CN116121281A - 经遗传修饰的细胞及其用途 - Google Patents

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A.特朗森
H.川本
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Abstract

本发明一般涉及干细胞(例如iPSC或HSC)群体，其包含编码T细胞受体和针对多个独特抗原决定簇，例如两种独特的肿瘤抗原决定簇的嵌合抗原受体的核酸。本发明还涉及共表达T细胞受体和针对多种独特抗原决定簇，如两种独特的肿瘤抗原决定簇的嵌合抗原受体的T细胞群体。本发明的细胞可以源自HLA类型与群体的重要部分相容的选择的供体，并且可用于多种应用，特别是在治疗性处理新生物状况(neoplastic condition)的背景下。

Description

经遗传修饰的细胞及其用途
本申请是基于申请日为2016年11月23日，优先权日为2015年11月27日，申请号为201680069543.6，发明名称为：“经遗传修饰的细胞及其用途”的专利申请的分案申请。
本申请要求2015年11月27日提交的澳大利亚临时专利申请No.2015904933以及2016年4月11日提交的No.2016901328的优先权的权益，其通过引用完整并入本文。
发明领域
本发明一般涉及干细胞(例如iPSC或HSC)群体，其包含编码T细胞受体和针对多种独特抗原决定簇，例如两种独特的肿瘤抗原决定簇的嵌合抗原受体的核酸。本发明还涉及T细胞群体，其共表达T细胞受体和针对多种独特抗原决定簇，如两种独特的肿瘤抗原决定簇的嵌合抗原受体。本发明的细胞可以衍生自选择的供体，其HLA类型与群体的重要部分相容，并且可用于多种应用，特别是在治疗性处理新生物状况(neoplastic condition)的情况下。
发明背景
本说明书中由作者引用的出版物的书目细节在说明书结尾处按字母顺序收集。
在本说明书中对任何在先出版物(或从其得到的信息)或对已知的任何事物的引用不视为并且不应视为认可或承认或任何形式暗示所述现有出版物(或从其得到的信息)或已知事物形成本说明书涉及的领域中的公知常识的一部分。
恶性肿瘤或癌症以不受控制的方式生长，侵入正常组织，并且经常在远离起源组织的部位处转移和生长。一般地，癌症衍生自一个或仅几个正常细胞，所述细胞已经经历了称为恶性转化的不甚了解的过程。癌症可以源自来自身体的几乎任何组织。来自上皮细胞的那些，称为癌瘤，是最常见的癌症种类。肉瘤是源自诸如成纤维细胞、肌细胞和脂肪细胞等细胞的间充质组织的恶性肿瘤。淋巴样组织的实体恶性肿瘤称为淋巴瘤，淋巴细胞和其它造血细胞的骨髓和血源性恶性肿瘤称为白血病。
癌症是工业化国家三大死亡原因之一。随着传染病治疗和心血管疾病预防不断改善以及平均预期寿命增加，癌症可能成为这些国家最常见的致命疾病。因此，成功治疗癌症需要在不杀死患者的情况下将所有恶性细胞移除或破坏。实现这点的理想方法是诱导针对肿瘤的免疫应答，该免疫应答可区分肿瘤细胞与其正常细胞对应物。然而，一个多世纪以来，尝试了治疗癌症的免疫学方法，具有不可持续的结果。
实体瘤导致最大的来自癌症的死亡数目。一旦实体瘤在全身扩散或“转移”后，它们通常不能治愈。近50年来转移性实体瘤的预后仅轻微改善。治愈实体肿瘤的最佳机会依赖于早期检测，随后在实体瘤局部化并且尚未扩散至对肿瘤或其它地方引流的淋巴结时使用局部治疗如手术和/或放疗。尽管如此，即使在此早期阶段，特别是若肿瘤已经扩散到引流淋巴结，则称为微转移的癌症的微观沉积物可能已经遍布整个身体并且随后将导致患者死亡。在此意义上，癌症是一种需要系统性施用的治疗的系统性疾病。
利用加载有毒素的抗体攻击癌症的“金子弹(Golden Bullet)”尝试历史悠久，利用它们潜在靶向任何特定分子实体如碳水化合物、脂质或蛋白质或其组合的能力。一旦与癌细胞结合，抗体可以与补体或FcR+NK/K细胞结合并诱导细胞溶解。不幸的是，癌症的抗体治疗通常仅获得中等的成功，主要是因为低亲和力结合、差的裂解效率和其短暂的寿命。这些共同损害了抗体快速破坏癌细胞的能力，增加了突变和免疫逃避的风险。最近，已经报道了抗体相关疗法，包括基于以高亲和力针对癌症分子和免疫检查点阻断分子的抗体。尽管特别在后者的情况下获得一些临床成功，但是此类疗法仍然与各种局限性有关。
因此，治疗癌症的常用方法继续遵循手术切除的长期使用程序(若可能的话)，继之以放射疗法和/或化学疗法(若必要的话)。此相当原始的治疗形式的成功率极其可变，但是通常随着肿瘤变得更为晚期并且转移而显著降低。此外，这些治疗与严重的副作用相关，所述副作用包括来自手术(例如乳房切除术或肢体截肢术)的毁容和疤痕、来自化学疗法的严重恶心和呕吐、以及最重要地对正常组织如毛囊、肠和骨髓的损害，其是由于构成大多数癌症治疗的部分的毒性药物的相对非特异性靶向机制而诱导的。
因此，迫切和持续需要开发用于癌症，特别是转移性癌症的改善的系统性治疗。
主流T细胞的胸腺生成对于感染防御是根本上需要的。“免疫监视”T细胞的此合并物巡逻身体以除去受损或异常的细胞，包括癌症。由于基于胸腺的T细胞产生以T细胞受体(TCR)全集的随机生成为特征，胸腺生成(thymopoiesis)还必须包括非常严格的选择过程，其消除或功能性沉默那些具有攻击自身的潜力的发育中的胸腺T细胞。因此，此种“自身耐受”限制了自身免疫性疾病(Fletcher等(2011))。然而，就是此过程必然损害针对癌症的免疫监视：鉴于非病毒诱导的癌症定义为“自身”的疾病。这意味着在进入血液之前可以消除胸腺中产生的许多T细胞，其潜在可能与肿瘤相关抗原是反应性的。至少它们在数字上是缺陷的，并且可能具有低亲和力的TCR。尽管如此，T细胞显然潜在是针对癌症的主要武器-因此挑战是提高它们检测癌症的能力，在数字上扩充它们，或者更好地增强其有力的细胞溶解能力。虽然抗体和T细胞是针对癌症的最合乎逻辑的武器，但是其潜在的快速和有效的癌症破坏尚未在临床上实现。免疫疗法的进展已经通过基因工程化改造T细胞以表达新型嵌合膜受体而演化，所述嵌合膜受体由癌抗原结合抗体片段以及与其在胞质偶联的T细胞信号转导分子组成。后者通常是TCRζ链、CD28或CD40配体中的一种或全部(Corrigan-Curay等(2014)；Fedorov等(2014)；Perna等(2014)；Curran等(2015)；Curran等(2012)；Dotti等(2014)；Han等(2013))。此类嵌合抗原受体(CAR)表达T细胞(CAR-T)不仅可以利用免疫系统的两种最有力的抗癌武器，而且还可以克服其单独的不足。CAR-T保留有力的、局部的细胞溶解能力，并且避免对内在TCR检测在HLA裂缝中表达的非常罕见的“癌症肽”的正常依赖性。对此类名义肽特异性的T细胞全集是非常罕见的。CAR的抗体部分赋予T细胞以癌症寻找特异性，并且克服循环抗体的差得公知的癌症破坏性功效。因此，癌症结合由CAR的抗体域介导，导致胞质信号转导，触发T细胞溶解途径来破坏癌症。
虽然仍处于临床初期阶段，但许多CAR-T试验正在进行中。尽管有希望，但是CAR-T技术的几个方面存在问题，并且正在阻碍其临床效力得到充分实现。最明显的是在T细胞介导的癌症破坏过程中发生，并且是肿瘤负荷依赖性的细胞因子风暴。发热指示癌症破坏，但是除非注意管理，否则可以导致严重的临床副作用(Davila等(2014)；Casucci等(2015))。目前的管理是通过细胞因子调节治疗，如抗IL6。此外，存在生成的CAR-T细胞的数目不足的相当大的问题，所述CAR-T细胞不仅攻击最初的癌症，而且还在复发的情况下在充足的供应中得到保留。目前，处理此问题的尝试是基于体外增殖诱导细胞因子的过度使用。更进一步，对于与CAR-T细胞一样有效地攻击癌症，即使对于CD19+癌症，肿瘤破坏也不是100％有效的。尽管已经对B-ALL报告了高达90％的响应性，但是在其它CD19+癌症中，结果的有效性少得多。因此，尽管与CAR-T效用相关的令人鼓舞的观察结果，但是在此项技术可以作为癌症治疗相关的可靠、有效且新的黄金标准而取而代之之前，仍有要克服的许多重大问题。
在导致本发明的工作中，已经尤其确定了目前就CAR-T技术的有效治疗应用而言存在的看起来不同的问题是可解决的，其中CAR-T细胞可以衍生自转染的干细胞如成体干细胞，而不是经转染的胸腺细胞或其它经转染的体细胞类型。例如，通过用嵌合抗原受体转染干细胞(诸如衍生自成体细胞的诱导性多能干细胞(“iPSC”))，提供针对特定肿瘤的CAR-T细胞的足够的现在和将来供应的问题由于体细胞T细胞的持续来源而解决，所述体细胞T细胞衍生自这些自身更新的经转染的干细胞。此外，这些iPSC以及因此自它们衍生的CAR-T细胞可以事先从表达纯合HLA单元型的供体，特别是在群体中广泛表达的HLA类型纯合的供体选择，由此提供产生表现出广泛的供体合适性的细胞库的手段。更进一步，已经确定了从表现针对感兴趣抗原的T细胞受体特异性的T细胞产生iPSC意味着针对癌症抗原特异性的TCR的基因重排将嵌入iPSC中。从所述iPSC诱导的所有T细胞将保留抗癌TCR特异性。这可以继之以用CAR转染此类iPSC，使得所述iPSC随后能够分化成T细胞，如CD4+或CD8+T细胞，其稳定表现出对CAR针对的抗原和TCR针对性抗原(初始T细胞针对的)的双重特异性。在不将本发明限制于任何一种理论或作用模式的情况下，认为这是由于外遗传记忆(epigeneticmemory)的作用。此外，还已经确定可以类似地产生双特异性NKT细胞。因此，可以提供T和NKT细胞的持续来源，所述T和NKT细胞选择性和稳定针对多个独特的抗原决定簇，如多个独特的肿瘤抗原决定簇，由此能够实现更加治疗有效的治疗步骤。
发明概述
在整个说明书和所附的权利要求书中，除非背景另有要求，词语“包括”以及诸如“包含”等变型将理解为暗示包含叙述的整数或步骤或整数或步骤的组，但不排除任何其它整数或步骤或整数或步骤的组。
如本文所用，术语“衍生自”应当理解指特定整数或整数组源自规定的物种，但不一定直接从规定来源获得。此外，如本文所用，除非背景另外明确指出，单数形式的“一个”，“一种”和“该/所述”包括复数指代物。
本说明书包含使用程序PatentIn Version 3.5制作的氨基酸序列信息，其在本文中在参考书目之后呈现。每个氨基酸序列在序列表中通过数字指示符<210>，随后是序列标识符(例如<210>1、210>2等)标识。每个氨基酸序列的长度、序列类型(蛋白质等)和来源生物体分别由数字指示符字段<211>、<212>和<213>中提供的信息指示。说明书中提及的氨基酸序列通过指示符SEQ ID NO:，随后是序列标识符(例如SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2等)标识。说明书中提及的序列标识符与序列表中的数字指示符字段<400>，随后是序列标识符(例如，<400>1，<400>2等)中提供的信息相关。如说明书中详述，SEQ ID NO:1与序列表中以<400>1所示的序列相关。
除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。
本发明的一个方面涉及经遗传修饰的哺乳动物干细胞或从其分化的T细胞，所述细胞能够分化成表达针对第一抗原决定簇的TCR的T细胞，并且包含编码嵌合抗原受体的核酸分子，其中所述受体包含针对第二抗原决定簇的抗原识别部分，该抗原识别部分可操作连接至T细胞活化部分。在一些实施方案中，经遗传修饰的哺乳动物干细胞表达至少一种纯合HLA单元型。
另一方面，提供了经遗传修饰的哺乳动物干细胞或从其分化的T细胞，所述细胞能够分化成表达针对第一抗原决定簇的TCR的CD4+T细胞，并且包含编码嵌合抗原受体的核酸分子，其中所述受体包含针对第二抗原决定簇的抗原识别部分，该抗原识别部分可操作连接至T细胞活化部分。在一些实施方案中，经遗传修饰的哺乳动物干细胞表达至少一种纯合HLA单元型。
又一方面，提供了遗传经修饰的哺乳动物干细胞或从其分化的T细胞，所述细胞能够分化成表达针对第一抗原决定簇的TCR的CD8+T细胞，并且包含编码嵌合抗原受体的核酸分子，其中所述受体包含针对第二抗原决定簇的抗原识别部分，该抗原识别部分可操作连接至T细胞活化部分。在一些实施方案中，经遗传修饰的哺乳动物干细胞表达至少一种纯合HLA单元型。
在另一方面，提供了经遗传修饰的哺乳动物干细胞或从其分化的T细胞，所述细胞是iPSC(诱导性多能干细胞)或HSC(造血干细胞)，能够分化成表达针对第一抗原决定簇的TCR的T细胞，并且包含编码嵌合抗原受体的核酸分子，其中所述受体包含针对第二抗原决定簇的抗原识别部分，该抗原识别部分可操作连接至T细胞活化部分。在一些实施方案中，经遗传修饰的干细胞如iPSC或HSC表达至少一种纯合HLA单元型。
根据本发明的此方面，在一个实施方案中，干细胞(例如iPSC)衍生自其中TCR基因已经经历重排的细胞。
在另一个实施方案中，所述干细胞(例如，iPSC)衍生自表达αβTCR的T细胞或胸腺细胞。
在又一个实施方案中，所述干细胞(例如iPSC)衍生自表达γδTCR的T细胞或胸腺细胞。
在又一个实施方案中，所述干细胞(例如iPSC)衍生自T细胞或胸腺细胞，所述T细胞或胸腺细胞表达针对所述第一抗原决定簇的TCR，即与衍生自所述干细胞(例如，iPSC)的T细胞上表达的TCR针对的抗原决定簇相同的抗原决定簇。
在又一个实施方案中，所述干细胞(例如，iPSC)衍生自CD8+的T细胞或胸腺细胞。
在又一个实施方案中，所述干细胞(例如iPSC)衍生自CD4+T细胞或胸腺细胞。
在一个实施方案中，干细胞(例如iPSC或HSC)能够分化成表达针对第一抗原决定簇的TCR的CD4+T细胞。在另一个实施方案中，干细胞(例如iPSC或HSC)能够分化成表达针对第一抗原决定簇的TCR的CD8+T细胞。
在又一方面，提供了经遗传修饰的哺乳动物干细胞或从其分化的T细胞，所述细胞能够分化成表达针对第一抗原决定簇的TCR的T细胞，并且包含编码嵌合抗原受体的核酸分子，其中所述受体包含针对第二抗原决定簇的抗原识别部分，所述抗原识别部分可操作连接至T细胞活化部分，并且其中所述抗原决定簇选自肿瘤抗原、微生物抗原或自体反应性免疫细胞抗原。在一些实施方案中，经遗传修饰的哺乳动物干细胞表达至少一种纯合HLA单元型。
在一个实施方案中，所述干细胞是iPSC。在另一个实施方案中，干细胞是HSC。
在另一个实施方案中，所述干细胞能够分化成CD4+T细胞或CD8+T细胞。
在又一个实施方案中，所述TCR是αβTCR。
在又一个实施方案中，所述干细胞(例如iPSC)衍生自T细胞或胸腺细胞，优选CD8+T细胞或胸腺细胞。在一些实施方案中，所述干细胞(例如iPSC)衍生自CD8+T细胞或胸腺细胞，所述CD8+T细胞或胸腺细胞表达针对所述第一抗原决定簇的TCR，即与衍生自所述干细胞(例如，iPSC)的T细胞上表达的TCR针对的相同抗原决定簇。
在又一个方面，提供了经遗传修饰的哺乳动物干细胞或从其分化的T细胞，所述细胞能够分化成表达针对第一肿瘤抗原决定簇的TCR的T细胞，并且包含编码嵌合抗原受体的核酸分子，其中所述受体包含针对第二肿瘤抗原决定簇的抗原识别部分，该抗原识别部分可操作连接至T细胞活化部分，并且其中所述第一抗原决定簇选自TCR识别的肽，如WT-1或EbvLMP2，并且所述第二抗原决定簇选自例如TAG-72、CD19、MAGE、或CD47。在一些实施方案中，经遗传修饰的哺乳动物干细胞表达至少一种纯合HLA单元型。
本文公开的经遗传修饰的哺乳动物干细胞(例如，iPSC或HSC)能够分化成表达针对第一抗原决定簇(例如，第一肿瘤抗原决定簇)的TCR的T细胞，并且包含可操作连接至T细胞活化部分的编码嵌合抗原受体的核酸分子，所述嵌合抗原受体包含针对第二抗原决定簇(例如第二肿瘤抗原决定簇)的抗原识别部分。也就是说，本文公开的经遗传修饰的干细胞(例如iPSC或HSC)能够分化成针对多个，即至少两个(即两个或更多个)抗原决定簇的T细胞。在一些实施方案中，经遗传修饰的哺乳动物干细胞表达至少一种纯合HLA单元型。
因此，另一方面，提供了能够分化成针对超过两种抗原决定簇的T细胞的经遗传修饰的哺乳动物干细胞。
根据本发明的此方面，在一些实施方案中，经遗传修饰的哺乳动物干细胞(例如iPSC或HSC)能够分化成表达针对第一抗原决定簇的TCR的T细胞，并且包含编码多种嵌合抗原受体的多个(即两个或更多个)核酸分子，其中每个嵌合抗原受体包含针对抗原决定簇的抗原识别部分，该抗原识别部分可操作连接至T细胞活化部分。在一些实施方案中，经遗传修饰的哺乳动物干细胞表达至少一种纯合HLA单元型。
在一个实施方案中，多种嵌合抗原受体针对的多种抗原决定簇各自不同于在自所述干细胞衍生的T细胞上表达的TCR针对的所述第一抗原决定簇。在另一个实施方案中，多种嵌合抗原受体所针对的多种抗原决定簇彼此不同，并且也是不同于自所述干细胞衍生的T细胞上表达的TCR针对的所述第一抗原决定簇。
在一个实施方案中，多个CAR编码核酸包含在一个连续的核酸片段中。例如，将多个CAR编码核酸置于转染入细胞中的一个构建体或载体中以产生包含多个CAR编码核酸的经遗传修饰的哺乳动物干细胞。在一个具体的实施方案中，多个CAR编码核酸可以在一个表达单元和阅读框内彼此连接(例如，通过利用自切割肽如P2A)，使得最初产生包含多个CAR多肽序列的一个单一多肽并随后加工产生多种CAR。在另一个实施方案中，将多个CAR编码核酸置于分开的载体中，所述载体用于转染以产生包含多个CAR编码核酸的经遗传修饰的哺乳动物干细胞。CAR编码核酸构建体的实例描绘于图11中，并且适合用于CAR的CAR和各种域的示例性序列提供于SEQ ID NO:1-2和7-20中。
进一步根据本发明的一方面，提供能够分化为针对超过两种抗原决定簇的T细胞的经遗传修饰的哺乳动物干细胞，在其它实施方案中，经遗传修饰的哺乳动物干细胞(例如iPSC或HSC)(其任选表达至少一种纯合HLA单元型)能够分化成表达针对第一抗原决定簇的TCR的T细胞，其包含可操作连接至T细胞活化部分的编码嵌合抗原受体的核酸分子，该嵌合抗原受体包含针对第二抗原决定簇，并且所述T细胞还包含编码抗原结合受体的核酸分子，所述抗原结合受体包含针对第三抗原决定簇的抗原识别部分。根据这些实施方案，此类经遗传修饰的干细胞能够分化成针对多种抗原决定簇的T细胞，优选多个彼此不同的抗原决定簇。可以通过使用如本文所述的多个CAR编码核酸，和/或利用编码抗原结合受体的多个核酸来提供另外的抗原特异性。
在一个实施方案中，抗原结合受体是非信号传导抗原结合受体；即受体锚定到细胞表面并与第三抗原决定簇结合，但不将信号转导到细胞的胞质部分中。在一个实施方案中，抗原结合受体包含与跨膜域可操作连接的针对第三抗原决定簇的抗原识别部分，但是缺乏T细胞活化部分。
在具体的实施方案中，抗原结合受体是针对CD47的非信号传导抗原结合受体。例如，抗原结合受体是非信号传导CD47结合分子，例如截短的CD47结合分子。
因此，提供了经遗传修饰的哺乳动物干细胞(例如iPSC或HSC)或从其分化的T细胞，所述细胞能够分化成表达针对第一抗原决定簇的TCR的T细胞，包含(i)编码嵌合抗原受体的核酸分子，其中所述受体包含针对第二抗原决定簇的抗原识别部分，该抗原识别部分可操作连接至T细胞活化部分，和(ii)编码非信号传导CD47结合分子，例如截短的CD47结合分子的核酸分子。在一些实施方案中，经遗传修饰的哺乳动物干细胞(例如iPSC或HSC)表达至少一种纯合的HLA单元型。
另一方面，提供了生成本文公开的经遗传修饰的哺乳动物干细胞(如iPSC或HSC)的方法。
在一个实施方案中，主题方法包括获得能够分化成表达针对第一抗原决定簇的TCR的T细胞的哺乳动物干细胞(例如iPSC或HSC)，所述干细胞(例如iPSC或HSC)在一个实施方案中表达至少一种纯合HLA单元型；并对干细胞(例如通过转染)导入编码一种或多种嵌合抗原受体的一种或多种核酸分子，每种嵌合抗原受体包含针对抗原决定簇的抗原识别部分，该抗原识别部分可操作连接至T细胞活化部分。在另一个实施方案中，该方法进一步包括对干细胞(例如通过转染)导入编码一种或多种抗原结合受体(例如非信号传导抗原结合受体)的一种或多种核酸分子，每种抗原结合受体包含针对抗原决定簇的抗原识别部分。如本文进一步公开，多个受体编码核酸可以通过单一载体或分开的载体导入。
在另一个实施方案中，主题方法包括获得T细胞或胸腺细胞(优选CD8+T细胞或胸腺细胞)，其表达针对第一抗原决定簇的TCR，并且在一个实施方案中还表达至少一种纯合HLA单元型；对T细胞或胸腺细胞导入编码一种或多种嵌合抗原受体的一种或多种核酸分子，每种嵌合抗原受体包含针对抗原决定簇的抗原识别部分，该抗原识别部分可操作连接至T细胞活化部分；并从T细胞或胸腺细胞衍生干细胞(例如，iPSC)。在另一个实施方案中，所述方法进一步包括在从T细胞或胸腺细胞衍生干细胞的步骤之前，对T细胞或胸腺细胞导入编码一种或多种抗原结合受体的一种或多种核酸分子(例如，非信号传导抗原结合受体)，每种抗原结合受体包含针对抗原决定簇的抗原识别部分。
在另一个实施方案中，所述方法包括获得HSC(例如来自骨髓或血液)，其在一些实施方案中表达至少一种纯合HLA单元型；对HSC导入(i)编码针对第一抗原决定簇的TCR的一种或多种核酸，(ii)编码一种或多种嵌合抗原受体的一种或多种核酸分子，每种嵌合抗原受体包含针对与所述第一抗原决定簇不同的抗原决定簇的抗原识别部分，所述抗原决定簇可操作连接至T细胞活化部分；以及任选地(iii)编码一种或多种抗原结合受体(例如非信号传导抗原结合受体)的一种或多种核酸分子，每种抗原结合受体包含针对抗原决定簇的抗原识别部分，所述抗原决定簇不同于所述第一抗原决定簇以及不同于嵌合抗原受体所针对的抗原决定簇不同。如本文所公开，可以通过单一载体或分开的载体导入多个受体编码核酸。此类经遗传修饰的HSC可用于产生对多种抗原决定簇具有特异性的T细胞。
另一方面，提供了表达针对第一抗原决定簇的TCR并表达一种或多种嵌合抗原受体的T细胞，其中每种受体包含针对抗原决定簇的抗原识别部分，该抗原识别部分可操作连接至T细胞活化部分。在一些实施方案中，T细胞还表达包含针对抗原决定簇的抗原识别部分的抗原结合受体。在一些实施方案中，其中提供的T细胞表达至少一种纯合HLA单元型。
另一方面，提供了生成表达针对第一抗原决定簇的TCR并表达一种或多种CAR的T细胞的方法，其中每个CAR包含针对抗原决定簇的抗原识别部分，该抗原识别部分可操作连接至T细胞活化部分，并且任选还表达一种或多种非信号传导抗原结合受体，每种非信号传导抗原结合受体包含针对抗原决定簇的抗原识别部分。在一些实施方案中，本文提供的方法涉及生成表达至少一种纯合HLA单元型的T细胞。
本发明的另一方面涉及治疗哺乳动物中以不想要的细胞群体存在为特征的状况的方法，所述方法包括对所述哺乳动物施用有效数目的干细胞或T细胞，如上文所述。
在一个实施方案中，所述状况是新生物状况、微生物感染(如HIV、STD或抗生素抗性细菌)或自身免疫病症。
根据此实施方案，提供了治疗新生物状况的方法，所述方法包括对所述哺乳动物施用有效数目的如上文所定义的干细胞或T细胞，其中所述TCR针对第一肿瘤抗原性，而所述CAR针对第二种肿瘤抗原决定簇。
在又一个实施方案中，所述第一肿瘤抗原决定簇是WT-1。
在另一个实施方案中，所述第二肿瘤抗原决定簇是TAG-72、CD19、MAGE、或CD47。
本发明的另一方面涉及如上文所定义的干细胞或T细胞在制备用于治疗以在哺乳动物中以不想要的细胞群体存在为特征的状况的药物的用途。
本发明包括以下内容：
实施方案1.经遗传修饰的哺乳动物干细胞，其中所述细胞能够分化成表达针对第一抗原决定簇的T细胞受体(TCR)的T细胞，并且包含编码嵌合抗原受体的核酸分子，所述嵌合抗原受体包含抗原识别部分和T细胞活化部分，其中所述抗原识别部分针对第二抗原决定簇并且可操作连接至所述T细胞活化部分。
实施方案2.经遗传修饰的干细胞，其中所述细胞表达至少一种纯合HLA单元型。
实施方案3.实施方案1或2的细胞，其中所述干细胞是诱导性多能干细胞(iPSC)或造血干细胞(HSC)。
实施方案4.实施方案3的细胞，其中所述iPSC或HSC能够分化成CD4+T细胞或CD8+T细胞。
实施方案5.实施方案3的细胞，其中所述T细胞表达αβTCR或γδTCR。
实施方案6.实施方案4的细胞，其中所述iPSC衍生自T细胞或胸腺细胞。
实施方案7.实施方案6的细胞，其中衍生所述iPSC的T细胞或胸腺细胞是CD8+或CD4+。
实施方案8.实施方案6或7的细胞，其中衍生所述iPSC的T细胞或胸腺细胞表达针对所述第一抗原决定簇的TCR。
实施方案9.实施方案8的细胞，其中在衍生所述iPSC的T细胞或胸腺细胞上表达的TCR是αβTCR或γδTCR。
实施方案10.实施方案1的细胞，其中所述第一和第二抗原决定簇选自下组：肿瘤抗原、微生物抗原或自体反应性免疫细胞抗原。
实施方案11.实施方案10的细胞，其中所述第一抗原决定簇选自肿瘤抗原，例如WT-1。
实施方案12.实施方案10或11的细胞，其中所述第二抗原决定簇选自肿瘤抗原，例如TAG 72、CD19、MAGE和CD47。
实施方案13.根据前述实施方案中任一项的细胞，其中所述抗原识别部分包含scFv。
实施方案14.根据前述实施方案中任一项的细胞，其中所述抗原识别部分通过铰链区和跨膜域与所述T细胞活化部分连接。
实施方案15.实施方案14的细胞，其中所述铰链区衍生自IgG1的铰链区、CD8的铰链区或CD28的铰链区。
实施方案16.实施方案14的细胞，其中所述铰链区包含促进所述嵌合抗原受体二聚化的半胱氨酸。
实施方案17.实施方案14的细胞，其中所述跨膜域衍生自所述T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、或免疫球蛋白如IgG4的跨膜域。
实施方案18.根据前述实施方案中任一项的细胞，其中所述T细胞活化部分包含选自下组的分子的胞内信号传导序列：TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、和CD66d。
实施方案19.实施方案18的细胞，其中所述T细胞活化部分还包含选自下组的共刺激分子的胞内信号传导序列：CD27、CD28、4-lBB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、TIM-3、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、和与CD83特异性结合的配体。
实施方案20.根据前述实施方案中任一项的细胞，其还包含编码另外的嵌合抗原受体的另外的核酸，所述另外的嵌合抗原受体包含抗原识别部分和T细胞活化部分，其中所述另外的嵌合抗原受体的所述抗原识别部分针对与所述第一和第二抗原决定簇不同的另外的抗原决定簇。
实施方案21.根据前述实施方案中任一项的细胞，其还包含编码包含抗原识别部分的非信号传导抗原结合受体的核酸，所述抗原识别部分针对与所述第一抗原决定簇和嵌合抗原受体针对的所述抗原决定簇不同的抗原决定簇。
实施方案22.实施方案21的细胞，其中所述抗原识别部分通过铰链区可操作连接至跨膜域。
实施方案23.实施方案21或22的细胞，其中所述抗原结合受体针对CD47。
实施方案24.实施方案23的细胞，其中所述抗原结合受体包含针对CD47的scFv。
实施方案25.实施方案24的细胞，其中所述抗原结合受体的铰链和跨膜区是CD28的铰链和跨膜区。
实施方案26.实施方案20的细胞，其中编码所述嵌合受体的所述核酸通过编码自切割肽的核苷酸序列可操作连接至编码所述另外的嵌合抗原受体的所述另外的核酸。
实施方案27.实施方案21的细胞，其中编码所述嵌合受体的所述核酸通过编码自切割肽的核苷酸序列可操作连接至编码所述抗原结合受体的核酸。
实施方案28.制备经遗传修饰的哺乳动物干细胞的方法，其包括：
获得能够分化成表达针对第一抗原决定簇的TCR的T细胞的哺乳动物干细胞；并且
对所述干细胞导入编码一种或多种嵌合抗原受体的一种或多种核酸分子，每种嵌合抗原受体包含针对与所述第一抗原决定簇不同的抗原决定簇的抗原识别部分，该抗原识别部分可操作连接至T细胞活化部分；和任选地导入编码一种或多种抗原结合受体(例如非信号传导抗原结合受体)的一种或多种核酸分子，每种抗原结合受体包含抗原识别部分，所述抗原识别部分针对与所述第一抗原决定簇和嵌合抗原受体针对的抗原决定簇不同的抗原决定簇。
实施方案29.实施方案28的方法，其中所述干细胞表达至少一种纯合HLA单元型。
实施方案30.制备经遗传修饰的哺乳动物干细胞的方法，其包括：
获得表达针对第一抗原决定簇的TCR的T细胞或胸腺细胞，其中任选地所述T细胞或胸腺细胞是CD8+或CD4+；
对所述T细胞或胸腺细胞导入编码一种或多种嵌合抗原受体的一种或多种核酸分子，每种嵌合抗原受体包含针对与所述第一抗原决定簇不同的抗原决定簇的抗原识别部分，所述抗原识别部分可操作连接至T细胞活化部分；和任选地导入编码一种或多种抗原结合受体(例如非信号传导抗原结合受体)的一种或多种核酸分子，每种抗原结合受体包含抗原识别部分，所述抗原识别部分针对与所述第一抗原决定簇和嵌合抗原受体针对的抗原决定簇不同的抗原决定簇；并且
从所述T细胞或胸腺细胞衍生干细胞。
实施方案31.实施方案30的方法，其中所述T细胞或胸腺细胞表达至少一种纯合HLA单元型。
实施方案32.根据实施方案28-31中任一项的方法，其中所述干细胞是iPSC。
实施方案33.T细胞，其中所述T细胞表达针对第一抗原决定簇的T细胞受体(TCR)，和包含抗原识别部分和T细胞活化部分的嵌合抗原受体，其中所述抗原识别部分针对第二抗原决定簇并且可操作连接至所述T细胞活化部分。
实施方案34.实施方案33的T细胞，其中所述T细胞表达至少一种纯合HLA单元型。
实施方案35.实施方案33或34的T细胞，其中所述T细胞是CD4+T细胞或CD8+T细胞。
实施方案36.实施方案33或34的T细胞，其中所述TCR是αβTCR或γδTCR。
实施方案37.实施方案33或34的T细胞，其衍生自表达所述至少一种纯合HLA单元型的干细胞。
实施方案38.实施方案37的T细胞，其中所述干细胞是iPSC或HSC。
实施方案39.实施方案38的T细胞，其中所述iPSC衍生自表达针对所述第一抗原决定簇的TCR的T细胞或胸腺细胞。
实施方案40.实施方案39的T细胞，其中在衍生所述iPSC的T细胞或胸腺细胞上表达的TCR是αβTCR或γδTCR。
实施方案41.实施方案39的T细胞，其中所述T细胞或胸腺细胞是CD8+。
实施方案42.实施方案38的T细胞，其中所述iPSC或HSC包含编码所述嵌合抗原受体的所述核酸分子。
实施方案43.实施方案33的T细胞，其中所述第一和第二抗原决定簇选自下组：肿瘤抗原、微生物抗原或自体反应性免疫细胞抗原。
实施方案44.实施方案43的T细胞，其中所述第一抗原决定簇选自肿瘤抗原，例如WT-1和EBVLMP2。
实施方案45.实施方案44的T细胞，其中所述第二抗原决定簇选自肿瘤抗原，例如TAG 72、CD19、MAGE、和CD47。
实施方案46.根据实施方案33-45中任一项的T细胞，其中所述抗原识别部分包含scFv。
实施方案47.根据实施方案33-46中任一项的T细胞，其中所述抗原识别部分通过铰链区和跨膜域与所述T细胞活化部分连接。
实施方案48.实施方案47的T细胞，其中所述铰链区衍生自IgG1的铰链区、CD8的铰链区或CD28的铰链区。
实施方案49.实施方案47的T细胞，其中所述铰链区包含促进所述嵌合抗原受体二聚化的半胱氨酸。
实施方案50.根据实施方案47的T细胞，其中所述跨膜域衍生自所述T细胞受体的α，β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、或免疫球蛋白如IgG4的跨膜域。
实施方案51.根据实施方案33-50中任一项的T细胞，其中所述T细胞活化部分包含选自下组的分子的胞内信号传导序列：TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、和CD66d。
实施方案52.实施方案51的T细胞，其中所述T细胞活化部分还包含选自下组的共刺激分子的胞内信号传导序列：CD27、CD28、4-lBB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、TIM-3、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、和与CD83特异性结合的配体。
实施方案53.根据实施方案33-52中任一项的T细胞，其还表达包含抗原识别部分和T细胞活化部分的另外的嵌合抗原受体，其中所述另外的嵌合抗原受体的所述抗原识别部分针对与所述第一和第二抗原决定簇不同的另外的抗原决定簇。
实施方案54.根据实施方案33-53中任一项的T细胞，其还表达包含抗原识别部分的非信号传导抗原结合受体，所述抗原识别部分针对与所述第一抗原决定簇和嵌合抗原受体针对的所述抗原决定簇不同的抗原决定簇。
实施方案55.实施方案54的T细胞，其中所述抗原识别部分通过铰链区可操作连接至跨膜域。
实施方案56.实施方案54或55的T细胞，其中所述抗原结合受体针对CD47。
实施方案57.实施方案56的T细胞，其中所述抗原结合受体包含针对CD47的scFv。
实施方案58.实施方案57的T细胞，其中所述抗原结合受体的铰链和跨膜区是CD28的铰链和跨膜区。
实施方案59.实施方案53的T细胞，其中所述嵌合受体和所述另外的嵌合抗原受体在最初翻译时通过自切割肽彼此连接，并且随后由于所述自切割肽的切割而分离。
实施方案60.实施方案54的T细胞，其中所述嵌合受体和所述抗原结合受体在最初翻译时通过自切割肽彼此连接，并且随后由于所述自切割肽的切割而分离。
实施方案61.衍生自根据实施方案1-27中任一项的干细胞的T细胞。
实施方案62.制备T细胞的方法，其包括
提供根据实施方案1-27中任一项的经遗传修饰的干细胞，并且
将所述经遗传修饰的干细胞分化成T细胞。
实施方案63.制备T细胞的方法，其包括
获得能够分化成表达针对第一抗原决定簇的TCR的T细胞的干细胞；
将所述干细胞分化成T细胞；并且
对所述T细胞导入编码一种或多种嵌合抗原受体的一种或多种核酸，每种嵌合抗原受体针对与所述第一抗原决定簇不同的抗原决定簇，和任选地导入编码一种或多种抗原结合受体的一种或多种核酸，每种抗原结合受体针对与所述第一抗原决定簇和嵌合抗原受体所针对的抗原决定簇不同的抗原决定簇。
实施方案64.实施方案63的方法，其中所述干细胞表达至少一种纯合HLA单元型。
实施方案65.实施方案62-64中任一项的方法，其中所述干细胞是iPSC或HSC。
实施方案66.实施方案65的方法，其中所述iPSC衍生自T细胞或胸腺细胞。
实施方案67.实施方案66的方法，其中所述T细胞或胸腺细胞是CD8+或CD4+。
实施方案68.实施方案65的方法，其中所述iPSC衍生自表达TCR的T细胞或胸腺细胞，所述TCR针对与衍生自所述iPSC的T细胞上表达的TCR针对的抗原决定簇相同的抗原决定簇。
实施方案69.治疗哺乳动物中以不想要的细胞群体的存在为特征的状况的方法，所述方法包括对所述哺乳动物施用有效数目的根据实施方案33-61中任一项的T细胞。
实施方案70.实施方案69的方法，其中所述状况是新生物状况、微生物感染(如HIV、STD或抗生素抗性细菌)或自身免疫性状况。
实施方案71.实施方案69的方法，其中所述状况是新生物状况，并且所述TCR针对第一肿瘤抗原决定簇，并且所述CAR针对第二肿瘤抗原决定簇。
实施方案72.实施方案71的方法，其中所述第一肿瘤抗原决定簇是WT 1。
实施方案73.实施方案71或72的方法，其中所述第二肿瘤抗原决定簇是TAG 72。
实施方案74.根据实施方案71-73中任一项的方法，其中施用于所述哺乳动物的所述细胞包含编码非信号传导CD47结合受体的核酸分子。
附图简述
图1A-1O。表达对威尔曼氏瘤1(WT-1)抗原特异性的TCR的细胞毒性T细胞的刺激和扩增。从全血外周血单个核细胞(PBMC)中分离细胞。将细胞在单细胞(A、F、K)上进行门控，其中也描绘了散点图(B、G、L)，然后是CD3阳性细胞(与APCCy7缀合；C、H、M)，随后是CD8(与PECy7缀合)和CD4(与PerCp缀合；D、I、N)，最后仅在CD8细胞(E、J、O)上。使用对WT-137肽特异性的HLA-A02四聚体进行WT-1染色。呈现来自HLA-A02阳性的两个不同患者(患者1A-E；患者2F-J)，并且与荧光减1(fluorescence minus one)(FMO；此染料缺乏WT-1四聚体染料，显示WT-137特异性染料，K-O)比较。显示的比例是CD3+细胞的百分比。对于两种样品，WT-1TCR T细胞的百分比增加至1.5％和4.5％；在未刺激的PBMC中，这些细胞是非常低的(低于使用本文的四聚体技术的检测水平)。在其它研究中(例如Schmeid等(2015))，它们是每10-6个CD8+细胞的少至1个(范围3x10-7-3x10-6个细胞)。
图2A-2G。具有对威尔曼氏瘤1(WT-1)抗原特异性的TCR的CD8+细胞毒性T细胞是有功能的。功能以干扰素γ(IFN-g)的产生表示(Ghanekar等，2001)。在WT-1特异性刺激后发现IFN-γ表达。将活化的细胞在CD8+和HLA-A02四聚体上门控到WT-137肽-PE缀合荧光染料。当用WT-1刺激时，这些具有对WT-1特异性的TCR的细胞毒性T细胞表明IFN-γ的胞内细胞因子染色(与太平洋蓝色荧光染料缀合(pacific blue fluorochrome))。呈现来自HLA-A02阳性的两个不同患者(Wt-1#1和WT-1#2)(患者1：A-B；患者2：C-D)并且与荧光减1(FMO；E-F；此染料缺乏WT-1四聚体染料，显示WT-137的特异性染色(G))相比。显示的比例是WT1+CD8+细胞的百分比，超过80％的WT-1TCR T细胞产生IFNγ。
图2H。LAG 3抑制剂(IMP 321)的添加增加刺激4天后WT-1特异性T细胞的频率。在此实验中，将纯化但未分离的脐带血单个核细胞单独、与单独的抗CD28一起、与WT-1肽(Miltenyi BioTech)和CD28(1μg/ml)一起或与WT-1肽加IMP321一起铺板24小时和4天。到24小时未观察到效应(数据未显示)，但与IMP 321对活化树突细胞的影响的动力学一致(Brigone等(2007))，4天后WT-1特异性CD8+T细胞倍增。
图3。从癌症特异性(例如WT-1)TCR T细胞产生iPSC。癌症抗原特异性T细胞在正常血液中极为罕见；它们通过在细胞因子存在下用于作用为抗原呈递细胞的自体B细胞(使用EBV形成淋巴母细胞系(LCL))结合的WT-1肽体外刺激来揭示。癌症抗原特异性T细胞显示为用CD8(对于细胞毒性T细胞)和针对HLA-WT-1与这些CD8+细胞的TCR结合的四聚体的双重标记。然后，使用Yamanaka重编程因子(reprogramming factor)将这些细胞转化为iPSC。将对WT-1特异性的重排TCR基因嵌入iPSC的TCR基因座中。
图4。在OP9支持物上培养1、5、9和13天后，iPSC集落到造血谱系和淋巴样祖细胞(lymphoid progenitor)的形态进展。到第13天注意到大量的单一造血样细胞。
图5。在OP9细胞上培养13天后，iPSC衍生的细胞的流式细胞术分析清楚地显示在存在造血干细胞(HSC)(CD34+CD43+)的情况下造血特化的证据。
图6。在OP9细胞上培养13天，接着在OP9 DL-L1细胞上培养9天后，iPSC衍生细胞中HSC的流式细胞术。将细胞在存活力、CD45表达上门控，然后通过染色CD34和CD43检查单细胞的HSC含量。注意HSC从>90％前OPDL-L1培养物(图5)降低到OP9DL-L1细胞上培养9天后的约60％。
图7。在OP9细胞上培养13天，接着在OP9 DL-L1细胞上培养9天后，iPSC衍生细胞的T细胞发育的流式细胞术。存在清楚的证据表明，具有CD5和CD7表达的T细胞谱系的定型以及具有未成熟(即缺乏CD3；数据未显示)CD4+，CD8+“单阳性”细胞和CD4+CD8+“双阳性细胞”的第一阶段的胸腺细胞发育。
图8。在OP9细胞上培养13天，接着在OP9 DL-L1细胞上培养16天后，iPSC衍生细胞中HSC和T细胞分化的流式细胞术。表达CD4和/或CD8的未成熟T细胞仍然明显存在，并且HSC从约60％进一步降低至约25％。最重要的是成熟的CD8+细胞是存在的并且表达CD3、αβTCR和CD8β链(除了未显示的CD8α-外)。
图9。来自从体外扩增的WT-1特异性TCR T细胞衍生的iPSC的WT-1特异性TCR，CD8αβT细胞的诱导的示意图。用(低水平)抗CD3抗体处理CD4+CD8+细胞模拟阳性选择期间在胸腺内发生的信号传导；这增加了表达CD8α和CD8β链两者的CD8+T细胞。
图10。从自体外扩增的WT-1特异性TCR T细胞衍生的iPSC诱导的WT-1特异性TCR，CD8αβT细胞保留了与初始细胞等同的全部功能(例如对WT-1表达靶物的细胞毒性)。效应物:靶物比率为3:1；测试了分级浓度的WT-1肽。
图11。嵌合抗原受体和抗原结合受体构建体的示意图。已经开发了一组嵌合抗原受体(CAR)构建体-用于针对TAG 72或CD19(作为阳性对照)的scFv。构建体使用人CD8或CD28作为铰链和跨膜区以及CD28、CD3ζ或4-1BB作为胞质活化信号传导域。P2A指导蛋白水解切割的信号序列，其在图11所示的前五个构建体中释放EGFP作为表达的荧光报告物，并且在图11中所示的下部(第六个)构建体中释放显示为前导物(CD8)-scFv(抗CD47)-铰链/TM(CD28)-内域尾部(CD8)的第二CAR受体构建体，其中前导物将被加工以释放由铰链/TM锚定的表面上的抗CD47 scFv，并且内域尾部不含信号传导序列。可以使用任何CD47结合外域以用于结合靶细胞上的CD47，包括例如SIRP-α。铰链区可以含有半胱氨酸残基以通过相邻铰链域之间的二硫键形成来指导二聚化，其是天然CD8铰链特征性的，或可以具有被不形成二硫键并且不形成共价稳定的二聚体的其它残基，诸如丝氨酸取代的半胱氨酸残基。CAR和CD47结合受体的示例性序列以及适用于构建CAR或抗原结合受体的各种域序列在SEQ IDNO:1-20中列出。
图12。逆转录病毒转化方案。用于产生含CAR的逆转录病毒构建体的过程的示意图。将CAR构建体克隆到pSAMEN质粒载体中，并通过P2A自切割多肽与荧光报告物EGFP连接以分开CAR和报告物。当细胞转导成功时，表达并切割P2A，并且通过流式细胞术和免疫荧光显微术来鉴定EGFP。
图13。慢病毒转化方案。用于产生含CAR的慢病毒构建体的过程的示意图。将CAR构建体克隆入pWP1质粒载体中并通过P2A自切割多肽与荧光报告物EGFP连接以分开CAR和报告物。当细胞转导成功时，表达并切割P2A，并且通过流式细胞术和免疫荧光显微术鉴定EGFP。
图14A。正常的第二代CAR结构的示意图。针对靶抗原的scFv结合域；允许CAR整合到质膜中的铰链区(茎)(铰链长度可以不同地影响scFv与靶细胞的结合)；在scFv接合后诱导T细胞活化的胞质信号传导域。CAR结构显示为二聚体，其通过铰链区域中相邻半胱氨酸残基之间的二硫键稳定。
图14B。非信号传导抗原结合受体、截短的CD47“附着茎”的示意图。结构显示用于CD47抗原结合的scFv域或单一V域，其附着到铰链和跨膜区，但在内域中不存在信号传导域。此构建体将允许CAR-T细胞对表达高水平CD47的癌细胞的结合亲和力增加。虽然此种受体也可以结合表达较低水平CD47的正常细胞，但不存在信号转导，因此不损害正常细胞。铰链区可以含有半胱氨酸残基以通过相邻铰链区之间的二硫键形成来指导二聚化，或可以具有被其它残基如丝氨酸取代的半胱氨酸残基，其不形成二硫键并且不形成共价稳定的二聚体。
图15。经CAR转导的人PBMC衍生的CD3+T细胞的流式细胞术分析，证明用TAG72慢病毒CAR构建体(20.8％阳性，与对照中<0.1％相比)和CD19慢病毒CAR构建体(33.9％阳性)的成功转导。
图16。Western印迹分析，确认经TAG 27和CD19 CAR转染的T细胞中的蛋白质表达。
图17。TAG-72CAR-T介导的对卵巢癌(TAG72+)靶细胞的杀伤。效应物:靶物比率(E:T)＝1:1。通过FACS以>95％纯分离从CD3活化的正常血液T细胞形成的TAG-72CAR-T效应细胞(GFP阳性细胞)，随后使用前在固定的αCD3/αCD28和IL-2存在下刺激以增强细胞溶解活性达72小时。在40小时内监测细胞阻抗的变化(在此表示为任意单位细胞指数)，并与从PBMC分离的刺激的非转导CD3+ve细胞和仅载体刺激的CAR-T细胞比较。TAG72 CAR-T细胞显示最高的杀伤，然而CD3/CD28活化的非CAR-T细胞也显示杀伤，尽管程度小得多。
图18。测定TAG-72CAR-T杀伤的特异性。通过FACS分别分离TAG-72和CD19 CAR-T，并立即添加至72hi/CD19低靶细胞而无需体外刺激(E:T＝5:1)。在15小时内监测细胞阻抗的变化(在此表示为任意单位细胞指数)。TAG-72CAR-T细胞显示强烈的细胞系杀伤。CD19CAR-T细胞与非CAR T细胞对照相同。
图19A-19B。从自WT-1特异性T细胞产生的iPSC衍生的WT-1特异性TCR CD8+T细胞的CAR转导的流式细胞术分析。图19A。用TAG72慢病毒CAR构建体成功转导WT-1特异性TCR T细胞(阳性31.3％，与对照中<0.1％相比)。图19B。从自WT-1特异性TCR T细胞形成的iPSC衍生的WT-1特异性TCR T细胞成功用TAG 72加非信号传导截短的CD47的双重特异性CAR构建体成功转导(55％转导)；用单独TAG 72转导32％。这些经转导的T细胞含有3种抗癌特异性：WT-1(TCR)；TAG72(CAR)；截短的非信号传导CD47。
图20A-20I。WT-1特异性TCR T细胞和双重特异性TAG 72CAR/WT-1TCR T细胞的细胞毒性功能。将WT-1特异性TCR T细胞和双重特异性TAG72CAR/WT-1TCR T细胞与卵巢癌细胞系CAOV4在单层培养物中温育24小时以评估细胞毒性。尽管2:1的较低的效应物:靶物比率(由于少量获得的效应物而必需)，但是在WT-1TCR T细胞的情况下具有特异性杀伤，并且这在用TAG72 CAR转导的情况下进一步增加。技术基于AquaAmine，其染色细胞内的胺。当细胞死亡或正在死亡时，受损细胞膜使染料浸润细胞并更强烈染色胺。因此，细胞的细胞毒性由细胞胺的染色强度增加描绘。注意：由于一些胺驻留于细胞表面上，活细胞仍会给出一些(尽管低)的阳性染色。A、D、G：仅CAOV4癌细胞。B、E、H：与WT-1TCR T细胞温育的CAOV4癌细胞。C、F、I：与CAOV4卵巢癌细胞温育的双重特异性TAG 72CAR/WT-1TCR T细胞。D、E、F：门控CD3-ve细胞(即CAOVA4)上的Aqua Amine水平。G：单独的癌细胞，H：非CAR转染的WT-1TCR细胞与癌细胞，以及I：经TAG-72转染的WT-1TCR T细胞和癌细胞的相差图像。40倍放大率。WT-1TCR T细胞引起约10％杀伤(高于背景)；TAG72 CAR-T细胞引起额外的10％杀伤(即，高于背景约20％)。双重抗癌杀伤机制是叠加的。
图21A-21B。iPS的CAR转导。与CAR慢病毒温育后4天，在MEF饲养层上生长的第5天。在20x放大率的明视野图像上覆盖TAG72、CD19和GFP病毒的CAR+转导(绿色)。未转导的对照未显示任何GFP信号。4倍放大率的iPSC集落的图像证明了MEF饲养层上存在iPSC集落。在每个系统中，注意到一些iPSC集落似乎已经开始自发分化。图21A中描绘了经转导的成纤维细胞衍生的iPSC。图21B显示了用TAG72 CAR对WT-1T细胞衍生的iPSC的成功转导。因此，这些iPSC对于WT-1TCR和TAG 72特异性两者都是成功印刷的。
图22。iPSC的嵌合抗原受体转导的流式细胞术分析。这些iPSC衍生自成体成纤维细胞，但是可以来自任何来源，包括未选择的T细胞、CD8+T细胞或癌症抗原特异性(例如WT-1)T细胞。清楚地存在有由TAG 72或CD19成功转导的荧光iPSC群体。与未转导的对照相比转导细胞的覆盖显示在图23中。
图23。比较未转导的对照细胞(蓝色)与经转导的iPSC培养物(绿色)的点图的重叠。GFP+门内的事件证明成功的转导，并以非碎片事件的百分比频率呈现。
图24。FACS分选后经CAR转导的iPSC集落的再形成。可以通过流式细胞术(GFP阳性荧光)分离经CAR转导的iPSC，并且再铺板以形成稳定的集落。
发明详述
本发明部分基于以下确定的预测：可以通过例如将CAR盒转染入自表现出针对感兴趣的抗原决定簇的TCR特异性的T细胞衍生的iPSC一致且稳定生成针对两种独特抗原决定簇的表达双重TCR/CAR的T细胞。由于外遗传记忆的作用，已经发现从此iPSC分化的T细胞稳定表达衍生iPSC的体细胞T细胞的TCR特异性和针对独特抗原决定簇的CAR两者。可以通过将编码结合此类另外的抗原决定簇结合的分子的另外的核酸导入细胞中实现对另外的抗原决定簇的特异性。因此，此类多特异性细胞提供了比目前可得的结果更有效的治疗结果。因此，这些确定(determination)使得现在能够开发稳定转化的双重抗原特异性T细胞，特别是细胞毒性CD8+αβTCR T细胞的持续来源，用于以不想要的细胞群体为特征的任何疾病状况，如新生物状况、病毒感染、细菌感染或自身免疫病症的情况下。此发现以及基于此的细胞的产生现在已经促进治疗性处理方案的改善，所述治疗性处理方案涉及治疗此类状况，特别是新生物状况，诸如实体瘤或血液癌症(例如白血病)，包括转移性疾病。
因此，本发明的一个方面涉及经遗传修饰的哺乳动物干细胞或从其分化的T细胞，所述细胞能够分化成表达针对第一抗原决定簇的TCR的T细胞，并且包含编码嵌合抗原受体的核酸分子，其中所述受体包含针对第二抗原决定簇的抗原识别部分，该抗原识别部分可操作连接至T细胞活化部分。在一些实施方案中，经遗传修饰的哺乳动物干细胞表达至少一种纯合HLA单元型。
提及“T细胞”应当理解为提及包含T细胞受体的任何细胞。在这方面，T细胞受体可以包含α、β、γ或δ链中的任何一个或多个。如本领域技术人员将理解的，NKT细胞也表达T细胞受体，因此根据本发明也可以产生双重特异性NKT细胞。本发明并非意在限于任何特定的T细胞亚类，尽管在优选实施方案中，主题T细胞表达α/βTCR二聚体。还更优选地，所述T细胞是CD4+辅助T细胞、CD8+杀伤T细胞或NKT细胞。在不将本发明限制于任何一种理论或作用模式的情况下，CD8+T细胞也称为细胞毒性细胞。作为适应性免疫系统的主要部分，CD8+T细胞扫描胞内环境以靶向并破坏主要感染的细胞。衍生自胞内内容物的小肽片段被加工并转运到细胞表面，在那里它们在MHC I类分子的背景下呈递。然而，超出仅仅响应病毒感染，CD8+T细胞还通过监测和除去受损或异常细胞(包括癌症)来提供免疫监视的额外水平。MHC I呈递的肽的CD8+T细胞识别通常导致细胞毒性颗粒或淋巴因子的释放或通过FAS/FASL相互作用活化凋亡途径以破坏主题细胞。另一方面，CD4+T细胞通常在MHC II类的情况下识别由抗原呈递细胞呈递的肽，导致设计用于调节B细胞和/或CD8+T细胞免疫应答的细胞因子的释放。因此，与细胞毒性T细胞不同，T辅助细胞不直接杀死不想要的细胞，如癌细胞，虽然它们可以提升此类响应，在它通过细胞毒性T细胞和/或基于抗体的清除机制实现的程度。
天然杀伤T(NKT)细胞是表达半不变T细胞受体(TCRαβ)和通常与天然杀伤细胞相关的表面抗原的T细胞的特化群体。NKT细胞上的TCR是独特的，因为它识别由MHC I样分子CD1d呈递的糖脂抗原。大多数NKT细胞表达不变的TCRα链和少量的TCRβ链之一。存在于I型NKT细胞上的TCR识别抗原α-半乳糖苷神经酰胺(α-GalCer)。在此组内，已经鉴定出可区分的亚群，包括CD4+CD8-细胞、CD4-CD8+细胞和CD4-/CD8-细胞。II型NKT细胞(或非不变NKT细胞)表达更广泛的TCRα链并且不识别α-GalCer抗原。NKT细胞产生具有多种(经常相反)效应的细胞因子，例如促进炎症或诱导免疫抑制，包括耐受性。因此，它们可以促进抗细菌和抗病毒免疫应答，促进肿瘤相关的免疫监视，并抑制或促进自身免疫疾病的发展。像天然杀伤细胞一样，NKT细胞也可以诱导穿孔素、Fas和TNF相关的细胞毒性。因此，提及本发明的经遗传修饰的T细胞应当理解为包括提及NKT细胞。
由于基于胸腺的T细胞产生的特征在于T细胞受体(TCR)全集的随机生成，胸腺生成还必须包括非常严格的选择过程，其消除或功能性沉默那些形成中的具有攻击自身的潜力的胸腺T细胞。因此，此种“自身耐受性”降低自身免疫性疾病的潜力。然而，此过程必然损害针对癌症的免疫监视-鉴于非病毒诱导的癌症定义为“自身”的疾病。这意味着在胸腺中产生的许多T细胞可以在进入血液之前已经被消除，所述T细胞可以潜在与肿瘤相关抗原是反应性的。它们至少将是数目上有缺陷并且可能表达低亲和力TCR。
在一个实施方案中，提供了经遗传修饰的哺乳动物干细胞或从其分化的T细胞，所述细胞能够分化成表达针对第一抗原决定簇的TCR的CD4+T细胞，并且包含编码嵌合抗原受体的核酸分子，其中所述受体包含针对第二抗原决定簇的抗原识别部分，该抗原识别部分可操作连接至T细胞活化部分。在一个实施方案中，经遗传修饰的哺乳动物干细胞表达至少一种纯合的HLA单元型。
在另一个实施方案中，提供了经遗传修饰的哺乳动物干细胞或从其分化的T细胞，所述细胞能够分化成表达针对第一抗原决定簇的TCR的CD8+T细胞，并且包含编码嵌合抗原受体的核酸分子，其中所述受体包含针对第二抗原决定簇的抗原识别部分，该抗原识别部分可操作连接至T细胞活化部分。在一个实施方案中，经遗传修饰的哺乳动物干细胞表达至少一种纯合的HLA单元型。
在一些实施方案中，本发明的经遗传修饰的细胞，例如经遗传修饰的干细胞(例如iPSC或HSC)或T细胞对于至少一种HLA单元型是纯合的。在不将本发明限制于任何一种理论或作用模式的情况下，主要组织相容性复合体(MHC)代表一组细胞表面分子，其主要功能是结合自抗原衍生的肽片段并将它们呈递给T细胞。MHC基因家族分为三个亚组：I类、II类和III类。I类MHC分子表达β2亚基，因此仅能被CD8共受体识别。II类MHC分子不表达β2亚基，因此可以被CD4共受体识别。因此，由于不同的淋巴细胞表达不同的TCR共受体，MHC分子调节哪种类型的淋巴细胞可以以高亲和力结合给定的抗原。由MHC I和II类介导的抗原呈递的多样性至少以三种方式获得：
(1)生物体的MHC全集通常是多基因的(通过多种相互作用基因)；
(2)MHC表达是共显性的(来自两组遗传等位基因)；和
(3)MHC基因变体是高度多态性的(在物种内的生物体间多种多样变化)。
MHC分子结合T淋巴细胞上的T细胞受体和CD4/CD8共受体两者。保持在MHC分子的肽结合沟中的抗原表位与TCR的可变Ig-样域相互作用以触发T细胞活化。然而，MHC分子本身也可以起抗原作用并且可以在表达外来MHC的组织或细胞的接受体中引起免疫应答，由此引起移植排斥。更进一步，免疫活性细胞的移植实际上可以导致宿主组织的排斥，也称为移植物抗宿主病。在这方面，每个人细胞表达6个MHC I类等位基因(来自每个亲本的一个HLA-A、-B和-C等位基因)和6至8个MHC II类等位基因(一个HLA-DP和-DQ、和来自每个亲本的一个或两个HLA-DR，以及这些的组合)。人群体中MHC变异较高，HLA-A基因至少有350个等位基因，HLA-B基因有620个等位基因，DR有400个等位基因，而DQ有90个等位基因。任何两个不是同卵双生的个体都会表达不同的MHC分子。
所有MHC分子都可以介导移植排斥，但显示低多态性的HLA-C和HLA-DP不太重要。可以通过寻求在供体和接受体之间匹配尽可能多的细胞表面HLA全集来将移植排斥最小化。完全匹配仅在同卵双生之间可能。然而，基于使细胞上表达的HLA抗原的一个或多个范围的不相容性最小化来选择供体是非常期望的，并且可以显著使排斥问题最小化。这是本发明解决的特定问题，因为管理组织/细胞排斥的常用方法是施用免疫抑制治疗方案，这在基于施用经遗传修饰的免疫细胞的治疗方案的背景下不是期望的，所述经遗传修饰的免疫细胞是以最佳功能性水平发挥功能需要的。根据本发明，这可以通过利用细胞如iPSC或细胞如衍生iPSC的T细胞来实现，所述细胞对于一种或多种MHC单元型是纯合的，感兴趣的HLA等位基因是主要的移植抗原并且优选由相当大比例的群体，诸如群体的至少5％、至少10％、至少15％、至少17％、至少20％或更多表达的HLA等位基因。当纯合HLA单元型对应于显性MHC I或MHC II HLA类型(就组织排斥而言)时，使用此类细胞将导致较广群体中组织排斥的问题的显著降低，所述群体接受治疗方案背景中的本发明的细胞。就本发明而言，经遗传修饰的细胞就一种细胞HLA抗原而言可以是纯合的，或者它们就超过一种HLA抗原(例如2、3或更多种HLA抗原)而言可以是纯合的。在一些实施方案中，经遗传修饰的细胞就选自表1中列出的HLA抗原的一种HLA抗原而言是纯合的，包括例如HLA A1、B8、C7、DR17、DQ2、或HLA A2、B44、C5、DR4、DQ8、或HLA A3、B7、C7、DR15、DQ6。在一些实施方案中，经遗传修饰的细胞就选自表1中列出的HLA抗原的两种或更多种HLA抗原而言是纯合的，包括例如HLA A1、B8、C7、DR17、DQ2、或HLA A2、B44、C5、DR4、DQ8、或HLA A3、B7、C7、DR15、DQ6。
因此，术语“HLA型”应当理解为指存在于个体细胞上的HLA抗原的互补物。
可以通过任何合适的方法实现获得用于产生iPSC的合适的纯合HLA T细胞，包括例如筛选群体(诸如经由血库)以鉴定表达HLA纯合性的个体，然后筛选来自所述个体的表现出感兴趣的TCR特异性的T细胞。这些通常非常罕见的T细胞可以通过它们的TCR识别的特定抗原肽选择性刺激并且频率大大增加(例如从<0.0001至0.2)。
本领域技术人员将理解，在公共文献中广泛可获得重要信息，其描述了就使感兴趣的给定群体间供体-接受体HLA错配最小化而言纯合单元型的鉴定和效用，从而实现供体库的生成。参见例如Pappas等人(2015)。在一个实例中，表1鉴定出相对于英国群体的比例，15个最高排序的纯合HLA单元型，这提供了与所述英国群体的最小错配。前8个列出的纯合HLA单元型与49％的群体相容。表2中概述了另一个实例，所述表2详述了与种族多样化的加利福尼亚群体相容的前10个排序的单元型。表2包括亚群体的匹配频率，包括黑人或非洲裔美国人、亚洲和太平洋岛民、白人、西班牙裔和美洲印第安人以及阿拉斯加原住民。此外，表3概述了中国北方群体中HLA-A-B-DR、A-B、A-DR和B-DR的50种最常见单元型。应当理解的是，本领域技术人员将会理解，表3中描述的数据可以用于定义一组纯合的单元型，其将为中国北方群体提供最小的错配。
表1：为了对英国群体提供零HLA错配而鉴定的15个最高排序的纯合HLA-A、-B、-DR类型的的效用。
Figure SMS_1
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表2：加利福尼亚群体的顶部顺式和反式匹配的单元系(haplolines)。缩写AFA，黑人或非洲裔美国人；API，亚洲和太平洋岛民；CAU，白人(非西班牙裔)；CIS，顺式匹配益处(cis match benefit)；fexp，预期的顺式匹配频率；HIS，西班牙裔；Ki，匹配数目，作为受试者的计数或总数目的百分比；NAM，美洲印第安人和阿拉斯加原住民；TRANS，反式匹配益处。
Figure SMS_3
表3：HLA-A-B-DR、A-B、A-DR和B-DR的50个最频繁的单元型(为10-5)HF＝单元型频率/100,000
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如上文详述，本发明基于下述确定来预测：干细胞可以一致地和稳定地工程化改造为表达针对多种多肽抗原的双重T细胞和嵌合抗原受体，从而提供T细胞的持续来源，所述T细胞是比目前可用的治疗性细胞治疗方案中使用的细胞更有治疗效果。在这方面，提及“干细胞”应当理解为提及表现出在多种谱系方向上发展的潜力(鉴于其特定的遗传构成)，并因此形成新的生物体或再生生物体的组织或细胞群体的任何细胞。根据本发明使用的干细胞可以是能够沿着两种或更多种谱系分化的任何合适类型，并且包括但不限于胚胎干细胞、成体干细胞、脐带干细胞、造血干细胞细胞(HSC)、全能细胞、祖细胞、前体细胞、多能细胞、多潜能细胞(multipotent cell)或去分化的体细胞(如诱导性多能干细胞)。“全能”指主题干细胞可以自身更新。“多能”指主题干细胞可以分化以特别形成三种胚层中的任何一种的细胞，这些胚层是外胚层、内胚层和中胚层。
在一个具体的实施方案中，主题干细胞是诱导性多能干细胞(iPSC)。在不将本发明限制于任何一种理论或作用模式的情况下，成体干细胞扩增不一定基于不对称干细胞分裂的发生，以便沿特定体细胞谱系实现干细胞更新和分化两者。具体地，多能干细胞可以源自诱导转变为多系潜能状态的T细胞。能够使成体细胞去分化的技术的发展由于在其它情况下在体外诱导干细胞更新和扩增的困难而有重大意义。
因此，根据该实施方案，提供了经遗传修饰的哺乳动物干细胞或从其分化的T细胞，所述干细胞是iPSC，能够分化成表达针对第一抗原决定簇的TCR的T细胞，并且包含编码嵌合抗原受体的核酸分子，其中所述受体包含针对第二抗原决定簇的抗原识别部分，该抗原识别部分可操作连接至T细胞活化部分。在一个实施方案中，经遗传修饰的哺乳动物iPSC表达至少一种纯合HLA单元型。
iPSC通常直接由体细胞产生，但应当理解，本发明在这方面不受限制。也就是说，主题iPSC可以从不是终末分化的细胞产生；确实原则上可以从任何有核细胞诱导iPSC，包括例如来自血液和皮肤细胞的单核细胞。例如，在本发明的一个实施方案的背景下，可以从完全分化的T细胞产生主题iPSC，或者它们可以从前体T细胞如胸腺细胞产生。就受试胸腺细胞已经重排其TCR并且在本发明的背景中表现出感兴趣的抗原特异性而言，可以寻求从此细胞产生iPSC。这可以是相关的，例如，在讨论的特定TCR重排是预期可以在胸腺发生期间选择的重排的情况下。本领域技术人员应当理解，关于对肿瘤细胞或自体反应细胞的免疫响应性的复杂因素之一是在此情况下需要免疫系统将免疫应答引导至自身细胞以及因此引导至自身抗原。通常在胸腺T淋巴细胞分化期间选择此类免疫细胞以最小化自身免疫性疾病发作的前景。然而，在新生物和自身免疫性状况的背景下，不想要的细胞是自身细胞，因此，寻求靶向的细胞表面抗原将是自身抗原。不以任何方式限制本发明，并且如下文更详细讨论的，使用产生针对多种独特抗原决定簇的表达TCR/CAR的T细胞的iPSC的优点之一是已经确定了外遗传记忆的作用可以加强iPSC分化成功能性T细胞，所述功能性T细胞表达针对与衍生iPSC的T细胞相同的抗原的TCR。然而，就选择衍生iPSC的特异性TCR表达细胞而言，可能难以鉴别合适的完全分化的T细胞，因为可以在胸腺生成期间已经选择了表达针对自身抗原的功能性TCR的T细胞。因此，筛选表达感兴趣的TCR重排的胸腺细胞可能更为可行，所述胸腺细胞尚未经过负选择以除去潜在的自身反应细胞。
在另一个实施方案中，用编码针对第一抗原决定簇(例如肿瘤抗原决定簇)的TCR的一种或多种核酸分子(如重排的TCR基因)转染iPSC。
在又一个实施方案中，主题干细胞是造血干细胞(HSC)。造血干细胞(HSC)指通过造血过程产生淋巴样和髓样谱系的所有血细胞的干细胞。HSC衍生自中胚层，并且可以在成体骨髓、外周血和脐带血中找到。可以通过建立的技术从骨髓、外周血和脐带血中收集HSC，并且通常与CD34+表达相关。在一些实施方案中，人HSC可以定义为CD34+CD38-CD90+CD45RA-(参见Reinisch等(2015))。可以用一种或多种编码针对第一抗原决定簇的TCR的核酸遗传修饰，例如转染HSC，然后定向分化为T细胞。也可以在HSC分化成T细胞之前或之后对HSC导入编码一种或多种CAR的核酸和任选地编码一种或多种对接抗原结合受体的核酸。
因此，提及“T细胞受体”(TCR)应当理解为提及识别由MHC呈递的肽的T细胞或NKT细胞表面上发现的异二聚体。具体地，CD8+T细胞识别MHC I类背景中呈递的肽，而CD4+T细胞识别MHC II类背景中呈递的肽。在不将本发明限制于任何一种理论或作用模式的情况下，在大多数人T细胞中，TCR包含α和β链，而少数细胞群体表达包含γδ异二聚体的TCR。TCR是二硫化物连接的膜锚定异二聚体蛋白质。γ、δ、α和β链由两个胞外域组成：可变(V)区和恒定(C)区，它们都形成免疫球蛋白超家族的一部分并且折叠以形成反平行β-片层。恒定区接近细胞膜，随后是跨膜区和短的胞质尾部，而可变区与肽/MHC复合物结合。
TCRα链和β链两者的可变域各自表达三个高变区或互补决定区(CDR)，而β-链的可变区具有另外的超变区(HV4)，其通常不接触抗原，并且因此认为不是CDR。产生TCR多样性的过程主要基于前体T细胞中DNA编码区段的基因重组-使用RAG1和RAG2重组酶的体细胞V(D)J重组或使用胞苷脱氨酶的基因转化。每种重组TCR拥有独特的抗原特异性，其由在αβT细胞的情况下由α和β链或者在γδT细胞的情况下由γ和δ链形成的抗原结合位点的结构决定。TCRα链由VJ重组产生，而β链由VDJ重组产生。同样，TCRγ链的产生涉及VJ重组，而通过VDJ重组发生TCRδ链。这些特定区域(对于α或γ链为V和J；对于β和δ链为V、D和J)的相互作用对应于对肽/MHC识别重要的CDR3区域。造成对加工的抗原肽的T细胞受体特异性的甚至更大的多样性是此区域处区段的独特组合，以及回文和随机核苷酸添加。
因此，提及“针对”抗原决定簇的TCR应当理解为针对已经经历重排并且对抗原决定簇，优选自身(特别是自身癌症)抗原决定簇表现出特异性的TCR。
在一个实施方案中，iPSC衍生自表达重排的TCR，优选重排的αβTCR的细胞。适用于产生本发明的iPSC的细胞的实例包括但不限于CD4+T细胞、CD8+T细胞、NKT细胞、胸腺细胞或其它形式的前体T细胞。在另一个实施方案中，所述细胞表达重排的γδTCR。
因此，提供了经遗传修饰的哺乳动物iPSC或HSC或从其分化的T细胞，所述iPSC或HSC能够分化成表达针对第一抗原决定簇的TCR的T细胞，衍生自TCR基因已经经历重排的细胞，或已经用所述重排基因转导，并且包含编码嵌合抗原受体的核酸分子，其中所述受体包含针对第二抗原决定簇的抗原识别部分，该抗原识别部分可操作连接至T细胞活化部分。在一些实施方案中，经遗传修饰的哺乳动物iPSC或HSC表达至少一种纯合HLA单元型。
在一个实施方案中，所述iPSC衍生自T细胞或胸腺细胞。
在另一个实施方案中，所述iPSC衍生自表达αβTCR的T细胞或胸腺细胞。
在又一个实施方案中，所述iPSC衍生自表达γδTCR的T细胞或胸腺细胞。
可以已经从作为治疗受试者的个体中新鲜分离主题干细胞，或者它们可以已经从非新鲜来源，例如从培养物(例如，其中扩增细胞数目和/或培养细胞以使它们接受分化信号)或冷冻的细胞原液获得，所述细胞原液已经在某个较早的时间点从个体或另一来源分离。还应当理解，主题细胞在进行分化之前可以已经经历一些其它形式的处理或操作，诸如但不限于纯化、细胞周期状态的改变或细胞系诸如胚胎干细胞系的形成。因此，主题细胞可以是原代细胞或继代细胞。原代细胞是已经从个体分离的细胞。继代细胞是在应用本发明的方法之前在其分离后已经经历某种形式的体外操作，诸如制备胚胎干细胞系的细胞。
就本发明的干细胞是iPSC而言，用于产生iPSC的方法是本领域技术人员公知的。在这方面，如上文详述，iPSC是衍生自更成熟的细胞类型，诸如体细胞(其已经转变/去分化回到多能状态)的细胞。
在不将本发明限制于任何一种理论或作用模式的情况下，可以通过将特定组的多能性相关基因或“重编程因子”导入体细胞类型来衍生iPSC。最常用的一组重编程因子(也称为Yamanaka因子)是基因Oct4(Pou5f1)、Sox2、cMyc、和Klf4。Yamanaka在2006年显示了这四种编码转录因子的特定基因的转染，以将成体细胞转化为多能细胞。虽然此种组合是用于产生iPSC的最常规组合，但是每种因子可以在功能上被相关的转录因子、miRNA、小分子或甚至非相关基因如谱系指定剂(lineage specifier)替换。例如，已经实现使用逆转录病毒系统转染Oct 3/4、Sox2、Klf4和c-Myc后的iPSC诱导，通过使用慢病毒系统转染Oct4、Sox2、Nanog和Lin28亦然。前一组转录因子称为Yamanaka因子，而后者通常称为Thomson因子。如本领域技术人员将理解的，已经对基本重编程因子表达载体进行了广泛的修饰，并且已经设计了新的递送模式以提高效率并最小化或除去载体序列，所述载体序列在其它情况下可以整合到重编程的iPSC基因组中。这些方法对于本领域技术人员来说是公知的，并且包括但不限于：
(i)具有Cre-Lox介导的转基因切除的单盒重编程载体；
(ii)由非整合病毒如腺病毒或仙台病毒重编程。或者，重编程因子作为蛋白质的表达提供了产生iPSC的手段，所述iPSC尚未经历导入的载体DNA对种系的整合。
也已经开发出非病毒重编程方法。这些包括但不限于：
(i)mRNA转染-以mRNA表达重编程因子的能力提供了生成iPSC的方法，对所述iPSC不发生病毒载体的染色体整合。Warren转录mRNA以有效表达重编程因子(Warren等(2010))。通过将Lin28加入Yamanaka重编程因子方案，在5％O2培养，并且在细胞培养基中包含丙戊酸，可以提高效率。重编程因子mRNA是商品化的。
(ii)miRNA感染/转染-几种miRNA簇在胚胎干细胞中强烈表达。当将成熟miR-302b和/或miR-372的合成模拟物加上四种慢病毒Yamanaka因子添加至MRC5和BJ-1成纤维细胞时，与单独的四种慢病毒因子相比，重编程效率增加10至15倍(Subramanyam等(2011))。还发现了某些miRNA可以在没有Yamanaka因子存在的情况下以高效率重编程细胞。
(iii)PiggyBac–PiggyBac是移动遗传元件(转座子)，其在存在转座酶的情况下可以整合到染色体TTAA位点中，并随后在转座酶再表达后从基因组切除。当克隆到piggyBac载体中并共转染到MEF中时，Yamanaka因子可以在转染后14-25天重编程细胞(Kaji等(2009)；Woltjen等(2009))。在再表达转座酶时，可以从iPSC中切除piggyBac载体。
(iv)微型环(minicircle)载体-微型环载体是仅含有真核启动子和将表达的cDNA的最小载体。在人脂肪基质细胞中表达的Lin28、GFP、Nanog、Sox2、和Oct4微型环载体能够重编程细胞(Narsinh等(2011))。
(v)附体型质粒-作为附加型质粒的重编程因子的瞬时表达允许产生iPSC。例如，可以用一个盒中的Yamanaka因子加Lin28和另一个含有SV40大T抗原的oriP/EBNA载体构建oriP/EBNA载体(Chuo等(2011))。已经显示这些载体在补充有丁酸钠的培养基中在CD34+脐带血、外周血和骨单个核细胞中表达，在14天内产生iPSC集落。转染的质粒最终丧失。
另一方面，本领域技术人员也会熟悉已知增强细胞编程效率的附加方法。例如，即使在使用相同的方法时，细胞之间的iPSC效率也可以有变化。已经显示各种小分子增强重编程效率(表4)。
表4
增加iPSC重编程效率的化合物
处理 受影响的过程
丙戊酸 组蛋白脱乙酰酶抑制
丁酸钠 组蛋白脱乙酰酶抑制
PD0325901 MEK抑制
A-83-01 TGFβ-抑制
SB43152 TGFβ-抑制
维生素C 增强表遗传修饰剂，促进抗氧化剂效应的存活
Thiazovivin ROCK抑制剂，促进细胞存活
PS48 P13K/Akit活化，促进糖酵解
5％氧气 促进糖酵解
几种已知的机制使这些分子能够促进重编程，包括对组蛋白脱乙酰化的抑制(Mali等(2010)；Huangfu等(2008))、TGFβ和MEK信号传导途径的阻断(Lin等(2009)；Ichida等(2009))、表遗传修饰剂功能的增强(Esteban等(2010))、对ROCK途径的抑制(Noggle等(2011))和糖酵解的诱导(Zhu等(2010))。在这些小分子中，重编程方案中最常使用组蛋白脱乙酰酶抑制剂丙戊酸和丁酸钠。还应当注意，在重编程过程中5％氧气中细胞的培养也可以提高iPSC衍生的效率(Yoshida等(2009))。对于特别难以重编程的细胞，在低氧条件下添加小分子和培养物可以产生改善。另一种选择是使用胚胎干细胞条件化培养基(ESCM)来诱导内源性重编程因子的表达(Balasubramanian等(2009))。可以通过加入丙戊酸进一步改善效率。也可以使用此类策略来增强外源引入的重编程因子提高重编程效率的能力。
就本发明的干细胞是HSC而言，用于产生或制备HSC的方法是本领域技术人员公知的。可以在例如用特定分子如GM-CSF处理后将HSC从骨髓释放后，通过从骨髓或血液中直接提取获得HSC。然后，HSC可以通过它们的CD34的质膜表达纯化，通过例如用抗CD34包被的磁珠或通过用荧光抗CD34标记后通过流式细胞术进行细胞分选来进行。可以使用实施例3和图3-10中概述的OP9/OP9DL-L1系统将这些如此纯化的HSC诱导成T细胞分化。
提及主题干细胞，特别是iPSC或HSC“能够”分化成表达针对抗原决定簇的TCR的T细胞，应当理解为提及下述细胞，所述细胞确实或有能力转录和翻译主题TCR基因，然后在细胞表面上以功能性受体组装TCR异二聚体。如技术人员将理解的，在大多数情况下，诸如iPSC的干细胞不会以其未分化形式表达TCR。通常预期一旦已经诱导沿着T细胞谱系的定向分化后发生TCR表达。在一个实施方案中，细胞是在具有或没有CAR遗传修饰的情况下可以诱导分化成表达功能性TCR的T细胞的细胞。应当理解，可以通过任何合适的手段来实现细胞表达特定特异性的TCR的能力。例如，可以已经用编码两种TCR链(例如α和β链)的基因转染细胞，所述TCR链在表达时会结合以形成TCR异二聚体。或者，在本发明的优选实施方案的背景下，本发明的干细胞是已经自T细胞、胸腺细胞或TCR基因已经得以重排的其它细胞产生的干细胞。已经确定了已经从此类细胞产生的iPSC在适当的细胞培养条件下定向分化为CD4+或CD8+T细胞时将表达与衍生iPSC的体细胞T细胞相同的TCR抗原特异性的。更进一步重要的是，并且如下文更详细讨论的，已经确定了在用或不用编码一种或多种CAR或编码抗原/MHC I类特异性TCR的CAR的α和β链的一种或多种核酸转染iPSC或HSC的情况下，从其分化的T细胞能够稳定表达功能性TCR和一种或多种CAR两者(和任选的一种或多种抗原结合受体)，并且因此涉及两种或更多种独特的抗原决定簇。因此，基于若给iPSC或HSC提供适当的分化信号则这会发生，此类干细胞视为“能够”分化成T细胞并表达必需的TCR。在这方面，由于TCR基因的重排是完全独立的基因组事件，因此从中产生iPSC的T细胞亚群的选择不需要必然与寻求最终通过iPSC的定向分化产生的T细胞亚群相同。例如，可以选择表现出适当的TCR特异性以产生iPSC的CD4+T细胞。然而，一旦产生了iPSC，技术人员可以寻求将iPSC分化为CD8+T细胞。在此情况下，凭借表遗传记忆，新产生的CD8+T细胞将表现出CD8+T细胞的功能，但TCR特异性将是衍生iPSC的CD4+T细胞的特异性。反之亦然。
提及诱导体细胞如T细胞向多谱系潜能表型如iPSC的“转变”应理解为提及诱导遗传、形态和/或功能变化，其是将体细胞表型改变为本文定义的类型的多谱系(多能)表型需要的。
就可以选择而给出通过用编码TCR的DNA转染细胞而能够产生TCR的iPSC而言，可以理解，此转染可以发生在任何时间点，例如在产生本发明的iPSC前，在产生iPSC后，或者它可以与CAR转染同时发生。
如上文详述，体细胞，特别是T细胞或胸腺细胞可以诱导转变成干细胞，即多谱系分化潜能的功能状态。因此，提及表现出“多谱系分化潜能”或“多谱系潜能”的细胞应当理解为提及表现出沿着超过一种体细胞分化途径发展的潜力的细胞。例如，细胞可以能够产生有限范围的体细胞类型，此类细胞通常称为多能或多潜能。这些细胞表现出定型为比全能细胞更有限范围的谱系的潜能，后者是可以在任何固有可能的分化方向上发育的细胞，包括所有的体细胞谱系和配子。
基于下述内容，经典地称为“祖”细胞或“前体”细胞的细胞落入“多谱系分化潜能”定义的范围内：在适当的刺激条件下，它们可以产生超过一种体细胞谱系的细胞。就本文中在通过本发明的方法产生的细胞方面提及“干细胞”而言，这应当理解为提及如本文所定义的表现出多谱系分化潜能的细胞。
就本发明而言，应当理解的是，主题干细胞的重要特征是细胞表现出的多谱系分化潜能包括分化成T细胞和表达对感兴趣的抗原表现出特异性的TCR的能力。在产生干细胞之前或之后是否诱导TCR特异性(如通过用编码感兴趣的TCR的DNA转染干细胞)是无关紧要的。应当理解，本文要求保护的干细胞涵盖表现出必需的分化潜能的所有干细胞，而不管何时或如何导入所述能力。更进一步，还应当理解，主题干细胞不需要是全能的。只要它们表现出沿着超过一种体细胞谱系分化的能力并且只要这些谱系之一是T细胞谱系，则所述细胞落入本发明的范围内。
如上文详述，由本发明提供的干细胞是经遗传修饰的。“经遗传修饰”指相对于在相应的未修饰细胞背景下观察到的，主题细胞源自分子操纵的某种形式。在本发明的背景中，主题干细胞包含编码嵌合抗原受体的核酸分子，并且任选地还包含编码抗原结合受体的核酸分子。如本文所公开的，可以将编码受体(无论是嵌合抗原受体还是抗原结合受体)的核酸导入干细胞如iPSC或HSC，或导入衍生干细胞的细胞(例如T细胞)；并且在这两种情况下，包含编码受体的核酸的所得干细胞在本文中认为是经遗传修饰的干细胞。从经遗传修饰的干细胞分化的T细胞和经工程改造而含有编码遗传工程化CAR或抗原结合受体的核酸的T细胞在本文中也认为是经遗传修饰的T细胞。
提及“核酸分子”应当理解为提及脱氧核糖核酸及其核糖核酸两者。主题核酸分子可以是任何合适形式的核酸分子，包括例如基因组、cDNA或核糖核酸分子。为此，术语“表达”指DNA的转录和翻译或RNA的翻译，从而导致肽、多肽或蛋白质的合成。例如，DNA构建体对应于可以寻求转染入细胞中以供随后表达的构建体，而RNA构建体的实例是从DNA构建体转录的RNA分子，该RNA构建体仅需要翻译以产生感兴趣的蛋白质。提及“表达产物”指从核酸分子的转录和翻译产生的产物。
提及“嵌合抗原受体”(也称为“人工T细胞受体”、“嵌合T细胞受体”和“嵌合免疫受体”)应当理解为提及将抗原结合部分植入免疫效应细胞上的工程化受体。通常，这些受体用于将单克隆抗体的特异性植入T细胞上；通过逆转录病毒载体促进其编码序列的转染。更具体地，并且不以任何方式限制本发明，这些分子的最常见形式是衍生自单克隆抗体的单链可变片段(scFv)融合至CD3-ζ链跨膜和内域的融合物。此类分子响应scFv对其靶物的识别而导致CD3-ζ链信号的传递。当T细胞表达此嵌合分子时，它们识别并杀死表达scFv所针对的抗原的靶细胞。例如，为了靶向恶性B细胞，使用对B谱系分子CD19特异性的嵌合免疫受体重定向T细胞的特异性。
免疫球蛋白重链和轻链的可变部分通常通过柔性接头融合以形成scFv。此scFv通常前面有信号肽以将新生蛋白引导至内质网和随后的表面表达，所述信号肽最终被切割。柔性间隔区允许scFv在不同方向上定向以实现抗原结合。跨膜域通常是典型的疏水性α螺旋，其通常衍生自突出入细胞中并传输期望信号的信号传导内域的初始分子。因此，提及“抗原识别部分”应当理解为指识别和结合感兴趣的抗原决定簇的受体的胞外部分(即靶物特异性结合元件)。抗原识别域通常是scFv。然而，有许多其它备选。例如，也已经使用来自天然T细胞受体(TCR)α和β单链的抗原识别部分，因为具有简单的胞外域(例如，CD4胞外域识别HIV感染的细胞)和其它识别组分如连接的细胞因子(其导致识别携带细胞因子受体的细胞)。事实上，以足够高的亲和力结合给定靶物的任何部分可以用作抗原识别域。此类分子对于本领域技术人员来说是公知的，并且选择适合于使用的分子完全在本领域人员的技术内。就设计嵌合抗原受体，特别是胞外域而言，技术人员可以包括就实现有效表达或功能发挥而言有用的其它部分。例如，如早先详述，表达CAR的核酸分子可以设计成在抗原识别部分的N-末端表达信号肽。在不将本发明限制于任何一种理论或作用模式的情况下，信号肽指导新生蛋白进入内质网中。若受体被糖基化并锚定在细胞膜中，则这是必需的。可以使用任何真核信号肽序列。通常，使用天然附着到氨基末端的信号肽(例如，在具有取向轻链-接头-重链的scFv中，使用轻链的天然信号)。在另一个实例中，胞外域还可以包含间隔区，其可以用于将抗原识别域连接至跨膜域。它应当是足够柔性的，以允许抗原识别域在不同方向上定向以促进抗原识别和结合。间隔区的最简单形式是来自IgG1的铰链区。备选包括免疫球蛋白的CH2CH3区和CD3的部分。对于大多数基于scFv的构建体，IgG1铰链足够。因此，术语“间隔区”指发挥功能以将跨膜域连接到胞外域或多肽链中的胞质域的任何寡肽或多肽。间隔区域可以包含多达300个氨基酸，优选10-100个氨基酸，最优选25-50个氨基酸。在又一个实例中，可以修饰铰链区以改变其长度并由此实现附加的功能益处。例如，在包含CD8或CD28铰链的传统CAR中，单一半胱氨酸(Cys)可留在铰链中以稳定T细胞表面上的二聚化。因此，通常显示两个scFv(二价)。在另一个实例中，可以用Cys取代(Ser)，从而不能形成稳定化的二硫键，从而防止二聚化并因此防止过早活化。也可以完全除去Cys。另一种设计是仅显示一个CAR上的VH域和另一个上的VL域，因此Cys配对将VH/VL对齐以形成靶向感兴趣抗原的功能性单价Fv。
主题嵌合抗原受体的抗原识别部分可操作连接至T细胞活化部分。“T细胞活化部分”指在抗原识别和结合之后，负责将信号传递到T细胞中以实现其活化和效应物机制诱导的受体的亚区。CAR的T细胞活化部分通常位于CAR的胞内域(或“内域”)内；因此，CAR分子的胞内域通常还包含或者是其“胞内信号传导域”。常用的内域组分是含有3个ITAM的CD3-ζ胞内域。这在抗原结合后向T细胞传递活化信号。CD3-ζ可以不提供完全有能力的活化信号，并且另外的共刺激信号传导是期望的。例如，嵌合CD28和OX40可以与CD3-ζ一起使用以传递增殖/存活信号，或者所有三种可以一起使用。应当理解的是，CAR的此胞内信号传导域负责活化免疫细胞的至少一种正常效应物功能，优选已经表达CAR的T细胞。术语“胞内信号传导域”指转导效应物功能信号并指导细胞进行特化功能的蛋白质部分。尽管通常可以使用整个胞内信号传导域，但在许多情况下，没有必要使用整个域。就使用胞内信号传导域的截短部分而言，可以使用此类截短部分替换完整链，只要它转导效应物功能信号。因此，术语“胞内信号传导域”意味着包括足以转导效应物功能信号的胞内域的任何截短部分。
用于CAR的胞内信号传导域的优选实例包括T细胞受体(TCR)和一致起作用以在抗原受体结合后启动信号转导的共受体的胞质序列，以及这些序列的任何衍生物或变体和任何合成序列，其具有相同的功能能力。
已知通过单独的TCR产生的信号不足以完全活化T细胞，并且还需要次级或共刺激信号。因此，T细胞活化可以说是由两种独特类型的胞质信号传导序列介导的：通过TCR启动抗原依赖性初级活化的胞质信号序列(初级胞质信号传导序列)和以抗原非依赖性方式起作用以提供次级或共刺激信号的胞质信号序列(次级胞质信号序列)。初级胞质信号序列以刺激方式或抑制方式调节TCR复合物的初级活化。以刺激方式起作用的初级胞质信号传导序列可含有称为基于免疫受体酪氨酸的活化基序或ITAM的信号传导基序。特别有用的含有ITAM的初级胞质信号传导序列的实例包括衍生自TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的那些。特别优选CAR中的胞质信号传导分子包含衍生自CD3-ζ的胞质信号传导序列。
在一个优选的实施方案中，CAR的胞质域可以设计为包含CD3-ζ信号传导域本身或者与在本发明的CAR的背景中有用的任何其它期望的胞质域组合。例如，CAR的胞质域可以包含CD3ζ链部分和共刺激信号传导区。共刺激信号区域指包含共刺激分子的胞内域的CAR的一部分。共刺激分子是抗原受体或其配体以外的细胞表面分子，其是淋巴细胞对抗原的有效应答所需要的。此类分子的实例包括CD27、CD28、4-lBB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、TIM3、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、和与CD83特异性结合的配体等。本发明的CAR的胞质信号传导部分内的胞质信号序列可以以随机或规定的顺序相互连接。任选地，短的寡肽或多肽接头，优选2-10个氨基酸长度可以形成连接。甘氨酸-丝氨酸双联体提供特别合适的接头。在一个实施方案中，胞质域设计为包含CD3-ζ的信号传导域和CD28的信号传导域。
如上文详述，抗原识别部分可操作连接至T细胞活化部分。“可操作连接”指抗原识别部分与T细胞活化部分连接、结合或以其它方式相关联，使得在抗原识别部分与抗原决定簇结合后，通过T细胞活化部分诱导信号以活化主题T细胞并使其效应物功能能够被活化。例如，这是通过设计跨膜域来实现的。
在一个实施方案中，使用与CAR中的一个域天然相关的跨膜域。在一些情况下，可以通过氨基酸取代来选择或修饰跨膜域，以避免这些域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜域结合，以最小化与受体复合物的其它成员的相互作用。跨膜域可以衍生自天然或合成来源。若来源是天然的，则该域可以衍生自任何膜结合或跨膜蛋白。例如，跨膜区可以源自(即至少包含)T细胞受体CD28，CD3ε，CD45，CD4，CD5，CD8的α，β或ζ链的跨膜区，CD9，CD16，CD22，CD33，CD37，CD64，CD80，CD86，CD134，CD137，CD154或来自免疫球蛋白如IgG4。或者，跨膜域可以是合成的，在这种情况下，它将主要包含疏水性残基如亮氨酸和缬氨酸。优选地，在合成跨膜域的每个末端将发现三联苯丙氨酸，色氨酸和缬氨酸。任选地，短的寡-或多肽接头，优选2-10个氨基酸长度可以形成CAR的跨膜域和细胞质信号传导域之间的连接。甘氨酸-丝氨酸双联体提供特别合适的接头。通常，跨膜域是跨越膜的疏水性α螺旋。通常使用来自内域的最近膜近端组分的跨膜域。
提及“抗原结合受体”应当理解为提及锚定于细胞表面并结合抗原的工程化受体。类似于本文公开的嵌合抗原受体，本文公开的抗原结合受体还包含针对抗原决定簇的抗原识别部分。如本文所述，抗原结合受体中的抗原识别部分可以采取与嵌合抗原受体的抗原识别部分相同的形式并以相同的方式设计。也类似于本文公开的嵌合抗原受体，抗原结合受体中的抗原识别部分可操作连接(例如，通过间隔区序列如铰链区)至跨膜域，使得抗原结合受体锚定于细胞表面。如上所述，还可以以与嵌合抗原受体的间隔区序列和跨膜域相同的方式设计抗原结合受体中的间隔区序列和跨膜域。然而，与嵌合抗原受体不同，如本文所定义的抗原结合受体通常是非信号传导的，并且可以包括缺乏T细胞活化域的胞内序列。此类非信号传递抗原结合受体可以结合抗原，但不在T细胞中触发任何信号转导，因此也称为“对接受体”或“锚定受体”。下文进一步描述了抗原结合受体如非信号传导CD47结合受体的某些实施方案。
图11中描绘了编码CAR和/或抗原结合受体的核酸构建体的实例，并且CAR和抗原结合受体以及适用于CAR和/或抗原结合受体的各种域的示例性序列提供于SEQ ID NO:1-20中。
本领域技术人员将理解，将这些遗传修饰导入细胞的机制可以采用本领域技术人员公知且理解的任何合适的形式。例如，通常通过使用表达构建体将遗传物质方便地导入细胞中。
在一个实施方案中，用编码CAR的表达构建体转染能够分化成表达TCR的T细胞(即，干细胞如iPSC或HSC)的细胞或可以衍生干细胞如iPSC的表达TCR的细胞。表达构建体可以包含一个或多个DNA区域，所述DNA区域包含与编码CAR的核苷酸序列和任选地编码选择标志物的第二DNA区域和任选地编码自杀蛋白的第三DNA区域可操作连接的启动子。在这方面，应当理解，作为常规程序的问题，可以设计具有本领域技术人员认为有用的任何一种或多种附加组分(例如自杀基因)的构建体。在建议用于体内治疗患者的本发明细胞的背景下，控制本发明的经遗传修饰细胞的杀伤并因此影响它们从体内环境中消除的能力是非常期望的。在不将本发明限制于任何一种理论或作用模式的情况下，本发明细胞的过继转移，特别就其可以针对“自身”抗原如自体反应细胞上表达的肿瘤抗原或而言，或可以发生与自身抗原的交叉反应的抗原不是没有风险的。在此种情况下，可以发生与移植物抗宿主病类似的结果，其中这些细胞攻击健康(未患病)的细胞。在整体治疗方案中，这些副作用可以仍然比对健康组织的非特异性系统性杀伤更为期望，所述非特异性系统性杀伤是治疗，诸如化疗或自身免疫性病症中健康组织的不受控杀伤特征性的。尽管如此，杀死癌细胞是至关重要的，但是控制本发明细胞的消除的能力是非常期望的，并且可以通过将可诱导自杀基因构建到基因构建体中的非常公知且广泛使用的技术来常规实现，所述基因构建体导入到本发明的干/T细胞中。
主题启动子可以是组成性或诱导型的。当主题构建体表达超过一种感兴趣的蛋白质的情况下，它们可以处于分开的启动子的控制下，或者它们可以处于单一启动子的控制下，如在使用双顺反子载体的背景下，所述双顺反子载体利用IRES序列来促进从单一RNA转录物以非融合形式翻译超过一种蛋白质产物。另外，可以设计主题构建体以便于使用Cre重组酶介导的剪接诱导型基因表达系统。
提及核酸“表达构建体”应当理解为指可传递给细胞并设计用于经历转录的核酸分子。然后从其转录RNA分子。通常，表达构建体也通过多个替代术语来指代，该术语可互换地广泛使用，包括“表达盒”和“载体”。
为了导入编码多种受体的核酸，无论受体是CAR、抗原结合受体还是其组合，可以将多个受体编码核酸置于一个构建体中，该构建体被转染入细胞。在一个实施方案中，多个受体编码核酸可以包含在利用IRES序列促进多种受体蛋白翻译的多顺反子载体中。在另一个实施方案中，多个受体编码核酸可以在一个表达单元和阅读框内彼此连接，例如通过利用自切割肽(例如P2A)使得最初产生包含多个受体序列的一个单一多肽并随后加工产生多种受体。在另一个实施方案中，将多种受体编码核酸置于用于转染的分开的构建体中。
可以通过任何合适的方法产生本发明的表达构建体，包括重组或合成技术。为此目的，主题构建体可以从第一原理构建，如在利用完全合成方法情况下会发生的，或者可以通过适当地修改现有的载体来构建它。在采用后一种方法的情况下，可以用作起点的载体范围广泛，包括但不限于：
(i)质粒：质粒是小的独立复制的胞质DNA片段，通常在原核细胞中发现，其能够自主复制。质粒通常用于分子克隆的背景下，因为它们能够从一个生物体转移到另一个生物体。在不将本发明限制于任何一种理论或作用模式的情况下，质粒可以保持附加体的或它们可以掺入宿主的基因组中。可以利用的质粒的实例包括细菌衍生的pBR322和pUC。
(ii)噬菌体：噬菌体是在细菌中感染和复制的病毒。它们通常由封装在蛋白质外壳(称为壳体)内的核酸核心组成。取决于噬菌体的类型，核酸可以是DNA(单链或双链)或RNA(单链)，并且它们可以是线性或环状的。噬菌体可以是丝状的、多面体的或多面体且有尾的、与一个或多个管状尾纤维连接的管状尾部。噬菌体通常可以容纳比例如质粒更大的外源DNA片段。噬菌体的实例包括但不限于大肠杆菌λ噬菌体、P1噬菌体和T-even噬菌体(例如T4)。
(iii)杆状病毒：它们是仅在无脊椎动物中增殖并且通常分类为杆状病毒科的一组DNA病毒中的任一种。它们的基因组由双链环状DNA组成。
(iv)哺乳动物病毒：感染哺乳动物的病毒的实例包括慢病毒、仙台病毒、逆转录病毒和痘苗病毒。
(v)人工染色体：人工染色体，如酵母人工染色体或细菌人工染色体。
(vi)杂合载体如粘粒、噬菌粒和质粒：粘粒通常衍生自质粒，但也包含λ噬菌体的cos位点，而噬菌粒表示嵌合噬菌体质粒载体。质粒通常也代表质粒-噬菌体嵌合体，但是凭借它们含有两者的功能性复制起点的实情限定。因此，可以将质粒作为质粒或噬菌体在适当的宿主菌株中繁殖。
(vii)商品化载体，其本身完全合成产生或是天然存在的载体如病毒载体的修饰形式。
本领域技术人员将理解，选择适合于修饰的载体就选择进行这点而非合成产生构建体而言取决于许多因素，包括经遗传修饰的细胞置于的最终用途。例如，在将细胞体内施用于人的情况下，利用某些类型的载体如病毒载体可能不太想要。此外，有必要考虑寻求导入构建体的DNA量。通常理解某些载体更容易转染到某些细胞类型中。例如，可以作为给定质粒的宿主的细胞类型的范围可以从一种质粒类型变化到另一种质粒类型。在又一个实例中，需要插入的DNA插入物越大，产生本发明表达构建体的载体的选择就越受限制。为此目的，插入的DNA的大小可以根据以下因素而变化，例如编码感兴趣蛋白质的DNA序列的大小、寻求表达的蛋白质的数目、使用的选择标记的数目和诸如线性化多接头区域等的特征的掺入。
用于本发明的表达构建体可以是任何形式，包括环形或线形。在此情况下，“环状”核苷酸序列应当理解为提及任何核苷酸分子的环状核苷酸序列部分。例如，核苷酸序列可以是完全环状的，如质粒，或者它可以是部分环状的，如在滚环复制期间产生的核苷酸分子的环状部分(这可以是相关的，例如，其中构建体是在其导入细胞群体之前，通过这种类型的方法而不是通过基于细胞的克隆系统进行初始复制)。在此背景下，“环状”核苷酸序列对应于此分子的环状部分。“线性”核苷酸序列应当理解为提及基本上呈线性形式的任何核苷酸序列。线性序列可以是线性核苷酸分子，或者它可以是核苷酸分子的线性部分，其也包含非线性部分，如圆形部分。线性核苷酸序列的实例包括但不限于质粒衍生的构建体，其已被线性化以便于其整合到宿主细胞的染色体中或已经以线性形式合成产生的构建体。为此目的，还应当理解的是，本发明的构建体的构造可以保持恒定或可以不保持恒定。例如，可以将环状质粒衍生的构建体转染到细胞中，其中它仍然是以此种形式进行复制和转录的稳定的环状附加体。然而，在另一个实例中，主题构建体可以是以环状形式转染入细胞但在染色体整合之前经历胞内线性化的构建体。这不一定是理想的情况，因为此类线性化可以以随机的方式发生，并潜在地在关键区域中切割构建体，从而使其无效。
用于本发明方法中的核酸分子可以衍生自任何人或非人来源。本发明考虑的非人来源包括灵长类、家畜(例如绵羊、猪、牛、山羊、马、驴)、实验室测试动物(例如小鼠、仓鼠、兔、大鼠、豚鼠)、家庭伴侣动物(例如狗、猫)、禽类(例如，鸡、鹅、鸭和其它家禽，猎鸟、鹤鸵、鸵鸟)、捕获的野生或驯服动物(例如牛、袋鼠、野鸭)、爬行动物、鱼、昆虫、原核生物或合成核酸。
应当理解的是，本发明的编码受体的构建体可以包含来自超过一种来源的核酸材料。例如，尽管构建体可以源自特定微生物，但在修饰该构建体以导入本文定义的特征中，可以导入来自其它微生物来源的核酸材料。这些来源可以包括例如病毒或细菌DNA(例如IRES DNA)、哺乳动物DNA(例如编码CAR的DNA)或合成DNA(例如以导入特定的限制性内切核酸酶位点)。另外，其中提出表达主题构建体的细胞类型可以再次不同，因为其不对应于与构建体的全部或部分核酸材料相同的生物体。例如，基本上由细菌和病毒衍生的DNA组成的构建体仍然可以在本文考虑的哺乳动物干细胞中表达。
不以任何方式限制本发明，本发明优选使用包含CAR序列的DNA构建体，其中所述序列包含与胞内域的核酸序列可操作连接的抗原结合部分的核酸序列。例如，可以在受试者CAR中使用的胞内域包括但不限于CD3-ζ的胞内域。在另一个实施方案中，CAR的胞内域包括与CD28的胞内域可操作连接至CD3-ζ的胞内域；并且在另一个实施方案中，CAR的胞内域包括彼此可操作连接的CD3-ζ、CD28和OX40的胞内域。
衍生自逆转录病毒如慢病毒的载体是适合于实现长期基因转移的载体的一个实例，因为它们允许转基因的长期稳定整合以及其在子细胞中增殖。其它合适的病毒包括仙台病毒和痘苗病毒。载体应当适合于复制和整合到真核生物中。典型的克隆载体含有转录和翻译终止子、起始序列和可用于调节期望核酸序列表达的启动子。病毒载体技术在本领域中是公知的，并且描述于例如Sambrook et al(2001,Molecular Cloning:A LaboratoryManual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York)以及其它病毒学和分子生物学手册中。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒和慢病毒。通常，合适的载体含有在至少一种生物体中起作用的复制起点，启动子序列、方便的限制性内切核酸酶位点和一种或多种选择标志物(例如WO 01/96584；WO 01/29058；和美国专利No.6,326,193)。
已经开发了许多基于病毒的系统用于基因转移到哺乳动物细胞中。例如，逆转录病毒为基因递送系统提供了一个便利的平台。可以使用本领域已知的技术将选择的基因插入载体并包装在逆转录病毒颗粒中。然后可以分离重组病毒并将其递送至受试者干细胞。本领域已知许多逆转录病毒系统。
另外的启动子元件(例如增强子)调节转录起始的频率。通常，这些位于起始位点上游30-110bp区域，尽管最近已显示许多启动子在起始位点下游也包含功能元件。启动子元件之间的间隔通常是灵活的，从而当元件相对于彼此倒转或移动时保持启动子功能。在胸苷激酶(tk)启动子中，启动子元件之间的间隔可以增加至相隔50bp，然后活性开始下降。取决于启动子，各个元件可以协同或独立地发挥功能以活化转录。
合适的启动子的一个实例是立即早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。此启动子序列是能够驱动与其可操作连接的任何多核苷酸序列的高水平表达的强组成型启动子序列。合适的启动子的另一个实例是延伸生长因子-1α(EF-1α)。然而，也可以使用其它组成型启动子序列，包括但不限于猿病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳房肿瘤病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复序列(LTR)启动子、MoMuLV启动子、禽白血病病毒启动子、埃巴病毒立即早期启动子、劳氏肉瘤病毒启动子、以及人基因启动子，例如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红蛋白启动子和肌酸激酶启动子。此外，构建体不应限于使用组成型启动子。也考虑使用诱导型启动子。诱导型启动子的使用提供了分子开关，该分子开关能够在期望表达时启动与其可操作连接的CAR多核苷酸序列的此类表达，或者当不期望表达时关闭表达。诱导型启动子的实例包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。
为了评估CAR多肽或其部分的表达，待导入细胞的表达载体还可含有选择标志物基因或报告基因或两者以促进从寻求通过病毒载体转染或感染的细胞群体鉴定和选择表达细胞。在其它方面，可以在DNA的不同段上携带选择标志物并用于共转染程序。选择标志物和报告基因两者侧翼都可以有适当的调控序列以实现在宿主细胞中表达。有用的选择标志物包括例如抗生素抗性基因，如neo等。表位标签也可包含在CAR分子的胞外域中，诸如通常使用的短多肽c-myc或FLAG，优选位于铰链区内，以通过表位特异性靶向剂诸如例如与流式细胞术组合使用的抗体鉴定CAR表达。
使用报告基因来鉴定潜在转染的细胞并用于评估调控序列的功能性。通常，报告基因是不存在于接受体生物体或组织中或由接受体生物体或组织表达的基因，并且编码其表达通过一些容易检测到的性质(例如酶活性)表达的多肽。在将DNA导入接受体细胞后，在合适的时间测定报告基因的表达。合适的报告基因可以包括编码萤光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌性碱性磷酸酶或绿色荧光蛋白基因的基因(例如Ui-Tei et al,2000FEBS Letters 479:79-82)。合适的表达系统是公知的，并且可以使用已知技术制备或商业获得。一般地，具有显示报告基因的最高水平表达的最小5'侧翼区域的构建体鉴定为启动子。此类启动子区域可以与报告基因连接并用于评估试剂调节启动子驱动的转录的能力。本领域技术人员将会理解，诸如eGFP(增强型绿色荧光蛋白)的报告物可以作为由自切割肽如P2A分开的CAR的C端多肽延伸掺入，所述自切割肽将在胞内释放报告物。
在细胞中导入和表达基因的方法在本领域中是已知的。在表达载体的情况下，可以通过物理、化学或生物手段容易地将载体导入宿主细胞。
用于将多核苷酸导入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染、颗粒轰击、显微注射、电穿孔等。用于产生包含载体和/或外源核酸的细胞的方法在本领域中是公知的。参见例如Sambrook et al(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory,New York)。将多核苷酸导入宿主细胞的优选方法是磷酸钙转染。
用于将感兴趣多核苷酸导入宿主细胞的生物学方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体，特别是逆转录病毒载体已成为将基因插入哺乳动物例如人细胞中最广泛使用的方法。其它病毒载体可以衍生自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒和腺伴随病毒等。参见例如美国专利No.5,350,674和5,585,362。
用于将多核苷酸导入宿主细胞的化学手段包括胶体分散体系，如大分子复合物、纳米胶囊、微球体、珠和基于脂质的体系，包括水包油乳液、胶束、混合胶束和脂质体。用作递送载体的示例性胶体系统是脂质体(例如人工膜囊泡)。
在寻求使用非病毒递送系统的情况下，示例性递送载体是脂质体。考虑将脂质制剂用于将核酸导入宿主细胞。另一方面，核酸可以与脂质结合。可以将与脂质相关的核酸包囊在脂质体的水性内部中，散布在脂质体的脂质双层内，通过与脂质体和寡核苷酸结合的连接分子连接到脂质体，在脂质体中捕获，与脂质体复合，分散在含有脂质的溶液中，与脂质混合，与脂质组合，作为悬浮液包含在脂质中，包含在胶束中或与胶束复合，或以其它方式与脂质结合。脂质、脂质/DNA或脂质/表达载体相关组合物不限于溶液中的任何特定结构。例如，它们可以以双层结构存在，作为胶束或具有“塌陷”结构。它们也可以简单地散布在溶液中，可能形成尺寸或形状不均匀的聚集体。脂质是可以是天然存在的脂肪物质或合成脂质。例如，脂质包括天然存在于细胞质中的脂肪滴以及含有长链脂肪族烃及其衍生物如脂肪酸、醇、胺、氨基醇和醛的化合物类别。
适合使用的脂质可以从商业来源获得。例如，二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(“DMPC”)可以从Sigma,St.Louis,MO获得；磷酸二鲸蜡酯(“DCP”)可以从K&K Laboratories(Plainview,NY)获得；胆固醇(“Choi”)可以从Calbiochem-Behring获得；二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(“DMPG”)和其它脂质可以从Avanti Polar Lipids,Inc.(Birmingham,AL)获得。氯仿或氯仿/甲醇中的脂质储备溶液可以贮存在约-20℃。氯仿用作唯一的溶剂，因为它比甲醇更容易蒸发。“脂质体”是一个通用术语，包括由封闭脂质双层或聚集体形成的各种单层和多层脂质载体。脂质体可以表征为具有磷脂双层膜和内部水性介质的囊泡结构。多层脂质体具有由水性介质分开的多个脂质层。当磷脂悬浮在过量的水溶液中时，它们自发形成。在形成封闭结构之前脂质组分发生自身重排，并在脂质双层之间捕获水和溶解的溶质(Ghosh等(1991))。然而，也包括在溶液中具有不同于正常囊泡结构的结构的组合物。例如，脂质可以呈现胶束结构或仅作为脂质分子的不均匀聚集体存在。还考虑lipofectamine-核酸复合物。
不管用于将外源核酸导入宿主细胞的方法，为了确认重组DNA序列在宿主细胞中的存在，可以进行多种测定。此类测定包括例如Southern和Northern印迹、RT-PCR和PCR或通过例如通过免疫学手段(ELISA和Western印迹)检测特定肽的存在或不存在。
在一些实施方案中本细胞的TCR和CAR以及抗原结合受体各自针对抗原决定簇。提及“抗原决定簇”应当理解为提及由寻求被本发明的受体表达T细胞靶向的细胞表达的任何蛋白质性或非蛋白质性分子。应当理解的是，这些是可以是“自身”分子的分子，因为它们通常在患者体内表达(例如在某些肿瘤细胞或自体反应细胞上预期的)，或者它们可以是非自身分子，如在细胞感染有微生物的情况下预期的(例如病毒蛋白)。还应当理解，主题抗原不限于天然能够引起T或B细胞免疫应答的抗原(不论是否自身)。确切地，在本发明的背景中，提及“抗原”或“抗原决定簇”指寻求靶向的任何蛋白质性或非蛋白质性分子。如上文详述，靶分子可以是免疫系统天然耐受的靶分子，如肿瘤抗原或自身反应性免疫细胞抗原。然而，可以期望(甚至考虑到潜在的侧支损伤)以依然靶向此抗原，例如以使可以在高度非特异性和系统性治疗，诸如化学疗法或免疫抑制中观察到的潜在甚至更严重的副作用最小化，或者减少经由高度靶向治疗的治疗的持续时间和/或使杀死所有不想要的细胞的前景最大化。优选地，所述分子在细胞表面上表达。
本领域技术人员将理解，在TCR结合的背景下，主题抗原决定簇将采取衍生自抗原的肽的形式，该肽在MHC I或MHC II的背景下表达。在CAR的背景下，由于该受体的设计基于免疫球蛋白可变区结合域的使用，受体将识别天然形式的抗原上存在的表位。主题表位可以是线性的或构象的。应当理解，主题抗原决定簇可以是由寻求靶向的细胞表达的任何分子。也就是说，靶向分子可以仅仅由靶细胞表达，或者它也可以由非靶细胞表达。优选地，主题抗原决定簇是非自身抗原决定簇或抗原决定簇，其在其它情况下仅仅或者以比正常细胞显著更高水平由寻求靶向的细胞表达。然而，如上文所讨论，取决于待治疗的疾病状况，鉴定和靶向非自身抗原决定簇可能并不总是可能的。
本文中提及针对“第一”抗原决定簇和“第二”抗原决定簇的TCR/CAR受体应理解为提及下述事实，即主题受体针对两个不同的抗原区。然而，在这方面，应当理解，受体可以针对两个完全不同的细胞表面分子上的表位，或者受体可以针对相同细胞表面分子的两个不同区域/表位。在提及与多个CAR一起的TCR或者提及具有一个或多个CAR和一个或多个抗原结合受体的TCR的实施方案中，应当理解，每个受体针对抗原决定簇，并且抗原决定簇优选彼此不同，即对应于相同或不同分子的不同表位区域的抗原决定簇。
因此，在一个实施方案中，提供了经遗传修饰的哺乳动物干细胞或从其分化的T细胞，所述细胞表达至少一种纯合HLA单元型，能够分化成表达针对第一抗原决定簇的TCR的T细胞并且包含编码嵌合抗原受体的至少一种(即一种或多种)核酸分子，其中所述受体包含针对第二抗原决定簇的抗原识别部分，该抗原识别部分可操作连接至T细胞活化部分并且任选地还包含编码针对第三抗原决定簇的抗原结合受体的核酸，并且其中所述抗原决定簇选自肿瘤抗原、微生物抗原或自体反应性免疫细胞抗原。
在一个实施方案中，所述干细胞是iPSC。在另一个实施方案中，干细胞是HSC。
在又一个实施方案中，所述干细胞能够分化成CD4+T细胞或CD8+T细胞。
在又一个实施方案中，所述TCR是αβTCR。
在又一个实施方案中，所述干细胞诸如衍生自T细胞或胸腺细胞的iPSC，优选CD8+T细胞或胸腺细胞。
如本领域技术人员将理解的，鉴定肿瘤专有的抗原是重要的研究领域，但在这方面进展有限。由于肿瘤细胞通常是自身细胞(与例如由移植组织产生的肿瘤相反)，情况是它们表达的抗原不仅是自身抗原，而且还可能由衍生肿瘤的组织的非新生物细胞表达。由于可以当抗新生物治疗方案针对此类抗原时产生，但是不可避免的副作用(就非新生物组织的破坏而言)，这显然不太理想。尽管如此，已经在鉴定靶肿瘤抗原方面取得了一些进展，所述靶肿瘤抗原即使不仅由肿瘤细胞表达，也以较低水平表达，或者在其它情况下在非新生物细胞上不太频繁表达。
本发明的抗原结合部分的选择将取决于待治疗的癌症的特定类型。肿瘤抗原是本领域中公知的，并且包括例如MAGE、LMP-2、CD19、CD20、WT1、MART-1胶质瘤相关抗原、癌胚抗原(CEA)、β-人绒毛膜促性腺激素、肿瘤相关糖蛋白72(TAG 72)、甲胎蛋白(AFP)、凝集素-反应性AFP、甲状腺球蛋白、RAGE-1、MN-CA IX、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2(AS)、肠羧基酯酶、mut hsp70-2、M-CSF、Prostase、前列腺特异性抗原(PSA)、PAP、NY-ESO-1、LAGE-la、p53、Prostein、PSMA、Her2/neu、存活蛋白和端粒末端转移酶、前列腺癌肿瘤抗原-1(PCTA-1)、ELF2M、嗜中性粒细胞弹性蛋白酶、ephrinB2、CD22、胰岛素生长因子(IGF)-I、IGF-II、IGF-I受体和间皮素。CD47(“不吃我(don’t eat me)”受体)也是一种肿瘤靶物，因为它与正常细胞相比通常在癌细胞中高度表达，并且防止这些癌细胞受到免疫系统细胞的攻击，包括且特别是清扫巨噬细胞(scavenger macrophages)。
在一个实施方案中，肿瘤抗原包含与恶性肿瘤相关的一个或多个表位。恶性肿瘤表达许多可以充当免疫攻击的靶抗原的蛋白质。这些分子包括但不限于组织特异性抗原如黑素瘤中的MART-1、WT-1、酪氨酸酶和GP100和前列腺癌中的前列腺酸性磷酸酶(PAP)和前列腺特异性抗原(PSA)。其它靶分子属于转化相关分子组，如癌基因HER-2/Neu/ErbB-2。另一组靶抗原是癌胚抗原，如癌胚抗原(CEA)。在B细胞淋巴瘤中，肿瘤特异性独特型免疫球蛋白构成对个体肿瘤独特的真正的肿瘤特异性免疫球蛋白抗原。B-细胞分化抗原如CD19、CD20和CD37是B-细胞淋巴瘤中靶抗原的其它候选物。
抗原的非限制性实例包括以下：分化抗原如MART-1/MelanA(MART-I)、gplOO(Pmel17)、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2和肿瘤特异性多谱系抗原诸如MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、pl5；过表达胚胎抗原如CEA；过表达癌基因和突变肿瘤抑制基因，如p53、Ras、HER-2/neu；源自染色体易位的独特肿瘤抗原；如BCR-ABL、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR；和病毒抗原，如埃巴病毒抗原EBVA和人乳头瘤病毒(HPV)抗原E6和E7。基于蛋白质的其它大抗原包括CD47、TSP-180、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、RAGE、NY-ESO、pl 85erbB2、pl80erbB-3、cMet、nm-23Hl、PSA、TAG-72、CA 19-9、CA 72-4、CAM 17.1、NuMa、K-ras、β-连环蛋白、CDK4、Mum-1、p 15、p 16、43-9F、5T4、791Tgp72、甲胎蛋白、β-HCG、BCA225、BTAA、CA 125、CA 15-3\CA 27.29\BCAA、CA 195、CA 242、CA-50、CAM43、CD68\P1、CO-029、FGF-5、G250、Ga733\EpCAM、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV 18、NB/70K、NY-CO-1、RCAS 1、SDCCAG16、TA-90\Mac-2结合蛋白\亲环蛋白C-相关蛋白、TAAL6、TAG72、TLP、和TPS。
本发明的细胞设计为针对多种，即两种或更多种抗原决定簇。如本文详述的，在一些实施方案中，多种抗原决定簇可以是或包括一个分子的多个表位，或者在其它实施方案中，多个完全独特的分子的表位。选择应当靶向哪些多个抗原决定簇以及进一步它们是否应当由TCR或CAR靶向在本领域技术人员的技术内。在一个实施方案中，设计本发明的细胞以清除肿瘤细胞，并且所述TCR/CAR针对肿瘤抗原，特别是TAG 72、MAGE和WT1。在另一个实施方案中，所述细胞设计成清除自体反应性免疫细胞，并且所述TCR/CAR针对独特型T细胞或B细胞受体。
因此，在一个实施方案中，提供了经遗传修饰的哺乳动物干细胞或从其分化的T细胞，所述细胞能够分化成表达针对第一肿瘤抗原决定簇的TCR的T细胞，并且包含编码一种或多种嵌合抗原受体的一种或多种核酸分子，其中每种嵌合抗原受体包含针对肿瘤抗原决定簇的抗原识别部分，该抗原识别部分可操作连接至T细胞活化部分，并且其中所述抗原决定簇选自TAG 72、CD47、CD19、WT-1、MAGE和EBVLMP2。
优选地，所述经遗传修饰的细胞针对TAG72和WT-1。还更优选地，所述CAR针对TAG72和CD47，并且所述TCR针对WT-1。
在一个实施方案中，所述干细胞是iPSC。在另一个实施方案中，干细胞是HSC。
在又一个实施方案中，所述干细胞能够分化成CD4+T细胞或CD8+T细胞。
在又一个实施方案中，所述TCR是αβTCR。
在又一个实施方案中，所述干细胞(如iPSC)衍生自T细胞或胸腺细胞，优选CD8+T细胞或胸腺细胞。
就本发明的细胞在一个实施方案中针对治疗新生物形成而言，已经开发出一大批CAR以靶向已知的肿瘤抗原。以下表5中提供了例示这些CAR中的一些以及受体结构的非限制性概述：
表5
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在一些实施方案中，CAR包含由针对CD19或TAG-72的scFv组成的抗原识别域、和都衍生自CD28或CD8的铰链(茎)区和跨膜区、和胞质内域，所述胞质内域也衍生自CD28或CD8并且包含T细胞活化部分。CAR可以包含作为C端多肽延伸的报告蛋白(例如EGFP)，其通过P2A自切割多肽连接在一起以在翻译后释放EGFP。参见例如图11和14。
在相关方面，已经进一步确定了若本发明的细胞工程化改造为表达非信号转导抗原结合受体，例如不能实现信号转导的CD47结合分子，则可以使它们特别有效。CD47结合分子在细胞表面上的表达将本发明的细胞锚定于其所针对的新生物细胞，由此促进TCR和CAR与其各自的配体的改善的相互作用。就实体瘤的治疗而言，具体地，相对于不表达主题CD47结合分子的细胞，就新生物细胞杀伤而言，主题细胞相互作用的增加的稳定性和结合亲和力实现改善的功能结果。
因此，在本发明的相关方面中，提供了经遗传修饰的哺乳动物干细胞或从其分化的T细胞，所述细胞能够分化成表达针对第一抗原决定簇的TCR的T细胞，并且包含(i)编码嵌合抗原受体的核酸分子，其中所述受体包含针对第二抗原决定簇的抗原识别部分，所述抗原识别部分可操作连接至T细胞活化部分，和(ii)编码非信号传导抗原结合受体，如非信号传导CD47结合受体的核酸分子。在一些实施方案中，经遗传修饰的哺乳动物干细胞表达至少一种纯合HLA单元型。
在不将本发明限制于任何一种理论或作用模式的情况下，CD47(也称为整联蛋白相关蛋白)是在人中由CD47基因编码的跨膜蛋白。CD47属于免疫球蛋白超家族。CD47参与一系列细胞过程，包括凋亡、增殖、粘附和迁移。此外，它在免疫和血管生成应答中起关键作用。CD47在人细胞中普遍表达，并已经发现在许多不同的肿瘤细胞中过表达。
CD47是50kDa膜受体，其包含胞外N-端IgV域、5个跨膜域和短C-端胞内尾部。有CD47的四种可变剪接同种型，它们的不同之处仅在于其胞质尾部的长度。形式2是在所有循环和免疫细胞中发现的最广泛表达的形式。第二种最丰富的同种型是形式4，其主要在脑和周围神经系统中表达。仅角质形成细胞表达显著量的形式1。这些同种型在小鼠和人之间高度保守，提示CD47功能中胞质域的重要作用。
CD47是凝血酶敏感蛋白(thrombospondin)-1(TSP-1)的受体，其是在血管发育和血管发生中起作用的分泌性糖蛋白。TSP-1与CD47的结合影响几种基本的细胞功能，包括细胞迁移和粘附、细胞增殖或凋亡，并在调节血管生成和炎症中起作用。CD47也与信号调节蛋白α(SIRPα)相互作用，SIRPα是存在于髓样细胞上的抑制性跨膜受体。CD47/SIRPα相互作用导致双向信号传导，导致不同的细胞间应答，包括抑制吞噬(促进癌细胞逃逸)、刺激细胞-细胞融合和T细胞活化。更进一步地，CD47与几种膜整联蛋白相互作用，最常见的是整联蛋白avb3。这些相互作用导致CD47/整合蛋白复合物，其影响一系列细胞功能，包括粘附、扩散和迁移。
然而，尽管CD47普遍表达，但已经确定了在新生物细胞上CD47的表达水平的升高足以促进在对非新生物细胞的任何实质性不利影响之前促进改善的对靶向CD47的分子的响应性以及靶向CD47的分子对所述新生物细胞的清除。
提及针对CD47的“结合受体”应当理解为提及与CD47相互作用的任何受体。这可以采取CD47结合受体的形式，如表面展示的抗体片段，并且优选缺乏信号传导功能。
根据此实施方案，提供了经遗传修饰的哺乳动物干细胞或从其分化的T细胞，所述细胞能够分化成表达针对第一抗原决定簇的TCR的T细胞，并且包含(i)编码嵌合抗原受体的核酸分子，其中所述受体包含针对第二抗原决定簇的抗原识别部分，所述抗原识别部分可操作连接至T细胞活化部分，和(ii)编码非信号转导抗原结合受体的核酸分子，其中所述受体包含针对CD47的抗原识别部分。在一些实施方案中，经遗传修饰的哺乳动物干细胞表达至少一种纯合HLA单元型。
如上文详述，主题CD47结合受体是非信号传导受体。“非信号传导”意指在主题受体与靶细胞上的CD47结合后，没有会对本发明的细胞的功能性实现变化的传递信号。相反，CD47结合受体的目的是提供主题细胞对靶细胞的改善的锚定，由此改善针对靶抗原部分如肿瘤抗原部分的CAR和TCR的结合的有效性。
例如，在非信号传导抗原结合受体的一种设计中，受体的胞外域包含对CD47具有结合特异性的抗原识别部分、铰链(茎)域、跨膜域和胞内域，其完全缺乏胞质信号传导功能。此类非信号传导CD47结合受体可以简单地用于附着，而不是用于信号传导，因此它可以通过CD47结合驱动T细胞对接癌细胞，并且若与正常CD47表达细胞结合，则没有不想要的活化和杀伤。
在一些实施方案中，非信号传导CD47结合受体的抗原识别部分包括抗体样域诸如scFv、Fv、Fab等和任何CD47靶向V域，包括单一人和哺乳动物V域和其等同物(VhH或vNAR)域，或者可以包括本领域公知的“基于蛋白质的备选靶向支架”，包括但不限于Darpins、Anticalins、Knottin、ImmE7s、Affibodies、Fn3纤连蛋白域等。抗原识别部分还可以包括SIRPα(CD47的天然配体)的一个或多个V样域。在一个实施方案中，抗原识别部分可以包括SIRPα的一个天然V样域。在另一个实施方案中，抗原识别部分可以包括SIRPα的全部三个天然V样域。在其它实施方案中，适用于在非信号传导CD47结合受体中提供抗原识别部分的分子是Hu5F9-G4 scFv分子(在美国专利申请序列号14/656,431中描述)。Hu5F9已经设计为有3种不同形式的VH(1、2、3)和3种不同形式的VL(11、12、13)，如美国专利申请序列号14/656,431的图12A，12B中所示，其公开为US 20150183874 A1。Liu等(PLOS One(2015)Sep21；10(9):e0137345)描述了Hu5F9-G4，其中所选择的V-域是框架中包含4个独特的残基变化(区分VH-2与VH-1、3)的重VH-2和框架中包含2个独特的残基变化(区分VL-12与VL-11、13区)的轻链VL-12。
在一些实施方案中，非信号传导CD47结合受体的铰链区可以是天然SIRPα铰链序列，或如CAR中典型使用的CD8或CD28铰链，或本领域公知的备选铰链，例如CD4域或粘蛋白肽铰链。铰链区可以设计成包含一个或多个半胱氨酸(Cys)残基以允许受体的二聚化。CD28是通过茎区中的单个Cys连接的天然二聚体结构。因此，在使用CD28的茎区作为非信号传导CD47结合受体的铰链的情况下，导入另外的Cys可能不是必需的，但可以为二聚体提供另外的稳定性。
本领域技术人员将理解，将编码CAR和非信号传导抗原结合受体(诸如非信号传导CD47结合受体)的核酸导入细胞(例如T细胞或iPSC)可以使用两个分开的转染载体或单个双顺反子载体或编码内部切割信号将CAR与抗原结合受体分开的单一基因来实现。在一个实施方案中，内部切割信号是P2A，指导自切割以将CAR与抗原结合受体分开的肽序列。在一个具体的实施方案中，非信号传导CD47结合受体表达为CAR的C端延伸并且被P2A自切割肽分开以在翻译后分开CAR和CD47结合受体。
用于修饰本发明的干细胞，使得其也表达非信号传导CD47结合分子的手段已经在上文中就实现针对肿瘤抗原部分的嵌合抗原受体的表达而言相当详细描述。技术人员将理解本文描述的实现受体表达的转染和其它方法同样适用于主题CD47结合分子的情况。
在一个实施方案中，所述干细胞是iPSC。在另一个实施方案中，所述干细胞是HSC。
在另一个实施方案中，所述干细胞能够分化成CD4+T细胞或CD8+T细胞。
在又一个实施方案中，所述TCR是αβTCR。
在又一个实施方案中，所述干细胞如iPSC衍生自T细胞或胸腺细胞，优选CD8+T细胞或胸腺细胞，并且在一些实施方案中，具有针对肿瘤抗原的内源TCR的CD8+T细胞或胸腺细胞。
在又一个实施方案中，所述干细胞针对TAG 72和WT 1。还更优选地，所述CAR针对TAG 72并且所述TCR针对WT 1。
在进一步的方面中，提供了生成经遗传修饰的哺乳动物干细胞的方法。上文已经描述了用于生成经遗传修饰的哺乳动物干细胞，特别是iPSC的各种手段。
另一方面，提供了表达针对第一抗原决定簇的TCR和嵌合抗原受体的T细胞，其中所述受体包含针对第二抗原决定簇的抗原识别部分，该抗原识别部分可操作连接至T细胞活化部分。在一些实施方案中，T细胞表达至少一种纯合的HLA单元型。
在一个实施方案中，T细胞表达多种嵌合抗原受体，其中每种嵌合抗原受体包含针对抗原决定簇的抗原识别部分，该抗原识别部分可操作连接至T细胞活化部分。
在一个实施方案中，多个嵌合抗原受体针对的多种抗原决定簇各自不同于在主题T细胞上表达的TCR针对的所述第一抗原决定簇。在另一个实施方案中，多个嵌合抗原受体针对的多种抗原决定簇彼此不同，并且也不同于在主题T细胞上表达的TCR针对的所述第一抗原决定簇。
在一个实施方案中，多个CAR由一个连续的核酸片段编码。例如，多个CAR由置于一个载体中的多个核酸编码，将所述载体转染到细胞中以最终产生主题T细胞。在一个具体的实施方案中，多个CAR编码核酸可以在一个表达单元和阅读框内彼此连接(例如，通过利用自切割肽如P2A)，使得最初产生包含多个CAR多肽序列的一个单一多肽并随后处理以提供多个CAR。在另一个实施方案中，将多个CAR编码核酸置于分开的载体中，所述载体用于转染以产生主题T细胞。
在另一个实施方案中，表达一种或多种CAR的T细胞还表达至少一种(即一种或多种)抗原结合受体，其包含针对第三抗原决定簇的抗原识别部分。
在一个实施方案中，抗原结合受体是非信号传导抗原结合受体；即受体锚定到主题T细胞的细胞表面并与第三抗原决定簇结合，但不将信号转导到T细胞的胞质部分，其会影响T细胞的功能(因此也称为作为非T细胞信号传导抗原结合受体)。在一个实施方案中，抗原结合受体包含针对第三抗原决定簇的抗原识别部分，其与跨膜域可操作连接，但缺少T细胞活化部分。
在具体的实施方案中，抗原结合受体是针对CD47的非信号传导抗原结合受体。例如，抗原结合受体是非信号传导的CD47结合分子。
在一些实施方案中，本文提供的T细胞是CD4+。在其它实施方案中，T细胞是CD8+。
在一些实施方案中，本文提供的T细胞表达αβTCR。在其它实施方案中，本文提供的T细胞表达γδTCR。
在一些实施方案中，主题T细胞针对的多种抗原决定簇，即TCR所针对的第一抗原决定簇、嵌合抗原受体所针对的抗原决定簇、和抗原结合受体所针对的抗原决定簇(若存在此类抗原结合受体的话)可以选自肿瘤抗原、微生物抗原、或自体反应性免疫细胞抗原。在某些实施方案中，抗原决定簇选自肿瘤抗原。在具体的实施方案中，TCR所针对的抗原决定簇选自TCR识别的肽如WT-1或EbvLMP2。在其它具体的实施方案中，嵌合抗原受体和抗原结合受体所针对的抗原决定簇可以选自例如TAG-72、CD19、MAGE、或CD47。
在一些实施方案中，主题T细胞衍生自iPSC或HSC，所述主题T细胞表达针对第一抗原决定簇的TCR，并表达包含针对第二抗原决定簇的抗原识别部分的嵌合抗原受体，所述抗原识别部分可操作连接至T细胞活化部分。
在一个实施方案中，衍生主题T细胞的iPSC或HSC是经遗传修饰的iPSC或HSC，其能够分化成表达针对所述第一抗原决定簇的TCR的T细胞，并且包含编码一种或多种嵌合抗原受体的一种或多种核酸，并且任选地包含编码抗原结合受体的一种或多种核酸。在另一个实施方案中，衍生主题T细胞的iPSC或HSC能够分化成表达T细胞，所述T细胞表达针对所述第一抗原决定簇的TCR；并且在iPSC或HSC已经分化成T细胞后导入编码一种或多种嵌合抗原受体的一种或多种核酸，和任选地编码抗原结合受体的一种或多种核酸。在一些实施方案中，衍生主题T细胞的iPSC或HSC表达至少一种HLA单元型，并且衍生自此类iPSC或HSC的T细胞也表达所述至少一种HLA单元型。
在一个实施方案中，衍生主题T细胞的iPSC本身衍生自T细胞或胸腺细胞。在一个实施方案中，iPSC衍生自CD8+T细胞或胸腺细胞。在一个实施方案中，iPSC衍生自T细胞或胸腺细胞，其表达针对第一抗原决定簇的TCR，即衍生自iPSC的主题T细胞的TCR针对的相同抗原决定簇。
本发明细胞的价值预示着指导主体干细胞分化成CD4+或CD8+T细胞。在这方面，提及“指导”干细胞向T细胞的分化应理解为指应用细胞培养系统，其诱导干细胞对T细胞谱系的定型和沿该谱系分化成成熟的T细胞。用于实现干细胞沿着T细胞谱系的定向分化的手段是本领域技术人员公知的。例如，并且如本文中例示，已知将Notch依赖性信号传导导入培养系统中实现干细胞沿着T细胞谱系的定向分化。此外，若在OP-9饲养细胞层上共培养的背景下对干细胞向干细胞提供此信号传导，则实现特别有效的分化。适合使用的Notch配体的实例包括但不限于δ-样1和δ-4。在这方面，OP-9细胞已经工程化改造为表达δ样1(OP9-DL1)，由此提供了从干细胞产生T细胞的非常方便的手段。在另一个实例中，并且如本文所例示，首先将主题干细胞在无饲养层条件下培养以产生中胚层，然后在OP9-DL1细胞系上共培养。本文例示了实现向CD8+T细胞的定向分化的特别优选的方法。
另一方面，提供了生成表达针对第一抗原决定簇的TCR并表达一种或多种CAR和任选地一种或多种抗原结合受体的T细胞的方法。在一些实施方案中，T细胞还表达至少一种纯合HLA单元型。
在一个实施方案中，所述方法包括获得能够分化成T细胞的经遗传修饰的干细胞(例如遗传修饰的iPSC或HSC)，所述T细胞表达针对第一抗原决定簇的TCR，并且包含编码一种或多种各自针对抗原决定簇(优选不同于第一抗原决定簇)的嵌合抗原受体的一个或多种核酸，并且任选地还包含编码一种或多种各种针对抗原决定簇(优选不同于第一抗原决定簇)的抗原结合受体的一种或多种核酸；并将此类经遗传修饰的干细胞分化成T细胞。在一些实施方案中，经遗传修饰的干细胞还表达至少一种纯合的HLA单元型。
在另一个实施方案中，该方法包括获得能够分化成表达针对第一抗原决定簇的TCR的T细胞的干细胞(例如iPSC或HSC)；将干细胞分化成T细胞；对T细胞导入编码一种或多种嵌合抗原受体的一种或多种核酸，每种嵌合抗原受体针对抗原决定簇(优选不同于第一抗原决定簇)，并且任选地还导致编码一种或多种抗原结合受体的一种或多种核酸，每种抗原结合受体针对抗原决定簇(优选不同于第一抗原决定簇)。在一些实施方案中，经遗传修饰的干细胞(例如iPSC或HSC)也表达至少一种纯合HLA单元型。
无论将编码CAR的核酸在分化成T细胞之前导入干细胞，还是在从干细胞分化后导入T细胞中，干细胞(如iPSC)自身可以是衍生自T细胞或胸腺细胞。此类T细胞和胸腺细胞可以具有对名义抗原(例如肿瘤抗原)特异的TCR。在一个实施方案中，干细胞是iPSC。在一个实施方案中，iPSC衍生自CD8+T细胞或胸腺细胞。在另一个实施方案中，iPSC衍生自表达TCR的T细胞或胸腺细胞，所述TCR针对衍生自iPSC的T细胞表达的TCR针对的相同抗原决定簇。
提及“哺乳动物”应当理解为包括提及哺乳动物，例如但不限于人、灵长类、家畜动物(例如绵羊、牛、马、驴、猪)、伴侣动物(例如狗、猫)、实验室试验动物(例如小鼠、兔、大鼠、豚鼠、仓鼠)、圈养的野生动物(例如狐狸、鹿)。优选地，哺乳动物是人或灵长类。最优选地，哺乳动物是人。
本发明的开发现促进了用于治疗以不想要的细胞群体如新生物细胞群体、病毒感染的细胞、自体反应性免疫细胞或微生物如抗生素抗性细菌感染的存在为特征的疾病状况的手段的开发。更具体地，本发明的细胞提供了以比目前高度非特异性方法以更为靶向的方式清除这些细胞的手段，所述高度非特异性方法诸如治疗新生物状况的化学疗法、治疗自身免疫性疾病症状的抗炎疗法或管理自身免疫的免疫抑制。在这方面，提及“以不想要的细胞群体的存在为特征的”疾病状况应当理解为提及下述任何状况，所述状况的症状或病因是可以凭借表达的细胞表面抗原靶向的细胞群体的存在或功能发挥，并且一些或所有所述细胞的消除对于患者会是有益的。通过施用从本发明的干细胞分化的T细胞来实现主题状况的治疗，所述T细胞是TCR/CAR的双重TCR/CAR针对由寻求被清除的细胞表达的两种或更多种抗原决定簇。
应当理解，寻求由本发明的T细胞清除的“细胞”可以是任何细胞，无论是自身的还是非自身的。例如，就本发明的T细胞设计用于治疗诸如新生物形成、病毒感染或自身免疫疾病的疾病状况而言，寻求清除的靶细胞群体是自身细胞。然而，就寻求治疗的状况例如是由微生物如抗生素抗性细菌或寄生物引起的感染而言，要清除的“细胞”是外来细胞。在这方面，细胞可以在悬浮液中(诸如存在于循环中的白血病细胞)，或者它们可以是块(例如肿瘤或组织)的一部分。就治疗的状况是微生物感染而言，细胞可以对应于单细胞微生物(诸如许多细菌)，或者它们可以是多细胞生物体的一部分。本发明的T细胞可用于靶向以任何形成类型存在的任何类型的细胞。
因此，本发明的另一方面涉及治疗哺乳动物中以不想要的细胞群体的存在为特征的状况的方法，所述方法包括对所述哺乳动物施用有效数目的如上文所定义的干细胞或从其分化的T细胞。
在一个实施方案中，所述状况是新生物状况、微生物感染(如HIV、STD或抗生素抗性细菌)或自身免疫状况。
在另一个实施方案中，所述干细胞是iPSC或HSC。
在又一个实施方案中，所述干细胞能够分化成CD4+T细胞或CD8+T细胞。
在又一个实施方案中，所述TCR是αβTCR。
在又一个实施方案中，所述干细胞如iPSC衍生自T细胞或胸腺细胞。
在又一个实施方案中，细胞还包含编码非信号转导抗原结合受体的核酸分子，其中所述受体包含针对CD47的抗原识别部分。
根据这些实施方案，在一个具体的方面中，提供了治疗新生物状况的方法，所述方法包括对所述哺乳动物施用有效数目的如上文所定义的干细胞或从其分化的T细胞，其中所述TCR针对第一种肿瘤抗原决定簇，并且所述CAR针对一种或多种另外的肿瘤抗原决定簇。
在一个实施方案中，所述第一肿瘤抗原决定簇是WT1。
在另一个实施方案中，所述第二种肿瘤抗原决定簇是TAG72。
在另一个实施方案中，细胞还包含编码非信号传导抗原结合受体的核酸分子，其中所述受体包含针对CD47的抗原识别部分。
在另一个实施方案中，经遗传修饰的干细胞还表达至少一种纯合的HLA单元型。
提及“新生物状况”应当理解为提及以新生物细胞的包囊或未包囊的生长或聚集体的存在为特征的状况。提及“新生物细胞”应当理解为提及表现出异常生长的细胞。术语“生长”应当在其最广的意义上理解，并且包括提及新生物细胞大小的扩大以及增殖。
在本背景中短语“异常生长”意图为指相对于正常细胞生长，表现出下列一种或多种的细胞生长：单独细胞大小和核/胞质比率增加、细胞分裂数速率增加、细胞分裂数目增加、细胞分裂时间段长度的减少、细胞分裂期频率增加或不受控制的增殖和逃避凋亡。在不以任何方式限制本发明的情况下，术语“新生物形成”的常见医学含义指由于对正常生长控制的响应性丧失所致的“新细胞生长”，例如，新生物细胞生长。新生物形成包括可以是良性，恶性前或恶性的“肿瘤”。术语“新生物”应当理解为指包含新生物细胞的损伤、肿瘤或其它包囊或未包囊的块或其它形式的生长或细胞聚集体。
在本发明的背景中，术语“新生物”应当理解为包括提及所有类型的癌性生长或致癌过程、转移性组织或恶性转化的细胞、组织或器官，而不管组织病理学类型或侵袭状态如何。
术语“癌”是本领域技术人员公认的，指上皮或内分泌组织的恶性，包括呼吸系统癌、胃肠系统癌、泌尿生殖系统癌、睾丸癌、乳腺癌、前列腺癌、内分泌系统癌和黑素瘤。该术语还包括癌肉瘤，例如其包括由癌性和肉瘤组织组成的恶性肿瘤。“腺癌”指衍生自腺体组织或其中肿瘤细胞形成可识别的腺体结构的癌。
构成新生物的新生物细胞可以是衍生自任何组织的任何细胞类型，如上皮细胞或非上皮细胞。本文中提及术语“恶性新生物”和“癌症”和“癌”应当理解为可互换。
术语“新生物”应当理解为提及包含新生物细胞的损伤、肿瘤或其它包囊或未包囊的块或其它形式的生长或细胞聚集体。构成新生物的新生物细胞可以是衍生自任何组织的任何细胞类型，如上皮细胞或非上皮细胞。由本发明涵盖的新生物和新生物细胞的实例包括但不限于中枢神经系统肿瘤、成视网膜细胞瘤、神经母细胞瘤、小儿肿瘤、头颈癌(例如鳞状细胞癌)、乳腺癌和前列腺癌、肺癌(小细胞肺癌和非小细胞肺癌两者)、肾癌(例如肾细胞腺癌)、食道胃癌、肝细胞癌、胰胆管新生物形成(例如腺癌和胰岛细胞瘤)、结肠直肠癌、宫颈癌和肛门癌、子宫癌和其它生殖道癌症、尿道癌(例如输尿管和膀胱癌)、生殖细胞肿瘤(例如睾丸生殖细胞肿瘤或卵巢生殖细胞肿瘤)、卵巢癌(例如卵巢上皮癌)、未知原发性癌、人免疫缺陷相关恶性(例如卡波西肉瘤)、淋巴瘤、白血病、恶素瘤、肉瘤、内分泌肿瘤(例如甲状腺肿瘤)、间皮瘤和其它胸膜或腹膜肿瘤、神经内分泌肿瘤和类癌肿瘤。
在一个具体的实施方案中，所述新生物状况是白血病或淋巴瘤。
在另一个实施方案中，所述新生物状况是转移性的。
进行治疗或预防的受试者可以是任何需要治疗或预防性处理的人或动物。在这方面，本文中提及“治疗”和“预防”将在其最广泛的背景中考虑。术语“治疗”不一定暗示将哺乳动物治疗到完全恢复。类似地，“预防”不一定意味着受试者最终不会感染疾病状况。因此，治疗和预防包括改善特定状况的症状或预防特定状况或以其它方式降低形成特定状况的风险。术语“预防”可以认为降低特定状况发作的严重性。“治疗”还可以降低现有状况的严重性。
因此，应当理解本发明包括减少或以其它方式改善哺乳动物中的状况。这应当理解为指减少或改善任何一种或多种疾病症状。尽管实现疾病治愈总是最理想的，但是在减缓疾病进展方面仍然具有显著的临床价值。例如，在诸如HIV或STD的病毒感染的情况下，即使不能完全治愈，病毒载量和传播程度的降低可以提供控制感染的手段，使得例如不经历严重的HIV免疫缺陷(其最终是致命的)，并且可以实现相对正常的寿命，而没有患者需要服用的目前抗病毒药物混合物特征性的严重副作用。在新生物状况的具体情况下，本发明的T细胞在向患者施用时下调新生物的生长。提及细胞或新生物的“生长”应当理解为提及主题细胞的增殖、分化和/或生存力的维持，而“下调细胞或新生物的生长”指细胞衰老的过程或减少、预防或抑制主题细胞的增殖、分化和/或存活力的维持。在一个优选实施方案中，主题生长是增殖并且主题下调是CD8+T细胞介导的杀伤。在这方面，可以通过减肿瘤块大小的降低或抑制肿瘤进一步生长或通过减缓肿瘤生长来证明杀伤。在这方面，并且在不将本发明限制于任何一种理论或作用模式的情况下，可以通过任何合适的机制，诸如直接裂解或细胞凋亡诱导或可以通过CD4+或CD8+T细胞，或缺乏这些CD4和CD8标志物的T细胞促进的一些其它机制来杀死新生物细胞。因此，应当理解本发明包括减少或以其它方式改善哺乳动物中的新生物状况。这应当理解为提及预防、减少或改善新生物状况的任何一种或多种症状。症状可以包括但不限于肿瘤生长部位处的疼痛或由于新生物状况导致的代谢或生理身体功能受损。应当理解的是，本发明的方法可以降低任何一种或多种症状的严重性或消除任何一种或多种症状的存在。本发明的方法还延伸至预防任何一种或多种症状的发作。
因此，本发明的方法在治疗和缓解方面都是有用的。为此，提及“治疗”应当理解为涵盖疗法和姑息治愈。如本领域技术人员将理解的，虽然治愈新生物状况总是最期望的结果，但是能够减缓或阻止肿瘤的进展仍然有显著的益处，即使它没有得到完全治愈。在不以任何方式限制本发明的情况下，存在一些新生物状况，若它们在细胞分裂方面充分下调，其对于患者而言不会是致命的，并且患者仍然可以具有合理的生活质量。更进一步，应当理解，本方法为现有的治疗方案提供了有用的替代方案。例如，在某些情况下，本方法的治疗结果可以与化学疗法或放射等同，但对患者的益处是治疗方案，其诱导较少的副作用或缩短的副作用期，并因此可以被患者好得多地耐受。如上文详述，还应当理解，术语“治疗”不一定暗示将受试者治疗到完全恢复。因此，如上文详述，治疗包括降低现有状况的严重性或改善特定病症的症状或缓解。在这方面，在治疗原发性肿瘤时应用本发明的治疗的情况下，其可以有效地发挥预防转移性癌症发作的预防剂的功能。例如，对于某些类型的实体瘤，手术切除肿瘤仍然可以是最期望的。然而，总是有可能未成功除去整个肿瘤，或者可能有一些新生物细胞逃脱的风险。在此种情况下，通过应用本发明的方法来裂解任何此类新生物细胞，方法有效应用为防止转移性扩散的预防剂。
根据本发明的此方面，主题细胞优选是自体细胞，其离体分离并遗传修饰，并移植回最初收获它们的个体中。然而，应当理解，本发明还扩展到使用衍生自任何其它合适来源的细胞，其中主题细胞表现出与作为治疗受试者的个体相似的组织相容性分布，使得受到宿主的免疫排斥前，转移的细胞可以进行其除去不想要的细胞的功能。因此，有效地，此类细胞是自体的，因为它们不会导致组织相容性问题，所述组织相容性问题通常与表现出外来MHC概况的细胞移植有关。此类细胞应当理解为落入组织相容性的定义内。例如，在某些情况下，可以期望、必需或具有实际意义的是，从遗传同卵双生(genetically identicaltwin)衍生的或从胚胎分离主题细胞，所述胚胎使用从受试者个体衍生的或从受试者个体克隆(在此种情况下，细胞可能对应于已经经历定向分化成合适的体细胞类型的干细胞)的配体产生。此类细胞的使用也可以工程化改造为表现出期望的主要组织相容性概况。此类细胞的使用克服了在组织和器官移植物的背景中固有遇到的困难。
然而，在分离或产生自体或组织相容性细胞是不可能或不可行的情况下，可以必需利用异基因细胞。“异基因”细胞是从与治疗的受试者相同的物种中分离，但表现出不同MHC概况的细胞。尽管在治疗学背景下使用这些细胞可以导致移植物抗宿主问题或宿主移植排斥，但是通过使用与治疗的受试者的MHC概况表现出相似性的MHC概况的细胞(诸如从亲属，诸如兄弟姐妹、父母或孩子分离/生成，或在其它情况下根据本文中示例的方法产生的细胞群体)使此问题最小化。
应当理解，在优选的实施方案中，使用的细胞是自体的。然而，由于给定情况的情形，产生自体干细胞群体体可以不总是可能的。这可以是由于诸如开始治疗的紧迫性或实现转化和定向分化的设施可用性等问题。在此情况下，并且如上文详述，可以期望或必需使用同基因或异基因细胞，如先前已转染并且作为细胞库中的冷冻原液可获得的细胞。尽管是同基因的，但是可以基于MHC单元型的表达选择此类细胞进行转化，所述MHC单元型比已知具有高免疫原性或者在其它情况下根据本文例示的方法生成的一些单元型表现出更低的免疫原性。
提及“有效数目”指至少部分获得期望的效果或延迟其发作，抑制所治疗的具体状况的发作或完全停止发作或进展所必需的细胞数目。当然，此类量将取决于所治疗的具体状况、状况的严重性和个体患者参数，包括年龄、身体状况、体格、体重、生理状态、并发治疗、医学史和与所讨论病症有关的参数。本领域技术人员无需过度实验能够确定构成有效剂量的本发明细胞的数目，以及其最佳施用模式，此后一种问题将在下文进一步讨论。这些因素对于本领域的普通技术人员而言是公知的，并且可以仅仅通过常规的实验来解决。通常优选使用最大细胞数目，即根据合理的医学判断的最高安全数目。然而，本领域普通技术人员将理解，可以出于医疗原因、心理原因或出于任何其它原因而施用较低的细胞数目。
如上文所讨论的，还应当理解，尽管本发明的方法基于将经遗传修饰的细胞导入患有如本文定义的状况的个体预测，但是下述情况可以是不必要的：导入个体的群体的每个细胞已经获得或将维持主题的修饰和分化。例如，在总共施用经转染且扩增的细胞群体(即未富集经成功修饰或分化的细胞)的情况下，可以存在一定比例的未获得或保留遗传修饰和/或期望的T的细胞细胞分化的细胞群体。因此，若由此导入的细胞的相关部分构成如上定义的“有效数目”，则实现本发明。然而，在特别优选的实施方案中，经历分化的细胞群体体将进行经成功修饰且分化的细胞的鉴定、其选择性分离。
在本发明的此方面的背景下，主题细胞需要导入受试者个体。为此，可以通过任何合适的方法导入细胞。例如，可以通过直接注射或在血液块内部导入细胞悬浮液，由此将细胞固定在凝块上，从而促进移植。也可以通过手术植入来导入细胞。例如，在细胞以组织移植物的形式存在的情况下，这可能是必需的。移植部位可以是任何合适的部位，例如皮下。在不将本发明限制于任何一种理论或作用模式的情况下，在细胞作为包囊细胞悬液施用的情况下，细胞将聚结成块。还应当理解细胞可以在移植后继续分裂。在这方面，如上文所述，导入自杀基因提供了控制正在进行的分裂的便利手段。
对患者施用的细胞可以通过任何合适的途径以单剂或多剂施用。优选地，并且在可能的情况下，使用单次施用。取决于所需要的治疗类型，可以将通过注射的施用引导至组织或器官的各个区域。
根据本发明的方法，可以与导入经转染细胞的共同施用其它蛋白质性或非蛋白质性分子。“共施用”指经由相同或不同途径或经由相同或不同途径的连续施用在相同制剂或不同制剂中同时施用。“顺序”施用指移植这些细胞和施用蛋白质性或非蛋白质性分子之间的秒、分钟、小时或天的时间差。例如，取决于所治疗状况的性质，可以有必要将患者维持服药过程以减轻状况的症状，直到移植细胞变得完整并且功能完全(例如，在HIV患者的情况下施用抗病毒药物)。或者，在治疗状况时，可以有必要开始长期使用药物以防止状的再发生。例如，在受试者损伤由自身免疫性疾病引起的情况下，一旦自体反应细胞受到了破坏，可以需要继续使用低水平的免疫抑制药物。
还应当理解，本发明的方法可以单独进行以治疗所讨论的状况，或者它可以与一种或多种设计用于促进或提升主题治疗的另外的技术一起进行。如上文详述，这些另外的技术可以采用其它蛋白质性或非蛋白质性分子或手术的共施用的形式。
本发明的又一方面涉及如上文所定义的干细胞或从其分化的T细胞在制备药物中的用途，所述药物用于治疗哺乳动物中以不想要的细胞群体的存在为特征的状况。
在另一个实施方案中，所述干细胞是iPSC或HSC。
在又一个实施方案中，所述干细胞能够分化成CD4+T细胞或CD8+T细胞。
在又一个实施方案中，所述TCR是αβTCR。
在又一个实施方案中，所述干细胞如iPSC衍生自T细胞或胸腺细胞，优选CD8+T细胞或胸腺细胞。
在又一个实施方案中，细胞还包含编码非信号传导抗原结合受体的核酸分子，其中所述受体包含针对CD47的抗原识别部分。
本文中提及“细胞”应当理解为指分离的细胞或分离的或基本上纯化的细胞群体。就细胞群体而言，“基本上纯的”指相关的细胞类型占细胞群体中的所有细胞的至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更高的百分比。例如，若此类T细胞占细胞群体中的细胞的至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更高百分比，则细胞群体对于相关T细胞是基本上纯的。
通过参考以下非限制性实施例进一步描述本发明。
实施例
通过以下实施例进一步阐述本发明，所述实施例证明本发明的某些实施方案的形成，包括衍生自iPSC细胞或HSC的双重抗癌特异性T细胞。这些实施例绝不应当解释为限制性的。
实施例1：从血液富集癌肽抗原特异性T细胞
WT-1特异性TCR T细胞刺激和扩增
WT-1特异性T细胞在正常人血液中非常罕见，但是可以扩增和富集以便检测。在此背景下，使用Ficoll-Hypaque密度梯度离心分离外周血单个核细胞(PBMC)。将新鲜分离的PBMC再悬浮于补充有人AB血清、L-谷氨酰胺和CD28单克隆抗体的组织培养基中，所述CD28单克隆抗体在WT-1存在时作用为T细胞的共刺激剂；单独的抗CD28不活化T细胞。然后，对于四种WT-1肽中的每种，以0.6ml/ml用威尔曼氏瘤1(WT-1)肽刺激PBMC过夜：WT-137(VLDFAPPGA、SEQ ID NO:22)、WT-1126(RMFPNAPYL、SEQ ID NO:23)、WT-1187(SLGEQQYSV、SEQID NO:24)、和WT-1235(CMTWNQMNL、SEQ ID NO:25)，其代表主要HLA I类结合基序。本申请实施例中呈现的数据使用WT-1肽1-37作为此WT-1肽家族的代表。可以用HLA-WT-1特异性四聚体或通过经刺激但不静息的T细胞上表面分子CD137的早期诱导来鉴定WT-1特异性T细胞。CD137是肿瘤坏死因子(TNF)受体家族的成员。它也称为4-1BB。24-36小时后，使用磁性细胞分离器磁性分离CD137阳性细胞(即经WT-1刺激的T细胞)。在补充有人AB血清、重组白细胞介素7、白细胞介素15和白细胞介素21的X-Vivo-15基础培养基组成的T细胞扩增培养基中培养CD137阳性(WT-1特异性TCR)细胞。相应的CD137阴性细胞进一步进行CD3磁分离。CD3阴性细胞(主要是B细胞)进行丝裂霉素C处理，并作为加载有WT-1肽的抗原呈递饲养细胞用于诱导的CD137阳性群体，而将剩余的CD3阳性细胞(非WT-1特异性)在培养物中培养以作为用于下游功能测定的对照T细胞类型。每隔一天补充具有重组细胞因子的培养基。
对于流式细胞术分析，将细胞重悬浮于FAC缓冲液中：每106个细胞30μl。在室温将10μl FcR封闭剂加入细胞5分钟。加入10μl HLA-A02 WT-1四聚体，并在4℃避光温育细胞20分钟。加入50μl“T细胞活化”混合物，在4℃避光温育细胞20分钟。加入100μl FAC缓冲液加2μl Aqua Amine，并温育细胞5分钟，随后以150xg离心5分钟。吸出或倾去上清液，并且将沉淀物重悬于每个样品100μl BD Cytofix/Cytoperm溶液中，并且在4℃温育细胞20分钟。在BD/Perm清洗液中清洗细胞。将IFN-γ抗体在BD/Perm清洗溶液中以1/100稀释，并在4℃在黑暗中与细胞温育30分钟。在BD/Perm清洗液中清洗细胞，并重悬于FAC缓冲液中，之后流式细胞术分析。在Miltenyi Quant细胞仪上完成FACS数据采集。
具有对WT-1肽特异性的TCR的T细胞通常频率非常低(例如Schmeid等人(2015))显示它们是每10-6个CD8+细胞的少至1个(范围为3x10-7-3x10-6个细胞)。在上文描述的刺激方案后，WT-1TCR特异性T细胞增加约100倍至约3.0％(WT-1患者#1 1.5％；WT-1患者#24.0％；图1)。
WT-1TCR T细胞的功能分析
另外用自体抗原呈递细胞(用EBV转化的B细胞)刺激体外扩增的T细胞并用一批WT-1肽引发：WT-137(VLDFAPPGA)、WT-1126(RMFPNAPYL)、WT-1187(SLGEQQYSV)、和WT-1235(CMTWNQMNL)。使用荧光珠测定法通过流式细胞术检测T细胞的干扰素γ(IFNγ)产生。通过与WT-1肽-HLA四聚体结合针对WT-1肽特异性对细胞双重标记(参见图2)。
经WT-1刺激的T细胞清楚地表达(80-90％)干扰素γ(IFNγ)(图2)，其是T细胞功能的公认测量(例如Ghanekar等(2001))。为了潜在地提高CD8 T细胞活化水平(靶向WT-1T细胞)，使用LAG3抑制剂IMP321。LAG3通常是“检查点阻断”，抑制树突细胞(DC)的刺激功能和CD8 T细胞对作为抗原呈递细胞的DC的应答。当添加到WT-1特异性T细胞活化测定时，在24小时没有IMP 321效果，但在4天后，存在罕见的CD8+WT-1特异性TCR T细胞倍增(图2H)。
实施例2：从人血液T细胞产生iPSC
为了从人血液T细胞衍生iPSC，存在着许多方法，所述方法具有初始T细胞特性的不同程度的忠实保留。已经从来自正常健康人的外周血T淋巴细胞合并物(T-iPSC)的广泛全集产生iPSC。例如，用丝裂原PHA或抗CD3和抗CD28抗体对T细胞进行预活化。使用各自含有Yamanaka重编程因子(Oct4、Sox 2、KLF、cMyc)种两种的双重逆转录病毒载体盒，产生在细胞和分子水平验证的多个T-iPSC克隆，包括针对一批标志物的流式细胞术和qRT-PCR，所述标志物包括Nanog、Oct3/4、SSEA 3,4、TRA-1-60和TRA-1-81。通过注射到NOD-SCID-IL共同γ链-/-(NSG小鼠)中后形成畸胎瘤来确认它们的多能性。通过显示TCR基因得以重排来确认T细胞起源的确认。
图3中总结了从WT-1特异性血液T细胞产生iPSC。
实施例3：从iPSC诱导人T细胞
本实施例显示从iPSC产生真正的T细胞。显示这些T细胞表达典型的T细胞，如通常由胸腺产生的T细胞的关键特征。显示了它们表达主流T细胞αβTCR和具有β和α链两者的CD8。
已经从自成体全液T细胞或预先选择的CD8+T细胞、或抗原特异性T细胞(例如那些对WT-1特异性的细胞)(T-iPSC)、或成体成纤维细胞衍生的iPSC诱导T细胞。特化到造血(造血干细胞或“HSC”)和部分地淋巴样谱系有两种基本阶段，通过在OP9细胞上培养进行；将这些培养的细胞转移至经遗传修饰以表达Notch信号传导分子δ样配体1(OP9-DL-L1)的OP细胞系以用于随后的T细胞分化诱导。
阶段1：制备OP9支持细胞和iPSC集落
第-8天：将经丝裂霉素处理的小鼠胚胎成纤维细胞饲养层在3mL MEF培养基(DMEM+15％FCS+1％pen/strep L-谷氨酰胺)中以0.3x106(14,250个细胞/cm2)铺板到经0.1％明胶包被的TC板上，并温育过夜。通过在11mL OP9培养基(MMEM+20％FCS+1％pen/strep)中以0.25x106个细胞铺板到经0.1％明胶包被的10cm TC板上来预制备OP9细胞。
第-7天：将iPS细胞解冻并铺板到MEF细胞上，并在37℃5％CO2培养7天。
阶段2：将iPSC转化为造血细胞
第0天：造血特化的开始。将iPS集落解离并铺板到OP9上进行HSC分化。逐滴添加菌落悬浮液以均匀分布到OP9平板上。在第1、5和9天添加新鲜的分化培养基。
第13天将经收获物诱导的HSC前体用于T细胞分化
通过胶原酶(工作溶液100μg/mL胶原酶/HBSS；37℃，达1:15小时)温和除去OP9细胞系上培养的细胞，并且通过胰蛋白酶/EDTA 0.05％在37℃进一步将集落破坏成单细胞达30分钟。温和清洗细胞并通过相差显微术(图4)和流式细胞术(图5)检查。通过流式细胞术确认细胞的造血特性(图5)。
阶段3：将iPSC衍生的HSC诱导成T细胞
第13天：诱导T细胞分化：将第13天OP9条件化(造血诱导的)细胞转移至OP9DL-L1细胞。
在一个优选的实施方案中，为了增强与OP9DL-L1细胞接触的效率，针对CD34+CD43+(HSC)纯化OP9条件化细胞，然后铺板到OP9 DLL-1细胞上，进行第一阶段的T细胞分化。本文公开的方法的关键组成是收集最初在OP9DL-L1细胞下生长的细胞。
将从OP9培养物收集的细胞重悬于T细胞分化培养基(OP9培养基，SCF 5ng/mL、Flt3 5ng/mL、IL-7 5ng/mL和维生素C 100μM)中，并将悬浮液逐滴加入到OP9 DLL-1细胞并在37℃温育。在OP9DL-L1上培养2、9、16、23和30天后收获细胞并进行流式细胞术分析(图6和图7)。
当检查这些培养物的T细胞发育时，有清楚的证据表明早期标志物CD7和CD9以及具有CD4和CD8表达的T细胞发育的之后的标志物的表达(图7)。即使在此早期阶段，已经有约10％的表达CD4+和CD8+两者的细胞；这些CD4+CD8+细胞是在胸腺皮质中正常发育的T细胞特征性的(Heng等(2010))。
流式细胞术显示从CD5、CD7+、然后是CD8+的初始表达的T细胞的逐渐发育。最重要的是，诱导的T细胞表达“最佳的、胸腺产生的”CD8T细胞的表型。除了CD8α链之外，它们还表达CD8β链(其它报道T细胞诱导系统不诱导最佳的信号传导CD8链；例如，Themeli等(2013))。作为功能的指示，它们还表达αβTCR与CD3。此外，与其它报道的系统中的第30天相比，这些细胞早在OP9DL-L1细胞上培养的第16天便存在。
阶段4成熟的T细胞的形成
再过7天后(在OP9细胞上总共13天，然后在OP DL-L1细胞上16天)，这些发育中的T细胞产生至关重要的转变以表达具有在CD3和αβTCR上明显呈阳性的CD8+T细胞的T细胞受体复合物；此外，这些细胞表达重要的CD8-这些是CAR-T期望的细胞。CD34+CD43+HSC有相应的进一步减少(图8)。
因此，此诱导系统在OP9细胞上培养13天，接着在OP9DL-L1细胞上培养16天后，成功地从iPSC产生成熟的CD8 T细胞。
使用上文描述的方法，从自身衍生自WT-1TCR CD8+T细胞的iPSC产生表达对WT-1特异性的TCR的T细胞(图9)。这些iPSC衍生的WT-1T细胞具有与衍生iPSC的原始T细胞等同的细胞毒性功能(图10)。
实施例4：CAR构建体的开发
嵌合抗原受体(CAR)-T细胞的成分是由scFv胞外域介导的CAR的抗原识别组分，由通过CD8或CD28铰链锚定的单链Fv(scFv)表示，并且包括跨膜(TM)区和通过胞质内域的CAR的信号转导-由CD28、4-1BB和CD3ζ(CD3ζ)链表示。还有两种合适的病毒传递系统-逆转录病毒和慢病毒。示例性的CAR和CD47结合受体构建体显示于图11中。
实施例5：嵌合抗原受体载体克隆策略
图12-13中显示了示例性的嵌合抗原受体载体克隆策略。图14显示了我们的第二代CAR和非信号传导抗CD47构建体的策略。嵌合抗原受体、非信号传导抗原结合受体及其各种域的示例性序列在SEQ ID NO:1-20中提供。
实施例6：T细胞的嵌合抗原受体转导
慢病毒生产
将293T细胞铺板到经聚-L-赖氨酸(Sigma)包被的175cm2烧瓶上。转染前两小时，用补充有10％FCS的DMEM替换培养基。将慢病毒转移载体DNA与包装和包膜质粒DNA一起组合，并与Lipofectamine2000混合。将溶液短暂涡旋振荡，并在室温温育30分钟。此后，将溶液再次混合，然后逐滴添加到细胞。将烧瓶返回培养箱。6小时后，添加新鲜生长培养基。48小时后收集病毒上清液，并通过在4℃以1500rpm离心5分钟澄清，然后通过0.45μm径PVDFMillex-HV滤器(Millipore)。使用超速离心用Sorval Discovery 100SE离心机使用AH-629转子进行慢病毒的浓缩。将30mL过滤的病毒上清液加入到36mL异质同晶聚合物锥形管(Beckman)中。以20000g离心90分钟。将上清液完全除去，并将病毒沉淀物重悬于300μL PBS中并贮存于-80℃直至使用。
CAR-T细胞的产生
图11和SEQ ID NO:1-6显示已经开发的一组嵌合抗原受体(CAR)和CD47结合受体构建体-具有对TAG 72或CD19特异性的scFv(作为阳性对照)。这些构建体使用人CD8或CD28作为铰链区和CD28、CD3ζ链或4-1BB胞质活化信号传导域。如前段所述，将CAR和CD47结合受体构建体克隆到慢病毒载体中。
T细胞的最佳慢病毒转导涉及它们在TCR和共刺激受体处的活化。因此，在第0天，通过来自健康供体的成分输血(apheresis)收集新鲜的PBMC，使用与顺磁珠(DynabeadsClinExVivo CD3/CD28，Invitrogen，Camarillo，CA，USA)结合的抗CD3和抗CD28抗体以3:1的比率(珠:细胞)富集活化的T细胞。将细胞和珠在室温共温育1小时，并且使用磁体(Invitrogen)进行CD3+细胞富集。将CD3+级分中的细胞以具有100IU/ml IL-2的T细胞扩增培养基中1x106个细胞/ml的浓度重悬于起始培养基中。在第1天，使用RetroNectin以2mg/cm2的浓度在10mg/mL的PBS溶液中在4℃下过夜包被细胞培养皿。在第2天，将RetroNectin溶液抽吸，并将相同体积的封闭溶液(由PBS中的0.5％人血清白蛋白组成)加入每个袋，并在室温温育30分钟。吸出封闭溶液，并用PBS清洗每个袋子。将慢病毒上清液迅速解冻，并添加到具有300IU/ml IL-2的T细胞增殖培养基的每个皿。将培养物放回培养箱并保持至少24小时。在第4天，停止转导；将细胞以0.5-1x106个细胞/mL的浓度重悬于新鲜T细胞增殖培养基中。将培养物维持至第14天，并每隔一天用新鲜扩增培养基补料以维持细胞浓度于1x106个细胞/mL。
首先将血液衍生的人T细胞进行CAR转导，所述CAR转导的成功通过流式细胞术测量，描绘了eGFP+细胞(图15)。通过Western印迹分析也确认了这点(图16)。
评估CAR-T细胞的功能。
对TAG-72CAR-T细胞(由正常PBMC创建)检查其体外杀死表达TAG72的靶细胞的能力。采用实时细胞监测系统(xCELLigence)测定CAR-T细胞体外杀伤效率。将10,000–2x106个靶细胞/100μL(例如TAG72+卵巢癌细胞系CaOV4)沉积到RTCA板中。在一些情况下，可能需要通过抗hCD40或通过人纤连蛋白预包被板将靶细胞栓系。在37℃、5％CO2将靶细胞维持3-12小时以允许细胞附着。在靶细胞附着后，以可变效应物:靶物比率(范围为1:1至10:1)加入CAR-T效应细胞。在一些实验中，在使用前通过FACS基于CAR-T细胞的GFP表达分离CAR-T效应细胞。在最佳生长条件下将共培养物维持至少12小时。在整个过程中监测细胞阻抗；阻抗下降指示细胞脱落以及最终细胞死亡。
图17显示了在40小时内监测的来自本实验的结果。在此时间段内卵巢癌细胞系CaOV4一致性生长(蓝线)。相比之下，补充有TAG-72特异性CAR T细胞的培养物显示比单独的靶细胞的初始生长期显著更少的初始生长期，随后随着时间逐渐消除靶细胞(紫色线)。为了克服由于CD3/CD28活化引起的非特异性杀伤，通过流式细胞术分离TAG 72CAR-T细胞并且与CD19 CAR-T细胞和非CAR-T细胞(没有先前的CD3/CD28活化)比较(图18)。图18中显示的数据指示在与表达TAG-72的癌细胞一起培养的前24小时内TAG-72CAR-T细胞的强抗原特异性，因为仅载体转染的T细胞和未转染的T细胞的阴性对照没有显示在此时间范围内的癌细胞杀伤。
在自外周血衍生的多克隆T细胞上进行上述研究。为了证明表达对名义癌症肽抗原特异性的TCR的单特异性T细胞的CAR-转导，通过TAG 72CAR慢病毒转导WT-1TCR特异性T细胞，其衍生自从WT-1特异性TCR形成的iPSC。图19A显示这些WT-1特异性TCR CD8+T细胞的成功CAR转导，所述WT-1特异性TCR CD8+T细胞自身衍生自从WT-1特异性T细胞产生的iPSC。CAR含有对TAG 72的特异性。最重要的是，图19B显示用针对TAG 72和CD47两者的CAR构建体对WT-1特异性TCR CD8+T细胞进行的成功转导，所述WT-1特异性TCR CD8+T细胞自身衍生自从WT-1特异性T细胞产生的iPSC。这指示可以产生具有三种癌症特异性的T细胞：WT-1(TCR)、TAG 72(CAR)和CD47(截短的CD47结合受体)。
这些结果证明衍生自iPSC的经双重特异性CAR转导的癌症特异性TCR(WT-1)的形成，所述iPSC自身衍生自来自正常成体血液的WT-1特异性TCR T细胞。
图20显示双特异性T细胞的两种组分(含有WT-1TCR和TAG72 CAR)可以有助于杀死癌细胞。当针对自发性细胞死亡进行校正时，即使在低效应物-靶物比率(这里，其是2个效应物比1个靶细胞)，WT-1细胞引起约10％的细胞杀伤，然后通过转导添加TAG72 CAR引起额外的10％杀伤。
实施例7：iPSC的嵌合抗原受体转导
多特异性CAR-T细胞的产生可以通过多种方法实现，包括CAR转导现有血液T细胞(图15)或通过转导iPSC，然后将所述iPSC诱导为T细胞(表达癌症特异性TCR和CAR)(例如，SEQ ID NO:1-6)。已经使用多种iPSC系进行CAR-T转导的进展。这些iPSC可以衍生自非T细胞，或会保留TCR基因重排的癌症抗原特异性T细胞(例如WT-1)。这些iPSC衍生自成体成纤维细胞或具有对特定癌症抗原(WT-1肽)特异性的内源性TCR的T细胞。
如图14所示，用单个顺反子稳定转导iPSC，其中CAR胞外域包含对TAG72(或作为对照的CD19)特异性的scFv。铰链(茎)区和跨膜区衍生自CD28或CD8，并且包含T细胞信号转导域的胞质内域衍生自CD28和TCRζ链。CAR具有通过分开CAR和报告物的P2A自切割多肽连接的编码EGFP的C端延伸。病毒整合后，P2A被切割，并通过测量释放的EGFP报告物的荧光来定量转导的成功。GFP荧光说明转导的成功。它可以用于显示原位转导(图21)或通过流式细胞术鉴定和分离经CAR转导的iPSC(图22，23)。
这些研究清楚显示了用慢病毒CAR构建体转导iPSC的能力。图21A显示了用编码TAG 72或CD19的CAR成功转导衍生自人成纤维细胞的iPSC(图21A)。图21B显示用TAG72成功转导衍生自WT-1TCR特异性T细胞的iPSC。因此，来自此系的任何T细胞将表达双重抗癌特异性(通过TCR的WT-1；通过CAR的TAG 72)。
也可以通过基于荧光的细胞分选分离转导的iPSC。可以收集阳性细胞并再铺板以成功形成(经CAR转导的)iPSC集落(图24)。
本领域技术人员将会理解，除了具体描述的那些以外，本文的发明易于进行变化和修改。应当理解，本发明包括所有这些变化和修改。本发明还包括单独地或共同地在本说明书中提及或指出的所有步骤、特征、组合物和化合物，以及任何两个或更多个所述步骤或特征的任何和所有组合。
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美国专利申请流水No.14/656,431，以US 20150183874 A1公布。

Claims (12)

1.组合物，其包含：
(i)编码第一嵌合抗原受体(CAR)的核酸，所述CAR包含通过铰链区和跨膜域可操作连接至T细胞活化部分并针对第一抗原决定簇的抗原识别部分；和
(ii)编码缺乏功能性信号传导胞内域的抗原结合受体的核酸，所述抗原结合受体包含CAR的抗原识别部分、铰链区和跨膜区，针对第二抗原决定簇。
2.权利要求1的组合物，其中在所述抗原结合受体中的所述铰链区具有去除的或取代的半胱氨酸残基以阻止二聚体的形成。
3.根据权利要求1或2的组合物，其中在所述抗原结合受体中的所述铰链区选自CD8铰链和CD28铰链。
4.根据前述权利要求中任一项的组合物，其中在所述CAR中的所述铰链区包含一个或多个半胱氨酸残基以指导所述CAR的二聚化。
5.根据前述权利要求中任一项的组合物，其中在所述CAR中的所述铰链区选自CD8铰链和CD28铰链。
6.根据前述权利要求中任一项的组合物，其中所述第一抗原决定簇选自TAG-72、CD19和MAGE。
7.根据前述权利要求中任一项的组合物，其中所述第二抗原决定簇是CD47。
8.权利要求1-6中任一项的组合物，其中所述第一抗原决定簇是TAG-72并且所述第二抗原决定簇是CD47。
9.根据前述权利要求中任一项的组合物，其中编码所述CAR的所述核酸通过编码自切割肽的核苷酸序列可操作连接至编码所述抗原结合受体的所述核酸。
10.细胞或其群体，其中
(i)所述细胞是(a)干细胞或(b)获得自(a)的细胞分化而来的衍生细胞；以及
(ii)所述细胞包含如前述权利要求中任一项定义的组合物。
11.根据权利要求10的细胞，其中所述细胞表达至少一种纯合HLA单元型。
12.根据权利要求10或11的细胞，其用于治疗新生物状况、微生物感染或自身免疫性状况。
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