CN114787198A - 具有生理活性的肽的制造方法以及包含短链接头的肽 - Google Patents
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Abstract
提供一种与以往的化学合成手法相比，能够更简便且低价地制造二聚体肽等复杂的肽分子的方法、包含特定的短链接头的具有良好的活性的二聚体肽等。
Description
技术领域
本发明涉及具有生理活性的肽的制造方法以及包含短链接头的肽等。
背景技术
近年，作为药物的形式，抗体药物等生物药物、再生医疗、核酸药物等已被研究并实际应用了。此外，作为新的药物的形式，中分子、特别是肽正受到瞩目。特别是，有多种环状肽等特殊形状的肽(特殊肽)已经被开发，其在药物中的应用正受到期待。
在这样的情况下，可以认为今后二聚体肽、肽复合体的开发会继续加速。例如，就二聚体肽而言，Apellis Pharmaceuticals的APL-2作为年龄相关性黄斑变性症等的治疗药正在进行临床研究，其实用化受到期待。
一般而言，二聚体肽具有以短链接头连结2条肽链的结构，并且肽复合体具有以短链接头连结肽链和药物的结构。作为这样的短链接头，主要使用P EG接头。
然而，在二聚体肽或肽复合体的制造中，如果用以往的化学合成手法，则需要进行肽链的化学合成、PEG接头的添加、以及纯化，需要经过大量的制造工序。此外，在肽为环状肽的情况下，必须进一步进行肽链的环状化。因此，要用以往的化学合成手法制造二聚体肽或肽复合体的话，必须经过复杂的工序，非常繁琐。并且，就以往的化学合成手法而言，在介由PEG接头而使第1肽与第2肽结合而得到的二聚体肽的合成中，会得到第1肽的C末端与接头结合、第2肽也是C末端与接头结合的产物，无法进行第1肽的C末端与接头结合、第2肽的N末端与接头结合的二聚体肽的高效合成。
并且，主要使用的PEG接头的价格高，因此以往的化学合成手法在经济上也不能说是优选的。
日本特表2013-531480中，记载了一种药物复合物，其包含：具有生物学活性的蛋白质、以及包含含有至少50个脯氨酸和丙氨酸的氨基酸残基的氨基酸序列的随机卷曲多肽。在专利文献1中，记载了该随机卷曲多肽能够使药物复合物的血中稳定性增加。
然而，在日本特表2013-531480中，对于将该随机卷曲多肽用来代替二聚体肽或肽复合体中的PEG接头这样的短链接头这一点没有具体公开。
此外，如果要将二聚体肽等肽分子作为药物利用，则不仅希望提高二聚体肽等肽分子的稳定性，还希望能够保持或提高活性。主要使用PEG接头作为将2条肽链连结的短链接头、以及PEG接头的使用在制造面上存在技术问题都如上所述，且从二聚体肽等肽分子的活性的观点出发，也需要更有用的短链接头。
发明内容
如上所述，在二聚体肽等肽分子的制造中，就以往的化学合成手法而言，操作并不简便，且必要费用也很高。
因此，在本发明的一种方式中，以提供一种与以往的化学合成手法相比，能够更简便并且低价地制造二聚体肽等肽分子的方法为目的。
作为连结2条肽链的短链接头，从二聚体肽等肽分子的活性的观点出发，需要有更为有用的短链接头这一点也如上所述。
因此，在本发明的一种方式中，以提供一种具有包含特定的短链接头的、具有良好的活性的二聚体肽等肽分子为目的。
本发明例如可以包含以下的方式。
[1]
一种肽分子，其为包含以下部分的肽分子：
(I)第1生理活性肽部分、
(II)包含49个以下的氨基酸残基的接头部分、以及
(III)隔着所述接头部分位于与所述第1生理活性肽部分相反的一侧的第2生理活性肽部分，
所述第1生理活性肽部分和所述第2生理活性肽部分彼此可以相同也可以不同，
所述接头部分的氨基酸序列的至少90％由选自丙氨酸(A)、脯氨酸(P)以及丝氨酸(S)的氨基酸残基构成。
[2]
根据项[1]所述的肽分子，其中，
所述第1生理活性肽部分构成了环状肽，并且/或者所述第2生理活性肽部分构成了环状肽。
[3]
根据项[1]或[2]所述的肽分子，其中，
所述第1生理活性肽部分构成了通过二硫键而形成有环状结构的环状肽，并且/或者所述第2生理活性肽部分构成了通过二硫键而形成有环状结构的环状肽。
[4]
根据项[1]～[3]中任一项所述的肽分子，其中，
所述第1生理活性肽部分和所述第2生理活性肽部分分别构成与c-Met蛋白结合的环状肽，所述第1生理活性肽部分和所述第2生理活性肽部分彼此可以相同也可以不同。
[5]
根据项[4]所述的肽分子，其中，
所述环状肽是包含选自以下的(a)～(i)的氨基酸序列，并且通过二硫键而形成有环状结构的环状肽。
(a)CYRQFNRRTHEVWNLDC(序列编号：1)；
(b)CRQFNRRTHEVWNLDC(序列编号：2)；
(c)CYWYYAWDQTYKAFPC(序列编号：3)；
(d)CWYYAWDQTYKAFPC(序列编号：4)；
(e)CYISWNEFNSPNWRFITC(序列编号：5)；
(f)CISWNEFNSPNWRFITC(序列编号：6)；
(g)(a)～(f)中的任一氨基酸序列中，半胱氨酸残基以外的1个或2个氨基酸残基发生了置换、缺失或添加，并且与c-Met蛋白结合的肽；
(h)包含与(a)～(f)中的任一氨基酸序列具有90％以上的序列同一性，且两端具有半胱氨酸残基的氨基酸序列，并且与c-Met蛋白结合的肽；以及
(i)(a)～(h)中的任一氨基酸序列中，两端的半胱氨酸残基以外的至少1个氨基酸得到了修饰的肽，氨基酸的修饰为磷酸化、甲基化、乙酰基化、腺苷酰化、ADP核糖化或糖链加成(glycosylation)。
[6]
根据项[1]～[3]中任一项所述的肽分子，其中，
所述第1生理活性肽部分和所述第2生理活性肽部分分别构成与促红细胞生成素受体结合的环状肽，所述第1生理活性肽部分和所述第2生理活性肽部分彼此可以相同也可以不同。
[7]
根据项[6]所述的肽分子，其中，
所述环状肽是包含选自以下的(j)～(n)的氨基酸序列，并且通过二硫键而形成有环状结构的环状肽。
(j)GGLYACHMGPMTWVCQPLRG(序列编号：65)；
(k)CISWNEFNSPNWRFITC(序列编号：66)；
(l)(j)或(k)的氨基酸序列中，半胱氨酸残基以外的1个或2个氨基酸残基发生了置换、缺失或添加，并且与促红细胞生成素受体结合的肽；
(m)包含与(j)或(k)中的任一氨基酸序列具有90％以上的序列同一性，且在(j)或(k)中的原本的位置处具有半胱氨酸残基的氨基酸序列，并且与促红细胞生成素受体结合的肽；以及
(n)(j)～(m)中的任一氨基酸序列中，半胱氨酸残基以外的至少1个氨基酸得到了修饰的肽，氨基酸的修饰为磷酸化、甲基化、乙酰基化、腺苷酰化、ADP核糖化或糖链加成。
[8]
根据项[1]～[3]中任一项所述的肽分子，其中，
所述第1生理活性肽部分和所述第2生理活性肽部分分别包含与血小板生成素受体结合的生理活性肽，所述第1生理活性肽部分和所述第2生理活性肽部分彼此可以相同也可以不同。
[9]
根据项[8]所述的肽分子，其中，
所述生理活性肽包含选自以下的(o)～(u)的氨基酸序列：
(o)IEGPTLRQWLAARA(序列编号：67)；
(p)GGCADGPTLREWISFCGG(序列编号：68)；
(q)GGCTLREWLHGGFCGG(序列编号：69)；
(r)LAIEGPTLRQWLHGNGRDT(序列编号：70)；
(s)(o)～(r)中的任一氨基酸序列中，半胱氨酸残基以外的1个或2个氨基酸残基发生了置换、缺失或添加，并且与血小板生成素受体结合的肽；
(t)包含与(o)～(r)中的任一氨基酸序列具有90％以上的序列同一性，且在以(p)或(q)为基准的情况下在(p)或(q)中的原本的位置处具有半胱氨酸残基的氨基酸序列，并且与血小板生成素受体结合的肽；以及
(u)(o)～(t)中的任一氨基酸序列中，半胱氨酸残基以外的至少1个氨基酸得到了修饰的肽，氨基酸的修饰为磷酸化、甲基化、乙酰基化、腺苷酰化、ADP核糖化或糖链加成。
[10]
根据项[1]～[9]中任一项所述的肽分子，其在与所述接头部分(II)不相邻的位置处，进一步包含功能性修饰部分。
[11]
根据项[1]～[10]中任一项所述的肽分子，其中，
所述接头部分(II)为第1接头部分，
所述肽分子进一步包含：位于所述第2生理活性肽部分的与所述第1接头部分相反的一侧的第2接头部分，
所述肽分子进一步包含：隔着所述第2接头部分位于与所述第2生理活性肽部分相反的一侧的第3生理活性肽部分，
所述第3生理活性肽部分与所述第1生理活性肽部分和/或所述第2生理活性肽部分可以相同也可以不同，
所述第2接头部分包含49个以下的氨基酸残基，其氨基酸序列的至少90％由选自丙氨酸(A)、脯氨酸(P)以及丝氨酸(S)的氨基酸残基构成，所述第2接头部分与所述第1接头部分可以相同也可以不同。
[12]
根据项[1]～[11]中任一项所述的肽分子，其中，
所述接头部分(II)重复包含2个以上的选自AP、AAP、AS、ASP以及ASS中的氨基酸序列，并且在存在第2接头部分的情况下，该第2接头部分重复包含2个以上的选自AP、AAP、AS、ASP以及ASS中的氨基酸序列。
[13]
一种肽分子的制造方法，其包含：
通过在包含编码所述肽分子的多核苷酸的宿主细胞中使所述多核苷酸表达、或使编码所述肽分子的多核苷酸在无细胞表达系中表达，来生成所述肽分子的工序，
所述肽分子包含：(I)第1生理活性肽部分、(II)包含氨基酸残基的接头部分、以及(III)隔着所述接头部分位于与所述第1生理活性肽部分相反的一侧的第2生理活性肽部分和/或包含至少1个氨基酸残基的添加氨基酸序列，
所述第1生理活性肽部分和所述第2生理活性肽部分的分子量分别为10000以下，并且包含50个以下的氨基酸残基，所述第1生理活性肽部分和所述第2生理活性肽部分彼此可以相同也可以不同，
所述添加氨基酸序列的分子量为10000以下，并且包含50个以下的氨基酸残基。
[14]
根据项[13]所述的制造方法，其中，
所述第1生理活性肽部分构成了环状肽，并且/或者所述第2生理活性肽部分构成了环状肽。
[15]
一种肽分子的制造方法，其包含：
通过在包含编码所述肽分子的多核苷酸的宿主细胞中使所述多核苷酸表达、或使编码所述肽分子的多核苷酸在无细胞表达系中表达，来生成所述肽分子的工序，
所述肽分子包含：(I)构成了环状肽的第1生理活性肽部分、(II)包含氨基酸残基的接头部分、以及(III)隔着所述接头部分位于与所述第1生理活性肽部分相反的一侧的第2生理活性肽部分和/或包含至少1个氨基酸残基的添加氨基酸序列，
所述第1生理活性肽部分和所述第2生理活性肽部分彼此可以相同也可以不同，
所述添加氨基酸序列的分子量为10000以下，并且包含50个以下的氨基酸残基。
[16]
根据项[15]所述的制造方法，其中，
所述肽分子包含所述第2生理活性肽部分，并且所述第2生理活性肽部分构成了环状肽。
[17]
[13]～[16]中任一项所述的制造方法，其中，
所述接头部分的分子量为10000以下，并且包含50个以下的氨基酸残基。
[18]
根据项[13]～[16]中任一项所述的制造方法，其中，
所述接头部分是分子量为10000以下，并且包含49个以下的氨基酸残基的接头部分，其氨基酸序列的至少90％由选自丙氨酸(A)、脯氨酸(P)以及丝氨酸(S)的氨基酸残基构成。
[19]
根据项[13]～[18]中任一项所述的制造方法，其中，
所述接头部分重复包含2个以上的选自AP、AAP、AS、ASP以及ASS的氨基酸序列。
根据本发明的一种实施方式，与以往的化学合成手法相比，能够更简便并且低价地制造二聚体肽等肽分子。
根据本发明的一种实施方式，能够进行第1肽的C末端与接头结合、第2肽的N末端与接头结合的二聚体肽的高效合成。
根据本发明的一种实施方式，能够提供一种具有良好的活性的二聚体肽。
附图说明
[图1]是表示谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)中的二聚体肽(FBP-PAS)的分泌表达的、SDS-聚丙烯酰胺电泳的结果。列1是标记(XL-Ladder Broad，APRO science)，列2～5是使用了pPK10_TorAss-FBP-PAS的结果，列6是使用了pPK10(空载体)的结果。
[图2]是基于MALDI-TOF-MS的二聚体肽(FBP-PAS)的测定结果。图中的分子示意图表示FBP-PAS二聚体肽，中央部分(无色)表示PAS，其两侧部分(有色)表示FBP。
[图3]是表示单体肽(FBP)和二聚体肽(FBP-PAS)的活性评价的图表。纵轴表示相对受体活性，横轴表示bFGF浓度。图中的分子示意图中，无色部分表示PAS，有色部分表示FBP。
[图4]是表示谷氨酸棒杆菌中的二聚体肽(HGF-PAS)的分泌表达的、SDS-聚丙烯酰胺电泳的结果。列1为标记(XL-Ladder Broad，APRO science)，列2～5是使用了pPK10_TorAss-PAS-aMD4-PEG11的结果，列6～9是使用了pPK10_TorAss-PAS-aMD4dY-PEG11的结果，列10～13是使用了pPK10_TorAss-PAS-aMD4-PEG3的结果，列14是使用了pPK10(空载体)的结果。
[图5]是表示谷氨酸棒杆菌中的二聚体肽(HGF-PAS)的分泌表达的、SDS-聚丙烯酰胺电泳的结果。列1是标记(XL-Ladder Broad，APRO science)，列2～5是使用了pPK4_CspBss-AET-PAS-aMD4-PEG11的结果，列6～9是使用了pPK4_CspBss-AET-PAS-aMD4dY-PEG11的结果，列10～13是使用了pPK4_CspBss-AET-PAS-aMD4-PEG3的结果，列14是使用了pPK4(空载体)的结果。
[图6]是基于MALDI-TOF-MS的二聚体肽(HGF-PAS)的测定结果。
[图7]是表示HGF和二聚体肽(HGF-PAS)的活性评价的图表。纵轴表示相对受体活性，横轴表示浓度。
[图8]是表示HGF和二聚体肽(HGF-PAS)的活性评价的图表。纵轴表示相对受体活性，横轴表示浓度。
[图9]是表示HGF和二聚体肽(HGF-PAS)的活性评价的图表。纵轴表示相对受体活性，横轴对于HGF而言表示浓度，对于二聚体肽(HGF-PAS)而言，使用了包含相对于供至活性评价的培养基进行10倍稀释的二聚体肽(HGF-PAS)的培养上清。
[图10]是使用Proteome Profiler Human Phospho-RTK Array Kit(R&DSystems)，对二聚体肽(HGF-PAS)的受体酪氨酸激酶(RTK)特异性进行了评价的图。确认了二聚体肽(HGF-PAS)表现Met(HGF受体)特异性。
[图11]是表示Proteome Profiler Human Phospho-RTK Array Kit(R&DSystems)的各阵列的图。
[图12]是表示HGF和二聚体肽(HGF-PAS)的细胞增殖促进活性的评价的图表。纵轴表示活细胞数。
[图13]是HGF和二聚体肽(HGF-PAS)的细胞游走活性的评价中的显微镜照片图。
[图14]是表示HGF和二聚体肽(HGF-PAS)的细胞游走活性的评价的图表。纵轴表示相对迁移效率。
[图15]是HGF和二聚体肽(HGF-PAS)的创伤治愈效果的评价中通过细胞观察装置拍摄的照片图。
[图16]是表示HGF和二聚体肽(HGF-PAS)的创伤治愈效果的评价的图表。纵轴表示创伤治愈速度。
[图17]是HGF和二聚体肽(HGF-PAS)的管状结构形成效果的评价中的显微镜照片图。比例尺表示500μm。
[图18]是表示谷氨酸棒杆菌中的异二聚体肽(HGF-PAS)的分泌表达的、SDS-聚丙烯酰胺电泳的结果。列1是标记(XL-Ladder Broad，APRO science)，列2～5是使用了pPK4_CspBss-AET-PAS-aMD4_aMD5-PEG11的结果，列6是使用了pPK4(空载体)的结果。
[图19]是基于MALDI-TOF-MS的异二聚体肽(HGF-PAS)的测定结果。
[图20]是表示谷氨酸棒杆菌中的二聚体肽(HGF-PAS，HGF-GS)的分泌表达的、SDS-聚丙烯酰胺电泳的结果。列1是标记(XL-Ladder Broad，APRO science)，列2是使用了pPK4_CspBss-AET-aMD4dY-GS15的结果，列3是使用了pPK4_CspBss-AET-aMD4dY-GS22的结果，列4是使用了pPK4_CspBss-AET-aMD4dY-PAS8的结果，列5是使用了pPK4_CspBss-AET-PAS-aMD4dY-PEG11的结果，列6是使用了pPK4_CspBss-AET-aMD4dY-PAS49的结果，列7是使用了pPK4_CspBss-AET-aMD4dY-PAS100的结果，列8是使用了pPK4_CspBss-AET-aMD4dY-PAS200的结果，列9是使用了pPK4(空载体)的结果。
[图21]是基于LC-MS的二聚体肽(HGF-GS)的测定结果。Calc表示理论值，Obs表示实测值。
[图22]是基于LC-MS的二聚体肽(HGF-PAS)的测定结果。Calc表示理论值，Obs表示实测值。
[图23]是基于LC-MS的二聚体肽(HGF-PAS)的测定结果。Calc表示理论值，Obs表示实测值。
[图24]是基于LC-MS的二聚体肽(HGF-PAS)的测定结果。Calc表示理论值，Obs表示实测值。
[图25]是基于LC-MS的二聚体肽(HGF-PAS)的测定结果。Calc表示理论值，Obs表示实测值。
[图26]是基于LC-MS的二聚体肽(HGF-PAS)的测定结果。Calc表示理论值，Obs表示实测值。
[图27]是表示HGF和二聚体肽(HGF-PAS)的活性评价的图表。纵轴表示相对受体活性，横轴对于HGF而言表示浓度，对于二聚体肽(HGF-PAS)而言，表示包含二聚体肽(HGF-PAS)的培养上清相对于供至活性评价的培养基的稀释率。横轴中的PAS8、PAS22、PAS49、PAS100以及PAS200分别表示AET-aMD4dY-PAS8、AET-aMD4dY-PAS22(与AET-PAS-aMD4dY-PEG11相同)、AET-aMD4dY-PAS49、AET-aMD4dY-PAS100以及AET-aMD4dY-PAS200。Empty是使用了空载体的结果，与使用了包含二聚体肽的培养上清的情况同样，表示相对于供至活性评价的培养基的稀释率。
[图28]是HGF和二聚体肽(HGF-GS)的活性评价表示的图表。纵轴表示相对受体活性，横轴对于HGF而言表示浓度，对于二聚体肽(HGF-GS)而言，表示包含二聚体肽(HGF-PAS)的培养上清相对于供至活性评价的培养基的稀释率。横轴中的GS15以及GS22分别表示AET-aMD4dY-GS15以及AET-aMD4dY-GS22。Empty是使用了空载体的结果，与使用了包含二聚体肽的培养上清的情况同样，表示相对于供至活性评价的培养基的稀释率。
[图29]是表示谷氨酸棒杆菌中的二聚体肽(HGF-PAS)的分泌表达的、SDS-聚丙烯酰胺电泳的结果。列1是标记(XL-Ladder Broad，APRO science)，列2～5是使用了pPK4_CspBss-AET-aMD4dY-PAS22-PAS200的结果，列6是使用了pPK4(空载体)的结果。
[图30]是基于LC-MS的二聚体肽(HGF-PAS)的测定结果。Calc表示理论值，Obs表示实测值。
[图31]是表示HGF和二聚体肽(HGF-PAS)的活性评价的图表。纵轴表示相对受体活性，横轴对于HGF而言表示浓度，对于二聚体肽(HGF-PAS)而言，表示包含二聚体肽(HGF-PAS)的培养上清相对于供至活性评价的培养基的稀释率。横轴中的PAS22-PAS200表示AET-aMD4dY-PAS22-PAS200。Empty是使用了空载体的结果，与使用了包含二聚体肽的培养上清的情况同样，表示相对于供至活性评价的培养基的稀释率。
[图32]是表示谷氨酸棒杆菌中的二聚体肽(EPO-PAS)的分泌表达的、SDS-聚丙烯酰胺电泳的结果。列1是标记(XL-Ladder Broad，APRO science)，列2～5是使用了pPK4_CspBss-EPO-PAS8的结果，列6～9是使用了pPK4_CspBss-EPO-PAS22的结果，列10～13是使用了pPK4_CspBss-AET-EPO-PAS8的结果，列14～17是使用了pPK4_CspBss-AET-EPO-PAS22的结果，列18是使用了pPK4(空载体)的结果。
[图33]是基于LC-MS的二聚体肽(EPO-PAS)的测定结果。Calc表示理论值，Obs表示实测值。
[图34]是基于LC-MS的二聚体肽(EPO-PAS)的测定结果。Calc表示理论值，Obs表示实测值。
[图35]是表示rhEPO和二聚体肽(EPO-PAS)的活性评价的图表。纵轴表示相对受体活性，横轴表示浓度。
[图36]是表示作为单体肽的EMP35的活性评价的图表。纵轴表示相对受体活性，横轴表示浓度。
[图37]是表示谷氨酸棒杆菌中的二聚体肽(TPO-PAS)的分泌表达的、SDS-聚丙烯酰胺电泳的结果。列1是标记(XL-Ladder Broad，APRO science)，列2～5是使用了pPK4_CspBss-AET-TPO1-PAS8的结果，列6～9是使用了pPK4_CspBss-TPO2-PAS8的结果，列10～13是使用了pPK4_CspBss-AET-TPO2-PAS8的结果，列14是使用了pPK4(空载体)的结果。
[图38]是基于LC-MS的二聚体肽(TPO-PAS)的测定结果。Calc表示理论值，Obs表示实测值。
[图39]是基于LC-MS的二聚体肽(TPO-PAS)的测定结果。Calc表示理论值，Obs表示实测值。
[图40]是基于LC-MS的二聚体肽(TPO-PAS)的测定结果。Calc表示理论值，Obs表示实测值。
[图41]是表示rhTPO和二聚体肽(TPO-PAS)的酪氨酸磷酸化水平的评价的图表。将如上图而检测到的点发光强度定量，其定量结果在下图的图表中以相对酪氨酸磷酸化水平表示。纵轴表示相对酪氨酸磷酸化水平，横轴对于rhTPO而言表示浓度，对于二聚体肽(TPO-PAS)而言，表示包含二聚体肽(TPO-PAS)的培养上清相对于供至活性评价的培养基的稀释率。Empty CFB是使用了空载体的情况下的关于上清的结果。Mock表示PBS添加组。
[图42]是表示rhTPO和二聚体肽(TPO-PAS)的细胞活化能力评价的图表。将如上图而检测到的点发光强度定量，其定量结果在下图的图表中表示。纵轴表示点发光强度，横轴对于rhTPO而言表示浓度，对于二聚体肽(TPO-PAS)而言，表示包含二聚体肽(TPO-PAS)的培养上清相对于供至活性评价的培养基的稀释率。Mock表示PBS添加组。
[图43]是使用Proteome Profiler Human Phospho-Kinase Array Kit(R&DSystems)，对rhTPO和二聚体肽(TPO-PAS)的信号活化特性进行了评价的图。对于二聚体肽(TPO-PAS)而言，表示了包含二聚体肽(TPO-PAS)的培养上清相对于供至活性评价的培养基的稀释率。Mock表示PBS添加组。
[图44]是定量地表示了使用Proteome Profiler Human Phospho-Kinase ArrayKit(R&D Systems)测定得到的rhTPO和二聚体肽(TPO-PAS)的磷酸化能力的图表。纵轴表示相对点发光强度，横轴表示活化了的分子。对于二聚体肽(TPO-PAS)而言，表示了包含二聚体肽(TPO-PAS)的培养上清相对于供至活性评价的培养基的稀释率。Mock表示PBS添加组。
[图45]是表示谷氨酸棒杆菌中的异二聚体肽(VEGFR_D2-PAS)的分泌表达的、SDS-聚丙烯酰胺电泳的结果。列1是标记(XL-Ladder Broad，APRO science)，列2和列3分别是关于在使用了pPK4_CspBss-VEGFR_D2-PAS16的情况下的培养上清(培养上清液)的结果、和关于包含菌体的培养液整体(包含细胞的完整培养基)的结果，列4和列5分别是关于在使用了pPK4_CspBss-VEGFR_D2-PAS16的情况下，向包含菌体的沉淀组分(细胞沉淀)添加Tris-HCl后的上清组分的结果、以及关于包含菌体的混合液整体的结果，列6和列7分别是关于在使用了pPK4_CspBss-VEGFR_D2-PAS16的情况下，向包含菌体的沉淀组分添加尿素处理液(0.5M尿素)后的上清组分的结果、以及关于包含菌体的混合液整体的结果，列8和列9分别是关于在使用了pPK4_CspBss-VEGFR_D2-PAS16的情况下，向包含菌体的沉淀组分添加尿素处理液(1.0M尿素)后的上清组分的结果、以及关于包含菌体的混合液整体的结果。
[图46]是基于LC-MS的异二聚体肽(VEGFR_D2-PAS)的测定结果。Calc表示理论值，Obs表示实测值。
[图47]是表示异二聚体肽(VEGFR_D2-PAS)和作为单体肽的P3以及Pm4的VEGF抑制能力的评价的图表。纵轴表示相对VEGF活性(相对受体活性)，横轴表示浓度。
[图48]是表示谷氨酸棒杆菌中的二聚体肽(EPO-PAS、EPO-GS)的分泌表达的、SDS-聚丙烯酰胺电泳的结果。列1是标记(XL-Ladder Broad，APRO science)，列2～5是使用了pPK4_CspBss-AET-EPO-PAS49的结果，列6～9是使用了pPK4_CspBss-AET-EPO-PAS49-b的结果，列10～13是使用了pPK4_CspBss-AET-EPO-PAS100的结果，列14～17是使用了pPK4_CspBss-AET-EPO-PAS100-b的结果，列18～21是使用了pPK4_CspBss-AET-EPO-GS8的结果，列22～25是使用了pPK4_CspBss-AET-EPO-GS22的结果，列26是使用了pPK4(空载体)的结果。
[图49]是基于LC-MS的二聚体肽(EPO-GS)的测定结果。Calc表示理论值，Obs表示实测值。
[图50]是基于LC-MS的二聚体肽(EPO-GS)的测定结果。Calc表示理论值，Obs表示实测值。
[图51]是基于LC-MS的二聚体肽(EPO-PAS)的测定结果。Calc表示理论值，Obs表示实测值。
[图52]是基于LC-MS的二聚体肽(EPO-PAS)的测定结果。Calc表示理论值，Obs表示实测值。
[图53]是基于LC-MS的二聚体肽(EPO-PAS)的测定结果。Calc表示理论值，Obs表示实测值。
[图54]是基于LC-MS的二聚体肽(EPO-PAS)的测定结果。Calc表示理论值，Obs表示实测值。
[图55]是表示二聚体肽(EPO-PAS，EPO-GS)的活性评价的图表。纵轴表示相对受体活性，横轴表示浓度。
[图56]是表示二聚体肽(EPO-PAS，EPO-GS)的活性评价的图表。纵轴表示相对受体活性，横轴表示浓度。
[图57]是表示二聚体肽(EPO-PAS)的活性评价的图表。纵轴表示相对受体活性，横轴表示浓度。
[图58]是表示谷氨酸棒杆菌中的二聚体肽(EPO-PAS)的分泌表达的、SDS-聚丙烯酰胺电泳的结果。列1是标记(XL-Ladder Broad，APRO science)，列2～5是使用了pPK4_CspBss-AET-EPO-PAS22-PAS200的结果，列6～9是使用了pPK4_CspBss-AET-EPO-PAS22-PAS600的结果，列10是使用了pPK4(空载体)的结果。
[图59]是基于LC-MS的二聚体肽(EPO-PAS)的测定结果。Calc表示理论值，Obs表示实测值。
[图60]是基于LC-MS的二聚体肽(EPO-PAS)的测定结果。Calc表示理论值，Obs表示实测值。
[图61]是表示二聚体肽(EPO-PAS)的活性评价的图表。纵轴表示相对受体活性，横轴表示浓度。
[图62]是基于MALDI-TOF-MS的二聚体肽(HGF-PAS)的测定结果。
[图63]是基于MALDI-TOF-MS的二聚体肽(HGF-PAS)的测定结果。
[图64]是基于MALDI-TOF-MS的二聚体肽(HGF-PAS)的测定结果。
[图65]是基于MALDI-TOF-MS的二聚体肽(EPO-PAS)的测定结果。
[图66]是基于MALDI-TOF-MS的二聚体肽(EPO-PAS)的测定结果。
[图67]是基于MALDI-TOF-MS的二聚体肽(EPO-PAS)的测定结果。
[图68]是基于MALDI-TOF-MS的二聚体肽(VEGFR_D2-PAS)的测定结果。
[图69]是表示二聚体肽(HGF-PAS)的活性评价的图表。纵轴表示相对受体活性，横轴表示包含二聚体肽(HGF-PAS)的无细胞表达系的反应液相对于供至活性评价的培养基的稀释倍率。Blank是在无细胞表达中没有使用表达用DNA的情况下的结果。
[图70]是表示二聚体肽(EPO-PAS)的活性评价的图表。纵轴表示相对受体活性，横轴表示浓度。
[图71]是表示异二聚体肽(VEGFR_D2-PAS)的VEGF抑制能力的评价的图表。纵轴表示相对VEGF活性(相对受体活性)，横轴表示浓度。
[图72]是表示异二聚体肽(VEGFR_D2-PAS，VEGFR_D2-GS)的VEGF抑制能力的评价的图表。纵轴表示相对VEGF活性(相对受体活性)，横轴表示浓度。
[图73]是表示谷氨酸棒杆菌中的二聚体肽以及三聚体肽(HGF-PAS)的分泌表达的、SDS-聚丙烯酰胺电泳的结果。列1是标记(XL-Ladder Broad，APRO science)，列2～5是使用了pPK4_CspBss-AET-aMD4dY-PAS22-Trimer(三聚体)的结果，列6是使用了pPK4_CspBss-AET-aMD4dY-PAS22的结果，列7是使用了pPK4(空载体)的结果。
[图74]是基于LC-MS的三聚体肽(HGF-PAS)的测定结果。Calc表示理论值，Obs表示实测值。
[图75]是表示二聚体肽以及三聚体肽(HGF-PAS)的活性评价的图表。纵轴表示相对受体活性，横轴表示浓度。
[图76]是表示HGF、二聚体肽(HGF-PAS)以及作为单体肽的aMD4dY的活性评价的图表。纵轴表示相对受体活性，横轴表示浓度。
[图77]是表示谷氨酸棒杆菌中的异二聚体肽(VEGFR_D2-PAS，VEGFR_D2-GS)的分泌表达的、SDS-聚丙烯酰胺电泳的结果。列1是标记(XL-Ladder Broad，APRO science)，列2～5是使用了pPK4_CspBss-VEGFR_D2-PAS49的结果，列6～9是使用了pPK4_CspBss-VEGFR_D2-PAS49-b的结果，列10～13是使用了pPK4_CspBss-VEGFR_D2-PAS100的结果，列14～17是使用了pPK4_CspBss-VEGFR_D2-PAS100-b的结果，列18～21是使用了pPK4_CspBss-VEGFR_D2-GS16的结果，列22是使用了pPK4(空载体)的结果。
[图78]是基于LC-MS的异二聚体肽(VEGFR_D2-GS)的测定结果。Calc表示理论值，Obs表示实测值。
[图79]是基于LC-MS的异二聚体肽(VEGFR_D2-PAS)的测定结果。Calc表示理论值，Obs表示实测值。
[图80]是基于LC-MS的异二聚体肽(VEGFR_D2-PAS)的测定结果。Calc表示理论值，Obs表示实测值。
[图81]是基于LC-MS的异二聚体肽(VEGFR_D2-PAS)的测定结果。Calc表示理论值，Obs表示实测值。
[图82]是表示异二聚体肽(VEGFR_D2-PAS，VEGFR_D2-GS)的VEGF抑制能力的评价的图表。纵轴表示相对VEGF活性(相对受体活性)，横轴表示浓度。
[图83]是表示异二聚体肽(VEGFR_D2-PAS)的VEGF抑制能力的评价的图表。纵轴表示相对VEGF活性(相对受体活性)，横轴表示浓度。
[图84]是表示谷氨酸棒杆菌中的二聚体肽(TPO-PAS，TPO-GS)的分泌表达的、SDS-聚丙烯酰胺电泳的结果。列1是标记(XL-Ladder Broad，APRO science)，列2～5是使用了pPK4_CspBss-TPO2-PAS49的结果，列6～9是使用了pPK4_CspBss-TPO2-PAS49-b的结果，列10～13是使用了pPK4_CspBss-TPO2-PAS100的结果，列14～17是使用了pPK4_CspBss-TPO2-PAS100-b的结果，列18～21是使用了pPK4_CspBss-TPO2-GS8的结果，列22是使用了pPK4(空载体)的结果。
[图85]是基于LC-MS的二聚体肽(TPO-GS)的测定结果。Calc表示理论值，Obs表示实测值。
[图86]是基于LC-MS的二聚体肽(TPO-PAS)的测定结果。Calc表示理论值，Obs表示实测值。
[图87]是基于LC-MS的二聚体肽(TPO-PAS)的测定结果。Calc表示理论值，Obs表示实测值。
[图88]是基于LC-MS的二聚体肽(TPO-PAS)的测定结果。Calc表示理论值，Obs表示实测值。
[图89]是基于LC-MS的二聚体肽(TPO-PAS)的测定结果。Calc表示理论值，Obs表示实测值。
[图90]是定量地表示使用Phospho-CREB(Ser133)and Total CREB ELISA kit(RayBio公司)测定的rhTPO和二聚体肽(TPO-PAS，TPO-GS)的磷酸化能力的图表。纵轴表示相对CREB磷酸化水平，横轴表示活化了的分子。Mock表示PBS添加组。
具体实施方式
本发明的一种实施方式涉及肽分子。这样的肽分子包含：
(I)第1生理活性肽部分、
(II)包含49个以下的氨基酸残基的接头部分、
(III)隔着所述接头部分位于与所述第1生理活性肽部分相反的一侧的第2生理活性肽部分，
所述第1生理活性肽部分与所述第2生理活性肽部分彼此可以相同也可以不同，
所述接头部分的氨基酸序列的至少90％由选自丙氨酸(A)、脯氨酸(P)以及丝氨酸(S)的氨基酸残基构成。
本发明的肽分子的一种实施方式中，可以是在接头部分的N末端侧包含第1生理活性肽部分，在接头部分的C末端侧包含第2生理活性肽部分，也可以是在接头部分的C末端侧包含第1生理活性肽部分，在接头部分的N末端侧包含第2生理活性肽部分。此外，本发明的肽分子的一种实施方式中，在不阻碍第1生理活性肽以及第2生理活性肽的功能的范围内，可以在第1生理活性肽部分和/或第2生理活性肽部分的N末端侧和/或C末端侧、或在与接头部分间，含有任意的氨基酸序列。作为这样的任意氨基酸序列，例如，可以使用有助于提高宿主细胞中的肽分子的表达、分泌的序列、或单纯以调节长度为目的的序列(1个、2个、3个或1～5个Gly等)。
本发明的肽分子中，各氨基酸可以是L-氨基酸也可以是D-氨基酸，可以是天然型也可以是非天然型。此外，本发明的肽分子中，各氨基酸优选为α-、β-或γ-氨基酸，更优选为α-氨基酸。
本发明的肽分子的一种实施方式中，肽分子可以以从N末端侧其为“第1生理活性肽部分”-“接头部分”-“第2生理活性肽部分”-“接头部分”-“任意的序列”这样的，具有2个以上接头部分的方式而构成。此处，任意的序列可以是第3生理活性肽部分(可以与第1生理活性肽部分和/或第2生理活性肽部分相同也可以不同)，也可以是包含至少1个氨基酸残基的添加氨基酸序列。作为添加氨基酸序列，例如，可以举出分子量为10000以下，并且包含50个以下的氨基酸残基的序列。作为这样的添加氨基酸序列，可以举出SortaseA识别信号、Butelase识别信号等酶识别序列、FLAGtag、PAtag、组氨酸tag等tag序列、赖氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、天冬氨酸等反应性氨基酸、或包含所述反应性氨基酸的序列等。
本发明的肽分子的一种实施方式中，就肽分子而言，接头部分(II)为第1接头部分，
所述肽分子进一步包含：位于所述第2生理活性肽部分的与所述第1接头部分相反的一侧的第2接头部分，
所述肽分子进一步包含：隔着所述第2接头部分位于与所述第2生理活性肽部分相反的一侧的第3生理活性肽部分，
所述第3生理活性肽部分与所述第1生理活性肽部分和/或所述第2生理活性肽部分可以相同也可以不同，
所述第2接头部分包含49个以下的氨基酸残基，其氨基酸序列的至少90％由选自丙氨酸(A)、脯氨酸(P)以及丝氨酸(S)的氨基酸残基构成，所述第2接头部分与所述第1接头部分可以相同也可以不同。
本说明书中使用的用语“生理活性肽”是指能够在人类或动物等活体内表现出生理活性的肽。此处，“生理活性”是指，对活体的生理功能产生作用的性质，可以包含使生理功能亢进的性质以及抑制生理功能的性质这两者。
本说明书中，“生理活性肽”中，不仅包含能够在人类或动物等活体内表现出生理活性的肽本身，还包含通过活体内的修饰而变得表现出生理活性的肽(即，前体物质)，“生理活性肽”可以包含天然存在的氨基酸序列，也可以包含天然不存在的氨基酸序列。作为“生理活性肽”，例如，可以举出靶标结合肽、靶标抑制肽、靶标活化肽、酶识别肽等，但不限于此。
本说明书中使用的用语“靶标结合肽”是指与受体、酶、离子通道、转运体等靶标(主要蛋白质)结合的生理活性肽(包含通过活体内的修饰而表现出对靶标的结合性或生理活性的物质)。作为靶标结合肽，例如，可以举出白蛋白结合环状肽、脏器送达环状肽等，但不限于此。
本说明书中使用的用语“靶标抑制肽”是指具有抑制通过受体、酶、离子通道、转运体等靶标(主要蛋白质)的活化而产生的活体反应或该靶标参与的生理功能的作用的生理活性肽(包含通过活体内的修饰而表现出抑制作用的物质)。该“靶标抑制肽”中不仅包含通过与靶标本身结合而抑制通过该靶标的活化而产生的活体反应或该靶标参与的生理功能的生理活性肽，也包含通过和与靶标结合的因子结合而使该因子的性质或形状变化，来抑制通过该靶标的活化而产生的活体反应或该靶标参与的生理功能的生理活性肽。
本说明书中使用的用语“靶标活化肽”是指具有使受体、酶、离子通道、转运体等靶标(主要蛋白质)活化而使活体反应发生的作用或使该靶标参与的生理功能亢进的作用的生理活性肽(也包含通过活体内的修饰而表现出活化作用或亢进作用的物质)。该“靶标活化肽”中，不仅包含通过与靶标本身结合来使该靶标活化而使活体反应发生或使该靶标参与的生理功能亢进的生理活性肽，还包含与某因子结合而使该因子的性质或形状变化，从而使该因子变为与靶标结合的形式，由此使该靶标活化而使活体反应发生或使该靶标参与的生理功能亢进的生理活性肽。
作为“靶标结合肽”、“靶标抑制肽”以及“靶标活化肽”中的靶标，优选为通过二聚化而活化的受体，例如，可以举出增殖因子受体、生长因子受体、细胞因子受体等。
本说明书中使用的用语“酶识别肽”是指被酶识别为基质的生理活性肽(也包含通过活体内的修饰而变得被酶识别为基质的物质或变得表现出生理活性的物质)。
本发明的肽分子的一种实施方式中，第1生理活性肽部分和第2生理活性肽部分的分子量无特别限定，例如，可以为250以上、500以上、800以上或1000以上，可以为10000以下、9000以下、8000以下、7000以下、6000以下、5000以下、4000以下。
本发明的肽分子的一种实施方式中，第1生理活性肽部分和第2生理活性肽部分的长度无特别限定，例如，可以分别独立地，包含3个以上、6个以上、10个以上或12个以上的氨基酸残基，可以包含50个以下、45个以下、40个以下、35个以下、30个以下、25个以下或20个以下的氨基酸残基。
本发明的肽分子的一种实施方式中，第1生理活性肽部分和/或第2生理活性肽部分可以为直链也可以为支链，也可以构成环状肽。第1生理活性肽部分和/或第2生理活性肽部分中的环状肽以怎样的结合样式构成环状结构无特别限定，例如在2个半胱氨酸残基之间可通过二硫键，通过硫醚键(硫醇基与卤代烷基之间的键)，通过1,2,3-三唑的键(叠氮基与炔基之间的键)而形成环状结构。需要说明的是，二硫键可以通过培养菌体而在菌体内或菌体外自发地形成，或也可以通过基于菌的酶反应而形成。
本发明的肽分子的一种实施方式中，第1生理活性肽部分可以包含2个半胱氨酸残基、或至少2个半胱氨酸残基。
本发明的肽分子的一种实施方式中，第2生理活性肽部分可以包含2个半胱氨酸残基、或至少2个半胱氨酸残基。
本发明的肽分子的一种实施方式中，优选第1生理活性肽部分构成了环状肽。
本发明的肽分子的一种实施方式中，优选第2生理活性肽部分构成了环状肽。
如果本发明的肽分子在第1生理活性肽部分和/或第2生理活性肽部分中具有环状肽，则作为环状肽，无特别限定，例如，可以举出FGFR结合肽、c-Met(HGFR)结合肽、促红细胞生成素受体结合肽、血小板生成素受体结合肽、白蛋白结合肽、EGFR结合肽、VEGFR结合肽、PDGFR结合肽、Axl结合肽、PDGFR结合肽、SCFR结合肽、Flt-3结合肽、c-Ret结合肽、ROR结合肽、Tie结合肽、NGFR结合肽、胰岛素受体(insulin receptor)结合肽、EphR结合肽、Alk结合肽、DDR结合肽、TGFBR结合肽、激活素(activin)受体结合肽、BMP受体结合肽、白细胞介素受体结合肽、T细胞受体结合肽、转铁蛋白受体结合肽、脂蛋白受体结合肽、泛素连接酶结合肽、抗体结合肽、补体结合肽、GPCR结合肽、离子通道结合肽、病毒结合肽等。
本发明的肽分子的一种实施方式中，作为具体例，第1生理活性肽部分和所述第2生理活性肽部分分别构成与c-Met(也简称为Met)蛋白质结合的环状肽，彼此可以相同也可以不同。作为与c-Met蛋白结合的环状肽，可以举出包含选自以下的(a)～(i)的氨基酸序列或由其构成的、通过二硫键而形成了环状结构的环状肽，但不限于此。
(a)CYRQFNRRTHEVWNLDC(序列编号：1)
(b)CRQFNRRTHEVWNLDC(序列编号：2)
(c)CYWYYAWDQTYKAFPC(序列编号：3)
(d)CWYYAWDQTYKAFPC(序列编号：4)
(e)CYISWNEFNSPNWRFITC(序列编号：5)
(f)CISWNEFNSPNWRFITC(序列编号：6)
(g)(a)～(f)中的任一氨基酸序列中，半胱氨酸残基以外的1个或2个氨基酸残基发生了置换、缺失或添加，并且与c-Met蛋白结合的肽。
(h)包含与(a)～(f)中的任一氨基酸序列具有90％以上的序列同一性，且两端具有半胱氨酸残基的氨基酸序列，并且与c-Met蛋白结合的肽。例如，序列同一性可以为92％以上、95％以上或98％以上。需要说明的是，本说明书中，氨基酸序列相同性可以用公知的解析工具计算，例如，可以通过使用美国国家生物技术信息中心(NCBI)的相同性算法BLAST(Basic local alignment search tool)计算。此外，氨基酸序列相同性的计算使用解析工具中的default(初期设定)的参数即可。
(i)(a)～(h)中的任一氨基酸序列中，两端的半胱氨酸残基以外的至少1个氨基酸得到了修饰的肽。此处，氨基酸的修饰为磷酸化、甲基化、乙酰基化、腺苷酰化、ADP核糖化或糖链加成。
需要说明的是，Met为HGF受体，是酪氨酸激酶型受体，已知与这样的Met(HGFR)结合的环状肽通过二聚体化而作为Met(HGFR)激动剂发挥功能。
本说明书中，“置换、缺失或添加”的表达中，置换是指，置换为公知的氨基酸，优选为保守氨基酸置换。“保守氨基酸置换”是通过具有有类似的化学性质(例如，电荷或疏水性)的侧链R基的另一氨基酸残基置换氨基酸残基的置换。具有有类似的化学性质的侧链的氨基酸基的例子中，包含具有脂肪族侧链的甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸，具有脂肪族羟基侧链的丝氨酸以及苏氨酸，具有含酰胺侧链的天冬酰胺以及谷氨酰胺，具有芳香族侧链的苯丙氨酸、酪氨酸以及色氨酸，具有碱性侧链的赖氨酸、精氨酸以及组氨酸，以及具有酸性侧链的天冬氨酸以及谷氨酸。通过置换而导入的各氨基酸可以是L-氨基酸也可以是D-氨基酸，可以是天然型氨基酸也可以是非天然型，优选为在人类或动物中构成蛋白质的氨基酸。
本说明书中，“置换、缺失或添加”的表达中，添加是指，公知的氨基酸添加于氨基酸序列的末端、或公知的氨基酸插入氨基酸序列的氨基酸残基间。通过添加而导入的各氨基酸可以是L-氨基酸也可以是D-氨基酸，可以是天然型氨基酸也可以是非天然型，优选为在人类或动物中构成蛋白质的氨基酸。
本发明的肽分子的一种实施方式中，作为具体例，第1生理活性肽部分和所述第2生理活性肽部分分别构成与促红细胞生成素受体结合的环状肽，第1生理活性肽部分和所述第2生理活性肽部分彼此可以相同也可以不同。作为与促红细胞生成素受体结合的环状肽，可以举出包含选自以下的(j)～(n)的氨基酸序列或由其构成的、通过二硫键而形成了环状结构的环状肽，但不限于此。
(j)GGLYACHMGPMTWVCQPLRG(序列编号：65)
(k)CISWNEFNSPNWRFITC(序列编号：66)
(l)(j)或(k)的氨基酸序列中，半胱氨酸残基以外的1个或2个氨基酸残基发生了置换、缺失或添加，并且与促红细胞生成素受体结合的肽。
(m)包含与(j)或(k)中的任一氨基酸序列具有90％以上的序列同一性，且在(j)或(k)中的原本的位置处具有半胱氨酸残基的氨基酸序列，并且与促红细胞生成素受体结合的肽。例如，序列同一性可以为92％以上、95％以上或98％以上。
(n)(j)～(m)中的任一氨基酸序列中，半胱氨酸残基以外的至少1个氨基酸得到了修饰的肽。此处，氨基酸的修饰为磷酸化、甲基化、乙酰基化、腺苷酰化、ADP核糖化或糖链加成。
本发明的肽分子的一种实施方式中，作为具体例，第1生理活性肽部分和所述第2生理活性肽部分分别包含与血小板生成素受体结合的生理活性肽，彼此可以相同也可以不同。作为与血小板生成素受体结合的生理活性肽，可以举出包含选自以下的(o)～(u)的氨基酸序列或由其构成的肽，但不限于此。
(o)IEGPTLRQWLAARA(序列编号：67)
(p)GGCADGPTLREWISFCGG(序列编号：68)
(q)GGCTLREWLHGGFCGG(序列编号：69)
(r)LAIEGPTLRQWLHGNGRDT(序列编号：70)
(s)(o)～(r)中的任一氨基酸序列中，半胱氨酸残基以外的1个或2个氨基酸残基发生了置换、缺失或添加，并且与血小板生成素受体结合的肽。
(t)包含与(o)～(r)中的任一氨基酸序列具有90％以上的序列同一性，且在以(p)或(q)为基准的情况下在(p)或(q)中的原本的位置处具有半胱氨酸残基的氨基酸序列，并且与血小板生成素受体结合的肽。例如，序列同一性可以为92％以上、95％以上或98％以上。
(u)(o)～(t)中的任一氨基酸序列中，半胱氨酸残基以外的至少1个氨基酸得到了修饰的肽。此处，氨基酸的修饰为磷酸化、甲基化、乙酰基化、腺苷酰化、ADP核糖化或糖链加成。
序列编号：68和序列编号：69所表示的肽分别是通过二硫键而形成了环状结构的环状肽。
本发明的肽分子的一种实施方式中，作为具体例，第1生理活性肽部分和所述第2生理活性肽部分分别构成与血管内皮细胞增殖因子受体(VEGFR)结合的环状肽，第1生理活性肽部分和所述第2生理活性肽部分彼此可以相同也可以不同。作为与VEGFR结合的环状肽，可以举出包含选自以下的(aa)～(ff)的氨基酸序列或由其构成的、通过二硫键而形成了环状结构的环状肽，但不限于此。
(aa)AGPTWCEDDWYYCWLFGT(序列编号：71)
(bb)VCWEDSWGGEVCWLFGT(序列编号：72)
(cc)VCWEDSWGGEVCFRYDP(序列编号：73)
(dd)(aa)～(cc)中的任一氨基酸序列中，半胱氨酸残基以外的1个或2个氨基酸残基发生了置换、缺失或添加，并且与VEGFR结合的肽。
(ee)包含与(aa)～(cc)中的任一氨基酸序列具有90％以上的序列同一性，且在(aa)～(cc)中的原本位置处具有半胱氨酸残基的氨基酸序列，并且与VEGFR结合的肽。例如，序列同一性可以为92％以上、95％以上或98％以上。
(ff)(aa)～(ee)中的任一氨基酸序列中，半胱氨酸残基以外的至少1个氨基酸得到了修饰的肽。此处，氨基酸的修饰为磷酸化、甲基化、乙酰基化、腺苷酰化、ADP核糖化或糖链加成。
本发明的肽分子的一种实施方式中，接头部分的分子量可以为10000以下。
本发明的肽分子的一种实施方式中，就接头部分而言，其氨基酸序列的至少90％、至少95％或100％可以由选自丙氨酸(A)、脯氨酸(P)以及丝氨酸(S)的氨基酸残基构成。就脯氨酸残基而言，在接头部分的氨基酸序列中，可以构成超过4％并且小于40％。例如，脯氨酸残基在接头部分的氨基酸序列中，可以构成超过约4％、超过约5％、超过约6％、超过约8％、超过约10％、超过约15％或超过约20％，也可以构成小于约40％或小于约35％。此外，丙氨酸残基以及丝氨酸残基分别独立地，可以构成超过约4％、超过约10％或超过约20％，也可以构成小于约50％。
本说明书中，用语“约X％”是指，不受X这个数字的限制，还包含多10％～20％的残基的值、或少10％～20％的残基的值。例如，用语“约10％”分别还包含11％或12％、以及9％或8％。
接头部分的氨基酸序列中，就与丙氨酸、丝氨酸和脯氨酸不同的氨基酸残基而言，例如，可以从下述中选择：Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Thr、Trp、Tyr以及Val、以及这些氨基酸经过修饰而得的产物、或添加了官能团或保护基而得的产物(例如，氯乙酰基化的氨基酸、同型半胱氨酸(homocysteine)、巯基正缬氨酸(mercaptonorvaline)、巯基正亮氨酸(mercaptonorleucine)、2-氨基-7-巯基庚酸(2-amino-7-mercaptoheptanoic acid)和2-氨基-8-巯基辛酸(2-amino-8-mercaptooctanoicacid)、以及先将这些氨基酸的SH基暂时保护后使保护基脱保护而得到的氨基酸、炔丙基甘氨酸(propargylglycine)、高炔丙基甘氨酸(homopropargylglycine)、2-氨基-6-庚酸(2-amino-6-heptynoic acid)、2-氨基-7-辛酸(2-amino-7-octynoic acid)、2-氨基-8-壬酸(2-amino-8-nonynoic acid)、4-戊酰基(4-pentynoyl)化、5-己炔酰基(5-hexynoyl)化了的氨基酸、叠氮丙氨酸(azidoalanine)、2-氨基-4-叠氮基丁酸(2-amino-4-azidobutanoicacid)、叠氮正缬氨酸(azidoptonorvaline)、叠氮亮氨酸(azidonorleucine)、2-氨基-7-叠氮庚酸(2-amino-7-azidoheptanoic acid)、2-氨基-8-叠氮辛酸(2-amino-8-azidooctanoic acid)、叠氮乙酰基(azidoacetyl)化或3-叠氮戊酰基(3-azidopentanoyl)化了的氨基酸、N-(4-氨基甲基-苯甲酰基)-苯丙氨酸(N-(4-aminomethyl-benzoyl)-phenylalanine，AMBF)、4-3-氨基甲基酪氨酸(4-3-aminomethyltyrosine)、5-羟基色氨酸(5-hydroxytryptophan，WOH)、N-3-氯甲基苯甲酰基-L-苯丙氨酸(N-3-chloromethylbenzoyl-L-phenylalanine)、N-3-氯甲基苯甲酰基-L-酪氨酸(N-3-chloromethylbenzoyl-L-tyrosine)、N-3-氯甲基苯甲酰基-L-色氨酸(N-3-chloromethylbenzoyl-L-tryptophane))。此外，各氨基酸可以为L-氨基酸也可以为D-氨基酸。作为这样的与丙氨酸、丝氨酸和脯氨酸不同的氨基酸残基，优选Val、Ile、Leu、Met、Phe、Tyr或Trp这样的不具有疏水性侧链的残基、和/或Lys、Arg、Asp或Glu这样的不具有带电荷的侧链的残基。
本发明的肽分子的一种实施方式中，就接头部分而言，其氨基酸序列的至少90％、至少95％或100％可以由选自丙氨酸(A)和脯氨酸(P)的氨基酸残基构成。该情况下，就脯氨酸残基而言，在接头部分的氨基酸序列中，可以构成超过10％并且小于75％。例如，脯氨酸残基在接头部分的氨基酸序列中，可以构成超过约10％、超过约12％、超过约14％、超过约18％、超过约20％、超过约22％、超过约23％、超过约24％或超过约25％，可以构成小于约75％、小于约70％、小于约65％、小于约60％、小于约55％、小于约50％、小于约48％、小于约46％、小于约44％、小于约42％、小于约41％、小于约40％、小于约39％、小于约38％、小于约37％、小于约36％或小于约35％。此外，丙氨酸残基可以构成超过约25％、超过约30％、超过约35％、超过约40％、超过约45％、超过约50％、超过约52％、超过约54％、超过约56％、超过约58％、超过约59％、超过约60％、超过约61％、超过约62％、超过约63％、超过约64％或超过约65％，可以构成小于约90％、小于约88％、小于约86％、小于约84％、小于约82％、小于约80％、小于约79％、小于约78％、小于约77％、小于约76％或小于约75％。
接头部分的氨基酸序列中，与丙氨酸、丝氨酸和脯氨酸不同的氨基酸残基可以选自Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Thr、Trp、Tyr以及Val。作为这样的与丙氨酸、丝氨酸和脯氨酸不同的氨基酸残基，优选Val、Ile、Leu、Met、Phe、Tyr或Trp这样的不具有疏水性侧链的残基、和/或Lys、Arg、Asp或Glu这样的不具有带电荷的侧链的残基。
本发明的肽分子的一种实施方式中，接头部分包含多个氨基酸重复，所述氨基酸重复包含丙氨酸(A)、脯氨酸(P)以及丝氨酸(S)，所述氨基酸重复中同一氨基酸残基的连续数可以为6残基以下、5残基以下、4残基以下或3残基以下。
本发明的肽分子的一种实施方式中，接头部分包含多个氨基酸重复，所述氨基酸重复包含丙氨酸(A)和脯氨酸(P)，所述氨基酸重复中同一氨基酸残基的连续数可以为6残基以下、5残基以下、4残基以下或3残基以下。
本发明的肽分子的一种实施方式中，接头部分可以重复包含2个以上的选自AP、AAP、AS、ASP以及ASS氨基酸序列。
本发明的肽分子的一种实施方式中，接头部分例如可以包含5个以上、6个以上、7个以上或8个以上的氨基酸残基。
本发明的肽分子的一种实施方式中，作为接头部分的具体例，可以举出包含以下的氨基酸序列的接头部分、或由以下的氨基酸序列构成的接头部分，但不限于此。选自AAPAAPAP(序列编号：74)、AAPAAPAPAAPAAPAP(序列编号：75)、AAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPA(序列编号：76)、SAPSPSSAPASASAPASPASASASASPASSPASASSASPAASSASPASS(序列编号：77)、AAPAAPAPAAPAAPAPAAPA(序列编号：7)、AAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAP(序列编号：8)、AAPAAPAPAAPAAP(序列编号：9)、AAPAAAPAPAAPAAPAPAAP(序列编号10)、AAAPAAAPAAAPAAAPAAAP(序列编号11)、AAPAAPAAPAAPAAPAAPAAPAAP(序列编号12)、APAAAPAPAAAPAPAAAPAPAAAP(序列编号13)、AAAPAAPAAPPAAAAPAAPAAPPA(序列编号14)、以及APAPAPAPAPAPAPAPAPAP(序列编号15)、ASPAAPAPASPAAPAPSAPA(序列编号16)、AAPASPAPAAPSAPAPAAPS(序列编号17)、APSSPSPSAPSSPSPASPSS(序列编号18)、SAPSSPSPSAPSSPSPASPS(序列编号19)、SSPSAPSPSSPASPSPSSPA(序列编号20)、AASPAAPSAPPAAASPAAPSAPPA(序列编号21)以及ASAAAPAAASAAASAPSAAA(序列编号22)、以及它们的环状排列变异序列的氨基酸序列。
就环状排列变异序列而言，以AAPAAPAPAAPAAPAPAAPA(序列编号：7)为例进行说明，例如，可以通过将所述序列的第1丙氨酸除去并在所述序列的末端添加另一丙氨酸而容易地制作。序列编号：7的这样的环状排列变异序列为APAAPAPAAPAAPAPAAPAA(序列编号：23)。此外，作为序列编号7的环状地改变氨基酸残基的顺序而得到的环状排列变异序列的非限定性例子，可以举出以下的例子。PAAPAPAAPAAPAPAAPAAA(序列编号：24)、AAPAPAAPAAPAPAAPAAAP(序列编号：25)、APAPAAPAAPAPAAPAAAPA(序列编号：26)、PAPAAPAAPAPAAPAAAPAA(序列编号：27)、APAAPAAPAPAAPAAAPAAP(序列编号：28)、PAAPAAPAPAAPAAAPAAPA(序列编号：29)、AAPAAPAPAAPAAAPAAPAP(序列编号：30)、APAAPAPAAPAAAPAAPAPA(序列编号：31)、以及PAAPAPAAPAAAPAAPAPAA(序列编号：32)。
本发明的肽分子的一种实施方式中，肽分子可以在不与接头部分相邻的位置进一步包含功能性修饰部分。
本说明书中使用的用语“功能性修饰部分”是指，在肽分子中赋予肽分子与生理活性肽的功能不同的、其他某种功能的部分，优选包含氨基酸序列。作为功能性修饰部分，例如，可以举出稳定化序列、水溶性提高序列、酶识别序列、tag序列、靶标结合序列等，但不限于此。
作为稳定化序列或水溶性提高序列的具体例，可以举出如日本特表2013-531480(此处以构成本说明书的一部分的形式通过参照该文献的内容而引用)中记载的包含至少含有50个脯氨酸以及丙氨酸的氨基酸残基的氨基酸序列的随机卷曲多肽、或如日本特表2010-531139(此处以构成本说明书的一部分的形式通过参照该文献的内容而引用)中记载的包含含有脯氨酸、丙氨酸以及丝氨酸的氨基酸残基的氨基酸序列的随机卷曲多肽等，但不限于此。
作为酶识别序列的具体例，可以举出SortaseA识别信号、Butelase识别信号、谷氨酰胺转氨酶(Transglutaminase)识别信号等，但不限于此。
作为tag序列的具体例，可以举出FLAGtag、PAtag、组氨酸tag等，但不限于此。
作为靶标结合序列的具体例，可以举出VHH、scFv这样的低分子抗体等，但不限于此。
本发明的肽分子的一种实施方式中，功能性修饰部分例如可以包含3个以上、6个以上、10个以上或12个以上的氨基酸残基，可以包含1000个以下、500个以下、300个以下或150个以下的氨基酸残基。
本发明的一种实施方式涉及肽分子的制造方法。通过本发明的制造方法制造的肽分子包含：
(I)第1生理活性肽部分、
(II)包含氨基酸残基的接头部分、以及
(III)隔着所述接头部分位于与所述第1生理活性肽部分相反的一侧的第2生理活性肽部分或包含至少1个氨基酸残基的添加氨基酸序列。
本发明的制造方法的一种实施方式中，肽分子例如可以具有从N末端侧起为“第1生理活性肽部分”-“接头部分”-“第2生理活性肽部分”的结构，或从N末端侧起为“第1生理活性肽部分”-“接头部分”-“添加氨基酸序列”的结构，但不限于此。此外，肽分子也可以以如从N末端侧起为“第1生理活性肽部分”-“接头部分”-“第2生理活性肽部分”-“接头部分”-“任意的序列”这样的形式，以具有2个以上的接头部分的方式(隔着2个以上的接头部分将第1生理活性肽部分、以及第2生理活性肽部分和/或包含至少1个氨基酸残基的添加氨基酸序列3个以上地串联连结)构成。此处，任意的序列可以为生理活性肽部分(可以与第1生理活性肽部分和/或第2生理活性肽部分相同)，也可以为包含至少1个氨基酸残基的添加氨基酸序列。
作为如此制造的肽分子的具体例，其可以为包含前述的以下部分的肽分子：
(I)第1生理活性肽部分、
(II)包含49个以下的氨基酸残基的接头部分、以及
(III)隔着所述接头部分位于与所述第1生理活性肽部分相反的一侧的第2生理活性肽部分，其中
所述第1生理活性肽部分和所述第2生理活性肽部分彼此可以相同也可以不同，
所述接头部分的氨基酸序列的至少90％由选自丙氨酸(A)、脯氨酸(P)以及丝氨酸(S)的氨基酸残基构成。
在通过本发明的制造方法制造的肽分子中，第1生理活性肽部分和第2生理活性肽部分的分子量分别可以为10000以下，并且可以包含50个以下的氨基酸残基，第1生理活性肽部分和第2生理活性肽部分彼此可以相同也可以不同。作为第1生理活性肽部分和/或第2生理活性肽部分，例如，可以举出FGFR结合肽、c-Met(HGFR)结合肽、促红细胞生成素受体结合肽、血小板生成素受体结合肽、白蛋白结合肽、EGFR结合肽、VEGFR结合肽、PDGFR结合肽、Axl结合肽、PDGFR结合肽、SCFR结合肽、Flt-3结合肽、c-Ret结合肽、ROR结合肽、Tie结合肽、NGFR结合肽、胰岛素受体结合肽、EphR结合肽、Alk结合肽、DDR结合肽、TGFBR结合肽、激活素受体结合肽、BMP受体结合肽、白细胞介素受体结合肽、T细胞受体结合肽、转铁蛋白受体结合肽、脂蛋白受体结合肽、泛素连接酶结合肽、抗体结合肽、补体结合肽、GPCR结合肽、离子通道结合肽、病毒结合肽等，但不限于此。
本发明的制造方法的一种实施方式中，第1生理活性肽部分和第2生理活性肽部分的分子量例如可以为9000以下、8000以下、7000以下、6000以下、5000以下、4000以下，此外，可以为250以上、500以上、800以上或1000以上。
本发明的制造方法的一种实施方式中，就第1生理活性肽部分和第2生理活性肽部分的长度而言，例如可以分别独立地包含45个以下、40个以下、35个以下、30个以下、25个以下或20个以下的氨基酸残基，此外，可以包含3个以上、6个以上、10个以上或12个以上的氨基酸残基。
本发明的制造方法的一种实施方式中，第1生理活性肽部分和/或第2生理活性肽部分可以为直链也可以为支链，也可以构成环状肽。第1生理活性肽部分和/或第2生理活性肽部分中的环状肽以怎样的结合样式而形成环状结构无特别限定，例如在2个半胱氨酸残基之间可通过二硫键，通过硫醚键(硫醇基与卤代烷基之间的键)，通过1,2,3-三唑的键(叠氮基与炔基之间的键)而形成环状结构。需要说明的是，二硫键可以通过培养菌体而在菌体内或菌体外自发地形成，或通过基于菌的酶反应而形成。
本发明的制造方法的一种实施方式中，第1生理活性肽部分可以包含2个半胱氨酸残基、或至少2个半胱氨酸残基。
本发明的制造方法的一种实施方式中，第2生理活性肽部分可以包含2个半胱氨酸残基、或至少2个半胱氨酸残基。
作为环状肽，可以认为存在各种各样的肽，在第1生理活性肽部分和/或第2生理活性肽部分中，构成怎样的环状肽无特别限定。
本发明的制造方法的一种实施方式中，肽分子如果为二聚体肽，则可能具有比单体肽更高的生理活性。例如，在通过本发明的制造方法制造的肽分子为2个FGFR结合环状肽隔着接头部分而结合的分子的情况下，可能具有比1个FGFR结合环状肽更高的FGFR抑制活性。
作为环状肽的具体例，在以下举出了与c-Met(也简称为Met)结合的环状肽，但通过本发明的制造方法而得到的肽分子中的环状肽不限于此。
包含选自以下的(a)～(i)的氨基酸序列或由其构成的、通过二硫键而形成了环状结构的环状肽。
(a)CYRQFNRRTHEVWNLDC(序列编号：1)
(b)CRQFNRRTHEVWNLDC(序列编号：2)
(c)CYWYYAWDQTYKAFPC(序列编号：3)
(d)CWYYAWDQTYKAFPC(序列编号：4)
(e)CYISWNEFNSPNWRFITC(序列编号：5)
(f)CISWNEFNSPNWRFITC(序列编号：6)
(g)(a)～(f)中的任一氨基酸序列中，半胱氨酸残基以外的1个或2个氨基酸残基发生了置换、缺失或添加，并且与c-Met蛋白结合的肽。
(h)包含与(a)～(f)中的任一氨基酸序列具有90％以上的序列同一性，且两端具有半胱氨酸残基的氨基酸序列，并且与c-Met蛋白结合的肽。例如，序列同一性可以为92％以上、95％以上或98％以上。本说明书中，氨基酸序列相同性可以用公知的解析工具计算，例如，可以通过使用美国国家生物技术信息中心(NCBI)的相同性算法BLAST(Basic localalignment search tool)计算。此外，氨基酸序列相同性的计算使用解析工具中的default(初期设定)的参数即可。
(i)(a)～(h)中的任一氨基酸序列中，两端的半胱氨酸残基以外的至少1个氨基酸得到了修饰的肽。此处，氨基酸的修饰为磷酸化、甲基化、乙酰基化、腺苷酰化、ADP核糖化或糖链加成。
需要说明的是，Met为HGF受体，是酪氨酸激酶型受体，已知与这样的Met(HGFR)结合的环状肽通过二聚体化而作为Met(HGFR)激动剂发挥功能。
本发明的制造方法的一种实施方式中，制造的肽分子所具有的第1生理活性肽部分和/或第2生理活性肽部分可以构成与促红细胞生成素受体结合的环状肽。在第1生理活性肽部分以及第2生理活性肽部分这两者构成与促红细胞生成素受体结合的环状肽的情况下，这些环状肽彼此可以相同也可以不同。作为与促红细胞生成素受体结合的环状肽，可以举出包含选自以下的(j)～(n)的氨基酸序列或由其构成的、通过二硫键而形成了环状结构的环状肽，但不限于此。
(j)GGLYACHMGPMTWVCQPLRG(序列编号：65)
(k)CISWNEFNSPNWRFITC(序列编号：66)
(l)(j)或(k)的氨基酸序列中，半胱氨酸残基以外的1个或2个氨基酸残基发生了置换、缺失或添加，并且与促红细胞生成素受体结合的肽。
(m)包含与(j)或(k)中的任一氨基酸序列具有90％以上的序列同一性，且在(j)或(k)中的原本的位置处具有半胱氨酸残基的氨基酸序列，并且与促红细胞生成素受体结合的肽。例如，序列同一性可以为92％以上、95％以上或98％以上。
(n)(j)～(m)中的任一氨基酸序列中，半胱氨酸残基以外的至少1个氨基酸得到了修饰的肽。此处，氨基酸的修饰为磷酸化、甲基化、乙酰基化、腺苷酰化、ADP核糖化或糖链加成。
本发明的制造方法的一种实施方式中，制造的肽分子所具有的第1生理活性肽部分和/或第2生理活性肽部分可以包含与血小板生成素受体结合的生理活性肽。在第1生理活性肽部分以及第2生理活性肽部分这两者构成与血小板生成素受体结合的生理活性肽的情况下，这些生理活性肽彼此可以相同也可以不同。作为与血小板生成素受体结合的生理活性肽，可以举出包含选自以下的(o)～(u)的氨基酸序列或由其构成的肽，但不限于此。
(o)IEGPTLRQWLAARA(序列编号：67)
(p)GGCADGPTLREWISFCGG(序列编号：68)
(q)GGCTLREWLHGGFCGG(序列编号：69)
(r)LAIEGPTLRQWLHGNGRDT(序列编号：70)
(s)(o)～(r)中的任一氨基酸序列中，半胱氨酸残基以外的1个或2个氨基酸残基发生了置换、缺失或添加，并且与血小板生成素受体结合的肽。
(t)包含与(o)～(r)中的任一氨基酸序列具有90％以上的序列同一性，且在以(p)或(q)为基准的情况下在(p)或(q)中的原本的位置处具有半胱氨酸残基的氨基酸序列，并且与血小板生成素受体结合的肽。例如，序列同一性可以为92％以上、95％以上或98％以上。
(u)(o)～(t)中的任一氨基酸序列中，半胱氨酸残基以外的至少1个氨基酸得到了修饰的肽。此处，氨基酸的修饰为磷酸化、甲基化、乙酰基化、腺苷酰化、ADP核糖化或糖链加成。
序列编号：68与序列编号：69所表示的肽分别是通过二硫键而形成了环状结构的环状肽。
本发明的制造方法的一种实施方式中，制造的肽分子所具有的第1生理活性肽部分和/或第2生理活性肽部分可以构成与血管内皮细胞增殖因子受体(VEGFR)结合的环状肽。在第1生理活性肽部分以及第2生理活性肽部分这两者构成与VEGFR结合的环状肽的情况下，这些环状肽彼此可以相同也可以不同。作为与VEGFR结合的环状肽，可以举出包含选自以下的(aa)～(ff)的氨基酸序列或由其构成的、通过二硫键而形成了环状结构的环状肽，但不限于此。
(aa)AGPTWCEDDWYYCWLFGT(序列编号：71)
(bb)VCWEDSWGGEVCWLFGT(序列编号：72)
(cc)VCWEDSWGGEVCFRYDP(序列编号：73)
(dd)(aa)～(cc)中的任一氨基酸序列中，半胱氨酸残基以外的1个或2个氨基酸残基发生了置换、缺失或添加，并且与VEGFR结合的肽。
(ee)包含与(aa)～(cc)中的任一氨基酸序列具有90％以上的序列同一性，且在(aa)～(cc)中的原本位置处具有半胱氨酸残基的氨基酸序列，并且与VEGFR结合的肽。例如，序列同一性可以为92％以上、95％以上或98％以上。
(ff)(aa)～(ee)中的任一氨基酸序列中，半胱氨酸残基以外的至少1个氨基酸得到了修饰的肽。此处，氨基酸的修饰为磷酸化、甲基化、乙酰基化、腺苷酰化、ADP核糖化或糖链加成。
本发明的制造方法的一种实施方式中，接头部分的分子量可以为10000以下，并且包含50个以下的氨基酸残基。
此外，本发明的制造方法的一种实施方式中，接头部分可以为分子量10000以下，并且包含50个以下或49个以下的氨基酸残基的接头部分，其氨基酸序列的至少90％、至少95％或100％可以由选自丙氨酸(A)、脯氨酸(P)以及丝氨酸(S)的氨基酸残基构成。该情况下，脯氨酸残基在接头部分的氨基酸序列中，可以构成超过4％并且小于40％。例如，脯氨酸残基在接头部分的氨基酸序列中，可以构成超过约4％、超过约5％、超过约6％、超过约8％、超过约10％、超过约15％或超过约20％，可以构成小于约40％或小于约35％。此外，丙氨酸残基以及丝氨酸残基分别独立地，可以构成超过约4％、超过约10％或超过约20％，可以构成小于约50％。
本说明书中，用语“约X％”是指，不限于百分比的简洁的数字，还进一步包含多10％～20％的残基的值，或少10％～20％的残基的值。例如，用语“约10％”还分别进一步涉及11％或12％、以及9％或8％。
接头部分的氨基酸序列中，与丙氨酸、丝氨酸和脯氨酸不同的氨基酸残基可以选自Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Thr、Trp、Tyr以及Val。作为这样的与丙氨酸、丝氨酸和脯氨酸不同的氨基酸残基，优选Val、Ile、Leu、Met、Phe、Tyr或Trp这样的不具有疏水性侧链的残基、和/或Lys、Arg、Asp或Glu这样的不具有带电荷的侧链的残基。
本发明的制造方法的一种实施方式中，接头部分可以为分子量10000以下，并且包含50个以下或49个以下的氨基酸残基的接头部分，该氨基酸序列的至少90％、至少95％或100％可以包含选自丙氨酸(A)和脯氨酸(P)的氨基酸残基。该情况下，脯氨酸残基在接头部分的氨基酸序列中，可以构成超过10％并且小于75％。例如，脯氨酸残基在接头部分的氨基酸序列中，可以构成超过约10％、超过约12％、超过约14％、超过约18％、超过约20％、超过约22％、超过约23％、超过约24％或超过约25％，可以构成小于约75％、小于约70％、小于约65％、小于约60％、小于约55％、小于约50％、小于约48％、小于约46％、小于约44％、小于约42％、小于约41％、小于约40％、小于约39％、小于约38％、小于约37％、小于约36％或小于约35％。此外，丙氨酸残基可以构成超过约25％、超过约30％、超过约35％、超过约40％、超过约45％、超过约50％、超过约52％、超过约54％、超过约56％、超过约58％、超过约59％、超过约60％、超过约61％、超过约62％、超过约63％、超过约64％或超过约65％，可以构成小于约90％、小于约88％、小于约86％、小于约84％、小于约82％、小于约80％、小于约79％、小于约78％、小于约77％、小于约76％或小于约75％。
接头部分的氨基酸序列中，与丙氨酸、丝氨酸和脯氨酸不同的氨基酸残基可以选自Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Thr、Trp、Tyr以及Val。作为这样的与丙氨酸、丝氨酸和脯氨酸不同的氨基酸残基，优选Val、Ile、Leu、Met、Phe、Tyr或Trp这样的不具有疏水性侧链的残基、和/或Lys、Arg、Asp或Glu这样的不具有带电荷的侧链的残基。
本发明的制造方法的一种实施方式中，接头部分包含多个氨基酸重复，所述氨基酸重复包含丙氨酸(A)、脯氨酸(P)以及丝氨酸(S)，所述氨基酸重复中同一氨基酸残基的连续数可以为6残基以下、5残基以下、4残基以下或3残基以下。
本发明的制造方法的一种实施方式中，接头部分包含多个氨基酸重复，所述氨基酸重复包含丙氨酸(A)和脯氨酸(P)，所述氨基酸重复中同一氨基酸残基的连续数可以为6残基以下、5残基以下、4残基以下或3残基以下。
本发明的制造方法的一种实施方式中，接头部分可以重复包含2个以上的选自AP、AAP、AS、ASP以及ASS氨基酸序列。
本发明的制造方法的一种实施方式中，接头部分可以包含由甘氨酸(G)和丝氨酸(S)构成的序列。该情况下，接头部分可以重复包含选自GGGGS、GGGS、GGS、以及GS的氨基酸序列。
本发明的制造方法的一种实施方式中，接头部分可以连续包含甘氨酸，此外，也可以仅由甘氨酸构成。
本发明的制造方法的一种实施方式中，接头部分可以重复包含EAAAK所表示的氨基酸序列。
本发明的制造方法的一种实施方式中，作为接头部分的氨基酸序列，优选：包含A、P以及S的序列、包含A以及P的序列、或重复包含GGGGS所表示的序列的序列，但不限于此。
本发明的制造方法的一种实施方式中，接头部分的长度可以包含50个以下的氨基酸残基，例如，接头部分可以包含49个以下、40个以下、35个以下、30个以下或25个以下的氨基酸残基。
本发明的制造方法的一种实施方式中，接头部分可以包含1个以上的氨基酸残基，例如，接头部分可以包含4个以上、8个以上、12个以上或16个以上的氨基酸残基。
本发明的制造方法的一种实施方式中，作为接头部分的具体例，可以举出包含以下的氨基酸序列的接头部分、或由以下的氨基酸序列构成的接头部分，但不限于此。选自AAPAAPAP(序列编号：74)、AAPAAPAPAAPAAPAP(序列编号：75)、AAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPA(序列编号：76)、SAPSPSSAPASASAPASPASASASASPASSPASASSASPAASSASPASS(序列编号：77)、AAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPA(序列编号：78)、SAPSPSSAPASASAPASPASASASASPASSPASASSASPAASSASPASSSASPSAPAAPSASAAPSASPASSSPAPASAPSPAAAASSPSPAPSSASSAA(序列编号：79)、AAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAP(序列编号：80)、AAPAAPAPAAPAAPAPAAPA(序列编号：7)、AAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAP(序列编号：8)、AAPAAPAPAAPAAP(序列编号：9)、AAPAAAPAPAAPAAPAPAAP(序列编号10)、AAAPAAAPAAAPAAAPAAAP(序列编号11)、AAPAAPAAPAAPAAPAAPAAPAAP(序列编号12)、APAAAPAPAAAPAPAAAPAPAAAP(序列编号13)、AAAPAAPAAPPAAAAPAAPAAPPA(序列编号14)、以及APAPAPAPAPAPAPAPAPAP(序列编号15)、ASPAAPAPASPAAPAPSAPA(序列编号16)、AAPASPAPAAPSAPAPAAPS(序列编号17)、APSSPSPSAPSSPSPASPSS(序列编号18)、SAPSSPSPSAPSSPSPASPS(序列编号19)、SSPSAPSPSSPASPSPSSPA(序列编号20)、AASPAAPSAPPAAASPAAPSAPPA(序列编号21)以及ASAAAPAAASAAASAPSAAA(序列编号22)、以及它们的环状排列变异序列的氨基酸序列。
就环状排列变异序列而言，以AAPAAPAPAAPAAPAPAAPA(序列编号：7)为例进行说明，例如，可以通过将所述序列的第1丙氨酸除去并在所述序列的末端添加另一丙氨酸而容易地制作。序列编号：7的这样的环状排列变异序列为APAAPAPAAPAAPAPAAPAA(序列编号：23)。此外，作为序列编号7的环状地改变氨基酸残基的顺序而得到的环状排列变异序列的非限定性例子，可以举出以下的例子。PAAPAPAAPAAPAPAAPAAA(序列编号：24)、AAPAPAAPAAPAPAAPAAAP(序列编号：25)、APAPAAPAAPAPAAPAAAPA(序列编号：26)、PAPAAPAAPAPAAPAAAPAA(序列编号：27)、APAAPAAPAPAAPAAAPAAP(序列编号：28)、PAAPAAPAPAAPAAAPAAPA(序列编号：29)、AAPAAPAPAAPAAAPAAPAP(序列编号：30)、APAAPAPAAPAAAPAAPAPA(序列编号：31)、以及PAAPAPAAPAAAPAAPAPAA(序列编号：32)。
本发明的制造方法的一种实施方式中，就通过本发明的制造方法制造的肽分子而言，相对于第1生理活性肽部分，隔着接头部分在相反的一侧可以包含：包含至少1个氨基酸残基的添加氨基酸序列。该添加氨基酸序列的分子量为10000以下，并且包含50个以下的氨基酸残基。作为这样的添加氨基酸序列，可以举出SortaseA识别信号、Butelase识别信号等酶识别序列、FLAGtag、PAtag、组氨酸tag等tag序列、赖氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、天冬氨酸等反应性氨基酸、或包含所述反应性氨基酸的序列等。
在通过本发明的制造方法制造的肽分子相对于第1生理活性肽部分，隔着接头部分在相反的一侧包含含有至少1个氨基酸残基的添加氨基酸序列，所述添加氨基酸序列为由反应性氨基酸构成或包含反应性氨基酸的序列的情况下，该肽分子可以作为用于制备生理活性肽-药物复合物等的复合物用试剂而使用。
通过本发明的制造方法制造的肽分子可以在隔着接头部分与第1生理活性肽部分相反的一侧，包含第2生理活性肽部分、以及包含至少1个氨基酸残基的添加氨基酸序列。
通过本发明的制造方法制造的肽分子可以在接头部分的N末端侧包含第1生理活性肽部分，在接头部分的C末端侧包含第2生理活性肽部分和/或添加氨基酸序列。此外，通过本发明的制造方法制造的肽分子也可以在接头部分的C末端侧包含第1生理活性肽部分，在接头部分的N末端侧包含第2生理活性肽部分和/或添加氨基酸序列。并且，通过本发明的制造方法制造的肽分子可以在第1生理活性肽部分和/或第2生理活性肽部分的N末端侧和/或C末端侧、或与接头部分之间处，在不阻碍第1生理活性肽以及第2生理活性肽的功能的范围内包含任意的氨基酸序列。作为这样的任意的氨基酸序列，例如，可以使用有助于提高宿主细胞中的肽分子的表达、分泌的序列。
本发明的制造方法的一种实施方式中，制造的肽分子可以在不与接头部分相邻的位置进一步包含功能性修饰部分。就功能性修饰部分而言如前所述。
本发明的制造方法包含：通过在包含编码肽分子的多核苷酸的宿主细胞中使所述多核苷酸表达、或使编码所述肽分子的多核苷酸在无细胞表达系中表达，来生成所述肽分子的工序。包含编码肽分子的多核苷酸的宿主细胞可以通过周知的手法准备。例如，包含编码肽分子的多核苷酸的宿主细胞可以是通过将包含该多核苷酸的重组载体导入宿主细胞中等而准备的。
本发明的制造方法的一种实施方式中，宿主细胞无特别限定，例如，可以举出埃希氏菌属(例如，大肠杆菌(Escherichia coli))、棒状杆菌属(例如，谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum))等原核细胞(细菌)、酵母等真菌细胞(真菌)、植物细胞、昆虫细胞以及动物细胞等。就作为宿主细胞的棒状杆菌属的细菌而言，可以使用WO2016/171224所述的菌。
本发明的制造方法的一种实施方式中，宿主细胞中的多核苷酸的表达可以是暂时性的也可以是稳定的。就宿主细胞的培养条件而言，本领域技术人员可以根据使用的宿主细胞的种类，基于技术常识而适宜选择。例如，就进行培养的环境的温度、湿度以及二氧化碳浓度等条件而言，只要是多核苷酸可在宿主细胞中表达的条件即可，使用的培养基只要适合于各个宿主细胞就无特别限定，可以从以往公知的培养基中选择。
本发明的制造方法的一种实施方式中，无细胞表达系中的肽分子合成可以使用细胞的提取液，也可以使用市售的无细胞表达用试剂，本领域技术人员可以根据周知的技术进行。作为无细胞表达系中包含的成分，可以举出编码作为模板的期望的多肽的核酸(DNA或mRNA)、转录·翻译·能量再生·翻译后修饰所需要的蛋白质(RNA聚合酶、核糖体、氨酰tRNA合成酶、翻译起始因子、翻译延伸谨慎因子、翻译终止因子、核糖体再生因子、核苷二磷酸激酶、腺苷激酶、肌酸激酶、脯氨酰异构酶、二硫键异构酶、分子伴侣等)、tRNA、氨酰tRNA、天然氨基酸、非天然氨基酸、NTP、缓冲液等。
作为市售的无细胞表达用试剂，例如，可以举出PUREfrex2.0(GeneFrontier公司)、PURExpress In Vitro Protein Synthesis Kit(New England BioLabs公司)等。
本发明的制造方法为了生成肽分子，也可以包含：将编码肽分子的多核苷酸或包含所述多核苷酸的重组载体导入宿主细胞的工序；以及使所述多核苷酸在该宿主细胞中表达，而生成肽分子的工序。就该导入工序中的导入手段而言，本领域技术人员可以基于技术常识，根据使用的宿主细胞的种类而适宜选择。作为可以使用的载体，只要能够功能性地插入编码肽分子的多核苷酸，能够以在宿主细胞内进行异种核酸片段的复制和/或表达的方式将该片段搬运至宿主细胞内即可，例如，可以举出质粒、噬菌体、粘粒以及病毒。就载体而言，本领域技术人员可以根据使用的宿主细胞的种类而适宜选择。
本发明的制造方法的一种实施方式中，就编码肽分子的多核苷酸而言，根据该肽分子的氨基酸序列，本领域技术人员可以使用现有的多核苷酸合成技术进行适宜合成。作为编码肽分子的多核苷酸的例子，可以举出编码具有“第1生理活性肽部分”-“接头部分”-“第2生理活性肽部分”或“第1生理活性肽部分”-“接头部分”-“添加氨基酸序列”的结构的肽分子的多核苷酸。可以由这样的多核苷酸简便并且低价地生成肽分子。
本发明的制造方法的一种实施方式中，就编码肽分子的多核苷酸而言，可以在其N末端侧适宜地包含启动子序列、信号序列。此外，多核苷酸可以在N末端侧和/或C末端侧包含限制酶识别序列。就这样的启动子序列、信号序列以及限制酶识别序列而言，本领域技术人员可以根据使用的宿主细胞、载体的种类而适宜选择。
本发明的制造方法的一种实施方式中，就制造的肽分子而言，可以根据本领域技术人员的技术常识，从宿主细胞中适宜分离，并且也可以纯化和/或回收。
本发明的制造方法的一种实施方式中，就制造的肽分子而言，其从宿主细胞中分泌后，可以根据本领域技术人员的技术常识，适宜地进行分离，并且也可以纯化和/或回收。
本发明的制造方法的一种实施方式中，可以从1条多核苷酸链中表达二聚体肽等期望的肽分子，与以往的化学合成手法相比，能够更简便并且低价地制造二聚体肽等期望的肽分子。
本发明的制造方法的一种实施方式中，在第1生理活性肽部分和/或第2生理活性肽部分构成环状肽的情况下，直链的肽分子可以从1条多核苷酸链中生成，在宿主细胞内或从宿主细胞中分泌后，从直链的肽分子构成环状肽。因此，就包含环状肽的肽分子的合成而言，以往的化学合成手法需要经过大量的工序而极为繁杂，而根据本发明的制造方法，能够简便并且低价地制造包含环状肽的肽分子。作为环状肽的构成，可以在2个半胱氨酸残基间通过二硫键形成环状结构，但不限于此。
本发明的一种实施方式涉及用于编码肽分子的多核苷酸。通过该多核苷酸的表达而生成的肽分子可以包含：(I)第1生理活性肽部分、(II)包含氨基酸残基的接头部分、以及(III)隔着所述接头部分位于与所述第1生理活性肽部分相反的一侧的第2生理活性肽部分和/或包含至少1个氨基酸残基的添加氨基酸序列。此处，第1生理活性肽部分和第2生理活性肽部分彼此可以相同也可以不同。就这样的多核苷酸而言，根据生成的肽分子的氨基酸序列，本领域技术人员可以使用现有的多核苷酸合成技术而适宜合成。
本发明的多核苷酸的一种实施方式可以与上述的本发明的制造方法中记载的多核苷酸相同。
本发明的多核苷酸的一种实施方式中，该多核苷酸可以是用于在上述的本发明的制造方法中使用的多核苷酸。
本发明的多核苷酸的一种实施方式中，通过多核苷酸的表达而生成的肽分子中的第1生理活性肽部分、包含氨基酸残基的接头部分、第2生理活性肽部分、以及包含至少1个氨基酸残基的添加氨基酸序列可以与上述的本发明的制造方法中记载的相同。
本发明的一种实施方式不仅涉及上述的肽分子，还涉及以下这样的肽分子。该肽分子可以包含：(I)第1生理活性肽部分、(II)包含氨基酸残基的接头部分、以及(III)隔着所述接头部分位于与所述第1生理活性肽部分相反的一侧的第2生理活性肽部分。
本发明的肽分子的一种实施方式中，可以在接头部分的N末端侧包含第1生理活性肽部分，在接头部分的C末端侧包含第2生理活性肽部分，也可以在接头部分的C末端侧包含第1生理活性肽部分，在接头部分的N末端侧包含第2生理活性肽部分。此外，本发明的肽分子的一种实施方式中，可以在第1生理活性肽部分和/或第2生理活性肽部分的N末端侧和/或C末端侧，或与接头部分之间处，在不阻碍第1生理活性肽以及第2生理活性肽的功能的范围内包含任意的氨基酸序列。作为这样的任意的氨基酸序列，例如，可以使用有助于提高宿主细胞中的肽分子的表达、分泌的序列。
本发明的肽分子的一种实施方式中，第1生理活性肽部分和第2生理活性肽部分分别构成与c-Met蛋白结合的环状肽，第1生理活性肽部分和第2生理活性肽部分彼此可以相同也可以不同。作为这样的与c-Met(也简称为Met)蛋白质结合的环状肽，可以举出包含选自以下的(a)～(i)的氨基酸序列的、通过二硫键而形成环状结构的环状肽。
(a)CYRQFNRRTHEVWNLDC(序列编号：1)
(b)CRQFNRRTHEVWNLDC(序列编号：2)
(c)CYWYYAWDQTYKAFPC(序列编号：3)
(d)CWYYAWDQTYKAFPC(序列编号：4)
(e)CYISWNEFNSPNWRFITC(序列编号：5)
(f)CISWNEFNSPNWRFITC(序列编号：6)
(g)(a)～(f)中的任一氨基酸序列中，半胱氨酸残基以外的1个或2个氨基酸残基发生了置换、缺失或添加，并且与c-Met蛋白结合的肽。
(h)包含与(a)～(f)中的任一氨基酸序列具有90％以上的序列同一性，且两端具有半胱氨酸残基的氨基酸序列，并且与c-Met蛋白结合的肽。例如，序列同一性可以为92％以上、95％以上或98％以上。本说明书中，氨基酸序列相同性可以用公知的解析工具计算，例如，可以通过使用美国国家生物技术信息中心(NCBI)的相同性算法BLAST(Basic localalignment search tool)计算。此外，氨基酸序列相同性的计算使用解析工具中的default(初期设定)的参数即可。
(i)(a)～(h)中的任一氨基酸序列中，两端的半胱氨酸残基以外的至少1个氨基酸得到了修饰的肽。此处，氨基酸的修饰为磷酸化、甲基化、乙酰基化、腺苷酰化、ADP核糖化或糖链加成。
需要说明的是，已知这样的与Met(HGFR)结合的环状肽通过二聚体化而作为Met(HGFR)激动剂发挥功能。
本发明的肽分子的一种实施方式中，接头部分的分子量可以为10000以下，并且包含50个以下的氨基酸残基。
此外，本发明的肽分子的一种实施方式中，接头部分可以为分子量10000以下，并且包含50个以下或49个以下的氨基酸残基的接头部分，其氨基酸序列的至少90％、至少95％或100％可以由选自丙氨酸(A)、脯氨酸(P)以及丝氨酸(S)的氨基酸残基构成。该情况下，脯氨酸残基在接头部分的氨基酸序列中，可以构成超过4％并且小于40％。例如，脯氨酸残基在接头部分的氨基酸序列中，可以构成超过约4％、超过约5％、超过约6％、超过约8％、超过约10％、超过约15％或超过约20％，可以构成小于约40％或小于约35％。此外，丙氨酸残基以及丝氨酸残基分别独立地，可以构成超过约4％、超过约10％或超过约20％，可以构成小于约50％。
接头部分的氨基酸序列中，与丙氨酸、丝氨酸和脯氨酸不同的氨基酸残基可以选自Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Thr、Trp、Tyr以及Val。作为这样的与丙氨酸、丝氨酸和脯氨酸不同的氨基酸残基，优选Val、Ile、Leu、Met、Phe、Tyr或Trp这样的不具有疏水性侧链的残基、和/或Lys、Arg、Asp或Glu这样的不具有带电荷的侧链的残基。
本发明的肽分子的一种实施方式中，接头部分可以为分子量10000以下，并且包含50个以下或49个以下的氨基酸残基的接头部分，其氨基酸序列的至少90％、至少95％或100％可以由选自丙氨酸(A)和脯氨酸(P)的氨基酸残基构成。该情况下，脯氨酸残基在接头部分的氨基酸序列中，可以构成超过10％并且小于75％。例如，脯氨酸残基在接头部分的氨基酸序列中，可以构成超过约10％、超过约12％、超过约14％、超过约18％、超过约20％、超过约22％、超过约23％、超过约24％或超过约25％，可以构成小于约75％、小于约70％、小于约65％、小于约60％、小于约55％、小于约50％、小于约48％、小于约46％、小于约44％、小于约42％、小于约41％、小于约40％、小于约39％、小于约38％、小于约37％、小于约36％或小于约35％。此外，丙氨酸残基可以构成超过约25％、超过约30％、超过约35％、超过约40％、超过约45％、超过约50％、超过约52％、超过约54％、超过约56％、超过约58％、超过约59％、超过约60％、超过约61％、超过约62％、超过约63％、超过约64％或超过约65％，可以构成小于约90％、小于约88％、小于约86％、小于约84％、小于约82％、小于约80％、小于约79％、小于约78％、小于约77％、小于约76％或小于约75％。
接头部分的氨基酸序列中，与丙氨酸、丝氨酸和脯氨酸不同的氨基酸残基可以选自Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Thr、Trp、Tyr以及Val。作为这样的与丙氨酸、丝氨酸和脯氨酸不同的氨基酸残基，优选Val、Ile、Leu、Met、Phe、Tyr或Trp这样的不具有疏水性侧链的残基、和/或Lys、Arg、Asp或Glu这样的不具有带电荷的侧链的残基。
本发明的肽分子的一种实施方式中，接头部分包含多个氨基酸重复，所述氨基酸重复包含丙氨酸(A)、脯氨酸(P)以及丝氨酸(S)，所述氨基酸重复中同一氨基酸残基的连续数可以为6残基以下、5残基以下、4残基以下或3残基以下。
本发明的肽分子的一种实施方式中，接头部分包含多个氨基酸重复，所述氨基酸重复包含丙氨酸(A)和脯氨酸(P)，所述氨基酸重复中同一氨基酸残基的连续数可以为6残基以下、5残基以下、4残基以下或3残基以下。
本发明的肽分子的一种实施方式中，接头部分可以重复包含2个以上的选自AP、AAP、AS、ASP以及ASS氨基酸序列。
本发明的肽分子的一种实施方式中，接头部分可以包含由甘氨酸(G)和丝氨酸(S)构成的序列。该情况下，接头部分可以重复包含选自GGGGS、GGGS、GGS以及GS的氨基酸序列。
本发明的制造方法的一种实施方式中，接头部分可以连续包含甘氨酸，此外，也可以仅由甘氨酸构成。
本发明的制造方法的一种实施方式中，接头部分可以重复包含EAAAK所表示的氨基酸序列。
本发明的制造方法的一种实施方式中，作为接头部分的氨基酸序列，优选：包含A、P以及S的序列、包含A以及P的序列、或重复包含GGGGS所表示的序列的序列，但不限于此。
本发明的肽分子的一种实施方式中，接头部分的长度可以包含50个以下的氨基酸残基，例如，接头部分可以包含49个以下、40个以下、35个以下、30个以下或25个以下的氨基酸残基。
本发明的制造方法的一种实施方式中，接头部分可以包含1个以上的氨基酸残基，例如，接头部分可以包含4个以上、8个以上、12个以上或16个以上的氨基酸残基。
本发明的肽分子的一种实施方式中，作为接头部分的具体例，可以举出包含以下的氨基酸序列的接头部分、或由以下的氨基酸序列构成的接头部分，但不限于此，选自AAPAAPAP(序列编号：74)、AAPAAPAPAAPAAPAP(序列编号：75)、AAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPA(序列编号：76)、SAPSPSSAPASASAPASPASASASASPASSPASASSASPAASSASPASS(序列编号：77)、AAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPA(序列编号：78)、SAPSPSSAPASASAPASPASASASASPASSPASASSASPAASSASPASSSASPSAPAAPSASAAPSASPASSSPAPASAPSPAAAASSPSPAPSSASSAA(序列编号：79)、AAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAP(序列编号：80)、AAPAAPAPAAPAAPAPAAPA(序列编号：7)、AAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAP(序列编号：8)、AAPAAPAPAAPAAP(序列编号：9)、AAPAAAPAPAAPAAPAPAAP(序列编号10)、AAAPAAAPAAAPAAAPAAAP(序列编号11)、AAPAAPAAPAAPAAPAAPAAPAAP(序列编号12)、APAAAPAPAAAPAPAAAPAPAAAP(序列编号13)、AAAPAAPAAPPAAAAPAAPAAPPA(序列编号14)、以及APAPAPAPAPAPAPAPAPAP(序列编号15)、ASPAAPAPASPAAPAPSAPA(序列编号16)、AAPASPAPAAPSAPAPAAPS(序列编号17)、APSSPSPSAPSSPSPASPSS(序列编号18)、SAPSSPSPSAPSSPSPASPS(序列编号19)、SSPSAPSPSSPASPSPSSPA(序列编号20)、AASPAAPSAPPAAASPAAPSAPPA(序列编号21)、以及ASAAAPAAASAAASAPSAAA(序列编号22)、以及它们的环状排列变异序列的氨基酸序列。
就环状排列变异序列而言，以AAPAAPAPAAPAAPAPAAPA(序列编号：7)为例进行说明，例如，可以通过将所述序列的第1丙氨酸除去并在所述序列的末端添加另一丙氨酸而容易地制作。序列编号：7的这样的环状排列变异序列为APAAPAPAAPAAPAPAAPAA(序列编号：23)。此外，作为序列编号7的环状地改变氨基酸残基的顺序而得到的环状排列变异序列的非限定性例子，可以举出以下的例子。PAAPAPAAPAAPAPAAPAAA(序列编号：24)、AAPAPAAPAAPAPAAPAAAP(序列编号：25)、APAPAAPAAPAPAAPAAAPA(序列编号：26)、PAPAAPAAPAPAAPAAAPAA(序列编号：27)、APAAPAAPAPAAPAAAPAAP(序列编号：28)、PAAPAAPAPAAPAAAPAAPA(序列编号：29)、AAPAAPAPAAPAAAPAAPAP(序列编号：30)、APAAPAPAAPAAAPAAPAPA(序列编号：31)、以及PAAPAPAAPAAAPAAPAPAA(序列编号：32)。
实施例
以下，将通过实施例对本发明进行更为详细的说明，但本发明不限于此。
需要说明的是，实施例中使用的HGF全部都是重组人类HGF(rhHGF,R&D Systems)，本说明书以及附图中，将重组人类HGF简单表示为HGF。
参考例1：tatABC基因扩增用载体pPK6的缩短化载体(pPK10)的构建
WO2016/171224所述的pPK6载体是编码Tat类分泌装置的tatABC基因的扩增用载体。通过从pPK6中除去不需要的序列，构建了以下这样的缩短化载体。
首先，以pPK6为模板，用序列编号：33和序列编号：34所述的引物扩增除去区域的5’侧，用序列编号：35和序列编号：36所述的引物扩增3’侧。将扩增得到的2个DNA片段通过Infusion反应导入pPK6的SalI-SalI部分，取得了从pPK6中除去了548碱基的质粒。将该质粒命名为pPK6b。
接下来，以pPK6b为模板，用序列编号：37和序列编号：38所述的引物扩增除去区域的5’侧，用序列编号：39和序列编号：40所述的引物扩增3’侧。将扩增的2个DNA片段通过Infusion反应导入pPK6b的ClaI-SpeI部分，构建了从pPK6b中进一步除去了310碱基的质粒。Infusion反应使用In-Fusion(注册商标)HD Cloning Kit(Takara Bio)，反应条件为制造商推荐的试验步骤。
如此，构建了从pPK6载体中除去了不需要的序列858碱基而缩短化了的质粒。将该载体命名为pPK10。
[表1]
| 引物序列编号 | 碱基序列 |
| 序列编号：33 | tcagaggaatgtcgactgctcgcaaccggcccgt |
| 序列编号：34 | cctacattcagcgcaggttcccctagagcacgt |
| 序列编号：35 | tgcgctgaatgtagggaag |
| 序列编号：36 | atcgctgcaggtcgactctagaggatccccggaa |
| 序列编号：37 | cttcccatacaatcgatagattgtcgcacetgattg |
| 序列编号：38 | cctcaggctggtgttgggcgagctcgaattcgt |
| 序列编号：39 | aacaccagcctgaggcaa |
| 序列编号：40 | gatcttcgggactagttactttcaaatgctcagcatg |
实施例1：FBP-PAS二聚体肽的设计和其在谷氨酸棒杆菌中的分泌表达
(1-1)FBP-PAS二聚体肽的设计的概要
将2个FGFR1结合环状肽(FBP)通过PAS接头而结合得到的肽分子作为一个多肽在谷氨酸棒杆菌中表达。因此，以“第一FBP”-“PAS接头”-“第二FBP(与所述第一FBP相同的序列)”的形式设计了肽序列。即，第一FBP的C末端与PAS接头的N末端通过酰胺键结合，第二FBP的N末端与PAS接头的C末端通过酰胺键结合，能够以一条多肽链的形式在谷氨酸棒杆菌中表达。
(1-2)FBP-PAS二聚体肽的制备
制备的FBP-PAS二聚体肽如下。
(a)FBP-PAS
RPGCGPRKPRTPKKCGSHGAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAGRPGCGPRKPRTPKKCGSH(序列编号：41)
(1-3)FBP-PAS二聚体肽的表达
使用Corynex(注册商标)进行了FBP-PAS二聚体肽的表达探讨。以下，记载了基于Corynex(注册商标)的表达探讨的实施例。
(1-4)使用了TorA信号序列的FBP-PAS二聚体肽的分泌表达质粒的构建
作为FBP-PAS二聚体肽，设计所述(a)FBP-PAS(以下，也称为“FBP-PAS”)的氨基酸序列，考虑谷氨酸棒杆菌的密码子使用频率而设计了编码该蛋白质的碱基序列。并且，以使得能够进行基于谷氨酸棒杆菌的分泌表达的方式，设计了以下的表达盒。
FBP-PAS以来源于E.coli的TorA的信号肽39氨基酸残基与FBP-PAS的融合蛋白(以下，表示为“TorAss-FBP-PAS”)的形式而分泌表达。编码设计的TorAss-FBP-PAS的碱基序列和氨基酸序列分别示于序列编号：42、43。
编码TorAss-FBP-PAS的碱基序列
atgaacaataacgatctctttcaggcatcacgtcggcgttttctggcacaactcggcggcttaaccgtcgccgggatgctggggccgtcattgttaacgccgcgacgtgcgactgcgcgtcctggttgtggtcctcgcaagccccgcacccctaagaaatgtggttctcacggcgccgctcctgccgcacccgcacccgctgctccagcagccccagccccagctgcaccagcaggtcgcccaggctgtggtccccgcaaaccccgcacccctaagaaatgtggctctcactaa(序列编号：42)
TorAss-FBP-PAS的氨基酸序列
MNNNDLFQASRRRFLAQLGGLTVAGMLGPSLLTPRRATARPGCGPRKPRTPKKCGSHGAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAGRPGCGPRKPRTPKKCGSH(序列编号：43)
在TorAss-FBP-PAS所述的碱基序列的上游连接来源于谷氨酸棒杆菌ATCC13869株的cspB基因的启动子，并且在5’-侧添加KpnI位点，在3’-侧添加ApaI位点，设计TorAss-FBP-PAS的表达盒，进行了全合成。通过将全合成得到的DNA片段(TorAss-FBP-PAS的表达盒)，插入至参考例1所述的pPK10的KpnI-ApaI部分，构建了作为利用了TorA信号序列的FBP-PAS二聚体肽的分泌表达质粒的pPK10_TorAss-FBP-PAS。对插入片段的碱基序列进行了确定的结果，确认构建了如同所设计的TorAss-FBP-PAS的表达盒。碱基序列的确定是使用BigDye(注册商标)Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems)和3130Genetic Analyzer(Applied Biosystems)进行的。
(1-5)谷氨酸棒杆菌中的FBP-PAS二聚体肽的分泌表达
使用所述构建得到的pPK10_TorAss-FBP-PAS，转化WO2016/171224所述的谷氨酸棒杆菌YDK0107株，得到了YDK0107/pPK10_TorAss-FBP-PAS株。
将得到的转化体在包含25mg/L的卡那霉素的MMTG液体培养基(葡萄糖120g，硫酸镁七水合物3g，硫酸铵30g，磷酸二氢钾1.5g，硫酸铁七水合物0.03g，硫酸锰五水合物0.03g，硫胺素盐酸盐0.45mg，生物素0.45mg，DL-蛋氨酸0.15g，大豆盐酸水解液(总氮量0.2g)，碳酸钙50g，用水调节至1L，调节至pH7.0)中，在30℃下，培养72小时。
培养结束后，将各培养液离心分离，用NuPAGE(注册商标)12％Bis-Tirs Gel(Thermo Fisher Scientific)将得到的培养上清6.5μL供至还原SDS-PAGE后，用Quick-CBB(Wako)进行了染色。其结果，在YDK0107/pPK10_TorAss-FBP-PAS株的培养上清中检测到了被认为是FBP-PAS的蛋白质带(图1，列2～5)。
(1-6)FBP-PAS二聚体肽的纯化
对于所述得到的包含FBP-PAS的培养上清，使用透析膜(MWCO＝3.5kDa，Spectrum公司)在PBS(Mg-/Ca-)缓冲液中进行了2天透析，由此进行了纯化。
实施例2：FBP-PAS二聚体肽的分子量和二硫环状结构的确认
向FBP-PAS二聚体肽溶液中，添加5mM的三(2-羧乙基)膦盐酸盐(Tris(2-carboxyethyl)phosphine Hydrochloride，TCEP-HCl)，通过在室温下孵育48小时而进行了二硫键的还原。向FBP-PAS和进行了TCEP-HCl处理的FBP-PAS二聚体肽中分别混合α-氰基-4-羟基肉桂酸(α-Cyano-4-hydroxycinnamic Acid，CHCA)，用MALDI-TOF-MS(Shimadzu,AXIMA-TOF2)进行了分子量的测定。
如图2所示，用TCEP-HCl还原前，得到了近似于在分子内形成有2个二硫键的FBP-PAS二聚体肽的分子量(m/z 5621)的值。此外，在用TCEP-HCl还原后，得到了近似于所有的二硫键被还原的分子量(m/z 5625)的值。
根据这些结果，确认了：通过Corynex(注册商标)而表达的FBP-PAS二聚体肽具有如同所设计的肽序列，并且为在分子内包含2个二硫键的结构。
实施例3：FBP-PAS二聚体肽的FGFR抑制活性评价
通过萤光素酶测定评价了FBP-PAS二聚体肽和化学合成的FBP单体肽的对FGFR的抑制活性。对于Opti-MEM培养基(Thermo Fisher Scientific公司)25μL，添加0.6μL的Attractene Transfection Reagent(QIAGEN公司)，在室温下进行了5分钟的孵育。对于所述混合溶液，添加Opti-MEM 25μL和1μL的SRE reporter vector(QIAGEN公司)的混合溶液，在室温下进行了20分钟的孵育。将该混合溶液添加至96孔板，从其上方接种40000cell/well的HEK293E细胞，在37℃、5％CO2孵育器内进行了过夜孵育。转染后，将培养上清全部除去，添加包含0.5％FBS(Thermo Fisher Scientific公司)、1％非必须氨基酸溶液(ThermoFisher Scientific公司)和青霉素-链霉素(Nacalai Tesque公司)的Opti-MEM培养基(评价基础培养基)100μL，在37℃下培养4小时，由此，使细胞为饥饿状态。
向包含bFGF 0-10ng/mL的评价基础培养基中添加10μM FBP-PAS二聚体肽或FBP单体肽，将其向细胞添加100μL。在37℃、5％CO2孵育器内进行过夜培养，由此进行了对细胞的刺激。
信号强度的检测使用了双萤光素酶报告基因系统(Dual-Luciferase ReporterAssay System)(Promega公司)。将100μL的培养基上清除去，添加Glo试剂(Glo reagent)50μL，在室温下溶解细胞10分钟。通过用读板器检测从细胞的溶解液中发出的萤火虫萤光素酶(Firefly luciferase)的发光，对FGFR-Erk-SRE通路的活化进行了定量。接下来，添加50μL的Glo&Stop reagent溶液，10分钟后检测作为内部标准的肾荧光素酶(Renillaluciferase)的发光，进行了细胞数的定量。以SRE活性＝(萤火虫萤光素酶的发光强度)/(肾荧光素酶的发光强度)的形式，对各样品的信号活性进行了定量。求出相对于未添加评价化合物的样品的相对信号活性值，以作为相对受体活性(Relative reporteractivity)。
如图3所示，可以看出FBP-PAS二聚体肽与FBP单体肽相比，能够更强地抑制基于同量的bFGF的FGFR信号。根据这些结果，可以看出FBP-PAS二聚体肽抑制FGFR，与FBP单体肽相比具有更高的抑制活性。
实施例4：HGF-PAS二聚体肽的设计和其在谷氨酸棒杆菌中的分泌表达(4-1)HGF-PAS二聚体肽的设计的概要
由于以下的理由，无法以一条多肽链的形式在谷氨酸棒杆菌中表达使K.Ito,etal.Nat.Commun.6,6373,2015中报道的Met结合环状肽aMD4通过PEG接头而二聚体化的肽二聚体分子。
(1)aMD4通过由添加在N末端的氨基上的氯乙酰基与序列中的半胱氨酸侧链的巯基的反应而形成的分子内硫醚键而环状化，但硫醚键在谷氨酸棒杆菌内无法表达。
(2)二聚体化是使用Bis-Maleimide-PEG接头使环状肽的C末端彼此结合而达成的，但无法在谷氨酸棒杆菌中表达。
因此，如下所述地对分子施加了转换，从而设计了能够表达的形式。对于所述(1)，将硫醚键转换为了基于2个半胱氨酸侧链的巯基的二硫键。通过转换为二硫键，环状化部分变长了2个原子份，以通过删除N末端侧的半胱氨酸的下一个残基(aMD4的情况下为酪氨酸)而使环状化部分缩短1个原子份的方式进行了设计。对于所述(2)，以用PAS序列代替PEG接头、并以能够以一条多肽链的形式表达的方式设计为“第一二硫转换aMD4”-“PAS接头”-“第二二硫转换aMD4”的肽序列来进行应对。即，第一二硫转换aMD4的C末端与PAS接头的N末端通过酰胺键结合，第二二硫转换aMD4的N末端与PAS接头的C末端通过酰胺键结合，可以作为一条多肽链而表达。
(4-2)HGF-PAS二聚体肽的制备
制备的HGF-PAS二聚体肽如下。
(b)PAS-aMD4-PEG11
CYRQFNRRTHEVWNLDCGAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPGCYRQFNRRTHEVWNLDC(序列编号：44)
(c)PAS-aMD4dY-PEG11
CRQFNRRTHEVWNLDCGAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPGCRQFNRRTHEVWNLDC(序列编号：45)
(d)PAS-aMD4-PEG3
CYRQFNRRTHEVWNLDCGAAPAAPAPAAPAAPGCYRQFNRRTHEVWNLDC(序列编号：46)
(e)AET-PAS-aMD4-PEG11
AETCYRQFNRRTHEVWNLDCGAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPGCYRQFNRRTHEVWNLDC(序列编号：47)
(f)AET-PAS-aMD4dY-PEG11
AETCRQFNRRTHEVWNLDCGAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPGCRQFNRRTHEVWNLDC(序列编号：48)
(g)AET-PAS-aMD4-PEG3
AETCYRQFNRRTHEVWNLDCGAAPAAPAPAAPAAPGCYRQFNRRTHEVWNLDC(序列编号：49)
(4-3)HGF-PAS二聚体肽的表达
使用Corynex(注册商标)进行了这些HGF-PAS二聚体肽的表达探讨。以下，记载了基于Corynex(注册商标)的表达探讨的实施例。
(4-4)利用了TorA信号序列的PAS-aMD4-PEG11、PAS-aMD4dY-PEG11和PAS-aMD4-PEG3的各分泌表达质粒的构建
作为HGF-PAS二聚体肽，分别设计所述(b)PAS-aMD4-PEG11(以下，也表示为“PAS-aMD4-PEG11”)、(c)PAS-aMD4dY-PEG11(以下，也表示为“PAS-aMD4dY-PEG11”)、和(d)PAS-aMD4-PEG3(以下，也表示为“PAS-aMD4-PEG3”)的3种氨基酸序列，考虑谷氨酸棒杆菌的密码子使用频率而设计了编码这些蛋白质的碱基序列。并且，以使得能够进行基于谷氨酸棒杆菌的分泌表达的方式，分别设计了以下的表达盒。
PAS-aMD4-PEG11以来源于E.coli的TorA的信号肽39氨基酸残基与PAS-aMD4-PEG11的融合蛋白(以下，表示为“TorAss-PAS-aMD4-PEG11”)的形式而分泌表达。编码设计的TorAss-PAS-aMD4-PEG11的碱基序列和氨基酸序列分别示于序列编号50、51。
编码TorAss-PAS-aMD4-PEG11的碱基序列
atgaacaataacgatctctttcaggcatcacgtcggcgttttctggcacaactcggcggcttaaccgtcgccgggatgctggggccgtcattgttaacgccgcgacgtgcgactgcgtgttaccgtcaattcaaccgtcgcacccacgaagtttggaacctggactgtggcgcagcacccgcagccccagcccccgcagcacctgcagccccagcaccagctgcaccagccgctccaggctgctaccgtcagttcaaccgccgcacccacgaagtttggaatttggattgctaa(序列编号：50)
TorAss-PAS-aMD4-PEG11的氨基酸序列
MNNNDLFQASRRRFLAQLGGLTVAGMLGPSLLTPRRATACYRQFNRRTHEVWNLDCGAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPGCYRQFNRRTHEVWNLDC(序列编号：51)
PAS-aMD4dY-PEG11以来源于E.coli的TorA的信号肽39氨基酸残基与PAS-aMD4dY-PEG11的融合蛋白(以下，表示为“TorAss-PAS-aMD4dY-PEG11”)的形式而分泌表达。编码设计的TorAss-PAS-aMD4dY-PEG11的碱基序列和氨基酸序列分别示于序列编号52、53。
编码TorAss-PAS-aMD4dY-PEG11的碱基序列
atgaacaataacgatctctttcaggcatcacgtcggcgttttctggcacaactcggcggcttaaccgtcgccgggatgctggggccgtcattgttaacgccgcgacgtgcgactgcgtgccgtcagttcaaccgtcgcacccacgaagtttggaatctggactgtggcgcagcccccgcagcacccgctcccgcagcacccgcagctccagcaccagcagccccagcagcaccaggctgccgccagttcaaccgtcgcacccacgaagtttggaatttggattgttag(序列编号：52)
TorAss-PAS-aMD4dY-PEG11的氨基酸序列
MNNNDLFQASRRRFLAQLGGLTVAGMLGPSLLTPRRATACRQFNRRTHEVWNLDCGAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPGCRQFNRRTHEVWNLDC(序列编号：53)
PAS-aMD4-PEG3以来源于E.coli的TorA的信号肽39氨基酸残基与PAS-aMD4-PEG3的融合蛋白(以下，表示为“TorAss-PAS-aMD4-PEG3”)的形式而分泌表达。编码设计的TorAss-PAS-aMD4-PEG3的碱基序列和氨基酸序列分别示于序列编号54、55。
编码TorAss-PAS-aMD4-PEG3的碱基序列
atgaacaataacgatctctttcaggcatcacgtcggcgttttctggcacaactcggcggcttaaccgtcgccgggatgctggggccgtcattgttaacgccgcgacgtgcgactgcgtgttaccgtcagttcaaccgccgtacccacgaagtctggaacctggattgtggtgccgcccccgccgctcccgctcccgccgctccggcagcccctggctgctaccgtcagtttaaccgtcgcacccacgaagtctggaacctggattgctaa(序列编号：54)
TorAss-PAS-aMD4-PEG3的氨基酸序列
MNNNDLFQASRRRFLAQLGGLTVAGMLGPSLLTPRRATACYRQFNRRTHEVWNLDCGAAPAAPAPAAPAAPGCYRQFNRRTHEVWNLDC(序列编号：55)
在TorAss-PAS-aMD4-PEG11、TorAss-PAS-aMD4dY-PEG11、和TorAss-PAS-aMD4-PEG3所述的碱基序列的上游连接来源于谷氨酸棒杆菌ATCC13869株的cspB基因的启动子，并且在5’-侧添加KpnI位点，在3’-侧添加ApaI位点，设计各HGF-PAS二聚体肽的表达盒，进行了全合成。通过将全合成得到的DNA片段(HGF-PAS二聚体肽的表达盒)插入参考例1所述的pPK10的KpnI-ApaI部分，分别构建了作为利用了TorA信号序列的各HGF-PAS二聚体肽的分泌表达质粒的pPK10_TorAss-PAS-aMD4-PEG11、pPK10_TorAss-PAS-aMD4dY-PEG11、和pPK10_TorAss-PAS-aMD4-PEG3。对插入片段的碱基序列进行了确定的结果，确认分别构建了如同所设计的HGF-PAS二聚体肽的表达盒。碱基序列的确定是使用BigDye(注册商标)Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems)和3130GeneticAnalyzer(Applied Biosystems)进行的。
(4-5)谷氨酸棒杆菌中的各HGF-PAS二聚体肽的分泌表达
使用所述构建得到的pPK10_TorAss-PAS-aMD4-PEG11、pPK10_TorAss-PAS-aMD4dY-PEG11、和pPK10_TorAss-PAS-aMD4-PEG3，转化WO2016/171224所述的谷氨酸棒杆菌YDK0107株，得到了YDK0107/pPK10_TorAss-PAS-aMD4-PEG11株、YDK0107/pPK10_TorAss-PAS-aMD4dY-PEG11株、和YDK0107/pPK10_TorAss-PAS-aMD4-PEG3株。
将得到的各转化体，用包含25mg/L的卡那霉素的MMTG液体培养基(葡萄糖120g，硫酸镁七水合物3g，硫酸铵30g，磷酸二氢钾1.5g，硫酸铁七水合物0.03g，硫酸锰五水合物0.03g，硫胺素盐酸盐0.45mg，生物素0.45mg，DL-蛋氨酸0.15g，大豆盐酸水解液(总氮量0.2g)，碳酸钙50g，用水调节至1L，调节至pH7.0)分别在30℃下，培养72小时。
培养结束后，将各培养液离心分离，用NuPAGE(注册商标)12％Bis-Tirs Gel(Thermo Fisher Scientific)将得到的培养上清6.5μL供至还原SDS-PAGE后，用Quick-CBB(Wako)进行了染色。其结果，在YDK0107/pPK10_TorAss-PAS-aMD4-PEG11株的培养上清中检测到被认为是PAS-aMD4-PEG11的蛋白质带(图4，列2～5)，在YDK0107/pPK10_TorAss-PAS-aMD4dY-PEG11株的培养上清中检测到被认为是PAS-aMD4dY-PEG11的蛋白质带(图4，列6～9)，在YDK0107/pPK10_TorAss-PAS-aMD4-PEG3株的培养上清中检测到被认为是PAS-aMD4-PEG3的蛋白质带(图4，列10～13)。
(4-6)利用了CspB信号序列的AET-PAS-aMD4-PEG11、AET-PAS-aMD4dY-PEG11、和AET-PAS-aMD4-PEG3的各分泌表达质粒的构建
作为HGF-PAS二聚体肽，分别设计所述(e)AET-PAS-aMD4-PEG11(以下，也表示为“AET-PAS-aMD4-PEG11”)、(f)AET-PAS-aMD4dY-PEG11(以下，也表示为“AET-PAS-aMD4dY-PEG11”)、和(g)AET-PAS-aMD4-PEG3(以下，也表示为“AET-PAS-aMD4-PEG3”)的3种氨基酸序列，考虑谷氨酸棒杆菌的密码子使用频率而设计了编码这些蛋白质的碱基序列。并且，以使得能够进行基于谷氨酸棒杆菌的分泌表达的方式，分别设计了以下的表达盒。
AET-PAS-aMD4-PEG11以来源于谷氨酸棒杆菌ATCC13869株的CspB的信号肽30氨基酸残基与AET-PAS-aMD4-PEG11的融合蛋白(以下，表示为“CspBss-AET-PAS-aMD4-PEG11”)的形式而分泌表达。编码设计的CspBss-AET-PAS-aMD4-PEG11的碱基序列和氨基酸序列分别示于序列编号56、57。
编码CspBss-AET-PAS-aMD4-PEG11的碱基序列
atgtttaacaaccgtatccgcactgcagctctcgctggtgcaatcgcaatctccaccgcagcttccggcgtagctatcccagcattcgctgcagagacctgttaccgtcaattcaaccgtcgcacccacgaagtttggaacctggactgtggcgcagcacccgcagccccagcccccgcagcacctgcagccccagcaccagctgcaccagccgctccaggctgctaccgtcagttcaaccgccgcacccacgaagtttggaatttggattgctaa(序列编号：56)
CspBss-AET-PAS-aMD4-PEG11的氨基酸序列
MFNNRIRTAALAGAIAISTAASGVAIPAFAAETCYRQFNRRTHEVWNLDCGAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPGCYRQFNRRTHEVWNLDC(序列编号：57)
AET-PAS-aMD4dY-PEG11以来源于谷氨酸棒杆菌ATCC13869株的CspB的信号肽30氨基酸残基与AET-PAS-aMD4dY-PEG11的融合蛋白(以下，表示为“CspBss-AET-PAS-aMD4dY-PEG11”)的形式而分泌表达。编码设计的CspBss-AET-PAS-aMD4dY-PEG11的碱基序列和氨基酸序列分别示于序列编号58、59。
编码CspBss-AET-PAS-aMD4dY-PEG11的碱基序列
atgtttaacaaccgtatccgcactgcagctctcgctggtgcaatcgcaatctccaccgcagcttccggcgtagctatcccagcattcgctgcagagacctgccgtcagttcaaccgtcgcacccacgaagtttggaatctggactgtggcgcagcccccgcagcacccgctcccgcagcacccgcagctccagcaccagcagccccagcagcaccaggctgccgccagttcaaccgtcgcacccacgaagtttggaatttggattgttag(序列编号：58)
CspBss-AET-PAS-aMD4dY-PEG11的氨基酸序列
MFNNRIRTAALAGAIAISTAASGVAIPAFAAETCRQFNRRTHEVWNLDCGAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPGCRQFNRRTHEVWNLDC(序列编号：59)
AET-PAS-aMD4-PEG3以来源于谷氨酸棒杆菌ATCC13869株的CspB的信号肽30氨基酸残基与AET-PAS-aMD4-PEG3的融合蛋白(以下，表示为“CspBss-AET-PAS-aMD4-PEG3”)的形式而分泌表达。编码设计的CspBss-AET-PAS-aMD4-PEG3的碱基序列和氨基酸序列分别示于序列编号60、61。
编码CspBss-AET-PAS-aMD4-PEG3的碱基序列
atgtttaacaaccgtatccgcactgcagctctcgctggtgcaatcgcaatctccaccgcagcttccggcgtagctatcccagcattcgctgcagagacctgttaccgtcagttcaaccgccgtacccacgaagtctggaacctggattgtggtgccgcccccgccgctcccgctcccgccgctccggcagcccctggctgctaccgtcagtttaaccgtcgcacccacgaagtctggaacctggattgctaa(序列编号：60)
CspBss-AET-PAS-aMD4-PEG3的氨基酸序列
MFNNRIRTAALAGAIAISTAASGVAIPAFAAETCYRQFNRRTHEVWNLDCGAAPAAPAPAAPAAPGCYRQFNRRTHEVWNLDC(序列编号：61)
在AET-PAS-aMD4-PEG11、AET-PAS-aMD4dY-PEG11、和AET-PAS-aMD4-PEG3所述的碱基序列的上游连接来源于谷氨酸棒杆菌ATCC13869株的cspB基因的启动子，并在5’-侧添加KpnI位点，在3’-侧添加BamHI位点，设计各HGF-PAS二聚体肽的表达盒，进行了全合成。通过将全合成得到的DNA片段(HGF-PAS二聚体肽的表达盒)插入日本特开平9-322774所述的pPK4的KpnI-BamHI部分，分别构建了作为利用了CspB信号序列的各HGF-PAS二聚体肽的分泌表达质粒的pPK4_CspBss-AET-PAS-aMD4-PEG11、pPK4_CspBss-AET-PAS-aMD4dY-PEG11、和pPK4_CspBss-AET-PAS-aMD4-PEG3。对插入片段的碱基序列进行了确定的结果，确认分别构建了如同所设计的HGF-PAS二聚体肽的表达盒。碱基序列的确定是使用BigDye(注册商标)Terminatorv3.1 Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems)和3130GeneticAnalyzer(Applied Biosystems)进行的。
(4-7)谷氨酸棒杆菌中的各HGF-PAS二聚体肽的分泌表达
使用所述构建得到的pPK4_CspBss-AET-PAS-aMD4-PEG11、pPK4_CspBss-AET-PAS-aMD4dY-PEG11、和pPK4_CspBss-AET-PAS-aMD4-PEG3，转化WO2016/171224所述的谷氨酸棒杆菌YDK010::phoS(W302C)株，得到了YDK010::phoS(W302C)/pPK4_CspBss-AET-PAS-aMD4-PEG11株、YDK010::phoS(W302C)/pPK4_CspBss-AET-PAS-aMD4dY-PEG11株、和YDK010::phoS(W302C)/pPK4_CspBss-AET-PAS-aMD4-PEG3株。
将得到的各转化体，用包含25mg/L的卡那霉素的MMTG液体培养基(葡萄糖120g，硫酸镁七水合物3g，硫酸铵30g，磷酸二氢钾1.5g，硫酸铁七水合物0.03g，硫酸锰五水合物0.03g，硫胺素盐酸盐0.45mg，生物素0.45mg，DL-蛋氨酸0.15g，大豆盐酸水解液(总氮量0.2g)，碳酸钙50g，用水调节至1L，调节至pH7.0)分别在30℃下，培养72小时。
培养结束后，将各培养液离心分离，用NuPAGE(注册商标)12％Bis-Tirs Gel(Thermo Fisher Scientific)将得到的培养上清6.5μL供至还原SDS-PAGE后，用Quick-CBB(Wako)进行了染色。其结果，YDK010::phoS(W302C)/pPK4_CspBss-AET-PAS-aMD4-PEG11株的培养上清中检测到了被认为是AET-PAS-aMD4-PEG11的蛋白质带(图5，列2～5)，YDK010::phoS(W302C)/pPK4_CspBss-AET-PAS-aMD4dY-PEG11株的培养上清中检测到了被认为是AET-PAS-aMD4dY-PEG11的蛋白质带(图5，列6～9)、和YDK010::phoS(W302C)/pPK4_CspBss-AET-PAS-aMD4-PEG3株的培养上清中检测到了被认为是AET-PAS-aMD4-PEG3的蛋白质带(图5，列10～13)。
(4-8)HGF-PAS二聚体肽的纯化
所述得到的HGF-PAS二聚体肽的纯化使用AKTAexplorer(GE Healthcare)和Superdex 75 10/300GL柱(GE Healthcare)进行。将1mL的培养上清注入AKTA explorer，通过在流速0.5mL/min的条件下流通PBS(10mM磷酸盐缓冲液,140mM NaCl,pH 7.4)将蛋白质分离，由此得到目标HGF-PAS二聚体肽组分。
实施例5：HGF-PAS二聚体肽的分子量分析
将AET-PAS-aMD4dY-PEG11、AET-PAS-aMD4-PEG11和AET-PAS-aMD4-PEG3分别与α-氰基-4-羟基肉桂酸(α-Cyano-4-hydroxycinnamic Acid，CHCA)混合，使用MALDI-TOF-MS(Shimadzu,AXIMA-TOF2)进行了分子量的测定。
如图6所示，得到了与在分子内形成有2个二硫键的氧化型的各二聚体肽的分子量理论值(AET-PAS-aMD4dY-PEG11：m/z 6320,AET-PAS-aMD4-PEG11：m/z 6646,AET-PAS-aMD4-PEG3：m/z 6000)基本相同的值。确认了能够表达包含2个二硫键的正确的氨基酸序列的肽。
实施例6：HGF-PAS二聚体肽的活性评价
通过萤光素酶测定评价了HGF-PAS二聚体肽的Met活化能力。对于Opti-MEM培养基(Thermo Fisher Scientific公司)25μL，添加0.6μL的Attractene Transfection Reagent(QIAGEN公司)，在室温下进行了5分钟的孵育。对于所述混合溶液，添加Opti-MEM 25μL和1μL的SRE reporter vector(QIAGEN公司)的混合溶液，在室温下进行了20分钟的孵育。将该混合溶液添加至96孔板，从其上方接种40000cell/well的HEK293E细胞，在37℃、5％CO2孵育器内进行了过夜孵育。转染后，将培养上清全部除去，添加包含0.5％FBS(Thermo FisherScientific公司)、1％非必须氨基酸溶液(Thermo Fisher Scientific公司)和青霉素-链霉素(Nacalai Tesque公司)的Opti-MEM培养基(评价基础培养基)100μL，在37℃下培养4小时，由此，使细胞为饥饿状态。
向评价基础培养基中，添加0-200ng/mL的HGF、或0-800ng/mL的AET-PAS-aMD4dY-PEG11、AET-PAS-aMD4-PEG11或AET-PAS-aMD4-PEG3、或以相对于该培养基为10倍稀释的方式包含PAS-aMD4dY-PEG11、PAS-aMD4-PEG11或PAS-aMD4-PEG3的培养上清，向细胞添加该评价基础培养基100μL。在37℃、5％CO2孵育器内进行过夜培养，由此进行了对细胞的刺激。
信号强度的检测使用了双萤光素酶报告基因系统(Promega公司)。将100μL的培养基上清除去，添加Glo试剂50μL，在室温下溶解细胞10分钟。通过用读板器检测从细胞的溶解液中发出的萤火虫萤光素酶的发光，对HGF-Erk-SRE通路的活化进行了定量。接下来，添加50μL的Glo&Stop reagent溶液，10分钟后检测作为内部标准的肾荧光素酶的发光，进行了细胞数的定量。以SRE活性＝(萤火虫萤光素酶的发光强度)/(肾荧光素酶的发光强度)的形式，对各样品的信号活性进行了定量。求出相对于未添加评价化合物的样品的相对信号活性值，以作为相对受体活性(Relative reporter activity)。
如图7～9所示，可以看出所有的HGF-PAS二聚体肽都具有信号活化能力。特别是，可以看出AET-PAS-aMD4dY-PEG11和PAS-aMD4dY-PEG11具有与100ng/mL HGF相同程度的最大活性。
实施例7：HGF-PAS二聚体肽的特异性评价
使用Proteome Profiler Human Phospho-RTK Array Kit(R&D Systems)评价了HGF-PAS二聚体肽的受体酪氨酸激酶(RTK)特异性。
将在10cm细胞培养皿达到汇合的状态的HEK293E细胞，在包含0.5％FBS(ThermoFisher Scientific公司)和青霉素-链霉素(Nacalai Tesque公司)的D-MEM培养基中培养24小时，由此使其为饥饿状态。将饥饿状态的HEK293E细胞在200ng/mL的AET-PAS-aMD4dY-PEG11中进行10分钟的刺激。作为阳性对照，以100ng/mL的HGF同样地进行了10分钟刺激。作为阴性对照加入PBS进行了10分钟的刺激(Mock组)。将培养基除去，用PBS清洗一次细胞后，通过加入1mL添加了蛋白酶抑制剂混合物(Protease inhibitor cocktail)(NacalaiTesque公司)的裂解缓冲液17(Lysis buffer 17)将细胞溶解。以14000G对溶解液进行5分钟离心，得到上清作为裂解液。
使用Proteome Profiler Human Phospho-RTK Array Kit解析了裂解液。化学发光的检测使用了Molecular Imager ChemiDoc XRS System(Bio-Rad公司)。如图10所示，确认了以PBS进行了刺激的细胞(Mock组)的RTK都为脱磷酸化状态。此外，确认了如果以HGF进行刺激，则作为HGF的受体的Met被特异性地磷酸化。如果以AET-PAS-aMD4dY-PEG11施加刺激，则与HGF同样，Met被特异地磷酸化。根据该结果，可以看出AET-PAS-aMD4dY-PEG11进行Met特异性活化。需要说明的是，图11表示Proteome Profiler Human Phospho-RTK ArrayKit(R&D Systems)的各阵列。
实施例8：HGF-PAS二聚体肽的细胞增殖促进活性评价
有报告称HGF通过使Met活化而促进细胞的增殖(K.Ito,et al.Nat.Commun.6,6373,2015)。因此，就HGF-PAS二聚体肽是否与HGF同样具有促进细胞增殖的活性，用HuCCT1细胞培养进行了评价。
向24孔细胞培养板中添加加入有5％FBS的RPMI1640培养基(Nacalai Tesque公司)，以5000cell/well接种了HuCCT1细胞。添加35ng/mL HGF或40ng/mL AET-PAS-aMD4dY-PEG11，在37℃、5％CO2的条件下进行了5天的培养。用0.25％胰蛋白酶/EDTA(ThermoFisher Scientific公司)剥离细胞，用Countess Automated Cell Counter(ThermoFisher Scientific公司)进行了细胞数的定量(N＝3)。
如图12所示，添加HGF或AET-PAS-aMD4dY-PEG11进行培养的细胞相对于未添加组(Mock)都显示出了2.5倍左右的更高的增殖能力。从这一点可以看出，AET-PAS-aMD4dY-PEG11与HGF同样，能够促进细胞的增殖。
实施例9：HGF-PAS二聚体肽的游走活性评价
有报道称HGF通过使Met活化而促进细胞的游走能力(K.Ito,etal.Nat.Commun.6,6373,2015)。因此，就HGF-PAS二聚体肽是否与HGF同样具有促进细胞的游走的活性，使用HuCCT1细胞培养进行了评价。
向24孔用Transwell小室(孔尺寸3.0μm,Corning公司)中添加了用低血清培养基(加入了0.5％FBS的RPMI1640培养基)悬浮的HuCCT1细胞20000细胞。在下层添加加入了100ng/mL HGF或200ng/mL AET-PAS-aMD4dY-PEG11的低血清培养基。在37℃、5％CO2的条件下进行了24小时培养后，用PBS清洗Transwell小室3次，用加入了0.5％结晶紫(CrystalViolet)(Nacalai Tesque公司)的甲醇进行10分钟的细胞固定以及染色。用蒸馏水清洗进行了固定化处理以及染色处理的Transwell小室。用刮刀除去小室内部的细胞。用BZ-X显微镜(Keyence公司)的明视野观察模式拍摄向小室外侧游走、被染色了的细胞。图13表示以结晶紫进行了染色的Transwell小室下部的明视野图像和游走能力的定量值。
游走能力设为(被染色了的区域的面积)/(小室面积)，以相对于未添加组(Mock)的值的相对值(Relative migration efficiency)的形式计算(N＝2)。结果如图14所示。
如果添加HGF或AET-PAS-aMD4dY-PEG11而进行培养，则向Transwell小室下部游走的细胞的比例增加，从这一点可以看出AET-PAS-aMD4dY-PEG11与HGF同样，促进细胞的游走。
实施例10：HGF-PAS二聚体肽的创伤治愈效果评价
有报告称HGF通过使Met活化而促进细胞的创伤治愈能力(K.Ito,etal.Nat.Commun.6,6373,2015)。因此，就HGF-PAS二聚体肽是否与HGF同样地促进创伤治愈，使用HuCCT1细胞培养进行了评价。
向96孔细胞培养用板中以每1孔50000细胞的形式添加以加入有10％FBS的RPMI1640培养基悬浮了的HuCCT1细胞，在37℃、5％CO2的条件下孵育一晚。使用1000μL的Thermo Scientific ART吸头(Thermo Fisher Scientific公司)刮取培养孔的中心部的细胞，用低血清培养基(加入了0.5％FBS的RPMI1640培养基)进行了清洗。添加加入了33ng/mL的HGF或100ng/mL的AET-PAS-aMD4dY-PEG11的低血清培养基，在37℃、5％CO2的条件下进行了培养。细胞观察使用BioStudio-T(Nikon株式会公司)，每1小时自动取得细胞的照片。创伤治愈的速度(μm/h)以((创伤造成后1小时的创伤的宽度)-(创伤造成后7小时的创伤的宽度))/6的形式计算(N＝4)。
图15表示造成创伤1小时后和9小时后的细胞的相位差图像，图16表示创伤治愈的速度。从添加了HGF或AET-PAS-aMD4dY-PEG11的细胞的创伤治愈的速度提高了1.6倍左右这一点可以看出AET-PAS-aMD4dY-PEG11与HGF同样地，使细胞的创伤治愈能力提高。
实施例11：HGF-PAS二聚体肽的管状结构形成效果评价
已知通过使HGF对胶原凝胶中内包的HUVEC细胞、HuCCT1细胞进行作用，能够形成管状结构(K.Ito,et al.Nat.Commun.6,6373,2015)。此外，有报道称具有与HGF同样的功能的Met完全激动剂能够使所述细胞形成管状结构，而仅具有一部分的功能的部分激动剂无法促进管状结构的形成(W.Miao,et al.Int.J.Mol.Sci.19,3141,2018)。因此，就HGF-PAS二聚体肽是完全激动剂还是部分激动剂，通过使用HuCCT1细胞的管状结构形成实验进行了确认。
对于CellMatrix type IA(新田gelatin公司)8等量，将10倍浓缩D-MEM/F12(Thermo Fisher Scientific)1等量和再构成用缓冲液(22g/L碳酸氢钠，47.7g/L HEPES,0.05N氢氧化钠水溶液)1等量依次在冰上混合。以混合液每1mL 25000细胞的方式添加HuCCT1细胞，在冰上混合。向48孔细胞培养用板中添加400μL的所述混合液，在37℃、5％CO2条件下静置4小时，使其凝胶化。向形成的细胞内包胶原凝胶上添加加入有10％FBS的RPMI1640培养基500μL。对细胞进行刺激的组加入35ng/mL的HGF或40ng/mL的AET-PAS-aMD4dY-PEG11进行培养。培养基以不超过3天的频率进行总量的交换。在培养第7天用倒置显微镜观察胶原凝胶内的细胞的形态。
图17中表示了培养第7天的HuCCT1细胞的形态(比例尺：500μm)。添加了HGF或AET-PAS-aMD4dY-PEG11的细胞形成了500-1000μm左右的管状结构，与之相对，未添加的细胞表现为球状的形态。根据这些结果，可以看出AET-PAS-aMD4dY-PEG11与rhHGF同样能够促进HuCCT1细胞的管状结构形成，是针对Met的完全激动剂。
实施例12：HGF-PAS异二聚体肽的设计和其在谷氨酸棒杆菌中的分泌表达
(12-1)HGF-PAS异二聚体肽的设计的概要
使K.Ito,et al.Nat.Commun.6,6373,2015中报道的Met结合环状肽的aMD4和aMD5以异二聚体分子的形式表达。就K.Ito,et al.Nat.Commun.6,6373,2015中的二聚体肽合成法而言，难以选择性地合成为“aMD4”-“接头”-“aMD5”的二聚体肽。即，在使2种肽隔着PEG分子而结合的情况下，会产生“aMD4”-“接头”-“aMD4”、“aMD4”-“接头”-“aMD5”、“aMD5”-“接头”-“aMD4”、“aMD5”-“接头”-“aMD5”的4种二聚体肽。因此，在本实施例中，通过进行以下的设计，而能够使通过PAS接头而二聚体化的异二聚体肽以一条多肽链的形式在谷氨酸棒杆菌中表达。
(1)aMD4、aMD5通过由添加在N末端的氨基上的氯乙酰基与序列中的半胱氨酸侧链的巯基之间的反应而形成的分子内硫醚键而环状化，因此通过基于2个半胱氨酸侧链的巯基的二硫键而环状化。
(2)二聚体化是使用Bis-Maleimide-PEG接头使环状肽的C末端彼此结合而达成的，无法在谷氨酸棒杆菌中表达，因此通过PAS接头肽使aMD4的C末端与aMD5的N末端结合。
通过以上的设计，而选择性地表达“aMD4”-“PAS接头”-“aMD5”肽。
(12-2)HGF-PAS异二聚体肽的制备
制备的HGF-PAS异二聚体肽如下。
(h)AET-PAS-aMD4_aMD5-PEG11
AETCYRQFNRRTHEVWNLDCGAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPGCYWYYAWDQTYKAFPC(序列编号：62)
(12-3)HGF-PAS异二聚体肽的表达
使用Corynex(注册商标)进行了HGF-PAS异二聚体肽的表达探讨。以下，记载了基于Corynex(注册商标)的表达探讨的实施例。
(12-4)利用了CspB信号序列的AET-PAS-aMD4_aMD5-PEG11的分泌表达质粒的构建
作为HGF-PAS异二聚体肽，设计所述(h)AET-PAS-aMD4_aMD5-PEG11(以下，也表示为“AET-PAS-aMD4_aMD5-PEG11”)的氨基酸序列，考虑谷氨酸棒杆菌的密码子使用频率而设计了编码该蛋白质的碱基序列。并且，以使得能够进行基于谷氨酸棒杆菌的分泌表达的方式，设计了以下的表达盒。
AET-PAS-aMD4_aMD5-PEG11以来源于谷氨酸棒杆菌ATCC13869株的CspB的信号肽30氨基酸残基与AET-PAS-aMD4_aMD5-PEG11的融合蛋白(以下，表示为“CspBss-AET-PAS-aMD4_aMD5-PEG11”)的形式而分泌表达。编码设计的CspBss-AET-PAS-aMD4_aMD5-PEG11的碱基序列和氨基酸序列分别示于序列编号63、64。
编码CspBss-AET-PAS-aMD4_aMD5-PEG11的碱基序列
atgtttaacaaccgtatccgcactgcagctctcgctggtgcaatcgcaatctccaccgcagcttccggcgtagctatcccagcattcgctgcagagacctgttaccgtcagttcaaccgtcgcacccacgaagtttggaacctggattgtggcgcagcccccgcagcccccgcacccgcagcccctgcagccccagccccagctgcaccagcagcacctggctgttactggtattatgcgtgggatcagacctacaaagcgtttccgtgttag(序列编号：63)
CspBss-AET-PAS-aMD4_aMD5-PEG11的氨基酸序列
MFNNRIRTAALAGAIAISTAASGVAIPAFAAETCYRQFNRRTHEVWNLDCGAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPGCYWYYAWDQTYKAFPC(序列编号：64)
在AET-PAS-aMD4_aMD5-PEG11所述的碱基序列的上游连接来源于谷氨酸棒杆菌ATCC13869株的cspB基因的启动子，并在5’-侧添加KpnI位点，在3’-侧添加BamHI位点，设计HGF-PAS异二聚体肽的表达盒，进行了全合成。通过将全合成得到的DNA片段(HGF-PAS异二聚体肽的表达盒)插入日本特开平9-322774所述的pPK4的KpnI-BamHI部分，构建了作为利用了CspB信号序列的HGF-PAS异二聚体肽的分泌表达质粒的pPK4_CspBss-AET-PAS-aMD4_aMD5-PEG1。对插入片段的碱基序列进行了确定的结果，确认构建了如同所设计的HGF-PAS异二聚体肽的表达盒。碱基序列的确定是使用BigDye(注册商标)Terminator v3.1 CycleSequencing Kit(Applied Biosystems)和3130Genetic Analyzer(Applied Biosystems)进行的。
(12-5)谷氨酸棒杆菌中的HGF-PAS异二聚体肽的分泌表达
使用所述构建得到的pPK4_CspBss-AET-PAS-aMD4_aMD5-PEG11，转化WO2016/171224所述的谷氨酸棒杆菌YDK010::phoS(W302C)株，得到了YDK010::phoS(W302C)/pPK4_CspBss-AET-PAS-aMD4_aMD5-PEG11株。
将得到的转化体在用包含25mg/L的卡那霉素的MMTG液体培养基(葡萄糖120g，硫酸镁七水合物3g，硫酸铵30g，磷酸二氢钾1.5g，硫酸铁七水合物0.03g，硫酸锰五水合物0.03g，硫胺素盐酸盐0.45mg，生物素0.45mg，DL-蛋氨酸0.15g，大豆盐酸水解液(总氮量0.2g)，碳酸钙50g，用水调节至1L，调节至pH7.0)分别在30℃下，培养72小时。
培养结束后，将各培养液离心分离，用NuPAGE(注册商标)12％Bis-Tirs Gel(Thermo Fisher Scientific)将得到的培养上清6.5μL供至还原SDS-PAGE后，用Quick-CBB(Wako)进行了染色。其结果，YDK010::phoS(W302C)/pPK4_CspBss-AET-PAS-aMD4_aMD5-PEG11株的培养上清中检测到了被认为是AET-PAS-aMD4_aMD5-PEG11的蛋白质带(图18，列2～5)。
实施例13：HGF-PAS异二聚体肽的分子量分析
将AET-PAS-aMD4_aMD5-PEG11肽表达上清与α-氰基-4-羟基肉桂酸(α-Cyano-4-hydroxycinnamic Acid，CHCA)混合，使用MALDI-TOF-MS(Shimadzu,AXIMA-TOF2)进行了分子量的测定。
如图19所示，得到了与在分子内形成有2个二硫键的氧化型的HGF-PAS异二聚体肽的分子量理论值(AET-PAS-aMD4_aMD5-PEG11：m/z 6514)基本相同的值。确认了能够表达包含2个二硫键的正确的氨基酸序列的肽。
实施例14：HGF-PAS二聚体肽接头改变体的设计和其在谷氨酸棒杆菌中的分泌表达
(14-1)HGF-PAS二聚体肽接头改变体的设计的概要
具有HGF样活性的AET-PAS-aMD4dY-PEG11具有通过包含22个氨基酸的PAS接头使第一aMD4dY环状肽(序列编号：2所表示的)与第二aMD4dY环状肽之间结合的结构。可以推测，通过改变该PAS接头的长度，HGF样活性会变化。因此，设计了将PAS接头部分变为8个氨基酸到200个氨基酸的PAS重复序列的接头改变体。
此外，作为挠性接头，除了PAS接头之外还已知有作为甘氨酸和丝氨酸的重复序列的GS接头。因此，设计了：使aMD4dY结合于包含甘氨酸4残基和丝氨酸1残基(GGGGS)的重复序列的GS接头的N末端和C末端而得到的接头改变体、即为“第一aMD4dY环状肽”-“GS接头”-“第二aMD4dY环状肽”的肽序列。
(14-2)HGF-PAS二聚体肽接头改变体的制备
制备的HGF-PAS二聚体肽接头改变体如下。
(i)AET-aMD4dY-PAS8
AETCRQFNRRTHEVWNLDCGAAPAAPAPGCRQFNRRTHEVWNLDC(序列编号：81)
(j)AET-aMD4dY-PAS49
AETCRQFNRRTHEVWNLDCGAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAGCRQFNRRTHEVWNLDC(序列编号：82)
(k)AET-aMD4dY-PAS100
AETCRQFNRRTHEVWNLDCGAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAGCRQFNRRTHEVWNLDC(序列编号：83)
(l)AET-aMD4dY-PAS200
AETCRQFNRRTHEVWNLDCGAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPGCRQFNRRTHEVWNLDC(序列编号：84)
(m)AET-aMD4dY-GS15
AETCRQFNRRTHEVWNLDCGGGGGSGGGGSGGGGSGCRQFNRRTHEVWNLDC(序列编号：85)
(n)AET-aMD4dY-GS22
AETCRQFNRRTHEVWNLDCGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGCRQFNRRTHEVWNLDC(序列编号：86)
(14-3)HGF-PAS二聚体肽接头改变体的表达
使用Corynex(注册商标)进行了这些HGF-PAS二聚体肽接头改变体的表达探讨。以下，记载了基于Corynex(注册商标)的表达探讨的实施例。
(14-4)利用了CspB信号序列的AET-aMD4dY-PAS8、AET-aMD4dY-PAS49、AET-aMD4dY-PAS100、AET-aMD4dY-PAS200、AET-aMD4dY-GS15、和AET-aMD4dY-GS22的各分泌表达质粒的构建
作为HGF-PAS二聚体肽接头改变体，分别设计了所述(i)AET-aMD4dY-PAS8(以下，也表示为“AET-aMD4dY-PAS8”)、(j)AET-aMD4dY-PAS49(以下，也表示为“AET-aMD4dY-PAS49”)、(k)AET-aMD4dY-PAS100(以下，也表示为“AET-aMD4dY-PAS100”)、(l)AET-aMD4dY-PAS200(以下，也表示为“AET-aMD4dY-PAS200”)、(m)AET-aMD4dY-GS15(以下，也表示为“AET-aMD4dY-GS15”)、和(n)AET-aMD4dY-GS22(以下，也表示为“AET-aMD4dY-GS22”)的6种氨基酸序列，考虑谷氨酸棒杆菌的密码子使用频率而设计了编码这些蛋白质的碱基序列。并且，以使得能够进行基于谷氨酸棒杆菌的分泌表达的方式，分别设计了以下的表达盒。
AET-aMD4dY-PAS8以来源于谷氨酸棒杆菌ATCC13869株的CspB的信号肽30氨基酸残基与AET-aMD4dY-PAS8的融合蛋白(以下，表示为“CspBss-AET-aMD4dY-PAS8”)的形式而分泌表达。编码设计的CspBss-AET-aMD4dY-PAS8的碱基序列和氨基酸序列分别示于序列编号87、88。
编码CspBss-AET-aMD4dY-PAS8的碱基序列
atgtttaacaaccgtatccgcactgcagctctcgctggtgcaatcgcaatctccaccgcagcttccggcgtagctatcccagcattcgctgcagagacctgccgccagttcaaccgccgcacccacgaagtgtggaacctggattgcggcgctgcaccagccgctccagcaccaggctgccgccagttcaaccgccgcacccacgaagtgtggaacctggattgctaa(序列编号：87)
CspBss-AET-aMD4dY-PAS8的氨基酸序列
MFNNRIRTAALAGAIAISTAASGVAIPAFAAETCRQFNRRTHEVWNLDCGAAPAAPAPGCRQFNRRTHEVWNLDC(序列编号：88)
AET-aMD4dY-PAS49以来源于谷氨酸棒杆菌ATCC13869株的CspB的信号肽30氨基酸残基与AET-aMD4dY-PAS49的融合蛋白(以下，表示为“CspBss-AET-aMD4dY-PAS49”)的形式而分泌表达。编码设计的CspBss-AET-aMD4dY-PAS49的碱基序列和氨基酸序列分别示于序列编号89、90。
编码CspBss-AET-aMD4dY-PAS49的碱基序列
atgtttaacaaccgtatccgcactgcagctctcgctggtgcaatcgcaatctccaccgcagcttccggcgtagctatcccagcattcgctgcagagacctgtcgtcagttcaaccgtcgcacccacgaagtttggaatttggactgtggcgcagcaccagcggcaccagcaccagcagccccagcggcaccagccccagctgcaccagccgctccagcaccagcagcacccgcagcccccgctcccgcagcccccgccgcaccagcacccgcagcaccagcagcacccgctccagcaggttgtcgccaattcaaccgccgcacccacgaagtgtggaacctggattgctaa(序列编号：89)
CspBss-AET-aMD4dY-PAS49的氨基酸序列
MFNNRIRTAALAGAIAISTAASGVAIPAFAAETCRQFNRRTHEVWNLDCGAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAGCRQFNRRTHEVWNLDC(序列编号：90)
AET-aMD4dY-PAS100以来源于谷氨酸棒杆菌ATCC13869株的CspB的信号肽30氨基酸残基与AET-aMD4dY-PAS100的融合蛋白(以下，表示为“CspBss-AET-aMD4dY-PAS100”)的形式而分泌表达。编码设计的CspBss-AET-aMD4dY-PAS100的碱基序列和氨基酸序列分别示于序列编号91、92。
编码CspBss-AET-aMD4dY-PAS100的碱基序列
atgtttaacaaccgtatccgcactgcagctctcgctggtgcaatcgcaatctccaccgcagcttccggcgtagctatcccagcattcgctgcagagacctgtcgtcagttcaaccgtcgcacccacgaagtttggaatttggactgtggcgcagcaccagcggcaccagcaccagcagccccagcggcaccagccccagctgcaccagccgctccagcaccagcagccccagcagcccccgctccagcagcacccgcagcaccagctcccgcagccccagcagccccagccccagcagcaccagcagccccagctccagcagccccagctgcaccagctccagccgcaccagcagctccagccccagccgctcccgccgccccagcccccgccgcaccagccgcccctgctcccgccgccccagccgctcccgctccagccgctcctgccggttgccgccagttcaaccgccgcacccacgaagtgtggaacctggattgctaa(序列编号：91)
CspBss-AET-aMD4dY-PAS100的氨基酸序列
MFNNRIRTAALAGAIAISTAASGVAIPAFAAETCRQFNRRTHEVWNLDCGAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAGCRQFNRRTHEVWNLDC(序列编号：92)
AET-aMD4dY-PAS200以来源于谷氨酸棒杆菌ATCC13869株的CspB的信号肽30氨基酸残基与AET-aMD4dY-PAS200的融合蛋白(以下，表示为“CspBss-AET-aMD4dY-PAS200”)的形式而分泌表达。编码设计的CspBss-AET-aMD4dY-PAS200的碱基序列和氨基酸序列分别示于序列编号93、94。
编码CspBss-AET-aMD4dY-PAS200的碱基序列
atgtttaacaaccgtatccgcactgcagctctcgctggtgcaatcgcaatctccaccgcagcttccggcgtagctatcccagcattcgctgcagagacctgtcgtcagttcaaccgtcgcacccacgaagtttggaatttggactgtggcgcagcaccagcggcaccagcaccagcagccccagcggcaccagccccagctgcaccagccgctccagcaccagccgcccccgccgcccccgcccctgctgctcctgctgctcccgctcccgctgctcccgctgcccctgctcctgctgctcccgctgcgccagccccagcagcaccagctgccccagcaccagctgcaccagccgcaccagctccagcagccccagctgctccagcaccagcagcaccagcagcaccagctccagcggcaccagcagcaccagcacctgcggcaccagcggctccagccccagcagcaccagcagcgccagcaccagcagctccagcagcaccagcaccagcagcaccagcggcaccagccccagctgcaccagccgctccagcaccagctgccccagcagctccagccccagccgcacctgccgcacctgcccctgccgctcctgctgcccccgctcctgccgctcctgctgcccctgcccctgctgctcctgctgctccagctccagccgcaccagccgctccagcaccagctgcaccagcagctccagccccagctgccccagcagctccagcccctggttgccgccaatttaatcgccgcacccacgaggtctggaatcttgactgctaa(序列编号：93)
CspBss-AET-aMD4dY-PAS200的氨基酸序列
MFNNRIRTAALAGAIAISTAASGVAIPAFAAETCRQFNRRTHEVWNLDCGAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPGCRQFNRRTHEVWNLDC(序列编号：94)
AET-aMD4dY-GS15以来源于谷氨酸棒杆菌ATCC13869株的CspB的信号肽30氨基酸残基与AET-aMD4dY-GS15的融合蛋白(以下，表示为“CspBss-AET-aMD4dY-GS15”)的形式而分泌表达。编码设计的CspBss-AET-aMD4dY-GS15的碱基序列和氨基酸序列分别示于序列编号95、96。
编码CspBss-AET-aMD4dY-GS15的碱基序列
atgtttaacaaccgtatccgcactgcagctctcgctggtgcaatcgcaatctccaccgcagcttccggcgtagctatcccagcattcgctgcagagacctgccgccagttcaaccgccgcacccacgaagtgtggaacctggattgcggcggcggcggcggctccggcggcggcggctccggcggcggcggctccggctgccgccagttcaaccgccgcacccacgaagtgtggaacctggattgctaa(序列编号：95)
CspBss-AET-aMD4dY-GS15的氨基酸序列
MFNNRIRTAALAGAIAISTAASGVAIPAFAAETCRQFNRRTHEVWNLDCGGGGGSGGGGSGGGGSGCRQFNRRTHEVWNLDC(序列编号：96)
AET-aMD4dY-GS22以来源于谷氨酸棒杆菌ATCC13869株的CspB的信号肽30氨基酸残基与AET-aMD4dY-GS22的融合蛋白(以下，表示为“CspBss-AET-aMD4dY-GS22”)的形式而分泌表达。编码设计的CspBss-AET-aMD4dY-GS22的碱基序列和氨基酸序列分别示于序列编号97、98。
编码CspBss-AET-aMD4dY-GS22的碱基序列
atgtttaacaaccgtatccgcactgcagctctcgctggtgcaatcgcaatctccaccgcagcttccggcgtagctatcccagcattcgctgcagagacctgccgccagttcaaccgccgcacccacgaagtgtggaacctggattgcggcggcggcggcggctccggcggcggcggttctggcggtggcggttctggcggcggcggttctggcggcggttgtcgtcagttcaatcgtcgcacccacgaagtctggaatctcgactgctaa(序列编号：97)
CspBss-AET-aMD4dY-GS22的氨基酸序列
MFNNRIRTAALAGAIAISTAASGVAIPAFAAETCRQFNRRTHEVWNLDCGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGCRQFNRRTHEVWNLDC(序列编号：98)
在CspBss-AET-aMD4dY-PAS8、CspBss-AET-aMD4dY-PAS49、CspBss-AET-aMD4dY-PAS100、CspBss-AET-aMD4dY-PAS200、CspBss-AET-aMD4dY-GS15、和CspBss-AET-aMD4dY-GS22所述的碱基序列的上游连接来源于谷氨酸棒杆菌ATCC13869株的cspB基因的启动子，并在5’-侧添加KpnI位点，在3’-侧添加BamHI位点，设计各HGF-PAS二聚体肽接头改变体的表达盒，进行了全合成。通过将全合成得到的DNA片段(HGF-PAS二聚体肽接头改变体的表达盒)插入日本特开平9-322774所述的pPK4的KpnI-BamHI部分，分别构建了作为利用了CspB信号序列的各HGF-PAS二聚体肽接头改变体的分泌表达质粒的pPK4_CspBss-AET-aMD4dY-PAS8、pPK4_CspBss-AET-aMD4dY-PAS49、pPK4_CspBss-AET-aMD4dY-PAS100、pPK4_CspBss-AET-aMD4dY-PAS200、pPK4_CspBss-AET-aMD4dY-GS15、和pPK4_CspBss-AET-aMD4dY-GS22。对插入片段的碱基序列进行了确定的结果，确认分别构建了如同所设计的HGF-PAS二聚体肽接头改变体的表达盒。碱基序列的确定使用BigDye(注册商标)Terminator v3.1 CycleSequencing Kit(Applied Biosystems)和3500xL Genetic Analyzer(AppliedBiosystems)进行。
此外，与所述同样地，构建pPK4_CspBss-AET-PAS-aMD4dY-PEG11，并确认了该构建。AET-PAS-aMD4dY-PEG11如实施例4所述，具有包含22个氨基酸的PAS接头。
(14-5)谷氨酸棒杆菌中的各HGF-PAS二聚体肽的分泌表达
使用所述构建得到的pPK4_CspBss-AET-aMD4dY-PAS8、pPK4_CspBss-AET-aMD4dY-PAS49、pPK4_CspBss-AET-aMD4dY-PAS100、pPK4_CspBss-AET-aMD4dY-PAS200、pPK4_CspBss-AET-aMD4dY-GS15、和pPK4_CspBss-AET-aMD4dY-GS22，转化WO2016/171224所述的谷氨酸棒杆菌YDK010::phoS(W302C)株，得到了YDK010::phoS(W302C)/pPK4_CspBss-AET-aMD4dY-PAS8株、YDK010::phoS(W302C)/pPK4_CspBss-AET-aMD4dY-PAS49株、YDK010::phoS(W302C)/pPK4_CspBss-AET-aMD4dY-PAS100株、YDK010::phoS(W302C)/pPK4_CspBss-AET-aMD4dY-PAS200株、YDK010::phoS(W302C)/pPK4_CspBss-AET-aMD4dY-GS15株、和YDK010::phoS(W302C)/pPK4_CspBss-AET-aMD4dY-GS22株。
将得到的各转化体，用包含25mg/L的卡那霉素的MMTG液体培养基(葡萄糖120g，硫酸镁七水合物3g，硫酸铵30g，磷酸二氢钾1.5g，硫酸铁七水合物0.03g，硫酸锰五水合物0.03g，硫胺素盐酸盐0.45mg，生物素0.45mg，DL-蛋氨酸0.15g，大豆盐酸水解液(总氮量0.2g)，碳酸钙50g，用水调节至1L，调节至pH7.0)分别在30℃下，培养72小时。
培养结束后，将各培养液离心分离，用NuPAGE(注册商标)12％Bis-Tirs Gel(Thermo Fisher Scientific)将得到的培养上清6.5μL供至还原SDS-PAGE后，用Quick-CBB(Wako)进行了染色。其结果，YDK010::phoS(W302C)/pPK4_CspBss-AET-aMD4dY-PAS8株的培养上清中检测到了被认为是AET-aMD4dY-PAS8的蛋白质带(图20，列4)，YDK010::phoS(W302C)/pPK4_CspBss-AET-aMD4dY-PAS49株的培养上清中检测到了被认为是AET-aMD4dY-PAS49的蛋白质带(图20，列6)，YDK010::phoS(W302C)/pPK4_CspBss-AET-aMD4dY-PAS100株的培养上清中检测到了被认为是AET-aMD4dY-PAS100的蛋白质带(图20，列7)，YDK010::phoS(W302C)/pPK4_CspBss-AET-aMD4dY-PAS200株的培养上清中检测到了被认为是AET-aMD4dY-PAS200的蛋白质带(图20，列8)，YDK010::phoS(W302C)/pPK4_CspBss-AET-aMD4dY-GS15株的培养上清中检测到了被认为是AET-aMD4dY-GS15的蛋白质带(图20，列2)，YDK010::phoS(W302C)/pPK4_CspBss-AET-aMD4dY-GS22株的培养上清中检测到了被认为是AET-aMD4dY-GS22的蛋白质带(图20，列3)。
此外，与所述同样地培养通过与所述同样的方法得到的YDK010::phoS(W302C)/pPK4_CspBss-AET-PAS-aMD4dY-PEG11株，在其培养上清中检测到了被认为是AET-PAS-aMD4dY-PEG11(以下，也称为“AET-aMD4dY-PAS22”)的蛋白质带(图20，列5)。
如果以接头的长度同为22个残基的例子相互比较，则与AET-aMD4dY-GS22(图20，列3)相比，AET-aMD4dY-PAS22(图20，列5：与AET-PAS-aMD4dY-PEG11相同的分子)显示了更高的分泌，即，与GS接头相比，使用了PAS接头的例子的分泌更高。
实施例15：HGF-PAS二聚体肽的分子量分析
对于实施例14中的培养后的、各HGF-PAS二聚体肽的菌体过滤液，使用LC-MS(Waters,ACQUITY UPLC H-Class/SQD2)进行了分子量的测定。分析条件如表2所示。
[表2]
如图21～26所示，得到了与在分子内形成有2个二硫键的氧化型的各二聚体肽的分子量的理论值基本相同的值。从这一点来看，确认了能够表达包含2个二硫键的正确的氨基酸序列的肽。
实施例16：HGF-PAS二聚体肽接头改变体的活性评价
通过萤光素酶测定评价了HGF-PAS二聚体肽接头改变体的Met活化能力。对于Opti-MEM培养基(Thermo Fisher Scientific公司)25μL，添加0.6μL的AttracteneTransfection Reagent(QIAGEN公司)，在室温下进行了5分钟的孵育。对于所述混合溶液，添加Opti-MEM 25μL和1μL的SRE reporter vector(QIAGEN公司)的混合溶液，在室温下进行了20分钟的孵育。将该混合溶液添加至96孔板，从其上方接种40000cell/well的HEK293E细胞，在37℃、5％CO2孵育器内进行了过夜孵育。转染后，将培养上清全部除去，添加100μL包含0.5％FBS(Thermo Fisher Scientific公司)、1％非必须氨基酸溶液(Thermo FisherScientific公司)和青霉素-链霉素(Nacalai Tesque公司)的Opti-MEM培养基(评价基础培养基)，在37℃下培养4小时，由此，使细胞为饥饿状态。
向评价基础培养基中，加入0-100ng/mL的HGF，或以相对于该培养基稀释为给定的倍率的方式添加包含AET-aMD4dY-PAS8、AET-aMD4dY-PAS22(与AET-PAS-aMD4dY-PEG11相同的分子)、AET-aMD4dY-PAS49、AET-aMD4dY-PAS100、AET-aMD4dY-PAS200、AET-aMD4dY-GS15、或AET-aMD4dY-GS22的培养上清，向细胞中添加该评价基础培养基100μL。在37℃、5％CO2孵育器内进行过夜培养，由此进行了对细胞的刺激。
信号强度的检测使用了双萤光素酶报告基因系统(Promega公司)。将100μL的培养基上清除去，添加Glo试剂50μL，在室温下溶解细胞10分钟。通过用读板器检测从细胞的溶解液中发出的萤火虫萤光素酶的发光，对HGF-Erk-SRE通路的活化进行了定量。接下来，添加50μL的Glo&Stop reagent溶液，10分钟后检测作为内部标准的肾荧光素酶的发光，进行了细胞数的定量。以SRE活性＝(萤火虫萤光素酶的发光强度)/(肾荧光素酶的发光强度)的形式，对各样品的信号活性进行了定量。求出相对于未添加评价化合物的样品的相对信号活性值，以作为相对受体活性(Relative reporter activity)。
如图27所示，可以看出所有PAS接头长度不同的HGF-PAS二聚体肽都使HGF信号活化。PAS接头的长度为22个氨基酸时发挥最高的效率，如下述表3所示，可以看出如果超过100个氨基酸则最大活性(EC50)减半。此外，如图28所示，以15个氨基酸和22个氨基酸的GS接头进行二聚化也得到了活性，但如下述表3所示，其最大活性(EC50)与PAS接头相比为一半以下，可以看出通过使用PAS接头能够制作具有高活性的二聚体肽。
[表3]
| 肽 | Emax(％) |
| AET-aMD4dY-PAS22 | 100.0 |
| AET-aMD4dY-PAS8 | 56.4 |
| AET-aMD4dY-PAS49 | 82.8 |
| AET-aMD4dY-PAS100 | 47.2 |
| AET-aMD4dY-PAS200 | 20.4 |
| AET-aMD4dY-GS15 | 45.8 |
| AET-aMD4dY-GS22 | 32.3 |
实施例17：稳定化HGF-PAS二聚体肽的设计和其在谷氨酸棒杆菌中的分泌表达
(17-1)设计的概要
提高了稳定性的HGF-PAS肽是如下设计的。作为提高肽、蛋白质的稳定性的手法，报道了添加长链的PAS序列的方法(日本特表2013-531480以及日本特表2010-531139)。作为提高了稳定性的HGF-PAS肽，设计了使包含200个氨基酸的PAS序列(PAS200)结合至AET-aMD4dY-PAS22(与AET-PAS-aMD4dY-PEG11相同的分子)的C末端而得到的肽。即设计了为“第一aMD4dY环状肽”-“PAS接头”-“第二aMD4dY环状肽”-“长链PAS序列(PAS200)”的肽序列。
(17-2)稳定化HGF-PAS二聚体肽的制备
制备的稳定化HGF-PAS二聚体肽如下。
(o)AET-aMD4dY-PAS22-PAS200
AETCRQFNRRTHEVWNLDCGAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPGCRQFNRRTHEVWNLDCAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAP(序列编号：99)
(17-3)稳定化HGF-PAS二聚体肽的表达
使用Corynex(注册商标)进行了稳定化HGF-PAS二聚体肽的表达探讨。以下，记载了基于Corynex(注册商标)的表达探讨的实施例。
(17-4)利用了CspB信号序列的AET-aMD4dY-PAS22-PAS200分泌表达质粒的构建
作为稳定化HGF-PAS二聚体肽，设计了所述(o)AET-aMD4dY-PAS22-PAS200(以下，也表示为“AET-aMD4dY-PAS22-PAS200”)的氨基酸序列，考虑谷氨酸棒杆菌的密码子使用频率而设计了编码该蛋白质的碱基序列。并且，以使得能够进行基于谷氨酸棒杆菌的分泌表达的方式，设计了以下的表达盒。
AET-aMD4dY-PAS22-PAS200以来源于谷氨酸棒杆菌ATCC13869株的CspB的信号肽30氨基酸残基与AET-aMD4dY-PAS22-PAS200的融合蛋白(以下，表示为“CspBss-AET-aMD4dY-PAS22-PAS200”)的形式而分泌表达。编码设计的CspBss-AET-aMD4dY-PAS22-PAS200的碱基序列和氨基酸序列分别示于序列编号100、101。
编码CspBss-AET-aMD4dY-PAS22-PAS200的碱基序列
atgtttaacaaccgtatccgcactgcagctctcgctggtgcaatcgcaatctccaccgcagcttccggcgtagctatcccagcattcgctgcagagacctgccgtcagttcaaccgccgtacccacgaagtttggaatctcgactgtggtgccgcccctgccgctcctgcccctgccgccccagccgctccagcaccagccgctccagcagccccaggctgccgccagttcaaccgccgcacccacgaagtgtggaacctggattgcgcagctccagcagcccctgcccccgccgccccagccgcccctgcccccgccgcccccgccgcacccgcccctgccgcccccgccgcccccgcccctgctgctcctgctgctcccgctcccgctgctcccgctgcccctgctcctgctgctcccgctgcgccagccccagcagcaccagctgccccagcaccagctgcaccagccgcaccagctccagcagccccagctgctccagcaccagcagcaccagcagcaccagctccagcggcaccagcagcaccagcacctgcggcaccagcggctccagccccagcagcaccagcagcgccagcaccagcagctccagcagcaccagcaccagcagcaccagcggcaccagccccagctgcaccagccgctccagcaccagctgccccagcagctccagccccagctgcccctgctgcccccgctcctgccgctcccgctgcccctgcccctgctgctcctgctgctcccgctcctgccgctcccgctgcgccagctccagcagccccagctgcaccagccccagccgcaccagccgccccagcccccgcagcacccgcagcaccagccccataa(序列编号：100)
CspBss-AET-aMD4dY-PAS22-PAS200的氨基酸序列
MFNNRIRTAALAGAIAISTAASGVAIPAFAAETCRQFNRRTHEVWNLDCGAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPGCRQFNRRTHEVWNLDCAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAP(序列编号：101)
在CspBss-AET-aMD4dY-PAS22-PAS200所述的碱基序列的上游连接来源于谷氨酸棒杆菌ATCC13869株的cspB基因的启动子，并在5’-侧添加KpnI位点，在3’-侧添加BamHI位点，设计稳定化HGF-PAS二聚体肽的表达盒，进行了全合成。通过将全合成得到的DNA片段(稳定化HGF-PAS二聚体肽的表达盒)插入日本特开平9-322774所述的pPK4的KpnI-BamHI部分，构建了作为利用了CspB信号序列的稳定化HGF-PAS二聚体肽的分泌表达质粒的pPK4_CspBss-AET-aMD4dY-PAS22-PAS200。对插入片段的碱基序列进行了确定的结果，确认构建了如同所设计的稳定化HGF-PAS二聚体肽的表达盒。碱基序列的确定使用BigDye(注册商标)Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems)和3500xL GeneticAnalyzer(Applied Biosystems)进行。
(17-5)谷氨酸棒杆菌中的稳定化HGF-PAS二聚体肽的分泌表达
使用所述构建得到的pPK4_CspBss-AET-aMD4dY-PAS22-PAS200转化WO2016/171224所述的谷氨酸棒杆菌YDK010::phoS(W302C)株，得到了YDK010::phoS(W302C)/pPK4_CspBss-AET-aMD4dY-PAS22-PAS200株。
将得到的各转化体，用包含25mg/L的卡那霉素的MMTG液体培养基(葡萄糖120g，硫酸镁七水合物3g，硫酸铵30g，磷酸二氢钾1.5g，硫酸铁七水合物0.03g，硫酸锰五水合物0.03g，硫胺素盐酸盐0.45mg，生物素0.45mg，DL-蛋氨酸0.15g，大豆盐酸水解液(总氮量0.2g)，碳酸钙50g，用水调节至1L，调节至pH7.0)分别在30℃下，培养72小时。
培养结束后，使用NuPAGE(注册商标)4-12％Bis-Tirs Gel(Thermo FisherScientific)，将各培养液离心分离得到的培养上清6.5μL供至还原SDS-PAGE后，用Quick-CBB(Wako)进行了染色。其结果，YDK010::phoS(W302C)/pPK4_CspBss-AET-aMD4dY-PAS22-PAS200株的培养上清中检测到了被认为是AET-aMD4dY-PAS22-PAS200的蛋白质带(图29，列2～5)。
实施例18：稳定化HGF-PAS二聚体肽的分子量分析
对于实施例17中的培养后的、稳定化HGF-PAS二聚体肽的菌体过滤液，使用LC-MS(Waters,ACQUITY UPLC/SQD2)进行了分子量的测定。分析条件如表2所述。如图30所示，得到了与在分子内形成有2个二硫键的氧化型的各二聚体肽的分子量的理论值基本相同的值。从这一点来看，确认了能够表达包含2个二硫键的正确的氨基酸序列的肽。
实施例19：稳定化HGF-PAS二聚体肽的活性评价
通过萤光素酶测定评价了稳定化HGF-PAS二聚体肽的Met活化能力。对于Opti-MEM培养基(Thermo Fisher Scientific公司)25μL，添加0.6μL的Attractene TransfectionReagent(QIAGEN公司)，在室温下进行了5分钟的孵育。对于所述混合溶液，添加Opti-MEM25μL和1μL的SRE reporter vector(QIAGEN公司)的混合溶液，在室温下进行了20分钟的孵育。将该混合溶液添加至96孔板，从其上方接种40000cell/well的HEK293E细胞，在37℃、5％CO2孵育器内进行了过夜孵育。转染后，将培养上清全部除去，添加包含0.5％FBS(Thermo Fisher Scientific公司)、1％非必须氨基酸溶液(Thermo Fisher Scientific公司)和青霉素-链霉素(Nacalai Tesque公司)的Opti-MEM培养基(评价基础培养基)100μL，在37℃下培养4小时，由此，使细胞为饥饿状态。
向评价基础培养基中，加入0-100ng/mL的HGF，或以相对于该培养基稀释为给定的倍率的方式添加包含AET-aMD4dY-PAS22-PAS200的培养上清，向细胞中添加该评价基础培养基100μL。在37℃、5％CO2孵育器内进行过夜培养，由此进行了对细胞的刺激。
信号强度的检测使用了双萤光素酶报告基因系统(Promega公司)。将100μL的培养基上清除去，添加Glo试剂50μL，在室温下溶解细胞10分钟。通过用读板器检测从细胞的溶解液中发出的萤火虫萤光素酶的发光，对HGF-Erk-SRE通路的活化进行了定量。接下来，添加50μL的Glo&Stop reagent溶液，10分钟后检测作为内部标准的肾荧光素酶的发光，进行了细胞数的定量。以SRE活性＝(萤火虫萤光素酶的发光强度)/(肾荧光素酶的发光强度)的形式，对各样品的信号活性进行了定量。求出相对于未添加评价化合物的样品的相对信号活性值，以作为相对受体活性(Relative reporter activity)。
如图31所示，可以看出，稳定化HGF-PAS二聚体肽具有信号活化能力、且最大活性与100ng/mL HGF为相同程度。
实施例20：EPO-PAS二聚体肽的设计和其在谷氨酸棒杆菌中的分泌表达
(20-1)设计的概要
作为促红细胞生成素模仿肽的Peginesatide已经被报道。Pedinesatide具有以下结构：在促红细胞生成素受体结合肽的C末端添加赖氨酸，并且通过由长链PEG结合的二羧酸接头将ε-氨基彼此结合的结构。但是，由于以下的理由无法使Peginesatide以一条多肽链的形式在谷氨酸棒杆菌中表达。
(1)Peginesatide中包含非天然氨基酸，包含非天然氨基酸的肽无法在谷氨酸棒杆菌中表达。
(2)包含二羧酸接头的肽无法在谷氨酸棒杆菌中表达。
(3)二聚体化是通过以赖氨酸的ε-氨基使2分子的环状肽的C末端结合而达成的，但C末端彼此结合的结构、以及赖氨酸的ε-氨基与另一氨基酸形成酰胺键的结构无法在谷氨酸棒杆菌中表达。
因此，如下所述地对分子施加了转换，从而设计了能够表达的形式。对于所述(1)，通过使用不包含非天然氨基酸的促红细胞生成素受体结合环状肽(US5773569A)而使其可以表达。对于所述(2)，通过使用肽性接头来使其可以表达。对于所述(3)，不是环状肽的C末端彼此之间，而是通过使用PAS序列使一个环状肽的N末端与另一个肽的C末端结合来进行应对。即，通过设计为“第一促红细胞生成素受体结合环状肽”-“PAS接头”-“第二促红细胞生成素受体结合环状肽”的肽序列来进行应对。即，第一促红细胞生成素受体结合环状肽的C末端与PAS接头的N末端通过酰胺键结合，第二促红细胞生成素受体结合环状肽的N末端与PAS接头的C末端通过酰胺键结合，可以以一条多肽链的形式表达。
(20-2)EPO-PAS二聚体肽的制备
制备的EPO-PAS二聚体肽如下。
(p)EPO-PAS8
GGLYACHMGPMTWVCQPLRGAAPAAPAPGGLYACHMGPMTWVCQPLRG(序列编号：102)
(q)EPO-PAS22
GGLYACHMGPMTWVCQPLRGAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPGGLYACHMGPMTWVCQPLRG(序列编号：103)
(r)AET-EPO-PAS8
AETGGLYACHMGPMTWVCQPLRGAAPAAPAPGGLYACHMGPMTWVCQPLRG(序列编号：104)
(s)AET-EPO-PAS22
AETGGLYACHMGPMTWVCQPLRGAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPGGLYACHMGPMTWVCQPLRG(序列编号：105)
(20-3)EPO-PAS二聚体肽的表达
使用Corynex(注册商标)进行了这些EPO-PAS二聚体肽的表达探讨。以下，记载了基于Corynex(注册商标)的表达探讨的实施例。
(20-4)利用了CspA信号序列的EPO-PAS8和EPO-PAS22的各分泌表达质粒的构建
作为EPO-PAS二聚体肽，分别设计所述(p)EPO-PAS8(也表示为以下，“EPO-PAS8”)和(q)EPO-PAS22(以下，也表示为“EPO-PAS22”)的2种氨基酸序列，考虑谷氨酸棒杆菌的密码子使用频率而设计了编码这些蛋白质的碱基序列。并且，以使得能够进行基于谷氨酸棒杆菌的分泌表达的方式，分别设计了以下的表达盒。
EPO-PAS8以来源于C.ammoniagenes ATCC6872株的CspA的信号肽25氨基酸残基与EPO-PAS8的融合蛋白(以下，表示为“CspAss-EPO-PAS8”)的形式而分泌表达。编码设计的CspAss-EPO-PAS8的碱基序列和氨基酸序列分别示于序列编号106、107。
编码CspAss-EPO-PAS8的碱基序列
atgaaacgcatgaaatcgctggctgcggcgctcaccgtcgctggggccatgctggccgcacctgtggcaacggcaggtggcctttacgcttgtcacatgggtccaatgacctgggtttgtcagcccctccgtggtgccgctcctgccgcccccgctcctggtggcctgtacgcatgccatatgggtccaatgacttgggtgtgccagccactccgcggctaa(序列编号：106)
CspAss-EPO-PAS8的氨基酸序列
MKRMKSLAAALTVAGAMLAAPVATAGGLYACHMGPMTWVCQPLRGAAPAAPAPGGLYACHMGPMTWVCQPLRG(序列编号：107)
EPO-PAS22以来源于C.ammoniagenes ATCC6872株的CspA的信号肽25氨基酸残基与EPO-PAS22的融合蛋白(以下，表示为“CspAss-EPO-PAS22”)的形式而分泌表达。编码设计的CspAss-EPO-PAS22的碱基序列和氨基酸序列分别示于序列编号108、109。
编码CspAss-EPO-PAS22的碱基序列
atgaaacgcatgaaatcgctggctgcggcgctcaccgtcgctggggccatgctggccgcacctgtggcaacggcaggcggcctttacgcttgtcacatgggtccaatgacctgggtctgtcaacctctccgtggtgcagccccggcagcccccgctccagccgcaccagcagccccagccccagctgcaccagccgctccaggcggcctctacgcctgccacatgggtcctatgacctgggtgtgccaaccacttcgcggctaa(序列编号：108)
CspAss-EPO-PAS22的氨基酸序列
MKRMKSLAAALTVAGAMLAAPVATAGGLYACHMGPMTWVCQPLRGAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPGGLYACHMGPMTWVCQPLRG(序列编号：109)
在CspAss-EPO-PAS8和CspAss-EPO-PAS22所述的碱基序列的上游连接来源于谷氨酸棒杆菌ATCC13869株的cspB基因的启动子，并在5’-侧添加KpnI位点，在3’-侧添加BamHI位点，设计各EPO-PAS二聚体肽的表达盒，进行了全合成。通过将全合成得到的DNA片段(EPO-PAS二聚体肽的表达盒)插入日本特开平9-322774所述的pPK4的KpnI-BamHI部分，分别构建了作为利用了CspA信号序列的各EPO-PAS二聚体肽的分泌表达质粒的pPK4_CspAss-EPO-PAS8和pPK4_CspAss-EPO-PAS22。对插入片段的碱基序列进行了确定的结果，确认分别构建了如同所设计的EPO-PAS二聚体肽的表达盒。碱基序列的确定使用BigDye(注册商标)Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems)和3500xL GeneticAnalyzer(Applied Biosystems)进行。
(20-5)利用了CspB信号序列的AET-EPO-PAS8和AET-EPO-PAS22的各分泌表达质粒的构建
作为EPO-PAS二聚体肽，分别设计所述(r)AET-EPO-PAS8(以下，也表示为“AET-EPO-PAS8”)和(s)AET-EPO-PAS22(以下，也表示为“AET-EPO-PAS22”)的2种氨基酸序列，考虑谷氨酸棒杆菌的密码子使用频率而设计了编码这些蛋白质的碱基序列。并且，以使得能够进行基于谷氨酸棒杆菌的分泌表达的方式，分别设计了以下的表达盒。
AET-EPO-PAS8以来源于谷氨酸棒杆菌ATCC13869株的CspB的信号肽30氨基酸残基与AET-EPO-PAS8的融合蛋白(以下，表示为“CspBss-AET-EPO-PAS8”)的形式而分泌表达。编码设计的CspBss-AET-EPO-PAS8的碱基序列和氨基酸序列分别示于序列编号110、111。
编码CspBss-AET-EPO-PAS8的碱基序列
atgtttaacaaccgtatccgcactgcagctctcgctggtgcaatcgcaatctccaccgcagcttccggcgtagctatcccagcattcgctgcagagaccggtggcctttacgcttgtcacatgggtccaatgacctgggtttgtcagcccctccgtggtgccgctcctgccgcccccgctcctggtggcctgtacgcatgccatatgggtccaatgacttgggtgtgccagccactccgcggctaa(序列编号：110)
CspBss-AET-EPO-PAS8的氨基酸序列
MFNNRIRTAALAGAIAISTAASGVAIPAFAAETGGLYACHMGPMTWVCQPLRGAAPAAPAPGGLYACHMGPMTWVCQPLRG(序列编号：111)
AET-EPO-PAS22以来源于谷氨酸棒杆菌ATCC13869株的CspB的信号肽30氨基酸残基与AET-EPO-PAS22的融合蛋白(以下，表示为“CspBss-AET-EPO-PAS22”)的形式而分泌表达。编码设计的CspBss-AET-EPO-PAS22的碱基序列和氨基酸序列分别示于序列编号112、113。
编码CspBss-AET-EPO-PAS22的碱基序列
atgtttaacaaccgtatccgcactgcagctctcgctggtgcaatcgcaatctccaccgcagcttccggcgtagctatcccagcattcgctgcagagaccggcggcctttacgcttgtcacatgggtccaatgacctgggtctgtcaacctctccgtggtgcagccccggcagcccccgctccagccgcaccagcagccccagccccagctgcaccagccgctccaggcggcctctacgcctgccacatgggtcctatgacctgggtgtgccaaccacttcgcggctaa(序列编号：112)
CspBss-AET-EPO-PAS22的氨基酸序列
MFNNRIRTAALAGAIAISTAASGVAIPAFAAETGGLYACHMGPMTWVCQPLRGAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPGGLYACHMGPMTWVCQPLRG(序列编号：113)
在CspBss-AET-EPO-PAS8和CspBss-AET-EPO-PAS22所述的碱基序列的上游连接来源于谷氨酸棒杆菌ATCC13869株的cspB基因的启动子，并在5’-侧添加KpnI位点，在3’-侧添加BamHI位点，设计各EPO-PAS二聚体肽的表达盒，进行了全合成。通过将全合成得到的DNA片段(EPO-PAS二聚体肽的表达盒)插入日本特开平9-322774所述的pPK4的KpnI-BamHI部分，分别构建了作为利用了CspB信号序列的各EPO-PAS二聚体肽的分泌表达质粒的pPK4_CspBss-AET-EPO-PAS8和pPK4_CspBss-AET-EPO-PAS22。对插入片段的碱基序列进行了确定的结果，确认分别构建了如同所设计的EPO-PAS二聚体肽的表达盒。碱基序列的确定使用BigDye(注册商标)Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems)和3500xL Genetic Analyzer(Applied Biosystems)进行。
(20-6)谷氨酸棒杆菌中的各EPO-PAS二聚体肽的分泌表达
使用所述构建得到的pPK4_CspAss-EPO-PAS8、pPK4_CspAss-EPO-PAS22、pPK4_CspBss-AET-EPO-PAS8、和pPK4_CspBss-AET-EPO-PAS22，转化WO2016/171224所述的谷氨酸棒杆菌YDK0107株，得到了YDK0107/pPK4_CspAss-EPO-PAS8株、YDK0107/pPK4_CspAss-EPO-PAS22株、YDK0107/pPK4_CspBss-AET-EPO-PAS8株、和YDK0107/pPK4_CspBss-AET-EPO-PAS22株。
将得到的各转化体，用包含25mg/L的卡那霉素的MMTG液体培养基(葡萄糖120g，硫酸镁七水合物3g，硫酸铵30g，磷酸二氢钾1.5g，硫酸铁七水合物0.03g，硫酸锰五水合物0.03g，硫胺素盐酸盐0.45mg，生物素0.45mg，DL-蛋氨酸0.15g，大豆盐酸水解液(总氮量0.2g)，碳酸钙50g，用水调节至1L，调节至pH7.0)分别在30℃下，培养72小时。
培养结束后，将各培养液离心分离，用NuPAGE(注册商标)12％Bis-Tirs Gel(Thermo Fisher Scientific)将得到的培养上清6.5μL供至还原SDS-PAGE后，用Quick-CBB(Wako)进行了染色。其结果，YDK0107/pPK4_CspAss-EPO-PAS8株的培养上清中检测到了被认为是EPO-PAS8的蛋白质带(图32，列2～5)，YDK0107/pPK4_CspAss-EPO-PAS22株的培养上清中检测到了被认为是EPO-PAS22的蛋白质带(图32，列6～9)，YDK0107/pPK4_CspBss-AET-EPO-PAS8株的培养上清中检测到了被认为是AET-EPO-PAS8的蛋白质带(图32，列10～13)、和YDK0107/pPK4_CspBss-AET-EPO-PAS22株的培养上清中检测到了被认为是AET-EPO-PAS22的蛋白质带(图32，列14～17)。
实施例21：EPO-PAS二聚体肽的分子量分析
对于实施例20中的培养后的、AET-EPO-PAS8和AET-EPO-PAS22的菌体过滤液，使用LC-MS(Waters,LC-MS(Waters,ACQUITY UPLC/SQD2)进行了分子量的测定。分析条件如表2所述。如图33以及34所示，得到了与在分子内形成有2个二硫键的氧化型的各二聚体肽的分子量的理论值基本相同的值。从这一点来看，确认了能够表达包含2个二硫键的正确的氨基酸序列的肽。
实施例22：EPO-PAS二聚体肽的活性评价
EPO-PAS二聚体肽的EpoR活化能力使用PathHunter(注册商标)eXpress EpoR-JAK2 Functional Assay Kit(DiscoverX公司)进行了评价。
向96孔板中接种PathHunter(注册商标)eXpress EpoR-JAK2 Functional AssayKit中包含的EPO活性评价用细胞，在37℃、5％CO2下进行了24小时培养。对于细胞，添加了860pg/L-900μg/L的重组人类促红细胞生成素(rhEPO,Peprotech公司)、或包含稀释至给定浓度的AET-EPO-PAS8或AET-EPO-PAS22的培养上清(培养如实施例20所述)、或作为单体肽的EMP35(GGLYACHMGPMTWVCQPLRG,Genscript Japan株式会社合成)。作为阴性对照，将除了使用不包含EPO-PAS二聚体肽表达用基因的载体之外如实施例20所述地进行培养而得的培养上清(图32，列18)，以与包含AET-EPO-PAS8或AET-EPO-PAS22的培养上清同样的倍率稀释而进行了添加。对于在室温下进行了3小时刺激的细胞，添加制备的底物试剂(SubstrateReagent)，孵育60分钟。使用Nivo读板器(Perkin Elmer公司)定量了化学发光强度。
如图35所示，可以看出AET-EPO-PAS8和AET-EPO-PAS22浓度依赖性地使EpoR活化。其最大活化能力与rhEPO几乎同等。此外，如下述表4所示，就EC50值而言，相对于rhEPO为1.1×10-6g/L，AET-EPO-PAS8为1.9×10-7g/L，AET-EPO-PAS22为3.4×10-7g/L，可以看出具有更高的活性。此外，作为单体肽的EMP35为1.1×10-4g/L，表现出与EPO-PAS二聚体肽相比低1000倍左右的活性(图36，表4)，可以看出，通过二聚化，得到了更高的激动剂活性。
[表4]
| 肽 | EC50(g/L) |
| rhEPO | 1.1×10<sup>-6</sup> |
| AET-EPO-PAS8 | 1.9×10<sup>-7</sup> |
| AET-EPO-PAS22 | 3.4×10<sup>-7</sup> |
| EMP35 | 1.1×10<sup>-4</sup> |
实施例23：TPO-PAS二聚体肽的设计和其在谷氨酸棒杆菌中的分泌表达
(23-1)设计的概要
与作为血小板生成素受体的c-Mpl结合的肽二聚体由于以下的理由而无法在谷氨酸棒杆菌中表达。具体而言，由于以下的理由，使S.E.Cwirla，et al.Science，276，1696-1699，1997中报道的直链状c-Mpl结合肽AF12505通过赖氨酸的α-和ε-氨基而二聚体化的肽二聚体分子(AF13948)无法以一条多肽链的形式在谷氨酸棒杆菌表达。
(1)二聚体化是通过直链状肽AF12505的C末端彼此隔着赖氨酸的α-和ε-氨基结合而达成的，无法在谷氨酸棒杆菌中表达。(2)与赖氨酸的α-氨基结合的AF12505的C末端结合有非蛋白质性氨基酸的β-丙氨酸，包含非蛋白质性氨基酸的肽无法在谷氨酸棒杆菌中表达。因此，如下所述地对分子施加了转换从而设计了能够表达的形式。使用PAS序列代替赖氨酸和β-丙氨酸，并以使其能够以一条多肽链的形式表达的方式，设计为“第一AF12505”-“PAS接头”-“第二AF12505”的肽序列，由此来进行应对。即，第一AF12505的C末端与PAS接头的N末端通过酰胺键结合，第二AF12505的N末端与PAS接头的C末端通过酰胺键结合，可以以一条多肽链的形式表达。
此外，由于以下的理由，在WO9640750中报道的、环状c-Mpl结合肽AF12285的C末端添加生物素并以链霉亲和素而多聚化的肽无法以一条多肽链的形式在谷氨酸棒杆菌中表达。
(1)环状肽AF12285的C末端是介由赖氨酸的ε-氨基而受到生物素修饰的。包含生物素的肽无法在谷氨酸棒杆菌中表达。
(2)生物素化环状肽通过链霉亲和素而多聚化。无法使链霉亲和素与肽同时在谷氨酸棒杆菌中表达。因此，如下所述地对分子施加了转换，从而设计了能够表达的形式。使用PAS序列进行多聚化，来代替基于生物素-链霉亲和素的多聚化，并以使其能够以一条多肽链的形式表达的方式设计为“第一AF12285”-“PAS接头”-“第二AF12285”的肽序列，从而进行了应对。即，第一AF12505的C末端与PAS接头的N末端通过酰胺键结合，第二AF12505的N末端与PAS接头的C末端通过酰胺键结合，可以以一条多肽链的形式表达。
(23-2)TPO-PAS二聚体肽的制备
制备的TPO-PAS二聚体肽如下。
(t)TPO2-PAS8
GGCADGPTLREWISFCGGAAPAAPAPGGCADGPTLREWISFCGG(序列编号：114)
(u)AET-TPO1-PAS8
AETIEGPTLRQWLAARAAAPAAPAPIEGPTLRQWLAARA(序列编号：115)
(v)AET-TPO2-PAS8
AETGGCADGPTLREWISFCGGAAPAAPAPGGCADGPTLREWISFCGG(序列编号：116)
(23-3)TPO-PAS二聚体肽的表达
使用Corynex(注册商标)进行了这些TPO-PAS二聚体肽的表达探讨。以下，记载了基于Corynex(注册商标)的表达探讨的实施例。
(23-4)利用了CspA信号序列的TPO2-PAS8的分泌表达质粒的构建
作为TPO-PAS二聚体肽，设计所述(t)TPO2-PAS8(以下，也表示为“TPO2-PAS8”)的氨基酸序列，考虑谷氨酸棒杆菌的密码子使用频率而设计了编码该蛋白质的碱基序列。并且，以使得能够进行基于谷氨酸棒杆菌的分泌表达的方式，设计了以下的表达盒。
TPO2-PAS8以来源于C.ammoniagenes ATCC6872株的CspA的信号肽25氨基酸残基与TPO2-PAS8的融合蛋白(以下，表示为“CspAss-TPO2-PAS8”)的形式而分泌表达。编码设计的CspAss-TPO2-PAS8的碱基序列和氨基酸序列分别示于序列编号117、118。
编码CspAss-TPO2-PAS8的碱基序列
atgaaacgcatgaaatcgctggctgcggcgctcaccgtcgctggggccatgctggccgcacctgtggcaacggcaggtggttgtgctgatggtcctaccttgcgtgaatggatttccttctgcggcggcgctgctccggctgcccctgcccctggcggttgcgcagatggcccaaccctgcgcgaatggatctccttctgcggcggctaa(序列编号：117)
CspAss-TPO2-PAS8的氨基酸序列
MKRMKSLAAALTVAGAMLAAPVATAGGCADGPTLREWISFCGGAAPAAPAPGGCADGPTLREWISFCGG(序列编号：118)
在CspAss-TPO2-PAS8所述的碱基序列的上游连接来源于谷氨酸棒杆菌ATCC13869株的cspB基因的启动子，并在5’-侧添加KpnI位点，在3’-侧添加BamHI位点，设计TPO-PAS二聚体肽的表达盒，进行了全合成。通过将全合成得到的DNA片段(TPO-PAS二聚体肽的表达盒)插入日本特开平9-322774所述的pPK4的KpnI-BamHI部分，构建了作为利用了CspA信号序列的TPO-PAS二聚体肽的分泌表达质粒的pPK4_CspAss-TPO2-PAS8。对插入片段的碱基序列进行了确定的结果，确认构建了如同所设计的TPO-PAS二聚体肽的表达盒。碱基序列的确定使用BigDye(注册商标)Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit(AppliedBiosystems)和3500xL Genetic Analyzer(Applied Biosystems)进行。
(23-5)利用了CspB信号序列的AET-TPO1-PAS8和AET-TPO2-PAS8的各分泌表达质粒的构建
作为TPO-PAS二聚体肽，分别设计所述(u)AET-TPO1-PAS8(以下，也表示为“AET-TPO1-PAS8”)、和(v)AET-TPO2-PAS8(以下，也表示为“AET-EPO2-PAS8”)的2种氨基酸序列，考虑谷氨酸棒杆菌的密码子使用频率而设计了编码这些蛋白质的碱基序列。并且，以使得能够进行基于谷氨酸棒杆菌的分泌表达的方式，分别设计了以下的表达盒。
AET-TPO1-PAS8以来源于谷氨酸棒杆菌ATCC13869株的CspB的信号肽30氨基酸残基与AET-TPO1-PAS8的融合蛋白(以下，表示为“CspBss-AET-TPO1-PAS8”)的形式而分泌表达。编码设计的CspBss-AET-TPO1-PAS8的碱基序列和氨基酸序列分别示于序列编号119、120。
编码CspBss-AET-TPO1-PAS8的碱基序列
atgtttaacaaccgtatccgcactgcagctctcgctggtgcaatcgcaatctccaccgcagcttccggcgtagctatcccagcattcgctgcagagaccatcgaaggtcctaccctccgtcaatggctggctgctcgtgccgccgctcccgccgctcctgctccaatcgaaggtcccaccctccgtcagtggctggcagcccgcgcataa(序列编号：119)
CspBss-AET-TPO1-PAS8的氨基酸序列
MFNNRIRTAALAGAIAISTAASGVAIPAFAAETIEGPTLRQWLAARAAAPAAPAPIEGPTLRQWLAARA(序列编号：120)
AET-TPO2-PAS8以来源于谷氨酸棒杆菌ATCC13869株的CspB的信号肽30氨基酸残基与AET-TPO2-PAS8的融合蛋白(以下，表示为“CspBss-AET-TPO2-PAS8”)的形式而分泌表达。编码设计的CspBss-AET-TPO2-PAS8的碱基序列和氨基酸序列分别示于序列编号121、122。
编码CspBss-AET-TPO2-PAS8的碱基序列
atgtttaacaaccgtatccgcactgcagctctcgctggtgcaatcgcaatctccaccgcagcttccggcgtagctatcccagcattcgctgcagagaccggtggttgtgctgatggtcctaccttgcgtgaatggatttccttctgcggcggcgctgctccggctgcccctgcccctggcggttgcgcagatggcccaaccctgcgcgaatggatctccttctgcggcggctaa(序列编号：121)
CspBss-AET-TPO2-PAS8的氨基酸序列
MFNNRIRTAALAGAIAISTAASGVAIPAFAAETGGCADGPTLREWISFCGGAAPAAPAPGGCADGPTLREWISFCGG(序列编号：122)
在CspBss-AET-TPO1-PAS8和CspBss-AET-TPO2-PAS8所述的碱基序列的上游连接来源于谷氨酸棒杆菌ATCC13869株的cspB基因的启动子，并在5’-侧添加KpnI位点，在3’-侧添加BamHI位点，设计各TPO-PAS二聚体肽的表达盒，进行了全合成。通过将全合成得到的DNA片段(TPO-PAS二聚体肽的表达盒)插入日本特开平9-322774所述的pPK4的KpnI-BamHI部分，分别构建了作为利用了CspB信号序列的各TPO-PAS二聚体肽的分泌表达质粒的pPK4_CspBss-AET-TPO1-PAS8和pPK4_CspBss-AET-TPO2-PAS8。对插入片段的碱基序列进行了确定的结果，确认分别构建了如同所设计的TPO-PAS二聚体肽的表达盒。碱基序列的确定使用BigDye(注册商标)Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems)和3500xL Genetic Analyzer(Applied Biosystems)进行。
(23-6)谷氨酸棒杆菌中的各TPO-PAS二聚体肽的分泌表达
使用所述构建得到的pPK4_CspAss-TPO2-PAS8、pPK4_CspBss-AET-TPO1-PAS8、和pPK4_CspBss-AET-TPO2-PAS8，转化WO2016/171224所述的谷氨酸棒杆菌YDK0107株，得到了YDK0107/pPK4_CspAss-TPO2-PAS8株、YDK0107/pPK4_CspBss-AET-TPO1-PAS8株、和YDK0107/pPK4_CspBss-AET-TPO2-PAS8株。
将得到的各转化体，用包含25mg/L的卡那霉素的MMTG液体培养基(葡萄糖120g，硫酸镁七水合物3g，硫酸铵30g，磷酸二氢钾1.5g，硫酸铁七水合物0.03g，硫酸锰五水合物0.03g，硫胺素盐酸盐0.45mg，生物素0.45mg，DL-蛋氨酸0.15g，大豆盐酸水解液(总氮量0.2g)，碳酸钙50g，用水调节至1L，调节至pH7.0)分别在30℃下，培养72小时。
培养结束后，将各培养液离心分离，用NuPAGE(注册商标)12％Bis-Tirs Gel(Thermo Fisher Scientific)将得到的培养上清6.5μL供至还原SDS-PAGE后，用Quick-CBB(Wako)进行了染色。其结果，YDK0107/pPK4_CspBss-AET-TPO1-PAS8株的培养上清中检测到了被认为是AET-TPO1-PAS8的蛋白质带(图37，列2～5)，YDK0107/pPK4_CspAss-TPO2-PAS8株的培养上清中检测到了被认为是TPO2-PAS8的蛋白质带(图37，列6～9)，YDK0107/pPK4_CspBss-AET-TPO2-PAS8株的培养上清中检测到了被认为是AET-TPO2-PAS8的蛋白质带(图37，列10～13)。
实施例24：TPO-PAS二聚体肽的分子量分析
对于实施例23中的培养后的、TPO-PAS二聚体肽的菌体过滤液，使用LC-MS(Waters,LC-MS(Waters,ACQUITY UPLC/SQD2)进行了分子量的测定。分析条件如表2所述。如图38～40所示，得到了与在分子内形成有2个二硫键的氧化型的各二聚体肽的分子量的理论值基本相同的值。从这一点来看，确认了能够表达包含2个二硫键的正确的氨基酸序列的肽。
实施例25：TPO-PAS二聚体肽的活性评价
TPO-PAS二聚体肽的血小板生成素样活性通过作为来源于人类白血病的血细胞细胞株的HEL细胞的酪氨酸磷酸化水平的定量而进行评价。将200000cell的HEL细胞用不含FBS的RPMI1640培养基(Thermo Fisher Scientific公司)培养24小时，使其为饥饿状态。对于该细胞，使用10-100ng/mL的重组人类TPO(rhTPO,Peprotech公司)或以给定的稀释倍率添加了包含AET-TPO1-PAS8、TPO2-PAS8或AET-TPO2-PAS8的培养上清的RPMI1640培养基进行20分钟的刺激。作为阴性对照，加入通过使用PBS(Mock组)或空载体而不表达肽的上清(Empty组)进行了20分钟的刺激。将培养基除去，用PBS清洗一次细胞后，通过加入100μL的添加有蛋白酶抑制剂混合物(Nacalai Tesque公司)的裂解缓冲液17(R&D Systems公司)来使细胞溶解。以14000G对溶解液进行5分钟离心，得到上清作为裂解液。
将PVDF膜(Immobilon-P膜0.45μm,Merck公司)在甲醇中处理1分钟，接下来在超纯水中处理5分钟，进行了亲水处理。使PVDF膜干燥，用1μL移液器点样(spotting)各细胞溶解液，并使其干燥。PVDF膜以PVDF Blocking Reagent for Can Get Signal(日油)在室温下进行1小时封闭后，添加以1:5000的比例加入有anti-pY抗体-HGF conjugate(CellSignaling Technology)的Can Get Signal Solution 2(日油)，在4℃下,进行24小时的抗体反应。用TBST缓冲液清洗膜3次，添加Luminata Crescendo Western HRP Substrate(Merck公司)，进行了化学发光反应。化学发光使用Amersham Imager 600(GE Healthcare公司)进行检测。检测的点的发光强度通过ImageJ进行定量。
如图41所示，在AET-TPO1-PAS8、AET-TPO2-PAS8、TPO2-PAS8中，都观察到了与rhTPO同等或其以上的酪氨酸磷酸化水平的上升。根据该结果，可以看出AET-TPO1-PAS8、AET-TPO2-PAS8、TPO2-PAS8与TPO同样，使HEL细胞活化。
图42表示TPO2-PAS8的浓度依赖性的HEL细胞活化能力。在1/100-1/10000稀释的范围内，TPO2-PAS8刺激组表现出与100ng/mL的rhTPO刺激组同等以上的发光强度，从这一点可以看出，在该浓度域中具有与rhTPO同等以上的HEL细胞活化能力。
实施例26：TPO-PAS二聚体肽的信号特性评价
TPO-PAS二聚体肽的信号特性使用Proteome Profiler Human Phospho-KinaseArray Kit(R&D Systems)进行了评价。
1000000cell的HEL细胞用不含FBS的RPMI1640培养基(Thermo FisherScientific公司)培养24小时，使其为饥饿状态。对于该细胞，使用100ng/mL的重组人类TPO(rhTPO,Peprotech公司)或以其为1/100-1/1000稀释的方式添加了包含TPO2-PAS8的培养上清的RPMI1640培养基进行了20分钟的刺激。作为阴性对照，加入PBS进行了20分钟的刺激(Mock组)。将培养基除去，用PBS清洗一次细胞后，通过加入200μL的添加有蛋白酶抑制剂混合物(Nacalai Tesque公司)的裂解缓冲液17(R&D Systems公司)使细胞溶解。以14000G对溶解液进行5分钟离心，得到上清作为裂解液。
使用Proteome Profiler Human Phospho-Kinase Array Kit解析裂解液。化学发光的检测使用了Amersham Imager 600(GE Healthcare公司)。点的化学发光强度以ImageJ进行了定量。如图43所示，确认到了：相对于以PBS进行了刺激的细胞(Mock组)，以rhTPO或TPO2-PAS8进行了刺激的细胞的Erk、CREB、Stat3、Stat5a、Stat5b的磷酸化水平上升、且两者的磷酸化图案类似。rhTPO刺激的信号通路主要为JAK2/Stat3,5通路，磷酸化水平上升了的蛋白质全部包含在该通路中。根据该结果，确认了TPO2-PAS8和rhTPO使类似的信号活化。
实施例27：VEGFR_D2-PAS异二聚体肽的设计和其在谷氨酸棒杆菌中的分泌表达
(27-1)设计的概要
由于以下的理由，使A.Shrivastava,et al.Protein Eng.Des.Select.18,417,2005中报道的VEGFR结合环状肽P-3和P-4通过戊二酸接头而二聚体化的肽异二聚体分子无法以一条多肽链的形式在谷氨酸棒杆菌中表达。二聚体化通过配置于环状肽P-3、P-4的各个C末端的赖氨酸残基的ε-氨基彼此介由戊二酸结合而达成，无法在谷氨酸棒杆菌中表达。因此，如下所述地对分子施加了转换，从而设计了能够表达的形式。使用PAS序列代替戊二酸接头、并以使其能够以一条多肽链的形式表达的方式设计为“第一VEGFR结合序列(P-3)”-“PAS接头”-“第二VEGFR结合序列(P-4)”的肽序列，由此进行了应对。即，P-3的C末端与PAS接头的N末端通过酰胺键结合，P-4的N末端与PAS接头的C末端通过酰胺键结合，可以以一条多肽链的形式表达。
(27-2)VEGFR_D2-PAS异二聚体肽的制备
制备的VEGFR_D2-PAS异二聚体肽如下。
(w)AET-VEGFR_D2-PAS16
AETAGPTWCEDDWYYCWLFGTAAPAAPAPAAPAAPAPVCWEDSWGGEVCWLFGT(序列编号：123)
(27-3)VEGFR_D2-PAS异二聚体肽的表达
使用Corynex(注册商标)进行了VEGFR_D2-PAS异二聚体肽的表达探讨。以下，记载了基于Corynex(注册商标)的表达探讨的实施例。
(27-4)利用了CspB信号序列的AET-VEGFR_D2-PAS16分泌表达质粒的构建
作为VEGFR_D2-PAS异二聚体肽，设计所述(w)AET-VEGFR_D2-PAS16(以下，表示为“AET-VEGFR_D2-PAS16”，也简单表示为“VEGFR_D2-PAS16”)的氨基酸序列，考虑谷氨酸棒杆菌的密码子使用频率而设计了编码该蛋白质的碱基序列。并且，以使得能够进行基于谷氨酸棒杆菌的分泌表达的方式，设计了以下的表达盒。
AET-VEGFR_D2-PAS16以来源于谷氨酸棒杆菌ATCC13869株的CspB的信号肽30氨基酸残基与AET-VEGFR_D2-PAS16的融合蛋白(以下，表示为“CspBss-VEGFR_D2-PAS16”)的形式而分泌表达。编码设计的CspBss-AET-VEGFR_D2-PAS16的碱基序列和氨基酸序列分别示于序列编号124、125。
编码CspBss-AET-VEGFR_D2-PAS16的碱基序列
atgtttaacaaccgtatccgcactgcagctctcgctggtgcaatcgcaatctccaccgcagcttccggcgtagctatcccagcattcgctgcagagaccgctggtcctacctggtgtgaagacgactggtactactgctggctgtttggcaccgctgctcccgctgcccctgctcctgccgctccggcagccccagctcctgtgtgttgggaagattcttggggcggcgaagtttgctggctgtttggcacctaa(序列编号：124)
CspBss-AET-VEGFR_D2-PAS16的氨基酸序列
MFNNRIRTAALAGAIAISTAASGVAIPAFAAETAGPTWCEDDWYYCWLFGTAAPAAPAPAAPAAPAPVCWEDSWGGEVCWLFGT(序列编号：125)
在CspBss-AET-VEGFR_D2-PAS16所述的碱基序列的上游连接来源于谷氨酸棒杆菌ATCC13869株的cspB基因的启动子，并在5’-侧添加KpnI位点，在3’-侧添加BamHI位点，设计VEGFR_D2-PAS异二聚体肽的表达盒，进行了全合成。通过将全合成得到的DNA片段(VEGFR_D2-PAS异二聚体肽的表达盒)插入日本特开平9-322774所述的pPK4的KpnI-BamHI部分，构建了作为利用了CspB信号序列的VEGFR_D2-PAS异二聚体肽的分泌表达质粒的pPK4_CspBss-AET-VEGFR_D2-PAS16。对插入片段的碱基序列进行了确定的结果，确认构建了如同所设计的VEGFR_D2-PAS异二聚体肽的表达盒。碱基序列的确定使用BigDye(注册商标)Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems)和3500xL GeneticAnalyzer(Applied Biosystems)进行。
(27-5)谷氨酸棒杆菌中的VEGFR_D2-PAS异二聚体肽的分泌表达
使用所述构建得到的pPK4_CspBss-AET-VEGFR_D2-PAS16，转化WO2016/171224所述的谷氨酸棒杆菌YDK0107株，得到了YDK0107/pPK4_CspBss-AET-VEGFR_D2-PAS16株。
将得到的转化体在用包含25mg/L的卡那霉素的MMTG液体培养基(葡萄糖120g，硫酸镁七水合物3g，硫酸铵30g，磷酸二氢钾1.5g，硫酸铁七水合物0.03g，硫酸锰五水合物0.03g，硫胺素盐酸盐0.45mg，生物素0.45mg，DL-蛋氨酸0.15g，大豆盐酸水解液(总氮量0.2g)，碳酸钙50g，用水调节至1L，调节至pH7.0)分别在30℃下，培养72小时。
培养结束后，使用NuPAGE(注册商标)12％Bis-Tirs Gel(Thermo FisherScientific)，分别将6.5μL的离心分离培养液而得到的培养上清、或不进行离心分离而均匀地包含菌体和培养上清的培养液，供至还原SDS-PAGE后，用Quick-CBB(Wako)进行了染色。其结果，YDK0107/pPK4_CspBss-AET-VEGFR_D2-PAS16株的培养上清中微量地检测到了被认为是AET-VEGFR_D2-PAS16的蛋白质带(图45，列2)，与之相对，在包含菌体的培养液样品中显著地检测到了被认为是AET-VEGFR_D2-PAS16的蛋白质的带(图45，列3)。
根据以上的结果，可以认为AET-VEGFR_D2-PAS16在分泌后，其大多部分在培养上清中凝聚而存在，或吸附在培养菌体的细胞表层中而存在。
(27-6)基于尿素处理的VEGFR_D2-PAS异二聚体肽的可溶化
向包含将所述取得的YDK0107/pPK4_CspBss-AET-VEGFR_D2-PAS16株的培养液离心分离而得到的菌体的沉淀组分中，添加与除去的培养上清等量的0.5M尿素(50mM Tris-HCl，pH 8.0)或1.0M尿素(50mM Tris-HCl，pH 8.0)并混合。使用NuPAGE(注册商标)12％Bis-Tirs Gel(Thermo Fisher Scientific)，分别将6.5μL的离心分离各尿素处理液而得到的上清组分、或不进行离心分离而均匀地包含菌体和上清的混合液，供至还原SDS-PAGE后，用Quick-CBB(Wako)进行了染色。其结果，在0.5M尿素和1.0M尿素处理样品中，被认为是AET-VEGFR_D2-PAS16的蛋白质带被提取至上清中，作为可溶性组分而取得(图45，列6和列8)。
实施例28：VEGFR_D2-PAS异二聚体的分子量分析
对于用8M尿素将实施例27中的培养后的、表达了VEGFR_D2-PAS异二聚体的菌体进行了清洗而得到的溶液，在菌体过滤后使用LC-MS(Waters,ACQUITY UPLC/SQD2)进行了分子量的测定。分析条件示于表5。
[表5]
如图46所示，得到了与在分子内形成有2个二硫键的氧化型的二聚体肽的分子量的理论值基本相同的值。从这一点来看，确认了能够表达包含2个二硫键的正确的氨基酸序列的肽。
实施例29：VEGFR_D2-PAS异二聚体的活性评价
通过萤光素酶测定评价了VEGFR_D2-PAS异二聚体肽的VEGF抑制能力。接种40000cell/well的VEGFR/NFAT Reporter HEK293细胞(BPS Bioscience公司)，在37℃、5％CO2孵育器内进行了过夜孵育。在分析培养基(Assay medium)(MEM培养基(Nacalai Tesque公司)、1x MEM非必需氨基酸溶液(Thermo Fisher Scientific公司)、1mM丙酮酸钠(Nacalai Tesque公司)、1％青霉素-链霉素(Sigma Aldrich公司)、0.3％FBS(ThermoFisher Scientific公司))中孵育细胞过夜，使其为饥饿状态。向分析培养基中添加10ng/mL的人类重组VEGF(R&D Systems)，并以给定的稀释倍率添加进行了HPLC纯化的VEGFR_D2-PAS16或作为单体肽的P3(AGPTWCEDDWYYCWLFGT(序列编号：71)，Genscript Japan株式会社合成)、Pm4(VCWEDSWGGEVCWLFGT(序列编号：72)，Genscript Japan株式会社合成)，将该分析培养基100μL添加至细胞。在37℃、5％CO2孵育器内培养4小时，由此进行了对细胞的刺激。
信号强度的检测使用了One-Glo Luciferase Assay System(Promega公司)。将50μL的培养基上清除去，添加One-Glo试剂50μL，在室温下溶解细胞10分钟。通过用Nivo读板器(Perkin Elmer公司)检测从细胞的溶解液中发出的发光来对VEGFR-NFAT通路的活化进行定量，求出相对于未添加评价化合物的样品的相对信号活性值，以作为相对受体活性(Relative reporter activity)。
如图47所示，VEGFR_D2-PAS16与作为单体肽的P3、Pm4相比表现出了更高的抑制活性，从这一点可以看出，通过环状肽的异二聚化得到了更高的抑制活性。
实施例30：EPO-PAS二聚体肽接头改变体的设计和其在谷氨酸棒杆菌中的分泌表达
(30-1)接头改变体的设计的概要
作为促红细胞生成素模仿肽的AET-EPO-PAS8和AET-EPO-PAS22具有以包含8个氨基酸或22个氨基酸的PAS接头使第一促红细胞生成素受体结合环状肽和第二促红细胞生成素受体结合环状肽之间结合的结构。可以预想通过改变该PAS接头的长度，促红细胞生成素受体结合活性会变化。因此，设计了将PAS接头部分改变为49个氨基酸或100个氨基酸的PAS重复序列的接头改变体。
此外，作为挠性接头，除了PAS接头之外，还已知有作为甘氨酸和丝氨酸的重复序列的GS接头。因此，设计了使EPO环状肽结合至包含甘氨酸4残基和丝氨酸1残基(GGGGS)的重复序列的GS接头的N末端和C末端而得到的接头改变体，即为“第一促红细胞生成素受体结合环状肽”-“GS接头”-“第二促红细胞生成素受体结合环状肽”的肽序列。
(30-2)EPO-PAS二聚体肽接头改变体的制备
制备的EPO-PAS二聚体肽接头改变体如下。
(x)AET-EPO-PAS49
AETGGLYACHMGPMTWVCQPLRGAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAGGLYACHMGPMTWVCQPLRG(序列编号：126)
(y)AET-EPO-PAS49-b
AETGGLYACHMGPMTWVCQPLRGSAPSPSSAPASASAPASPASASASASPASSPASASSASPAASSASPASSGGLYACHMGPMTWVCQPLRG(序列编号：127)
(z)AET-EPO-PAS100
AETGGLYACHMGPMTWVCQPLRGAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAGGLYACHMGPMTWVCQPLRG((序列编号：128)
(A)AET-EPO-PAS100-b
AETGGLYACHMGPMTWVCQPLRGSAPSPSSAPASASAPASPASASASASPASSPASASSASPAASSASPASSSASPSAPAAPSASAAPSASPASSSPAPASAPSPAAAASSPSPAPSSASSAAGGLYACHMGPMTWVCQPLRG(序列编号：129)
(B)AET-EPO-GS8
AETGGLYACHMGPMTWVCQPLRGGGGGSGGGGGLYACHMGPMTWVCQPLRG(序列编号：130)
(C)AET-EPO-GS22
AETGGLYACHMGPMTWVCQPLRGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGLYACHMGPMTWVCQPLRG(序列编号：131)
(30-3)EPO-PAS二聚体肽接头改变体的表达
使用Corynex(注册商标)进行了这些EPO-PAS二聚体肽接头改变体的表达探讨。以下，记载了基于Corynex(注册商标)的表达探讨的实施例。
(30-4)利用了CspB信号序列的AET-EPO-PAS49、AET-EPO-PAS49-b、AET-EPO-PAS100、AET-EPO-PAS100-b、AET-EPO-GS8、和AET-EPO-GS22的各分泌表达质粒的构建
作为EPO-PAS二聚体肽接头改变体，分别设计了所述(x)AET-EPO-PAS49(以下，也表示为“AET-EPO-PAS49”)、(y)AET-EPO-PAS49-b(以下，也表示为“AET-EPO-PAS49-b”)、(z)AET-EPO-PAS100(以下，也表示为“AET-EPO-PAS100”)、(A)AET-EPO-PAS100-b(以下，也表示为“AET-EPO-PAS100-b”)、(B)AET-EPO-GS8(以下，也表示为“AET-EPO-GS8”)、和(C)AET-EPO-GS22(以下，也表示为“AET-EPO-GS22”)的6种氨基酸序列，考虑谷氨酸棒杆菌的密码子使用频率而设计了编码这些蛋白质的碱基序列。并且，以使得能够进行基于谷氨酸棒杆菌的分泌表达的方式，分别设计了以下的表达盒。
AET-EPO-PAS49以来源于谷氨酸棒杆菌ATCC13869株的CspB的信号肽30氨基酸残基与AET-EPO-PAS49的融合蛋白(以下，表示为“CspBss-AET-EPO-PAS49”)的形式而分泌表达。编码设计的CspBss-AET-EPO-PAS49的碱基序列和氨基酸序列分别示于序列编号132、133。
编码CspBss-AET-EPO-PAS49的碱基序列
atgtttaacaaccgtatccgcactgcagctctcgctggtgcaatcgcaatctccaccgcagcttccggcgtagctatcccagcattcgctgcagagaccggtggtctctacgcctgtcacatgggtcctatgacctgggtgtgccaacctctccgtggtgccgcccccgccgcccccgcccccgccgccccagctgcaccagctccagcagccccagccgcaccagccccagcagctccagctgccccagcaccagcagcaccagccgctccagcaccagctgctccagcagctccagccccagccggcggcctttacgcctgccacatgggtcctatgacctgggtttgccagcctcttcgcggttag(序列编号：132)
CspBss-AET-EPO-PAS49的氨基酸序列
MFNNRIRTAALAGAIAISTAASGVAIPAFAAETGGLYACHMGPMTWVCQPLRGAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAGGLYACHMGPMTWVCQPLRG(序列编号：133)
AET-EPO-PAS49-b以来源于谷氨酸棒杆菌ATCC13869株的CspB的信号肽30氨基酸残基与AET-EPO-PAS49-b的融合蛋白(以下，表示为“CspBss-AET-EPO-PAS49-b”)的形式而分泌表达。编码设计的CspBss-AET-EPO-PAS49-b的碱基序列和氨基酸序列分别示于序列编号134、135。
编码CspBss-AET-EPO-PAS49-b的碱基序列
atgtttaacaaccgtatccgcactgcagctctcgctggtgcaatcgcaatctccaccgcagcttccggcgtagctatcccagcattcgctgcagagaccggcggactgtacgcctgccatatggggccaatgacctgggtgtgccaaccgttgcgtggatcagcgccatcgccctcttccgctccagcctctgcgtctgctcccgcatccccagcgtcagcttccgcatccgcttcgcctgcaagctcccctgctagcgcgtcctctgcctcccctgcagcatcctcggcttccccggcaagctcaggtggcctctatgcctgccacatgggtccgatgacttgggtctgtcagccacttcgcggctaa(序列编号：134)
CspBss-AET-EPO-PAS49-b的氨基酸序列
MFNNRIRTAALAGAIAISTAASGVAIPAFAAETGGLYACHMGPMTWVCQPLRGSAPSPSSAPASASAPASPASASASASPASSPASASSASPAASSASPASSGGLYACHMGPMTWVCQPLRG(序列编号：135)
AET-EPO-PAS100以来源于谷氨酸棒杆菌ATCC13869株的CspB的信号肽30氨基酸残基与AET-EPO-PAS100的融合蛋白(以下，表示为“CspBss-AET-EPO-PAS100”)的形式而分泌表达。编码设计的CspBss-AET-EPO-PAS100的碱基序列和氨基酸序列分别示于序列编号136、137。
编码CspBss-AET-EPO-PAS100的碱基序列
atgtttaacaaccgtatccgcactgcagctctcgctggtgcaatcgcaatctccaccgcagcttccggcgtagctatcccagcattcgctgcagagaccggtggtttgtacgcttgccacatgggtcctatgacctgggtttgtcagcctcttcgtggtgccgcccccgcagcccccgctcccgctgcaccagccgcaccagcaccagcagctccagcagctccagcaccagctgcaccagccgccccagcaccagcagccccagccgctccagcaccagctgccccagctgctccagctccagcagcaccagctgccccagccccagcagcaccagccgctccagccccagctgccccagcagctccagctccagctgctccagcagccccagcaccagccgccccagcagccccagctccagctgcaccagctgcaccagccccagccgcaccagccggcggtttgtacgcttgccacatgggtccgatgacctgggtttgtcagccccttcgcggttag(序列编号：136)
CspBss-AET-EPO-PAS100的氨基酸序列
MFNNRIRTAALAGAIAISTAASGVAIPAFAAETGGLYACHMGPMTWVCQPLRGAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAGGLYACHMGPMTWVCQPLRG(序列编号：137)
AET-EPO-PAS100-b以来源于谷氨酸棒杆菌ATCC13869株的CspB的信号肽30氨基酸残基与AET-EPO-PAS100-b的融合蛋白(以下，表示为“CspBss-AET-EPO-PAS100-b”)的形式而分泌表达。编码设计的CspBss-AET-EPO-PAS100-b的碱基序列和氨基酸序列分别示于序列编号138、139。
编码CspBss-AET-EPO-PAS100-b的碱基序列
atgtttaacaaccgtatccgcactgcagctctcgctggtgcaatcgcaatctccaccgcagcttccggcgtagctatcccagcattcgctgcagagaccggcggcttgtacgcctgccatatggggcctatgacctgggtctgccaaccactgcgtggaagcgcaccctcaccatcctccgcaccagctagcgcctccgctcctgcaagcccagcgtccgcatccgcttcggcctcaccagcgtcctctccagcttccgcttcgagcgctagcccagcggcatcctctgcctccccagcctcctcgtctgcatccccgtccgctccagccgcaccttctgcatctgcggctccgtccgcctccccggcatcttcctcgcctgctcccgcgtcagcgccttccccggctgcagcggcctcctctccgtcacccgctccttcaagcgcgtcgtctgcagcaggaggcctctatgcctgccacatgggtccgatgacttgggtgtgtcagccccttcgcggttaa(序列编号：138)
CspBss-AET-EPO-PAS100-b的氨基酸序列
MFNNRIRTAALAGAIAISTAASGVAIPAFAAETGGLYACHMGPMTWVCQPLRGSAPSPSSAPASASAPASPASASASASPASSPASASSASPAASSASPASSSASPSAPAAPSASAAPSASPASSSPAPASAPSPAAAASSPSPAPSSASSAAGGLYACHMGPMTWVCQPLRG(序列编号：139)
AET-EPO-GS8以来源于谷氨酸棒杆菌ATCC13869株的CspB的信号肽30氨基酸残基与AET-EPO-GS8的融合蛋白(以下，表示为“CspBss-AET-EPO-GS8”)的形式而分泌表达。编码设计的CspBss-AET-EPO-GS8的碱基序列和氨基酸序列分别示于序列编号140、141。
编码CspBss-AET-EPO-GS8的碱基序列
atgtttaacaaccgtatccgcactgcagctctcgctggtgcaatcgcaatctccaccgcagcttccggcgtagctatcccagcattcgctgcagagaccggcggcctctatgcatgccatatggggccaatgacctgggtctgccaaccgttgcgtggcggaggtggcggttccggtggaggtggtggcctgtacgcttgccacatgggacccatgacttgggtgtgtcagcctcttcgcggctaa(序列编号：140)
CspBss-AET-EPO-GS8的氨基酸序列
MFNNRIRTAALAGAIAISTAASGVAIPAFAAETGGLYACHMGPMTWVCQPLRGGGGGSGGGGGLYACHMGPMTWVCQPLRG(序列编号：141)
AET-EPO-GS22以来源于谷氨酸棒杆菌ATCC13869株的CspB的信号肽30氨基酸残基与AET-EPO-GS22的融合蛋白(以下，表示为“CspBss-AET-EPO-GS22”)的形式而分泌表达。编码设计的CspBss-AET-EPO-GS22的碱基序列和氨基酸序列分别示于序列编号142、143。
编码CspBss-AET-EPO-GS22的碱基序列
atgtttaacaaccgtatccgcactgcagctctcgctggtgcaatcgcaatctccaccgcagcttccggcgtagctatcccagcattcgctgcagagaccggtgggctgtatgcttgccatatggggcctatgacttgggtgtgccaacccttgcgtggtggaggcggaggctccggcggtggtgggagcggaggaggcggttccggtggcggtggctctggcggaggcggcctctacgcatgccacatgggtccgatgacctgggtctgtcagccacttcgcggctaa(序列编号：142)
CspBss-AET-EPO-GS22的氨基酸序列
MFNNRIRTAALAGAIAISTAASGVAIPAFAAETGGLYACHMGPMTWVCQPLRGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGLYACHMGPMTWVCQPLRG(序列编号：143)
在CspBss-AET-EPO-PAS49、CspBss-AET-EPO-PAS49-b、CspBss-AET-EPO-PAS100、CspBss-AET-EPO-PAS100-b、CspBss-AET-EPO-GS8、和CspBss-AET-EPO-GS22所述的碱基序列的上游连接来源于谷氨酸棒杆菌ATCC13869株的cspB基因的启动子，并在5’-侧添加KpnI位点，在3’-侧添加BamHI位点，设计各EPO-PAS二聚体肽接头改变体的表达盒，进行了全合成。通过将全合成得到的DNA片段(EPO-PAS二聚体肽接头改变体的表达盒)插入日本特开平9-322774所述的pPK4的KpnI-BamHI部分，分别构建了作为利用了CspB信号序列的各EPO-PAS二聚体肽接头改变体的分泌表达质粒的pPK4_CspBss-AET-EPO-PAS49、pPK4_CspBss-AET-EPO-PAS49-b、pPK4_CspBss-AET-EPO-PAS100、pPK4_CspBss-AET-EPO-PAS100-b、pPK4_CspBss-AET-EPO-GS8、和pPK4_CspBss-AET-EPO-GS22。对插入片段的碱基序列进行了确定的结果，确认分别构建了如同所设计的EPO-PAS二聚体肽接头改变体的表达盒。碱基序列的确定使用BigDye(注册商标)Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit(AppliedBiosystems)和3500xL Genetic Analyzer(Applied Biosystems)进行。
(30-5)谷氨酸棒杆菌中的各EPO-PAS二聚体肽的分泌表达
使用所述构建得到的pPK4_CspBss-AET-EPO-PAS49、pPK4_CspBss-AET-EPO-PAS49-b、pPK4_CspBss-AET-EPO-PAS100、pPK4_CspBss-AET-EPO-PAS100-b、pPK4_CspBss-AET-EPO-GS8、和pPK4_CspBss-AET-EPO-GS22，转化WO2016/171224所述的谷氨酸棒杆菌YDK0107株，得到了YDK0107/pPK4_CspBss-AET-EPO-PAS49株、YDK0107/pPK4_CspBss-AET-EPO-PAS49-b株、YDK0107/pPK4_CspBss-AET-EPO-PAS100株、YDK0107/pPK4_CspBss-AET-EPO-PAS100-b株、YDK0107/pPK4_CspBss-AET-EPO-GS8株、和YDK0107/pPK4_CspBss-AET-EPO-GS22株。
将得到的各转化体，用包含25mg/L的卡那霉素的MMTG液体培养基(葡萄糖120g，硫酸镁七水合物3g，硫酸铵30g，磷酸二氢钾1.5g，硫酸铁七水合物0.03g，硫酸锰五水合物0.03g，硫胺素盐酸盐0.45mg，生物素0.45mg，DL-蛋氨酸0.15g，大豆盐酸水解液(总氮量0.2g)，碳酸钙50g，用水调节至1L，调节至pH7.0)分别在30℃下，培养72小时。
培养结束后，将各培养液离心分离，用NuPAGE(注册商标)12％Bis-Tirs Gel(Thermo Fisher Scientific)将得到的培养上清6.5μL供至还原SDS-PAGE后，用Quick-CBB(Wako)进行了染色。其结果，YDK0107/pPK4_CspBss-AET-EPO-PAS49株的培养上清中检测到了被认为是AET-EPO-PAS49的蛋白质带(图48，列2～5)，YDK0107/pPK4_CspBss-AET-EPO-PAS49-b株的培养上清中检测到了被认为是AET-EPO-PAS49-b的蛋白质带(图48，列6～9)，YDK0107/pPK4_CspBss-AET-EPO-PAS100株的培养上清中检测到了被认为是AET-EPO-PAS100的蛋白质带(图48，列10～13)，YDK0107/pPK4_CspBss-AET-EPO-PAS100-b株的培养上清中检测到了被认为是AET-EPO-PAS100-b的蛋白质带(图48，列14～17)，YDK0107/pPK4_CspBss-AET-EPO-GS8株的培养上清中检测到了被认为是AET-EPO-GS8的蛋白质带(图48，列18～21)，YDK0107/pPK4_CspBss-AET-EPO-GS22株的培养上清中检测到了被认为是AET-EPO-GS22的蛋白质带(图48，列22～25)。
实施例31：EPO-PAS二聚体肽接头改变体的分子量分析
对于实施例30中的培养后的、EPO-PAS二聚体肽接头改变体的菌体过滤液，使用LC-MS(Waters,LC-MS(Waters,ACQUITY UPLC/SQD2)进行了分子量的测定。分析条件如表2所述。如图49～54所示，得到了与在分子内形成有2个二硫键的氧化型的各二聚体肽的分子量的理论值基本相同的值。从这一点来看，确认了能够表达包含2个二硫键的正确的氨基酸序列的肽。
实施例32：EPO-PAS二聚体肽接头改变体的活性评价
EPO-PAS二聚体肽接头改变体的EpoR活化能力使用PathHunter(注册商标)eXpress EpoR-JAK2 Functional Assay Kit(DiscoverX公司)进行了评价。
向96孔板中接种PathHunter(注册商标)eXpress EpoR-JAK2 Functional AssayKit中包含的EPO活性评价用细胞，在37℃、5％CO2下进行了24小时培养。对于细胞，添加了包含稀释至给定浓度的AET-EPO-PAS8、AET-EPO-GS8、AET-EPO-PAS22、或AET-EPO-GS22的培养上清(培养如实施例20或30所述)。作为阴性对照，将除了使用了不包含EPO-PAS二聚体肽表达用基因的载体之外，进行了如实施例30所述的培养而得到的培养上清(图48，列26)，以与包含AET-EPO-PAS8或AET-EPO-PAS22的培养上清同样的倍率进行稀释而进行了添加。对于在室温下进行了3小时刺激的细胞，添加制备的底物试剂，孵育60分钟。使用Nivo读板器(Perkin Elmer公司)定量了化学发光强度。
如图55～57所示，可以看出所有的二聚体肽都浓度依赖性地使EpoR活化。各构建体(construct)的EC50值如下述表6所示，AET-EPO-PAS8显示比AET-EPO-GS8更高的活性，可以看出AET-EPO-PAS22具有比AET-EPO-GS22更高的活性。需要说明的是，rhEPO、AET-EPO-PAS8和AET-EPO-PAS22的EC50值为实施例22中的值。此外，可以看出AET-EPO-PAS100的活性比AET-EPO-PAS49、AET-EPO-PAS22、AET-EPO-PAS8低。从这一点可以看出，通过使用PAS接头，与使用GS接头相比，能够开发出具有更高的活性的二聚体肽，通过使用49个氨基酸以下的PAS接头，能够开发出具有更高激动剂活性的二聚体肽。
[表6]
| 肽 | EC50(g/L) |
| rhEPO | 1.1x10<sup>-6</sup> |
| AET-EPO-PAS8 | 1.9x10<sup>-7</sup> |
| AET-EPO-GS8 | 5.3x10<sup>-7</sup> |
| AET-EPO-PAS22 | 3.4x10<sup>-7</sup> |
| AET-EPO-GS22 | 1.3x10<sup>-6</sup> |
| AET-EPO-PAS49 | 4.3x10<sup>-6</sup> |
| AET-EPO-PAS100 | 6.6x10<sup>-6</sup> |
实施例33：稳定化EPO-PAS二聚体肽的设计和其在谷氨酸棒杆菌中的分泌表达
(33-1)设计的概要
提高了稳定性的EPO-PAS肽是如下设计的。作为提高肽、蛋白质的稳定性的手法，报告了添加长链的PAS序列的方法(日本特表2013-531480以及日本特表2010-531139)。作为提高了稳定性的EPO-PAS肽，设计了使包含200个氨基酸的PAS序列(PAS200)或包含600个氨基酸的PAS序列(PAS600)结合至AET-EPO-PAS22的C末端而得到的肽。即设计了为“第一促红细胞生成素受体结合环状肽”-“PAS接头”-“第二促红细胞生成素受体结合环状肽”-“长链PAS序列(PAS200或PAS600)”的肽序列。
(33-2)稳定化EPO-PAS二聚体肽的制备
制备的稳定化EPO-PAS二聚体肽如下。
(D)AET-EPO-PAS22-PAS200
AETGGLYACHMGPMTWVCQPLRGAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPGGLYACHMGPMTWVCQPLRGAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAP(序列编号：144)
(E)AET-EPO-PAS22-PAS600
AETGGLYACHMGPMTWVCQPLRGAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPGGLYACHMGPMTWVCQPLRGAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAP(序列编号：145)
(33-3)稳定化EPO-PAS二聚体肽的表达
使用Corynex(注册商标)进行了稳定化EPO-PAS二聚体肽的表达探讨。以下，记载了基于Corynex(注册商标)的表达探讨的实施例。
(33-4)利用了CspB信号序列的AET-EPO-PAS22-PAS200分泌表达质粒的构建
作为稳定化EPO-PAS二聚体肽，设计了所述(D)AET-EPO-PAS22-PAS200(以下，也表示为“AET-EPO-PAS22-PAS200”)和(E)AET-EPO-PAS22-PAS600(以下，也表示为“AET-EPO-PAS22-PAS600”)的氨基酸序列，考虑谷氨酸棒杆菌的密码子使用频率而设计了编码这些蛋白质的碱基序列。并且，以使得能够进行基于谷氨酸棒杆菌的分泌表达的方式，设计了以下的表达盒。
AET-EPO-PAS22-PAS200以来源于谷氨酸棒杆菌ATCC13869株的CspB的信号肽30氨基酸残基与AET-EPO-PAS22-PAS200的融合蛋白(以下，表示为“CspBss-AET-EPO-PAS22-PAS200”)的形式而分泌表达。编码设计的CspBss-AET-EPO-PAS22-PAS200的碱基序列和氨基酸序列分别示于序列编号146、147。
编码CspBss-AET-EPO-PAS22-PAS200的碱基序列
atgttcaacaaccgtattcgtaccgctgccctggccggcgccattgccatctccaccgctgcgtccggcgtcgccattcctgcgttcgcagccgaaaccggcggcctgtacgcatgccacatgggtccaatgacctgggtgtgccagccactgcgcggcgctgcaccagctgctccagcaccagcagccccagctgcaccagcaccagctgctccagctgcaccaggcggcctgtacgcttgtcatatgggtccaatgacttgggtctgccagccactccgcggcgctgcaccagcagctcctgctccagcagcacctgcagcaccagcaccagcagctccagcagcacctgccccagcagctcctgcagctcctgccccagcagcacctgccgctcctgctcctgcagctccagcagcacccgccccagcagctcccgcagctcctgcgccagcagcacctgccgcccctgctcccgcagctccagcagcaccggcacccgcagctccagcagctcctgcacctgcagcacctgccgctcccgctccggcagctccagcagcaccagcccctgcagctcctgctgcacctgctccagcagcacccgcggctcctgctccggctgctccagcagcccctgctccagcagctcccgctgcacctgcaccagcagcacctgccgcgcctgctcctgctgcccctgctgctcctgctcctgcagcccctgctgcacccgctccagcagcacctgcggctcctgctccggccgcccctgctgctccagcaccagctgcccctgcagcccctgcccctgcagccccagctgcaccagcaccagcagcaccagcagcacccgcaccagcagccccagcagccccagccccttag(序列编号：146)
CspBss-AET-EPO-PAS22-PAS200的氨基酸序列
MFNNRIRTAALAGAIAISTAASGVAIPAFAAETGGLYACHMGPMTWVCQPLRGAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPGGLYACHMGPMTWVCQPLRGAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAP(序列编号：147)
AET-EPO-PAS22-PAS600以来源于谷氨酸棒杆菌ATCC13869株的CspB的信号肽30氨基酸残基与AET-EPO-PAS22-PAS600的融合蛋白(以下，表示为“CspBss-AET-EPO-PAS22-PAS600”)的形式而分泌表达。编码设计的CspBss-AET-EPO-PAS22-PAS600的碱基序列和氨基酸序列分别示于序列编号148、149。
编码CspBss-AET-EPO-PAS22-PAS600的碱基序列
atgtttaacaaccgtattcgtaccgctgccctcgctggtgccattgccatctctaccgctgcgtccggcgtcgctattcctgcctttgcagccgaaaccggcggcctgtacgcatgccacatgggtccaatgacctgggtgtgccagccactccgcggcgctgcaccagcagctccagcaccagcagccccagctgcaccagctccagctgctccagctgcaccaggcggcctgtacgcttgtcatatgggtccaatgacttgggtctgtcaacctctgcgcggcgctgctcctgcagctccagctccagcagcaccagctgcaccagcccctgctgcaccagcagcaccagcaccagcagcaccagctgcccctgcccctgctgccccagctgcaccagcccccgctgcccctgccgctcctgctcctgcagcaccagctgcccccgcccctgctgctcctgcagcccctgctcccgctgcccctgccgcccccgcccctgcagcaccagctgcgcctgcccccgctgcgccagctgcaccagccccggctgcccctgccgctcccgcccccgcagcaccagctgccccggccccggctgcgcctgctgcaccagctcctgctgcccctgccgctccggccccggcagcaccagctgccccagcacctgctgcaccagctgcaccagcgcctgctgcccctgccgccccggcccccgcagctcctgctgcccccgcacctgccgcaccagctgcaccagcacctgctgctcccgccgctcctgctcccgcagcaccagctgcgcccgccccggctgcgcccgcagcccctgctcccgccgcacctgctgctcccgcgcctgcagcaccagctgctcctgcacctgctgctcctgccgctccagctcctgctgccccggccgctcctgctccggcagcaccagctgcgccggcccccgctgcccccgcagcccctgctccggctgcccctgccgcccctgctccagcagctcctgctgccccagcacctgccgctcctgcagctcctgctccagctgcccctgccgctccagccccagcagcaccagctgcgccagcacctgccgctcccgcagctcctgctccagccgcacctgctgctccggcgcccgcagcaccagctgctcccgcacctgcggctccagcagcccctgcccctgctgcgcctgccgctcctgctccagcagctcccgctgcacctgccccggccgctccagctgcaccagccccagctgctccagccgctcccgctccggcagctcctgctgctcccgctccggctgctcctgccgcaccagctcctgcagctccagcagcccccgctccggcagctcccgctgctcccgctccagccgctcctgcagccccagcaccagctgctccagccgcccccgctccggcagcccctgctgctcccgctcccgctgctcctgcggcaccagctcccgcagctccagcagccccggctccggcagctccggctgctcccgctcccgccgctcccgcagcccctgctccagctgctccagccgcgcccgctccagcagctccagctgcacctgctccggccgcccctgccgctccagctccggcagctccagcagccccagcgcctgcagctcctgctgctccggctccagccgctcccgcagcccccgctccagctgctccagcggctcccgctccagcagcccccgccgcacctgctccagccgctccggcagccccagctccagccgctccagccgctccagcgcctgcagctccagcggctcccgccccagccgctcctgcagcgccagctccagcggctcctgccgctcctgcccctgcagctccagcagcgcccgctccagccgccccggcagctcctgctcctgctgctccagccgctccagcacctgcagctccagcagctcctgccccagccgctcccgcagcgccagctccagcagcgccggctgcaccggcccctgcagcaccagccgctcccgctcccgctgctcccgccgcccccgcacccgccgcccccgctgctcccgctccctaa(序列编号：148)
CspBss-AET-EPO-PAS22-PAS600的氨基酸序列
MFNNRIRTAALAGAIAISTAASGVAIPAFAAETGGLYACHMGPMTWVCQPLRGAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPGGLYACHMGPMTWVCQPLRGAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAP(序列编号：149)
在CspBss-AET-EPO-PAS22-PAS200和CspBss-AET-EPO-PAS22-PAS600所述的碱基序列的上游连接来源于谷氨酸棒杆菌ATCC13869株的cspB基因的启动子，并在5’-侧添加KpnI位点，在3’-侧添加BamHI位点，设计各稳定化EPO-PAS二聚体肽的表达盒，进行了全合成。通过将全合成得到的DNA片段(稳定化EPO-PAS二聚体肽的表达盒)插入日本特开平9-322774所述的pPK4的KpnI-BamHI部分，分别构建了作为利用了CspB信号序列的各稳定化EPO-PAS二聚体肽的分泌表达质粒的pPK4_CspBss-AET-EPO-PAS22-PAS200和pPK4_CspBss-AET-EPO-PAS22-PAS600。对插入片段的碱基序列进行了确定的结果，确认构建了如同所设计的稳定化EPO-PAS二聚体肽的表达盒。碱基序列的确定使用BigDye(注册商标)Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems)和3500xL GeneticAnalyzer(Applied Biosystems)进行。
(33-5)谷氨酸棒杆菌中的稳定化EPO-PAS二聚体肽的分泌表达
使用所述构建得到的pPK4_CspBss-AET-EPO-PAS22-PAS200和pPK4_CspBss-AET-EPO-PAS22-PAS600，转化WO2016/171224所述的谷氨酸棒杆菌YDK0107株，得到了YDK0107/pPK4_CspBss-AET-EPO-PAS22-PAS200株和YDK0107/pPK4_CspBss-AET-EPO-PAS22-PAS600株。
将得到的各转化体，用包含25mg/L的卡那霉素的MMTG液体培养基(葡萄糖120g，硫酸镁七水合物3g，硫酸铵30g，磷酸二氢钾1.5g，硫酸铁七水合物0.03g，硫酸锰五水合物0.03g，硫胺素盐酸盐0.45mg，生物素0.45mg，DL-蛋氨酸0.15g，大豆盐酸水解液(总氮量0.2g)，碳酸钙50g，用水调节至1L，调节至pH7.0)分别在30℃下，培养72小时。
培养结束后，使用NuPAGE(注册商标)4-12％Bis-Tirs Gel(Thermo FisherScientific)，将各培养液离心分离得到的培养上清6.5μL供至还原SDS-PAGE后，用Quick-CBB(Wako)进行了染色。其结果，YDK0107/pPK4_CspBss-AET-EPO-PAS22-PAS200株的培养上清中检测到了被认为是AET-EPO-PAS22-PAS200的蛋白质带(图58，列2～5)，YDK0107/pPK4_CspBss-AET-EPO-PAS22-PAS600株的培养上清中检测到了被认为是AET-EPO-PAS22-PAS600的蛋白质带(图58，列6～9)。
实施例34：稳定化EPO-PAS二聚体肽的分子量分析
对于实施例33中的培养后的、各稳定化EPO-PAS二聚体肽的菌体过滤液，使用LC-MS(Waters,LC-MS(Waters,ACQUITY UPLC/SQD2)进行了分子量的测定。分析条件如表2所述。如图59以及60所示，得到了与在分子内形成有2个二硫键的氧化型的各二聚体肽的分子量的理论值基本相同的值。从这一点来看，确认了能够表达包含2个二硫键的正确的氨基酸序列的肽。
实施例35：稳定化EPO-PAS二聚体肽的活性评价
稳定化EPO-PAS二聚体肽的EpoR活化能力使用PathHunter(注册商标)eXpressEpoR-JAK2 Functional Assay Kit(DiscoverX公司)进行了评价。
向96孔板中接种PathHunter(注册商标)eXpress EpoR-JAK2 Functional AssayKit中包含的EPO活性评价用细胞，在37℃、5％CO2下进行了24小时培养。对于细胞，添加了包含14.2μg/L～220pg/L的AET-EPO-PAS22、AET-EPO-PAS22-PAS200或AET-EPO-PAS22-PAS600的培养上清(培养如实施例20或33所述)。作为阴性对照，将除了使用了不包含EPO-PAS二聚体肽表达用基因的载体之外，进行了如实施例33所述的培养而得到的培养上清(图58，列20)，以与包含AET-EPO-PAS22、AET-EPO-PAS22-PAS200或AET-EPO-PAS22-PAS600的培养上清同样的倍率进行稀释而进行了添加。对于在室温下进行了3小时刺激的细胞，添加制备的底物试剂，孵育60分钟。使用Nivo读板器(Perkin Elmer公司)定量了化学发光强度。
如图61所示，可以看出，AET-EPO-PAS22、AET-EPO-PAS22-PAS200和AET-EPO-PAS22-PAS600浓度依赖性地使EpoR活化。此外，EC50值如下述表7地计算，可以看出，即使对C末端进行稳定化修饰，EPO-PAS二聚体肽的激动剂能力也不降低。需要说明的是，AET-EPO-PAS22的EC50值为实施例22中的值。
[表7]
| 肽 | EC50(g/L) |
| AET-EPO-PAS22 | 3.4x10<sup>-7</sup> |
| AET-EPO-PAS22-PAS200 | 8.5x10<sup>-7</sup> |
| AET-EPO-PAS22-PAS600 | 3.2x10<sup>-7</sup> |
实施例36：二聚体肽的无细胞表达
(36-1)无细胞表达用二聚体肽的基因构建体构建
作为进行无细胞表达的二聚体肽，设计了以下的肽。
(F)MAET-aMD4dY-PAS22
MAETCRQFNRRTHEVWNLDCGAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPGCRQFNRRTHEVWNLDC(序列编号：150)
(G)MAET-aMD4dY-PAS8
MAETCRQFNRRTHEVWNLDCGAAPAAPAPGCRQFNRRTHEVWNLDC(序列编号：151)
(H)MAET-aMD4-PAS22
MAETCYRQFNRRTHEVWNLDCGAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPGCRQFNRRTHEVWNLDC(序列编号：152)
(I)MAET-EPO-PAS8
MAETGGLYACHMGPMTWVCQPLRGAAPAAPAPGGLYACHMGPMTWVCQPLRG(序列编号：153)
(J)MAET-EPO-PAS49-b
MAETGGLYACHMGPMTWVCQPLRGSAPSPSSAPASASAPASPASASASASPASSPASASSASPAASSASPASSGGLYACHMGPMTWVCQPLRG(序列编号：154)
(K)MAET-EPO-PAS100-b
MAETGGLYACHMGPMTWVCQPLRGSAPSPSSAPASASAPASPASASASASPASSPASASSASPAASSASPASSSASPSAPAAPSASAAPSASPASSSPAPASAPSPAAAASSPSPAPSSASSAAGGLYACHMGPMTWVCQPLRG(序列编号：155)
(L)MAET-VEGFR_D2-PAS16
MAETAGPTWCEDDWYYCWLFGTAAPAAPAPAAPAAPAPVCWEDSWGGEVCWLFGT(序列编号：156)
(M)MAET-VEGFR_D2-PAS49-b
MAETAGPTWCEDDWYYCWLFGTSAPSPSSAPASASAPASPASASASASPASSPASASSASPAASSASPASSVCWEDSWGGEVCWLFGT(序列编号：157)
(N)MAET-VEGFR_D2-PAS100-b
MAETAGPTWCEDDWYYCWLFGTSAPSPSSAPASASAPASPASASASASPASSPASASSASPAASSASPASSSASPSAPAAPSASAAPSASPASSSPAPASAPSPAAAASSPSPAPSSASSAAVCWEDSWGGEVCWLFGT(序列编号：158)
(O)MAET-VEGFR_D2-GS16
MAETAGPTWCEDDWYYCWLFGTGGGGSGGGGSGGGGSGVCWEDSWGGEVCWLFGT(序列编号：159)
设计了编码所述二聚体肽的氨基酸序列的碱基序列。并且，在它们的5’侧添加了无细胞表达所需要的T7启动子序列和核糖体结合序列，在3’侧添加了终始密码子和非翻译区域。对应的无细胞表达用碱基序列分别如下所示。这些DNA序列在Eurofin Genomics株式会社进行了全合成和克隆至pEX-K4J2载体中的工序。
编码MAET-aMD4dY-PAS22的碱基序列
gaaattaatacgactcactatagggagaccacaacggtttccctctagaaataattttgtttaactttaagaaggagatataccaatgcagagacctgtcgtcagtttaaccgtcgtacgcacgaagtttggaatctggactgtggcgcagcccccgcagcaccagctccagcagcacccgcagctccagcaccagcagcccctgcagccccaggctgccgccaattcaatcgccgcacccatgaagtgtggaacttagattgctagtgaataactaatcc(序列编号：160)
编码MAET-aMD4dY-PAS8的碱基序列
gaaattaatacgactcactatagggagaccacaacggtttccctctagaaataattttgtttaactttaagaaggagatataccaatggcagagacctgtcgtcagtttaaccgtcgtacgcacgaagtttggaatctggactgtggcgcagcacccgcagctccagcaccaggctgccgccaattcaatcgccgcacccatgaagtgtggaacttagattgctagtgaataactaatcc(序列编号：161)
编码MAET-aMD4-PAS22的碱基序列
gaaattaatacgactcactatagggagaccacaacggtttccctctagaaataattttgtttaactttaagaaggagatataccaatggcagagacctgttatcgtcagtttaaccgtcgtacgcacgaagtttggaatctggactgtggcgcagcccccgcagcaccagctccagcagcacccgcagctccagcaccagcagcccctgcagccccaggctgctatcgccaattcaatcgccgcacccatgaagtgtggaacttagattgctagtgaataactaatcc(序列编号：162)
编码MAET-EPO-PAS8的碱基序列
gaaattaatacgactcactatagggagaccacaacggtttccctctagaaataattttgtttaactttaagaaggagatataccaatggcagaaactggtggtttatacgcctgtcacatgggcccgatgacttgggtttgccagccattgcgtggcgcagcacccgcagctccagcaccaggtggcctgtatgcgtgccatatggggccaatgacctgggtgtgtcagccgttacgcggctagtgaataactaatcc(序列编号：163)
编码MAET-EPO-PAS49-b的碱基序列
gaaattaatacgactcactatagggagaccacaacggtttccctctagaaataattttgtttaactttaagaaggagatataccaatggcagaaactggtggtttatacgcctgtcacatgggcccgatgacttgggtttgccagccattgcgtggctctgctccatcaccttcttccgcaccagcatcagcttctgcaccagcgtcgcctgcttctgcatctgcgtctgcttcaccagcatcctcacctgcatcagcatcgtctgcttctccagcagcttcctcagcttcacctgcttcgtctggtggcctgtatgcgtgccatatggggccaatgacctgggtgtgtcagccgttacgcggctagtgaataactaatcc(序列编号：164)
编码MAET-EPO-PAS100-b的碱基序列
gaaattaatacgactcactatagggagaccacaacggtttccctctagaaataattttgtttaactttaagaaggagatataccaatggcagaaactggtggtttatacgcctgtcacatgggcccgatgacttgggtttgccagccattgcgtggctctgctccatcaccttcttccgcaccagcatcagcttctgcaccagcgtcgcctgcttctgcatctgcgtctgcttcaccagcatcctcacctgcatcagcatcgtctgcttctccagcagcttcctcagcttcacctgcttcgtcttccgcatccccatctgctccagcagcaccttcagcttctgcagctccatctgcttcacctgcctcatcgtctccagcacctgcgtcagctccatcccctgcagcagcggcttcatcgccatctccagcaccttcttcagcgtcatccgctgcaggtggcctgtatgcgtgccatatggggccaatgacctgggtgtgtcagccgttacgcggctagtgaataactaatcc(序列编号：165)
编码MAET-VEGFR_D2-PAS16的碱基序列
gaaattaatacgactcactatagggagaccacaacggtttccctctagaaataattttgtttaactttaagaaggagatataccaatggcggaaaccgcgggtcccacgtggtgtgaggatgactggtactattgctggttattcgggactgcggcccctgctgccccggctccggcagcaccggccgcaccagcgccggtttgctgggaagatagctggggtggcgaagtgtgttggctgtttggcacctagtgaataactaatcc(序列编号：166)
编码MAET-VEGFR_D2-PAS49-b的碱基序列
gaaattaatacgactcactatagggagaccacaacggtttccctctagaaataattttgtttaactttaagaaggagatataccaatggcggaaaccgcgggtcccacgtggtgtgaggatgactggtactattgctggttattcgggacttctgctccatcaccttcttccgcaccagcatcagcttctgcaccagcgtcgcctgcttctgcatctgcgtctgcttcaccagcatcctcacctgcatcagcatcgtctgcttctccagcagcttcctcagcttcacctgcttcgtctgtttgctgggaagatagctggggtggcgaagtgtgttggctgtttggcacctagtgaataactaatcc(序列编号：167)
编码MAET-VEGFR_D2-PAS100-b的碱基序列
gaaattaatacgactcactatagggagaccacaacggtttccctctagaaataattttgtttaactttaagaaggagatataccaatggcagaaactggtggtttatacgcctgtcacatgggcccgatgacttgggtttgccagccattgcgtggctctgctccatcaccttcttccgcaccagcatcagcttctgcaccagcgtcgcctgcttctgcatctgcgtctgcttcaccagcatcctcacctgcatcagcatcgtctgcttctccagcagcttcctcagcttcacctgcttcgtcttccgcatccccatctgctccagcagcaccttcagcttctgcagctccatctgcttcacctgcctcatcgtctccagcacctgcgtcagctccatcccctgcagcagcggcttcatcgccatctccagcaccttcttcagcgtcatccgctgcaggtggcctgtatgcgtgccatatggggccaatgacctgggtgtgtcagccgttacgcggctagtgaataactaatcc(序列编号：168)
编码MAET-VEGFR_D2-GS16的碱基序列
gaaattaatacgactcactatagggagaccacaacggtttccctctagaaataattttgtttaactttaagaaggagatataccaatggcggaaaccgcgggtcccacgtggtgtgaggatgactggtactattgctggttattcgggactggtagcggtagcggcagcggcagcggtagtggtagtggcagcggcagcgtttgctgggaagatagctggggtggcgaagtgtgttggctgtttggcacctagtgaataactaatcc(序列编号：169)
(36-2)二聚体肽的无细胞表达
通过PCR扩增了所述构建得到的二聚体肽的基因。PCR使用以下所示的序列的引物和作为PCR酶的KOD-Plus-Ver.2(东洋纺)进行。
Cell-free primer Fwd：
gaaattaatacgactcactataggg(序列编号：170)
Cell-free primer Rev：
cactgactggattagttattcac(序列编号：171)
接下来，基于通过PCR进行了扩增的基因片段，通过无细胞表达系表达了肽二聚体。无细胞表达使用了PUREfrex2.0(GeneFrontier)。
在用PUREfrex2.0进行无细胞表达的情况下，对于以2nM的PCR进行了扩增的基因片段，添加10μL的溶液I、1μL的溶液II、2μL的溶液III、7μL的水，通过在37℃下孵育6小时而进行了翻译反应。
(36-3)无细胞表达二聚体肽的分子量分析
将用无细胞表达系表达了HGF-PAS二聚体肽(MAET-aMD4-PAS22,MAET-aMD4dY-PAS8,MAET-aMD4dY-PAS22)、EPO-PAS二聚体肽(MAET-EPO-PAS8,MAET-EPO-PAS49-b、MAET-EPO-PAS100-b)、VEGFR_D2-PAS二聚体肽(MAET-VEGFR_D2-PAS16)的溶液与α-氰基-4-羟基肉桂酸(α-Cyano-4-hydroxycinnamic Acid，CHCA)混合，用MALDI-TOF-MS(Shimadzu,AXIMATOF2)进行了分子量的测定。
如图62～68所示，就HGF-PAS二聚体肽而言，得到了与形成了2个二硫键、N末端被甲酰化了的分子量接近的值，就EPO-PAS二聚体肽和VEGFR_D2-PAS二聚体肽而言，得到了形成了2个二硫键、N末端被甲酰化了的分子量和N末端未脱甲酰化的分子量这两者，分别确认了能够表达包含2个二硫键的二聚体肽。
实施例37：无细胞表达HGF-PAS二聚体肽的活性评价
通过萤光素酶测定评价了无细胞表达HGF-PAS二聚体肽的Met活化能力。对于Opti-MEM培养基(Thermo Fisher Scientific公司)25μL，添加0.6μL的AttracteneTransfection Reagent(QIAGEN公司)，在室温下进行了5分钟的孵育。对于所述混合溶液，添加Opti-MEM 25μL和1μL的SRE reporter vector(QIAGEN公司)的混合溶液，在室温下进行了20分钟的孵育。将该混合溶液添加至96孔板，从其上方接种40000cell/well的HEK293E细胞，在37℃、5％CO2孵育器内进行了过夜孵育。转染后，将培养上清全部除去，添加包含0.5％FBS(Thermo Fisher Scientific公司)、1％非必须氨基酸溶液(Thermo FisherScientific公司)和青霉素-链霉素(Nacalai Tesque公司)的Opti-MEM培养基(评价基础培养基)100μL，在37℃下培养4小时，由此，使细胞为饥饿状态。
向评价基础培养基中，加入0-100ng/mL的HGF，或以相对于该培养基稀释为给定的倍率的方式添加翻译了AET-aMD4dY-PAS22的无细胞翻译液，或以同样的倍率稀释的方式添加未翻译肽的无细胞翻译液，向细胞中添加该评价基础培养基100μL。在37℃、5％CO2孵育器内进行过夜培养，由此进行了对细胞的刺激。
信号强度的检测使用了双萤光素酶报告基因系统(Promega公司)。将100μL的培养基上清除去，添加Glo试剂50μL，在室温下溶解细胞10分钟。通过用读板器检测从细胞的溶解液中发出的萤火虫萤光素酶的发光，对HGF-Erk-SRE通路的活化进行了定量。接下来，添加50μL的Glo&Stop reagent溶液，10分钟后检测作为内部标准的肾荧光素酶的发光，进行了细胞数的定量。以SRE活性＝(萤火虫萤光素酶的发光强度)/(肾荧光素酶的发光强度)的形式，对各样品的信号活性进行了定量。求出相对于未添加评价化合物的样品的相对信号活性值，以作为相对受体活性(Relative reporter activity)。
如图69所示，可以看出无细胞翻译MAET-aMD4dY-PAS22、MAET-aMD4dY-PAS8、MAET-aMD4-PAS22具有Met活化能力。
实施例38：无细胞表达EPO-PAS二聚体肽的活性评价
EPO-PAS二聚体肽接头改变体的EpoR活化能力使用PathHunter(注册商标)eXpress EpoR-JAK2 Functional Assay Kit(DiscoverX公司)进行了评价。
向96孔板中接种PathHunter(注册商标)eXpress EpoR-JAK2 Functional AssayKit中包含的EPO活性评价用细胞，在37℃、5％CO2下进行了24小时培养。对于细胞，添加了稀释至给定浓度的翻译了AET-EPO-PAS8、AET-EPO-PAS49-b、或AET-EPO-PAS100-b的无细胞翻译液。作为阴性对照，将未翻译肽的无细胞翻译液以与翻译了AET-EPO-PAS8、AET-EPO-PAS49、或AET-EPO-PAS100的无细胞翻译液同样的倍率进行稀释而进行了添加。对于在室温下进行了3小时刺激的细胞，添加制备的底物试剂，孵育60分钟。使用Nivo读板器(PerkinElmer公司)定量了化学发光强度。
如图70所示，可以看出，所有的二聚体肽都浓度依赖性地使EpoR活化。此外，MAET-EPO-PAS8和MAET-EPO-PAS49-b表现出了比MAET-EPO-PAS100-b更高的活性。从这一点可以看出，通过使用49个氨基酸以下的短链PAS接头，能够构建具有更高的活性的二聚体肽。
实施例39：无细胞表达VEGFR_D2-PAS异二聚体的活性评价
通过萤光素酶测定评价了无细胞表达的VEGFR_D2-PAS异二聚体肽的VEGF抑制能力。接种40000cell/well的VEGFR/NFAT Reporter HEK293细胞(BPS Bioscience公司)，在37℃、5％CO2孵育器内进行了过夜孵育。在分析培养基(MEM培养基(Nacalai Tesque公司)、1x MEM非必需氨基酸溶液(Thermo Fisher Scientific公司)、1mM丙酮酸钠(NacalaiTesque公司)、1％青霉素-链霉素(Sigma Aldrich公司)、0.3％FBS(Thermo FisherScientific公司))中孵育细胞过夜，使其为饥饿状态。向分析培养基中，添加10ng/mL的人类重组VEGF(R&D Systems)100μL，并以给定的稀释倍率添加包含MAET-VEGFR_D2-PAS16、MAET-VEGFR_D2-PAS49-b、MAET-VEGFR_D2-PAS100-b、或MAET-VEGFR_D2-GS16的无细胞表达液、或未表达肽的无细胞表达液，向细胞中添加该分析培养基100μL。在37℃、5％CO2孵育器内培养4小时，由此进行了对细胞的刺激。
信号强度的检测使用了One-Glo Luciferase Assay System(Promega公司)。将50μL的培养基上清除去，添加One-Glo试剂50μL，在室温下溶解细胞10分钟。通过用Nivo读板器(Perkin Elmer公司)检测从细胞的溶解液中发出的发光来对VEGFR-NFAT通路的活化进行定量，求出相对于未添加评价化合物的样品的相对信号活性值，以作为相对受体活性(Relative reporter activity)。
如图71以及72所示，从MAET-VEGFR_D2-PAS16、MAET-VEGFR_D2-PAS49-b表现出比MAET-VEGFR_D2-PAS100-b更高的抑制活性这一点可以看出，通过使用49个氨基酸以下的短链PAS接头，能够构建具有更高活性的二聚体肽。此外，从MAET-VEGFR_D2-PAS16表现出比MAET-VEGFR_D2-GS16更高的抑制活性这一点可以看出，通过使用PAS接头，与GS接头相比，能够构建具有更高活性的二聚体肽。
实施例40：HGF-PAS三聚体肽的设计和其在谷氨酸棒杆菌中的分泌表达
(40-1)设计的概要
HGF-PAS三聚体肽是如下设计的。设计了介由PAS接头进一步使aMD4dY序列结合至所述AET-aMD4dY-PAS22的C末端而得到的肽。即设计了为“第一aMD4dY环状肽”-“PAS接头”-“第二aMD4dY环状肽”-“PAS接头”-“第三的aMD4dY环状肽”的肽序列。
(40-2)HGF-PAS三聚体肽的制备
制备的HGF-PAS三聚体肽如下。
(P)AET-aMD4dY-PAS22-Trimer
AETCRQFNRRTHEVWNLDCGAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPGCRQFNRRTHEVWNLDCGAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPGCRQFNRRTHEVWNLDC(序列编号：172)
(40-3)HGF-PAS三聚体肽的表达
使用Corynex(注册商标)进行了稳定化HGF-PAS三聚体肽的表达探讨。以下，记载了基于Corynex(注册商标)的表达探讨的实施例。
(40-4)利用了CspB信号序列的AET-aMD4dY-PAS22-Trimer分泌表达质粒的构建
作为稳定化HGF-PAS二聚体肽，设计了所述(P)AET-aMD4dY-PAS22-Trimer的氨基酸序列，考虑谷氨酸棒杆菌的密码子使用频率而设计了编码该蛋白质的碱基序列。并且，以使得能够进行基于谷氨酸棒杆菌的分泌表达的方式，设计了以下的表达盒。
AET-aMD4dY-PAS22-Trimer以来源于谷氨酸棒杆菌ATCC13869株的CspB的信号肽30氨基酸残基与AET-aMD4dY-PAS22-Trimer的融合蛋白(以下，表示为“CspBss-AET-aMD4dY-PAS22-Trimer”)的形式而分泌表达。编码设计的CspBss-AET-aMD4dY-PAS22-Trimer的碱基序列和氨基酸序列分别示于序列编号173、174。
编码CspBss-AET-aMD4dY-PAS22-Trimer的碱基序列
atgtttaacaaccgtatccgcactgcagctctcgctggtgcaatcgcaatctccaccgcagcttccggcgtagctatcccagcattcgctgcagagacctgccgccagttcaatcgccggacccacgaagtctggaatctggattgcggcgcagctcctgccgccccagcaccggctgcgccagctgctccagcgccggctgcccctgcggcaccgggttgccgtcagtttaaccgccgtactcacgaggtttggaaccttgactgtggagcggctcccgcagcaccagccccagccgcccctgctgcacccgcaccagcggcacccgccgctcctggctgtcgccaattcaaccgacgcacccatgaagtgtggaacctcgattgctaa(序列编号：173)
CspBss-AET-aMD4dY-PAS22-Trimer的氨基酸序列
MFNNRIRTAALAGAIAISTAASGVAIPAFAAETCRQFNRRTHEVWNLDCGAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPGCRQFNRRTHEVWNLDCGAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPGCRQFNRRTHEVWNLDC(序列编号：174)
在CspBss-AET-aMD4dY-PAS22-Trimer所述的碱基序列的上游连接来源于谷氨酸棒杆菌ATCC13869株的cspB基因的启动子，并在5’-侧添加KpnI位点，在3’-侧添加BamHI位点，设计HGF-PAS三聚体肽的表达盒，进行了全合成。通过将全合成得到的DNA片段(HGF-PAS三聚体肽的表达盒)插入日本特开平9-322774所述的pPK4的KpnI-BamHI部分，构建了作为利用了CspB信号序列的HGF-PAS三聚体肽的分泌表达质粒的pPK4_CspBss-AET-aMD4dY-PAS22-Trimer。对插入片段的碱基序列进行了确定的结果，确认构建了如同所设计的HGF-PAS三聚体肽的表达盒。碱基序列的确定使用BigDye(注册商标)Terminator v3.1 CycleSequencing Kit(Applied Biosystems)和3500xL Genetic Analyzer(AppliedBiosystems)进行。
(40-5)谷氨酸棒杆菌中的HGF-PAS三聚体肽的分泌表达
使用所述构建得到的pPK4_CspBss-AET-aMD4dY-PAS22-Trimer转化WO2016/171224所述的谷氨酸棒杆菌YDK010::phoS(W302C)株，得到了YDK010::phoS(W302C)/pPK4_CspBss-AET-aMD4dY-PAS22-Trimer株。
将得到的转化体在用包含25mg/L的卡那霉素的MMTG液体培养基(葡萄糖120g，硫酸镁七水合物3g，硫酸铵30g，磷酸二氢钾1.5g，硫酸铁七水合物0.03g，硫酸锰五水合物0.03g，硫胺素盐酸盐0.45mg，生物素0.45mg，DL-蛋氨酸0.15g，大豆盐酸水解液(总氮量0.2g)，碳酸钙50g，用水调节至1L，调节至pH7.0)分别在30℃下，培养72小时。
培养结束后，将各培养液离心分离，用NuPAGE(注册商标)12％Bis-Tirs Gel(Thermo Fisher Scientific)将得到的培养上清6.5μL供至还原SDS-PAGE后，用Quick-CBB(Wako)进行了染色。其结果，YDK010::phoS(W302C)/pPK4_CspBss-AET-aMD4dY-PAS22-Trimer株的培养上清中检测到了被认为是AET-aMD4dY-PAS22-Trimer的蛋白质带(图73，列2～5)。
此外，与所述同样地培养通过与所述同样的方法得到的YDK010::phoS(W302C)/pPK4_CspBss-AET-aMD4dY-PAS22株，其培养上清中检测到了被认为是AET-aMD4dY-PAS22的蛋白质带(图73，列6)。
实施例41：HGF-PAS三聚体肽的分子量分析
对于实施例40中的培养后的、AET-aMD4dY-PAS22-Trimer的菌体过滤液，使用LC-MS(Waters,LC-MS(Waters,ACQUITY UPLC/SQD2)进行了分子量的测定。分析条件如表2所述。如图74所示，得到了与在分子内形成了3个二硫键的氧化型的二聚体肽的分子量的理论值基本相同的值。从这一点来看，确认了能够表达包含3个二硫键的正确的氨基酸序列的肽。
实施例42：HGF-PAS三聚体肽的活性评价
通过萤光素酶测定评价了HGF-PAS三聚体肽的Met活化能力。对于Opti-MEM培养基(Thermo Fisher Scientific公司)25μL，添加0.6μL的Attractene Transfection Reagent(QIAGEN公司)，在室温下进行了5分钟的孵育。对于所述混合溶液，添加Opti-MEM 25μL和1μL的SRE reporter vector(QIAGEN公司)的混合溶液，在室温下进行了20分钟的孵育。将该混合溶液添加至96孔板，从其上方接种40000cell/well的HEK293E细胞，在37℃、5％CO2孵育器内进行了过夜孵育。转染后，将培养上清全部除去，添加包含0.5％FBS(Thermo FisherScientific公司)、1％非必须氨基酸溶液(Thermo Fisher Scientific公司)和青霉素-链霉素(Nacalai Tesque公司)的Opti-MEM培养基(评价基础培养基)100μL，在37℃下培养4小时，由此，使细胞为饥饿状态。
向评价基础培养基中，加入0-100ng/mL的HGF，或以相对于该培养基稀释为给定的倍率的方式添加包含AET-aMD4dY-PAS22或AET-aMD4dY-PAS22-Trimer的培养上清，向细胞中添加该评价基础培养基100μL。在37℃、5％CO2孵育器内进行过夜培养，由此进行了对细胞的刺激。
信号强度的检测使用了双萤光素酶报告基因系统(Promega公司)。将100μL的培养基上清除去，添加Glo试剂50μL，在室温下溶解细胞10分钟。通过用读板器检测从细胞的溶解液中发出的萤火虫萤光素酶的发光，对HGF-Erk-SRE通路的活化进行了定量。接下来，添加50μL的Glo&Stop reagent溶液，10分钟后检测作为内部标准的肾荧光素酶的发光，进行了细胞数的定量。以SRE活性＝(萤火虫萤光素酶的发光强度)/(肾荧光素酶的发光强度)的形式，对各样品的信号活性进行了定量。求出相对于未添加评价化合物的样品的相对信号活性值，以作为相对受体活性(Relative reporter activity)。
如图75所示，可以看出，HGF-PAS三聚体肽(AET-aMD4dY-PAS22-Trimer)与二聚体肽(AET-aMD4dY-PAS22)同样具有信号活化能力。
实施例43：HGF-PAS二聚体肽与单体肽的活性比较
通过萤光素酶测定对HGF-PAS二聚体肽和单体肽的Met活化能力进行了比较。对于Opti-MEM培养基(Thermo Fisher Scientific公司)25μL，添加0.6μL的AttracteneTransfection Reagent(QIAGEN公司)，在室温下进行了5分钟的孵育。对于所述混合溶液，添加Opti-MEM 25μL和1μL的SRE reporter vector(QIAGEN公司)的混合溶液，在室温下进行了20分钟的孵育。将该混合溶液添加至96孔板，从其上方接种40000cell/well的HEK293E细胞，在37℃、5％CO2孵育器内进行了过夜孵育。转染后，将培养上清全部除去，添加包含0.5％FBS(Thermo Fisher Scientific公司)、1％非必须氨基酸溶液(Thermo FisherScientific公司)和青霉素-链霉素(Nacalai Tesque公司)的Opti-MEM培养基(评价基础培养基)100μL，在37℃下培养4小时，由此，使细胞为饥饿状态。
向评价基础培养基中，加入0-100ng/mL的HGF，或以给定浓度加入AET-aMD4dY-PAS22或aMD4dY单体肽(CRQFNRRTHEVWNLDC(序列编号：2)，Genscript Japan株式会社合成)，将该培养基添加100μL至细胞。在37℃、5％CO2孵育器内进行过夜培养，由此进行了对细胞的刺激。
信号强度的检测使用了双萤光素酶报告基因系统(Promega公司)。将100μL的培养基上清除去，添加Glo试剂50μL，在室温下溶解细胞10分钟。通过用读板器检测从细胞的溶解液中发出的萤火虫萤光素酶的发光，对HGF-Erk-SRE通路的活化进行了定量。接下来，添加50μL的Glo&Stop reagent溶液，10分钟后检测作为内部标准的肾荧光素酶的发光，进行了细胞数的定量。以SRE活性＝(萤火虫萤光素酶的发光强度)/(肾荧光素酶的发光强度)的形式，对各样品的信号活性进行了定量。求出相对于未添加评价化合物的样品的相对信号活性值，以作为相对受体活性(Relative reporter activity)。
如图76所示，HGF和二聚体肽(AET-aMD4dY-PAS22)表现出信号活化能力，与之相对，单体肽(aMD4dY)未表现出信号活化能力。根据该结果，可以看出肽通过二聚体化而获得了信号活化能力。
实施例44：VEGFR_D2-PAS异二聚体肽接头改变体的设计和其在谷氨酸棒杆菌中的分泌表达
(44-1)接头改变体的设计的概要
AET-VEGFR_D2-PAS16具有以包含16个氨基酸的PAS接头使第一VEGFR结合序列(P-3)与第二VEGFR结合序列(P-4)之间结合的结构。可以预想通过改变该PAS接头的长度，VEGFR结合活性会改变。因此，设计了将PAS接头部分改变为49个氨基酸或100个氨基酸的PAS重复序列的接头改变体。
此外，作为挠性接头，除了PAS接头之外，还已知有作为甘氨酸和丝氨酸的重复序列的GS接头。因此，设计了使VEGFR结合环状肽结合至包含甘氨酸4残基和丝氨酸1残基(GGGGS)的重复序列的GS接头的N末端和C末端而得到的接头改变体，即设计了为“第一VEGFR结合序列(P-3)”-“GS接头”-“第二VEGFR结合序列(P-4)”的肽序列。即，P-3的C末端与PAS接头的N末端通过酰胺键结合，P-4的N末端与PAS接头的C末端通过酰胺键结合，可以以一条多肽链的形式表达。
(44-2)VEGFR_D2-PAS异二聚体肽接头改变体的制备
制备的VEGFR_D2-PAS异二聚体肽接头改变体如下。
(Q)AET-VEGFR_D2-PAS49
AETAGPTWCEDDWYYCWLFGTAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAVCWEDSWGGEVCWLFGT(序列编号：175)
(R)AET-VEGFR_D2-PAS49-b
AETAGPTWCEDDWYYCWLFGTSAPSPSSAPASASAPASPASASASASPASSPASASSASPAASSASPASSVCWEDSWGGEVCWLFGT(序列编号：176)
(S)AET-VEGFR_D2-PAS100
AETAGPTWCEDDWYYCWLFGTAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAVCWEDSWGGEVCWLFGT(序列编号：177)
(T)AET-VEGFR_D2-PAS100-b
AETAGPTWCEDDWYYCWLFGTSAPSPSSAPASASAPASPASASASASPASSPASASSASPAASSASPASSSASPSAPAAPSASAAPSASPASSSPAPASAPSPAAAASSPSPAPSSASSAAVCWEDSWGGEVCWLFGT(序列编号：178)
(U)AET-VEGFR_D2-GS16
AETAGPTWCEDDWYYCWLFGTGGGGSGGGGSGGGGSGVCWEDSWGGEVCWLFGT(序列编号：179)
(44-3)VEGFR_D2-PAS异二聚体肽接头改变体的表达
使用Corynex(注册商标)进行了VEGFR_D2-PAS异二聚体肽接头改变体的表达探讨。以下，记载了基于Corynex(注册商标)的表达探讨的实施例。
(44-4)利用了CspB信号序列的AET-VEGFR_D2-PAS49、AET-VEGFR_D2-PAS49-b、AET-VEGFR_D2-PAS100、AET-VEGFR_D2-PAS100-b、和AET-VEGFR_D2-GS16的各分泌表达质粒的构建
作为VEGFR_D2-PAS异二聚体肽接头改变体，分别设计了所述(Q)AET-VEGFR_D2-PAS49(以下，也表示为“AET-VEGFR_D2-PAS49”，也简单表示为“VEGFR_D2-PAS49”)、(R)AET-VEGFR_D2-PAS49-b(以下，也表示为“AET-VEGFR_D2-PAS49-b”，也简单表示为“VEGFR_D2-PAS49-b”)、(S)AET-VEGFR_D2-PAS100(以下，也表示为“AET-VEGFR_D2-PAS100”，也简单表示为“VEGFR_D2-PAS100”)、(T)AET-VEGFR_D2-PAS100-b(以下，也表示为“AET-VEGFR_D2-PAS100-b”，也简单表示为“VEGFR_D2-PAS100-b”)、和(U)AET-VEGFR_D2-GS16(以下，也表示为“AET-VEGFR_D2-GS16”，也简单表示为“VEGFR_D2-GS16”)的5种氨基酸序列，考虑谷氨酸棒杆菌的密码子使用频率而设计了编码这些蛋白质的碱基序列。并且，以使得能够进行基于谷氨酸棒杆菌的分泌表达的方式，分别设计了以下的表达盒。
VEGFR_D2-PAS49以来源于谷氨酸棒杆菌ATCC13869株的CspB的信号肽30氨基酸残基与VEGFR_D2-PAS49的融合蛋白(以下，表示为“CspBss-VEGFR_D2-PAS49”)的形式而分泌表达。编码设计的CspBss-VEGFR_D2-PAS49的碱基序列和氨基酸序列分别示于序列编号180、181。
编码CspBss-VEGFR_D2-PAS49的碱基序列
atgtttaacaaccgtatccgcactgcagctctcgctggtgcaatcgcaatctccaccgcagcttccggcgtagctatcccagcattcgctgcagagaccgctggccctacctggtgtgaggacgattggtactactgttggctctttggcaccgccgcccctgctgctcccgcccccgccgcccctgccgcaccagctccagcagccccagctgcaccagcaccagccgctccagcagctccagcaccagctgctccagcagcaccagccccagcagctccagccgcaccagctcctgcggtttgctgggaggattcttggggcggcgaagtttgctggctctttggcacctaa(序列编号：180)
CspBss-VEGFR_D2-PAS49的氨基酸序列
MFNNRIRTAALAGAIAISTAASGVAIPAFAAETAGPTWCEDDWYYCWLFGTAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAVCWEDSWGGEVCWLFGT(序列编号：181)
VEGFR_D2-PAS49-b以来源于谷氨酸棒杆菌ATCC13869株的CspB的信号肽30氨基酸残基与VEGFR_D2-PAS49-b的融合蛋白(以下，表示为“CspBss-VEGFR_D2-PAS49-b”)的形式而分泌表达。编码设计的CspBss-VEGFR_D2-PAS49-b的碱基序列和氨基酸序列分别示于序列编号182、183。
编码CspBss-VEGFR_D2-PAS49-b的碱基序列
atgtttaacaaccgtatccgcactgcagctctcgctggtgcaatcgcaatctccaccgcagcttccggcgtagctatcccagcattcgctgcagagaccgcaggacccacttggtgcgaagatgactggtactattgctggctctttggcacctcagcacccagcccatcctccgctccagcgtctgcgagcgctcctgcatccccagcctctgcctccgcatcggcatcaccggcttccagcccagcgtcggcatcgtcagcctctccggctgcctcctccgcttctcctgcgtcctccgtgtgttgggaggattcctggggtggtgaagtctgctggctgttcggcacctaa(序列编号：182)
CspBss-VEGFR_D2-PAS49-b的氨基酸序列
MFNNRIRTAALAGAIAISTAASGVAIPAFAAETAGPTWCEDDWYYCWLFGTSAPSPSSAPASASAPASPASASASASPASSPASASSASPAASSASPASSVCWEDSWGGEVCWLFGT(序列编号：183)
VEGFR_D2-PAS100以来源于谷氨酸棒杆菌ATCC13869株的CspB的信号肽30氨基酸残基与VEGFR_D2-PAS100的融合蛋白(以下，表示为“CspBss-VEGFR_D2-PAS100”)的形式而分泌表达。编码设计的CspBss-VEGFR_D2-PAS100的碱基序列和氨基酸序列分别示于序列编号184、185。
编码CspBss-VEGFR_D2-PAS100的碱基序列
atgtttaacaaccgtatccgcactgcagctctcgctggtgcaatcgcaatctccaccgcagcttccggcgtagctatcccagcattcgctgcagagaccgccggtccaacctggtgtgaggatgactggtactactgctggctctttggcaccgctgctcccgctgctcccgcccctgctgctccagctgccccagccccagctgccccagctgctccagcaccagccgctccagctgccccagcaccagctgcaccagcagcaccagcaccagcagctccagccgctccagccccagccgctccagcagcaccagccccagcagctccagctgcaccagctccagccgccccagcagcaccagctccagcagccccagcagctccagctccagccgcaccagctgctccagccccagccgcaccagcagccccagctccagctgctcctgctgtctgttgggaggactcttggggcggcgaagtttgttggttgtttggcacctaa(序列编号：184)
CspBss-VEGFR_D2-PAS100的氨基酸序列
MFNNRIRTAALAGAIAISTAASGVAIPAFAAETAGPTWCEDDWYYCWLFGTAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAVCWEDSWGGEVCWLFGT(序列编号：185)
VEGFR_D2-PAS100-b以来源于谷氨酸棒杆菌ATCC13869株的CspB的信号肽30氨基酸残基与VEGFR_D2-PAS100-b的融合蛋白(以下，表示为“CspBss-VEGFR_D2-PAS100-b”)的形式而分泌表达。编码设计的CspBss-VEGFR_D2-PAS100-b的碱基序列和氨基酸序列分别示于序列编号186、187。
编码CspBss-VEGFR_D2-PAS100-b的碱基序列
atgtttaacaaccgtatccgcactgcagctctcgctggtgcaatcgcaatctccaccgcagcttccggcgtagctatcccagcattcgctgcagagaccgccggacctacctggtgtgaggatgactggtactattgctggctcttcggcacttccgccccttccccttccagcgcaccagcgagcgcttcggctccggcctccccagcgtccgcatctgcgtctgcatcccctgcgtcgtcacccgcttcagcctcctcagcctcccctgcggcttcatccgcctcgcccgcatccagctccgcatcaccctctgcgccagcagctccatccgcttctgctgccccatcggcctctccggcttccagctctcccgcaccggcatccgctccgagcccagcagcagctgcatcctccccatctccggcaccatcctcggcctctagcgcggctgtgtgctgggaagattcctggggtggtgaagtctgctggctgtttggcacctaa(序列编号：186)
CspBss-VEGFR_D2-PAS100-b的氨基酸序列
MFNNRIRTAALAGAIAISTAASGVAIPAFAAETAGPTWCEDDWYYCWLFGTSAPSPSSAPASASAPASPASASASASPASSPASASSASPAASSASPASSSASPSAPAAPSASAAPSASPASSSPAPASAPSPAAAASSPSPAPSSASSAAVCWEDSWGGEVCWLFGT(序列编号：187)
VEGFR_D2-GS16以来源于谷氨酸棒杆菌ATCC13869株的CspB的信号肽30氨基酸残基与VEGFR_D2-GS16的融合蛋白(以下，表示为“CspBss-VEGFR_D2-GS16”)的形式而分泌表达。编码设计的CspBss-VEGFR_D2-GS16的碱基序列和氨基酸序列分别示于序列编号188、189。
编码CspBss-VEGFR_D2-GS16的碱基序列
atgtttaacaaccgtatccgcactgcagctctcgctggtgcaatcgcaatctccaccgcagcttccggcgtagctatcccagcattcgctgcagagaccgcgggtccgacctggtgtgaggatgactggtactactgttggttgttcggcaccggcggcggcggctccggcggcggcggctctggcggcggcggctctggcgtttgttgggaggactcttggggcggcgaagtttgctggctgtttggcacctaa(序列编号：188)
CspBss-VEGFR_D2-GS16的氨基酸序列
MFNNRIRTAALAGAIAISTAASGVAIPAFAAETAGPTWCEDDWYYCWLFGTGGGGSGGGGSGGGGSGVCWEDSWGGEVCWLFGT(序列编号：189)
在CspBss-VEGFR_D2-PAS49、CspBss-VEGFR_D2-PAS49-b、CspBss-VEGFR_D2-PAS100、CspBss-VEGFR_D2-PAS100-b、和CspBss-VEGFR_D2-GS16所述的碱基序列的上游连接来源于谷氨酸棒杆菌ATCC13869株的cspB基因的启动子，并在5’-侧添加KpnI位点，在3’-侧添加BamHI位点，设计各VEGFR_D2-PAS异二聚体肽接头改变体的表达盒，进行了全合成。通过将全合成得到的DNA片段(VEGFR_D2-PAS异二聚体肽接头改变体的表达盒)插入日本特开平9-322774所述的pPK4的KpnI-BamHI部分，分别构建了作为利用了CspB信号序列的各VEGFR_D2-PAS异二聚体肽接头改变体的分泌表达质粒的pPK4_CspBss-VEGFR_D2-PAS49、pPK4_CspBss-VEGFR_D2-PAS49-b、pPK4_CspBss-VEGFR_D2-PAS100、pPK4_CspBss-VEGFR_D2-PAS100-b、和pPK4_CspBss-VEGFR_D2-GS16。对插入片段的碱基序列进行了确定的结果，确认分别构建了如同所设计的VEGFR_D2-PAS异二聚体肽接头改变体的表达盒。碱基序列的确定使用BigDye(注册商标)Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit(AppliedBiosystems)和3500xL Genetic Analyzer(Applied Biosystems)进行。
(44-5)谷氨酸棒杆菌中的各VEGFR_D2-PAS异二聚体肽接头改变体的分泌表达
使用所述构建得到的pPK4_CspBss-VEGFR_D2-PAS49、pPK4_CspBss-VEGFR_D2-PAS49-b、pPK4_CspBss-VEGFR_D2-PAS100、pPK4_CspBss-VEGFR_D2-PAS100-b、和pPK4_CspBss-VEGFR_D2-GS16，转化WO2016/171224所述的谷氨酸棒杆菌YDK0107株，得到了YDK0107/pPK4_CspBss-VEGFR_D2-PAS49株、YDK0107/pPK4_CspBss-VEGFR_D2-PAS49-b株、YDK0107/pPK4_CspBss-VEGFR_D2-PAS100株、YDK0107/pPK4_CspBss-VEGFR_D2-PAS100-b株、和YDK0107/pPK4_CspBss-VEGFR_D2-GS16株。
将得到的各转化体，用包含25mg/L的卡那霉素的MMTG液体培养基(葡萄糖120g，硫酸镁七水合物3g，硫酸铵30g，磷酸二氢钾1.5g，硫酸铁七水合物0.03g，硫酸锰五水合物0.03g，硫胺素盐酸盐0.45mg，生物素0.45mg，DL-蛋氨酸0.15g，大豆盐酸水解液(总氮量0.2g)，碳酸钙50g，用水调节至1L，调节至pH7.0)分别在30℃下，培养72小时。
培养结束后，将各培养液离心分离，用NuPAGE(注册商标)12％Bis-Tirs Gel(Thermo Fisher Scientific)将得到的培养上清6.5μL供至还原SDS-PAGE后，用Quick-CBB(Wako)进行了染色。其结果，YDK0107/pPK4_CspBss-VEGFR_D2-PAS49株的培养上清中检测到了被认为是VEGFR_D2-PAS49的蛋白质带(图77，列2～5)，YDK0107/pPK4_CspBss-VEGFR_D2-PAS49-b株的培养上清中检测到了被认为是VEGFR_D2-PAS49-b的蛋白质带(图77，列6～9)，YDK0107/pPK4_CspBss-VEGFR_D2-PAS100株的培养上清中检测到了被认为是VEGFR_D2-PAS100的蛋白质带(图77，列10～13)，YDK0107/pPK4_CspBss-VEGFR_D2-PAS100-b株的培养上清中检测到了被认为是VEGFR_D2-PAS100-b的蛋白质带(图77，列14～17)、YDK0107/pPK4_CspBss-VEGFR_D2-GS16株的培养上清中检测到了被认为是VEGFR_D2-GS16的蛋白质带(图77，列18～21)。
实施例45：VEGFR_D2-PAS异二聚体肽接头改变体的分子量分析
对于实施例44中的培养后的、表达了VEGFR_D2-PAS异二聚体改变体的菌体过滤液，在进行了菌体过滤后使用LC-MS(Waters,ACQUITY UPLC/SQD2)进行了分子量的测定。分析条件如表5所述。如图78～81所示，得到了与在分子内形成有2个二硫键的氧化型的各二聚体肽的分子量的理论值基本相同的值。从这一点来看，确认了能够表达包含2个二硫键的正确的氨基酸序列的肽。
实施例46：VEGFR_D2-PAS异二聚体肽接头改变体的活性评价
通过萤光素酶测定评价了VEGFR_D2-PAS异二聚体肽接头改变体的VEGF抑制能力。接种40000cell/well的VEGFR/NFAT Reporter HEK293细胞(BPS Bioscience公司)，在37℃、5％CO2孵育器内进行了过夜孵育。在分析培养基(MEM培养基(Nacalai Tesque公司)、1xMEM非必需氨基酸溶液(Thermo Fisher Scientific公司)、1mM丙酮酸钠(Nacalai Tesque公司)、1％青霉素-链霉素(Sigma Aldrich公司)、0.3％FBS(Thermo Fisher Scientific公司))中孵育细胞过夜，使其为饥饿状态。向分析培养基中，添加10ng/mL的人类重组VEGF(R＆D Systems)，并添加以给定的浓度包含VEGFR_D2-PAS16、VEGFR_D2-PAS49、VEGFR_D2-PAS100的培养上清，向细胞中添加该分析培养基100μL。在37℃、5％CO2孵育器内培养4小时，由此进行了对细胞的刺激。需要说明的是，VEGFR_D2-PAS16是依照实施例27所述的方法得到的。
信号强度的检测使用了One-Glo Luciferase Assay System(Promega公司)。将50μL的培养基上清除去，添加One-Glo试剂50μL，在室温下溶解细胞10分钟。通过用Nivo读板器(Perkin Elmer公司)检测从细胞的溶解液中发出的发光来对VEGFR-NFAT通路的活化进行定量，求出相对于未添加评价化合物的样品的相对信号活性值，以作为相对受体活性(Relative reporter activity)。
评价结果示于图82以及83，计算各肽二聚体的IC50值得到的结果如下述表8所示。VEGFR_D2-PAS16表现出了比VEGFR_D2-GS16更高的抑制活性。此外，VEGFR_D2-PAS16和VEGFR_D2-PAS49表现出了比VEGFR_D2-PAS100更高的抑制活性，由此可以看出，通过使用PAS接头，与GS接头相比，能够开发具有更高抑制活性的二聚体肽，通过使用49个氨基酸以下的PAS接头，能够开发具有更高抑制活性的二聚体肽。
[表8]
| 肽 | IC50(g/L) |
| AET-VEGFR_D2-PAS16 | 1.5x10<sup>-6</sup> |
| AET-VEGFR_D2-GS16 | 1.6x10<sup>-5</sup> |
| AET-VEGFR_D2-PAS49 | 1.2x10<sup>-5</sup> |
| AET-VEGFR_D2-PAS100 | 8.6x10<sup>-5</sup> |
实施例47：TPO-PAS二聚体肽接头改变体的设计和其在谷氨酸棒杆菌中的分泌表达
(47-1)接头改变体的设计的概要
具有血小板生成素样活性的TPO2-PAS8具有以包含8个氨基酸的PAS接头使第一AF12285肽与第二第一AF12285肽之间结合的结构。可以预想通过改变该PAS接头的长度，血小板生成素样活性会改变。因此，设计了将PAS接头部分改变为49个氨基酸或100个氨基酸的PAS重复序列的接头改变体。
此外，作为挠性接头，除了PAS接头之外，还已知有作为甘氨酸和丝氨酸的重复序列的GS接头。因此，设计了使EPO环状肽结合至包含甘氨酸4残基和丝氨酸1残基(GGGGS)的重复序列的GS接头的N末端和C末端而得到的接头改变体，即设计了为“第一AF12285肽”-“GS接头”-“第一AF12285肽”的肽序列。
(47-2)TPO-PAS二聚体肽接头改变体的制备
制备的TPO-PAS二聚体肽接头改变体如下。
(V)TPO2-PAS49
GGCADGPTLREWISFCGGAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAGGCADGPTLREWISFCGG(序列编号：190)
(W)TPO2-PAS49-b
GGCADGPTLREWISFCGGSAPSPSSAPASASAPASPASASASASPASSPASASSASPAASSASPASSGGCADGPTLREWISFCGG(序列编号：191)
(X)TPO2-PAS100
GGCADGPTLREWISFCGGAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAGGCADGPTLREWISFCGG(序列编号：192)
(Y)TPO2-PAS100-b
GGCADGPTLREWISFCGGSAPSPSSAPASASAPASPASASASASPASSPASASSASPAASSASPASSSASPSAPAAPSASAAPSASPASSSPAPASAPSPAAAASSPSPAPSSASSAAGGCADGPTLREWISFCGG(序列编号：193)
(Z)TPO2-GS8
GGCADGPTLREWISFCGGGGGGSGGGGGCADGPTLREWISFCGG(序列编号：194)
(47-3)TPO-PAS二聚体肽接头改变体的表达
使用Corynex(注册商标)进行了这些TPO-PAS二聚体肽接头改变体的表达探讨。以下，记载了基于Corynex(注册商标)的表达探讨的实施例。
(47-4)利用了CspA信号序列的TPO2-PAS49、TPO2-PAS49-b、TPO2-PAS100、TPO2-PAS100-b、和TPO2-GS8的各分泌表达质粒的构建
作为TPO-PAS二聚体肽接头改变体，分别设计了所述(V)TPO2-PAS49(以下，也表示为“TPO2-PAS49”)、(W)TPO2-PAS49-b(以下，也表示为“TPO2-PAS49-b”)、(X)TPO2-PAS100(以下，也表示为“TPO2-PAS100”)、(Y)TPO2-PAS100-b(以下，也表示为“TPO2-PAS100-b”)、和(Z)TPO2-GS8(以下，也表示为“TPO2-GS8”)的5种氨基酸序列，考虑谷氨酸棒杆菌的密码子使用频率而设计了编码这些蛋白质的碱基序列。并且，以使得能够进行基于谷氨酸棒杆菌的分泌表达的方式，分别设计了以下的表达盒。
TPO2-PAS49以来源于C.ammoniagenes ATCC6872株的CspA的信号肽25氨基酸残基与TPO2-PAS49的融合蛋白(以下，表示为“CspAss-TPO2-PAS49”)的形式而分泌表达。编码设计的CspAss-TPO2-PAS49的碱基序列和氨基酸序列分别示于序列编号195、196。
编码CspAss-TPO2-PAS49的碱基序列
atgaaacgcatgaaatcgctggctgcggcgctcaccgtcgctggggccatgctggccgcacctgtggcaacggcaggtggctgtgctgacggtcctacccttcgtgagtggatttctttttgcggcggtgctgctcctgctgcccctgctcctgctgctcctgcagcaccagccccagcagctccagccgccccagctccagccgcaccagctgccccagcaccagccgctccagcagcaccagctccagcagccccagctgcaccagccccagcgggcggttgtgctgacggtcctacccttcgtgagtggatttccttctgtggtggctaa(序列编号：195)
CspAss-TPO2-PAS49的氨基酸序列
MKRMKSLAAALTVAGAMLAAPVATAGGCADGPTLREWISFCGGAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAGGCADGPTLREWISFCGG(序列编号：196)
TPO2-PAS49-b以来源于C.ammoniagenes ATCC6872株的CspA的信号肽25氨基酸残基与TPO2-PAS49-b的融合蛋白(以下，表示为“CspAss-TPO2-PAS49-b”)的形式而分泌表达。编码设计的CspAss-TPO2-PAS49-b的碱基序列和氨基酸序列分别示于序列编号197、198。
编码CspAss-TPO2-PAS49-b的碱基序列
atgaaacgcatgaaatcgctggctgcggcgctcaccgtcgctggggccatgctggccgcacctgtggcaacggcaggcgggtgtgcagacggacccactctgcgcgaatggatctccttttgcggcggttccgctccgtcgccatcctctgctccggcatccgcgtctgcgccagcatccccagccagcgcttcagcctcagcgtcccctgcctcctctccagcatccgccagcagcgcatctcctgcggctagctcggcatcacccgcttcgtccggaggttgcgctgatggccctaccctccgtgagtggatttccttctgcggtggctaa(序列编号：197)
CspAss-TPO2-PAS49-b的氨基酸序列
MKRMKSLAAALTVAGAMLAAPVATAGGCADGPTLREWISFCGGSAPSPSSAPASASAPASPASASASASPASSPASASSASPAASSASPASSGGCADGPTLREWISFCGG(序列编号：198)
TPO2-PAS100以来源于C.ammoniagenes ATCC6872株的CspA的信号肽25氨基酸残基与TPO2-PAS100的融合蛋白(以下，表示为“CspAss-TPO2-PAS100”)的形式而分泌表达。编码设计的CspAss-TPO2-PAS100的碱基序列和氨基酸序列分别示于序列编号199、200。
编码CspAss-TPO2-PAS100的碱基序列
atgaaacgcatgaaatcgctggctgcggcgctcaccgtcgctggggccatgctggccgcacctgtggcaacggcaggcggttgtgctgacggtcctaccttgcgtgaatggatttctttctgtggtggtgcggctccggctgctccggctcctgcggctccggctgcaccagcaccagccgcaccagctgcaccagccccagctgcaccagccgctccagcaccagctgccccagctgcaccagctccagccgcaccagcagccccagctccagcagccccagcagctccagcaccagccgctccagctgccccagcaccagctgctccagcagctccagcaccagcagctccagctgctccagccccagccgccccagccgctccagccccagcagcaccagccgccccagctccagccgccccagcaggtggctgtgctgatggtcctacccttcgtgaatggatttccttttgtggcggttag(序列编号：199)
CspAss-TPO2-PAS100的氨基酸序列
MKRMKSLAAALTVAGAMLAAPVATAGGCADGPTLREWISFCGGAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAGGCADGPTLREWISFCGG(序列编号：200)
TPO2-PAS100-b以来源于C.ammoniagenes ATCC6872株的CspA的信号肽25氨基酸残基与TPO2-PAS100的融合蛋白(以下，表示为“CspAss-TPO2-PAS100-b”)的形式而分泌表达。编码设计的CspAss-TPO2-PAS100-b的碱基序列和氨基酸序列分别示于序列编号201、202。
编码CspAss-TPO2-PAS100-b的碱基序列
atgaaacgcatgaaatcgctggctgcggcgctcaccgtcgctggggccatgctggccgcacctgtggcaacggcaggcgggtgtgcagacggtcccactctccgcgaatggatctccttttgcggcggaagcgcgccctccccgtcatctgcccctgcatctgcgtccgcaccagcatccccagcctctgcgtctgcttctgcatcaccggcctcgtccccagcaagcgcatcgtccgcgtcaccagctgcgtcctcagcctcccctgcttcctcgtccgcttcgccttcggctcctgccgctccctctgcatccgctgccccatccgcctcaccagccagctcctctccggcaccagcgtccgctccttcccctgcagctgcggcgagctctccaagcccggctccctcctccgcatccagcgctgccggtggatgcgcagatggcccgaccctgcgtgagtggattagcttctgcggcggttaa(序列编号：201)
CspAss-TPO2-PAS100-b的氨基酸序列
MKRMKSLAAALTVAGAMLAAPVATAGGCADGPTLREWISFCGGSAPSPSSAPASASAPASPASASASASPASSPASASSASPAASSASPASSSASPSAPAAPSASAAPSASPASSSPAPASAPSPAAAASSPSPAPSSASSAAGGCADGPTLREWISFCGG(序列编号：202)
TPO2-GS8以来源于C.ammoniagenes ATCC6872株的CspA的信号肽25氨基酸残基与TPO2-GS8的融合蛋白(以下，表示为“CspAss-TPO2-GS8”)的形式而分泌表达。编码设计的CspAss-TPO2-GS8的碱基序列和氨基酸序列分别示于序列编号203、204。
编码CspAss-TPO2-GS8的碱基序列
atgaaacgcatgaaatcgctggctgcggcgctcaccgtcgctggggccatgctggccgcacctgtggcaacggcaggtggctgtgcggatggtcctaccttgcgtgagtggatttctttctgtggcggtggtggtggtggttctggtggtggtggtggttgcgcagatggcccaaccctgcgcgaatggatctccttctgcggcggctaa(序列编号：203)
CspAss-TPO2-GS8的氨基酸序列
MKRMKSLAAALTVAGAMLAAPVATAGGCADGPTLREWISFCGGGGGGSGGGGGCADGPTLREWISFCGG(序列编号：204)
在CspAss-TPO2-PAS49、CspAss-TPO2-PAS49-b、CspAss-TPO2-PAS100、CspAss-TPO2-PAS100-b、和CspAss-TPO2-GS8所述的碱基序列的上游连接来源于谷氨酸棒杆菌ATCC13869株的cspB基因的启动子，并在5’-侧添加KpnI位点，在3’-侧添加BamHI位点，设计各TPO-PAS二聚体肽接头改变体的表达盒，进行了全合成。通过将全合成得到的DNA片段(TPO-PAS二聚体肽接头改变体的表达盒)插入日本特开平9-322774所述的pPK4的KpnI-BamHI部分，分别构建了作为利用了CspA信号序列的各TPO-PAS二聚体肽接头改变体的分泌表达质粒的pPK4_CspAss-TPO2-PAS49、pPK4_CspAss-TPO2-PAS49-b、pPK4_CspAss-TPO2-PAS100、pPK4_CspAss-TPO2-PAS100-b、和pPK4_CspAss-TPO2-GS8。对插入片段的碱基序列进行了确定的结果，确认分别构建了如同所设计的TPO-PAS二聚体肽接头改变体的表达盒。碱基序列的确定使用BigDye(注册商标)Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems)和3500xL Genetic Analyzer(Applied Biosystems)进行。
(47-5)谷氨酸棒杆菌中的各TPO-PAS二聚体肽接头改变体的分泌表达
使用所述构建得到的pPK4_CspAss-TPO2-PAS49、pPK4_CspAss-TPO2-PAS49-b、pPK4_CspAss-TPO2-PAS100、pPK4_CspAss-TPO2-PAS100-b、和pPK4_CspAss-TPO2-GS8，转化WO2016/171224所述的谷氨酸棒杆菌YDK0107株，得到了YDK0107/pPK4_CspAss-TPO2-PAS49株、YDK0107/pPK4_CspAss-TPO2-PAS49-b株、YDK0107/pPK4_CspAss-TPO2-PAS100株、YDK0107/pPK4_CspAss-TPO2-PAS100-b株、和YDK0107/pPK4_CspAss-TPO2-GS8株。
将得到的各转化体，用包含25mg/L的卡那霉素的MMTG液体培养基(葡萄糖120g，硫酸镁七水合物3g，硫酸铵30g，磷酸二氢钾1.5g，硫酸铁七水合物0.03g，硫酸锰五水合物0.03g，硫胺素盐酸盐0.45mg，生物素0.45mg，DL-蛋氨酸0.15g，大豆盐酸水解液(总氮量0.2g)，碳酸钙50g，用水调节至1L，调节至pH7.0)分别在30℃下，培养72小时。
培养结束后，将各培养液离心分离，用NuPAGE(注册商标)12％Bis-Tirs Gel(Thermo Fisher Scientific)将得到的培养上清6.5μL供至还原SDS-PAGE后，用Quick-CBB(Wako)进行了染色。其结果，YDK0107/pPK4_CspAss-TPO2-PAS49株的培养上清中检测到了被认为是TPO2-PAS49的蛋白质带(图84，列2～5)，YDK0107/pPK4_CspAss-TPO2-PAS49-b株的培养上清中检测到了被认为是TPO2-PAS49-b的蛋白质带(图84，列6～9)，YDK0107/pPK4_CspAss-TPO2-PAS100株的培养上清中检测到了被认为是TPO2-PAS100的蛋白质带(图84，列10～13)，YDK0107/pPK4_CspAss-TPO2-PAS49-b株的培养上清中检测到了被认为是TPO2-PAS49-b的蛋白质带(图84，列14～17)、YDK0107/pPK4_CspAss-TPO2-GS8株的培养上清中检测到了被认为是TPO2-GS8的蛋白质带(图84，列18～21)。
实施例48：TPO-PAS二聚体肽接头改变体的分子量分析
对于实施例47中的培养后的、TPO-PAS二聚体肽接头改变体的菌体过滤液，使用LC-MS(Waters,LC-MS(Waters,ACQUITY UPLC/SQD2)进行了分子量的测定。分析条件如表2所述。如图85～89所示，得到了与在分子内形成有2个二硫键的氧化型的各二聚体肽的分子量的理论值基本相同的值。从这一点来看，确认了能够表达包含2个二硫键的正确的氨基酸序列的肽。
实施例49：TPO-PAS二聚体肽接头改变体的活性评价
TPO-PAS二聚体肽改变体的血小板生成素样活性通过作为来源于人类白血病的血细胞细胞株的HEL细胞的CREB磷酸化水平的定量进行了评价。200000cell的HEL细胞用不含FBS的RPMI1640培养基(Thermo Fisher Scientific公司)培养24小时，使其为饥饿状态。对于该细胞，使用100ng/mL的重组人类TPO(rhTPO,Peprotech公司)、或以终浓度为20-40ng/mL的方式稀释并添加有包含TPO2-PAS8、TPO2-PAS49、TPO2-PAS100或TPO2-GS8的各二聚体肽的培养上清的RPMI1640培养基进行20分钟的刺激。作为阴性对照，加入PBS进行了20分钟刺激(Mock组)。将培养基除去，用PBS清洗一次细胞后，通过加入100μL的添加有蛋白酶抑制剂混合物(Nacalai Tesque公司)的裂解缓冲液17(R&D Systems公司)来使细胞溶解。以14000G对溶解液进行5分钟离心，得到上清作为裂解液。需要说明的是，TPO2-PAS8是依照实施例23所述的方法得到的。
使用Phospho-CREB(Ser133)and Total CREB ELISA kit(RayBio公司)，进行了裂解液中的磷酸化CREB(pCREB)水平的定量。各裂解液用Assay Diluent进行25倍稀释，向CREB Pan CREB微孔板中分别添加100μL并在4℃下振荡一晚。用清洗缓冲液清洗微孔板3次后，添加100μL的Phospho Detection Antibody CREB(Ser133)100μL，在37℃下静置30分钟，由此进行了抗原抗体反应。再用清洗缓冲液清洗微孔板3次后，添加100μL的anti-rabbit抗体HRP复合物100μL，在37℃下静置30分钟，由此进行了抗原抗体反应。再用清洗缓冲液清洗微孔板3次后，添加100μL的TMB溶液，在室温下进行了30分钟发色反应。添加50μL的终止溶液(Stop溶液)，用微孔板测定450nm波长的吸光度，由此进行了磷酸化水平的定量。
结果如图90所示。在所有添加了二聚体肽的组中，都确认到了比Mock组更高的pCREB水平。TPO2-PAS8和TPO2-PAS49分别为136％、131％，表现出与rhTPO刺激组(143％)相近的pCREB水平，与之相对，TPO2-PAS100为112％这一较低的pCREB水平。此外，TPO2-GS8为121％这一比TPO2-PAS8更低的pCREB水平。从这些结果可以看出，通过使用短链PAS接头，与长链PAS接头、GS接头相比，能够得到更高的激动剂活性。
序列表
<110> 味之素株式会社
<120> 具有生理活性的肽的制造方法以及包含短链接头的肽
<130> OP20095
<150> JP 2019-221040
<151> 2019-12-06
<160> 204
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Met结合肽
<220>
<221> DISULFID
<222> (1)..(17)
<223> 二硫键介于Cys-1和Cys-17
<400> 1
Cys Tyr Arg Gln Phe Asn Arg Arg Thr His Glu Val Trp Asn Leu Asp
1 5 10 15
Cys
<210> 2
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Met结合肽
<220>
<221> DISULFID
<222> (1)..(16)
<223> 二硫键介于Cys-1和Cys-16
<400> 2
Cys Arg Gln Phe Asn Arg Arg Thr His Glu Val Trp Asn Leu Asp Cys
1 5 10 15
<210> 3
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Met结合肽
<220>
<221> DISULFID
<222> (1)..(16)
<223> 二硫键介于Cys-1和Cys-16
<400> 3
Cys Tyr Trp Tyr Tyr Ala Trp Asp Gln Thr Tyr Lys Ala Phe Pro Cys
1 5 10 15
<210> 4
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Met结合肽
<220>
<221> DISULFID
<222> (1)..(15)
<223> 二硫键介于Cys-1和Cys-15
<400> 4
Cys Trp Tyr Tyr Ala Trp Asp Gln Thr Tyr Lys Ala Phe Pro Cys
1 5 10 15
<210> 5
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Met结合肽
<220>
<221> DISULFID
<222> (1)..(18)
<223> 二硫键介于Cys-1和Cys-18
<400> 5
Cys Tyr Ile Ser Trp Asn Glu Phe Asn Ser Pro Asn Trp Arg Phe Ile
1 5 10 15
Thr Cys
<210> 6
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Met结合肽
<220>
<221> DISULFID
<222> (1)..(17)
<223> 二硫键介于Cys-1和Cys-17
<400> 6
Cys Ile Ser Trp Asn Glu Phe Asn Ser Pro Asn Trp Arg Phe Ile Thr
1 5 10 15
Cys
<210> 7
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PAS接头
<400> 7
Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro
1 5 10 15
Ala Ala Pro Ala
20
<210> 8
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PAS接头
<400> 8
Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro
1 5 10 15
Ala Ala Pro Ala Ala Pro
20
<210> 9
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PAS接头
<400> 9
Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro
1 5 10
<210> 10
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PAS接头
<400> 10
Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala
1 5 10 15
Pro Ala Ala Pro
20
<210> 11
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PAS接头
<400> 11
Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro
1 5 10 15
Ala Ala Ala Pro
20
<210> 12
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PAS接头
<400> 12
Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala
1 5 10 15
Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro
20
<210> 13
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PAS接头
<400> 13
Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala
1 5 10 15
Ala Pro Ala Pro Ala Ala Ala Pro
20
<210> 14
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PAS接头
<400> 14
Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Pro Ala Ala Ala Ala Pro
1 5 10 15
Ala Ala Pro Ala Ala Pro Pro Ala
20
<210> 15
<211> 20
<212> PRT
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<220>
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<400> 15
Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro
1 5 10 15
Ala Pro Ala Pro
20
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<400> 16
Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro
1 5 10 15
Ser Ala Pro Ala
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Ala Ala Pro Ala Ser Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ser Ala Pro Ala Pro
1 5 10 15
Ala Ala Pro Ser
20
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<212> PRT
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<400> 18
Ala Pro Ser Ser Pro Ser Pro Ser Ala Pro Ser Ser Pro Ser Pro Ala
1 5 10 15
Ser Pro Ser Ser
20
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<400> 19
Ser Ala Pro Ser Ser Pro Ser Pro Ser Ala Pro Ser Ser Pro Ser Pro
1 5 10 15
Ala Ser Pro Ser
20
<210> 20
<211> 20
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<213> 人工序列
<220>
<223> PAS接头
<400> 20
Ser Ser Pro Ser Ala Pro Ser Pro Ser Ser Pro Ala Ser Pro Ser Pro
1 5 10 15
Ser Ser Pro Ala
20
<210> 21
<211> 24
<212> PRT
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<220>
<223> PAS接头
<400> 21
Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ser Ala Pro Pro Ala Ala Ala Ser Pro
1 5 10 15
Ala Ala Pro Ser Ala Pro Pro Ala
20
<210> 22
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PAS接头
<400> 22
Ala Ser Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Ser Ala Ala Ala Ser Ala Pro
1 5 10 15
Ser Ala Ala Ala
20
<210> 23
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PAS接头
<400> 23
Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala
1 5 10 15
Ala Pro Ala Ala
20
<210> 24
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PAS接头
<400> 24
Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala
1 5 10 15
Pro Ala Ala Ala
20
<210> 25
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PAS接头
<400> 25
Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro
1 5 10 15
Ala Ala Ala Pro
20
<210> 26
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PAS接头
<400> 26
Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala
1 5 10 15
Ala Ala Pro Ala
20
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<211> 20
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<220>
<223> PAS接头
<400> 27
Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala
1 5 10 15
Ala Pro Ala Ala
20
<210> 28
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PAS接头
<400> 28
Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Ala
1 5 10 15
Pro Ala Ala Pro
20
<210> 29
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PAS接头
<400> 29
Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro
1 5 10 15
Ala Ala Pro Ala
20
<210> 30
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PAS接头
<400> 30
Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala
1 5 10 15
Ala Pro Ala Pro
20
<210> 31
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PAS接头
<400> 31
Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala
1 5 10 15
Pro Ala Pro Ala
20
<210> 32
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PAS接头
<400> 32
Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro
1 5 10 15
Ala Pro Ala Ala
20
<210> 33
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 33
tcagaggaat gtcgactgct cgcaaccggc ccgt 34
<210> 34
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 34
cctacattca gcgcaggttc ccctagagca cgt 33
<210> 35
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 35
tgcgctgaat gtagggaag 19
<210> 36
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 36
atcgctgcag gtcgactcta gaggatcccc ggaa 34
<210> 37
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 37
cttcccatac aatcgataga ttgtcgcacc tgattg 36
<210> 38
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 38
cctcaggctg gtgttgggcg agctcgaatt cgt 33
<210> 39
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 39
aacaccagcc tgaggcaa 18
<210> 40
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 40
gatcttcggg actagttact ttcaaatgct cagcatg 37
<210> 41
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FBP-PAS
<220>
<221> DISULFID
<222> (4)..(15)
<223> 二硫键介于Cys-4和Cys-15
<220>
<221> DISULFID
<222> (44)..(55)
<223> 二硫键介于Cys-44和Cys-55
<400> 41
Arg Pro Gly Cys Gly Pro Arg Lys Pro Arg Thr Pro Lys Lys Cys Gly
1 5 10 15
Ser His Gly Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala
20 25 30
Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Gly Arg Pro Gly Cys Gly Pro Arg Lys
35 40 45
Pro Arg Thr Pro Lys Lys Cys Gly Ser His
50 55
<210> 42
<211> 294
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TorAss-FBP-PAS
<400> 42
atgaacaata acgatctctt tcaggcatca cgtcggcgtt ttctggcaca actcggcggc 60
ttaaccgtcg ccgggatgct ggggccgtca ttgttaacgc cgcgacgtgc gactgcgcgt 120
cctggttgtg gtcctcgcaa gccccgcacc cctaagaaat gtggttctca cggcgccgct 180
cctgccgcac ccgcacccgc tgctccagca gccccagccc cagctgcacc agcaggtcgc 240
ccaggctgtg gtccccgcaa accccgcacc cctaagaaat gtggctctca ctaa 294
<210> 43
<211> 97
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TorAss-FBP-PAS
<220>
<221> DISULFID
<222> (43)..(54)
<223> 二硫键介于Cys-43和Cys-54
<220>
<221> DISULFID
<222> (83)..(94)
<223> 二硫键介于Cys-83和Cys-94
<400> 43
Met Asn Asn Asn Asp Leu Phe Gln Ala Ser Arg Arg Arg Phe Leu Ala
1 5 10 15
Gln Leu Gly Gly Leu Thr Val Ala Gly Met Leu Gly Pro Ser Leu Leu
20 25 30
Thr Pro Arg Arg Ala Thr Ala Arg Pro Gly Cys Gly Pro Arg Lys Pro
35 40 45
Arg Thr Pro Lys Lys Cys Gly Ser His Gly Ala Ala Pro Ala Ala Pro
50 55 60
Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Gly Arg
65 70 75 80
Pro Gly Cys Gly Pro Arg Lys Pro Arg Thr Pro Lys Lys Cys Gly Ser
85 90 95
His
<210> 44
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PAS-aMD4-PEG11
<220>
<221> DISULFID
<222> (1)..(17)
<223> 二硫键介于Cys-1和Cys-17
<220>
<221> DISULFID
<222> (42)..(58)
<223> 二硫键介于Cys-42和Cys-58
<400> 44
Cys Tyr Arg Gln Phe Asn Arg Arg Thr His Glu Val Trp Asn Leu Asp
1 5 10 15
Cys Gly Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro
20 25 30
Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Gly Cys Tyr Arg Gln Phe Asn Arg
35 40 45
Arg Thr His Glu Val Trp Asn Leu Asp Cys
50 55
<210> 45
<211> 56
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PAS-aMD4dY-PEG11
<220>
<221> DISULFID
<222> (1)..(16)
<223> 二硫键介于Cys-1和Cys-16
<220>
<221> DISULFID
<222> (41)..(56)
<223> 二硫键介于Cys-41和Cys-56
<400> 45
Cys Arg Gln Phe Asn Arg Arg Thr His Glu Val Trp Asn Leu Asp Cys
1 5 10 15
Gly Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala
20 25 30
Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Gly Cys Arg Gln Phe Asn Arg Arg Thr
35 40 45
His Glu Val Trp Asn Leu Asp Cys
50 55
<210> 46
<211> 50
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PAS-aMD4-PEG3
<220>
<221> DISULFID
<222> (1)..(17)
<223> 二硫键介于Cys-1和Cys-17
<220>
<221> DISULFID
<222> (34)..(50)
<223> 二硫键介于Cys-34和Cys-50
<400> 46
Cys Tyr Arg Gln Phe Asn Arg Arg Thr His Glu Val Trp Asn Leu Asp
1 5 10 15
Cys Gly Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro
20 25 30
Gly Cys Tyr Arg Gln Phe Asn Arg Arg Thr His Glu Val Trp Asn Leu
35 40 45
Asp Cys
50
<210> 47
<211> 61
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AET-PAS-aMD4-PEG11
<220>
<221> DISULFID
<222> (4)..(20)
<223> 二硫键介于Cys-4和Cys-20
<220>
<221> DISULFID
<222> (45)..(61)
<223> 二硫键介于Cys-45和Cys-61
<400> 47
Ala Glu Thr Cys Tyr Arg Gln Phe Asn Arg Arg Thr His Glu Val Trp
1 5 10 15
Asn Leu Asp Cys Gly Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro
20 25 30
Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Gly Cys Tyr Arg Gln
35 40 45
Phe Asn Arg Arg Thr His Glu Val Trp Asn Leu Asp Cys
50 55 60
<210> 48
<211> 59
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AET-PAS-aMD4dY-PEG11
<220>
<221> DISULFID
<222> (4)..(19)
<223> 二硫键介于Cys-4和Cys-19
<220>
<221> DISULFID
<222> (44)..(59)
<223> 二硫键介于Cys-44和Cys-59
<400> 48
Ala Glu Thr Cys Arg Gln Phe Asn Arg Arg Thr His Glu Val Trp Asn
1 5 10 15
Leu Asp Cys Gly Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala
20 25 30
Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Gly Cys Arg Gln Phe Asn
35 40 45
Arg Arg Thr His Glu Val Trp Asn Leu Asp Cys
50 55
<210> 49
<211> 53
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AET-PAS-aMD4-PEG3
<220>
<221> DISULFID
<222> (4)..(20)
<223> 二硫键介于Cys-4和Cys-20
<220>
<221> DISULFID
<222> (37)..(53)
<223> 二硫键介于Cys-37和Cys-53
<400> 49
Ala Glu Thr Cys Tyr Arg Gln Phe Asn Arg Arg Thr His Glu Val Trp
1 5 10 15
Asn Leu Asp Cys Gly Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro
20 25 30
Ala Ala Pro Gly Cys Tyr Arg Gln Phe Asn Arg Arg Thr His Glu Val
35 40 45
Trp Asn Leu Asp Cys
50
<210> 50
<211> 294
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TorAss-PAS-aMD4-PEG11
<400> 50
atgaacaata acgatctctt tcaggcatca cgtcggcgtt ttctggcaca actcggcggc 60
ttaaccgtcg ccgggatgct ggggccgtca ttgttaacgc cgcgacgtgc gactgcgtgt 120
taccgtcaat tcaaccgtcg cacccacgaa gtttggaacc tggactgtgg cgcagcaccc 180
gcagccccag cccccgcagc acctgcagcc ccagcaccag ctgcaccagc cgctccaggc 240
tgctaccgtc agttcaaccg ccgcacccac gaagtttgga atttggattg ctaa 294
<210> 51
<211> 97
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TorAss-PAS-aMD4-PEG11
<220>
<221> DISULFID
<222> (40)..(56)
<223> 二硫键介于Cys-40和Cys-56
<220>
<221> DISULFID
<222> (81)..(97)
<223> 二硫键介于Cys-81和Cys-97
<400> 51
Met Asn Asn Asn Asp Leu Phe Gln Ala Ser Arg Arg Arg Phe Leu Ala
1 5 10 15
Gln Leu Gly Gly Leu Thr Val Ala Gly Met Leu Gly Pro Ser Leu Leu
20 25 30
Thr Pro Arg Arg Ala Thr Ala Cys Tyr Arg Gln Phe Asn Arg Arg Thr
35 40 45
His Glu Val Trp Asn Leu Asp Cys Gly Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala
50 55 60
Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Gly
65 70 75 80
Cys Tyr Arg Gln Phe Asn Arg Arg Thr His Glu Val Trp Asn Leu Asp
85 90 95
Cys
<210> 52
<211> 288
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TorAss-PAS-aMD4dY-PEG11
<400> 52
atgaacaata acgatctctt tcaggcatca cgtcggcgtt ttctggcaca actcggcggc 60
ttaaccgtcg ccgggatgct ggggccgtca ttgttaacgc cgcgacgtgc gactgcgtgc 120
cgtcagttca accgtcgcac ccacgaagtt tggaatctgg actgtggcgc agcccccgca 180
gcacccgctc ccgcagcacc cgcagctcca gcaccagcag ccccagcagc accaggctgc 240
cgccagttca accgtcgcac ccacgaagtt tggaatttgg attgttag 288
<210> 53
<211> 95
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TorAss-PAS-aMD4dY-PEG11
<220>
<221> DISULFID
<222> (40)..(55)
<223> 二硫键介于Cys-40和Cys-55
<220>
<221> DISULFID
<222> (80)..(95)
<223> 二硫键介于Cys-80和Cys-95
<400> 53
Met Asn Asn Asn Asp Leu Phe Gln Ala Ser Arg Arg Arg Phe Leu Ala
1 5 10 15
Gln Leu Gly Gly Leu Thr Val Ala Gly Met Leu Gly Pro Ser Leu Leu
20 25 30
Thr Pro Arg Arg Ala Thr Ala Cys Arg Gln Phe Asn Arg Arg Thr His
35 40 45
Glu Val Trp Asn Leu Asp Cys Gly Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro
50 55 60
Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Gly Cys
65 70 75 80
Arg Gln Phe Asn Arg Arg Thr His Glu Val Trp Asn Leu Asp Cys
85 90 95
<210> 54
<211> 270
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TorAss-PAS-aMD4-PEG3
<400> 54
atgaacaata acgatctctt tcaggcatca cgtcggcgtt ttctggcaca actcggcggc 60
ttaaccgtcg ccgggatgct ggggccgtca ttgttaacgc cgcgacgtgc gactgcgtgt 120
taccgtcagt tcaaccgccg tacccacgaa gtctggaacc tggattgtgg tgccgccccc 180
gccgctcccg ctcccgccgc tccggcagcc cctggctgct accgtcagtt taaccgtcgc 240
acccacgaag tctggaacct ggattgctaa 270
<210> 55
<211> 89
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TorAss-PAS-aMD4-PEG3
<220>
<221> DISULFID
<222> (40)..(56)
<223> 二硫键介于Cys-40和Cys-56
<220>
<221> DISULFID
<222> (73)..(89)
<223> 二硫键介于Cys-73和Cys-89
<400> 55
Met Asn Asn Asn Asp Leu Phe Gln Ala Ser Arg Arg Arg Phe Leu Ala
1 5 10 15
Gln Leu Gly Gly Leu Thr Val Ala Gly Met Leu Gly Pro Ser Leu Leu
20 25 30
Thr Pro Arg Arg Ala Thr Ala Cys Tyr Arg Gln Phe Asn Arg Arg Thr
35 40 45
His Glu Val Trp Asn Leu Asp Cys Gly Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala
50 55 60
Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Gly Cys Tyr Arg Gln Phe Asn Arg Arg
65 70 75 80
Thr His Glu Val Trp Asn Leu Asp Cys
85
<210> 56
<211> 276
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CspBss-AET-PAS-aMD4-PEG11
<400> 56
atgtttaaca accgtatccg cactgcagct ctcgctggtg caatcgcaat ctccaccgca 60
gcttccggcg tagctatccc agcattcgct gcagagacct gttaccgtca attcaaccgt 120
cgcacccacg aagtttggaa cctggactgt ggcgcagcac ccgcagcccc agcccccgca 180
gcacctgcag ccccagcacc agctgcacca gccgctccag gctgctaccg tcagttcaac 240
cgccgcaccc acgaagtttg gaatttggat tgctaa 276
<210> 57
<211> 91
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CspBss-AET-PAS-aMD4-PEG11
<220>
<221> DISULFID
<222> (34)..(50)
<223> 二硫键介于Cys-34和Cys-50
<220>
<221> DISULFID
<222> (75)..(91)
<223> 二硫键介于Cys-75和Cys-91
<400> 57
Met Phe Asn Asn Arg Ile Arg Thr Ala Ala Leu Ala Gly Ala Ile Ala
1 5 10 15
Ile Ser Thr Ala Ala Ser Gly Val Ala Ile Pro Ala Phe Ala Ala Glu
20 25 30
Thr Cys Tyr Arg Gln Phe Asn Arg Arg Thr His Glu Val Trp Asn Leu
35 40 45
Asp Cys Gly Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala
50 55 60
Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Gly Cys Tyr Arg Gln Phe Asn
65 70 75 80
Arg Arg Thr His Glu Val Trp Asn Leu Asp Cys
85 90
<210> 58
<211> 270
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CspBss-AET-PAS-aMD4dY-PEG11
<400> 58
atgtttaaca accgtatccg cactgcagct ctcgctggtg caatcgcaat ctccaccgca 60
gcttccggcg tagctatccc agcattcgct gcagagacct gccgtcagtt caaccgtcgc 120
acccacgaag tttggaatct ggactgtggc gcagcccccg cagcacccgc tcccgcagca 180
cccgcagctc cagcaccagc agccccagca gcaccaggct gccgccagtt caaccgtcgc 240
acccacgaag tttggaattt ggattgttag 270
<210> 59
<211> 89
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CspBss-AET-PAS-aMD4dY-PEG11
<220>
<221> DISULFID
<222> (34)..(49)
<223> 二硫键介于Cys-34和Cys-49
<220>
<221> DISULFID
<222> (74)..(89)
<223> 二硫键介于Cys-74和Cys-89
<400> 59
Met Phe Asn Asn Arg Ile Arg Thr Ala Ala Leu Ala Gly Ala Ile Ala
1 5 10 15
Ile Ser Thr Ala Ala Ser Gly Val Ala Ile Pro Ala Phe Ala Ala Glu
20 25 30
Thr Cys Arg Gln Phe Asn Arg Arg Thr His Glu Val Trp Asn Leu Asp
35 40 45
Cys Gly Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro
50 55 60
Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Gly Cys Arg Gln Phe Asn Arg Arg
65 70 75 80
Thr His Glu Val Trp Asn Leu Asp Cys
85
<210> 60
<211> 252
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CspBss-AET-PAS-aMD4-PEG3
<400> 60
atgtttaaca accgtatccg cactgcagct ctcgctggtg caatcgcaat ctccaccgca 60
gcttccggcg tagctatccc agcattcgct gcagagacct gttaccgtca gttcaaccgc 120
cgtacccacg aagtctggaa cctggattgt ggtgccgccc ccgccgctcc cgctcccgcc 180
gctccggcag cccctggctg ctaccgtcag tttaaccgtc gcacccacga agtctggaac 240
ctggattgct aa 252
<210> 61
<211> 83
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CspBss-AET-PAS-aMD4-PEG3
<220>
<221> DISULFID
<222> (34)..(50)
<223> 二硫键介于Cys-34和Cys-50
<220>
<221> DISULFID
<222> (67)..(83)
<223> 二硫键介于Cys-67和Cys-83
<400> 61
Met Phe Asn Asn Arg Ile Arg Thr Ala Ala Leu Ala Gly Ala Ile Ala
1 5 10 15
Ile Ser Thr Ala Ala Ser Gly Val Ala Ile Pro Ala Phe Ala Ala Glu
20 25 30
Thr Cys Tyr Arg Gln Phe Asn Arg Arg Thr His Glu Val Trp Asn Leu
35 40 45
Asp Cys Gly Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala
50 55 60
Pro Gly Cys Tyr Arg Gln Phe Asn Arg Arg Thr His Glu Val Trp Asn
65 70 75 80
Leu Asp Cys
<210> 62
<211> 60
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AET-PAS-aMD4_aMD5-PEG11
<220>
<221> DISULFID
<222> (4)..(20)
<223> 二硫键介于Cys-4和Cys-20
<220>
<221> DISULFID
<222> (45)..(60)
<223> 二硫键介于Cys-45和Cys-60
<400> 62
Ala Glu Thr Cys Tyr Arg Gln Phe Asn Arg Arg Thr His Glu Val Trp
1 5 10 15
Asn Leu Asp Cys Gly Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro
20 25 30
Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Gly Cys Tyr Trp Tyr
35 40 45
Tyr Ala Trp Asp Gln Thr Tyr Lys Ala Phe Pro Cys
50 55 60
<210> 63
<211> 273
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CspBss-AET-PAS-aMD4_aMD5-PEG11
<400> 63
atgtttaaca accgtatccg cactgcagct ctcgctggtg caatcgcaat ctccaccgca 60
gcttccggcg tagctatccc agcattcgct gcagagacct gttaccgtca gttcaaccgt 120
cgcacccacg aagtttggaa cctggattgt ggcgcagccc ccgcagcccc cgcacccgca 180
gcccctgcag ccccagcccc agctgcacca gcagcacctg gctgttactg gtattatgcg 240
tgggatcaga cctacaaagc gtttccgtgt tag 273
<210> 64
<211> 90
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CspBss-AET-PAS-aMD4_aMD5-PEG11
<220>
<221> DISULFID
<222> (34)..(50)
<223> 二硫键介于Cys-34和Cys-50
<220>
<221> DISULFID
<222> (75)..(90)
<223> 二硫键介于Cys-75和Cys-90
<400> 64
Met Phe Asn Asn Arg Ile Arg Thr Ala Ala Leu Ala Gly Ala Ile Ala
1 5 10 15
Ile Ser Thr Ala Ala Ser Gly Val Ala Ile Pro Ala Phe Ala Ala Glu
20 25 30
Thr Cys Tyr Arg Gln Phe Asn Arg Arg Thr His Glu Val Trp Asn Leu
35 40 45
Asp Cys Gly Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala
50 55 60
Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Gly Cys Tyr Trp Tyr Tyr Ala
65 70 75 80
Trp Asp Gln Thr Tyr Lys Ala Phe Pro Cys
85 90
<210> 65
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> EpoR结合肽
<220>
<221> DISULFID
<222> (6)..(15)
<223> 二硫键介于Cys-6和Cys-15
<400> 65
Gly Gly Leu Tyr Ala Cys His Met Gly Pro Met Thr Trp Val Cys Gln
1 5 10 15
Pro Leu Arg Gly
20
<210> 66
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> EpoR结合肽
<220>
<221> DISULFID
<222> (1)..(17)
<223> 二硫键介于Cys-1和Cys-17
<400> 66
Cys Ile Ser Trp Asn Glu Phe Asn Ser Pro Asn Trp Arg Phe Ile Thr
1 5 10 15
Cys
<210> 67
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPO受体结合肽
<400> 67
Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gln Trp Leu Ala Ala Arg Ala
1 5 10
<210> 68
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPO受体结合肽
<220>
<221> DISULFID
<222> (3)..(16)
<223> 二硫键介于Cys-3和Cys-16
<400> 68
Gly Gly Cys Ala Asp Gly Pro Thr Leu Arg Glu Trp Ile Ser Phe Cys
1 5 10 15
Gly Gly
<210> 69
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPO受体结合肽
<220>
<221> DISULFID
<222> (3)..(14)
<223> 二硫键介于Cys-3和Cys-14
<400> 69
Gly Gly Cys Thr Leu Arg Glu Trp Leu His Gly Gly Phe Cys Gly Gly
1 5 10 15
<210> 70
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPO受体结合肽
<400> 70
Leu Ala Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gln Trp Leu His Gly Asn Gly
1 5 10 15
Arg Asp Thr
<210> 71
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VEGFR结合肽
<220>
<221> DISULFID
<222> (6)..(13)
<223> 二硫键介于Cys-6和Cys-13
<400> 71
Ala Gly Pro Thr Trp Cys Glu Asp Asp Trp Tyr Tyr Cys Trp Leu Phe
1 5 10 15
Gly Thr
<210> 72
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VEGFR结合肽
<220>
<221> DISULFID
<222> (2)..(12)
<223> 二硫键介于Cys-2和Cys-12
<400> 72
Val Cys Trp Glu Asp Ser Trp Gly Gly Glu Val Cys Trp Leu Phe Gly
1 5 10 15
Thr
<210> 73
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VEGFR结合肽
<220>
<221> DISULFID
<222> (2)..(12)
<223> 二硫键介于Cys-2和Cys-12
<400> 73
Val Cys Trp Glu Asp Ser Trp Gly Gly Glu Val Cys Phe Arg Tyr Asp
1 5 10 15
Pro
<210> 74
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PAS接头
<400> 74
Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro
1 5
<210> 75
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PAS接头
<400> 75
Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro
1 5 10 15
<210> 76
<211> 49
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PAS接头
<400> 76
Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro
1 5 10 15
Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro
20 25 30
Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro
35 40 45
Ala
<210> 77
<211> 49
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PAS接头
<400> 77
Ser Ala Pro Ser Pro Ser Ser Ala Pro Ala Ser Ala Ser Ala Pro Ala
1 5 10 15
Ser Pro Ala Ser Ala Ser Ala Ser Ala Ser Pro Ala Ser Ser Pro Ala
20 25 30
Ser Ala Ser Ser Ala Ser Pro Ala Ala Ser Ser Ala Ser Pro Ala Ser
35 40 45
Ser
<210> 78
<211> 100
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PAS接头
<400> 78
Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro
1 5 10 15
Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro
20 25 30
Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro
35 40 45
Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro
50 55 60
Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro
65 70 75 80
Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro
85 90 95
Ala Ala Pro Ala
100
<210> 79
<211> 100
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PAS接头
<400> 79
Ser Ala Pro Ser Pro Ser Ser Ala Pro Ala Ser Ala Ser Ala Pro Ala
1 5 10 15
Ser Pro Ala Ser Ala Ser Ala Ser Ala Ser Pro Ala Ser Ser Pro Ala
20 25 30
Ser Ala Ser Ser Ala Ser Pro Ala Ala Ser Ser Ala Ser Pro Ala Ser
35 40 45
Ser Ser Ala Ser Pro Ser Ala Pro Ala Ala Pro Ser Ala Ser Ala Ala
50 55 60
Pro Ser Ala Ser Pro Ala Ser Ser Ser Pro Ala Pro Ala Ser Ala Pro
65 70 75 80
Ser Pro Ala Ala Ala Ala Ser Ser Pro Ser Pro Ala Pro Ser Ser Ala
85 90 95
Ser Ser Ala Ala
100
<210> 80
<211> 200
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PAS接头
<400> 80
Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro
1 5 10 15
Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro
20 25 30
Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro
35 40 45
Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro
50 55 60
Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro
65 70 75 80
Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro
85 90 95
Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro
100 105 110
Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro
115 120 125
Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro
130 135 140
Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro
145 150 155 160
Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro
165 170 175
Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro
180 185 190
Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro
195 200
<210> 81
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AET-aMD4dY-PAS8
<220>
<221> DISULFID
<222> (4)..(19)
<223> 二硫键介于Cys-4和Cys-19
<220>
<221> DISULFID
<222> (30)..(45)
<223> 二硫键介于Cys-30和Cys-45
<400> 81
Ala Glu Thr Cys Arg Gln Phe Asn Arg Arg Thr His Glu Val Trp Asn
1 5 10 15
Leu Asp Cys Gly Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Gly Cys Arg Gln
20 25 30
Phe Asn Arg Arg Thr His Glu Val Trp Asn Leu Asp Cys
35 40 45
<210> 82
<211> 86
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AET-aMD4dY-PAS49
<220>
<221> DISULFID
<222> (4)..(19)
<223> 二硫键介于Cys-4和Cys-19
<220>
<221> DISULFID
<222> (71)..(86)
<223> 二硫键介于Cys-71和Cys-86
<400> 82
Ala Glu Thr Cys Arg Gln Phe Asn Arg Arg Thr His Glu Val Trp Asn
1 5 10 15
Leu Asp Cys Gly Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala
20 25 30
Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala
35 40 45
Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala
50 55 60
Ala Pro Ala Pro Ala Gly Cys Arg Gln Phe Asn Arg Arg Thr His Glu
65 70 75 80
Val Trp Asn Leu Asp Cys
85
<210> 83
<211> 137
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AET-aMD4dY-PAS100
<220>
<221> DISULFID
<222> (4)..(19)
<223> 二硫键介于Cys-4和Cys-19
<220>
<221> DISULFID
<222> (122)..(137)
<223> 二硫键介于Cys-122和Cys-137
<400> 83
Ala Glu Thr Cys Arg Gln Phe Asn Arg Arg Thr His Glu Val Trp Asn
1 5 10 15
Leu Asp Cys Gly Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala
20 25 30
Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala
35 40 45
Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala
50 55 60
Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala
65 70 75 80
Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala
85 90 95
Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala
100 105 110
Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Gly Cys Arg Gln Phe Asn Arg Arg
115 120 125
Thr His Glu Val Trp Asn Leu Asp Cys
130 135
<210> 84
<211> 237
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AET-aMD4dY-PAS200
<220>
<221> DISULFID
<222> (4)..(19)
<223> 二硫键介于Cys-4和Cys-19
<220>
<221> DISULFID
<222> (222)..(237)
<223> 二硫键介于Cys-222和Cys-237
<400> 84
Ala Glu Thr Cys Arg Gln Phe Asn Arg Arg Thr His Glu Val Trp Asn
1 5 10 15
Leu Asp Cys Gly Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala
20 25 30
Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala
35 40 45
Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala
50 55 60
Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala
65 70 75 80
Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala
85 90 95
Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala
100 105 110
Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala
115 120 125
Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala
130 135 140
Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala
145 150 155 160
Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala
165 170 175
Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala
180 185 190
Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala
195 200 205
Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Gly Cys Arg Gln
210 215 220
Phe Asn Arg Arg Thr His Glu Val Trp Asn Leu Asp Cys
225 230 235
<210> 85
<211> 52
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AET-aMD4dY-GS15
<220>
<221> DISULFID
<222> (4)..(19)
<223> 二硫键介于Cys-4和Cys-19
<220>
<221> DISULFID
<222> (37)..(52)
<223> 二硫键介于Cys-37和Cys-52
<400> 85
Ala Glu Thr Cys Arg Gln Phe Asn Arg Arg Thr His Glu Val Trp Asn
1 5 10 15
Leu Asp Cys Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Ser Gly Cys Arg Gln Phe Asn Arg Arg Thr His Glu Val Trp
35 40 45
Asn Leu Asp Cys
50
<210> 86
<211> 59
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AET-aMD4dY-GS22
<220>
<221> DISULFID
<222> (4)..(19)
<223> 二硫键介于Cys-4和Cys-19
<220>
<221> DISULFID
<222> (44)..(59)
<223> 二硫键介于Cys-44和Cys-59
<400> 86
Ala Glu Thr Cys Arg Gln Phe Asn Arg Arg Thr His Glu Val Trp Asn
1 5 10 15
Leu Asp Cys Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Cys Arg Gln Phe Asn
35 40 45
Arg Arg Thr His Glu Val Trp Asn Leu Asp Cys
50 55
<210> 87
<211> 228
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CspBss-AET-aMD4dY-PAS8
<400> 87
atgtttaaca accgtatccg cactgcagct ctcgctggtg caatcgcaat ctccaccgca 60
gcttccggcg tagctatccc agcattcgct gcagagacct gccgccagtt caaccgccgc 120
acccacgaag tgtggaacct ggattgcggc gctgcaccag ccgctccagc accaggctgc 180
cgccagttca accgccgcac ccacgaagtg tggaacctgg attgctaa 228
<210> 88
<211> 75
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CspBss-AET-aMD4dY-PAS8
<220>
<221> DISULFID
<222> (34)..(49)
<223> 二硫键介于Cys-34和Cys-49
<220>
<221> DISULFID
<222> (60)..(75)
<223> 二硫键介于Cys-60和Cys-75
<400> 88
Met Phe Asn Asn Arg Ile Arg Thr Ala Ala Leu Ala Gly Ala Ile Ala
1 5 10 15
Ile Ser Thr Ala Ala Ser Gly Val Ala Ile Pro Ala Phe Ala Ala Glu
20 25 30
Thr Cys Arg Gln Phe Asn Arg Arg Thr His Glu Val Trp Asn Leu Asp
35 40 45
Cys Gly Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Gly Cys Arg Gln Phe Asn
50 55 60
Arg Arg Thr His Glu Val Trp Asn Leu Asp Cys
65 70 75
<210> 89
<211> 351
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CspBss-AET-aMD4dY-PAS49
<400> 89
atgtttaaca accgtatccg cactgcagct ctcgctggtg caatcgcaat ctccaccgca 60
gcttccggcg tagctatccc agcattcgct gcagagacct gtcgtcagtt caaccgtcgc 120
acccacgaag tttggaattt ggactgtggc gcagcaccag cggcaccagc accagcagcc 180
ccagcggcac cagccccagc tgcaccagcc gctccagcac cagcagcacc cgcagccccc 240
gctcccgcag cccccgccgc accagcaccc gcagcaccag cagcacccgc tccagcaggt 300
tgtcgccaat tcaaccgccg cacccacgaa gtgtggaacc tggattgcta a 351
<210> 90
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CspBss-AET-aMD4dY-PAS49
<220>
<221> DISULFID
<222> (34)..(49)
<223> 二硫键介于Cys-34和Cys-49
<220>
<221> DISULFID
<222> (101)..(116)
<223> 二硫键介于Cys-101和Cys-116
<400> 90
Met Phe Asn Asn Arg Ile Arg Thr Ala Ala Leu Ala Gly Ala Ile Ala
1 5 10 15
Ile Ser Thr Ala Ala Ser Gly Val Ala Ile Pro Ala Phe Ala Ala Glu
20 25 30
Thr Cys Arg Gln Phe Asn Arg Arg Thr His Glu Val Trp Asn Leu Asp
35 40 45
Cys Gly Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro
50 55 60
Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro
65 70 75 80
Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro
85 90 95
Ala Pro Ala Gly Cys Arg Gln Phe Asn Arg Arg Thr His Glu Val Trp
100 105 110
Asn Leu Asp Cys
115
<210> 91
<211> 504
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CspBss-AET-aMD4dY-PAS100
<400> 91
atgtttaaca accgtatccg cactgcagct ctcgctggtg caatcgcaat ctccaccgca 60
gcttccggcg tagctatccc agcattcgct gcagagacct gtcgtcagtt caaccgtcgc 120
acccacgaag tttggaattt ggactgtggc gcagcaccag cggcaccagc accagcagcc 180
ccagcggcac cagccccagc tgcaccagcc gctccagcac cagcagcccc agcagccccc 240
gctccagcag cacccgcagc accagctccc gcagccccag cagccccagc cccagcagca 300
ccagcagccc cagctccagc agccccagct gcaccagctc cagccgcacc agcagctcca 360
gccccagccg ctcccgccgc cccagccccc gccgcaccag ccgcccctgc tcccgccgcc 420
ccagccgctc ccgctccagc cgctcctgcc ggttgccgcc agttcaaccg ccgcacccac 480
gaagtgtgga acctggattg ctaa 504
<210> 92
<211> 167
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CspBss-AET-aMD4dY-PAS100
<220>
<221> DISULFID
<222> (34)..(49)
<223> 二硫键介于Cys-34和Cys-49
<220>
<221> DISULFID
<222> (152)..(167)
<223> 二硫键介于Cys-152和Cys-167
<400> 92
Met Phe Asn Asn Arg Ile Arg Thr Ala Ala Leu Ala Gly Ala Ile Ala
1 5 10 15
Ile Ser Thr Ala Ala Ser Gly Val Ala Ile Pro Ala Phe Ala Ala Glu
20 25 30
Thr Cys Arg Gln Phe Asn Arg Arg Thr His Glu Val Trp Asn Leu Asp
35 40 45
Cys Gly Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro
50 55 60
Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro
65 70 75 80
Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro
85 90 95
Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro
100 105 110
Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro
115 120 125
Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro
130 135 140
Ala Pro Ala Ala Pro Ala Gly Cys Arg Gln Phe Asn Arg Arg Thr His
145 150 155 160
Glu Val Trp Asn Leu Asp Cys
165
<210> 93
<211> 804
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CspBss-AET-aMD4dY-PAS200
<400> 93
atgtttaaca accgtatccg cactgcagct ctcgctggtg caatcgcaat ctccaccgca 60
gcttccggcg tagctatccc agcattcgct gcagagacct gtcgtcagtt caaccgtcgc 120
acccacgaag tttggaattt ggactgtggc gcagcaccag cggcaccagc accagcagcc 180
ccagcggcac cagccccagc tgcaccagcc gctccagcac cagccgcccc cgccgccccc 240
gcccctgctg ctcctgctgc tcccgctccc gctgctcccg ctgcccctgc tcctgctgct 300
cccgctgcgc cagccccagc agcaccagct gccccagcac cagctgcacc agccgcacca 360
gctccagcag ccccagctgc tccagcacca gcagcaccag cagcaccagc tccagcggca 420
ccagcagcac cagcacctgc ggcaccagcg gctccagccc cagcagcacc agcagcgcca 480
gcaccagcag ctccagcagc accagcacca gcagcaccag cggcaccagc cccagctgca 540
ccagccgctc cagcaccagc tgccccagca gctccagccc cagccgcacc tgccgcacct 600
gcccctgccg ctcctgctgc ccccgctcct gccgctcctg ctgcccctgc ccctgctgct 660
cctgctgctc cagctccagc cgcaccagcc gctccagcac cagctgcacc agcagctcca 720
gccccagctg ccccagcagc tccagcccct ggttgccgcc aatttaatcg ccgcacccac 780
gaggtctgga atcttgactg ctaa 804
<210> 94
<211> 267
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CspBss-AET-aMD4dY-PAS200
<220>
<221> DISULFID
<222> (34)..(49)
<223> 二硫键介于Cys-34和Cys-49
<220>
<221> DISULFID
<222> (252)..(267)
<223> 二硫键介于Cys-252和Cys-267
<400> 94
Met Phe Asn Asn Arg Ile Arg Thr Ala Ala Leu Ala Gly Ala Ile Ala
1 5 10 15
Ile Ser Thr Ala Ala Ser Gly Val Ala Ile Pro Ala Phe Ala Ala Glu
20 25 30
Thr Cys Arg Gln Phe Asn Arg Arg Thr His Glu Val Trp Asn Leu Asp
35 40 45
Cys Gly Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro
50 55 60
Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro
65 70 75 80
Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro
85 90 95
Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro
100 105 110
Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro
115 120 125
Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro
130 135 140
Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro
145 150 155 160
Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro
165 170 175
Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro
180 185 190
Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro
195 200 205
Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro
210 215 220
Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro
225 230 235 240
Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Gly Cys Arg Gln Phe Asn
245 250 255
Arg Arg Thr His Glu Val Trp Asn Leu Asp Cys
260 265
<210> 95
<211> 249
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CspBss-AET-aMD4dY-GS15
<400> 95
atgtttaaca accgtatccg cactgcagct ctcgctggtg caatcgcaat ctccaccgca 60
gcttccggcg tagctatccc agcattcgct gcagagacct gccgccagtt caaccgccgc 120
acccacgaag tgtggaacct ggattgcggc ggcggcggcg gctccggcgg cggcggctcc 180
ggcggcggcg gctccggctg ccgccagttc aaccgccgca cccacgaagt gtggaacctg 240
gattgctaa 249
<210> 96
<211> 82
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CspBss-AET-aMD4dY-GS15
<220>
<221> DISULFID
<222> (34)..(49)
<223> 二硫键介于Cys-34和Cys-49
<220>
<221> DISULFID
<222> (67)..(82)
<223> 二硫键介于Cys-67和Cys-82
<400> 96
Met Phe Asn Asn Arg Ile Arg Thr Ala Ala Leu Ala Gly Ala Ile Ala
1 5 10 15
Ile Ser Thr Ala Ala Ser Gly Val Ala Ile Pro Ala Phe Ala Ala Glu
20 25 30
Thr Cys Arg Gln Phe Asn Arg Arg Thr His Glu Val Trp Asn Leu Asp
35 40 45
Cys Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
50 55 60
Ser Gly Cys Arg Gln Phe Asn Arg Arg Thr His Glu Val Trp Asn Leu
65 70 75 80
Asp Cys
<210> 97
<211> 270
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CspBss-AET-aMD4dY-GS22
<400> 97
atgtttaaca accgtatccg cactgcagct ctcgctggtg caatcgcaat ctccaccgca 60
gcttccggcg tagctatccc agcattcgct gcagagacct gccgccagtt caaccgccgc 120
acccacgaag tgtggaacct ggattgcggc ggcggcggcg gctccggcgg cggcggttct 180
ggcggtggcg gttctggcgg cggcggttct ggcggcggtt gtcgtcagtt caatcgtcgc 240
acccacgaag tctggaatct cgactgctaa 270
<210> 98
<211> 89
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CspBss-AET-aMD4dY-GS22
<220>
<221> DISULFID
<222> (34)..(49)
<223> 二硫键介于Cys-34和Cys-49
<220>
<221> DISULFID
<222> (74)..(89)
<223> 二硫键介于Cys-74和Cys-89
<400> 98
Met Phe Asn Asn Arg Ile Arg Thr Ala Ala Leu Ala Gly Ala Ile Ala
1 5 10 15
Ile Ser Thr Ala Ala Ser Gly Val Ala Ile Pro Ala Phe Ala Ala Glu
20 25 30
Thr Cys Arg Gln Phe Asn Arg Arg Thr His Glu Val Trp Asn Leu Asp
35 40 45
Cys Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
50 55 60
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Cys Arg Gln Phe Asn Arg Arg
65 70 75 80
Thr His Glu Val Trp Asn Leu Asp Cys
85
<210> 99
<211> 259
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AET-aMD4dY-PAS22-PAS200
<220>
<221> DISULFID
<222> (4)..(19)
<223> 二硫键介于Cys-4和Cys-19
<220>
<221> DISULFID
<222> (44)..(59)
<223> 二硫键介于Cys-44和Cys-59
<400> 99
Ala Glu Thr Cys Arg Gln Phe Asn Arg Arg Thr His Glu Val Trp Asn
1 5 10 15
Leu Asp Cys Gly Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala
20 25 30
Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Gly Cys Arg Gln Phe Asn
35 40 45
Arg Arg Thr His Glu Val Trp Asn Leu Asp Cys Ala Ala Pro Ala Ala
50 55 60
Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala
65 70 75 80
Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala
85 90 95
Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala
100 105 110
Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala
115 120 125
Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala
130 135 140
Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala
145 150 155 160
Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala
165 170 175
Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala
180 185 190
Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala
195 200 205
Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala
210 215 220
Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala
225 230 235 240
Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala
245 250 255
Pro Ala Pro
<210> 100
<211> 870
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CspBss-AET-aMD4dY-PAS22-PAS200
<400> 100
atgtttaaca accgtatccg cactgcagct ctcgctggtg caatcgcaat ctccaccgca 60
gcttccggcg tagctatccc agcattcgct gcagagacct gccgtcagtt caaccgccgt 120
acccacgaag tttggaatct cgactgtggt gccgcccctg ccgctcctgc ccctgccgcc 180
ccagccgctc cagcaccagc cgctccagca gccccaggct gccgccagtt caaccgccgc 240
acccacgaag tgtggaacct ggattgcgca gctccagcag cccctgcccc cgccgcccca 300
gccgcccctg cccccgccgc ccccgccgca cccgcccctg ccgcccccgc cgcccccgcc 360
cctgctgctc ctgctgctcc cgctcccgct gctcccgctg cccctgctcc tgctgctccc 420
gctgcgccag ccccagcagc accagctgcc ccagcaccag ctgcaccagc cgcaccagct 480
ccagcagccc cagctgctcc agcaccagca gcaccagcag caccagctcc agcggcacca 540
gcagcaccag cacctgcggc accagcggct ccagccccag cagcaccagc agcgccagca 600
ccagcagctc cagcagcacc agcaccagca gcaccagcgg caccagcccc agctgcacca 660
gccgctccag caccagctgc cccagcagct ccagccccag ctgcccctgc tgcccccgct 720
cctgccgctc ccgctgcccc tgcccctgct gctcctgctg ctcccgctcc tgccgctccc 780
gctgcgccag ctccagcagc cccagctgca ccagccccag ccgcaccagc cgccccagcc 840
cccgcagcac ccgcagcacc agccccataa 870
<210> 101
<211> 289
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CspBss-AET-aMD4dY-PAS22-PAS200
<220>
<221> DISULFID
<222> (34)..(49)
<223> 二硫键介于Cys-34和Cys-49
<220>
<221> DISULFID
<222> (74)..(89)
<223> 二硫键介于Cys-74和Cys-89
<400> 101
Met Phe Asn Asn Arg Ile Arg Thr Ala Ala Leu Ala Gly Ala Ile Ala
1 5 10 15
Ile Ser Thr Ala Ala Ser Gly Val Ala Ile Pro Ala Phe Ala Ala Glu
20 25 30
Thr Cys Arg Gln Phe Asn Arg Arg Thr His Glu Val Trp Asn Leu Asp
35 40 45
Cys Gly Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro
50 55 60
Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Gly Cys Arg Gln Phe Asn Arg Arg
65 70 75 80
Thr His Glu Val Trp Asn Leu Asp Cys Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala
85 90 95
Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala
100 105 110
Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala
115 120 125
Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala
130 135 140
Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala
145 150 155 160
Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala
165 170 175
Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala
180 185 190
Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala
195 200 205
Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala
210 215 220
Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala
225 230 235 240
Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala
245 250 255
Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala
260 265 270
Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala
275 280 285
Pro
<210> 102
<211> 48
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> EPO-PAS8
<220>
<221> DISULFID
<222> (6)..(15)
<223> 二硫键介于Cys-6和Cys-15
<220>
<221> DISULFID
<222> (34)..(43)
<223> 二硫键介于Cys-34和Cys-43
<400> 102
Gly Gly Leu Tyr Ala Cys His Met Gly Pro Met Thr Trp Val Cys Gln
1 5 10 15
Pro Leu Arg Gly Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Gly Gly Leu Tyr
20 25 30
Ala Cys His Met Gly Pro Met Thr Trp Val Cys Gln Pro Leu Arg Gly
35 40 45
<210> 103
<211> 62
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> EPO-PAS22
<220>
<221> DISULFID
<222> (6)..(15)
<223> 二硫键介于Cys-6和Cys-15
<220>
<221> DISULFID
<222> (48)..(57)
<223> 二硫键介于Cys-48和Cys-57
<400> 103
Gly Gly Leu Tyr Ala Cys His Met Gly Pro Met Thr Trp Val Cys Gln
1 5 10 15
Pro Leu Arg Gly Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala
20 25 30
Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Gly Gly Leu Tyr Ala Cys
35 40 45
His Met Gly Pro Met Thr Trp Val Cys Gln Pro Leu Arg Gly
50 55 60
<210> 104
<211> 51
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AET-EPO-PAS8
<220>
<221> DISULFID
<222> (9)..(18)
<223> 二硫键介于Cys-9和Cys-18
<220>
<221> DISULFID
<222> (37)..(46)
<223> 二硫键介于Cys-37和Cys-46
<400> 104
Ala Glu Thr Gly Gly Leu Tyr Ala Cys His Met Gly Pro Met Thr Trp
1 5 10 15
Val Cys Gln Pro Leu Arg Gly Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Gly
20 25 30
Gly Leu Tyr Ala Cys His Met Gly Pro Met Thr Trp Val Cys Gln Pro
35 40 45
Leu Arg Gly
50
<210> 105
<211> 65
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AET-EPO-PAS22
<220>
<221> DISULFID
<222> (9)..(18)
<223> 二硫键介于Cys-9和Cys-18
<220>
<221> DISULFID
<222> (51)..(60)
<223> 二硫键介于Cys-51和Cys-60
<400> 105
Ala Glu Thr Gly Gly Leu Tyr Ala Cys His Met Gly Pro Met Thr Trp
1 5 10 15
Val Cys Gln Pro Leu Arg Gly Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala
20 25 30
Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Gly Gly Leu
35 40 45
Tyr Ala Cys His Met Gly Pro Met Thr Trp Val Cys Gln Pro Leu Arg
50 55 60
Gly
65
<210> 106
<211> 222
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CspAss-EPO-PAS8
<400> 106
atgaaacgca tgaaatcgct ggctgcggcg ctcaccgtcg ctggggccat gctggccgca 60
cctgtggcaa cggcaggtgg cctttacgct tgtcacatgg gtccaatgac ctgggtttgt 120
cagcccctcc gtggtgccgc tcctgccgcc cccgctcctg gtggcctgta cgcatgccat 180
atgggtccaa tgacttgggt gtgccagcca ctccgcggct aa 222
<210> 107
<211> 73
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CspAss-EPO-PAS8
<220>
<221> DISULFID
<222> (31)..(40)
<223> 二硫键介于Cys-31和Cys-40
<220>
<221> DISULFID
<222> (59)..(68)
<223> 二硫键介于Cys-59和Cys-68
<400> 107
Met Lys Arg Met Lys Ser Leu Ala Ala Ala Leu Thr Val Ala Gly Ala
1 5 10 15
Met Leu Ala Ala Pro Val Ala Thr Ala Gly Gly Leu Tyr Ala Cys His
20 25 30
Met Gly Pro Met Thr Trp Val Cys Gln Pro Leu Arg Gly Ala Ala Pro
35 40 45
Ala Ala Pro Ala Pro Gly Gly Leu Tyr Ala Cys His Met Gly Pro Met
50 55 60
Thr Trp Val Cys Gln Pro Leu Arg Gly
65 70
<210> 108
<211> 264
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CspAss-EPO-PAS22
<400> 108
atgaaacgca tgaaatcgct ggctgcggcg ctcaccgtcg ctggggccat gctggccgca 60
cctgtggcaa cggcaggcgg cctttacgct tgtcacatgg gtccaatgac ctgggtctgt 120
caacctctcc gtggtgcagc cccggcagcc cccgctccag ccgcaccagc agccccagcc 180
ccagctgcac cagccgctcc aggcggcctc tacgcctgcc acatgggtcc tatgacctgg 240
gtgtgccaac cacttcgcgg ctaa 264
<210> 109
<211> 87
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CspAss-EPO-PAS22
<220>
<221> DISULFID
<222> (31)..(40)
<223> 二硫键介于Cys-31和Cys-40
<220>
<221> DISULFID
<222> (73)..(82)
<223> 二硫键介于Cys-73和Cys-82
<400> 109
Met Lys Arg Met Lys Ser Leu Ala Ala Ala Leu Thr Val Ala Gly Ala
1 5 10 15
Met Leu Ala Ala Pro Val Ala Thr Ala Gly Gly Leu Tyr Ala Cys His
20 25 30
Met Gly Pro Met Thr Trp Val Cys Gln Pro Leu Arg Gly Ala Ala Pro
35 40 45
Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro
50 55 60
Ala Ala Pro Gly Gly Leu Tyr Ala Cys His Met Gly Pro Met Thr Trp
65 70 75 80
Val Cys Gln Pro Leu Arg Gly
85
<210> 110
<211> 246
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CspBss-AET-EPO-PAS8
<400> 110
atgtttaaca accgtatccg cactgcagct ctcgctggtg caatcgcaat ctccaccgca 60
gcttccggcg tagctatccc agcattcgct gcagagaccg gtggccttta cgcttgtcac 120
atgggtccaa tgacctgggt ttgtcagccc ctccgtggtg ccgctcctgc cgcccccgct 180
cctggtggcc tgtacgcatg ccatatgggt ccaatgactt gggtgtgcca gccactccgc 240
ggctaa 246
<210> 111
<211> 81
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CspBss-AET-EPO-PAS8
<220>
<221> DISULFID
<222> (39)..(48)
<223> 二硫键介于Cys-39和Cys-48
<220>
<221> DISULFID
<222> (67)..(76)
<223> 二硫键介于Cys-67和Cys-76
<400> 111
Met Phe Asn Asn Arg Ile Arg Thr Ala Ala Leu Ala Gly Ala Ile Ala
1 5 10 15
Ile Ser Thr Ala Ala Ser Gly Val Ala Ile Pro Ala Phe Ala Ala Glu
20 25 30
Thr Gly Gly Leu Tyr Ala Cys His Met Gly Pro Met Thr Trp Val Cys
35 40 45
Gln Pro Leu Arg Gly Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Gly Gly Leu
50 55 60
Tyr Ala Cys His Met Gly Pro Met Thr Trp Val Cys Gln Pro Leu Arg
65 70 75 80
Gly
<210> 112
<211> 288
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CspBss-AET-EPO-PAS22
<400> 112
atgtttaaca accgtatccg cactgcagct ctcgctggtg caatcgcaat ctccaccgca 60
gcttccggcg tagctatccc agcattcgct gcagagaccg gcggccttta cgcttgtcac 120
atgggtccaa tgacctgggt ctgtcaacct ctccgtggtg cagccccggc agcccccgct 180
ccagccgcac cagcagcccc agccccagct gcaccagccg ctccaggcgg cctctacgcc 240
tgccacatgg gtcctatgac ctgggtgtgc caaccacttc gcggctaa 288
<210> 113
<211> 95
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CspBss-AET-EPO-PAS22
<220>
<221> DISULFID
<222> (39)..(48)
<223> 二硫键介于Cys-39和Cys-48
<220>
<221> DISULFID
<222> (81)..(90)
<223> 二硫键介于Cys-81和Cys-90
<400> 113
Met Phe Asn Asn Arg Ile Arg Thr Ala Ala Leu Ala Gly Ala Ile Ala
1 5 10 15
Ile Ser Thr Ala Ala Ser Gly Val Ala Ile Pro Ala Phe Ala Ala Glu
20 25 30
Thr Gly Gly Leu Tyr Ala Cys His Met Gly Pro Met Thr Trp Val Cys
35 40 45
Gln Pro Leu Arg Gly Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro
50 55 60
Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Gly Gly Leu Tyr Ala
65 70 75 80
Cys His Met Gly Pro Met Thr Trp Val Cys Gln Pro Leu Arg Gly
85 90 95
<210> 114
<211> 44
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPO2-PAS8
<220>
<221> DISULFID
<222> (3)..(16)
<223> 二硫键介于Cys-3和Cys-16
<220>
<221> DISULFID
<222> (29)..(42)
<223> 二硫键介于Cys-29和Cys-42
<400> 114
Gly Gly Cys Ala Asp Gly Pro Thr Leu Arg Glu Trp Ile Ser Phe Cys
1 5 10 15
Gly Gly Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Gly Gly Cys Ala Asp Gly
20 25 30
Pro Thr Leu Arg Glu Trp Ile Ser Phe Cys Gly Gly
35 40
<210> 115
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AET-TPO1-PAS8
<400> 115
Ala Glu Thr Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gln Trp Leu Ala Ala Arg
1 5 10 15
Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg
20 25 30
Gln Trp Leu Ala Ala Arg Ala
35
<210> 116
<211> 47
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AET-TPO2-PAS8
<220>
<221> DISULFID
<222> (6)..(19)
<223> 二硫键介于Cys-6和Cys-19
<220>
<221> DISULFID
<222> (32)..(45)
<223> 二硫键介于Cys-32和Cys-45
<400> 116
Ala Glu Thr Gly Gly Cys Ala Asp Gly Pro Thr Leu Arg Glu Trp Ile
1 5 10 15
Ser Phe Cys Gly Gly Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Gly Gly Cys
20 25 30
Ala Asp Gly Pro Thr Leu Arg Glu Trp Ile Ser Phe Cys Gly Gly
35 40 45
<210> 117
<211> 210
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CspAss-TPO2-PAS8
<400> 117
atgaaacgca tgaaatcgct ggctgcggcg ctcaccgtcg ctggggccat gctggccgca 60
cctgtggcaa cggcaggtgg ttgtgctgat ggtcctacct tgcgtgaatg gatttccttc 120
tgcggcggcg ctgctccggc tgcccctgcc cctggcggtt gcgcagatgg cccaaccctg 180
cgcgaatgga tctccttctg cggcggctaa 210
<210> 118
<211> 69
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CspAss-TPO2-PAS8
<220>
<221> DISULFID
<222> (28)..(41)
<223> 二硫键介于Cys-28和Cys-41
<220>
<221> DISULFID
<222> (54)..(67)
<223> 二硫键介于Cys-54和Cys-67
<400> 118
Met Lys Arg Met Lys Ser Leu Ala Ala Ala Leu Thr Val Ala Gly Ala
1 5 10 15
Met Leu Ala Ala Pro Val Ala Thr Ala Gly Gly Cys Ala Asp Gly Pro
20 25 30
Thr Leu Arg Glu Trp Ile Ser Phe Cys Gly Gly Ala Ala Pro Ala Ala
35 40 45
Pro Ala Pro Gly Gly Cys Ala Asp Gly Pro Thr Leu Arg Glu Trp Ile
50 55 60
Ser Phe Cys Gly Gly
65
<210> 119
<211> 210
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CspBss-AET-TPO1-PAS8
<400> 119
atgtttaaca accgtatccg cactgcagct ctcgctggtg caatcgcaat ctccaccgca 60
gcttccggcg tagctatccc agcattcgct gcagagacca tcgaaggtcc taccctccgt 120
caatggctgg ctgctcgtgc cgccgctccc gccgctcctg ctccaatcga aggtcccacc 180
ctccgtcagt ggctggcagc ccgcgcataa 210
<210> 120
<211> 69
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CspBss-AET-TPO1-PAS8
<400> 120
Met Phe Asn Asn Arg Ile Arg Thr Ala Ala Leu Ala Gly Ala Ile Ala
1 5 10 15
Ile Ser Thr Ala Ala Ser Gly Val Ala Ile Pro Ala Phe Ala Ala Glu
20 25 30
Thr Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gln Trp Leu Ala Ala Arg Ala Ala
35 40 45
Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gln Trp
50 55 60
Leu Ala Ala Arg Ala
65
<210> 121
<211> 234
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CspBss-AET-TPO2-PAS8
<400> 121
atgtttaaca accgtatccg cactgcagct ctcgctggtg caatcgcaat ctccaccgca 60
gcttccggcg tagctatccc agcattcgct gcagagaccg gtggttgtgc tgatggtcct 120
accttgcgtg aatggatttc cttctgcggc ggcgctgctc cggctgcccc tgcccctggc 180
ggttgcgcag atggcccaac cctgcgcgaa tggatctcct tctgcggcgg ctaa 234
<210> 122
<211> 77
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CspBss-AET-TPO2-PAS8
<220>
<221> DISULFID
<222> (36)..(49)
<223> 二硫键介于Cys-36和Cys-49
<220>
<221> DISULFID
<222> (62)..(75)
<223> 二硫键介于Cys-62和Cys-75
<400> 122
Met Phe Asn Asn Arg Ile Arg Thr Ala Ala Leu Ala Gly Ala Ile Ala
1 5 10 15
Ile Ser Thr Ala Ala Ser Gly Val Ala Ile Pro Ala Phe Ala Ala Glu
20 25 30
Thr Gly Gly Cys Ala Asp Gly Pro Thr Leu Arg Glu Trp Ile Ser Phe
35 40 45
Cys Gly Gly Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Gly Gly Cys Ala Asp
50 55 60
Gly Pro Thr Leu Arg Glu Trp Ile Ser Phe Cys Gly Gly
65 70 75
<210> 123
<211> 54
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AET-VEGFR_D2-PAS16
<220>
<221> DISULFID
<222> (9)..(16)
<223> 二硫键介于Cys-9和Cys-16
<220>
<221> DISULFID
<222> (39)..(49)
<223> 二硫键介于Cys-39和Cys-49
<400> 123
Ala Glu Thr Ala Gly Pro Thr Trp Cys Glu Asp Asp Trp Tyr Tyr Cys
1 5 10 15
Trp Leu Phe Gly Thr Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro
20 25 30
Ala Ala Pro Ala Pro Val Cys Trp Glu Asp Ser Trp Gly Gly Glu Val
35 40 45
Cys Trp Leu Phe Gly Thr
50
<210> 124
<211> 255
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CspBss-AET-VEGFR_D2-PAS16
<400> 124
atgtttaaca accgtatccg cactgcagct ctcgctggtg caatcgcaat ctccaccgca 60
gcttccggcg tagctatccc agcattcgct gcagagaccg ctggtcctac ctggtgtgaa 120
gacgactggt actactgctg gctgtttggc accgctgctc ccgctgcccc tgctcctgcc 180
gctccggcag ccccagctcc tgtgtgttgg gaagattctt ggggcggcga agtttgctgg 240
ctgtttggca cctaa 255
<210> 125
<211> 84
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CspBss-AET-VEGFR_D2-PAS16
<220>
<221> DISULFID
<222> (39)..(46)
<223> 二硫键介于Cys-39和Cys-46
<220>
<221> DISULFID
<222> (69)..(79)
<223> 二硫键介于Cys-69和Cys-79
<400> 125
Met Phe Asn Asn Arg Ile Arg Thr Ala Ala Leu Ala Gly Ala Ile Ala
1 5 10 15
Ile Ser Thr Ala Ala Ser Gly Val Ala Ile Pro Ala Phe Ala Ala Glu
20 25 30
Thr Ala Gly Pro Thr Trp Cys Glu Asp Asp Trp Tyr Tyr Cys Trp Leu
35 40 45
Phe Gly Thr Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala
50 55 60
Pro Ala Pro Val Cys Trp Glu Asp Ser Trp Gly Gly Glu Val Cys Trp
65 70 75 80
Leu Phe Gly Thr
<210> 126
<211> 92
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AET-EPO-PAS49
<220>
<221> DISULFID
<222> (9)..(18)
<223> 二硫键介于Cys-9和Cys-18
<220>
<221> DISULFID
<222> (78)..(87)
<223> 二硫键介于Cys-78和Cys-87
<400> 126
Ala Glu Thr Gly Gly Leu Tyr Ala Cys His Met Gly Pro Met Thr Trp
1 5 10 15
Val Cys Gln Pro Leu Arg Gly Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala
20 25 30
Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala
35 40 45
Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala
50 55 60
Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Gly Gly Leu Tyr Ala Cys His Met
65 70 75 80
Gly Pro Met Thr Trp Val Cys Gln Pro Leu Arg Gly
85 90
<210> 127
<211> 92
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AET-EPO-PAS49-b
<220>
<221> DISULFID
<222> (9)..(18)
<223> 二硫键介于Cys-9和Cys-18
<220>
<221> DISULFID
<222> (78)..(87)
<223> 二硫键介于Cys-78和Cys-87
<400> 127
Ala Glu Thr Gly Gly Leu Tyr Ala Cys His Met Gly Pro Met Thr Trp
1 5 10 15
Val Cys Gln Pro Leu Arg Gly Ser Ala Pro Ser Pro Ser Ser Ala Pro
20 25 30
Ala Ser Ala Ser Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ser Ala Ser Ala Ser Ala
35 40 45
Ser Pro Ala Ser Ser Pro Ala Ser Ala Ser Ser Ala Ser Pro Ala Ala
50 55 60
Ser Ser Ala Ser Pro Ala Ser Ser Gly Gly Leu Tyr Ala Cys His Met
65 70 75 80
Gly Pro Met Thr Trp Val Cys Gln Pro Leu Arg Gly
85 90
<210> 128
<211> 143
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AET-EPO-PAS100
<220>
<221> DISULFID
<222> (9)..(18)
<223> 二硫键介于Cys-9和Cys-18
<220>
<221> DISULFID
<222> (129)..(138)
<223> 二硫键介于Cys-129和Cys-138
<400> 128
Ala Glu Thr Gly Gly Leu Tyr Ala Cys His Met Gly Pro Met Thr Trp
1 5 10 15
Val Cys Gln Pro Leu Arg Gly Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala
20 25 30
Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala
35 40 45
Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala
50 55 60
Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala
65 70 75 80
Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala
85 90 95
Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala
100 105 110
Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Gly Gly Leu Tyr Ala
115 120 125
Cys His Met Gly Pro Met Thr Trp Val Cys Gln Pro Leu Arg Gly
130 135 140
<210> 129
<211> 143
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AET-EPO-PAS100-b
<220>
<221> DISULFID
<222> (9)..(18)
<223> 二硫键介于Cys-9和Cys-18
<220>
<221> DISULFID
<222> (129)..(138)
<223> 二硫键介于Cys-129和Cys-138
<400> 129
Ala Glu Thr Gly Gly Leu Tyr Ala Cys His Met Gly Pro Met Thr Trp
1 5 10 15
Val Cys Gln Pro Leu Arg Gly Ser Ala Pro Ser Pro Ser Ser Ala Pro
20 25 30
Ala Ser Ala Ser Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ser Ala Ser Ala Ser Ala
35 40 45
Ser Pro Ala Ser Ser Pro Ala Ser Ala Ser Ser Ala Ser Pro Ala Ala
50 55 60
Ser Ser Ala Ser Pro Ala Ser Ser Ser Ala Ser Pro Ser Ala Pro Ala
65 70 75 80
Ala Pro Ser Ala Ser Ala Ala Pro Ser Ala Ser Pro Ala Ser Ser Ser
85 90 95
Pro Ala Pro Ala Ser Ala Pro Ser Pro Ala Ala Ala Ala Ser Ser Pro
100 105 110
Ser Pro Ala Pro Ser Ser Ala Ser Ser Ala Ala Gly Gly Leu Tyr Ala
115 120 125
Cys His Met Gly Pro Met Thr Trp Val Cys Gln Pro Leu Arg Gly
130 135 140
<210> 130
<211> 51
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AET-EPO-GS8
<220>
<221> DISULFID
<222> (9)..(18)
<223> 二硫键介于Cys-9和Cys-18
<220>
<221> DISULFID
<222> (37)..(46)
<223> 二硫键介于Cys-37和Cys-46
<400> 130
Ala Glu Thr Gly Gly Leu Tyr Ala Cys His Met Gly Pro Met Thr Trp
1 5 10 15
Val Cys Gln Pro Leu Arg Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Gly Leu Tyr Ala Cys His Met Gly Pro Met Thr Trp Val Cys Gln Pro
35 40 45
Leu Arg Gly
50
<210> 131
<211> 65
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AET-EPO-GS22
<220>
<221> DISULFID
<222> (9)..(18)
<223> 二硫键介于Cys-9和Cys-18
<220>
<221> DISULFID
<222> (51)..(60)
<223> 二硫键介于Cys-51和Cys-60
<400> 131
Ala Glu Thr Gly Gly Leu Tyr Ala Cys His Met Gly Pro Met Thr Trp
1 5 10 15
Val Cys Gln Pro Leu Arg Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Leu
35 40 45
Tyr Ala Cys His Met Gly Pro Met Thr Trp Val Cys Gln Pro Leu Arg
50 55 60
Gly
65
<210> 132
<211> 369
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CspBss-AET-EPO-PAS49
<400> 132
atgtttaaca accgtatccg cactgcagct ctcgctggtg caatcgcaat ctccaccgca 60
gcttccggcg tagctatccc agcattcgct gcagagaccg gtggtctcta cgcctgtcac 120
atgggtccta tgacctgggt gtgccaacct ctccgtggtg ccgcccccgc cgcccccgcc 180
cccgccgccc cagctgcacc agctccagca gccccagccg caccagcccc agcagctcca 240
gctgccccag caccagcagc accagccgct ccagcaccag ctgctccagc agctccagcc 300
ccagccggcg gcctttacgc ctgccacatg ggtcctatga cctgggtttg ccagcctctt 360
cgcggttag 369
<210> 133
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CspBss-AET-EPO-PAS49
<220>
<221> DISULFID
<222> (39)..(48)
<223> 二硫键介于Cys-39和Cys-48
<220>
<221> DISULFID
<222> (108)..(117)
<223> 二硫键介于Cys-108和Cys-117
<400> 133
Met Phe Asn Asn Arg Ile Arg Thr Ala Ala Leu Ala Gly Ala Ile Ala
1 5 10 15
Ile Ser Thr Ala Ala Ser Gly Val Ala Ile Pro Ala Phe Ala Ala Glu
20 25 30
Thr Gly Gly Leu Tyr Ala Cys His Met Gly Pro Met Thr Trp Val Cys
35 40 45
Gln Pro Leu Arg Gly Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro
50 55 60
Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro
65 70 75 80
Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro
85 90 95
Ala Ala Pro Ala Pro Ala Gly Gly Leu Tyr Ala Cys His Met Gly Pro
100 105 110
Met Thr Trp Val Cys Gln Pro Leu Arg Gly
115 120
<210> 134
<211> 369
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CspBss-AET-EPO-PAS49-b
<400> 134
atgtttaaca accgtatccg cactgcagct ctcgctggtg caatcgcaat ctccaccgca 60
gcttccggcg tagctatccc agcattcgct gcagagaccg gcggactgta cgcctgccat 120
atggggccaa tgacctgggt gtgccaaccg ttgcgtggat cagcgccatc gccctcttcc 180
gctccagcct ctgcgtctgc tcccgcatcc ccagcgtcag cttccgcatc cgcttcgcct 240
gcaagctccc ctgctagcgc gtcctctgcc tcccctgcag catcctcggc ttccccggca 300
agctcaggtg gcctctatgc ctgccacatg ggtccgatga cttgggtctg tcagccactt 360
cgcggctaa 369
<210> 135
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CspBss-AET-EPO-PAS49-b
<220>
<221> DISULFID
<222> (39)..(48)
<223> 二硫键介于Cys-39和Cys-48
<220>
<221> DISULFID
<222> (108)..(117)
<223> 二硫键介于Cys-108和Cys-117
<400> 135
Met Phe Asn Asn Arg Ile Arg Thr Ala Ala Leu Ala Gly Ala Ile Ala
1 5 10 15
Ile Ser Thr Ala Ala Ser Gly Val Ala Ile Pro Ala Phe Ala Ala Glu
20 25 30
Thr Gly Gly Leu Tyr Ala Cys His Met Gly Pro Met Thr Trp Val Cys
35 40 45
Gln Pro Leu Arg Gly Ser Ala Pro Ser Pro Ser Ser Ala Pro Ala Ser
50 55 60
Ala Ser Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ser Ala Ser Ala Ser Ala Ser Pro
65 70 75 80
Ala Ser Ser Pro Ala Ser Ala Ser Ser Ala Ser Pro Ala Ala Ser Ser
85 90 95
Ala Ser Pro Ala Ser Ser Gly Gly Leu Tyr Ala Cys His Met Gly Pro
100 105 110
Met Thr Trp Val Cys Gln Pro Leu Arg Gly
115 120
<210> 136
<211> 522
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CspBss-AET-EPO-PAS100
<400> 136
atgtttaaca accgtatccg cactgcagct ctcgctggtg caatcgcaat ctccaccgca 60
gcttccggcg tagctatccc agcattcgct gcagagaccg gtggtttgta cgcttgccac 120
atgggtccta tgacctgggt ttgtcagcct cttcgtggtg ccgcccccgc agcccccgct 180
cccgctgcac cagccgcacc agcaccagca gctccagcag ctccagcacc agctgcacca 240
gccgccccag caccagcagc cccagccgct ccagcaccag ctgccccagc tgctccagct 300
ccagcagcac cagctgcccc agccccagca gcaccagccg ctccagcccc agctgcccca 360
gcagctccag ctccagctgc tccagcagcc ccagcaccag ccgccccagc agccccagct 420
ccagctgcac cagctgcacc agccccagcc gcaccagccg gcggtttgta cgcttgccac 480
atgggtccga tgacctgggt ttgtcagccc cttcgcggtt ag 522
<210> 137
<211> 173
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CspBss-AET-EPO-PAS100
<220>
<221> DISULFID
<222> (39)..(48)
<223> 二硫键介于Cys-39和Cys-48
<220>
<221> DISULFID
<222> (159)..(168)
<223> 二硫键介于Cys-159和Cys-168
<400> 137
Met Phe Asn Asn Arg Ile Arg Thr Ala Ala Leu Ala Gly Ala Ile Ala
1 5 10 15
Ile Ser Thr Ala Ala Ser Gly Val Ala Ile Pro Ala Phe Ala Ala Glu
20 25 30
Thr Gly Gly Leu Tyr Ala Cys His Met Gly Pro Met Thr Trp Val Cys
35 40 45
Gln Pro Leu Arg Gly Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro
50 55 60
Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro
65 70 75 80
Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro
85 90 95
Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro
100 105 110
Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro
115 120 125
Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro
130 135 140
Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Gly Gly Leu Tyr Ala Cys His
145 150 155 160
Met Gly Pro Met Thr Trp Val Cys Gln Pro Leu Arg Gly
165 170
<210> 138
<211> 522
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CspBss-AET-EPO-PAS100-b
<400> 138
atgtttaaca accgtatccg cactgcagct ctcgctggtg caatcgcaat ctccaccgca 60
gcttccggcg tagctatccc agcattcgct gcagagaccg gcggcttgta cgcctgccat 120
atggggccta tgacctgggt ctgccaacca ctgcgtggaa gcgcaccctc accatcctcc 180
gcaccagcta gcgcctccgc tcctgcaagc ccagcgtccg catccgcttc ggcctcacca 240
gcgtcctctc cagcttccgc ttcgagcgct agcccagcgg catcctctgc ctccccagcc 300
tcctcgtctg catccccgtc cgctccagcc gcaccttctg catctgcggc tccgtccgcc 360
tccccggcat cttcctcgcc tgctcccgcg tcagcgcctt ccccggctgc agcggcctcc 420
tctccgtcac ccgctccttc aagcgcgtcg tctgcagcag gaggcctcta tgcctgccac 480
atgggtccga tgacttgggt gtgtcagccc cttcgcggtt aa 522
<210> 139
<211> 173
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CspBss-AET-EPO-PAS100-b
<220>
<221> DISULFID
<222> (39)..(48)
<223> 二硫键介于Cys-39和Cys-48
<220>
<221> DISULFID
<222> (159)..(168)
<223> 二硫键介于Cys-159和Cys-168
<400> 139
Met Phe Asn Asn Arg Ile Arg Thr Ala Ala Leu Ala Gly Ala Ile Ala
1 5 10 15
Ile Ser Thr Ala Ala Ser Gly Val Ala Ile Pro Ala Phe Ala Ala Glu
20 25 30
Thr Gly Gly Leu Tyr Ala Cys His Met Gly Pro Met Thr Trp Val Cys
35 40 45
Gln Pro Leu Arg Gly Ser Ala Pro Ser Pro Ser Ser Ala Pro Ala Ser
50 55 60
Ala Ser Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ser Ala Ser Ala Ser Ala Ser Pro
65 70 75 80
Ala Ser Ser Pro Ala Ser Ala Ser Ser Ala Ser Pro Ala Ala Ser Ser
85 90 95
Ala Ser Pro Ala Ser Ser Ser Ala Ser Pro Ser Ala Pro Ala Ala Pro
100 105 110
Ser Ala Ser Ala Ala Pro Ser Ala Ser Pro Ala Ser Ser Ser Pro Ala
115 120 125
Pro Ala Ser Ala Pro Ser Pro Ala Ala Ala Ala Ser Ser Pro Ser Pro
130 135 140
Ala Pro Ser Ser Ala Ser Ser Ala Ala Gly Gly Leu Tyr Ala Cys His
145 150 155 160
Met Gly Pro Met Thr Trp Val Cys Gln Pro Leu Arg Gly
165 170
<210> 140
<211> 246
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CspBss-AET-EPO-GS8
<400> 140
atgtttaaca accgtatccg cactgcagct ctcgctggtg caatcgcaat ctccaccgca 60
gcttccggcg tagctatccc agcattcgct gcagagaccg gcggcctcta tgcatgccat 120
atggggccaa tgacctgggt ctgccaaccg ttgcgtggcg gaggtggcgg ttccggtgga 180
ggtggtggcc tgtacgcttg ccacatggga cccatgactt gggtgtgtca gcctcttcgc 240
ggctaa 246
<210> 141
<211> 81
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CspBss-AET-EPO-GS8
<220>
<221> DISULFID
<222> (39)..(48)
<223> 二硫键介于Cys-39和Cys-48
<220>
<221> DISULFID
<222> (67)..(76)
<223> 二硫键介于Cys-67和Cys-76
<400> 141
Met Phe Asn Asn Arg Ile Arg Thr Ala Ala Leu Ala Gly Ala Ile Ala
1 5 10 15
Ile Ser Thr Ala Ala Ser Gly Val Ala Ile Pro Ala Phe Ala Ala Glu
20 25 30
Thr Gly Gly Leu Tyr Ala Cys His Met Gly Pro Met Thr Trp Val Cys
35 40 45
Gln Pro Leu Arg Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Leu
50 55 60
Tyr Ala Cys His Met Gly Pro Met Thr Trp Val Cys Gln Pro Leu Arg
65 70 75 80
Gly
<210> 142
<211> 288
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CspBss-AET-EPO-GS22
<400> 142
atgtttaaca accgtatccg cactgcagct ctcgctggtg caatcgcaat ctccaccgca 60
gcttccggcg tagctatccc agcattcgct gcagagaccg gtgggctgta tgcttgccat 120
atggggccta tgacttgggt gtgccaaccc ttgcgtggtg gaggcggagg ctccggcggt 180
ggtgggagcg gaggaggcgg ttccggtggc ggtggctctg gcggaggcgg cctctacgca 240
tgccacatgg gtccgatgac ctgggtctgt cagccacttc gcggctaa 288
<210> 143
<211> 95
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CspBss-AET-EPO-GS22
<220>
<221> DISULFID
<222> (39)..(48)
<223> 二硫键介于Cys-39和Cys-48
<220>
<221> DISULFID
<222> (81)..(90)
<223> 二硫键介于Cys-81和Cys-90
<400> 143
Met Phe Asn Asn Arg Ile Arg Thr Ala Ala Leu Ala Gly Ala Ile Ala
1 5 10 15
Ile Ser Thr Ala Ala Ser Gly Val Ala Ile Pro Ala Phe Ala Ala Glu
20 25 30
Thr Gly Gly Leu Tyr Ala Cys His Met Gly Pro Met Thr Trp Val Cys
35 40 45
Gln Pro Leu Arg Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
50 55 60
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Leu Tyr Ala
65 70 75 80
Cys His Met Gly Pro Met Thr Trp Val Cys Gln Pro Leu Arg Gly
85 90 95
<210> 144
<211> 265
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AET-EPO-PAS22-PAS200
<220>
<221> DISULFID
<222> (9)..(18)
<223> 二硫键介于Cys-9和Cys-18
<220>
<221> DISULFID
<222> (51)..(60)
<223> 二硫键介于Cys-51和Cys-60
<400> 144
Ala Glu Thr Gly Gly Leu Tyr Ala Cys His Met Gly Pro Met Thr Trp
1 5 10 15
Val Cys Gln Pro Leu Arg Gly Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala
20 25 30
Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Gly Gly Leu
35 40 45
Tyr Ala Cys His Met Gly Pro Met Thr Trp Val Cys Gln Pro Leu Arg
50 55 60
Gly Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala
65 70 75 80
Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala
85 90 95
Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala
100 105 110
Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala
115 120 125
Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala
130 135 140
Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala
145 150 155 160
Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala
165 170 175
Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala
180 185 190
Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala
195 200 205
Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala
210 215 220
Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala
225 230 235 240
Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala
245 250 255
Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro
260 265
<210> 145
<211> 665
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AET-EPO-PAS22-PAS600
<220>
<221> DISULFID
<222> (9)..(18)
<223> 二硫键介于Cys-9和Cys-18
<220>
<221> DISULFID
<222> (51)..(60)
<223> 二硫键介于Cys-51和Cys-60
<400> 145
Ala Glu Thr Gly Gly Leu Tyr Ala Cys His Met Gly Pro Met Thr Trp
1 5 10 15
Val Cys Gln Pro Leu Arg Gly Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala
20 25 30
Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Gly Gly Leu
35 40 45
Tyr Ala Cys His Met Gly Pro Met Thr Trp Val Cys Gln Pro Leu Arg
50 55 60
Gly Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala
65 70 75 80
Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala
85 90 95
Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala
100 105 110
Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala
115 120 125
Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala
130 135 140
Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala
145 150 155 160
Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala
165 170 175
Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala
180 185 190
Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala
195 200 205
Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala
210 215 220
Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala
225 230 235 240
Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala
245 250 255
Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala
260 265 270
Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala
275 280 285
Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala
290 295 300
Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala
305 310 315 320
Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala
325 330 335
Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala
340 345 350
Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala
355 360 365
Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala
370 375 380
Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala
385 390 395 400
Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala
405 410 415
Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala
420 425 430
Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala
435 440 445
Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala
450 455 460
Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala
465 470 475 480
Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala
485 490 495
Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala
500 505 510
Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala
515 520 525
Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala
530 535 540
Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala
545 550 555 560
Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala
565 570 575
Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala
580 585 590
Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala
595 600 605
Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala
610 615 620
Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala
625 630 635 640
Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala
645 650 655
Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro
660 665
<210> 146
<211> 888
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CspBss-AET-EPO-PAS22-PAS200
<400> 146
atgttcaaca accgtattcg taccgctgcc ctggccggcg ccattgccat ctccaccgct 60
gcgtccggcg tcgccattcc tgcgttcgca gccgaaaccg gcggcctgta cgcatgccac 120
atgggtccaa tgacctgggt gtgccagcca ctgcgcggcg ctgcaccagc tgctccagca 180
ccagcagccc cagctgcacc agcaccagct gctccagctg caccaggcgg cctgtacgct 240
tgtcatatgg gtccaatgac ttgggtctgc cagccactcc gcggcgctgc accagcagct 300
cctgctccag cagcacctgc agcaccagca ccagcagctc cagcagcacc tgccccagca 360
gctcctgcag ctcctgcccc agcagcacct gccgctcctg ctcctgcagc tccagcagca 420
cccgccccag cagctcccgc agctcctgcg ccagcagcac ctgccgcccc tgctcccgca 480
gctccagcag caccggcacc cgcagctcca gcagctcctg cacctgcagc acctgccgct 540
cccgctccgg cagctccagc agcaccagcc cctgcagctc ctgctgcacc tgctccagca 600
gcacccgcgg ctcctgctcc ggctgctcca gcagcccctg ctccagcagc tcccgctgca 660
cctgcaccag cagcacctgc cgcgcctgct cctgctgccc ctgctgctcc tgctcctgca 720
gcccctgctg cacccgctcc agcagcacct gcggctcctg ctccggccgc ccctgctgct 780
ccagcaccag ctgcccctgc agcccctgcc cctgcagccc cagctgcacc agcaccagca 840
gcaccagcag cacccgcacc agcagcccca gcagccccag ccccttag 888
<210> 147
<211> 295
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CspBss-AET-EPO-PAS22-PAS200
<220>
<221> DISULFID
<222> (39)..(48)
<223> 二硫键介于Cys-39和Cys-48
<220>
<221> DISULFID
<222> (81)..(90)
<223> 二硫键介于Cys-81和Cys-90
<400> 147
Met Phe Asn Asn Arg Ile Arg Thr Ala Ala Leu Ala Gly Ala Ile Ala
1 5 10 15
Ile Ser Thr Ala Ala Ser Gly Val Ala Ile Pro Ala Phe Ala Ala Glu
20 25 30
Thr Gly Gly Leu Tyr Ala Cys His Met Gly Pro Met Thr Trp Val Cys
35 40 45
Gln Pro Leu Arg Gly Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro
50 55 60
Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Gly Gly Leu Tyr Ala
65 70 75 80
Cys His Met Gly Pro Met Thr Trp Val Cys Gln Pro Leu Arg Gly Ala
85 90 95
Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala
100 105 110
Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala
115 120 125
Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala
130 135 140
Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala
145 150 155 160
Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala
165 170 175
Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala
180 185 190
Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala
195 200 205
Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala
210 215 220
Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala
225 230 235 240
Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala
245 250 255
Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala
260 265 270
Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala
275 280 285
Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro
290 295
<210> 148
<211> 2088
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CspBss-AET-EPO-PAS22-PAS600
<400> 148
atgtttaaca accgtattcg taccgctgcc ctcgctggtg ccattgccat ctctaccgct 60
gcgtccggcg tcgctattcc tgcctttgca gccgaaaccg gcggcctgta cgcatgccac 120
atgggtccaa tgacctgggt gtgccagcca ctccgcggcg ctgcaccagc agctccagca 180
ccagcagccc cagctgcacc agctccagct gctccagctg caccaggcgg cctgtacgct 240
tgtcatatgg gtccaatgac ttgggtctgt caacctctgc gcggcgctgc tcctgcagct 300
ccagctccag cagcaccagc tgcaccagcc cctgctgcac cagcagcacc agcaccagca 360
gcaccagctg cccctgcccc tgctgcccca gctgcaccag cccccgctgc ccctgccgct 420
cctgctcctg cagcaccagc tgcccccgcc cctgctgctc ctgcagcccc tgctcccgct 480
gcccctgccg cccccgcccc tgcagcacca gctgcgcctg cccccgctgc gccagctgca 540
ccagccccgg ctgcccctgc cgctcccgcc cccgcagcac cagctgcccc ggccccggct 600
gcgcctgctg caccagctcc tgctgcccct gccgctccgg ccccggcagc accagctgcc 660
ccagcacctg ctgcaccagc tgcaccagcg cctgctgccc ctgccgcccc ggcccccgca 720
gctcctgctg cccccgcacc tgccgcacca gctgcaccag cacctgctgc tcccgccgct 780
cctgctcccg cagcaccagc tgcgcccgcc ccggctgcgc ccgcagcccc tgctcccgcc 840
gcacctgctg ctcccgcgcc tgcagcacca gctgctcctg cacctgctgc tcctgccgct 900
ccagctcctg ctgccccggc cgctcctgct ccggcagcac cagctgcgcc ggcccccgct 960
gcccccgcag cccctgctcc ggctgcccct gccgcccctg ctccagcagc tcctgctgcc 1020
ccagcacctg ccgctcctgc agctcctgct ccagctgccc ctgccgctcc agccccagca 1080
gcaccagctg cgccagcacc tgccgctccc gcagctcctg ctccagccgc acctgctgct 1140
ccggcgcccg cagcaccagc tgctcccgca cctgcggctc cagcagcccc tgcccctgct 1200
gcgcctgccg ctcctgctcc agcagctccc gctgcacctg ccccggccgc tccagctgca 1260
ccagccccag ctgctccagc cgctcccgct ccggcagctc ctgctgctcc cgctccggct 1320
gctcctgccg caccagctcc tgcagctcca gcagcccccg ctccggcagc tcccgctgct 1380
cccgctccag ccgctcctgc agccccagca ccagctgctc cagccgcccc cgctccggca 1440
gcccctgctg ctcccgctcc cgctgctcct gcggcaccag ctcccgcagc tccagcagcc 1500
ccggctccgg cagctccggc tgctcccgct cccgccgctc ccgcagcccc tgctccagct 1560
gctccagccg cgcccgctcc agcagctcca gctgcacctg ctccggccgc ccctgccgct 1620
ccagctccgg cagctccagc agccccagcg cctgcagctc ctgctgctcc ggctccagcc 1680
gctcccgcag cccccgctcc agctgctcca gcggctcccg ctccagcagc ccccgccgca 1740
cctgctccag ccgctccggc agccccagct ccagccgctc cagccgctcc agcgcctgca 1800
gctccagcgg ctcccgcccc agccgctcct gcagcgccag ctccagcggc tcctgccgct 1860
cctgcccctg cagctccagc agcgcccgct ccagccgccc cggcagctcc tgctcctgct 1920
gctccagccg ctccagcacc tgcagctcca gcagctcctg ccccagccgc tcccgcagcg 1980
ccagctccag cagcgccggc tgcaccggcc cctgcagcac cagccgctcc cgctcccgct 2040
gctcccgccg cccccgcacc cgccgccccc gctgctcccg ctccctaa 2088
<210> 149
<211> 695
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CspBss-AET-EPO-PAS22-PAS600
<220>
<221> DISULFID
<222> (39)..(48)
<223> 二硫键介于Cys-39和Cys-48
<220>
<221> DISULFID
<222> (81)..(90)
<223> 二硫键介于Cys-81和Cys-90
<400> 149
Met Phe Asn Asn Arg Ile Arg Thr Ala Ala Leu Ala Gly Ala Ile Ala
1 5 10 15
Ile Ser Thr Ala Ala Ser Gly Val Ala Ile Pro Ala Phe Ala Ala Glu
20 25 30
Thr Gly Gly Leu Tyr Ala Cys His Met Gly Pro Met Thr Trp Val Cys
35 40 45
Gln Pro Leu Arg Gly Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro
50 55 60
Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Gly Gly Leu Tyr Ala
65 70 75 80
Cys His Met Gly Pro Met Thr Trp Val Cys Gln Pro Leu Arg Gly Ala
85 90 95
Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala
100 105 110
Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala
115 120 125
Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala
130 135 140
Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala
145 150 155 160
Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala
165 170 175
Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala
180 185 190
Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala
195 200 205
Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala
210 215 220
Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala
225 230 235 240
Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala
245 250 255
Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala
260 265 270
Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala
275 280 285
Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala
290 295 300
Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala
305 310 315 320
Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala
325 330 335
Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala
340 345 350
Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala
355 360 365
Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala
370 375 380
Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala
385 390 395 400
Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala
405 410 415
Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala
420 425 430
Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala
435 440 445
Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala
450 455 460
Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala
465 470 475 480
Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala
485 490 495
Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala
500 505 510
Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala
515 520 525
Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala
530 535 540
Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala
545 550 555 560
Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala
565 570 575
Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala
580 585 590
Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala
595 600 605
Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala
610 615 620
Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala
625 630 635 640
Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala
645 650 655
Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala
660 665 670
Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala
675 680 685
Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro
690 695
<210> 150
<211> 60
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MAET-aMD4dY-PAS22
<220>
<221> DISULFID
<222> (5)..(20)
<223> 二硫键介于Cys-5和Cys-20
<220>
<221> DISULFID
<222> (45)..(60)
<223> 二硫键介于Cys-45和Cys-60
<400> 150
Met Ala Glu Thr Cys Arg Gln Phe Asn Arg Arg Thr His Glu Val Trp
1 5 10 15
Asn Leu Asp Cys Gly Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro
20 25 30
Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Gly Cys Arg Gln Phe
35 40 45
Asn Arg Arg Thr His Glu Val Trp Asn Leu Asp Cys
50 55 60
<210> 151
<211> 46
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MAET-aMD4dY-PAS8
<220>
<221> DISULFID
<222> (5)..(20)
<223> 二硫键介于Cys-5和Cys-20
<220>
<221> DISULFID
<222> (31)..(46)
<223> 二硫键介于Cys-31和Cys-46
<400> 151
Met Ala Glu Thr Cys Arg Gln Phe Asn Arg Arg Thr His Glu Val Trp
1 5 10 15
Asn Leu Asp Cys Gly Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Gly Cys Arg
20 25 30
Gln Phe Asn Arg Arg Thr His Glu Val Trp Asn Leu Asp Cys
35 40 45
<210> 152
<211> 61
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MAET-aMD4-PAS22
<220>
<221> DISULFID
<222> (5)..(21)
<223> 二硫键介于Cys-5和Cys-21
<220>
<221> DISULFID
<222> (46)..(61)
<223> 二硫键介于Cys-46和Cys-61
<400> 152
Met Ala Glu Thr Cys Tyr Arg Gln Phe Asn Arg Arg Thr His Glu Val
1 5 10 15
Trp Asn Leu Asp Cys Gly Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala
20 25 30
Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Gly Cys Arg Gln
35 40 45
Phe Asn Arg Arg Thr His Glu Val Trp Asn Leu Asp Cys
50 55 60
<210> 153
<211> 52
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MAET-EPO-PAS8
<220>
<221> DISULFID
<222> (10)..(19)
<223> 二硫键介于Cys-10和Cys-19
<220>
<221> DISULFID
<222> (38)..(47)
<223> 二硫键介于Cys-38和Cys-47
<400> 153
Met Ala Glu Thr Gly Gly Leu Tyr Ala Cys His Met Gly Pro Met Thr
1 5 10 15
Trp Val Cys Gln Pro Leu Arg Gly Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro
20 25 30
Gly Gly Leu Tyr Ala Cys His Met Gly Pro Met Thr Trp Val Cys Gln
35 40 45
Pro Leu Arg Gly
50
<210> 154
<211> 93
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MAET-EPO-PAS49-b
<220>
<221> DISULFID
<222> (10)..(19)
<223> 二硫键介于Cys-10和Cys-19
<220>
<221> DISULFID
<222> (79)..(88)
<223> 二硫键介于Cys-79和Cys-88
<400> 154
Met Ala Glu Thr Gly Gly Leu Tyr Ala Cys His Met Gly Pro Met Thr
1 5 10 15
Trp Val Cys Gln Pro Leu Arg Gly Ser Ala Pro Ser Pro Ser Ser Ala
20 25 30
Pro Ala Ser Ala Ser Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ser Ala Ser Ala Ser
35 40 45
Ala Ser Pro Ala Ser Ser Pro Ala Ser Ala Ser Ser Ala Ser Pro Ala
50 55 60
Ala Ser Ser Ala Ser Pro Ala Ser Ser Gly Gly Leu Tyr Ala Cys His
65 70 75 80
Met Gly Pro Met Thr Trp Val Cys Gln Pro Leu Arg Gly
85 90
<210> 155
<211> 144
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MAET-EPO-PAS100-b
<220>
<221> DISULFID
<222> (10)..(19)
<223> 二硫键介于Cys-10和Cys-19
<220>
<221> DISULFID
<222> (130)..(139)
<223> 二硫键介于Cys-130和Cys-139
<400> 155
Met Ala Glu Thr Gly Gly Leu Tyr Ala Cys His Met Gly Pro Met Thr
1 5 10 15
Trp Val Cys Gln Pro Leu Arg Gly Ser Ala Pro Ser Pro Ser Ser Ala
20 25 30
Pro Ala Ser Ala Ser Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ser Ala Ser Ala Ser
35 40 45
Ala Ser Pro Ala Ser Ser Pro Ala Ser Ala Ser Ser Ala Ser Pro Ala
50 55 60
Ala Ser Ser Ala Ser Pro Ala Ser Ser Ser Ala Ser Pro Ser Ala Pro
65 70 75 80
Ala Ala Pro Ser Ala Ser Ala Ala Pro Ser Ala Ser Pro Ala Ser Ser
85 90 95
Ser Pro Ala Pro Ala Ser Ala Pro Ser Pro Ala Ala Ala Ala Ser Ser
100 105 110
Pro Ser Pro Ala Pro Ser Ser Ala Ser Ser Ala Ala Gly Gly Leu Tyr
115 120 125
Ala Cys His Met Gly Pro Met Thr Trp Val Cys Gln Pro Leu Arg Gly
130 135 140
<210> 156
<211> 55
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MAET-VEGFR_D2-PAS16
<220>
<221> DISULFID
<222> (10)..(17)
<223> 二硫键介于Cys-10和Cys-17
<220>
<221> DISULFID
<222> (40)..(50)
<223> 二硫键介于Cys-40和Cys-50
<400> 156
Met Ala Glu Thr Ala Gly Pro Thr Trp Cys Glu Asp Asp Trp Tyr Tyr
1 5 10 15
Cys Trp Leu Phe Gly Thr Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala
20 25 30
Pro Ala Ala Pro Ala Pro Val Cys Trp Glu Asp Ser Trp Gly Gly Glu
35 40 45
Val Cys Trp Leu Phe Gly Thr
50 55
<210> 157
<211> 88
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MAET-VEGFR_D2-PAS49-b
<220>
<221> DISULFID
<222> (10)..(17)
<223> 二硫键介于Cys-10和Cys-17
<220>
<221> DISULFID
<222> (73)..(83)
<223> 二硫键介于Cys-73和Cys-83
<400> 157
Met Ala Glu Thr Ala Gly Pro Thr Trp Cys Glu Asp Asp Trp Tyr Tyr
1 5 10 15
Cys Trp Leu Phe Gly Thr Ser Ala Pro Ser Pro Ser Ser Ala Pro Ala
20 25 30
Ser Ala Ser Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ser Ala Ser Ala Ser Ala Ser
35 40 45
Pro Ala Ser Ser Pro Ala Ser Ala Ser Ser Ala Ser Pro Ala Ala Ser
50 55 60
Ser Ala Ser Pro Ala Ser Ser Val Cys Trp Glu Asp Ser Trp Gly Gly
65 70 75 80
Glu Val Cys Trp Leu Phe Gly Thr
85
<210> 158
<211> 139
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MAET-VEGFR_D2-PAS100-b
<220>
<221> DISULFID
<222> (10)..(17)
<223> 二硫键介于Cys-10和Cys-17
<220>
<221> DISULFID
<222> (124)..(134)
<223> 二硫键介于Cys-124和Cys-134
<400> 158
Met Ala Glu Thr Ala Gly Pro Thr Trp Cys Glu Asp Asp Trp Tyr Tyr
1 5 10 15
Cys Trp Leu Phe Gly Thr Ser Ala Pro Ser Pro Ser Ser Ala Pro Ala
20 25 30
Ser Ala Ser Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ser Ala Ser Ala Ser Ala Ser
35 40 45
Pro Ala Ser Ser Pro Ala Ser Ala Ser Ser Ala Ser Pro Ala Ala Ser
50 55 60
Ser Ala Ser Pro Ala Ser Ser Ser Ala Ser Pro Ser Ala Pro Ala Ala
65 70 75 80
Pro Ser Ala Ser Ala Ala Pro Ser Ala Ser Pro Ala Ser Ser Ser Pro
85 90 95
Ala Pro Ala Ser Ala Pro Ser Pro Ala Ala Ala Ala Ser Ser Pro Ser
100 105 110
Pro Ala Pro Ser Ser Ala Ser Ser Ala Ala Val Cys Trp Glu Asp Ser
115 120 125
Trp Gly Gly Glu Val Cys Trp Leu Phe Gly Thr
130 135
<210> 159
<211> 55
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MAET-VEGFR_D2-GS16
<220>
<221> DISULFID
<222> (10)..(17)
<223> 二硫键介于Cys-10和Cys-17
<220>
<221> DISULFID
<222> (40)..(50)
<223> 二硫键介于Cys-40和Cys-50
<400> 159
Met Ala Glu Thr Ala Gly Pro Thr Trp Cys Glu Asp Asp Trp Tyr Tyr
1 5 10 15
Cys Trp Leu Phe Gly Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
20 25 30
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Val Cys Trp Glu Asp Ser Trp Gly Gly Glu
35 40 45
Val Cys Trp Leu Phe Gly Thr
50 55
<210> 160
<211> 281
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MAET-aMD4dY-PAS22
<400> 160
gaaattaata cgactcacta tagggagacc acaacggttt ccctctagaa ataattttgt 60
ttaactttaa gaaggagata taccaatgca gagacctgtc gtcagtttaa ccgtcgtacg 120
cacgaagttt ggaatctgga ctgtggcgca gcccccgcag caccagctcc agcagcaccc 180
gcagctccag caccagcagc ccctgcagcc ccaggctgcc gccaattcaa tcgccgcacc 240
catgaagtgt ggaacttaga ttgctagtga ataactaatc c 281
<210> 161
<211> 240
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MAET-aMD4dY-PAS8
<400> 161
gaaattaata cgactcacta tagggagacc acaacggttt ccctctagaa ataattttgt 60
ttaactttaa gaaggagata taccaatggc agagacctgt cgtcagttta accgtcgtac 120
gcacgaagtt tggaatctgg actgtggcgc agcacccgca gctccagcac caggctgccg 180
ccaattcaat cgccgcaccc atgaagtgtg gaacttagat tgctagtgaa taactaatcc 240
<210> 162
<211> 288
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MAET-aMD4-PAS22
<400> 162
gaaattaata cgactcacta tagggagacc acaacggttt ccctctagaa ataattttgt 60
ttaactttaa gaaggagata taccaatggc agagacctgt tatcgtcagt ttaaccgtcg 120
tacgcacgaa gtttggaatc tggactgtgg cgcagccccc gcagcaccag ctccagcagc 180
acccgcagct ccagcaccag cagcccctgc agccccaggc tgctatcgcc aattcaatcg 240
ccgcacccat gaagtgtgga acttagattg ctagtgaata actaatcc 288
<210> 163
<211> 258
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MAET-EPO-PAS8
<400> 163
gaaattaata cgactcacta tagggagacc acaacggttt ccctctagaa ataattttgt 60
ttaactttaa gaaggagata taccaatggc agaaactggt ggtttatacg cctgtcacat 120
gggcccgatg acttgggttt gccagccatt gcgtggcgca gcacccgcag ctccagcacc 180
aggtggcctg tatgcgtgcc atatggggcc aatgacctgg gtgtgtcagc cgttacgcgg 240
ctagtgaata actaatcc 258
<210> 164
<211> 381
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MAET-EPO-PAS49-b
<400> 164
gaaattaata cgactcacta tagggagacc acaacggttt ccctctagaa ataattttgt 60
ttaactttaa gaaggagata taccaatggc agaaactggt ggtttatacg cctgtcacat 120
gggcccgatg acttgggttt gccagccatt gcgtggctct gctccatcac cttcttccgc 180
accagcatca gcttctgcac cagcgtcgcc tgcttctgca tctgcgtctg cttcaccagc 240
atcctcacct gcatcagcat cgtctgcttc tccagcagct tcctcagctt cacctgcttc 300
gtctggtggc ctgtatgcgt gccatatggg gccaatgacc tgggtgtgtc agccgttacg 360
cggctagtga ataactaatc c 381
<210> 165
<211> 534
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MAET-EPO-PAS100-b
<400> 165
gaaattaata cgactcacta tagggagacc acaacggttt ccctctagaa ataattttgt 60
ttaactttaa gaaggagata taccaatggc agaaactggt ggtttatacg cctgtcacat 120
gggcccgatg acttgggttt gccagccatt gcgtggctct gctccatcac cttcttccgc 180
accagcatca gcttctgcac cagcgtcgcc tgcttctgca tctgcgtctg cttcaccagc 240
atcctcacct gcatcagcat cgtctgcttc tccagcagct tcctcagctt cacctgcttc 300
gtcttccgca tccccatctg ctccagcagc accttcagct tctgcagctc catctgcttc 360
acctgcctca tcgtctccag cacctgcgtc agctccatcc cctgcagcag cggcttcatc 420
gccatctcca gcaccttctt cagcgtcatc cgctgcaggt ggcctgtatg cgtgccatat 480
ggggccaatg acctgggtgt gtcagccgtt acgcggctag tgaataacta atcc 534
<210> 166
<211> 267
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MAET-VEGFR_D2-PAS16
<400> 166
gaaattaata cgactcacta tagggagacc acaacggttt ccctctagaa ataattttgt 60
ttaactttaa gaaggagata taccaatggc ggaaaccgcg ggtcccacgt ggtgtgagga 120
tgactggtac tattgctggt tattcgggac tgcggcccct gctgccccgg ctccggcagc 180
accggccgca ccagcgccgg tttgctggga agatagctgg ggtggcgaag tgtgttggct 240
gtttggcacc tagtgaataa ctaatcc 267
<210> 167
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MAET-VEGFR_D2-PAS49-b
<400> 167
gaaattaata cgactcacta tagggagacc acaacggttt ccctctagaa ataattttgt 60
ttaactttaa gaaggagata taccaatggc ggaaaccgcg ggtcccacgt ggtgtgagga 120
tgactggtac tattgctggt tattcgggac ttctgctcca tcaccttctt ccgcaccagc 180
atcagcttct gcaccagcgt cgcctgcttc tgcatctgcg tctgcttcac cagcatcctc 240
acctgcatca gcatcgtctg cttctccagc agcttcctca gcttcacctg cttcgtctgt 300
ttgctgggaa gatagctggg gtggcgaagt gtgttggctg tttggcacct agtgaataac 360
taatcc 366
<210> 168
<211> 534
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MAET-VEGFR_D2-PAS100-b
<400> 168
gaaattaata cgactcacta tagggagacc acaacggttt ccctctagaa ataattttgt 60
ttaactttaa gaaggagata taccaatggc agaaactggt ggtttatacg cctgtcacat 120
gggcccgatg acttgggttt gccagccatt gcgtggctct gctccatcac cttcttccgc 180
accagcatca gcttctgcac cagcgtcgcc tgcttctgca tctgcgtctg cttcaccagc 240
atcctcacct gcatcagcat cgtctgcttc tccagcagct tcctcagctt cacctgcttc 300
gtcttccgca tccccatctg ctccagcagc accttcagct tctgcagctc catctgcttc 360
acctgcctca tcgtctccag cacctgcgtc agctccatcc cctgcagcag cggcttcatc 420
gccatctcca gcaccttctt cagcgtcatc cgctgcaggt ggcctgtatg cgtgccatat 480
ggggccaatg acctgggtgt gtcagccgtt acgcggctag tgaataacta atcc 534
<210> 169
<211> 267
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MAET-VEGFR_D2-GS16
<400> 169
gaaattaata cgactcacta tagggagacc acaacggttt ccctctagaa ataattttgt 60
ttaactttaa gaaggagata taccaatggc ggaaaccgcg ggtcccacgt ggtgtgagga 120
tgactggtac tattgctggt tattcgggac tggtagcggt agcggcagcg gcagcggtag 180
tggtagtggc agcggcagcg tttgctggga agatagctgg ggtggcgaag tgtgttggct 240
gtttggcacc tagtgaataa ctaatcc 267
<210> 170
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cell-free primer Fwd
<400> 170
gaaattaata cgactcacta taggg 25
<210> 171
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cell-free primer Rev
<400> 171
cactgactgg attagttatt cac 23
<210> 172
<211> 99
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AET-aMD4dY-PAS22-Trimer
<220>
<221> DISULFID
<222> (4)..(19)
<223> 二硫键介于Cys-4和Cys-19
<220>
<221> DISULFID
<222> (44)..(59)
<223> 二硫键介于Cys-44和Cys-59
<220>
<221> DISULFID
<222> (84)..(99)
<223> 二硫键介于Cys-84和Cys-99
<400> 172
Ala Glu Thr Cys Arg Gln Phe Asn Arg Arg Thr His Glu Val Trp Asn
1 5 10 15
Leu Asp Cys Gly Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala
20 25 30
Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Gly Cys Arg Gln Phe Asn
35 40 45
Arg Arg Thr His Glu Val Trp Asn Leu Asp Cys Gly Ala Ala Pro Ala
50 55 60
Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala
65 70 75 80
Ala Pro Gly Cys Arg Gln Phe Asn Arg Arg Thr His Glu Val Trp Asn
85 90 95
Leu Asp Cys
<210> 173
<211> 390
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CspBss-AET-aMD4dY-PAS22-Trimer
<400> 173
atgtttaaca accgtatccg cactgcagct ctcgctggtg caatcgcaat ctccaccgca 60
gcttccggcg tagctatccc agcattcgct gcagagacct gccgccagtt caatcgccgg 120
acccacgaag tctggaatct ggattgcggc gcagctcctg ccgccccagc accggctgcg 180
ccagctgctc cagcgccggc tgcccctgcg gcaccgggtt gccgtcagtt taaccgccgt 240
actcacgagg tttggaacct tgactgtgga gcggctcccg cagcaccagc cccagccgcc 300
cctgctgcac ccgcaccagc ggcacccgcc gctcctggct gtcgccaatt caaccgacgc 360
acccatgaag tgtggaacct cgattgctaa 390
<210> 174
<211> 129
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CspBss-AET-aMD4dY-PAS22-Trimer
<220>
<221> DISULFID
<222> (34)..(49)
<223> 二硫键介于Cys-34和Cys-49
<220>
<221> DISULFID
<222> (74)..(89)
<223> 二硫键介于Cys-74和Cys-89
<220>
<221> DISULFID
<222> (114)..(129)
<223> 二硫键介于Cys-114和Cys-129
<400> 174
Met Phe Asn Asn Arg Ile Arg Thr Ala Ala Leu Ala Gly Ala Ile Ala
1 5 10 15
Ile Ser Thr Ala Ala Ser Gly Val Ala Ile Pro Ala Phe Ala Ala Glu
20 25 30
Thr Cys Arg Gln Phe Asn Arg Arg Thr His Glu Val Trp Asn Leu Asp
35 40 45
Cys Gly Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro
50 55 60
Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Gly Cys Arg Gln Phe Asn Arg Arg
65 70 75 80
Thr His Glu Val Trp Asn Leu Asp Cys Gly Ala Ala Pro Ala Ala Pro
85 90 95
Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro
100 105 110
Gly Cys Arg Gln Phe Asn Arg Arg Thr His Glu Val Trp Asn Leu Asp
115 120 125
Cys
<210> 175
<211> 87
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AET-VEGFR_D2-PAS49
<220>
<221> DISULFID
<222> (9)..(16)
<223> 二硫键介于Cys-9和Cys-16
<220>
<221> DISULFID
<222> (72)..(82)
<223> 二硫键介于Cys-72和Cys-82
<400> 175
Ala Glu Thr Ala Gly Pro Thr Trp Cys Glu Asp Asp Trp Tyr Tyr Cys
1 5 10 15
Trp Leu Phe Gly Thr Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro
20 25 30
Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro
35 40 45
Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro
50 55 60
Ala Ala Pro Ala Pro Ala Val Cys Trp Glu Asp Ser Trp Gly Gly Glu
65 70 75 80
Val Cys Trp Leu Phe Gly Thr
85
<210> 176
<211> 87
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AET-VEGFR_D2-PAS49-b
<220>
<221> DISULFID
<222> (9)..(16)
<223> 二硫键介于Cys-9和Cys-16
<220>
<221> DISULFID
<222> (72)..(82)
<223> 二硫键介于Cys-72和Cys-82
<400> 176
Ala Glu Thr Ala Gly Pro Thr Trp Cys Glu Asp Asp Trp Tyr Tyr Cys
1 5 10 15
Trp Leu Phe Gly Thr Ser Ala Pro Ser Pro Ser Ser Ala Pro Ala Ser
20 25 30
Ala Ser Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ser Ala Ser Ala Ser Ala Ser Pro
35 40 45
Ala Ser Ser Pro Ala Ser Ala Ser Ser Ala Ser Pro Ala Ala Ser Ser
50 55 60
Ala Ser Pro Ala Ser Ser Val Cys Trp Glu Asp Ser Trp Gly Gly Glu
65 70 75 80
Val Cys Trp Leu Phe Gly Thr
85
<210> 177
<211> 138
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AET-VEGFR_D2-PAS100
<220>
<221> DISULFID
<222> (9)..(16)
<223> 二硫键介于Cys-9和Cys-16
<220>
<221> DISULFID
<222> (123)..(133)
<223> 二硫键介于Cys-123和Cys-133
<400> 177
Ala Glu Thr Ala Gly Pro Thr Trp Cys Glu Asp Asp Trp Tyr Tyr Cys
1 5 10 15
Trp Leu Phe Gly Thr Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro
20 25 30
Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro
35 40 45
Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro
50 55 60
Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro
65 70 75 80
Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro
85 90 95
Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro
100 105 110
Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Val Cys Trp Glu Asp Ser Trp
115 120 125
Gly Gly Glu Val Cys Trp Leu Phe Gly Thr
130 135
<210> 178
<211> 138
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AET-VEGFR_D2-PAS100-b
<220>
<221> DISULFID
<222> (9)..(16)
<223> 二硫键介于Cys-9和Cys-16
<220>
<221> DISULFID
<222> (123)..(133)
<223> 二硫键介于Cys-123和Cys-133
<400> 178
Ala Glu Thr Ala Gly Pro Thr Trp Cys Glu Asp Asp Trp Tyr Tyr Cys
1 5 10 15
Trp Leu Phe Gly Thr Ser Ala Pro Ser Pro Ser Ser Ala Pro Ala Ser
20 25 30
Ala Ser Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ser Ala Ser Ala Ser Ala Ser Pro
35 40 45
Ala Ser Ser Pro Ala Ser Ala Ser Ser Ala Ser Pro Ala Ala Ser Ser
50 55 60
Ala Ser Pro Ala Ser Ser Ser Ala Ser Pro Ser Ala Pro Ala Ala Pro
65 70 75 80
Ser Ala Ser Ala Ala Pro Ser Ala Ser Pro Ala Ser Ser Ser Pro Ala
85 90 95
Pro Ala Ser Ala Pro Ser Pro Ala Ala Ala Ala Ser Ser Pro Ser Pro
100 105 110
Ala Pro Ser Ser Ala Ser Ser Ala Ala Val Cys Trp Glu Asp Ser Trp
115 120 125
Gly Gly Glu Val Cys Trp Leu Phe Gly Thr
130 135
<210> 179
<211> 54
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AET-VEGFR_D2-GS16
<220>
<221> DISULFID
<222> (9)..(16)
<223> 二硫键介于Cys-9和Cys-16
<220>
<221> DISULFID
<222> (39)..(49)
<223> 二硫键介于Cys-39和Cys-49
<400> 179
Ala Glu Thr Ala Gly Pro Thr Trp Cys Glu Asp Asp Trp Tyr Tyr Cys
1 5 10 15
Trp Leu Phe Gly Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
20 25 30
Gly Gly Gly Ser Gly Val Cys Trp Glu Asp Ser Trp Gly Gly Glu Val
35 40 45
Cys Trp Leu Phe Gly Thr
50
<210> 180
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CspBss-VEGFR_D2-PAS49
<400> 180
atgtttaaca accgtatccg cactgcagct ctcgctggtg caatcgcaat ctccaccgca 60
gcttccggcg tagctatccc agcattcgct gcagagaccg ctggccctac ctggtgtgag 120
gacgattggt actactgttg gctctttggc accgccgccc ctgctgctcc cgcccccgcc 180
gcccctgccg caccagctcc agcagcccca gctgcaccag caccagccgc tccagcagct 240
ccagcaccag ctgctccagc agcaccagcc ccagcagctc cagccgcacc agctcctgcg 300
gtttgctggg aggattcttg gggcggcgaa gtttgctggc tctttggcac ctaa 354
<210> 181
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CspBss-VEGFR_D2-PAS49
<220>
<221> DISULFID
<222> (39)..(46)
<223> 二硫键介于Cys-39和Cys-46
<220>
<221> DISULFID
<222> (102)..(112)
<223> 二硫键介于Cys-102和Cys-112
<400> 181
Met Phe Asn Asn Arg Ile Arg Thr Ala Ala Leu Ala Gly Ala Ile Ala
1 5 10 15
Ile Ser Thr Ala Ala Ser Gly Val Ala Ile Pro Ala Phe Ala Ala Glu
20 25 30
Thr Ala Gly Pro Thr Trp Cys Glu Asp Asp Trp Tyr Tyr Cys Trp Leu
35 40 45
Phe Gly Thr Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala
50 55 60
Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala
65 70 75 80
Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala
85 90 95
Pro Ala Pro Ala Val Cys Trp Glu Asp Ser Trp Gly Gly Glu Val Cys
100 105 110
Trp Leu Phe Gly Thr
115
<210> 182
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CspBss-VEGFR_D2-PAS49-b
<400> 182
atgtttaaca accgtatccg cactgcagct ctcgctggtg caatcgcaat ctccaccgca 60
gcttccggcg tagctatccc agcattcgct gcagagaccg caggacccac ttggtgcgaa 120
gatgactggt actattgctg gctctttggc acctcagcac ccagcccatc ctccgctcca 180
gcgtctgcga gcgctcctgc atccccagcc tctgcctccg catcggcatc accggcttcc 240
agcccagcgt cggcatcgtc agcctctccg gctgcctcct ccgcttctcc tgcgtcctcc 300
gtgtgttggg aggattcctg gggtggtgaa gtctgctggc tgttcggcac ctaa 354
<210> 183
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CspBss-VEGFR_D2-PAS49-b
<220>
<221> DISULFID
<222> (39)..(46)
<223> 二硫键介于Cys-39和Cys-46
<220>
<221> DISULFID
<222> (102)..(112)
<223> 二硫键介于Cys-102和Cys-112
<400> 183
Met Phe Asn Asn Arg Ile Arg Thr Ala Ala Leu Ala Gly Ala Ile Ala
1 5 10 15
Ile Ser Thr Ala Ala Ser Gly Val Ala Ile Pro Ala Phe Ala Ala Glu
20 25 30
Thr Ala Gly Pro Thr Trp Cys Glu Asp Asp Trp Tyr Tyr Cys Trp Leu
35 40 45
Phe Gly Thr Ser Ala Pro Ser Pro Ser Ser Ala Pro Ala Ser Ala Ser
50 55 60
Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ser Ala Ser Ala Ser Ala Ser Pro Ala Ser
65 70 75 80
Ser Pro Ala Ser Ala Ser Ser Ala Ser Pro Ala Ala Ser Ser Ala Ser
85 90 95
Pro Ala Ser Ser Val Cys Trp Glu Asp Ser Trp Gly Gly Glu Val Cys
100 105 110
Trp Leu Phe Gly Thr
115
<210> 184
<211> 507
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CspBss-VEGFR_D2-PAS100
<400> 184
atgtttaaca accgtatccg cactgcagct ctcgctggtg caatcgcaat ctccaccgca 60
gcttccggcg tagctatccc agcattcgct gcagagaccg ccggtccaac ctggtgtgag 120
gatgactggt actactgctg gctctttggc accgctgctc ccgctgctcc cgcccctgct 180
gctccagctg ccccagcccc agctgcccca gctgctccag caccagccgc tccagctgcc 240
ccagcaccag ctgcaccagc agcaccagca ccagcagctc cagccgctcc agccccagcc 300
gctccagcag caccagcccc agcagctcca gctgcaccag ctccagccgc cccagcagca 360
ccagctccag cagccccagc agctccagct ccagccgcac cagctgctcc agccccagcc 420
gcaccagcag ccccagctcc agctgctcct gctgtctgtt gggaggactc ttggggcggc 480
gaagtttgtt ggttgtttgg cacctaa 507
<210> 185
<211> 168
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CspBss-VEGFR_D2-PAS100
<220>
<221> DISULFID
<222> (39)..(46)
<223> 二硫键介于Cys-39和Cys-46
<220>
<221> DISULFID
<222> (153)..(163)
<223> 二硫键介于Cys-153和Cys-163
<400> 185
Met Phe Asn Asn Arg Ile Arg Thr Ala Ala Leu Ala Gly Ala Ile Ala
1 5 10 15
Ile Ser Thr Ala Ala Ser Gly Val Ala Ile Pro Ala Phe Ala Ala Glu
20 25 30
Thr Ala Gly Pro Thr Trp Cys Glu Asp Asp Trp Tyr Tyr Cys Trp Leu
35 40 45
Phe Gly Thr Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala
50 55 60
Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala
65 70 75 80
Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala
85 90 95
Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala
100 105 110
Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala
115 120 125
Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala
130 135 140
Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Val Cys Trp Glu Asp Ser Trp Gly Gly
145 150 155 160
Glu Val Cys Trp Leu Phe Gly Thr
165
<210> 186
<211> 507
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CspBss-VEGFR_D2-PAS100-b
<400> 186
atgtttaaca accgtatccg cactgcagct ctcgctggtg caatcgcaat ctccaccgca 60
gcttccggcg tagctatccc agcattcgct gcagagaccg ccggacctac ctggtgtgag 120
gatgactggt actattgctg gctcttcggc acttccgccc cttccccttc cagcgcacca 180
gcgagcgctt cggctccggc ctccccagcg tccgcatctg cgtctgcatc ccctgcgtcg 240
tcacccgctt cagcctcctc agcctcccct gcggcttcat ccgcctcgcc cgcatccagc 300
tccgcatcac cctctgcgcc agcagctcca tccgcttctg ctgccccatc ggcctctccg 360
gcttccagct ctcccgcacc ggcatccgct ccgagcccag cagcagctgc atcctcccca 420
tctccggcac catcctcggc ctctagcgcg gctgtgtgct gggaagattc ctggggtggt 480
gaagtctgct ggctgtttgg cacctaa 507
<210> 187
<211> 168
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CspBss-VEGFR_D2-PAS100-b
<220>
<221> DISULFID
<222> (39)..(46)
<223> 二硫键介于Cys-39和Cys-46
<220>
<221> DISULFID
<222> (153)..(163)
<223> 二硫键介于Cys-153和Cys-163
<400> 187
Met Phe Asn Asn Arg Ile Arg Thr Ala Ala Leu Ala Gly Ala Ile Ala
1 5 10 15
Ile Ser Thr Ala Ala Ser Gly Val Ala Ile Pro Ala Phe Ala Ala Glu
20 25 30
Thr Ala Gly Pro Thr Trp Cys Glu Asp Asp Trp Tyr Tyr Cys Trp Leu
35 40 45
Phe Gly Thr Ser Ala Pro Ser Pro Ser Ser Ala Pro Ala Ser Ala Ser
50 55 60
Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ser Ala Ser Ala Ser Ala Ser Pro Ala Ser
65 70 75 80
Ser Pro Ala Ser Ala Ser Ser Ala Ser Pro Ala Ala Ser Ser Ala Ser
85 90 95
Pro Ala Ser Ser Ser Ala Ser Pro Ser Ala Pro Ala Ala Pro Ser Ala
100 105 110
Ser Ala Ala Pro Ser Ala Ser Pro Ala Ser Ser Ser Pro Ala Pro Ala
115 120 125
Ser Ala Pro Ser Pro Ala Ala Ala Ala Ser Ser Pro Ser Pro Ala Pro
130 135 140
Ser Ser Ala Ser Ser Ala Ala Val Cys Trp Glu Asp Ser Trp Gly Gly
145 150 155 160
Glu Val Cys Trp Leu Phe Gly Thr
165
<210> 188
<211> 255
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CspBss-VEGFR_D2-GS16
<400> 188
atgtttaaca accgtatccg cactgcagct ctcgctggtg caatcgcaat ctccaccgca 60
gcttccggcg tagctatccc agcattcgct gcagagaccg cgggtccgac ctggtgtgag 120
gatgactggt actactgttg gttgttcggc accggcggcg gcggctccgg cggcggcggc 180
tctggcggcg gcggctctgg cgtttgttgg gaggactctt ggggcggcga agtttgctgg 240
ctgtttggca cctaa 255
<210> 189
<211> 84
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CspBss-VEGFR_D2-GS16
<220>
<221> DISULFID
<222> (39)..(46)
<223> 二硫键介于Cys-39和Cys-46
<220>
<221> DISULFID
<222> (69)..(79)
<223> 二硫键介于Cys-69和Cys-79
<400> 189
Met Phe Asn Asn Arg Ile Arg Thr Ala Ala Leu Ala Gly Ala Ile Ala
1 5 10 15
Ile Ser Thr Ala Ala Ser Gly Val Ala Ile Pro Ala Phe Ala Ala Glu
20 25 30
Thr Ala Gly Pro Thr Trp Cys Glu Asp Asp Trp Tyr Tyr Cys Trp Leu
35 40 45
Phe Gly Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
50 55 60
Gly Ser Gly Val Cys Trp Glu Asp Ser Trp Gly Gly Glu Val Cys Trp
65 70 75 80
Leu Phe Gly Thr
<210> 190
<211> 85
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPO2-PAS49
<220>
<221> DISULFID
<222> (3)..(16)
<223> 二硫键介于Cys-3和Cys-16
<220>
<221> DISULFID
<222> (70)..(83)
<223> 二硫键介于Cys-70和Cys-83
<400> 190
Gly Gly Cys Ala Asp Gly Pro Thr Leu Arg Glu Trp Ile Ser Phe Cys
1 5 10 15
Gly Gly Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro
20 25 30
Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro
35 40 45
Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro
50 55 60
Ala Pro Ala Gly Gly Cys Ala Asp Gly Pro Thr Leu Arg Glu Trp Ile
65 70 75 80
Ser Phe Cys Gly Gly
85
<210> 191
<211> 85
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPO2-PAS49-b
<220>
<221> DISULFID
<222> (3)..(16)
<223> 二硫键介于Cys-3和Cys-16
<220>
<221> DISULFID
<222> (70)..(83)
<223> 二硫键介于Cys-70和Cys-83
<400> 191
Gly Gly Cys Ala Asp Gly Pro Thr Leu Arg Glu Trp Ile Ser Phe Cys
1 5 10 15
Gly Gly Ser Ala Pro Ser Pro Ser Ser Ala Pro Ala Ser Ala Ser Ala
20 25 30
Pro Ala Ser Pro Ala Ser Ala Ser Ala Ser Ala Ser Pro Ala Ser Ser
35 40 45
Pro Ala Ser Ala Ser Ser Ala Ser Pro Ala Ala Ser Ser Ala Ser Pro
50 55 60
Ala Ser Ser Gly Gly Cys Ala Asp Gly Pro Thr Leu Arg Glu Trp Ile
65 70 75 80
Ser Phe Cys Gly Gly
85
<210> 192
<211> 136
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPO2-PAS100
<220>
<221> DISULFID
<222> (3)..(16)
<223> 二硫键介于Cys-3和Cys-16
<220>
<221> DISULFID
<222> (121)..(134)
<223> 二硫键介于Cys-121和Cys-134
<400> 192
Gly Gly Cys Ala Asp Gly Pro Thr Leu Arg Glu Trp Ile Ser Phe Cys
1 5 10 15
Gly Gly Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro
20 25 30
Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro
35 40 45
Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro
50 55 60
Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro
65 70 75 80
Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro
85 90 95
Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro
100 105 110
Ala Pro Ala Ala Pro Ala Gly Gly Cys Ala Asp Gly Pro Thr Leu Arg
115 120 125
Glu Trp Ile Ser Phe Cys Gly Gly
130 135
<210> 193
<211> 136
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPO2-PAS100-b
<220>
<221> DISULFID
<222> (3)..(16)
<223> 二硫键介于Cys-3和Cys-16
<220>
<221> DISULFID
<222> (121)..(134)
<223> 二硫键介于Cys-121和Cys-134
<400> 193
Gly Gly Cys Ala Asp Gly Pro Thr Leu Arg Glu Trp Ile Ser Phe Cys
1 5 10 15
Gly Gly Ser Ala Pro Ser Pro Ser Ser Ala Pro Ala Ser Ala Ser Ala
20 25 30
Pro Ala Ser Pro Ala Ser Ala Ser Ala Ser Ala Ser Pro Ala Ser Ser
35 40 45
Pro Ala Ser Ala Ser Ser Ala Ser Pro Ala Ala Ser Ser Ala Ser Pro
50 55 60
Ala Ser Ser Ser Ala Ser Pro Ser Ala Pro Ala Ala Pro Ser Ala Ser
65 70 75 80
Ala Ala Pro Ser Ala Ser Pro Ala Ser Ser Ser Pro Ala Pro Ala Ser
85 90 95
Ala Pro Ser Pro Ala Ala Ala Ala Ser Ser Pro Ser Pro Ala Pro Ser
100 105 110
Ser Ala Ser Ser Ala Ala Gly Gly Cys Ala Asp Gly Pro Thr Leu Arg
115 120 125
Glu Trp Ile Ser Phe Cys Gly Gly
130 135
<210> 194
<211> 44
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPO2-GS8
<220>
<221> DISULFID
<222> (3)..(16)
<223> 二硫键介于Cys-3和Cys-16
<220>
<221> DISULFID
<222> (29)..(42)
<223> 二硫键介于Cys-29和Cys-42
<400> 194
Gly Gly Cys Ala Asp Gly Pro Thr Leu Arg Glu Trp Ile Ser Phe Cys
1 5 10 15
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Cys Ala Asp Gly
20 25 30
Pro Thr Leu Arg Glu Trp Ile Ser Phe Cys Gly Gly
35 40
<210> 195
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CspAss-TPO2-PAS49
<400> 195
atgaaacgca tgaaatcgct ggctgcggcg ctcaccgtcg ctggggccat gctggccgca 60
cctgtggcaa cggcaggtgg ctgtgctgac ggtcctaccc ttcgtgagtg gatttctttt 120
tgcggcggtg ctgctcctgc tgcccctgct cctgctgctc ctgcagcacc agccccagca 180
gctccagccg ccccagctcc agccgcacca gctgccccag caccagccgc tccagcagca 240
ccagctccag cagccccagc tgcaccagcc ccagcgggcg gttgtgctga cggtcctacc 300
cttcgtgagt ggatttcctt ctgtggtggc taa 333
<210> 196
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CspAss-TPO2-PAS49
<220>
<221> DISULFID
<222> (28)..(41)
<223> 二硫键介于Cys-28和Cys-41
<220>
<221> DISULFID
<222> (95)..(108)
<223> 二硫键介于Cys-95和Cys-108
<400> 196
Met Lys Arg Met Lys Ser Leu Ala Ala Ala Leu Thr Val Ala Gly Ala
1 5 10 15
Met Leu Ala Ala Pro Val Ala Thr Ala Gly Gly Cys Ala Asp Gly Pro
20 25 30
Thr Leu Arg Glu Trp Ile Ser Phe Cys Gly Gly Ala Ala Pro Ala Ala
35 40 45
Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala
50 55 60
Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala
65 70 75 80
Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Gly Gly Cys Ala
85 90 95
Asp Gly Pro Thr Leu Arg Glu Trp Ile Ser Phe Cys Gly Gly
100 105 110
<210> 197
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CspAss-TPO2-PAS49-b
<400> 197
atgaaacgca tgaaatcgct ggctgcggcg ctcaccgtcg ctggggccat gctggccgca 60
cctgtggcaa cggcaggcgg gtgtgcagac ggacccactc tgcgcgaatg gatctccttt 120
tgcggcggtt ccgctccgtc gccatcctct gctccggcat ccgcgtctgc gccagcatcc 180
ccagccagcg cttcagcctc agcgtcccct gcctcctctc cagcatccgc cagcagcgca 240
tctcctgcgg ctagctcggc atcacccgct tcgtccggag gttgcgctga tggccctacc 300
ctccgtgagt ggatttcctt ctgcggtggc taa 333
<210> 198
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CspAss-TPO2-PAS49-b
<220>
<221> DISULFID
<222> (28)..(41)
<223> 二硫键介于Cys-28和Cys-41
<220>
<221> DISULFID
<222> (95)..(108)
<223> 二硫键介于Cys-95和Cys-108
<400> 198
Met Lys Arg Met Lys Ser Leu Ala Ala Ala Leu Thr Val Ala Gly Ala
1 5 10 15
Met Leu Ala Ala Pro Val Ala Thr Ala Gly Gly Cys Ala Asp Gly Pro
20 25 30
Thr Leu Arg Glu Trp Ile Ser Phe Cys Gly Gly Ser Ala Pro Ser Pro
35 40 45
Ser Ser Ala Pro Ala Ser Ala Ser Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ser Ala
50 55 60
Ser Ala Ser Ala Ser Pro Ala Ser Ser Pro Ala Ser Ala Ser Ser Ala
65 70 75 80
Ser Pro Ala Ala Ser Ser Ala Ser Pro Ala Ser Ser Gly Gly Cys Ala
85 90 95
Asp Gly Pro Thr Leu Arg Glu Trp Ile Ser Phe Cys Gly Gly
100 105 110
<210> 199
<211> 486
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CspAss-TPO2-PAS100
<400> 199
atgaaacgca tgaaatcgct ggctgcggcg ctcaccgtcg ctggggccat gctggccgca 60
cctgtggcaa cggcaggcgg ttgtgctgac ggtcctacct tgcgtgaatg gatttctttc 120
tgtggtggtg cggctccggc tgctccggct cctgcggctc cggctgcacc agcaccagcc 180
gcaccagctg caccagcccc agctgcacca gccgctccag caccagctgc cccagctgca 240
ccagctccag ccgcaccagc agccccagct ccagcagccc cagcagctcc agcaccagcc 300
gctccagctg ccccagcacc agctgctcca gcagctccag caccagcagc tccagctgct 360
ccagccccag ccgccccagc cgctccagcc ccagcagcac cagccgcccc agctccagcc 420
gccccagcag gtggctgtgc tgatggtcct acccttcgtg aatggatttc cttttgtggc 480
ggttag 486
<210> 200
<211> 161
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CspAss-TPO2-PAS100
<220>
<221> DISULFID
<222> (28)..(41)
<223> 二硫键介于Cys-28和Cys-41
<220>
<221> DISULFID
<222> (146)..(159)
<223> 二硫键介于Cys-146和Cys-159
<400> 200
Met Lys Arg Met Lys Ser Leu Ala Ala Ala Leu Thr Val Ala Gly Ala
1 5 10 15
Met Leu Ala Ala Pro Val Ala Thr Ala Gly Gly Cys Ala Asp Gly Pro
20 25 30
Thr Leu Arg Glu Trp Ile Ser Phe Cys Gly Gly Ala Ala Pro Ala Ala
35 40 45
Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala
50 55 60
Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala
65 70 75 80
Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala
85 90 95
Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala
100 105 110
Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala
115 120 125
Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Gly
130 135 140
Gly Cys Ala Asp Gly Pro Thr Leu Arg Glu Trp Ile Ser Phe Cys Gly
145 150 155 160
Gly
<210> 201
<211> 486
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CspAss-TPO2-PAS100-b
<400> 201
atgaaacgca tgaaatcgct ggctgcggcg ctcaccgtcg ctggggccat gctggccgca 60
cctgtggcaa cggcaggcgg gtgtgcagac ggtcccactc tccgcgaatg gatctccttt 120
tgcggcggaa gcgcgccctc cccgtcatct gcccctgcat ctgcgtccgc accagcatcc 180
ccagcctctg cgtctgcttc tgcatcaccg gcctcgtccc cagcaagcgc atcgtccgcg 240
tcaccagctg cgtcctcagc ctcccctgct tcctcgtccg cttcgccttc ggctcctgcc 300
gctccctctg catccgctgc cccatccgcc tcaccagcca gctcctctcc ggcaccagcg 360
tccgctcctt cccctgcagc tgcggcgagc tctccaagcc cggctccctc ctccgcatcc 420
agcgctgccg gtggatgcgc agatggcccg accctgcgtg agtggattag cttctgcggc 480
ggttaa 486
<210> 202
<211> 161
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CspAss-TPO2-PAS100-b
<220>
<221> DISULFID
<222> (28)..(41)
<223> 二硫键介于Cys-28和Cys-41
<220>
<221> DISULFID
<222> (146)..(159)
<223> 二硫键介于Cys-146和Cys-159
<400> 202
Met Lys Arg Met Lys Ser Leu Ala Ala Ala Leu Thr Val Ala Gly Ala
1 5 10 15
Met Leu Ala Ala Pro Val Ala Thr Ala Gly Gly Cys Ala Asp Gly Pro
20 25 30
Thr Leu Arg Glu Trp Ile Ser Phe Cys Gly Gly Ser Ala Pro Ser Pro
35 40 45
Ser Ser Ala Pro Ala Ser Ala Ser Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ser Ala
50 55 60
Ser Ala Ser Ala Ser Pro Ala Ser Ser Pro Ala Ser Ala Ser Ser Ala
65 70 75 80
Ser Pro Ala Ala Ser Ser Ala Ser Pro Ala Ser Ser Ser Ala Ser Pro
85 90 95
Ser Ala Pro Ala Ala Pro Ser Ala Ser Ala Ala Pro Ser Ala Ser Pro
100 105 110
Ala Ser Ser Ser Pro Ala Pro Ala Ser Ala Pro Ser Pro Ala Ala Ala
115 120 125
Ala Ser Ser Pro Ser Pro Ala Pro Ser Ser Ala Ser Ser Ala Ala Gly
130 135 140
Gly Cys Ala Asp Gly Pro Thr Leu Arg Glu Trp Ile Ser Phe Cys Gly
145 150 155 160
Gly
<210> 203
<211> 210
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CspAss-TPO2-GS8
<400> 203
atgaaacgca tgaaatcgct ggctgcggcg ctcaccgtcg ctggggccat gctggccgca 60
cctgtggcaa cggcaggtgg ctgtgcggat ggtcctacct tgcgtgagtg gatttctttc 120
tgtggcggtg gtggtggtgg ttctggtggt ggtggtggtt gcgcagatgg cccaaccctg 180
cgcgaatgga tctccttctg cggcggctaa 210
<210> 204
<211> 69
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CspAss-TPO2-GS8
<220>
<221> DISULFID
<222> (28)..(41)
<223> 二硫键介于Cys-28和Cys-41
<220>
<221> DISULFID
<222> (54)..(67)
<223> 二硫键介于Cys-54和Cys-67
<400> 204
Met Lys Arg Met Lys Ser Leu Ala Ala Ala Leu Thr Val Ala Gly Ala
1 5 10 15
Met Leu Ala Ala Pro Val Ala Thr Ala Gly Gly Cys Ala Asp Gly Pro
20 25 30
Thr Leu Arg Glu Trp Ile Ser Phe Cys Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser
35 40 45
Gly Gly Gly Gly Gly Cys Ala Asp Gly Pro Thr Leu Arg Glu Trp Ile
50 55 60
Ser Phe Cys Gly Gly
65
Claims (19)
1.一种肽分子，其为包含以下部分的肽分子：
(I)第1生理活性肽部分、
(II)包含49个以下的氨基酸残基的接头部分、以及
(III)隔着所述接头部分位于与所述第1生理活性肽部分相反的一侧的第2生理活性肽部分，
所述第1生理活性肽部分和所述第2生理活性肽部分彼此可以相同也可以不同，
所述接头部分的氨基酸序列的至少90％由选自丙氨酸(A)、脯氨酸(P)以及丝氨酸(S)的氨基酸残基构成。
2.根据权利要求1所述的肽分子，其中，
所述第1生理活性肽部分构成了环状肽，并且/或者所述第2生理活性肽部分构成了环状肽。
3.根据权利要求1或2所述的肽分子，其中，
所述第1生理活性肽部分构成了通过二硫键而形成有环状结构的环状肽，并且/或者所述第2生理活性肽部分构成了通过二硫键而形成有环状结构的环状肽。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的肽分子，其中，
所述第1生理活性肽部分和所述第2生理活性肽部分分别构成与c-Met蛋白结合的环状肽，所述第1生理活性肽部分和所述第2生理活性肽部分彼此可以相同也可以不同。
5.根据权利要求4所述的肽分子，其中，
所述环状肽是包含选自以下的(a)～(i)的氨基酸序列，并且通过二硫键而形成有环状结构的环状肽：
(a)CYRQFNRRTHEVWNLDC(序列编号：1)；
(b)CRQFNRRTHEVWNLDC(序列编号：2)；
(c)CYWYYAWDQTYKAFPC(序列编号：3)；
(d)CWYYAWDQTYKAFPC(序列编号：4)；
(e)CYISWNEFNSPNWRFITC(序列编号：5)；
(f)CISWNEFNSPNWRFITC(序列编号：6)；
(g)(a)～(f)中的任一氨基酸序列中，半胱氨酸残基以外的1个或2个氨基酸残基发生了置换、缺失或添加，并且与c-Met蛋白结合的肽；
(h)包含与(a)～(f)中的任一氨基酸序列具有90％以上的序列同一性，且两端具有半胱氨酸残基的氨基酸序列，并且与c-Met蛋白结合的肽；以及
(i)(a)～(h)中的任一氨基酸序列中，两端的半胱氨酸残基以外的至少1个氨基酸得到了修饰的肽，氨基酸的修饰为磷酸化、甲基化、乙酰基化、腺苷酰化、ADP核糖化或糖链加成。
6.根据权利要求1～3中任一项所述的肽分子，其中，
所述第1生理活性肽部分和所述第2生理活性肽部分分别构成与促红细胞生成素受体结合的环状肽，所述第1生理活性肽部分和所述第2生理活性肽部分彼此可以相同也可以不同。
7.根据权利要求6所述的肽分子，其中，
所述环状肽是包含选自以下的(j)～(n)的氨基酸序列，并且通过二硫键而形成有环状结构的环状肽：
(j)GGLYACHMGPMTWVCQPLRG(序列编号：65)；
(k)CISWNEFNSPNWRFITC(序列编号：66)；
(l)(j)或(k)的氨基酸序列中，半胱氨酸残基以外的1个或2个氨基酸残基发生了置换、缺失或添加，并且与促红细胞生成素受体结合的肽；
(m)包含与(j)或(k)中的任一氨基酸序列具有90％以上的序列同一性，且在(j)或(k)中的原本的位置处具有半胱氨酸残基的氨基酸序列，并且与促红细胞生成素受体结合的肽；以及
(n)(j)～(m)中的任一氨基酸序列中，半胱氨酸残基以外的至少1个氨基酸得到了修饰的肽，氨基酸的修饰为磷酸化、甲基化、乙酰基化、腺苷酰化、ADP核糖化或糖链加成。
8.根据权利要求1～3中任一项所述的肽分子，其中，
所述第1生理活性肽部分和所述第2生理活性肽部分分别包含与血小板生成素受体结合的生理活性肽，所述第1生理活性肽部分和所述第2生理活性肽部分彼此可以相同也可以不同。
9.根据权利要求8所述的肽分子，其中，
所述生理活性肽包含选自以下的(o)～(u)的氨基酸序列：
(o)IEGPTLRQWLAARA(序列编号：67)；
(p)GGCADGPTLREWISFCGG(序列编号：68)；
(q)GGCTLREWLHGGFCGG(序列编号：69)；
(r)LAIEGPTLRQWLHGNGRDT(序列编号：70)；
(s)(o)～(r)中的任一氨基酸序列中，半胱氨酸残基以外的1个或2个氨基酸残基发生了置换、缺失或添加，并且与血小板生成素受体结合的肽；
(t)包含与(o)～(r)中的任一氨基酸序列具有90％以上的序列同一性，且在以(p)或(q)为基准的情况下在(p)或(q)中的原本的位置处具有半胱氨酸残基的氨基酸序列，并且与血小板生成素受体结合的肽；以及
(u)(o)～(t)中的任一氨基酸序列中，半胱氨酸残基以外的至少1个氨基酸得到了修饰的肽，氨基酸的修饰为磷酸化、甲基化、乙酰基化、腺苷酰化、ADP核糖化或糖链加成。
10.根据权利要求1～9中任一项所述的肽分子，其在与所述接头部分(II)不相邻的位置处，进一步包含功能性修饰部分。
11.根据权利要求1～10中任一项所述的肽分子，其中，
所述接头部分(II)为第1接头部分，
所述肽分子进一步包含：位于所述第2生理活性肽部分的与所述第1接头部分相反的一侧的第2接头部分，
所述肽分子进一步包含：隔着所述第2接头部分位于与所述第2生理活性肽部分相反的一侧的第3生理活性肽部分，
所述第3生理活性肽部分与所述第1生理活性肽部分和/或所述第2生理活性肽部分可以相同也可以不同，
所述第2接头部分包含49个以下的氨基酸残基，其氨基酸序列的至少90％由选自丙氨酸(A)、脯氨酸(P)以及丝氨酸(S)的氨基酸残基构成，所述第2接头部分与所述第1接头部分可以相同也可以不同。
12.根据权利要求1～11中任一项所述的肽分子，其中，
所述接头部分(II)重复包含2个以上的选自AP、AAP、AS、ASP以及ASS中的氨基酸序列，并且在存在第2接头部分的情况下，该第2接头部分重复包含2个以上的选自AP、AAP、AS、ASP以及ASS中的氨基酸序列。
13.一种肽分子的制造方法，其包含：
通过在包含编码所述肽分子的多核苷酸的宿主细胞中使所述多核苷酸表达、或使编码所述肽分子的多核苷酸在无细胞表达系中表达，来生成所述肽分子的工序，
所述肽分子包含：(I)第1生理活性肽部分、(II)包含氨基酸残基的接头部分、以及(III)隔着所述接头部分位于与所述第1生理活性肽部分相反的一侧的第2生理活性肽部分和/或包含至少1个氨基酸残基的添加氨基酸序列，
所述第1生理活性肽部分和所述第2生理活性肽部分的分子量分别为10000以下，并且包含50个以下的氨基酸残基，所述第1生理活性肽部分和所述第2生理活性肽部分彼此可以相同也可以不同，
所述添加氨基酸序列的分子量为10000以下，并且包含50个以下的氨基酸残基。
14.根据权利要求13所述的制造方法，其中，
所述第1生理活性肽部分构成了环状肽，并且/或者所述第2生理活性肽部分构成了环状肽。
15.一种肽分子的制造方法，其包含：
通过在包含编码所述肽分子的多核苷酸的宿主细胞中使所述多核苷酸表达、或使编码所述肽分子的多核苷酸在无细胞表达系中表达，来生成所述肽分子的工序，
所述肽分子包含：(I)构成了环状肽的第1生理活性肽部分、(II)包含氨基酸残基的接头部分、以及(III)隔着所述接头部分位于与所述第1生理活性肽部分相反的一侧的第2生理活性肽部分和/或包含至少1个氨基酸残基的添加氨基酸序列，
所述第1生理活性肽部分和所述第2生理活性肽部分彼此可以相同也可以不同，
所述添加氨基酸序列的分子量为10000以下，并且包含50个以下的氨基酸残基。
16.根据权利要求15所述的制造方法，其中，
所述肽分子包含所述第2生理活性肽部分，并且所述第2生理活性肽部分构成了环状肽。
17.根据权利要求13～16中任一项所述的制造方法，其中，
所述接头部分的分子量为10000以下，并且包含50个以下的氨基酸残基。
18.根据权利要求13～16中任一项所述的制造方法，其中，
所述接头部分是分子量为10000以下，并且包含49个以下的氨基酸残基的接头部分，其氨基酸序列的至少90％由选自丙氨酸(A)、脯氨酸(P)以及丝氨酸(S)的氨基酸残基构成。
19.根据权利要求13～18中任一项所述的制造方法，其中，
所述接头部分重复包含2个以上的选自AP、AAP、AS、ASP以及ASS的氨基酸序列。
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