CN116064622B - Claudin6-mCherry报告基因CHO-K1稳转细胞株制备及应用 - Google Patents

Claudin6-mCherry报告基因CHO-K1稳转细胞株制备及应用 Download PDF

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Abstract

本申请公开了Claudin6‑mCherry报告基因CHO‑K1稳转细胞株制备及应用，将Claudin6基因的序列和mCherry基因的序列使用linker进行连接融合，同时添加HIS标签，构建成包含Claudin6‑mCherry融合基因的重组质粒；将重组质粒构建到三代慢病毒表达质粒中包装慢病毒；并转染CHO‑K1细胞；使用流式分选CHO‑K1细胞，并对其扩增培养、功能验证等步骤，获得能够稳定表达有活性的Claudin6蛋白的CHO‑K1单克隆细胞株。

Description

Claudin6-mCherry报告基因CHO-K1稳转细胞株制备及应用
技术领域
本申请涉及生物医药技术领域，尤其涉及Claudin6-mCherry报告基因CHO-K1稳转细胞株制备及应用。
背景技术
Claudins(CLDNs)蛋白家族最早是在1998年被发现的，由Furuse Mikio等人从鸡肝中克隆得到并为之命名。该家族蛋白是紧密连接(Tight junctions，TJs)的重要组成成分，在哺乳动物中，迄今为止发现了27个Claudins成员，大量研究已证实，Claudins家族是TJs必不可少的骨架蛋白，在维持上皮和内皮细胞中的细胞极性、细胞间的粘附固定、细胞旁路的离子运输等方面发挥重要作用。
Claudin6(UniProt ID：P56747)的分子量为23kDa，有四个跨膜结构域，两个胞外域和一个胞内域，胞内域含有一个PDZ结合区，可以募集具有PDZ结构域的蛋白AF-6，AF-6与Ras结合，抑制Ras和Raf的结合，使得Ras不能被Raf激活，从而抑制Ras的活性，进一步抑制下游靶分子如ERK和PI3K等信号通路，进而调控细胞的行为。Claudin6的两个胞外结构域，分别是位于29～81和138～160之间的氨基酸，相对较短，是开发治疗性抗体最重要的片段。Claudin6可以与信号蛋白和细胞骨架蛋白结合，参与细胞外和细胞内信号传递的细胞应答。
大量研究表明，Claudin6基因可能直接或间接参与肿瘤细胞增殖、分化、凋亡等功能的调节，具体的调节机制有待进一步阐明，目前的研究普遍认为，Claudin6的异常表达或者磷酸化水平的改变会导致紧密连接的正常结构发生变化，进而影响细胞的之间的粘附，并导致一些分子的异常扩散，进而促进肿瘤的增值和迁移。Claudin6在卵巢癌、睾丸癌、乳腺癌，宫颈癌，肝细胞癌和肺腺癌等多种癌症中特异表达，在癌细胞上差异表达，而在成人正常组织中几乎检测不到，这使得它成为极具检测和治疗潜力的TAA靶点。ParmSnap数据库显示，已有10多家企业布局Claudin6研发管线，包括抗体、ADC、双特异性抗体、CAR-T、RNA疫苗等多种形式，其中进展最快的是日本安斯泰来制药的抗体药IMAB-027和德国拜恩泰科的CAR-T疗法，目前都已经进入临床二期。其中，德国拜恩泰科披露的BNT211 CAR-T+CARVac联合治疗Claudin6阳性实体瘤的临床初步数据显示，在16名接受治疗患者中，Claudin6CAR-T治疗具有良好的耐受性和安全性，且疾病控制率达到86％，客观缓解率ORR为43％，这意味着Claudin6基因是治疗实体瘤非常有价值的靶点。
由于Claudin6蛋白位于细胞膜表面，在体外获得有活性的Claudin6蛋白十分困难，因此，亟需开发出一种Claudin6基因的稳转细胞株，能够在体外表达出有活性的Claudin6蛋白，这对于与该靶点相关的药物开发和检测均有十分重要的意义。
发明内容
本申请的目的是提供一种Claudin6-mCherry报告基因CHO-K1稳转细胞株构建和应用，以至少解决上述部分技术问题。
第一方面，本申请提供了一种重组质粒，构建所述重组质粒包括将Claudin6基因的序列和mCherry基因的序列使用linker进行连接融合，同时添加HIS标签的步骤，所述重组质粒全长DNA的核苷酸序列如SEQ IDNO:3所示。
第二方面，本申请提供了一种Claudin6-mCherry报告基因CHO-K1稳转细胞株，其中，mCherry(Unipot ID：X5DSL3)是一种红色荧光蛋白，是一种目前被广泛用于生物技术作为示踪剂的红色荧光染料，包括分子的标记和细胞组分的定位等。mCherry因为其颜色和单体分子的光稳定性，细胞毒性低。比其它荧光蛋白标签更优异，其最大激发光和发射光分别为587nm和610nm；所述CHO-K1稳转细胞株通过如下方法获得：
将第一方面所述的重组质粒，构建到三代慢病毒表达质粒中包装慢病毒；
使用包装好的慢病毒稳定转染CHO-K1细胞，获得稳定表达Claudin6-mCherry融合蛋白的CHO-K1细胞；
进一步使用流式分选将mCherry阳性的细胞分离出来，并扩增培养，经过进一步的功能验证，获得能够稳定表达有活性的Claudin6蛋白的CHO-K1单克隆细胞株。
进一步地，所述Claudin6-mCherry报告基因的核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示，所述Claudin6-mCherry报告基因翻译表达出来的Claudin6-mCherry融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
第三方面，本申请提供了通过第一方面所述重组质粒或第二方面所述CHO-K1稳转细胞株在表达Claudin6蛋白的应用。
与现有技术相比，本申请的优点及积极效果至少如下：
(1)通过本申请提供的CHO-K1稳转细胞株表达出的Claudin6蛋白产量稳定、质量高。
(2)本申请提供的CHO-K1稳转细胞株的构建方法步骤简便，易于实施。
附图说明
图1为本申请实施例提供Claudin6-mCherry慢病毒转染效率图，其中A为没有转染Claudin6-mCherry慢病毒的CHO-K1细胞流式图，B为转染Claudin6-mCherry慢病毒48小时后的CHO-K1细胞流式图。
图2为本申请实施例提供的第14天检测96孔板中的Claudin6阳性分布图，其中A为96孔板中mCherry信号强度的分布图，B为Claudin6蛋白的表达信号强度分布图。
图3为本申请实施例提供的单克隆细胞株中CLDN6和mCherry的表达图，其中A为野生型CHO-K1细胞中CLDN6和mCherry表达量的流式图，B为筛选到的单克隆细胞株中CLDN6和mCherry表达量的流式图。
具体实施方式
为了使本申请的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。本申请中未详细单独说明的试剂均为常规试剂，均可从商业途径获得；未详细特别说明的方法均为常规实验方法，可从现有技术中获知。
术语解释
在本申请中，术语“报告基因(reportergene)”是一种编码可被检测的蛋白质的基因，也就是说，是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。把它的编码序列和基因表达调节序列相融合形成嵌合基因，或与其它目的基因相融合，在调控序列控制下进行表达，从而利用它的表达产物来标定目的基因的表达调控，筛选得到转化体。
术语“HIS标签(His-Tag)”是由6～10个组氨酸残基组成，分子量小，不到0.84KD，通常插入在目的蛋白的C末端或N末端，不影响目标蛋白的结构和功能且能在变性条件下进行纯化，加之其价格便宜，是目前蛋白分离纯化中最受欢迎且最有效的的选择之一；“His标签(His-Tag)”可与多种金属离子发生特殊的相互作用，如Ca2+、Mg2+、Ni2+、Cu2+，Fe3+等，其原理是利用蛋白质表面的特性，使之被吸附在凝胶柱上，从而达到分离纯化蛋白的目的；“His标签(His-Tag)”蛋白纯化完之后可以不需切除此标签，且纯化的条件温和，不会对蛋白产生功能影响。
术语“融合基因”是指将两个或多个基因的编码区首尾相连.置于同一套调控序列控制之下，构成的嵌合基因。“融合基因”的表达产物为即为“融合蛋白”。
术语“慢病毒(Lentivirus)”是以HIV-1(人类免疫缺陷I型病毒)为基础发展起来的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。“慢病毒”载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞，在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。
术语“穿梭质粒”是指一类具有两种不同复制起点和选择标记，因而可以在两种不同类群宿主中存活和复制的质粒载体。
术语“表达(gene expression)”是指将来自基因的遗传信息合成功能性基因产物的过程，基因或质粒“表达”产物通常是蛋白质，但是非蛋白质编码基因如转移RNA(tRNA)或小核RNA(snRNA)基因的表达产物是功能性RNA，在本申请中，所述基因表达的产物为蛋白质。
在本申请实施例中，构建将上述Claudin6-mCherry报告基因CHO-K1稳转细胞株的过程包括：构建Claudin6-mCherry基因表达质粒；将表达质粒包装成Claudin6-mCherry慢病毒；Claudin6-mCherry慢病毒转染CHO-K1细胞；使用流式分选的方法将mCherry阳性的细胞分离出来，并进行扩增培养；对扩增培养出的CHO-K1细胞进行功能验证，获得能够稳定表达有活性的Claudin6蛋白的CHO-K1单克隆细胞株。
本申请实施例中，Claudin6-mCherry基因表达质粒的过程包括：将Claudin6基因的序列和mCherry基因的序列使用linker进行连接融合，，同时添加HIS标签的步骤，最后构建融合基因，所述融合基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其表达获得的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；Claudin6基因最后构建的包装质粒的全长DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
以下通过具体的实施例对上述步骤进行详细的说明，并通过实施例的结果进一步验证筛选的CHO-K1稳转细胞株的表达Claudin6蛋白的效果。
实施例1
本实施例为一种Claudin6-mCherry慢病毒包装方法，其具体骤包括：
将293T细胞接种到6孔板中，观察细胞融合度，待细胞融合度达到60％～70％，进行慢病毒包装；将三种包装质粒(pL1，pL2，pL3)和构建好的Claudin6-mCherry穿梭质粒按照2:1:1:2的质量比进行混合，三种包装质粒表达合成慢病毒所需要的组分，包括一些结构蛋白和酶，将Claudin6-mCherry穿梭质粒包裹起来，起辅助作用；所述Claudin6-mCherry穿梭质粒构建包括将Claudin6基因的序列和mCherry基因的序列使用linker进行连接融合，同时添加HIS标签的步骤，最后构建的包装质粒的全长DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；取1μg的混合质粒用50μL的无血清培养基溶解，另外将3μg的聚醚酰亚胺(PEI)用另外50μL的无血清培养基溶解，混匀；将混有PEI的溶液逐滴加入到混有质粒的溶液中，混匀，室温静止10～30min；将上述混合液加入到24孔板中，于37℃含5％二氧化碳培养箱培养，6～8小时后换液，换成含血清的培养基，48h时收集上清；将收集到的上清，室温，4000rpm，离心30min，去除细胞沉淀；将收集得到的上清过0.45μm滤膜，分装后-80摄氏度冻存。
实施例2
本实施例是实施例1中包装获得的Claudin6-mCherry慢病毒转染CHO-K1细胞的过程，具体包括：
将CHO-K1细胞接种到12孔板中，观察细胞融合度，待细胞融合度达到60％～70％，进行转染；吸除旧的培养基，向上述孔中分别加入1mL Claudin6-mCherry慢病毒原液和polybrene，使终浓度为4μg/mL，并混匀；置于37℃、5％ CO2培养箱中；24h后换新鲜培养基；48h后消化细胞转入6孔板中，留样用于流式检测转染效率，加入10μg/mL puromycin的F12完全培养基，进行加压培养。
结果：图1为Claudin6-mCherry慢病毒转染效率图，其中A为没有转染Claudin6-mCherry慢病毒的CHO-K1细胞流式图，B为转染Claudin6-mCherry慢病毒48小时后的CHO-K1细胞流式图。从图中可以看出，Claudin6-mCherry慢病毒转染CHO-K1细胞的效率约为33.27％，即慢病毒成功感染了约1/3的CHO-K1细胞。
实施例3
本实施例是对CHO-K1单克隆稳转细胞株筛选过程，具体步骤包括：
维持10μg/mL puromycin的F12培养基生长传代加压两代后，进行流式分析检测及分选，将mCherry阳性的细胞到96孔板中继续培养，1cell/孔；第14天检测96孔板中Claudin6阳性的孔，经筛选后，依次转移到6孔板，T25，T75，T175培养得到单克隆细胞株，流式验证得到单克隆细胞的表达稳定性。
结果：图2为第14天检测96孔板中的Claudin6阳性分布图，其中A为96孔板中mCherry信号强度的分布图，B为Claudin6蛋白的表达信号强度分布图，从图中可以看出，约9个孔中的单克隆细胞同时高表达Claudin6和mCherry。
实施例4
本实施例是对前述筛选出的CHO-K1单克隆细胞株的Claudin6表达效果进行验证，其具体内容为：
取适量转染后的CHO-K1细胞，使用抗Claudin6蛋白的一抗结合30分钟；使用羊抗人IgG-APC的二抗进行显色30分钟；使用安捷伦NovoCyte Advanteon分析型流式细胞仪检测细胞表面的APC和mCherry荧光信号并作图。
结果：图3为CHO-K1单克隆细胞株中CLDN6和mCherry的表达图，其中其中A为野生型CHO-K1细胞中CLDN6和mCherry表达量的流式图，B为筛选到的单克隆细胞株中CLDN6和mCherry表达量的流式图，从图中可以看出野生型CHO-K1细胞不表达CLDN6和mCherry，筛选到的单克隆细胞高表达CLDN6和mCherry。
以上所述，仅为本申请较佳的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本申请揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种Claudin6-mCherry报告基因的CHO-K1稳转细胞株的制备方法，所述制备方法包括：
构建Claudin6-mCherry慢病毒载体，所述Claudin6-mCherry慢病毒载体携带于CHO-K1细胞内稳定表达编码如SEQ ID NO.2所示的融合蛋白的融合基因，所述融合基因如SEQ IDNO:1所示，所述融合基因包括Claudin6基因、mCherry基因、HIS标签序列以及连接Claudin6基因和mCherry基因的linker；
使用所述Claudin6-mCherry慢病毒载体稳定转染CHO-K1细胞，获得稳定表达所述融合蛋白的CHO-K1细胞；
使用流式分选CHO-K1细胞并进行扩增培养、功能验证，最终获得能够稳定表达有活性的Claudin6蛋白的CHO-K1单克隆细胞株；
所述Claudin6-mCherry慢病毒载体的包装方法包括以下步骤：
将三种包装质粒pL1、pL2、pL3和重组表达质粒按照2:1:1:2的质量比进行混合，获得混合质粒；其中，所述重组表达质粒携带所述融合基因，所述重组表达质粒为一穿梭质粒，所述重组表达质粒全长DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；
将混合质粒用无血清培养基溶解，将混有PEI的溶液逐滴加入到混合质粒的溶液中，获得混合液；
将上述混合液加入到融合度达到60％～70％的293T细胞液中，于37℃含5％二氧化碳培养箱培养，6～8小时后换液，换成含血清的培养基，48h时收集上清；
将上清液进行4000rpm离心30min，去除细胞沉淀，获得所述慢病毒载体，分装保存。
2.权利要求1所述的制备方法制得的CHO-K1稳转细胞株在表达Claudin6蛋白的应用。
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