CN115125153B - 一种半乳糖酵母样菌发酵产物滤液的制备方法及其应用 - Google Patents

一种半乳糖酵母样菌发酵产物滤液的制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种半乳糖酵母样菌发酵产物滤液的制备方法及其应用。本发明公开了阿萨希丝孢酵母（Trichosporon asahii）在制备半乳糖酵母样菌发酵产物滤液中的应用；由阿萨希丝孢酵母发酵制备得到的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液呈淡黄色透明状，带有轻微清新酒香，理化指标稳定，还可通过激活抗氧化系统去抑制促炎细胞因子的氧化应激，具有优异的抗氧化和抗炎等性能，可用于生产抗氧化和抗炎产品。

Description

一种半乳糖酵母样菌发酵产物滤液的制备方法及其应用
技术领域
本发明属于微生物发酵技术领域。更具体地，涉及一种半乳糖酵母样菌发酵产物滤液的制备方法及其应用。
背景技术
皮肤是人体最大的器官，也是人体与外界直接接触的第一道屏障，可防止人体脱水。皮肤内表皮细胞的分化、诱导表达等程序结合在一起建立的物理屏障可保护机体免受外部物理、化学和生物的侵害，例如创伤、UVB辐射和微生物感染，还可有效防止皮肤内部的水分流失，而皮肤屏障的老化和受损不仅会导致皮肤出现斑痕、皱纹、油腻等肌肤问题，还会对人体健康造成潜在的风险。
著名原料Pitera的起源来自于清酒工厂，研究者发现脸上满布皱纹的年迈酿酒师却拥有一双年轻细嫩的双手，这个强烈的对比吸引了众多研究者们对其进行研究，最后从酒曲所含酵母中找到一种菌种Geotrichum klebahnii，加以发酵、提炼，研发得到Pitera，Pitera作为SK-II的活性成分，是一种名为覆膜孢酵母属的特殊酵母在发酵过程中产生的半乳糖酵母样菌发酵产物，含有皮肤不可缺少的游离氨基酸、矿物质、有机酸、无机酸等，具有多种功效，如美白、补水、抗衰等。对于生产来说，菌种存在退化的问题，因此，寻找更多种类的半乳糖酵母样菌发酵产物对护肤品领域的发展相当必要。
能够代谢出半乳糖、在发酵过程中产生半乳糖酵母样菌发酵产物的菌很多，而不同菌发酵代谢有明显差异，因此，寻找能够发酵产生具有多种护肤功效且安全的菌种，及其发酵工艺的优化研究，是生产半乳糖酵母样菌发酵产物滤液的研发重点。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，旨在提供阿萨希丝孢酵母（Trichosporon asahii）在制备半乳糖酵母样菌发酵产物滤液中的应用。
本发明的另一目的是提供一种半乳糖酵母样菌发酵产物滤液的制备方法。
本发明的又一目的是提供上述方法制备得到的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液。
本发明的又一目的是提供上述半乳糖酵母样菌发酵产物滤液在制备医学、美容或化妆品用组合物中的应用。
本发明的再一目的是提供一种医学、美容或化妆品用组合物。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
由阿萨希丝孢酵母发酵制备得到的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液可通过激活抗氧化系统去抑制促炎细胞因子的氧化应激，具有优异的抗氧化和抗炎性能，因此，阿萨希丝孢酵母在制备半乳糖酵母样菌发酵产物滤液中的应用应当在本发明的保护范围之内。
本发明还提供了一种制备半乳糖酵母样菌发酵产物滤液的发酵剂，该发酵剂含有阿萨希丝孢酵母。
优选地，还含有阿萨希丝孢酵母发酵培养基。
进一步优选地，所述发酵培养基包括发酵培养基Y-1和发酵培养基Y-2；
所述发酵培养基Y-1包含以下质量百分数的各组分：酵母浸粉1.0～2.0%、蛋白胨1.5～2.5%、葡萄糖1.0～4.0%、乳糖0.5～2.0%，余量为水；
所述发酵培养基Y-2的制备方法为：将大米、小米、玉米渣、高粱的水提液依次进行酶解、加热、离心，再将离心所得上清液加入到发酵培养基Y-1中混匀即得。
本申请将由大米、小米、玉米渣、高粱组成的复合谷物进行水提、酶解，创造性地优化了发酵过程中所用的培养基，使培养基富含小分子、维生素及多种天然低聚糖类等成分，提高了阿萨希丝孢酵母的发酵效率、体内酶活性、次生代谢产物产率，以及半乳糖酵母样菌发酵产物滤液中的功效活性成分含量，进而显著提升了产物的品质。本发明解决了阿萨希丝孢酵母繁育和代谢慢的难题，使菌体生长速度显著加快，同时还限制了环境中杂菌的共生，提高了发酵产物的安全性。
进一步优选地，所述发酵培养基Y-1包含以下质量百分数的各组分：酵母浸粉1.3～1.8%、蛋白胨1.8～2.2%、葡萄糖1.5～3.0%、乳糖0.5～1.5%，余量为水。
最优选地，所述发酵培养基Y-1包含以下质量百分数的各组分：酵母浸粉1.5%、蛋白胨2%、葡萄糖2%、乳糖0.5～1.0%，余量为水。
优选地，所述水提液的制备方法为：向1～5质量份大米、1～5质量份小米、1～2质量份玉米渣、1～3质量份高粱加入60～120质量份水，在75～80℃下提取0.5～1.0h，即得到所述水提液。
进一步优选地，大米1～3质量份、小米1～3质量份、玉米渣1～2质量份、高粱1～2质量份、水80～120质量份。
最优选地，大米2质量份、小米2质量份、玉米渣1质量份、高粱2质量份、水100质量份。
优选地，所述酶解使用的酶为淀粉酶和/或蛋白酶。
进一步优选地，所述淀粉酶为耐高温α-淀粉酶、β-淀粉酶或异淀粉酶中的一种或几种。
进一步优选地，所述蛋白酶为复合蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、木瓜蛋白酶或中性蛋白酶中的一种或几种。
优选地，所述酶解使用的酶在水提液中的终浓度为0.05～0.1wt%。
优选地，所述酶解为在40～50℃下酶解2～10h。
进一步优选地，所述酶解为在45℃下酶解5～6h。
优选地，所述加热为在70～80℃下加热15～25min。最优选为在75℃下加热20min。
优选地，所述离心为在600～1000rpm/min下离心10～30min，最优选为在800rpm/min下离心20min。
优选地，所述上清液与发酵培养基Y-1的质量体积比为50～100g/L。最优选为75g/L。
优选地，所述混匀后，还进行灭菌。
进一步优选地，所述灭菌为在115～125℃下灭菌15～25min。最优选为在121℃下灭菌20min。
此外，本发明还提供了一种半乳糖酵母样菌发酵产物滤液的制备方法，由上述发酵剂发酵得到。
优选地，所述制备方法包括如下步骤：
S1. 厌氧发酵：将阿萨希丝孢酵母在发酵培养基Y-1中进行厌氧发酵，得到种子液；
S2. 微氧发酵：将S1所得种子液加入到发酵培养基Y-2中，进行微氧发酵，离心即得到所述半乳糖酵母样菌发酵产物滤液；
其中，S2所述微氧发酵在含氧量为1.0～5.0%的环境中进行。
优选地，所述阿萨希丝孢酵母在发酵培养基Y-1中的终浓度为1～2wt%。
优选地，S1所述厌氧发酵的温度为25～30℃，时间为48～60h，pH为4.0～6.0。
优选地，S1所述厌氧发酵在摇床上进行，所述摇床的转速为150～200rpm/min。最优选为180rpm/min。
优选地，S2所述种子液在发酵培养基Y-2中的终浓度为1～3wt%。
优选地，S2所述微氧发酵的温度为30～35℃，时间为20～28h，pH为4.5～6.0。最优选地，时间为24h。
优选地，S2所述微氧发酵的同时还进行搅拌，所述搅拌的转速为150～200rpm/min。最优选为180rpm/min。
优选地，S2所述微氧发酵采用巴氏灭菌终止发酵。
进一步优选地，所述巴氏灭菌的温度为60～65℃，时间为20～30min。
优选地，S2所述离心为在1800～2200rpm/min下离心10～30min，最优选为在2000rpm/min下离心20min。
优选地，S2所述离心后，还向离心所得上清液中加入抗氧化剂。
进一步优选地，所述抗氧化剂为苯甲酸钠、苯氧乙醇或对羟基苯乙酮的一种或几种。
更优选地，所述抗氧化剂与上清液的质量比为0.3～1.0：100。
上述半乳糖酵母样菌发酵产物滤液不仅呈淡黄色，纯净透明，涂抹于皮肤上有明显的滋润感和滑感，且带有轻微清新酒香，气味清新柔和，电导率较低（300～600us/cm），理化指标稳定；还显著提升了菌体发酵的效率和次生代谢产物的含量，可通过激活抗氧化系统去抑制促炎细胞因子的氧化应激，具有优异的抗氧化和抗炎性能，因此，上述方法制备得到的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液，以及上述半乳糖酵母样菌发酵产物滤液在制备医学、美容或化妆品用组合物中的应用均应在本发明的保护范围之内。
此外，本发明还提供了一种医学、美容或化妆品用组合物，该组合物包含上述半乳糖酵母样菌发酵产物滤液，以及医学、美容或化妆品用可接受的基质。
优选地，所述化妆品为精华液、面膜液、啫喱、乳液、面霜、眼霜、泥膜中的一种或几种。
进一步优选地，所述精华液包含以下质量百分数的各组分：半乳糖酵母样菌发酵产物滤液3～7%，对羟基苯乙酮0.2～0.6%、1,2-己二醇0.5～0.7%、941卡波0.05～0.15%、三乙醇胺0.08～0.12%、EDTA二钠0.01～0.03%，余量为水。
最优选地，所述精华液包含以下质量百分数的各组分：半乳糖酵母样菌发酵产物滤液5%，对羟基苯乙酮0.4%、1,2-己二醇0.6%、941卡波0.1%、三乙醇胺0.1%、EDTA二钠0.02%，余量为水。
本发明具有以下有益效果：
1. 本发明提供了一种生产制备半乳糖酵母样菌发酵产物滤液的发酵菌新选择，即阿萨希丝孢酵母。本发明以阿萨希丝孢酵母发酵制备得到的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液可通过激活抗氧化系统去抑制促炎细胞因子的氧化应激，具有优异的抗氧化和抗炎性能。
2. 本发明采用厌氧发酵和微氧发酵的多级培养模式，结合特定的培养基，不仅改善了半乳糖酵母样菌发酵产物滤液的外观和气味，使半乳糖酵母样菌发酵产物滤液呈淡黄色透明状，带有轻微清新酒香，理化指标更稳定，还显著提升了菌体发酵的效率和次生代谢产物的含量，可通过激活抗氧化系统去抑制促炎细胞因子的氧化应激，具有优异的抗氧化和抗炎性能。
3. 本发明的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液性能温和、无皮肤刺激性，作为精华液的活性成分，使精华液不仅具有优异的保湿、提亮、控油、抗敏性能，还具有收敛毛孔、修复皮肤屏障、改善肌肤损伤红肿等功效。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
以下实施例所用阿萨希丝孢酵母为市购。具体实施例1～11和对比例1～-3的阿萨希丝孢酵母购自山东杰凯生物科技有限公司，实施例12的阿萨希丝孢酵母购自北京百欧博伟生物技术有限公司，实施例13的阿萨希丝孢酵母购自上海莼试生物技术有限公司。
实施例1 一种半乳糖酵母样菌发酵产物滤液的制备
S1. 厌氧发酵：向1000mL发酵培养基Y-1中加入阿萨希丝孢酵母，使阿萨希丝孢酵母在发酵培养基Y-1中的终浓度为2wt%，再在30℃、pH 5.0、180rpm/min下厌氧发酵摇床培养48h，得到种子液；
S2. 微氧发酵：将S1所得种子液加入到发酵培养基Y-2中，使种子液在发酵培养基Y-2中的终浓度为2wt%，再在35℃、pH 5.0、180rpm/min下微氧发酵搅拌培养24h后，在65℃下巴氏灭菌20min终止发酵，在2000rpm/min下离心20min，向离心所得上清液中加入对羟基苯乙酮（使对羟基苯乙酮与上清液的质量比为0.5：100），即得到所述半乳糖酵母样菌发酵产物滤液；
其中，所述微氧发酵在含氧量为2.0%的环境中进行；
所述发酵培养基Y-1包含以下质量百分数的各组分：酵母浸粉1.5%、蛋白胨2%、葡萄糖2%、乳糖0.5%，余量为水；
所述发酵培养基Y-2的制备方法为：向2质量份大米、2质量份小米、1质量份玉米渣、2质量份高粱加入100质量份纯化水，在75℃下提取0.5h，得到水提液，再向水提液加入质量比为1：1：1的耐高温α-淀粉酶、β-淀粉酶、复合蛋白酶，使总酶用量在水提液中的终浓度为0.1wt%，在45℃下酶解5h，然后在75℃下加热20min，在800rpm/min下离心20min，最后将离心所得上清液与发酵培养基Y-1按75g/L的质量体积比混匀，在121℃下灭菌20min，即得到所述发酵培养基Y-2。
实施例2一种半乳糖酵母样菌发酵产物滤液的制备
同实施例1的制备方法，区别在于：
（1）所述发酵培养基Y-1中各组分的质量百分数为：酵母浸粉1.8%、蛋白胨1.8%、葡萄糖3.0%、乳糖0.5%，余量为水；
（2）所述发酵培养基Y-2的制备方法中，大米、小米、玉米渣、高粱、纯化水的质量比为1：3：2：1：80。
实施例3一种半乳糖酵母样菌发酵产物滤液的制备
同实施例1的制备方法，区别在于：
（1）所述发酵培养基Y-1中各组分的质量百分数为：酵母浸粉1.3%、蛋白胨2.2%、葡萄糖1.5%、乳糖1.5%，余量为水；
（2）所述发酵培养基Y-2的制备方法中，大米、小米、玉米渣、高粱、纯化水的质量比为3：1：1：2：120。
实施例4一种半乳糖酵母样菌发酵产物滤液的制备
S1. 厌氧发酵：向1000mL发酵培养基Y-1中加入阿萨希丝孢酵母，使阿萨希丝孢酵母在发酵培养基Y-1中的终浓度为2wt%，再在25℃、pH 4.0、150rpm/min下厌氧发酵摇床培养48h，得到种子液；
S2. 微氧发酵：将S1所得种子液加入到发酵培养基Y-2中，使种子液在发酵培养基Y-2中的终浓度为3wt%，再在35℃、pH 6.0、150rpm/min下微氧发酵搅拌培养28h后，在65℃下巴氏灭菌20min终止发酵，在1800rpm/min下离心30min，向离心所得上清液中加入苯氧乙醇（使苯氧乙醇与上清液的质量体积比为1.0：100），即得到所述半乳糖酵母样菌发酵产物滤液；
其中，所述微氧发酵在含氧量为1.0%的环境中进行；
所述发酵培养基Y-1包含以下质量百分数的各组分：酵母浸粉1.0%、蛋白胨2.5%、葡萄糖4.0%、乳糖0.5%，余量为水；
所述发酵培养基Y-2的制备方法为：向5质量份大米、1质量份小米、2质量份玉米渣、1质量份高粱加入60质量份纯化水，在75℃下提取0.5h，得到水提液，再向水提液加入质量比为1：1的β-淀粉酶、枯草杆菌蛋白酶，使总酶用量在水提液中的终浓度为0.1wt%，在50℃下酶解2h，然后在70℃下加热25min，在600rpm/min下离心30min，最后将离心所得上清液与发酵培养基Y-1按50g/L的质量体积比混匀，在115℃下灭菌25min，即得到所述发酵培养基Y-2。
实施例5一种半乳糖酵母样菌发酵产物滤液的制备
S1. 厌氧发酵：向1000mL发酵培养基Y-1中加入阿萨希丝孢酵母，使阿萨希丝孢酵母在发酵培养基Y-1中的终浓度为1wt%，再在30℃、pH 6.0、200rpm/min下厌氧发酵摇床培养60h，得到种子液；
S2. 微氧发酵：将S1所得种子液加入到发酵培养基Y-2中，使种子液在发酵培养基Y-2中的终浓度为1wt%，再在30℃、pH 4.5、200rpm/min下微氧发酵搅拌培养20h后，在60℃下巴氏灭菌30min终止发酵，在2200rpm/min下离心10min，向离心所得上清液中加入苯甲酸钠（使苯甲酸钠与上清液的质量比为0.3：100），即得到所述半乳糖酵母样菌发酵产物滤液；
其中，所述微氧发酵在含氧量为5.0%的环境中进行；
所述发酵培养基Y-1包含以下质量百分数的各组分：酵母浸粉2.0%、蛋白胨1.5%、葡萄糖1.0%、乳糖2.0%，余量为水；
所述发酵培养基Y-2的制备方法为：向1质量份大米、5质量份小米、1质量份玉米渣、3质量份高粱加入120质量份纯化水，在80℃下提取1.0h，得到水提液，再向水提液加入质量比为1：1的耐高温α-淀粉酶、木瓜蛋白酶，使总酶用量在水提液中的终浓度为0.05wt%，在40℃下酶解10h，然后在80℃下加热15min，在1000rpm/min下离心10min，最后将离心所得上清液与发酵培养基Y-1按100g/L的质量体积比混匀，在125℃下灭菌15min，即得到所述发酵培养基Y-2。
实施例6一种半乳糖酵母样菌发酵产物滤液的制备
同实施例1的制备方法，区别在于，所述发酵培养基Y-2的制备方法中，大米、小米、玉米渣、高粱、纯化水的质量比为2：1：1：1：120。
实施例7一种半乳糖酵母样菌发酵产物滤液的制备
同实施例1的制备方法，区别在于，所述发酵培养基Y-2的制备方法中，大米、小米、玉米渣、高粱、纯化水的质量比为1：1：1：2：80。
实施例8一种半乳糖酵母样菌发酵产物滤液的制备
同实施例1的制备方法，区别在于，所述发酵培养基Y-2的制备方法中，上清液与发酵培养基Y-1的质量体积比为100g/L。
实施例9一种半乳糖酵母样菌发酵产物滤液的制备
同实施例1的制备方法，区别在于，S1所述阿萨希丝孢酵母在发酵培养基Y-1中的终浓度为1wt%。
实施例10一种半乳糖酵母样菌发酵产物滤液的制备
同实施例1的制备方法，区别在于，S1所述阿萨希丝孢酵母在发酵培养基Y-1中的终浓度为1wt%，且所述厌氧摇床培养的时间为60h。
实施例11一种半乳糖酵母样菌发酵产物滤液的制备
同实施例1的制备方法，区别在于，S2所述微氧发酵在含氧量为5.0%的环境中进行；且所述种子液在发酵培养基Y-2中的终浓度为3wt%。
实施例12 一种半乳糖酵母样菌发酵产物滤液的制备
同实施例1的制备方法，区别在于，所用阿萨希丝孢酵母购自北京百欧博伟生物技术有限公司。
实施例13 一种半乳糖酵母样菌发酵产物滤液的制备
同实施例1的制备方法，区别在于，所用阿萨希丝孢酵母购自上海莼试生物技术有限公司。
对比例1
同实施例1的制备方法，区别在于，将S2微氧发酵使用的发酵培养基Y-2替换为发酵培养基Y-1。
对比例2
同实施例1的制备方法，区别在于，所述发酵培养基Y-2的制备方法中，不进行酶解和加热，即所述发酵培养基Y-2的制备方法为：向2质量份大米、2质量份小米、1质量份玉米渣、2质量份高粱加入100质量份纯化水，在75℃下提取0.5h，得到水提液，冷却至45℃，在800rpm/min下离心20min，最后将离心所得上清液与发酵培养基Y-1按75g/L的质量体积比混匀，在121℃下灭菌20min，即得到所述发酵培养基Y-2。
对比例3
同实施例1的制备方法，区别在于，将S2所述微氧发酵替换为厌氧发酵，即S2具体为：将S1所得种子液加入到发酵培养基Y-2中，使种子液在发酵培养基Y-2中的终浓度为2wt%，再在35℃、pH 5.0、180rpm/min下厌氧发酵摇床培养24h后，在65℃下巴氏灭菌20min终止发酵，在2000rpm/min下离心20min，向离心所得上清液中加入对羟基苯乙酮，即得到所述半乳糖酵母样菌发酵产物滤液。
对比例4
SK-II精华露（内含90%Pitera），市购。
测试例1 半乳糖酵母样菌发酵产物滤液的理化指标测试
一、测试方法
（1）外观和气味：
分别将100g实施例1～13和对比例1～3所得半乳糖酵母样菌发酵产物滤液、对比例4 SK-II精华露置于洁净烧杯中，观察外观，嗅闻气味。
（2）固含量测试：
分别将2g（m0）实施例1～13和对比例1～3所得半乳糖酵母样菌发酵产物滤液、对比例4 SK-II精华露置于95℃下干燥120min，取出放入干燥器中，冷却至25℃后，称重m1；再按照固含量=（m1/m0）*100%的公式计算固含量。
（3）刺激性测试：
分别将实施例1～13所得半乳糖酵母样菌发酵产物滤液按照《化妆品安全技术规范》（2015年版）第六章4的方法进行多次皮肤刺激性试验，按照《化妆品安全技术规范》（2015年版）第六章5的方法进行急性眼刺激性试验。
（4）菌体浓度及成分含量检测：
分别取实施例1～13和对比例1～3所得半乳糖酵母样菌发酵产物滤液、对比例4SK-II精华露在4000r/min的转速下离心20min后，弃上清液，收集湿菌体，计算湿菌体在滤液中的浓度，以及滤液/精华露中小分子多肽、总糖、氨基酸、有机酸的含量。
二、测试结果
测试结果如表1和表2所示。
表1
Figure 209103DEST_PATH_IMAGE001
表中“-”表示未测。
表2
Figure 798347DEST_PATH_IMAGE002
由表1和表2可知，实施例1～13所得半乳糖酵母样菌发酵产物滤液在固含量、外观、气味、湿菌体浓度、小分子多肽含量、总糖含量、氨基酸含量、有机酸含量等方面的表现均显著优于对比例1～4，可见，本发明以阿萨希丝孢酵母为发酵菌，采用厌氧发酵和微氧发酵的多级培养模式，结合特定的培养基，不仅改善了半乳糖酵母样菌发酵产物滤液的外观和气味，使半乳糖酵母样菌发酵产物滤液呈淡黄色透明状，带有轻微清新酒香，理化指标更稳定，还显著提升了菌体发酵的效率和次生代谢产物的含量。
测试例2 半乳糖酵母样菌发酵产物滤液的功效测试
一、测试方法
（1）DPPH自由基清除率测试
样品组：取2 μL实施例1～13和对比例1～3所得半乳糖酵母样菌发酵产物滤液、对比例4 SK-II精华露分别溶解于98 μL蒸馏水中，并向体系中加入100 μL 0.1 mM的DPPH溶液；
对照组：在100μL蒸馏水中加入100μL 0.1 mM的DPPH溶液。
实验在96孔板中进行，每组设置三个复孔，体系为200 μL。体系构建完成后，避光摇晃10 min，测定各组样品在520 nm处的吸光度，并按清除率%=[（A0-Ax）/A0] ×100%的公式计算DPPH自由基清除率，其中，A0为对照组；Ax为样品组。
（2）炎症因子抑制实验
以RAW 264.7巨噬细胞为研究对象，首先通过MTT细胞增殖实验分别确定待实施例1～13和对比例1～3所得半乳糖酵母样菌发酵产物滤液、对比例4 SK-II精华露的最适作用浓度为1%，再通过脂多糖LPS（细菌内毒素）刺激细胞，建立细胞炎症模型，分别加入实施例1～13和对比例1～3所得半乳糖酵母样菌发酵产物滤液、对比例4 SK-II精华露、0.5% 槲皮素（加入槲皮素的组别作为阳性对照），培养24小时，收集细胞上清，最后采用ELISA试剂盒分析RAW264.7巨噬细胞的促炎性炎症因子TNF-α的释放量水平。
二、测试结果
测试结果如表3所示。
表3
Figure 109243DEST_PATH_IMAGE003
由表3可知，实施例1～13所得半乳糖酵母样菌发酵产物滤液的DPPH自由基清除率和TNF-α抑制率均显著高于对比例1～4，可见，本发明以阿萨希丝孢酵母为发酵菌，采用厌氧发酵和微氧发酵的多级培养模式，结合特定的培养基，制备得到的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液可通过激活抗氧化系统抑制促炎细胞因子的氧化应激，具有优异的抗氧化和抗炎性能。
此外，以实施例1所得半乳糖酵母样菌发酵产物滤液为例，本发明委托了广州华淼检测服务有限公司对其进行检测，测得其透明质酸酶抑制率（样品稀释成5%（v/v）水溶液）为38.744±4.929%，表明本发明的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液具有优异的抗敏功效。
本发明还委托了广东省产品质量检测有限公司对实施例1所得半乳糖酵母样菌发酵产物滤液进行检测，测得2%（v/v）的样品稀释液的5α-还原酶抑制率为53.21%，5%（v/v）的样品稀释液的5α-还原酶抑制率为59.48%，表明本发明的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液具有优异的控油功效。
测试例3 精华液的短期持久性测试和长期改善效果测试
将实施例1～7、12、13和对比例1～3所得半乳糖酵母样菌发酵产物滤液按以下质量百分比的各成分制备成精华液：半乳糖酵母样菌发酵产物滤液5%、对羟基苯乙酮0.4%、1,2-己二醇0.6%、941卡波0.1%、三乙醇胺0.1%、EDTA 二钠0.02%，余量为水；对比例4采用SK-II精华露原液；将不加入半乳糖酵母样菌发酵产物滤液的精华液（即由以下质量百分比的各成分制备得到：对羟基苯乙酮0.4%、1,2-己二醇0.6%、941卡波0.1%、三乙醇胺0.1%、EDTA二钠0.02%，余量为水）作为空白对照组。
一、水分含量测试
采用电容法测定人体皮肤角质层的水分含量，基于水和其他物质的介电常数差异显著，按照皮肤角质层水分含量的不同，测得皮肤的电容值不同，因此，电容值可代表皮肤水分含量。
在待选志愿者（35～45周岁，女性）的两只手臂内侧随机选取两个标定区域（结果取平均值），采用电容法皮肤水分测定仪分别测定皮肤角质层的水分含量，选择涂抹前皮肤角质层的水分含量接近的志愿者进行涂抹使用实验。最终选择的志愿者按表4所示分组，每组15人。
以上述志愿者的两只手臂内侧随机选取的两个标定区域作为精华液涂抹区域，采用乳胶指套将2.0mg/cm2的实施例1～7、12、13和对比例1～3所得精华液和对比例4精华露分别涂抹均匀，采用电容法皮肤水分测定仪分别测定精华液涂抹区域于涂抹前，以及抹匀后的0小时、2小时、4小时、8小时的人体皮肤角质层的水分含量。结果如表4所示。
表4 皮肤角质层水分含量测定结果（%）
Figure 910977DEST_PATH_IMAGE004
由表4可知，实施例1～7、12、13半乳糖酵母样菌发酵产物滤液所制得的精华液保水性能显著优于对比例1～4，可见，本发明以阿萨希丝孢酵母为发酵菌，采用厌氧发酵和微氧发酵的多级培养模式，结合特定的培养基，制得的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液作为精华液的活性成分，可使精华液具有优秀的保湿性能。
二、持久控油效果测试
采用Sebumeter测试法对精华液的持久控油效果进行测试。基于分光光度计的工作原理，采用胶带吸收人体皮肤上的油脂，消光胶带的透光量会发生变化，吸收的油脂越多，透光量就会越大，进而能通过透光量测定皮肤油脂的含量。
在恒温恒湿室（温度21±1℃、相对湿度50±10％）中，先测量待选志愿者（35～45周岁，女性）面部皮肤油脂含量的原始值，选择涂抹前面部皮肤油脂含量接近的志愿者进行涂抹使用实验。最终选择的志愿者按表5所示分组，每组15人。
以上述志愿者的面部皮肤油脂含量的原始值为表5中“涂抹前”，再使用基准洁面乳清洁志愿者的面部，擦干后测量皮肤油脂含量的初始值（即为表5中“清洁后”）。之后在志愿者面部分别使用1.0g实施例1～7、12、13和对比例1～3所得精华液和对比例4精华露，涂抹均匀，测试抹匀后的2小时、4小时、8小时的皮肤油脂量。结果如表5所示。
表5皮肤油脂量测定结果（µg/ cm2）
Figure 256507DEST_PATH_IMAGE005
由表5可知，实施例1～7、12、13半乳糖酵母样菌发酵产物滤液所制得的精华液控油性能显著优于对比例1～4，可见，本发明以阿萨希丝孢酵母为发酵菌，采用厌氧发酵和微氧发酵的多级培养模式，结合特定的培养基，制得的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液作为精华液的活性成分，可使精华液具有优秀的持久控油性能。
三、长期改善效果测试
对实施例1～7、12、13和对比例1～3所得精华液和对比例4精华露的使用效果进行4周时间的跟踪测试。
首先，将待选志愿者（35～45周岁，女性）分别清洁面部后，用VISIA全脸分析仪和皮肤测试仪对皮肤指标（油脂量、红色区域面积、含水量、水分流失量、亮度）进行测试，此时的测试结果作为初始皮肤指标，选择皮肤指标接近的志愿者进行涂抹实验，最终选择的志愿者按表6所示分组，每组15人。
上述志愿者分别使用实施例1～7、12、13和对比例1～3所得精华液和对比例4精华露按摩至吸收，每日早上和晚上洁面后各使用1次，每次约0.5mL，连续使用4周（测试期间不得更换或合用其它同类产品），并于4周结束后的次日早上，洁面后（当天不涂抹产品）用VISIA全脸分析仪和皮肤测试仪对皮肤指标（油脂量、红色区域面积、含水量、水分流失量、亮度）进行测试，将得到的测试结果与前述初始皮肤指标进行比较，相应变化率（油脂变化率、红色区域变化率、含水量提升率、水分流失变化率、亮度提升率）如表6所示。
表6
Figure 485494DEST_PATH_IMAGE006
由表6可知，实施例1～7、12、13半乳糖酵母样菌发酵产物滤液所制得的精华液在油脂变化率、红色区域变化率、含水量提升率、水分流失变化率、亮度提升率等发面的表现均显著优于对比例1～4，可见，本发明以阿萨希丝孢酵母为发酵菌，采用厌氧发酵和微氧发酵的多级培养模式，结合特定的培养基，制得的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液作为精华液的活性成分，可使精华液具有优秀的保湿和提亮性能，可有效修复皮肤屏障、改善肌肤损伤红肿。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (15)

1.一种半乳糖酵母样菌发酵产物滤液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1. 厌氧发酵：将阿萨希丝孢酵母在发酵培养基Y-1中进行厌氧发酵，得到种子液；
S2. 微氧发酵：将S1所得种子液加入到发酵培养基Y-2中，进行微氧发酵，离心即得到所述半乳糖酵母样菌发酵产物滤液；
其中，S1所述发酵培养基Y-1包含以下质量百分数的各组分：酵母浸粉1.0～2.0%、蛋白胨1.5～2.5%、葡萄糖1.0～4.0%、乳糖0.5～2.0%，余量为水；S2所述发酵培养基Y-2的制备方法为：将大米、小米、玉米渣、高粱的水提液依次进行酶解、加热、离心，再将离心所得上清液加入到发酵培养基Y-1中混匀即得；所述水提液的制备方法为：向1～5质量份大米、1～5质量份小米、1～2质量份玉米渣、1～3质量份高粱加入60～120质量份水，在75～80℃下提取0.5～1.0h，即得到所述水提液；S2所述微氧发酵在含氧量为1.0～5.0%的环境中进行。
2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述发酵培养基Y-1包含以下质量百分数的各组分：酵母浸粉1.3～1.8%、蛋白胨1.8～2.2%、葡萄糖1.5～3.0%、乳糖0.5～1.5%，余量为水。
3.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述加热为在70～80℃下加热15～25min。
4.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述上清液与发酵培养基Y-1的质量体积比为50～100g/L。
5.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述阿萨希丝孢酵母在发酵培养基Y-1中的终浓度为1～2wt%。
6.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，S1所述厌氧发酵的温度为25～30℃，时间为48～60h，pH为4.0～6.0。
7.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，S2所述种子液在发酵培养基Y-2中的终浓度为1～3wt%。
8.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，S2所述微氧发酵的温度为30～35℃，时间为20～28h，pH为4.5～6.0。
9.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，S2所述离心为在1800～2200rpm/min下离心10～30min。
10.权利要求1～9任一所述方法制备得到的半乳糖酵母样菌发酵产物滤液。
11.权利要求10所述半乳糖酵母样菌发酵产物滤液在制备医学、美容或化妆品用组合物中的应用。
12.一种医学、美容或化妆品用组合物，其特征在于，包含权利要求10所述半乳糖酵母样菌发酵产物滤液，以及医学、美容或化妆品用可接受的基质。
13.根据权利要求12所述组合物，其特征在于，所述化妆品为精华液、面膜液、啫喱、乳液、面霜、眼霜、泥膜中的一种或几种。
14.根据权利要求13所述组合物，其特征在于，所述精华液包含以下质量百分数的各组分：半乳糖酵母样菌发酵产物滤液3～7%，对羟基苯乙酮0.2～0.6%、1,2-己二醇0.5～0.7%、941卡波0.05～0.15%、三乙醇胺0.08～0.12%、EDTA二钠0.01～0.03%，余量为水。
15.根据权利要求14所述组合物，其特征在于，所述精华液包含以下质量百分数的各组分：半乳糖酵母样菌发酵产物滤液5%，对羟基苯乙酮0.4%、1,2-己二醇0.6%、941卡波0.1%、三乙醇胺0.1%、EDTA二钠0.02%，余量为水。
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