNA聚合酶的5'核酸酶活性切割。探针的切割通过将报道基因染料释放到溶液中而将报道基因染料与猝灭剂染料分离，从而增加报道基因染料信号。切割进一步从靶链去除探针，允许引物延伸继续至模板链的末端。因此，包含探针不会抑制整个PCR过程。附加报道基因染料分子随着每个循环从它们的相应探针上切割下来，实现与所产生的扩增子的量成比例的荧光强度的增加。
荧光检测器探针相对于DNA结合染料(诸如SYBR
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)的优点是需要探针与靶标之间的特异性杂交以产生荧光信号。因此，使用荧光检测器探针时，由于错误引发或引物-二聚体人工产品导致的非特异性扩增不会产生信号。荧光探针的另一个优点是它们可用不同的、可区分的报道基因染料进行标记。通过使用标记有不同报道基因的检测器探针，可在单个PCR反应中检测多个不同序列的扩增，通常称为多重测定。
如本文所用，术语“探针”或“检测器探针”一般是指指示扩增的多种信号分子中的任一种信号分子，诸如“寡核苷酸探针”。如本文所用，“寡核苷酸探针”是指合成的或生物产生的核酸(例如，DNA或RNA或DNA/RNA杂交体)的寡聚物，该寡核苷酸探针通过设计或选择，含有特定核苷酸序列，该特定核苷酸序列允许其在限定的严格性下特异性地(即，优先地)与靶核酸序列杂交。因此，一些探针或检测器探针可以是基于序列的(也称为“序列特异性检测器探针”)，例如5'核酸酶探针。各种检测器探针是本领域已知的，例如(本文所述的
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探针(还可参见美国专利号5,538,848)、各种茎环分子信标(参见例如美国专利号6,103,476和5,925,517，以及Tyagi和Kramer,1996,Nature Biotechnology 14:303-308)、无茎或线性信标(参见例如WO 99/21881)、PNA Molecular BeaconsTM(美国专利号6,355,421和6,593,091)、线性PNA信标(参见例如Kubista等人,2001,SPIE 4264:53-58)、非FRET探针(参见例如美国专利号6,150,097)、
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探针(美国专利号6,548,250)、茎环和双重ScorpionTM探针(Solinas等人,2001,Nucleic Acids Research 29:E96和美国专利号6,589,743)、凸环探针(美国专利号6,590,091)、假结探头(pseudo knotprobes)(美国专利号6,589,250)、环状体(美国专利号6,383,752)、MGB EclipseTM探针(Epoch Biosciences)、发夹探针(美国专利号6,596,490)、肽核酸(PNA)发光探针、自组装纳米颗粒探针和二茂铁修饰的探针，例如以下文献中描述的：美国专利号6,485,901；Mhlanga等人,2001,Methods 25:463-471；Whitcombe等人,1999,NatureBiotechnology.17:804-807；Isacsson等人,2000,Molecular Cell Probes.14:321-328；Svanvik等人,2000,Anal Biochem.281:26-35；Wolffs等人,2001,Biotechniques 766:769-771；Tsourkas等人,2002,Nucleic Acids Research.30:4208-4215；Riccelli等人,2002,Nucleic Acids Research 30:4088-4093；Zhang等人,2002Shanghai.34:329-332；Maxwell等人,2002,J.Am.Chem.Soc.124:9606-9612；Broude等人,2002,TrendsBiotechnol.20:249-56；Huang等人,2002,Chem Res.Toxicol.15:118-126；以及Yu等人,2001,J.Am.Chem.Soc 14:11155-11161。检测器探针可包括报道基因染料，诸如本文所述的新型染料以及6-羧基荧光素(6-FAM)或四氯荧光素(TET)和本领域技术人员已知的其他染料。检测器探针还可包括猝灭剂部分，诸如本文所述的那些猝灭剂以及四甲基罗丹明(TAMRA)、黑洞猝灭剂(Biosearch)、Iowa Black(IDT)、QSY猝灭剂(分子探针公司(Molecular Probes))以及Dabsyl和Dabcyl磺酸酯/羧酸酯猝灭剂(Epoch)。在一些实施方案中，检测器探针还可包括两种探针的组合，其中例如荧光染料在一种探针上，而猝灭剂在另一种探针上，其中两种探针在靶标上杂交在一起会猝灭信号，或者其中靶标上的杂交经由荧光变化来改变信号特征。
如本文所用的“引物”可指多于一种引物，并且指天然存在或以合成方式产生的寡核苷酸，当置于诱导与核酸链互补的引物延伸产物的合成的条件下时，即在核苷酸和用于聚合的试剂诸如DNA聚合酶的存在下，在合适的温度下保持足够长的时间并且在缓冲剂的存在下，该寡核苷酸能够充当合成的起始点。此类条件可包括，例如，在至少四种不同的脱氧核糖核苷三磷酸腺苷(诸如G、C、A和T)和聚合诱导剂(诸如DNA聚合酶或逆转录酶)的存在下，在合适的缓冲液(“缓冲液”包括为辅因子或影响pH、离子强度等的取代基)中以及在合适的温度下。在一些实施方案中，引物可以是单链的以用于实现扩增中的最大效率。本文中的引物被选择用于与待扩增的每个特定序列的不同链基本上互补。这意味着引物必须充分互补以与它们的相应链杂交。非互补核苷酸片段可与引物的5'末端(诸如具有“尾部”)连接，其中引物序列的其余部分与靶核酸的靶区域互补或部分互补。通常，引物是互补的，除了当非互补核苷酸可能存在于预先确定的序列或序列范围位置(诸如所述的引物末端)时。在一些实施方案中，此类非互补“尾部”可包含通用序列，例如，一个或多个寡核苷酸共有的序列。在某些实施方案中，非互补片段或尾部可包含多核苷酸序列，诸如与例如聚腺苷酸化的寡核苷酸或序列杂交的聚(T)序列。
如本文所用，“样品”是指含有或推测含有一种或多种生物分子(例如，一种或多种核酸和/或蛋白质靶分子)的任何物质，并且可包括从一个或多个个体提取和/或分离的细胞、组织或流体中的一者或多者。样品可来源于哺乳动物或非哺乳动物生物体(例如，包括但不限于植物、病毒、噬菌体、细菌和/或真菌)。如本文所用，样品可指包括在单个溶液、容器、小瓶和/或反应位点中的物质，或者可指在溶液、容器、小瓶和/或反应位点的阵列之间分配的物质(例如，在微量滴定板小瓶的阵列上或者在样品板的通孔或反应区域的阵列中的一个阵列上分配的物质；例如，用于dPCR测定)。在一些实施方案中，样品可以是粗制样品。例如，样品可以是未经历任何附加样品制备或分离的粗制生物样品。在一些实施方案中，样品可以是经处理的样品，其已经经历了附加处理步骤以进一步分离感兴趣的分析物，以及/或者从样品中清除其他碎片或污染物。
如本文所用，术语“靶标”、“靶分子”、“靶生物分子”、“靶分析物”、“靶序列”、“靶核酸分子”等是指具有特定化学结构的分子，该特定化学结构与一种或多种其他“靶标”、“靶分子”、“靶生物分子”、“靶分析物”、“靶序列”、“靶核酸分子”等的化学结构不同。一般来讲，每种“靶标”、“靶分子”、“靶生物分子”、“靶分析物”、“靶序列”、“靶核酸分子”等含有与其他“靶标”、“靶分子”、“靶生物分子”、“靶分析物”、“靶序列”、“靶核酸分子”的任何结构或序列不同的结构或序列，并且可用于与样品或样品溶液中所含的特定探针或染料连接。
如本文所用，术语“扩增(amplification/amplify)”是指使其中一种或多种靶生物分子的量或数量增加的测定，例如允许检测和/或定量该一种或多种靶生物分子的量。例如，在一些实施方案中，PCR测定可用于扩增靶生物分子。如本文所用，除非另有明确定义，否则“聚合酶链反应”或“PCR”是指单重或多重PCR测定，并且可以是实时或定量PCR(其中检测发生在扩增期间)或终端PCR(其中检测发生在PCR结束时或扩增后；例如，dPCR测定)。扩增的其他类型的测定和方法也是预期的，诸如等温核酸扩增，并且是本领域技术人员容易理解的。
如本文所用，术语“核酸”、“多核苷酸”和“寡核苷酸”可指引物、探针、待检测的寡聚物片段、标记或未标记的寡聚物对照以及未标记的封闭寡聚物，并且将是多脱氧核糖核苷酸(含有2-脱氧-D-核糖)、多核糖核苷酸(含有D-核糖)以及作为嘌呤或嘧啶碱基或者修饰的嘌呤或嘧啶碱基的N-糖苷的任何其他类型的多核苷酸的总称。术语“核酸”、“多核苷酸”和“寡核苷酸”之间不存在明显的长度区别，并且这些术语可互换使用。“核酸”、“DNA”、“RNA”和类似术语还可包括核酸类似物。如本文所述，寡核苷酸不一定是以物理方式来源于任何现有或天然序列，而是可以任何方式产生，包括化学合成、DNA复制、反转录或它们的组合。
术语“类似物(analog/analogue)”包括具有修饰的碱基部分、修饰的糖部分和/或修饰的磷酸酯部分的合成类似物。如本文所用，术语“修饰的碱基”一般是指核酸中的碱基的任何修饰或碱基的化学键，该修饰的碱基在结构上与天然存在的核酸中发现的碱基不同。此类修饰可包括碱基的化学结构变化、或核酸中碱基的化学键变化、或核酸的主链结构变化。(参见例如Latorra,D.等人,Hum Mut 2003,2:79-85.Nakiandwe,J.等人,plantMethod 2007,3:2.)
除了天然存在的碱基腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶(分别表示为A、C、G、T和U)之外，本文所述的寡核苷酸，特别是用作探针和/或引物的那些寡核苷酸，可包括一个或多个修饰的碱基。在一些实施方案中，修饰的碱基可增加匹配的靶序列与错配的靶序列之间的Tm差异，并且/或者降低错配引发效率，从而不仅改善测定特异性，而且改善选择性。修饰的碱基可以是通过添加或缺失一个或多个官能团、杂环结构的差异(即碳取代杂原子，或反之亦然)和/或一个或多个接头臂结构与碱基的连接而与天然存在的碱基不同的那些碱基。此类修饰的碱基可包括例如8-氮杂-7-脱氮杂-dA(ppA)、8-氮杂-7-脱氮杂-dG(ppG)、锁核酸(LNA)或2'-O,4'-C-乙烯核酸(ENA)碱基。修饰的碱基的其他示例包括但不限于碱基类似物7-脱氮杂嘌呤及其衍生物和吡唑并嘧啶及其衍生物的一般类别(例如，如PCTWO 90/14353中描述的，该文献以引用方式并入本文)。这些碱基类似物，当存在于寡核苷酸中时，可增强杂交并改善错配辨别。可包括天然存在的碱基、修饰的碱基和碱基类似物的所有互变异构形式。修饰的核苷酸间键也可存在于本文所述的寡核苷酸中。此类修饰的键包括但不限于肽、磷酸酯、磷酸二酯、磷酸三酯、烷基磷酸酯、烷烃膦酸酯、硫代磷酸盐、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、氨基磷酸酯、取代的氨基磷酸酯等。碱基、糖和/或核苷酸间键的数种进一步修饰，与该碱基、糖和/或核苷酸间键在用作探针和/或引物的寡核苷酸中的用途相容，对于本领域技术人员将是显而易见的。
在一些实施方案中，修饰的碱基位于寡核苷酸探针和/或引物中的(a)3'末端、(b)5'末端、(c)内部位置处，或者(a)、(b)和/或(c)的任何组合。
在一些实施方案中，如本文所公开的引物和/或探针被设计为单链寡聚物。在一些实施方案中，引物和/或探针是线性的。在其他实施方案中，引物和/或探针是双链的或包括双链片段。例如，在一些实施方案中，引物和/或探针可形成茎-环结构，包括环部分和茎部分。在一些实施方案中，引物和/或探针为短寡核苷酸，其具有以下长度：100个核苷酸或更少，更优选50个核苷酸或更少，还更优选30个核苷酸或更少，并且最优选20个核苷酸或更少，其中下限为大约3个至5个核苷酸。在一些实施方案中，如本文所公开的引物和/或探针具有介于5个至35个核苷酸之间的长度。在一些实施方案中，如本文所公开的引物和/或探针具有10个、15个、20个、25个、30个核苷酸或者介于10个至30个核苷酸之间的长度的任何长度。在一些实施方案中，如本文所公开的引物和/或探针具有介于5个至35个核苷酸之间的长度。在一些实施方案中，如本文所公开的引物和/或探针具有10个、15个、20个、25个、30个核苷酸或者介于10个至30个核苷酸之间的长度的任何长度。
在一些实施方案中，本文所公开的引物和/或探针的Tm在约50℃至约75℃的范围内。在一些实施方案中，引物和/或探针介于约55℃至约65℃之间。在一些实施方案中，引物和/或探针介于约60℃至70℃之间。例如，本文所公开的引物和/或探针的Tm可以是56℃、57℃、58℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃等。在一些其他实施方案中，本文所公开的引物和/或探针的Tm可以是56℃至63℃、58℃至68℃、61℃至69℃、62℃至68℃、63℃至67℃、64℃至66℃或介于其间的任何范围。在一些实施方案中，引物的Tm低于如本文所用的探针的Tm。在一些实施方案中，如本文所用引物的Tm为约55℃至约65℃，并且如本文所用探针的Tm为约60℃至约70℃。在一些实施方案中，在PCR中使用的引物的Tm范围比在同一PCR中使用的探针的Tm范围低约5℃至15℃。在其他实施方案中，引物和/或探针的Tm约比在扩增期间采用的PCR循环条件中的退火/延伸温度高约3℃至6℃。
在一些实施方案中，探针在其3'末端处包含不可延伸的阻断剂部分。在一些实施方案中，探针还可在其3'末端、5'末端和/或介于其间的任何内部位置处包含其他部分(包括但不限于相同或不同的附加不可延伸的阻断剂部分、猝灭剂部分、荧光部分等)。在一些实施方案中，不可延伸的阻断剂部分可以是但不限于胺(NH2)、生物素、PEG、DPI3或PO4。在一些优选的实施方案中，阻断剂部分是小沟结合剂(MGB)部分。
如本文所用，术语“MGB”、“MGB基团”、“MGB化合物”或“MBG部分”是指在双链DNA的小沟内结合的分子。当与寡核苷酸的3'末端缀合时，MGB基团可用作不可延伸的阻断剂部分。MGB部分还可增加寡核苷酸探针和/或引物的特异性。在一些实施方案中，寡核苷酸(如本文所公开的此类探针)的Tm可通过包含MGB部分而降低。例如，如本文所公开的包括MGB部分的探针的Tm可在约45℃至55℃的范围内。在一些实施方案中，在同一探针中包含MGB部分的情况下，探针的Tm降低约10℃至20℃。
尽管无法提供所有已知的MGB化合物的一般化学式，因为此类化合物具有广泛变化的化学结构，但是能够在DNA的小沟中结合的化合物，一般来讲，具有新月形状的三维结构。大多数MGB部分对B形式的双链DNA的富含A-T(腺嘌呤和胸腺嘧啶)的区域具有强烈的偏好。然而，显示出对富含C-G(胞嘧啶和鸟嘌呤)的区域具有偏好的MGB化合物在理论上也是可能的。因此，包括来源于对C-G区域具有偏好的小沟结合剂分子的自由基或部分的寡核苷酸也在本发明的范围内。
一些MGB能够以103M-1或更大的结合常数在双链DNA的小沟内结合。这种类型的结合可通过众所周知的分光光度法(诸如紫外(UV))和核磁共振(NMR)光谱法以及通过凝胶电泳来检测。UV光谱在结合小沟结合剂分子时的位移以及利用“Nuclear Overhauser”(NOESY)效应的NMR光谱是用于该目的的特别熟知和有用的技术。凝胶电泳检测了MGB与双链DNA或其片段的结合，因为在此类结合时，双链DNA的迁移率发生改变。
文献中已经描述了多种合适的小沟结合剂。参见例如Kutyavin等人,美国专利号5,801,155；Wemmer,D.E.和Dervan P.B.,Current Opinion in Structural Biology,7:355-361(1997)；Walker,W.L.,Kopka,J.L.和Goodsell,D.S.,Biopolymers,44:323-334(1997)；Zimmer,C.和Wahnert,U.Prog.Biophys.Molec.Bio.47:31-112(1986)；以及Reddy,B.S.P.,Dondhi,S.M.和Lown,J.W.,Pharmacol.Therap.,84:1-111(1999)(这些文献的公开内容全文以引用方式并入本文)。根据本公开的优选MGB是DPI3。此类MGB的合成方法和/或来源(其中此类MGB中的一些MGB可商购获得)也是本领域熟知的。(参见例如美国专利号5,801,155、6,492,346、6,084,102和6,727,356，这些专利的公开内容全文以引用方式并入本文)。
如本文所用，术语“MGB阻断剂探针”、“MBG阻断剂”或“MGB探针”是在其3'末端和/或5'末端处与小沟结合剂部分进一步连接的寡核苷酸序列和/或探针。与MGB部分缀合的寡核苷酸与单链和双链DNA靶标形成极其稳定的双链体，因此允许较短的探针用于基于杂交的测定。与未修饰的DNA相比，MGB探针具有更高的熔解温度(Tm)和增加的特异性，特别是当错配接近杂交双链体的MGB区时。(参见例如Kutyavin,I.V.等人,Nucleic AcidsResearch,2000,Vol.28,No.2:655-661)。
在一些实施方案中，掺入充当探针的寡核苷酸中的核苷酸单元可包括小沟结合剂(MGB)部分。在一些实施方案中，此类MGB部分可具有通过连接臂与碱基中的一个或多个碱基共价结合的交联功能(烷化剂)。类似地，修饰的糖或糖类似物可存在于本文所公开的寡核苷酸的一个或多个核苷酸亚基中。糖修饰包括但不限于取代基与糖的2'、3'和/或4'碳原子的连接、糖的不同差向异构形式、糖苷键的α构型或β构型的差异以及其他端基异构变化。糖部分包括但不限于戊糖、脱氧戊糖、己糖、脱氧己糖、核糖、脱氧核糖、葡萄糖、阿拉伯糖、戊呋喃糖、木糖、来苏糖和环戊基。在一些实施方案中，充当探针的寡核苷酸(例如包括MGB部分的寡核苷酸)的一些实施方案的糖或糖苷部分可包括脱氧核糖、核糖、2-氟代核糖、2-0烷基或烯基核糖，其中该烷基可具有1至6个碳并且该烯基具有2至6个碳。在一些实施方案中，天然存在的核苷酸以及在本文描述的修饰和类似物中，脱氧核糖或核糖部分可形成呋喃糖环，并且嘌呤碱基可经由9-位与糖部分连接，经由I-位与嘧啶连接，以及经由I-位与吡唑并嘧啶连接。并且在一些实施方案中，特别是在充当探针的寡核苷酸(例如，第三寡核苷酸和/或第六寡核苷酸，靶位点特异性探针)中，寡核苷酸的核苷酸单元可通过“磷酸”主链相互连接，如本领域所熟知的以及/或者除了“天然”磷酸二酯键之外，还可包括硫代磷酸酯和甲基磷酸酯。如本领域普通技术人员所理解的，本文还设想了其他类型的修饰寡核苷酸或修饰碱基。
当两个不同的非重叠(或部分重叠)寡核苷酸与同一线性互补核酸序列的不同区域退火，并且一个寡核苷酸的3'末端指向另一个寡核苷酸的5'末端时，前者可称为“上游”寡核苷酸，并且后者称为“下游”寡核苷酸。
如本文所用，术语“靶序列”、“靶核酸”、“靶核酸序列”和“感兴趣的核酸”可互换使用，并且是指待扩增、待检测或两者的核酸分子的期望区域。
如本文所用的“引物”可指多于一种引物，并且指天然存在或以合成方式产生的寡核苷酸，当置于诱导与核酸链互补的引物延伸产物的合成的条件下时，即在核苷酸和用于聚合的试剂诸如DNA聚合酶的存在下，在合适的温度下保持足够长的时间并且在缓冲剂的存在下，该寡核苷酸能够充当合成的起始点。此类条件可包括，例如，在至少四种不同的脱氧核糖核苷三磷酸腺苷(诸如G、C、A和T)和聚合诱导剂(诸如DNA聚合酶或逆转录酶)的存在下，在合适的缓冲液(“缓冲液”包括为辅因子或影响pH、离子强度等的取代基)中以及在合适的温度下。在一些实施方案中，引物可以是单链的以用于实现扩增中的最大效率。本文中的引物被选择用于与待扩增的每个特定序列的不同链基本上互补。这意味着引物必须充分互补以与它们的相应链杂交。非互补核苷酸片段可与引物的5'末端(诸如具有“尾部”)连接，其中引物序列的其余部分与靶核酸的靶区域互补或部分互补。通常，引物是互补的，除了当非互补核苷酸可能存在于预先确定的序列或序列范围位置(诸如所述的引物末端)时。在一些实施方案中，此类非互补“尾部”可包含通用序列，例如，一个或多个寡核苷酸共有的序列。在某些实施方案中，非互补片段或尾部可包含多核苷酸序列，诸如与例如聚腺苷酸化的寡核苷酸或序列杂交的聚(T)序列。
如本文所用的核酸序列的补体是指当与该核酸序列比对使得一个序列的5'末端与另一个序列的3'末端配对时处于“反向平行缔合”的寡核苷酸。互补性不必是完美的；稳定双链体可含有错配的碱基对或不匹配的碱基。
核酸双链体的稳定性通过熔解温度或“Tm”测量。特定核酸双链体在特定条件下的Tm是一半碱基对已解离时的温度。
如本文所用，术语寡核苷酸的“Tm”或“熔解温度”是指单链寡核苷酸群体中50％的分子与其互补序列杂交并且该群体中50％的分子不与所述互补序列杂交时的温度(以摄氏度计)。引物或探针的Tm可通过熔解曲线凭经验确定。在一些情况下，其还可使用本领域熟知的公式计算(参见例如Maniatis,T.等人,Molecular cloning:a laboratory manual/Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.:1982)。
如本文所用，术语“灵敏度”是指可通过给定的测定法检测的模板的最小量(拷贝数或质量)。如本文所用，术语“特异性”是指测定来自匹配模板的扩增与来自错配模板的扩增的区别的能力。通常，特异性表示为ΔCt＝Ct错配-Ct匹配。在一些实施方案中，特异性的改善或“特异性改善”或“倍数差异”表示为2(ΔCt_条件1-(ΔCt_条件2)。
如本文所用，术语“Ct”或“Ct值”是指阈值循环并且表示PCR扩增测定的循环，其中指示扩增子产生(例如，荧光)的来自报道基因的信号在高于背景水平时首先变成可检测的。在一些实施方案中，阈值循环或“Ct”是当PCR扩增变成指数时的循环数。
本文所用的术语“与…互补”涉及可与另一个特定核苷酸进行碱基配对的核苷酸。因此，例如，腺苷与尿苷或胸苷互补，鸟苷与胞苷互补。
术语“相同”意指两个核酸序列具有相同序列或互补序列。
如本文所用的“扩增”表示使用任何扩增程序来增加核酸序列混合物中的特定核酸序列的浓度。
“聚合”也可称为“核酸合成”，是指通过使用聚合酶和模板核酸来延伸引物的核酸序列的过程。
如本文所用的术语“标记”是指可用于提供或帮助提供可检测的信号和/或可定量的信号并且可与生物分子(诸如核酸或蛋白质)连接的任何原子或分子。标记可提供可通过荧光、放射性、比色法、重量分析法、磁性、酶活性等可检测的信号。提供通过荧光可检测的信号的标记在本文中也称为“荧光团”或“荧光剂”或“荧光染料”。如本文所用，术语“染料”是指吸收光或辐射并且可能发射光或可能不发射光的化合物。“荧光染料”是指发射所吸收的光以产生可观察到的可检测的信号的分子(例如，“受体染料”、“供体染料”、“报道基因染料”、“大染料”、“能量转移染料”、“同轴染料”、“离轴染料”等)。“猝灭剂染料”是指被设计成吸收来自对应荧光染料的发射的分子。
在一些实施方案中，术语“荧光团”、“荧光剂”或“荧光染料”可应用于在荧光能量转移配对(例如，与供体染料或受体染料)中使用的荧光染料分子。如本文所用的“荧光能量转移缀合物”通常包括两个或更多个荧光团(例如，供体染料和受体染料)，这些荧光团通过接头共价连接并且能够在适当条件下经历荧光能量转移过程。
术语“猝灭剂”、“猝灭剂化合物”、“猝灭剂基团”、“猝灭剂部分”或“猝灭剂染料”在本文中以广义使用，并且是指能够抑制来自报道基因(诸如荧光染料)的信号的分子或部分。
如本文所用的术语“重叠”(当用于提及寡核苷酸时)是指两个寡核苷酸在模板核酸的互补链上的定位。这两个寡核苷酸可重叠至少1个的任何数量的核苷酸，例如1至约40个核苷酸，例如约1个至10个核苷酸或1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个核苷酸。换句话说，由寡核苷酸杂交的两个模板区域可具有与这两个寡核苷酸互补的共同区域。
术语“热循环(thermally cycling/thermal cycling/thermal cycles/thermalcycle)”是指从总变性温度至退火(或杂交)温度、至延伸温度并返回到该总变性温度的温度变化的重复循环。该术语还指变性温度和延伸温度的重复循环，其中退火温度和延伸温度组合成一个温度。总变性温度将所有双链片段展开为单链。退火温度允许引物与核酸模板的分离链的互补序列杂交或退火。延伸温度允许扩增子的新生DNA链的合成。术语“单轮热循环”是指一轮变性温度、退火温度和延伸温度。例如，在单轮热循环中，可存在退火温度和延伸温度的内部重复循环。例如，单轮热循环可包括变性温度、退火温度(即，第一退火温度)、延伸温度(即，第一延伸温度)、另一退火温度(即，第二退火温度)和另一延伸温度(即，第二延伸温度)。
如本文所用的术语“反应混合物”、“扩增混合物”或“PCR混合物”是指从核酸模板扩增至少一个扩增子所必需的组分的混合物。该混合物可包括核苷酸(dNTP)、热稳定聚合酶、引物和多种核酸模板(例如，靶核酸)。该混合物还可包括Tris缓冲液、单价盐和/或Mg2+。每种组分的工作浓度范围是本领域熟知的，并且可进一步优化或配制成包括普通技术人员所需要的其他试剂和/或组分。
术语“扩增产物”或“扩增子”是指在扩增方法(诸如PCR或逆转录酶(RT)-PCR)中使用一对引物通过聚合酶扩增的核酸的片段。
如本文所定义的，“5'→3'核酸酶活性”或“5'至3'核酸酶活性”或“5'核酸酶活性”是指切割反应的活性，包括传统上与一些DNA聚合酶相关的5'至3'核酸酶活性(由此核苷酸以连续方式从寡核苷酸的5'末端去除，即，大肠杆菌(E.coli)DNA聚合酶I具有这种活性，而Klenow片段不具有这种活性))、或5'至3'核酸内切酶活性(其中切割发生于来自5'末端的多于一个磷酸二酯键(核苷酸)、或两者，或一组同源5'至3'核酸外切酶(也称为5'核酸酶)，该核酸外切酶修剪在DNA复制、重组和修复期间产生的分叉分子、分支DNA结构。在一些实施方案中，此类5'核酸酶可用于切割与靶核酸序列退火的标记寡核苷酸探针。
如本文所用，术语“烷基”是指具有所示碳原子数的直链或支链的饱和脂族自由基。例如，C1-C6烷基包括但不限于甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、异丙基、异丁基、仲丁基、叔丁基等。如本文所用，术语“亚烷基”是指具有所示碳原子数的直链或支链的饱和脂族双自由基。例如，C1-C6烷基包括但不限于亚甲基、乙烯、丙烯、丁烯、戊烯、己烯等。应当理解，烷基和亚烷基可任选地通过替换该烷基和亚烷基上的一个或多个氢原子而被一个或多个取代基取代。
如本文所用，术语“烯基”是指具有所示碳原子数并且具有至少一个双键的直链或支链烃自由基。例如，C2-C6烯基包括但不限于乙烯基、丙烯基、异丙烯基、丁烯基、异丁烯基、丁二烯基、戊烯基、己二烯基等。如本文所用，术语“亚烯基”是指具有所示碳原子数、具有至少一个双键的直链或支链烃双自由基。例如，C2-C6烯基包括但不限于乙烯基、丙烯基、异丙烯基、丁烯基、异丁烯基、丁二烯基、戊烯基、己二烯基等。应当理解，烯基和亚烯基可任选地通过替换该烯基和亚烯基上的一个或多个氢原子而被一个或多个取代基取代。
如本文所用，术语“烷氧基”是指在烷基链内或在烷基链末端处包含至少一个氧原子的烷基自由基，例如甲氧基、乙氧基等。“卤素取代的烷氧基”是指其中至少一个氢原子被卤素原子取代的烷氧基。例如，卤素取代的烷氧基包括三氟甲氧基等。如本文所用，术语“氧基-亚烷基”是指包含氧原子的烷基双自由基，例如-OCH2、-OCH2CH2-、-OC1-C10亚烷基-、-C1-C6亚烷基-O-C1-C6亚烷基-、聚(亚烷基二醇)、聚(乙二醇)(或PEG)等。“卤素取代的氧基-亚烷基”是指其中至少一个氢原子被卤素原子取代的氧基-亚烷基。应当理解，烷氧基和氧基-亚烷基可任选地通过替换该烷氧基和氧基-亚烷基上的一个或多个氢原子而被一个或多个取代基取代。
如本文所用，术语“炔基”是指具有所示碳原子数并且具有至少一个三键的直链或支链烃自由基。例如，C2-C6炔基包括但不限于乙炔基、丙炔基、丁炔基等。如本文所用，术语“亚炔基”是指具有所示碳原子数并且具有至少一个三键的直链或支链烃双自由基。亚炔基的示例包括但不限于-C≡C-、-C≡CCH2-、-C≡CCH2CH2-、-CH2C≡CCH2-等。应当理解，炔基和亚炔基可任选地通过替换该炔基和亚炔基上的一个或多个氢原子而被一个或多个取代基取代。
如本文所用，术语“芳基”是指具有所示碳原子数并且具有完全共轭的π-电子体系的环状烃自由基。例如，C6-C10芳基包括但不限于苯基、萘基等。如本文所用，术语“亚芳基”是指具有所示碳原子数并且具有完全共轭的π-电子体系的环状烃双自由基。例如，C6-C10亚芳基包括但不限于亚苯基、亚萘基等。应当理解，芳基和亚芳基可任选地通过替换该芳基和亚芳基上的一个或多个氢原子而被一个或多个取代基取代。
如本文所用，术语“磷酸二酯部分”是指包括至少一个-O-P(O)(OH)-O-官能团的键。应当理解，除了一个或多个-O-P(O)(OH)-O-官能团之外，磷酸二酯部分还可包括其他基团，诸如烷基、亚烷基、亚烯基、氧基-亚烷基，诸如PEG。应当理解，其他基团(诸如烷基、亚烷基、亚烯基、氧基-亚烷基，诸如PEG)可任选地通过替换该基团上的一个或多个氢原子而被一个或多个取代基取代。
如本文所用，术语“磺基”是指磺酸或磺酸的盐(磺酸盐)。
如本文所用，术语“羧基”是指羧酸或羧酸的盐。
如本文所用，术语“磷酸盐”是指磷酸的酯，并且包括磷酸的盐。
如本文所用，术语“膦酸盐”是指膦酸，并且包括膦酸的盐。
如本文所用，除非另有说明，否则取代基(诸如烷基、烷氧基、芳基烷基、烷基氨基、二烷基氨基、三烷基铵或全氟烷基)的烷基部分任选地为饱和的、不饱和的、直链的或支链的，并且所有烷基、烷氧基、烷基氨基和二烷基氨基取代基可任选地被羧基、磺基、氨基或羟基取代。
如本文所用，“取代的”是指其中一个或多个氢原子被一个或多个非氢原子、官能团或部分替换的分子。示例性的取代基包括但不限于卤素(例如氟和氯)、C1-C8烷基、C6-C14芳基、杂环、硫酸盐、磺酸盐、砜、氨基、铵、酰氨基、腈、硝基、低级烷氧基、苯氧基、芳族、苯基、多环芳族、杂环、水溶性基团、键和连接部分。在一些实施方案中，取代基包括但不限于-X、-R、-OH、-OR、-SR、-SH、-NH2、-NHR、-NR2、-NR3 +、-N＝NR2、-CX3、-CN、-OCN、-SCN、-NCO、-NCS、-NO、-NO2、-N2 +、-N3、-NHC(O)R、-C(O)R、-C(O)NR2、-S(O)2O-、-S(O)2R、-OS(O)2OR、-S(O)2NR、-S(O)R、-OP(O)(OR)2、-P(O)(OR)2、-P(O)(O-)2、-P(O)(OH)2、-C(O)R、-C(O)X、-C(S)R、-C(O)OR、-CO2-、-C(S)OR、-C(O)SR、-C(S)SR、-C(O)NR2、-C(S)NR2、-C(NR)NR2，其中每个X独立地为卤素，并且每个R独立地为-H、C1-C6烷基、C6-C14芳基、杂环或连接基团。
除非另有说明，否则本文未明确定义的取代基的命名是通过命名官能团的末端部分，随后命名朝向连接点的相邻官能团而得到的。例如，取代基“芳基烷氧基羰基”是指基团(芳基)-(烷基)-O-C(O)-。
本文所公开的化合物可以非溶剂化形式以及溶剂化形式(包括水合形式)存在。在一些实施方案中，本文所公开的化合物可溶于水性介质(例如水或缓冲液)中。例如，这些化合物可包括使化合物能够溶于水性介质中的取代基(例如，水溶性基团)。能够溶于水性介质中的化合物在本文中称为“水溶性”化合物。此类水溶性化合物在生物测定中是特别有用的。这些化合物可以多晶形式或无定形形式存在。一般来讲，所有物理形式对于本文所述的用途是等效的，并且旨在处于本公开的范围内。本文所公开的化合物可具有不对称碳原子(即，手性中心)或双键；本文所述的化合物的外消旋物、非对映体、几何异构体和单个异构体在本公开的范围内。可将本文所述的化合物制备成单一异构体或异构体的混合物。
当取代基由它们的常规化学式指定并且从左至右书写时，它们同样涵盖化学上相同的取代基，这些化学上相同的取代基将由从右至左书写结构产生，例如，-CH2O-还将被理解为-OCH2-。
应当理解，用于定义本文所公开的化合物的化学结构各自表示可能的共振结构中的一个共振结构，通过该共振结构可表示各自的给定结构。此外，应当理解，根据定义，共振结构仅仅是本领域技术人员用来表示电子离域的图形表示，并且本公开不以任何方式通过显示任何给定结构的一种特定共振结构而受到限制。
在所公开的化合物包括共轭环系的情况下，共振稳定化可允许形式电子电荷分布在整个分子上。尽管特定的电荷可被描述为位于特定的环系或特定的杂原子上，但通常应当理解，可绘制出可比较的共振结构，其中该电荷可在形式上位于该化合物的另一部分上。
如本文所用，术语“保护基团”或“PG”是指本领域普通技术人员通常已知的任何基团，这些基团可通过对反应性官能团(诸如胺或羟基)进行化学修饰而引入分子中，以在随后的化学反应中获得化学选择性。应当理解，此类保护基团可随后在合成中的稍后时刻从官能团中去除，以提供在此类官能团处反应的进一步机会，或者在最终产物的情况下，暴露出此类官能团。保护基团已经描述于例如Wuts,P.G.M.,Greene,T.W.,Greene,T.W.,&JohnWiley&Sons.(2006).Greene's protective groups in organic synthesis.Hoboken,N.J:Wiley-Interscience中。本领域技术人员将容易理解此类保护基团可被安装在官能团上的化学工艺条件。在本文所述的各种实施方案中，本领域普通技术人员应当理解，用于制备本文所述的能量转移染料缀合物的保护基团的选择可选自本领域已知的各种替代方案。还应当理解，可选择合适的保护基团方案，使得所用的保护基团提供正交保护策略。如本文所用，“正交保护”是指一种保护基团策略，其允许在不影响其他受保护的一种或多种反应性能团的情况下，使用一组专用的反应条件对一种或多种反应性官能团进行保护和脱保护。
如本文所用，“PAG”是指聚(亚烷基二醇)部分，其中亚烷基可以是C2-C6直链或支链亚烷基链。应当理解，聚(亚烷基二醇)可由-(C2-C6亚烷基-O-C2-C6亚烷基)n-表示，其中n为1至约20的整数，或者由式-(C2-C6亚烷基-O-C2-C6亚烷基)n-表示，其中n为1至约100的整数。与O-P接头键合在一起的合适的PAG部分包括但不限于五(乙二醇)(又名PEG)、五(丙二醇)(又名PPG)、五(1,2-丁二醇)等。
如本文所用，“水溶性基团”是指增加化合物在水性溶液中的溶解度的部分。示例性水溶性基团包括但不限于如本文所述的亲水性基团、聚醚、聚羟基、硼酸盐、聚乙二醇、环氧乙烷(-(CH2CH2O)-)的重复单元等。
如本文所用，“亲水性基团”是指增加化合物在水性溶液中的溶解度的取代基。示例性亲水性基团包括但不限于-OH、-O-Z+、-SH、-S-Z+、-NH2、-NR3 +Z-、-N＝NR2 +Z-、-CN、-OCN、-SCN、-NCO、-NCS、-NO、-NO2、-N2 +、-N3、-NHC(O)R、-C(O)R、-C(O)NR2、-S(O)2O-Z+、-S(O)2R、-OS(O)2OR、-S(O)2NR、-S(O)R、-OP(O)(OR)2、-P(O)(OR)2、-P(O)(O-)2Z+、-P(O)(OH)2、-C(O)R、-C(S)R、-C(O)OH、-C(O)OR、-CO2 -Z+、-C(S)OR、-C(S)O-Z+、-C(O)SR、-C(O)S-Z+、-C(S)SR、-C(S)S-Z+、-C(O)NR2、-C(S)NR2、-C(NR)NR2等，其中R为H、C1-C6烷基、C1-C6烷基C6-C10芳基或C6-C10芳基，并且任选地被取代。
如本文所用，“反应性官能团”或“反应性基团”是指化合物上能够与不同化合物上的官能团发生化学反应以形成共价键的部分(即，在合适的反应条件下是共价反应性的)，并且一般表示另一物质的连接点。通常，反应性基团是亲电体或亲核体，其可通过分别暴露于亲核体或亲电体的对应官能团而形成共价键。在一些实施方案中，“反应性官能团”或“反应性基团”可以是亲水性基团或者已被活化为“反应性官能团”或“反应性基团”的亲水性基团。在一些实施方案中，“反应性官能团”或“反应性基团”可以是亲水性基团，诸如C(O)OR基团。在一些实施方案中，亲水性基团诸如-C(O)OH可通过本领域已知的多种方法活化以变成反应性官能团，诸如通过使-C(O)OH基团与N,N,N′,N′-四甲基-O-(N-琥珀酰亚胺基)脲鎓四氟硼酸盐(TSTU)反应，得到NHS酯部分-C(O)O-NHS(又名活性酯)。
另选地，反应性基团是可光活化的基团，其仅在用适当波长的光照射之后才变成具有化学反应性。
示例性反应性基团包括但不限于烯烃、乙炔、醇、酚、醚、氧化物、卤化物、醛、酮、羧酸、酯、酰胺、氰酸酯、异氰酸酯、硫氰酸酯、异硫氰酸酯、胺、肼、腙、酰肼、重氮基、重氮鎓、硝基、腈、硫醇、硫化物、二硫化物、亚砜、砜、磺酸、亚磺酸、缩醛、缩酮、酸酐、硫酸盐、次磺酸异腈、脒、酰亚胺、亚氨酸酯、硝酮、羟胺、肟、异羟肟酸、硫代异羟肟酸、丙二烯、原酸酯、亚硫酸盐、烯胺、炔胺、脲、假脲、氨基脲、碳二亚胺、氨基甲酸酯、亚胺、叠氮化物、炔烃(包括应变炔烃，诸如DIBO和DBCO)、偶氮化合物、氧化偶氮基化合物和亚硝基化合物。反应性官能团还包括用于制备生物缀合物的那些反应性官能团，例如N-羟基琥珀酰亚胺酯(或琥珀酰亚胺酯(SE))、马来酰亚胺、磺基二氯苯基(SDP)酯、磺基四氟苯基(STP)酯、四氟苯基(TFP)酯、五氟苯基(PFP)酯、次氮基三乙酸(NTA)、氨基葡聚糖、环辛炔-胺等。制备这些官能团中的每一种官能团的方法都是本领域熟知的，并且对这些官能团出于特定目的的应用或修改在本领域技术人员的能力范围内(参见例如Sandler和Karo编辑,Organic Functional GroupPreparations,Academic Press,San Diego,1989)。示例性的反应性基团或反应性配体包括NHS酯、亚磷酰胺以及下文表1中列出的其他部分。核苷酸、核苷和糖类(例如，核糖基和脱氧核糖基)也被视为反应性配体，因为至少它们能够通过酶催化形成磷酸二酯键。为了避免疑问，饱和烷基未被视为反应性配体。
如本文所用，如本文所用的术语“固体载体”是指基本上不溶于液相并且能够结合感兴趣的分子或颗粒的基质或介质。适用于本文的固体载体包括半固体载体，并且不限于特定类型的载体。可用的固体载体包括固体基质和半固体基质，诸如气凝胶和水凝胶、树脂、珠粒、生物芯片(包括薄膜涂覆的生物芯片)、微流体芯片、硅芯片、多孔板(也称为微量滴定板或微孔板)、阵列(例如，微阵列)、膜、导电金属和非导电金属、玻璃(包括显微镜载玻片)和磁性载体。可用的固体载体的更多具体示例包括硅胶、聚合物膜、颗粒、衍生的塑料膜、玻璃珠、棉花、塑料珠、氧化铝凝胶、多糖(诸如SEPHAROSE(GE Healthcare))、聚(丙烯酸酯)、聚苯乙烯、聚(丙烯酰胺)、多元醇、琼脂糖、琼脂、纤维素、葡聚糖、淀粉、FICOLL(GEHealthcare)、肝素、糖原、支链淀粉、甘露聚糖、菊粉、硝基纤维素、重氮纤维素、聚氯乙烯、聚丙烯、聚乙烯(包括聚(乙二醇))、尼龙、乳胶珠、磁珠、顺磁珠、超顺磁珠、淀粉等。
水解探针测定可利用某些DNA聚合酶(诸如Taq DNA聚合酶)的5'核酸酶活性，以在PCR期间切割标记探针。水解探针的一个具体示例是TaqMan探针。在一些实施方案中，水解探针在探针的5'末端处含有报道基因染料，并且在探针的3'末端处含有猝灭剂染料。在PCR反应期间，探针的切割将报道基因染料和猝灭剂染料分离，导致报道基因荧光的增加。通过监测报道基因染料荧光的增加来直接检测PCR产物的积累。当探针完整时，报道基因染料与猝灭剂染料的紧密接近，导致主要通过
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型能量转移来抑制报道基因荧光(
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1948；Lakowicz,1983)。在PCR期间，如果存在感兴趣的靶，则探针在正向引物位点与反向引物位点之间特异性退火。只有当探针与靶标杂交时，Taq DNA聚合酶的5'至3'核酸分解活性才在报道基因与猝灭剂之间切割探针。然后将探针片段从靶标上置换下来，并且继续链的聚合。在一些实施方案中，探针的3'末端被阻断以防止探针在PCR期间延伸。一般来讲，杂交和切割过程发生在连续循环中，并且不干扰产物的指数累积。
在不受限于这些参数的情况下，对设计TaqMan探针和引物的一般准则如下：设计引物尽可能靠近探针，但不与探针重叠；探针的Tm应比引物的Tm高约10℃；选择给予探针更多G碱基而不是C碱基的链；引物的3'末端处的五个核苷酸应具有不超过两个G碱基和/或C碱基，并且反应应在两步热谱上运行，其中退火和延伸在60℃的相同温度下运行。
荧光染料(即，荧光团)和猝灭剂化合物的以下描述提供了关于构建本文所述的能量转移缀合物和探针的一般信息。如本文所述，荧光染料(例如，供体染料和受体染料)可通过接头彼此共价结合以形成能量转移染料缀合物(例如，报道基因部分)。在一些实施方案中，能量转移染料或能量转移染料缀合物和猝灭剂化合物可通过分析物彼此共价结合。在一些实施方案中，分析物是探针，诸如寡核苷酸探针。所公开的FRET缀合物和包括本文所公开的独特荧光团/猝灭剂组合的探针允许通过在一些商业仪器上已经可获得的附加光谱通道来增加多重反应和检测。此外，新的荧光团、FRET缀合物以及荧光团/猝灭剂和探针组合提供了独特的光学特性，一旦具有附加通道的仪器并且其他相关硬件和软件改善变得可用，就可促进甚至更高阶的多重化。
能量转移染料
在一些实施方案中，本文所述的能量转移染料缀合物包含两种或更多种荧光染料。该两种或更多种荧光染料包括供体染料和受体染料。具有适当光学和物理特性的任何荧光染料可用于构建本文所公开的染料缀合物。在一些实施方案中，供体染料的发射光谱与受体染料的吸收光谱重叠。在一些实施方案中，受体染料可具有比供体染料的发射最大值更长的波长的发射最大值。应当理解，在本文所述的能量转移染料缀合物中，供体染料或受体染料的身份不受特定限制，前提条件是选择供体染料和受体染料对以及接头使得供体染料可将能量转移至报道基因染料。
如本文所述的能量转移染料缀合物中的合适的荧光染料(即，供体染料和受体染料)可独立地为呫吨染料(例如，荧光素或罗丹明染料)、硅基罗丹明染料、花青染料、硼-二吡咯亚甲基(本文中称为“吡咯硼”)染料、嵌二萘染料或香豆素染料。在一些实施方案中，包括在ET缀合物中的花青染料是氮杂吲哚花青化合物(即，包括至少一个氮杂吲哚基团的花青化合物)。在一些实施方案中，包括在ET缀合物中的花青染料是氮杂吲哚(即，吡咯并吡啶)花青化合物(即，包括至少一个氮杂吲哚基团的花青化合物)。如本文所用，“氮杂吲哚”和“吡咯并吡啶”可互换使用，是指具有双环结构的杂环芳族有机化合物，该双环结构包括与吡啶环稠合的吡咯环。如本文所用，“氮杂吲哚花青”和“吡咯并吡啶花青”可互换使用，是指包括至少一个氮杂吲哚基团的花青化合物。某些氮杂吲哚花青化合物可包括一个或两个任选取代的氮杂吲哚基团。对于包括两个氮杂吲哚基团的化合物，这些氮杂吲哚基团可以是相同或不同的。可与本公开结合使用的染料的示例包括以下专利中描述的那些染料：美国专利号5,863,727、6,448,407、6,649,769、7,038,063、6,162,931、6,229,055、6,130,101、5,188,934、5,840,999、7,179,906、6,008,379、6,221,604、5,231,191、5,366,860、7,595,162、7,550,570、5,936,087、8,030,096、6,562,632、5,846,737、5,442,045、6,716,994、5,582,977、5,321,130、5,863,753、6,977,305、7,566,790、7,927,830、7,888,136、4,774,339、5,248,782、5,187,288、5,451,663、5,433,896、9,040,674、9,783,560、9,040,674、6,255,476、6,020,481、6,303,775和6,020,481，这些专利中的每一篇专利的公开内容全文以引用方式并入本文，因为这些专利涉及染料和用于将染料缀合到寡核苷酸的方法。
在一些实施方案中，供体染料或受体染料可以是花青染料，诸如美国专利号6,974,873中描述的。合适的花青包括具有式(I)的那些：
Figure SMS_17
其中，
每个R1’独立地为H或C1-C6烷基，其中C1-C6烷基中的每个氢原子独立地且任选地被一个或多个亲水性基团或含亲水性基团的部分(例如，-C1-C6烷基OH、-C1-C6烷基CO2H或烷基芳基)取代；
每个R2’独立地为H、C1-C6烷基、C1-C6烷基C6-C10芳基或C6-C10芳基，其中C1-C6烷基、C1-C6烷基C6-C10芳基或C6-C10芳基中的每个氢原子独立地且任选地被一个或多个亲水性基团或含亲水性基团的部分(例如，-C1-C6烷基OH、-C1-C6烷基CO2H或烷基芳基)取代；
每个R3’、R4’、R5’和R6’独立地为H、C1-C6烷基、C6-C10芳基、亲水性基团、含亲水性基团的部分或者R3’和R4’、R4’和R5’或R5’和R6’中的每一对，这些基团与它们所连接的碳原子一起独立地且任选地形成稠合六元芳环，该稠合六元芳环任选地被一个或多个亲水性基团或含亲水性基团的部分取代；并且
每个R7’或R8’独立地为H、C1-C6烷基、-C1-C6烷基SO3H、-C1-C6烷基SO3Z、-C1-C6烷基OH或-C1-C6烷基CO2H，
其中R1’、R2’、R7’或R8’中的一者包括如本文所公开的接头(L1、L2或L3)。
在一些实施方案中，供体染料或受体染料可以是罗丹明染料或其衍生物，诸如U.S.9,040,674或PCT/US2019/067925(现在为WO 2020/132487)中描述的；二氯罗丹明(例如，4,7-二氯罗丹明)，诸如美国专利号5,847,162中描述的；不对称罗丹明，诸如申请号PCT/US2019/068111No.(现在为WO 2020/132607)中描述的；或者硅基罗丹明，诸如申请号PCT/US2019/045697(现在为WO 2020/033681)中描述的。
可用作供体染料或受体染料的罗丹明染料的代表性类型描述于式(II)中：
Figure SMS_18
其中，
R1-R6单独地选自氢、氟、氯、低级烷基、低级烯烃、磺酸砜、氨基酰氨基、腈低级烷氧基、连接基团以及它们的组合；或者当合在一起时，R1和R6为苯并；或者当合在一起时，R4和R5为苯并；Y1-Y4单独地选自氢和低级烷基；或者当合在一起时，Y1和R2为丙基或丙烯基，并且Y2和R1为丙基或丙烯基；当合在一起时，Y3和R3为丙基或丙烯基，并且Y4和R4为丙基或丙烯基；X1-X5单独地选自氢、氯、氟低级烷基、羧酸酯、磺酸和连接基团；
X1为羧酸酯；
X2和X3为连接基团；
X4和X5为氯；并且
Y1-Y4单独地选自氢、甲基和乙基，并且Y2和R1以及Y4和R4合起来为丙基或丙烯基。
在一些实施方案中，供体染料或受体染料可以是式(III)的罗丹明染料：
Figure SMS_19
其中，
Ra、Rb和Rc各自彼此独立地选自氢、(C1-C4)烷基、(C6-C14)芳基、(C7-C20)芳基烷基、5元至14元杂芳基、6元至20元杂芳基烷基、-Rk或-(CH2)1-10-Rk；其中(C1-C4)烷基、(C6-C14)芳基、(C7-C20)芳基烷基、5元至14元杂芳基、6元至20元杂芳基烷基中的每个氢原子独立地且任选地被一个或多个亲水性基团或含亲水性基团的部分取代；
每个Rd和Re，当单独使用时，独立地选自氢、(C1-C4)烷基、(C6-C14)芳基、(C7-C20)芳基烷基、5元至14元杂芳基、6元至20元杂芳基烷基、-Rb或-(CH2)n-Rb；其中(C1-C4)烷基、(C6-C14)芳基、(C7-C20)芳基烷基、5元至14元杂芳基、6元至20元杂芳基烷基中的每个氢原子独立地且任选地被一个或多个亲水性基团或含亲水性基团的部分取代；
Rf、Rg、Rh、Ri和Rj中的每一者，当单独使用时，各自彼此独立地选自氢、(C1-C4)烷基、(C6-C14)芳基、(C7-C20)芳基烷基、5元至14元杂芳基、6元至20元杂芳基烷基、-Rb或-(CH2)n-Rb；其中(C1-C4)烷基、(C6-C14)芳基、(C7-C20)芳基烷基、5元至14元杂芳基、6元至20元杂芳基烷基中的每个氢原子独立地且任选地被一个或多个亲水性基团或含亲水性基团的部分取代；
每个Rk独立地选自卤素、-SRa-NH2、-NH2、全卤低级烷基、三卤甲基、三氟甲基、-P(O)(OH)2、-OP(O)(OH)2、-S(O)2OH、-C(O)H、-C(O)OH、-C(O)NH2、-C(S)NH2和-C(NH)NH2；
并且X2和X3可以是羧酸酯、磺酸盐、H或连接基团。
在一些实施方案中，供体染料或受体染料可以是硅基罗丹明染料(也称为“甲硅烷基罗丹明”)。硅基罗丹明染料的示例性结构具有式(IV)：
Figure SMS_20
其中，
R1”和R2”各自独立地为任选地被至少一个至少一个亲水性基团或含亲水性基团的部分、硫醚或取代的硫醚取代的C1-C6烷基；或者R1”和R2”与它们所连接的硅基一起形成环；
R3”为H、-COOH、-SO3Z、-C(O)NRN3RN4，
每个RN1独立地为H、C1-C4烷基、-C(O)R13”，或者RN1与其所连接的氮原子一起与R5”和/或R7”形成5元至7元杂环，其中C1-C4烷基或5元至7元杂环中的每个氢原子独立地且任选地被一个或多个亲水性基团或含亲水性基团的部分取代；
每个RN2独立地为H、C1-C4烷基、-C(O)R13”，或者RN2与其所连接的氮原子一起与R6”和/或R8”形成5元至7元杂环，其中C1-C4烷基或5元至7元杂环中的每个氢原子独立地且任选地被一个或多个亲水性基团或含亲水性基团的部分取代；
RN3和RN4中的每一者独立地为H、C1-C6烷基，或者RN3和RN4与它们所连接的氮原子一起形成5元至7元杂环基团，其中C1-C4烷基或5元至7元杂环中的每个氢原子独立地且任选地被一个或多个亲水性基团或含亲水性基团的部分取代，或者RN3和RN4独立地为接头；
R4”为H、-SO3Z、C1-C6烷基、氯或接头；
E为H、-SO3Z、C1-C6烷基、氯或接头；
R5”为H、C1-C6烷基，或者R5”与其所连接的碳原子一起与RN1形成5元至7元杂环，其中C1-C4烷基或5元至7元杂环中的每个氢原子独立地且任选地被一个或多个亲水性基团或含亲水性基团的部分取代；
R6”为H、C1-C6烷基，或者R6”与其所连接的碳原子一起与RN2形成5元至7元杂环，其中C1-C4烷基或5元至7元杂环中的每个氢原子独立地且任选地被一个或多个亲水性基团或含亲水性基团的部分取代；
R7”为H、C1-C6烷基，或者R7”与其所连接的碳原子一起与RN1形成5元至7元杂环，其中C1-C4烷基或5元至7元杂环中的每个氢原子独立地且任选地被一个或多个亲水性基团或含亲水性基团的部分取代；
R8”为H、C1-C6烷基，或者R8”与其所连接的碳原子一起与RN2形成5元至7元杂环，其中C1-C4烷基或5元至7元杂环中的每个氢原子独立地且任选地被一个或多个亲水性基团或含亲水性基团的部分取代；
R9”为H、-SO3Z、C1-C6烷基、氯或接头；
R10”为-CF3或-O-CH2-A1，其中A1为任选地被至少一个R11”取代的芳基或杂芳基；
R11”为C1-C6烷基或-OR12”；
R12”为H、甲基、乙酰基(Ac)、乙酰氧基甲基(AM)、-PO3M2、-PO3(R14”)2或糖苷；
R13”为
Figure SMS_21
R14”为乙酰氧基甲基；并且
R15”为-OR’,其中R’为乙酰基(Ac)、AM、PO3M2、PO3(R14)2或糖苷。
通常，R1”、R2”或R3”包括供体染料或受体染料的接头结构。
在一些实施方案中，供体染料或受体染料可以是荧光素或其衍生物。荧光素染料的示例性结构具有式(V)：
Figure SMS_22
其中，R1-R6单独地选自氢、氟、氯、苯基、低级烷基、低级烯烃、磺酸砜、氨基、酰氨基、腈低级烷氧基、连接基团以及它们的组合；或者当合在一起时，R1和R6为苯并；或者当合在一起时，R4和R5为苯并；并且R7选自乙炔、低级烷基、氰基、苯基和杂环芳族。
在一些实施方案中，R7为苯基：
Figure SMS_23
其中，X1-X5单独地选自氢、氯、氟、低级烷基、羧酸酯、磺酸或连接基团。在某些实施方案中，X1独立地为羧酸酯；X2或X3为连接基团；并且X4和X5为氯。
本文所公开的荧光染料可以受保护或未受保护的形式提供。各种染料(例如，罗丹明)以及它们未受保护的对应物可以是封闭的螺甾内酯形式。在某些实施方案中，染料以封闭的螺甾内酯形式提供。在某些实施方案中，染料以化合物的开放的酸形式提供。本文所公开的某些罗丹明染料的开放的酸形式相对于化合物的封闭的螺甾内酯形式可以是发出荧光的(或表现出荧光的增加)。因此，本文还提供了荧光化合物以及荧光标记的核酸探针和引物，它们包括具有脱保护的开放的内酯形式的化合物。
本文所述的能量转移染料缀合物可包括供体染料和受体染料的不同组合，这取决于期望的激发谱和/或发射谱。可用于ET缀合物中的染料的代表性类别包括其中供体染料或受体染料为呫吨染料(例如，荧光素或罗丹明)、花青染料、吡咯硼染料、嵌二萘染料、焦宁染料或香豆素染料的那些染料，其中受体染料是在比供体染料更长的波长下发射的化合物。尽管某些供体-受体染料组合在本文中被描述为适于构建FRET缀合物，但未明确描述的供体-受体组合的许多其他示例可使用本文所公开的化学物进行实施，得到FRET缀合物。
一种合适的组合包括作为供体染料的荧光素(例如，FAM或VIC)和作为受体染料的罗丹明。另一种合适的组合包括作为供体染料的香豆素(例如，香豆素343、ATTO 425或Pacific Blue)和作为受体染料的罗丹明。又一种合适的组合包括作为供体染料的荧光素和作为受体染料的花青。适用于本文所公开的ET缀合物中的受体染料的花青染料的示例包括但不限于以商品名ALEXA FLUOR从赛默飞世尔科技(Thermo Fisher Scientific)可商购获得的那些染料(例如，AF-647、AF-680、AF-700和AF-750)。在又一种合适的组合中，供体染料是罗丹明，并且受体染料是花青染料。在又一种合适的组合中，供体染料是罗丹明，并且受体染料是在比供体染料更长的波长下发射的罗丹明，例如TAMRA和ROX、甲硅烷基罗丹明或焦宁染料。在一些实施方案中，供体染料是花青染料(例如，AF-647)，并且受体染料是在比供体染料更长的波长下发射的化合物，诸如甲硅烷基罗丹明或花青。在一些实施方案中，受体染料是花青染料。例如，供体染料可以是FAM，并且受体染料可以是花青染料，具有如本文所述的取代基。在一些实施方案中，受体染料是NH-罗丹明，如本文所述。例如，供体染料可以是FAM，并且受体染料可以是NH-罗丹明。可用于本文所述的ET染料缀合物中的供体-受体染料对的附加示例列于表3中。
在一些实施方案中，如本文所述，供体染料或受体染料可在本文所述的染料结构中示出的位置中的任一个位置处具有一个或多个亲水性基团。在一些实施方案中，如本文所述，供体染料或受体染料可在本文所述的染料结构中示出的位置中的任一个位置处具有多个含亲水性基团的部分中的一个含亲水性基团的部分。
在一些实施方案中，每种染料可具有包括多个磺酸盐基团的结构。本领域中已知的是，磺酸盐基团可改善染料化合物在水性介质中的溶解度。在一些实施方案中，染料包括一个或多个反应性官能团或受保护的反应性官能团，用于将染料连接至另一种物质上。在一些实施方案中，如本领域已知的，染料以亚磷酰胺衍生物的形式提供，其可用于在自动化核酸合成期间将染料缀合至分子诸如寡核苷酸。
在一些实施方案中，本文所述的水溶性基团、亲水性基团、染料和ET染料具有总电子电荷。应当理解，当此类电子电荷被证明存在时，它们通过适当的抗衡离子的存在而平衡，该抗衡离子可能被明确地鉴定或可能不被明确地鉴定。当本文所述的水溶性基团、亲水性基团、染料或ET染料带正电时，抗衡离子是带负电的部分，通常选自但不限于氯离子、溴离子、碘离子、硫酸根、链烷磺酸根、芳基磺酸根、磷酸根、高氯酸根、四氟硼酸根、四芳基硼离子、硝酸根以及芳族或脂族羧酸的阴离子。当本文所述的水溶性基团、亲水性基团、染料或ET染料带负电时，抗衡离子是带正电的部分，通常地选自但不限于碱金属离子(诸如Li+、Na+、K+等)、铵或取代的铵(诸如NMe4 +、Pr2NHEt+等)，或吡啶鎓离子。在一些实施方案中，抗衡离子是生物相容的，不像所使用的那样有毒，并且对生物分子基本上没有有害作用。抗衡离子容易通过本领域熟知的方法改变，诸如离子交换色谱法或选择性沉淀。
应当理解，如本文所公开的染料已被绘制在一种或另一种特定的电子共振结构中。上述的每个方面同样适用于以其他允许的共振结构形式绘制的染料，因为主题染料上的电子电荷在整个染料自身中是不受位置限制的。
接头
在一些实施方案中，能量转移染料缀合物包括将供体染料共价连接至受体染料的接头。
接头的身份将部分取决于彼此连接的染料的身份。一般来讲，接头包括间隔基团，该间隔基团可包括对用于合成标记的生物分子(例如，寡核苷酸)的合成条件(诸如通常用于通过亚磷酸三酯法合成寡核苷酸的条件)稳定的原子或官能团的几乎任何组合，并且在结构上可以是直链、支链或环状的，或者可包括直链、支链和/或环状结构的组合。间隔基团在性质上可以是单体的，或者它在性质上可以是聚合物的区域或包括聚合物的区域。间隔基团可被设计成具有特定的特性，诸如在特定条件下切割的能力，或特定程度的刚性、柔性、疏水性和/或亲水性。
可用于制备如本文所公开的ET缀合物的接头的代表性示例可包括以下项中的一者或多者：烷基部分、氨基-亚烷基部分和氧基-亚烷基部分，以及氨基-亚烷基-二烷氧基部分、亚烯基部分、亚炔基部分、聚醚部分、亚芳基部分、酰胺部分或磷酸二酯部分。另选地，接头可以是共价键。
图4示出了能量转移染料缀合物的代表性类型，其包括通过接头与受体染料结合的供体染料。例如，供体染料可通过接头(诸如L1或L2)与受体染料结合。在某些实施方案中，染料缀合物包括将供体或受体染料(例如，D1)连接至分析物的接头(例如，L3)，并且还包括用于与受体或供体染料(D2)连接的附加接头(例如，L4)。如本文所述，可用于能量转移缀合物中的供体和受体染料的示例包括呫吨、花青、罗丹明、吡咯硼、嵌二萘、焦宁和香豆素染料。
在一些实施方案中，接头具有以下结构中的一者：
Figure SMS_24
Figure SMS_25
其中L1为第一接头，其中L1通过共价键或通过包含一个或多个居间原子的间隔区与D1、D2和A连接；
L2为第二接头，其中L2通过共价键或通过包含一个或多个居间原子的间隔区与D2和D3中的每一者连接；
L3为第三接头，其中L3通过共价键或通过包含一个或多个居间原子的间隔区与每个PO4H和D1连接；
L4为第四接头，其中L4通过共价键或通过包含一个或多个居间原子的间隔区与PO4H和D2连接；并且
A为分析物；
D1、D2和D3中的每一者可互换地为供体染料或受体染料；并且其中LI和LIII中的D1和D2与LII中的D2和D3的组合形成能量转移染料对。
在某些实施方案中，L1接头包括下式的亚芳基部分
Figure SMS_26
其中
每个R1独立地为-C1-C10烷基-N(R3)-*、-C2-C10烯基-N(R3)-*、-C2-C10炔基-N(R3)-*、-OC1-C10烷基-*、-C1-C10烷基-O-*、-N(R3)C1-C6烷基-*、-N(R3)C1-C6烷基-O-*、-OC1-C6烷基-N(R3)-*；或-N(R3)-*；
每个R2独立地为-C(O)N(R4)、-C1-C10烷基-C(O)N(R4)、-C2-C10烯基-C(O)N(R4)、-C2-C10炔基-R4、-C(O)N(R4)、-N(R3)-C(O)N(R4)、C1-C6烷基-O-C(O)N(R4)、-OC1-C6烷基-C(O)N(R4)、-N(R4)、卤素、-CO2 -Z+、-SO3R4或-SO3 -Z+；
每个R3独立地为H或C1-C6烷基；
每个R4独立地为H、C1-C6烷基或与A的连接点，其中与A的连接是通过共价键或通过包含一个或多个居间原子的间隔区；
每个*表示与D1或D2的连接点，其中与D1或D2的连接是通过共价键或通过包含一个或多个居间原子的间隔区；
Z+为阳离子(例如，Na+、K+或NH4 +)；
n为2、3或4；并且m为0、1、2、3或4，前提条件是n+m＝3至6。
在一些实施方案中，L1接头包括亚芳基部分和双烷基氨基部分或双羧基酰胺基部分中的一个或多个部分，其中L1接头还包括与A的连接点，其中与A的连接是通过共价键或通过包含一个或多个居间原子的间隔区。
L2接头可包括下式的亚芳基部分
Figure SMS_27
其中每个R1独立地为-C1-C10烷基-N(R3)-*、-C2-C10烯基-N(R3)-*、-C2-C10炔基-N(R3)-*、-OC1-C10烷基-*、-C1-C10烷基-O-*、-N(R3)C1-C6烷基*-、-N(R3)C1-C6烷基-O-*、-OC1-C6烷基-N(R3)-*；或-N(R3)-*；
每个R2独立地为-C(O)N(R3)-*、-C1-C10烷基-C(O)N(R3)-*、-C2-C10烯基-C(O)N(R3)-*、-C2-C10炔基-(R3)-*、-C(O)N(R3)-*、-N(R3)-C(O)N(R3)-*、C1-C6烷基-O-C(O)N(R3)-*,-OC1-C6烷基-C(O)N(R3)-*、-N(R3)-*、卤素、-CO2 -Z+或-SO3 -Z+；
每个R3独立地为H或C1-C6烷基；
每个*表示与D2或D3的连接点，其中与D2或D3的连接是通过共价键或通过包含一个或多个居间原子的间隔区；
Z+为阳离子(例如，Na+、K+或NH4 +)；
n为2、3或4；并且m为0、1、2、3或4，前提条件是n+m＝2至6。
在某些实施方案中，接头包括下式的片段
Figure SMS_28
其中每个R2、m和*如上文所定义。
L3接头可包括下式的片段。
Figure SMS_29
其中R5为H或C1-C6烷基；
n为2、3或4；X为O或CH2；
L4为与D2的连接，其中L4为共价键或包含一个或多个居间原子的间隔区；
R7为与PO3H-A的连接点，其中与PO3H-A的连接是通过共价键或通过包含一个或多个居间原子的间隔区；并且
其中*表示与D1的连接点，其中与D1的连接是通过共价键或通过包含一个或多个居间原子的间隔区。
在上文示出的能量转移染料缀合物中，L4接头可包括下式的磷酸二酯部分
Figure SMS_30
其中Y包括烷氧基部分、烷基部分、亚芳基部分或寡核苷酸部分中的一者或多者；
p为0至10的整数；
D2或A包含氧原子，其中每个*表示磷酸二酯部分与D2或A中的氧原子的连接点，其中磷酸二酯与D2或A中的氧原子的连接是通过共价键或通过包含一个或多个居间原子的间隔区。
在某些实施方案中，Y为C1-C10烷基或聚(亚烷基二醇)。
在某些实施方案中，L3和L4接头的组合可包括具有下式的结构：
Figure SMS_31
其中
R7包括与A连接的磷酸二酯基团，其中该磷酸二酯基团与磷酸二酯部分、烷氧基部分、氨基-烷基部分、烷氧基部分、烷基部分、聚醚部分或亚芳基部分中的一者或多者连接，
PAG为聚(亚烷基二醇)，其中该聚(亚烷基二醇)是或包括C2-C6直链或支链亚烷基链；n为2至6；并且p为1至4。
在一些实施方案中，PAG为戊乙二醇。
在上述接头结构中的任一个接头结构中，分析物(A)可以是生物分子，诸如核酸分子、肽、多肽、蛋白质和碳水化合物。
本文提供的不同接头结构各自具有它们自己的特定优点，并且适当接头设计的选择取决于用于形成ET缀合物的特定染料以及待与ET缀合物偶联的分析物的类型。接头L1(也称为“Y-接头”)可与特别大量的多种潜在供体染料和受体染料组合使用，因为L1不需要使用含双官能团的染料来形成与分析物以及与其ET配偶体的连接，如使用接头L2时所需要的。因为接头L1不需要染料带有第二官能团，所以任何一对染料NHS酯中可与Y-接头连接在一起。Y-接头结构的多功能性使不同供体染料和受体染料的用途变得普遍，从而促进了大量不同供体-受体对缀合物的构建。
接头L1的另一个优点是该接头包括第三官能团，该第三官能团可在构建ET缀合物后与探针或分析物连接。因此，ET缀合物可在添加到寡核苷酸探针或分析物之前制备和纯化。虽然在探针连接之前用L2接头(但不用接头L3)进行纯化也是可行的，但在探针连接之前纯化ET缀合物可提供显著改善的最终产物的产率和纯度。然而，具有与D1和D2的正交反应性连接位点的L2接头排除了在不使用附加选择性保护基团衍生作用的情况下使用L1产生的位置异构体的形成。
接头L3可容易地用于使用自动化偶联化学方法制备ET缀合物。但出于所有实际目的，接头L3需要至少一种染料亚磷酰胺偶联步骤。因此，使用接头L3偶联供体染料和受体染料需要至少有一种染料经历亚磷酰胺基团衍生化，并且优选两种染料都是。并非所有染料分子都能够容易地制成亚磷酰胺衍生物。因此，与L1相比，接头L3的通用性较低。尽管在使用受保护的亚磷酰胺接头衍生物添加染料之前首先将接头L3和L4连接至固体载体是可行的，但必须使用选择性脱保护化学方法和NHS偶联化学方法在两个二级偶联步骤中单独将染料添加到载体上的接头处。此类多步骤合成方案就不具备自动化的优点(例如，用较少的步骤和劳动达到高产率和纯度)，这些自动化的优点可通过在ET缀合物的合成中使用至少一种染料亚磷酰胺来实现。
能量转移染料的缀合物
在一个方面，本公开提供了能量转移染料缀合物，该能量转移染料缀合物包括如本文所述的一种或多种能量转移染料，该一种或多种能量转移染料与分析物共价连接。该分析物可以是例如寡核苷酸探针，直接或通过任选的接头共价连接。在一些实施方案中，本文所述的能量转移染料缀合物可直接或通过任选的接头与猝灭剂染料(Q)进一步共价连接。在一些实施方案中，猝灭剂染料(Q)与本公开的能量转移染料缀合物的寡核苷酸部分共价连接。
在一些实施方案中，形成能量转移染料缀合物的供体染料和受体染料与待缀合的分析物或物质之间的缀合反应，产生通过互补的Z基团和ZR基团来连接供体染料和受体染料以及所缀合的分析物的新键。互补反应性基团和键的合适示例在下文表1中示出，其中亲电基团与亲核基团的反应产生共价键。
表1—共价键的途径的示例
Figure SMS_32
共价键直接或通过任选的接头部分结合反应性基团Z以形成如本文所述的能量转移染料。应当理解，将能量转移染料缀合物共价连接至分析物(诸如寡核苷酸探针)的任选接头部分不受结构的特别限制。任选的接头部分可以是稳定化学键的组合，任选地包括单键、双键、三键或芳族碳-碳键，以及碳-氮键、氮-氮键、碳-氧键、磷-氧键。任选的接头部分可包括官能部分，诸如醚、硫醚、甲酰胺、磺酰胺、脲、氨基甲酸酯或肼部分。在一些实施方案中，任选的接头部分可包括1个至20个选自C、N、O、P和S的非氢原子，并且由醚、硫醚、胺、甲酰胺、磺酰胺、酰肼键和芳族键或杂芳族键的任何组合组成。在一些实施方案中，任选的接头部分可以是碳-碳单键和甲酰胺或硫醚键的组合。
在一些实施方案中，能量转移染料缀合物通过能量转移染料的接头部分与分析物诸如寡核苷酸探针共价连接。在一些实施方案中，能量转移染料缀合物通过能量转移染料缀合物的接头部分与分析物(诸如寡核苷酸探针)共价连接，该接头部分通过附加接头将能量转移染料接头部分连接至该分析物。在一些实施方案中，能量转移染料缀合物通过将分析物(诸如寡核苷酸探针)经由附加接头连接至供体染料或受体染料而与该分析物共价连接。在一些实施方案中，能量转移染料缀合物通过将分析物(诸如寡核苷酸探针)连接至供体染料或受体染料而与该分析物共价连接。
在一些实施方案中，能量转移染料缀合物经由分析物(诸如寡核苷酸探针)上的反应性官能团的共价键与该分析物共价连接。
应当理解，用于将能量转移染料缀合物连接至分析物的反应性基团的选择可以是待缀合的分析物上存在的官能团和/或所需共价键的类型或长度的函数。
用于将ET染料与分析物缀合的反应性基团是本领域技术人员熟知的。通常，反应性基团将与胺、硫醇、醇、醛或酮反应。在一些实施方案中，反应性基团与胺或硫醇官能团反应。在一些实施方案中，反应性基团为丙烯酰胺、反应性胺(包括尸胺或乙二胺)、羧酸的活化酯(通常是羧酸的琥珀酰亚胺酯)、酰基叠氮化物、酰基腈、醛、烷基卤化物、酸酐、苯胺、芳基卤化物、叠氮化物、氮丙啶、硼酸盐、羧酸、重氮烷、卤代乙酰胺、卤代三嗪、肼(包括酰肼)、酰亚胺酯、异氰酸酯、异硫氰酸酯、马来酰亚胺、亚磷酰胺、磺酰卤化物或硫醇。
在一些实施方案中，本文所述的ET缀合物可与核酸碱基、核苷、核苷酸或核酸聚合物连接，包括经修饰以具有用于连接能量转移染料缀合物的附加接头或间隔区(诸如炔基键、氨基烯丙基键或杂原子取代的接头或其他键)的那些缀合物。
在一些实施方案中，通过能量转移染料缀合物上的接头部分或通过供体染料或受体染料而将能量转移染料缀合物与分析物连接的附加接头部分包括以下项中的一者或多者：烷基部分、氨基-亚烷基部分和烷氧基部分，以及氨基-亚烷基-二烷氧基部分、亚烯基部分、亚炔基部分、聚醚部分、酰胺部分或亚芳基部分。
具有适当官能团的任何供体染料和受体染料可与本文所公开的接头连接。然而，在某些实施方案中，当接头包括烷基部分、聚醚部分和磷酸二酯部分时，能量转移染料缀合物不包括与罗丹明染料共价连接的荧光素染料。
在一些实施方案中，附加接头部分是取代或未取代的聚亚甲基、亚芳基、烷基亚芳基、亚芳基烷基或芳硫基。在一些实施方案中，附加接头部分包括下式的片段
Figure SMS_33
其中
R6为H或C1-C6烷基；
每个*表示附加接头部分与寡核苷酸以及能量转移染料缀合物的其余部分的连接点。
在一些实施方案中，附加接头部分包括下式的片段：-(CH2)d(CONH(CH2)e)z’-、-(CH2)d(CON(CH2)4NH(CH2)e)z′-、-(CH2)d(CONH(CH2)eNH2)z′-或-(CH2)d(CONH(CH2)eNHCO)z′-，其中d为0至5，e为1至5，并且z′为0或1。
在另一个实施方案中，分析物的缀合点可以是核苷或核苷酸类似物，其通过非环状间隔区将嘌呤或嘧啶碱基连接至磷酸酯或聚磷酸酯部分。
在一些实施方案中，能量转移染料缀合物可进一步缀合至核苷酸或核苷的碳水化合物部分，包括但不限于通过羟基、通过硫醇或通过氨基。在一些实施方案中，所缀合的核苷酸是核苷三磷酸腺苷或脱氧核苷三磷酸腺苷或双脱氧核苷三磷酸腺苷。应当理解，将亚甲基部分或者氮或硫杂原子掺入磷酸酯或聚磷酸酯部分中可能也是有用的。嘌呤和嘧啶非天然碱基(诸如7-脱氮杂嘌呤)以及含有此类碱基的核酸也可与如本文所述的能量转移染料缀合物偶联。通过使脱嘌呤核酸(例如，核糖衍生物)与胺、酰肼或羟胺衍生物反应而制备的核酸加合物提供了标记和检测核酸的附加手段。
在一些实施方案中，标记的核酸聚合物缀合物包括单链、双链或多链、天然或合成的DNA或RNA、DNA或RNA寡核苷酸、或DNA/RNA杂合体，或者掺入接头(诸如吗啉衍生的磷酸酯(AntiVirals,Inc.,Corvallis,OR))或肽核酸诸如N-(2-氨基乙基)甘氨酸单元。当核酸为合成的寡核苷酸(诸如寡核苷酸探针)时，寡核苷酸可含有约5个至约50个核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸含有约5个至约25个核苷酸。在一些实施方案中，提供了肽核酸(PNA)的能量转移染料缀合物。应当理解，肽核酸的此类能量转移染料缀合物由于其通常更快的杂交速率而可用于一些应用。
在一些实施方案中，荧光核酸聚合物可使用寡核苷酸引发的DNA聚合由标记的核苷酸或寡核苷酸制备，诸如通过使用聚合酶链反应或通过引物延伸，或通过末端转移酶催化将标记的核苷酸添加到核酸聚合物的3'末端。在一些实施方案中，荧光RNA聚合物通常通过转录由标记的核苷酸制备。在一些实施方案中，能量转移染料缀合物通过酰胺、酯、醚或硫醚键经由一个或多个嘌呤或嘧啶碱基连接；或者通过作为酯、硫酯、酰胺、醚或硫醚的键与磷酸酯或碳水化合物连接。在一些实施方案中，能量转移染料缀合物可同时用半抗原(诸如生物素或地高辛)或酶(诸如碱性磷酸酶)或蛋白质(诸如抗体)进行标记。在一些实施方案中，能量转移染料核苷酸缀合物可通过DNA聚合酶掺入并且可用于原位杂交和核酸测序。
在一些实施方案中，聚合物(诸如寡核苷酸和核酸聚合物)用至少一种能量转移染料缀合物生物进行标记，以形成能量转移探针。参见图5，示出了寡核苷酸探针1000，其包括与寡核苷酸1050连接的ET缀合物1010，其中ET缀合物1010包括通过接头1030与受体染料1040连接的供体染料1020。供体染料1020在适当波长的光下的激发可导致所吸收的能量转移至受体染料1040，随后由受体染料发射不同波长的光。取决于缀合物中供体染料和受体染料的物理和光学特性，接头1030的结构和组成(关于L1、L2和L3，如前所述)可被独特地定制，以使能量转移效率、量子产率和荧光强度最大化。
在一些实施方案中，生物聚合物(诸如寡核苷酸和核酸聚合物)用至少一种能量转移染料缀合物和至少一种无荧光染料进行标记，以形成能量转移探针。在一些实施方案中，无荧光染料是猝灭剂。图6描述了与如图5所示的ET缀合物1000结合的寡核苷酸探针，其中寡核苷酸1050与猝灭剂分子1060进一步结合。寡核苷酸探针可用于例如TaqMan测定中，其中它可被称为“检测器探针”。当猝灭剂接近ET缀合物1010中的受体染料1040时，供体染料1020在适当波长的光下的激发可导致所吸收的能量(称为ET1)转移至受体染料1040，从而导致抑制(即，猝灭)来自受体染料1040的荧光信号。
在一些实施方案中，所标记的探针用作酶底物，并且酶促水解破坏了能量转移染料缀合物与猝灭剂之间的能量转移。在一些实施方案中，核酸聚合酶的5'至3'核酸酶活性切割寡核苷酸，因此从它们的邻近位置释放能量转移染料缀合物和猝灭剂，从而通过猝灭剂去除或基本上去除由能量转移染料缀合物产生的荧光的猝灭效应(称为ET2)。图7示出了在探针置换和寡核苷酸1050的切割(例如，通过聚合酶)之后的图6中描述的寡核苷酸探针。一旦猝灭剂1060被置换并且不再接近ET缀合物1010的受体染料1040，就可恢复先前被猝灭剂1060抑制的来自受体染料1040的荧光信号。
在一些实施方案中，寡核苷酸与第一报道基因部分共价连接，其中该报道基因部分是ET染料缀合物。在一些实施方案中，ET染料缀合物包含第一供体染料和第一受体染料。在一些实施方案中，第一供体染料是第一荧光团，并且受体染料是第二荧光团。在一些实施方案中，寡核苷酸包括第一荧光团、第二荧光团和第一猝灭剂。在一些实施方案中，第一荧光团和第二荧光团通过本文所述的接头中的任一个接头共价连接。在一些实施方案中，第一荧光团和第二荧光团是不同的。在一些实施方案中，包括第一供体染料和第一受体染料的报道基因部分位于寡核苷酸的一个末端，并且第一猝灭剂部分位于相对的末端。在一些实施方案中，报道基因部分位于距寡核苷酸的一个末端的约5个核苷酸内，并且第一猝灭剂部分位于距寡核苷酸的相对末端的约5个核苷酸内。在一些实施方案中，报道基因部分位于距寡核苷酸的5'末端的5个核苷酸处或5个核苷酸内，并且猝灭剂部分位于距寡核苷酸的3'末端的5个核苷酸处或5个核苷酸内。在一些实施方案中，报道基因部分位于距寡核苷酸的3'末端的5个核苷酸处或5个核苷酸内，并且猝灭剂部分位于距寡核苷酸的5'末端的5个核苷酸处或5个核苷酸内。
猝灭剂
在一些实施方案中，猝灭剂是在一个或多个氨基氮原子处被芳族或杂芳族猝灭部分Q取代的3-和/或6-氨基呫吨的衍生物。在一些实施方案中，猝灭剂是dabcyl的衍生物。在一些实施方案中，猝灭剂是dabcyl。在一些实施方案中，猝灭剂具有式(Q1)：
Figure SMS_34
在一些实施方案中，所述猝灭化合物通常具有大于530nm的最大吸收，具有很少或没有可观察到的荧光，并且有效地猝灭广谱荧光，诸如由本文所公开的荧光团发射的荧光。在一些实施方案中，猝灭化合物是取代的罗丹明。在另一个实施方案中，猝灭化合物是取代的对甲氨基酚。在又一个实施方案中，猝灭剂是化学反应性化合物。化学反应性猝灭化合物具有标记多种物质(包括生物分子，诸如核酸)的实用性。这些标记物质对于多种能量转移测定和应用是十分有用的，特别是当与荧光团组合使用时。
如本文所用，每个猝灭部分Q为芳族或杂芳族环系，该猝灭部分具有1个至4个稠合的芳族或杂芳族环，通过单个共价键与氨基氮连接。当Q部分为完全芳族并且不含杂原子时，Q包括1个至4个稠合的六元芳环。当Q部分为杂芳族时，Q掺入至少一个5元或6元芳族杂环，该芳族杂环含有至少1个和多达4个选自O、N和S的任意组合的杂原子，该Q任选地与附加六元芳族环稠合，或与一个5元或6元杂芳族环稠合，该杂芳族环含有至少1个和多达3个选自O、N和S的任意组合的杂原子。
在一些实施方案中，每个Q部分在3-或6-氨基氮原子处经由单个共价键与呫吨化合物结合。在一些实施方案中，氨基氮取代基组合在一起式形成作为哌啶、吗啉、吡咯烷、吡嗪或哌嗪的5元或6元杂环，并且Q部分与邻近于呫吨氮的所得杂环稠合，以便在形式上经由单键与氨基氮结合。Q部分可与芳环或杂芳环处的氨基氮原子结合，前提条件是它在该环的碳原子处连接。
通常，Q部分为取代或未取代的苯基、萘基、蒽基、苯并噻唑、苯并噁唑或苯并咪唑。当氨基氮取代基形成5元或6元杂环并且Q部分与所得杂环稠合时，该杂环通常为吡咯烷环并且该Q部分通常为稠合的六元芳环。在一些实施方案中，Q为苯基或取代的苯基。
在各种实施方案中，每个Q部分任选且独立地被以下项取代：氢、卤素、氰基、磺基、磺基的碱金属盐或铵盐、羧基、羧基的碱金属盐或铵盐、硝基、烷基、全氟烷基、烷氧基、烷基硫基、氨基、单烷基氨基、二烷基氨基或烷基氨基。
在各种实施方案中，猝灭化合物具有式(Q2)
Figure SMS_35
其中K部分为O或N+R18aR19a。
在本文所述的猝灭化合物的各种实施方案中，R8a、R9a、R18a和R19a中的至少一者为Q部分。另选地，R8a与R9a组合在一起或R18a与R19a组合在一起形成作为哌啶或吡咯烷与Q部分稠合的饱和5元或6元杂环。通常，R8a和R9a中的一者以及R18a和R19a中的一者各自为Q部分，它们是相同或不同的。在另一个实施方案中，R8a、R9a、R18a和R19a中的每一者为Q部分，它们可以是相同或不同的。
R8a、R9a、R18a和R19a的其余部分独立地为H、C1-C6烷基、C1-C6羧基烷基、C1-C6磺基烷基、C1-C6羧基烷基的盐或C1-C6磺基烷基的盐，其中烷基部分任选地被以下项取代：氨基、羟基、羧酸、羧酸的盐或C1-C6烷基的羧酸酯。另选地，其中R8a与R9a组合或R18a与R19a组合，或者两者组合形成饱和5元或6元杂环，该杂环为哌啶、吗啉、吡咯烷、吡嗪或哌嗪，该杂环任选地被以下项取代：甲基、磺酸、磺酸的盐、羧酸、羧酸的盐或C1-C6烷基的羧酸酯。另选地，R8a与R2a组合、R9a与R3a组合、R18a与R4a组合或R19a与R5a组合中的一者或多者形成饱和或不饱和的并且任选地被一个或多个C1-C6烷基或-CH2SO3Xa取代的5元或6元环，其中Xa为H或抗衡离子。
在一些实施方案中，R1a和R6a为H，或者R1a与R2a组合或R6a与R5a组合中的一者或多者是稠合的六元芳环。
在一些实施方案中，取代基R2a、R3a、R4a和R5a独立地为H、F、Cl、Br、I、CN；或者C1-C18烷基或C1-C18烷氧基，其中每个烷基或烷氧基任选地被以下项进一步取代：F、Cl、Br、I、羧酸、羧酸的盐或C1-C6醇的羧酸酯；或者-SO3Xa。
在一些实施方案中，侧基R10a为H、CN、羧酸、羧酸的盐或C1-C6醇的羧酸酯。另选地，R10a为饱和或不饱和的、支链或非支链的C1-C18烷基，该烷基任选地被以下项取代一次或多次：F、Cl、Br、羧酸、羧酸的盐、C1-C6醇的羧酸酯、-SO3Xa、氨基、烷基氨基或二烷基氨基，其烷基具有1个至6个碳。在另一个实施方案中，R10a具有下式
Figure SMS_36
其中R12a、R13a、R14a、R15a和R16a独立地为H、F、Cl、Br、I、-SO3Xa、羧酸、羧酸的盐、CN、羟基、氨基、肼基、叠氮基；或者C1-C18烷基、C1-C18烷氧基、C1-C18烷基硫基、C1-C18烷酰基氨基、C1-C18烷基氨基羰基、C2-C36二烷基氨基羰基、C1-C18烷氧基羰基或C7-C18芳基甲酰胺基，其烷基或芳基部分任选地被以下项取代一次或多次：F、Cl、Br、I、羟基、羧酸、羧酸的盐、C1-C6醇的羧酸酯、-SO3Xa、氨基、烷基氨基、二烷基氨基或烷氧基，每一者的烷基部分具有1个至6个碳。另选地，一对相邻的取代基R13a和R14a、R14a和R15a或R15a和R16a组合在一起形成稠合的6元芳环，该芳环任选地被羧酸或羧酸的盐进一步取代。
这些化合物任选地被反应性基团(Rx)或缀合的分析物或物质(Sc)取代，该反应性基团或缀合的分析物或物质通过共价键L与化合物连接，如上文详细描述的。通常，化合物在R8a、R9a、R12a、R13a、R14a、R15a、R16a、R18a或R19a中的一者或多者处(例如在R12a-R16a中的一者处，或者在R12a、R14a或R15a处)被-L-Rx或-L-Sc部分取代，或者作为Q部分上的取代基。另选地，-L-Rx或-L-Sc部分作为烷基、烷氧基、烷基硫基或烷基氨基取代基上的取代基而存在。在一些实施方案中，恰好R8a、R9a、R12a、R13a、R14a、R15a、R16a、R18a或R19a中的一者为-L-Rx或-L-Sc部分。在另一个实施方案中，恰好R12a、R13a、R14a、R15a或R16a中的一者为-L-Rx或-L-Sc部分。在一些实施方案中，R12a、R14a和R15a中的一者为-L-Rx或-L-Sc部分。
在K部分为N+R18aR19a的实施方案中，化合物为罗丹明，并且具有式(Q3)：
Figure SMS_37
其中R8a、R9a、R18a和R19a中的至少一者为Q部分。在一些实施方案中，R8a和R9a中的至少一者为Q部分，并且R18a和R19a中的至少一者为Q部分，它们可以是相同或不同的。
在K部分为O的实施方案中，化合物为对甲氨基酚，并且具有式(Q4)：
Figure SMS_38
其中R8a和R9a中的至少一者为Q部分。
在一些实施方案中，速溶化合物具有式(Q5)：
Figure SMS_39
其中J为O-R7a或NR18aR19a，并且R1a-R19a中的每一者如上文所定义。
猝灭化合物的前体通常不用作猝灭剂，除非或者直到环系的芳香性恢复，如针对上述猝灭化合物而言。在这些前体中，R7a为H、C1-C6烷基、C1-C6羧基烷基、C1-C6磺基烷基、C1-C6羧基烷基的盐或C1-C6磺基烷基的盐，其中烷基部分任选地被以下项取代：氨基、羟基、羧酸、羧酸的盐或C1-C6烷基的羧酸酯。另选地，R7是通过从羧酸、磺酸、磷酸或单糖或多糖(诸如糖苷)中去除羟基而在形式上衍生的单价基团。
在一些实施方案中，R10a如先前所定义，并且R11a为H、羟基、CN或具有1个至6个碳的烷氧基。另选地，R10a与R11a组合形成5元或6元螺甾内酯环，或者R11a与R12a组合形成5元或6元螺甾内酯环，或5元或6元磺内酯环。
这些前体化合物通过化学方式、酶方式或光解方式容易地转化为完全缀合的猝灭化合物。通常，无色前体被-L-Rx部分取代，或者与分析物或物质(Sc)缀合。
示例性猝灭剂化合物包括但不限于以下：
Figure SMS_40
Figure SMS_41
在一些实施方案中，猝灭剂为
Figure SMS_42
在一些实施方案中，猝灭剂包括一个或多个磺酸酯或SO3H取代基，例如
Figure SMS_43
本文还提供了与如本文所公开的ET缀合物偶联的寡核苷酸探针，该ET缀合物与猝灭剂进一步偶联，其中该猝灭剂为二苯并呫吨化合物。在某些实施方案中，二苯并呫吨化合物为亚氨基二苯并呫吨化合物，诸如取代的3-亚氨基-3H-二苯并[c,h]呫吨-11-胺化合物。
可用于制备与本文所述ET缀合物偶联的寡核苷酸探针的猝灭剂的具体示例提供于表2中。
表2—猝灭剂化合物的示例
Dabcyl QSY7 BHQ1 BBQ Iowa Black FQ DYQ-1
Dabsyl QSY21 BHQ2 QC-1 Iowa Black RQ DYQ-2
Eclipse IRDye QC-1 BHQ3 DYQ-660 QYQ-700 DYQ-3
反应性化合物的缀合物
在一些实施方案中，化合物(猝灭化合物或前体化合物)被至少一个基团-L-Rx取代，其中Rx为通过共价键L与化合物连接的反应性基团，如上完关于染料详细描述的。具有反应性基团(Rx)的化合物标记多种有机物质或无机物质，这些物质包含具有合适反应性的官能团或者经修饰以包含具有合适反应性的官能团，导致所缀合的分析物或物质(Sc)的化学连接，用-L-Sc表示。
在一些实施方案中，所缀合的分析物或物质(Sc)是天然或合成的核酸碱基、核苷、核苷酸或核酸聚合物，包括受保护或经修饰以具有用于连接化合物的附加接头或间隔区的那些，诸如炔基键、氨基烯丙基键或其他键。在一些实施方案中，所缀合的核苷酸是核苷三磷酸腺苷或脱氧核苷三磷酸腺苷或双脱氧核苷三磷酸腺苷。
示例性核酸聚合物缀合物是标记的、单链、双链或多链的、天然或合成的DNA或RNA、DNA或RNA寡核苷酸、或DNA/RNA杂交体，或掺入不常见的接头(诸如吗啉衍生的磷酸酯)或肽核酸(诸如N-(2-氨基乙基)甘氨酸单元)。当核酸是合成的寡核苷酸时，其通常包含少于50个核苷酸，更通常少于25个核苷酸。较大的核酸聚合物通常使用寡核苷酸引发的DNA聚合由标记的核苷酸或寡核苷酸制备，诸如通过使用聚合酶链反应或通过引物延伸，或者通过末端转移酶催化将标记的核苷酸添加到核酸聚合物的3′末端。通常，化合物通过酰胺、酯、醚或硫醚键经由一个或多个嘌呤或嘧啶碱基连接；或者通过作为酯、硫酯、酰胺、醚或硫醚的键与磷酸酯或碳水化合物连接。另选地，化合物通过化学后修饰(诸如用铂试剂)或使用可光活化分子(诸如缀合的补骨脂素)与核酸聚合物结合。在一些实施方案中，猝灭部分经由亚磷酰胺反应性基团与核苷酸、寡核苷酸或核酸聚合物连接，产生磷酸二酯键。
猝灭化合物可接受来自多种荧光团的能量，前提条件是猝灭化合物和荧光团足够紧密接近以发生猝灭，并且在荧光团的发射波长与猝灭化合物的吸收带之间发生至少一些光谱重叠。这种重叠可随着在比猝灭化合物的最大吸收波长更低或甚至更高的波长发射最大值处发生供体的发射时而发生，前提条件是存在足够的光谱重叠。在一些实施方案中，猝灭化合物是仅弱荧光的或者基本上无荧光的，使得能量转移导致很少或没有荧光发射。在一个方面，猝灭化合物是基本上无荧光的并且具有小于约0.05的荧光量子产率。在另一个方面，猝灭化合物具有小于约0.01的荧光量子产率。在又一个方面，猝灭化合物具有小于约0.005的荧光量子产率。
应当容易理解，能量转移的程度以及因此猝灭的程度高度依赖于报道基因部分(例如，荧光团)与猝灭部分之间的分离距离。在分子系统中，荧光猝灭的变化通常与荧光团分子和猝灭化合物分子之间的分离距离的变化密切相关。具有足够的光谱重叠和与猝灭化合物接近的荧光团一般是用于本文所设想的各种应用的合适供体。重叠和接近的程度越大，总体猝灭的可能性就越大。
在一些实施方案中，通过观察荧光团的荧光的部分或完全恢复来检测包括所述荧光团和猝灭剂的分子结构的分解、裂解或其他降解。在一些实施方案中，与该结构缔合的荧光团的荧光的最初猝灭在通过二级结构的改变、分子结构的分解、裂解或降解而在与猝灭化合物紧密接近时变成去猝灭。猝灭化合物任选地与和荧光团相同的分子结构缔合，或者供体和受体与该结构的相邻但不同的亚基缔合。以下系统等可使用所述能量转移对进行分析，以检测和/或定量结构的分解：使用荧光生成底物检测蛋白酶活性(例如HIV蛋白酶测)；检测酶介导的蛋白质修饰(例如，碳水化合物/脂肪酸、磷酸酯、辅基的裂解)；免疫测定法(经由置换/竞争性测定)；DNA双链体解旋的检测(例如，解旋酶/拓扑异构酶/促旋酶测定)；核酸链置换；ds DNA熔解；核酸酶活性；脂质分布和转运；和TaqMan测定。
当缀合的分析物暴露于感兴趣的降解条件下保持足以发生降解的一段时间时，通常通过观察荧光的部分或完全恢复来检测结构分解。荧光的恢复表明荧光团和猝灭化合物之间的分离距离的增加，从而导致所缀合的分析物的降解。可在生物测定期间监测结构变化(例如，使用聚合酶或其他酶促分解切割机制)，并且分解的程度可提供关于所研究的生物系统的有价值的信息。
探针
在一些实施方案中，本文所述的能量转移染料缀合物可以是用于在实施多重激发和多重发射(即，检测)通道的PCR中检测的报道基因染料，诸如涉及以下的那些报道基因染料：在约480+/-10nm(蓝色)处激发和在约587+/-10nm(黄色/橙色)处的检测通道、在约480+/-10nm(蓝色)处激发和在约623+/-14nm(橙色/红色)处的检测通道、在约550+/-10nm(绿色)处激发和在约682+/-14nm(红色)处的检测通道、或在约550+/-10nm(绿色)处激发和在约711+/-12nm(红色)处的检测通道。在一些实施方案中，本文所述的能量转移染料缀合物可以是用于在实施7th、8th、9th、10th等报道基因染料的PCR中检测的报道基因染料。在一些实施方案中，附加报道基因染料，诸如7th、8th、9th、10th等报道基因染料，可以亚磷酰胺前体的形式提供。应当理解，报道基因染料的亚磷酰胺前体可促进高质量和低成本的PCR探针的合成。在一些实施方案中，可将所述探针作为较高波长(诸如5th、6th、7th、8th等探针)包括在多重PCR测定中。在一些实施方案中，测定还可包括具有染料/猝灭剂组合的探针，其中猝灭剂可以是本领域技术人员已知的那些猝灭剂中的任一种猝灭剂，包括例如Dabcyl、Dabsyl、EclipseTM猝灭剂、QSY7、QSY21和Black Hole猝灭剂1、2和3(对于附加示例还可参见表2)。在一些实施方案中，所述探针在3'端处包含小沟结合剂(MGB)部分，这提高了探针的熔解温度(Tm)并且使探针靶杂交体稳定。在一些实施方案中，探针中MGB或锁核酸(LNA)的使用允许该探针比传统探针更短，这能够提供更好的序列鉴别和灵活性以适应更多靶标。
在一些实施方案中，所述探针包含如本文所述的能量转移染料缀合物中的一种能量转移染料缀合物(作为荧光团)和本文所述的猝灭剂中的一种猝灭剂，其中该荧光团和该猝灭剂各自与寡核苷酸共价缀合。适于多重PCR应用的探针的示例可包括如本文所述的能量转移染料缀合物，其在光谱区域中发射以用于在包括多个激发和发射通道的PCR仪器的一个或多个发射通道中检测。在一些实施方案中，包括如本文所述的能量转移染料缀合物的此类探针是可用于检测互补靶核酸分子的检测器探针。
所述探针可根据本领域已知的方法合成。例如，在一些实施方案中，使用上述缀合化学物和反应性基团使荧光团和猝灭剂与寡核苷酸的末端共价缀合。在另一个示例中，猝灭剂或探针可与固体载体缀合，并且使用标准寡核苷酸合成方法(诸如DNA合成器)从所连接的猝灭剂或探针合成寡核苷酸，然后将猝灭剂或探针中的另一者与所合成的寡核苷酸的末端共价连接。
方法和试剂盒
本文还提供了制备能量转移缀合物以及将此类缀合物连接至生物分子(例如，寡核苷酸)的方法。用于制备包括接头L1-L4的能量转移缀合物的合成路线的示例描述于图21、图22和图23中。本公开提供了可用于化学合成与ET缀合物连接的寡核苷酸的试剂。在某些实施方案中，本文所述的独特接头策略允许使用本领域熟知的自动化固相合成技术将ET缀合物连接至寡核苷酸，并且可在不使用HPLC的情况下进行纯化。
本文还提供了在生物测定中使用荧光能量转移缀合物的方法和用于执行此类测定的试剂盒。例如，本文提供的能量转移染料缀合物可用于实时和终端PCR测定中。可被激发并在宽波长范围内发射的荧光ET缀合物可被制备。通过调整供体染料、受体染料和分析物之间的接头的类型和长度，可调谐所得缀合物的光学特性以提供精确的激发谱和发射谱。因为缀合物可被调制以适合期望的激发谱和发射谱，所以缀合物在构建单独或与一种或多种其他荧光团组合用于多重生物测定(例如，qPCR测定)的寡核苷酸探针中是特别有用的。
因此，在另一个方面，本文所述的ET转移染料缀合物可用于实施多重测定。具有适当激发谱和发射谱的任何荧光ET缀合物可用于实施此类多重测定。各种制造商提供了能够检测多重PCR测定的仪器。作为一个示例，赛默飞世尔科技(Waltham,MA)提供了用于在赛默飞世尔科技仪器(诸如Vii7、Quant Studio等)上实时检测核酸靶标的4重TaqMan测定，其中某些实时qPCR仪器具有运行高达6重TaqMan测定的光学能力。
本文所提供的独特ET缀合物允许将qPCR测定扩展超过6重，例如7重、8重、9重、10重等。
因此，在另一个方面，提供了使用所述ET缀合物执行单重或多重PCR(诸如qPCR或终端PCR)的方法。终端PCR是在完成PCR的所有循环后的分析。不同于允许随着模板加倍(指数期)而定量的qPCR，终端分析基于扩增的平台期。
具体地，用于扩增和检测多个靶DNA序列的方法包括提供包含所述探针的组合物或反应混合物，使反应混合物经受热循环方案从而使得所述多个靶序列的扩增能够发生，以及通过在多个扩增循环期间对所述探针的荧光进行至少一次检测来监测扩增。在一些实施方案中，该方法包括5重或6重的多重qPCR测定，其中所述探针允许检测第5核酸靶标和/或第6核酸靶标。在一些实施方案中，该方法包括7重或8重的多重qPCR测定，其中这些探针使用本文所述的允许检测第7核酸靶标和/或第8核酸靶标的ET报道基因。在一些实施方案中，该方法包括9重或10重的多重qPCR测定，其中所述探针允许检测9个或10个核酸靶标。本文所述的ET缀合物可用于更高阶的多重测定中。例如，使用本文所述的ET缀合物可促进用于评估6个至20个(例如，6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个和20个)或更多个核酸靶标的多重测定。在一些实施方案中，该方法包括高达6重的多重qPCR测定，其中所述探针允许检测6个核酸靶标。在一些实施方案中，该方法包括高达10重的多重qPCR测定，其中所述探针允许检测10个核酸靶标。在一些实施方案中，该方法包括高达20重的多重qPCR测定，其中所述探针允许检测20个核酸靶标。在一些实施方案中，该方法包括用于5重至高达30重的多重qPCR测定(或其间的任何重)的足够测定，其中所述探针以允许检测介于5个至30个之间或介于其间的任何数量的核酸靶标的方式提供。
本文所述的ET转移染料缀合物可用于实施多重测定。具有适当激发谱和发射谱的任何荧光ET缀合物可用于实施此类多重测定。在某些实施方案中，供体染料具有约450nm至约580nm的激发最大值，并且受体染料具有约580nm至约750nm的发射最大值。可用于制备ET染料缀合物的供体和报道基因的代表性示例及其相关的激发和发射波长在表3中示出，这些ET染料缀合物使用本文所述的接头以用于实施多重qPCR测定。
表3—供体染料和报道基因染料的示例
Figure SMS_44
可选择适当的接头以使供体染料与受体染料之间的能量转移效率最大化。在某些实施方案中，供体染料是通过具有结构(LI)的接头与罗丹明受体染料、焦宁或花青受体染料共价连接的荧光素或罗丹明染料。在其他实施方案中，供体染料是通过具有结构(LII)的接头与罗丹明、焦宁或花青受体染料共价连接的荧光素或罗丹明染料。在其他实施方案中，供体染料是通过具有结构(LIII)的接头与罗丹明受体染料共价连接的荧光素或罗丹明染料。在其他实施方案中，供体染料是通过具有结构(LIII)的接头与焦宁或花青受体染料共价连接的荧光素或罗丹明染料。在这些实施方案的任何实施方案中，接头(LI)、(LII)或(LIII)可以是供体，并且受体染料可与分析物(例如，寡核苷酸或蛋白质)进一步连接。
信号的检测可使用对来自荧光团的荧光变化进行检测的任何试剂或仪器来完成。例如，可使用任何分光光度热循环仪执行检测。分光光度热循环仪的示例包括但不限于Applied Biosystems(AB)
Figure SMS_45
7000、AB 7300实时PCR系统、AB 7500实时PCR系统、AB
Figure SMS_46
7900HT、Bio-Rad Cycler IQTM、Cepheid
Figure SMS_47
II、Corbett ResearchRotor-Gene 3000、Idaho Technologies R.A.P.I.D.TM、MJ Research Chromo 4TM、RocheApplied Science
Figure SMS_48
Roche Applied Science
Figure SMS_49
2.0、StratageneMx3000PTM和Stratagene Mx4000TM。
可用于将染料组扩展至超过10重的染料的代表性示例包括但不限于：供体染料是香豆素343，并且受体染料是FAM。在一些实施方案中，供体染料是ATTO 425(ATTO-Tec,GmbH)，并且受体染料是FAM。在一些实施方案中，供体染料是Pacific Blue(赛默飞世尔科技)，并且受体染料是FAM。在一些实施方案中，供体染料是ATTO 425，并且受体染料是FAM。在一些实施方案中，供体染料是ALEXA FLUOR 405，并且受体染料是FAM。在一些实施方案中，供体染料是香豆素343，并且受体染料是VIC。在一些实施方案中，供体染料是ATTO 425，并且受体染料是VIC。在一些实施方案中，供体染料是Pacific Blue，并且受体染料是VIC。在一些实施方案中，供体染料是ATTO 425，并且受体染料是VIC。在一些实施方案中，供体染料是Alexa Fluor 405，并且受体染料是VIC。类似地，染料基质可扩展至包括报道基因染料，这些报道基因染料包括在m6发射通道上方发射的受体，诸如花青染料，诸如Cy 7(GEHealthcare)、氮杂吲哚啉花青染料、Alexa Fluor 750或甲硅烷基罗丹明。在某些实施方案中，供体染料是罗丹明或花青染料，并且报道基因染料是在光谱的远红区域或近IR区域中发射的花青染料(例如，氮杂吲哚啉花青染料)。
所述方法的核酸靶标可以是本领域技术人员已知的任何核酸靶标。此外，靶标可以是低突变区域或高突变区域。例如，本文所公开的方法的一个特别有价值的用途涉及靶向高度突变的核酸(诸如RNA病毒基因)或具有高遗传变异性的区域(诸如单核苷酸多态性(SNP))。在一些实施方案中，靶标可被片段化或降解，诸如来自法医样品和/或固定(例如，通过福尔马林)组织的材料。靶标可具有适于扩增的任何尺寸。本文提供的方法和组合物的一个特别有价值的用途涉及鉴定短片段，诸如siRNA和miRNA。另一个特别有价值的用途是用于可能具有片段化和/或降解的核酸的样品，诸如固定的样品或已经暴露于环境的样品。因此，这些方法可用于例如活检组织和法医DNA样品。靶标可以是纯化的或未纯化的。靶可以是在体外产生的(例如，cDNA靶标)，或者可以是在生物样品中发现的(例如，RNA或基因组DNA(gDNA)靶标)。生物样品可在无需处理的情况下被使用，或者生物样品可经处理以去除可能干扰本文所公开的方法的物质。
其中可存在核酸靶标的样品包括，例如，从哺乳动物或非哺乳动物生物体(例如，包括但不限于植物、病毒、噬菌体、细菌和/或真菌)获得的组织、细胞和/或流体(例如，循环、干燥、重构)样品。在一些实施方案中，样品可来源于例如哺乳动物唾液、口腔上皮细胞、面颊组织、淋巴液、脑脊髓液、皮肤、毛发、血液、血浆、尿液、粪便、精液、肿瘤样品(例如，癌细胞/组织)、培养的细胞和/或培养的肿瘤细胞。靶多核苷酸可以是基因组形式的DNA，或者它可被克隆在质粒、噬菌体、细菌人工染色体(BAC)、酵母人工染色体(YAC)和/或其他载体中。其他类型的样品也可用于本文所述的方法中，这些样品可与例如诊断或法医测定相关。在一些实施方案中，本文所述的探针可用于检测病毒DNA序列。
本文提供的探针可用于诊断方法，例如SNP检测、特异性生物标志物的鉴定等，由此探针与感染性疾病病原体(例如，人类疾病的感染性疾病病原体，包括但不限于病毒、细菌、寄生虫和真菌)的序列(例如，基因组)互补，从而诊断来自患者的具有核酸的样品中感染性病原体的存在。靶核酸可以是基因组DNA(gDNA)、cDNA或RNA，诸如mRNA、siRNA或miRNA；或者人或动物的合成DNA；或者微生物等的合成DNA。在其他实施方案中，探针可用于诊断或预后并非由感染性病原体引起的疾病或障碍。例如，探针可用于通过鉴定感染性病原体(诸如病毒)或宿主、突变、多态性或等位基因在来自人或动物的样品中的存在，从而诊断或预后癌症、自身免疫性疾病、精神疾病、遗传障碍等。在一些实施方案中，探针包括突变或多态性。附加地，探针可用于评估或跟踪感染、疾病或障碍的治疗的进展。
还提供了包含所述探针的组合物，诸如反应混合物或主混合物。在一些实施方案中，用于PCR(诸如用于实时或定量PCR或终端PCR)的组合物包含所述探针中的至少一种探针。在一些实施方案中，用于PCR(例如，qPCR或终端PCR)的组合物或反应混合物或主混合物包含以下探针：允许检测至少4种靶核酸的探针以及允许检测第5靶核酸和/或第6靶核酸中的至少一者的所述探针；所述探针中的至少一种探针由ET供体染料和ET受体染料组成，其中荧光团具有介于约650nm至720nm之间的发射最大值。如本文所述的受体的吸收最大值介于660nm至668nm之间。如本文所述的猝灭剂的吸光度范围为530nm至730nm。在一个另选实施方案中，提供标记试剂用于将所述荧光团和猝灭剂缀合至选择的寡核苷酸。
另外，此类组合物或反应混合物或主混合物可包含选自以下列表的一种或数种化合物和试剂：适用于聚合酶链反应的缓冲液、脱氧核苷三磷酸腺苷(dNTP)、具有5'至3’核酸外切酶活性的DNA聚合酶、至少一对或数对扩增引物和/或附加探针、尿嘧啶DNA糖基化酶、PCR抑制剂阻断剂(诸如明胶和白蛋白混合物的组合)、热启动组分和/或修饰物、至少一种盐(诸如氯化镁和/或氯化钾)、参比染料和至少一种洗涤剂。适于包含在本文所公开的组合物、反应混合物和主混合物中的其他化合物和试剂可由本领域技术人员设想。
在一些实施方案中，如本文所述的组合物或主混合物可包含以下组分：包含如本文所述的探针，适于冻干(例如，“冻干就绪”)、已经处于冻干形式和/或以其他方式稳定(例如，冷冻干燥)、干燥或制备成蒸发的组合物或组分。
在某些实施方案中，提供了可用于使用本文提供的寡核苷酸进行杂交、延伸和扩增反应的试剂盒。优选的试剂盒可包括一个或多个容器，诸如小瓶、管等，该一个或多个容器被构造成含有用于本文所述的方法中的试剂，并且任选地可含有使用此类试剂的说明书或方案。本文所述的试剂盒可包括选自以下项的一种或多种组分：本文所述的一种或多种寡核苷酸(包括但不限于本文所述的一种或多种探针)和聚合酶。在其他实施方案中，试剂盒还可包括一种或多种引物。
在又一个方面，提供了包括所述探针中的至少一种探针的试剂盒。另外，试剂盒可包括选自以下列表的一种或数种其他化合物和试剂：适用于聚合酶链反应的缓冲液、脱氧核苷三磷酸腺苷(dNTP)、具有5'至3'核酸外切酶活性的DNA聚合酶、至少一对或多对扩增引物。试剂盒还可包括内参DNA或标准品。上文公开的组分中的每一者可储存在单个储存容器中，并且单独包装或一起包装。然而，用于储存在同一容器内的组分的任何组合也是可能的。在一些实施方案中，可将包括在试剂盒中的探针和/或其他组分冻干或以其他方式稳定以用于储存和/或运输，并且由使用者根据需要进行重构。还可包括试剂盒的使用说明。
本文提供的另一个方面是一种通过聚合酶链反应(PCR)(诸如通过定量实时聚合酶链反应(qPCR))来检测或定量样品中的靶核酸分子的方法。在一些实施方案中，该方法包括：(i)使包含一种或多种靶核酸分子的样品与a)至少一种探针(诸如本文所述的那些)接触，该至少一种探针对该靶核酸分子具有序列特异性，其中该至少一种探针在扩增该一种或多种靶核酸分子时经历可检测的荧光变化；以及与b)至少一种寡核苷酸引物对接触；(ii)在足以扩增该一种或多种靶核酸分子的条件下将步骤(i)的混合物与DNA聚合酶一起孵育；以及(iii)通过测量该探针的荧光来检测所扩增的靶核酸分子的存在或不存在，或者定量所扩增的靶核酸分子的量。在一些实施方案中，探针是水解探针，诸如TaqMan探针。
本文提供的另一个方面是一种用于PCR诸如定量实时聚合酶链反应(qPCR)的试剂盒。在一些实施方案中，该试剂盒包括探针(诸如本文所述的那些)、用于进行PCR的说明书以及以下项中的一者或多者：缓冲剂、脱氧核苷三磷酸腺苷(dNTP)、有机溶剂、酶、酶辅因子和酶抑制剂。在附加方面，本文提供了组合物，诸如用于PCR的“主混合物”，其包含所述探针以及用于PCR的其他组分。如本文所用的术语“扩增反应混合物”和/或“主混合物”是指包含用于扩增靶核酸的各种(一些或全部)试剂的水性溶液。此类反应还可使用固体载体(例如，阵列)执行。这些反应还可由使用者根据需要以单一形式或多重形式执行。这些反应物通常包括酶、水性缓冲液、盐、扩增引物、靶核酸和核苷三磷酸腺苷。根据上下文，混合物可以是完全或不完全的扩增反应混合物。用于扩增靶核酸的方法可以是本领域技术人员可获得的任何方法。可使用用于扩增核酸的靶序列拷贝的任何体外方法。这些方法包括线性、对数和/或任何其他扩增方法。虽然本公开内容一般可论述PCR作为核酸扩增反应，但预期本文所述的经修饰的洗涤剂在其他类型的核酸扩增反应中应是有效的，包括聚合酶介导的扩增反应(诸如解旋酶依赖性扩增(HDA)、重组酶聚合酶扩增(RPA)和滚环扩增(RCA))以及连接酶介导的扩增反应(诸如连接酶检测反应(LDR)、连接酶链反应(LCR)和各自的间隙版本)两者，以及核酸扩增反应(诸如LDR和PCR)的组合(参见例如美国专利号6,797,470)。例如，经修饰的洗涤剂可用于例如各种连接介导的反应中，其中例如采用连接探针而不是PCR引物。附加示例性方法包括聚合酶链反应(PCR；参见例如美国专利号4,683,202；4,683,195；4,965,188；和/或5,035,996)、等温程序(使用一种或多种RNA聚合酶(参见例如PCT公开号WO2006/081222)、链置换(参见例如美国专利号RE39007E)、引物分子的部分破坏(参见例如PCT公开号WO 2006/087574))、连接酶链反应(LCR)(参见例如Wu等人,Genomics 4:560-569(1990))，和/或Barany等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:189-193(1991))、Q～RNA复制酶系统(参见例如PCT公开号WO 1994/016108)、基于RNA转录的系统(例如，TAS、3SR)、滚环扩增(RCA)(参见例如美国专利号5,854,033；美国专利申请公开号2004/265897；Lizardi等人,Nat.Genet.19:225-232(1998)；和/或Barrer等人,Nucleic Acid Res.,26:5073-5078(1998))，以及链置换扩增(SDA)(Little等人,Clin.Chem.45:777-784(1999))，等等。这些系统连同本领域技术人员可获得的许多其他系统可适用于聚合和/或扩增如本文所述使用的靶核酸。
在一些实施方案中，制备使主混合物得其在用于PCR之前需要小于3倍稀释，例如2倍稀释、1.5倍稀释、1.2倍稀释等。在一些实施方案中，如本文所述的组合物或主混合物包含稳定组分，或者能够被处理以提供用于储存和/或运输的稳定。例如，可将主混合物制备成在以下条件稳定的组合物：在-20℃下大约两年；在4℃下大约一年；在室温下大约三至六个月；以及/或者在高于室温的温度下大约一至两个月。在一些实施方案中，本文提供的组合物或主混合物是干燥的(例如冻干的)或在水或TE缓冲液的溶液中。本文所述的试剂盒还可包括用于使冻干的或以其他方式稳定的组合物重构的缓冲液等(例如，通过添加水或缓冲液诸如TE或Tris)。
聚合酶
如本文所公开，组合物、反应混合物和试剂盒还可包括至少一种聚合酶(例如，DNA聚合酶)和核苷酸的至少一种来源(例如，dNTP)。聚合酶可以是具有5'至3'核酸外切酶活性的DNA聚合酶。在一些实施方案中，聚合酶可以是“热稳定聚合酶”，该聚合酶是指热稳定的、耐热的并且/或者在扩增期间当经受升高的温度保持单链核酸去稳定化或双链核酸变性所必需的时间时不会可逆失活的酶(例如，在约90℃至约100℃将不会发生不可逆地变性，诸如在扩增(例如，在聚合酶链反应(PCR)中)通常所需的条件下)，并且该酶催化脱氧核糖核苷酸的聚合以形成与靶多核苷酸链互补的引物延伸产物。热稳定聚合酶可例如使用本领域普通技术人员熟知的方法(参见例如美国专利号6,245,533)从可公开获得的多种嗜热细菌(例如，来自马里兰州罗克维尔的美国典型培养物保藏中心)获得。细菌细胞可根据标准微生物技术使用本领域普通技术人员熟知的适用于生长特定物种的活性培养物的培养基和孵育条件(参见例如Brock,T.D.和Freeze,H.,J.Bacteriol.98(1):289-297(1969)；Oshima,T.和Imahori,K,Int.J.Syst.Bacteriol.24(1):102-112(1974))进行生长。以下嗜热细菌适于用作热稳定聚合酶的来源：水生栖热菌(Thermus aquaticus)、嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)、嗜热球菌(Thermococcus litoralis)、激烈热球菌(Pyrococcusfuriosus)、沃氏热球菌(Pyrococcus woosii)以及热球菌属(Pyrococcus genus)的其他种类、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、嗜酸热硫化叶菌(Sulfolobusacidocaldarius)、嗜酸热原体(Thermoplasma acidophilum)、黄栖热菌(Thermusflavus)、红栖热菌(Thermus ruber)、布氏栖热菌(Thermus brockianus)、新阿波罗栖热袍菌(Thermotoga neapolitana)、海栖热袍菌(Thermotoga maritima)以及栖热袍菌属(Thermotoga genus)的其他种类，和热自养甲烷杆菌(Methanobacteriumthermoautotrophicum)，以及这些物种各自的突变体。示例性热稳定聚合酶可包括但不限于SuperScript、Platinum、TaqMan、MicroAmp、AmpliTaq和/或融合聚合酶中的任一者。示例性聚合酶可包括但不限于(水生栖热菌)Taq DNA聚合酶、AmpliTaqTMDNA聚合酶、AmpliTaqTMGold DNA聚合酶、DreamTaqTMDNA聚合酶、重组体、在大肠杆菌(E.coli)(赛默飞世尔科技)中表达的(水生栖热菌)Taq DNA聚合酶基因的修饰形式、iTaqTM(Bio-Rad)、Platinum Taq DNA聚合酶高保真、PlatinumTMII TaqTM热启动DNA聚合酶、PlatinumSuperFi DNA聚合酶、AccuPrime TaqTMDNA聚合酶高保真、Tne DNA聚合酶、Tma DNA聚合酶、Phire热启动II DNA聚合酶、Phusion U热启动DNA聚合酶、Phusion热启动II高保真DNA聚合酶、iProof高保真DNA聚合酶(Bio-Rad)；热启动Taq聚合酶(Qiagen)，一种经化学修饰(例如在特定温度(诸如室温)下阻断其活性)的聚合酶和/或其突变体、衍生物和/或片段。在一些实施方案中，寡核苷酸或核酸配体也可用作热启动剂，并且/或者热启动作用可通过在特定温度(例如室温)下阻断聚合酶活性而对该聚合酶产生化学修饰(例如，TaqGold、FlashTaq、热启动Taq)。在一些实施方案中，热启动组分可以是针对(即，对其具有结合特异性)混合物(如可从赛默飞世尔科技获得，例如PlatinumTMII热启动Green PCR主混合物；DreamTaqTM热启动Green PCR主混合物、Phusion U Green多重PCR主混合物、Phire Green热启动II主混合物，或
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Gold 360主混合物(赛默飞世尔科技))中的热稳定聚合酶的一种或多种抗体。在一些实施方案中，可使用双重热启动机制。例如，第一热启动组分(诸如寡核苷酸)可与第二热启动组分(诸如一种或多种抗体)一起用作热启动剂。在一些实施方案中，双重热启动机制的第一热启动组分和第二热启动组分可以是相同类型或不同类型(基于寡核苷酸的；基于抗体的；基于化学的等)。在一些实施方案中，双重热启动机制的第一热启动组分和第二热启动组分可对相同的聚合酶具有抑制性(例如，采用针对Taq DNA聚合酶的抑制性抗体和对Taq DNA聚合酶具有特异性的抑制性寡核苷酸的双重热启动机制)。在一些实施方案中，聚合酶可以是融合或嵌合聚合酶，其是指由来源于不同来源的不同结构域或序列组成的酶或聚合酶。例如，融合聚合酶可包含与DNA结合结构域(诸如单链或双链DNA结合蛋白结构域)融合的聚合酶结构域，诸如水生栖热菌(Taq)聚合酶结构域。融合或嵌合聚合酶可例如使用本领域普通技术人员熟知的方法获得(参见例如美国专利号8,828,700)，该专利的公开内容全文以引用方式并入。在一些实施方案中，此类融合或嵌合聚合酶是热稳定的。在一些实施方案中，混合物可包括作为主混合物和/或混合物的混合物(例如，TaqPathTMProAmpTM主混合物(Applied BiosystemsTM)、TaqPathTMProAmpTM多重主混合物(Applied BiosystemsTM)、TaqManTMPreAmp主混合物(Applied BiosystemsTM)、含UNG的TaqManTM通用型主混合物II(Applied BiosystemsTM)、TaqManTM通用型PCR主混合物II(不含UNG)(Applied BiosystemsTM)、含UNG的TaqManTM基因表达主混合物II(AppliedBiosystemsTM)、通用型EXPRESS qPCR Supermix(Invitrogen)、TaqManTM快速高级主混合物(Applied BiosystemsTM)、TaqManTM多重主混合物(Applied BiosystemsTM)、TaqManTMPreAmp主混合物试剂盒(Applied BiosystemsTM)、不含AmpEraseTMUNG的TaqManTM通用型PCR主混合物(Applied BiosystemsTM)、PowerUp SYBR Green主混合物(Applied BiosystemsTM)，或FlashTaq热启动2X MeanGreen主混合物(Empirical Biosciences))。在一些实施方案中，混合物还可包含以下项中的一者或多者：至少一种洗涤剂；甘油；PCR抑制剂阻断剂，包括明胶和白蛋白的组合；尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)和至少一种参比染料(例如，ROXTM、MustangPurpleTM)。在一些实施方案中，反应混合物还可包含扩增子，该扩增子包含靶多核苷酸链的靶多核苷酸序列(例如，第一序列)。在一些实施方案中，混合物不包含扩增子，该扩增子包含第二多核苷酸链的序列(例如，主要等位基因变体的序列)。
逆转录酶
在一些实施方案中，如本文所公开的组合物、反应混合物和试剂盒还可包括诸如用于逆转录PCR(RT-PCR)的至少一种逆转录酶(RT)和相关组分。当例如RNA是用于后续分析的起始材料时，可使用本文所述的组合物、反应混合物和试剂盒执行RT-PCR。在一些实施方案中，RT-PCR可以是使用如本文所述的一种或多种引物和一种或多种探针的一步程序。在一些实施方案中，RT-PCR可在单个反应管或反应容器中进行，诸如在1步或1管RT-PCR中进行。合适的示例性RT可包括例如莫洛尼鼠白血病病毒(M-MLV)逆转录酶、SuperScript逆转录酶(赛默飞世尔科技)、SuperScript IV逆转录酶(赛默飞世尔科技)或Maxima逆转录酶(赛默飞世尔科技)，或者任何此类RT的修饰形式。组合物、反应混合物和试剂盒还可包括进行此类RT-PCR反应所必需的任何其他组分，诸如可在SuperScript IV VILO主混合物(赛默飞世尔科技)或任何其他合适的RT-PCR主混合物(包括上述那些)中找到的组分。
如本文所用，术语“波长范围”、“波长带”等可表示“半极大处全宽度”(FWHM)波长范围或波长带。如本文所用，术语FWHM波长范围或FWHM波长带意指具有与最大长值和最小波长值之间的差值相等的范围的波长范围或波长带，在该波长范围或波长带处，通过、来自或离开光学元件(例如，辐射源或光谱滤光器、反射镜、分束器、光栅等)的辐射与该元件的波长范围或波长带内的最大值的一半相等。
对于由波长范围上的光谱函数(例如，吸收、激发或发射光谱函数)定义的光谱，如本文所用的“峰值波长”或“最大波长”(例如，“最大吸收波长”、“最大激发波长”、“最大发射波长”)意指光谱函数随着波长在最大波长或峰值波长附近增加或减少而减少的波长(例如，吸收、激发或发射随着波长从最大波长或峰值波长增加或减少(例如，增加或减少2纳米)而减少)。如本文所用，峰值波长或最大波长可以是在总光谱的预先确定的部分上的局部峰值或最大值；或者可以是“绝对峰值”或“绝对最大值”，其中光谱函数的值大于在整个光谱上的任何其他波长处的值。
如本文所用，当两个或更多个光谱(例如，两种或更多种染料的吸收、激发或发射光谱)的峰值或最大值之间的差值小于或等于15纳米时，两个或更多个光谱的峰值或最大值可被视为彼此“相等”、“接近”或“基本上相等”。如本文所用，当光谱(例如，染料的吸收、激发或发射光谱)的峰值或最大值在参考波长带(例如，激发或发射通道、光谱元件或滤光器的参考波长带)的最小限值或最大限值的15纳米内时，该光谱的峰值或最大值可被视为“接近”该参考波长带。如本文所用，当光谱(例如，染料的吸收、激发或发射光谱)在参考波长带(例如，激发或发射通道、光谱元件或滤光器组的波长带)上的积分值大于该光谱在可用波长带组的任何其他波长带上的积分值时，该光谱的峰值或最大值可被视为“最接近”或“最靠近”属于该可用波长带组的参考波长带。
如本文所用，“辐射发生器”或“发生器”意指能够产生电磁辐射的源。辐射发生器可包括单个光源，例如白炽灯、气体放电灯(例如卤素灯、氙灯、氩灯、氪灯等)、发光二极管(LED)、白光LED、有机LED(OLED)、激光器(例如化学激光器、准分子激光器、半导体激光器、固态激光器、氦氖激光器、氩激光器、染料激光器、二极管激光器、二极管泵浦激光器、光纤激光器、脉冲激光器、连续激光器)等。另选地，辐射发生器可包括多个单独的辐射发生器(例如，多个LED或激光器)，每个辐射发生器被构造成产生可能不与其他单独的辐射发生器重叠或部分重叠的不同波长范围或波长带。辐射发生器的特征在于电磁辐射，该电磁辐射主要在可见光范围(例如，发射波长在400纳米至700纳米范围内或者在380纳米至800纳米范围内的电磁辐射的“光源”)、近红外范围、红外范围、紫外范围或电磁波谱内的其他范围内。辐射发生器可提供连续或脉冲照射，并且可包括单个光束或者在空间和/或时间上分离的多个光束。
参见图1，在某些实施方案中，系统1000包括第一辐射源101a，该第一辐射源被构造成照射位于样品保持器或容器112中或上的核酸样品110，样品110被设置成接收来自第一辐射源101a的辐射。样品110包括被构造成与第一靶分子结合的第一染料和被构造成与第二靶分子结合的第二染料。辐射源101a被构造成产生激发光束，这些激发光束沿激发光学路径125被引导至样品110。系统1000还包括被构造成测量来自样品110的发射的传感器或检测器115、特征在于第一平均发射波长的第一发射光谱元件121a，以及特征在于与该第一平均发射波长不同的第二平均发射波长的第二发射光谱元件121b。光学元件或透镜123可与检测器115组合使用，例如用于使样品保持器112、样品110和/或来自它们的发射重新成像。光学元件123可以是透射和/或反射光学元件的形式，该透射和/或反射光学元件被构造成聚焦或成像来自样品保持器112和/或样品110的光或辐射。
每个发射光谱元件121a、121b可进一步通过波长带或波长范围来表征。发射光谱元件121a、121b的波长带或波长范围可被选择为使得发射光谱元件121a的波长带或波长范围不与发射光谱元件121b的波长带或波长范围重叠或者仅部分重叠。当第一靶分子和/或第二靶分子存在于样品110中时，来自对应的第一染料和/或第二染料的发射沿发射光学路径126从样品110被引导至检测器115。发射光谱元件121a、121b可包括穿过或反射适于检测和/或测量相应染料的波长带的相应滤光器。
系统1000可被构造成对样品110执行扩增测定。任选地，该扩增测定可在单独的系统上执行，并且使用系统1000进行进一步处理和/或检查。系统1000还可包括至少一个计算机或处理器130，该至少一个计算机或处理器包括至少一个存储器(未示出)，该至少一个存储器包括对样品110执行扩增测定的指令。在扩增测定期间和/或之后，系统1000被构造成使用辐射源101a照射样品110并且使用与发射光谱元件121a、121b组合的检测器115来检测和/或测量来自所存在的任何靶分子的发射。与处理器130相关联的存储器可包括用于以下的指令：在扩增测定期间或之后至少一次用第一辐射源101a照射样品110，并且作为响应，(1)使用检测器115和发射光谱元件121a测量来自样品110的发射，以及(2)使用检测器115和第二发射光谱元件121b测量来自样品110的发射。如下文进一步详细论述的，存储器可包括用于确定存在于样品110中的任一种靶分子的量的指令，例如，通过将使用第一发射光谱元件121a和第二发射光谱元件121b测量的来自样品110的发射分别与第一靶分子和第二靶分子的量相关联。
参见图2，在另一个实施方案中，系统2000包括第一辐射源101a和第二辐射源102，其中第一辐射源101a的特征在于第一平均激发波长，并且第二辐射源102的特征在于与该第一平均激发波长不同的第二平均激发波长。用于系统1000、2000的辐射源101a、102可各自进一步通过波长带或波长范围来表征。辐射源101a、101b的波长带或波长范围可被选择为使得辐射源101a的波长带或波长范围不与辐射源101b的波长带或波长范围重叠。样品110包括被构造成与第一靶分子结合的第一染料和被构造成与第二靶分子结合的第二染料，其中一种或两种染料可不同于上文关于系统1000论述的第一染料和第二染料。系统2000可任选地包括第一发射光谱元件121a，该第一发射光谱元件可与系统1000中使用的第一发射光谱元件121a相同或不同。系统1000、2000的辐射源101a、101b可包括与相应激发光谱元件141a、141b组合的辐射发射器或辐射发生器132，这些相应激发光谱元件例如可以是穿过或反射适于激发相应染料的波长带的相应激发滤光器。
系统2000可被构造成对样品110执行扩增测定。任选地，该扩增测定可在单独的系统上执行，并且使用系统2000进行后续处理和/或检查。在扩增测定期间和/或之后，系统2000被构造成使用辐射源101a、101b照射样品110，并且使用与第一发射光谱元件121a(当存在时)组合的检测器115来检测和/或测量来自所存在的任何靶分子的发射。与系统2000中的处理器130相关联的存储器可包括对样品110执行扩增测定的指令。与处理器130相关联的存储器可包括用于以下的指令：在扩增测定期间或之后至少一次(1)用第一辐射源101a照射样品110，并且作为响应，使用检测器115和任选的第一发射光谱元件121a测量来自样品110的发射，以及(2)用第二辐射源101b照射样品110，并且作为响应，使用检测器115和任选的第一发射光谱元件121a测量来自样品110的发射。如下文进一步详细论述的，存储器还可包括用于确定当存在于样品110中时第一靶分子的量和/或第二靶分子的量的指令，例如，通过将在用第一辐射源101a和第二辐射源101b照射时测量的来自样品110的发射分别与第一靶分子和第二靶分子的量相关联。在适用的情况下，系统2000可结合本文上文关于系统1000论述的元件或特征中的任一者。在适用的情况下，处理器130以及系统2000的相关联存储器可结合本文上文关于系统1000论述的处理器130的元件或特征中的任一者。
进一步参见图3，在一些实施方案中，系统3000包括第一辐射源101a和第二辐射源101b两者以及第一发射光谱元件121a和第二发射光谱元件121b两者。在此类实施方案中，样品110包括被构造成与第一靶分子结合的第一染料、被构造成与第二靶分子结合的第二染料和被构造成与第三靶分子结合的第三染料。如上所述，第一辐射源101a的特征在于第一平均激发波长，并且第二辐射源101b的特征在于与该第一平均激发波长不同的第二平均激发波长，而第一发射光谱元件121a的特征在于第一平均发射波长，并且第二发射光谱元件121b的特征在于与该第一平均发射波长不同的第二平均发射波长。
系统3000可被构造成对样品110执行扩增测定。任选地，该扩增测定可在单独的系统上执行，并且使用系统3000进行进一步处理和/或检查。在扩增测定期间和/或之后，系统1000被构造成使用辐射源101a、101b照射样品110，并且使用与发射光谱元件121a、121b组合的检测器115来检测和/或测量来自所存在的任何靶分子的发射。系统3000可被构造成对样品110执行扩增测定。任选地，该扩增测定可在单独的系统上执行，并且使用系统3000进行进一步处理和/或检查。在扩增测定期间和/或之后，系统3000被构造成在扩增测定期间或之后至少一次(1)用第一辐射源101a照射样品110至少一次，并且作为响应，使用检测器115和第一发射光谱元件121a检测或测量来自样品110的发射，并且使用检测器115和第二发射光谱元件121b检测或测量来自样品110的发射，以及(2)用第二辐射源101b照射样品110，并且作为响应，使用检测器115和第二发射光谱元件121b检测或测量来自样品110的发射。如下文进一步详细论述的，存储器可包括用于确定当存在于样品110中时第一靶分子、第二靶分子和/或第三靶分子的量的指令，例如，通过将在用第一辐射源101a或第二辐射源101b照射时测量的来自样品110的发射分别与第一靶分子、第二靶分子和第三靶分子的量相关联。
在适用的情况下，系统3000可结合本文上文关于系统1000、2000论述的元件或特征中的任一者。在适用的情况下，系统3000的处理器130可结合本文上文关于系统1000、2000论述的处理器130和相关联存储器的元件或特征中的任一者。上文关于图1和图2论述的光谱元件121a、121b、141a、141b和源101a、101b的实施方案也可应用于系统3000的那些元件和源。系统1000、2000或3000中的任一个系统可包括滤光轮、平移台等，例如用于选择性地将激发光谱元件141a、141b移入和移出激发光学路径125。系统1000、2000或3000中的任一个系统可包括滤光轮、平移台等，例如用于选择性地将发射光谱元件121a、121b移入和移出发射光学路径126。
在某些实施方案中，系统1000、2000或3000中的任一个系统可包括至少一个光束转向光学元件135，该至少一个光束转向光学元件将来自辐射源101a、101b的辐射转向或折叠至样品110。另选地，系统1000、2000、3000中的任一个系统可被构造成使得使用至少一个光束转向光学元件135将来自样品110的发射转向或引导至检测器115。使用该光束转向光学元件135，激发光学路径125和发射光学路径126可包括公共路径部分，其中光学路径125、126从光束转向光学元件135到样品110重叠。在其他实施方案中，激发光学路径125不与发射光学路径126重叠或者除了样品110处之外具有共同路径部分。例如，发射光束光学路径126可被设置成与样品保持器112的表面正交或垂直，而激发光学路径125可被设置成和不与样品保持器112的表面正交或垂直的表面成离轴角度。系统1000、2000、3000可附加地或另选地结合本领域已知的其他光学构造。例如，不同于处于图1至图3中示出的反射布置，其中激发光学路径125和发射光学路径126位于样品保持器112的公共侧或表面上，激发光学路径125和发射光学路径126可被构造成处于透射布置，其中激发光学路径125位于样品保持器112的一侧或表面上并且发射光学路径126位于样品保持器112的相对侧或表面上。系统1000、2000或3000还可包括用于调节来自辐射源101a、101b的辐射或光以及/或者来自样品112的发射的其他光学元件。
参见图4，在某些实施方案中，系统4000包括多个辐射源401和多个发射光谱元件441(在例示的实施方案中为441a-441f)。在例示的实施方案中，每个辐射源401包括辐射发生器132和六个激发光谱元件441中的一个激发光谱元件。在某些实施方案中，每个辐射源401可通过各自的平均激发波长来表征，其中六个平均激发波长中的一个或多个平均激发波长不同于其余平均激发波长。每个辐射源401可通过各自的激发波长带或波长范围来表征，其中激发波长带或波长范围中的至少一些激发波长带或波长范围不与其余辐射源401中的任一个辐射源的激发波长带或波长范围重叠。在某些实施方案中，辐射源401a-f中的任一个辐射源可包括与激发光谱元件401(例如，与激发光谱元件401a-f中的相应一个激发光谱元件)组合的一个或多个辐射发生器132。
系统4000还包括检测器115和用于与辐射源421a-f组合使用的多个发射光谱元件421(在例示的实施方案中为421a-421f)。样品110可包括与三种靶分子缔合的三种染料，如关于系统3000论述的。由于辐射源401和发射光谱元件421的附加数量，系统4000被构造成检测和/或测量多于三种染料。使用六个辐射源401和六个相关联的发射光谱元件421，现有技术系统仅能够检测和解卷积至多六种染料，以确定至多六种对应靶分子的量。如下文进一步详细论述的，系统4000被构造成检测和解卷积多于六种染料，以便确定多于六种对应靶分子的量。在某些实施方案中，系统4000可包括场透镜445或适于调节来自辐射发生器132的辐射和/或来自样品112的发射的其他光学元件。
而图4示出了包括六个辐射源401a-f和六个发射光谱元件421a-f的系统4000。应当理解，系统4000可包括少于六个辐射源和/或少于六个发射光谱元件(例如，类似系统1000、2000或3000)。在某些实施方案中，系统4000可包括多于六个辐射源和/或多于六个发射光谱元件，例如，用于增加可由系统4000检测或测量的靶分子的数量，以及/或者增加系统4000检测或测量选定数量的靶分子的准确度或灵敏度。例如，系统4000可包括七个、八个或更多个辐射源401和/或七个、八个或更多个发射光谱元件421。在某些实施方案中，每个发射光谱元件421包括由来自样品110的发射照射的色度色散光学元件(诸如棱镜、衍射光学元件、光谱仪或分光光度计)的特定波长带或波长范围。附加地或另选地，每个激发光谱元件441包括来自由一个或多个辐射发生器132提供光谱的色度色散光学元件(诸如棱镜或衍射光学元件)的特定波长带或波长范围。
在适用的情况下，系统4000的元件或组件可采取上文关于系统1000、2000、3000中的任一个系统论述的任何对应元件的实施方案的形式。例如，辐射发生器132、样品110、样品保持器112以及处理器130和相关联的存储器可采取上文关于系统1000、2000、3000中的任一个系统论述的那些相同元件或组件的形式。激发光谱元件441中的任一激发光谱元件或所有激发光谱元件可采取上文关于激发光谱元件141a或激发光谱元件141b论述的实施方案中的任一个实施方案的形式。任何或所有发射光谱元件421可采取上文关于发射光谱元件121a或激发光谱元件121b论述的实施方案中的任一个实施方案的形式。任何或所有辐射源401a-f可采取上文关于辐射源101a或辐射源101b论述的实施方案中的任一个实施方案的形式。
系统1000、2000、3000、4000可结合生物仪器和系统领域中已知的其他透镜、滤光器、反射镜、棱镜、衍射光学元件等。在某些实施方案中，沿系统1000、2000、3000、4000的激发和发射光学路径(例如，光学路径125、126)可包括附加透镜或其他成像光学元件。例如，场透镜可定位在样品保持器112近侧(例如，图4中示出的场透镜445在样品保持器112近侧)。在一些实施方案中，沿样品保持器112与检测器115之间的光学路径定位附加成像光学器件以中继图像或以其他方式调节来自样品110的发射。1000、2000、3000、4000的实施方案可结合US6818437、US2004/0009586、US9702823或US2016/0230210中公开的光学元件或构造中的任一者，这些文献全文以引用方式并入本文。
光学元件123或沿系统1000、2000、3000、4000的激发和/或发射光学路径的任何其他成像光学元件可包括折射透镜、反射镜、衍射或全息光学元件等中的一者或多者。光谱元件121、141、421、441中的一个或多个光谱元件可包括彩色基板、二向色元件(诸如滤光器、反射镜或分束器)或色散光学元件(诸如棱镜、衍射光栅或全息光栅)中的一者或多者。对于系统1000、2000、3000、4000中的任一个系统，检测器115可包括一个或多个单独的光电探测器，包括但不限于光电二极管、光电倍增管、辐射热计、低温探测器、量子点、发光二极管(LED)、半导体探测器、HgCdTe探测器等。附加地或另选地，检测器115可包括阵列传感器，该阵列传感器包括传感器或像素的阵列。阵列传感器可包括互补金属-氧化物-半导体传感器(CMOS)、电荷耦合器件(CCD)传感器、多个光电二极管检测器、多个光电倍增管等中的一者或多者。在某些实施方案中，检测器115包括两个或更多个阵列传感器。
系统4000可包括多个光束转向光学元件435，以沿从辐射发生器132到样品110的激发光学路径引导激发光束，以及/或者沿从样品110到检测器115的发射光学路径引导发射。在例示的实施方案中，每个激发光谱元件441如果耦接在旋转449上。光束转向光学元件135、435可采取上文关于光束转向光学元件135(上文关于系统1000、2000、3000论述该光束转向光学元件)论述的实施方案中的任一个实施方案的形式。在图4中示出的例示的实施方案中，系统4000包括六个光束转向光学元件435，六个激发光谱元件441中的每个激发光谱元件对应一个光束转向光学元件。光束转向光学元件135、435中的一个或多个光束转向光学元件可包括一个或多个光谱选择性光学元件(例如，二向色镜、滤光器或分束器)，该一个或多个光谱选择性光学元件的特征在于与辐射源401中的一个辐射源和/或发射光谱元件421中的一个发射光谱元件的光谱对应或互补的光谱。在某些实施方案中，光束转向光学元件135、435中的一个或多个光束转向光学元件可包括在波长的宽带上具有恒定或基本上恒定的透射率的中性密度滤光器(例如，在可见波长带、红外波长带和/或UV波长带上，在一些或全部光谱元件421、441的波长带上和/或在辐射源400的一些或全部波长带上具有恒定的透射率)。例如，光束转向光学元件135、435中的一个或多个光束转向光学元件可包括在给定波长带上具有1％、5％、10％、20％、25％、50％、75％、80％、90％、95％或99％的透射率的一个或多个中性密度滤光器。在例示的实施方案中，光束转向光学元件435与滤光轮449耦接。另选地，光束转向光学元件435可与滤光轮429耦接，使得每个光束转向光学元件435与发射光谱元件421a-f中的相应一个发射光谱元件对应。在其他实施方案中，光束转向光学元件135、435可独立于辐射源401、激发光谱元件441和发射光谱元件421移动。光束转向光学元件135、435的数量可小于或大于辐射源401的总数或发射光谱元件421的总数，例如，用于增加由激发光谱元件441提供的波长带的数量或发射光谱元件421的总数。
图1至图4中示出的光谱元件121(例如，121a、121b)、141(例如，141a、141b)、421(例如，421a-f)、441(例如，441a-f)可包括光谱滤光器，其中每个滤光器的特征在于透射波长带或波长范围和/或平均透射波长。光谱元件121、141、421、441中的任一个光谱元件可包括透射或反射光学滤光器，该透射或反射光学滤光器被构造成将来自样品的发射过滤到期望或预先确定的波长范围或波长带中。例如，光谱元件121、141、421、441中的任一个光谱元件可包括彩色滤光器、二向色滤光器、二向色镜或二向色分束器中的一者或多者。在某些实施方案中，光谱元件121、141、421、441可包括来自样品110的发射，该发射已穿过色散光学元件诸如棱镜或衍射光栅、光谱仪或分光光度计。在此类实施方案中，每个光谱元件121、141、421、441包括由色散光学元件产生的光谱的不同部分。发射光谱元件121、421可与滤光轮(例如，图4中的滤光轮429)或类似运动装置连接，以将元件121、421中的不同元件移入和移出检测器115与样品110之间的光学路径。
图1至图4中示出的辐射源101(例如，101a和/或101b)、401中的任一个辐射源可包括与来自多个激发光谱元件141a、141b中的相应一个激发光谱元件组合的一个或多个辐射发生器132(例如，一个或多个光源或其他宽带光源和/或UV辐射)。附加地或另选地，辐射源101、401中的一个或多个辐射源可包括辐射发生器132，该辐射发生器具有相对窄的波长范围或波长带(诸如彩色或窄带LED、激光器、放电管等)，具有被选择用于激发可与相应靶分子缔合的染料的光或其他电磁辐射的光谱或波长带。在此类实施方案中，可任选地包括激发光谱元件141(例如，141a、141b)、441(例如，441a-f中的任一个)中的一个或多个激发光谱元件，例如用于进一步缩窄或以其他方式调节被引导至样品110的辐射的光谱。如图4所示，激发光谱元件441可与滤光轮449或类似运动装置连接，以将元件441中的不同元件移入和移出辐射发生器132与样品110之间的光学路径。在一些实施方案中，辐射源101、401可各自包括辐射发生器和色度色散光学元件，该色度色散光学元件被构造成透射或反射来自该辐射发生器的辐射，每个辐射源包括来自该色度色散光学元件的光谱的不同部分。
系统1000、2000、3000、4000中的样品保持器112可包括板或表面，其中样品110被设置在样品保持器112上或者被设置在样品保持器112内，例如被设置在样品孔、通孔或表面区域内。在实施方案中，样品110包括多个空间上分离的样品部分，例如，分离到多个空间上分离的样品位点(诸如多个样品孔、通孔或表面区域)中的样品溶液。每个样品部分可含有相同或基本上相同量的一种或多种靶分子，可含有不同量或不同类型的一种或多种靶分子，或者不含有靶分子(例如，dPCR样品部分)。样品保持器112可包括条或微量滴定板(例如，具有4个、6个或8个孔的条或者包括24个孔、48个孔、96个孔、384个孔、1536个孔或3456个孔的微量滴定板)。另选地，样品保持器112可包括卡片或板，该卡片或板包括反应位点或室的阵列，每个反应位点或室含有样品110的一部分(例如，包括384个或9216个样品室或反应位点的卡片或板)。在一些实施方案中，样品保持器112包括板或芯片，该板或芯片包括空间上分离的通孔的阵列，每个通孔含有样品110的一部分(例如，含有3072个通孔、20000个通孔、50000个通孔、100,000个通孔或多于100,000个通孔的通孔板或芯片)。在某些实施方案中，样品保持器112包括管、通道或毛细管，该管、通道或毛细管包括多个样品液滴或料块，该多个样品液滴或料块含有样品110的一部分和任选地设置在液滴之间的不混溶流体或油。每个液滴或料块可含有相同或基本上相同量的一种或多种靶分子，可含有不同量或不同类型的一种或多种靶分子，或者不含靶分子(例如，dPCR样品液滴或料块)。
在适用的情况下，处理器130以及系统4000的相关联存储器可结合本文上文关于系统1000、2000、3000论述的处理器130的元件或特征中的任一者。在图4中示出的例示的实施方案中，处理器130和相关联的存储器可被构造成包括上文关于图1至图3论述的指令中的任一个指令，例如，在执行扩增测定、用辐射源401a-f中的任一个射源照射样品110以及/或者用发射光谱元件421a-f中的任一个发射光谱元件检测或测量来自样品110的发射时。在系统1000、2000、3000、4000的某些实施方案中，处理器130和/或相关联的存储器的全部或部分可被集成到单个仪器中，该单个仪器可被封装到外壳中。在一些实施方案中，处理器130和/或相关联的存储器的全部或部分可与系统1000的其余部分分离地定位，其中它们经由物理电缆、局域网、广域网等彼此物理连接。附加地或另选地，它们可经由Wi-Fi连接、蓝牙连接、云连接等彼此无线连接。
在某些实施方案中，系统1000、2000、3000、4000中的任一个系统可包括单个系统或仪器，该单个系统或仪器具有一个或多个处理器130和含有本文上文针对相应系统论述的指令的相关联存储器。另选地，系统1000、2000、3000、4000中的任一个系统可包括第二系统或仪器，该第二系统或仪器被构造成执行这些任务中的一个或多个任务。在此类实施方案中，系统1000、2000、3000、4000可包括两个或更多个系统或仪器，该两个或更多个系统或仪器各自执行这些任务中的一些任务。每个此类系统或仪器可具有其自己的处理器和/或存储器，或者另选地，共享公共处理器和/或存储器，例如使用集中式存储系统(诸如云存储系统)和/或集中式处理器或处理器系统(诸如云计算处理器或系统)。
系统1000、2000、3000、4000可以是终端系统或仪器，该终端系统或仪器被构造成在扩增测定(诸如PCR测定)结束之后提供对来自样品110中的一种或多种染料的发射的测量(例如，qPCR或dPCR系统或仪器，或者被构造成执行熔解测定的系统或仪器)。参见图5，在某些实施方案中，扩增系统5000包括系统1000、2000、3000或4000的光学组件(例如，辐射源、光谱元件、检测器、光束转向光学元件等)、处理器130、样品保持器112以及热控制器或系统，该热控制器或系统包括热块502和温度控制器或热循环仪504，该热块被构造成接收样品保持器112，该温度控制器或热循环仪被构造成执行PCR或其他扩增测定。系统5000还可包括加热盖(未示出)，该加热盖与热块502相对定位并且被构造成进一步控制样品保持器112和/或样品110的温度和/或环境。处理器130被构造成在扩增测定的执行期间控制系统5000并且操作光学部件，以在扩增测定期间检测或测量来自存在于样品100中的一种或多种染料的发射一次或多次。系统5000还可被构造成在扩增测定完成之后检测或测量来自一种或多种染料的发射，例如用于确定与该一种或多种染料缔合的一种或多种分子的量，或者用于在扩增测定之后执行的熔解测定期间检测或测量来自这些染料的发射。在某些实施方案中，系统5000在不使用热循环的情况下对样品110执行扩增测定。在此类实施方案中，系统5000可被构造成无需热块502和/或无需热循环仪504。
参见图6，给出根据系统4000和/或5000的实施方案的辐射源401(例如，与激发光谱元件441a-f组合的辐射发生器132)和发射光谱元件421的选择的示例。标记为“Ex”的列中的每个条目是系统4000的激发“通道”，其中每个Ex或激发通道指示用于照射样品110的波长范围或波长带。针对每个激发通道示出的数字是辐射源401a-f中的相应一个辐射源的平均或中心激发波长。每个激发通道的波长带由关于该激发或Ex通道的平均或中心透射波长的以纳米为单位的“±”数值表示(例如，例示的实施方案中的激发或Ex通道x1的波长带为480±10纳米，或470纳米至490纳米)。在某些实施方案中，平均或中心激发波长的选择可与图6中示出的不同，例如，用于适应特定染料组、靶分子的选择和/或测定化学方法。例如，Ex通道x1-x6的平均或中心波长可选择为在关于图6的表中示出的值的±5纳米的范围内(例如，Ex通道x1的平均或中心波长可选择为480纳米±5纳米，Ex通道x2的平均或中心波长可选择为520纳米±5纳米等)。此外，Ex通道的宽度可比图6中示出的宽度更宽或更窄。例如，Ex通道中的任一个通道的宽度可小于或等于给定通道的±5纳米、±10纳米、±12纳米、±15纳米、±18纳米、±20纳米、约平均值或中心值。
标记为“Em”的行中的每个条目是系统4000的发射“通道”，其中每个Em或发射通道表示来自样品110的发射(例如，荧光发射)，这些发射在由发射光谱元件421(例如，421a-f)中的相应一个发射光谱元件透射、反射和/或衍射之后由检测器115接收。针对每个发射通道示出的数字是发射光谱元件421中的相应一个发射光谱元件的平均或中心发射波长。每个发射通道的波长带由关于该发射或Em通道的平均或中心透射波长的以纳米为单位的“±”数值表示(例如，例示的实施方案中的发射或Em通道m1的波长带为520±15纳米，或505纳米至535纳米)。在某些实施方案中，平均或中心发射波长的选择可与图6中示出的不同，例如，用于适应特定染料组、靶分子的选择和/或测定化学方法。例如，Em通道m1-m6的平均或中心波长可选择为在关于图6的表中示出的值的±5纳米的范围内(例如，Em通道m1的平均或中心波长可选择为480纳米±5纳米，Em通道m2的平均或中心波长可选择为520纳米±5纳米等)。此外，Em通道的宽度可比图6中示出的宽度更宽或更窄。例如，Em通道中的任一个通道的宽度可小于或等于给定通道的±5纳米、±10纳米、±12纳米、±15纳米、±18纳米、±20纳米、约平均值或中心值。
图6中Ex列右边和Em角色下方的其余元件表示各种激发/发射通道组合或对(本文称为ex-em通道组合或对，或简称为通道组合或对)，这些激发/发射通道组合或对适于在特定激发波长范围的特定发射波长范围内检测或测量来自样品110中的一种或多种染料的发射。在某些实施方案中，通道组合可与具有最大吸收(或激发)波长和最大发射波长的染料对应，该最大吸收(或激发)波长在该组合的对应激发通道的波长带内或接近该波长带，该最大发射波长在该组合的对应激发通道的发射通道的波长带内或接近该波长带。例如，x1，m1通道组合(本文指定为x1/m1并由“A1”表示)可用于检测或测量具有(1)最大吸收波长和(2)最大发射波长的染料，该最大吸收波长在x1通道的480±10纳米波长带内或者最接近该波长带，该最大发射波长在对应m1通道的520±15纳米带内或者最接近该带。作为另一示例，x1，m3通道组合(x1/m3并由“B13”表示)可用于检测或测量具有(1)最大吸收波长和(2)最大发射波长的任何染料，该最大吸收波长在x1通道的480±10纳米带内或接近该带，该最大发射波长在对应m3通道的587±10纳米带内或接近该带。此类染料可由它们易于检测或测量的激发/发射通道来指代(例如，针对当前示例，作为“A1染料”和“B13染料”)。应当理解，给定染料可具有延伸到针对该染料设计的激发/发射通道组合之外的吸收和/或发射光谱。
标记为A1-A6的激发/发射通道组合可称为“同轴通道”或“同轴通道组合”，其中具有对应最大激发波长和最大发射波长的染料可称为“同轴染料”。图6中并非同轴通道的所有其他激发/发射通道组合可称为“离轴通道”或“离轴通道组合”，其中具有对应最大激发波长和最大发射波长的染料可称为“同轴染料”。以字母B(即，B12至B56)开始的离轴通道组合适于还产生斯托克斯位移的染料，但这些染料可具有比更适合与同轴通道组合一起使用的染料更大的斯托克斯位移。因此，离轴染料一般将在最大吸收波长与对应的最大发射波长之间产生比同轴染料更大的位移(例如斯托克斯位移)。以字母C(即，C12至C56)开始的离轴通道适于所谓的“反斯托克斯”或“上转换”荧光染料，这些荧光染料是产生位移发射的染料，其中这些染料具有比它们的最大吸收波长或波长带更小的最大发射波长或波长带。
如本文所用，“同轴通道组合”或“同轴ex-em通道对”是一对ex-em通道，其中Em通道的平均或中心波长相对于对应Ex通道偏移小于或等于60纳米的量。另选地，对于一组Ex和Em通道，“同轴通道组合”或“同轴ex-em通道对”包括给定Ex通道以及具有相对于该给定Ex通道的平均或中心波长的最小平均或中心波长偏移的Em通道。在这些定义下，“离轴通道组合”或“离轴ex-em通道对”是并非“同轴通道组合”或“同轴ex-em通道对”的任何ex-em通道对。
除非另有说明，否则如本文在包括一个或多个同轴/离轴通道组合和一个或多个同轴/离轴ex-em通道组合的系统或仪器的上下文中所使用的，“离轴染料”被定义为具有第一最大吸收或激发波长并且具有第二最大吸收或激发波长的染料，该第一最大吸收或激发波长是该染料的整个光谱上的绝对最大值，该第二最大吸收或激发波长是局部最大值并且与第一最大吸收或激发波长分开至少60纳米(例如，参见图16，其中B13具有分开约68纳米的两个最大波长，并且B4具有分开约100纳米的两个最大波长)。使用离轴染料的这种定义，“同轴染料”是并非离轴染料的任何染料。
一些同轴染料可以是“增宽染料”。如本文所用，“增宽染料”被定义为具有第一最大吸收或激发波长并且具有第二最大吸收或激发波长的同轴染料，该第一最大吸收或激发波长是该染料的整个光谱上的绝对最大值，该第二最大吸收或激发波长是局部最大值并且与第一最大吸收或激发波长分开小于60纳米。增宽染料可与另一同轴染料组合使用，以增加可使用同轴和离轴通道组合的组合进行检测或测量的染料数量。例如，可选择使用同轴通道组合(例如，A1通道组合)产生最大信号的第一同轴染料，并且与第二增宽染料组合使用，在两种染料具有相同浓度的情况下，该第二增宽染料在相邻离轴通道组合(例如，B12通道组合)中产生的信号比该第一染料产生的信号更高。
在某些实施方案中，“离轴染料”包括“大染料”或“能量转移染料缀合物”，其中该离轴染料包括经由接头共价连接的两种“同轴染料”：“供体染料”和“受体染料”(例如参见US5800996，其全文以引用方式并入本文)。离轴染料的这种定义可能与任何一对局部最大吸收或激发波长之间的偏移量无关。供体染料和受体染料通过接头连接，其中供体染料是能够吸收第一波长处的光以产生激发能量的染料，并且受体染料是能够吸收由供体染料产生的激发能量的至少一部分并且作为响应在第二波长处发出荧光的染料，该第二波长与受体染料本身(即，当未与供体染料连接时)的最大发射波长相等或基本上相等。
在某些实施方案中，一对染料可根据它们与彼此相比的光谱特征被视为“同轴染料”或“离轴染料”。例如，当第一染料和第二染料具有相同或几乎相同的最大吸收或激发波长(例如，在彼此的5纳米内的吸收或激发最大值，或者从仪器或系统的共同激发通道吸收最大量的辐射)，但第二染料的最大发射波长比第一染料的最大发射波长大至少50纳米(例如，参见图16，染料A1、B13或B14均具有几乎相同的最大吸收波长，但“离轴染料”B13、B14各自具有比“同轴染料”A1大50纳米以上的最大发射波长)时，样品内的第一染料可被视为“同轴染料”并且第二染料可被视为“离轴染料”。附加地或另选地，当第一染料和第二染料具有相同或几乎相同的最大发射波长(例如，在彼此的2纳米内的发射最大值，或者在仪器或系统的共同发射通道的波长带上产生最大发射)，但第二染料的最大吸收或激发波长比第一染料的最大吸收或激发波长的值小至少60纳米(例如，参见图16，针对染料对A3、B13或A4、B14而言，每一染料对具有几乎相同的最大吸收波长(分别为约565纳米和约600纳米)，但“离轴染料”B13、B14各自具有比“同轴染料”A1的最大吸收/激发波长小至少60纳米的最大吸收/激发波长)时，样品内的第一染料可被视为“同轴染料”并且第二染料可被视为“离轴染料”。
如图6所示，就六个激发通道和六个对应发射通道而言，本发明人已经发现可以从样品中获得或多路复用所有21个不同发射信号(即，针对通道组合A1-A6和B12-B56而言)。在某些实施方案中，本发明人已经发现可以从样品中获得或多路复用18个至20个不同发射信号(例如，使用除B56之外的所有通道组合以及/或者其中相邻的ex和/或em通道的中心波长之间的差值小的另一通道组合；例如，差值小于或等于30纳米或者小于或等于25纳米)。如本文下文所述，本发明人已经发现可选择至少10种染料(例如，六种同轴染料和四种离轴染料)以在单次PCR测定期间确定或测量同一样品溶液中含有的10种不同靶分子的量。
图6中示出的六个激发通道x1-x6与六个发射通道m1-m6的组合提供了适于示出本公开的各种实施方案的示例性实施方案。这些ex/em通道x1-x6和m1-m6中的每个通道的中心波长和波长带可被修改以适应各种系统或测定构造，例如，用于提供所考虑的特定染料组和/或探针和靶分子的改善的测量。通过增加发射通道的数量和/或发射通道的数量，例如通过使用7个、8个或更多个激发通道以及/或者通过使用7个、8个或更多个发射通道，可增加ex/em通道的数量。附加地或另选地，激发通道可被构造成覆盖更宽范围的波长，例如，延伸到电磁波谱的UV、近UV、红外或近红外波长带中(例如，包括具有小于或等于450纳米或500纳米的中心波长的激发通道，或者包括具有大于或等于720纳米或750纳米的中心波长的激发通道)。附加地或另选地，发射通道可被构造成覆盖更宽范围的波长，例如，延伸到电磁波谱的UV、近UV、红外或近红外波长带中(例如，包括具有小于或等于400纳米或450纳米的中心波长的激发通道，或者包括具有大于或等于670纳米或700纳米的中心波长的激发通道)。在某些实施方案中，与图6中示出的发射通道相比，通过使用光谱色散光学元件诸如棱镜、衍射光栅、光谱仪或分光光度计，可增加发射通道的数量，并且/或者可减小相邻发射通道之间的光谱距离。在某些实施方案中，与图6中示出的激发通道相比，通过使用光谱色散光学元件诸如棱镜或衍射光栅，可增加激发通道的数量，并且/或者可减小相邻激发通道之间的光谱距离。
本发明人已经鉴定了染料的各种组合，针对这些组合，可以检测和/或定量一种或多种离轴染料的量，从而检测和/或定量与这些同轴/离轴染料中的各种染料相关的靶核酸的量。现在将论述包括至少一种离轴染料的各种方法和染料组合，以用于识别一个样品中或样品阵列中的每个样品中的三种染料、五种染料和十种染料。
参见图7，在某些实施方案中，方法700包括元件705，该元件包括提供包含第一同轴染料和第二离轴染料的样品110。方法700还包括元件710，该元件包括对样品执行测定。方法700还包括元件715，该元件包括用第一辐射源照射样品，该第一辐射源的特征在于第一激发波长和/或波长带。方法700还包括元件720，该元件包括响应于元件715中的照射，在第一发射波长处和/或在第一波长带上进行来自样品的第一发射测量。方法700还包括元件725，该元件包括用第二辐射源照射样品，该第二辐射源的特征在于与第一激发波长和/或波长带不同的第二激发波长和/或波长带。方法700还包括元件730，该元件包括响应于元件725中的照射，在第二发射波长处和/或在第二波长带上进行来自样品的第二发射测量。方法700可任选地包括元件735，该元件包括基于第一发射测量来调整第二发射测量以提供经调整的第二发射测量。方法700可任选地包括元件740，该元件包括基于至少一些发射测量计算第一染料和第二染料的量。方法700可任选地包括元件745，该元件包括基于至少一些发射测量确定两种靶分子的量。
系统2000、3000、4000或5000可用于执行方法700，在这种情况下，辐射源可以是本文关于辐射源101、401论述的那些辐射源中的任一个辐射源，例如，与激发光谱元件141或441组合的辐射发生器132。可使用与发射光谱元件121或421组合的一个或多个检测器115进行来自样品的第一发射测量和第二发射测量。参考元件710，测定可以是PCR测定(诸如qPCR测定、dPCR测定)、后PCR测定(诸如熔解曲线分析)等。
图8示出了适合与方法700一起使用的两种染料(例如，染料A3和B13)的归一化吸收或激发光谱(下图)和归一化发射光谱(上图)。此处关于图8中的曲线论述的特征一般也适用于本文论述的其他染料的其他此类曲线。图8中的曲线示出了称为B13的离轴染料和称为A3的同轴染料的归一化数据。来自图6的激发通道x1、x3和发射通道m1、m3的波长带还在两个曲线中的以灰色区域表示。图9示出了在图6中引入的ex-em通道对栅格内的染料A3和B13。与这些染料相关联的辐射通道组合对应于这两种染料的吸收/激发最大值和发射最大值。图9示出了可与每种染料的量单独相关的ex-em通道组合。
使用方法700，可使用激发通道x1、x3和发射通道m3(即，通道组合x1/m3以及x3/m3)确定A3和B13的量。方法700还可与具有共同或类似最大发射波长(例如，彼此相等、在彼此的±1纳米内、在彼此的±2纳米内、在彼此的±5纳米内或在彼此的±10纳米内的最大发射波长)的其他两种染料组合(诸如本文所公开的或以其他方式公开的)一起使用，并且与具有光谱带宽的其他ex-em通道组合一起使用，这些光谱带宽包含或接近这两种染料的最大激发和发射波长。在当前示例中，离轴染料B13包括与同轴染料A3的最大发射波长相等或基本上相等的最大发射波长。在一些实施方案中，染料可包括在彼此的2纳米内、在彼此的5纳米内、在彼此的10纳米内或在彼此的15纳米内的最大发射波长。在具有多于两种染料的更复杂样品混合物的实施方案中，发射通道m3的选择被选择为使得当由x1通道和/或x3通道照射时，两种目标染料中的任一种或两种染料在m3通道带宽上的积分能量大于样品溶液内的任何其他染料的积分能量。
参见图8中示出的标称吸收曲线，可以看出同轴染料具有接近x3激发通道光谱带宽的最大激发波长。然而，可以看出离轴染料B13具有两个局部最大激发波长，一个接近激发通道x1的带宽，并且另一个接近激发通道x3的带宽。另选地，可选择x1和/或x3通道带宽，使得这两种染料的任何或全部最大激发波长在x1和/或x3激发通道的光谱带宽内。在具有多于两种染料的更复杂样品混合物的实施方案中，选择激发通道的带宽，使得在对应ex通道上的同轴和/或离轴染料的积分能量大于同一样品中包含的其他染料的积分能量。
图10示出了方法700的当前示例中的“ex-em通道空间”或“ex-em滤光器空间”(本文称为“ex-em空间”)，并且该空间基于图8中示出的染料的光谱特征以及图9中示出的每个通道(即，通道x1-x6和m1-m6)的所选激发和发射带。图10还示出了来自每个ex-em通道组合处的各种染料的信号的总和，该总和被标记为“总计”。曲线中每个数据点之间的线路是出于清楚的目的，以便更容易地看到信号如何从一个ex-em通道组合变化到下一个ex-em通道组合(例如，从x1-m1变化到x1-m2、从x1-m2变化到x1-m3等)。可以看出，不同激发通道之间(例如，x1-m6与x2-m2之间、x2-m6与x3-m3之间等)的线路中存在中断，使得每组激发通道可与下一组激发通道区分开。可以看出，每种染料在ex-em空间中具有独特且与众不同的特征、指纹或图案，本发明人已经发现，当多种染料同时产生高于环境噪声或阈值水平的信号时，允许将离轴染料与同轴染料区分开，并且/或者能够校正染料之间的信号干扰或串扰。
在当前示例中，用于A1和B13染料的例示的ex-em空间适用于包含等量的这些染料的样品，并且使用构造类似于系统4000的仪器和示出的所选ex-em通道带宽。方法700中的第一发射测量和第二发射测量的检测信号是图10中标记为“总计”的值。图10中用于A1和B13的数据基于该示例的样品中已知量的这些染料，并且基于每种染料的ex-em空间中已知的且与众不同的染料特征、指纹或图案。一般来讲，各种染料中的一些或全部染料的量是未知的，并且使用方法700或基于方法700中的第一发射测量和第二发射测量的其他解卷积方法来确定每种染料和所缔合的靶分子的量。
参见元件720、730、735并且参见图10，第二发射测量(通道组合x3-m3)中对总信号的贡献包括来自离轴染料B13和同轴染料A3两者的大量发射信号；然而，第一发射测量(通道组合x1-m3)包括几乎完全来自离轴染料B13的发射信号。因此，第一发射测量与样品中包含的B13染料的量密切相关，并且提供了存在于样品中的B13的量的良好估计。基于来自第一发射测量的B13的估计量，可估计染料B13对第二测量(总x3-m3信号)的贡献，因为染料的光谱特征根据图8中示出的ex-em数据是已知的。因此，可通过从第二测量中减去以x3-m3计的染料B13的估计发射来计算经调整的第二测量。因此，经调整的第二发射测量与样品中A3染料的量相关，因为来自B13第二信号的发射信号的贡献已被去除。
在某些实施方案中，经调整的第二测量可用于提供经调整的第一测量，因为现在可近似得出x1-m3通道中的染料A3信号的贡献并从第一测量中减去该贡献。还可实施进一步的迭代，用于例如基于经调整的第一测量提供进一步调整的第二测量。在其他实施方案中，可修改方法700以结合方程组，该方程组可被同时求解以确定或测量A3和B13染料以及所缔合的靶分子的量。在方法700的这些实施方案中的任一个实施方案中，可结合来自其他ex-em通道组合中的任何或所有ex-em通道组合的ex-em空间数据(图10)，以提供对A3和B13染料以及所缔合的靶分子的量的更准确估计(例如，以下项中的任一项或全部：当用x1照射样品时m1-m6的测量、当用x2照射样品时m2-m6的测量、当用x3照射样品时m3-m6的测量、当用x4照射样品时m4-m6的测量、当用x5照射样品时m5-m6的测量、当用x6照射样品时m6的测量)。当仅A3和B13染料存在于样品中时，使用来自所选或所有可用的ex-em通道组合的测量求解联立方程提高了确定这两种染料的量的准确度。当10种或更多种染料存在于样品中时，使用来自所选或所有可用的ex-em通道组合的测量求解联立方程也可用于确定附加染料的量。
以下段落根据图12中示出的曲线来解释当前教导内容的优点。在现有技术系统中，包含两种或更多种同轴染料的样品可被多路复用以量化两种或更多种对应靶分子的量，其中相应染料被构造成与两种或更多种对应靶分子结合。例如，上文论述的同轴染料A1、A3都可被放置在包含两个对应靶分子的样品中，其中A1和A3被构造成与该两个对应靶分子(并且可稍后被释放以产生发射信号)。通过用通道x1照明来照射样品，大部分能量被A1染料吸收(如图12中示出的A1在x1激发通道带宽上的吸收光谱下方的大积分面积所证实的)。如图12所示，A1染料的大部分所得发射能量包含在m1发射通道中。相反，x1通道中非常少的能量被A3染料吸收，并且该能量的大部分将在m3发射通道中重新发射，而不是在m1发射通道中重新发射。因此，发射通道m1中的信号可能与存在于样品中的A1染料的量高度相关。通过类似地回顾图12中的曲线，可以看出x3激发通道与m3的组合可能与存在于样品中的A3染料的量高度相关。
然而，这些相关性不是精确的。例如，A1染料在m3发射通道中具有少量但可测量的发射量，这因此可降低与A3染料的相关性。这种类型的不需要的信号贡献被称为“串扰”或“信号干扰”。虽然串扰在本示例中相对较小，但当样品中存在多于两种同轴染料(例如，A1、A2和A4，或者A1、A2、A3和A4)时以及/或者当针对特定测定存在大量的一种靶分子和少得多的另一种靶分子时，串扰可能更加显著。这些影响可通过适当的测定设计、校准板的使用以及用于处理来自每个通道的原始发射数据的解卷积算法而被最小化。各种离轴通道组合的使用还可用于增强解卷积，从而提高准确度。
为了补偿和/或校正信号干扰或串扰以及其他此类影响，可使用校准板。校准板含有已知量的多种染料。因此，当用来自一个或多个激发通道的辐射照射时，可确定来自每种染料的所得荧光信号，并且可针对在各种照射条件下染料之间的串扰来校正系统。校准板可在一个或多个反应位点(例如，96或384孔微量滴定板的孔或小瓶)中包含已知染料组合，该一个或多个反应位点与含有未知量的靶分子组合的测试板的一个或多个反应位点对应。校准板的一个可商购获得的示例是Thermo Fisher校准板A26337。A26337在AppliedBiosystems的QuantStudioTM3和5,96孔0.1mL实时PCR系统上建立ABYTM、JUNTM和MUSTANGPURPLETM染料的纯染料光谱和多组分值。该板中的染料制剂通过在实时PCR实验中更准确地表示各个探针的荧光光谱而改善了多重化结果。
本发明人已发现，离轴通道不仅可用于改善解卷积算法以提高多个同轴染料的准确度，而且来自这些离轴通道的添加信息还可用于将附加的离轴染料包括到样品中，而不需要增加激发或发射通道的数量。例如，可在样品中使用本文论述的六个Ex通道x1-x6和六个Em通道m1-m6鉴别六种同轴染料。为了将可检测的同轴染料的数量增加超过六个，使用现有技术将需要附加的Ex和Em通道。这不仅增加了系统成本和复杂性，而且可能存在技术问题，例如，使得难以利用适于在可见波长带内操作的光学部件来增加可提供的波长带的数量。
本发明人已经发现，可将附加离轴染料包括在样品110中，以增加可用同一组激发和发射通道测量的染料和对应靶分子的数量。该结果是出乎意料的，因为附加离轴染料的引入增加了上文关于在同一样品中多路复用多个同轴染料论述的串扰问题。为了理解，再次参见图12。例如，可以看出，染料A3与B13之间存在大量串扰，因为染料A3和B13两者都吸收x3激发通道中的大量能量，并且都在m3发射通道中重新发射该能量。基于这些观察，似乎不可能确定x3、m3通道组合中有多少信号来自染料A3、B13中的每种染料。
然而，已经发现，来自同轴通道组合和离轴通道组合两者的数据可用于帮助减轻此类问题。例如，在这种情况下，B13通道组合可用于帮助确定存在于样品110中的染料B13的量。利用这种信息，染料B13对A3通道组合中的信号的贡献可被计算并用于修改m3信号以确定染料A3的量。这可以解释如下。如图12中的吸收曲线所示，染料B13在激发通道x1带上吸收大量能量，而染料A3在激发通道x1带上吸收非常少的能量。而且，由染料B13吸收的大量x1能量在m3通道中发射。因此，x1激发通道可用于通过分别测量m1发射通道和m3发射通道中的信号来确定A1和B13染料两者的量，因为当这两种染料都使用激发通道x1照射时，染料A1主要在发射通道m1中发射，并且染料B13主要在发射通道m3中发射。利用针对染料B13的量的这种信息，可使用x3激发通道通过调整已知量的B13染料的m3发射信号来确定染料A3的量。
参见图11，在某些实施方案中，方法1100包括元件1105，该元件包括提供包含第一同轴染料和第二同轴染料以及第三离轴染料的样品110。方法1100还包括元件1110，该元件包括对样品执行测定。方法1100还包括元件1115，该元件包括用第一辐射源照射样品，该第一辐射源的特征在于第一激发波长和/或波长带。方法1100还包括元件1120，该元件包括响应于元件1115中的照射，在第一发射波长处和/或在第一波长带上进行来自样品的第一发射测量，并且在第二发射波长处和/或在第一波长带上进行来自样品的第二发射测量。方法1100还包括元件1125，该元件包括用第二辐射源照射样品，该第二辐射源的特征在于与第一激发波长和/或波长带不同的第二激发波长和/或波长带。方法1100还包括元件1130，该元件包括响应于元件1125中的照射，在第二发射波长处和/或在第二波长带上进行来自样品的第三发射测量。方法1100可任选地包括元件1135，该元件包括基于第一发射测量来调整第二发射测量以提供经调整的第二发射测量。方法1100可任选地包括元件1140，该元件包括调整第三发射测量以提供基于第一发射测量、第二发射测量和/或经调整的第二发射测量中的至少一者的经调整的第二发射测量。方法1100可任选地包括元件1145，该元件包括基于至少一些发射测量计算第一染料、第二染料和第三染料的量。方法1100可任选地包括元件1145，该元件包括基于存在于样品中的染料的量来确定三种靶分子的量。
系统2000、3000、4000或5000可用于执行方法1100，在这种情况下，辐射源可以是本文关于辐射源101或401论述的那些辐射源中的任一个辐射源，例如，与激发光谱元件141或441组合的辐射发生器132。可使用分别与发射光谱元件101a、101b或者发射光谱元件421a-f中的两个发射光谱元件组合的一个或多个检测器115来进行来自样品的发射测量。参见元件1110，测定可以是PCR测定(诸如qPCR测定、dPCR测定)、后PCR测定(诸如熔解曲线分析)等。在适当的情况下，本文上文论述的方法700的任何方面也可应用于方法1100，例如关于染料、辐射源和/或发射过滤特征或使用方法。
图12示出了适合与方法1100一起使用的三种染料(两种同轴染料A1、A3和一种离轴染料B13)的归一化吸收光谱和归一化发射光谱。此处关于图12中的曲线论述的特征一般也适用于本文论述的其他染料的其他此类曲线。图12中的曲线示出了离轴染料B13以及同轴染料A1和A3的归一化数据。这三种染料分别适于图6中示出的通道组合x1-m3、x1-m1和x3-m3。
使用方法1100，A1、A3和B13的量可使用激发通道x1、x3和发射通道x1、m3(即，通道组合x1/m3、x1/m1和x3/m3)来确定。方法1100还可与其他三种染料组合(诸如本文所公开的或以其他方式公开的)一起使用，其中同轴染料中的一种同轴染料具有与离轴染料共同或类似的最大发射波长，并且另一同轴染料具有与离轴染料共同或类似的最大激发波长。方法1100还可与具有光谱带宽的其他ex-em通道组合一起使用，该光谱带宽包含或接近这三种染料的最大发射和擦伤波长。在当前示例中，离轴染料B13包括与同轴染料A3的最大发射波长相等或基本上相等的最大发射波长。附加地，离轴染料B13包括与同轴染料A1的最大发射波长相等或基本上相等的最大激发波长。在一些实施方案中，染料可包括在彼此的2纳米内、在彼此的5纳米内、在彼此的10纳米内或在彼此的15纳米内的最大发射波长。在具有多于三种染料的更复杂样品混合物的实施方案中，发射通道m1和m3的选择被选择为使得当由x1通道和/或x3通道照射以及/或者在m1和/或m3通道中发射能量时，三种目标染料在x1、x3、m1和m3通道带宽中的每个通道带宽上的积分能量大于样品内的任何其他染料的积分能量。
参见图12中示出的标称吸收曲线，可以看出A1同轴染料具有接近x1激发通道光谱带宽的最大激发波长，同时可以看到A3同轴染料具有接近x3激发通道光谱带宽的最大激发波长。然而，可以看出离轴染料B13具有两个局部最大激发波长，一个接近激发通道x1的带宽，并且另一个接近激发通道x3的带宽。另选地，可选择x1和/或x3通道带宽，使得这三种染料的任何或全部最大激发波长在x1和/或x3激发通道的光谱带宽内。在具有多于三种染料的更复杂样品混合物的实施方案中，选择激发通道的带宽，使得在对应ex通道上的同轴和/或离轴染料的积分能量大于同一样品中包含的其他染料的积分能量。图13示出了在图6中引入的ex-em通道对栅格内的染料A1、A3和B13。与这些染料相关联的ex-em通道组合对应于这三种染料的吸收/激发最大值和发射最大值。图13示出了可与每种染料的量单独相关的ex-em通道组合。
图14示出了在方法1100的当前示例中使用的三种所选染料的ex-em空间，并且该ex-em空间基于图12中示出的染料的光谱特征以及图13中示出的每个通道(即，通道x1-x6和m1-m6)的所选激发和发射带。图14还示出了来自每个ex-em通道组合处的各种染料的信号的总和，该总和被标记为“总计”。可以看出，每种染料在ex-em空间中具有独特且与众不同的特征或指纹，本发明人已经发现，当多种染料同时产生高于环境噪声或阈值水平的信号时，允许将离轴染料与同轴染料区分开，并且/或者能够校正染料之间的串扰。
在当前示例中，用于A1、A3、B13染料的例示的ex-em空间适用于包含等量的这些染料并且使用类似系统4000构造的仪器和示出的所选ex-em通道带宽的样品。方法1100中的第一测量、第二测量和第三测量的检测信号是图14中标记为“总计”的值。图14中用于A1、A3和B13的数据基于该示例的样品中已知量的这些染料，并且基于每种染料的ex-em空间中已知的且与众不同的染料特征或指纹。一般来讲，各种染料中的一些或全部染料的量是未知的，并且使用方法1100或基于方法1100中的第一次测量、第二次测量和第三次测量的其他解卷积方法来确定每种染料和所缔合的靶分子的量。本发明人已经发现，对于具有更多数量的同轴和离轴染料以及所缔合的靶分子的更复杂样品，在该示例的图14中示出的ex-em空间中每种染料的独特特征或指纹可用于在共同样品中同时多路复用十种或更多种同轴/离轴染料。
参见元件1120、1130、1135、1140和图14中的ex-em空间曲线，第二发射测量(通道组合x1-m3)中对总信号的贡献包括来自同轴染料A1和A3两者以及来自离轴染料B13的大量发射信号；然而，第一发射测量(通道组合x1-m1)包括主要来自同轴染料A1的发射信号。因此，第一发射测量与样品中包含的A1染料的量密切相关，并且提供了存在于样品中的A1的量的良好估计。基于来自第一发射测量的A1的估计量，可估计染料A1对第二测量(总x1-m3信号)的贡献，因为染料的光谱特征根据图12中示出的ex-em数据是已知的。因此，可通过从第二测量中减去x1-m3中染料A1的估计发射来计算经调整的第二测量。因此，经调整的第二发射测量与样品中B13染料的量相关，因为来自A3第二信号的发射信号的贡献已被去除。
以类似的方式，第三发射测量(通道组合x3-m3)中对总信号的贡献包括来自离轴染料B13以及来自同轴染料A3的大量发射信号；然而，经调整的第二发射测量(通道组合x1-m3)提供了对存在于样品中的B13染料的量的良好估计。基于来自经调整的第二发射测量的B13的估计量，可估计染料B13对第三测量(总x3-m3信号)的贡献，因为染料的光谱特征根据图12中示出的ex-em数据是已知的。因此，可通过从第三测量中减去x3-m3中染料B13的估计发射来计算经调整的第三测量。因此，经调整的第三发射测量与样品中A3染料的量相关，因为来自B13第二信号的发射信号的贡献已被去除。虽然x3-m3通道组合中A1染料的贡献在本示例中是不显著的，但一般来讲，方法1100还可用于从x3-m3通道组合中的A1染料中减去信号的量以提供更准确的经调整的第三信号，从而导致经调整的第三信号与A3染料的量以及与之相关的靶分子的量的甚至更好的相关性。
在某些实施方案中，经调整的第二测量和/或经调整的第三测量可用于提供经调整的第一测量，因为现在可近似得出x1-m1通道中的B13染料信号和A3染料信号的贡献并从第一测量中减去该贡献(因为可根据图12中的数据确定任何发射通道中的这些染料的这些光谱特征)。附加地或另选地，经调整的第三测量可用于提供更准确的经调整的第二测量，因为现在可近似得出x1-m3通道中的A3染料信号的贡献并从第二测量中减去该贡献(因为可根据图12中的数据确定任何发射通道中的A3的这些光谱特征)。还可实施进一步的迭代，用于例如基于经调整的第一测量和/或第二测量提供进一步调整的第三测量。在其他实施方案中，可修改方法1100以结合方程组，该方程组可被同时求解以确定或测量A1、A3和B13染料以及所缔合的靶分子的量。在方法1100的这些实施方案中的任一个实施方案中，可结合来自任何或所有其他ex-em通道组合的ex-em空间数据(图14)，以提供对A1、A3和B13染料以及所缔合的靶分子的量的更准确估计(例如，以下项中的任一项或全部：当用x1照射样品时m1-m6的测量、当用x2照射样品时m2-m6的测量、当用x3照射样品时m3-m6的测量、当用x4照射样品时m4-m6的测量、当用x5照射样品时m5-m6的测量、当用x6照射样品时m6的测量)。当仅A1、A3和B13染料存在于样品中时，使用来自所选或所有可用的ex-em通道组合的测量求解联立方程提高了确定这三种染料的量的准确度。当10种或更多种染料存在于样品中时，使用来自所选或所有可用的ex-em通道组合的测量求解联立方程也可用于确定附加染料的量。
参考元件1150，在某些实施方案中，第一染料和第二染料与不同靶分子(诸如第一靶多核苷酸和第二靶多核苷酸、第一蛋白质和第二蛋白质等)缔合，并且/或者被构造成与不同靶分子结合或连接。
再次参见图2至图4，方法700可使用系统3000、4000、5000中的任一个系统来执行，以测量至少第一染料和第二染料的量。方法700可用于进一步测量或计算被构造成与第一染料结合的第一靶分子的量和/或被构造成与第二染料结合的第二靶分子的量。在此类实施方案中，元件715、725包括用辐射源101a、101b或者用辐射源的第一辐射源和第二辐射源、辐射源401a-f照射样品110，其中两个辐射源中的每个辐射源的特征在于一个辐射源的平均激发波长不同于另一个辐射源的平均激发波长(例如，相差至少60纳米)。在当前实施方案中，每个发射光谱元件121a、121b或两个发射光谱元件141a-f的特征在于一个发射光谱元件的平均发射波长不同于另一个发射光谱元件的平均发射波长(例如，相差至少60纳米)。响应于这些照射，方法700的元件720、730包括：
·响应于用辐射源101a或辐射源401中的第一辐射源照射样品110，使用检测器115和发射光谱元件121a或发射光谱元件421中的第一发射光谱元件测量来自该样品的发射，以及
·响应于用辐射源101b或辐射源401中的第二辐射源照射样品110，使用检测器115和发射光谱元件121b或发射光谱元件421中的第二发射光谱元件测量来自该样品的发射在某些实施方案中，第一染料包括第一发射光谱，该第一发射光谱包括第一最大发射波长，并且第二染料包括第二发射光谱，该第二发射光谱包括与第一最大发射波长相等或基本上相等的第二最大发射波长。例如，第一染料可以是同轴染料并且第二染料可以是离轴染料，其中最大发射波长相同或大致相同(例如，在彼此的2纳米内或在彼此的5纳米内)。
再次参见图3和图4，方法1100可使用系统3000、4000、5000中的任一个系统来执行，以测量至少第一染料、第二染料和第三染料的量。方法700可用于进一步测量或计算被构造成与第一染料结合的第一靶分子的量、被构造成与第二染料结合的第二靶分子的量和/或被构造成与第三染料结合的第三靶分子的量。在此类实施方案中，元件1115、1125包括用辐射源101a、101b或者用辐射源的第一辐射源和第二辐射源照、辐射源401a-f射样品110，其中两个辐射源中的每个辐射源的特征在于一个辐射源的平均激发波长不同于另一个辐射源的平均激发波长(例如，相差至少60纳米)。在当前实施方案中，每个发射光谱元件121a、121b或两个发射光谱元件141a-f的特征在于一个发射光谱元件的平均发射波长不同于另一个发射光谱元件的平均发射波长(例如，相差至少60纳米)。响应于这些照射，方法1100的元件1120、1130包括：
·响应于用辐射源101a或辐射源401中的第一辐射源照射样品110，使用检测器115和发射光谱元件121a或发射光谱元件421中的第一发射光谱元件测量来自该样品的发射，
·响应于用辐射源101a或辐射源401中的第一辐射源照射样品110，使用检测器115和发射光谱元件121b或发射光谱元件421中的第二发射光谱元件测量来自该样品的发射，以及
·响应于用辐射源101b或辐射源401中的第二辐射源照射样品110，使用检测器115和发射光谱元件121b或发射光谱元件421中的第二发射光谱元件测量来自该样品的发射
在某些实施方案中：
·第一染料包括第一吸收光谱，该第一吸收光谱包括第一最大吸收波长
·第二染料包括第二吸收光谱，该第二吸收光谱包括与第一最大吸收波长相等或基本上相等的第二最大吸收波长(例如，在彼此的2纳米内或在彼此的5纳米内)；并且
·第二染料包括第二发射光谱，该第二发射光谱包括第二最大发射波长，并且第三染料包括第三发射光谱，该第三发射光谱包括与第二最大发射波长相等或基本上相等的第三最大发射波长(例如，在彼此的2纳米内或在彼此的5纳米内)。
例如，第一染料和第三染料可以是在系统或仪器的不同激发通道上具有最大吸收波长的同轴染料。
在各种实施方案中，方法700或方法1100还可包括使用系统1000、2000、3000、4000、5000中的任一个系统对样品110执行扩增测定。在此类实施方案中，方法700、1100可使用本文针对这些系统论述的各种实施方案来执行。方法700、1100的实施方案可包括或者在扩增测定期间执行元件715-70、1115-1130。例如，扩增测定可以是实时聚合酶链反应(qPCR)测定，其中使用热循环仪在各种循环中加热和冷却样品110。在这些循环中的一个或多个循环期间的一个或多个点处，可对样品110执行元件715-70、1115-1130中的任一者或全部。附加地或另选地，可在PCR或其他扩增测定结束之后执行方法700、1100。例如，在PCR测定的最后一个循环之后，在扩增测定之后的熔解测定期间，或者在扩增测定之后的数字PCR(dPCR)评估期间。
参见图15，示出了染料的另一种三元组组合(染料A1、A4和B14)的吸收或激发光谱特征以及发射光谱特征。A4和B14的量还可使用方法700和/或1100来确定和测量，其中使用如上所述相同的处理，但用通道组合x1-x3和x3-m3代替通道组合x1-x4和x4-m4。图16示出了上述所有五种染料(A1、A3、A4、B13、B14)的组合光谱特征。
图17示出了在图6中引入的ex-em通道对栅格内的染料A1、A3、A4、B13、B14。与这些染料相关联的ex-em通道组合对应于这五种染料的吸收/激发最大值和发射最大值。图17示出了可与每种染料的量单独相关的ex-em通道组合。由于当所有五种染料都存在时出现串扰，因此图18中示出的ex-em空间中每种染料的特征或指纹可用于减少或消除串扰的影响。例如，方法700以及上述变化形式可用于校正包含在样品中的染料A3、B13和/或染料A4、B14之间的串扰。附加地或另选地，方法1100以及上述变化形式可用于校正包含在样品中的染料A1、A3、B13和/或染料A1、A4、B14之间的串扰。
如图18所示，A4和B14染料的特征或图案与A3和B13染料的特征或图案有很大不同。例如，在x1-m4和x4-m4通道组合中，A3和B13的对总信号的贡献较低。因此，在一些实施方案中，可使用方法1100处理A1、A4、B14三元组，而不考虑来自A3、B13的信号的贡献。另选地，如上文关于上述方法1100的变化形式所述，结合该方法的方程组可被同时求解以确定或测量A1、A3、A4、B13和B14染料以及所缔合的靶分子的量。在某些实施方案中，可修改方法1100以结合方程组，该方程组包括图6中示出的“A”和“B”通道组合的21个ex-em通道组合中的一些或全部。可结合图18中的ex-em空间数据中的一些或全部数据，以提供所有五种染料和所缔合的靶分子的量的准确估计。在某些实施方案中，染料A1、A3、A4、B13、B14可以是下表A中列出的染料的各种组合。在某些实施方案中，所执行的测定可以是PCR测定(诸如qPCR测定、dPCR测定)、后PCR测定(诸如熔解曲线分析)等。
表1—使用x1、x3、x4、m1、m3、m4通道用于2重、3重和5重测定的染料
Figure SMS_51
图19示出了在图6中引入的ex-em通道对栅格内的染料A1-A6、B13、B14、B35和B36。与这些染料相关联的辐射通道组合对应于这10种染料的吸收/激发最大值和发射最大值。图19示出了可与每种染料的量单独相关的ex-em通道组合。本发明人已经发现了多种染料组合，这些染料组合可与这十种ex-em通道组合一起使用，以允许同时检测和/或测量所有十种染料和所缔合的靶分子的量。下文的表2示出了可用于这十种ex-em组合中的每一种组合的各种染料。
表2—使用六个激发通道和六个发射通道用于10重测定的染料
Figure SMS_52
Figure SMS_53
比较图19和图17可知，染料A2、A5、A6、B35、B36已被添加到图17中示出的5种染料中。在某些实施方案中，样品中同轴染料A2、A5、A6的量可通过使用同轴、ex-em通道组合x2-m2、x5-m5和x6-m6校正检测器处接收的信号而被至少近似地确定或测量。如图18所示，A1、A3、A4、B13、B14染料的特征或图案在ex-em通道组合x2-m2、x5-m5和x6-m6中具有相对较低的发射。因此，来自染料A1、A3、A4、B13、B14的串扰相对较小。染料A1、A3、A4、B13、B14的量可使用针对这些染料的上述方法700和/或方法1100来确定或测量。类似地，离轴染料B35和B36可使用方法700来确定或测量，针对染料B35和A5使用垂直的发射通道组合x5-m5和x3-m5，并且针对染料B36和A6使用通道组合x6-m6和x3-m6。附加地或另选地，离轴染料B35和B36可使用方法1100来确定或测量，针对染料B35和A5使用三元组ex-em通道组合x3-m3、x5-m5和x3-m5，并且针对染料B36和A6使用三元组ex-em通道组合x3-m3、x6-m6和x3-m6。另选地，如上文关于上述方法1100的变化形式所述，结合该方法的方程组可被同时求解以确定或测量A1、A2、A3、A4、A5、A6、B13、B14、B35和B36染料以及所缔合的靶分子的量。在某些实施方案中，可修改方法1100以结合方程组，该方程组包括表2中示出的“A”和“B”通道组合的21个ex-em通道组合中的一些或全部通道组合。可结合图18中的ex-em空间数据中的一些或全部数据，以提供所有十种染料及其所缔合的靶分子的量的准确估计。
本发明人已经发现，对于具有十种或更多种染料(例如，来自表2的六种同轴染料和四种离轴染料的组合)及其所缔合的靶分子的更复杂样品，可利用每种染料在ex-em空间中的独特的ex-em空间特征或指纹来同时多路复用共同样品中的所有同轴/离轴染料。图18示出了上述每种特定染料A1、A3、A4、B13、B14的不同的ex-em空间特征或指纹。比较这些染料的特征或指纹可知，A1在x1-m1通道组合中具有独特的强信号，并且在x1-m2通道组合中具有大约为x1-m3通道组合中的信号的五分之二的信号。相反，A3和A4在x1-m1或x1-m2通道组合中几乎没有信号，反而分别在x3-m3和x4-m4通道组合中具有强信号。染料B13和B14也分别在x3-m3和x4-m4通道组合中具有强信号，但与A3和A4染料的不同之处在于B13和B14还分别在x2-m3和x2-m4通道组合中具有相对强的信号。虽然未在图18中示出，但对于染料A2、A5、A6、B35和B36存在类似的不同特征。应当注意，染料A2、A5、A6、B35和B36染料通常在发射通道m5和m6中具有高发射，然而再次参见图18，染料A1、A3、A4、B13和B14在m5或m6发射通道中具有非常少发射甚至基本上没有发射，特别是当由x5或x6通道激发时。
本发明人已经发现，对于包含同轴和离轴染料(例如，图17中示出的8种染料或图19中示出的10种染料)两者的测定，标准校准板(诸如本文上文所述的Thermo Fisher校准板A26337)不足以校正各种染料之间的信号干扰或串扰，从而在确定样品中每种染料和对应靶分子的量时降低了准确性。为了提高此类测定的准确性，本发明人已经发现，在仪器的校准期间使用的校准板应当包含已知量的一种或多种离轴染料。例如，在共同样品或样品溶液中使用10种染料的实施方案中，如图19所示，本发明人已经发现，使用包含四种同轴染料加两种离轴染料或者两种同轴染料加四种离轴染料的校准板，可在确定或测量10种染料中每种染料和/或与这些染料缔合的对应靶分子的量时提高准确度。例如，已经发现包含FAM和VIC加四种离轴染料的校准板在确定或测量10种染料中每种染料和/或与这些染料缔合的对应靶分子的量时提高了准确度。四种离轴染料可包括：
·FAM-TAMRA、FAM-ABY或FAM-NED中的一种，和
·FAM-PET、FAM-ROX、FAM-JUN、FAM-Texas Red或TET-Alexa Fluor 594中的一种，和
·ABY-Alexa Fluor 647、NED-Alexa Fluor 647、
Figure SMS_54
ABY-ATTO 647TM或ABY-DyLight 650TM中的一种，和
·NED-Alexa Fluor 676、NED DyLight 680TM,
Figure SMS_55
ABY-Alexa Fluor676、ABY-DyLight 680TM或
Figure SMS_56
中的一种。
系统4000和/或5000可用于执行此处论述的用于10重样品测定的方法，该方法对包含三种同轴染料和两种离轴染料的样品进行多重测定，并且用于分析所得数据以同时确定或测量十种或更多种染料及其所缔合的靶分子的量。在某些实施方案中，此类10重或更高重的测定包括PCR测定(诸如qPCR测定、dPCR测定)、后PCR测定(诸如熔解曲线分析)等。
参见图20，在某些实施方案中，系统2000、3000、4000、5000可与进行或执行扩增测定(诸如qPCR测定)的方法2100一起使用。方法2100包括元件2105，该元件包括提供离轴染料和同轴染料。方法2100还包括元件2110，该元件包括对样品执行扩增测定。方法2100还包括元件2115，该元件包括在扩增测定的扩增测定的第一循环期间，用两个或更多个激发通道执行样品的第一系列照射。方法2100还包括元件2120，该元件包括响应于第一系列照射中的每个照射，测量来自两个或更多个发射通道的相应第一系列发射信号。方法2100还包括元件2125，该元件包括在扩增测定的扩增测定的第二循环期间，用两个或更多个激发通道执行样品的第二系列照射。方法2100还包括元件2130，该元件包括响应于第二系列照射中的每个照射，测量来自两个或更多个发射通道的相应第二系列发射信号。方法2100还包括元件2135，该元件包括基于来自第一系列测量的测量中的至少一个测量计算离轴染料或同轴染料的量。方法2100还包括元件2140，该元件包括基于来自第二系列测量的测量中的至少一个测量计算离轴染料和同轴染料中的另一种染料的量。
本发明人已经发现，如本文上文所述，离轴染料的独特特征或指纹可用于在测定中测量或计算样品中各种染料和/或其所缔合的靶分子的量时提高准确度，其中一种或多种染料在比同一样品内的其他染料更少的循环中产生超过背景荧光的荧光信号(例如，其中一种或多种染料具有较低的阈值循环Ct或交叉点Cp)。应当记得，图10、图14和图18中示出的ex-em空间曲线表示来自含有相等量或浓度的每种染料的样品的数据。在一些测定中，样品含有不同数量或浓度的靶分子。因此，在qPCR或相关扩增测定期间，染料与更大数量或浓度的靶分子缔合，来自这些染料的信号将在扩增测定中的早期循环期间被检测到，并且因此在任何可检测信号从其他染料产生之前，使得当测量来自更丰富的靶分子的荧光信号时，这些较不丰富的染料不产生串扰。
例如，参见图18，如果一种或两种离轴染料B13和/或B14与比那些与同轴染料A3和A4缔合的靶分子更丰富的靶分子缔合，则在扩增测定的早期循环期间，所检测到的信号主要来自x3-m3通道组合中的B13染料，以及/或者来自x4-m4通道组合中的B14染料。因此，由x3-m3和/或x4-m4通道组合产生的信号将主要归因于分别由B13和/或B14染料产生的信号，这允许计算在早期循环期间存在于溶液中的B13和/或B14的量。基于B13和/或B14的该计算值，在后期扩增循环期间存在的这些染料的量也可在后期循环期间计算，因为所缔合的靶分子的性能基于例如Ct或Cp的估计值。因此，一旦与A3和/或A4缔合的分子在扩增测定的后续循环期间开始发出荧光，就可从来自x3-m3和/或x4-m4的检测信号中减去来自B13和/或B14的计算信号。经调整的信号可用于计算与A3和/或A4染料缔合的分子的量。以类似的方式，B13和/或B14在一种或多种其他ex-em通道组合中的贡献可用于更准确地计算A3和/或A4在后期扩增循环中的量。
实施例
实施例1：t-Boc-F-染料1NHS酯(5)的合成。
荧光素供体染料根据方案1中针对2,7-二氟-磺基-荧光素3所示的一般程序合成。将间苯二酚衍生物(诸如1)与2-磺基-对苯二甲酸衍生物(诸如2)在甲磺酸中加热，并通过正相色谱分离。荧光素染料是O保护的，诸如针对将染料3转化为t-BOC保护的染料4所示，并通过标准程序转化为相应的NHS酯5。
方案1
Figure SMS_57
步骤1：F-染料1(3)的合成。
将4-氟间苯二酚(1，490mg，3.825mmol)和2-磺基-对苯二甲酸钠盐(2，513mg，1.913mmol)于甲磺酸(5mL)中的混合物在110℃加热6小时。将反应混合物冷却至室温并继续搅拌3天。加入冰H2O(100mL)并过滤所得悬浮液。将滤饼用部分冰H2O洗涤，然后悬浮于5mLMeOH中。将悬浮液用50mL Et2O稀释并过滤。将固体产物用Et2O洗涤并真空干燥，得到555mg(65％)3，为淡黄色固体。
步骤2：用t-Boc基团保护3。
将F-染料1(3，184mg，0.410mmol)悬浮于10mL MeCN中，并在室温下用二异丙基乙胺(0.644mL)和二碳酸二叔丁酯(537mg，2.46mmol)处理3天。加入H2O(0.5mL)并继续搅拌30分钟。将反应混合物直接装载到二氧化硅(Iatrobeads 6RS-8060)柱(2cm×22cm)上，并用10％至30％ MeOH/DCM洗脱该柱。蒸发适当的级分，得到216mg(65％)4，为棕色泡沫。
步骤3：t-Boc-F-染料1NHS酯(5)的合成。
将4(210mg，0.260mmol)、N-羟基琥珀酰亚胺(150mg，1.3mmol)和二环己基碳二亚胺(107mg，0.52mmol)于DCM(5mL)中的混合物在室温下搅拌3小时。将反应物用H2O(0.1mL)猝灭并再搅拌15分钟。过滤所得悬浮液，并将滤液直接装载到二氧化硅(Iatrobeads 6RS-8060)柱(2cm×15cm)上。用1:0:20:80至1:30:20:50的AcOH/MeOH/EtOAc/DCM洗脱该柱。将含有期望产物的级分蒸发，得到185mg(92％)5，为棕色泡沫。
实施例2：磺基-荧光素染料8和9的合成
通过采用实施例1用于从氟间苯二酚1合成磺基-荧光素3的一般程序，使用间苯二酚6和吡啶基间苯二酚(美国专利号6,221,604)7从磺基-对苯二甲酸2制备相应的磺基-荧光素染料8和9，如方案2所示。
方案2
Figure SMS_58
由于吡啶基取代基的存在，化合物9在520nm处是可激发的并且在544nm处发射，使得该染料适合用于实时PCR仪器的X2/m2(绿色)通道。通过MS分析(数据未示出)证实磺基FAM和吡啶基FAM产物的结构
实施例3：DPC-联吡啶-二氯-荧光素NHS酯(17)的合成。
如方案3所示，采用实施例1用于合成磺基-荧光素3的一般程序合成二氯磺基对苯二甲酸13并用于制备磺基-荧光素15。染料15是O保护的并被转化为NHS酯17。
方案3
Figure SMS_59
步骤1：2,5-二氯-3,6-二甲基-苯磺酰氯(11)：
向17.5g(0.1mol)2,5-二氯-对二甲苯10中加入53.2mL(0.8mol)氯磺酸。将反应混合物在室温下搅拌3天，然后用350mL DCM稀释。将DCM溶液非常缓慢地加入350g冰中并搅拌1小时。将混合物转移至分液漏斗中，并分离有机层，干燥(Na2SO4)，蒸发并真空干燥，得到25.56g(93％)11，为白色固体。1H NMR(CDCl3)δ7.63(s,1,4-H),2.84,2.46(2x s,6,2xCH3).MS(离子阱MS)m/z 273.0(计算值MH+＝272.9)。
步骤2：2,5-二氯-3,6-二甲基-苯磺酸锂盐(12)
向15.307g(60mmol)11的200mL MeOH溶液中缓慢加入75mL(150mmol)2N LiOH。将反应混合物在室温下搅拌18小时。将MeOH通过蒸发去除，并过滤产物于H2O中的所得悬浮液。将滤饼用20mL冷H2O洗涤，然后风干，得到14.5g 12，为白色结晶化合物。从滤液中分离第二批产物。3x的总产量为15.24g(97％)。1H NMR(CD3OD)δ7.42(s,1,4-H),2.76,2.38(2xs,6,2x CH3).MS m/e 253.0(计算值[M-Li]-＝253.0)。
步骤3：2,5-二氯-3-磺基-对苯二甲酸(13)
向25.286g(160mmol)KMnO4的400mL H2O溶液中加入5.221g(20mmol)12。将反应混合物搅拌并在温和回流下加热22小时。通过缓慢加入100mL MeOH来破坏过量的KMnO4，同时保持回流并搅拌30分钟。趁热过滤反应混合物。将滤饼再次悬浮于H2O/MeOH(200mL/50mL)的混合物中，加热至沸腾并趁热过滤。将合并的滤液蒸发至干，并重新溶解于50mL H2O中。过滤H2O溶液，并将滤液蒸发。在Dowex 50W-X8 H+柱(4cm×34cm，450mL树脂，用350mL H2O洗脱)上纯化残余物。蒸发H2O溶液，得到4.6g(73％)13，为白色固体。1H NMR(CD3OD)δ7.80(s,1,6-H).MS m/e 313.0(计算值[M-H]-＝312.9)。
步骤4：染料化合物(15)
将473mg(1.5mmol)13和561mg吡啶并-间苯二酚14于6mL MeSO3H中的混合物在170℃至180℃搅拌28小时，然后冷却至室温，并沉淀于160mL Et2O中。将固体通过离心收集，然后重新溶解于30mL H2O中。用20％ NaOH将H2O溶液的pH值调节至约为5。将所得悬浮液离心并倾析出上清液。将固体重悬于30mL水中，超声处理，离心，并将H2O洗涤过程再重复一次。将粗固体产物重悬于20mL MeOH中，超声处理，用40mL EtOAc稀释，涡旋并离心。将固体产物风干，然后真空干燥，得到502mg(53％)15，为深红色固体。1H NMR(CD3OD)δ8.73(d,2),8.46(dd,2),7.96(m,2),7.64(s,1),7.45(m,2),7.17(s,2),6.84(s,2).MS m/z 635.0(计算值[MH]+＝635.0)。
步骤5：DPC-染料酸(16)
将64mg(0.1mmol)15和46mg(0.2mmol)Ph2NCOCl于6mL吡啶中的混合物在室温下搅拌2小时。加入H2O(0.1mL)并继续搅拌1小时。将挥发性物质通过蒸发以及与1:50:50的i-Pr2Net/DCM/PhCH3(2x)共蒸发去除。将残余物溶解于10％ MeOH/DCM(25mL)中并用H2O(25mL)洗涤。将H2O溶液用10％ MeOH/DCM(25mL×4)萃取。将有机层和萃取物合并，并蒸发。通过二氧化硅(来自Shell-USA的Iatrobeads 6RS-8060)柱色谱使用0-20％ H2O/MeCN作为洗脱液来残余物。蒸发适当的级分，得到39mg(47％)16。MS m/z 830.0(计算值[MH]+＝830.0)。
步骤6：DPC-染料-NHS酯(17)
向39mg(0.047mmol)16和27mg(0.235mmol)N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的1.5mL DCM溶液中加入19mg(0.094mmol)二环己基碳二亚胺(DCC)。将反应混合物在室温下搅拌3小时，然后用10％ HCl(0.1mL)猝灭。将挥发性物质通过蒸发去除，并将残余物溶解于5％ MeOH/DCM(5mL)中，并通过二氧化硅(来自Shell-USA的Iatrobeads 6RS-8060)柱色谱使用梯度(1:5:95至1:30:70)的AcOH/MeOH/DCM作为洗脱液来纯化。蒸发适当的级分，得到31mg(71％)17。
实施例4：FRET-接头(24)的合成。
制备L1型能量转移接头24(本文中称为“Y-接头”)的合成方法概述于下文方案4中。用N-溴琥珀酰亚胺对2,5-二甲基苯甲酸甲酯18进行溴化，得到二溴化物19。用叠氮化钠对19进行后续处理，随后对中间体二叠氮化物20进行皂化。所得酸21用N,N,N',N'-四甲基-O-(N-琥珀酰亚胺基)脲鎓四氟硼酸盐(TSTU)活化，然后用大量过量的2,2'-(乙二氧基)双(乙胺)猝灭，得到胺衍生物22。22与戊二酸酐的进一步反应得到羧酸衍生物23，该羧酸衍生物在雷尼镍(Raney-Nickel)的存在下通过氢化转化为期望的Y-接头24。
方案4
Figure SMS_60
步骤1：二溴化物(19)的合成。
向18(11.5g，70mmol)的四氯化碳(100mL)溶液中加入N-溴琥珀酰亚胺(23.7g，133.2mmol)和过氧化苯甲酰(1.7g，7mmol)。将反应混合物在80℃搅拌6小时。将该反应混合物冷却至室温，并用己烷(50mL)稀释。过滤所得悬浮液，并将滤液蒸发。将残余物从己烷中分级重结晶，得到6.7g(31％)19，为白色结晶化合物。
步骤2：二溴化物(19)的置换。
将19(6.7g，20.8mmol)的DMF(40mL)溶液在室温下用叠氮化钠(6.8g，104.0mmol)处理16小时。将反应混合物用DCM(50mL)稀释并过滤。将滤液蒸发，并将残余物重新溶解于DCM(150mL)中。将DCM溶液用H2O(100mL)、盐水溶液(100mL)洗涤，干燥(Na2SO4)并过滤。蒸发滤液，并将残余物真空干燥，得到5.06g(99％)20，为浆状物。
步骤3：化合物(20)的皂化。
向20(5.05g，20.5mmol)的MeOH(80mL)溶液中加入LiOH/H2O溶液(1.72g，41.0mmol)。将反应混合物在室温下搅拌16小时，然后用10％ HCl溶液(14.8mL)酸化。将挥发性物质通过蒸发去除，并将残余物溶解于DCM(150mL)中。将DCM溶液用H2O(100mL)、盐水溶液(100mL)洗涤，干燥(Na2SO4)并过滤。将滤液蒸发，并将残余物从EtOAc/己烷中重结晶，得到4.17g(2批，88％)21，为白色结晶针状物。
步骤4：胺(22)的合成。
将21(929mg，4.0mmol)、二异丙基乙胺(1.394mL，8.0mmol)和TSTU(1.806g，6.0mmol)的DCM(20mL)溶液在室温下搅拌1小时。然后将该反应混合物缓慢加入2,2'-(乙二氧基)双(乙胺)/DCM溶液(2.929mL/20mL)中，并再搅拌3小时。加入DCM(100mL)，并将DCM溶液用盐水溶液(100mL×2)洗涤，干燥(Na2SO4)并过滤。将滤液蒸发，并在二氧化硅(Iatrobeads 6RS-8060)柱(2.5cm×17cm)上使用1:10:90至1:35:65的Et3N/MeOH/DCM作为洗脱液来纯化残余物。蒸发适当的级分，得到1.15g(79％)22，为浆状物。
步骤5：酸(23)的合成。
向22(1.142g，3.151mmol)的DCM(15mL)溶液中加入二异丙基乙胺(1.098mL，6.302mmol)和戊二酸酐(0.539g，4.727mmol)。将反应混合物在室温下搅拌17小时。加入H2O(0.2mL)并继续搅拌15分钟。将挥发性物质通过蒸发去除，并将残余物重新溶解于DCM(120mL)中。将DCM溶液用0.1N HCl(100mL)洗涤，干燥(Na2SO4)并过滤。将滤液蒸发，并在二氧化硅(Iatrobeads 6RS-8060)柱(2cm×20cm)上使用1:5:95至1:10:90的Et3N/MeOH/DCM作为洗脱液来纯化残余物。蒸发适当的级分，得到1.43g(95％)23，为浆状物。
步骤6：二甲基氨基-FRET-接头24的合成。
将23(300mg，0.630mmol)和雷尼镍(约200mg，湿重)于MeOH(15mL)中的悬浮液在H2下搅拌20小时。然后将反应混合物通过硅藻土过滤并将滤液蒸发。将残余物与MeOH共蒸发并真空干燥，得到260mg(97％)24，为泡沫。
实施例5：染料接头中间体的合成。
染料接头中间体的合成一般遵循下文方案5中概述的用于形成t-BOC-保护的磺基-FAM-ET-接头NHS酯28的程序。ET-接头，例如24与t-Boc-保护的染料NHS酯(诸如25)偶联，得到染料接头中间体(诸如26)，为位置异构体的混合物。在经二氧化硅柱纯化后，纯的位置异构体氨基可用三氟乙酰基保护以用于逐步分析物标记，或者直接用于用第二染料NHS标记以产生ET染料。为了产生染料-接头中间体NHS，诸如下文所示，用TFA基团保护游离氨基，并活化羧酸基团，得到t-Boc-染料-ET-接头NHS酯28。
方案5
Figure SMS_61
步骤1：t-Boc-染料NHS酯(25)与接头(24)的偶联。
向接头(24，130mg，0.306mmol)和二异丙基乙胺(0.07mL)于DCM(5mL)中的混合物中加入t-Boc-染料NHS酯(25，148mg，0.2mmol)。将反应混合物在室温下搅拌2小时。将挥发性物质通过蒸发去除，并在二氧化硅(Iatrobeads 6RS-8060)柱(2cm×26cm)上使用5％至20％ H2O/MeCN作为洗脱液来纯化残余物。蒸发适当的级分，得到80mg(44％)26，为位置异构体。
步骤2：用三氟乙酰基保护26。
将26(77mg，0.084mmol)、二异丙基乙胺(0.2mL)和三氟乙酸乙酯(0.3mL)于MeOH(3mL)中的混合物在室温下搅拌18小时。将挥发性物质通过蒸发去除，并将残余物与MeCN和DCM共蒸发，得到羧酸27。该物质无需进一步纯化即可直接用于后续反应。
步骤3：t-Boc-染料-接头NHS酯(28)的合成。向27(来自先前反应)的DCM(10mL)溶液中加入二异丙基乙胺(0.1mL)和TSTU(50mg，0.167mmol)。将反应混合物在室温下搅拌2.5小时。将溶剂通过蒸发去除，并在二氧化硅(Iatrobeads 6RS-8060)柱(2cm×16cm)上使用1:5:95至1:20:80的AcOH/MeOH/DCM作为洗脱液来纯化残余物。蒸发适当的级分，得到81mg(总计87％)染料-接头NHS中间体28，为固体。
实施例6：染料接头中间体(32)的合成。
染料接头中间体的合成一般遵循下文方案6中概述的用于形成Cy3-FRET-接头NHS酯32的程序。将接头(诸如24)与Cy3染料NHS酯(诸如29)偶联，得到染料接头中间体诸如30，为位置异构体的混合物。在经二氧化硅柱纯化后，纯的位置异构体氨基可用三氟乙酰基保护以用于逐步分析物标记，或者直接用于用第二染料NHS标记以制备ET染料。为了制备染料-接头中间体NHS28，诸如下文所示，用TFA基团保护26中的游离氨基，得到27，并将羧酸基团活化为Cy3-FRET-接头NHS酯28。
方案6
Figure SMS_62
步骤1：将Cy3 NHS酯(29)与ET-接头(24)偶联。
向ET-接头(24，130mg，0.306mmol)和二异丙基乙胺(0.07mL)于DMF(5mL)中的混合物中加入Cy3 NHS酯(29，0.2mmol)。将反应混合物在室温下搅拌2小时。将反应溶液加入20mL乙醚中。从所得油状沉淀中倾析出母液，并将该沉淀悬浮于10％ MeOH/CH2Cl2中，通过正相色谱纯化，用10％ MeOH/CH2Cl2/1％ AcOH进行洗脱。蒸发适当的级分，得到30，为位置异构体的混合物。
步骤2：用三氟乙酰基保护30。将30(77mg)、二异丙基乙胺(0.2mL)和三氟乙酸乙酯(0.3mL)于MeOH(3mL)中的混合物在室温下搅拌18小时。将挥发性物质通过蒸发去除，并将残余物与MeCN和DCM共蒸发，得到羧酸31。该物质无需进一步纯化即可直接用于后续反应。
步骤3：Cy3-ET-接头NHS酯(32)的合成。
向31(来自先前反应)的DCM(10mL)溶液中加入二异丙基乙胺(0.1mL)和TSTU(50mg，0.167mmol，2当量)。将反应混合物在室温下搅拌2.5小时。将溶剂通过蒸发去除，并在二氧化硅(Iatrobeads 6RS-8060)柱(2cm×16cm)上使用1:5:95至1:20:80的AcOH/MeOH/DCM作为洗脱液来纯化残余物。蒸发适当的级分，得到Cy3-接头NHS中间体32，为固体。
实施例7：Cy3-Cy5.5 ET染料NHS(35)合成
将纯的异构体Cy3-接头中间体30(10mg)悬浮于3mL无水DMF和6当量二异丙基乙胺(11μL)中。加入悬浮于2mL DMF中的来自GE Healthcare的Cy5.5-NHS酯33(1.2当量，12mg)，并将反应物在室温下搅拌5小时。通过加入乙腈/乙醚并收集沉淀的固体来分离粗产物。通过正相柱色谱(Iatrobeads 6RS-8060)使用5％至20％ H2O/MeCN/1％ NEt3作为洗脱液来分离ET染料羧酸产物34。将ET染料34悬浮于具有6当量DIPEA的DMF中。加入固体TSTU(3当量)，并将混合物在室温下搅拌3小时。通过加入乙酸乙酯使粗双发色团Cy3-Cy5.5 ET染料NHS35沉淀。将所得固体沉淀收集并重悬于AcCN中，将残余物收集并且无需进一步纯化即可使用。方案7的程序可用以NHS形式提供的其他类型的染料代替Cy3来实施，这些其他类型的染料诸如AF 555、FAM、BODIPY 530/550、BODIPY R6G和BODIPY TMR，它们都可从赛默飞世尔科技(Waltham，MA)获得。可用于代替方案7中示出的程序中的Cy3的其他染料包括荧光素和罗丹明染料的NHS衍生物，诸如NED、VIC、HEX或JOE。在方案7中，可用于代替Cy5.5的NHS形式的其他花青染料包括例如可从赛默飞世尔科技获得的AF647、AF660和AF680。
Figure SMS_63
实施例8.ET染料合成和分析物标记。
期望的目标分析物的标记根据底物遵循单步骤或两步骤标记程序，其中分析物胺与预先形成的供体/受体ET染料NHS酯偶联以直接得到期望的ET染料标记的分析物，或者可在第一步骤中加入氨基保护的染料-接头中间体NHS，分离分析物-接头-染料标记的中间体，N-脱保护，随后在第二步骤中用互补染料NHS标记以产生ET染料标记的分析物(参见图1)。
实施例8a：分析物的单步骤ET染料标记。
单步骤寡核苷酸标记遵循方案9中概述的用预先形成的ET染料(诸如染料35)标记氨基衍生的寡核苷酸的一般程序来执行。将氨基衍生的寡聚物(30000pM)悬浮于250μL的100毫摩尔NaHCO3 DI水中。加入悬浮于5μL DMSO中的3当量(0.2mg)35。将反应物搅拌5小时，加载到经1x TEAA平衡的LH-20尺寸排阻柱上，并收集移动较快的寡核苷酸染料标记带40。通过RP HPLC纯化用5％至60％ AcCN的1x TEAA溶液进行洗脱来分离纯产物。
Figure SMS_64
实施例8b：分析物的两步骤ET染料标记
使用两步骤标记方法，采用荧光素-接头NHS中间体28或Cy3-接头NHS中间体32与适当的报道基因染料NHS酯组合来合成一系列ET染料，得到下文方案10中示出的一系列ET染料。方案10中示出的染料标记的寡核苷酸的制备方法示于方案11中。
方案10
Figure SMS_65
Figure SMS_66
首先，用染料-接头NHS中间体(诸如Cy3-接头NHS中间体32)标记底物，得到染料-接头标记的寡核苷酸中间体41，将该寡核苷酸中间体通过反相HPLC纯化，随后用Cy5.5染料NHS的DMF和DIPEA溶液进行标记，得到ET染料标记的寡核苷酸42。
实施例9：猝灭剂连接
根据方案12中的以下反应，猝灭剂化合物可与固体载体例如珠粒子连接，得到用于使用寡核苷酸合成器构建探针的底物。
方案12
Figure SMS_67
Figure SMS_68
以下示例性合成程序可容易地推广至上述猝灭剂中的任一种猝灭剂。
在一些实施方案中，代表性衍生化猝灭剂44可根据以下程序合成。将代表性猝灭剂43NHS酯(100mg，0.123mmol)溶解于1mL无水DCM中。将溶解于1213μL DCM(5％溶液)中的1-O-DMT-2-(4-氨基丁基)-1,3-丙二醇(61mg，0.14mmol)与二异丙基乙胺(32μL，0.19mmol)混合。在室温下将该混合物逐滴加入代表性猝灭剂43NHS酯中，并在氮气下搅拌30分钟。将粗代表性猝灭剂44的DCM溶液用DCM(50mL)稀释，并用1％柠檬酸、水洗涤，然后用盐水洗涤。有机层经Na2SO4干燥并蒸发至干。进一步高真空干燥过夜，得到125mg(88％产率)44，为深蓝色固体。该产物无需进一步纯化即可用于下一步骤。1H NMR(400MHz,CD2Cl2):δ8.14(1H,d),7.83(2H,m),7.60(2H,d),7.50–7.10(22H,m),6.80(4H,m)4.40(2H,m),4.25(2H,m),3.75(6H,s),3.62–3.50(4H,m),3.30(6H,m),3.05(2H,m),2.51(2H,t),2.40(1H,t),1.72(2H,d),1.50–1.20(7H,m).LC/HRMS(ESI+)对于[M+]的计算值为1113.48；实测值为1113.47。用从40％至100％乙腈(相对于0.1M乙酸三乙铵)的20分钟线性梯度进行洗脱。流速为1.0ml/min。在285nm和655nm处检测。
在另一个实施方案中，包括二甘醇接头45的代表性猝灭剂可根据以下程序合成。将代表性猝灭剂44(125mg，0.109mmol)溶解于3mL无水DCM中。加入DIPEA(47μL，0.27mmol)，随后加入二甘醇酸酐(25mg，0.22mmol)。将溶液在氮气下搅拌30分钟。将反应溶液浓缩，并将残余物重新溶解于1％ TEA/DCM中，并在硅胶柱色谱(在10％至1％TEA/DCM中预平衡)上使用5％至15％ MeOH/DCM/1％ TEA洗脱液来纯化。将纯化的合并物浓缩，然后用1％柠檬酸、水和盐水洗涤。将有机层经无水Na2SO4干燥，蒸发至干，然后在高真空下进一步干燥，得到代表性猝灭剂二甘醇接头(45)(96mg，69％产率)，为深蓝色固体。1H NMR(400MHz,CD2Cl2):δ8.14(1H,d),7.85(2H,m),7.60(2H,d),7.52–7.10(22H,m),6.79(4H,d),4.35(2H,m),4.25(2H,m)4.05(3H,s/m),3.80(2H,s),3.72(6H,s),3.28(6H,m),3.00(2H,m),2.90(2H,m),2.50(2H,t),2.32(1H,t),1.65(2H,m),1.50–1.10(7H,m).LC/HRMS(ESI+)对于[M+]的计算值为1229.49；实测值为1229.49。用从40％至100％乙腈(相对于0.1M乙酸三乙铵)的20分钟线性梯度进行洗脱。流速为1.0ml/min。在285nm和655nm处检测。
根据以下程序，代表性猝灭剂45可与固体载体例如聚苯乙烯珠粒连接，得到46。将代表性猝灭剂二甘醇接头45(357mg，0.20mmol)溶解于50mL无水DMF中。向其中加入氨基甲基聚苯乙烯(6.77g，0.223mmol，33μmol/g胺)、DIPEA(194μL，1.12mol)和COMU或1-氰基-2-乙氧基-2-氧代亚乙基氨基氧基)二甲基氨基-吗啉代-碳鎓六氟磷酸盐(287mg，0.669mmol)。将混合物振摇3小时。将溶剂去除，并将树脂洗涤3次，每次用50mL的DMF、MeCN和DCM洗涤。然后通过以下方法将树脂上的任何其余胺基封端：和与50mL 1-N-甲基咪唑的THF溶液混合的50mL乙酸酐/吡啶的THF溶液反应，并振摇1小时。将溶剂去除，并将树脂洗涤3次，每次用THF、MeCN和DCM洗涤。然后将树脂在高真空下干燥过夜，得到6.60g代表猝灭剂46，为浅蓝色粉末。使用茚三酮测试对树脂载体的任何残余胺基进行测试，并发现具有0.94μmol/g胺(可忽略)。与载体偶联的代表性猝灭剂的量通过以下方法测定：用已知体积的0.1M甲苯磺酸的MeCN溶液裂解代表性猝灭剂PS样品的称量等分试样的DMT基团。获得在498处的吸光率，并且使用消光系数(76500M-1cm-1)、质量和容积，发现每g聚苯乙烯的代表性猝灭剂的装载量为22μmol/g。已知该偶联条件的通常范围为20μmol/g至27μmol/g。
实施例10：猝灭剂固体载体氨基探针合成
猝灭剂化合物和ET染料可与固体载体例如珠粒连接，得到用于使用寡核苷酸合成器构建探针的底物，得到根据以下反应方案使用L3(即，47)-L4(即，49)型接头(参见图3)的猝灭剂-ET染料寡核苷酸探针构建体：
通过称出11mg QSY21散装固体载体(22μmol/g装载量)并倒入3900柱主体中来填装0.25μmol QSY21 3900柱。Biolytics 3900合成器根据3900合成标准方案用所有标准试剂制备，这些标准试剂包括染料亚磷酰胺50和接头亚磷酰胺(47和49)。将28％ DIPA/乙腈试剂安置在3900上的位置6中。在无水乙腈中制备0.1M浓度的专用试剂。在MicrosoftExcel中打开3900序列模板，并键入每个寡核苷酸序列的相关寡核苷酸序列信息。通过将QSY21柱放置在合成页面上指定的柱位置的每个库中，从而将这些柱装载到DNA合成器中。填装试剂管线。开始寡核苷酸合成。一旦寡核苷酸合成步骤完成，就可通过将合成柱放置在真空板上并将真空板放置在真空歧管上并开启真空5分钟，从而将QSY载体完全干燥以去除任何残留的乙腈。向柱中加入50/50胺/甲醇/水裂解溶液并等待10分钟。排出全部洗涤溶液。重复。将加盖的柱小瓶放入设置为65℃的savant或等同物中，并加热4小时至5小时。取出小瓶并在冰箱中放置10分钟以冷却。冷却后，从小瓶上取下盖子，并在真空下将该小瓶放置在savant或等同物和干燥的寡核苷酸中。乙醇通过在Eppendorf管中用不含核酸酶的水稀释寡核苷酸并涡旋来沉淀干燥的QSY-染料标记的寡核苷酸51。加入50mM乙酸钠的乙醇溶液并涡旋。将寡核苷酸置于冰箱中冷却。将试管以2500rpm离心5分钟，以沉淀粗产物，从寡核苷酸试管中取出上清液倒入废烧杯中。重复三次，并在真空savant中干燥寡核苷酸沉淀。
将干燥的氨基QSY寡核苷酸52从savant中取出并悬浮于0.25M碳酸氢钠水溶液(pH为8.5)中，伴随涡旋以及温和加热。在DMSO中制备60mM的染料NHS酯Alexa Fluor 647(53)溶液。将染料DMSO溶液(5当量)加入寡核苷酸中，并涡旋该溶液。将反应在室温下进行1小时至2小时，伴随间歇搅拌。通过收集反应混合物的质谱来监测反应，并且当标记的产物达到80％转化率时，停止反应，通过添加50mM乙酸钠的乙醇溶液进行乙醇沉淀，将反应物冷却并通过离心收集所沉淀的物质，然后真空干燥该沉淀。通过反相HPLC采用0.1M TEAA和0.1MTEAA的50/50乙腈/水溶液来分离纯QSY标记探针53。
方案13的程序可用以亚磷酰胺形式提供的其他类型的染料(诸如VIC、NED和HEX)代替FAM来实施。可用于代替方案13中的AF647的其他染料包括花青染料的NHS衍生物(诸如AF660和AF680)或罗丹明染料(诸如TAMRA或ROX)。
方案13
Figure SMS_69
实施例11：使用L2接头制备ET染料
荧光素-罗丹明能量转移染料的制备方法如下：通过使4-氨基甲基苯甲酸与4-氨基甲基-5-羧基荧光素反应，随后与罗丹明HNS酯缀合，使用L2接头与罗丹明染料诸如ROX罗丹明来执行该制备(方案14)(参见图2)。
ROX-L2-NHS的合成
将5-ROX-NHS54(5mg，9μmol)、4-氨基甲基苯甲酸55(3mg，19μmol)和三乙基胺(20μl)的混合物悬浮于1.5ml Eppendorf管中的二甲基甲酰胺(DMF，200μl)中(方案14)。将混合物加热至60℃达10分钟。通过硅胶上的TLC监测反应进程，用二氯甲烷、甲醇和乙酸的400/30/10混合物洗脱。将不溶解的4-氨基甲基苯甲酸通过离心分离，并将DMF溶液倾析到5％HCl(1ml)中。将不溶解的4-氨基甲基苯甲酸-5-ROX56通过离心分离，用5％ HCl(2×1ml)洗涤并在真空离心机中干燥。
方案14
Figure SMS_70
将粗4-氨基甲基苯甲酸-ROX56的DMF溶液(125μl)、二异丙基乙胺(10μl)和二琥珀酰亚胺基碳酸酯(10mg)混合在1.5ml Eppendorf管中，并加热至60℃。通过硅胶上的TLC监测反应进程，用二氯甲烷、甲醇和乙酸的600/60/16混合物洗脱。5分钟后，反应似乎完成。将溶液稀释到二氯甲烷(3ml)中，并用250mM碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液(pH为9，4×1ml)洗涤，将有机层干燥(Na2SO4)并在真空离心机中浓缩至干，得到57。将固体溶解于DMF(100μl)中。产率通过将等分试样稀释到缓冲液(pH为9)中并测量552nm处的吸光度来测定。使用50000/cm/M的消光系数，4-氨基甲基苯甲酸-5-ROX-NHS57的浓度为4.8mM，来自54的产率为8％。
FAM-ROX ET染料的合成
将4-氨基甲基苯甲酸-5ROX NHS57溶液(1μmol于250μl DMF中)与4-氨基甲基-5-羧基荧光素58(19，2.2μmol于100μl DMSO中)和三乙基胺(20μl)于1.5ml Eppendorf管中的溶液混合(方案15)。通过使用C8反相柱的HPLC监测反应，其中洗脱梯度为15％至35％乙腈与0.1M TEAA。HPLC分析表明57被消耗，留下过量的未反应的58。将反应物用5％ HCl(1ml)稀释，并通过离心分离FAM-ROX ET染料酸产物59，将未反应的58留在水相中。将固体用5％HCl(4×1ml)洗涤，在真空离心机中干燥并吸收在DMF(300μl)中。产率是定量的。
方案15
Figure SMS_71
FAM-ROX ET-NHS的合成
将FAM-ROX ET染料59溶液(0.6μmol于100μl DMF中)、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(DEC，2mg)和N-羟基琥珀酰亚胺(4mg)混合在1.5ml Eppendorf管中(方案16)。将混合物短暂超声处理并加热至60℃。通过硅胶上的TLC监测反应，用二氯甲烷、甲醇和乙酸的600/60/16混合物洗脱。反应在30分钟内完成，并用5％ HCl稀释。将沉淀的产物60通过离心分离，并在真空离心机中干燥。将活化的FAM-ROX ET染料NHS60溶解于DMF(20μl)中。
方案16
Figure SMS_72
ET染料标记的寡核苷酸的制备
下文描述了L2 ET ROX标记的寡核苷酸的代表性制备(方案17)。将5-氨基己基官能化的寡核苷酸(10μl，1mM)于碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液(2μl，1M)中的溶液和ET ROX-NHS60(10μl，12mM于二甲亚砜中)混合。在室温下10分钟后，将溶液在Sephadex G-25上进行凝胶过滤以分离游离染料。收集含有染料标记的寡核苷酸和未标记的寡核苷酸的级分，并将该级分在反相柱上进行HPLC纯化。使用洗脱梯度为10％至30％乙腈与0.1M TEAA来分离未标记的寡核苷酸以及染料标记的寡核苷酸的每种染料异构体。将含有染料标记的寡核苷酸的溶液在真空离心机中浓缩，并重新溶解于TE缓冲液中。
方案17
Figure SMS_73
应当理解，虽然已经通过插图和实施例详细描述了前述实施方案，但是在不脱离如以下条款和权利要求书中描述的本发明的实质神和范围的情况下，许多修改、替换和改变是可能的。
1.一种荧光能量转移染料缀合物，包含：
i.供体染料，所述供体染料能够吸收第一波长处的光并且发射激发能量作为响应；
ii.受体染料，所述受体染料能够吸收由所述供体染料发射的所述激发能量并且发射第二波长处的光作为响应；和
iii.接头，所述接头将所述供体染料共价连接至所述受体染料，其中所述接头包括以下项中的一者或多者：烷基部分、氨基-烷基部分、氧基-亚烷基部分、氨基-亚烷基-二烷氧基部分、亚烯基部分、亚炔基部分、聚醚部分、亚芳基部分、酰胺部分或磷酸二酯部分。
2.根据条款1所述的能量转移染料缀合物，其中所述第二波长比所述第一波长长。
3.根据条款1或2所述的能量转移染料缀合物，其中所述供体染料选自呫吨染料、花青染料、吡咯硼染料、嵌二萘染料、焦宁染料和香豆素染料。
4.根据前述条款中任一项所述的能量转移染料缀合物，其中所述供体染料是荧光素染料或罗丹明染料。
5.根据前述条款中任一项所述的能量转移染料缀合物，其中所述受体染料选自荧光素染料、花青染料、罗丹明染料、吡咯硼染料、嵌二萘染料、焦宁染料和香豆素染料。
6.根据前述条款中任一项所述的能量转移染料缀合物，其中所述缀合物与分析物连接并且具有选自以下项中的一者的基本结构：
Figure SMS_74
其中L1为第一接头，其中L1通过共价键或通过包含一个或多个居间原子的间隔区与D1、D2和A连接；
其中L2为第二接头，其中L2通过共价键或通过包含一个或多个居间原子的间隔区与D2和D3中的每一者连接；
其中L3为第三接头，其中L3通过共价键或通过包含一个或多个居间原子的间隔区与每个PO4H和D1连接；
其中L4为第四接头，其中L4通过共价键或通过包含一个或多个居间原子的间隔区与PO4H和D2连接；
其中A为分析物；
其中D1、D2和D3中的每一者可互换地为供体染料或受体染料；
其中LI和LIII中的D1和D2与LII中的D2和D3的组合形成能量转移染料对。
7.根据条款6所述的能量转移染料缀合物，其中所述L1接头包括下式的亚芳基部分
Figure SMS_75
其中
每个R1独立地为-C1-C10烷基-N(R3)-*、-C2-C10烯基-N(R3)-
*、-C2-C10炔基-N(R3)-*、-OC1-C10烷基-*、-C1-C10烷基-O-*、-
N(R3)C1-C6烷基-*、-N(R3)C1-C6烷基-O-*、-OC1-C6烷基-N(R3)-
*；或-N(R3)-*；
每个R2独立地为-C(O)N(R4)、-C1-C10烷基-C(O)N(R4)、-C2-C10烯基-C(O)N(R4)、-C2-C10炔基-R4、-C(O)N(R4)、-N(R3)-C(O)N(R4)、C1-C6烷基-O-C(O)N(R4)、-OC1-C6烷基-C(O)N(R4)、-N(R4)、卤素、-CO2 -Z+、-SO3R4或-SO3 -Z+；
每个R3独立地为H或C1-C6烷基；
每个R4独立地为H、C1-C6烷基或与A的连接点，其中与A的所述连接是通过共价键或通过包含一个或多个居间原子的间隔区；
每个*表示与D1或D2的连接点，其中与D1或D2的所述连接是通过共价键或通过包含一个或多个居间原子的间隔区；
Z+为阳离子(例如，Na+、K+或NH4 +)；
n为2、3或4；并且
m为0、1、2、3或4，前提条件是n+m＝3至6。
8.根据条款6所述的能量转移荧光染料缀合物，其中所述L1接头包括亚芳基部分和双烷基氨基部分或双羧基酰胺基部分中的一个或多个部分，其中所述L1接头还包括与A的连接点，其中与A的所述连接是通过共价键或通过包含一个或多个居间原子的间隔区。
9.根据条款6所述的能量转移染料缀合物，其中所述L2接头包括下式的亚芳基部分
Figure SMS_76
其中
每个R1独立地为-C1-C10烷基-N(R3)-*、-C2-C10烯基-N(R3)-*、-C2-C10炔基-N(R3)-*、-OC1-C10烷基-*、-C1-C10烷基-O-*、-N(R3)C1-C6烷基*-、-N(R3)C1-C6烷基-O-*、-OC1-C6烷基-N(R3)-*；或-N(R3)-*；
每个R2独立地为-C(O)N(R3)-*、-C1-C10烷基-C(O)N(R3)-*、-C2-C10烯基-C(O)N(R3)-*、-C2-C10炔基-(R3)-*、-C(O)N(R3)-*、-N(R3)-C(O)N(R3)-*、C1-C6烷基-O-C(O)N(R3)-*,-OC1-C6烷基-C(O)N(R3)-*、-N(R3)-*、卤素、-CO2 -Z+或-SO3 -Z+；
每个R3独立地为H或C1-C6烷基；
每个*表示与D2或D3的连接点，其中与D2或D3的所述连接是通过共价键或通过包含一个或多个居间原子的间隔区。
Z+为阳离子(例如，Na+、K+或NH4 +)；
n为2、3或4；并且
m为0、1、2、3或4，前提条件是n+m＝2至6。
10.根据前述条款中任一项所述的能量转移染料缀合物，其中所述接头包括下式的片段
Figure SMS_77
其中每个R2、m和*如上文所定义。
11.根据条款6所述的能量转移染料缀合物，其中所述L3接头包括下式的片段。
Figure SMS_78
其中
R5为H或C1-C6烷基；
n为2、3或4；
X为O或CH2；
L4为与D2的连接，其中L4为共价键或包含一个或多个居间原子的间隔区；
R7为与PO3H-A的连接点，其中与PO3H-A的所述连接是通过共价键或通过包含一个或多个居间原子的间隔区；并且
其中*表示与D1的连接点，其中与D1的所述连接是通过共价键或通过包含一个或多个居间原子的间隔区。
12.根据条款11所述的能量转移染料缀合物，其中所述L4接头包括下式的磷酸二酯部分
Figure SMS_79
其中
Y包括烷氧基部分、烷基部分、亚芳基部分或寡核苷酸部分中的一者或多者；
p为0至10的整数；
D2或A包含氧原子，其中每个*表示所述磷酸二酯部分与D2或A中的所述氧原子的连接点，其中所述磷酸二酯与D2或A中的所述氧原子的所述连接是通过共价键或通过包含一个或多个居间原子的间隔区。
13.根据条款12所述的能量转移染料缀合物，其中Y为C1-C10烷基或聚(亚烷基二醇)。
14.根据条款6至13中任一项所述的能量转移染料缀合物，其中所述L3和所述L4接头的组合包括下式
Figure SMS_80
其中
R7包括与A连接的磷酸二酯基团，其中所述磷酸二酯基团与磷酸二酯部分、烷氧基部分、氨基-烷基部分、烷氧基部分、烷基部分、聚醚部分或亚芳基部分中的一者或多者连接，
PAG为聚(亚烷基二醇)，其中所述聚(亚烷基二醇)是或包括
C2-C6直链或支链亚烷基链；
n为2至6；并且
p为1至4。
15.根据条款14所述的能量转移染料缀合物，其中所述PAG为戊乙二醇。
16.根据条款6至15中任一项所述的能量转移染料缀合物，其中所述分析物是选自核酸分子、肽、多肽、蛋白质和碳水化合物的生物分子。
17.根据前述条款中任一项所述的能量转移染料缀合物，其中所述能量转移染料缀合物与寡核苷酸共价连接(例如，通过共价键或通过包含一个或多个居间原子的间隔区)。
18.一种寡核苷酸探针，包含：
i.寡核苷酸；和
ii.根据条款1至17中任一项所述的能量转移染料缀合物，所述能量转移染料缀合物与所述寡核苷酸共价连接(例如，通过共价键或通过包含一个或多个居间原子的间隔区)。
19.根据条款17所述的寡核苷酸探针，还包含与所述寡核苷酸共价连接的猝灭剂染料(例如，通过共价键或通过包含一个或多个居间原子的间隔区)。
20.根据条款18或19所述的探针，其中所述寡核苷酸包括修饰。
21.根据条款20所述的探针，其中所述修饰包括小沟结合剂(MGB)。
22.根据条款21所述的探针，其中所述修饰包括锁核酸(LNA)。
23.根据条款18所述的探针，其中所述荧光能量转移染料缀合物与所述寡核苷酸的3'末端、内部或5末端共价连接。
24.根据条款19所述的探针，其中所述荧光能量转移染料缀合物与所述寡核苷酸的所述5'末端共价连接。
25.根据条款19所述的探针，其中所述猝灭剂染料与所述寡核苷酸的所述3'末端共价连接。
26.根据条款19所述的探针，其中所述荧光能量转移染料缀合物和所述猝灭剂染料与所述寡核苷酸的相对末端共价连接。
27.根据条款19所述的探针，其中所述荧光能量转移染料缀合物与所述寡核苷酸的所述5'末端共价连接，并且所述猝灭剂染料与所述寡核苷酸的所述3'末端共价连接。
28.根据前述条款中任一项所述的探针，其中所述探针是水解探针。
29.根据前述条款中任一项所述的探针，其中所述探针具有在60℃至75℃范围内的Tm。
30.根据前述条款中任一项所述的探针，其中所述探针具有介于5个至40个核苷酸之间的长度。
31.根据前述条款中任一项所述的探针，其中所述寡核苷酸包括与靶核酸分子互补的部分。
32.根据条款31所述的探针，其中所述寡核苷酸与所述靶核酸分子具有至少60％互补。
33.根据条款31所述的探针，其中所述寡核苷酸与所述靶核酸分子具有至少90％互补。
34.根据条款18所述的探针，其中所述寡核苷酸形成茎环结构。
35.根据条款18所述的探针，其中所述寡核苷酸包括靶特异性部分和尾部部分。
36.根据条款35所述的探针，其中所述尾部部分是通用尾部部分。
37.一种系统，包括：
辐射源，所述辐射源的特征在于平均激发波长；
样品，所述样品被设置成接收来自所述辐射源的辐射，所述样品包含：
第一染料；
第二染料；和
检测器，所述检测器被构造成测量来自所述样品的发射；
第一发射光谱元件，所述第一发射光谱元件的特征在于第一平均发射波长；
第二发射光谱元件，所述第二发射光谱元件的特征在于与所述第一平均发射波长不同的第二平均发射波长；
至少一个处理器，所述至少一个处理器包括至少一个存储器，所述至少一个存储器包括用于以下的指令：
用所述辐射源照射所述样品，并且作为响应，(1)使用所述检测器和所述第一发射光谱元件测量来自所述样品的发射，以及(2)使用所述检测器和所述第二发射光谱元件测量来自所述样品的发射。
38.根据条款37所述的系统，其中所述第一染料是或包括第一荧光团，并且所述第二染料是或包括根据条款1至17中任一项所述的荧光能量转移染料缀合物。
39.根据条款37至38中任一项所述的系统，其中所述第一荧光团包括选自以下项的染料：呫吨染料、花青染料、吡咯硼染料、嵌二萘染料、焦宁染料和香豆素染料。
40.根据条款37至39中任一项所述的系统，其中所述第二染料包括选自以下项的荧光团：荧光素染料、罗丹明染料、焦宁染料和花青染料。
41.根据条款37至40中任一项所述的系统，其中所述第一染料与第一探针共价连接，并且所述第二染料与第二探针共价连接，其中所述第一探针和所述第二探针被构造成分别与第一靶分子和第二靶分子结合。
42.根据条款41所述的系统，其中所述第一探针和所述第二探针是寡核苷酸探针，并且所述第二探针是根据条款18至36中任一项所述的探针。
43.根据条款41至42中任一项所述的系统，其中所述第一靶分子和所述第二靶分子是核酸分子。
44.根据条款37至43中任一项所述的系统，其中所述第一染料包括第一吸收光谱，所述第一吸收光谱包括第一最大吸收波长，并且所述第二染料包括第二吸收光谱，所述第二吸收光谱包括与所述第一最大吸收波长相等或基本上相等的第二最大吸收波长。
45.根据条款44所述的系统，其中所述第一最大吸收波长或所述第二最大吸收波长中的一者或多者是相应吸收光谱整体上的绝对最大值。
46.根据条款37至45中任一项所述的系统，其中所述第一染料是同轴染料，并且所述第二染料是离轴染料。
47.根据条款37或44至46中任一项所述的系统，其中：
所述第一染料包括5-FAM、6-FAM、Oregon Green或TET、R110中的一种或多种；并且
所述第二染料包括FAM-TAMRA、FAM-ABY或FAM-NED中的一种或多种。
48.根据条款37或44至47中任一项所述的系统，其中：
所述第一辐射源的所述平均激发波长为480±5纳米，并且/或者所述第一辐射源的特征在于小于或等于约所述平均激发波长的±12纳米的波长带；
所述第一发射光谱元件的所述第一平均发射波长为520±5纳米，并且/或者所述第一发射光谱元件的特征在于小于或等于约所述第一平均发射波长的±20纳米的波长带；并且
所述第二发射光谱元件的所述第二平均发射波长为587±5纳米，并且/或者所述第二发射光谱元件的特征在于小于或等于约所述第二平均发射波长的±12纳米的波长带。
49.根据条款37或44至46中任一项所述的系统，其中：
所述第一染料包括5-FAM、6-FAM、Oregon Green、TET或R110中的一种或多种；并且
所述第二染料包括FAM-PET、FAM-ROX、FAM-JUN、FAM-Texas Red或TET-AlexaFluor 594中的一种或多种。
50.根据条款49所述的系统，其中：
所述第一辐射源的所述平均激发波长为480±5纳米，并且/或者所述第一辐射源的特征在于小于或等于约所述平均激发波长的±12纳米的波长带；
所述第一发射光谱元件的所述第一平均发射波长为520±5纳米，并且/或者所述第一发射光谱元件的特征在于小于或等于约所述第一平均发射波长的±18纳米的波长带；并且
所述第二发射光谱元件的所述第二平均发射波长为623±5纳米，并且/或者所述第二发射光谱元件的特征在于小于或等于约所述第二平均发射波长的±18纳米的波长带。
51.根据条款37或44至46中任一项所述的系统，其中：
所述第一染料包括NED、TAMRA、ABY或DY-555中的一种或多种；并且
所述第二染料包括ABY-Alexa Fluor 647、NED-Alexa Fluor647、
Figure SMS_81
ABY-ATTO 647TM或ABY-DyLight 650TM中的一种或多种。
52.根据条款51所述的系统，其中：
所述第一辐射源的所述平均激发波长为550±5纳米，并且/或者所述第一辐射源的特征在于小于或等于约所述平均激发波长的±14纳米的波长带；
所述第一发射光谱元件的所述第一平均发射波长为587±5纳米，并且/或者所述第一发射光谱元件的特征在于小于或等于约所述第一平均发射波长的±12纳米的波长带；并且
所述第二发射光谱元件的所述第二平均发射波长为682±5纳米，并且/或者所述第二发射光谱元件的特征在于小于或等于约所述第二平均发射波长的±16纳米的波长带。
53.根据条款37或44至46中任一项所述的系统，其中：
所述第一染料包括NED、TAMRA、ABY或DY-555中的一种或多种；并且
所述第二染料包括NED-Alexa Fluor 676、NED DyLight680TM、
Figure SMS_82
ABY-Alexa Fluor 676、ABY-DyLight 680TM或
Figure SMS_83
中的一种或多种。
54.根据条款53所述的系统，其中：
所述第一辐射源的所述平均激发波长为550±5纳米，并且/或者所述第一辐射源的特征在于小于或等于约所述平均激发波长的±14纳米的波长带；
所述第一发射光谱元件的所述第一平均发射波长为587±5纳米，并且/或者所述第一发射光谱元件的特征在于小于或等于约所述第一平均发射波长的±12纳米的波长带；并且
所述第二发射光谱元件的所述第二平均发射波长为711±5纳米，并且/或者所述第二发射光谱元件的特征在于小于或等于约所述第二平均发射波长的±16纳米的波长带。
55.一种系统，包括：
第一辐射源，所述第一辐射源的特征在于第一平均激发波长；
第二辐射源，所述第二辐射源的特征在于与所述第一平均激发波长不同的第二平均激发波长；
样品，所述样品被设置成接收来自所述辐射源的辐射，所述样品包含：
第一染料；
第二染料；和
检测器，所述检测器被构造成测量来自所述样品的发射；
发射光谱元件，所述发射光谱元件的特征在于平均发射波长；
至少一个处理器，所述至少一个处理器包括至少一个存储器，所述至少一个存储器包括用于以下的指令：
用所述第一辐射源照射所述样品，并且作为响应，使用所述检测器和所述发射光谱元件测量来自所述样品的发射；
用所述第二辐射源照射所述样品，并且作为响应，使用所述检测器和所述发射光谱元件测量来自所述样品的发射。
56.根据条款55所述的系统，其中所述第一染料是或包括第一荧光团，并且所述第二染料是或包括根据条款1至17中任一项所述的荧光能量转移染料缀合物。
57.根据条款55至56中任一项所述的系统，其中所述第一荧光团是选自以下项的染料：呫吨染料、花青染料、吡咯硼染料、嵌二萘染料、焦宁染料和香豆素染料。
58.根据条款55至57中任一项所述的系统，其中所述第二染料包括选自以下项的荧光团：荧光素染料、罗丹明染料、焦宁染料和花青染料。
59.根据条款55至58中任一项所述的系统，其中所述第一染料与第一探针共价连接，并且所述第二染料与第二探针共价连接，其中
所述第一探针和所述第二探针被构造成分别与第一靶分子和第二靶分子结合。
60.根据条款59所述的系统，其中所述第一探针和所述第二探针是寡核苷酸探针，并且所述第二探针是根据条款18至36中任一项所述的探针。
61.根据条款59至60中任一项所述的系统，其中所述第一靶分子和所述第二靶分子是核酸分子。
62.根据条款55至61中任一项所述的系统，其中所述第一染料包括第一发射光谱，所述第一发射光谱包括第一最大发射波长，并且
所述第二染料包括第二发射光谱，所述第二发射光谱包括与所述第一最大发射波长相等或基本上相等的第二最大发射波长。
63.根据条款62所述的系统，其中所述第一最大发射波长或所述第二最大发射波长中的一者或多者是所述相应吸收光谱整体上的绝对最大值。
64.根据条款55至63中任一项所述的系统，其中所述第二染料是离轴染料。
65.根据条款55或62至64中任一项所述的系统，其中：
所述第一染料包括NED、TAMRA、ABY或DY-555中的一种或多种；并且
所述第二染料包括FAM-TAMRA、FAM-ABY或FAM-NED中的一种或多种。
66.根据条款55或62至64中任一项所述的系统，其中：
所述第一辐射源的所述第一平均激发波长为480±5纳米，并且/或者所述第一辐射源的特征在于小于或等于约所述第一平均激发波长的±12纳米的波长带；
所述第二辐射源的所述第二平均激发波长为550±5纳米，并且/或者所述第二辐射源的特征在于小于或等于约所述第二平均激发波长的±12纳米的波长带；
所述第一发射光谱元件的所述第一平均发射波长为587±5纳米，并且/或者所述第二发射光谱元件的特征在于小于或等于约所述平均发射波长的±12纳米的波长带。
67.根据条款55或62至64中任一项所述的系统，其中：
所述第一染料包括FAM-PET、FAM-ROX、FAM-JUN、FAM-Texas Red或TET-AlexaFluor 594中的一种或多种；并且
所述第二染料包括PET、ROX、JUN、Texas Red或Alexa Fluor 594中的一种或多种。
68.根据条款67所述的系统，其中：
所述第一辐射源的所述第一平均激发波长为480±5纳米，并且/或者所述第一辐射源的特征在于小于或等于约所述第一平均激发波长的±12纳米的波长带；
所述第二辐射源的所述第二平均激发波长为580±5纳米，并且/或者所述第二辐射源的特征在于小于或等于约所述第二平均激发波长的±12纳米的波长带；
所述第一发射光谱元件的所述第一平均发射波长为623±5纳米，并且/或者所述第二发射光谱元件的特征在于小于或等于约所述平均发射波长的±18纳米的波长带。
69.根据条款55或62至64中任一项所述的系统，其中：
所述第一染料包括ABY-Alexa Fluor 647、NED-Alexa Fluor647、
Figure SMS_84
ABY-ATTO 647TM或ABY-DyLight 650TM中的一种或多种；并且
所述第二染料包括Alexa Fluor 647、
Figure SMS_85
ATTO 647TM或DyLight 650TM中的一种或多种。
70.根据条款69所述的系统，其中：
所述第一辐射源的所述第一平均激发波长为550±5纳米，并且/或者所述第一辐射源的特征在于小于或等于约所述第一平均激发波长的±14纳米的波长带；
所述第二辐射源的所述第二平均激发波长为640±5纳米，并且/或者所述第二辐射源的特征在于小于或等于约所述第二平均激发波长的±12纳米的波长带；
所述第一发射光谱元件的所述平均发射波长为682±5纳米，并且/或者所述第二发射光谱元件的特征在于小于或等于约所述平均发射波长的±16纳米的波长带。
71.根据条款55或62至64中任一项所述的系统，其中：
所述第一染料包括NED-Alexa Fluor 676、NED DyLight680TM、
Figure SMS_86
ABY-Alexa Fluor 676、ABY-DyLight 680TM或
Figure SMS_87
中的一种或多种；并且
所述第二染料包括Alexa Fluor 676、DyLight 680TM或
Figure SMS_88
中的一种或多种。
72.根据条款71所述的系统，其中：
所述第一辐射源的所述第一平均激发波长为550±5纳米，并且/或者所述第一辐射源的特征在于小于或等于约所述第一平均激发波长的±14纳米的波长带；
所述第二辐射源的所述第二平均激发波长为662±5纳米，并且/或者所述第二辐射源的特征在于小于或等于约所述第二平均激发波长的±12纳米的波长带；并且
所述第一发射光谱元件的所述平均发射波长为711±5纳米，并且/或者所述第二发射光谱元件的特征在于小于或等于约所述平均发射波长的±16纳米的波长带。
73.一种系统，包括：
第一辐射源，所述第一辐射源的特征在于第一平均激发波长；
第二辐射源，所述第二辐射源的特征在于与所述第一平均激发波长不同的第二平均激发波长；
样品，所述样品被设置成接收来自所述辐射源的辐射，所述样品包含：
第一染料；
第二染料；和
第三染料；
检测器，所述检测器被构造成测量来自所述样品的发射；
第一发射光谱元件，所述第一发射光谱元件的特征在于第一平均发射波长；
第二发射光谱元件，所述第二发射光谱元件的特征在于与所述第一平均发射波长不同的第二平均发射波长；
至少一个处理器，所述至少一个处理器包括至少一个存储器，所述至少一个存储器包括用于以下的指令：
用所述第一辐射源照射所述样品，并且作为响应，(1)使用所述检测器和所述第一发射光谱元件测量来自所述样品的发射，以及(2)使用所述检测器和所述第二发射光谱元件测量来自所述样品的发射；
用所述第二辐射源照射所述样品，并且作为响应，使用所述检测器和所述第二发射光谱元件测量来自所述样品的发射。
74.根据条款73所述的系统，其中所述第一染料和/或所述第三染料是或包括第一荧光团，并且第二染料是或包括根据条款1至17中任一项所述的荧光能量转移染料缀合物。
75.根据条款73至74中任一项所述的系统，其中所述第一荧光团和/或第三荧光团是选自以下项的染料：呫吨染料、花青染料、吡咯硼染料、嵌二萘染料、焦宁染料和香豆素染料。
76.根据条款73至75所述的系统，其中所述第二染料包括选自以下项的荧光团：荧光素染料、罗丹明染料、焦宁染料和花青染料
77.根据条款73至75中任一项所述的系统，其中所述第一染料与第一探针共价连接，并且所述第二染料与缀合物第二探针共价连接，并且所述第三染料与第三探针共价连接，其中所述第一探针、所述第二探针和所述第三探针被构造成分别与第一靶分子、第二靶分子和第三靶分子结合。
78.根据条款77所述的系统，其中所述第一探针、所述第二探针和所述第三探针是寡核苷酸探针，并且所述第二探针是根据条款18至36中任一项所述的探针。
79.根据条款77至78所述的系统，其中所述第一靶分子、所述第二靶分子和所述第三靶分子是核酸分子。
80.根据条款73至79中任一项所述的系统，其中(1)所述第一染料包括第一吸收光谱，所述第一吸收光谱包括第一最大吸收波长，并且所述第二染料包括第二吸收光谱，所述第二吸收光谱包括与所述第一最大吸收波长相等或基本上相等的第二最大吸收波长；并且(2)所述第二染料包括第二发射光谱，所述第二发射光谱包括第二最大发射波长，并且所述第三染料包括第三发射光谱，所述第三发射光谱包括与所述第二最大发射波长相等或基本上相等的第三最大发射波长。
81.根据条款80所述的系统，其中所述第一最大吸收波长、所述第二最大吸收波长、所述第二最大发射波长或所述第三最大发射波长中的一者或多者是所述相应吸收光谱整体上的绝对最大值。
82.根据条款73至81中任一项所述的系统，其中所述第二染料是离轴染料。
83.根据条款73或80至82中任一项所述的系统，其中：
所述第一染料包括5-FAM、6-FAM、Oregon Green或TET、R110中的一种或多种；
所述第二染料包括FAM-TAMRA、FAM-ABY或FAM-NED中的一种或多种；并且
所述第三染料包括NED、TAMRA、ABY或DY-555中的一种或多种。
84.根据条款73或80至83中任一项所述的系统，其中：
所述第一辐射源的所述第一平均激发波长为480±5纳米，并且/或者所述第一辐射源的特征在于小于或等于约所述第一平均激发波长的±12纳米的波长带；
所述第二辐射源的所述第二平均激发波长为550±5纳米，并且/或者所述第二辐射源的特征在于小于或等于约所述第二平均激发波长的±12纳米的波长带；
所述第一发射光谱元件的所述第一平均发射波长为520±5纳米，并且/或者所述第一发射光谱元件的特征在于小于或等于约所述第一平均发射波长的±20纳米的波长带；并且
所述第二发射光谱元件的所述第二平均发射波长为587±5纳米，并且/或者所述第二发射光谱元件的特征在于小于或等于约所述第二平均发射波长的±12纳米的波长带。
85.根据条款73或80至82中任一项所述的系统，其中：
所述第一染料包括5-FAM、6-FAM、Oregon Green、TET或R110中的一种或多种；
所述第二染料包括FAM-PET、FAM-ROX、FAM-JUN、FAM-Texas Red或TET-AlexaFluor 594中的一种或多种；并且
所述第三染料包括PET、ROX、JUN、Texas Red或Alexa Fluor 594中的一种或多种。
86.根据条款85所述的系统，其中：
所述第一辐射源的所述第一平均激发波长为480±5纳米，并且/或者所述第一辐射源的特征在于小于或等于约所述第一平均激发波长的±12纳米的波长带；
所述第二辐射源的所述第二平均激发波长为580±5纳米，并且/或者所述第二辐射源的特征在于小于或等于约所述第二平均激发波长的±12纳米的波长带；
所述第一发射光谱元件的所述第一平均发射波长为520±5纳米，并且/或者所述第一发射光谱元件的特征在于小于或等于约所述第一平均发射波长的±18纳米的波长带；并且
所述第二发射光谱元件的所述第二平均发射波长为623±5纳米，并且/或者所述第二发射光谱元件的特征在于小于或等于约所述第二平均发射波长的±18纳米的波长带。
87.根据条款73或80至82中任一项所述的系统，其中：
所述第一染料包括NED、TAMRA、ABY或DY-555中的一种或多种；
所述第二染料包括ABY-Alexa Fluor 647、NED-Alexa Fluor647、
Figure SMS_89
ABY-ATTO 647TM或ABY-DyLight 650TM中的一种或多种；并且
所述第三染料包括Alexa Fluor 647、
Figure SMS_90
ATTO 647TM或DyLight 650TM中的一种或多种。
88.根据条款87所述的系统，其中：
所述第一辐射源的所述第一平均激发波长为550±5纳米，并且/或者所述第一辐射源的特征在于小于或等于约所述第一平均激发波长的±14纳米的波长带；
所述第二辐射源的所述第二平均激发波长为640±5纳米，并且/或者所述第二辐射源的特征在于小于或等于约所述第二平均激发波长的±12纳米的波长带；
所述第一发射光谱元件的所述第一平均发射波长为587±5纳米，并且/或者所述第一发射光谱元件的特征在于小于或等于约所述第一平均发射波长的±12纳米的波长带；并且
所述第二发射光谱元件的所述第二平均发射波长为682±5纳米，并且/或者所述第二发射光谱元件的特征在于小于或等于约所述第二平均发射波长的±16纳米的波长带。
89.根据条款73或80至82中任一项所述的系统，其中：
所述第一染料包括NED、TAMRA、ABY或DY-555中的一种或多种；
所述第二染料包括NED-Alexa Fluor 676、NED DyLight680TM、
Figure SMS_91
ABY-Alexa Fluor 676、ABY-DyLight 680TM或
Figure SMS_92
中的一种或多种；并且
所述第三染料包括Alexa Fluor 676、DyLight 680TM或
Figure SMS_93
中的一种或多种。
90.根据条款89所述的系统，其中：
所述第一辐射源的所述第一平均激发波长为550±5纳米，并且/或者所述第一辐射源的特征在于小于或等于约所述第一平均激发波长的±14纳米的波长带；
所述第二辐射源的所述第二平均激发波长为662±5纳米，并且/或者所述第二辐射源的特征在于小于或等于约所述第二平均激发波长的±12纳米的波长带；
所述第一发射光谱元件的所述第一平均发射波长为587±5纳米，并且/或者所述第一发射光谱元件的特征在于小于或等于约所述第一平均发射波长的±12纳米的波长带；并且
所述第二发射光谱元件的所述第二平均发射波长为711±5纳米，并且/或者所述第二发射光谱元件的特征在于小于或等于约所述第二平均发射波长的±16纳米的波长带。
91.根据条款73至90中任一项所述的系统，其中所述至少一个存储器还包括用于执行核酸合成测定的一个或多个指令，并且其中所述指令用于在所述核酸合成测定期间以及/或者在所述核苷酸合成测定之后执行照射和测量。
92.根据条款91所述的系统，其中所述核酸合成测定包括聚合酶链反应(PCR)测定，所述合酶链反应测定包括使溶液循环通过多个温度循环，以及在所述温度循环中的一个或多个温度循环之后执行对所述染料的发射的测量。
93.根据条款91所述的系统，其中所述核酸合成测定包括聚合酶链反应(PCR)测定，所述聚合酶链反应测定包括使所述溶液循环通过所述多个温度循环，以及在最后温度循环之后执行对所述染料的发射的测量。
94.根据条款73至93中任一项所述的系统，其中所述至少一个存储器包括用于以下的指令：
在扩增期间从第一靶分子产生第一扩增子；
在扩增期间从第二靶分子产生第二扩增子；并且/或者
在扩增期间从第三靶分子产生第三扩增子。
95.根据条款94所述的系统，其中所述第一扩增子、所述第二扩增子和/或所述第三扩增子同时产生。
96.根据条款73至82中任一项所述的系统，其中：
所述系统还包括第三辐射源、第四辐射源、第五辐射源和第六辐射源，所述第三辐射源、所述第四辐射源、所述第五辐射源和所述第六辐射源中的每一者的特征在于相应的第三平均激发波长、第四平均激发波长、第五平均激发波长和第六平均激发波长，其中所述六个平均激发波长中的每一者不同于其余的平均激发波长；
所述样品还包含第四染料、第五染料、第六染料、第七染料和第八染料；
所述系统还包括第三发射光谱元件、第四发射光谱元件、第五发射光谱元件和第六发射光谱元件，所述发射光谱元件各自被构造成传递来自所述样品的发射，所述第三发射元件、所述第四发射元件、所述第五发射元件和所述第六发射元件中的每一者的特征在于相应的第三平均发射波长、第四平均发射波长、第五平均发射波长和第六平均发射波长，其中所述波长源中的每个波长源的所述六个平均发射波长中的每一者不同于其余源的所述平均发射波长；
所述至少一个存储器包括用于以下的指令：
用所述第三辐射源、所述第四辐射源、所述第五辐射源和所述第六辐射源照射所述样品；
响应于用所述第三辐射源、所述第四辐射源、所述第五辐射源和所述第六辐射源中的每一者照射所述样品，使用所述发射光谱元件中的一个或多个发射光谱元件测量来自所述样品的发射。
97.根据条款96所述的系统，其中所述第一染料、所述第二染料、所述第三染料、所述第四染料、所述第五染料、所述第六染料、所述第七染料和所述第八染料与相应的第一探针、第二探针、第三探针、第四探针、第五探针、第六探针、第七探针和第八探针共价连接，每个探针被构造成与相应的第一靶分子、第二靶分子、第三靶分子、第四靶分子、第五靶分子、第六靶分子、第七靶分子和第八靶分子结合，并且所述至少一个存储器还包括基于所测量的发射来确定存在于所述样品中的所述靶分子的量的指令。
98.根据条款97所述的系统，其中所述第一探针、所述第二探针、所述第三探针、所述第四探针、所述第五探针、所述第六探针、所述第七探针和/或所述第八探针还包含猝灭剂部分。
99.根据条款98所述的系统，其中所述第一探针、所述第二探针、所述第三探针、所述第四探针、所述第五探针、所述第六探针、所述第七探针和所述第八探针是寡核苷酸探针，并且所述第二探针是根据条款18至36中任一项所述的探针。
100.根据条款99所述的系统，其中所述第一靶分子、所述第二靶分子、所述第三靶分子、所述第四靶分子、所述第五靶分子、所述第六靶分子、所述第七靶分子和第八靶分子是核酸分子。
101.根据条款96至100中任一项所述的系统，其中所述第二染料和所述第四染料是离轴染料。
102.根据条款96至101中任一项所述的系统，其中：
所述第二染料包括与所述第一染料的最大吸收波长相等或基本上相等的最大吸收波长；
所述第四染料包括与所述第一染料的最大吸收波长相等或基本上相等的最大吸收波长；
所述第二染料包括与所述第三染料的最大发射波长相等或基本上相等的最大发射波长；并且
所述第四染料包括与所述第五染料的最大发射波长相等或基本上相等的最大发射波长
103.根据条款73至82中任一项所述的系统，其中：
所述系统还包括第三辐射源、第四辐射源、第五辐射源和第六辐射源，所述第三辐射源、所述第四辐射源、所述第五辐射源和所述第六辐射源中的每一者的特征在于相应的第三平均激发波长、第四平均激发波长、第五平均激发波长和第六平均激发波长，其中所述六个平均激发波长中的每一者不同于其余的平均激发波长；
所述样品还包含第四染料、第五染料、第六染料、第七染料、第八染料、第九染料和第十染料；
所述系统还包括第三发射光谱元件、第四发射光谱元件、第五发射光谱元件和第六发射光谱元件，所述发射光谱元件各自被构造成传递来自所述样品的发射，所述第三发射元件、所述第四发射元件、所述第五发射元件和所述第六发射元件中的每一者的特征在于相应的第三平均发射波长、第四平均发射波长、第五平均发射波长和第六平均发射波长，其中所述波长源中的每个波长源的所述六个平均发射波长中的每一者不同于其余源的所述平均发射波长；
所述至少一个存储器包括用于以下的指令：
用所述第三辐射源、所述第四辐射源、所述第五辐射源和所述第六辐射源照射所述样品；
响应于用所述第三辐射源、所述第四辐射源、所述第五辐射源和所述第六辐射源中的每一者照射所述样品，使用所述发射光谱元件中的一个或多个发射光谱元件测量来自所述样品的发射。
104.根据条款103所述的系统，其中所述第一染料、所述第二染料、所述第三染料、所述第四染料、所述第五染料、所述第六染料、所述第七染料、所述第八染料、所述第九染料和第十染料分别与相应的第一探针、第二探针、第三探针、第四探针、第五探针、第六探针、第七探针、第八探针、第九探针和第十探针共价连接，每个探针被构造成与相应的第一靶分子、第二靶分子、第三靶分子、第四靶分子、第五靶分子、第六靶分子、第七靶分子、第八靶分子、第九靶分子和第十靶分子结合，并且所述至少一个存储器还包括基于所测量的发射来确定存在于所述样品中的所述靶分子的量的指令。
105.根据条款104所述的系统，其中所述第一探针、所述第二探针、所述第三探针、所述第四探针、所述第五探针、所述第六探针、所述第七探针、所述第八探针、所述第九探针和/或所述第十探针还包含猝灭剂部分。
106.根据条款105所述的系统，其中所述第一探针、所述第二探针、所述第三探针、所述第四探针、所述第五探针、所述第六探针、所述第七探针、所述第八探针、所述第九探针和/或所述第十探针是寡核苷酸探针，并且所述第二探针是根据条款18至36中任一项所述的探针。
107.根据条款106所述的系统，其中所述第一靶分子、所述第二靶分子、所述第三靶分子、所述第四靶分子、所述第五靶分子、所述第六靶分子、所述第七靶分子、所述第八靶分子、所述第九靶分子和所述第十靶分子是核酸分子。
108.根据条款103至107中任一项所述的系统，其中所述第二染料、所述第四染料、所述第九染料和所述第十染料是离轴染料。
109.根据条款103至108中任一项所述的系统，其中：
所述第二染料包括与所述第一染料的最大吸收波长相等或基本上相等的最大吸收波长；
所述第四染料包括与所述第一染料的最大吸收波长相等或基本上相等的最大吸收波长；
所述第九染料包括与所述第三染料的最大吸收波长相等或基本上相等的最大吸收波长；
所述第十染料包括与所述第三染料的最大吸收波长相等或基本上相等的最大吸收波长；
所述第二染料包括与所述第三染料的最大发射波长相等或基本上相等的最大发射波长
所述第四染料包括与所述第五染料的最大发射波长相等或基本上相等的最大发射波长
所述第九染料包括与所述第七染料的最大发射波长相等或基本上相等的最大发射波长；并且
所述第十染料包括与所述第十染料的最大发射波长相等或基本上相等的最大发射波长
110.根据条款96至109中任一项所述的系统，其中：
所述第一辐射源的所述第一平均激发波长为480±5纳米，并且/或者所述第一辐射源的特征在于小于或等于约所述第一平均激发波长的±12纳米的波长带；
所述第二辐射源的所述第二平均激发波长为520±5纳米，并且/或者所述第二辐射源的特征在于小于或等于约所述第二平均激发波长的±12纳米的波长带；
所述第三辐射源的所述第三平均激发波长为550±5纳米，并且/或者所述第三辐射源的特征在于小于或等于约所述第三平均激发波长的±12纳米的波长带；
所述第四辐射源的所述第四平均激发波长为580±5纳米，并且/或者所述第四辐射源的特征在于小于或等于约所述第四平均激发波长的±12纳米的波长带；
所述第五辐射源的所述第五平均激发波长为640±5纳米，并且/或者所述第五辐射源的特征在于小于或等于约所述第五平均激发波长的±12纳米的波长带；
所述第六辐射源的所述第六平均激发波长为662±5纳米，并且/或者所述第六辐射源的特征在于小于或等于约所述第六平均激发波长的±12纳米的波长带；
所述第一发射光谱元件的所述第一平均发射波长为520±5纳米，并且/或者所述第一发射光谱元件的特征在于小于或等于约所述第一平均发射波长的±18纳米的波长带；
所述第二发射光谱元件的所述第二平均发射波长为558±5纳米，并且/或者所述第二发射光谱元件的特征在于小于或等于约所述第二平均发射波长的±15纳米的波长带；
所述第三发射光谱元件的所述第三平均发射波长为587±5纳米，并且/或者所述第三发射光谱元件的特征在于小于或等于约所述第三平均发射波长的±12纳米的波长带；
所述第四发射光谱元件的所述第四平均发射波长为623±5纳米，并且/或者所述第四发射光谱元件的特征在于小于或等于约所述第四平均发射波长的±16纳米的波长带；
所述第五发射光谱元件的所述第五平均发射波长为682±5纳米，并且/或者所述第五发射光谱元件的特征在于小于或等于约所述第五平均发射波长的±16纳米的波长带；并且
所述第六发射光谱元件的所述第六平均发射波长为711±5纳米，并且/或者所述第六发射光谱元件的特征在于小于或等于约所述第六平均发射波长的±16纳米的波长带。
111.根据条款96至110中任一项所述的系统，其中：
所述第一染料是5-FAM、6-FAM、Oregon Green、TET或R110中的至少一种；
所述第二染料是FAM-TAMRA、FAM-ABY或FAM-NED中的至少一种；
所述第三染料是NED、TAMRA、ABY或DY-555中的至少一种；
所述第四染料是FAM-PET、FAM-ROX、FAM-JUN、FAM-Texas Red或TET-Alexa Fluor594中的至少一种；
所述第五染料是PET、ROX、JUN、Texas Red或Alexa Fluor 594中的至少一种；
所述第六染料是VIC、HEX、JOE、Yakima Yellow或R6G中的至少一种；
所述第七染料是Alexa Fluor 647、
Figure SMS_94
ATTO 647TM或DyLight 650TM中的至少一种；
所述第八染料是Alexa Fluor 676、DyLight 680TM或
Figure SMS_95
中的至少一种。
112.根据条款103至111中任一项所述的系统，其中：
所述第九染料是ABY-Alexa Fluor 647、NED-Alexa Fluor647、
Figure SMS_96
ABY-ATTO 647TM或ABY-DyLight 650TM中的至少一种；并且
所述第十染料是NED-Alexa Fluor 676、NED DyLight 680TM、
Figure SMS_97
ABY-Alexa Fluor 676、ABY-DyLight 680TM或
Figure SMS_98
中的至少一种。
113.根据条款96至112中任一项所述的系统，其中所述第二染料和所述第四染料独立地包括选自以下项的荧光团：荧光素染料、罗丹明染料、焦宁染料和花青染料。
114.根据条款103至112中任一项所述的系统，其中所述第二染料、所述第四染料、所述第九染料和所述第十染料独立地包括选自以下项的荧光团：荧光素染料、罗丹明染料、焦宁染料和花青染料。
115.根据条款37至114中任一项所述的系统，其中所述辐射源中的每个辐射源的特征在于具有可见光光谱中的最大波长和/或平均波长的辐射。
116.根据条款37至114中任一项所述的系统，其中所述辐射源中的每个辐射源的特征在于具有红外波长带和/或紫外波长带中的最大波长和/或平均波长的辐射。
117.根据条款37至114中任一项所述的系统，其中在所述辐射源中的至少一个辐射源中包括发光二极管(LED)或激光器。
118.根据条款37至114中任一项所述的系统，其中所述第一辐射源的所述第一平均激发波长和所述第二辐射源的所述第二平均激发波长相差至少50纳米或至少60纳米。
119.根据条款37至114中任一项所述的系统，其中：
所述第一辐射源包括辐射发生器，并且第一滤光器被构造成过滤来自所述辐射发生器的辐射；并且
所述第二辐射源包括所述辐射发生器，并且第二滤光器被构造成过滤来自所述辐射发生器的辐射。
120.根据条款119所述的系统，还包括滤光器的滤光轮。
121.根据条款37至114中任一项所述的系统，其中所述辐射源各自包括辐射发生器和色度色散光学元件，所述色度色散光学元件被构造成透射或反射来自所述辐射发生器的辐射，每个辐射源包括来自所述色度色散光学元件的光谱的不同部分。
122.根据条款37至121中任一项所述的系统，其中所述辐射发生器包括光源。
123.根据条款37至121中任一项所述的系统，其中所述辐射发生器包括白色光源，所述白色光源的特征在于在辐射的可见带的至少一部分上。
124.根据条款37至121中任一项所述的系统，其中所述辐射发生器包括发光二极管或卤素灯。
125.根据条款37至114中任一项所述的系统，其中所述检测器包括阵列传感器，所述阵列传感器包括传感器或像素的阵列。
126.根据条款125所述的系统，其中所述阵列传感器包括电耦装置(CCD)或互补金属-氧化物-半导体(CMOS)。
127.根据条款37至114中任一项所述的系统，其中所述发射光谱元件包括色散光学元件，所述色散光学元件被构造成沿第一光学路径和第二光学路径分散来自所述样品的发射，其中所述检测器包括第一检测器和第二检测器，所述第一检测器被构造成接收沿所述第一光学路径的发射，所述第二检测器被构造成接收沿所述第二光学路径的发射。
128.根据条款127所述的系统，其中所述第一检测器包括在CCD检测器或CMOS检测器上的第一位置，并且所述第二包括在CCD检测器或CMOS检测器上的与所述第一位置在空间上分开的第二位置。
129.根据条款128所述的系统，其中所述第一位置包括像素或像素组，并且所述第二位置包括不同的像素或像素组。
130.根据条款37至54或73至129中任一项所述的系统，其中：
所述第一发射光谱元件包括第一光谱滤光器；并且
所述第二发射光谱元件包括第二光谱滤光器。
131.根据条款37至54或73至130中任一项所述的系统，其中所述第一平均发射波长和所述第二平均发射波长相差至少25纳米。
132.根据条款37至54或73至131中任一项所述的系统，还包括滤光轮，所述滤光轮包括所述发射光谱元件，所述滤光轮被构造成沿所述样品与所述检测器之间的光学路径顺序地放置所述发射光谱元件以便测量来自所述样品的发射。
133.根据条款37至54或73至132中任一项所述的系统，其中：
所述第一发射光谱元件包括第一光谱滤光器，所述第一光谱滤光器被构造成传递第一发射波长带内的辐射；
所述第二发射光谱元件包括第二光谱滤光器，所述第二光谱滤光器被构造成传递第二发射波长带内的辐射，所述第二发射波长带不与所述第一发射波长带重叠。
134.根据条款73至95或115至133中任一项所述的系统，还包括：
提供第三辐射源，所述第三辐射源的特征在于第三平均激发波长，所述第三平均激发波长不同于所述第一辐射源的所述第一平均激发波长或所述第二辐射源的所述第二平均激发波长；
用来自第三辐射源的辐射照射所述样品，并且作为响应，使用所述第一发射光谱元件或所述第二发射光谱元件中的一者或多者测量来自所述样品的发射；
其中确定靶分子中的一种或多种靶分子的量是基于来自所述样品的所测量发射，以响应于用来自所述第三辐射源的辐射照射所述样品。
135.根据条款134所述的系统，其中确定所述靶分子中的一种或多种靶分子的所述量包括调整来自所述样品的所测量发射中的一种或多种所测量发射，以响应于用来自所述第一辐射源和/或所述第二辐射源的辐射照射所述样品。
136.根据条款73至135中任一项所述的系统，其中：
所述第一染料的特征在于第一发射光谱特征，所述第二染料的特征在于第二发射光谱特征，并且所述第三染料的特征在于第三发射光谱特征；
所述第一光谱特征包括当所述第一染料被所述辐射源中的每个辐射源单独照射时在发射波长带的每个发射波长带内发射的能量的量；
所述第二光谱特征包括当所述第二染料被所述辐射源中的每个辐射源单独照射时在发射波长带的每个发射波长带内发射的能量的量；
所述第三光谱特征包括当所述第三染料被所述辐射源中的每个辐射源单独照射时在发射波长带的每个发射波长带内发射的能量的量；并且
每种染料的光谱特征不同于其余染料的所述光谱特征。
137.根据条款73至136中任一项所述的系统，其中对来自所述三种染料中的每种染料的发射的测量按时间顺序地发生。
138.根据条款73至137中任一项所述的系统，其中对来自所述三种染料的发射的测量同时发生。
139.根据条款73至138中任一项所述的系统，其中所述第一染料是FAM，所述第二染料是ROX，并且所述第三染料是FAM-ROX。
140.根据条款73至139中任一项所述的系统，其中所述第二最大发射波长大于所述第二最大吸收波长。
141.根据条款73至140中任一项所述的系统，其中所述第二最大发射波长小于所述第二最大吸收波长。
142.根据条款73至141中任一项所述的系统，其中所述第二染料是能量转移染料缀合物，所述能量转移染料缀合物包含：
供体染料，所述供体染料的特征在于与所述第一染料的所述最大吸收波长相等或基本上相等的最大吸收波长，所述供体染料被构造成吸收来自所述第一辐射源的辐射，并且作为响应，产生能量；和
受体染料，所述受体染料的特征在于与所述第三染料的所述最大发射波长相等或基本上相等的最大发射波长，其中所述染料被构造成将由所述供体产生的所述能量的至少一些能量转移至所述受体染料。
143.根据条款142所述的系统，其中所述第一染料包括第一荧光团，并且其中所述供体染料和所述第一荧光团相同。
144.根据条款142所述的系统，其中所述第三染料包括第三荧光团，并且其中所述供体染料和所述第三荧光团不同。
145.根据条款142所述的系统，其中所述第一染料的特征在于第一光谱特征，所述第三染料的特征在于第三光谱特征，所述供体染料的特征在于供体染料光谱特征，并且(1)所述供体染料光谱特征等于所述第三发射光谱特征，并且/或者(2)所述供体染料的最大发射波长等于所述第三染料的最大发射波长。
146.根据条款142所述的系统，其中所述供体染料具有发射波长带，并且所述受体染料具有不与所述供体染料发射波长带重叠的吸收波长带。
147.根据条款142所述的系统，其中所述供体染料具有与所述第一染料或所述第三染料不同的化学结构。
148.根据条款142所述的系统，其中所述第一染料的特征在于第一光谱特征，所述第三染料的特征在于第三光谱特征，所述供体染料的特征在于供体染料光谱特征，并且(1)所述供体染料光谱特征与所述第三光谱特征不同，并且/或者(2)所述供体染料最大发射波长与所述第三染料的所述最大发射波长不同。
149.根据条款37至148中任一项所述的系统，其中所述样品是生物样品。
150.根据条款149所述的系统，其中所述生物样品包含一种或多种靶分子。
151.根据条款150所述的系统，其中所述一种或多种靶分子包括一种或多种核酸分子。
152.根据条款149至151中任一项所述的系统，其中所述至少一个存储器包括基于所测量的发射来确定存在于所述样品中的所述靶分子中的任何靶分子的量的指令。
153.一种方法，包括：
提供包含第一染料和第二染料的样品；
用辐射源照射所述样品，并且作为响应，使用检测器和特征在于第一平均发射波长的第一发射光谱元件测量来自所述样品的发射，以及使用所述检测器和特征在于与所述第一平均发射波长不同的第二平均发射波长的第二发射光谱元件测量来自所述样品的发射。
154.根据条款153所述的方法，其中第一染料是或包括第一荧光团，并且第二染料是或包括根据条款1至17中任一项所述的荧光能量转移染料缀合物。
155.根据条款153至154中任一项所述的方法，其中所述第一荧光团选自呫吨染料、花青染料、吡咯硼染料、嵌二萘染料、焦宁染料和香豆素染料。
156.根据条款153至155中任一项所述的方法，其中所述第二染料包括选自以下项的荧光团：荧光素染料、罗丹明染料、焦宁染料和花青染料。
157.根据条款153至156中任一项所述的方法，其中所述第一染料与第一探针共价连接，并且所述第二染料与第二探针共价连接，其中所述第一探针和所述第二探针被构造成分别与第一靶分子和第二靶分子结合。
158.根据条款157所述的方法，其中所述第一探针和所述第二探针是寡核苷酸探针，并且所述第二探针是根据条款18至36中任一项所述的探针。
159.根据条款153至158中任一项所述的方法，其中所述第一靶分子和所述第二靶分子是核酸分子。
160.根据条款153至159中任一项所述的方法，其中所述第一染料包括与所述第二染料的最大吸收波长相等或基本上相等的最大吸收波长。
161.根据条款160所述的方法，其中所述第一最大吸收波长或所述第二最大吸收波长中的一者或多者是所述相应光谱整体上的绝对最大值。
162.根据条款153至161中任一项所述的方法，其中所述第一染料是同轴染料，并且所述第二染料是离轴染料。
163.根据条款153至162中任一项所述的方法，其中所述第一染料被构造成与第一靶分子结合，并且所述第二染料被构造成与第二靶分子结合，所述方法还包括基于所测量的发射来确定存在于所述样品中的任何靶分子的量。
164.一种方法，包括：
提供包含第一染料和第二染料的样品；
对所述样品执行扩增测定；
用特征在于第一平均激发波长的第一辐射源照射所述样品，并且作为响应，使用检测器和特征在于第一平均发射波长的第一发射光谱元件测量来自所述样品的发射；并且
用特征在于与所述第一平均激发波长不同的第二平均激发波长的第二辐射源照射所述样品，并且作为响应，使用所述检测器和所述第二发射光谱元件测量来自所述样品的发射。
165.根据条款164所述的方法，其中第一染料是或包括第一荧光团，并且第二染料是或包括根据条款1至17中任一项所述的荧光能量转移染料缀合物。
166.根据条款164至165中任一项所述的方法，其中所述第一荧光团选自呫吨染料、花青染料、吡咯硼染料、嵌二萘染料、焦宁染料和香豆素染料。
167.根据条款164至166中任一项所述的方法，其中所述第二染料包括选自以下项的荧光团：荧光素染料、罗丹明染料、焦宁染料和花青染料。
168.根据条款164至167中任一项所述的方法，其中所述第一染料与第一探针共价连接，并且所述第二染料与缀合物第二探针共价连接，其中所述第一探针和所述第二探针被构造成分别与第一靶分子和第二靶分子结合。
169.根据条款168所述的方法，其中所述第一探针和所述第二探针是寡核苷酸探针，并且所述第二探针是根据条款18至36中任一项所述的探针。
170.根据条款168至169中任一项所述的方法，其中所述第一靶分子和所述第二靶分子是核酸分子。
171.根据条款164至170中任一项所述的方法，其中所述第一染料包括与所述第二染料的最大发射波长相等或基本上相等的最大发射波长。
172.根据条款171所述的方法，其中所述第一最大发射波长或所述第二最大发射波长中的一者或多者是所述相应光谱整体上的绝对最大值。
173.根据条款164至172中任一项所述的方法，其中所述第二染料是离轴染料。
174.根据条款164至173中任一项所述的方法，其中所述第一染料被构造成与第一靶分子结合，并且所述第二染料被构造成与第二靶分子结合，所述方法还包括基于所测量的发射来确定存在于所述样品中的任何靶分子的量。
175.一种方法，包括：
提供样品，所述样品包含被构造成与第三靶分子结合的第一染料、第二染料和第三染料；
用特征在于第一平均激发波长的第一辐射源照射所述样品，并且作为响应，(1)使用检测器和特征在于第一平均发射波长的第一发射光谱元件测量来自所述样品的发射，以及(2)使用所述检测器和特征在于与所述第一平均发射波长不同的第二平均发射波长的第二发射光谱元件测量来自所述样品的发射；
用特征在于与所述第一平均激发波长不同的第二平均激发波长的第二辐射源照射所述样品，并且作为响应，使用所述检测器和所述第二发射光谱元件测量来自所述样品的发射。
176.根据条款175所述的方法，其中第一染料是或包括第一荧光团，并且第二染料是或包括根据条款1至17中任一项所述的荧光能量转移染料缀合物。
177.根据条款175至186中任一项所述的方法，其中所述第一荧光团选自呫吨染料、花青染料、吡咯硼染料、嵌二萘染料、焦宁染料和香豆素染料。
178.根据条款175至177中任一项所述的方法，其中所述第一染料与第一探针共价连接，并且所述第二染料与缀合物第二探针共价连接，并且所述第三染料与第三探针共价连接，其中所述第一探针、所述第二探针和所述第三探针被构造成分别与第一靶分子、第二靶分子和第三靶分子结合。
179.根据条款178所述的系统，其中所述第一探针、所述第二探针和所述第三探针是寡核苷酸探针，并且所述第二探针是根据条款18至36中任一项所述的探针。
180.根据条款178至179所述的系统，其中所述第一靶分子、所述第二靶分子和所述第三靶分子是核酸分子。
181.根据条款175至181中任一项所述的方法，其中(1)所述第一染料包括第一吸收光谱，所述第一吸收光谱包括第一最大吸收波长，并且所述第二染料包括第二吸收光谱，所述第二吸收光谱包括与所述第一最大吸收波长相等或基本上相等的第二最大吸收波长；并且(2)所述第二染料包括第二发射光谱，所述第二发射光谱包括第二最大发射波长，并且所述第三染料包括第三发射光谱，所述第三发射光谱包括与所述第二最大发射波长相等或基本上相等的第三最大发射波长。
182.根据条款181所述的方法，其中所述第一最大吸收波长、所述第二最大吸收波长、所述第二最大发射波长或所述第三最大发射波长中的一者或多者是所述相应吸收光谱整体上的绝对最大值。
183.根据条款175至182中任一项所述的方法，其中所述第二染料是离轴染料。
184.根据条款175至183中任一项所述的方法，其中所述第一染料被构造成与第一靶分子结合，并且所述第二染料被构造成与第二靶分子结合，所述方法还包括基于所测量的发射来确定存在于所述样品中的所述靶分子的量。
185.根据条款175至184中任一项所述的方法，其中：
所述第一染料包括5-FAM、6-FAM、Oregon Green或TET、R110中的一种或多种；
所述第二染料包括FAM-TAMRA、FAM-ABY或FAM-NED中的一种或多种；并且
所述第三染料包括NED、TAMRA、ABY或DY-555中的一种或多种。
186.根据条款175至185中任一项所述的方法，其中：
所述第一辐射源的所述第一平均激发波长为480±5纳米，并且/或者所述第一辐射源的特征在于小于或等于约所述第一平均激发波长的±12纳米的波长带；
所述第二辐射源的所述第二平均激发波长为550±5纳米，并且/或者所述第二辐射源的特征在于小于或等于约所述第二平均激发波长的±12纳米的波长带；
所述第一发射光谱元件的所述第一平均发射波长为520±5纳米，并且/或者所述第一发射光谱元件的特征在于小于或等于约所述第一平均发射波长的±20纳米的波长带；
所述第二发射光谱元件的所述第二平均发射波长为587±5纳米，并且/或者所述第二发射光谱元件的特征在于小于或等于约所述第二平均发射波长的±12纳米的波长带。
187.根据条款175至184中任一项所述的方法，其中：
所述第一染料包括5-FAM、6-FAM、Oregon Green、TET、R110中的一种或多种；
所述第二染料包括FAM-PET、FAM-ROX、FAM-JUN、FAM-Texas Red或TET-AlexaFluor 594中的一种或多种；并且
所述第三染料包括PET、ROX、JUN、Texas Red或Alexa Fluor 594中的一种或多种。
188.根据条款187所述的方法，其中：
所述第一辐射源的所述第一平均激发波长为480±5纳米，并且/或者所述第一辐射源的特征在于小于或等于约所述第一平均激发波长的±12纳米的波长带；
所述第二辐射源的所述第二平均激发波长为580±5纳米，并且/或者所述第二辐射源的特征在于小于或等于约所述第二平均激发波长的±12纳米的波长带；
所述第一发射光谱元件的所述第一平均发射波长为520±5纳米，并且/或者所述第一发射光谱元件的特征在于小于或等于约所述第一平均发射波长的±18纳米的波长带；
所述第二发射光谱元件的所述第二平均发射波长为623±5纳米，并且/或者所述第二发射光谱元件的特征在于小于或等于约所述第二平均发射波长的±18纳米的波长带。
189.根据条款175至184中任一项所述的方法，其中：
所述第一染料包括NED、TAMRA、ABY、DY-555中的一种或多种；
所述第二染料包括ABY-Alexa Fluor 647、NED-Alexa Fluor647、
Figure SMS_99
ABY-ATTO 647TM或ABY-DyLight 650TM中的一种或多种；并且
所述第三染料包括Alexa Fluor 647、
Figure SMS_100
ATTO 647TM或DyLight 650TM中的一种或多种。
190.根据条款189所述的方法，其中：
所述第一辐射源的所述第一平均激发波长为550±5纳米，并且/或者所述第一辐射源的特征在于小于或等于约所述第一平均激发波长的±14纳米的波长带；
所述第二辐射源的所述第二平均激发波长为640±5纳米，并且/或者所述第二辐射源的特征在于小于或等于约所述第二平均激发波长的±12纳米的波长带；
所述第一发射光谱元件的所述第一平均发射波长为587±5纳米，并且/或者所述第一发射光谱元件的特征在于小于或等于约所述第一平均发射波长的±12纳米的波长带；
所述第二发射光谱元件的所述第二平均发射波长为682±5纳米，并且/或者所述第二发射光谱元件的特征在于小于或等于约所述第二平均发射波长的±16纳米的波长带。
191.根据条款175至184中任一项所述的方法，其中：
所述第一染料包括NED、TAMRA、ABY、DY-555中的一种或多种；
所述第二染料包括NED-Alexa Fluor 676、NED DyLight680TM、
Figure SMS_101
ABY-Alexa Fluor 676、ABY-DyLight680TM、
Figure SMS_102
中的一种或多种；并且
所述第三染料包括Alexa Fluor 676、DyLight 680TM或
Figure SMS_103
中的一种或多种。
192.根据条款191所述的方法，其中：
所述第一辐射源的所述第一平均激发波长为550±5纳米，并且/或者所述第一辐射源的特征在于小于或等于约所述第一平均激发波长的±14纳米的波长带；
所述第二辐射源的所述第二平均激发波长为662±5纳米，并且/或者所述第二辐射源的特征在于小于或等于约所述第二平均激发波长的±12纳米的波长带；
所述第一发射光谱元件的所述第一平均发射波长为587±5纳米，并且/或者所述第一发射光谱元件的特征在于小于或等于约所述第一平均发射波长的±12纳米的波长带；
所述第二发射光谱元件的所述第二平均发射波长为711±5纳米，并且/或者所述第二发射光谱元件的特征在于小于或等于约所述第二平均发射波长的±16纳米的波长带。
193.根据条款175至192中任一项所述的方法，还包括执行核酸合成测定，以及在所述核酸合成测定期间和/或在所述核酸合成测定之后进行照射和测量。
194.根据条款193所述的方法，其中所述核酸合成测定包括聚合酶链反应(PCR)测定，所述合酶链反应测定包括使溶液循环通过多个温度循环，以及在所述温度循环中的一个或多个温度循环之后执行对所述染料的发射的测量。
195.根据条款193所述的方法，其中所述核酸合成测定包括聚合酶链反应(PCR)测定，所述聚合酶链反应测定包括使所述溶液循环通过所述多个温度循环，以及在最后温度循环之后执行对所述染料的发射的测量。
196.根据条款178所述的方法，还包括：
从所述第一靶分子产生第一扩增子；
从所述第二靶分子产生第二扩增子；以及/或者
从所述第三靶分子产生第三扩增子。
197.根据条款175至184中任一项所述的方法，还包括：
提供第三辐射源、第四辐射源、第五辐射源和第六辐射源，所述第三辐射源、所述第四辐射源、所述第五辐射源和所述第六辐射源中的每一者的特征在于相应的第三平均激发波长、第四平均激发波长、第五平均激发波长和第六平均激发波长，其中所述六个平均激发波长中的每一者不同于其余的平均激发波长
在所述样品中提供第四染料、第五染料、第六染料、第七染料和第八染料；
提供第三发射光谱元件、第四发射光谱元件、第五发射光谱元件和第六发射光谱元件，所述发射光谱元件各自被构造成传递来自所述样品的发射，所述第三发射元件、所述第四发射元件、所述第五发射元件和所述第六发射元件中的每一者的特征在于相应的第三平均发射波长、第四平均发射波长、第五平均发射波长和第六平均发射波长，其中所述波长源中的每个波长源的所述六个平均发射波长中的每一者不同于其余源的所述平均发射波长；
用第三辐射源、第四辐射源、第五辐射源和第六辐射源照射所述样品；并且
响应于用所述第三辐射源、所述第四辐射源、所述第五辐射源和所述第六辐射源中的每一者照射所述样品，使用所述发射光谱元件中的一个或多个发射光谱元件测量来自所述样品的发射。
198.根据条款197所述的方法，其中所述第四染料、所述第五染料、所述第六染料、所述第七染料和所述第八染料被构造成与相应的第四靶分子、第五靶分子、第六靶分子、第七靶分子和第八靶分子结合，所述方法还包括基于所测量的发射来确定存在于所述样品中的所述靶分子的量。
199.根据条款197至198中任一项所述的方法，其中所述第二染料和所述第四染料是离轴染料。
200.根据条款197至199中任一项所述的方法，其中：
所述第二染料包括与所述第一染料的最大吸收波长相等或基本上相等的最大吸收波长；
所述第四染料包括与所述第一染料的最大吸收波长相等或基本上相等的最大吸收波长；
所述第二染料包括与所述第三染料的最大发射波长相等或基本上相等的最大发射波长；并且
所述第四染料包括与所述第五染料的最大发射波长相等或基本上相等的最大发射波长。
201.根据条款175至184中任一项所述的方法，还包括：
提供第三辐射源、第四辐射源、第五辐射源和第六辐射源，所述第三辐射源、所述第四辐射源、所述第五辐射源和所述第六辐射源中的每一者的特征在于相应的第三平均激发波长、第四平均激发波长、第五平均激发波长和第六平均激发波长，其中所述六个平均激发波长中的每一者不同于其余的平均激发波长；
在所述样品中提供第四染料、第五染料、第六染料、第七染料、第八染料、第九染料和第十染料；
提供第三发射光谱元件、第四发射光谱元件、第五发射光谱元件和第六发射光谱元件，所述发射光谱元件各自被构造成传递来自所述样品的发射，所述第三发射元件、所述第四发射元件、所述第五发射元件和所述第六发射元件中的每一者的特征在于相应的第三平均发射波长、第四平均发射波长、第五平均发射波长和第六平均发射波长，其中所述波长源中的每个波长源的所述六个平均发射波长中的每一者不同于其余源的所述平均发射波长；
用第三辐射源、第四辐射源、第五辐射源和第六辐射源照射所述样品；
响应于用所述第一辐射源、所述第二辐射源、所述第三辐射源、所述第四辐射源、所述第五辐射源和所述第六辐射源中的每一者照射所述样品，使用所述发射光谱元件中的一个或多个发射光谱元件测量来自所述样品的发射；
基于所测量的发射确定存在于所述样品中的所述靶分子的量。
202.根据条款201所述的方法，其中所述第四染料、所述第五染料、所述第六染料、所述第七染料、所述第八染料、所述第九染料和所述第十染料被构造成与相应的第四靶分子、第五靶分子、第六靶分子、第七靶分子、第八靶分子、第九靶分子和第十靶分子结合，所述方法还包括基于所测量的发射来确定存在于所述样品中的所述靶分子的量。
203.根据条款201至202中任一项所述的方法，其中所述第二染料、所述第四染料、所述第九染料和所述第十染料是离轴染料。
204.根据条款201至203中任一项所述的方法，其中：
所述第二染料包括与所述第一染料的最大吸收波长相等或基本上相等的最大吸收波长；
所述第四染料包括与所述第一染料的最大吸收波长相等或基本上相等的最大吸收波长；
所述第九染料包括与所述第三染料的最大吸收波长相等或基本上相等的最大吸收波长；
所述第十染料包括与所述第三染料的最大吸收波长相等或基本上相等的最大吸收波长；
所述第二染料包括与所述第三染料的最大发射波长相等或基本上相等的最大发射波长；
所述第四染料包括与所述第五染料的最大发射波长相等或基本上相等的最大发射波长；
所述第九染料包括与所述第七染料的最大发射波长相等或基本上相等的最大发射波长；并且
所述第二染料包括与所述第十染料的最大发射波长相等或基本上相等的最大发射波长
205.根据条款197至204中任一项所述的方法，其中：
所述第一辐射源的所述第一平均激发波长为480±5纳米，并且/或者所述第一辐射源的特征在于小于或等于约所述第一平均激发波长的±12纳米的波长带；
所述第二辐射源的所述第二平均激发波长为520±5纳米，并且/或者所述第二辐射源的特征在于小于或等于约所述第二平均激发波长的±12纳米的波长带；
所述第三辐射源的所述第三平均激发波长为550±5纳米，并且/或者所述第三辐射源的特征在于小于或等于约所述第三平均激发波长的±12纳米的波长带；
所述第四辐射源的所述第四平均激发波长为580±5纳米，并且/或者所述第四辐射源的特征在于小于或等于约所述第四平均激发波长的±12纳米的波长带；
所述第五辐射源的所述第五平均激发波长为640±5纳米，并且/或者所述第五辐射源的特征在于小于或等于约所述第五平均激发波长的±12纳米的波长带；
所述第六辐射源的所述第六平均激发波长为662±5纳米，并且/或者所述第六辐射源的特征在于小于或等于约所述第六平均激发波长的±12纳米的波长带；
所述第一发射光谱元件的所述第一平均发射波长为520±5纳米，并且/或者所述第一发射光谱元件的特征在于小于或等于约所述第一平均发射波长的±18纳米的波长带；
所述第二发射光谱元件的所述第二平均发射波长为558±5纳米，并且/或者所述第二发射光谱元件的特征在于小于或等于约所述第二平均发射波长的±15纳米的波长带；
所述第三发射光谱元件的所述第三平均发射波长为587±5纳米，并且/或者所述第三发射光谱元件的特征在于小于或等于约所述第三平均发射波长的±12纳米的波长带；
所述第四发射光谱元件的所述第四平均发射波长为623±5纳米，并且/或者所述第四发射光谱元件的特征在于小于或等于约所述第四平均发射波长的±16纳米的波长带；
所述第五发射光谱元件的所述第五平均发射波长为682±5纳米，并且/或者所述第五发射光谱元件的特征在于小于或等于约所述第五平均发射波长的±16纳米的波长带；并且
所述第六发射光谱元件的所述第六平均发射波长为711±5纳米，并且/或者所述第六发射光谱元件的特征在于小于或等于约所述第六平均发射波长的±16纳米的波长带。
206.根据条款197至205中任一项所述的方法，其中：
所述第一染料是5-FAM、6-FAM、Oregon Green、TET或R110中的至少一种；
所述第二染料是FAM-TAMRA、FAM-ABY或FAM-NED中的至少一种；
所述第三染料是NED、TAMRA、ABY或DY-555中的至少一种；
所述第四染料是FAM-PET、FAM-ROX、FAM-JUN、FAM-Texas Red或TET-Alexa Fluor594中的至少一种；
所述第五染料是PET、ROX、JUN、Texas Red或Alexa Fluor 594中的至少一种；
所述第六染料是VIC、HEX、JOE、Yakima Yellow或R6G中的至少一种；
所述第七染料是Alexa Fluor 647、
Figure SMS_104
ATTO 647TM或DyLight 650TM中的至少一种；
所述第八染料是Alexa Fluor 676、DyLight 680TM或
Figure SMS_105
中的至少一种。
207.根据条款201至206中任一项所述的方法，其中：
所述第九染料是ABY-Alexa Fluor 647、NED-Alexa Fluor647、
Figure SMS_106
ABY-ATTO 647TM或ABY-DyLight 650TM中的至少一种；并且
所述第十染料是NED-Alexa Fluor 676、NED DyLight 680TM、
Figure SMS_107
ABY-Alexa Fluor 676、ABY-DyLight 680TM或
Figure SMS_108
中的至少一种。
208.根据条款197至207中任一项所述的方法，其中所述第二染料和所述第四染料独立地包括选自以下项的荧光团：荧光素染料、罗丹明染料、焦宁染料和花青染料。
209.根据条款201至208中任一项所述的方法，其中所述第二染料、所述第四染料、所述第九染料和所述第十染料独立地包括选自以下项的荧光团：荧光素染料、罗丹明染料、焦宁染料和花青染料。
210.根据条款153至196中任一项所述的方法，其中所述辐射源中的每个辐射源的特征在于具有可见光光谱中的最大波长和/或平均波长的辐射。
211.根据条款153至196中任一项所述的方法，其中所述辐射源中的每个辐射源的特征在于具有红外波长带和/或紫外波长带中的最大波长和/或平均波长的辐射。
212.根据条款153至196中任一项所述的方法，其中在所述辐射源中的至少一个辐射源中包括发光二极管(LED)或激光器。
213.根据条款153至196中任一项所述的方法，其中：
所述第一辐射源和第一滤光器被构造成过滤来自所述辐射源的辐射；并且
所述第二辐射源包括所述辐射源和第二滤光器，所述辐射源和所述第二滤光器被构造成过滤来自所述辐射源的辐射。
214.根据条款153至196中任一项所述的方法，其中所述第一辐射源的所述第一平均激发波长和所述第二辐射源的所述第二平均激发波长相差至少50纳米或至少60纳米。
215.根据条款153至196中任一项所述的方法，还包括滤光轮，所述滤光轮包括所述辐射源。
216.根据条款153至196中任一项所述的方法，其中测量包括使用检测器测量来自所述样品的发射。
217.根据条款216所述的方法，其中所述检测器包括阵列传感器，所述阵列传感器包括传感器或像素的阵列。
218.根据条款217所述的方法，其中所述阵列传感器包括电耦装置(CCD)或互补金属-氧化物-半导体(CMOS)。
219.根据条款216所述的方法，其中所述发射光谱元件包括色散光学元件，所述色散光学元件被构造成沿第一光学路径和第二光学路径分散来自所述样品的发射，所述方法还包括使用所述色散光学元件用于：
将来自所述样品的发射沿第一光学路径引导至所述第一检测器；并且
将来自所述样品的发射沿第二光学路径引导至所述第二检测器。
220.根据条款219所述的方法，其中所述第一检测器包括在CCD检测器或CMOS检测器上的第一位置，并且所述第二包括在CCD检测器或CMOS检测器上的与所述第一位置在空间上分开的第二位置。
221.根据条款220所述的方法，其中所述第一位置包括像素或像素组，并且所述第二位置包括不同的像素或像素组。
222.根据条款175至221中任一项所述的方法，其中：
所述第一发射光谱元件包括第一光谱滤光器；
所述第二发射光谱元件包括第二光谱滤光器；并且
测量包括沿所述样品与所述检测器之间的光学路径顺序地放置所述第一光谱滤光器和所述第二光谱滤光器。
223.根据条款148至163或175至222中任一项所述的方法，其中所述第一平均发射波长和所述第二平均发射波长相差至少25纳米。
224.根据条款175至223中任一项所述的方法，还包括滤光轮，所述滤光轮包括所述发射光谱元件，其中照射所述样品包括使用所述滤光轮沿所述样品与检测器之间的光学路径顺序地放置所述发射光谱元件，所述检测器用于测量来自所述样品的发射。
225.根据条款175至224中任一项所述的方法，其中：
所述第一发射光谱元件包括第一光谱滤光器，所述第一光谱滤光器被构造成传递第一发射波长带内的辐射；
所述第二发射光谱元件包括第二光谱滤光器，所述第二光谱滤光器被构造成传递第二发射波长带内的辐射，所述第二发射波长带不与所述第一发射波长带重叠。
226.根据条款178所述的方法，其中所述第一探针、所述第二探针或所述第三探针还包含猝灭剂部分。
227.根据条款175至226中任一项所述的方法，还包括：
提供第三辐射源，所述第三辐射源的特征在于第三平均激发波长，所述第三平均激发波长不同于所述第一辐射源的所述第一平均激发波长或所述第二辐射源的所述第二平均激发波长；并且
用来自第三辐射源的辐射照射所述样品，并且作为响应，使用所述第一发射光谱元件或所述第二发射光谱元件中的一者或多者测量来自所述样品的发射；
其中确定靶分子中的一种或多种靶分子的量是基于来自所述样品的所测量发射，以响应于用来自所述第三辐射源的辐射照射所述样品。
228.根据条款227所述的方法，其中确定所述靶分子中的一种或多种靶分子的所述量包括调整来自所述样品的所测量发射中的一种或多种所测量发射，以响应于用来自所述第一辐射源和/或所述第二辐射源的辐射照射所述样品。
229.根据条款175至228中任一项所述的方法，其中：
所述第一染料的特征在于第一发射光谱特征，所述第二染料的特征在于第二发射光谱特征，并且所述第三染料的特征在于第三发射光谱特征；
所述第一光谱特征包括当所述第一染料被所述辐射源中的每个辐射源单独照射时在发射波长带的每个发射波长带内发射的能量的量；
所述第二光谱特征包括当所述第二染料被所述辐射源中的每个辐射源单独照射时在发射波长带的每个发射波长带内发射的能量的量；
所述第三光谱特征包括当所述第三染料被所述辐射源中的每个辐射源单独照射时在发射波长带的每个发射波长带内发射的能量的量；并且
每种染料的光谱特征不同于其余染料的所述光谱特征。
230.根据条款175至229中任一项所述的方法，其中对来自所述三种染料中的每种染料的发射的测量按时间顺序地发生。
231.根据条款175至230中任一项所述的方法，其中对来自所述三种染料的发射的测量同时发生。
232.根据条款175至231中任一项所述的方法，其中所述第一染料是FAM，所述第二染料是ROX，并且所述第三染料是FAM-ROX。
233.根据条款175至232中任一项所述的方法，其中所述第二最大吸收波长大于所述第一最大吸收波长。
234.根据条款175至233中任一项所述的方法，其中所述第二最大吸收波长小于所述第一最大吸收波长。
235.根据条款175至234中任一项所述的方法，其中所述第二染料是能量转移染料缀合物，所述能量转移染料缀合物包含：
供体染料，所述供体染料的特征在于与所述第一染料的所述最大吸收波长相等或基本上相等的最大吸收波长，所述供体染料被构造成吸收来自所述第一辐射源的辐射，并且作为响应，产生能量；和
受体染料，所述受体染料的特征在于与所述第三染料的所述最大发射波长相等或基本上相等的最大发射波长，其中所述染料被构造成将由所述供体产生的所述能量的至少一些能量转移至所述受体染料。
236.根据条款235所述的方法，其中所述第一染料包括第一荧光团，并且其中所述供体染料和所述第一荧光团相同。
237.根据条款235所述的方法，其中所述第三染料包括第三荧光团，并且其中所述供体染料和所述第三荧光团不同。
238.根据条款235所述的方法，其中所述第一染料的特征在于第一光谱特征，所述第三染料的特征在于第三光谱特征，所述供体染料的特征在于供体染料光谱特征，并且(1)所述供体染料光谱特征等于所述第三发射光谱特征，并且/或者(2)所述供体染料的最大发射波长等于所述第三染料的最大发射波长。
239.根据条款235所述的方法，其中所述供体染料具有发射波长带，并且所述受体染料具有不与所述供体染料发射波长带重叠的吸收波长带。
240.根据条款235所述的方法，其中所述供体染料具有与所述第一染料或所述第三染料不同的化学结构。
241.根据条款235所述的方法，其中所述第一染料的特征在于第一光谱特征，所述第三染料的特征在于第三光谱特征，所述供体染料的特征在于供体染料光谱特征，并且(1)所述供体染料光谱特征与所述第三光谱特征不同，并且/或者(2)所述供体染料最大发射波长与所述第三染料的所述最大发射波长不同。
242.根据条款235所述的方法，其中所述第一染料的特征在于第一光谱特征，所述第三染料的特征在于第三光谱特征，所述供体染料的特征在于供体染料光谱特征，并且(1)所述供体染料光谱特征与所述第三光谱特征不同，并且/或者(2)所述供体染料最大发射波长与所述第三染料的所述最大发射波长不同。
243.一种执行定量聚合酶链反应(qPCR)测定的方法，包括：
提供包含离轴染料和同轴染料的生物样品；
对所述样品执行qPCR测定；
在所述qPCR测定的所述qPCR测定的第一循环期间，用两个或更多个激发通道执行所述样品的第一系列照射；
响应于所述第一系列照射中的每个照射，测量来自两个或更多个发射通道的相应第一系列发射信号；
在所述qPCR测定的所述qPCR测定的第二循环期间，用所述两个或更多个激发通道执行所述样品的第二系列照射；
响应于所述第二系列照射中的每个照射，测量来自所述两个或更多个发射通道的相应第二系列发射信号；
基于来自所述第一系列测量中的至少一个测量来计算所述离轴染料的量；以及
基于来自所述第二系列测量中的至少一个测量来计算所述同轴染料的量。
244.根据条款243所述的方法，基于来自所述第一系列测量中的至少一个测量来计算在所述第二系列测量期间存在的所述离轴染料的量。
245.根据条款243所述的方法，其中至少部分地基于所述染料中的至少一种染料的ex-em空间特征来计算所述至少一种染料的量。
246.一种执行定量聚合酶链反应(qPCR)测定的方法，包括：
提供包含离轴染料和同轴染料的生物样品；
对所述样品执行qPCR测定；
在所述qPCR测定的所述qPCR测定的第一循环期间，用两个或更多个激发通道执行所述样品的第一系列照射；
响应于所述第一系列照射中的每个照射，测量来自两个或更多个发射通道的相应第一系列发射信号；
在所述qPCR测定的所述qPCR测定的第二循环期间，用所述两个或更多个激发通道执行所述样品的第二系列照射；
响应于所述第二系列照射中的每个照射，测量来自所述两个或更多个发射通道的相应第二系列发射信号；
基于来自所述第一系列测量中的至少一个测量来计算所述同轴染料的量；以及
基于来自所述第二系列测量中的至少一个测量来计算所述离轴染料的量。
247.根据条款246所述的方法，基于来自所述第一系列测量中的至少一个测量来计算在所述第二系列测量期间存在的所述同轴染料的量。
248.根据条款246所述的方法，其中至少部分地基于所述染料中的至少一种染料的ex-em空间特征来计算所述至少一种染料的量。
249.根据条款153至248中任一项所述的方法，其中所述样品是生物样品。
250.根据条款249所述的方法，其中所述生物样品包含一种或多种靶分子。
251.根据条款250所述的方法，其中所述一种或多种靶分子包括一种或多种核酸分子。
252.根据条款249至251中任一项所述的方法，其中所述至少一个存储器包括基于所测量的发射来确定存在于所述样品中的所述靶分子中的任何靶分子的量的指令。
253.一种包含一组荧光标记的寡核苷酸探针的组合物，其中所述组包括：
i.第一探针，所述第一探针与第一荧光团共价连接，其中所述第一荧光团的特征在于第一吸收波长和第一发射波长；和
ii.第二探针，所述第二探针与根据条款1至17中任一项所述的能量转移染料缀合物共价连接。
254.根据条款253所述的组合物，其中所述缀合物的所述供体染料的特征在于第二吸收波长并且发射激发能量作为响应。
255.根据条款253所述的组合物，其中所述缀合物的所述受体染料能够吸收由所述供体染料发射的所述激发能量，并且作为响应，发射特征在于第二发射波长的辐射。
256.根据条款255所述的组合物，其中所述第一吸收波长和所述第二吸收波长相差50纳米或更大。
257.根据条款255所述的组合物，其中所述第一发射波长和所述第二发射波长在彼此的10纳米内。
258.根据条款255所述的组合物，还包括：
iii.第三探针，所述第三探针与第二荧光团共价连接，其中所述第二荧光团的特征在于第三吸收波长和第三发射波长。
259.根据条款258所述的组合物，其中所述第一探针、所述第二探针和/或所述第三探针是寡核苷酸探针。
260.根据条款258所述的组合物，其中所述第一探针、所述第二探针和/或所述第三探针还包含猝灭剂部分。
261.根据条款258所述的组合物，其中所述第三吸收波长与所述第二吸收波长相差50nm或更大。
262.根据条款258所述的组合物，其中所述第三发射波长在所述第二发射波长的20nm内。
263.根据条款258至262中任一项所述的组合物，其中所述第一荧光团和所述第二荧光团独立地选自：荧光素染料、花青染料、罗丹明染料、吡咯硼染料、嵌二萘染料、焦宁染料和香豆素染料。
264.根据条款258至263中任一项所述的组合物，其中所述第一荧光团和所述供体染料相同。
265.根据条款258至263中任一项所述的组合物，其中所述第二荧光团和所述受体染料相同。
266.根据条款258至265中任一项所述的组合物，其中
所述第一荧光团和所述供体染料是荧光素染料或罗丹明染料；并且
所述第二荧光团和所述受体染料是罗丹明染料、焦宁染料或花青染料。
267.根据条款258至265中任一项所述的组合物，其中
所述第一荧光团和所述供体染料是荧光素染料；并且
所述第二荧光团和所述受体染料是花青染料或焦宁染料。
268.根据条款258至265中任一项所述的组合物，其中
所述第一荧光团和所述供体染料是荧光素染料；并且
所述第二荧光团和所述受体染料是罗丹明染料。
269.根据条款258至265中任一项所述的组合物，其中
所述第一荧光团和所述供体染料是罗丹明染料；并且
所述第二荧光团和所述受体染料是花青或焦宁染料。
270.一种包含一组荧光标记的寡核苷酸探针的组合物，其中所述组包括：
i.第一寡核苷酸探针，所述第一寡核苷酸探针与第一荧光团共价连接，其中所述第一荧光团的特征在于第一吸收波长和第一发射波长；和
ii.第二寡核苷酸探针，所述第二寡核苷酸探针与根据条款1至17中任一项所述的能量转移染料缀合物共价连接，其中
a)所述供体染料的特征在于第二吸收波长并且发射激发能量作为响应，并且
b)所述受体染料能够吸收由所述供体染料发射的所述激发能量，并且作为响应，发射特征在于第二发射波长的辐射；
其中所述第一吸收波长和所述第二吸收波长在彼此的20纳米内，并且
其中所述第一发射波长和所述第二发射波长相差大于50纳米。
271.一种通过聚合酶链反应(PCR)检测或定量样品中的靶核酸分子的方法，所述方法包括：
(i)使包含一种或多种靶核酸分子的所述样品与a)根据条款18至36中任一项所述的至少一种寡核苷酸探针接触，所述寡核苷酸探针具有与所述靶核酸分子至少部分互补的序列，其中所述至少一种探针在扩增所述一种或多种靶核酸分子时经历可检测的荧光变化；以及与b)至少一种寡核苷酸引物对接触；
(ii)在足以扩增所述一种或多种靶核酸分子的条件下将步骤(i)的混合物与DNA聚合酶一起孵育；以及
(iii)通过测量所述探针的荧光来检测所扩增的靶核酸分子的存在或不存在，或者定量所扩增的靶核酸分子的量。
272.一种用于聚合酶链反应(PCR)的试剂盒，所述试剂盒包括：
i.一种或多种缓冲剂、纯化介质、有机溶剂、核酸合成酶；和
ii.根据条款18或条款19所述的寡核苷酸探针；和
iii.用于执行PCR测定的说明书。
273.一种组合物，包含：
a)第一标记寡核苷酸，所述第一标记寡核苷酸包括根据条款1至17中任一项所述的能量转移染料缀合物；和
b)聚合酶。
274.根据条款273所述的组合物，其中所述聚合酶是DNA聚合酶。
275.根据条款273所述的组合物，其中所述聚合酶是热稳定的。
276.根据条款273所述的组合物，其中所述组合物还包含逆转录酶(RT)。
277.根据条款273所述的组合物，还包含至少一种脱氧核糖核苷三磷酸腺苷(dNTP)。
278.根据条款273至277中任一项所述的组合物，还包含以下中的一者或多者：
a)被动参考对照；
b)甘油；
c)一种或多种PCR抑制剂阻断剂；
d)尿嘧啶DNA糖基化酶；
e)洗涤剂；
f)一种或多种盐；和
g)缓冲剂。
279.根据条款278所述的组合物，其中所述一种或多种盐是氯化镁和/或氯化钾。
280.根据条款273至279中任一项所述的组合物，其中所述组合物还包含一种或多种热启动组分。
281.根据条款280所述的组合物，其中所述一种或多种热启动组分选自对所述聚合酶的化学修饰、对所述聚合酶具有抑制性的寡核苷酸和对所述聚合酶具有特异性的抗体。
282.根据条款273至281所述的组合物，还包括以下中的一者或多者：
a)核酸样品；
b)至少一种引物寡核苷酸，所述至少一种引物寡核苷酸对靶核酸的扩增具有特异性；或
c)扩增的核酸产物(即，扩增子)。
283.根据条款282所述的组合物，其中所述核酸样品是RNA。
284.根据条款282所述的组合物，其中所述核酸样品是DNA。
285.根据条款282所述的组合物，其中所述核酸样品是cDNA。
286.根据条款258至271中任一项所述的组合物，其中所述组合物还包含第二标记寡核苷酸，所述第二标记寡核苷酸包括根据条款1至17中任一项所述的能量转移染料缀合物，其中所述第一标记寡核苷酸和所述第二标记寡核苷酸的能量转移染料缀合物不同。287.根据条款258至271中任一项所述的组合物，其中所述第一标记寡核苷酸和/或所述第二标记寡核苷酸包括至少一个修饰的核苷酸。
288.根据条款287所述的组合物，其中所述至少一种修饰的核苷酸包括锁核酸(LNA)。
289.根据条款287所述的组合物，其中所述至少一种修饰的核苷酸包括小沟结合剂(MGB)。
一种组合物，包含
a)根据条款273至289中任一项所述的荧光能量转移染料缀合物；
b)核酸分子。
一种组合物，包含
a)根据条款273至290中任一项所述的荧光能量转移染料缀合物；
一种组合物，包含
a)根据前述条款中任一项所述的荧光能量转移染料缀合物；和
b)荧光团，所述荧光团具有在所述能量转移染料缀合物中所述供体染料的所述激发波长的20nm内或在所述能量转移染料缀合物中所述受体染料的所述发射波长的20nm内的激发波长。
根据条款59所述的组合物，其中所述荧光团是或包括选自以下项的染料：呫吨染料、花青染料、吡咯硼染料、嵌二萘染料、焦宁染料和香豆素染料。
根据条款18至36中任一项所述的探针，其中所述荧光能量转移染料缀合物与所述寡核苷酸的所述5'末端共价连接，并且所述猝灭剂染料与所述寡核苷酸的所述3'末端共价连接。
根据条款18至36中任一项所述的探针，其中所述寡核苷酸与所述靶核酸分子具有至少60％互补。根据条款18至36中任一项所述的探针，其中所述寡核苷酸与所述靶核酸分子具有至少90％互补。
根据条款35或36所述的探针，其中所述尾部部分是通用尾部部分。
290.一种组合物，包含：
a)根据条款1至17中任一项所述的荧光能量转移染料缀合物；
b)分析物。
291.根据条款290所述的组合物，其中所述分析物选自核酸分子、蛋白质或肽和碳水化合物。
292.根据条款290所述的组合物，其中所述核酸分子是寡核苷酸。
293.根据条款290所述的组合物，其中所述蛋白质是抗体。
294.一种组合物，包含：
a)根据1至17中任一项所述的荧光能量转移染料缀合物；和
b)酶。
295.根据条款294所述的组合物，其中所述酶是聚合酶和/或逆转录酶。
296.一种检测或定量样品中的靶核酸分子的方法：
(i)使包含一种或多种靶核酸分子的所述样品与a)根据条款18至36中任一项所述的至少一种寡核苷酸探针接触，所述探针具有与所述靶核酸分子至少部分互补的序列；以及
(ii)通过测量所述探针的荧光来检测所述靶核酸分子的存在或不存在，或者定量所述靶核酸分子的量。
297.根据条款37至252中任一项所述的系统或方法，包括根据条款1至17中任一项所述的荧光能量转移染料缀合物。
298.一种用于检测样品中的生物分子的试剂盒，所述试剂盒包括：
i.根据条款18至36中任一项所述的寡核苷酸探针；和
iii.用于执行检测所述生物分子的测定的说明书。
299.根据条款1至36、38至54、56至72、74至152、154至163、165至174、176至298中任一项所述的组合物、方法、试剂盒或系统，其中所述荧光能量转移染料缀合物是水溶性的。
300.根据条款37至152所述的系统，还包括校准板，所述校准板被构造成减少所述染料中的两种或更多种染料之间的串扰。
301.根据条款300所述的系统，其中所述校准板包括四种校准同轴染料和两种校准离轴染料。
302.根据条款300所述的系统，其中所述校准板包括两种校准同轴染料和四种校准离轴染料。
303.根据条款301或302所述的系统，其中所述校准离轴染料包括以下中的一者或多者：
所述染料FAM-TAMRA、FAM-ABY或FAM-NED中的一种；
所述染料FAM-PET、FAM-ROX、FAM-JUN、FAM-Texas Red或TET-Alexa Fluor 594中的一种；
所述染料ABY-Alexa Fluor 647、NED-Alexa Fluor 647、
Figure SMS_109
ABY-ATTO647TM或ABY-DyLight 650TM中的一种；和/或
所述染料NED-Alexa Fluor 676、NED DyLight 680TM、
Figure SMS_110
ABY-AlexaFluor 676、ABY-DyLight 680TM或
Figure SMS_111
中的一种。
304.根据条款301至303所述的系统，其中所述校准同轴染料包括一种或多种所述染料FAM或VIC：
305.一种方法，包括：
提供用于执行根据条款153至252或271所述的方法的系统；
使用校准板来校准系统，所述校准板被构造成减少所述染料中的两种或更多种染料之间的串扰。
306.根据条款305所述的方法，其中所述校准板包括四种校准同轴染料和两种校准离轴染料。
307.根据条款305所述的方法，其中所述校准板包括两种校准同轴染料和四种校准离轴染料。
308.根据条款306或307所述的方法，其中所述校准离轴染料包括以下中的一者或多者：
所述染料FAM-TAMRA、FAM-ABY或FAM-NED中的一种；
所述染料FAM-PET、FAM-ROX、FAM-JUN、FAM-Texas Red或TET-Alexa Fluor 594中的一种；
所述染料ABY-Alexa Fluor 647、NED-Alexa Fluor 647、
Figure SMS_112
ABY-ATTO647TM或ABY-DyLight 650TM中的一种；和/或
所述染料NED-Alexa Fluor 676、NED DyLight 680TM、
Figure SMS_113
ABY-AlexaFluor 676、ABY-DyLight 680TM或
Figure SMS_114
中的一种。
309.根据条款305至308所述的方法，其中所述校准同轴染料包括一种或多种所述染料FAM或VIC。
310.一种包括校准板的系统，所述校准板被构造成减少两种或更多种染料之间的串扰，其中所述校准板包括：
四种校准同轴染料和两种校准离轴染料；或者
两种校准同轴染料和四种校准离轴染料。
311.根据条款310所述的系统，其中所述校准离轴染料包括以下中的一者或多者：
所述染料FAM-TAMRA、FAM-ABY或FAM-NED中的一种；
所述染料FAM-PET、FAM-ROX、FAM-JUN、FAM-Texas Red或TET-Alexa Fluor 594中的一种；
所述染料ABY-Alexa Fluor 647、NED-Alexa Fluor 647、
Figure SMS_115
ABY-ATTO647TM或ABY-DyLight 650TM中的一种；和/或
所述染料NED-Alexa Fluor 676、NED DyLight 680TM、
Figure SMS_116
ABY-AlexaFluor 676、ABY-DyLight 680TM或
Figure SMS_117
中的一种。
312.根据条款310至311所述的系统，其中所述校准同轴染料包括一种或多种所述染料FAM或VIC：
313.一种方法，包括：
提供用于执行根据条款153至252或271所述的方法的系统；
使用校准板来校准系统，所述校准板被构造成减少所述染料中的两种或更多种染料之间的串扰。
314.根据条款313所述的系统，其中所述校准离轴染料包括以下中的一者或多者：
所述染料FAM-TAMRA、FAM-ABY或FAM-NED中的一种；
所述染料FAM-PET、FAM-ROX、FAM-JUN、FAM-Texas Red或TET-Alexa Fluor 594中的一种；
所述染料ABY-Alexa Fluor 647、NED-Alexa Fluor 647、
Figure SMS_118
ABY-ATTO647TM或ABY-DyLight 650TM中的一种；和/或
所述染料NED-Alexa Fluor 676、NED DyLight 680TM、
Figure SMS_119
ABY-AlexaFluor 676、ABY-DyLight 680TM或
Figure SMS_120
中的一种。
315.根据条款301至303所述的系统，其中所述校准同轴染料包括一种或多种所述染料FAM或VIC。
316.一种执行扩增测定的方法，包括：
提供生物样品，所述生物样品包含多种靶分子、一种或多种离轴染料和一种或多种同轴染料，所述一种或多种离轴染料被构造成与所述多种靶分子中的相应一种或多种靶分子结合，所述一种或多种同轴染料被构造成与所述多种靶分子中的相应一种或多种靶分子结合；
对所述样品执行至少一个扩增循环；
在所述至少一个扩增循环期间或之后，用两个或更多个激发通道照射所述样品；
响应于所述照射中的每个照射，测量来自两个或更多个发射通道的发射信号；
基于所述发射信号来计算所述同轴染料和所述离轴染料的量。
317.根据条款316所述的方法，还包括基于所述发射信号来计算所述靶分子中的一种或多种靶分子的量。
318.根据条款316至317中任一项所述的方法，其中所述扩增测定包括定量聚合酶链反应(qPCR)测定。
319.根据条款316至317中任一项所述的方法，其中所述生物样品被分离到多个反应区域中，并且所述扩增测定包括在所述反应区域中的至少一些反应区域上的数字聚合酶链反应(dPCR)测定。
320.根据条款316至317或319中任一项所述的方法，其中所述反应区域的数量大于或等于3000个反应区域。
321.根据条款316至317或319中任一项所述的方法，其中所述反应区域的数量大于或等于20000个反应区域。
322.根据条款316至317或319中任一项所述的方法，其中所述反应区域的数量大于或等于100000个反应区域。
323.根据条款316至317或319中任一项所述的方法，其中所述反应区域的数量大于或等于1000000个反应区域。
324.根据条款316至317或319至323中任一项所述的方法，其中所述反应区域中的至少一些反应区域不含所述靶分子。
325.根据条款316至317或319至324中任一项所述的方法，其中述反应区域中的至少一些反应区域仅含有所述靶分子中的一种靶分子。
326.根据条款316至317或319至325中任一项所述的方法，其中所述生物样品包含至少三种靶分子。
327.根据条款316至317或319至326中任一项所述的方法，所述反应区域中的至少一些反应区域含有多于一种的所述靶分子和少于全部的所述至少三种靶分子。
328.根据条款316至327中任一项所述的方法，其中第一染料是或包括第一荧光团，并且第二染料是或包括根据条款1至17中任一项所述的荧光能量转移染料缀合物。
329.根据条款316至328中任一项所述的方法，其中所述第一荧光团选自呫吨染料、花青染料、吡咯硼染料、嵌二萘染料、焦宁染料和香豆素染料。
330.根据条款316至329中任一项所述的方法，其中所述第二染料包括选自以下项的荧光团：荧光素染料、罗丹明染料、焦宁染料和花青染料。
331.根据条款316至330中任一项所述的方法，其中所述第一染料与第一探针共价连接，并且所述第二染料与第二探针共价连接，其中所述第一探针和所述第二探针被构造成分别与第一靶分子和第二靶分子结合。
332.根据条款331所述的方法，其中所述第一探针和所述第二探针是寡核苷酸探针，并且所述第二探针是根据条款18至36中任一项所述的探针。
333.根据条款316至332中任一项所述的方法，其中所述第一靶分子和所述第二靶分子是核酸分子。
334.根据条款316至333中任一项所述的方法，其中所述第一染料包括与所述第二染料的最大吸收波长相等或基本上相等的最大吸收波长。
335.根据条款334所述的方法，其中所述第一最大吸收波长或所述第二最大吸收波长中的一者或多者是所述相应光谱整体上的绝对最大值。
336.根据条款316至335中任一项所述的方法，其中所述第一染料是同轴染料，并且所述第二染料是离轴染料。
337.根据条款316至336中任一项所述的方法，其中所述第一染料被构造成与第一靶分子结合，并且所述第二染料被构造成与第二靶分子结合，所述方法还包括基于所测量的发射来确定存在于所述样品中的任何靶分子的量。
338.一种方法，包括：
提供用于执行根据条款316至337所述的方法的系统；
使用校准板来校准系统，所述校准板被构造成减少所述染料中的两种或更多种染料之间的串扰。
339.根据条款338所述的方法，其中所述校准板包括四种校准同轴染料和两种校准离轴染料。
340.根据条款338所述的方法，其中所述校准板包括两种校准同轴染料和四种校准离轴染料。
341.根据条款339或340所述的方法，其中所述校准离轴染料包括以下中的一者或多者：
所述染料FAM-TAMRA、FAM-ABY或FAM-NED中的一种；
所述染料FAM-PET、FAM-ROX、FAM-JUN、FAM-Texas Red或TET-Alexa Fluor 594中的一种；
所述染料ABY-Alexa Fluor 647、NED-Alexa Fluor 647、
Figure SMS_121
ABY-ATTO647TM或ABY-DyLight 650TM中的一种；和/或
所述染料NED-Alexa Fluor 676、NED DyLight 680TM、
Figure SMS_122
ABY-AlexaFluor 676、ABY-DyLight 680TM或
Figure SMS_123
中的一种。
342.根据条款338至341所述的方法，其中所述校准同轴染料包括一种或多种所述染料FAM或VIC。

Claims (41)

1.一种系统，包括：
第一辐射源，所述第一辐射源的特征在于第一平均激发波长；
第二辐射源，所述第二辐射源的特征在于与所述第一平均激发波长不同的第二平均激发波长；
样品，所述样品被设置成接收来自所述辐射源的辐射，所述样品包含：
第一染料；
第二染料；和
第三染料；
检测器，所述检测器被构造成测量来自所述样品的发射；
第一发射光谱元件，所述第一发射光谱元件的特征在于第一平均发射波长；
第二发射光谱元件，所述第二发射光谱元件的特征在于与所述第一平均发射波长不同的第二平均发射波长；
至少一个处理器，所述至少一个处理器包括至少一个存储器，所述至少一个存储器包括用于以下的指令：
用所述第一辐射源照射所述样品，并且作为响应，(1)使用所述检测器和所述第一发射光谱元件测量来自所述样品的发射，以及(2)使用所述检测器和所述第二发射光谱元件测量来自所述样品的发射；
用所述第二辐射源照射所述样品，并且作为响应，使用所述检测器和所述第二发射光谱元件测量来自所述样品的发射；
其中(1)所述第一染料包括第一吸收光谱，所述第一吸收光谱包括第一最大吸收波长，并且所述第二染料包括第二吸收光谱，所述第二吸收光谱包括与所述第一最大吸收波长相等或基本上相等的第二最大吸收波长；并且(2)所述第二染料包括第二发射光谱，所述第二发射光谱包括第二最大发射波长，并且所述第三染料包括第三发射光谱，所述第三发射光谱包括与所述第二最大发射波长相等或基本上相等的第三最大发射波长。
2.根据权利要求1所述的系统，其中所述第一染料包括第一发射光谱，所述第一发射光谱包括第一最大发射波长，并且所述第二染料包括第二发射光谱，所述第二发射光谱包括与所述第一最大发射波长相等或基本上相等的第二最大发射波长。
3.根据权利要求1所述的系统，其中所述染料中的至少一种染料是离轴染料。
4.根据权利要求1所述的系统，其中：
·所述第一辐射源的所述平均激发波长为480±5纳米，并且/或者所述第一辐射源的特征在于小于或等于约所述平均激发波长的±12纳米的波长带；所述第一发射光谱元件的所述第一平均发射波长为520±5纳米，并且/或者所述第一发射光谱元件的特征在于小于或等于约所述第一平均发射波长的±20纳米的波长带；并且所述第二发射光谱元件的所述第二平均发射波长为587±5纳米，并且/或者所述第二发射光谱元件的特征在于小于或等于约所述第二平均发射波长的±12纳米的波长带；
·所述第一辐射源的所述平均激发波长为480±5纳米，并且/或者所述第一辐射源的特征在于小于或等于约所述平均激发波长的±12纳米的波长带；所述第一发射光谱元件的所述第一平均发射波长为520±5纳米，并且/或者所述第一发射光谱元件的特征在于小于或等于约所述第一平均发射波长的±18纳米的波长带；并且所述第二发射光谱元件的所述第二平均发射波长为623±5纳米，并且/或者所述第二发射光谱元件的特征在于小于或等于约所述第二平均发射波长的±18纳米的波长带；
·所述第一辐射源的所述第一平均激发波长为550±5纳米，并且/或者所述第一辐射源的特征在于小于或等于约所述第一平均激发波长的±14纳米的波长带；所述第二辐射源的所述第二平均激发波长为640±5纳米，并且/或者所述第二辐射源的特征在于小于或等于约所述第二平均激发波长的±12纳米的波长带；所述第一发射光谱元件的所述平均发射波长为682±5纳米，并且/或者所述第二发射光谱元件的特征在于小于或等于约所述平均发射波长的±16纳米的波长带；
或者
·所述第一辐射源的所述第一平均激发波长为550±5纳米，并且/或者所述第一辐射源的特征在于小于或等于约所述第一平均激发波长的±14纳米的波长带；所述第二辐射源的所述第二平均激发波长为662±5纳米，并且/或者所述第二辐射源的特征在于小于或等于约所述第二平均激发波长的±12纳米的波长带；并且所述第一发射光谱元件的所述平均发射波长为711±5纳米，并且/或者所述第二发射光谱元件的特征在于小于或等于约所述平均发射波长的±16纳米的波长带。
5.根据权利要求1所述的系统，其中：
所述系统还包括第四辐射源、第五辐射源和第六辐射源，所述第四辐射源、所述第五辐射源和所述第六辐射源中的每一者的特征在于相应的第四平均激发波长、第五平均激发波长和第六平均激发波长，其中所述六个平均激发波长中的每一者不同于其余的平均激发波长；
所述样品还包含第四染料、第五染料、第六染料、第七染料和第八染料；
所述系统还包括第三发射光谱元件、第四发射光谱元件、第五发射光谱元件和第六发射光谱元件，所述发射光谱元件各自被构造成传递来自所述样品的发射，所述第三发射元件、所述第四发射元件、所述第五发射元件和所述第六发射元件中的每一者的特征在于相应的第三平均发射波长、第四平均发射波长、第五平均发射波长和第六平均发射波长，其中所述波长源中的每个波长源的所述六个平均发射波长中的每一者不同于其余源的所述平均发射波长；
所述至少一个存储器包括用于以下的指令：
用所述第三辐射源、所述第四辐射源、所述第五辐射源和所述第六辐射源照射所述样品；
响应于用所述第三辐射源、所述第四辐射源、所述第五辐射源和所述第六辐射源中的每一者照射所述样品，使用所述发射光谱元件中的一个或多个发射光谱元件测量来自所述样品的发射。
6.根据权利要求5所述的系统，其中所述第二染料和所述第四染料是离轴染料。
7.根据权利要求5所述的系统，其中：
所述第二染料包括与所述第一染料的最大吸收波长相等或基本上相等的最大吸收波长；
所述第四染料包括与所述第一染料的最大吸收波长相等或基本上相等的最大吸收波长；
所述第二染料包括与所述第三染料的最大发射波长相等或基本上相等的最大发射波长；并且
所述第四染料包括与所述第五染料的最大发射波长相等或基本上相等的最大发射波长。
8.根据权利要求1所述的系统，其中所述发射光谱元件包括色散光学元件，所述色散光学元件被构造成沿第一光学路径和第二光学路径分散来自所述样品的发射，其中所述检测器包括第一检测器和第二检测器，所述第一检测器被构造成接收沿所述第一光学路径的发射，所述第二检测器被构造成接收沿所述第二光学路径的发射；任选地，其中所述第一检测器包括CCD检测器或CMOS检测器上的第一位置，并且所述第二检测器包括CCD检测器或CMOS检测器上的与所述第一位置在空间上分开的第二位置。
9.根据权利要求1所述的系统，包括确定靶分子中的一种或多种靶分子的量，包括响应于用来自所述第一辐射源和/或所述第二辐射源的辐射来照射所述样品而调整来自所述样品的所测量的发射中的一个或多个发射。
10.根据权利要求1所述的系统，其中所述第二染料是能量转移染料缀合物，所述能量转移染料缀合物包含：
供体染料，所述供体染料的特征在于与所述第一染料的所述最大吸收波长相等或基本上相等的最大吸收波长，所述供体染料被构造成吸收来自所述第一辐射源的辐射，并且作为响应，产生能量；和
受体染料，所述受体染料的特征在于与所述第三染料的所述最大发射波长相等或基本上相等的最大发射波长，其中所述染料被构造成将由所述供体产生的所述能量的至少一些能量转移至所述受体染料。
11.根据权利要求10所述的系统，其中所述第一染料的特征在于第一光谱特征，所述第三染料的特征在于第三光谱特征，所述供体染料的特征在于供体染料光谱特征，并且(1)所述供体染料光谱特征等于所述第三发射光谱特征，并且/或者(2)所述供体染料的最大发射波长等于所述第三染料的最大发射波长。
12.根据权利要求10所述的系统，其中所述供体染料具有发射波长带，并且所述受体染料具有不与所述供体染料发射波长带重叠的吸收波长带。
13.一种方法，包括：
提供样品，所述样品包含被构造成与第一靶分子、第二靶分子和第三靶分子结合的第一染料、第二染料和第三染料；
用特征在于第一平均激发波长的第一辐射源照射所述样品，并且作为响应，(1)使用检测器和特征在于第一平均发射波长的第一发射光谱元件测量来自所述样品的发射，以及(2)使用所述检测器和特征在于与所述第一平均发射波长不同的第二平均发射波长的第二发射光谱元件测量来自所述样品的发射；
用特征在于与所述第一平均激发波长不同的第二平均激发波长的第二辐射源照射所述样品，并且作为响应，使用所述检测器和所述第二发射光谱元件测量来自所述样品的发射。
14.根据权利要求13所述的方法，其中(1)所述第一染料包括第一吸收光谱，所述第一吸收光谱包括第一最大吸收波长，并且所述第二染料包括第二吸收光谱，所述第二吸收光谱包括与所述第一最大吸收波长相等或基本上相等的第二最大吸收波长；并且(2)所述第二染料包括第二发射光谱，所述第二发射光谱包括第二最大发射波长，并且所述第三染料包括第三发射光谱，所述第三发射光谱包括与所述第二最大发射波长相等或基本上相等的第三最大发射波长。
15.根据权利要求1所述的方法，包括执行PCR测定，所述PCR测定包括通过多个温度循环来循环溶液，以及在所述温度循环中的一个或多个温度循环之后测量至少一种染料的发射。
16.一种执行定量聚合酶链反应(qPCR)测定的方法，包括：
提供包含离轴染料和同轴染料的生物样品；
对所述样品执行qPCR测定；
在所述qPCR测定的第一循环期间，用两个或更多个激发通道执行所述样品的第一系列照射；
响应于所述第一系列照射中的每个照射，测量来自两个或更多个发射通道的相应第一系列发射信号；
在所述qPCR测定的第二循环期间，用所述两个或更多个激发通道执行所述样品的第二系列照射；
响应于所述第二系列照射中的每个照射，测量来自所述两个或更多个发射通道的相应第二系列发射信号；
基于来自所述第一系列测量中的至少一个测量来计算所述离轴染料的量；以及
基于来自所述第二系列测量中的至少一个测量来计算所述同轴染料的量。
17.一种执行定量聚合酶链反应(qPCR)测定的方法，包括：
提供包含离轴染料和同轴染料的生物样品；
对所述样品执行qPCR测定；
在所述qPCR测定的第一循环期间，用两个或更多个激发通道执行所述样品的第一系列照射；
响应于所述第一系列照射中的每个照射，测量来自两个或更多个发射通道的相应第一系列发射信号；
在所述qPCR测定的第二循环期间，用所述两个或更多个激发通道执行所述样品的第二系列照射；
响应于所述第二系列照射中的每个照射，测量来自所述两个或更多个发射通道的相应第二系列发射信号；
基于来自所述第一系列测量中的至少一个测量来计算所述同轴染料的量；以及
基于来自所述第二系列测量中的至少一个测量来计算所述离轴染料的量。
18.一种荧光能量转移染料缀合物，包含：
i.供体染料，所述供体染料能够吸收第一波长处的光并且发射激发能量作为响应；
ii.受体染料，所述受体染料能够吸收由所述供体染料发射的所述激发能量并且发射第二波长处的光作为响应；和
iii.接头，所述接头将所述供体染料共价连接至所述受体染料，其中所述接头包括以下项中的一者或多者：烷基部分、氨基-烷基部分、氧基-亚烷基部分、氨基-亚烷基-二烷氧基部分、亚烯基部分、亚炔基部分、聚醚部分、亚芳基部分、酰胺部分或磷酸二酯部分。
19.一种包含一组荧光标记的寡核苷酸探针的组合物，其中所述组包括：
i.第一探针，所述第一探针与第一荧光团共价连接，其中所述第一荧光团的特征在于第一吸收波长和第一发射波长；和
ii.第二探针，所述第二探针与根据权利要求18所述的能量转移染料缀合物共价连接。
20.一种寡核苷酸探针，包含：
i.寡核苷酸；和
ii.根据权利要求18所述的荧光能量转移染料缀合物，所述荧光能量转移染料缀合物与所述寡核苷酸共价连接。
21.一种系统，包括：
辐射源，所述辐射源的特征在于平均激发波长；
样品，所述样品被设置成接收来自所述辐射源的辐射，所述样品包含：
第一染料；
第二染料；和
检测器，所述检测器被构造成测量来自所述样品的发射；
第一发射光谱元件，所述第一发射光谱元件的特征在于第一平均发射波长；
第二发射光谱元件，所述第二发射光谱元件的特征在于与所述第一平均发射波长不同的第二平均发射波长；
至少一个处理器，所述至少一个处理器包括至少一个存储器，所述至少一个存储器包括用于以下的指令：
用所述辐射源照射所述样品，并且作为响应，(1)使用所述检测器和所述第一发射光谱元件测量来自所述样品的发射，以及(2)使用所述检测器和所述第二发射光谱元件测量来自所述样品的发射。
22.一种系统，包括：
第一辐射源，所述第一辐射源的特征在于第一平均激发波长；
第二辐射源，所述第二辐射源的特征在于与所述第一平均激发波长不同的第二平均激发波长；
样品，所述样品被设置成接收来自所述辐射源的辐射，所述样品包含：
第一染料；
第二染料；和
检测器，所述检测器被构造成测量来自所述样品的发射；
发射光谱元件，所述发射光谱元件的特征在于平均发射波长；
至少一个处理器，所述至少一个处理器包括至少一个存储器，所述至少一个存储器包括用于以下的指令：
用所述第一辐射源照射所述样品，并且作为响应，使用所述检测器和所述发射光谱元件测量来自所述样品的发射；
用所述第二辐射源照射所述样品，并且作为响应，使用所述检测器和所述发射光谱元件测量来自所述样品的发射。
23.一种系统，包括：
第一辐射源，所述第一辐射源的特征在于第一平均激发波长；
第二辐射源，所述第二辐射源的特征在于与所述第一平均激发波长不同的第二平均激发波长；
样品，所述样品被设置成接收来自所述辐射源的辐射，所述样品包含：
第一染料；
第二染料；和
第三染料；
检测器，所述检测器被构造成测量来自所述样品的发射；
第一发射光谱元件，所述第一发射光谱元件的特征在于第一平均发射波长；
第二发射光谱元件，所述第二发射光谱元件的特征在于与所述第一平均发射波长不同的第二平均发射波长；
至少一个处理器，所述至少一个处理器包括至少一个存储器，所述至少一个存储器包括用于以下的指令：
用所述第一辐射源照射所述样品，并且作为响应，(1)使用所述检测器和所述第一发射光谱元件测量来自所述样品的发射，以及(2)使用所述检测器和所述第二发射光谱元件测量来自所述样品的发射；
用所述第二辐射源照射所述样品，并且作为响应，使用所述检测器和所述第二发射光谱元件测量来自所述样品的发射。
24.一种方法，包括：
提供包含第一染料和第二染料的样品；
用辐射源照射所述样品，并且作为响应，使用检测器和特征在于第一平均发射波长的第一发射光谱元件测量来自所述样品的发射，以及使用所述检测器和特征在于与所述第一平均发射波长不同的第二平均发射波长的第二发射光谱元件测量来自所述样品的发射。
25.一种方法，包括：
提供包含第一染料和第二染料的样品；
对所述样品执行扩增测定；
用特征在于第一平均激发波长的第一辐射源照射所述样品，并且作为响应，使用检测器和特征在于第一平均发射波长的第一发射光谱元件测量来自所述样品的发射；以及
用特征在于与所述第一平均激发波长不同的第二平均激发波长的第二辐射源照射所述样品，并且作为响应，使用所述检测器和所述第二发射光谱元件测量来自所述样品的发射。
26.一种执行定量聚合酶链反应(qPCR)测定的方法，包括：
提供包含离轴染料和同轴染料的生物样品；
对所述样品执行qPCR测定；
在所述qPCR测定的第一循环期间，用两个或更多个激发通道执行所述样品的第一系列照射；
响应于所述第一系列照射中的每个照射，测量来自两个或更多个发射通道的相应第一系列发射信号；
在所述qPCR测定的第二循环期间，用所述两个或更多个激发通道执行所述样品的第二系列照射；
响应于所述第二系列照射中的每个照射，测量来自所述两个或更多个发射通道的相应第二系列发射信号；
基于来自所述第一系列测量中的至少一个测量来计算所述离轴染料的量；以及
基于来自所述第二系列测量中的至少一个测量来计算所述同轴染料的量。
27.一种执行定量聚合酶链反应(qPCR)测定的方法，包括：
提供包含离轴染料和同轴染料的生物样品；
对所述样品执行qPCR测定；
在所述qPCR测定的第一循环期间，用两个或更多个激发通道执行所述样品的第一系列照射；
响应于所述第一系列照射中的每个照射，测量来自两个或更多个发射通道的相应第一系列发射信号；
在所述qPCR测定的第二循环期间，用所述两个或更多个激发通道执行所述样品的第二系列照射；
响应于所述第二系列照射中的每个照射，测量来自所述两个或更多个发射通道的相应第二系列发射信号；
基于来自所述第一系列测量中的至少一个测量来计算所述同轴染料的量；以及
基于来自所述第二系列测量中的至少一个测量来计算所述离轴染料的量。
28.一种包含一组荧光标记的寡核苷酸探针的组合物，其中所述组包括：
i.第一寡核苷酸探针，所述第一寡核苷酸探针与第一荧光团共价连接，其中所述第一荧光团的特征在于第一吸收波长和第一发射波长；和
ii.第二寡核苷酸探针，所述第二寡核苷酸探针与根据权利要求18所述的能量转移染料缀合物共价连接，其中
a)所述供体染料的特征在于第二吸收波长并且发射激发能量作为响应，并且
b)所述受体染料能够吸收由所述供体染料发射的所述激发能量，并且作为响应，发射特征在于第二发射波长的辐射；
其中所述第一吸收波长和所述第二吸收波长在彼此的20纳米内，并且
其中所述第一发射波长和所述第二发射波长相差大于50纳米。
29.一种通过聚合酶链反应(PCR)检测或定量样品中的靶核酸分子的方法，所述方法包括：
(i)使包含一种或多种靶核酸分子的所述样品与a)根据权利要求20所述的至少一种寡核苷酸探针接触，所述寡核苷酸探针具有与所述靶核酸分子至少部分互补的序列，其中所述至少一种探针在扩增所述一种或多种靶核酸分子时经历可检测的荧光变化；
以及与b)至少一种寡核苷酸引物对接触；
(ii)在足以扩增所述一种或多种靶核酸分子的条件下将步骤(i)的混合物与DNA聚合酶一起孵育；以及
(iii)通过测量所述探针的荧光来检测所扩增的靶核酸分子的存在或不存在，或者定量所扩增的靶核酸分子的量。
30.一种用于聚合酶链反应(PCR)的试剂盒，所述试剂盒包括：
i.一种或多种缓冲剂和核酸合成酶；和
ii.根据权利要求20所述的寡核苷酸探针；和
iii.用于执行PCR测定的说明书。
31.一种组合物，包含：
a)第一标记寡核苷酸，所述第一标记寡核苷酸包括根据权利要求18所述的能量转移染料缀合物；和
b)聚合酶。
32.一种组合物，包含：
a)根据权利要求18所述的荧光能量转移染料缀合物；
b)分析物或酶。
33.一种检测或定量样品中的靶核酸分子的方法：
(i)使包含一种或多种靶核酸分子的所述样品与a)根据权利要求20所述的至少一种寡核苷酸探针接触，所述探针具有与所述靶核酸分子至少部分互补的序列；以及
(ii)通过测量所述探针的荧光来检测所述靶核酸分子的存在或不存在，或者定量所述靶核酸分子的量。
34.一种用于检测样品中的生物分子的试剂盒，所述试剂盒包括：
i.根据权利要求20所述的寡核苷酸探针；和
iii.用于执行检测所述生物分子的测定的说明书。
35.根据权利要求1所述的系统，还包括校准板，所述校准板被构造成减少所述染料中的两种或更多种染料之间的串扰。
36.根据权利要求35所述的系统，其中所述校准板包括四种校准同轴染料和两种校准离轴染料，或者两种校准同轴染料和四种校准离轴染料。
37.一种方法，包括：
提供用于执行根据权利要求13所述的方法的系统；
使用校准板来校准系统，所述校准板被构造成减少所述染料中的两种或更多种染料之间的串扰。
38.一种包括校准板的系统，所述校准板被构造成减少两种或更多种染料之间的串扰，其中所述校准板包括：
四种校准同轴染料和两种校准离轴染料；或者
两种校准同轴染料和四种校准离轴染料。
39.一种方法，包括：
提供用于执行根据权利要求13所述的方法的系统；
使用校准板来校准系统，所述校准板被构造成减少所述染料中的两种或更多种染料之间的串扰。
40.一种执行扩增测定的方法，包括：
提供生物样品，所述生物样品包含多种靶分子、一种或多种离轴染料和一种或多种同轴染料，所述一种或多种离轴染料被构造成与所述多种靶分子中的相应一种或多种靶分子结合，所述一种或多种同轴染料被构造成与所述多种靶分子中的相应一种或多种靶分子结合；
对所述样品执行至少一个扩增循环；
在所述至少一个扩增循环期间或之后，用两个或更多个激发通道照射所述样品；
响应于所述照射中的每个照射，测量来自两个或更多个发射通道的发射信号；
基于所述发射信号来计算所述同轴染料和所述离轴染料的量。
41.一种方法，包括：
提供用于执行根据权利要求13所述的方法的系统；
使用校准板来校准系统，所述校准板被构造成减少所述染料中的两种或更多种染料之间的串扰。
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