CN116027033B - 一种基于细菌样颗粒检测细菌和病毒抗原、抗体的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明适用于免疫学技术领域，提供了一种基于细菌样颗粒检测细菌和病毒抗原、抗体的方法，本发明以细菌蛋白(BP)或病毒蛋白(VP)为检测目标，利用细菌样颗粒(BLP)为固相载体，检测内容包括：通过BLP与锚定蛋白(PA)间的非共价结合作用固定重组表达的抗原BP(VP)‑PA，产生BLP/BP(VP)‑PA抗原复合体，检测血清中抗BP(VP)的IgG效价；通过BLP与锚定蛋白(PA)间的非共价结合作用固定重组表达的单链抗体scFV‑BP(VP)‑PA，产生BLP/scFV‑BP(VP)‑PA复合体，检测BP(VP)蛋白抗原的含量。本发明实现了快速检测，降低检测费用的效果，并且能够提高检测灵敏度。
Description
技术领域
本发明属于免疫学技术领域，尤其涉及一种基于细菌样颗粒检测细菌和病毒抗原、抗体的方法。
背景技术
细菌和病毒是人类和动物各类传染病的主要病源体，其引起的传染病给人类的健康带来了严重威胁，因此，对这些传染病的快速诊断和识别，对阻止其传播和防治尤为重要。对这些病源体的诊断主要包括抗原诊断和抗体诊断，从原理上，这些检测方法主要是PCR法检测其核酸、ELISA法检测其抗原和抗体等。这些检测方法往往有其各自的缺点，如：ELISA法需要进行封闭、多次洗涤，费时费力，步骤比较繁琐，还需要96孔板，费用较高，这些缺点都需要加以改进。为此我们提出一种基于细菌样颗粒检测细菌和病毒抗原、抗体的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于细菌样颗粒检测细菌和病毒抗原、抗体的方法，旨在解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种基于细菌样颗粒检测细菌和病毒抗原、抗体的方法，包括：
a.检测肺炎链球菌抗体效价的具体操作为：通过以BLP为载体，对原核表达的重组抗原PspA-PA进行结合，形成BLP/PspA-PA抗原复合体，以此抗原复合体去结合待测血清中的抗PspA的IgG，再利用酶标记的二抗对其进行定量检测；
b.检测肺炎链球菌抗原的具体操作为：通过以BLP为载体，对原核表达的重组单链抗体scFV-PspA-PA进行结合，形成BLP/scFV-PspA-PA单链抗体复合体，以此单链抗体复合体去结合待测样品中的抗原PspA或肺炎链球菌细胞，再利用抗PspA的IgG和酶标记的二抗对抗原PspA或肺炎链球菌细胞进行定量检测；
c.检测新型冠状病毒SARS-CoV-2抗体效价的具体操作为：通过以BLP为载体，对原核表达的重组抗原S-PA进行结合，形成BLP/S-PA抗原复合体，以此抗原复合体去结合待测血清中的抗S蛋白的IgG，再利用酶标记的二抗对其进行定量检测；
d.检测新型冠状病毒SARS-CoV-2抗原的具体操作为：通过以BLP为载体，对原核表达的重组单链抗体scFV-S-PA进行结合，形成BLP/scFV-S-PA单链抗体复合体，以此单链抗体颗粒去结合待测样品中的抗原S蛋白或病毒颗粒，再利用抗S蛋白的IgG和酶标记的二抗对抗原S蛋白或病毒颗粒进行定量检测。
进一步的，所述BLP的制备方法为：将培养的乳酸乳球菌与三氯乙酸进行加热处理，通过洗涤纯化去除杂质，留下无生命力的肽聚糖壳，即为BLP。
进一步的，所述PspA-PA重组抗原的制备方法为：选择PspA家族2亚类4的部分序列(α螺旋区和脯氨酸富集区)，并在其脯氨酸富集区的C端融合表达锚定蛋白PA，通过化学合成基因序列，在合成前对序列进行优化，选择大肠杆菌偏爱的密码子，使其在大肠杆菌中高表达，然后将其克隆构建于pET20b原核表达载体上，转化入大肠杆菌BL21中进行表达，优化蛋白的表达条件，并进行诱导表达候选蛋白，通过His Trap亲和纯化柱获得目的蛋白PspA-PA。
进一步的，所述BLP/PspA-PA抗原复合体的制备方法为：取冻存的BLP与PspA-PA蛋白，待其融化后充分混匀，向含有50mg PspA-PA的蛋白溶液中加入10mg BLP，室温震荡结合1h后，8000rpm离心20min，回收结合上清液，吸取6.5mL无菌PBS溶液重悬沉淀样品，分别取样进行SDS-PAGE电泳检测。
进一步的，所述S-PA重组抗原的制备方法为：SARS-CoV-2的S蛋白抗原为S蛋白的部分序列，通过基因工程技术在原核系统中进行表达和制备，作为含量测定的目标抗原。
进一步的，所述scFV-S-PA单链抗体的制备方法为：选择一种抗S蛋白的单克隆抗体为母体，以其重链可变区为N端，轻链可变区为C端，或者以其轻链可变区为N端，重链可变区为C端，通过连接肽相连，在单链抗体的C端融合表达锚定蛋白PA，通过化学合成基因序列，在合成前对序列进行优化，选择大肠杆菌偏爱的密码子，使其在大肠杆菌中高表达，然后将其克隆构建于pET20b原核表达载体上，转化入大肠杆菌BL21中进行表达，优化蛋白的表达条件，并进行诱导表达候选蛋白，通过His Trap亲和纯化柱获得目的蛋白scFV-S-PA。
进一步的，所述BLP/scFV-S-PA单链抗体复合体的制备方法为：向含有50mg scFV-S-PA的蛋白溶液中加入10mg BLP，室温震荡结合1h后，8000rpm离心20min，回收结合上清液，吸取6.5mL无菌PBS溶液重悬沉淀样品，分别取样进行SDS-PAGE电泳检测。
进一步的，所述BLP/scFV-S-PA固相法测抗原的最佳工作浓度为：scFV-S-PA用量为1μg，抗S蛋白血清浓度为1：100。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
该基于细菌样颗粒检测细菌和病毒抗原、抗体的方法，无需进行封闭，抗体孵育后的洗涤次数更少，孵育时间更短，简化了检测步骤，且无需96孔板，大大地降低了检测费用，并且能够保证准确率等指标；该方法对较低浓度的抗原、抗体具有富积作用，可以提高检测灵敏度。
附图说明
图1为本发明中大肠杆菌诱导表达PspA-PA蛋白SDS-PAGE(Lane1：预染蛋白marker；Lane2：PspA-PA蛋白在大肠杆菌系统中的诱导表达；Lane3：诱导前大肠杆菌系统中蛋白的表达)。
图2为本发明中Western-blot验证PspA-PA蛋白的表达(一抗为anti-PspA4多抗；Lane1：预染蛋白marker；Lane2：PspA-PA蛋白在大肠杆菌系统中的诱导表达；Lane3：诱导前大肠杆菌系统中蛋白的表达)。
图3为本发明中BLP的SDS-PAGE鉴定(Lane1：预染蛋白marker；Lane2：乳酸乳球菌的全菌体；Lane3：乳酸乳球菌用酸处理后(BLP))。
图4为本发明中BLP标准品OD600光吸收标准曲线图。
图5为本发明中BLPs/PspA-PA的制备与定量。
图6为本发明中BLP/PspA-PA用量对抗体效价检测的影响(BLP/PspA-PA用量：(A)38.6μg/mL，(B)77.2μg/mL，(C)154.4μg/mL)。
图7为本发明中封闭与否对抗体效价检测的影响((A)使用3％牛血清白蛋白进行封闭，200uL/管，(B)不进行封闭)。
图8为本发明中多抗血清孵育后PBS-T洗涤次数对抗体效价检测的影响(洗涤次数：(A)1次，(B)2次，(C)3次)。
图9为本发明中酶标二抗孵育后PBS-T洗涤次数对抗体效价检测的影响(洗涤次数：(A)1次，(B)2次，(C)3次)。
图10为本发明中大肠杆菌诱导表达S蛋白的SDS-PAGE和Western Blot鉴定(一抗为抗His标签单克隆抗体；左Lane1：诱导前；右Lane1：阳性对照；左Lane2：诱导后；右Lane2：诱导前；左Lane3：超声后上清；右Lane3：诱导后；左Lane4：破碎沉淀；右Lane4：超声后上清；Lane5：破碎沉淀)。
图11为本发明中大肠杆菌诱导表达scFV-S-PA蛋白的SDS-PAGE和Western Blot鉴定(一抗为抗His标签单克隆抗体；Lane1：预染蛋白marker；Lane2：PspA-PA蛋白在大肠杆菌系统中的诱导表达；Lane3：诱导前大肠杆菌系统中蛋白的表达)。
图12为本发明中BLP/scFV-S-PA固相抗体复合物的制备(Lane1：BLP；Lane2：scFV-S-PA；Lane3：BLP与scFV-S-PA结合上清液；Lane4：BLP/scFV-S-PA固相抗体)。
图13为本发明BSA标准品浓度与灰度值标准曲线图。
图14为本发明SDS-PAGE与Western Blot鉴定BLP/scFV-S-PA捕获S蛋白(Lane1：阳性对照；Lane2：BLP；Lane3：scFV-S-PA；Lane4：S；Lane5：S-PA；Lane6：BLP/scFV-S-PA；Lane7：BLP/S；Lane8：BLP/S-PA；Lane9：BLP/scFV-S-PA+S；Western Blot鉴定中一抗为抗His标签单克隆抗体)。
图15为本发明BLP/scFV-S-PA固相法检测抗原标准曲线图(A、B组scFV-S-PA铺板量为0.25μg/孔，多抗血清稀释倍数为1：100；A组初始抗原浓度为66667ng/mL，三倍系列稀释；B组初始抗原浓度为100000ng/mL，四倍系列稀释)。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
以下结合具体实施例对本发明的具体实现进行详细描述。
本发明一个实施例提供的一种基于细菌样颗粒检测细菌和病毒抗原、抗体的方法，包括：
a.检测肺炎链球菌抗体效价的具体操作为：通过以BLP为载体，对原核表达的重组抗原PspA-PA进行结合，形成BLP/PspA-PA抗原复合体，以此抗原复合体去结合待测血清中的抗PspA的IgG，再利用酶标记的二抗对其进行定量检测；
b.检测肺炎链球菌抗原的具体操作为：通过以BLP为载体，对原核表达的重组单链抗体scFV-PspA-PA进行结合，形成BLP/scFV-PspA-PA单链抗体复合体，以此单链抗体复合体去结合待测样品中的抗原PspA或肺炎链球菌细胞，再利用抗PspA的IgG和酶标记的二抗对抗原PspA或肺炎链球菌细胞进行定量检测；
c.检测新型冠状病毒SARS-CoV-2抗体效价的具体操作为：通过以BLP为载体，对原核表达的重组抗原S-PA进行结合，形成BLP/S-PA抗原复合体，以此抗原复合体去结合待测血清中的抗S蛋白的IgG，再利用酶标记的二抗对其进行定量检测；
d.检测新型冠状病毒SARS-CoV-2抗原的具体操作为：通过以BLP为载体，对原核表达的重组单链抗体scFV-S-PA进行结合，形成BLP/scFV-S-PA单链抗体复合体，以此单链抗体颗粒去结合待测样品中的抗原S蛋白或病毒颗粒，再利用抗S蛋白的IgG和酶标记的二抗对抗原S蛋白或病毒颗粒进行定量检测。
在本发明实施例中，PspA蛋白和S蛋白可以是全序列、截短序列或其组合。将革兰氏阳性菌(如乳酸乳球菌)在高温环境酸解，可降解其自身的核酸与蛋白，留下无生命活性且疏松的肽聚糖壳，因其仍保有细菌原有的颗粒形态，故称为细菌样颗粒(缩写为BLP)。BLP通过一种独特的蛋白连接器(PA)可将抗原与BLP连接起来。PA是细菌细胞壁水解酶AcmA的C端的肽聚糖结合区域，AcmA对乳酸乳球菌的肽聚糖结构有很强的结合能力。通过基因重组的方法将抗原与PA融合表达，然后与BLP混合，这样抗原就很容易结合到BLP上。PA与BLP的结合是很稳定的，结合后不易分离。
肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)是一种有荚膜的革兰氏阳性菌，该菌通常定植于健康人群的口腔和鼻咽部，是正常菌群中的一种。当人体免疫力低下时，肺炎链球菌局部浸润引起鼻窦炎、中耳炎，吸入肺引起肺炎，还可以侵袭机体引起菌血症和脑膜炎等疾病。肺炎链球菌自身蛋白有很多种，肺炎链球菌表面蛋白A(Pneumococcal surfaceprotein A，PspA)就是其中之一。PspA是一种胆固醇结合蛋白，分布在肺炎链球菌表面，是肺炎链球菌关键的毒力因子和生存必需的蛋白质，至今在所有的临床分离到的肺炎链球菌菌株中都能检测到PspA的表达。PspA在肺炎链球菌与宿主相互作用中起到关键作用。PspA蛋白分子在所有肺炎链球菌中并不完全保守，存在着结构变异性，分子量从67-100KD不等。PspA分子分为5个区域：信号肽区、α螺旋区、脯氨酸富集区、胆碱结合区和C端17个氨基酸尾。基因和蛋白图谱研究结果显示，关键的交叉保护性抗原表位位于α螺旋区中靠近脯氨酸富集区的大约100个氨基酸左右的序列，被称为亚类决定区(clade defining region，简称CDR)。根据CDR区的不同，PspA被分为3个家族(家族1、家族2和家族3)、6个亚类(Clade1、Clade2、Clade3、Clade4、Clade5和Clade6)，6个亚类分别属于3个家族；其中Clade1和Clade2属于家族1，Clade3、Clade4和Clade5属于家族2，Clade6属于家族3。每个家族内亚类间CDR区基因序列相似度大于80％；各家族间CDR区基因序列间相似度大于50％。在三个家族中，家族1与家族2流行率大于95％，而家族3很少出现。尽管PspA的结构和抗原性具有多变性，但是针对PspA产生的抗体具有高度的交叉反应性与交叉保护性。
新型冠状病毒(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2)被世界卫生组织命名为SARS-CoV-2，是新发现的β冠状病毒属成员，目前正在全球流行，造成了严重的全球健康威胁。SARS-CoV-2有四种主要结构蛋白：刺突蛋白(Spike protein,S)、膜蛋白(Membrane protein,M)、包膜蛋白(Envelope protein,E)和核蛋白(Nucleocapsidprotein,N)，其中，S蛋白(Spike protein)是四种结构蛋白中最主要的参与感染和免疫的蛋白质。S蛋白可分为多个功能域，首先，球状头部包含了S1区的N端受体结合结构域(Receptor-binding Domain,RBD)。其次，茎部包含C末端膜融合结构域S2区，末端是两个七肽区域，即跨膜结构域和胞质尾。S1区由大约200个氨基酸编码，S1区与人类的血管紧张素转换酶2(Angiotensin Converting Enzyme 2，ACE2)结合以介导病毒进入细胞。因此，目前研究的亚单位疫苗都是以S蛋白为主要免疫原，也是对其抗原、抗体检测的主要目标。
作为本发明的一种优选实施例，所述BLP的制备方法为：将培养的乳酸乳球菌与三氯乙酸进行加热处理，通过洗涤纯化去除杂质，留下无生命力的肽聚糖壳，即为BLP。
在本发明实施例中，BLP的定量操作为：取适量BLP冻干，完全去除水分后，将冻干样品系列稀释为0.1mg/mL、0.25mg/mL，0.5mg/mL，1mg/mL，分别测定不同浓度BLP悬液在600nm下的光吸收值，并以浓度-吸光值做线性回归，结果见图3-4。将制备的BLP混匀后，稀释10倍，测定OD600为0.6，带入线性回归方程y＝0.6488x+0.0324，得BLP浓度为118.3mg/mL。
作为本发明的一种优选实施例，所述PspA-PA重组抗原的制备方法为(PspA4蛋白的部分序列)：选择PspA家族2亚类4的部分序列(α螺旋区和脯氨酸富集区)，并在其脯氨酸富集区的C端融合表达锚定蛋白PA，通过化学合成基因序列，在合成前对序列进行优化，选择大肠杆菌偏爱的密码子，使其在大肠杆菌中高表达，然后将其克隆构建于pET20b原核表达载体上(命名为pET20b-PspA-PA)，转化入大肠杆菌BL21中进行表达，优化蛋白的表达条件，并进行诱导表达候选蛋白，通过His Trap亲和纯化柱获得目的蛋白PspA-PA。
在本发明实施例中，使用SDS-PAGE与Western Blot方法进行鉴定。结果见图1-2。动物免疫：用表达和纯化的PspA-PA蛋白对雌性Bal/c小鼠进行皮下免疫，共免疫四次，每次间隔一周，免疫前及每轮免疫一周后分别取小鼠血液，制备抗PspA-PA蛋白的血清。
作为本发明的一种优选实施例，所述BLP/PspA-PA抗原复合体的制备方法为：取冻存的BLP与PspA-PA蛋白，待其融化后充分混匀，向含有50mg PspA-PA的蛋白溶液中加入10mg BLP，室温震荡结合1h后，8000rpm离心20min，回收结合上清液，吸取6.5mL无菌PBS溶液重悬沉淀样品，分别取样进行SDS-PAGE电泳检测。
在本发明实施例中，固相BLP/PspA-PA抗原复合物中BLP与PspA-PA的定量：将BLP浓度稀释成0.1mg/mL，0.25mg/mL，0.5mg/mL，1mg/mL，分别测定不同浓度BLP悬液在600nm下的光吸收值，并以浓度-吸光值做线性回归，将BLP/PspA-PA结合物稀释10倍后，测定600nm下的光吸收值，代入标曲，计算BLP的浓度。灰度分析定量PspA-PA：将BSA标准品稀释成0.1mg/mL，0.2mg/mL，0.4mg/mL，0.6mg/mL，0.8mg/mL，1mg/mL，制成等体积的电泳样品后，与BLP/PspA-PA一同进行SDS-PAGE电泳，样品量均为10uL/孔。电泳后进行脱色，对条带清晰可见的聚丙烯酰胺凝胶进行灰度分析，使用Image Studio V2.1软件处理，以BSA浓度与灰度值做标准曲线，对BLP/PspA-PA结合物中的PspA-PA进行定量。结果见图5。
BLP/PspA-PA抗原用量探究：用PBS溶液将BLP/PspA-PA和BLP悬液稀释为(A)38.6μg/mL，(B)77.2μg/mL，(C)154.4μg/mL三个梯度，100uL/EP管。以无关蛋白为阴性对照组，以间接ELISA法的结果作为阳性对照。使用PBS将PspA-PA蛋白四次免疫小鼠的血清和阴性血清进行10倍系列稀释至106，将系列稀释的血清各加入上述各管中，100uL/EP管，涡旋震荡以重悬BLP/PspA-PA微粒后，室温震荡孵育10min。使用PBS-T进行“洗涤-重悬-离心”的过程，共洗涤3次。8000rpm离心10min，弃去上清。向各管中加1：10000稀释的山羊抗小鼠IgG/HRP标记抗体，100uL/管，涡旋震荡以重悬BLP/PspA-PA微粒后，室温震荡孵育10min。使用PBS-T进行“洗涤-重悬-离心”的过程，共洗涤3次。8000rpm离心10min，弃去二抗，使用PBS-T进行“洗涤-重悬-离心”的过程，共洗涤3次。向管中加入TMB底物，100uL/管，涡旋震荡以重悬BLP/PspA-PA微粒，避光震荡反应10min后，向管中加入2M硫酸终止反应，8000rpm离心10min，吸取上清于聚苯乙烯板中，测定OD450。结果见图6，由结果可知，BLP/PspA-PA的浓度大于77.2μg/mL即过量，与阳性对照一致，满足测定要求。
封闭与否对于检测抗体效价的影响：在BLP/PspA-PA抗原用量探究中，加入PspA-PA蛋白四次免疫小鼠的血清和阴性血清前，(A)使用3％牛血清白蛋白进行封闭，200uL/管；(B)不进行封闭。其它步骤与上述相同。结果见图7，由结果可知，封闭与不封闭的检测结果一致，对检测结果没有影响，因此，该方法无需进行封闭。
PBS-T洗涤次数对检测抗体效价的影响：在BLP/PspA-PA抗原用量探究中，在加入血清和二抗后，分别对其洗涤一次、两次和三次。其它步骤与上述相同。结果见图8-9，由结果可知，在加入血清和二抗后，洗涤一次至三次检测结果相同，因此，该方法仅需要洗涤一次即可，不需要多次重复洗涤。
重复性验证：选取PspA-PA蛋白免疫小鼠的二免、三免、四免的PspA-PA蛋白抗血清和PBS血清，共五份样品，进行重复性验证。用PBS溶液将BLP/PspA-PA复合物稀释为77.2μg/mL，100uL/管，其它检测步骤与上述步骤5相同。结果见表1。结果表明：该方法检测PspA-PA蛋白免疫小鼠的抗血清重复性很好，方法稳定。
表1BLP/PspA-PA检测血清效价重复性验证结果
作为本发明的一种优选实施例，所述S-PA重组抗原的制备方法为：SARS-CoV-2的S蛋白抗原为S蛋白的部分序列，通过基因工程技术在原核系统中进行表达和制备，作为含量测定的目标抗原。
作为本发明的一种优选实施例，所述scFV-S-PA单链抗体的制备方法为：选择一种抗S蛋白的单克隆抗体为母体，以其重链可变区为N端，轻链可变区为C端，或者以其轻链可变区为N端，重链可变区为C端，通过连接肽相连，在单链抗体的C端融合表达锚定蛋白PA，通过化学合成基因序列，在合成前对序列进行优化，选择大肠杆菌偏爱的密码子，使其在大肠杆菌中高表达，然后将其克隆构建于pET20b原核表达载体上(命名为pET20b-scFV-S-PA)，转化入大肠杆菌BL21中进行表达，优化蛋白的表达条件，并进行诱导表达候选蛋白，通过His Trap亲和纯化柱获得目的蛋白scFV-S-PA。
在本发明实施例中，使用SDS-PAGE与Western Blot方法进行鉴定。结果见图10-11。
作为本发明的一种优选实施例，所述BLP/scFV-S-PA单链抗体复合体的制备方法为：向含有50mg scFV-S-PA的蛋白溶液中加入10mg BLP，室温震荡结合1h后，8000rpm离心20min，回收结合上清液，吸取6.5mL无菌PBS溶液重悬沉淀样品，分别取样进行SDS-PAGE电泳检测。
在本发明实施例中，电泳检测结果如图12。Lane2为scFV-S-PA蛋白溶液，总浓度为0.25mg/mL，Lane3为回收结合上清液，测定其蛋白浓度为0.18mg/mL，回收率为72％，Lane4为制备的BLP/scFV-S-PA，可以看到scFV-S-PA已被BLP捕获。BLP/scFV-S-PA固相抗体已成功制备，将BSA标准品系列稀释，制备成等体积的电泳样品，与BLP/scFV-S-PA结合物一同进行电泳，图片经Image Studio V2.1软件处理，以BSA浓度与蛋白条带灰度值做标准曲线，结果如图13，待测样品信号值为18176.054，代入标准曲线，得出BLP/scFV-S-PA结合物的浓度为54μg scFV-S-PA/mg BLP。
BLP/scFV-S-PA与S蛋白结合功能鉴定：为了展示BLP/scFV-S-PA固相抗体捕获S蛋白的功能，使用SDS-PAGE和Western Blot进行表征，结果如图14，Lane7中，BLP无法与S蛋白直接结合，但使用Lane6中的BLP/scFV-S-PA结合S蛋白后，取沉淀样品进行电泳，Lane9中出现一条27kD的蛋白条带，经Western Blot鉴定，此条带为S蛋白，这展示了BLP无法直接与S蛋白结合，但BLP/scFV-S-PA固相抗体能够通过scFV-S-PA与S蛋白间的特异性结合能力，捕获溶液中游离的S蛋白，这为后续BLP/scFV-S-PA固相抗体检测重组抗原S提供了依据。
作为本发明的一种优选实施例，所述BLP/scFV-S-PA固相法测抗原的最佳工作浓度为：scFV-S-PA用量为1μg，抗S蛋白血清浓度为1：100。
在本发明实施例中，最佳工作浓度确定的具体操作为：将BLP/scFV-S-PA结合物充分混匀，PBS作为稀释液，将BLP/scFV-S-PA结合物稀释梯度为：8μg/管，4μg/管，2μg/管，1μg/管，0.5μg/管，0.25/管，8000rpm离心20min，弃去上清液，无需进行封闭，加入40μg S蛋白，阴性对照组加入40μg无关蛋白，涡旋振荡以重悬BLP微粒，室温震荡孵育10min。8000rpm离心20min，回收抗原，使用PBS-T进行“洗涤-重悬-离心”的过程，共洗涤三次。以1％ BSA为稀释液，将鼠源抗S蛋白血清稀释为1:10，1:100，1:1000，1:10000四个梯度，涡旋振荡以重悬BLP微粒，室温震荡孵育10min。8000rpm离心15min，弃去上清，以PBS-T，重复“洗涤-重悬-离心”的过程，共洗涤三次。向管中加入1：10000稀释的山羊抗小鼠IGg/HRP标记抗体，100uL/管，涡旋震荡，室温震荡孵育10min。显色与终止：8000rpm离心15min，弃去上清，使用PBS-T进行“洗涤-重悬-离心”的过程，共洗涤3次。加入TMB底物，100uL/管，涡旋震荡以重悬BLP/S-PA微粒，避光震荡反应10min后，加入2M硫酸终止反应，8000rpm离心15min，吸取上清于聚丙乙烯板中，测定OD450并计算实验组与阴性组间的P/N。结果显示：scFV-S-PA用量为1μg，多抗血清浓度为1：100稀释的检测效果最佳，抗原浓度与吸光度间有较好的线性关系。
BLP/scFV-S-PA固相法检测抗原检测限确定：根据检测结果，绘制蛋白浓度对数与OD450的曲线，蛋白浓度与OD450的曲线如图15所示，在一定范围内，蛋白浓度与OD450呈线性关系，检测的抗原浓度范围为：30-7400ng/mL。
重复性验证：配制不同浓度的S蛋白，进行上述方法的重复测定验证。结果见表2。结果表明：该方法检测S蛋白重复性很好，方法稳定。
表2BLP/scFV-S-PA检测血清效价重复性验证结果
本发明的工作原理是：
该基于细菌样颗粒检测细菌和病毒抗原、抗体的方法，通过BLP与锚定蛋白(PA)间的非共价结合作用，可将重组表达的抗原BP(VP)-PA，或重组表达的单链抗体scFV-BP(VP)-PA固定在BLP表面，产生BLP/BP(VP)-PA抗原复合体，或BLP/scFV-BP(VP)-PA复合体，它们可以结合待测样品中的相应抗BP(VP)的IgG或BP(VP)蛋白，再利用酶标记的二抗对其进行定量检测，从而可用于检测血清中抗BP(VP)的IgG效价或BP(VP)蛋白含量，如疫苗的含量，以及细菌和病毒的含量等。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些均不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。
Claims (2)
1.一种基于细菌样颗粒检测细菌和病毒抗原、抗体的方法，其特征在于，包括：
a.检测肺炎链球菌抗体效价的具体操作为：通过以BLP为载体，对原核表达的重组抗原PspA-PA进行结合，形成BLP/PspA-PA抗原复合体，以此抗原复合体去结合待测血清中的抗PspA的IgG，再利用酶标记的二抗对其进行定量检测；
b.检测肺炎链球菌抗原的具体操作为：通过以BLP为载体，对原核表达的重组单链抗体scFV-PspA-PA进行结合，形成BLP/scFV-PspA-PA单链抗体复合体，以此单链抗体复合体去结合待测样品中的抗原PspA或肺炎链球菌细胞，再利用抗PspA的IgG和酶标记的二抗对抗原PspA或肺炎链球菌细胞进行定量检测；
c.检测新型冠状病毒SARS-CoV-2抗体效价的具体操作为：通过以BLP为载体，对原核表达的重组抗原S-PA进行结合，形成BLP/S-PA抗原复合体，以此抗原复合体去结合待测血清中的抗S蛋白的IgG，再利用酶标记的二抗对其进行定量检测；
d.检测新型冠状病毒SARS-CoV-2抗原的具体操作为：通过以BLP为载体，对原核表达的重组单链抗体scFV-S-PA进行结合，形成BLP/scFV-S-PA单链抗体复合体，以此单链抗体颗粒去结合待测样品中的抗原S蛋白或病毒颗粒，再利用抗S蛋白的IgG和酶标记的二抗对抗原S蛋白或病毒颗粒进行定量检测；
所述重组抗原PspA-PA的制备方法为：选择PspA家族2亚类4的α螺旋区和脯氨酸富集区序列，并在其脯氨酸富集区的C端融合表达锚定蛋白PA，通过化学合成基因序列，在合成前对序列进行优化，选择大肠杆菌偏爱的密码子，使其在大肠杆菌中高表达，然后将其克隆构建于pET20b原核表达载体上，转化入大肠杆菌BL21中进行表达，优化蛋白的表达条件，并进行诱导表达候选蛋白，通过His Trap亲和纯化柱获得目的蛋白PspA-PA；
所述重组抗原S-PA的制备方法为：SARS-CoV-2的S蛋白抗原为S蛋白的部分序列，通过基因工程技术在原核系统中进行表达和制备，作为含量测定的目标抗原；
所述重组单链抗体scFV-S-PA的制备方法为：选择一种抗S蛋白的单克隆抗体为母体，以其重链可变区为N端，轻链可变区为C端，通过连接肽相连，在单克隆抗体的C端融合表达锚定蛋白PA，通过化学合成基因序列，在合成前对序列进行优化，选择大肠杆菌偏爱的密码子，使其在大肠杆菌中高表达，然后将其克隆构建于pET20b原核表达载体上，转化入大肠杆菌BL21中进行表达，优化蛋白的表达条件，并进行诱导表达候选蛋白，通过His Trap亲和纯化柱获得目的蛋白scFV-S-PA。
2.根据权利要求1所述的基于细菌样颗粒检测细菌和病毒抗原、抗体的方法，其特征在于，所述BLP的制备方法为：将培养的乳酸乳球菌与三氯乙酸进行加热处理，通过洗涤纯化去除杂质，留下无生命力的肽聚糖壳，即为BLP。
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