CN114858889A - Ide叉指电极的制作以及预功能化处理方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种IDE叉指电极的制作以及预功能化处理方法，通过微纳加工技术将具有高精度的微型IDE传感器和生物传感器相结合，提高了后续检测的灵敏度。由于与功能化步骤中探针的结合位置不在传统的电极上，因此不需要特定的氧化还原剂/标记来产生检测目标的信号。此外，设计和制造的IDE传感器类型可以根据检测目标、注意使用事项，以及用户电子要求轻松优化和使用。
Description
技术领域
本发明涉及IDE生物传感器技术领域，具体涉及一种IDE叉指电极的制作以及预功能化处理方法。
背景技术
叉指电极(IDE)是指沉积在基底上的微电极，其工作电极和对电极呈现间距很小的交错指状或图案周期性重复出现的外观。叉指电极一般用于微波滤波器、表面声波装置、电光快门，同时也应用在具有电气和介电特性的材料中，比如亲和型生物传感器，包括无标记型(直接/无氧化还原)和标记型(氧化还原)生物传感器。
目前已经开发出许多用于检测病原体、病毒、等温扩增和PCR扩增产物的方法。其中，生物传感器的应用已被广泛报道。然而，大多数生物传感器需要特定的氧化还原剂或标记来产生信号，并且仅限于特定的电极设计，制造复杂，信号测量也需要高端仪器。另外部分传感器是通过在金上面形成硫金键继而固定所需要的生物探针，导致了其成本高，杂质中的氧化还原剂也容易影响电信号。同时，生物传感器的检测方法还需要初始读数来进行基准线的比较。因此需要提供一种检测灵敏度高，且可以采用多样性电极设计的IDE生物传感器，无需测量初始读数也能得到检测结果。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种IDE叉指电极的制作以及预功能化处理方法。上述方法包括在洁净室中使用微纳加工技术制造出间距只有数微米的叉指电极(IDE)结构，并且通过一系列的化学反应成功将和目标基因互补的寡核苷酸探针序列固定在电极上，实现了叉指电极的预功能化。加工后的叉指电极(IDE)可以用于基因序列等遗传学的检测。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
本发明涉及一种IDE叉指电极的制作以及预功能化处理方法，包括以下步骤：
(1)IDE传感器的制作
(1-1)根据设计的结构制作掩膜版；
(1-2)在洁净室环境中制作IDE生物传感器
优选地，所述在洁净室环境中制作IDE生物传感器的具体工艺包括以下步骤：
(1-2-1)在通风橱内对晶圆进行清洗；
(1-2-2)对所述晶圆进行旋涂；
优选地，所述晶圆为4英寸晶圆，材质为硼硅酸盐玻璃。
(1-2-3)对所述掩膜版进行光刻掩模对准和紫外线(UV)曝光；
(1-2-4)在通风橱内对所述晶圆进行显影；
(1-2-5)在偏振光下用显微镜检查显影后的光刻胶图案；
(1-2-6)采用电子束蒸发器对所述晶圆进行金属沉积，在整个衬底上沉积一层Cr/Au金属；
(1-2-7)在通风柜内对所述晶圆进行金属剥离；
(1-2-8)对所述晶圆进行高速旋涂，在晶圆表面制备保护层；
(1-2-9)对所述晶圆进行湿切割；
(2)IDE传感器的预功能化处理
优选地，所述IDE传感器的预功能化处理方法包括以下步骤：
(2-1)采用超声波和溶剂，对所述IDE传感器进行清洗；
(2-2)使用等离子清洗机对所述IDE传感器进行表面活化，在其表面形成羟基(-OH)；
优选地，所述等离子清洗过程中，射频功率为150-300W，优选200W，真空设定值>300.0mtorr(毫托)，清洗时间为3-7min，优选5min。
(2-3)对所述IDE传感器进行第一次表面改性，即盐化步骤；
优选地，采用体积分数为2％的APTES乙醇溶液，对所述IDE传感器进行摇动培养，时间为5min。培养结束后用乙醇对所述IDE传感器进行清洗，即完成盐化。
(2-4)对所述IDE传感器进行第二次表面改性，即连接聚合物；
优选地，采用体积分数为2.5％的戊二醛水溶液，对所述IDE传感器进行摇动培养，时间为2h。培养结束后用去离子水对所述IDE传感器进行清洗，即完成连接聚合物。
(2-5)对所述IDE传感器进行表面修饰，将氨基修饰的寡核苷酸探针固定在传感器上；
寡核苷酸探针是根据要检测的目标基因所合成的互补序列。再在探针的5’端进行氨基修饰。
优选地，将浓度为100μM的末端氨基修饰的生物探针溶液注入IDE传感器表面的IDE传感器条内，在4-5℃培育15-16h，然后进行清洗。
(2-6)对所述IDE传感器进行封闭(Blocking)；
优选地，将体积分数为1％的乙醇胺水溶液注入IDE传感器表面的IDE传感器条内，对所述IDE传感器进行封闭培养，时间为30min。培养结束后用去离子水对所述IDE传感器进行清洗，即完成封闭过程。
本发明的有益效果：
以往的研究以及现有的技术工作已经使用或复杂或简单的叉指电极(IDE)平面传感器表面作为生物传感器，同时使用不同的电化学技术作为端点检测。大多数IDE传感器以及检测技术，仅限于使用大容量传感器来进行相关测试，叉指电极结构(模式)的细节仅限于所用基质和金属的规格，并且没有应用于药物遗传学测试。本发明通过微纳加工技术将具有高精度的微型IDE传感器和生物传感器相结合，提高了后续检测的灵敏度。由于与功能化步骤中探针的结合位置不在传统的电极上，因此不需要特定的氧化还原剂/标记来产生检测目标的信号。此外，设计和制造的IDE传感器类型可以根据检测目标、注意使用事项，以及用户电子要求轻松优化和使用。
本发明重点关注生物传感应用。亲和型生物传感器的构建可以通过生物识别来固定转导元件，其中生物识别元件在电极上或电极之间的薄层中捕获目标产物。接着，当目标产物在IDE传感器表面杂交并被捕获后，通过对电极电化学阻抗测量的变化来检测由于亲和性生物识别目标产物所引起的变化。检测原理基于目标产物与IDE生物传感器结合时电极或间隙表面形成复合物的介电性质、电荷分布、表面物理性质、尺寸和形状的变化。电极之间的微米级分离有助于提高电化学阻抗测量的灵敏度，并提高少量样本的电化学分析。
附图说明
图1为传感器结构设计图。其中，图1(a)为在4英寸晶圆上制造传感器的掩模设计，图1(b)为带有电子测量垫的传感器结构。
图2为在洁净室环境中传感器的制造流程中，不同阶段传感器的照片。其中，图2(a)为基板选择和清洁阶段，图2(b)为光刻胶涂层阶段，图2(c)为掩模调整和UV曝光器阶段，图2(d)为光刻步骤和显影阶段，图2(e)为金属沉积和剥离阶段，图2(f)为具有64个叉指电极的IDE传感器示例(电极宽度＝8μm，间隙＝8μm，长度＝1mm)。
图3为对已制造的IDE传感器的表面功能化过程示意图。其中，图3(a)为超声清洗，图3(b)为表面活化/羟基(-OH)形成，图3(c)为表面改性中的盐化步骤，图3(d)为表面改性中的聚合物连接附着步骤，图3(e)为表面改性中的将氨基修饰的寡核苷酸探针固定在传感器上的步骤。
图4(a)是本发明一个实施例中IDE生物传感器微系统的示意图，图4(b)是本发明一个实施例中阻抗测量电路的等效电路简化图。
图5是本发明一个实施例中检测HLA-B*15:02(外显子2)时阻抗反应的奈奎斯特示意图。
图6是本发明一个实施例中HLA-B*15:02外显子2的LAMP扩增产物每个样本示意图。
图7是本发明一个实施例中IDE生物传感器表面上结合的HLA-B*15:02的一个阳性与一个阴性LAMP扩增产物的电化学阻抗谱特性。
图8是本发明一个实施例中显示基线和杂交后阻抗测量相关ΔZR的表格。
图9是本发明一个实施例基线测量条形图中显示的ΔZR值和清晰显示的目标样本。
图10是本发明一个实施例中阳性和阴性目标检测测量值之间的统计学t检验结果。
图11是本发明一个实施例中用于阳性和阴性样本检测的生物传感器之间基线测量的统计学t检验结果。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
本发明的目的在于提供一种IDE叉指电极的制作以及预功能化处理方法。上述方法包括在洁净室中使用微纳加工技术制造出间距只有数微米的叉指电极(IDE)结构，并且通过一系列的化学反应成功将和目标基因互补的寡核苷酸探针序列固定在电极上，实现了叉指电极的预功能化。加工后的叉指电极(IDE)可以用于基因序列等遗传学的检测。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
本发明涉及一种IDE叉指电极的制作以及预功能化处理方法，包括以下步骤：
(1)IDE传感器的制作
(1-1)根据设计的结构制作掩膜版；
掩膜版在IDE传感器的制作中有着最关键的作用，通过它能够将设计好的图案传递到玻璃衬底上并形成对应的电极图案。通过使用电脑辅助设计软件(CAD，KLayot)可以绘制出叉指电极的图案，形成的电子版的二维图可以进行掩膜版的加工。掩膜版的用途是在光刻机(紫外曝光机)的光照下，阻挡部分区域的光线，将掩膜版上的图案转到下层的光刻胶上。根据光刻胶的类型(正性或负性)改变掩膜版的吸光区域。掩膜版常见的制作材料是石英玻璃，金属铬和感光胶，把已设计好的电路图形通过电子激光设备曝光在感光胶上，被曝光的区域会被显影出来，在金属铬上形成电路图形，成为类似曝光后的底片的光掩模版。制造电极传感器前审核设计的相关文件。
图1显示了包括电极传感器的掩模示例和尺寸。掩模规格如下：电极区域为黑色，阻挡紫外光穿过。使用5英寸的掩膜版制作4英寸的晶片衬底，由墨尔本纳米制造中心(MCN)工艺工程师完成传感器的制造。
(1-2)在洁净室环境中制作IDE生物传感器
所述IDE生物传感器需要在10000级和100级洁净室环境中制造，保证产品绝对不会受到污染和沉积。不仅操作人员是潜在的污染颗粒载体，室内安装的灯具也需要符合相关参数需求、卫生法规和不同的分类。本发明中涉及到医药行业以及半导体制造业的要求。
本发明提供的IDE传感器是在含有光刻胶涂层的衬底上使用UV光刻技术制造得到。图2展示了具体的制作步骤，首先在玻璃衬底上加上一层光刻胶，这里所用的衬底为4英寸的
33硼硅酸盐玻璃晶片。只在光刻胶上覆盖掩膜版并进行紫外光照，未被紫外线照射过的区域会在显影步骤中溶解留下需要的结构。然后在上面通过电子束沉积上金属铬/金堆叠金属(10/90nm)。之后去掉附着在上面的光刻胶即可得到想要的金属电极图形。
由于在晶圆上应用光敏层光刻胶，所以在100级洁净室中，使用琥珀色光进行光刻步骤和图案显影。琥珀色光在半导体制造的光刻工艺中起着重要的作用。由于光刻胶仅在几秒钟内就会显影，因此当使用常见的带有蓝光的白色灯光时，不可能进行可再现的光刻工艺。
进一步地，上述在洁净室环境中制作IDE生物传感器的具体工艺包括以下步骤：
(1-2-1)在通风橱内对晶圆进行清洗；
优选地，使用丙酮、异丙醇(IPA)、去离子水依次对晶圆进行冲洗，以去除表面的灰尘和有机物，冲洗结束后用氮气(N2)进行干燥清洁，最后用氮气(N2)清除晶圆上的灰尘颗粒。
(1-2-2)对所述晶圆进行旋涂；
优选地，所述晶圆为4英寸晶圆，旋涂采用的设备型号为SUSS Delta 80RC。
优选地，所述旋涂包括以下步骤：
i.第一次旋涂：在晶圆表面旋涂一层六甲基二硅氨烷(HMDS)，增加下一步光刻胶和玻璃衬底的粘附性。旋涂参数为1000-4000rpm持续10-40秒；
ii.第一次软烘烤：加热光刻胶，蒸发其中的挥发性溶剂。加热温度为100-120℃，持续80-100秒；
iii.第二次旋涂：继续旋涂一层光刻胶，型号为
1512HS。光刻胶会在之后的紫外光曝光时产生交联固化，形成沉积金属所需的结构。旋涂参数为1000-4000rpm持续10-40秒；
iv.第二次软烘烤：去除光刻胶中的挥发性溶剂。加热温度为100-120℃，持续80-100秒。
(1-2-3)对所述掩膜版进行光刻掩模对准和紫外线(UV)曝光；
优选地，所述光刻掩模使用EVG 6200掩模对准器。
优选地，所述光刻掩模的暴露剂量为75mJ/cm2，晶圆和掩模之间为软接触。软接触的含义是通过托盘吸附基片，将掩膜盖在基片上面。这种接触方式较为紧密，光刻分辨率高。
光刻掩模的具体过程包括：通过在掩膜对准器中调节掩膜版的位置，使其和玻璃衬底同心。然后打开紫外光对玻璃衬底进行曝光。紫外光先通过掩膜版，掩膜版中透光的部分会有紫外线穿过照射在玻璃衬底的光刻胶上，该部分光刻胶会发生交联固化，在后续的显影中不会被溶解而留下来。没有被紫外光照过的部分在显影中溶解而被去除。
(1-2-4)在通风橱内对所述晶圆进行显影；
优选地，所述显影液为
726光刻胶与去离子水的新鲜混合溶液，所述
726光刻胶与去离子水的体积比为3:2。
优选地，准备单独的去离子水容器用于冲洗晶圆(通过冲洗停止显影)，然后将晶圆浸入显影液中45秒，接着将其直接浸入去离子水中，去除残留在上面的显影液。
(1-2-5)在偏振光下用显微镜检查显影后的光刻胶图案；
优选地，所述检查包括以下步骤：
i.在偏振光下检查晶圆表面的显影图案是否显影不足或过度显影；
ii.如果显影不足，重复步骤(1-2-4)；
iii.如果过度显影，停止晶圆上的任何进度步骤，通过去除光刻胶可以重复使用玻璃衬底。剥离光刻胶可通过使用溶剂或碱性介质作为去除剂，即用剥离剂或O2燃烧来实现。
(1-2-6)采用电子束蒸发器对所述晶圆进行金属沉积，在整个衬底上沉积一层指定厚度的Cr/Au金属；
优选地，所述电子束蒸发器为Intlvac Nanochrome II。
优选地，所述电子束蒸镀包括以下步骤：
i.在等离子清洗机腔室内进行1分30秒的等离子清洗；
ii.进行Cr/Au叠层金属电子束气相沉积：总厚度100nm；
这一步中，Cr的最终厚度为10nm，沉积速率为
Au的最终厚度为90nm，先以
的速度沉积至10nm厚度，然后以
的速度沉积至90nm厚度。
(1-2-7)在通风柜内对所述晶圆进行金属剥离；
这一步的作用是：通过去除固化后的光刻胶来去除在光刻胶上方的金属，只留下直接附着在玻璃衬底上的金属，也就是所要的叉指电极部分，包括以下步骤：
i.将晶圆放入丙酮中，使用超声波清洁器清洗处理5-10分钟；
ii.使用挤压瓶挤出丙酮冲洗晶圆；
iii.使用新鲜的丙酮溶液重复步骤i)和ii)；
iv.将晶圆浸入异丙醇中，超声处理5分钟；
v.将晶圆浸入去离子水中30秒；
vi.取出并用氮气干燥；
vii.用显微镜和万用表检查特征是否存在短路装置；
viii.如果在晶片上发现残留物，重复步骤i)-vii)或使用光刻胶剥离介质。(1-2-8)对所述晶圆进行高速旋涂，在晶圆表面制备保护层；
优选地，所述高速旋涂采用的设备型号为SUSS Delta 80RC。
优选地，所述高速旋涂包括以下步骤：
i.在晶圆表面旋涂一层光刻胶，型号为
1512HS，用来保护金属在之后的湿切割时不被损坏。旋涂参数：1000-4000rpm；
ii.软烘烤去除挥发性溶剂，加热温度为100-120℃，时间为80-100秒。
(1-2-9)对所述晶圆进行湿切割；
优选地，所述湿切割采用的设备型号为Disco DAD321。
优选地，由MCN的工艺工程师进行湿切割后，将切好的玻璃衬底贴在一个塑性膜上，并用环状的塑料环固定在盒子中。此时IDE传感器芯片条已准备好，可以进行下一步，即IDE传感器的表面修饰和探针固定。
(2)IDE传感器的预功能化处理
这一步是在已制造的IDE传感器表面功能化，在有机和无机材料之间建立连接，包括以下步骤：
(1)IDE传感器的表面清洁；(2)在传感器表面形成羟基(-OH)，进行表面活化，(3)通过盐化步骤和聚合物连接进行表面修饰，(4)将带有氨基修饰的寡核苷酸探针连接到传感器固体表面，(5)封闭。上述过程完成后进行生物传感或检测。
图3表示对已制造的IDE传感器的表面功能化过程，即在有机和无机材料之间建立键合。其中，图3(a)为超声清洗，图3(b)为表面活化/羟基(-OH)形成，图3(c)为表面改性中的盐化步骤，图3(d)为表面改性中的聚合物连接附着步骤，图3(e)为表面改性中的将氨基修饰的寡核苷酸探针固定在传感器上的步骤。
所述IDE传感器的预功能化处理方法，包括以下步骤：
(2-1)采用超声波和溶剂，对所述IDE传感器进行清洗；
申请人需要说明，已制造的传感器在圆形衬底中呈现条状分布，切割方法是湿法切割，传感器上涂有保护性光刻胶层。此外，湿法切割会引入小颗粒污染。因此，生物传感芯片条首先需要进行表面有机清洁。
优选地，所述清洗步骤包括将所述IDE生物传感器分别放入丙酮、异丙醇(IPA)和去离子水中进行超声洗涤，洗涤完成后将所述芯片取出干燥。
在本发明的一个具体实施例中，所述清洗包括以下步骤：
i.使用带有密封盖的PET或PP管，进行生物传感芯片的清洁(也可使用玻璃杯或结晶皿)；
ii.将清洁液注入管中，直至没过待清洁的芯片，盖紧盖子密闭，依次使用丙酮、异丙醇和去离子水进行清洗，每种溶液分别超声5分钟。
iii.洗涤完成后将所述芯片取出，使用氮气喷枪在无油空气或氮气流中进行干燥。
(2-2)使用等离子清洗机对所述IDE传感器进行表面活化，在其表面形成羟基(-OH)；
等离子系统可用于干法蚀刻、灰化或表面活化工艺，通过低压等离子体工艺去除表面材料，并在玻璃上进行表面活化。活性离子被加速到样品表面，并发生吸附和解吸反应，挥发性反应产物被真空泵排出。等离子清洗系统可同时用于清洁和表面改性。根据材料类型和应用选择活性气体的类型及其比例。当选择气体流速以将等离子体处理室中的真空保持在0.15到0.30托的范围内时，可获得最佳且均匀的处理结果。等离子系统的射频功率可高达400W，这是精心选择的，以避免被蚀刻样品过程中的过度升温。
等离子清洗机在200W功率(或高功率)、0.30托压力和30sccm空气流量(氧气20.9％、氮气78.1％、氩气0.9％)下进行氧气等离子体处理5分钟，以激活表面，并去除表面功能化后可能导致硅烷生长失败的有机污染物。根据可用性来选择气体类型/混合百分比(例如氧气25％，氩气75％)。
申请人需要说明，如果等离子体系统类型、真空泵类型和气体混合物发生变化，需要更改使用材料和实验程序。如果等离子清洗机已用于其他用途，或一天中首次使用，建议在不将样品放入清洗腔内的情况下运行该系统，这样它将净化清洗机并去除有机物污染。
优选地，所述等离子清洗过程中，射频功率为150-300W，优选200W，真空设定值>300.0mtorr(毫托)，清洗时间为3-7min，优选5min。
在本发明的一个具体实施例中，所述等离子清洗包括以下步骤：
i.打开等离子清洗机，设置所需的射频功率为200W，设置编辑等离子清洗实验过程：设置内部气体压力为0.3托，待荧光开始后打开进气阀，设置进气流速为30sccm。等离子处理时间为5分钟。
ii.将样品装入等离子清洗腔内并关上门。使用镊子夹住样品，传感器区域需要位于上部，倒置会导致划伤/传感器故障。
iii.运行等离子系统运行程序。启动自动循环来运行预先编程的程序；自动启动“大气通风口”对腔室通风，或关闭真空泵并将空气引入腔室，手动启动腔室进行通风。
iv.当清洗工艺完成且反应腔体处于大气压力下时，将处理过的传感器快速浸入APTES溶液中。
建议在开始等离子清洗/表面活化步骤之前，先按照下一个步骤(3)，即盐碱化步骤准备好APTES溶液。这样传感器在完成表面活化后，可以被快速放入APTES溶液中。
上述表面活化/羟基(-OH)形成过程也可通过食人鱼蚀刻步骤实现，即，将IDE传感器浸入96％H2SO4:30％H2O2(两者体积比为3:1)的溶液中30分钟。
(2-3)对所述IDE传感器进行第一次表面改性，即盐化步骤；
在经过等离子处理之后，玻璃衬底中的二氧化硅能够被激活，从而连接上羟基(-OH)而产生亲水性。此时加入(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷(APTES)溶液，硅烷分子会直接和羟基反应，通过硅氧键连接在玻璃衬底上(非金属电极上)。
优选地，采用体积分数为2％的APTES乙醇溶液，对所述IDE传感器进行摇动培养，时间为5min。培养结束后用乙醇对所述IDE传感器进行清洗，即完成盐化。
在本发明的一个具体实施例中，所述盐化包括以下步骤：
i.用乙醇制备2％APTES((3-氨基丙基)三乙氧基硅烷)溶液。例如配置20mL的2％APTES溶液需要在19.6mL乙醇中混合0.4mL100％APTES。此步骤需要在等离子清洗前制备好以增加连接的效果。
ii.将预处理(已清洁)的IDE传感器(硼硅玻璃衬底)放入培养皿内。
iii.将APTES溶液倒入培养皿至覆盖传感器，盖上培养皿盖子，并用封口膜密封。
iv.使用摇床进行1小时摇动培养。
v.从培养皿中倒出APTES溶液，并倒入废液桶中。
vi.用乙醇清洗感应器芯片条，摇床上震动5分钟，重复清洗3次。
下一步使用的戊二醛溶液需要在最后一次清洗之前准备好，以减少等待时间并减少风干效果。
(2-4)对所述IDE传感器进行第二次表面改性，即连接聚合物；
APTES的另一端还有氨基，加入戊二醛后，戊二醛能够与氨基结合从而连接在玻璃衬底上。同时戊二醛的另一端有助于连接下一步所需要的DNA探针序列，实现DNA在玻璃衬底上的连接。
优选地，采用体积分数为2.5％的戊二醛水溶液，对所述IDE传感器进行摇动培养，时间为2h。培养结束后用去离子水对所述IDE传感器进行清洗，即完成连接聚合物。
在本发明的一个具体实施例中，所述连接聚合物包括以下步骤：
i.制备体积分数为2.5％的戊二醛溶液。20mL的2.5％戊二醛溶液制备如下：在18mL
水中混合2mL25％戊二醛。
ii.使用注射器过滤器过滤戊二醛溶液中的杂质。对于25％二级戊二醛溶液，使用0.2μm或0.4μm注射器过滤器去除溶液中的杂质。
iii.将戊二醛溶液倒入培养皿中，没过传感器芯片，盖上培养皿盖子，并用封口膜密封。
iv.使用摇床进行2小时摇动培养。
v.从培养皿中去除戊二醛溶液，将戊二醛溶液废液倒入废液桶中。
vi.用
水清洗传感器芯片条，摇床上震动5分钟，重复清洗3次。
vii.在无油空气或氮气流中干燥传感器芯片条。
下一步使用的探针溶液需要在最终清洗完成之前准备好，以尽量减少等待及风干影响。
(2-5)对所述IDE传感器进行表面修饰，将氨基修饰的寡核苷酸探针固定在传感器上；
寡核苷酸探针是根据要检测的目标基因所合成的互补序列。再在探针的5’端进行氨基修饰。氨基能够连接在上述步骤加入的戊二醛，从而实现核苷酸探针在玻璃衬底上的化学连接。本发明所用探针生产厂家为生工生物工程(上海)股份有限公司，为定制DNA序列，无具体型号。
优选地，将浓度为100μM的末端氨基修饰的生物探针溶液注入IDE传感器表面的IDE传感器条内，在4-5℃培育15-16h，然后进行清洗。
在本发明的一个具体实施例中，所述固定探针包括以下步骤：
i.在传感器上贴覆提前准备好的PSA胶带，方便将IDE电极浸入在探针溶液中。以每一传感器芯片条上有6个独立的叉指电极为例，则在PSA胶带上切割6个直径为3-4mm的孔，将胶带贴在玻璃衬底上使得每个IDE传感器位于小孔中央。在培养皿中放入KIMWIPE清洁抹布，并接入
水形成一个湿润室，保证电极存放环境的湿度。
ii.将3.5μL的100μM(或其它需要/优化的摩尔浓度)的末端氨基修饰的生物探针溶液滴到每个孔中。
iii.将带有探针溶液的IDE生物传感芯片放入湿度室内，盖上湿度室盖子后，用封口膜密闭，在4℃冰箱中培育15-16小时。
iv.探针培育完成后，用微量移液器去除多余液体后，再用
水快速清洗。
上述过程中确保载玻片/传感器在洗涤步骤之间以及洗涤和封闭之间不会变干。清洗结束后，应立即进入封闭步骤。下一步实验的封闭液需要在最后一次洗涤之前准备好，最大限度地减少等待并减少风干效应。
(2-6)对所述IDE传感器进行封闭(Blocking)；
封闭培养是使用乙醇胺溶液覆盖在加入了寡核苷酸探针的电极上，保证电极的活性。
优选地，将体积分数为1％的乙醇胺水溶液注入IDE传感器表面的IDE传感器条内，对所述IDE传感器进行封闭培养，时间为30min。培养结束后用去离子水对所述IDE传感器进行清洗，即完成封闭过程。
在本发明的一个具体实施例中，所述封闭包括以下步骤：
i.配制体积分数为1％的乙醇胺水溶液作为封闭液。1mL乙醇胺溶液制备如下：将10μL纯度为100％的乙醇胺与990μL
水混合。
ii.每个孔中滴入10μL1％乙醇胺溶液。
iii.盖上培养皿盖子，并用封口膜密封。
iv.培养30分钟。
v.去除封闭液，用
水清洗生物传感器，每次摇床反应5分钟，重复清洗3次。
vi.将清洗废液倒入废液桶中。
vii.在无油空气或氮气流中干燥生物传感器芯片条。
至此，IDE传感器可以开始进行阻抗测量和目标基因的检测。
对上述封闭后的IED生物传感器进行阻抗测量。阻抗谱是一种强有力的方法，可以用来确定生物传感器系统的响应。目标材料引起的变化可能与溶液的介电常数、物理结构和离子性质的变化有关。由于随后引入的目标，初始系统的这些变化将在阻抗谱中反映为无源电气元件特性变化(电阻、电容和电感)。采用本发明提供的IDE生物传感器进行目标基因检测包括如下步骤：
步骤S101、在IDE生物传感器上固定检测待测样本的目标基因探针(前述部分已完成)；
步骤S102、所述待测样本与所述目标基因探针结合后发生反应，得到电信号数据的实部和虚部；所述电信号数据为电路的阻抗数据。
阻抗谱是一种强有力的方法，可以用来确定生物传感器系统的响应。目标材料引起的变化可能与溶液的介电常数、物理结构和离子性质的变化有关。由于随后引入的目标，初始系统的这些变化将在阻抗谱中反映为无源电气元件特性变化(电阻、电容和电感)。请参阅图4(a)，图4(a)是IDE生物传感器微系统的示意图，用于检测电极之间的DNA杂交孵育，并指示所有无源电路组件。每个组成部分解释如下。
(1)Rct–金属间电荷转移电阻-测量溶液；
(2)Rsol–测量溶液的电阻；
(3)Rbio–电极之间固定的DNA分子、有机物和聚合物(生物识别元件层)的电阻；
(4)Csol–测量溶液的寄生电容；
(5)Csub–玻璃基板的寄生电容；
(6)Cdl–金属间的双层电容-测量溶液。
请参阅图4(b)，图4(b)是阻抗测量电路的等效电路简化图，即上述相应的电气元件可简化为一个等效电路模型。如下所示：
(1)Csol和Csub视为与Ccell＝Csol+Csub.等效的并联电容器；
(2)Rsol和Rbio被认为是与Rcell＝((Rsol)-1+(Rbio)-1)-1等价的并联电容器；
(3)在实践中，以Warburg阻抗ZW.来代表Rct(金属-测量溶液之间的电荷转移电阻)和Cdl(金属-测量溶液之间的双层电容)在低频下的效应。
它可以被认为是一个具有相当于Zcell＝Zreal-jZimaginary(笛卡尔形式)值的复阻抗的电化学电池，其中阻抗的实部是Zreal，虚部是Zimaginary。阻抗的幅值和相位可通过以下关系式得出：
(1)幅值阻抗,|Zcell|＝(ZcellZ* cell)1/2＝(Z2 real+Z2 imaginary)1/2；
(2)阻抗相位,-θ＝tan-1(-Zimaginary/Zreal)。
在典型的电化学阻抗测量中，利用频率响应分析仪(FRA)模块根据所述电信号数据按预设频率和振幅生成正弦波。该信号叠加在电池上施加的直流电位或电流上。通过两个频率响应分析仪通道分析交流电压和电流分量，计算传递函数、总阻抗、相位角偏移以及总阻抗的实部和虚部。
需要说明的是，计算传递函数、总阻抗、相位角偏移以及总阻抗的实部和虚部是频率响应分析仪自带的功能。
步骤S103、根据所述电信号数据的实部和虚部判断所述待测样本是否含有所述目标基因。
在一个实施例中，当要检测的目标基因和连接在玻璃衬底的探针结合后，电路的阻抗特性会发生改变，例如从EIS阻抗谱中可以看到高频率段(半圆形部分)实部电阻值将会减小。而检测的样本中如果没有目标DNA，则在清洗后没有DNA能够与之前连接的探针相结合，测量得到实部阻抗值偏大。因此在测量的样本与修饰过的IDE电极杂交后再进行阻抗测量能够知道样本的阴阳性。
作为上述方法的进一步改进，在一个实施例中，所述根据所所述电信号数据的实部和虚部判断所述待测样本是否含有目标基因，包括：
计算所述转折点处的实部阻抗值与预设阈值的差值，若所述转折点处的实部阻抗值大于预设阈值，则所述待测样本中不含有目标基因。
作为上述方法的进一步改进，在一个实施例中，所述根据所所述电信号数据的实部和虚部判断所述待测样本是否含有目标基因，包括：
计算所述转折点处的实部阻抗值与预设阈值的差值，若所述转折点处的实部阻抗值小于预设阈值，则所述待测样本中含有目标基因。
请参阅图5，图5是本发明一个实施例中检测HLA-B*15:02(外显子2)时阻抗反应的奈奎斯特示意图，如图5所示，图中显示了来自HLA-B*15:02外显子2的阳性LAMP扩增产物、外显子2的阴性LAMP扩增产物、无DNA模板对照组NTC，以及所有样本的基线测量结果。
请参阅图6，图6是本发明一个实施例中HLA-B*15:02外显子2的LAMP扩增产物每个样本示意图。
请参阅图7，图7是本发明一个实施例中IDE生物传感器表面上结合的HLA-B*15:02的LAMP扩增产物的电化学阻抗谱特性。
本发明使用了两个传感器阻抗响应的奈奎斯特表示法和ΔZR＝Zreal(转折点)-Zreal(100kHz)的计算方法。
如图5-7的阻抗曲线所示，奈奎斯特图的横坐标为整个系统的实部阻值，纵坐标表示整个系统的虚部阻值。可以看到阻抗的曲线图为一个弧形加一段直线部分，弧形为高频时的曲线，直线为低频时的曲线。转折处的实部阻抗是电阻的阻值加上电容的阻抗。在LAMP阳性产物结合在电极上之后就会改变电容的阻抗导致圆弧变小，也就是实部的阻抗很小。而LAMP阴性产物不会结合在电极上，对电容阻抗的改变不大。
因此，可以通过测量ΔZR来判断样本的阴阳性。根据绝对值可以认为ZR小于预设临界值就是阳性，或者根据统计学方法判断ZR是否在阳性范围内。
作为上述方法的进一步改进，在一个实施例中，所述根据所所述电信号数据的实部和虚部判断所述待测样本是否含有目标基因，包括：
若所述实部阻抗值不大于预设阻抗值，则所述待测样本中含有目标基因。
一些实施例中，所述电信号数据包括所述待测样本与所述目标基因探针结合时电极或电极间隙表面形成复合物的介电性质、电荷分布、表面物理性质、尺寸和形状的变化。
本申请对每个目标检测的阻抗测量数据进行分析/比较，如图5所示，图中包括：
基线，基线是指传感器在没加样本之前进行测量，得到的曲线，基线是带正方形标记的线；
已知样本为阴性经过检测后得到的曲线是用带三角形标记的线，其中掺杂了2个带五角星的线是blank空白对照，也可以算阴性。
已知样本为阳性是经过检测后得到的曲线是用圆圈标记的线。
由此得出统计学结果，对于未知样本进行检测时候，若未知样本转折点处的实部阻抗值小于预设阈值，则所述待测样本中含有目标基因。
若未知样本转折点处的实部阻抗值大于预设阈值，则所述待测样本中不含有目标基因。
其中，预设的阈值可以根据实际测量中的统计结果得出。
用于检测HLA-B*15:02(外显子2)的阻抗反应的奈奎斯特图表示清楚地显示了HLA-B*15:02外显子2的LAMP阳性扩增产物和LAMP阴性扩增产物之间的差异，这证明了这项新技术的工作原理。
接下来，对奈奎斯特图中清晰显示的一个特征进行统计分析，以便更好地进行分类。在这方面，如图6所示，在图5的基础上增加了具体的样本的标签，N1到N12号代表阴性样本。P1到P8号代表阳性样本。B1到B2号代表空白对照样本。
本发明计算了所用每个传感器在虚部最小(转折点)时阻抗实部与100kHz频率下阻抗实部之间的差异。如图7所示，理论上，这种差异将代表电极之间固定的DNA分子、有机物和聚合物(生物识别元件层)的电阻变化(RDNA)。
ΔZR＝Zreal(转折点)-Zreal(100kHz)
请参阅图8，图8是本发明一个实施例提供的显示基线和杂交后阻抗测量相关ΔZR的表格。在LAMP实验中进行了外显子2的等温扩增，产物与生物传感器结合后，测量目标相关的ΔZR。
请参阅图9，图9是基线测量条形图中显示的ΔZR值和清晰显示的目标样本。阳性和阴性之间的统计学t检验结果表现了明显的统计显著性差异(p<0.0001)。
图8和图9显示了所用每个传感器(基线和目标杂交后)的ΔZR。通过在进行正态性检验后进行统计t检验，使用GraphPad Prism8.0软件进行数据分析，评估传感器的基线测量和每个目标杂交后传感器的性能。p值≤0.05被认为具有统计学意义。
请参阅图10，图10是本发明一个实施例中阳性和阴性目标检测测量值之间的统计学t检验结果。
请参阅图11，图11是本发明一个实施例中用于阳性和阴性样本检测的生物传感器之间基线测量的统计学t检验结果。
如图10和图11所示，在阳性和阴性扩增样本杂交传感器后读数组之间进行的t检验显示出明显的统计显著性差异(p<0.0001)，这证明了生物传感器作应用时未受到影响。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
Claims (10)
1.一种IDE叉指电极的制作以及预功能化处理方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)根据设计结构制作掩膜版，然后在洁净室环境中制作IDE生物传感器；
(2)IDE传感器的预功能化处理，包括依次对所述IDE传感器进行表面活化、盐化、连接聚合物、进行表面修饰和封闭步骤。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述晶圆为4英寸晶圆，材质为硼硅酸盐玻璃。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，在洁净室环境中制作IDE生物传感器包括以下步骤：
(1-1)在通风橱内对所述晶圆进行清洗；
(1-2)对所述晶圆进行旋涂；
(1-3)对所述掩膜版进行光刻掩模对准和紫外线曝光；
(1-4)在通风橱内对所述晶圆进行显影；
(1-5)在偏振光下用显微镜检查显影后的光刻胶图案；
(1-6)采用电子束蒸发器对所述晶圆进行金属沉积，在整个衬底上沉积一层Cr/Au金属；
(1-7)在通风柜内对所述晶圆进行金属剥离；
(1-8)对所述晶圆进行高速旋涂，在晶圆表面制备保护层；
(1-9)对所述晶圆进行湿切割。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述IDE传感器的预功能化处理方法包括以下步骤：
(2-1)采用超声波和溶剂，对所述IDE传感器进行清洗；
(2-2)使用等离子清洗机对所述IDE传感器进行表面活化，在其表面形成羟基；
(2-3)对所述IDE传感器进行第一次表面改性，即盐化步骤；
(2-4)对所述IDE传感器进行第二次表面改性，即连接聚合物；
(2-5)对所述IDE传感器进行表面修饰，将氨基修饰的寡核苷酸探针固定在传感器上；
(2-6)对所述IDE传感器进行封闭。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(2-2)所述等离子清洗过程中，射频功率为150-300W，优选200W，真空设定值>300.0mtorr，清洗时间为3-7min，优选5min。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(2-3)所述盐化步骤中，采用体积分数为2％的APTES乙醇溶液，对所述IDE传感器进行摇动培养，时间为5min。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(2-4)所述连接聚合物步骤中，采用体积分数为2.5％的戊二醛水溶液，对所述IDE传感器进行摇动培养，时间为2h。
8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(2-5)所述表面修饰步骤中，寡核苷酸探针是根据要检测的目标基因所合成的互补序列，再在探针的5’端进行氨基修饰。
9.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(2-5)所述表面修饰步骤中，将浓度为100μM的末端氨基修饰的生物探针溶液注入IDE传感器表面的IDE传感器条内，在4-5℃培育15-16h。
10.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(2-6)所述封闭步骤中，将体积分数为1％的乙醇胺水溶液注入IDE传感器表面的IDE传感器条内，对所述IDE传感器进行封闭培养，时间为30min。
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