CN115074285A - 一种双歧杆菌酶解溶胞产物及其制备工艺与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了双歧杆菌酶解溶胞产物及其制备工艺与应用，采用固态发酵法制备燕麦培养基；筛选具有抗氧化活性的多个双歧杆菌菌种，分别接种于所述燕麦培养基中发酵，获得每一双歧杆菌菌种的种子液；配置培养基，将获得的多个双歧杆菌菌种的种子液中的某一菌种或某两菌种的种子液在培养基中进行接种，经一次发酵，获得一次发酵产物；向一次发酵产物中加入营养物质及与用于一次发酵相同的种子液后进行二次发酵，获得二次发酵产物；将二次发酵产物离心，过滤，高压均质裂解获得双歧杆菌溶胞液和细胞壁碎片；将获得的细胞壁碎片进行酶解处理，离心，过滤，获得细胞碎片酶解液；将所述双歧杆菌溶胞液和细胞碎片酶解液复配获得所述双歧杆菌酶解溶胞产物。

Description

一种双歧杆菌酶解溶胞产物及其制备工艺与应用
技术领域
本发明涉及益生菌发酵技术领域，特别涉及一种双歧杆菌酶解溶胞产物及其制备工艺与应用。
背景技术
双歧杆菌是人体内存在的一种生理性细菌，是人体有益菌中最值得重视和研究的一种，它与人体的健康密不可分。可以说是大自然赐予人类的健康法宝。
正如人们的肠道一样，人们的皮肤上也生活着数以亿计的微生物。这些种类繁多的微生物之间，以及与人们的皮肤之间，彼此相互作用，相互影响，共同构成了皮肤的微生态系统。目前，皮肤微生态理念的产品开发思路主要通过添加益生菌发酵产物，为皮肤建立益生态环境提供营养物质条件，从而在一定程度上实现皮肤微生态维护的作用。
现有技术双歧杆菌发酵溶胞产物制备工艺中，在发酵工艺后对细胞的处理方式通常为离心等方式将细胞及培养基残留成份分离，该方法造成细胞中活性成份的损失；或者通过细胞裂解，将细胞壁碎片化后，形成碎片与溶胞液共存产物，该方法细胞壁碎片较大，沉淀在溶胞液下层，在化妆品中应用，细胞壁碎片沉淀物不仅会影响产品外观，而且不利于细胞壁碎片中活性成份的吸收利用。
发明内容
本申请的一个目的在于提供一种双歧杆菌酶解溶胞产物，该产物中可溶性的多糖含量是传统发酵工艺产物中多糖含量的18.32倍，水解氨基酸提升19.04％。
本申请的另一个目的在于提供双歧杆菌酶解溶胞产物的制备工艺及应用。
为达上述目的，本方案如下：
采用固态发酵法制备燕麦培养基；
筛选具有抗氧化活性的多个双歧杆菌菌种，分别接种于所述燕麦培养基中进行发酵，获得每一种双歧杆菌菌种的种子液；
配置培养基，将获得的多个双歧杆菌菌种的种子液中的某一菌种或某两菌种的种子液在培养基中进行接种，经一次发酵，获得一次发酵产物；
向一次发酵产物中加入营养物质及与用于一次发酵相同的种子液后进行二次发酵，获得二次发酵产物；
将二次发酵产物离心，过滤，高压均质裂解获得双歧杆菌溶胞液和细胞壁碎片；
将获得的细胞壁碎片进行酶解处理，离心，过滤，获得细胞碎片酶解液；
将所述双歧杆菌溶胞液和细胞碎片酶解液复配获得所述双歧杆菌酶解溶胞产物。
优选的，所述固态发酵法制备燕麦培养基步骤如下：
将燕麦脱皮置于95-100℃去离子水中浸煮，捞出冷却，加入酵母菌混合均匀，撒白糖进行固态发酵获得固态发酵产物；
将固态发酵产物粉碎，加入去离子水，保温，搅拌，过筛得滤液，向滤液中加入葡萄糖、琼脂搅拌均匀获得燕麦培养基。
优选的，所述细胞碎片酶解液获得步骤如下：
向高压均质裂解获得的细胞壁碎片中加入酶进行酶解处理，调节PH值至 8～8.5，水浴温度52～58℃，加热时间3～4小时；
然后将上述反应置于水浴温度90～95℃，加热15～20min进行酶灭活；
灭活后置于冰箱冷藏，离心，分离出上清液为细胞碎片酶解液；
优选的，所述将获得的细胞壁碎片进行酶解处理中使用的酶为糖苷水解酶和下述酶中的一种：
Alcalase碱性蛋白酶，动物蛋白酶、植物蛋白酶和微生物蛋白酶。
优选的，所述双歧杆菌菌种包括青春双歧杆菌、动物双歧杆菌、短双歧杆菌、及长双歧杆菌和嗜热双歧杆菌中的一种或两种。
优选的，所述将获得的多个双歧杆菌菌种的种子液中的某一菌种或某两菌种的种子液在培养基中进行接种中的培养基以培养基总重计，由如下质量百分含量的组分组成：燕麦培养基40～80wt％、复合维生素0.1～0.2wt％、尿素 0.1～0.2wt％，余量为种子液。
优选的，所述向一次发酵产物中加入营养物质包括葡萄糖和水苏糖，以一次发酵产物的总重计，向一次发酵产物中加入葡萄糖的质量百分含量为 0.5～2wt％；加入水苏糖的质量百分含量为0.05～0.1wt％。
优选的，所述一次发酵产物中总糖含量为0.5wt％以下，pH值在4.5以下；所述二次发酵产物中pH值在4.5以上。
优选的，所述双歧杆菌溶胞液和细胞碎片酶解液复配获得所述双歧杆菌酶解溶胞产物的步骤包括：
向双歧杆菌溶胞液和细胞碎片酶解液混合液体中加入对羟基苯乙酮和已二醇、戊二醇和甲基丙二醇中的一种或几种。
经上述步骤制备的双歧杆菌酶解溶胞产物可在妆品中应用。
本发明的有益效果如下：
本申请通过固态燕麦发酵培养基与液态发酵工艺相结合的形式制备双歧杆菌酶解溶胞产物，与单一液态发酵溶胞产物相比抗氧化性能提升20％；本申请采用燕麦发酵滤液制备培养基，含有丰富的糖源、氮源和无机物，与传统培养基相比可以减少引入硫酸锰、牛肉冻等成份，大大提升了双歧杆菌发酵产物的安全性，减少了不良气味的产生；本申请增加酶解工艺即将发酵后的细胞碎片进行酶解处理得到可溶性多糖、小分子肽；增加酶解工艺制备的双歧杆菌酶解溶胞产物中多糖含量是传统发酵工艺溶胞产物中多糖含量的18.32倍，其中的水解氨基酸相比提升19.04％。本申请中细胞壁碎片经过酶解，形成水溶性成份，产物中无沉淀，有利于在化妆品多种剂型中使用，无需考虑细胞壁碎片对产品外观的影响。
附图说明
为了更清楚地说明本方案的实施，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本方案的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为固态发酵燕麦培养基制备工艺流程图；
图2为双歧杆菌酶解溶胞产物制备工艺流程图；
图3为刚制备完成的本申请双歧杆菌酶解溶胞产物(右)与传统双歧杆菌溶胞产物(左)图；
图4为静置三小时的本申请双歧杆菌酶解溶胞产物(右)与传统双歧杆菌溶胞产物(左)图。
具体实施方式
下面对本申请的实施方式作进一步地详细描述，显然，所描述的实施例仅是本申请的一部分实施例，而不是所有实施例的穷举。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等(如果存在) 是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的实施例能够以除了在这里图示或描述的内容以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备，不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
双歧杆菌发酵溶胞产物，是经双歧杆菌发酵后处理得到的生理溶胞产物，主要成分为细胞代谢产物、胞质片段、多糖、蛋白质与多肽等。大量的体外实验证实了双歧杆菌发酵溶胞产物中的多种氨基酸、蛋白质和各类分子介质具有调节平衡肌肤、调节免疫机能的功效，也同样是人类皮肤细胞的营养分子，具有一定的抗皱、紧致、修护、防晒、抗氧化、抗衰老作用，并能够防止紫外线等外源刺激的损害，促进损伤DNA的修复，这些优势使得双歧杆菌发酵溶胞产物广泛应用于护肤产品中以改善肤质，具有极大的市场前景。但目前用于化妆品原料的双歧杆菌发酵溶胞产物制备工艺存在功效活性成分如蛋白和易于皮肤吸收的小分子多肽含量较少等问题，影响发酵产物溶胞物的品质。
本申请通过采用固态发酵燕麦培养基和液态发酵工艺相结合的方式制备双歧杆菌酶解溶胞产物，制备的双歧杆菌溶胞产物与单一液态发酵溶胞产物相比抗氧化性能提升20％；本申请增加酶解工艺即将发酵后的细胞碎片进行酶解处理得到可溶性多糖、小分子肽；增加酶解工艺制备的双歧杆菌酶解溶胞产物中多糖含量是传统发酵工艺溶胞产物中多糖含量的18.32倍，其中的水解氨基酸相比提升19.04％，本申请酶解工艺使用的酶不限于Alcalase碱性蛋白酶，还可使用包括动物蛋白酶、植物蛋白酶及微生物蛋白酶等。
实施例
1.固态发酵法制备燕麦培养基
图1为本实施例中固态发酵法制备燕麦培养基的工艺流程；
将质量份数100份的燕麦进行脱皮处理，然后放置在95～100℃去离子水中浸煮4小时，至燕麦软烂捞出，冷却至室温；
将质量分数0.4份的酵母菌均匀撒在冷却后的燕麦上，翻拌使酵母菌和冷却后的燕麦混合均匀，然后再在表面均匀撒满白糖直至表面完全被白糖覆盖，最后盖上带排气功能的盖子，在20-30℃环境中静置7天，进行固态发酵；
将固态发酵后的燕麦进行破壁粉碎，然后按质量比1：50加入到去离子水中，保温85～90℃搅拌2小时，过300目双层筛，收集滤液备用；
按各物质占培养基的总质量的质量百分比，将0.5wt％葡萄糖、2.0wt％琼脂和97.5wt％滤液混合，搅拌均匀，即得燕麦培养基。
2.液态发酵法制备双歧杆菌酶解溶胞产物
图2为本实施例中2.1～2.7步骤液态发酵法制备双歧杆菌酶解溶胞产物的工艺流程。
2.1获得双歧杆菌种子液
将基于16S rDNA测序技术得到的不同种的双歧杆菌，包括青春双歧杆菌、角双歧杆菌、动物双歧杆菌、星状双歧杆菌、两歧双歧杆菌、牛双歧杆菌、短双歧杆菌、齿双歧杆菌、婴儿双歧杆菌即长双歧杆菌婴儿亚种、乳双歧杆菌即动物双歧乳脂亚种、长双歧杆菌、假小链双歧杆菌以及嗜热双歧杆菌和嗜酸热双歧杆菌，经过发酵后安全性筛选，选出安全性高的菌种：青春双歧杆菌、动物双歧杆菌、短双歧杆菌、及长双歧杆菌和嗜热双歧杆菌；
将上述选出的安全性高的菌种中的一种或者两种按燕麦培养基质量的 3wt％～10wt％接种，于36～38℃发酵2天(约48小时)，通过镜检，确保双歧杆菌活化，获得双歧杆菌种子液。
2.2获得一次发酵产物
按各物质占培养基的总质量的质量百分比，将燕麦培养基40～80wt％、复合维生素0.1～0.2wt％、尿素0.1～0.2wt％和双歧杆菌种子液补充余量，混合搅拌均匀后进行厌氧发酵；
厌氧发酵的条件为36～38℃，20～24h，总糖含量降至0.5％以下，PH在4.5 以下时，获得一次发酵产物。
2.3获得二次发酵产物
按各物质占培养基的总质量的质量百分比，将上述获得的一次发酵产物中加入0.5～2wt％葡萄糖、0.05～0.1wt％水苏糖、2～20wt％双歧杆菌种子液进行二次发酵；
二次发酵的条件为36～38℃，6～8h，PH值在4.5以上时，获得二次发酵产物。
2.4离心分离
将上述获得的二次发酵产物进行高速离心，离心条件为2000～3000rmp/min， 15～20min，然后进行过滤，将上清液与下层细胞分离。
2.5细胞裂解
将离心分离后获得的下层细胞按质量比1:10的比例加入蒸馏水，搅拌 10～20min，将下层细胞的细胞内间质溶出，进行高速离心；
离心条件为2000～3000rmp/min，15～20min，然后进行过滤后，将上清液与下层细胞分离，重复此步骤两次；
将上述过滤后得到的下层细胞，进行高压均质处理，2～3次，通过镜检，细胞裂解度达到95％以上，过300目双层筛，将上层溶胞液与下层细胞壁碎片分离；
然后前述的所有高压均质处理后的溶胞液与离心分离的上清液合并，获得双歧杆菌溶胞液；
得到高压均质处理后的下层细胞壁碎片保留，备用。
2.6获得细胞碎片酶解液
以各物质占细胞碎片酶解液的质量比计。将上述高压均质处理后的下层细胞壁碎片9wt％与去离子水混合，加入5-6wt％Alcalase碱性蛋白酶(酶活>60 万U/g，酶底比>5000U/g)，10-12wt％糖苷水解酶(酶活>30万U/g，酶底比>5000U/g)，将上述各物质加入反应容器中，余量为去离子水，使用水浴振荡器使各物质充分分散混合均匀，调节PH值至8-8.5，水浴温度55℃，加热时间 3-4小时，然后将反应容器置于90-95℃水浴中15-20min进行Alcalase碱性蛋白酶和糖苷水解酶灭活，灭活后置于冰箱0-5℃冷藏过夜，离心，离心条件为 6000rmp/min，8min，离心后分离上清液，获得细胞碎片酶解液；
本步骤中，选用酶不限于Alcalase碱性蛋白酶，可选用包括动物蛋白酶、植物蛋白酶及微生物蛋白酶等，根据使用的酶种类及特性调节相应的PH值、温度及反应时间。
2.7复配获得双歧杆菌酶解溶胞产物
将2.5步骤双歧杆菌溶胞液与2.6步骤细胞碎片酶解液混合，按总量 0.5-4.0wt％的比例向混合液体中加入已二醇、戊二醇、甲基丙二醇中的1-3种； 0.1-0.5wt％对羟基苯乙酮，混合均匀后获得的产物为双歧杆菌酶解溶胞产物。
实施例效果
3.成份检测
3.1水解氨基酸含量
本申请实施例获得的双歧杆菌酶解溶胞产物采用氨基酸自动分析仪(日本株式会社日立高新技术科学，LA8080)测定水解氨基酸的实验方法；
本申请中实施例获得的双歧杆菌酶解溶胞产物(样品1)与传统的双歧杆菌溶胞产物(样品2)的水解氨基酸含量进行对比；如下表1中为双歧杆菌酶解溶胞产物和双歧杆菌溶胞产物中氨基酸含量：
表1
Figure BDA0003725054600000081
Figure BDA0003725054600000091
从表1中结果对比分析得出：本申请中实施例获得的双歧杆菌酶解溶胞产物(样品1)与传统的双歧杆菌溶胞产物(样品2)的水解氨基酸含量相比，提高了19.04％，达到了意想不到的技术效果。
3.2多糖含量
本申请中实施例获得的双歧杆菌酶解溶胞产物(样品1)与传统的双歧杆菌溶胞产物(样品2)的多糖含量进行对比；如下表2中为双歧杆菌酶解溶胞产物和双歧杆菌溶胞产物中多糖含量：
表2
测试样品 样品1 样品2
多糖含量mg/ml 11.4 0.59
从表2结果对比分析得出：本申请中实施例获得的双歧杆菌酶解溶胞产物 (样品1)是传统的双歧杆菌溶胞产物(样品2)的多糖含量的19.32倍，达到了意想不到的技术效果。
3.3小分子肽含量
本申请中实施例获得的双歧杆菌酶解溶胞产物(样品1)与传统的双歧杆菌溶胞产物(样品2)的300D以下小分子肽含量进行对比；如下表3中为双歧杆菌酶解溶胞产物和双歧杆菌溶胞产物中300D以下小分子肽含量：
表3
测试样品 样品1 样品2
300D以下肽(g/100mL) 0.13 0.06
从表2结果对比分析得出：本申请中实施例获得的双歧杆菌酶解溶胞产物 (样品1)是传统的双歧杆菌溶胞产物(样品2)的300D以下小分子肽含量的 2.2倍，达到了意想不到的技术效果。
3.4抗氧化评价
本实验采用稳定的且具有典型的代表性的自由基——DPPH自由基为实验对象，DPPH是一种很稳定的以氮为中心的自由基，若受试物能清除它，则表示受试物具有清除自由基的作用，其广泛用于清除自由基的研究，该方法的原理是：具有单电子的DPPH自由基在乙醇溶液中呈深紫色，在517nm波长处有一强吸收，当DPPH溶液中加入自由基清除剂时，由于与其单电子配对而使溶液颜色变浅，吸收逐渐消失，其褪色程度与其所接受的电子数成线性关系，因而可用分光法进行测量。
本申请中实施例获得的双歧杆菌酶解溶胞产物(样品1)与传统的双歧杆菌溶胞产物(样品2)的及市售的同类型样品3和样品4的抗氧化性能进对比，如下表4中为四种样品的抗氧化性能：
表4
测试样品 IC50值mg/ml
样品1 0.0032
样品2 0.0041
竞品3 0.0102
竞品4 0.0078
从表4结果对比分析得出：本申请中实施例获得的双歧杆菌酶解溶胞产物(样品1)与传统的双歧杆菌溶胞产物(样品2)相比，抗氧化性能提升20％；
本申请中实施例获得的双歧杆菌酶解溶胞产物(样品1)与市售的同类型样品3和样品4相比，抗氧化性能提升58.9％-68.6％。
3.5稳定性评价
图3～4示出了本申请中制备的双歧杆菌酶解溶胞产物与传统的双歧杆菌溶胞产物溶液状态。图3中刚制备的双歧杆菌酶解溶胞产物(图右样品1)与传统的双歧杆菌溶胞产物溶液(图左样品2)，均没有沉淀；但双歧杆菌酶解溶胞产物(图右样品1)澄清透明，颜色较浅，双歧杆菌溶胞产物溶液(图左样品2) 颜色较深。图4为静置三小时的双歧杆菌酶解溶胞产物(图右样品1)与传统的双歧杆菌溶胞产物溶液(图左样品2)，双歧杆菌酶解溶胞产物(图右样品1) 无明显沉淀，双歧杆菌溶胞产物溶液(图左样品2)下部有明显沉淀。
本申请中细胞壁碎片经过酶解，形成水溶性成份，双歧杆菌酶解溶胞产物中无沉淀，有利于在化妆品多种剂型中使用，避免了细胞壁碎片沉淀影响产品外观。
从以上实施例效果可以得出，本申请通过采用独特的固态发酵燕麦培养基和液态发酵工艺相结合的方式，增加酶解工艺制备的双歧杆菌酶解溶胞产物具有抗氧化性能更好、可溶性多糖更多、小分子肽更多、水解氨基酸含量更高等特点。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

Claims (10)

1.一种双歧杆菌酶解溶胞产物，其特征在于，所述双歧杆菌酶解溶胞产物由下述方法制备得到：
采用固态发酵法制备燕麦培养基；
筛选具有抗氧化活性的多个双歧杆菌菌种，分别接种于所述燕麦培养基中进行发酵，获得每一种双歧杆菌菌种的种子液；
配置培养基，将获得的多个双歧杆菌菌种的种子液中的某一菌种或某两菌种的种子液在培养基中进行接种，经一次发酵，获得一次发酵产物；
向一次发酵产物中加入营养物质及与用于一次发酵相同的种子液后进行二次发酵，获得二次发酵产物；
将二次发酵产物离心，过滤，高压均质裂解获得双歧杆菌溶胞液和细胞壁碎片；
将获得的细胞壁碎片进行酶解处理，离心，过滤，获得细胞碎片酶解液；
将所述双歧杆菌溶胞液和细胞碎片酶解液复配获得所述双歧杆菌酶解溶胞产物。
2.根据权利要求1所述的双歧杆菌酶解溶胞产物，其特征在于，所述固态发酵法制备燕麦培养基步骤如下：
将燕麦脱皮置于95-100℃去离子水中浸煮，捞出冷却，加入酵母菌混合均匀，撒白糖进行固态发酵获得固态发酵产物；
将固态发酵产物粉碎，加入去离子水，保温，搅拌，过筛得滤液，向滤液中加入葡萄糖、琼脂搅拌均匀获得燕麦培养基。
3.根据权利要求1所述的双歧杆菌酶解溶胞产物，其特征在于，所述细胞碎片酶解液获得步骤如下：
向高压均质裂解获得的细胞壁碎片中加入酶进行酶解处理，调节PH值至8～8.5，水浴温度52～58℃，加热时间3～4小时；
然后将上述反应置于水浴温度90～95℃，加热15～20min进行酶灭活；
灭活后置于冰箱冷藏，离心，分离出上清液为细胞碎片酶解液。
4.根据权利要求1所述的双歧杆菌酶解溶胞产物，其特征在于，所述将获得的细胞壁碎片进行酶解处理中使用的酶为糖苷水解酶和下述酶中的一种：
Alcalase碱性蛋白酶，动物蛋白酶、植物蛋白酶和微生物蛋白酶。
5.根据权利要求1所述的双歧杆菌酶解溶胞产物，其特征在于，所述双歧杆菌菌种包括青春双歧杆菌、动物双歧杆菌、短双歧杆菌、及长双歧杆菌和嗜热双歧杆菌中的一种或两种。
6.根据权利要求1所述的双歧杆菌酶解溶胞产物，其特征在于，所述将获得的多个双歧杆菌菌种的种子液中的某一菌种或某两菌种的种子液在培养基中进行接种中的培养基以培养基总重计，由如下质量百分含量的组分组成：
燕麦培养基40～80wt％、复合维生素0.1～0.2wt％、尿素0.1～0.2wt％，余量为种子液。
7.根据权利要求1所述的双歧杆菌酶解溶胞产物，其特征在于，所述向一次发酵产物中加入营养物质包括葡萄糖和水苏糖，以一次发酵产物的总重计，向一次发酵产物中加入葡萄糖的质量百分含量为0.5～2wt％；加入水苏糖的质量百分含量为0.05～0.1wt％。
8.根据权利要求1所述的双歧杆菌酶解溶胞产物，其特征在于，所述一次发酵产物中总糖含量为0.5wt％以下，pH值在4.5以下；所述二次发酵产物中pH值在4.5以上。
9.根据权利要求1所述的双歧杆菌酶解溶胞产物，其特征在于，所述双歧杆菌溶胞液和细胞碎片酶解液复配获得所述双歧杆菌酶解溶胞产物的步骤包括：向双歧杆菌溶胞液和细胞碎片酶解液混合液体中加入对羟基苯乙酮和已二醇、戊二醇和甲基丙二醇中的一种或几种。
10.如权利要求1至9任一项所述的双歧杆菌酶解溶胞产物在制备化妆品中的应用。
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