CN114761800A - 用于分析物检测和分析的方法 - Google Patents
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Abstract
本文提供了用于测量来自单个细胞的分泌的细胞因子或其他分析物的方法和系统。本文公开的方法包括使用分析物特异性和/或条形码化结合剂(例如,抗体)和分区(例如,液滴或孔)中的珠粒来在单细胞基础上测量此类分析物。本文还描述了包括使用水凝胶包封的细胞(例如,细胞珠粒)来测量来自单个细胞的分泌的分析物和/或细胞分析物的方法。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2019年10月11日提交的美国临时专利申请序列号62/914,296的优先权,出于所有目的将该申请通过引用以其整体并入本文。
背景技术
基于核酸的条形码技术可用于通过使用与DNA序列缀合的抗体来测量蛋白质,所述DNA序列含有用于扩增/测序的引物和充当抗体条形码的独特寡核苷酸。它是用于检测和定量保持与细胞表面结合的蛋白质的有用工具。然而,需要分析细胞分泌的蛋白质和分子的方法。
发明内容
本文提供了用于分析例如来自目的细胞的分泌的分析物、可溶性分析物和/或细胞外分析物的方法和组合物。
测量分泌蛋白和分子对于充分理解功能异质性并且破译细胞相互作用和通讯的潜在机制是必要的。分泌蛋白先前使用诸如“细胞因子分泌测定”等测定以单细胞分辨率测量。例如,可使用包被细胞并可“捕获”分子的抗体-抗体复合物分离目的分泌蛋白。然后可以通过另一种荧光染料标记的抗体检测细胞,随后使用荧光激活细胞分选术(FACS)对其进行分析。FACS方法与酶联免疫吸附测定(ELISA)抗体形式大体相似,除了包封的细胞保持完整。细胞因子分泌测定也可直接与测量细胞表面蛋白用于免疫分型和/或肽-MHC四聚体染色用于抗原特异性T细胞的功能表征进行组合。然而,与使用FACS测量表面蛋白相关的相同限制也适用于分泌蛋白:多重化超过数十种蛋白质的分析物的能力有限,并且不能同时测量来自同一细胞的核酸。因此,需要用于多重化具有大样品量的分泌的分析物以及用于同时测量分泌的分析物、mRNA、细胞表面蛋白、配对的αβT细胞受体序列和抗原结合特异性等的改进的方法和系统。本公开文本提供了用于对来自单个细胞的各种目的分析物进行这种多重化和同时测量的方法和系统。
在一方面,本公开文本提供了处理来自细胞的分泌分子的方法,所述方法包括(a)将所述分泌分子与捕获剂(例如,第一多肽)偶联以形成第一缀合物,所述捕获剂与所述细胞的表面偶联;和(b)将报告剂(例如,第二多肽)与所述分泌分子偶联以形成第二缀合物,其中所述报告剂包含含有第一条形码序列的核酸报告分子(例如,包含报告条形码序列的报告序列)。
在一些实施方案中,在(a)之前,所述方法还包括在足够的条件下将细胞与捕获剂一起孵育,使得捕获剂与细胞表面偶联。在一些实施方案中,在(b)之前,所述方法还包括刺激细胞以诱导分泌分子分泌。
在一些实施方案中,用抗原刺激细胞。在一些实施方案中,抗原是模式识别受体(PRR)配体。PRR配体可以基于或衍生自病原体相关分子模式(PAMP)(也称为微生物相关分子模式(MAMP)),并且可以包含基于PAMP的大分子的一个或多个元件(例如,核酸或氨基酸)。在一些实施方案中,PRR配体是Toll样受体(TLR)配体、NOD样受体(NLR)配体、RIG-I样受体(RLR)配体、黑素瘤缺乏因子(AIM)样受体(ALR)配体、C型凝集素受体(CLR)配体或胞质dsDNA感受器(CDS)配体。在一些实施方案中,抗原是、包含或衍生自病毒蛋白(例如,来自呼吸道合胞病毒(RSV)的F蛋白、或来自水泡性口炎病毒(VSV)的糖蛋白)、脂多肽或脂肽(例如,三酰基脂肽、二酰基脂多肽)、肽聚糖、磷脂酰丝氨酸、酵母聚糖、鞭毛蛋白、疟原虫色素、脂多糖(LPS)、双链DNA(dsDNA)、双链RNA(dsRNA)、合成dsRNA或CpG寡脱氧核苷酸(CpGODN)。在一些实施方案中,合成dsRNA是聚肌苷酸-聚胞苷酸(poly I:C)或聚腺苷酸-聚尿苷酸(poly A:U)。
在一些实施方案中,所述方法还包括以足以诱导分泌分子分泌的浓度向细胞提供多种抗原。在一些实施方案中,在足以诱导分泌分子分泌的一段时间内向细胞提供多种抗原。在一些实施方案中,多种抗原中的抗原与主要组织相容性复合物(MHC)分子偶联。在一些实施方案中,MHC分子是MHC多聚体。在一些实施方案中,MHC多聚体包含葡聚糖聚合物。在一些实施方案中,MHC分子存在于抗原呈递细胞中。
在一些实施方案中,所述方法还包括使细胞与一种或多种共刺激分子接触。在一些实施方案中,一种或多种共刺激分子包括一种或多种抗体。在一些实施方案中,一种或多种抗体是抗CD3或抗CD28抗体。在一些实施方案中,一种或多种共刺激分子包括一种或多种细胞因子。
在一些实施方案中,一种或多种细胞因子包括白介素。在一些实施方案中,一种或多种共刺激分子存在于抗原呈递细胞上。在一些实施方案中,所述方法还包括将多个核酸条形码分子与包含第一缀合物和第二缀合物(例如,与细胞表面偶联的复合物,所述复合物包含(i)捕获剂、(ii)分泌的分析物、和(iii)报告剂)的细胞(例如,标记的细胞)共分区成分区,其中所述多个核酸分子中的每个核酸分子包含第二条形码序列,并且其中第二条形码序列不同于第一条形码序列。在一些实施方案中,多个核酸条形码分子附接到支持物(例如,珠粒)。在一些实施方案中,多个核酸条形码分子可释放地附接到所述支持物(例如,珠粒)。在一些实施方案中,多个核酸条形码分子经由不稳定键可释放地附接到支持物(例如,珠粒)。在一些实施方案中,多个核酸条形码分子在施加刺激后可从支持物(例如,珠粒)释放。在一些实施方案中,刺激是热刺激、化学刺激、生物刺激或光刺激。在一些实施方案中,化学刺激是还原剂。在一些实施方案中,不稳定键是二硫键。
在一些实施方案中,所述方法还包括从支持物如珠粒释放多个核酸条形码分子中的核酸条形码分子。在一些实施方案中,珠粒是凝胶珠粒。在一些实施方案中,珠粒是可降解的凝胶珠粒。在一些实施方案中,凝胶珠粒在施加刺激后可降解。在一些实施方案中,刺激是热刺激、化学刺激、生物刺激或光刺激。在一些实施方案中,化学刺激是还原剂。在一些实施方案中,分区是液滴或孔。
在一些实施方案中,所述方法还包括裂解细胞。在一些实施方案中,所述方法还包括从细胞中释放核酸。在一个实施方案中,核酸包含来自细胞的信使核糖核酸(mRNA)分子。在一些实施方案中,所述方法还包括使用多个核酸条形码分子中的核酸条形码分子和报告分子来产生包含对应于第一条形码序列的序列和对应于第二条形码序列的序列的第一条形码化核酸分子。在一些实施方案中,核酸条形码分子包含与报告分子中的序列互补的序列。
在一些实施方案中,所述方法还包括将核酸条形码分子与报告分子杂交并进行核酸反应以产生第一条形码化核酸分子。在一些实施方案中,核酸反应是连接反应或核酸延伸反应。在一些实施方案中,所述方法还包括使用来自细胞的核酸分子(例如,一种或多种mRNA分子)和多个核酸条形码分子中的核酸条形码分子来产生包含对应于mRNA分子的序列和对应于第二条形码序列的序列的第二条形码化核酸分子。
在一些实施方案中,核酸条形码分子包含与mRNA分子中的序列互补的序列。在一些实施方案中,所述方法还包括将核酸条形码分子与mRNA分子或其cDNA杂交并进行核酸反应以产生条形码化核酸分子。在一些实施方案中,核酸反应是逆转录反应、连接反应或核酸延伸反应。在一些实施方案中,所述方法还包括扩增报告分子和/或衍生自mRNA分子的cDNA分子。
在一些实施方案中,扩增包括聚合酶链式反应(PCR)。在一些实施方案中,其中扩增是等温的。在一些实施方案中,所述方法还包括根据核酸分子和/或cDNA分子的大小对它们进行分选。在一些实施方案中,所述方法还包括对第一条形码化核酸分子或其衍生物和/或第二条形码化核酸分子或其衍生物进行测序。
在一些实施方案中,所述方法还包括进行一种或多种核酸反应以将一种或多种功能序列添加到第一条形码化核酸分子和/或第二条形码化核酸分子。在一些实施方案中,一种或多种功能序列是引物序列、测序引物序列或被配置为附接到测序仪的流动池的序列。在一些实施方案中,报告分子包含一种或多种选自引物序列、测序引物序列、被配置为附接到测序仪的流动池的序列和唯一分子标识符(UMI)的功能序列。在一些实施方案中,多个核酸条形码分子各自包含一种或多种选自引物序列、测序引物序列、部分测序引物序列、被配置为附接到测序仪的流动池的序列和唯一分子标识符(UMI)的功能序列。
在一些实施方案中,所述方法还包括鉴定第一条形码序列和第二条形码序列并将分泌分子和/或mRNA分子与细胞缔合。在一些实施方案中,分泌分子是细胞因子。在一些实施方案中,捕获剂(例如,第一多肽)经由细胞表面蛋白与细胞偶联。在一些实施方案中,捕获剂(例如,第一多肽)包含第一抗体或抗体片段和第二抗体或抗体片段,其中将第一抗体或抗体片段与第二抗体或抗体片段缔合。在一些实施方案中,第一抗体或抗体片段能够与分泌分子偶联。在一些实施方案中,第二抗体或抗体片段能够与细胞表面偶联。在一些实施方案中,报告剂(例如,第二多肽)包含或为抗体或抗体片段。
在一些实施方案中,所述方法还包括使细胞与多种捕获剂分子接触,并且在(b)之前,去除未结合到细胞表面的捕获剂分子。在一些实施方案中,所述方法还包括使细胞与多个报告剂分子(例如,第二多肽分子)接触,并且在(b)之后,去除未结合到分泌分子的报告剂分子。
在另一方面,本公开文本提供了处理来自细胞的分子的方法,所述方法包括(a)产生细胞珠粒,其中所述细胞珠粒包含被聚合物基质包封的细胞,其中所述聚合物基质包含多个捕获剂;和(b)将从细胞分泌的分子与多种捕获剂中的第一捕获剂偶联以形成第一缀合物。
在一些实施方案中,聚合物基质为水凝胶基质。在一些实施方案中,聚合物基质包含胶原蛋白、层粘连蛋白和/或纤连蛋白。在一些实施方案中,多种捕获剂(例如,第一多肽)与聚合物基质的聚合物主链偶联。在一些实施方案中,在(b)之前,所述方法还包括刺激含有细胞的细胞珠粒以诱导从细胞中分泌分子。在一些实施方案中,用抗原刺激细胞珠粒。在一些实施方案中,抗原是模式识别受体(PRR)配体。在一些实施方案中,PRR配体是Toll样受体(TLR)配体、NOD样受体(NLR)配体、RIG-I样受体(RLR)配体、C型凝集素受体(CLR)配体或胞质dsDNA感受器(CDS)配体。在一些实施方案中,抗原是脂多糖(LPS)、双链DNA(dsDNA)、双链RNA(dsRNA)、合成dsRNA或CpG寡脱氧核苷酸(CpG ODN)。在一些实施方案中,合成dsRNA是聚肌苷酸-聚胞苷酸(poly I:C)或聚腺苷酸-聚尿苷酸(poly A:U)。
在一些实施方案中,所述方法还包括以足以诱导分泌分子分泌的浓度向细胞珠粒提供多种抗原。在一些实施方案中,在足以诱导分泌分子分泌的一段时间内向细胞珠粒提供多种抗原。在一些实施方案中,多种抗原中的抗原与主要组织相容性复合物(MHC)分子偶联。在一些实施方案中,MHC分子是MHC多聚体。在一些实施方案中,MHC多聚体包含葡聚糖聚合物。在一些实施方案中,MHC分子存在于抗原呈递细胞中。
在一些实施方案中,所述方法还包括使细胞珠粒与一种或多种共刺激分子接触。在一些实施方案中,一种或多种共刺激分子包括一种或多种抗体。在一些实施方案中,一种或多种抗体是抗CD3或抗CD28抗体。在一些实施方案中,一种或多种共刺激分子包括一种或多种细胞因子。在一些实施方案中,一种或多种细胞因子包括白介素。在一些实施方案中,一种或多种共刺激分子存在于抗原呈递细胞上。
在一些实施方案中,所述方法还包括将报告剂(例如,第二多肽)与从细胞分泌的分子偶联以形成第二缀合物,其中所述报告剂包含含有第一条形码序列(例如,报告条形码序列)的核酸报告分子。在一些实施方案中,所述方法还包括从细胞珠粒中去除未结合的报告剂分子。
在一些实施方案中,在(b)之后,所述方法还包括(c)用酶部分消化细胞珠粒,从而产生部分消化的细胞珠粒。在一些实施方案中,酶是胶原酶或分散酶。在一些实施方案中,所述方法还包括在使得来自多个报告剂中的报告剂与从细胞分泌的分子偶联的条件下,使包含条形码的多个报告剂与所述部分消化的细胞珠粒接触。在一些实施方案中,所述方法还包括将多个核酸条形码分子与包含第一缀合物和第二缀合物的细胞珠粒共分区成分区,其中所述多个核酸条形码分子中的每个核酸条形码分子包含第二条形码序列,并且其中第二条形码序列不同于第一条形码序列。
在一些实施方案中,多个核酸条形码分子附接到珠粒。在一些实施方案中,多个核酸条形码分子可释放地附接到所述珠粒。在一些实施方案中,多个核酸条形码分子经由不稳定键可释放地附接到珠粒。在一些实施方案中,多个核酸条形码分子在施加刺激后可从珠粒释放。在一些实施方案中,刺激是热刺激、化学刺激、生物刺激或光刺激。
在一些实施方案中,化学刺激是还原剂。在一些实施方案中,不稳定键是二硫键。
在一些实施方案中,所述方法还包括释放多个核酸条形码分子中的核酸条形码分子。在一些实施方案中,其中珠粒是凝胶珠粒。在一些实施方案中,珠粒是可降解的凝胶珠粒。在一些实施方案中,凝胶珠粒在施加刺激后可降解。在一些实施方案中,刺激是热刺激、化学刺激、生物刺激或光刺激。在一些实施方案中,化学刺激是还原剂。
在一些实施方案中,分区是液滴或孔。在一些实施方案中,所述方法还包括降解细胞珠粒。
在一些实施方案中,所述方法还包括裂解细胞。在一个实施方案中,所述方法还包括从细胞释放信使核糖核酸(mRNA)分子。在一些实施方案中,所述方法还包括使用多个核酸条形码分子中的核酸条形码分子和报告分子来产生包含对应于第一条形码序列的序列和对应于第二条形码序列的序列的第一条形码化核酸分子。
在一些实施方案中,核酸条形码分子包含与报告分子中的序列互补的序列。在一些实施方案中,所述方法还包括将核酸条形码分子与报告分子杂交并进行核酸反应以产生第一条形码化核酸分子。在一些实施方案中,所述方法还包括核酸反应,所述核酸反应是连接反应或核酸延伸反应。在一些实施方案中,所述方法还包括使用mRNA分子和多个核酸条形码分子中的核酸条形码分子来产生包含对应于mRNA分子的序列和对应于第二条形码序列的序列的第二条形码化核酸分子。
在一些实施方案中,核酸条形码分子包含与mRNA分子中的序列互补的序列。在一些实施方案中,所述方法还包括将核酸条形码分子与mRNA分子或其cDNA杂交并进行核酸反应以产生条形码化核酸分子。在一些实施方案中,核酸反应是逆转录反应、连接反应或核酸延伸反应。在一些实施方案中,所述方法还包括扩增报告分子和/或衍生自mRNA分子的cDNA分子。
在一些实施方案中,扩增包括聚合酶链式反应(PCR)。在一些实施方案中,扩增是等温的。在一些实施方案中,所述方法还包括根据核酸分子和/或cDNA分子的大小对它们进行分选。在一些实施方案中,所述方法还包括对第一条形码化核酸分子或其衍生物和/或第二条形码化核酸分子或其衍生物进行测序。在一些实施方案中,所述方法还包括进行一种或多种核酸反应以将一种或多种功能序列添加到第一条形码化核酸分子和/或第二条形码化核酸分子。
在一些实施方案中,一种或多种功能序列是引物序列、测序引物序列或被配置为附接到测序仪的流动池的序列。在一些实施方案中,报告分子包含一种或多种选自引物序列、测序引物序列、被配置为附接到测序仪的流动池的序列和唯一分子标识符(UMI)的功能序列。在一些实施方案中,多个核酸条形码分子各自包含一种或多种选自引物序列、测序引物序列、部分测序引物序列、被配置为附接到测序仪的流动池的序列和唯一分子标识符(UMI)的功能序列。
在一些实施方案中,所述方法还包括鉴定第一条形码序列和第二条形码序列并将分泌分子和/或mRNA分子与细胞缔合。在一些实施方案中,分泌分子是细胞因子。在一些实施方案中,第二多肽是抗体或抗体片段。在一些实施方案中,MHC分子包含含有第三条形码序列的核酸分子。在一些实施方案中,第三条形码序列不同于第一条形码序列或第二条形码序列。
在某些实施方案中,处理来自细胞的分泌分子的方法包括(a)将所述分泌分子与捕获剂(例如,第一多肽或包含第一多肽的第一结合剂)偶联以形成第一缀合物,所述捕获剂与所述细胞的表面偶联;和(b)将报告剂(例如,第二多肽或包含第二多肽的第二结合剂)与所述分泌分子偶联以形成第二缀合物,其中所述报告剂包含含有第一条形码序列的核酸分子。此外,所述方法包括在(a)之前,将细胞与捕获剂一起孵育,使得捕获剂与细胞表面偶联。此外,所述方法包括在(a)之前,以足以诱导分泌分子分泌的浓度向细胞提供多种抗原。此外,所述方法包括将支持物如珠粒(例如,凝胶珠粒,如乳液珠粒)与和第二缀合物偶联的细胞共分区成分区,其中所述珠粒与包含第二条形码序列的多个核酸分子偶联,其中第二条形码序列不同于第一条形码序列。所述方法还包括裂解细胞以释放细胞内内容物如细胞mRNA分子,反转录mRNA分子从而产生相应的cDNA分子,所述cDNA分子包含珠粒(例如,乳液珠粒)可包含的第二条形码序列,并将第二条形码序列(例如,分区特异性条形码序列)附接到包含第一分析物特异性条形码序列的核酸分子。可以扩增核酸分子(例如,cDNA、条形码序列等),并按大小分类,然后对分类的核酸分子进行测序。测序可以鉴定分泌的分析物(例如,细胞因子)、mRNA分子和其他细胞特异性分析物,并且使得这些细胞分析物能够与其相应的细胞或细胞类型(例如,免疫细胞,如T细胞)缔合,用于例如免疫分型等。本公开文本提供了这样的方法,所述方法不仅允许在单个细胞基础上获得该信息,而且除了分析和/或同时分析单个细胞的细胞核酸分子(例如,用于分析T细胞受体(TCR)序列的mRNA,参见例如,操作1804和1805)、细胞表面蛋白(例如,T细胞受体、B细胞受体等,参见例如,操作1801)、抗原特异性(参见例如,操作1802)等,还允许分析分泌的分析物(例如,细胞因子或其他分泌蛋白,参见例如,操作1803)。用于分析物的单细胞分析的示例性方法和组合物公开于WO2019/157529中,出于所有目的将其通过引用以其整体并入本文。此外,所述方法允许通过使用标记剂来多重化或以其他方式增加用于分析的样品的通量,所述标记剂包含核酸报告分子并且能够结合或以其他方式偶联一个或多个细胞或细胞特征,如本文进一步描述的。
此外,在某些实施方案中,处理来自细胞的分泌分子的方法包括(a)产生细胞珠粒,其中所述细胞珠粒包含被聚合物基质(例如,水凝胶基质)包封的细胞,其中所述聚合物基质与捕获剂(例如,第一多肽或包含第一多肽的第一结合剂)偶联,其中所述捕获剂对所述分泌分子具有特异性;和(b)将所述分泌分子与所述捕获剂偶联以形成第一缀合物。所述方法还包括在(b)之前,以足以诱导分泌分子分泌的浓度向细胞珠粒提供多种抗原。在形成第一缀合物之后,报告剂(例如,第二多肽或包含第二多肽的第二结合剂)可以与和捕获剂(例如,第一多肽)结合的分泌分子偶联以形成第二缀合物,其中所述报告剂包含含有第一条形码序列(例如,报告条形码序列)的核酸分子,从而对分泌分子进行条形码化。此外,所述方法还包括将与第二缀合物偶联的细胞珠粒共分区成分区,其中所述分区还包含珠粒(例如,凝胶珠粒,如乳液珠粒),并且其中所述珠粒包含多个包含第二条形码序列的核酸分子,其中第二条形码序列不同于第一条形码序列。溶解聚合物基质,随后裂解细胞以释放细胞内内容物,如细胞mRNA分子。将mRNA分子逆转录,从而产生包含第二条形码序列(例如,分区特异性条形码序列)的相应cDNA分子。包含第一分析物特异性条形码序列的核酸分子也用第二条形码序列进行条形码化。可以扩增核酸(例如,cDNA、条形码序列等),并按大小分类,然后对分类的核酸分子进行测序。测序可以鉴定分泌的分析物(例如,细胞因子)、mRNA分子和其他细胞特异性分析物,并且使得这些细胞分析物能够与其相应的细胞或细胞类型(例如,免疫细胞,如T细胞)缔合,用于例如免疫分型等。本公开文本提供了这样的方法,所述方法不仅允许在单个细胞基础上获得该信息,而且除了分析和/或同时分析单个细胞的细胞核酸分子(例如,用于分析T细胞受体(TCR)序列的mRNA,参见例如,操作1804和1805)、细胞表面蛋白(例如,T细胞受体、B细胞受体等,参见例如,操作1801)、抗原特异性(参见例如,操作1802)等,还允许分析分泌的分析物(例如,细胞因子或其他分泌蛋白,参见例如,操作1803)。此外,所述方法允许通过使用标记剂来多重化或以其他方式增加用于分析的样品的通量,所述标记剂包含核酸报告分子并且能够结合或以其他方式偶联一个或多个细胞或细胞特征,如本文进一步描述的。
在一些实施方案中,本文提供了单细胞分析的方法,所述方法包括:a)使细胞与包含报告核酸分子的报告剂接触以提供标记的细胞,其中所述报告核酸分子包含对应于所述报告剂的报告序列,其中所述标记的细胞包含与所述细胞的表面偶联的复合物,并且其中所述复合物包含(i)捕获剂,(ii)分泌的分析物,和(iii)报告剂;b)将标记的细胞分区为分区,其中所述分区包含含有多个分区条形码序列的多个条形码核酸分子;和c)在所述分区中,由所述多个条形码核酸分子中的条形码核酸分子和所述报告核酸分子产生条形码化核酸分子,其中所述条形码化核酸分子包含所述报告序列或其互补序列以及分区条形码序列或其互补序列。
在任一前述实施方案中,分泌的分析物可以包含分泌蛋白。在任一前述实施方案中,捕获剂可以被配置为与细胞表面分子偶联。在任一前述实施方案中,所述细胞表面分子可以包含细胞表面蛋白。在任一前述实施方案中,捕获剂可以被配置为与分泌的分析物偶联。在任一前述实施方案中,所述捕获剂可以被配置为与细胞表面蛋白和所述分泌的分析物二者偶联。在任一前述实施方案中,所述捕获剂可以是第一蛋白结合剂。在任一前述实施方案中,报告剂可以被配置为与分泌的分析物偶联。在任一前述实施方案中,所述报告剂可以是第二蛋白结合剂。在任一前述实施方案中,所述报告核酸分子还可以包含被配置为与条形码核酸分子偶联的序列。
在任一前述实施方案中,所述标记的细胞还可以包含含有第二报告核酸分子的第二报告剂。在任一前述实施方案中,所述第二报告剂可以被配置为与细胞的第二细胞表面蛋白偶联。在任一前述实施方案中,所述第二报告核酸分子可以包含对应于第二报告剂的第二报告序列。在任一前述实施方案中,分区还可以包含多个第二条形码核酸分子中的第二条形码核酸分子。在任一前述实施方案中,所述第二报告核酸分子可以包含被配置为与第二条形码核酸分子偶联的第二序列。在任一前述实施方案中,所述方法还可以包括由来自多个第二条形码核酸分子的第二条形码核酸分子和第二报告核酸分子产生第二条形码化核酸分子,其中所述第二条形码化核酸分子包含来自第二报告核酸分子和第二条形码核酸分子的序列或其互补序列。
在任一前述实施方案中,所述标记的细胞还可以包含多种核酸分析物,并且所述多种核酸分析物中的核酸分析物可以包含核酸分析物序列。在任一前述实施方案中,分区还可以包含多个第三条形码核酸分子。在任一前述实施方案中,所述多个第三条形码核酸分子中的第三条形码核酸分子可以包含被配置为与核酸分析物序列偶联的第三序列。在任一前述实施方案中,所述方法还可以包括由来自多个第三条形码核酸分子的第三条形码核酸分子和核酸分析物产生第三条形码化核酸分子,其中所述第三条形码化核酸分子包含来自核酸分析物和第三条形码核酸分子的序列或其互补序列。
在任一前述实施方案中,所述分区可以包含含有多个条形码核酸分子的支持物。在任一前述实施方案中,所述支持物可以包含珠粒。在任一前述实施方案中,所述珠粒可以包含凝胶珠粒。在任一前述实施方案中,所述多个条形码核酸分子可以可释放地附接到支持物。在任一前述实施方案中,分区可以来自多个分区。在任一前述实施方案中,分区可以包含液滴或微孔。
在一些实施方案中,本文提供了单细胞分析的方法,所述方法包括:a)使细胞珠粒与包含报告核酸分子的报告剂接触以提供标记的细胞珠粒,其中所述细胞珠粒包含基质中的细胞,其中所述报告核酸分子包含对应于所述报告剂的报告序列,其中所述标记的细胞珠粒包含在所述细胞珠粒中或其上的复合物,并且其中所述复合物包含(i)捕获剂,(ii)分泌的分析物,和(iii)报告剂;b)将标记的细胞珠粒分区为分区,其中所述分区包含含有多个分区条形码序列的多个条形码核酸分子;和c)在所述分区中,由所述多个条形码核酸分子中的条形码核酸分子和所述报告核酸分子产生条形码化核酸分子,其中所述条形码化核酸分子包含所述报告序列或其互补序列以及分区条形码序列或其互补序列。
在任一前述实施方案中,所述分泌的分析物可以包含分泌蛋白。在任一前述实施方案中,捕获剂可以被配置为与细胞珠粒的基质偶联。在任一前述实施方案中,所述基质可以是可降解的聚合物基质。在任一前述实施方案中,捕获剂可以被配置为与分泌的分析物偶联。在任一前述实施方案中,所述捕获剂可以被配置为与基质和所述分泌的分析物二者偶联。在任一前述实施方案中,所述捕获剂可以是第一蛋白结合剂。在任一前述实施方案中,报告剂可以被配置为与分泌的分析物偶联。在任一前述实施方案中,所述报告剂可以是第二蛋白结合剂。在任一前述实施方案中,所述报告核酸分子还可以包含被配置为与条形码核酸分子偶联的序列。
在任一前述实施方案中,所述细胞或所述标记的细胞珠粒还可以包含含有第二报告核酸分子的第二报告剂。在任一前述实施方案中,所述第二报告剂可以被配置为与细胞的细胞表面蛋白偶联。在任一前述实施方案中,所述第二报告核酸分子可以包含对应于第二报告剂的第二报告序列。在任一前述实施方案中,分区还可以包含多个第二条形码核酸分子中的第二条形码核酸分子。在任一前述实施方案中,所述第二报告核酸分子可以包含被配置为与第二条形码核酸分子偶联的第二序列。在任一前述实施方案中,所述方法还可以包括由来自多个第二条形码核酸分子的第二条形码核酸分子和第二报告核酸分子产生第二条形码化核酸分子,其中所述第二条形码化核酸分子包含来自第二报告核酸分子和第二条形码核酸分子的序列或其互补序列。
在任一前述实施方案中,所述细胞还可以包含多种核酸分析物,其中所述多种核酸分析物中的核酸分析物可以包含核酸分析物序列。在任一前述实施方案中,分区还可以包含多个第三条形码核酸分子。在任一前述实施方案中,所述多个第三条形码核酸分子中的第三条形码核酸分子可以包含被配置为与核酸分析物序列偶联的第三序列。在任一前述实施方案中,所述方法还可以包括由来自多个第三条形码核酸分子的第三条形码核酸分子和核酸分析物产生第三条形码化核酸分子,其中所述第三条形码化核酸分子包含来自核酸分析物和第三条形码核酸分子的序列或其互补序列。
在任一前述实施方案中,所述分区可以包含含有多个条形码核酸分子的支持物。在任一前述实施方案中,所述支持物可以包含珠粒。在任一前述实施方案中,所述珠粒包含凝胶珠粒。在任一前述实施方案中,所述多个条形码核酸分子可以可释放地附接到支持物。在任一前述实施方案中,分区可以来自多个分区。在任一前述实施方案中,分区可以包含液滴或微孔。
从以下详细描述中,本公开文本的其他方面和优点对于本领域技术人员将变得显而易见,其中仅示出和描述了本公开文本的说明性实施方案。如将认识到的,本公开文本能够具有其他和不同的实施方案,并且其若干细节能够在各种明显的方面进行修改,所有这些都不脱离本公开文本。因此,附图和描述本质上应被视为说明性的而非限制性的。
通过引用并入
此说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请都通过引用并入本文,并入程度就像每个单独的出版物、专利或专利申请被明确和单独地指出以通过引用并入一样。就通过引用并入的出版物和专利或专利申请与说明书中包括的公开内容相矛盾而言,说明书旨在取代和/或优先于任何这种矛盾的材料。
附图说明
本发明的新型特征具体陈述于所附的权利要求中。通过参考以下详细描述,将获得对本发明的特征和优点的更好理解,该详细描述阐述了使用本发明原理的说明性实施方案和附图(本文中也称为“图”),并且附图中:
图1示出了用于对单独的生物颗粒进行分区的微流体通道结构的例子。
图2示出了用于将携带条形码的珠粒递送到液滴的微流体通道结构的例子。
图3示出了用于对生物颗粒和试剂进行共分区的微流体通道结构的例子。
图4示出了用于将珠粒受控分区到离散液滴的微流体通道结构的例子。
图5示出了用于增加液滴产生通量的微流体通道结构的例子。
图6示出了用于增加液滴产生通量的微流体通道结构的另一个例子。
图7A示出了具有用于受控分区的几何特征的微流体通道结构的另一个例子的截面图。
图7B示出了图7A的通道结构的透视图。
图8说明携带条形码的珠粒的例子。
图9说明携带条形码的珠粒的另一例子。
图10示意性地说明示例性微孔阵列。
图11示意性地说明用于处理核酸分子的示例性工作流。
图12A示出了培养细胞以允许或诱导内源分子分泌的例子。
图12B示出了与细胞表面和分泌的分析物偶联的第一结合剂(例如,捕获剂)的例子。
图13示出了与包含多肽(例如,抗体)的第一结合剂(例如,捕获剂)偶联的细胞的例子;并且每个捕获剂与分泌的分析物(例如,细胞因子)偶联,然后将其与包含多肽(例如,抗体)和含有第一条形码序列(例如,报告条形码序列)的核酸分子的第二结合剂(例如,报告剂)偶联。
图14A-14C示出了本文公开的方法的例子。
图15A示出了形成细胞珠粒的例子。
图15B示出了在细胞珠粒内培养细胞以允许或诱导内源分子分泌的例子。
图15C示出了第一结合剂(例如,捕获剂)的例子,其包含结合或偶联聚合物主链的分析物特异性抗体。
图15D示出了与包含多肽(例如,抗体)和含有第一条形码序列(例如,报告条形码序列)的核酸分子的结合剂(例如,报告剂)偶联的水凝胶基质(例如,细胞珠粒)的例子,其中结合剂与分泌的分析物(例如,细胞因子)偶联。
图16示出了分区细胞1602和分区细胞珠粒1604的例子。
图17A示出了条形码化珠粒的例子,该珠粒可以用于在诸如液滴等分区中将单个细胞的一种或多种分析物(例如,分泌的分析物,如细胞因子、mRNA等)与条形码(例如,分区特异性条形码)偶联,从而将所述一种或多种分析物与单个细胞缔合。
图17B示出了条形码化分析物转化为测序文库的图示。
图18示出了同时测量分泌的分析物、mRNA、细胞表面蛋白、配对的αβT细胞受体序列和抗原结合特异性的例子。
图19示意性地说明标记剂的例子。
图20描绘携带条形码的珠粒的例子。
图21A-21C示意性地绘用于处理核酸分子的工作流的例子。
图22示出了被编程或以其他方式配置为实现本文提供的方法的计算机系统。
具体实施方式
虽然在本文中已经示出和描述了本发明的各种实施方案,但是对于本领域的技术人员来说,显然这些实施方案仅作为举例提供。在不脱离本发明的情况下,本领域技术人员可以想到许多变化、改变和替换。应当理解,可以采用在本文中描述的本发明实施方案的各种替代方案。
当值被描述为范围时,应当理解,这种公开包括在这种范围内的所有可能的子范围的公开,以及落入这种范围内的特定数值,而不管是否明确说明了特定数值或特定子范围。
如本文所用的术语“条形码”通常指传达或能够传达关于分析物的信息的标记或标识符。条形码可以是分析物的一部分。条形码可以独立于分析物。条形码可以是附接到分析物(例如核酸分子)上的标签,或者除分析物的内源性特征(例如分析物的尺寸或末端序列)之外的标签的组合。条形码可能是唯一的。条形码可以有多种不同的格式。例如,条形码可以包括:多核苷酸条形码;随机核酸和/或氨基酸序列;和合成核酸和/或氨基酸序列。条形码可以以可逆或不可逆的方式附接到分析物上。条形码可以在样品测序之前、期间和/或之后添加到例如脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)样品的片段中。条形码可以鉴定和/或量化各个测序读段。
如本文所用的术语“实时”可以指响应时间小于约1秒、十分之一秒、百分之一秒、一毫秒或更短。响应时间可能大于1秒。在一些情况下,实时可以指同时或基本同时的处理、检测或鉴定。
如本文所用的术语“受试者”通常指动物,如哺乳动物(如人)或禽类(如鸟),或其他生物,如植物。例如,受试者可以是脊椎动物、哺乳动物、啮齿动物(例如,小鼠)、灵长类动物、猿猴或人类。动物可以包括但不限于农场动物、竞技动物和宠物。受试者可以是健康的或无症状的个体、患有或怀疑患有疾病(例如癌症)或有患病倾向的个体、和/或需要治疗或怀疑需要治疗的个体。受试者可以是患者。受试者可以是微小生物或微生物(例如细菌、真菌、古细菌、病毒)。
如本文所用的术语“基因组”通常指来自受试者的基因组信息,其可以是例如受试者遗传信息的至少一部分或全部。基因组可以用DNA或RNA编码。基因组可以包括编码区(例如,编码蛋白质的区域)以及非编码区。基因组可以包括生物体中所有染色体的序列。例如,人类基因组通常总共有46条染色体。所有这些的序列共同构成了人类基因组。
术语“衔接子”(“adaptor”、“adapter”)、和“标签”可以同义使用。衔接子或标签可以通过任何方法与待“标记”的多核苷酸序列偶联,包括连接、杂交或其他方法。
如本文所用的术语“测序”通常指用于确定一种或多种多核苷酸中核苷酸碱基序列的方法和技术。多核苷酸可以是例如核酸分子,例如脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA),包括其变体或衍生物(例如单链DNA)。测序可以通过目前可用的各种系统进行,例如但不限于Pacific BiosciencesOxford或LifeTechnologies(Ion)的测序系统。可替代地或另外地,可以使用核酸扩增、聚合酶链式反应(PCR)(例如,数字PCR、定量PCR或实时PCR)或等温扩增来进行测序。这种系统可以提供与受试者(例如人类)的遗传信息相对应的多个原始遗传数据,这些数据由系统从受试者提供的样品中生成。在一些例子中,这样的系统提供测序读段(在此也称为“读段”)。读段可以包括对应于已经测序的核酸分子序列的一串核酸碱基。在一些情况下,本文提供的系统和方法可以与蛋白质组信息一起使用。
如本文所用的术语“珠粒”通常指颗粒。珠粒可以是固体或半固体颗粒。珠粒可以是凝胶珠粒。凝胶珠粒可以包括聚合物基质(例如,通过聚合或交联形成的基质)。聚合物基质可以包括一种或多种聚合物(例如,具有不同官能团或重复单元的聚合物)。聚合物基质中的聚合物可以是无规排列的,例如无规共聚物,和/或具有有序结构,例如嵌段共聚物。交联可以经由共价、离子、或诱导、相互作用或物理缠结进行。珠粒可以是大分子。珠粒可以由结合在一起的核酸分子形成。珠粒可以经由分子(例如大分子)的共价或非共价组装形成,如单体或聚合物。这种聚合物或单体可以是天然的或合成的。这种聚合物或单体可以是或包括例如核酸分子(例如,DNA或RNA)。珠粒可以由聚合材料形成。珠粒可以是磁性的或非磁性的。珠粒可以是刚性的。珠粒可以是柔性的和/或可压缩的。珠粒可以是可破裂的或可溶解的。珠粒可以是覆盖有包括一种或多种聚合物的涂层的固体颗粒(例如,包括但不限于氧化铁、金或银的金属基颗粒)。这种涂层可以是可破裂的或可溶解的。
如本文所用,术语“条形码化核酸分子”通常是指由例如用核酸序列(例如,与核酸条形码分子包括的核酸引物序列互补的核酸序列)处理核酸条形码分子产生的核酸分子。核酸序列可以是靶向序列或非靶向序列。核酸条形码分子可以与包含核酸序列的核酸分子偶联或附接。例如,在本文所述的方法和系统中,细胞的核酸分子(例如,信使RNA(mRNA)分子)与核酸条形码分子(例如,含有条形码序列和与mRNA分子的核酸序列互补的核酸引物序列的核酸条形码分子)的杂交和逆转录产生了条形码化核酸分子,其具有对应于mRNA的核酸序列和条形码序列(或其反向互补序列)的序列。包含核酸序列的核酸分子、核酸条形码分子或两者的处理可以包括核酸反应,如在非限制性例子中,包括逆转录、核酸延伸、连接等。核酸反应可以在核酸序列的条形码化之前、期间或之后进行以产生条形码化核酸分子。例如,包含核酸序列的核酸分子可以进行逆转录,然后附接到核酸条形码分子以产生条形码化核酸分子,或包含核酸序列的核酸分子可以附接到核酸条形码分子并进行核酸反应(例如,延伸、连接)以产生条形码化核酸分子。条形码化核酸分子可以用作模板,例如模板多核苷酸,其可以被进一步处理(例如,扩增)和测序以获得靶核酸序列。例如,在本文描述的方法和系统中,条形码化核酸分子可以被进一步处理(例如,扩增)和测序以获得核酸分子(例如,mRNA)的核酸序列。
如本文所用的术语“样品”通常指受试者的生物样品。生物样品可以包括任何数量的大分子,例如细胞大分子。样品可以是细胞样品。样品可以是细胞系或细胞培养物样品。样品可以包括一个或多个细胞。样品可以包括一种或多种微生物。生物样品可以是核酸样品或蛋白质样品。生物样品也可以是碳水化合物样品或脂质样品。生物样品可以来自另一个样品。样品可以是组织样品,例如活组织检查、空芯针穿刺活检、针吸出或细针吸出。样品可以是流体样品,例如血液样品、尿液样品或唾液样品。样品可以是皮肤样品。样品可以是颊拭子。样品可以是血浆或血清样品。样品可以是无细胞或无细胞样品。无细胞样品可以包括细胞外多核苷酸。细胞外多核苷酸可以从选自血液、血浆、血清、尿液、唾液、粘膜排泄物、痰、粪便和泪液的身体样品中分离。
如本文所用的术语“生物颗粒”通常指源自生物样品的离散生物系统。生物颗粒可以是大分子。生物颗粒可以是小分子。生物颗粒可能是病毒。生物颗粒可以是细胞或细胞的衍生物。生物颗粒可以是细胞器。生物颗粒可以是细胞群中的稀有细胞。生物颗粒可以是任何类型的细胞,包括但不限于原核细胞、真核细胞、细菌、真菌、植物、哺乳动物或其他动物细胞类型、支原体、正常组织细胞、肿瘤细胞或任何其他细胞类型,无论来源于单细胞还是多细胞生物。生物颗粒可以是细胞的成分。生物颗粒可以是或可以包括DNA、RNA、细胞器、蛋白质、或其任意组合。生物颗粒可以是或可以包括基质(例如凝胶或聚合物基质),所述基质包括细胞或来自细胞的一种或多种成分(例如细胞珠粒),例如来自细胞的DNA、RNA、细胞器、蛋白质、或其任意组合。生物颗粒可以从受试者的组织中获得。生物颗粒可以是硬化的细胞。这种硬化的细胞可以包括也可以不包括细胞壁或细胞膜。生物颗粒可以包括细胞的一种或多种成分,但是可以不包括细胞的其他成分。这种成分的一个例子是细胞核或细胞器。细胞可以是活细胞。活细胞能够被培养,例如,当封闭在凝胶或聚合物基质中时被培养,或者当包括凝胶或聚合物基质时被培养。
如本文所用的术语“偶联的”、“连接的(linked)”、“缀合的”、“缔合的”、“附接的”、“连接的(connected)”或“融合的”在本文中可以互换使用,并且通常是指一个分子(例如,多肽、受体、分析物等)附接或连接(例如,化学结合)到另一个分子(例如,多肽、受体、分析物等)。
如本文所用的术语“结合剂”通常是指能够结合一种或多种其他分子(例如,分析物、受体、其他结合剂等)并且包含一个或多个部分的分子。在一些情况下,结合剂包含至少一个、至少两个、至少三个或至少四个部分。每个部分可以包含多肽。特定部分的多肽能够结合一种或多种分子。例如,特定部分的多肽可以结合位于细胞表面的分子,如细胞表面蛋白或受体(例如,CD表面标记物,如CD45)。结合剂的另一部分的多肽可以结合可从细胞(例如,T细胞、B细胞、树突细胞等)分泌的分子。结合剂的一个或多个部分可以直接或间接地彼此连接、缀合或融合。例如,结合剂的第一部分可以直接或间接地连接到、缀合到或融合到结合剂的第二部分。此外,术语“结合剂”、“多肽”和“抗体”在本文中可以互换使用。
如本文所用的术语“细胞珠粒”通常是指水凝胶、聚合物或交联材料,其包含(例如,包封、含有等)生物颗粒(例如,细胞、细胞核、固定细胞、交联细胞)、病毒、细胞或病毒的组分或大分子成分或衍生自细胞或病毒的组分或大分子成分。例如,细胞珠粒可以包含病毒和/或细胞。在一些情况下,细胞珠粒包含单个细胞。在一些情况下,细胞珠粒可以包含粘附在一起的多个细胞。细胞珠粒可以包括任何类型的细胞,包括但不限于原核细胞,真核细胞,细菌、真菌、植物、哺乳动物或其他动物细胞类型,支原体,正常组织细胞,肿瘤细胞,免疫细胞(例如,T细胞(例如,CD4 T细胞、包含人类免疫缺陷病毒(HIV)的休眠拷贝的CD4 T细胞)、B细胞或树突细胞)、固定细胞、交联细胞、来自细胞群体的稀有细胞、或任何其他细胞类型(无论其衍生自单细胞或多细胞生物体)。此外,细胞珠粒可以包含活细胞,例如能够培养的细胞。此外,在一些例子中,细胞珠粒可以包含细胞的衍生物,如细胞的一种或多种组分(例如,细胞器、细胞蛋白质、细胞核酸、基因组核酸、信使核糖核酸、核糖体、细胞酶等)。在一些例子中,细胞珠粒可以包含从生物组织获得的材料,例如从受试者获得的材料。在一些情况下,细胞、病毒或其大分子成分被包封在细胞珠粒内。包封可以发生在形成细胞珠粒的结构组分的聚合物或凝胶基质内。在一些情况下,通过将细胞固定在固定培养基中或通过交联细胞的元件如细胞膜、细胞骨架等产生细胞珠粒。
如本文所用的术语“大分子成分”通常指包括在生物颗粒内或来自生物颗粒的大分子。大分子成分可以包括核酸。在一些情况下,生物颗粒可以是大分子。大分子成分可以包括DNA。大分子成分可以包括RNA。RNA可以是编码的或非编码的。例如,RNA可以是信使RNA(mRNA)、核糖体RNA(rRNA)或转运RNA(tRNA)。RNA可以是转录本。RNA可以是长度小于200个核酸碱基的小RNA,也可以是长度大于200个核酸碱基的大RNA。小RNA可以包括5.8S核糖体RNA(rRNA)、5S rRNA、转运RNA(tRNA)、微RNA(miRNA)、小干扰RNA(siRNA)、小核仁RNA(snoRNAs)、Piwi相互作用RNA(piRNA)、tRNA衍生的小RNA(tsRNA)和小rDNA衍生的RNA(srRNA)。RNA可以是双链RNA或单链RNA。RNA可以是环状RNA。大分子成分可以包括蛋白质。大分子成分可以包括肽。大分子成分可以包括多肽。
如本文所用的术语“抗原结合片段”、“表位结合片段”或“抗体片段”可以互换使用,并且通常是指完整抗体的一部分(例如,分别包含轻链和重链的每个结构域),其能够结合与完整抗体相同的表位/抗原,但不必达到相同的程度。尽管多种类型的表位结合片段是可能的,但表位结合片段通常包含至少一对保持在一起(例如,通过二硫键)的重链和轻链可变区(分别为VH和VL)以保留抗原结合位点,并且不包含全部或部分Fc区。抗体的表位结合片段可以通过任何合适的技术(例如,重组DNA技术或完整抗体的酶促或化学切割)从给定抗体获得,并且通常可以以与筛选完整抗体相同的方式筛选特异性。在一些实施方案中,表位结合片段包含F(ab’)2片段、Fab’片段、Fab片段、Fd片段或Fv片段。在一些实施方案中,术语“抗体”包括抗体衍生的多肽,如单链可变片段(scFv)、双抗体或其他多聚体scFv、重链抗体、单结构域抗体或包含抗体的足够部分(例如,一个或多个互补决定区(CDR))以赋予多肽特异性抗原结合能力的其他多肽。
如本文所用的术语“分子标签”通常指能够结合大分子成分的分子。分子标签可以高亲和力结合大分子成分。分子标签可以高特异性结合大分子成分。分子标签可以包括核苷酸序列。分子标签可以包括核酸序列。核酸序列可以是分子标签的至少一部分或全部。分子标签可以是核酸分子或者可以是核酸分子的一部分。分子标签可以是寡核苷酸或多肽。分子标签可以包括DNA适配体。分子标签可以是或包括引物。分子标签可以是或包括蛋白质。分子标签可以包括多肽。分子标签可以是条形码。
如本文所用的术语“分区”通常指的是适于容纳一种或多种物质或进行一种或多种反应的空间或体积。分区可以是物理区室,例如液滴或孔。分区可以将空间或体积与另一个空间或体积隔离。液滴可以是第二相(例如油)中的第一相(例如水相),第二相与第一相不混溶。液滴可以是第二相中的第一相,第二相不与第一相发生相分离,例如,水相中的胶囊或脂质体。一个分区可以包括一个或多个其他(内部)分区。在一些情况下,分区可以是虚拟区室,其可以由跨多个和/或远程物理区室的索引(例如,索引库)来定义和鉴定。例如,物理区室可以包括多个虚拟区室。
如本文所用的术语“分析物”通常是指用于检测的目的物质。分析物可以是生物分析物,如核酸分子或蛋白质。分析物可以是原子或分子。分析物是较大单元的亚单元,例如多核苷酸序列的给定序列或作为较大序列的一部分的序列。本公开文本的分析物包括分泌的分析物、可溶性分析物和/或细胞外分析物。
本公开文本提供了用于单细胞分析物检测和测量的方法和系统,其包含可以与来自单细胞的分泌的分析物偶联的核苷酸条形码化多肽。本文所述的方法和系统可以包括进行下一代测序以测量和分析可从单个细胞分泌和/或存在于单个细胞中的分析物分子(例如,细胞因子、mRNA等)。与其他细胞分析方法相比,本文公开的方法和系统可以增加可从单个细胞测量的不同分子或分析物的数量。此外,所公开的方法和系统可以允许同时测量多种细胞分子(例如,分泌的和/或细胞内的分子),如分泌的分析物(例如,细胞因子)、mRNA、细胞表面蛋白、配对的αβT细胞受体序列和抗原结合特异性等。
对来自单个细胞的分析物进行条形码化
本文提供了用于处理来自细胞(例如,免疫细胞,如T细胞、B细胞或树突细胞)的一种或多种分析物(例如,分泌分子或细胞核酸)的方法和系统。本文所述的方法和系统可以包括将条形码化多肽(例如,与包含条形码序列的核酸分子偶联的多肽)与从单个细胞(例如,免疫细胞,如T细胞、B细胞或树突细胞)分泌的分析物偶联(例如,共价或非共价结合或连接)。
在一些实施方案中,处理来自细胞的分泌分子的方法可以包括:(i)将所述分泌分子与捕获剂(例如,第一多肽)偶联以形成第一缀合物,所述捕获剂与所述细胞的表面偶联;和(ii)将报告剂(例如,第二多肽)与所述分泌分子偶联以形成第二缀合物,其中所述报告剂(例如,第二多肽)包含含有第一条形码序列的核酸分子(例如,报告条形码序列)。本文公开的方法还可以包括在(i)之前,将细胞与捕获剂一起孵育,使得捕获剂与细胞表面偶联,例如经由结合而偶联至细胞表面受体如CD45。可以刺激细胞以诱导分泌分子分泌。分子(例如,细胞因子、激素或生长因子)的分泌可以通过使用一种或多种刺激(或共刺激)分子来诱导。可与本文所述方法一起使用的刺激分子或抗原包括但不限于模式识别受体(PRR)配体,其中PRR配体可以是Toll样受体(TLR)配体、NOD样受体(NLR)配体、RIG-I样受体(RLR)配体、C型凝集素受体(CLR)配体或胞质dsDNA感受器(CDS)配体。此外,可以使用脂多糖(LPS)、双链DNA(dsDNA)、双链RNA(dsRNA)、合成dsRNA或CpG寡脱氧核苷酸(CpG ODN)刺激分泌,其中合成dsRNA是聚肌苷酸-聚胞苷酸(poly I:C)或聚腺苷酸-聚尿苷酸(poly A:U)。
可以使用本文公开的方法和系统分析的包含一种或多种细胞(例如,免疫细胞,如T细胞、B细胞和/或树突细胞)的细胞样品可以通过各种手段获得。例如,细胞样品可以从生物学流体如血浆中分离,或者可以从受试者的特定组织或器官中分离。在某些实施方案中,细胞1202(例如,免疫细胞,如T细胞、B细胞、树突细胞等)连同它们所分泌的分析物1206可以如图12A中所示提供;1206也可以是刺激分子,如包含抗原的分子。
在一些实施方案中,本文公开的方法、试剂盒和系统包括使用能够结合分泌的分析物的结合剂(例如,分别包含第一和第二多肽的捕获剂和报告剂)。例如,如图12B所示,细胞1202(例如,T细胞、B细胞、树突细胞等)与捕获剂1204接触。
通常,如本文所公开的,捕获剂可以包含一个或多个部分。在一些情况下,捕获剂包含至少一个、至少两个、至少三个或至少四个或更多个部分。每个部分可以包含多肽。特定部分的多肽能够结合一种或多种分子。例如,特定部分的多肽可以结合位于细胞表面的分子,如细胞表面蛋白或受体(例如,CD表面标记物,如CD45)。捕获剂的另一部分的多肽可结合可从细胞(例如,T细胞、B细胞、树突细胞等)分泌的分子。捕获剂的一个或多个部分可以直接或间接地彼此连接、缀合或融合。例如,捕获剂的第一部分可以直接或间接地连接到、缀合到或融合到捕获剂的第二部分。在一些情况下,第一部分(例如,图12B中的1208)结合(例如,以化学方式,如共价地或非共价地)或连接到第二部分(例如,图12B中的1210)。在一些情况下,第一部分和第二部分经由接头(例如,氨基酸接头)连接。在一些情况下,第一部分和第二部分经由一个或多个结构域或多肽链连接。如本文所述的捕获剂可以包含一种或多种免疫球蛋白(或抗体)分子(例如,IgA、IgE、IgG或IgM分子)或其任何片段(例如,表位结合片段)或衍生物,以及任何合适的组合。例如,捕获剂可以是双特异性抗体。双特异性抗体可以包含第一部分和第二部分,所述第一部分包含能够结合细胞表面分子(例如,CD受体)的捕获剂(例如,第一多肽),所述第二部分包含能够结合细胞的一种或多种分子(例如,从细胞分泌的一种或多种分子、来自细胞的一种或多种可溶性分子、和/或细胞的一种或多种细胞外分子,包括在外来体或细胞外囊泡中的分子,例如,在外来体或微泡的表面上的分子)的第二多肽。在一些情况下,捕获剂的第一部分的捕获剂(例如,第一多肽)可以包含第一免疫球蛋白分子(例如,IgA、IgE、IgG或IgM)或其一种或多种片段或衍生物(例如,Fab、F(ab’)2、双特异性Fab2、scFv、双抗体等),并且结合剂的第二部分的第二多肽可以包含第二免疫球蛋白分子(例如,IgA、IgE、IgG或IgM)或其一种或多种片段或衍生物(例如,Fab、F(ab’)2、双特异性Fab2、scFv、双抗体等)。
捕获剂的第一多肽(例如,第一免疫球蛋白分子)能够结合细胞表面上的分子,第二多肽(例如,第二免疫球蛋白分子)能够结合从细胞分泌的一种或多种分子。
分别包含一种或多种多肽的捕获剂的一个或多个部分可以彼此缔合,例如彼此结合、连接或偶联。例如,包含第一多肽的捕获剂的第一部分可以经由接头与包含第二多肽的捕获剂的第二部分连接。接头可以是柔性接头,允许第一和第二多肽与它们各自的结合配偶体有效结合。接头可以是氨基酸接头,如富含甘氨酸的接头。接头可以是可切割的或不可切割的接头。
在一些实施方案中,捕获剂包含多肽1204。多肽1204可以是双特异性抗体(或另一种抗体构建体,如三特异性抗体),其包含第一部分1208和第二部分1210,所述第一部分能够结合从细胞(例如,免疫细胞,如T细胞、B细胞或树突细胞)分泌的分子(例如,细胞因子、激素或生长因子),所述第二部分能够结合细胞表面分子,如细胞表面受体(例如CD45)。可以将细胞(例如,T细胞)与包含多肽1204的捕获剂在溶液中在允许多肽1204与细胞表面偶联(例如,经由多肽1204的细胞表面结合部分1210)的合理且充分的条件下孵育一定量的时间。在某些实施方案中,多肽1204是包含第一部分1208和第二部分1210的双特异性抗体。在一些实施方案中,第一部分1208是能够与单个细胞(例如,免疫细胞)分泌的分析物(例如,细胞因子)偶联的抗体或其表位结合片段。可使用本文所述的方法、试剂盒和系统分析的示例性细胞因子包括但不限于肿瘤坏死因子超家族成员(如TNFα、CD27、CD30、CD40等)、干扰素(如IFN-α、IFN-β、IFN-γ等)、转化生长因子(如TGF-β等)、白介素(如IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-13、IL-17RA、IL-17RB、IL-17RC、IL17RD、IL-17RE、IL-22等)、集落刺激因子(如M-CSF、GM-CSF等)和趋化因子(如CC趋化因子、CXC趋化因子等)。在一些实施方案中,第一部分1208包含对一种或多种分子(如对一种或多种不同类型的细胞因子)具有结合亲和力的抗体或其表位结合片段,例如,第一部分1208可以结合进入其附近的一种或多种分子(例如,一种或多种细胞因子)。在其他实施方案中,多肽1204的第一部分1208包含对一个或多个特定家族的细胞因子(如TNF或白介素家族)的一个或多个成员具有结合亲和力的抗体,例如部分1208可以选择性地结合一个或多个TNF家族成员或一个或多个白介素家族成员。可以选择第一部分1208以使其结合一个或多个细胞(例如免疫细胞)分泌的特定的目的分析物。在其他实施方案中,第一部分1208包含多个抗体或其片段(例如,表位结合片段),每个抗体或其片段可以对诸如细胞因子等特定分析物具有选择性。例如,第一部分1208可以包含两种抗体或其片段(例如,表位结合片段),它们各自对不同的分析物具有结合亲和力。第一部分1208可以包含一种抗体、两种抗体、三种抗体、四种抗体、五种抗体、六种抗体、七种抗体或八种抗体或其片段,其中每种抗体或其片段对不同分析物具有结合亲和力。在其他情况下,一种或多种抗体和/或抗体片段(例如,表位结合片段)对相同分析物(例如,相同细胞因子)具有结合亲和力。
此外,在某些实施方案中,第二部分1210包含抗体或其表位结合片段。第二部分1210可以被配置成使得其靶向、结合或以其他方式缔合一种或多种细胞表面蛋白,如受体酪氨酸激酶(RTK)、G蛋白偶联受体(GPCR)、分化簇(CD)蛋白(如CD45等)等、或其任何组合。在一些实施方案中,第二部分1210被配置为结合(例如,共价或非共价结合)细胞表面并且允许第一部分1208结合(例如,共价或非共价)如本文所述的一种或多种分泌的分析物。捕获剂(或多肽或其部分)可以以多种方式结合细胞表面。例如,多肽1204的第二部分1210可以使用任何合适的方法附接到细胞表面,例如通过半胱氨酸残基或通过具有反应性官能团的非天然氨基酸附接。在一些情况下,第二部分1210经由其碳水化合物基团(例如,糖基化位点),例如在抗体的恒定区(例如Fc)上,或经由脂质-脂质或脂质-蛋白质相互作用附接到表面。此外,在一些实施方案中,第二部分1210包含两种抗体或其表位结合片段,它们各自分别对不同细胞表面分子具有结合亲和力。在其他实施方案中,第二部分1210包含三种、四种、五种、六种、七种、八种或更多种抗体或其表位结合片段,它们各自选择性地靶向特定的细胞表面分子(例如,相同或不同的细胞表面分子)。
在一些实施方案中,捕获剂(例如,包含多肽1204的那些)的第一部分可以连接或缀合到(例如,化学连接或缀合到)第二部分。可替代地,捕获剂的第一部分可以融合到(例如重组融合到)第二部分。因此,在一些实施方案中,多肽1204是包含第一部分1208和第二部分1210的融合蛋白。融合多肽1204可以通过重组DNA技术产生,例如,融合基因(一个或多个基因编码第一部分1208,另一个或多个基因编码第二部分1210)的翻译产生融合多肽1204。在某些实施方案中,一个或多个接头(例如,氨基酸接头,如多肽接头)将第一部分1208连接到第二部分1210,以例如确保第一部分和第二部分的适当折叠和/或确保有效的细胞表面和/或分析物结合。此外,多肽接头可以允许重要的结构域相互作用,增强稳定性并减少空间位阻。在其他实施方案中,第一部分蛋白质1208和第二部分蛋白质1210在翻译后连接或缀合。例如,可以使用任何合适的生物缀合策略将捕获剂的第一部分(例如,部分1208)的多肽缀合到第二部分(例如,部分1210),所述生物缀合策略包括但不限于活化酯(例如,NHS酯)、环加成反应、施陶丁格连接、点击化学等。在又其他实施方案中,第一部分蛋白质1208和第二部分1210可以经由第一部分1208和第二部分1210之间的N或C末端的连接而端对端连接,提供用于适当折叠和减少空间位阻的柔性桥结构。
图14A说明了用于检测单个细胞分泌的分析物的示例性工作流程。通常,本文所述的方法和系统可以包括刺激细胞(例如,免疫细胞)以诱导一种或多种分析物(例如,分泌分子)从细胞分泌。刺激细胞(例如,免疫细胞,如T细胞、B细胞或树突细胞)以诱导一种或多种分析物(例如,分泌分子,如细胞因子或抗体)的分泌可以包括使细胞经受(例如,接触)特定分子(例如,刺激或共刺激分子)。可用于诱导分析物从细胞分泌的特定分子可以包括抗原,如模式识别受体(PRR)配体(例如,Toll样受体(TLR)配体、NOD样受体(NLR)配体、RIG-I样受体(RLR)配体、C型凝集素受体(CLR)配体、胞质dsDNA感受器(CDS)配体等)、脂多糖(LPS)、双链DNA(dsDNA)、双链RNA(dsRNA)、合成dsRNA(例如,聚肌苷酸-聚胞苷酸(poly I:C)或聚腺苷酸-聚尿苷酸(poly A:U))、CpG寡脱氧核苷酸(CpG ODN)或其任何组合。本文所述的方法可以包括以足以诱导一种或多种分泌分子(例如,细胞因子)分泌的浓度向细胞提供多个一种或多种不同的刺激分子。
参考操作1402,将免疫细胞(例如,T细胞)或其他目的细胞类型与合适浓度的抗原(或其他刺激分子)一起孵育以诱导细胞因子或其他分析物的分泌。本文可以使用足以诱导细胞(例如,T细胞)分泌细胞因子的任何合适浓度的刺激分子(例如,抗原)。在一些情况下,刺激或共刺激分子(例如抗原)与主要组织相容性复合物(MHC)分子偶联。在一些情况下,MHC分子是MHC多聚体(例如,单体、二聚体、三聚体、四聚体、五聚体等),产生多聚体(例如,单体、二聚体、三聚体、四聚体等)MHC-抗原复合物(例如,如果抗原是肽,则为MHC-肽复合物)。MHC多聚体可以与细胞或聚合物连接。细胞可以是抗原呈递细胞(APC)。聚合物可以是葡聚糖聚合物(例如,dextramer)。MHC多聚体(例如,四聚体或dextramer)或APC可以构成多个MHC复合物。MHC分子/多聚体可以包含一种或多种刺激分子,如抗原肽,从而形成肽-MHC复合物。因此,MHC分子(例如,多聚体)和/或APC可以用于将刺激和/或共刺激分子(例如,经由MHC-肽复合物的刺激肽)呈递给细胞(例如,免疫细胞)以诱导一种或多种分析物的分泌。此外,细胞或其他非细胞构建体可以用于将刺激分子呈递给细胞以诱导一种或多种分析物的分泌。在一些情况下,抗原呈递细胞(APC)可以包含多个MHC分子(例如,MHC多聚体),因此APC可以用于诱导细胞(例如,免疫细胞)分泌分析物。如本文所述的共刺激分子可以是抗体(例如,抗CD3或抗CD28抗体)或细胞因子(例如,白介素)。例如,APC或MHC多聚体(例如,四聚体或dextramer)可以包含多种共刺激分子,因此可以用于诱导细胞分泌分析物。在一些情况下,如本文所述的刺激物或共刺激分子、MHC多聚体、APC和/或MHC分子可以包含含有条形码序列的核酸分子。在一些情况下,本文公开的方法包含作为抗原-MHC复合物(例如,抗原-MHC四聚体)的一部分的抗原,所述抗原-MHC复合物包含抗原(例如,肽或多肽)和MHC分子(例如,MHC多聚体,如四聚体)。MHC分子可以包含核酸分子,所述核酸分子包含识别存在于MHC分子或多聚体中的一种或多种肽的条形码序列。关于使用条形码化MHC标记剂分析细胞和免疫受体的示例性分子和方法,参见例如美国专利10,011,872,其通过引用以其整体并入本文。如本文使用和描述的偶联MHC的条形码序列可以不同于第一条形码序列(例如,附接到捕获剂和/或报告剂)和第二条形码序列(例如,细胞特异性条形码或分区特异性条形码,如附接到珠粒如凝胶珠粒的条形码)。
本文所述的方法和系统可以包括使用一种或多种条形码化组分或分子(例如,捕获剂或其部分)以在单细胞基础上分析生物样品(例如,免疫细胞群体)。在一些实施方案中,本文所述的方法包括使用能够结合细胞分泌的分析物(例如,细胞因子)的第二结合剂(例如,报告剂)。当分析物与结合于细胞表面的捕获剂结合时,报告剂可以与分析物结合(参见例如,图12B中的多肽(初级结合剂)1204)。报告剂可以是抗体或其片段(例如,表位结合片段)或衍生物。报告剂可以是能够结合与捕获剂结合的分析物的抗体。报告剂可以包含条形码(例如,报告条形码序列),例如包含条形码序列的寡核苷酸序列,并且可以对分析物进行条形码化。因此,分析物(例如,分泌分子)可以被条形码化,同时结合到报告剂,报告剂又可以结合到分泌所述分析物的细胞。当使用例如Illumina测序仪产生的测序读数分析条形码时,如本文所述的条形码可以用于使一种或多种分析物(例如,分泌分子或细胞核苷酸序列,如mRNA)与细胞和/或分区(例如,液滴或孔)缔合。
本文所述的方法可以包括使用多种条形码来分析多种分析物和细胞分子,如细胞因子和/或mRNA分子。条形码可以是核酸序列(条形码序列)。第一条形码可以不同于第二条形码。例如,第一条形码序列的核酸序列可以不同于第二条形码序列的核酸序列。如本文所述,包含条形码序列的核酸分子可与其他分子、聚合物或颗粒偶联。例如,包含条形码序列的核酸分子可以与MHC分子(例如,包含条形码序列的四聚体MHC-肽复合物)、第二结合剂(例如,与条形码序列偶联的抗体)、聚合物(例如,dextramer或能够形成水凝胶的聚合物)、和/或珠粒(例如,乳液液滴中的珠粒,或微孔阵列的孔中的珠粒,例如,如图10和图11所示)偶联。使用一种或多种条形码可以允许测量和分析细胞的一种或多种分析物,并且可以允许将一种或多种分析物与相应的细胞缔合。当测量和分析来自单个细胞或来自多个细胞如一个或多个细胞群体(例如,免疫细胞)的多种分析物(例如,分泌分子和/或mRNA)时,这可能是特别有利的。在此类情况下,第一条形码可以用于测量细胞的第一分析物(例如,分泌分子,如细胞因子),并且第二条形码可以用于测量细胞的第二分析物(例如,mRNA分子),等等。在这些情况下,分区特异性条形码或细胞特异性条形码(例如,附接到珠粒,如凝胶珠粒)可以用来连接第一条形码和第二条形码以将一种或多种分析物归属于单个细胞。例如,免疫细胞(例如,T细胞、B细胞或树突细胞)的分析可以包括测量一种或多种可以在刺激细胞时分泌(例如,通过使用刺激分子)的信号分子(例如,细胞因子)以及一种或多种可以在细胞裂解时从细胞释放以用于分析的mRNA分子,例如,免疫细胞受体基因区段(例如,T细胞受体(TCR)的V(D)J序列)。关于使用核酸条形码分子分析单细胞的V(D)J序列的示例性分子和方法,参见例如美国专利公开2018/0105808,其通过引用以其整体并入。
如本文所述,分析和测量细胞(例如,免疫细胞)的一种或多种分析物可以在诸如液滴或孔(例如,乳液中的凝胶珠粒)等分区中进行。因此,诸如核酸条形码序列等条形码可以对于其中可包封细胞的分区(例如,液滴或孔)具有特异性,从而允许细胞分析物(例如,分泌的分析物和细胞核酸分子)与该细胞缔合。可以使用本文所述的方法(参见例如,图1-图7、图10和图11)产生分区(例如,液滴或孔)。
此外,参考操作1404(图14A),将目的细胞(例如,T细胞)或其他目的细胞类型与捕获剂一起孵育。与捕获剂的孵育可以在捕获剂(例如,包含多肽1204)的合适浓度下进行一定量的时间。本文考虑了可以诱导第二部分1210与细胞表面充分结合的任何合适浓度的多肽1204。此外,操作1404中的孵育过程进行足够的时间,以使第一部分蛋白质1208与分泌的细胞因子或任何其他目的分析物结合并且使第二部分蛋白质1210与细胞表面结合。在某些实施方案中,操作1404可以在操作1402之前执行。将细胞(例如,免疫细胞)与诸如刺激和/或共刺激分子等抗原和/或呈递其的细胞(例如,APC)或聚合物(例如,dextramer)一起孵育可以被配置为使多肽1204从细胞表面的解偶联或解离最小化。
参考操作1406,在分泌的细胞因子或其他分析物结合到第一部分蛋白质1208以形成第一缀合物1212之后,将细胞(例如,T细胞)或其他类型的细胞进一步与包含多种多肽(例如,报告剂)1302(图13)的溶液一起孵育。每个报告剂1302与包含条形码序列(例如,报告条形码序列)的核酸分子1304偶联。在某些实施方案中,报告剂1302是蛋白质。在某些实施方案中,报告剂是选择性结合至少一种细胞因子的抗体或其表位结合片段。在其他实施方案中,抗体选择性地结合分泌的其他目的分析物。此外,在一些实施方案中,除条形码1304之外,报告剂还包含荧光团、发色团、重金属或其任何组合。这里可以使用的荧光团的例子是异硫氰酸荧光素(FITC)、藻红蛋白(PE)、别藻蓝蛋白(APC)、ALexa Four、DyLight等。
报告剂与条形码1304一起与被捕获剂1204捕获的细胞因子结合以形成第二缀合物1306。与例如用于刺激细胞因子分泌的MHC多聚体(MHC条形码)附接的条形码可以不同于与细胞因子特异性抗体1302附接的条形码1304。在一个示例性实施方案中,包括条形码1304的条形码是DNA寡核苷酸。因此,在一些情况下,将细胞特异性条形码(例如,在分区中,如液滴,参见图8)附接到含有细胞因子-条形码的分子(例如,1304),并且在存在的情况下,MHC条形码允许细胞因子分子和蛋白质-MHC复合物二者与同一单个细胞缔合。
此外,例如,在操作1406期间,也可以添加对某些细胞表面蛋白(细胞表面蛋白特异性分子)具有选择性的另外的条形码化分子(例如,抗体或抗体片段)以分析细胞表面蛋白的存在和/或量。因此,可以通过将这些条形码化抗体结合到细胞表面并使用本文所述的条形码化反应(例如,结合到单个细胞的细胞表面蛋白特异性分子的基于分区的条形码化)对它们进行进一步分析来查询一种或多种目的细胞表面蛋白。关于使用条形码化标记剂分析蛋白质分子的示例性分子和方法,参见例如美国专利10,011,872,其通过引用以其整体并入本文。附接到细胞表面蛋白特异性分子的条形码(细胞表面蛋白条形码)可以用于鉴定细胞表面蛋白特异性分子,并且在一些情况下,所述条形码不同于例如MHC多聚体条形码和细胞因子条形码(例如1304)。在某些实施方案中,细胞表面蛋白条形码是DNA寡核苷酸。在一些情况下,除细胞表面条形码序列之外,附接到细胞表面特异性结合分子的核酸分子还可以包含一个或多个功能序列。例如,附接到细胞表面结合分子的一种或多种核酸分子可以包含以下中的一种或多种:唯一分子标识符(UMI)、引物序列或引物结合序列(例如,测序引物序列(或部分测序引物序列),如R1和/或R2序列)、被配制为附接到测序仪的流动池的序列(例如,P5和/或P7)、或与核酸条形码分子上的序列互补的序列(例如,附接到珠粒,如图8中所述的那些)。因此,由附接到细胞表面结合分子(或其衍生物)的分子产生的条形码化分子(例如,包含细胞表面特异性和细胞特异性条形码)也可以包含这些功能序列。
使用细胞珠粒对来自单个细胞的分析物进行条形码化
本文提供了用于处理来自细胞(例如,免疫细胞,如T细胞、B细胞或树突细胞)的一种或多种分析物(例如,分泌分子或细胞核酸)的方法和系统。本文所述的方法和系统可以包括将条形码化多肽(例如,与包含条形码序列的核酸分子偶联的多肽)与从单个细胞(例如,免疫细胞,如T细胞、B细胞或树突细胞)分泌的分析物偶联(例如,共价或非共价结合或连接)。
在一些实施方案中,处理来自细胞的分泌分子的方法可以包括:(a)产生细胞珠粒,其中所述细胞珠粒包含被聚合物基质包封的细胞,其中所述聚合物基质包含多种捕获剂(例如,第一多肽);和(b)将从细胞分泌的分子与多种捕获剂中的捕获剂偶联以形成第一缀合物。
图14A和14B中描述了使用细胞珠粒的示例性分泌分析物条形码化方法(参见例如,操作1408、1410、1411a、1411b等)。在某些实施方案中,微流体通道结构(例如,图1-7)可以用于将细胞包封到如图15A所示的液滴1502中。关于示例性细胞珠粒产生系统和方法,参见例如,美国专利公开2018/0216162(现在是美国专利10,428,326)和美国专利公开2019/0100632(现在是美国专利10,590,244),其通过引用以其整体并入。在某些实施方案中,液滴1502包含细胞1501(例如,单个单元)和含有聚合物和/或交联前体1506的水溶液。为了将细胞包封在液滴中,在一些实施方案中,微流体通道结构包含第一水性流体,所述第一水性流体包含悬浮的生物颗粒(例如细胞或细胞核),所述第一水性流体可以沿第一通道区段输送并接触与第一水性流体不混溶的第二流体,以产生第一水性流体的离散液滴。在一些情况下,第一水性流体包括如本文别处所述的其他试剂,包括用于产生细胞珠粒的聚合物和/或交联前体。在其他情况下,在液滴产生之前或同时使含有其他试剂(包括聚合物和/或交联前体)的第二水性流体与第一水性流体接触。在仍其他情况下,含有第一水性流体(例如,包含细胞)和第二水性流体(例如,包含试剂,如聚合物和/或交联前体)的两个离散液滴可以合并成聚结的液滴。在一些情况下,产生的离散液滴至多包括单个生物颗粒(例如单个细胞或单个细胞核,参见例如液滴1502)。
此外,包封例如细胞1501的液滴1502可以经受合适的条件,使得聚合物和/或交联前体1506可以聚合/交联以产生细胞外基质1504(图15A)。细胞珠粒可以是均匀尺寸或不均匀尺寸。在一些情况下,细胞珠粒的直径可以是至少约10纳米(nm)、100nm、500nm、1微米(μm)、5μm、10μm、20μm、30μm、40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm、100μm、250μm、500μm、1mm或更大。在一些情况下,细胞珠粒的直径可以小于约10nm、100nm、500nm、1μm、5μm、10μm、20μm、30μm、40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm、100μm、250μm、500μm、1mm或更小。在一些情况下,珠粒的直径可以在约40-75μm、30-75μm、20-75μm、40-85μm、40-95μm、20-100μm、10-100μm、1-100μm、20-250μm或20-500μm的范围内。
在一些实施方案中,珠粒可以包括聚合物前体(例如单体、低聚物、线性聚合物)、寡核苷酸、引物和其他实体之间的共价键或离子键。在一些情况下,共价键包括碳碳键或硫醚键。
在一些情况下,珠粒可以包含acrydite部分或点击化学部分,其在某些方面可以用于附接一种或多种结合剂(例如,包含分析物特异性抗体的捕获剂1508(图15C))。关于示例性细胞珠粒聚合物和官能化策略,参见例如美国专利公开2019/0100632(现在是美国专利10,590,244),其通过引用以其整体并入。在一些情况下,使用化学缀合方法将分子(例如,捕获剂1508)附接到细胞珠粒水凝胶基质。在一些情况下,抗体可以包含化学修饰(例如,点击化学前体,如烯烃/炔烃),其被配置为与细胞珠粒的聚合物基质或聚合物前体中存在的化学修饰(例如,点击化学前体,如叠氮化物/炔烃)反应。在某些实施方案中,包含分析物特异性抗体的捕获剂1508与细胞珠粒的聚合物基质1504的聚合物主链偶联,如图15C所示。在分析物(例如,分泌的细胞因子1503)结合或偶联到第一捕获剂1508以形成缀合物1511之后,第二结合剂(例如,报告剂)1509包含分析物特异性抗体1512和含有条形码序列(例如,报告条形码序列)的核酸分子1513。在一些实施方案中,例如,如图15D所示,水凝胶基质1504(例如,细胞珠粒)与包含多肽1514(例如,抗体)和含有第一条形码序列(例如,报告条形码序列)的核酸分子1515的结合剂(例如,报告剂)偶联,其中结合剂与分泌的分析物(例如,细胞因子或抗体)偶联。在一些实施方案中,在分泌时,分泌的分析物被与细胞珠粒偶联的分析物特异性结合剂(例如,报告剂)捕获,而未被结合剂特异性捕获的其他分泌的分析物被从细胞珠粒去除,例如洗去。因此,在一些实施方案中,分析物特异性结合剂用作分泌的分析物的捕获剂和报告剂。
在一些情况下,acrydite部分可以指由acrydite与一种或多种物质的反应产生的acrydite类似物,例如在聚合反应期间acrydite与其他单体和交联剂的反应。acrydite部分可以被修饰以与待附接的物质形成化学键,如寡核苷酸(例如,条形码序列、条形码化寡核苷酸、引物、或其他寡核苷酸)。acrydite部分可以用能够形成二硫键的硫醇基团修饰,或者可以用已经包括二硫键的基团修饰。硫醇或二硫化物(通过二硫化物交换)可用作待附接物质的锚定点,或者acrydite部分的另一部分可用于附接。在一些情况下,附接是可逆的,使得当二硫键断裂时(例如,在还原剂的存在下),附接的物质从珠粒中释放。在其他情况下,acrydite部分包括可用于附接的反应性羟基。
在一些实施方案中,在形成包含细胞因子特异性捕获剂(例如抗体)(例如复合物1511)的细胞珠粒之后,使用刺激剂(如抗原)来刺激细胞(例如T细胞)以分泌细胞因子或其他目的分析物,如操作1410(图14A和14B)和图15B中所示。在某些实施方案中,抗原与条形码化的肽-主要组织相容性复合物(MHC)分子(例如,MHC多聚体,如四聚体或dextramer)偶联。可以使用任何合适浓度的抗原以允许细胞因子从细胞珠粒中充分分泌。此外,使用足够的孵育时间以确保细胞因子从细胞珠粒中分泌。在细胞因子或其他目的分析物从细胞分泌后,多种捕获剂和/或报告剂(例如,分析物/细胞因子特异性抗体)可以与分泌的细胞因子或其他分析物偶联(例如,共价或非共价结合)。因此,捕获剂可以与“捕获的”或结合的细胞因子或分析物形成缀合物。
随后,例如,在操作1411a(图14A)中,在一些情况下,包含分析物(例如,细胞因子)特异性抗体的报告剂可以与分泌的细胞因子或与捕获剂结合的其他分析物偶联(例如,共价或非共价结合),所述分析物特异性抗体包含含有第一条形码序列(例如,报告条形码序列)的核酸分子。报告剂和/或核酸分子的进一步处理(例如,附接细胞和/或分区条形码以及测序)可以允许鉴定分泌的分析物的存在和/或量。
此外,如操作1411b所示,在操作1410之后,细胞珠粒的细胞外基质(ECM)1420可以被酶部分消化。在一些情况下,酶可以是胶原酶,其有助于破坏胶原蛋白中的肽键。在其他情况下,酶可以是分散酶,它是裂解纤连蛋白、胶原蛋白IV以及在较小程度上裂解胶原蛋白I的蛋白酶。在其他情况下,此处可以使用可部分消化ECM 1420的合适的酶。此外,ECM可以包含胶原蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白等。
部分消化的ECM允许另一种分析物(例如,细胞因子)特异性报告剂(例如,抗体)1422(图14C)结合由抗体(例如,捕获剂)1424捕获的分析物。如上所述,捕获剂(例如,分析物特异性抗体)1424与ECM 1504的聚合物主链偶联,如图15C所示。分析物特异性抗体(例如,报告剂)还包含第三条形码序列1426(图14C)。此外,在操作1411b中,将部分消化的细胞珠粒与多种抗体一起孵育,每种抗体包含条形码序列。可以洗去过量的抗体。洗去过量的抗体后,用抗体染色的细胞珠粒可以如以上在选项1412、1414、1416和1418中描述的被分区成乳液液滴。
条形码化分析物的分析和测量
本文公开的方法和系统可以包括测量和/或分析细胞的一种或多种分析物。分析物可以是分泌分子(例如,在刺激细胞时从细胞释放/分泌的分子)和/或其他分子,如细胞的核酸分子、表面蛋白和表面受体。如本文所述,一种或多种分析物中的分析物可以与第一条形码(例如,包含第一条形码序列的核酸分子)偶联(例如,直接或间接)。这可以例如发生在(i)细胞的表面上,例如如果分析物是表面受体;(ii)分析物从细胞分泌之后(例如,如果分析物是细胞因子或另一种分泌分子);或(iii)在细胞裂解之后,例如当分析物是细胞的核酸分子(例如,mRNA分子)时。
在一些实施方案中,从细胞分泌目的分析物或分子(例如,细胞因子)并将分析物与一种或多种结合剂(例如,捕获剂和报告剂)偶联(例如,结合,如共价或非共价结合)之后是将细胞共分区成分区(参见例如图14A和14B)。在其他情况下,共分区发生在从细胞分泌分析物和分析物与一种或多种结合剂偶联之前。在一些实施方案中,至少一些分区可以包含至多一个细胞。在一些情况下,分区包含至少一个细胞。如本文所述的分区可以包括液滴或孔(例如,在微孔阵列中)。液滴可以是乳液液滴。液滴(例如,乳液液滴)可以通过使第一相与和第一相不混溶的第二相接触而形成。在其他情况下,分区可以是作为多个孔的一部分的孔。在又其他情况下,分区可以是作为多个腔室的一部分的腔室。分区可以彼此流体隔离或彼此物理隔离。
因此,在一些情况下,分区(例如,液滴或孔)可以包含细胞、捕获剂和报告剂,其中捕获剂和报告剂可以与分析物偶联并且直接和/或间接地与细胞偶联(参见例如图12B、图13和图14C)。在一些情况下,报告剂包含(例如,偶联或连接到)第一分析物特异性条形码(例如,报告条形码序列)。第一条形码可以包含含有第一条形码序列的核酸分子。
分区(例如,液滴或孔)可以进一步包含多个核酸分子,其中多个核酸分子中的每个核酸分子包含第二条形码序列(例如,细胞特异性条形码或分区特异性条形码),并且其中第二条形码序列不同于第一分析物特异性条形码序列。包含第二条形码序列的多个核酸分子可以与颗粒、聚合物或大分子结构偶联(例如,共价或非共价结合或连接)。在一些情况下,包含第二条形码序列的多个核酸分子与珠粒偶联(例如,共价或非共价连接)。珠粒可以是如本文别处所述的凝胶珠粒。
在一些实施方案中,将包含第二条形码序列的多个核酸分子与珠粒(例如,凝胶珠粒)偶联(例如,共价或非共价结合或连接)。可以使用任何合适的偶联策略将包含第二条形码序列的核酸分子与珠粒偶联,所述偶联策略例如生物缀合反应(例如,施陶丁格连接或链霉抗生物素蛋白-生物素偶联)或点击化学。可以将包含含有第二条形码序列的多个核酸分子的珠粒共分区成分区,如液滴。因此,如本文所述的分区(例如,液滴或孔)可以包含细胞(例如,包含捕获剂和/或报告剂和分析物特异性条形码)和含有分区/细胞特异性条形码的珠粒,参见例如图8。可以刺激(例如,使用刺激分子,如抗原)细胞分泌分析物,其中分析物在从细胞分泌后可以与捕获剂和报告剂(例如,抗体或双特异性抗体)偶联。第一条形码序列(与报告剂偶联的分析物特异性条形码)可以附接或以其他方式处理以添加第二条形码序列(细胞特异性条形码,其在一些情况下附接到珠粒),从而使分泌的分析物与细胞(以及在一些情况下,分区)缔合。在一些情况下,细胞在分区(例如,液滴或孔)内裂解,并且因此细胞的另外的分析物(例如,核酸分子)可以被条形码化(例如,被第二条形码序列条形码化)。因此,第二细胞特异性条形码序列可以将一种或多种分析物与细胞缔合。在一些情况下,使用包含第二细胞特异性条形码序列的核酸分子逆转录在细胞裂解后从细胞释放的mRNA分子,从而将第二条形码附接到逆转录的核酸分子(例如cDNA,参见例如图17A)。此外,第二条形码可以附接到包含第一分析物特异性条形码序列的核酸分子(例如,与分泌的分析物结合的报告剂,参见例如图13、14C和17A)上。包括衍生自细胞mRNA分子的条形码化cDNA分子的核酸分子以及包含第一和第二条形码序列的核酸分子(例如,衍生自与分泌的分析物结合的报告剂的那些)可以通过如本文别处所述的一种或多种核酸反应(分区或批量)来处理,其中一个分析工作流程实施方案概述于图17B中。
本公开文本提供了包括使用能够形成基质如聚合物和/或交联基质的大分子(例如,聚合物)的方法。在一些情况下,将聚合物前体聚合以形成聚合物凝胶基质。在一些实施方案中,聚合物凝胶可以是水凝胶,从而形成水凝胶基质。用于形成水凝胶基质的聚合物分子可以包含多种捕获剂。多种捕获剂可以与聚合物的主链偶联或连接(例如,共价或非共价结合或连接)。关于示例性细胞珠粒官能化策略,参见例如美国专利公开2019/0100632(现在是美国专利10,590,244),其通过引用以其整体并入。多种捕获剂中的第一捕获剂可以包含能够结合特定分子(例如,分泌分子,如细胞因子)的多肽。包含能够结合特定分子的多肽的捕获剂可以是抗体或其抗原结合片段或衍生物。捕获剂能够结合的特定分子可以是细胞(例如免疫细胞)的分析物。分析物可以是例如在用一种或多种刺激分子或一种或多种APC刺激后可由细胞分泌的分子。
多个细胞(例如,免疫细胞,如T细胞、B细胞和/或树突细胞)可被共分区(例如,包封成液滴),使得分区(例如,液滴或孔)可以包含多个细胞中的细胞。分区可以进一步包含能够在分区内形成聚合物或交联基质如水凝胶基质的组分,导致形成细胞珠粒。凝胶基质(例如,水凝胶基质)和如此得到的细胞珠粒可以使用可逆凝胶(例如,水凝胶)形成。凝胶基质可以是水凝胶基质,并且形成水凝胶基质的聚合物分子的主链可以包含多种捕获剂,所述捕获剂包含能够结合特定分子(例如,细胞因子)的多肽。
本文公开的方法可以包括刺激形成细胞珠粒的细胞(例如,免疫细胞),使得细胞分泌一种或多种分析物。由细胞分泌的分析物可以与多种捕获剂中的第一捕获剂(参见例如1508)偶联(例如,共价或非共价结合或连接),所述第一捕获剂附接(例如,偶联或连接)到形成细胞珠粒水凝胶基质的聚合物分子的主链,例如1510。关于示例性细胞珠粒官能化策略,参见例如美国专利公开2019/0100632(现在是美国专利10,590,244),其通过引用以其整体并入。刺激细胞以诱导分泌可以进行一段时间以允许分泌的分析物分子与捕获剂偶联。可以将第二结合剂,例如报告剂(参见例如1302)添加至细胞珠粒,其中报告剂可以包含(i)能够结合分析物分子(例如,分泌的细胞因子)的部分,如第二多肽(例如抗体),所述分析物分子结合到捕获剂;和(ii)包含第一分析物特异性条形码序列的核酸分子,从而标记与捕获剂结合的分析物分子(例如,细胞因子)。在一些情况下,可以从细胞珠粒中去除未与分析物(例如,分泌的细胞因子)结合的任何报告剂分子(例如,通过进行洗涤步骤去除未结合的第二结合剂分子)。
参考操作1402,将免疫细胞(例如,T细胞)或其他目的细胞类型与合适浓度的抗原(或其他刺激分子)一起孵育以诱导细胞因子或其他分析物的分泌。本文可以使用足以诱导细胞(例如,T细胞)分泌细胞因子的任何合适浓度的刺激分子(例如,抗原)。在一些情况下,刺激或共刺激分子(例如抗原)与主要组织相容性复合物(MHC)分子偶联。在一些情况下,MHC分子是MHC多聚体(例如,单体、二聚体、三聚体、四聚体、五聚体等),产生多聚体(例如,单体、二聚体、三聚体、四聚体等)MHC-抗原复合物(例如,如果抗原是肽,则为MHC-肽复合物)。MHC多聚体可以与细胞或聚合物连接。细胞可以是抗原呈递细胞(APC)。聚合物可以是葡聚糖聚合物(例如,dextramer)。dextramer或APC可以包含多个MHC复合物。dextramer结合的MHC复合物可以包含一种或多种刺激分子如抗原肽,从而形成MHC-肽复合物。因此,MHC分子(例如,MHC多聚体)和/或APC可以用于将刺激和/或共刺激分子(例如,经由MHC-肽复合物的刺激肽)呈递给细胞(例如,免疫细胞)以诱导一种或多种分析物的分泌。此外,细胞或其他非细胞构建体可以用于将刺激分子呈递给细胞以诱导一种或多种分析物的分泌。在一些情况下,抗原呈递细胞(APC)可以包含多个MHC分子(例如,MHC多聚体),因此APC可以用于诱导细胞(例如,免疫细胞)分泌分析物。如本文所述的共刺激分子可以是抗体(例如,抗CD3或抗CD28抗体)或细胞因子(例如,白介素)。例如,APC或MHC分子可以包含多种共刺激分子,因此可以用于诱导细胞分泌分析物。在一些情况下,如本文所述的刺激物或共刺激分子、MHC分子、APC和/或MHC分子可以被条形码化。在一些情况下,本文公开的方法包含作为抗原-MHC复合物(例如,抗原-MHC四聚体)的一部分的抗原,所述抗原-MHC复合物包含抗原(例如,肽或多肽)和MHC分子(例如,MHC多聚体,如四聚体)。MHC分子可以包含含有第三肽特异性条形码序列的核酸分子。如本文所使用和描述的,第三条形码序列可以用于鉴定由MHC分子展示的相应肽。在一些实施方案中,第三肽特异性条形码序列不同于第一分析物特异性条形码序列(例如,报告条形码序列)和第二细胞特异性(例如,图8)条形码序列。在一些情况下,除肽特异性条形码序列之外,附接到MHC分子/多聚体的核酸分子还可以包含一种或多种功能序列。例如,附接到MHC分子/多聚体的核酸分子可以包含以下中的一种或多种:唯一分子标识符(UMI)、引物序列或引物结合序列(例如,测序引物序列(或部分测序引物序列),如R1和/或R2序列)、被配制为附接到测序仪的流动池的序列(例如,P5和/或P7)、或与核酸条形码分子上的序列互补的序列(例如,附接到珠粒,如图8中所述的那些)。因此,由附接到MHC分子/多聚体(或其衍生物)的分子产生的条形码化分子(例如,包含肽特异性和细胞特异性条形码)也可以包含这些功能序列。
本文公开的方法和系统可以进一步包括用包含细胞特异性条形码序列的多个核酸分子(参见例如,图8中描述的条形码分子)将细胞珠粒分区成多个分区。在一些情况下,细胞特异性条形码附接到珠粒,如凝胶珠粒。如本文别处所述,细胞条形码可以可释放地附接到珠粒上。细胞珠粒和细胞条形码(例如,附接到珠粒,如凝胶珠粒)可以在液滴或孔中分区。液滴可以是乳液液滴并且可以包含细胞珠粒。乳液液滴可以如本文别处所述形成或产生,例如通过使不混溶(例如水相和油)的两相(例如,第一相和第二相)接触。可以溶解形成细胞珠粒的水凝胶基质,从而释放包含分析物(例如细胞因子)、捕获剂和含有第一条形码的报告剂的分析物缀合物。细胞珠粒可以用一种或多种刺激溶解,例如pH、温度或分区中离子浓度的变化。在一些情况下,细胞被裂解,释放细胞分子,如核酸分子(例如mRNA)。细胞可以在分析物的分区和条形码化之前裂解或在分区中裂解。可以使用包含第二条形码序列的核酸分子将细胞mRNA分子逆转录,从而将第二条形码附接到逆转录的核酸分子(并且例如,将分析物与细胞缔合)。可替代地,可以首先将细胞mRNA分子逆转录成cDNA(例如,使用含多聚T的引物),并使用例如本文别处所述的模板转换反应附接(例如,附接到mRNA/cDNA分子的5'端)第二细胞特异性条形码序列。关于使用模板转换反应和模板转换寡核苷酸分析和条形码化单细胞mRNA的示例性分子和方法,参见例如美国专利公开2018/0105808,其通过引用以其整体并入。在一些情况下,如本文别处所述(例如,使用刺激物,如还原剂),细胞条形码从例如珠粒(如凝胶珠粒)释放到分区中。类似地,包含第一分析物特异性条形码序列的核酸分子(例如,1304)可以用于产生包含第一分析物特异性条形码和第二细胞特异性条形码的分子(参见例如图17A)。除分析物特异性条形码序列之外,附接到分析物特异性结合剂(例如报告剂(例如,1302))的核酸分子(例如,1304)还可以包含一个或多个功能序列。例如,附接到分析物特异性结合剂(例如,1302)的核酸分子(例如,1304)可以包含以下中的一种或多种:唯一分子标识符(UMI)、引物序列或引物结合序列(例如,测序引物序列(或部分测序引物序列),如R1和/或R2序列)、被配制为附接到测序仪的流动池的序列(例如,P5和/或P7)、或与核酸条形码分子上的序列互补的序列(例如,附接到珠粒,如图8中所述的那些)。因此,由例如1304或其衍生物产生的条形码化分子(例如,包含分析物特异性和细胞特异性条形码)也可以包含这些功能序列。
在完成一个或多个条形码化、逆转录和/或核酸处理步骤(例如,取决于细胞的多少不同分析物被条形码化)后,可合并分区(例如,液滴或孔)的内容物,并对核酸分子进行进一步的批量处理和测序。因此,目前描述的方法和系统允许多种分析物与单个细胞缔合,从而能够在单细胞水平上测量、分析和/或表征多个细胞。如本文所述,可以以有效且同时的方式分析和表征多个细胞(例如,一个或多个细胞群体,如免疫细胞群体)。本文公开的方法不仅允许在细胞裂解后分析细胞分子,而且允许分析可由细胞(例如,免疫细胞,如T细胞、B细胞或树突细胞)分泌的分子,如细胞因子、激素或生长因子。
参考图14A中的操作1414,在其中细胞内分析物(例如mRNA)与分泌的分析物平行处理的实施方案中,使包含在分区(例如,液滴或孔)中的细胞1602和包含在分区(例如,液滴或孔)中的细胞珠粒1604(在细胞珠粒任选地例如通过溶解聚合物基质而溶解之后)与裂解试剂接触,以释放细胞内容物或与细胞珠粒缔合的病毒。在一些情况下,裂解剂可以在细胞珠粒形成后与大量细胞珠粒悬浮液接触。裂解剂的例子包括生物活性试剂,例如用于裂解不同细胞类型(例如革兰氏阳性或阴性细菌、植物、酵母、哺乳动物细胞等)的裂解酶,如溶菌酶、无色肽酶、溶葡萄球菌酶、labiase、细胞裂解酶、溶细胞酶、以及可从例如Sigma-Aldrich公司(密苏里州圣路易斯)获得的各种其他裂解酶、基于表面活性剂的裂解溶液(例如,TritonX-100、Tween 20、十二烷基硫酸钠(SDS))以及其他商业上可获得的裂解酶。在某些情况下也可以使用电穿孔、热、声或机械细胞破碎。在一些情况下,细胞珠粒基质可以被配置为在细胞破碎后产生足够小的孔径以保留特定大小的核酸片段。在其他情况下,细胞珠粒基质可以用核酸分子(例如,含有多聚T序列)官能化(例如,共价结合),所述核酸分子被配置为捕获释放的分析物(例如,mRNA,其任选地可以在分区之前被加工成cDNA)。
其他试剂也可以与细胞接触,包括例如DNA酶和RNA酶灭活剂或抑制剂(如蛋白酶K),螯合剂(如EDTA),以及用于去除或以其他方式减少不同细胞裂解物组分对核酸后续处理的负面活性或影响的其他试剂。此外,在包封的细胞珠粒的情况下,细胞珠粒可以暴露于适当的刺激以将细胞珠粒或其内容物释放到例如分区中。例如,在一些情况下,化学刺激可以与包封的细胞珠粒一起被共分区,以允许微胶囊的降解和细胞或其内容物释放到更大的分区中。在一些情况下,这种刺激可以与本文别处描述的用于从它们各自的微胶囊(例如珠粒)中释放寡核苷酸的刺激相同。在替代方面,这可以是不同且不重叠的刺激,以便允许包封的细胞珠粒在与寡核苷酸释放到同一分区不同的时间将其内容物释放到分区中。
在释放细胞大分子成分后,在操作1416中,细胞mRNA分子用其他类型的逆转录引物进行逆转录反应,从而从mRNA产生cDNA。在一些情况下,在cDNA产生期间同时附接如图17A中所示的分区特异性(例如,细胞特异性,如图8中所述的那些)条形码分子1702。在某些实施方案中,分区特异性(例如,细胞特异性)条形码序列1702是DNA寡核苷酸。分区特异性(例如,细胞特异性)条形码序列1702可以是与第一条形码序列(例如,分析物特异性条形码)不同的第二条形码序列,所述第一条形码序列附接到或偶联到用于对从细胞(例如,免疫细胞,如T细胞)分泌的分析物进行条形码化的报告剂。
在某些实施方案中,分区特异性(例如,细胞特异性)条形码分子(例如,寡核苷酸)在对珠粒施加特定刺激时可从珠粒释放,如本文别处所述。在一些情况下,刺激可以是光刺激,例如通过切断释放核酸分子的光不稳定连接。在其他情况下,可以使用热刺激,其中珠粒环境的温度的升高将导致连接的切割或核酸分子从珠粒的其他释放。在仍其他情况下,可以使用化学刺激,其切割核酸分子与珠粒的连接,或者以其他方式导致从珠粒释放核酸分子。在一种情况下,这种组合物包括上述用于包封生物颗粒的聚丙烯酰胺基质,并且可以通过暴露于还原剂(如DTT)而降解以释放附接的核酸分子。
在操作1414期间,在一些实施方案中,附接到结合分析物(例如,细胞因子)的第二结合剂(例如,报告剂,分析物特异性多肽,如抗体)1302的条形码分子(例如,1304)可以被释放(例如,通过如本文别处所述的可释放的连接/不稳定结合)。类似地,在一些实施方案中,附接到MHC多聚体(参见例如图18中的1802)和/或附接到细胞表面蛋白特异性抗体(参见例如图18中的1801)的条形码也可以被释放(例如,通过如本文别处所述的可释放的连接/不稳定结合)。在操作1416中,分区特异性(例如,液滴特异性或第二)条形码序列1702可以附接到这些释放的条形码分子(或其衍生物)中的任一个或全部。在操作1402和1410中,这些释放的条形码用作用于刺激细胞的RNA、DNA、蛋白质和/或抗原的细胞特异性标识符和/或分区特异性标识符。将唯一条形码专门分配给单个生物颗粒或生物颗粒组可以将特征归属于单独生物颗粒或生物颗粒组。唯一标识符(例如核酸条形码形式的标识符)被分配给或缔合单独生物颗粒或生物颗粒群体,以便用唯一标识符标签化或标记生物颗粒的大分子组分(以及因此其特征)。然后,这些唯一标识符(例如条形码)可以用于将生物颗粒的组分和特征归属于单独生物颗粒或生物颗粒组。此外,如本文别处所述,除了细胞特异性条形码和/或分区特异性条形码之外,还可以将唯一分子标识符(UMI)添加至细胞分析物(例如,mRNA分子)和报告分子(例如,附接到结合剂,如1304;或附接到MHC分子/多聚体的报告分子;和/或抗体,如细胞表面抗体)以提供用于定量单独分子的唯一标识符。
在操作1418中,将条形码化的分区内容物合并成大体积溶液并如本文别处所述进一步处理以产生测序文库。参考图18,关于分泌的分析物(例如,细胞因子)以及其他分析物(例如,mRNA、细胞表面蛋白、配对的αβT细胞受体序列和抗原结合特异性)的信息均可以使用细胞特异性条形码(参见例如图8)进行分析并归属于同一细胞。
用于样品区室化的系统和方法
在一个方面,本文描述的系统和方法提供了将一种或多种颗粒(例如,生物颗粒、生物颗粒的大分子成分、珠粒、试剂等)区室化、沉积或分区到离散的隔室或分区(这里可互换地称为分区)中,其中每个分区保持其自身内容物与其他分区的内容物的分离。分区可以是乳液中的液滴或孔。一个分区可以包括一个或多个其他分区。
分区可以包括一个或多个颗粒。分区可以包括一种或多种类型的颗粒。例如,本公开文本的分区可以包括一种或多种生物颗粒和/或其大分子成分。分区可以包括一个或多个珠粒。分区可以包括一个或多个凝胶珠粒。分区可以包括一个或多个细胞珠粒。分区可以包括单个凝胶珠粒、单个细胞珠粒、或同时包括单个细胞珠粒和单个凝胶珠粒。分区可以包括一种或多种试剂。可替代地,分区可能未被占据。例如,分区可以不包括珠粒。细胞珠粒可以是包裹在凝胶或聚合物基质内的生物颗粒和/或其一种或多种大分子成分,例如经由包含生物颗粒和能够聚合或凝胶化的前体的液滴的聚合。如本文别处所述,诸如条形码等唯一标识符可以在液滴产生之前、之后或同时注入液滴中,例如经由微胶囊(例如珠粒)。微流体通道网络(例如,在芯片上的)可用于产生如本文所述的分区。也可使用替代机制来对各个生物颗粒进行分区,包括多孔膜,细胞的水性混合物通过所述多孔膜被挤压成非水性流体。
本公开文本的方法和系统可以包括用于产生一个或多个分区(如液滴)的方法和系统。液滴可以包括乳液中的多个液滴。在一些例子中,液滴可以包括胶体中的液滴。在一些情况下,乳液可以包括微乳液或纳米乳液。在一些例子中,液滴可以借助于微流体装置和/或通过使不混溶相的混合物经受搅拌(例如,在容器中)来产生。在一些情况下,所述方法的组合可用于液滴和/或乳液形成。
液滴可以通过混合和/或搅拌不混溶相产生乳液来形成。混合或搅拌可以包括各种搅拌技术,如涡旋、移液、管弹或其他搅拌技术。在一些情况下,可以在不使用微流体装置的情况下进行混合或搅拌。在一些例子中,液滴可以通过将混合物暴露于超声或声处理而形成。在国际申请号PCT/US2020/017785和PCT/US2020/020486中描述了用于通过搅拌产生液滴和/或乳液的系统和方法,这些文献出于所有目的通过引用以其整体并入本文。
包括微流体通道网络(例如,在芯片上)的微流体装置或平台可用于产生如本文所述的分区,如液滴和/或乳液。在美国专利公开号2019/0367997和2019/0064173以及国际申请号PCT/US2015/025197、PCT/US2020/017785和PCT/US2020/020486中描述了以下各项:用于产生分区(如液滴)的方法和系统,将分析物载体和/或分析物载体包封在分区中的方法,增加液滴产生的吞吐量的方法,以及微流体装置和通道的各种几何形状、架构和配置,这些文献中的每一个出于所有目的通过引用以其整体并入本文。
在一些例子中,可以通过将水性流体中的流动颗粒流引入到非水性流体的流动流或储器中来将单独颗粒分区成离散分区,使得可以在两个流/储器的交汇点处(例如,在本文别处提供的微流体装置的交汇点处)产生液滴。
本公开文本的方法可以包括产生分区和/或包封颗粒,如生物颗粒,在一些情况下,单独生物颗粒,如单个细胞。在一些例子中,试剂可以被包封和/或分区(例如,与生物颗粒共分区)在分区中。可以采用各种机制分区单独颗粒。一个例子可以包括多孔膜,细胞的水性混合物可以通过所述多孔膜挤出成流体(例如,非水性流体)。
分区可以在流体流内流动。分区可以包括例如微泡,其具有围绕内部流体中心或核心的外部屏障。在一些情况下,分区可以包括多孔基质,其能够在其基质中夹带和/或保留物质。分区可以是第二相内的第一相的液滴,其中第一相和第二相是不混溶的。例如,分区可以是非水性连续相(例如油相)内的水性流体的液滴。在另一例子中,分区可以是水相内的非水性流体的液滴。在一些例子中,分区可以以油包水乳液或水包油乳液的形式提供。例如,在美国专利申请公开号2014/0155295中描述了多种不同的容器,该文献出于所有目的通过引用以其整体并入本文。例如,在美国专利申请公开号2010/0105112中描述了用于在非水性或油连续相中产生稳定液滴的乳液系统,该文献出于所有目的通过引用以其整体并入本文。
在一个非限制性例子中,在乳液中的液滴的情况下,将单独颗粒分配至离散的分区中可以通过将颗粒在水性流体中的流动流引入非水性流体的流动流中来完成,使得在两个流的交汇点处生成液滴。可以调整流体特性(例如,流体流速、流体粘度等)、颗粒特性(例如,体积分数、颗粒尺寸、颗粒浓度等)、微流体结构(例如,通道几何结构等)、以及其他参数来控制所得分区的占据率(例如,每个分区的生物颗粒数量、每个分区的珠粒数量等)。例如,可以通过提供一定浓度和/或流速的颗粒的水性流来控制分区占据。为了产生单个生物颗粒分区,可以选择不混溶流体的相对流速,使得平均来说,每个分区可以包括少于一个生物颗粒,以确保那些被占据的分区主要是被单一占据的。在一些情况下,多个分区中的分区可以包括至多一个生物颗粒(例如,珠粒、DNA、细胞或细胞物质)。在一些实施方案中,可以选择或调整各种参数(例如,流体特性、颗粒特性、微流体结构等),使得大部分分区被占据,例如,只允许一小部分未被占据的分区。可以控制流和通道结构,以确保给定数量的单一占据分区,少于某一级别的未占据分区和/或少于某一级别的多重占据分区。
图1示出了用于对各生物颗粒进行分区的微流体通道结构100的例子。通道结构100可以包括在通道交汇点110处连通的通道区段102、104、106和108。在操作中,包括悬浮的生物颗粒(或细胞)114的第一水性流体112可以沿着通道区段102输送到交汇点110,而与水性流体112不混溶的第二流体116从通道区段104和106中的每一个输送到交汇点110,以产生第一水性流体112的离散液滴118、120,流入通道区段108并离开交汇点110。通道区段108可以流体地连接出口储器,离散的液滴可以在所述出口储器中被储存和/或收获。所产生的一个离散液滴可以包括单个生物颗粒114(如液滴118)。所产生的一个离散液滴可以包括多于一个单个生物颗粒114(在图1中未示出)。离散液滴可以不包括生物颗粒114(如液滴120)。每个离散分区可以保持其自身内容物(例如,单个生物颗粒114)与其他分区的内容物的分离。
第二流体116可以包括油(如氟化油),其包括用于稳定所得液滴的含氟表面活性剂,例如,抑制所得液滴118、120的后续聚结。特别有用的分区流体和含氟表面活性剂的例子描述于例如美国专利申请公开号2010/0105112中,该文献出于所有目的通过引用以其整体并入本文。
可以理解的是,本文所述的微流体装置的通道区段可以连接多种不同的流体源中的任何一种或接收部件,包括储器、管道、歧管或其他系统的流体部件。可以理解,微流体通道结构100可以具有其他几何结构和/或构型。例如,微流体通道结构可以具有多于一个通道交汇点。例如,微流体通道结构可以具有2、3、4或5个通道区段,每个通道区段携带在通道交汇点相遇的颗粒(例如,生物颗粒、细胞珠粒和/或凝胶珠粒)。流体可以经由一个或多个流体流动单元沿着一个或多个通道或储器被引导流动。流体流动单元可以包括压缩机(例如,提供正压)、泵(例如,提供负压)、致动器等来控制流体的流动。流体也可以或以其他方式经由施加的压差、离心力、电动泵送、真空、毛细管或重力流等来控制。
生成的液滴可以包括两个液滴子集:(1)被占据的液滴118,含有一个或多个生物颗粒114,和(2)未被占据的液滴120,不含任何生物颗粒114。被占据的液滴118可以包括被单一占据的液滴(具有一个生物颗粒)和被多重占据的液滴(具有多于一个生物颗粒)。如本文别处所述,在一些情况下,大多数被占据的分区可以在每个被占据的分区中包括不超过一个生物颗粒,并且一些产生的分区可以是未被占据的(未被任何生物颗粒占据)。然而,在一些情况下,一些被占据的分区可能包括多于一个生物颗粒。在一些情况下,可以控制分区过程,使得少于约25%的被占据分区包括多于一个生物颗粒,并且在许多情况下,少于约20%的被占据分区具有多于一个生物颗粒,而在一些情况下,少于约10%或者甚至少于约5%的被占据分区每个分区包括多于一个生物颗粒。
在一些情况下,可能希望过多数量的空分区的生成最小化,以降低成本和/或提高效率。虽然这种最小化可以通过在分区交汇点110提供足够数量的生物颗粒(例如,生物颗粒114)来实现,如确保至少一个生物颗粒被包封在分区中,但是泊松分布可以预期地增加包括多个生物颗粒的分区的数量。因此,在要获得单一占据的分区的情况下,至多约95%、90%、85%、80%、75%、70%、65%、60%、55%、50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%、5%或更少的所生成的分区可以是未被占据的。
在一些情况下,可以控制一种或多种生物颗粒(例如,在通道区段102中)或被导入分区交汇点的其他流体的流动(例如,在通道区段104、106中),使得在许多情况下,不超过约50%的生成分区、不超过约25%的生成分区或不超过约10%的生成分区未被占据。可以控制这些流,以便呈现单一占据分区的非泊松分布,同时提供较低水平的未占据分区。可以实现上述范围的未被占据的分区,同时仍提供上述任何单一占据率。例如,在许多情况下,本文所述的系统和方法的使用可以产生的所得分区具有的多重占据率小于约25%、小于约20%、小于约15%、小于约10%和在许多情况下小于约5%,同时具有的未被占据的分区小于约50%、小于约40%、小于约30%、小于约20%、小于约10%、小于约5%或更少。
应当理解,上述占据率也适用于同时包括生物颗粒和另外的试剂的分区,所述另外的试剂包括但不限于携带条形码化核酸分子(例如寡核苷酸)的微胶囊或珠粒(例如凝胶珠粒)(参照图2描述)。占据的分区(例如,占据的分区的至少约10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、或99%)可以包括包含条形码化核酸分子的微胶囊(例如珠粒)和生物颗粒二者。
在另一方面,除了基于液滴的分区之外,或者作为基于液滴的分区的替代物,生物颗粒还可以被包封在微胶囊内,所述微胶囊包含外壳、层或多孔基质,其中夹带有一个或多个单独的生物颗粒或小生物颗粒组。微胶囊可以包括其他试剂。生物颗粒的包封可以通过多种方法进行。这种方法可以将含有生物颗粒的水性流体与聚合物前体材料结合,在对所述聚合物前体施加特定刺激时,所述聚合物前体材料能够形成凝胶或其他固体或半固体基质。这种刺激可以包括例如热刺激(例如加热或冷却)、光刺激(例如通过光固化)、化学刺激(例如通过交联、前体的聚合引发(例如通过添加引发剂))、机械刺激、或其组合。
包含生物颗粒的微胶囊的制备可以通过多种方法进行。例如,气刀液滴或气溶胶发生器可以用于将前体流体的液滴分配到胶凝溶液中,以形成包括单个生物颗粒或小生物颗粒组的微胶囊。同样,基于膜的包封系统可以用于产生包括本文所述的包封生物颗粒的微胶囊。本公开文本的微流体系统,如图1中所示的微流体系统,可以容易地用于包封本文所述的细胞。特别地,参照图1,包含(i)生物颗粒114和(ii)聚合物前体材料(未示出)的水性流体112流入通道交汇点110,其在此通过非水性流体116的流动被分区成液滴118、120。在包封方法的情况下,非水性流体116还可以包括引发剂(未示出),以引起聚合物前体的聚合和/或交联,从而形成包括夹带的生物颗粒的微胶囊。聚合物前体/引发剂对的例子包括美国专利申请公开号2014/0378345中描述的那些,该文献出于所有目的通过引用以其整体并入本文。
例如,在聚合物前体材料包括线性聚合物材料(例如线性聚丙烯酰胺、PEG或其他线性聚合物材料)的情况下,活化剂可以包括交联剂,或在形成的液滴内活化交联剂的化学物质。同样,对于包括可聚合单体的聚合物前体,活化剂可以包括聚合引发剂。例如,在某些情况下,当聚合物前体包括丙烯酰胺单体与N,N’-双(丙烯酰)胱胺(BAC)共聚单体的混合物时,可以在通道区段104和106中的第二流体流116内提供诸如四甲基乙二胺(TEMED)等试剂,其可以引发丙烯酰胺和BAC共聚成交联聚合物网络或水凝胶。
当第二流体流116与第一流体流112在交汇点110接触时,在液滴形成期间,TEMED可以从第二流体116扩散到包含线性聚丙烯酰胺的水性流体112中,这将激活液滴118、120内聚丙烯酰胺的交联,导致凝胶(例如水凝胶)微胶囊的形成,作为夹带细胞114的固体或半固体珠粒或颗粒。尽管就聚丙烯酰胺包封进行了描述,但是在本文描述的方法和组合物的上下文中也可以使用其他‘可激活的’包封组合物。例如,藻酸盐液滴的形成,随后暴露于二价金属离子(例如,Ca2+离子),可以用作使用所述方法的包封过程。同样,琼脂糖液滴也可以通过基于温度的凝胶化(例如,冷却等)转化成胶囊。
在一些情况下,包封的生物颗粒可以选择性地从微胶囊中释放,例如通过时间的推移或施加特定的刺激,这充分降解了微胶囊,以允许生物颗粒(例如细胞)或其其他内容物从微胶囊中释放,例如释放到分区(例如液滴)中。例如,在上述聚丙烯酰胺聚合物的情况下,微胶囊的降解可以通过引入适当的还原剂(如DTT或类似试剂)以切断使聚合物基质交联的二硫键来完成。例如,参见美国专利申请公开号2014/0378345,该文献出于所有目的通过引用以其整体并入本文。
生物颗粒可以经受足以聚合或凝胶化前体的其他条件。足以聚合或凝胶化前体的条件可以包括暴露于加热、冷却、电磁辐射和/或光。足以聚合或凝胶化前体的条件可以包括足以聚合或凝胶化前体的任何条件。在聚合或凝胶化之后,可以在生物颗粒周围形成聚合物或凝胶。聚合物或凝胶可以对化学或生物化学试剂具有扩散渗透性。聚合物或凝胶对于生物颗粒的大分子成分可以是扩散不可渗透的。以这种方式,聚合物或凝胶可以允许生物颗粒经受化学或生物化学操作,同时在空间上将大分子成分限制在由聚合物或凝胶限定的液滴区域。聚合物或凝胶可以包括二硫化物交联聚丙烯酰胺、琼脂糖、藻酸盐、聚乙烯醇、聚乙二醇二丙烯酸酯、聚乙二醇(PEG)-二丙烯酸酯、PEG-丙烯酸酯、PEG-硫醇、PEG-叠氮化物、PEG-炔基、其他丙烯酸酯、壳聚糖、透明质酸、胶原蛋白、纤维蛋白、明胶或弹性蛋白中的一种或多种。聚合物或凝胶可以包括任何其他聚合物或凝胶。
聚合物或凝胶可以被官能化以结合靶分析物,如核酸、蛋白质、碳水化合物、脂质或其他分析物。聚合物或凝胶可以经由被动机制聚合或凝胶化。聚合物或凝胶在碱性条件下或高温下可以是稳定的。聚合物或凝胶的力学性能可以类似于珠粒的力学性能。例如,聚合物或凝胶可以具有与珠粒相似的尺寸。聚合物或凝胶可以具有类似于珠粒的机械强度(例如拉伸强度)。聚合物或凝胶的密度可以低于油。聚合物或凝胶的密度可以大致类似于缓冲液的密度。聚合物或凝胶可以具有可调的孔径。孔径可以选择,例如,以截留变性的核酸。可以选择孔径以保持对外源化学物质(如氢氧化钠(NaOH))和/或内源化学物质(如抑制剂)的扩散渗透性。聚合物或凝胶可以是生物相容的。聚合物或凝胶可以保持或增强细胞活力。聚合物或凝胶可以是生物化学相容的。聚合物或凝胶可以以热、化学、酶促和/或光学方式聚合和/或解聚。
聚合物可以包括用二硫化物连接交联的聚丙烯酸-丙烯酰胺(poly(acrylamide-co-acrylic acid))。聚合物的制备可以包括两步反应。在第一活化步骤中,聚丙烯酸-丙烯酰胺可以暴露于酰化剂,以将羧酸转化为酯。例如,聚丙烯酸-丙烯酰胺可以暴露于4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物(DMTMM)。聚丙烯酸-丙烯酰胺可以暴露于4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓的其他盐。在第二交联步骤中,在第一步骤中形成的酯可以暴露于二硫化物交联剂。例如,酯可以暴露于胱胺(2,2’-二硫代双(乙胺))。在这两个步骤之后,生物颗粒可以被通过二硫键连接在一起的聚丙烯酰胺链包围。以这种方式,生物颗粒可以被包裹在凝胶或基质(例如,聚合物基质)内或包含凝胶或基质,以形成“细胞珠粒”。细胞珠粒可以包括生物颗粒(例如细胞)或生物颗粒的大分子成分(例如RNA、DNA、蛋白质等)。细胞珠粒可以包括单个细胞或多个细胞、或者单个细胞或多个细胞的衍生物。例如,在裂解和洗涤细胞后,来自细胞裂解物的抑制成分可以被洗掉,并且大分子成分可以结合为细胞珠粒。本文公开的系统和方法可适用于含有生物颗粒的细胞珠粒(和/或液滴或其他分区)和含有生物颗粒的大分子成分的细胞珠粒(和/或液滴或其他分区)。
包封的生物颗粒可以提供某些潜在的优点,即比基于液滴进行分区的生物颗粒更易于储存和携带。此外,在一些情况下,可能希望允许生物颗粒在分析之前孵育选定的时间段,例如为了表征这种生物颗粒在不同刺激存在或不存在的情况下随时间的变化。在这种情况下,相比在乳液液滴中进行分区,包封可以允许更长的孵育时间,尽管在一些情况下,被液滴分区的生物颗粒也可以孵育不同的时间段,例如至少10秒、至少30秒、至少1分钟、至少5分钟、至少10分钟、至少30分钟、至少1小时、至少2小时、至少5小时或至少10小时或更长。生物颗粒的包封可以构成生物颗粒的分区,其他试剂被共同分区到所述分区中。可替代地或另外地,包封的生物颗粒可以容易地沉积到如上所述的其他分区(例如,液滴)中。
样品和细胞处理
样品可以源自任何有用的来源,包括任何受试者,如人受试者。样品可以包含来自一种或多种不同来源、如一个或多个不同受试者的材料(例如,一个或多个细胞)。可以获得多个样品用于如本文所述的分析,如来自单一受试者的多个样品(例如,以相同或不同方式从相同或不同身体位置获得和/或在相同或不同时间(例如,相隔数秒、数分钟、数小时、数天、数周、数月或数年)获得的多个样品),或者来自不同受试者的多个样品。例如,第一样品可以在第一时间从受试者获得,并且第二样品可以在所述第一时间之后的第二时间从所述受试者获得。第一时间可以在受试者经历治疗方案或程序(例如,以解决疾病或病症)之前,并且第二时间可以在受试者经历治疗方案或程序期间或之后。在另一例子中,第一样品可以从受试者的第一身体位置或系统获得(例如,使用第一收集技术),并且第二样品可以从所述受试者的第二身体位置或系统获得(例如,使用第二收集技术),所述第二身体位置或系统可以与第一身体位置或系统不同。在另一例子中,多个样品可以在同一时间从相同或不同的身体位置从受试者获得。不同的样品,如从同一受试者的不同身体位置、在不同时间、从多个不同受试者和/或使用不同的收集技术收集的不同样品,可以经历相同或不同的处理(例如,如本文所述)。例如,第一样品可以经历第一处理方案,并且第二样品可以经历第二处理方案。
样品可以是生物样品,如细胞样品(例如,如本文所述)。样品可以包括一种或多种分析物载体,如一种或多种细胞和/或细胞成分,如一个或多个细胞核。例如,样品可以包含多种细胞和/或细胞成分。样品的组分(例如,细胞或细胞成分,如细胞核)可以具有单一类型或多个不同类型。例如,样品的细胞可以包括一个或多个不同类型的血细胞。
生物样品可以包括具有不同尺寸和特征的多种细胞。在一些情况下,生物样品的处理,如细胞分离和分选(例如,如本文所述),可以通过耗尽具有一些特征和尺寸的细胞和/或分离具有一些特征和尺寸的细胞来影响样品中包括的尺寸分布和细胞特征。
在用于分析的制备中(例如,如本文所述),样品可以经历一个或多个过程,包括但不限于过滤、选择性沉淀、纯化、离心、透化、分离、搅拌、加热和/或其他过程。例如,样品可以被过滤以去除污染物或其他材料。在一个例子中,过滤过程可以包括微流体的使用(例如,以分离不同大小、类型、电荷或其他特征的分析物载体)。
在一个例子中,包含一个或多个细胞的样品可以被处理以将所述一个或多个细胞与样品中的其他材料分离(例如,使用离心和/或另一过程)。在一些情况下,样品的细胞和/或细胞成分可以被加工以分离和/或分选细胞和/或细胞成分的组,例如以分离和/或分选不同类型的细胞和/或细胞成分。细胞分离的例子包括但不限于将白细胞或免疫细胞与其他血细胞和组分分离、将循环肿瘤细胞从血液分离以及将细菌与身体细胞和/或环境物质分离。分离过程可以包括阳性选择过程(例如,靶向目的细胞类型以供保留用于后续下游分析,如通过使用靶向目的细胞类型的表面标记物的单克隆抗体)、阴性选择过程(例如,去除一种或多种细胞类型并保留一种或多种其他目的细胞类型)和/或耗竭过程(例如,从样品去除单一细胞类型,如从外周血单个核细胞去除红细胞)。
一种或多种不同类型的细胞的分离可以包括例如离心、过滤、基于微流体的分选、流式细胞术、荧光激活细胞分选(FACS)、磁性激活细胞分选(MACS)、浮力激活细胞分选(BACS)或任何其他有用方法。例如,流式细胞术方法可以用于基于诸如以下等参数来检测细胞和/或细胞成分:大小、形态或蛋白质表达。基于流式细胞术的细胞分选可以包括将样品注射至鞘液中,其将样品的细胞和/或细胞成分每次一个地运送至测量区中。在测量区中,光源如激光器可以询问细胞和/或细胞成分,并且散射光和/或荧光可以被检测并被转化为数字信号。喷嘴系统(例如,振动喷嘴系统)可以用于生成包含单独细胞和/或细胞成分的液滴(例如,水性液滴)。包括目的细胞和/或细胞成分(例如,如经由光学检测所确定)的液滴可以用电荷来标记(例如,使用带电荷的环),所述电荷可以用于将这样的液滴与包括其他细胞和/或细胞成分的液滴分离。例如,FACS可以包括用荧光标记(例如,使用内部和/或外部生物标记物)来标记细胞和/或细胞成分。然后,细胞和/或细胞成分可以逐个被测量和鉴定,并且基于标记物的发射的荧光或其不存在进行分选。MACS可以使用微米级或纳米级磁性颗粒结合到细胞和/或细胞成分(例如,经由与细胞表面标记物的抗体相互作用)以促进目的细胞和/或细胞成分与样品的其他组分的磁性分离(例如,使用基于柱的分析)。BACS可以使用用针对目的靶细胞的抗体标记的微泡(例如,玻璃微泡)。与微泡偶联的细胞和/或细胞组分可以漂浮至溶液的表面,从而将靶细胞和/或细胞组分与样品的其他组分分离。细胞分离技术可以用于富集目的细胞的群体(例如,在分区之前,如本文所述)。例如,包含多个细胞(包括给定类型的多个细胞)的样品可以经历阳性分离过程。给定类型的多个细胞可以用荧光标记(例如,基于表达的细胞表面标记物或另一标记物)并且经历FACS过程以将这些细胞与所述多个细胞中的其他细胞分离。然后所选细胞可以经历后续基于分区的分析(例如,如本文所述)或其他下游分析。荧光标记可以在这样的分析之前被去除或者可以被保留。荧光标记可以包含鉴定性特征,如核酸条形码序列和/或唯一分子标识符。
在另一例子中,包含第一多个细胞(包括给定类型的第一多个细胞)(例如,表达特定标记物或标记物组合的免疫细胞)的第一样品和包含第二多个细胞(包括给定类型的第二多个细胞)的第二样品可以经历阳性分离过程。第一和第二样品可以从相同或不同受试者、以相同或不同的类型、从相同或不同的身体位置或系统、使用相同或不同的收集技术来收集。例如,第一样品可以来自第一受试者,并且第二样品可以来自与所述第一受试者不同的第二受试者。第一样品的第一多个细胞可以被提供配置为标记给定类型的第一多个细胞的第一多个荧光标记。第二样品的第二多个细胞可以被提供配置为标记给定类型的第二多个细胞的第二多个荧光标记。第一多个荧光标记可以包括第一鉴定性特征,如第一条形码,而第二多个荧光标记可以包括与所述第一鉴定性特征不同的第二鉴定性特征,如第二条形码。第一多个荧光标记和第二多个荧光标记可以在用相同的激发源(例如,光源,如激光器)激发后以相同的强度且在相同的波长范围内发荧光。第一和第二样品然后可以被组合并经历FACS过程,以基于标记给定类型的第一多个细胞的第一多个荧光标记和标记给定类型的第二多个细胞的第二多个荧光标记将给定类型的细胞与其他细胞分离。可替代地,第一和第二样品可以经历单独的FACS过程,并且然后来自第一样品的给定类型的阳性选择的细胞和来自第二样品的给定类型的阳性选择的细胞可以被组合用于后续分析。不同荧光标记的编码的鉴定性特征可以用于鉴定源自第一样品的细胞和源自第二样品的细胞。例如,第一和第二鉴定性特征可以配置为与核酸条形码分子(例如,如本文所述)相互作用(例如,在分区中,如本文所述),以生成可使用例如核酸测序检测的条形码化的核酸产物。
多重化方法
本公开文本提供了用于多重化以及以其他方式增加用于分析的样品的通量的方法和系统。例如,单一或集成过程工作流可以允许更多或多种分析物的处理、鉴定和/或分析、更多或多种类型的分析物和/或更多或多种类型的分析物表征。例如,在本文所述的方法和系统中,能够结合或以其他方式偶联一种或多种细胞或细胞特征的一种或多种标记剂可以用于表征细胞和/或细胞特征。在一些情况下,细胞特征包括细胞表面特征。细胞表面特征可以包括但不限于受体、抗原、表面蛋白、跨膜蛋白、分化蛋白簇、蛋白质通道、蛋白质泵、载体蛋白、磷脂、糖蛋白、糖脂、细胞间相互作用蛋白复合物、抗原呈递复合物、主要组织相容复合物、工程化T细胞受体、T细胞受体、B细胞受体、嵌合抗原受体、间隙连接、黏着连接或其任何组合。在一些情况下,细胞特征可以包括细胞内分析物,如蛋白质、蛋白质修饰(例如,磷酸化状态或其他翻译后修饰)、核蛋白、核膜蛋白或其任何组合。标记剂可以包括但不限于蛋白质、肽、抗体(或其表位结合片段)、亲脂部分(如胆固醇)、细胞表面受体结合分子、受体配体、小分子、双特异性抗体、双特异性T细胞接合器、T细胞受体接合器、B细胞受体接合器、pro-body、适配体、monobody、affimer、darpin和蛋白质支架或其任何组合。标记剂可以包括(例如,附接到)指示与结合基团结合的细胞表面特征的报告寡核苷酸。例如,报告寡核苷酸可以包含允许鉴定标记剂的条形码序列。例如,对一种类型的细胞特征(例如,第一细胞表面特征)具有特异性的标记剂可以具有与其偶联的第一报告寡核苷酸,而对不同细胞特征(例如,第二细胞表面特征)具有特异性的标记剂可以具有与其偶联的不同报告寡核苷酸。关于示例性标记剂、报告寡核苷酸和使用方法的描述,参见例如美国专利10,550,429、美国专利公开20190177800和美国专利公开20190367969,其各自出于所有目的通过引用以其整体并入本文。
在一个特定例子中,可以提供潜在细胞特征标记剂的库,其中各自的细胞特征标记剂与核酸报告分子缔合,使得不同报告寡核苷酸序列与能够结合特定细胞特征的每种标记剂缔合。在其他方面,所述库的不同成员可以通过不同寡核苷酸序列标记的存在来表征。例如,能够结合第一蛋白的抗体可以具有与其缔合的第一报告寡核苷酸序列,而能够结合第二蛋白的抗体可以具有不同的与其缔合的报告寡核苷酸序列。特定寡核苷酸序列的存在可以指示特定抗体或可以被所述特定抗体识别或结合的细胞特征的存在。
能够结合或以其他方式偶联一个或多个细胞的标记剂可以用于表征如属于特定细胞组的细胞。例如,标记剂可以用于标记细胞样品或细胞组。以此方式,细胞组可以被标记为与另一细胞组不同。在一个例子中,第一细胞组可以源自第一样品,并且第二细胞组可以源自第二样品。标记剂可以允许第一组和第二组具有不同标记剂(或与标记剂缔合的报告寡核苷酸)。这可以例如促进多重化,其中第一组的细胞和第二组的细胞可以单独标记,然后合并在一起用于下游分析。标记的下游检测可以指示分析物属于特定组。
例如,报告寡核苷酸可以被连接到抗体或其表位结合片段,并且标记细胞可以包括使抗体连接的条形码分子或表位结合片段连接的条形码分子经历适合于使抗体结合到细胞表面上存在的分子的条件。抗体或其表位结合片段与表面上存在的分子之间的结合亲和力可以在所需范围内,以确保抗体或其表位结合片段保持结合到分子。例如,结合亲和力可以在所需范围内以确保抗体或其表位结合片段在各个样品处理步骤(如分区和/或核酸扩增或延伸)期间保持结合到分子。抗体或其表位结合片段与其结合的分子之间的解离常数(Kd)可以小于约100μM、90μM、80μM、70μM、60μM、50μM、40μM、30μM、20μM、10μM、9μM、8μM、7μM、6μM、5μM、4μM、3μM、2μM、1μM、900nM、800nM、700nM、600nM、500nM、400nM、300nM、200nM、100nM、90nM、80nM、70nM、60nM、50nM、40nM、30nM、20nM、10nM、9nM、8nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM、2nM、1nM、900pM、800pM、700pM、600pM、500pM、400pM、300pM、200pM、100pM、90pM、80pM、70pM、60pM、50pM、40pM、30pM、20pM、10pM、9pM、8pM、7pM、6pM、5pM、4pM、3pM、2pM或1pM。例如,解离常数可以小于约10μM。
在另一例子中,报告寡核苷酸可以与细胞穿膜肽(CPP)偶联,并且标记细胞可以包括将CPP偶联的报告寡核苷酸递送到分析物载体中。标记分析物载体可以包括通过细胞穿膜肽将CPP缀合的寡核苷酸递送到细胞和/或细胞珠粒中。可以用于本文提供的方法中的CPP可以包含至少一个非功能半胱氨酸残基,所述残基可以是游离的或被衍生以形成与寡核苷酸的二硫化物连接,所述寡核苷酸已经针对这样的连接进行修饰。可以用于本文的实施方案中的CPP的非限制性例子包括穿透素、转运肽、plsl、TAT(48-60)、pVEC、MTS和MAP。可用于本文提供的方法中的细胞穿膜肽可以具有针对细胞群中至少约30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的细胞诱导细胞穿透的能力。CPP可以是富精氨酸肽转运蛋白。CPP可以是穿透素或Tat肽。在另一例子中,报告寡核苷酸可以与荧光团或染料偶联,并且标记细胞可以包括使荧光团连接的条形码分子经历适合于使荧光团结合到细胞表面的条件。在一些情况下,荧光团可以与脂质双层强相互作用,并且标记细胞可以包括使荧光团连接的条形码分子经历使得荧光团结合到细胞的膜或插入细胞的膜中的条件。在一些情况下,荧光团是水溶性的有机荧光团。在一些情况下,荧光团是Alexa 532马来酰亚胺、四甲基罗丹明-5-马来酰亚胺(TMR马来酰亚胺)、BODIPY-TMR马来酰亚胺、磺基-Cy3马来酰亚胺、Alexa 546羧酸/琥珀酰亚胺基酯、Atto 550马来酰亚胺、Cy3羧酸/琥珀酰亚胺基酯、Cy3B羧酸/琥珀酰亚胺基酯、Atto 565生物素、磺基罗丹明B、Alexa594马来酰亚胺、Texas Red马来酰亚胺、Alexa 633马来酰亚胺、Abberior STAR 635P叠氮化物、Atto 647N马来酰亚胺、Atto 647 SE或磺基-Cy5马来酰亚胺。关于有机荧光团的描述,参见例如,Hughes L D等人PLoS One.2014年2月4日;9(2):e87649,其出于所有目的通过引用以其整体特此并入。
报告寡核苷酸可以与亲脂分子偶联,并且标记细胞可以包括通过亲脂分子将核酸条形码分子递送到细胞的膜或核膜。亲脂分子可以与脂质膜如细胞膜和核膜缔合和/或插入其中。在一些情况下,所述插入可以是可逆的。在一些情况下,亲脂分子与细胞膜或核膜之间的缔合可以使得所述膜在后续处理(例如,分区、细胞透化、扩增、合并等)期间保留亲脂分子(例如,及其相关组分,如核酸条形码分子)。报告核苷酸可以进入细胞内空间和/或细胞核中。在一个实施方案中,与亲脂分子偶联的报告寡核苷酸将经由亲脂分子保持与脂质膜缔合和/或插入脂质膜中(如本文所述),直至发生细胞裂解,例如,在分区内。
报告寡核苷酸可以是核酸分子的一部分,所述核酸分子包含任何数量的功能序列,如本文别处所述,如靶标捕获序列、随机引物序列等,并且与作为或源自分析物的另一核酸分子偶联。
在分区之前,所述细胞可以与标记剂的库一起孵育,所述标记剂可以是针对不同细胞特征(例如,受体、蛋白质等)的大组的标记剂,并且其包括其缔合的报告寡核苷酸。未结合的标记剂可以从细胞被洗涤,然后所述细胞可以与如本文别处所述的分区特异性条形码寡核苷酸(例如,附接到支持物,如珠粒或凝胶珠粒)一起共分区(例如,至液滴或孔中)。因此,分区可以包括一个或多个细胞,以及结合的标记剂及其缔合的已知的报告寡核苷酸。
在其他情况下,例如,为了促进样品多重化,对特定细胞特征具有特异性的标记剂可以具有与第一报告寡核苷酸偶联的第一多个标记剂(例如,抗体或亲脂部分)以及与第二报告寡核苷酸偶联的第二多个标记剂。例如,第一多个标记剂和第二多个标记剂可以与不同细胞、细胞群或样品相互作用,从而允许特定报告寡核苷酸指示特定细胞群(或细胞或样品)和细胞特征。以此方式,不同的样品或组可以被独立处理,随后合并在一起用于合并分析(例如,如本文别处所述的基于分区的条形码化)。参见例如,美国专利公开20190323088,其出于所有目的通过引用以其整体特此并入。
如本文别处所述,标记剂的库可以与特定细胞特征相关,以及用于将分析物鉴定为源自特定细胞群或样品。细胞群可以与多个库一起孵育,使得一个或多个细胞包含多种标记剂。例如,细胞可以包含与其偶联的亲脂标记剂和抗体。亲脂标记剂可以表明细胞是特定细胞样品的成员,而抗体可以表明细胞包含特定分析物。以此方式,报告寡核苷酸和标记剂可以允许进行多分析物、多重化分析。
在一些情况下,这些报告寡核苷酸可以包含允许鉴定与报告寡核苷酸偶联的标记剂的核酸条形码序列。使用寡核苷酸作为报告物可以提供以下优点:能够生成在序列方面的显著多样性,同时还可容易地附接到大多数生物分子例如抗体等,以及易于被检测,例如,使用测序或阵列技术。
报告寡核苷酸与标记剂的附接(偶联)可以通过多种直接或间接、共价或非共价缔合或附接中的任一种来实现。例如,可以使用化学缀合技术(例如,可从InnovaBiosciences获得的抗体标记试剂盒)以及其他非共价附接机制,例如,使用生物素化的抗体和具有抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白接头的寡核苷酸(或包括一个或多个与寡核苷酸偶联的生物素化接头的珠粒),将寡核苷酸共价附接到标记剂(如蛋白质,例如抗体或抗体片段)的一部分。抗体和寡核苷酸生物素化技术是可用的。参见例如,Fang等人,“Fluoride-Cleavable Biotinylation Phosphoramidite for 5′-end-Labelling and Affinity Purification of Synthetic Oligonucleotides,”NucleicAcids Res.2003年1月15日;31(2):708-715,其出于所有目的通过引用以其整体并入本文。同样,蛋白质和肽生物素化技术已经被开发并且可易于获得。参见例如,美国专利号6,265,552,其出于所有目的通过引用以其整体并入本文。此外,点击反应化学如甲基四嗪-PEG5-NHS酯反应、TCO-PEG4-NHS酯反应等可以用于将报告寡核苷酸与标记剂偶联。市售试剂盒如来自Thunderlink和Abcam的那些以及本领域中常用的技术可以视情况用于将报告寡核苷酸与标记剂偶联。在另一例子中,标记剂间接(例如,经由杂交)与包含鉴定标记剂的条形码序列的报告寡核苷酸偶联。例如,标记剂可以直接与包含与报告寡核苷酸序列杂交的序列的杂交寡核苷酸偶联(例如,共价偶联)。杂交寡核苷酸与报告寡核苷酸的杂交将标记剂与报告寡核苷酸偶联。在一些实施方案中,报告寡核苷酸是可从标记剂释放的,如在施加刺激后。例如,报告寡核苷酸可以经由不稳定键(例如,化学不稳定、光不稳定、热不稳定等)附接到标记剂,如本文别处针对从支持物释放分子所大体描述。在一些情况下,本文所述的报告寡核苷酸可以包括可以用于后续处理中的一个或多个功能序列,如衔接子序列、唯一分子标识符(UMI)序列、测序仪专用流动池附接序列(如P5、P7或者部分P5或P7序列)、引物或引物结合序列、测序引物或引物结合序列(如R1、R2或者部分R1或R2序列)。
在一些情况下,标记剂可以包含报告寡核苷酸和标记。标记可以是荧光团、放射性同位素、能够进行比色反应的分子、磁性颗粒或能够检测的任何其他合适的分子或化合物。标记可以直接或间接缀合到标记剂(或报告寡核苷酸)(例如,标记可以缀合到可结合标记剂或报告寡核苷酸的分子)。在一些情况下,标记缀合到与报告寡核苷酸的序列互补的寡核苷酸,并且所述寡核苷酸可以被允许与报告寡核苷酸杂交。
图19描述了包含附接到其的报告寡核苷酸(1940)的示例性标记剂(1910、1920、1930)。标记剂1910(例如,任何本文所述的标记剂)附接(直接地,例如共价附接,或间接地)到报告寡核苷酸1940。报告寡核苷酸1940可以包含鉴定标记剂1910的条形码序列1942。报告寡核苷酸1940还可以包含可以用于后续处理中的一个或多个功能序列1943,如衔接子序列、唯一分子标识符(UMI)序列、测序仪专用流动池附接序列(如P5、P7或者部分P5或P7序列)、引物或引物结合序列或者测序引物或引物结合序列(如R1、R2或者部分R1或R2序列)。
参考图19,在一些情况下,缀合到标记剂(例如,1910、1920、1930)的报告寡核苷酸1940包含引物序列1941、鉴定标记剂(例如,1910、1920、1930)的条形码序列1942和功能序列1943。功能序列1943可以被配置为与互补序列杂交,如核酸条形码分子1990(未显示)上存在的互补序列,如本文别处所述的那些。在一些情况下,核酸条形码分子1990附接到支持物(例如,珠粒,如凝胶珠粒),如本文别处所述的那些。例如,核酸条形码分子1990可以经由可释放连接(例如,包括不稳定键)附接到支持物,如本文别处所述的那些。在一些情况下,报告寡核苷酸1940包含一个或多个另外的功能序列,如上文所述的那些。
在一些情况下,标记剂1910是包含报告寡核苷酸1940的蛋白质或多肽(例如,抗原或预期抗原)。报告寡核苷酸1940包含鉴定多肽1910并且可以用于推知分析物(例如,多肽1910的结合配偶体(即,多肽1910可以结合的分子或化合物))的存在的条形码序列1942。在一些情况下,标记剂1910是包含报告寡核苷酸1940的亲脂部分(例如,胆固醇),其中选择所述亲脂部分使得标记剂1910整合至细胞膜或细胞核中。报告寡核苷酸1940包含鉴定亲脂部分1910的条形码序列1942,所述条形码序列在一些情况下用于对细胞(例如,细胞组、细胞样品等)加标签并且可以用于如本文别处所述的多重分析。在一些情况下,标记剂是包含报告寡核苷酸1940的抗体1920(或其表位结合片段)。报告寡核苷酸1940包含鉴定抗体1920并且可以用于推知例如抗体1920的靶标(即,抗体1920结合的分子或化合物)的存在的条形码序列1942。在其他实施方案中,标记剂1930包含含有肽1932的MHC分子1931和鉴定肽1932的报告寡核苷酸1940。在一些情况下,MHC分子与支持物1933偶联。在一些情况下,支持物1933可以是多肽如链霉抗生物素蛋白,或多糖如葡聚糖。在一些情况下,报告寡核苷酸1940可以以任何合适的方式直接或间接与MHC标记剂1930偶联。例如,报告寡核苷酸1940可以与MHC分子1931、支持物1933或肽1932偶联。在一些实施方案中,标记剂1930包含多个MHC分子,例如MHC多聚体,其可以与支持物(例如,1933)偶联。可以与本文所公开的组合物、方法和系统一起使用的I类和/或II类MHC多聚体存在许多可能的构型,例如,MHC四聚体、MHC五聚体(经由卷曲螺旋结构域组装的MHC,例如,MHC I类五聚体(ProImmune,Ltd.))、MHC八聚体、MHC十二聚体、MHC修饰的葡聚糖分子(例如,MHC(Immudex))等。对于示例性标记剂(包括抗体和基于MHC的标记剂)、报告寡核苷酸和使用方法的描述,参见例如,美国专利10,550,429和美国专利公开20190367969,其各自出于所有目的通过引用以其整体并入本文。
图20说明携带条形码的珠粒的另一例子。在一些实施方案中,对多种分析物(例如,RNA和使用本文所述的标记剂的一种或多种分析物)的分析可以包括如图20中大体描绘的核酸条形码分子。在一些实施方案中,核酸条形码分子2010和2020经由如本文别处所述的可释放连接2040(例如,包含不稳定键)附接到支持物2030。核酸条形码分子2010可以包含衔接子序列2011、条形码序列2012和衔接子序列2013。核酸条形码分子2020可以包含衔接子序列2021、条形码序列2012和衔接子序列2023,其中衔接子序列2023包括与衔接子序列2013不同的序列。在一些情况下,衔接子2011和衔接子2021包含相同序列。在一些情况下,衔接子2011和衔接子2021包含不同序列。尽管显示支持物2030包含核酸条形码分子2010和2020,但在本文中考虑包含共有条形码序列2012的任何合适数量的条形码分子。例如,在一些实施方案中,支持物2030还包含核酸条形码分子2050。核酸条形码分子2050可以包含衔接子序列2051、条形码序列2012和衔接子序列2053,其中衔接子序列2053包含与衔接子序列2013和2023不同的序列。在一些情况下,核酸条形码分子(例如,2010、2020、2050)包含一个或多个另外的功能序列,如UMI或本文所述的其他序列。核酸条形码分子2010、2020或2050可以与如本文别处所述的分析物相互作用,例如,如图21A-21C中所描绘。
参考图21A,在细胞被标记剂标记的情况下,序列2123可以与报告寡核苷酸的衔接子序列互补。细胞可以与一个或多个报告寡核苷酸2110缀合的标记剂2120(例如,多肽、抗体或本文别处所述的其他)接触。在一些情况下,细胞可以在条形码化之前被进一步处理。例如,这样的处理步骤可以包括一个或多个洗涤和/或细胞分选步骤。在一些情况下,与缀合到报告寡核苷酸2110和包含核酸条形码分子2190的支持物2130(例如,珠粒,如凝胶珠粒)的标记剂2120结合的细胞被分区至多个分区(例如,液滴乳液的液滴或微孔阵列的孔)中的分区中。在一些情况下,所述分区包含结合标记剂2120的至多一个细胞。在一些情况下,缀合到标记剂2120(例如,多肽、抗体、pMHC分子如MHC多聚体等)的报告寡核苷酸2110包含第一衔接子序列2111(例如,引物序列)、鉴定标记剂2120(例如,多肽、抗体或者pMHC分子的肽或复合物)的条形码序列2112和衔接子序列2113。衔接子序列2113可以被配置为与互补序列(如核酸条形码分子2190上存在的序列2123)杂交。在一些情况下,寡核苷酸2110包含一个或多个另外的功能序列,如本文别处所述的那些。
条形码化核酸可以由图21A-21C中描述的构建体产生(例如,经由核酸反应,如核酸延伸或连接)。例如,序列2113然后可以与互补序列2123杂交以产生(例如,经由核酸反应,如核酸延伸或连接)包含细胞(例如,分区特异性)条形码序列2122(或其反向互补序列)和报告序列2112(或其反向互补序列)的条形码化核酸分子。条形码化核酸分子然后可以如本文别处所述任选地被处理,例如,以扩增所述分子和/或将测序平台专用序列附加到所述片段。参见例如,美国专利公开2018/0105808,其出于所有目的通过引用以其整体特此并入。条形码化核酸分子或从其生成的衍生物然后可以在合适的测序平台上进行测序。
在一些情况下,可以进行对多种分析物(例如,使用本文所述标记剂的核酸和一种或多种分析物)的分析。例如,工作流可以包括如图21A-21C中的任一者大体描绘的工作流或用于单独分析物的工作流的组合,如本文别处所述。例如,通过使用如图21A-21C中大体描绘的工作流的组合,可以分析多种分析物。
在一些情况下,对分析物(例如核酸、多肽、碳水化合物、脂质等)的分析包括如图21A中大体描绘的工作流。核酸条形码分子2190可以与一种或多种分析物一起共分区。在一些情况下,核酸条形码分子2190附接到支持物2130(例如,珠粒,如凝胶珠粒),如本文别处所述的那些。例如,核酸条形码分子2190可以经由可释放连接2140(例如,包含不稳定键)附接到支持物2130,如本文别处所述的那些。核酸条形码分子2190可以包含条形码序列2121,并且任选地包含其他另外的序列,例如UMI序列2122(或本文别处描述的其他功能序列)。核酸条形码分子2190可以包含可能与另一核酸序列互补的序列2123,使得其可以与特定序列杂交。
例如,序列2123可以包含多聚T序列并且可以用于与mRNA杂交。参考图21C,在一些实施方案中,核酸条形码分子2190包含与来自细胞的RNA分子2160的序列互补的序列2123。在一些情况下,序列2123包含对RNA分子具有特异性的序列。序列2123可以包含已知或靶向序列或随机序列。在一些情况下,可以进行核酸延伸反应,从而生成条形码化的核酸产物,其包含序列2123、条形码序列2121、UMI序列2122、任何其他功能序列以及对应于RNA分子2160的序列。
在另一例子中,序列2123可以与单链突出端或已经附加到分析物的衔接子序列互补。例如,参考图21B,在一些实施方案中,引物2150包含与来自分析物载体的核酸分子2160(如编码BCR序列的RNA)的序列互补的序列。在一些情况下,引物2150包含与RNA分子2160不互补的一个或多个序列2151。序列2151可以是如本文别处所述的功能序列,例如,衔接子序列、测序引物序列或促进与测序仪的流动池偶联的序列。在一些情况下,引物2150包含多聚T序列。在一些情况下,引物2150包含与RNA分子中的靶序列互补的序列。在一些情况下,引物2150包含与免疫分子的区域(如TCR或BCR序列的恒定区)互补的序列。引物2150与核酸分子2160杂交并生成互补分子2170。例如,互补分子2170可以是在逆转录反应中生成的cDNA。在一些情况下,另外的序列可以附加到互补分子2170。例如,可以选择逆转录酶使得几个未模板化的碱基2180(例如,多聚C序列)附加到cDNA。在另一例子中,末端转移酶也可以用于附加另外的序列。核酸条形码分子2190包含与未模板化的碱基互补的序列2124,并且逆转录酶进行模板转换反应至核酸条形码分子2190上,以生成包含细胞(例如,分区特异性)条形码序列2122(或其反向互补体)和互补分子2170(或其部分)的序列的条形码化核酸分子。在一些情况下,序列2123包含与免疫分子的区域(如TCR或BCR序列的恒定区)互补的序列。序列2123与核酸分子2160杂交并且生成互补分子2170。例如,互补分子2170可以在逆转录反应中生成,所述逆转录反应生成包含细胞(例如,分区特异性)条形码序列2122(或其反向互补序列)和互补分子2170(或其部分)的序列的条形码化核酸分子。适合于条形码化从mRNA转录物(包括编码免疫细胞受体的V(D)J区域的那些)生成的cDNA的另外的方法和组合物和/或包括模板转换寡核苷酸的条形码化方法和组合物描述于国际专利申请WO2018/075693、美国专利公开号2018/0105808、2015年6月26日提交的美国专利公开号2015/0376609、以及美国专利公开号2019/0367969中,其各自出于所有目的通过引用以其整体并入本文。
珠粒
分区可以包含一个或多个唯一标识符,如条形码。条形码可以被预先、随后或同时递送到分区,这些分区容纳被区室化或被分区的生物颗粒。例如,条形码可以在液滴产生之前、之后或同时注射到液滴中。将条形码递送到特定分区允许以后将单个生物颗粒的特征归属于特定分区。条形码可以例如在核酸分子(例如寡核苷酸)上经由任何合适的机制被递送到分区。条形码化核酸分子可以经由微胶囊递送到分区。在一些情况下,微胶囊可以包含珠粒。下面将进一步详细描述珠粒。
在一些情况下,条形码化核酸分子最初可以与微胶囊缔合,然后从微胶囊中释放出来。条形码化核酸分子的释放可以是被动的(例如,通过扩散出微胶囊)。此外或可替代地,微胶囊的释放可以在施加刺激时进行,所述刺激允许条形码化核酸分子从微胶囊解离或释放。这种刺激可能破坏微胶囊,这种相互作用将条形码化核酸分子偶联到微胶囊上或微胶囊内,或者两种情况兼而有之。这种刺激可以包括,例如,热刺激、光刺激、化学刺激(例如,改变pH或使用一种或多种还原剂)、机械刺激、辐射刺激、生物刺激(例如酶)、或其任意组合。用于将携带条形码的珠粒分区到液滴中的方法和系统提供在美国专利公开号2019/0367997和2019/0064173、以及国际申请号PCT/US2015/025197、PCT/US2020/017785和PCT/US2020/020486中,其各自出于所有目的通过引用以其整体并入本文。
图2示出了用于将携带条形码的珠粒递送到液滴的微流体通道结构200的例子。通道结构200可以包括在通道交汇点210处连通的通道区段201、202、204、206和208。在操作中,通道区段201可以沿着通道区段201将包括多个珠粒214(例如,具有核酸分子、寡核苷酸、分子标签)的水性流体212输送到交汇点210。所述多个珠粒214可以来源于珠粒的悬浮液。例如,通道区段201可以连接到包含珠粒214的水性悬浮液的储器。通道区段202可以将包括多个生物颗粒216的水性流体212沿着通道区段202输送到交汇点210。所述多个生物颗粒216可以来源于生物颗粒的悬浮液。例如,通道区段202可以连接到包含生物颗粒216的水性悬浮液的储器。在一些情况下,第一通道区段201或第二通道区段202或两个通道区段中的水性流体212可以包括一种或多种试剂,如下文进一步描述的。与水性流体212不混溶的第二流体218(例如油)可以从通道区段204和206中的每一个递送到交汇点210。当来自通道区段201和202中的每一个区段的水性流体212和来自通道区段204和206中的每一个区段的第二流体218在通道交汇点210处相遇时,水性流体212可以在第二流体218中被分区成离散的液滴220,并沿着通道区段208从交汇点210流出。通道区段208可以将离散的液滴递送到与通道区段208流体联接的出口储器,在那里液滴可以被收获。
作为替代,通道区段201和202可以在交汇点210上游的另一个交汇点处相遇。在这样的交汇点处,珠粒和生物颗粒可以形成混合物,所述混合物沿着另一个通道被引导到交汇点210以产生液滴220。所述混合物可以以交替方式提供珠粒和生物颗粒,使得例如液滴包含单个珠粒和单个生物颗粒。
在一些例子中,珠粒、生物颗粒和液滴可以沿通道(例如,微流体装置的通道)流动。珠粒、生物颗粒和液滴可以以基本上规则的流动曲线(例如,以规则的流速)沿着通道流动。这种规则的流动曲线可以允许液滴包括单个珠粒和单个生物颗粒。这种规则的流动曲线可以允许液滴的占据率(例如,具有珠粒和生物颗粒的液滴)大于5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%。例如,在美国专利公开号2015/0292988中提供了这种规律的流动曲线和可以用于提供这种规律的流动曲线的设备,该文献通过引用以其整体并入本文。
第二流体218可以包括油,例如氟化油,其包括用于稳定所得液滴的含氟表面活性剂,例如,抑制所得液滴220的后续聚结。
产生的离散液滴可以包括单个生物颗粒216。产生的离散液滴可以包括携带条形码或其他试剂的珠粒214。产生的离散液滴可以包括单个生物颗粒和携带条形码的珠粒,例如液滴220。在一些情况下,离散的液滴可以包括多于一个单独的生物颗粒或者不包括生物颗粒。在一些情况下,离散的液滴可以包括多于一个珠粒或者不包括珠粒。离散的液滴可以是未被占据的(例如,没有珠粒,没有生物颗粒)。
有益的是,对生物颗粒和携带条形码的珠粒的离散液滴进行分区可以有效地将条形码归属于分区内生物颗粒的大分子成分。分区中的内容物可以与其他分区的内容物保持离散状态。
可以理解的是,本文所述的通道区段可以连接到多种不同的流体源或接收部件中的任何一种,包括储器、管道、歧管或其他系统的流体部件。可以理解,微流体通道结构200可以具有其他几何形状。例如,微流体通道结构可以具有多于一个通道交汇点。例如,微流体通道结构可以具有2、3、4或5个通道区段,每个通道区段携带在通道交汇点相遇的珠粒。流体可以经由一个或多个流体流动单元沿着一个或多个通道或储器被引导流动。流体流动单元可以包括压缩机(例如,提供正压)、泵(例如,提供负压)、致动器等来控制流体的流动。流体也可以或以其他方式经由施加的压差、离心力、电动泵送、真空、毛细管或重力流等来控制。
珠粒可以是多孔的、无孔的、固体的、半固体的、半流体的、流体的和/或其组合。在一些情况下,珠粒可以是可溶解的、可破裂的和/或可降解的。在一些情况下,珠粒可能不可降解。在一些情况下,珠粒可以是凝胶珠粒。凝胶珠粒可以是水凝胶珠粒。凝胶珠粒可以由分子前体(例如聚合物或单体物质)形成。半固体珠粒可以是脂质体珠粒。固体珠粒可以包括金属,包括氧化铁、金和银。在一些情况下,珠粒可以是二氧化硅珠粒。在一些情况下,珠粒可以是刚性的。在其他情况下,珠粒可以是柔性的和/或可压缩的。
珠粒可以是任何合适的形状。珠粒形状的例子包括但不限于球形、非球形、椭圆形、长方形、无定形、圆形、圆柱形及其变体。
珠粒可以是均匀尺寸或不均匀尺寸。在一些情况下,珠粒的直径可以是至少约10纳米(nm)、100nm、500nm、1微米(μm)、5μm、10μm、20μm、30μm、40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm、100μm、250μm、500μm、1mm或更大。在一些情况下,珠粒的直径可以小于约10nm、100nm、500nm、1μm、5μm、10μm、20μm、30μm、40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm、100μm、250μm、500μm、1mm或更小。在一些情况下,珠粒的直径可以在约40-75μm、30-75μm、20-75μm、40-85μm、40-95μm、20-100μm、10-100μm、1-100μm、20-250μm或20-500μm的范围内。
在某些方面,珠粒可以作为具有相对单分散大小分布的珠粒群体或多个珠粒来提供。在可能期望在分区内提供相对一致的量的试剂的情况下,维持相对一致的珠粒特征如尺寸可以有助于整体的一致性。特别地,本文所述的珠粒可以具有尺寸分布,其截面尺寸的变化系数小于50%、小于40%、小于30%、小于20%,并且在一些情况下小于15%、小于10%、小于5%或更小。
珠粒可以包含天然和/或合成材料。例如,珠粒可以包含天然聚合物、合成聚合物或同时包括天然和合成聚合物。天然聚合物的例子包括蛋白质和糖,例如脱氧核糖核酸、橡胶、纤维素、淀粉(例如直链淀粉、支链淀粉)、蛋白质、酶、多糖、丝绸、聚羟基链烷酸酯、壳聚糖、葡聚糖、胶原蛋白、角叉菜胶、洋车前子纤维、阿拉伯胶、琼脂、明胶、虫胶、刺梧桐胶、黄原胶、玉米糖胶、瓜尔豆胶、卡拉胶、琼脂糖、藻酸、藻酸盐、或其天然聚合物。合成聚合物的例子包括丙烯酸类、尼龙、硅酮、氨纶、粘胶人造丝、聚羧酸、聚乙酸乙烯酯、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸酯、聚乙二醇、聚氨酯、聚乳酸、二氧化硅、聚苯乙烯、聚丙烯腈、聚丁二烯、聚碳酸酯、聚乙烯、聚对苯二甲酸乙二酯、聚(氯三氟乙烯)、聚(环氧乙烷)、聚(对苯二甲酸乙二酯)、聚乙烯、聚异丁烯、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(氧亚甲基)、聚甲醛、聚丙烯、聚苯乙烯、聚(四氟乙烯)、聚(乙酸乙烯酯)、聚(乙烯醇)、聚(氯乙烯)、聚(偏二氯乙烯)、聚(偏二氟乙烯)、聚(氟乙烯)和/或其组合(例如,共聚物)。珠粒也可以由聚合物以外的材料形成,包括脂质、胶束、陶瓷、玻璃陶瓷、材料复合物、金属、其他无机材料等。
在一些情况下,珠粒可以含有分子前体(例如,单体或聚合物),其可以经由分子前体的聚合形成聚合物网络。在一些情况下,前体可以是能够通过例如化学交联进行进一步聚合的已经聚合的物质。在一些情况下,前体可以包括丙烯酰胺或甲基丙烯酰胺单体、低聚物或聚合物中的一种或多种。在一些情况下,珠粒可以包括预聚物,其是能够进一步聚合的低聚物。例如,聚氨酯珠粒可以使用预聚物制备。在一些情况下,珠粒可以含有可进一步聚合在一起的单独的聚合物。在一些情况下,珠粒可以经由不同前体的聚合产生,使得它们包含混合的聚合物、共聚物、和/或嵌段共聚物。在一些情况下,珠粒可以包含聚合物前体(例如单体、低聚物、线性聚合物)、核酸分子(例如寡核苷酸)、引物和其他实体之间的共价键或离子键。在一些情况下,共价键可以是碳-碳键、硫醚键或碳-杂原子键。
交联可以是永久性的或可逆的,这取决于所用的特定交联剂。可逆交联可以允许聚合物在适当的条件下线性化或解离。在一些情况下,可逆交联也可以允许结合到珠粒表面的物质的可逆附接。在一些情况下,交联剂可以形成二硫化物连接。在一些情况下,形成二硫化物连接的化学交联剂可以是胱胺或改性的胱胺。
在一些情况下,可以在分子前体单元(例如,单体、低聚物或线性聚合物)或掺入到珠粒和核酸分子(例如,寡核苷酸)中的前体之间形成二硫化物连接。例如,胱胺(包括改性的胱胺)是包含二硫键的有机试剂,其可用作珠粒的单个单体或聚合物前体之间的交联剂。聚丙烯酰胺可以在胱胺或包含胱胺的物质(例如,改性的胱胺)的存在下聚合,以生成包含二硫化物连接的聚丙烯酰胺凝胶珠粒(例如,包括化学可还原交联剂的化学可降解珠粒)。二硫化物连接可允许珠粒在暴露于还原剂时降解(或溶解)。
在一些情况下,壳聚糖(一种线性多糖聚合物)可以经由亲水链与戊二醛交联形成珠粒。壳聚糖聚合物的交联可以通过由热、压力、pH变化和/或辐射引发的化学反应来实现。
在一些情况下,珠粒可以包含acrydite部分,其在一些方面可以用于将一个或多个核酸分子(例如,条形码序列、条形码化核酸分子、条形码化寡核苷酸、引物或其他寡核苷酸)附接到珠粒上。在一些情况下,acrydite部分可以指由acrydite与一种或多种物质的反应产生的acrydite类似物,例如在聚合反应期间acrydite与其他单体和交联剂的反应。acrydite部分可以被修饰以与待附接的物质形成化学键,例如核酸分子(例如,条形码序列、条形码化核酸分子、条形码化寡核苷酸、引物、或其他寡核苷酸)。acrydite部分可以用能够形成二硫键的硫醇基团修饰,或者可以用已经包括二硫键的基团修饰。硫醇或二硫化物(通过二硫化物交换)可用作待附接物质的锚定点,或者acrydite部分的另一部分可用于附接。在一些情况下,附接可以是可逆的,使得当二硫键断裂时(例如,在还原剂的存在下),附接的物质从珠粒中释放。在其他情况下,acrydite部分可以包含可用于附接的反应性羟基。
用于附接核酸分子(例如寡核苷酸)的珠粒的官能化可以通过各种不同的方法实现,包括激活聚合物中的化学基团、在聚合物结构中掺入活性或可激活的官能团、或者在珠粒生产的预聚合物或单体阶段进行附接。
例如,聚合形成珠粒的前体(例如,单体、交联剂)可以包含acrydite部分,使得当珠粒产生时,珠粒也包含acrydite部分。acrydite部分可以附接到核酸分子(例如,寡核苷酸),所述核酸分子可以包括引发序列(例如,用于扩增靶核酸的引物、随机引物、用于信使RNA的引物序列)和/或一个或多个条形码序列。所述一个或多个条形码序列可以包括与给定珠粒偶联的所有核酸分子相同的序列和/或与给定珠粒偶联的所有核酸分子不同的序列。核酸分子可以被掺入到珠粒中。
在一些情况下,核酸分子可以包含功能序列,例如,用于附接到测序流动池,例如,用于测序的P5序列。在一些情况下,核酸分子或其衍生物(例如,从核酸分子产生的寡核苷酸或多核苷酸)可以包含另一种功能序列,例如,用于附接到用于Illumina测序的测序流动池的P7序列。在一些情况下,核酸分子可以包含条形码序列。在一些情况下,引物还可以包含唯一分子标识符(UMI)。在一些情况下,引物可以包含用于Illumina测序的R1引物序列。在一些情况下,引物可以包含用于Illumina测序的R2引物序列。这种核酸分子(例如,寡核苷酸、多核苷酸等)的例子及其用途(如可与本公开文本的组合物、设备、方法和系统一起使用)的例子在美国专利公开号2014/0378345和2015/0376609中提供,其各自通过引用以其整体并入本文。
图8说明携带条形码的珠粒的例子。核酸分子802(例如寡核苷酸)可以通过可释放的连接806(例如二硫化物接头)与珠粒804偶联。相同的珠粒804可以与一个或多个其他核酸分子818、820偶联(例如,经由可释放的连接)。核酸分子802可以是或包含条形码。如本文别处所述,条形码的结构可以包含多个序列元素。核酸分子802可以包含可用于后续处理的功能序列808。例如,功能序列808可以包括测序仪特异性流动池附接序列(例如,测序系统的P5序列)和测序引物序列(例如,测序系统的R1引物)中的一个或多个。核酸分子802可以包含条形码序列810,用于对样品(例如,DNA、RNA、蛋白质等)进行条形码标记。在一些情况下,条形码序列810可以是珠粒特异性的,使得条形码序列810对于与同一珠粒804偶联的所有核酸分子(例如,包括核酸分子802)是共同的。可替代地或另外地,条形码序列810可以是分区特异性的,使得条形码序列810对于与一个或多个被划分到相同分区中的珠粒偶联的所有核酸分子是共同的。核酸分子802可以包含特异性引发序列812,例如mRNA特异性引发序列(例如,多聚T序列)、靶向引发序列和/或随机引发序列。核酸分子802可以包含锚定序列814,以确保特异性引发序列812在序列末端(例如,mRNA的末端)杂交。例如,锚定序列814可以包括随机短核苷酸序列,如1聚体、2聚体、3聚体或更长的序列,这可以确保多聚T区段更有可能在mRNA的多聚A尾的序列末端处杂交。
核酸分子802可以包含唯一分子标识序列816(例如,唯一分子标识符(UMI))。在一些情况下,唯一分子标识序列816可以包含约5至约8个核苷酸。可替代地,唯一分子标识序列816可以包含少于约5个或多于约8个核苷酸。唯一分子标识序列816可以是在与单个珠粒(例如珠粒804)偶联的单个核酸分子(例如802、818、820等)之间变化的唯一序列。在一些情况下,唯一分子标识序列816可以是随机序列(例如,如随机的N-mer序列)。例如,UMI可以提供捕获的起始mRNA分子的唯一标识符,以便能够对原始表达的RNA的数量进行定量。可以理解,虽然图8示出了三个核酸分子802、818、820与珠粒804的表面偶联,但是单个珠粒可以与任意数量的单独的核酸分子偶联,例如从一个到几十到几十万甚至几百万个单独的核酸分子。单独的核酸分子的各自条形码可以包含共同的序列区段或相对共同的序列区段(例如,808、810、812等)以及与同一珠粒偶联的不同单独核酸分子之间的有差异的或独特的序列区段(例如816)。
在操作中,生物颗粒(例如细胞、DNA、RNA等)可以与带有条形码的珠粒804一起被共分区。条形码化核酸分子802、818、820可以从分区中的珠粒804释放。举例来说,在分析样品RNA的情况下,其中一个释放的核酸分子(如802)的多聚T区段(如812)可以与一个mRNA分子的多聚A尾杂交。逆转录可以产生mRNA的cDNA转录物,但是所述转录物包括核酸分子802的各序列区段808、810、816。因为核酸分子802包含锚定序列814,它将更有可能与mRNA的多聚A尾的序列末端杂交并引发逆转录。在任何给定的分区内,单个mRNA分子的所有cDNA转录物可以包括共同的条形码序列区段810。然而,由给定分区内的不同mRNA分子制成的转录物可能在唯一分子标识序列812区段(例如,UMI区段)上有所不同。有益的是,甚至在给定分区的内容物的任何后续扩增之后,不同UMI的数量可以指示源自给定分区并因此源自生物颗粒(例如细胞)的mRNA的数量。如上所述,转录物可以被扩增、清理和测序,以鉴定mRNA的cDNA转录物的序列,以及对条形码区段和UMI区段进行测序。虽然描述了多聚T引物序列,但其他靶向或随机引发序列也可用于引发逆转录反应。同样,尽管被描述为将条形码化寡核苷酸释放到分区中,但在一些情况下,结合到珠粒(例如凝胶珠粒)上的核酸分子可以用于杂交并捕获珠粒固相上的mRNA,例如,以便于从其他细胞内容物中分离出RNA。在这样的情况下,可以在分区中或在分区外部(例如,批量)进行进一步处理。例如,珠上的RNA分子可以经历逆转录或其他核酸处理,另外的衔接子序列可以被添加到条形码化核酸分子,或者可以进行其他核酸反应(例如,扩增、核酸延伸)。珠粒或其产物(例如,条形码化核酸分子)可以从分区被收集,和/或合并在一起并且随后经历清理和进一步表征(例如,测序)。
本文所述的操作可以在任何有用的或便利的步骤进行。例如,包含核酸条形码分子的珠粒可以在将样品引入分区中之前、期间或之后被引入分区(例如,孔或液滴)中。样品的核酸分子可以经历条形码化,其可以在珠粒上进行(在核酸分子保持偶联到珠粒的情况下)或者在将核酸条形码分子释放至分区中之后进行。在来自样品的核酸分子保持附接到珠粒的情况下,来自各个分区的珠粒可以被收集、合并并经历进一步处理(例如,逆转录、衔接子附接、扩增、清理、测序)。在其他情况下,所述处理可以在分区中进行。例如,足以用于条形码化、衔接子附接、逆转录或其他核酸处理操作的条件可以在分区中提供并且在清理和测序之前进行。
在一些情况下,珠粒可以包含配置为结合到相应捕获序列或结合序列的捕获序列或结合序列。在一些情况下,珠粒可以包含配置为结合到不同的各自相应的捕获序列或结合序列的多个不同的捕获序列或结合序列。例如,珠粒可以包含各自配置为结合到第一相应捕获序列的一个或多个捕获序列的第一子集、各自配置为结合到第二相应捕获序列的一个或多个捕获序列的第二子集、各自配置为结合到第三相应捕获序列的一个或多个捕获序列的第三子集等。珠粒可以包含任何数量的不同捕获序列。在一些情况下,珠粒可以包含配置为分别结合到不同的各自的捕获序列或结合序列的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个不同捕获序列或结合序列。可替代地或另外地,珠粒可以包含配置为结合到不同的各自的捕获序列或结合序列的至多约10、9、8、7、6、5、4、3或2个不同捕获序列或结合序列。在一些情况下,不同捕获序列或结合序列可以配置为促进对相同类型的分析物的分析。在一些情况下,不同捕获序列或结合序列可以配置为促进对不同类型的分析物(使用同一珠粒)的分析。捕获序列可以设计为附接到相应捕获序列。有益地,这样的相应捕获序列可以被引入生物颗粒(例如,细胞、细胞珠等)中或以其他方式在所述生物颗粒中被诱导,用于以各种形式(例如,包含相应捕获序列的条形码化的抗体、包含相应捕获序列的条形码化的MHCdextramer、包含相应捕获序列的条形码化的指导RNA分子等)进行不同测定,使得相应捕获序列随后可以与和珠粒缔合的捕获序列相互作用。在一些情况下,与珠粒(或其他支持物)偶联的捕获序列可以配置为附接到接头分子如夹板分子,其中所述接头分子配置为通过所述接头分子将珠粒(或其他支持物)与其他分子偶联,如与一种或多种分析物或一种或多种其他接头分子偶联。
图9说明携带条形码的珠粒的另一例子。核酸分子905(例如寡核苷酸)可以通过可释放的连接906(例如二硫化物接头)与珠粒904偶联。核酸分子905可以包含第一捕获序列960。同一珠粒904可以与包含其他捕获序列的一个或多个其他核酸分子903、907偶联(例如,经由可释放的连接)。核酸分子905可以是或包含条形码。如本文别处所述,条形码的结构可以包含多个序列元件,如功能序列908(例如,流动池附接序列、测序引物序列等)、条形码序列910(例如,与珠粒共有的珠粒特异性序列、与分区共有的分区特异性序列等)以及唯一分子标识符912(例如,附接到珠的不同分子内的唯一序列)或其部分序列。捕获序列960可以被配置为附接到相应捕获序列965。在一些情况下,相应捕获序列965可以与可作为分析物或中间载体的另一分子偶联。例如,如图9中所说明,相应捕获序列965与包含靶序列964的指导RNA分子962偶联,其中靶序列964配置为附接到分析物。附接到珠粒904的另一寡核苷酸分子907包含第二捕获序列980,其配置为附接到第二相应捕获序列985。在图9中所说明,第二相应捕获序列985与抗体982偶联。在一些情况下,抗体982可以具有对分析物(例如,表面蛋白)的结合特异性。可替代地,抗体982可以不具有结合特异性。附接到珠粒904的另一寡核苷酸分子903包含第三捕获序列970,其被配置为附接到第二相应捕获序列975。如图9中所说明,第三相应捕获序列975与分子972偶联。分子972可以配置为或可以不配置为靶向分析物。其他寡核苷酸分子903、907可以包含关于寡核苷酸分子905所述的其他序列(例如,功能序列、条形码序列、UMI等)。尽管在图9中说明包含每个捕获序列的单一寡核苷酸分子,但应理解,对于每个捕获序列,珠粒可以包含各自含有捕获序列的一个或多个寡核苷酸分子的组。例如,珠粒可以包含任何数量的一个或多个不同捕获序列的组。可替代地或另外地,珠粒904可以包含其他捕获序列。可替代地或另外地,珠粒904可以包含更少类型的捕获序列(例如,两种捕获序列)。可替代地或另外地,珠粒904可以包含含有引发序列(如特异性引发序列,如mRNA特异性引发序列(例如,多聚T序列)、靶向引发序列和/或随机引发序列)的一个或多个寡核苷酸分子,例如,以促进对基因表达的测定。
在操作中,条形码化的寡核苷酸可以被释放(例如,在分区中),如本文别处所述。可替代地,结合到珠粒(例如,凝胶珠粒)的核酸分子可以用于杂交和捕获珠的固相上的分析物(例如,一种或多种类型的分析物)。
在一些情况下,包含具有反应性或能够被激活从而变得具有反应性的官能团的前体可以与其他前体聚合以产生包含激活或可激活官能团的凝胶珠粒。然后,所述官能团可用于将另外的物质(例如,二硫化物接头、引物、其他寡核苷酸等)附接到凝胶珠粒上。例如,一些包含羧酸(COOH)基团的前体可以与其他前体共聚,以形成也包含COOH官能团的凝胶珠粒。在一些情况下,丙烯酸(一种包含游离COOH基团的物质)、丙烯酰胺和双(丙烯酰)胱胺可以共聚在一起以产生包含游离COOH基团的凝胶珠粒。凝胶珠粒的COOH基团可以被活化(例如,经由1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)或4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物(DMTMM)),使得它们具有反应性(例如,在EDC/NHS或DMTMM用于活化的情况下对胺官能团具有反应性)。然后,活化的COOH基团可以与合适的物质(例如,包含胺官能团的物质,其中羧酸基团被活化以与胺官能团反应)反应,所述物质包含要连接到珠粒上的部分。
在其聚合物网络中包含二硫化物连接的珠粒可以经由将一些二硫化物连接还原成游离硫醇而用另外的物质官能化。二硫化物连接可以经由例如还原剂(例如,DTT、TCEP等)的作用被还原,以生成游离的硫醇基团,而不溶解珠粒。珠粒的游离硫醇然后可以与一种物质或包括另一种二硫键的物质的游离硫醇反应(例如,经由硫醇-二硫键交换),使得所述物质可以连接到珠粒上(例如,经由产生的二硫键)。在一些情况下,珠粒的游离硫醇可以与任何其他合适的基团反应。例如,珠粒的游离硫醇可以与包括acrydite部分的物质反应。珠粒的游离硫醇基团可以经由迈克尔加成化学反应与acrydite反应,使得包括acrydite的物质与珠粒连接。在一些情况下,通过加入硫醇封端剂,如N-乙基马来酰亚胺或碘乙酸盐,可以防止不受控制的反应。
可以控制珠粒内二硫化物连接的激活,使得只有少量二硫键被激活。例如,可以通过控制用于生成游离硫醇基团的还原剂的浓度和/或用于在珠粒聚合中形成二硫键的试剂的浓度来进行控制。在一些情况下,可以使用低浓度(例如,还原剂分子:凝胶珠粒的比率小于或等于约1:100,000,000,000,小于或等于约1:10,000,000,000,小于或等于约1:1,000,000,000,小于或等于约1:100,000,000,小于或等于约1:10,000,000,小于或等于约1:1,000,000,小于或等于约1:100,000,小于或等于约1:10,000)的还原剂进行还原。控制被还原成游离硫醇的二硫化物连接的数量可能有助于确保官能化过程中珠粒结构的完整性。在一些情况下,光学活性剂如荧光染料可以经由珠粒的游离硫醇基团与珠粒偶联,并用于定量珠粒中存在的游离硫醇的数量和/或跟踪珠粒。
在一些情况下,在凝胶珠粒形成后向凝胶珠粒添加部分可能是有利的。例如,在凝胶珠粒形成后添加寡核苷酸(例如条形码化寡核苷酸)可以避免在聚合过程中可能发生的链转移终止过程中物质的损失。此外,较小的前体(例如,不包含侧链基团和连接部分的单体或交联剂)可以用于聚合,并且由于粘性效应,可以最小程度地阻碍链端的生长。在一些情况下,凝胶珠粒合成后的官能化可以使负载潜在破坏剂(例如自由基)的物质(例如寡核苷酸)和/或化学环境的暴露最小化。在一些情况下,生成的凝胶可能具有最高临界溶解温度(UCST),所述温度可允许珠粒的温度驱动溶胀和塌陷。在随后用寡核苷酸官能化珠粒的过程中,这种功能可以帮助寡核苷酸(例如引物)渗入珠粒。生产后官能化也可用于控制珠粒中物质的负载率,使得例如负载率的可变性最小化。物质负载也可以在分批过程中进行,使得多个珠粒可以在单个批次中用所述物质官能化。
被注射或以其他方式引入分区的珠粒可以包含可释放地、可分裂地或可逆地附接的条形码。被注射或以其他方式引入分区的珠粒可以包含可激活的条形码。被注射或以其他方式引入分区的珠粒可以是可降解的、可破裂的或可溶解的珠粒。
条形码可以可释放地、可裂解地或可逆地附接到珠粒上,使得条形码可以通过切断条形码分子和珠粒之间的连接而被释放或可释放,或者通过下面的珠粒本身的降解而被释放,从而允许条形码被其他试剂接近或可被其他试剂接近,或者两种情况兼而有之。在非限制性实例中,可以通过二硫键的还原、限制性酶的使用、光活化切断、或经由其他类型的刺激(例如,化学、热、pH、酶等)的切断和/或反应来实现切断,如本文别处所述。可释放的条形码有时被称为可激活的,因为它们一旦被释放就可用于反应。因此,例如,可以通过从珠粒(或本文所述的其他合适类型的分区)中释放条形码来激活可激活的条形码。在所描述的方法和系统的上下文中,也可以设想其他可激活的配置。
另外地,或作为珠粒和所缔合分子(例如含有核酸分子的条形码(例如,条形码化寡核苷酸))之间的可切断连接的替代,珠粒可以是可降解的、可破裂的或可自发溶解的,或者在暴露于一种或多种刺激(例如,温度变化、pH变化、暴露于特定化学物质或相、暴露于光、还原剂等)时可溶解的。在一些情况下,珠粒可以是可溶解的,使得当暴露于特定的化学物质或环境变化(如温度变化或pH变化)时,珠粒的材料成分被溶解。在一些情况下,凝胶珠粒可以在高温和/或碱性条件下降解或溶解。在一些情况下,珠粒可以是可热降解的,使得当珠粒暴露于适当的温度变化(例如,热)时,珠粒降解。结合到物质(例如核酸分子,例如条形码化寡核苷酸)的珠粒的降解或溶解可能导致物质从珠粒中释放。
从上述公开文本中可以理解,珠粒的降解可以指结合的或夹带的物质从珠粒中解离,无论是否在结构上降解物理珠粒本身。例如,珠粒的降解可以包括经由本文别处描述的一种或多种物质和/或方法切断可切断的连接。在另一例子中,由于例如化学环境的变化,夹带的物质可以通过渗透压差从珠粒中释放出来。举例来说,由于渗透压差引起的珠粒孔尺寸的改变通常可以在珠粒本身没有结构劣化的情况下发生。在一些情况下,由于珠粒的渗透溶胀导致的孔径的增加可以允许珠粒内夹带物质的释放。在其他情况下,珠粒的渗透收缩可能由于孔径收缩导致珠粒更好地保留夹带的物质。
可降解珠粒可以被引入到分区中,例如乳液的液滴或孔中,使得当施加适当的刺激时,珠粒在分区中降解,并且任何相缔合的物质(例如寡核苷酸)在液滴中释放。游离物质(例如寡核苷酸、核酸分子)可以与分区中包括的其他试剂相互作用。例如,包含胱胺并经由二硫键连接到条形码序列的聚丙烯酰胺珠粒可以在油包水乳液的液滴中与还原剂结合。在液滴中,还原剂可以破坏各种二硫键,导致珠粒降解,并将条形码序列释放到液滴的水性内部环境中。在另一例子中,加热在碱性溶液中包含结合珠粒的条形码序列的液滴也可能导致珠粒降解和附接的条形码序列释放到液滴的水性内部环境中。
任何合适数量的分子标签分子(例如引物、条形码化寡核苷酸)可以与珠粒缔合,使得在从珠粒释放时,分子标签分子(例如引物,例如条形码化寡核苷酸)以预定浓度存在于分区中。这种的预定浓度可以选择成促进在分区内产生测序文库的某些反应,例如扩增。在一些情况下,引物的预定浓度可能受到生产带有核酸分子(例如寡核苷酸)的珠粒的过程的限制。
在一些情况下,珠粒可以非共价负载一种或多种试剂。珠粒可以通过例如以下方式来非共价负载:使珠粒经历足以使珠粒溶胀的条件,允许试剂有足够时间扩散至珠粒的内部,以及使珠粒经历足以使珠粒去溶胀的条件。珠粒的溶胀可以通过例如将珠粒置于热力学有利的溶剂中、使珠粒经受更高或更低的温度、使珠粒经受更高或更低的离子浓度、和/或使珠粒经受电场来实现。珠粒的溶胀可以通过各种溶胀方法来完成。珠粒的去溶胀可以通过例如将珠粒转移到热力学上不利的溶剂中、使珠粒经受较低或较高的温度、使珠粒经受较低或较高的离子浓度、和/或去除电场来实现。珠粒的去溶胀可以通过各种去溶胀方法来完成。转移珠粒可能导致珠粒中的孔收缩。收缩会阻碍珠粒内的试剂扩散出珠粒内部。阻碍可能是由于试剂和珠粒内部之间的空间相互作用。转移可以通过微流体完成。例如,转移可以通过将珠粒从一个同流溶剂流移动到不同的同流溶剂流来实现。珠粒的可溶胀性和/或孔径可以通过改变珠粒的聚合物组成来调节。
在一些情况下,连接到前体的acrydite部分、连接到前体的另一种物质或前体本身可以包含不稳定键,例如化学敏感的、热敏的或光敏的键,例如二硫键、UV敏感键等。一旦包含不稳定键的acrydite部分或其他部分被掺入到珠粒中,珠粒也可以包含不稳定键。不稳定键例如可以用于将物质(例如条形码、引物等)可逆连接(例如共价连接)到珠粒。在一些情况下,热不稳定键可以包括基于核酸杂交的附接,例如,其中寡核苷酸与附接到珠粒上的互补序列杂交,使得杂交体的热熔化从珠粒或微胶囊中释放寡核苷酸,例如含有条形码的序列。
向凝胶珠粒中添加多种类型的不稳定键可导致产生能够对各种刺激做出反应的珠粒。每种类型的不稳定键可能对相关的刺激(例如,化学刺激、光、温度、酶等)敏感,使得经由每个不稳定键附接到珠粒上的物质的释放可以通过施加适当的刺激来控制。这种功能可用于从凝胶珠粒中控制物质的释放。在一些情况下,包含不稳定键的另一种物质可以在凝胶珠粒形成后经由例如如上所述的凝胶珠粒的活化官能团连接到凝胶珠粒上。应当理解,可释放地、可裂解地或可逆地附接到本文所述珠粒上的条形码包括通过切断条形码分子和珠粒之间的连接而释放或可释放的条形码、或者通过下面的珠粒本身的降解而释放的条形码,从而允许条形码被其他试剂接近或可被其他试剂接近,或者两种情况兼而有之。
如本文所述的可释放的条形码有时可被称为可激活的,因为它们一旦被释放就可用于反应。因此,例如,可以通过从珠粒(或本文所述的其他合适类型的分区)中释放条形码来激活可激活的条形码。在所描述的方法和系统的上下文中,也可以设想其他可激活的配置。
除了可热切断的键、二硫键和UV敏感键之外,可与前体或珠粒偶联的不稳定键的其他非限制性例子包括酯连接(例如,可被酸、碱或羟胺切断)、邻二醇连接(例如,可经由高碘酸钠切断)、狄尔斯-阿尔德连接(例如,可经由热切断)、砜连接(例如,可经由碱切断)、甲硅烷基醚连接(例如,可经由酸切断)、糖苷连接(例如,可经由淀粉酶切断)、肽连接(例如,可经由蛋白酶切断)、或磷酸二酯连接(例如,可经由核酸酶切断(例如DNA酶))。如下文进一步描述的,可以经由其他核酸分子靶向酶,例如限制性内切酶(例如限制性核酸内切酶)来切断键。
在珠粒生成期间(例如,在前体聚合期间),物质可以被包封在珠粒中。这种物质可以参与或可以不参与聚合。这种物质可以进入聚合反应混合物中,使得生成的珠粒包含珠粒形成时的物质。在一些情况下,这种物质可以在形成后添加到凝胶珠粒中。这种物质可以包括例如核酸分子(例如,寡核苷酸)、用于核酸扩增反应的试剂(例如,引物、聚合酶、dNTP、辅因子(例如,离子辅因子)、缓冲液,包括本文所述的那些),用于酶促反应的试剂(例如,酶、辅因子、底物、缓冲液),用于核酸修饰反应(如聚合、连接或消化)的试剂,和/或用于一个或多个测序平台(例如,用于的)的模板制备(例如,标记化)的试剂。这种物质可以包括本文所述的一种或多种酶,包括但不限于聚合酶、逆转录酶、限制性酶(例如,核酸内切酶)、转座酶、连接酶、蛋白酶K、DNA酶等。这种物质可以包括本文别处所述的一种或多种试剂(例如,裂解剂、抑制剂、失活剂、螯合剂、刺激物)。可以通过前体聚合过程中产生的聚合物网络密度、凝胶珠粒内离子电荷的控制(例如,经由与聚合物质相连的离子物质)或通过释放其他物质来控制这些物质的截留。在珠粒降解时和/或通过施加能够从珠粒中释放物质的刺激,可以从珠粒中释放包封的物质。可替代地或另外地,在分区形成期间或之后,物质可以被分区在分区(例如,液滴)中。这种物质可以包括但不限于上述也可以包封在珠粒中的物质。
可降解珠粒可以包含一种或多种具有不稳定键的物质,使得当珠粒/物质暴露于适当的刺激时,键断裂,珠粒降解。不稳定键可以是化学键(例如共价键、离子键)或者可以是另一种类型的物理相互作用(例如范德华相互作用、偶极-偶极相互作用等)。在一些情况下,用于产生珠粒的交联剂可以包含不稳定键。暴露在适当的条件下,不稳定的键会断裂,珠粒会降解。例如,当包含胱胺交联剂的聚丙烯酰胺凝胶珠粒暴露于还原剂时,胱胺的二硫键会断裂,珠粒会降解。
与不降解的珠粒相比,当对可降解的珠粒施加适当的刺激时,可降解的珠粒可用于更快地从珠粒中释放附接的物质(例如,核酸分子、条形码序列、引物等)。例如,对于结合到多孔珠粒内表面的物质,或者在包封物质的情况下,当珠粒降解时,所述物质对于溶液中的其他物质可能具有更大的流动性和可接近性。在一些情况下,物质也可以经由可降解的接头(例如,二硫化物接头)附接到可降解的珠粒上。可降解接头可以对与可降解珠粒相同的刺激做出反应,或者两种可降解物质可以对不同的刺激做出反应。例如,条形码序列可以经由二硫键附接到包括胱胺的聚丙烯酰胺珠粒上。当条形码化珠粒暴露于还原剂时,珠粒降解,并且条形码序列在条形码序列和珠粒之间的二硫化物连接以及珠粒中胱胺的二硫化物连接断裂时释放。
从上述公开文本中可以理解,虽然被称为珠粒的降解,但在许多情况下,如上所述,该降解可以指结合的或夹带的物质从珠粒中解离,无论是否在结构上降解物理珠粒本身。例如,由于例如化学环境的变化,夹带的物质可以通过渗透压差从珠粒中释放出来。举例来说,由于渗透压差引起的珠粒孔尺寸的改变通常可以在珠粒本身没有结构劣化的情况下发生。在一些情况下,由于珠粒的渗透溶胀导致的孔径的增加可以允许珠粒内夹带物质的释放。在其他情况下,珠粒的渗透收缩可能由于孔径收缩导致珠粒更好地保留夹带的物质。
在提供可降解珠粒的情况下,避免在给定时间之前将这种珠粒暴露于导致这种降解的一种或多种刺激可能是有益的,以便例如避免珠粒过早降解和由这种降解产生的问题,包括例如差的流动特性和聚集。举例来说,当珠粒包含可还原的交联基团(例如二硫化物基团)时,希望避免这种珠粒与还原剂(例如DTT或其他二硫化物切断试剂)接触。在这种情况下,本文所述的珠粒处理在一些情况下不含还原剂(如DTT)。因为还原剂通常在商业酶制剂中提供,所以在处理本文所述的珠粒时,可能需要提供不含还原剂(或不含DTT)的酶制剂。这种酶的例子包括,例如,聚合酶酶制剂、逆转录酶酶制剂、连接酶酶制剂,以及可以用于处理本文所述珠粒的许多其他酶制剂。术语“不含还原剂”或“不含DTT”的制剂可以指对于用于降解珠粒的这种材料,具有小于约1/10、小于约1/50或甚至小于约1/100的较低范围的制剂。例如,对于DTT,不含还原剂的制剂可以具有小于约0.01毫摩尔(mM)、0.005mM、0.001mM的DTT、0.0005mM的DTT、或者甚至小于约0.0001mM的DTT。在许多情况下,DTT的量可能无法检测到。
许多化学引发剂可以用来引发珠粒的降解。这些化学变化的例子可以包括由pH介导的珠粒内组分完整性的变化、经由交联键的断裂导致的珠粒组分的降解、以及珠粒组分的解聚。
在一些实施方案中,珠粒可以由包含可降解化学交联剂的材料(如BAC或胱胺)形成。这种可降解交联剂的降解可以通过多种机制完成。在一些例子中,珠粒可以与化学降解剂接触,所述化学降解剂可以诱导氧化、还原或其他化学变化。例如,化学降解剂可以是还原剂,例如二硫苏糖醇(DTT)。还原剂的其他例子可以包括β-巯基乙醇、(2S)-2-氨基-1,4-二巯基丁烷(二硫丁胺或DTBA)、三(2-羧乙基)膦(TCEP)或其组合。还原剂可以降解形成珠粒的凝胶前体之间形成的二硫键,从而降解珠粒。在其他情况下,溶液pH的变化,如pH的增加,可能会引发珠粒的降解。在其他情况下,暴露于水溶液(例如水)可能引发水解降解,从而导致珠粒的降解。在一些情况下,任何刺激组合都可能引发珠粒的降解。例如,pH的变化可以使化学试剂(例如,DTT)成为有效的还原剂。
珠粒也可以在施加热刺激时被诱导释放其内容物。温度的变化会引起珠粒的各种变化。例如,热可以导致固体珠粒液化。热量的变化可能导致珠粒熔化,从而使珠粒的一部分降解。在其他情况下,热量可能会增加珠粒部件的内部压力,从而导致珠粒破裂或爆炸。热量也可以作用于用作构建珠粒的材料的热敏聚合物。
任何合适的试剂都可以降解珠粒。在一些实施方案中,温度或pH的变化可以用于降解珠粒内的热敏键或pH敏感键。在一些实施方案中,化学降解剂可以用于通过氧化、还原或其他化学变化来降解珠粒内的化学键。例如,化学降解剂可以是还原剂,例如DTT,其中DTT可以降解交联剂和凝胶前体之间形成的二硫键,从而降解珠粒。在一些实施方案中,可以添加还原剂来降解珠粒,这可以导致或不导致珠粒释放其内容物。还原剂的例子可以包括二硫苏糖醇(DTT)、β-巯基乙醇、(2S)-2-氨基-1,4-二巯基丁烷(二硫丁胺或DTBA)、三(2-羧乙基)膦(TCEP)或其组合。还原剂可以以约0.1mM、0.5mM、1mM、5mM、10mM的浓度存在。还原剂可以以至少约0.1mM、0.5mM、1mM、5mM、10mM或大于10mM的浓度存在。还原剂可以以至多约10mM、5mM、1mM、0.5mM、0.1mM或更低的浓度存在。
任何合适数量的分子标签分子(例如引物、条形码化寡核苷酸)可以与珠粒缔合,使得在从珠粒释放时,分子标签分子(例如引物,例如条形码化寡核苷酸)以预定浓度存在于分区中。这种的预定浓度可以选择成促进在分区内产生测序文库的某些反应,例如扩增。在一些情况下,引物的预定浓度可能受到生产带有例如寡核苷酸的珠粒的过程的限制。
尽管在上文中图1和图2已经根据提供基本上被单一占据的分区进行了描述,但是在某些情况下,可能希望提供被多重占据的分区,例如,在单个分区内包括两个、三个、四个或更多个包括条形码化核酸分子(例如,寡核苷酸)的细胞和/或微胶囊(例如,珠粒)。因此,如上所述,可以控制包含生物颗粒和/或珠粒的流体以及分区流体的流动特性,以提供这种多重占据的分区。特别地,可以控制流动参数,以大于约50%的分区、大于约75%以及在一些情况下大于约80%、90%、95%或更高的分区提供给定的占据率。
在一些情况下,可以使用另外的微胶囊将另外的试剂递送到分区。在这种情况下,从不同的珠粒源(例如,包含不同的缔合试剂)通过不同的通道入口将不同的珠粒引入到共同通道或液滴产生交汇点(例如,交汇点210)中可能是有利的。在这种情况下,可以控制不同珠粒进入通道或交汇点的流量和频率,以提供来自每个来源的一定比例的微胶囊,同时确保进入具有给定数量的生物颗粒的分区(例如,每个分区一个生物颗粒和一个珠粒)的这些珠粒的给定的配对或组合。
本文描述的分区可以包括小体积,例如,小于约10微升(μL)、5μL、1μL、900皮升(pL)、800pL、700pL、600pL、500pL、400pL、300pL、200pL、100pL、50pL、20pL、10pL、1pL、500纳升(nL)、100nL、50nL或更小。
例如,在基于液滴的分区的情况下,液滴可以具有如下总体积:小于约1000pL、900pL、800pL、700pL、600pL、500pL、400pL、300pL、200pL、100pL、50pL、20pL、10pL、1pL或更小。在与微胶囊共分区的情况下,应当理解,在分区内的样品流体体积,例如包括共分区的生物颗粒和/或珠粒,可以小于上述体积的约90%、小于约80%、小于约70%、小于约60%、小于约50%、小于约40%、小于约30%、小于约20%或小于上述体积的约10%。
如本文别处所述,分区物质可以产生一个群体或多个分区。在这种情况下,可以生成或以其他方式提供任何合适数量的分区。例如,可以生成或以其他方式提供至少约1,000个分区、至少约5,000个分区、至少约10,000个分区、至少约50,000个分区、至少约100,000个分区、至少约500,000个分区、至少约1,000,000个分区、至少约5,000,000个分区、至少约10,000,000个分区、至少约50,000,000个分区、至少约100,000,000个分区、至少约500,000,000个分区、至少约1,000,000,000个分区或更多分区。此外,多个分区可以包括未被占据的分区(例如,空分区)和被占据的分区。
微孔
如本文所述,可以在分区中进行一种或多种过程,所述分区可以是孔。所述孔可以是衬底的多个孔中的孔,如微孔阵列或板的微孔,或者所述孔可以是包含衬底的装置(例如,微流体装置)的微孔或微室。所述孔可以是孔阵列或板的孔,或者所述孔可以是装置(例如,流体装置)的孔或室。因此,所述孔或微孔可以假定“开放的”构型,其中所述孔或微孔暴露于环境(例如,含有开放的表面)并且在衬底的一个平坦面上是可接近的,或者所述孔或微孔可以假定“封闭的”或“密封的”构型,其中所述微孔在衬底的一个平坦面上是不可接近的。在一些情况下,所述孔或微孔可以配置为在“开放的”与“封闭的”构型之间切换。例如,“开放的”微孔或微孔集可以使用膜(例如,半透膜)、油(例如,氟化油以覆盖水溶液)或盖被“封闭”或“密封”,如本文别处所述。所述孔或微孔可以最初以“封闭的”或“密封的”构型来提供,其中它们在没有外力的情况下在衬底的平坦表面上是不可接近的。例如,“封闭的”或“密封的”构型可以包含可被一个或多个移液管吸头刺穿或穿透的衬底,如密封薄膜或箔。适用于衬底的材料包括但不限于聚酯、聚丙烯、聚乙烯、乙烯树脂和铝箔。
所述孔可以具有小于1毫升(mL)的容积。例如,所述孔可以配置为容纳如下体积:至多1000微升(μL)、至多100μL、至多10μL、至多1μL、至多100纳升(nL)、至多10nL、至多1nL、至多100皮升(pL)、至多10(pL)或更小。所述孔可以配置为容纳如下体积:约1000μL、约100μL、约10μL、约1μL、约100nL、约10nL、约1nL、约100pL、约10pL等。所述孔可以配置为容纳如下体积:至少10pL、至少100pL、至少1nL、至少10nL、至少100nL、至少1μL、至少10μL、至少100μL、至少1000μL或更大。所述孔可以配置为容纳在本文列出的体积范围内的体积,例如,约5nL至约20nL、约1nL至约100nL、约500pL至约100μL等。所述孔可以属于具有变化容积的多个孔并且可以配置为容纳适合于接纳本文所述的任何分区体积的体积。
在一些情况下,微孔阵列或板包含单一种类的微孔。在一些情况下,微孔阵列或板包含多种微孔。例如,微孔阵列或板可以在单一微孔阵列或板内包含一种或多种类型的微孔。微孔的类型可以具有不同尺寸(例如,长度、宽度、直径、深度、横截面积等)、形状(例如,圆形、三角形、正方形、矩形、五边形、六边形、七边形、八边形、九边形、十边形等)、纵横比或其他物理特征。微孔阵列或板可以包含任何数量的不同类型的微孔。例如,微孔阵列或板可以包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000或更多种不同类型的微孔。孔可以具有任何尺寸(例如,长度、宽度、直径、深度、横截面积、体积等)、形状(例如,圆形、三角形、正方形、矩形、五边形、六边形、七边形、八边形、九边形、十边形、其他多边形等)、纵横比或本文关于任何孔所述的其他物理特征。
在某些情况下,微孔阵列或板包含不同类型的微孔,其彼此相邻地位于阵列或板内。例如,具有一个尺寸集的微孔可以位于与具有不同尺寸集的微孔相邻或接触。类似地,不同几何结构的微孔可以置于彼此相邻或接触。相邻的微孔可以配置为容纳不同物品;例如,一个微孔可以用于容纳细胞、细胞珠粒或其他样品(例如,细胞组分、核酸分子等),而相邻微孔可以用于容纳微胶囊、液滴、珠粒或其他试剂。在一些情况下,相邻的微孔可以被配置为在每个微孔中的物品接触后合并其中容纳的内容物,例如,在施加刺激后,或者自发地进行。
如本文别处所述,多个分区可以用于本文所述的系统、组合物和方法中。例如,任何合适的数量的分区(例如,孔或液滴)可以被生成或以其他方式来提供。例如,在使用孔的情况下,至少约1,000个孔、至少约5,000个孔、至少约10,000个孔、至少约50,000个孔、至少约100,000个孔、至少约500,000个孔、至少约1,000,000个孔、至少约5,000,000个孔、至少约10,000,000个孔、至少约50,000,000个孔、至少约100,000,000个孔、至少约500,000,000个孔、至少约1,000,000,000个孔或更多孔可以被生成或以其他方式来提供。此外,所述多个孔可以包括未被占据的孔(例如,空孔)和被占据的孔二者。
孔可以包含本文所述的任何试剂或其组合。这些试剂可以包括例如条形码分子、酶、衔接子及其组合。所述试剂可以与置于孔中的样品(例如,细胞、细胞珠粒或细胞组分,例如,蛋白质、核酸分子等)物理分离。此物理分离可以通过将所述试剂含于置于孔内的微胶囊或珠粒内或与所述微胶囊或珠粒偶联来完成。所述物理分离也可以通过在将多核苷酸样品引入孔中之前将所述试剂分配于孔中并将所述试剂与例如可溶解的、可熔化的或可渗透的层重叠来完成。该层可以是例如油、蜡、膜(例如,半透膜)等。所述孔可以在任何点被密封,例如,在微胶囊或珠粒的添加之后、在所述试剂的添加之后或者在这些组分中的任一种的添加之后。所述孔的密封可以用于多种目的,包括预防珠粒或负载的试剂从孔逃逸,允许某些试剂的选择性递送(例如,经由使用半透膜),用于孔在进一步处理之前或之后的储存等。
孔可以包含游离试剂和/或包封在微胶囊、珠粒或液滴中或以其他方式与其偶联或缔合的试剂。本公开文本中描述的任何试剂可以被包封于微胶囊、液滴或珠粒中或以其他方式与其偶联,所述液滴或珠粒具有适合于样品处理反应的任何化学物质、颗粒和元素,包括生物分子,例如但不限于核酸分子和蛋白质。例如,用于DNA测序的样品制备反应中使用的珠粒或液滴可以包含以下试剂中的一种或多种:酶、限制性酶(例如,多种切割剂)、连接酶、聚合酶、荧光团、寡核苷酸条形码、衔接子、缓冲液、核苷酸(例如,dNTP、ddNTP)等。
试剂的另外的例子包括但不限于:缓冲液、酸性溶液、碱性溶液、温度敏感酶、pH敏感酶、光敏酶、金属、金属离子、氯化镁、氯化钠、锰、水性缓冲液、温和缓冲液、离子型缓冲液、抑制剂、酶、蛋白质、多核苷酸、抗体、糖类、脂质、油、盐、离子、洗涤剂、离子型洗涤剂、非离子型洗涤剂、寡核苷酸、核苷酸、脱氧核糖核苷酸三磷酸(dNTP)、二脱氧核糖核苷酸三磷酸(ddNTP)、DNA、RNA、肽多核苷酸、互补DNA(cDNA)、双链DNA(dsDNA)、单链DNA(ssDNA)、质粒DNA、粘粒DNA、染色体DNA、基因组DNA、病毒DNA、细菌DNA、mtDNA(线粒体DNA)、mRNA、rRNA、tRNA、nRNA、siRNA、snRNA、snoRNA、scaRNA、微RNA、dsRNA、核酶、核糖开关(riboswitch)和病毒RNA、聚合酶、连接酶、限制性酶、蛋白酶、核酸酶、蛋白酶抑制剂、核酸酶抑制剂、螯合剂、还原剂、氧化剂、荧光团、探针、发色团、染料、有机物、乳化剂、表面活性剂、稳定剂、聚合物、水、小分子、药物、放射性分子、防腐剂、抗生素、适配体和药物化合物。如本文所述,孔中的一种或多种试剂可以用于进行一种或多种反应,包括但不限于:细胞裂解、细胞固定、透化、核酸反应(例如,核酸延伸反应)、扩增、逆转录、转座酶反应(例如,标签化)等。
孔可以作为试剂盒的一部分来提供。例如,试剂盒可以包含使用说明、微孔阵列或装置以及试剂(例如,珠粒)。试剂盒可以包含用于进行本文所述过程(例如,核酸反应、核酸分子的条形码化、样品处理(例如,用于细胞裂解、固定和/或透化))的任何有用试剂。
在一些情况下,孔包含含有具有类似属性的试剂组(例如酶组、矿物组、寡核苷酸组、不同条形码分子的混合物、相同条形码分子的混合物)的微胶囊、珠粒或液滴。在其他情况下,微胶囊、珠粒或液滴包含试剂的异质性混合物。在一些情况下,试剂的异质性混合物可以包含进行反应所需的所有组分。在一些情况下,这样的混合物可以包含进行反应所需的所有组分,进行反应所需的1、2、3、4、5或更多种组分除外。在一些情况下,这样的另外的组分含于不同微胶囊、液滴或珠粒内或以其他方式与其偶联,或者含于系统分区(例如,微孔)内的溶液内。
图10示意性地说明微孔阵列的例子。所述阵列可以含于衬底1000内。衬底1000包含多个孔1002。孔1002可以具有任何大小或形状,并且孔之间的间隔、每个中孔的数量以及衬底1000上孔的密度可以被修改,根据具体应用而定。在一个这样的示例性应用中,可以包含细胞或细胞组分(例如,核酸分子)的样品分子1006与可以包含与其偶联的核酸条形码分子的珠粒1004共分区。孔1002可以使用重力或其他加载技术(例如,离心、液体处理器、声学加载、光电子学等)进行加载。在一些情况下,孔1002中的至少一个含有单个样品分子1006(例如,细胞)和单个珠粒1004。
试剂可以被依序或同时加载至孔中。在一些情况下,试剂在特定操作之前或之后被引入装置。在一些情况下,试剂(在某些情况下,其可以以微胶囊、液滴或珠粒来提供)被依序引入,使得不同反应或操作在不同步骤中进行。试剂(或者微胶囊、液滴或珠粒)也可以在穿插有反应或操作步骤的操作中被加载。例如,包含用于片段化多核苷酸的试剂(例如,限制性酶)和/或其他酶(例如,转座酶、连接酶、聚合酶等)的微胶囊(或者液滴或珠粒)可以被加载至孔或多个孔中,之后加载包含用于将核酸条形码分子附接到样品核酸分子的试剂的微胶囊、液滴或珠粒。试剂可以与样品(例如,细胞或细胞组分(例如,细胞器、蛋白质、核酸分子、碳水化合物、脂质等))同时或依序提供。因此,孔的使用在进行多步式操作或反应时可以是有用的。
如本文别处所述,核酸条形码分子和其他试剂可以含于微胶囊、珠粒或液滴内。这些微胶囊、珠粒或液滴可以在加载细胞之前、之后或同时被加载至分区(例如,微孔)中,使得每个细胞与不同的微胶囊、珠粒或液滴接触。这种技术可以用于将唯一的核酸条形码分子附接到从每个细胞获得的核酸分子。可替代地或另外地,样品核酸分子可以附接到支持物。例如,分区(例如,微孔)可以包含具有与其偶联的多个核酸条形码分子的珠粒。样品核酸分子或其衍生物可以偶联或附接到支持物上的核酸条形码分子。然后所得条形码化核酸分子可以从分区中去除,并且在一些情况下,被合并和测序。在这样的情况下,核酸条形码序列可以用于跟踪样品核酸分子的起源。例如,具有相同条形码的多核苷酸可以被确定为源自相同的细胞或分区,而具有不同条形码的多核苷酸可以被确定为源自不同的细胞或分区。
样品或试剂可以使用多种方法加载至孔或微孔中。样品(例如,细胞、细胞珠粒或细胞组分)或试剂(如本文所述)可以使用外力(例如,重力、电动力、磁力)或使用将样品或试剂驱动至孔中的机制(例如,经由压力驱动的流动、离心、光电子学、声学加载、电动泵浦、真空、毛细管流等)被加载至孔或微孔中。在某些情况下,流体操作系统可以用于将样品或试剂加载至孔中。样品或试剂的加载可以遵循泊松分布或非泊松分布,例如,超泊松分布或亚泊松分布。微孔的几何结构、孔间间隔、密度和大小可以被修改以适应有用的样品或试剂分布;例如,微孔的大小和间隔可以被调整,使得样品或试剂可以以超泊松方式分布。
在一个特定非限制性例子中,微孔阵列或板包含微孔对,其中每对微孔配置为容纳液滴(例如,包含单细胞)和单一珠粒(如本文所述的那些,在一些情况下,其也可以被包封于液滴中)。液滴和珠粒(或者含有珠粒的液滴)可以被同时或依序加载,并且液滴和珠粒可以被合并,例如,在液滴与珠粒接触后,或者在施加刺激(例如,外力、搅拌、热、光、磁力或电动力等)后。在一些情况下,液滴和珠粒的加载是超泊松的。在微孔对的其他例子中,孔配置为容纳包含不同试剂和/或样品的两个液滴,所述液滴在接触后或在施加刺激后合并。在这样的情况下,所述对中一个微孔的液滴可以包含可以与所述对中另一微孔的液滴中的药剂反应的试剂。例如,一个液滴可以包含配置为释放位于相邻微孔中的另一液滴中所含珠粒的核酸条形码分子的试剂。在液滴合并后,核酸条形码分子可以被从珠粒释放至分区(例如,微孔或相接触的微孔对)中,并且可以进行进一步处理(例如,条形码化、核酸反应等)。在完整或活细胞被加载于微孔中的情况下,一个液滴可以包含用于在液滴合并后裂解细胞的裂解试剂。
液滴或微胶囊可以被分区到孔中。液滴可以在加载至孔中之前被选择或经历预处理。例如,液滴可以包含细胞,并且仅某些液滴(如含有单细胞(或至少一个细胞)的那些)可以被选择用于孔的加载。这样的预选择过程可以用于单细胞的有效加载,如以获得非泊松分布,或者以在孔中进一步分区之前针对所选特征预填充细胞。此外,所述技术可以用于在微孔的加载之前或期间获得或防止细胞双联体或多联体形成。
在一些情况下,孔可以包含附接到其的核酸条形码分子。核酸条形码分子可以附接到孔(例如,孔壁)的表面。一个孔的核酸条形码分子(例如,分区条形码序列)可以与另一孔的核酸条形码分子不同,从而可以允许鉴定单一分区或孔内所含的内容物。在一些情况下,核酸条形码分子可以包含可鉴定孔(如在孔阵列或孔板内)的空间坐标的空间条形码序列。在一些情况下,核酸条形码分子可以包含用于单独分子标识的唯一分子标识符。在一些情况下,核酸条形码分子可以配置为附接到或捕获分布于孔中的样品或细胞内的核酸分子。例如,核酸条形码分子可以包含可用于捕获或杂交样品内的核酸分子(例如,RNA、DNA)的捕获序列。在一些情况下,核酸条形码分子可以是可从微孔释放的。例如,核酸条形码分子可以包含可以在施加刺激(例如,光刺激、磁性刺激、化学刺激、生物学刺激)后被切割的化学交联剂。可以杂交至或配置为杂交样品核酸分子的所释放的核酸条形码分子可以被收集和合并用于进一步处理,所述进一步处理可以包括核酸处理(例如,扩增、延伸、逆转录等)和/或表征(例如,测序)。在这样的情况下,唯一分区条形码序列可以用于鉴定核酸分子所来源的细胞或分区。
可以进行孔内样品的表征。在非限制性例子中,这样的表征可以包括样品(例如,细胞、细胞珠粒或细胞组分)或其衍生物的成像。表征技术如显微术或成像可以用于测量固定的空间位置中的样品谱。例如,在任选地用珠粒分区细胞时,每个微孔和其中所含内容物的成像可以提供关于以下的有用信息:细胞双联体形成(例如,频率、空间位置等)、细胞-珠粒对效率、细胞活力、细胞大小、细胞形态学、生物标记物(例如,表面标记物、其中的荧光标记分子等)的表达水平、细胞或珠粒加载率、细胞-珠粒对的数量等。在一些情况下,成像可以用于表征孔中的活细胞,包括但不限于:动态活细胞跟踪、细胞间相互作用(在两个或更多个细胞被共分区时)、细胞增殖等。可替代地或另外地,成像可以用于表征孔中的扩增产物的量。
在操作中,孔可以同时或依序加载样品和试剂。在加载细胞或细胞珠粒时,孔可以经历洗涤,例如,以从孔、微孔阵列或板去除过多细胞。类似地,可以进行洗涤以从孔、微孔阵列或板去除过多珠粒或其他试剂。在使用活细胞的情况下,可以在单独分区中裂解细胞以释放细胞内组分或细胞分析物。可替代地,细胞可以在单独分区中进行固定或透化。细胞内组分或细胞分析物可以与支持物偶联,例如,在微孔的表面上、在固体支持物(例如,珠粒)上,或者它们可以被收集用于进一步下游处理。例如,在细胞裂解后,细胞内组分或细胞分析物可以被转移至单独液滴或其他分区用于条形码化。可替代地或另外地,细胞内组分或细胞分析物(例如,核酸分子)可以与包含核酸条形码分子的珠粒偶联;随后,所述珠粒可以被收集和进一步加工,例如,经历核酸反应(如逆转录、扩增或延伸),并且其上的核酸分子可以被进一步表征,例如经由测序来表征。可替代地或另外地,细胞内组分或细胞分析物可以在孔中被条形码化(例如,使用包含可释放的核酸条形码分子的珠粒或者在包含核酸条形码分子的微孔的表面上)。条形码化核酸分子或分析物可以在孔中被进一步处理,或者条形码化核酸分子或分析物可以从单独分区被收集并在分区外部经历进一步处理。进一步处理可以包括核酸处理(例如,进行扩增、延伸)或表征(例如,扩增的分子的荧光监测、测序)。在任何方便的或有用的步骤,孔(或微孔阵列或板)可以被密封(例如,使用油、膜、蜡等),从而使得能够储存测定或选择性引入另外的试剂。
图11示意性地显示用于处理样品内的核酸分子的工作流的例子。可以提供包含多个微孔1102的衬底1100。可以包含细胞、细胞珠粒、细胞组分或分析物(例如,蛋白质和/或核酸分子)的样品1106可以在多个微孔1102中与包含核酸条形码分子的多个珠粒1104共分区。在过程1110期间,样品1106可以在所述分区内被处理。例如,在活细胞的情况下,细胞可以经历足以裂解细胞并释放其中所含的分析物的条件。在过程1120中,珠粒1104可以被进一步处理。举例来说,过程1120a和1120b示意性地说明不同工作流,根据珠粒1104的特性而定。
在1120a中,珠粒包含附接到其的核酸条形码分子,并且样品核酸分子(例如,RNA、DNA)可以例如经由连接的杂交而附接到核酸条形码分子。这样的附接可以发生在所述珠粒上。在过程1130中,来自多个孔1102的珠粒1104可以被收集和合并。可以在过程1140中进行进一步处理。例如,可以进行一种或多种核酸反应,如逆转录、核酸延伸、扩增、连接、转座等。在一些情况下,衔接子序列连接到核酸分子或其衍生物,如本文别处所述。例如,测序引物序列可以附加到核酸分子的每一端。在过程1150中,可以进行进一步表征(如测序)以生成测序读段。所述测序读段可以产生关于单独细胞或细胞群的信息,所述信息可以例如在小图1155中以视觉方式或图形方式来表示。
在1120b中,珠粒包含可释放地附接到其的核酸条形码分子,如下文所述。珠粒可以降解或以其他方式将核酸条形码分子释放至孔1102中;核酸条形码分子然后可以用于条形码化孔1102内的核酸分子。进一步处理可以在分区内部或分区外部进行。例如,可以进行一种或多种核酸反应,如逆转录、核酸延伸、扩增、连接、转座等。在一些情况下,衔接子序列连接到核酸分子或其衍生物,如本文别处所述。例如,测序引物序列可以附加到核酸分子的每一端。在过程1150中,可以进行进一步表征(如测序)以生成测序读段。所述测序读段可以产生关于单独细胞或细胞群的信息,所述信息可以例如在小图1155中以视觉方式或图形方式来表示。
细胞珠粒和用于产生细胞珠粒的方法
本公开文本的方法可以包括产生包含本文公开的一种或多种聚合物的一种或多种细胞珠粒。关于示例性细胞珠粒产生系统和方法,参见例如,美国专利公开2018/0216162(现在是美国专利10,428,326)、美国专利公开2019/0100632(现在是美国专利10,590,244)和美国专利公开2019/0233878,其通过引用以其整体并入。例如,将细胞和聚合物或凝胶前体与不混溶的流体(例如油)混合,从而产生多个水性液滴,包括包含细胞的液滴。如本文所述,液滴可以包含带电物质。可以使液滴经受足以使聚合物或凝胶前体聚合或凝胶化以产生包含细胞的细胞珠粒的条件。凝胶化可以包括本文所述的任何凝胶化机制和聚合物,包括使用点击化学反应的那些,如本文别处所述。在一些情况下,使细胞珠粒经受足以裂解细胞的处理条件,从而将细胞组分释放到细胞珠粒中。在其他实施方案中,在聚合物或凝胶前体聚合或凝胶化以产生细胞珠粒之前将细胞在液滴中裂解。在仍其他实施方案中,在聚合物或凝胶前体聚合或凝胶化之前或之后使细胞透化。可以将细胞珠粒收集在水相中以产生多个细胞珠粒。可以储存细胞珠粒用于进一步处理。在一些情况下,带电物质可以在聚合物或凝胶前体聚合或凝胶化之后附接到细胞珠粒。例如,聚合物或凝胶前体可以包含一个或多个官能团,其在聚合物或凝胶前体聚合或凝胶化之后促进带电物质的附接。在其他实施方案中,聚合物或凝胶前体包含含有官能团的带电物质,其在聚合物或凝胶前体聚合或凝胶化期间掺入细胞珠粒中。
在一个方面,本公开文本提供了用于产生包含带电物质的细胞珠粒的方法。首先,可以产生包含来自多个细胞的细胞、聚合物或凝胶前体和带电物质的分区。接着,可以使分区经受足以使聚合物或凝胶前体反应以产生包含细胞或其衍生物和带电物质的聚合物或凝胶网络的条件,从而产生细胞珠粒。可以使分区经受足以使聚合物或凝胶前体聚合或凝胶化的条件。在本文别处描述了足以使聚合物或凝胶前体聚合或凝胶化的条件。在一些实施方案中,细胞被裂解以将细胞组分释放到细胞珠粒中。细胞可以在聚合物或凝胶前体的聚合或凝胶化之前,与聚合物或凝胶前体的聚合或凝胶化同时,或在聚合物或凝胶前体的聚合或凝胶化之后裂解。在其他实施方案中,细胞珠粒中的细胞没有被裂解,而是被透化以允许接近细胞核内的组分。
在另一方面,本公开文本提供了用于产生包含带电物质的细胞珠粒的方法。首先,可以产生包含从细胞分离的细胞核、聚合物或凝胶前体和带电物质的分区。接着,可使分区经受足以使聚合物或凝胶前体反应以产生包含细胞核和带电物质的聚合物或凝胶网络的条件,从而产生细胞珠粒。可以使分区经受足以使聚合物或凝胶前体聚合或凝胶化的条件。在本文别处描述了足以使聚合物或凝胶前体聚合或凝胶化的条件。例如,铜催化剂可以用于催化点击化学反应,从而产生水凝胶。在一些实施方案中,细胞核被裂解以将细胞核组分释放到细胞珠粒中。细胞核可以在聚合物或凝胶前体的聚合或凝胶化之前,与聚合物或凝胶前体的聚合或凝胶化同时,或在聚合物或凝胶前体的聚合或凝胶化之后裂解。在其他实施方案中,细胞珠粒中的细胞核没有被裂解,而是被透化以允许接近细胞核内的核组分。
带电物质可以是带正电物质。带正电物质可以是包含正电荷的试剂。带正电物质可以包括三甲基铵。带正电物质可以是(3-丙烯酰胺基丙基)-三甲基铵。带电物质可以是带负电物质。带负电物质可以包括磷酸盐。带电物质可以附接到聚合物或凝胶网络。带电物质可在聚合期间掺入聚合物或凝胶网络中。细胞珠粒可以包含一种或多种化学交联剂。化学交联剂可以是二硫键。带电物质可以附接到一种或多种化学交联剂上。细胞的衍生物可以是来自细胞的组分(例如,DNA、RNA、蛋白质等)。产生细胞珠粒的方法可以包括裂解分区(例如液滴)内的细胞以从细胞中释放组分。组分可以是核酸。核酸可以是DNA(例如,基因组DNA)或RNA(例如,mRNA、siRNA)。组分可以是蛋白质。组分可以是带负电组分,例如DNA、RNA或miRNA。组分可以是带正电组分,例如蛋白质。来自细胞的组分可以与带电物质相互作用。来自细胞的组分可以非共价地附接到带电物质。
在一些实施方案中,来自或衍生自细胞的带负电组分(例如,DNA)经由离子相互作用与细胞珠粒(例如,细胞珠粒聚合物的带正电官能团)的带正电物质(例如,(3-丙烯酰胺基丙基)-三甲基铵)相互作用。在其他实施方案中,来自或衍生自细胞的带正电组分(例如,蛋白质)经由离子相互作用与细胞珠粒(例如,细胞珠粒聚合物的带负电官能团)的带负电物质(例如,磷酸盐)相互作用。在仍其他实施方案中,来自或衍生自细胞的带负电组分(例如,DNA)与细胞珠粒(例如,细胞珠粒聚合物的带正电官能团)的带正电物质(例如,(3-丙烯酰胺基丙基)-三甲基铵)相互作用,并且来自或衍生自细胞的带正电组分(例如,蛋白质)与细胞珠粒(例如,细胞珠粒聚合物的带负电官能团)的带负电物质(例如,磷酸盐)相互作用。因此,例如由于与细胞珠粒的带电物质的静电相互作用,来自细胞的一种或多种组分能够保留在细胞珠粒内。来自细胞的组分能够在细胞珠粒内保留约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约12小时、约24小时、约48小时、约72小时或更长时间。来自细胞的组分能够在细胞珠粒内保留至少1小时、至少2小时、至少3小时、至少4小时、至少5小时、至少6小时、至少12小时、至少24小时、至少48小时、至少72小时或更长时间。来自细胞的组分能够在细胞珠粒内保留至多1小时、至多2小时、至多3小时、至多4小时、至多5小时、至多6小时、至多12小时、至多24小时、至多48小时或至多72小时。
在一个方面,本公开文本提供了用于产生包含带电聚合物或凝胶网络的细胞珠粒(例如,包含带电物质的细胞珠粒)的方法。首先,可以产生包含来自多个细胞的细胞和聚合物或凝胶前体的分区。接着,可以使分区经受足以使所述带电聚合物或凝胶前体反应以产生包含细胞或其衍生物的带电聚合物或凝胶网络的条件,从而提供包含带电物质的细胞珠粒。反应可以使得聚合物或凝胶前体上的净电荷发生改变,从而产生带电聚合物或凝胶网络。反应可以使得聚合物或凝胶网络上的净电荷改变,从而产生带电聚合物或凝胶网络。
聚合物或凝胶前体可以带正电。聚合物或凝胶前体可以包含壳聚糖。聚合物或凝胶前体可以包含聚乙烯亚胺(PEI)。聚合物或凝胶前体可以带负电。聚合物或凝胶前体可以包含藻酸盐。细胞的衍生物可以是来自细胞的组分(例如,DNA、RNA、蛋白质等)。产生细胞珠粒的方法可以包括裂解分区(例如液滴)内的细胞以从细胞中释放组分。组分可以是核酸。核酸可以是DNA(例如,基因组DNA)或RNA(例如,mRNA、siRNA)。组分可以是蛋白质。组分可以是带负电组分,例如DNA、RNA或miRNA。组分可以是带正电组分,例如蛋白质。来自细胞的组分可以与带电聚合物或凝胶网络相互作用。来自细胞的组分可以非共价附接到包含带电物质的细胞珠粒的聚合物或凝胶网络。在一些实施方案中,来自或衍生自细胞的带负电组分(例如,DNA)经由离子相互作用与细胞珠粒的带正电物质(例如,带正电的聚合物或凝胶网络)相互作用。在其他实施方案中,来自或衍生自细胞的带正电组分(例如,蛋白质)经由离子相互作用与细胞珠粒的带负电物质(例如,带负电的聚合物或凝胶网络)相互作用。在仍其他实施方案中,来自或衍生自细胞的带负电组分(例如,DNA)与细胞珠粒的带正电物质(例如,带正电的聚合物或凝胶网络)相互作用,来自或衍生自细胞的带正电组分(例如,蛋白质)与细胞珠粒的带负电物质(例如,带负电的聚合物或凝胶网络)相互作用。因此,例如由于与细胞珠粒的带电物质的静电相互作用,来自细胞的一种或多种组分能够保留在细胞珠粒内。例如,由于与带电聚合物或凝胶网络的相互作用,来自细胞的组分能够保留在细胞珠粒内。来自细胞的组分能够在细胞珠粒内保留约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约12小时、约24小时、约48小时、约72小时或更长时间。来自细胞的组分能够在细胞珠粒内保留至少1小时、至少2小时、至少3小时、至少4小时、至少5小时、至少6小时、至少12小时、至少24小时、至少48小时、至少72小时或更长时间。来自细胞的组分能够在细胞珠粒内保留至多1小时、至多2小时、至多3小时、至多4小时、至多5小时、至多6小时、至多12小时、至多24小时、至多48小时或至多72小时。
在一个方面,本公开文本提供了用于产生包含带电物质的细胞珠粒的方法。首先,可以产生包含来自多个细胞的细胞和聚合物或凝胶前体的分区。接着,可以使分区经受足以使聚合物或凝胶前体反应以产生包含细胞或其衍生物的聚合物或凝胶网络的条件。接下来,带电物质可以与聚合物或凝胶网络偶联,从而提供包含带电物质的细胞珠粒。可以使分区经受足以使聚合物或凝胶前体聚合或凝胶化的条件。在本文别处描述了足以使聚合物或凝胶前体聚合或凝胶化的条件。例如,铜催化剂可以用于催化点击化学反应,从而产生水凝胶。在一些情况下,细胞被裂解以释放细胞组分。细胞可以在聚合物或凝胶前体的聚合或凝胶化之前,与聚合物或凝胶前体的聚合或凝胶化同时,或在聚合物或凝胶前体的聚合或凝胶化之后裂解。
如本文所述,聚合物或凝胶网络可以是可降解的聚合物或凝胶网络,使得细胞珠粒是可降解的细胞珠粒。可以通过产生多个分区来产生任何数量的细胞珠粒。在一些情况下,产生约1个、约2个、约3个、约4个、约5个、约10个、约50个、约100个、约500个、约1000个、约5000个、约10000个、约20000个、约50000个、约100000个或更多个细胞珠粒,从而产生多个细胞珠粒。细胞珠粒可以与条形码珠粒(例如,凝胶珠粒)一起分区,用于分析细胞或其组分。
细胞珠粒可以通过如本文所述的方法产生,例如通过在包含细胞或来自细胞的成分的分区中聚合分子前体(例如,聚合物或凝胶前体)。细胞珠粒可以包含来自细胞的一种或多种不同类型的组分,包括例如DNA(例如,gDNA、染色质等)、RNA(例如,mRNA、miRNA)、蛋白质和/或代谢物。组分可以包含在细胞珠粒中和/或附接到细胞珠粒。细胞珠粒可以通过以下来产生:将细胞包封在聚合物或凝胶基质中并在凝胶或聚合物基质中裂解细胞,当细胞被包封在聚合物或凝胶基质中时裂解细胞,或裂解细胞使得其成分被包封在聚合物或凝胶基质中。聚合物或凝胶基质可以包含一种或多种带电物质,其被配置为与来自细胞的组分(例如,DNA、RNA、蛋白质等)相互作用。
用于产生细胞珠粒的分区可以包含一种或多种用于进行一种或多种反应的试剂。物质可以包括例如用于核酸扩增或延伸反应的试剂(例如,引物、聚合酶、核苷酸、辅因子(例如,离子辅因子)、缓冲液等,包括本文所述的那些),用于酶促反应的试剂(例如,酶、辅因子、底物、缓冲液等),用于核酸修饰反应(如聚合、连接或消化)的试剂,和/或用于模板制备的试剂。
试剂可以包括用于最小化由点击化学反应导致的核酸损伤的试剂。例如,可以将自由基清除剂加入到分区中,从而降低点击化学反应期间产生的自由基对核酸造成损伤的风险。在一些情况下,自由基清除剂包括二甲亚砜(DMSO)。可以将DMSO以足以防止核酸损伤的浓度加入到用于产生细胞珠粒的分区中。在一些实施方案中,将DMSO以至少约1%、约2%、约3%、约4%、约5%、约6%、约7%、约8%、约9%、约10%或更大的量加入到分区中。
分区内的一种或多种试剂可以附接到前体(例如,聚合物或凝胶前体)。试剂可以共价附接到前体。试剂可以可逆地或不可逆地附接到前体。试剂可以经由acrydite部分附接到前体。
在一些情况下,寡核苷酸可以附接到前体。附接到前体的寡核苷酸可用于例如捕获RNA和/或进行逆转录反应。寡核苷酸可以包含多聚T序列或多聚U序列(例如,可以是多聚T引物)。在一些实施方案中,多聚T序列用于与例如来自细胞mRNA的多聚A序列杂交。在一些实施方案中,多聚U序列用于与例如来自细胞mRNA的多聚A序列杂交。
在一些情况下,寡核苷酸(如多聚T序列)可以经由不可逆的点击化学反应附接到前体(例如,聚合物)。在一些实施方案中,寡核苷酸的这种点击化学附接可以在产生凝胶基质的聚合物交联期间进行。例如,与用叠氮化物和炔烃点击化学基团修饰的聚合物一起引入乳液液滴中的炔丙基化多聚T寡核苷酸经由CuAAC点击化学附接,产生与叠氮化物修饰的聚合物的一些叠氮化物修饰的接头位点的1,2,3-三唑连接。其他位点与炔烃修饰的聚合物形成交联,产生包含能够捕获聚腺苷酸化RNA转录物的共价附接的多聚T试剂的凝胶基质。
用于产生细胞珠粒的分区可以包含一个或多个颗粒(例如,磁性颗粒)。分区内的一种或多种试剂可以附接到颗粒。试剂可以共价附接到颗粒。试剂可以可逆地或不可逆地附接到颗粒。试剂可以经由acrydite部分附接到颗粒。在一些情况下,寡核苷酸可以附接到颗粒。附接到颗粒的寡核苷酸可用于例如捕获RNA并进行逆转录反应。在一些实施方案中,颗粒(任选地为磁性颗粒)包含附接到其上的寡核苷酸,所述寡核苷酸包含能够与例如来自细胞mRNA的多聚A序列杂交的多聚T序列。
分区内的细胞可以如本文所述裂解,从而将成分从细胞释放到分区中。成分可以包括多种类型的细胞组分,包括蛋白质、代谢物和/或核酸分子(例如,DNA、RNA(例如,信使RNA)等)。可替代地或另外地,分区内的细胞可以被透化。在进行或不进行完全的细胞裂解的情况下,透化可允许将某些试剂、物质、成分等转移到细胞中和/或转移出细胞。在一些实施方案中,在细胞珠粒聚合或凝胶化之前裂解或透化细胞。在其他实施方案中,在细胞珠粒聚合或凝胶化的同时裂解或透化细胞。在一些实施方案中,在细胞珠粒聚合或凝胶化之后裂解或透化细胞。在仍其他实施方案中,细胞当在细胞珠粒中时不被裂解或透化。
试剂可以包括在分区内,包括附接到前体、颗粒等的试剂,并且可以用于对细胞或来自或衍生自细胞的成分进行一种或多种反应。反应可以是例如扩增、逆转录或脱氨反应。在一些实施方案中,一种或多种反应在细胞珠粒聚合或凝胶化之前进行。在一些实施方案中,一种或多种反应在细胞珠粒聚合或凝胶化的同时进行。在一些实施方案中,一种或多种反应在细胞珠粒聚合或凝胶化之后进行。在一些情况下,使用寡核苷酸(例如,引物)对来自细胞的信使RNA进行逆转录反应,从而产生互补DNA(cDNA)。逆转录可以包括向cDNA中添加另外的核苷酸,例如多核苷酸,如多聚C。在一些情况下,可以进行模板转换以进一步延伸cDNA。模板转换可以将一个或多个另外的序列附加到cDNA上。在一些情况下,另外的序列可用于促进核酸延伸/扩增和/或条形码化,如本文所述。cDNA可以附接到前体和/或颗粒。在一些情况下,使用寡核苷酸以在产生细胞珠粒之前捕获来自细胞的信使RNA(例如,经由杂交)。
在一些实施方案中,使分区经受足以产生包含一种或多种试剂的细胞珠粒的条件。例如,可以使包含附接到试剂(例如,引物、核酸分子等)的聚合物前体的分区液滴聚合或凝胶化,使得试剂附接到聚合物或凝胶基质(例如,附接到细胞珠粒)。在一些情况下,试剂经由不稳定键(例如,化学不稳定键、热不稳定键或光不稳定键)可释放地附接到凝胶前体。试剂可以共价附接到细胞珠粒。试剂可以可逆地或不可逆地附接到细胞珠粒。试剂可以附接到凝胶珠粒的表面。试剂可以附接到细胞珠粒的内部。在一些情况下,mRNA附接到细胞珠粒。例如,附接到来自细胞的mRNA的聚合物前体可以聚合或凝胶化以产生细胞珠粒,使得mRNA附接到细胞珠粒。在一些情况下,cDNA附接到细胞珠粒。例如,附接到衍生自细胞的cDNA的聚合物前体可以聚合以产生细胞珠粒,使得cDNA附接到细胞珠粒。在一些情况下,一种或多种寡核苷酸附接到细胞珠粒。例如,附接到寡核苷酸的聚合物前体可以聚合或凝胶化以产生细胞珠粒,使得寡核苷酸附接到细胞珠粒。
将大分子成分(例如,核酸分子、蛋白质等)附接到细胞珠粒或细胞珠粒内的颗粒可用于制备用于进一步处理的物质。例如,附接到细胞珠粒或颗粒的核酸分子可以在保持附接到细胞珠粒或颗粒的同时被处理。处理后,核酸可以从细胞珠粒和/或颗粒中释放(例如,释放到分区中)用于分析。在一些情况下,可以将一种类型的细胞组分或其衍生物(例如,mRNA、cDNA)附接到细胞珠粒或细胞珠粒内的颗粒,同时包封但不附接另一种类型的细胞组分(例如,基因组DNA)。这可用于例如促进多种类型的组分的单独处理。例如,在细胞珠粒形成后,可以将细胞珠粒转移到水溶液中并如本文所述进行另外处理。例如,可以对细胞珠粒批量进行逆转录以从捕获的mRNA产生cDNA(例如,与附接到细胞珠粒基质或颗粒(如磁性颗粒)的寡核苷酸杂交)。
点击化学
如本文所用,术语“点击化学”通常是指模块化的、宽范围的、高产率的、仅产生无害副产物(如可以通过非色谱法去除的那些)的、并且是立体定向的(但不一定具有对映选择性)的反应。参见例如,美国专利公开2019/0100632(现在是美国专利10,590,244)、美国专利公开2019/0233878和Angew.Chem.Int.Ed.,2001,40(11):2004-2021,其出于所有目的通过引用以其整体并入本文。
在一些情况下,点击化学可以描述在温和的水性条件下可以选择性地彼此反应的官能团对。点击化学反应的例子可以是叠氮化物与炔烃的Huisgen 1,3-偶极环加成,例如叠氮化物与炔烃的铜催化的反应以形成称为1,2,3-三唑的5元杂原子环。该反应还可以称为Cu(I)催化的叠氮化物-炔烃环加成(CuAAC)、Cu(I)点击化学或Cu+点击化学。用于点击化学的催化剂可以是Cu(I)盐、或通过用还原剂将Cu(II)试剂还原为Cu(I)试剂而原位制备的Cu(I)盐(Pharm Res.2008,25(10):2216-2230)。用于点击化学的已知Cu(II)试剂可以包括但不限于Cu(II)-(TBTA)络合物和Cu(II)(THPTA)络合物。TBTA是三-[(1-苄基-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基]胺,也称为三-(苄基三唑基甲基)胺,可以是Cu(I)盐的稳定配体。THPTA是三-(羟丙基三唑基甲基)胺,可以是Cu(I)的稳定剂的另一个例子。也可以实现其他条件以使用无铜点击化学从叠氮化物和炔烃构建1,2,3-三唑环,例如通过应变促进的叠氮化物-炔烃点击化学反应(SPAAC,参见例如,Chem.Commun.,2011,47:6257-6259和Nature,2015,519(7544):486-90),将这些文献中的每一个出于所有目的通过引用以其整体并入本文。
在一些情况下,本公开文本还考虑使用点击化学反应产生不是1,2,3-三唑的化学连接。参见例如,美国专利公开2019/0233878,其通过引用以其整体并入。用于制备生物相容性凝胶的一系列这样的点击化学反应是本领域公知的。参见例如,Madl和Heilshorn,“Bioorthogonal Strategies for Engineering Extracellular Matrices,”Adv.Funct.Mater.2018,28:1706046,其通过引用特此并入本文。
可用于本公开文本的组合物和方法中的不含铜且不产生1,2,3-三唑连接的点击化学反应的例子是反电子需求狄尔斯-阿尔德(IED-DA)反应。(参见例如,Madl和Heilshorn2018。)如本文别处所述,在IED-DA点击化学反应中,点击化学官能团对包含四嗪基团和反式环辛烯(TCO)基团、或四嗪基团和降冰片烯基团。该反应不含铜且产生包含二氢哒嗪基团而不是1,2,3-三唑的连接。
可用于本公开文本的组合物和方法中但产生除1,2,3-三唑以外的化学连接的其他特异性双正交点击化学反应包括呋喃和马来酰亚胺官能团对之间的狄尔斯-阿尔德反应、施陶丁格连接和氧化腈环加成。这些点击化学反应和其他点击化学反应是本领域公知的,并且描述于例如Madl和Heilshorn 2018中。
因此,在一些实施方案中,可用于形成本公开文本的交联聚合物的无铜点击化学可以选自:(a)应变促进的叠氮化物/二苯并环辛炔-胺(DBCO)点击化学;(b)反电子需求狄尔斯-阿尔德(IED-DA)四嗪/反式-环辛烯(TCO)点击化学;(c)反电子需求狄尔斯-阿尔德(IED-DA)四嗪/降冰片烯点击化学;(d)狄尔斯-阿尔德马来酰亚胺/呋喃点击化学;(e)施陶丁格连接;和(f)氧化腈/降冰片烯环加成点击化学。
试剂
根据某些方面,生物颗粒可以与裂解试剂一起被分区,以便释放分区内生物颗粒的内容物。参见例如,美国专利公开2018/0216162(现在是美国专利10,428,326)、美国专利公开2019/0100632(现在是美国专利10,590,244)和美国专利公开2019/0233878,其通过引用以其整体并入。细胞珠粒可以与核酸条形码分子一起被分区,并且细胞珠粒的或源自细胞珠粒的核酸分子(例如,mRNA、cDNA、gDNA等)可以被条形码化,如本文别处所述。在一些实施方案中,细胞珠粒与携带条形码的珠粒(例如,凝胶珠粒)共分区,并且细胞珠粒的或源自细胞珠粒的核酸分子被条形码化,如本文别处所述。在这种情况下,裂解剂可以与生物颗粒悬浮液接触,与将生物颗粒引入分区交汇点/液滴生成区(例如交汇点210)同时或紧接在其之前,如通过通道交汇点上游的另外的一个或多个通道。根据其他方面,附加地或可替代地,生物颗粒可以与其他试剂一起被分区,这将在下面进一步描述。
图3示出了用于对生物颗粒和试剂进行共分区的微流体通道结构300的例子。通道结构300可以包括通道区段301、302、304、306和308。通道区段301和302在第一通道交汇点309处连通。通道区段302、304、306和308在第二通道交汇点310处连通。
在示例性操作中,通道区段301可以沿着通道区段301将包括多个生物颗粒314的水性流体312输送到第二交汇点310中。作为替代或另外地,通道区段301可以运输珠粒(例如凝胶珠粒)。珠粒可以包含条形码分子。
例如,通道区段301可以连接到包含生物颗粒314的水性悬浮液的储器。在第二交汇点310的上游,并且就在到达第二交汇点之前,通道区段301可以在第一交汇点309处与通道区段302相遇。通道区段302可将悬浮在水性流体312中的多种试剂315(例如裂解剂)沿通道区段302输送到第一交汇点309。例如,通道区段302可以连接到包括试剂315的储器。在第一交汇点309之后,通道区段301中的水性流体312可以携带生物颗粒314和试剂315到达第二交汇点310。在一些情况下,通道区段301中的水性流体312可以包括一种或多种试剂,这些试剂可以是与试剂315相同或不同的试剂。与水性流体312不混溶的第二流体316(例如油)可以从通道区段304和306中的每一个递送到第二交汇点310。当来自通道区段301的水性流体312以及来自通道区段304和306中的每一个的第二流体316在第二通道交汇点310处相遇时,水性流体312可以被分区成第二流体316中的离散液滴318,并沿着通道区段308从第二交汇点310流出。通道区段308可以将离散的液滴318递送到与通道区段308进行流体联接的出口储器,在那里液滴可以被收获。
第二流体316可以包括油,例如氟化油,其包括用于稳定所得液滴的含氟表面活性剂,例如,抑制所得液滴318的后续聚结。
产生的离散液滴可以包括单个生物颗粒314和/或一种或多种试剂315。在一些情况下,产生的离散液滴可以包括携带条形码的珠粒(未示出),如经由本文别处描述的其他微流体结构。在一些情况下,离散的液滴可能未被占据(例如,没有试剂,没有生物颗粒)。
有益地,在裂解试剂和生物颗粒被共分区时,裂解试剂可以促进生物颗粒的内容物在分区内的释放。分区中释放的内容物可以与其他分区的内容物保持离散状态。
可以理解的是,本文所述的通道区段可以连接到多种不同的流体源或接收部件中的任何一种,包括储器、管道、歧管或其他系统的流体部件。可以理解,微流体通道结构300可以具有其他几何形状。例如,微流体通道结构可以具有两个以上的通道交汇点。例如,微流体通道结构可以具有在通道交汇点相遇的2个、3个、4个、5个或更多个通道区段,每个通道区段携带相同或不同类型的珠粒、试剂和/或生物颗粒。可以控制每个通道区段中的流体流动,以控制不同元素被分区到液滴中。流体可以经由一个或多个流体流动单元沿着一个或多个通道或储器被引导流动。流体流动单元可以包括压缩机(例如,提供正压)、泵(例如,提供负压)、致动器等来控制流体的流动。流体也可以或以其他方式经由施加的压差、离心力、电动泵送、真空、毛细管或重力流等来控制。
裂解剂的例子包括生物活性试剂,如用于裂解不同细胞类型(例如革兰氏阳性或阴性细菌、植物、酵母、哺乳动物细胞等)的裂解酶,如溶菌酶、无色肽酶、溶葡萄球菌酶、labiase、细胞裂解酶、溶细胞酶、以及可从例如Sigma-Aldrich公司(密苏里州圣路易斯)获得的各种其他裂解酶、以及其他商业上可获得的裂解酶。其他裂解剂可以附加地或可替代地与生物颗粒共分区,以使生物颗粒的内容物释放到分区中。例如,在一些情况下,基于表面活性剂的裂解溶液可以用于裂解细胞,尽管这些对于基于乳液的系统(其中表面活性剂会干扰稳定的乳液)可能不太理想。在一些情况下,裂解溶液可以包括非离子表面活性剂,例如TritonX-100和Tween 20。在一些情况下,裂解溶液可以包括离子表面活性剂,例如十二烷基肌氨酸钠和十二烷基硫酸钠(SDS)。电穿孔、热、声或机械细胞破坏也可用于某些情况,例如非基于乳液的分区,例如生物颗粒的包封,其可补充或代替液滴分区,其中在细胞破裂后,包封的任何孔径都足够小以截留给定尺寸的核酸片段。
作为与上述生物颗粒共分区的裂解剂的替代或另外地,其他试剂也可以与生物颗粒共分区,包括例如DNA酶和RNA酶灭活剂或抑制剂(如蛋白酶K),螯合剂(如EDTA),以及用于去除或以其他方式减少不同细胞裂解物组分对核酸后续处理的负面活性或影响的其他试剂。此外,在包封的生物颗粒的情况下,生物颗粒可以暴露于适当的刺激,以从共分区的微胶囊中释放生物颗粒或其内容物。例如,在一些情况下,化学刺激可以与包封的生物颗粒一起被共分区,以允许微胶囊的降解和细胞或其内容物释放到更大的分区中。在一些情况下,这种刺激可以与本文别处描述的用于从它们各自的微胶囊(例如珠粒)中释放核酸分子(例如寡核苷酸)的刺激相同。在替代方面,这可以是不同且不重叠的刺激,以便允许包封的生物颗粒在不同于核酸分子释放到分区的时间释放到相同分区中。
另外的试剂也可以与生物颗粒共分区,例如用于片段化生物颗粒的DNA的核酸内切酶、用于扩增生物颗粒核酸片段并将条形码分子标签附接到扩增片段上的DNA聚合酶和dNTP。其他酶可以被共分区,所述其他酶包括但不限于聚合酶、转座酶、连接酶、蛋白酶K、DNA酶等。另外的试剂还可以包括逆转录酶,包括具有末端转移酶活性的酶、引物和寡核苷酸以及可以用于模板转换的转换寡核苷酸(本文中也称为“转换寡核苷酸”或“模板转换寡核苷酸”)。在一些情况下,模板转换可以用于增加cDNA的长度。在一些情况下,模板转换可以用于将预定核酸序列附加到cDNA。在模板转换的一个例子中,可以从模板(例如细胞mRNA)的逆转录生成cDNA,其中具有末端转移酶活性的逆转录酶可以以模板无关的方式向cDNA添加另外的核苷酸,例如多聚C。转换寡核苷酸可以包括与另外的核苷酸互补的序列,例如,多聚G。cDNA上的另外的核苷酸(例如,多聚C)可以与转换寡核苷酸上的另外的核苷酸(例如,多聚G)杂交,由此转换寡核苷酸可以被逆转录酶用作模板来进一步延伸cDNA。模板转换寡核苷酸可以包含杂交区和模板区。杂交区可以包含能够与靶标杂交的任何序列。在一些情况下,如前所述,杂交区包含一系列G碱基,以补充cDNA分子3’端的突出C碱基。G碱基系列可以包括1个G碱基、2个G碱基、3个G碱基、4个G碱基、5个G碱基或多于5个G碱基。模板序列可以包括任何要掺入cDNA中的序列。在一些情况下,模板区域包含至少1个(例如,至少2个、3个、4个、5个或更多个)标签序列和/或功能序列。转换寡核苷酸可以包括脱氧核糖核酸;核糖核酸;修饰的核酸,包括2-氨基嘌呤、2,6-二氨基嘌呤(2-氨基-dA)、倒dT、5-甲基dC、2’-脱氧肌苷、Super T(5-羟基丁炔-2’-脱氧尿苷)、Super G(8-氮杂-7-脱氮鸟苷)、锁核酸(LNA)、解锁核酸(UNA,例如UNA-A、UNA-U、UNA-C、UNA-G)、Iso-dG、Iso-dC、2’氟代碱基(例如氟代C、氟代U、氟代A、和氟代G)或任何组合。
在一些情况下,转换寡核苷酸的长度可以是至少约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249或250个核苷酸或更长。
在一些情况下,转换寡核苷酸的长度可以是至多约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249或250个核苷酸。
一旦细胞的内容物被释放到它们各自的分区中,其中包括的大分子成分(例如生物颗粒的大分子成分,如RNA、DNA或蛋白质)可以在分区中进一步处理。根据本文所述的方法和系统,单个生物颗粒的大分子成分含量可以提供有唯一标识符,使得在表征这些大分子成分时,它们可以被认为来自相同的一个或多个生物颗粒。将特征归属于单独生物颗粒或生物颗粒组的能力是通过将唯一标识符特异性分配至单独生物颗粒或生物颗粒组来提供。唯一标识符(例如核酸条形码形式的标识符)可以被分配给或缔合单个生物颗粒或生物颗粒群体,以便用唯一标识符标签化或标记生物颗粒的大分子成分(以及因此其特征)。然后,这些唯一标识符可以用于将生物颗粒的组分和特征归属于单独生物颗粒或生物颗粒组。
在一些方面,这是通过用唯一标识符将单个生物颗粒或生物颗粒组共分区来执行的,如上文所述(参考图2)。在一些方面,唯一标识符以核酸分子(例如,寡核苷酸)的形式提供,所述核酸分子包括核酸条形码序列,所述核酸条形码序列可以附接到或以其他方式缔合单个生物颗粒的核酸内容物,或附接到生物颗粒的其他成分、特别是那些核酸的片段。核酸分子被分区,使得在给定分区中的核酸分子之间,其中包含的核酸条形码序列是相同的,但是在不同分区之间,核酸分子可以并且确实具有不同的条形码序列,或者至少在给定分析中代表所有分区的大量不同条形码序列。在一些方面,只有一个核酸条形码序列可以与给定的分区缔合,尽管在一些情况下,可能存在两个或更多个不同的条形码序列。
核酸条形码序列可以在核酸分子(例如寡核苷酸)的序列中包括约6至约20个或更多个核苷酸。核酸条形码序列可以包括约6至约20、30、40、50、60、70、80、90、100或更多个核苷酸。在一些情况下,条形码序列的长度可以是约6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个核苷酸或更长。在一些情况下,条形码序列的长度可以是至少约6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个核苷酸或更长。在一些情况下,条形码序列的长度可以至多约6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个核苷酸或更短。这些核苷酸可以是完全连续的,例如在相邻核苷酸的单个片段中,或者它们可以被分成两个或多个分开的子序列,这些子序列被1个或多个核苷酸分开。在一些情况下,分离的条形码子序列的长度可以为约4至约16个核苷酸。在一些情况下,条形码子序列可以是约4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16个核苷酸或更长。在一些情况下,条形码子序列可以是至少约4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16个核苷酸或更长。在一些情况下,条形码子序列可能至多约为4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16个核苷酸或更短。
共分区的核酸分子还可以包含可用于处理来自共分区的生物颗粒的核酸的其他功能序列。这些序列包括例如用于扩增来自分区内的单独生物颗粒的基因组DNA同时附接相关条形码序列的靶向的或随机的/通用的扩增引物序列、测序引物或引物识别位点、杂交或探测序列(例如,用于鉴定序列的存在或用于拉下条形码化的核酸)或者多种其他潜在功能序列中的任一种。还可以采用共分区寡核苷酸的其他机制,包括例如两个或更多个液滴的聚结,其中一个液滴含有寡核苷酸,或者将寡核苷酸微分配至分区(例如,微流体系统内的液滴)中。
在一个实例中,提供了微胶囊,例如珠粒,其每个都包括大量可释放地附接到珠粒上的上述条形码化核酸分子(例如,条形码化寡核苷酸),其中附接到特定珠粒上的所有核酸分子将包括相同的核酸条形码序列,但是其中大量不同的条形码序列在所使用的珠粒群体中表示。在一些实施方案中,水凝胶珠粒(例如包含聚丙烯酰胺聚合物基质)被用作核酸分子进入分区的固体支持物和递送载体,因为它们能够携带大量核酸分子,并且可以被配置为在暴露于特定刺激时释放那些核酸分子,如本文别处所述。在一些情况下,珠粒群体提供了多样的条形码序列文库,其包括至少约1,000个不同的条形码序列、至少约5,000个不同的条形码序列、至少约10,000个不同的条形码序列、至少约50,000个不同的条形码序列、至少约100,000个不同的条形码序列、至少约1,000,000个不同的条形码序列、至少约5,000,000个不同的条形码序列、或至少约10,000,000个不同的条形码序列、或更多。此外,每个珠粒可以提供有大量附接的核酸(例如寡核苷酸)分子。特别地,在单个珠粒上包括条形码序列的核酸分子的分子数量可以是至少约1,000个核酸分子、至少约5,000个核酸分子、至少约10,000个核酸分子、至少约50,000个核酸分子、至少约100,000个核酸分子、至少约500,000个核酸、至少约1,000,000个核酸分子、至少约5,000,000个核酸分子、至少约10,000,000个核酸分子、至少约50,000,000个核酸分子、至少约100,000,000个核酸分子、至少约250,000,000个核酸分子、以及在一些情况下至少约十亿个核酸分子、或更多。给定珠粒的核酸分子可以包括相同的(或共同的)条形码序列、不同的条形码序列、或两者的组合。给定珠粒的核酸分子可以包括多组核酸分子。给定组的核酸分子可以包括相同的条形码序列。相同的条形码序列可以与另一组中核酸分子的条形码序列不同。
此外,当珠粒的群体被分区时,所得分区的群体还可以包括多样的条形码文库,所述文库包括至少约1,000个不同的条形码序列、至少约5,000个不同的条形码序列、至少约10,000个不同的条形码序列、至少约50,000个不同的条形码序列、至少约100,000个不同的条形码序列、至少约1,000,000个不同的条形码序列、至少约5,000,000个不同的条形码序列、或至少约10,000,000个不同的条形码序列。此外,群体中的每个分区可以包括至少约1,000个核酸分子、至少约5,000个核酸分子、至少约10,000个核酸分子、至少约50,000个核酸分子、至少约100,000个核酸分子、至少约500,000个核酸分子、至少约1,000,000个核酸分子、至少约5,000,000个核酸分子、至少约10,000,000个核酸分子、至少约50,000,000个核酸分子、至少约100,000,000个核酸分子、至少约250,000,000个核酸分子以及在一些情况下至少约十亿个核酸分子。
在一些情况下,可以期望在给定分区内掺入多种不同的条形码,它们附接到所述分区内的单一珠粒或多个珠粒。例如,在一些情况下,混合的但已知的一组条形码序列可以在后续处理中提供更多的鉴定保证,例如通过向给定分区提供更强的条形码寻址或归属,作为对来自给定分区的输出的重复或独立确认。
当对珠粒施加特定的刺激时,核酸分子(例如寡核苷酸)可从珠粒中释放出来。在一些情况下,刺激可以是光刺激,例如通过切断释放核酸分子的光不稳定连接。在其他情况下,可以使用热刺激,其中珠粒环境的温度的升高将导致连接的切割或核酸分子从珠粒的其他释放。在仍其他情况下,可以使用化学刺激,其切割核酸分子与珠粒的连接,或者以其他方式导致从珠粒释放核酸分子。在一种情况下,这种组合物包括上述用于包封生物颗粒的聚丙烯酰胺基质,并且可以通过暴露于还原剂(如DTT)而降解以释放附接的核酸分子。
在一些方面,提供了用于受控分区的系统和方法。液滴尺寸可以通过调节通道结构(例如微流体通道结构)中的某些几何特征来控制。例如,可以调节通道的扩张角、宽度和/或长度来控制液滴尺寸。
图4示出了用于将珠粒受控分区到离散液滴的微流体通道结构的例子。通道结构400可以包括通道区段402,所述通道区段在通道交汇点406(或交叉点)处与储器404连通。储器404可以是一个腔室。对如本文所用的“储器”的任何提及也可以是指“腔室”。在操作中,包括悬浮珠粒412的水性流体408可以沿着通道区段402输送到交汇点406,以与储器404中的第二流体410相遇,第二流体与水性流体408不混溶,从而产生流入储器404的水性流体408的液滴416、418。在水性流体408和第二流体410相遇的交汇点406处,液滴可以基于诸如交汇点406处的流体动力,两种流体408、410的流速,流体性质,以及通道结构400的某些几何参数(例如w、h0、α等)等因素而形成。通过将水性流体408从通道区段402连续注入通过交汇点406,可以在储器404中收集多个液滴。
产生的离散液滴可以包括珠粒(例如,在被占据的液滴416中)。可替代地,产生的离散液滴可以包括多于一个珠粒。可替代地,产生的离散液滴可以不包括任何珠粒(例如,如在未被占据的液滴418中)。在一些情况下,产生的离散液滴可以含有一个或多个生物颗粒,如本文别处所述。在一些情况下,产生的离散液滴可以包含一种或多种试剂,如本文别处所述。
在一些情况下,水性流体408可以具有基本均匀的珠粒412浓度或频率。珠粒412可以从分立通道(图4中未示出)引入通道区段402。可以通过控制珠粒412引入通道区段402的频率和/或通道区段402和分立通道中流体的相对流速来控制珠粒412在通道区段402中的频率。在一些情况下,珠粒可以从多个不同的通道引入通道区段402,并且相应地控制频率。
在一些情况下,通道区段402中的水性流体408包含生物颗粒(例如,参考图1和图2描述的)。在一些情况下,水性流体408可以具有基本均匀的生物颗粒浓度或频率。与珠粒一样,生物颗粒可以从分立通道引入通道区段402中。可以通过控制将生物颗粒引入通道区段402的频率和/或通道区段402和分立通道中流体的相对流速来控制通道区段402中水性流体408中生物颗粒的频率或浓度。在一些情况下,生物颗粒可以从多个不同的通道引入通道区段402,并且相应地控制频率。在一些情况下,第一分立通道可以引入珠粒,第二分立通道可以将生物颗粒引入通道区段402。引入珠粒的第一分立通道可以在引入生物颗粒的第二分立通道的上游或下游。
第二流体410可以包括油,例如氟化油,其包括用于稳定所得液滴的含氟表面活性剂,例如,抑制所得液滴的后续聚结。
在一些情况下,第二流体410可以不发生和/或不被引导任何流入或流出储器404的流动。例如,第二流体410可以基本上静止在储器404中。在一些情况下,第二流体410可以在储器404内流动,但不会流入或流出储器404,例如经由向储器404施加压力和/或在交汇点406处受到水性流体408的流入的影响。可替代地,第二流体410可以发生和/或被引导流入或流出储器404。例如,储器404可以是将第二流体410从上游引导至下游的通道,输送产生的液滴。
在交汇点406处或附近的通道结构400可能具有某些几何特征,这些几何特征至少部分地决定了由通道结构400形成的液滴的尺寸。通道区段402可以在交汇点406处或附近具有高度h0和宽度w。举例来说,通道区段402可以包括通向具有更宽截面(例如宽度或直径)的储器404的矩形截面。可替代地,通道区段402的截面可以是其他形状,例如圆形、梯形、多边形或任何其他形状。在交汇点406处或附近的储器404的顶壁和底壁可以以扩张角α倾斜。扩张角α允许舌部(在交汇点406处离开通道区段402并在液滴形成之前进入储器404的一部分水性流体408)增加深度,并有助于中间形成的液滴的曲率减小。液滴尺寸可能随着扩张角的增加而减小。对于h0、w和α的前述几何参数,所得液滴半径Rd可通过以下等式预测:
举例来说,对于w=21μm、h=21μm和α=3°的通道结构,预测的液滴尺寸为121μm。在另一例子中,对于w=25μm、h=25μm和α=5°的通道结构,预测的液滴尺寸为123μm。在另一例子中,对于w=28μm、h=28μm和α=7°的通道结构,预测的液滴尺寸为124μm。
在一些情况下,扩张角α可以在约0.5°至约4°、约0.1°至约10°、或者约0°至约90°的范围内。例如,扩张角可以是至少约0.01°、0.1°、0.2°、0.3°、0.4°、0.5°、0.6°、0.7°、0.8°、0.9°、1°、2°、3°、4°、5°、6°、7°、8°、9°、10°、15°、20°、25°、30°、35°、40°、45°、50°、55°、60°、65°、70°、75°、80°、85°或更高。在一些情况下,扩张角可以是至多约89°、88°、87°、86°、85°、84°、83°、82°、81°、80°、75°、70°、65°、60°、55°、50°、45°、40°、35°、30°、25°、20°、15°、10°、9°、8°、7°、6°、5°、4°、3°、2°、1°、0.1°、0.01°或更少。在一些情况下,宽度w可以在约100微米(μm)至约500μm的范围内。在一些情况下,宽度w可以在约10μm至约200μm的范围内。可替代地,宽度可以小于约10μm。可替代地,宽度可以大于约500μm。在一些情况下,进入交汇点406的水性流体408的流速可以在约0.04微升(μL)/分钟(min)至约40μL/min之间。在一些情况下,进入交汇点406的水性流体408的流速可以在约0.01微升(μL)/分钟(min)至约100μL/min之间。可替代地,进入交汇点406的水性流体408的流速可以小于约0.01μL/min。可替代地,进入交汇点406的水性流体408的流速可以大于约40μL/min,如45μL/min、50μL/min、55μL/min、60μL/min、65μL/min、70μL/min、75μL/min、80μL/min、85μL/min、90μL/min、95μL/min、100μL/min、110μL/min、120μL/min、130μL/min、140μL/min、150μL/min或更大。在较低的流速下,如约小于或等于10微升/分钟的流速,液滴半径可能不取决于进入交汇点406的水性流体408的流速。
在一些情况下,至少约50%的产生的液滴可以具有均匀的尺寸。在一些情况下,至少约55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更多的产生的液滴可以具有均匀的尺寸。可替代地,小于约50%的产生的液滴可以具有均匀的尺寸。
通过增加产生点,例如增加水性流体408通道区段(例如通道区段402)和储器404之间的交汇点(例如交汇点406)的数量,可以增加液滴产生的通量。可替代地或另外地,通过增加通道区段402中的水性流体408的流速,可以增加液滴产生的通量。
图5示出了用于增加液滴产生通量的微流体通道结构的例子。微流体通道结构500可以包括多个通道区段502和一个储器504。多个通道区段502中的每一个都可以与储器504进行流体连通。通道结构500可以包括在多个通道区段502与储器504之间的多个通道交汇点506。每个通道交汇点可以是液滴产生的一个点。来自图4中的通道结构400的通道区段402及其部件的任何描述可以对应于通道结构500中的所述多个通道区段502的给定通道区段及其对应部件的任何描述。来自通道结构400的储器404及其部件的任何描述可以对应于来自通道结构500的储器504及其相应部件的任何描述。
多个通道区段502中的每个通道区段可以包括水性流体508,其包括悬浮珠粒512。储器504可以包括与水性流体508不混溶的第二流体510。在一些情况下,第二流体510可以不发生和/或不被引导任何流入或流出储器504的流动。例如,第二流体510可以基本上静止在储器504中。在一些情况下,第二流体510可以在储器504内流动,但不会流入或流出储器504,例如经由向储器504施加压力和/或在交汇点处受到水性流体508的流入的影响。可替代地,第二流体510可以发生和/或被引导流入或流出储器504。例如,储器504可以是将第二流体510从上游引导至下游的通道,输送产生的液滴。
在操作中,包括悬浮珠粒512的水性流体508可以沿着多个通道区段502输送到多个交汇点506中,以与储器504中的第二流体510相遇,从而产生液滴516、518。液滴可以从每个通道区段在每个相应的与储器504的交汇点形成。在水性流体508和第二流体510相遇的交汇点,液滴可以基于诸如交汇点的流体动力,两种流体508、510的流速,流体性质,以及通道结构500的某些几何参数(例如w、h0、α等)等因素而形成,如本文别处所述。通过从多个通道区段502通过多个交汇点506连续注入水性流体508,可以在储器504中收集多个液滴。利用通道结构500的平行通道配置,吞吐量可能会显著增加。例如,在通道区段中的流体流速基本相同的条件下,具有包括水性流体508的五个入口通道区段的通道结构可以比具有一个入口通道区段的通道结构产生液滴的频率高五倍。不同入口通道区段中的流体流速可以基本相同,也可以不相同。通道结构可以具有尽可能多的平行通道区段,这是实用的,并且考虑到了储器的尺寸。例如,通道结构可以具有至少约2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、500、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1000、1500、5000个或更多个平行或基本平行的通道区段。
对于多个通道区段502中的每个通道区段,几何参数w、h0和α可以是一致的,也可以是不一致的。例如,每个通道区段在其与储器504的相应通道交汇点或附近可以具有相同或不同的宽度。例如,每个通道区段在其与储器504的相应通道交汇点或附近可以具有相同或不同的高度。在另一例子中,储器504在与所述多个通道区段502的不同通道交汇点处可以具有相同或不同的扩张角。当几何参数一致时,有利的是,液滴尺寸也可以被控制为一致的,即使增加了通量。在一些情况下,当期望具有不同的液滴尺寸分布时,所述多个通道区段502的几何参数可以相应地变化。
在一些情况下,至少约50%的产生的液滴可以具有均匀的尺寸。在一些情况下,至少约55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更多的产生的液滴可以具有均匀的尺寸。可替代地,小于约50%的产生的液滴可以具有均匀的尺寸。
图6示出了用于增加液滴产生通量的微流体通道结构的另一个例子。微流体通道结构600可以包括多个通道区段602,这些通道区段通常围绕储器604的周边呈圆形排列。多个通道区段602中的每一个都可以与储器604流体连通。通道结构600可以包括在多个通道区段602与储器604之间的多个通道交汇点606。每个通道交汇点可以是液滴产生的一个点。来自图4中的通道结构400的通道区段402及其部件的任何描述可以对应于通道结构600中的所述多个通道区段602的给定通道区段及其对应部件的任何描述。来自通道结构400的储器404及其部件的任何描述可以对应于来自通道结构600的储器604及其相应部件的任何描述。
多个通道区段602中的每个通道区段可以包括水性流体608,其包括悬浮珠粒612。储器604可以包括与水性流体608不混溶的第二流体610。在一些情况下,第二流体610可以不发生和/或不被引导至任何流入或流出储器604的流动。例如,第二流体610可以基本上静止在储器604中。在一些情况下,第二流体610可以在储器604内流动,但不会流入或流出储器604,例如经由向储器604施加压力和/或在交汇点处受到水性流体608的流入的影响。可替代地,第二流体610可以发生和/或被引导流入或流出储器604。例如,储器604可以是将第二流体610从上游引导至下游的通道,从而输送所生成的液滴。
在操作中,包括悬浮珠粒612的水性流体608可以沿着多个通道区段602输送到多个交汇点606中,以与储器604中的第二流体610相遇,从而产生多个液滴616。液滴可以从每个通道区段在每个相应的与储器604的交汇点形成。在水性流体608和第二流体610相遇的交汇点,液滴可以基于诸如交汇点的流体动力,两种流体608、610的流速,流体性质,以及通道结构600的某些几何参数(例如,通道区段602的宽度和高度、储器604的扩张角等)等因素而形成,如本文别处所述。通过从多个通道区段602通过多个交汇点606连续注入水性流体608,可以在储器604中收集多个液滴。利用通道结构600的基本平行的通道配置,吞吐量可能会显著增加。通道结构可以具有尽可能多的基本平行的通道区段,这是实用的,并且考虑到了储器的尺寸。例如,通道结构可以具有至少约2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1000、1500、5000个或更多个平行或基本平行的通道区段。多个通道区段可以基本均匀地间隔开,例如,围绕储器的边缘或周边。可替代地,多个通道区段的间隔可以是不均匀的。
储器604可能在每个通道交汇点或附近具有扩张角α(图6中未显示)。所述多个通道区段602中的每个通道区段在通道交汇点处或附近可以具有宽度w和高度h0。对于多个通道区段602中的每个通道区段,几何参数w、h0和α可以是一致的,也可以是不一致的。例如,每个通道区段在其与储器604的相应通道交汇点或附近可以具有相同或不同的宽度。例如,每个通道区段在其与储器604的相应通道交汇点或附近可以具有相同或不同的高度。
储器604在与所述多个通道区段602的不同通道交汇点处可以具有相同或不同的扩张角。例如,圆形储器(如图6所示)可以具有圆锥形、圆顶状或半球形的顶板(例如,顶壁),以便为多个通道交汇点606处或附近的每个通道区段602提供相同或基本相同的扩张角。当几何参数一致时,有利的是,即使通量增加,所得的液滴尺寸也可以被控制为一致的。在一些情况下,当期望具有不同的液滴尺寸分布时,所述多个通道区段602的几何参数可以相应地变化。
在一些情况下,至少约50%的产生的液滴可以具有均匀的尺寸。在一些情况下,至少约55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更多的产生的液滴可以具有均匀的尺寸。可替代地,小于约50%的产生的液滴可以具有均匀的尺寸。注射到液滴中的珠粒和/或生物颗粒可以具有或不具有均匀的尺寸。
图7A示出了具有用于受控分区的几何特征的微流体通道结构的另一个例子的截面图。通道结构700可以包括在通道交汇点706(或交叉点)处与储器704连通的通道区段702。在一些情况下,通道结构700及其一个或多个部件可以对应于通道结构100及其一个或多个部件。图7B示出了图7A的通道结构700的透视图。
包含多个颗粒716的水性流体712可以沿着通道区段702输送到交汇点706中,以与储器704中的第二流体714(例如,油等)相遇,第二流体与水性流体712不混溶,以产生流入储器704的水性流体712的液滴720。在水性流体712和第二流体714相遇的交汇点706,液滴可以基于诸如交汇点706处的流体动力,两种流体712、714的相对流速,流体性质,以及通道结构700的某些几何参数(例如Δh等)等因素而形成。通过将水性流体712从通道区段702连续注入到交汇点706,可以在储器704中收集多个液滴。
产生的离散液滴可以包含所述多个颗粒716中的一个或多个颗粒。如本文别处所述,颗粒可以是任何颗粒,例如珠粒、细胞珠粒、凝胶珠粒、生物颗粒、生物颗粒的大分子成分、或其他颗粒。可替代地,产生的离散液滴可以不包括任何颗粒。
在一些情况下,水性流体712可以具有基本均匀的颗粒716浓度或频率。如本文别处所述(例如,参考图4),颗粒716(例如,珠粒)可以从分立通道(图7A或7B中未示出)引入通道区段702。可以通过控制颗粒716引入通道区段702的频率和/或通道区段702和分立通道中流体的相对流速来控制颗粒716在通道区段702中的频率。在一些情况下,颗粒716可以从多个不同的通道引入通道区段702,并且相应地控制频率。在一些情况下,不同的颗粒可以经由分立的通道引入。例如,第一分立通道可以引入珠粒,第二分立通道可以将生物颗粒引入通道区段702。引入珠粒的第一分立通道可以在引入生物颗粒的第二分立通道的上游或下游。
在一些情况下,第二流体714可以不发生和/或不被引导任何流入或流出储器704的流动。例如,第二流体714可以基本上静止在储器704中。在一些情况下,第二流体714可以在储器704内流动,但不会流入或流出储器704,例如经由向储器704施加压力和/或在交汇点706处受到水性流体712的流入的影响。可替代地,第二流体714可以发生和/或被引导流入或流出储器704。例如,储器704可以是将第二流体714从上游引导至下游的通道,输送产生的液滴。
在交汇点706处或附近的通道结构700可能具有某些几何特征,这些几何特征至少部分地决定了由通道结构700形成的液滴的尺寸和/或形状。通道区段702可以具有第一截面高度h1,并且储器704可以具有第二截面高度h2。第一截面高度h1和第二截面高度h2可以不同,使得在交汇点706处存在高度差Δh。第二截面高度h2可以大于第一截面高度h1。在一些情况下,储器此后可以逐渐增加截面高度,例如,随着它离交汇点706越远而逐渐增加。在一些情况下,储器的截面高度可能会根据交汇点706处或附近的扩张角β而增加。高度差Δh和/或扩张角β可以允许舌部(在交汇点706处离开通道区段702并在液滴形成之前进入储器704的一部分水性流体712)增加深度,并有助于中间形成的液滴的曲率减小。例如,液滴尺寸可以随着高度差的增加和/或扩张角的增加而减小。
高度差Δh可以是至少约1μm。可替代地,高度差可以是至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500μm或更大。可替代地,高度差可以是至多约500、400、300、200、100、90、80、70、60、50、45、40、35、30、25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1μm或更小。在一些情况下,扩张角β可以在约0.5°至约4°、约0.1°至约10°、或者约0°至约90°的范围内。例如,扩张角可以是至少约0.01°、0.1°、0.2°、0.3°、0.4°、0.5°、0.6°、0.7°、0.8°、0.9°、1°、2°、3°、4°、5°、6°、7°、8°、9°、10°、15°、20°、25°、30°、35°、40°、45°、50°、55°、60°、65°、70°、75°、80°、85°或更高。在一些情况下,扩张角可以是至多约89°、88°、87°、86°、85°、84°、83°、82°、81°、80°、75°、70°、65°、60°、55°、50°、45°、40°、35°、30°、25°、20°、15°、10°、9°、8°、7°、6°、5°、4°、3°、2°、1°、0.1°、0.01°或更少。
在一些情况下,进入交汇点706的水性流体712的流速可以在约0.04微升(μL)/分钟(min)至约40μL/min之间。在一些情况下,进入交汇点706的水性流体712的流速可以在约0.01微升(μL)/分钟(min)至约100μL/min之间。可替代地,进入交汇点706的水性流体712的流速可以小于约0.01μL/min。可替代地,进入交汇点706的水性流体712的流速可以大于约40μL/min,例如45μL/min、50μL/min、55μL/min、60μL/min、65μL/min、70μL/min、75μL/min、80μL/min、85μL/min、90μL/min、95μL/min、100μL/min、110μL/min、120μL/min、130μL/min、140μL/min、150μL/min或更大。在较低的流速下,如约小于或等于10微升/分钟的流速,液滴半径可能不取决于进入交汇点706的水性流体712的流速。第二流体714可以在储器704中是静止的或基本静止的。可替代地,第二流体714可以流动,如以上述水性流体712的流速流动。
在一些情况下,至少约50%的产生的液滴可以具有均匀的尺寸。在一些情况下,至少约55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更多的产生的液滴可以具有均匀的尺寸。可替代地,小于约50%的产生的液滴可以具有均匀的尺寸。
虽然图7A和图7B示出了高度差Δh,其在交汇点706处是突变的(例如,阶跃式增加),但是高度差可以逐渐增加的(例如,从约0μm到最大高度差)。可替代地,高度差可以从最大高度差逐渐减小(例如,渐缩)。如本文所用的高度差的逐渐增加或减小可以指高度差的连续递增式增加或减小,其中高度轮廓的任何一个微分段和高度轮廓的紧邻微分段之间的角度大于90°。例如,在交汇点706处,通道的底壁和储器的底壁可以以大于90°的角度相交。可替代地或另外地,通道的顶壁(例如,顶板)和储器的顶壁(例如,顶板)可以以大于90°的角度相交。逐渐增加或减少可以是线性或非线性的(例如,指数、正弦等)。可替代地或另外地,高度差可以线性或非线性地可变地增加和/或减少。虽然图7A和图7B将扩张的储器截面高度图示为线性的(例如,恒定的扩张角β),但是截面高度可以非线性扩张。例如,储器可以至少部分地由具有可变扩张角的圆顶状(例如,半球形)形状限定。截面高度可以以任何形状扩张。
通道网络(例如,如上所述或本文别处所述)可以流体地联接到适当的流体部件。例如,入口通道区段流体联接到合适的物质源,所述物质将被输送到通道交汇点。这些源可以包括多种不同流体部件中的任何一种,从限定在微流体设备的主体结构中或连接到其上的简单储器,到从设备外源、歧管、流体流动单元(例如,致动器、泵、压缩机)等递送流体的流体导管。同样,出口通道区段(例如通道区段208、储器604等)可以流体联接到用于被分区的细胞的接收容器或导管,用于后续处理。同样,这可以是限定在微流体设备主体中的储器,或者它可以是用于将被分区的细胞递送到后续处理操作、仪器或部件的流体导管。
本文所述的方法和系统可以用于大大提高单细胞应用和/或接收基于液滴的输入的其他应用的效率。例如,在对被占据的细胞和/或适当尺寸的细胞进行分选之后,可以进行的后续操作可以包括在分区(例如,乳液中的凝胶珠粒)中进行逆转录、扩增产物的产生、纯化(例如,经由固相可逆固定法(SPRI))、进一步的处理(例如,剪切、功能序列的连接、以及后续的扩增(例如,经由PCR))、富集、文库构建和/或测序,例如,如图17B中所示。这些操作可以批量发生(例如,在分区之外)。在分区是乳液中的液滴的情况下,乳液可以被破坏,液滴的内容物被汇集用于另外的操作。可以与带有条形码的珠粒一起共分区的其他试剂可以包括阻断核糖体RNA(rRNA)的寡核苷酸和消化细胞基因组DNA的核酸酶。可替代地,可以在另外的处理操作中应用rRNA去除剂。通过这种方法产生的构建体的构型有助于在测序和/或对多核苷酸序列的5’端测序期间最小化(或避免)多聚T序列的测序。扩增产物(例如第一扩增产物和/或第二扩增产物)可以进行测序以进行序列分析。在一些情况下,可以使用部分发卡扩增测序(PHASE)方法进行扩增。
各种各样的应用需要评估生物颗粒群中不同生物颗粒或生物类型的存在和对其进行量化,包括例如微生物组分析和表征、环境测试、食品安全测试、流行病学分析,例如在追踪污染等方面。
包含与条形码分子缔合的条形码珠粒(例如,凝胶珠粒)和包封细胞成分如细胞核酸的珠粒(例如,细胞珠粒)的分区可以用于成分分析中,如在美国专利公开号2018/0216162中所述,其出于所有目的通过引用以其整体并入本文。
计算机系统
本公开提供了被编程为实现本公开的方法的计算机系统。图22显示了计算机系统2201,其被编程或以其他方式配置为(i)控制微流体系统(例如,流体流动),(ii)从未被占用的液滴中分选占用的液滴,(iii)聚合液滴,(iv)将细胞珠粒或细胞分区成分区(例如,液滴或孔),(v)裂解细胞和细胞珠粒,(vi)进行测序应用,(vii)分别产生和维护细胞因子或其他分析物特异性抗体条形码序列、MHC多聚体条形码序列、细胞表面蛋白条形码序列和由mRNA产生的cDNA的文库,(vi)分析这样的文库。计算机系统2201可以调节本公开文本的各个方面,例如调节微流体结构中一个或多个通道中的流体流速、调节聚合应用单元、调节序列应用单元等。计算机系统2201可以是用户的电子设备或相对于电子设备远程定位的计算机系统。电子设备可以是移动电子设备。
计算机系统2201包括中央处理单元(CPU,在本文中也称为“处理器”和“计算机处理器”)2205,其可以是单核或多核处理器,或者是用于并行处理的多个处理器。计算机系统2201还包括存储器或存储位置2210(例如,随机存取存储器、只读存储器、闪存)、电子存储单元2215(例如,硬盘)、用于与一个或多个其他系统通信的通信接口2220(例如,网络适配器)、以及外围设备2225(如高速缓冲存储器、其他存储器、数据存储设备和/或电子显示适配器)。存储器2210、存储单元2215、接口2220和外围设备2225通过通信总线(实线)(如主板)与CPU 2205通信。存储单元2215可以是用于存储数据的数据存储单元(或数据仓库)。借助于通信接口2220,计算机系统2201可以操作性地联接到计算机网络(“网络”)2230。网络2230可以是因特网、互联网和/或外联网,或者是与因特网通信的内联网和/或外联网。网络2230在一些情况下是电信和/或数据网络。网络2230可以包括一个或多个计算机服务器,其可以实现分布式计算,如云计算。网络2230,在一些情况下借助于计算机系统2201,可以实现对等网络,这可以使联接到计算机系统2201的设备充当客户端或服务器。
CPU 2205可以执行一系列机器可读指令,所述指令可以在程序或软件中实现。指令可以存储在存储器位置,如存储器2210中。指令可以被引导到CPU 2205,随后可以编程或以其他方式配置CPU 2205以实现本公开文本的方法。CPU 2205执行的操作的例子可以包括提取、解码、执行和写回。
CPU 2205可以是电路(如集成电路)的一部分。电路可以包括系统2201的一个或多个其他部件。在一些情况下,电路是专用集成电路(ASIC)。
存储单元2215可以存储文件,如驱动程序、函数库和保存的程序。存储单元2215可以存储用户数据,例如用户偏好和用户程序。在一些情况下,计算机系统2201可以包括在计算机系统2201外部的一个或多个另外的数据存储单元,如位于通过内联网或互联网与计算机系统2201通信的远程服务器上。
计算机系统2201可以通过网络2230与一个或多个远程计算机系统通信。例如,计算机系统2201可以与用户(例如,操作员)的远程计算机系统通信。远程计算机系统的例子包括个人计算机(例如,便携式PC)、平板电脑(例如,iPad、Galaxy Tab)、电话、智能手机(例如,iPhone、支持安卓的设备、)或个人数字助理。用户可以经由网络2230访问计算机系统2201。
本文中描述的方法可以通过存储在计算机系统2201的电子存储位置上(例如存储在存储器2210或电子存储单元2215上)的机器(例如,计算机处理器)可执行代码来实现。机器可执行代码或机器可读代码可以以软件的形式提供。在使用期间,代码可以由处理器2205执行。在一些情况下,代码可以从存储单元2215中检索,并存储在存储器2210中,以便处理器2205随时访问。在一些情况下,可以排除电子存储单元2215,并且机器可执行指令存储在存储器2210上。
代码可以被预编译和配置成与具有适于执行代码的处理器的机器一起使用,或者可以在运行时被编译。代码可以用编程语言来提供,可以选择所述编程语言来使代码能够以预编译或按照编译的方式执行。
本文提供的系统和方法的方面,如计算机系统2201,可以在编程中实现。该技术的各个方面可以被认为是“产品”或“制造品”,通常是机器(或处理器)可执行代码和/或在一种机器可读介质上承载或具体呈现的相关数据的形式。机器可执行代码可以存储在电子存储单元上,例如存储器(例如,只读存储器、随机存取存储器、闪存)或硬盘上。“存储”型介质可以包括计算机的任何或所有有形存储器、处理器等或其相关模块,例如各种半导体存储器、磁带驱动器、磁盘驱动器等,它们可以在任何时候为软件编程提供非暂时性存储。软件的全部或部分有时可以通过英特网或各种其他电信网络进行通信。例如,这种通信可以使得能够将软件从一个计算机或处理器加载到另一个计算机或处理器中,例如从管理服务器或主计算机加载到应用服务器的计算机平台中。因此,可以承载软件元素的另一种类型的介质包括光、电和电磁波,诸如通过有线和光学陆线网络以及各种空中链路在本地设备之间的物理接口上使用的。承载这种波的物理元件,例如有线或无线链路、光链路等,也可以被认为是承载软件的介质。如本文所用,除非限于非暂时性的有形“存储”介质,否则诸如计算机或机器“可读介质”的术语指参与向处理器提供指令以供执行的任何介质。
因此,诸如计算机可执行代码等机器可读介质可以采取许多形式,包括但不限于有形存储介质、载波介质或物理传输介质。非易失性存储介质包括例如光盘或磁盘,如任何一个或多个计算机等中的任何存储设备,诸如可以用于实现如图所示的数据库等。易失性存储介质包括动态存储器,如这种计算机平台的主存储器。有形传输介质包括同轴电缆;铜线和光纤,包括构成计算机系统内总线的导线。载波传输介质可以采取电信号或电磁信号的形式,或者声波或光波的形式,诸如在射频(RF)和红外(IR)数据通信中产生的那些。因此,计算机可读介质的常见形式包括例如:软盘、软磁盘、硬盘、磁带、任何其他磁性介质、CD-ROM、DVD或DVD-ROM、任何其他光学介质、穿孔卡、纸带、任何其他具有孔图案的物理存储介质、RAM、ROM、PROM和EPROM、FLASH-EPROM、任何其他存储芯片或内存盒、传输数据或指令的载波、传输这种载波的电缆或链路、或计算机可以从中读取编程代码和/或数据的任何其他介质。这些形式的计算机可读介质中的许多可能涉及将一个或多个指令的一个或多个序列传送到处理器以供执行。
计算机系统2201可以包括电子显示器1935或者与其通信,所述电子显示器包括用户接口(UI)2240,用于提供例如测序分析结果等。UI的例子包括但不限于图形用户界面(GUI)和基于网络的用户界面。
本公开文本的方法和系统可以通过一个或多个算法来实现。算法可以通过软件在被中央处理单元2205执行时来实现。算法可以例如执行核苷酸序列扩增、基于条形码大小的测序分选、测序扩增的条形码序列、分析测序数据等。
本公开文本的设备、系统、组合物和方法可以用于各种应用,例如处理来自单个细胞的单个分析物(例如RNA、DNA或蛋白质)或多个分析物(例如DNA和RNA,DNA和蛋白质,RNA和蛋白质,或RNA、DNA和蛋白质)。例如,生物颗粒(例如,细胞或细胞珠粒)被分区在分区(例如,液滴)中,并且来自生物颗粒的多个分析物被处理用于后续处理。所述多个分析物可以来自单个细胞。这可以实现例如细胞的同时蛋白质组学、转录组学和基因组学分析。
示例性实施方案
所提供的实施方案包括:
一种处理来自细胞的分泌分子的方法,所述方法包括:
(a)将所述分泌分子与第一多肽偶联以形成第一缀合物,所述第一多肽与所述细胞的表面偶联;以及
(b)将第二多肽与所述分泌分子偶联以形成第二缀合物,其中所述第二多肽包含含有第一条形码序列的核酸报告分子。
根据实施方案1所述的方法,所述方法还包括,在(a)之前,在足以使所述第一多肽与所述细胞表面偶联的条件下将所述细胞与所述第一多肽一起孵育。
根据实施方案1-2中任一项所述的方法,所述方法还包括,在(b)之前,刺激所述细胞以诱导所述分泌分子分泌。
根据实施方案1-3中任一项所述的方法,其中用抗原刺激所述细胞。
根据实施方案4所述的方法,其中所述抗原是模式识别受体(PRR)配体。
根据实施方案5所述的方法,其中所述PRR配体是Toll样受体(TLR)配体、NOD样受体(NLR)配体、RIG-I样受体(RLR)配体、C型凝集素受体(CLR)配体或胞质dsDNA感受器(CDS)配体。
根据实施方案4所述的方法,其中所述抗原是脂多糖(LPS)、双链DNA(dsDNA)、双链RNA(dsRNA)、合成dsRNA或CpG寡脱氧核苷酸(CpG ODN)。
根据实施方案7所述的方法,其中所述合成dsRNA是聚肌苷酸-聚胞苷酸(poly I:C)或聚腺苷酸-聚尿苷酸(poly A:U)。
根据实施方案3-8中任一项所述的方法,所述方法还包括以足以诱导所述分泌分子分泌的浓度向所述细胞提供多种抗原。
根据实施方案9所述的方法,其中在足以诱导所述分泌分子分泌的一段时间内向所述细胞提供多种抗原。
根据实施方案3-10中任一项所述的方法,其中所述多种抗原中的抗原与主要组织相容性复合物(MHC)分子偶联。
根据实施方案11所述的方法,其中所述MHC分子是MHC多聚体。
根据实施方案11-12中任一项所述的方法,其中所述MHC多聚体包含葡聚糖聚合物。
根据实施方案11-13中任一项所述的方法,其中所述MHC分子存在于抗原呈递细胞中。
根据实施方案1-14中任一项所述的方法,所述方法还包括使所述细胞与一种或多种共刺激分子接触。
根据实施方案15所述的方法,其中所述一种或多种共刺激分子包括一种或多种抗体。
根据实施方案16所述的方法,其中所述一种或多种抗体是抗CD3或抗CD28抗体。
根据实施方案15-17中任一项所述的方法,其中所述一种或多种共刺激分子包括一种或多种细胞因子。
根据实施方案18所述的方法,其中所述一种或多种细胞因子包括白介素。
根据实施方案15-19中任一项所述的方法,其中所述一种或多种共刺激分子存在于抗原呈递细胞上。
根据实施方案1-20中任一项所述的方法,所述方法还包括将多个核酸条形码分子与包含所述第一缀合物和第二缀合物的细胞共分区成分区,其中所述多个核酸分子中的每个核酸分子包含第二条形码序列,并且其中所述第二条形码序列不同于所述第一条形码序列。
根据实施方案21所述的方法,其中所述多个核酸条形码分子附接到珠粒。
根据实施方案22所述的方法,其中所述多个核酸条形码分子可释放地附接到所述珠粒。
根据实施方案23所述的方法,其中所述多个核酸条形码分子经由不稳定键可释放地附接到所述珠粒。
根据实施方案23或24所述的方法,其中所述多个核酸条形码分子在施加刺激后可从所述珠粒释放。
根据实施方案25所述的方法,其中所述刺激是热刺激、化学刺激、生物刺激或光刺激。
根据实施方案26所述的方法,其中所述化学刺激是还原剂。
根据实施方案24所述的方法,其中所述不稳定键是二硫键。
根据实施方案22-28中任一项所述的方法,所述方法还包括释放所述多个核酸条形码分子中的核酸条形码分子。
根据实施方案22-29中任一项所述的方法,其中所述珠粒是凝胶珠粒。
根据实施方案29所述的方法,其中所述珠粒是可降解的凝胶珠粒。
根据实施方案30所述的方法,其中所述凝胶珠粒在施加刺激后可降解。
根据实施方案25所述的方法,其中所述刺激是热刺激、化学刺激、生物刺激或光刺激。
根据实施方案26所述的方法,其中所述化学刺激是还原剂。
根据实施方案21-23中任一项所述的方法,其中所述分区是液滴或孔。
根据实施方案21-24中任一项所述的方法,所述方法还包括裂解所述细胞。
根据实施方案25所述的方法,所述方法还包括从所述细胞释放信使核糖核酸(mRNA)分子。
根据实施方案1-26中任一项所述的方法,所述方法还包括使用所述多个核酸条形码分子中的核酸条形码分子和所述报告分子来产生包含对应于所述第一条形码序列的序列和对应于所述第二条形码序列的序列的第一条形码化核酸分子。
根据实施方案38所述的方法,其中所述核酸条形码分子包含与所述报告分子中的序列互补的序列。
根据实施方案39所述的方法,所述方法还包括将所述核酸条形码分子与所述报告分子杂交并进行核酸反应以产生所述第一条形码化核酸分子。
根据实施方案40所述的方法,其中所述核酸反应是连接反应或核酸延伸反应。
根据实施方案26-27中任一项所述的方法,所述方法还包括使用所述mRNA分子和所述多个核酸条形码分子中的核酸条形码分子来产生包含对应于所述mRNA分子的序列和对应于所述第二条形码序列的序列的第二条形码化核酸分子。
根据实施方案42所述的方法,其中所述核酸条形码分子包含与所述mRNA分子中的序列互补的序列。
根据实施方案43所述的方法,所述方法还包括将所述核酸条形码分子与所述mRNA分子或其cDNA杂交并进行核酸反应以产生所述条形码化核酸分子。
根据实施方案44所述的方法,其中所述核酸反应是逆转录反应、连接反应或核酸延伸反应。
根据实施方案1-29中任一项所述的方法,所述方法还包括扩增所述报告分子和/或衍生自所述mRNA分子的cDNA分子。
根据实施方案30所述的方法,其中所述扩增包括聚合酶链式反应(PCR)。
根据实施方案46-47中任一项所述的方法,其中所述扩增是等温的。
根据实施方案1-31中任一项所述的方法,所述方法还包括根据所述核酸分子和/或cDNA分子的大小对它们进行分选。
根据实施方案1-32中任一项所述的方法,所述方法还包括对所述第一条形码化核酸分子或其衍生物和/或所述第二条形码化核酸分子或其衍生物进行测序。
根据实施方案42-50中任一项所述的方法,所述方法还包括进行一种或多种核酸反应以将一种或多种功能序列添加到所述第一条形码化核酸分子和/或所述第二条形码化核酸分子。
根据实施方案51所述的方法,其中所述一种或多种功能序列是引物序列、测序引物序列或被配置为附接到测序仪的流动池的序列。
根据实施方案1-52中任一项所述的方法,其中所述报告分子包含一种或多种选自引物序列、测序引物序列、被配置为附接到测序仪的流动池的序列和唯一分子标识符(UMI)的功能序列。
根据实施方案21-53中任一项所述的方法,其中所述多个核酸条形码分子各自包含一种或多种选自引物序列、测序引物序列、部分测序引物序列、被配置为附接到测序仪的流动池的序列和唯一分子标识符(UMI)的功能序列。
根据实施方案1-33中任一项所述的方法,所述方法还包括鉴定所述第一条形码序列和所述第二条形码序列并将所述分泌分子和/或所述mRNA分子与所述细胞缔合。
根据实施方案1-34中任一项所述的方法,其中所述分泌分子是细胞因子。
根据实施方案1-35中任一项所述的方法,其中所述第一多肽经由细胞表面蛋白与所述细胞偶联。
根据实施方案1-36中任一项所述的方法,其中所述第一多肽包含第一抗体或抗体片段和第二抗体或抗体片段,其中将所述第一抗体或抗体片段与第二抗体或抗体片段缔合。
根据实施方案1-37中任一项所述的方法,其中所述第一抗体或抗体片段能够与所述分泌分子偶联。
根据实施方案1-38中任一项所述的方法,其中所述第二抗体或抗体片段能够与所述细胞表面偶联。
根据实施方案1-39中任一项所述的方法,其中所述第二多肽是抗体或抗体片段。
根据实施方案1-61中任一项所述的方法,所述方法还包括使所述细胞与多个第一多肽分子接触,并且在(b)之前,去除未结合到所述细胞表面的第一多肽分子。
根据实施方案1-62中任一项所述的方法,所述方法还包括使所述细胞与多个第二多肽分子接触,并且在(b)之后,去除未结合到所述分泌分子的第二多肽分子。
一种处理来自细胞的分子的方法,所述方法包括:
(a)产生细胞珠粒,其中所述细胞珠粒包含被聚合物基质包封的细胞,其中所述聚合物基质包含多个第一多肽;以及
(b)将从所述细胞分泌的分子与所述多个第一多肽中的第一多肽偶联以形成第一缀合物。
根据实施方案41所述的方法,其中所述聚合物基质是水凝胶基质。
根据实施方案41所述的方法,其中所述聚合物基质包含胶原蛋白、层粘连蛋白和/或纤连蛋白。
根据实施方案64-66中任一项所述的方法,其中所述多个第一多肽与所述聚合物基质的聚合物主链偶联。
根据实施方案64-66中任一项所述的方法,所述方法还包括在(b)之前,刺激含有所述细胞的细胞珠粒以诱导所述分子从所述细胞分泌。
根据实施方案64-66中任一项所述的方法,其中用抗原刺激所述细胞珠粒。
根据实施方案69所述的方法,其中所述抗原是模式识别受体(PRR)配体。
根据实施方案69所述的方法,其中所述PRR配体是Toll样受体(TLR)配体、NOD样受体(NLR)配体、RIG-I样受体(RLR)配体、C型凝集素受体(CLR)配体或胞质dsDNA感受器(CDS)配体。
根据实施方案69所述的方法,其中所述抗原是脂多糖(LPS)、双链DNA(dsDNA)、双链RNA(dsRNA)、合成dsRNA或CpG寡脱氧核苷酸(CpG ODN)。
根据实施方案72所述的方法,其中所述合成dsRNA是聚肌苷酸-聚胞苷酸(poly I:C)或聚腺苷酸-聚尿苷酸(poly A:U)。
根据实施方案64-73中任一项所述的方法,所述方法还包括以足以诱导所述分泌分子分泌的浓度向所述细胞珠粒提供多种抗原。
根据实施方案64-74中任一项所述的方法,其中在足以诱导所述分泌分子分泌的一段时间内向所述细胞珠粒提供多种抗原。
根据实施方案64-75中任一项所述的方法,其中所述多种抗原中的抗原与主要组织相容性复合物(MHC)分子偶联。
根据实施方案76所述的方法,其中所述MHC分子是MHC多聚体。
根据实施方案76-77中任一项所述的方法,其中所述MHC多聚体包含葡聚糖聚合物。
根据实施方案76-78中任一项所述的方法,其中所述MHC分子存在于抗原呈递细胞中。
根据实施方案64-79中任一项所述的方法,所述方法还包括使所述细胞珠粒与一种或多种共刺激分子接触。
根据实施方案80所述的方法,其中所述一种或多种共刺激分子包括一种或多种抗体。
根据实施方案81所述的方法,其中所述一种或多种抗体是抗CD3或抗CD28抗体。
根据实施方案80-82中任一项所述的方法,其中所述一种或多种共刺激分子包括一种或多种细胞因子。
根据实施方案83所述的方法,其中所述一种或多种细胞因子包括白介素。
根据实施方案80-84中任一项所述的方法,其中所述一种或多种共刺激分子存在于抗原呈递细胞上。
根据实施方案64-85中任一项所述的方法,所述方法还包括将第二多肽与所述细胞分泌的分子偶联以形成第二缀合物,其中所述第二多肽包含含有第一条形码序列的核酸报告分子。
根据实施方案86所述的方法,所述方法还包括从所述细胞珠粒去除未结合的第二多肽分子。
根据实施方案64所述的方法,在(b)之后,其还包括(c)用酶部分消化所述细胞珠粒,从而产生部分消化的细胞珠粒。
根据实施方案88所述的方法,所述酶是胶原酶或分散酶。
根据实施方案88所述的方法,所述方法还包括在使得来自多个第二多肽中的第二多肽与从所述细胞分泌的分子偶联的条件下,使包含条形码的多个第二多肽与所述部分消化的细胞珠粒接触。
根据实施方案64-90中任一项所述的方法,所述方法还包括将多个核酸条形码分子与包含所述第一缀合物和第二缀合物的细胞珠粒共分区成分区,其中所述多个核酸条形码分子中的每个核酸条形码分子包含第二条形码序列,并且其中所述第二条形码序列不同于所述第一条形码序列。
根据实施方案91所述的方法,其中所述多个核酸条形码分子附接到珠粒。
根据实施方案91所述的方法,其中所述多个核酸条形码分子可释放地附接到所述珠粒。
根据实施方案91所述的方法,其中所述多个核酸条形码分子经由不稳定键可释放地附接到所述珠粒。
根据实施方案91或92所述的方法,其中所述多个核酸条形码分子在施加刺激后可从所述珠粒释放。
根据实施方案95所述的方法,其中所述刺激是热刺激、化学刺激、生物刺激或光刺激。
根据实施方案96所述的方法,其中所述化学刺激是还原剂。
根据实施方案94所述的方法,其中所述不稳定键是二硫键。
根据实施方案93-98中任一项所述的方法,所述方法还包括释放所述多个核酸条形码分子中的核酸条形码分子。
根据实施方案92-99中任一项所述的方法,其中所述珠粒是凝胶珠粒。
根据实施方案100所述的方法,其中所述珠粒是可降解的凝胶珠粒。
根据实施方案101所述的方法,其中所述凝胶珠粒在施加刺激后可降解。
根据实施方案102所述的方法,其中所述刺激是热刺激、化学刺激、生物刺激或光刺激。
根据实施方案103所述的方法,其中所述化学刺激是还原剂。
根据实施方案91-104中任一项所述的方法,其中所述分区是液滴或孔。
根据实施方案91-104中任一项所述的方法,所述方法还包括降解所述细胞珠粒。
根据实施方案91-104中任一项所述的方法,所述方法还包括裂解所述细胞。
根据实施方案107所述的方法,所述方法还包括从所述细胞释放信使核糖核酸(mRNA)分子。
根据实施方案91-108中任一项所述的方法,所述方法还包括使用所述多个核酸条形码分子中的核酸条形码分子和所述报告分子来产生包含对应于所述第一条形码序列的序列和对应于所述第二条形码序列的序列的第一条形码化核酸分子。
根据实施方案109所述的方法,其中所述核酸条形码分子包含与所述报告分子中的序列互补的序列。
根据实施方案110所述的方法,所述方法还包括将所述核酸条形码分子与所述报告分子杂交并进行核酸反应以产生所述第一条形码化核酸分子。
根据实施方案111所述的方法,其中所述核酸反应是连接反应或核酸延伸反应。
根据实施方案91-108中任一项所述的方法,所述方法还包括使用所述mRNA分子和所述多个核酸条形码分子中的核酸条形码分子来产生包含对应于所述mRNA分子的序列和对应于所述第二条形码序列的序列的第二条形码化核酸分子。
根据实施方案113所述的方法,其中所述核酸条形码分子包含与所述mRNA分子中的序列互补的序列。
根据实施方案114所述的方法,所述方法还包括将所述核酸条形码分子与所述mRNA分子或其cDNA杂交并进行核酸反应以产生所述条形码化核酸分子。
根据实施方案115所述的方法,其中所述核酸反应是逆转录反应、连接反应或核酸延伸反应。
根据实施方案41-73中任一项所述的方法,所述方法还包括扩增所述报告分子和/或衍生自所述mRNA分子的cDNA分子。
根据实施方案117所述的方法,其中所述扩增包括聚合酶链式反应(PCR)。
根据实施方案118中任一项所述的方法,其中所述扩增是等温的。
根据实施方案117中任一项所述的方法,所述方法还包括根据所述核酸分子和/或cDNA分子的大小对它们进行分选。
根据实施方案64-120中任一项所述的方法,所述方法还包括对所述第一条形码化核酸分子或其衍生物和/或所述第二条形码化核酸分子或其衍生物进行测序。
根据实施方案109-121中任一项所述的方法,所述方法还包括进行一种或多种核酸反应以将一种或多种功能序列添加到所述第一条形码化核酸分子和/或所述第二条形码化核酸分子。
根据实施方案122所述的方法,其中所述一种或多种功能序列是引物序列、测序引物序列或被配置为附接到测序仪的流动池的序列。
根据实施方案64-123中任一项所述的方法,其中所述报告分子包含一种或多种选自引物序列、测序引物序列、被配置为附接到测序仪的流动池的序列和唯一分子标识符(UMI)的功能序列。
根据实施方案91-124中任一项所述的方法,其中所述多个核酸条形码分子各自包含一种或多种选自引物序列、测序引物序列、部分测序引物序列、被配置为附接到测序仪的流动池的序列和唯一分子标识符(UMI)的功能序列。
根据实施方案64-125中任一项所述的方法,所述方法还包括鉴定所述第一条形码序列和所述第二条形码序列并将所述分泌分子和/或所述mRNA分子与所述细胞缔合。
根据实施方案64-126中任一项所述的方法,其中所述分泌分子是细胞因子。
根据实施方案64-127中任一项所述的方法,其中所述第二多肽是抗体或抗体片段。
根据实施方案11-14和76-79中任一项所述的方法,其中所述MHC分子包含含有第三条形码序列的核酸分子。
根据实施方案129所述的方法,其中所述第三条形码序列不同于所述第一条形码序列或所述第二条形码序列。
实施例
实施例1:对来自单个细胞的分析物进行条形码化
本实施例说明了使用捕获剂产生和鉴定来自体外细胞的条形码化的分泌分析物。
细胞(例如,免疫细胞)分离自受试者。在足以使得多种捕获剂(第一结合剂)结合到每个细胞的表面的条件下,将细胞与捕获剂(例如,第一多肽)的溶液一起孵育。捕获剂由两种不同的多肽(例如,抗体)组成。第一多肽是分析物特异性多肽,其可以直接或间接连接、缀合或融合到靶向细胞表面蛋白的第二多肽,所述细胞表面蛋白将捕获剂附接到细胞。可以改变这些多肽中的任一个,从而可以捕获任何细胞表面标记物或分泌蛋白。捕获试剂还可以包含靶向细胞表面蛋白(或多种蛋白)的多种多肽和/或靶向分泌的细胞蛋白(或多种蛋白)的多种抗体。分析物特异性捕获多肽可以与已知的DNA寡核苷酸序列(例如,报告条形码序列)缀合。如本文所示,在与捕获剂的溶液一起孵育后,在足以允许分子(例如,细胞因子或其他细胞内分析物)分泌的条件下用特定抗原或其他合适的刺激来刺激细胞。抗原任选地与已知的DNA寡核苷酸条形码化MHC多聚体结合。
此外,将细胞与具有报告分子(例如,条形码化第二多肽)的多个条形码化报告剂一起孵育,所述报告剂对分泌的分子(例如,细胞因子或其他分泌的细胞内分析物)具有特异性亲和力。对目的分泌分子具有特异性的报告剂可以含有荧光团、发色团、重金属、DNA寡核苷酸或其组合。此外,报告剂和这些标记物之间的偶联化学和共价键类型可以改变。任选地,在该阶段还加入对细胞表面蛋白具有特异性的DNA寡核苷酸条形码化抗体。分泌的分子与位于细胞表面上的前述分析物特异性捕获剂结合,在细胞表面上形成复合物。
在一些例子中,将细胞分区(例如,分区成乳液液滴),并且分区可以包括包含不同条形码(例如,分区/细胞特异性条形码)的珠粒,所述条形码不同于缀合到报告剂的分析物特异性条形码。细胞可以在分区内部裂解以释放细胞内内容物和两种不同类型的条形码(例如,分析物特异性条形码和分区特异性/细胞特异性条形码)。可以进行条形码的DNA扩增和测序以测量分泌的分子(例如,细胞因子和其他细胞内分析物)。因此,可以鉴定和定量分泌的分子(例如,细胞因子和其他细胞内分析物)。
实施例2:使用细胞珠粒对来自单个细胞的分析物进行条形码化
本实施例说明了使用细胞珠粒产生和鉴定来自体外细胞的条形码化的分泌分析物。
细胞(例如,免疫细胞)分离自受试者,并且将每个细胞进一步包封在液滴中,随后将液滴凝胶化成水凝胶基质。使聚合物前体经受足以使前体聚合的条件,使得产生各自包含单个细胞的细胞珠粒。水凝胶基质的主链与多种捕获剂(例如,第一多肽)附接。
然后在足以允许分子(例如,细胞因子或其他细胞内分析物)分泌的条件下将细胞珠粒置于包含特定抗原或其他合适刺激的溶液中。此外,将细胞珠粒在另一种溶液中孵育,所述另一种溶液包含多种具有报告分子(例如,条形码化第二多肽)的条形码化报告剂,所述报告剂对分泌的分子(例如,细胞因子或其他分泌的细胞内分析物)具有特异性亲和力。在一些例子中,将共刺激剂如CD3加入细胞以诱导分析物分泌。对目的分泌分子具有特异性的报告剂可以含有荧光团、发色团、重金属、DNA寡核苷酸或其组合。此外,报告剂和这些标记物之间的偶联化学和共价键类型可以改变。任选地,在该阶段还加入对细胞表面蛋白具有特异性的DNA寡核苷酸条形码化抗体。
在一些例子中,可以将细胞珠粒分区(例如,分区成乳液液滴),并且分区可以包括包含不同条形码(例如,分区/细胞特异性条形码)的珠粒,所述条形码不同于缀合到报告剂的分析物特异性条形码。细胞可以在分区内部裂解以释放细胞内内容物和两种不同类型的条形码(例如,分析物特异性条形码和分区特异性/细胞特异性条形码)。可以进行条形码的DNA扩增和测序以测量分泌的分子(例如,细胞因子和其他细胞内分析物)。因此,可以鉴定和定量分泌的分子(例如,细胞因子和其他细胞内分析物)。
实施例3:使用细胞珠粒对来自单个细胞的分析物进行染色
本实施例描述了条形码化的分泌分子的染色。
形成各自包含单个细胞的细胞珠粒。在足够的条件下与特定抗原或其他合适的刺激一起孵育后,在合适的条件下用合适的酶处理细胞珠粒,使得包含每个珠粒的细胞外基质(ECM)被部分消化。此外,将部分消化的细胞珠粒与具有报告分子(例如,条形码化第二多肽)的多个条形码化报告剂一起孵育,所述报告剂对分泌的分子(例如,细胞因子或其他分泌的细胞内分析物)具有特异性亲和力。部分消化的ECM允许条形码化多肽结合分泌的分子(例如,细胞因子或其他分泌的细胞内分析物)。此外,洗去过量的报告剂用于分泌分子(例如,细胞因子或细胞内分析物)的成像。
实施例4:鉴定和定量来自单个细胞的分泌的分析物
本实施例描述了对条形码化的分泌分子的分析处理。
一旦实施例1和2中概述的DNA条形码化程序完成,则将乳液液滴聚结成大体积溶液。将扩增的cDNA和报告剂衍生的DNA寡核苷酸按大小分开,然后独立地转化为Illumina测序文库。分区特异性DNA条形码通过计算推断出,具有相同序列的所有mRNA和报告剂衍生的DNA寡核苷酸衍生自相同的单个细胞(例如,T细胞)。分析物特异性多肽DNA条形码(例如,报告条形码序列)的DNA扩增和测序鉴定并定量了分泌的分子。在一些例子中,可以同时测量分泌分子、mRNA、细胞表面蛋白、配对的αβT细胞受体序列和抗原结合特异性。
抗原任选地通过已知的MHC-多聚体DNA条形码鉴定,而细胞表面蛋白的身份和数量通过附接到分析物特异性多肽的已知DNA条形码(例如,报告条形码序列)确定,如前所述。
实施例5:评估单克隆抗体的细胞因子释放潜力
本实施例说明使用单细胞技术定量给定单克隆抗体诱导的细胞因子释放,并鉴定负责该细胞因子释放的细胞群体。
用目的单克隆抗体(例如,候选单克隆抗体)包被板的一个或多个孔。作为阳性对照,可以将靶向CD3和/或CD28的单克隆抗体、或佛波醇12-肉豆蔻酸酯和离子霉素加入同一板的一个或多个孔中。同一板中的其他孔可以用无关的单克隆抗体、人肌红蛋白和/或人血红蛋白包被以用作阴性对照。然后将目的免疫样品(例如,PBMC、肿瘤活检物或另一种免疫样品)加入到每个孔中。
然后将第一报告条形码化捕获剂加入到板中。捕获剂由双特异性F(ab')2或其他基于双特异性抗体的分子组成,其中一种特异性是针对规范淋巴细胞标记物PTPRC/CD45,第二种特异性是针对目的细胞因子。捕获剂缀合到第一报告条形码寡核苷酸,以位点特异性形式(例如,经由Ig Fc区的糖基化、分选酶缀合或非规范氨基酸附接)或非位点特异性形式(例如,经由点击化学或ReACT化学)附接。在一些例子中,捕获剂也可以是脂质缀合的,使得捕获剂能够在与靶标孵育之前插入免疫细胞的细胞膜中。
将细胞和靶标平行孵育6、12和18小时,重复进行。在此期间,捕获剂结合并保留细胞分泌的细胞因子。在每个时间点,加入针对目的细胞因子的第二报告条形码化单克隆抗体(例如,报告剂)。任选地,报告剂也可以是scFv、纳米抗体或对细胞因子具有特异性的其他分子,只要可以附接不同的报告条形码化寡核苷酸即可。
在一个替代性例子中,目的单克隆抗体候选物可以被工程化以在N末端含有a)动力学激活的细菌分选酶A结构域、片段或完整酶,或b)分选酶A基序(LPXTG)。为了评价Fc结合诱导的细胞因子释放,对患者来源的、自体的或人类淋巴母细胞样细胞系工程化,其中Fc新生儿受体在N末端含有a)动力学激活的细菌分选酶A结构域、片段或完整酶,或b)分选酶A基序(LPXTG)。如果候选单克隆抗体含有分选酶A结构域、片段或完整酶,则Fc新生儿工程化受体必须含有LPXTG基序,或反之亦然。
然后如前所述共孵育工程化的细胞群体。可以将具有与肽缀合的报告条形码寡核苷酸的聚甘氨酸肽(GGGGG)加入孔中。任选地,所述肽可以与荧光团或其他较大的生物分子缀合,并类似地附接报告条形码寡核苷酸。通过该过程,将可识别的结构域从抗体转移到识别或结合抗体的细胞,或反之亦然,这取决于抗体是与分选酶A融合还是与LPXTG基序融合。通过添加对聚甘氨酸或聚甘氨酸缀合的信号分子(例如荧光团、受体结构域或其他生物分子)具有特异性的报告条形码化抗体或检测分子,该可识别的结构域可以在细胞表面上检测,或在透化后在细胞内检测。如前所述,也可以在此时加入报告条形码化捕获剂。
释放的细胞因子的检测通过共检测缔合细胞的部分(例如,乳液中的凝胶珠粒)内的报告条形码寡核苷酸来测量,从而允许检测的细胞因子追溯到单个细胞。在一些例子中,通过对给定细胞进行分子计数检测到捕获剂上的第一报告条形码寡核苷酸和报告剂上的第二报告条形码寡核苷酸,表明细胞已捕获分泌的细胞因子。在其他例子中,对于给定细胞,检测到附接到聚甘氨酸识别分子或聚甘氨酸缀合物识别分子的报告条形码寡核苷酸,表明目的细胞与单克隆抗体物理接触,并分泌出给定的目的细胞因子。
结合各种其他多组学测量,包括但不限于空间位置(例如,其中抗体沉积在空间载玻片、微孔或其他指示位置上)、染色质构象、基因表达、表面或细胞内蛋白质,本领域技术人员可以鉴定哪些免疫细胞群体存在于样品中,以及哪些群体响应于与目的单克隆抗体一起孵育而分泌细胞因子。任选地,这通过与阳性和阴性对照样品比较来进一步评估,以定量在暴露于阳性对照(例如,刺激试剂)或阴性对照(例如,人血清中大量的循环蛋白)后分泌或不分泌抗体的相同群体中的细胞数目。
虽然在本文中已经示出和描述了本发明的优选实施方案,但是对于本领域的技术人员来说,显然这些实施方案仅作为举例提供。本发明不受说明书中提供的具体例子的限制。虽然已经参考前述说明书描述了本发明,但是这里对实施方案的描述和图示并不意味着限制。在不脱离本发明的情况下,本领域技术人员将会想到许多变化、改变和替换。此外,应当理解,本发明的所有方面不限于这里根据各种条件和变量阐述的具体描述、配置或相对比例。应当理解,在实践本发明时,可以采用在本文中描述的本发明实施方案的各种替代方案。因此,预期本发明也将覆盖任何这样的替换、修改、变化或等同物。下面的权利要求旨在限定本发明的范围,从而覆盖在这些权利要求及其等同物的范围内的方法和结构。
Claims (52)
1.一种单细胞分析方法,所述方法包括:
a)使细胞与包含报告核酸分子的报告剂接触以提供标记的细胞,其中所述报告核酸分子包含对应于所述报告剂的报告序列,其中所述标记的细胞包含与所述细胞的表面偶联的复合物,并且其中所述复合物包含(i)捕获剂,(ii)分泌的分析物,和(iii)所述报告剂;
b)将所述标记的细胞分区为分区,其中所述分区包含含有多个分区条形码序列的多个条形码核酸分子;以及
c)在所述分区中,由所述多个条形码核酸分子中的条形码核酸分子和所述报告核酸分子产生条形码化核酸分子,其中所述条形码化核酸分子包含所述报告序列或其互补序列和分区条形码序列或其互补序列。
2.根据权利要求1所述的方法,其中其中所述分泌的分析物是分泌的蛋白质。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其中其中所述捕获剂被配置为与细胞表面分子偶联。
4.根据权利要求3所述的方法,其中所述细胞表面分子是细胞表面蛋白。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法,其中所述捕获剂被配置为与所述分泌的分析物偶联。
6.根据权利要求4所述的方法,其中所述捕获剂被配置为与所述细胞表面蛋白和所述分泌的分析物二者偶联。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法,其中所述捕获剂是第一蛋白结合剂。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法,其中所述报告剂被配置为与所述分泌的分析物偶联。
9.根据权利要求7或8所述的方法,其中所述报告剂是第二蛋白结合剂。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法,其中所述报告核酸分子还包含被配置为与所述条形码核酸分子偶联的序列。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法,其中所述标记的细胞还包含含有第二报告核酸分子的第二报告剂。
12.根据权利要求11所述的方法,其中所述第二报告剂被配置为与所述细胞的第二细胞表面蛋白偶联。
13.根据权利要求11或12所述的方法,其中所述第二报告核酸分子包含对应于所述第二报告剂的第二报告序列。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法,其中所述分区还包含多个第二条形码核酸分子中的第二条形码核酸分子。
15.根据权利要求14所述的方法,其中所述第二报告核酸分子包含被配置为与所述第二条形码核酸分子偶联的第二序列。
16.根据权利要求14或15所述的方法,其中步骤(c)还包括由来自所述多个第二条形码核酸分子的第二条形码核酸分子和所述第二报告核酸分子产生第二条形码化核酸分子,其中所述第二条形码化核酸分子包含来自所述第二报告核酸分子和所述第二条形码核酸分子的序列或其互补序列。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的方法,其中所述标记的细胞还包含多种核酸分析物,其中所述多种核酸分析物中的核酸分析物包含核酸分析物序列。
18.根据权利要求1-17中任一项所述的方法,其中所述分区还包含多个第三条形码核酸分子。
19.根据权利要求18所述的方法,其中所述多个第三条形码核酸分子中的第三条形码核酸分子包含被配置为与所述核酸分析物序列偶联的第三序列。
20.根据权利要求18或19所述的方法,其中步骤(c)还包括由来自所述多个第三条形码核酸分子的第三条形码核酸分子和所述核酸分析物产生第三条形码化核酸分子,其中所述第三条形码化核酸分子包含来自所述核酸分析物和所述第三条形码核酸分子的序列或其互补序列。
21.根据权利要求1-20中任一项所述的方法,其中所述分区包含含有所述多个条形码核酸分子的支持物。
22.根据权利要求21所述的方法,其中所述支持物是珠粒。
23.根据权利要求22所述的方法,其中所述珠粒是凝胶珠粒。
24.根据权利要求21-23中任一项所述的方法,其中所述多个条形码核酸分子可释放地附接到所述支持物。
25.根据权利要求1-24中任一项所述的方法,其中所述分区来自多个分区。
26.根据权利要求25所述的方法,其中所述分区是液滴或微孔。
27.一种单细胞分析方法,所述方法包括:
a)使细胞珠粒与包含报告核酸分子的报告剂接触以提供标记的细胞珠粒,其中所述细胞珠粒包含基质中的细胞,其中所述报告核酸分子包含对应于所述报告剂的报告序列,其中所述标记的细胞珠粒包含在所述细胞珠粒中或所述细胞珠粒上的复合物,并且其中所述复合物包含(i)捕获剂,(ii)分泌的分析物,和(iii)报告剂;
b)将所述标记的细胞珠粒分区为分区,其中所述分区包含含有多个分区条形码序列的多个条形码核酸分子;以及
c)在所述分区中,由所述多个条形码核酸分子中的条形码核酸分子和所述报告核酸分子产生条形码化核酸分子,其中所述条形码化核酸分子包含所述报告序列或其互补序列和分区条形码序列或其互补序列。
28.根据权利要求27所述的方法,其中其中所述分泌的分析物是分泌的蛋白质。
29.根据权利要求27或28所述的方法,其中所述捕获剂被配置为与所述细胞珠粒的基质偶联。
30.根据权利要求29所述的方法,其中所述基质是可降解的聚合物基质。
31.根据权利要求27-30中任一项所述的方法,其中所述捕获剂被配置为与所述分泌的分析物偶联。
32.根据权利要求30所述的方法,其中所述捕获剂被配置为与所述基质和所述分泌的分析物二者偶联。
33.根据权利要求27-32中任一项所述的方法,其中所述捕获剂是第一蛋白结合剂。
34.根据权利要求27-33中任一项所述的方法,其中所述报告剂被配置为与所述分泌的分析物偶联。
35.根据权利要求33或34所述的方法,其中所述报告剂是第二蛋白结合剂。
36.根据权利要求27-35中任一项所述的方法,其中所述报告核酸分子还包含被配置为与所述条形码核酸分子偶联的序列。
37.根据权利要求27-36中任一项所述的方法,其中所述细胞或所述标记的细胞珠粒还包含含有第二报告核酸分子的第二报告剂。
38.根据权利要求37所述的方法,其中所述第二报告剂被配置为与所述细胞的细胞表面蛋白偶联。
39.根据权利要求37或38所述的方法,其中所述第二报告核酸分子包含对应于所述第二报告剂的第二报告序列。
40.根据权利要求27-39中任一项所述的方法,其中所述分区还包含多个第二条形码核酸分子中的第二条形码核酸分子。
41.根据权利要求40所述的方法,其中所述第二报告核酸分子包含被配置为与所述第二条形码核酸分子偶联的第二序列。
42.根据权利要求40或41所述的方法,其中步骤(c)还包括由来自所述多个第二条形码核酸分子的第二条形码核酸分子和所述第二报告核酸分子产生第二条形码化核酸分子,其中所述第二条形码化核酸分子包含来自所述第二报告核酸分子和所述第二条形码核酸分子的序列或其互补序列。
43.根据权利要求27-42中任一项所述的方法,其中所述细胞还包含多种核酸分析物,其中所述多种核酸分析物中的核酸分析物包含核酸分析物序列。
44.根据权利要求27-43中任一项所述的方法,其中所述分区还包含多个第三条形码核酸分子。
45.根据权利要求44所述的方法,其中所述多个第三条形码核酸分子中的第三条形码核酸分子包含被配置为与所述核酸分析物序列偶联的第三序列。
46.根据权利要求44或45所述的方法,其中步骤(c)还包括由来自所述多个第三条形码核酸分子的第三条形码核酸分子和所述核酸分析物产生第三条形码化核酸分子,其中所述第三条形码化核酸分子包含来自所述核酸分析物和所述第三条形码核酸分子的序列或其互补序列。
47.根据权利要求27-46中任一项所述的方法,其中所述分区包含含有所述多个条形码核酸分子的支持物。
48.根据权利要求47所述的方法,其中所述支持物是珠粒。
49.根据权利要求48所述的方法,其中所述珠粒是凝胶珠粒。
50.根据权利要求47-49中任一项所述的方法,其中所述多个条形码核酸分子可释放地附接到所述支持物。
51.根据权利要求27-50中任一项所述的方法,其中所述分区来自多个分区。
52.根据权利要求51所述的方法,其中所述分区是液滴或微孔。
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