CN114438100A

CN114438100A - 一种高效分离带有野生稻血缘的抗白叶枯病基因及其家族成员的方法

Info

Publication number: CN114438100A
Application number: CN202210192367.2A
Authority: CN
Inventors: 陈玲; 张敦宇; 程在全; 殷富有; 钟巧芳; 王波; 卢源达; 肖素勤; 张云; 王玲仙; 柯学; 余腾琼; 蒋聪; 刘丽
Original assignee: Biotechnology and Germplasm Resource Institute of Yunnan Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Biotechnology and Germplasm Resource Institute of Yunnan Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2022-03-01
Filing date: 2022-03-01
Publication date: 2022-05-06
Anticipated expiration: 2042-03-01
Also published as: CN114438100B

Abstract

本发明提供了一种高效分离带有野生稻血缘的抗白叶枯病基因及其家族成员的方法，属于分子生物学技术领域。本发明提供了一种高效分离带有野生稻血缘的抗白叶枯病基因及其家族成员的方法，利用来自元江普通野生稻与栽培稻杂交获得的多样化抗谱后代材料，高效快速地克隆到Xa47(t)基因及其家族成员，不仅为分离新的基因提供了较好的借鉴方法，同时避免了常规图位克隆的繁琐和耗时费力，利用元江普通野生稻杂交后代(渗入系)获得的家族成员，其遗传背景清晰，为后续研究家族成员的功能以及育种利用奠定了坚实的基础。

Description

一种高效分离带有野生稻血缘的抗白叶枯病基因及其家族成员的方法

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种高效分离带有野生稻血缘的抗白叶枯病基因及其家族成员的方法。

背景技术

水稻(Oryza sativa L.)是全世界近一半人口的主粮，然而水稻生长发育过程中时常遭遇各种病原物的危害，严重制约着水稻的高产稳产以及稻米品质。由稻黄单胞杆菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae，简称Xoo)引起的水稻白叶枯病(bacterialblight)是世界范围内最严重的细菌性病害，也是我国水稻三大病害之一，我国除新疆、西藏和东北的北部以外均有不同程度的发生，长江以南和江淮平原籼稻产区为常发区，遭受白叶枯病危害后易造成水稻减产20％～30％，严重时可达50％，甚至绝收。随着全球气候逐渐变暖，水稻白叶枯病发生面积在逐年增加，水稻产量损失严重，已严重威胁到国家粮食安全(陈功友,徐正银,杨阳阳,等.我国水稻白叶枯病菌致病型划分和水稻抗病育种中应注意的问题.上海交通大学学报(农业科学版),2019,37(1):71-77.)。从长远途径来说，要想在水稻白叶枯病害常发区获得理想的水稻产量，就必须不断培育抗病新品种，以抵御白叶枯病菌的不断变异。尤其是多渠道、多来源发掘出抗白叶枯病基因，并服务于育种实践，已成为目前水稻分子育种的重要目标。

回顾水稻新品种的培育历程，育种家们大都将来自栽培品种中的优良基因不断重组、聚合，导致栽培品种原有的遗传资源利用日趋饱和，许多改良品种具有相同或相似的遗传来源，造成了遗传上的单一性，尤其由于早期育种家们对栽培稻抗病特性的忽视，我们现有的栽培稻不具有抗病特性或携有的抗病基因单一。从远缘种群中引入优良基因创作新的水稻品种是扩大亲本间遗传差异的重要途径之一。栽培稻有20多个野生近缘种，包含有极其丰富的遗传变异。云南省是亚洲栽培稻的遗传多样性中心和起源中心之一，拥有中国的全部三种野生稻，即普通野生稻(Oryza rufipogon Griff.)、药用野生稻(Oryzaofficinalis Wall.)和疣粒野生稻(Oryza granulataBaill.)，而且每种野生稻具有许多亚种或生态类型，这些种质资源在表型和分子水平上都具有较高的遗传多样性，拥有显著的抗逆、抗病虫害、耐寒、耐旱和耐贫瘠等许多优良性状(陈玲,张敦宇,陈越,等.云南药用野生稻种质资源的白叶枯病抗性评价.南方农业学报,2019,50(7):1417-1425；程在全.云南野生稻遗传特性及其优良基因克隆研究.四川:四川大学,2006.)。因此，利用拥有的广谱高抗白叶枯病的野生资源培育水稻新品种，这不仅将大大降低生产成本，而且具有重要的生态意义。

前期我们利用广谱高抗白叶枯病的元江普通野生稻渗入系(元江普通野生稻与栽培稻合系35杂交后代BC₂F₁₆)精细定位到了一个位于水稻11号染色体的显性抗白叶枯病基因Xa47(t)(陈玲,钟巧芳,王玲仙,等.与水稻广谱高抗白叶枯病基因Xa45(t)紧密连锁的分子标记Hxjy-14,2020a,中国,ZL201910825566.0.；陈玲,王波,程在全,等.水稻广谱高抗白叶枯病基因Xa45(t)的共分离分子标记Hxjy-1,2020b,中国,ZL201910825603.0.；陈玲,程在全,王波,等.与水稻广谱高抗叶枯病基因Xa45(t)紧密连锁分子标记R13I14,2020c,中国,ZL201910825560.3.)，之前暂命名为Xa45(t)，因与位于4号染色体的水稻抗白叶枯病基因Xa1的等位基因Xa45(t)重名(Ji CH,Ji ZY,Liu B,et al.Xa1 allelic R genesactivate rice blight resistance suppressed by interfering TAL effectors.PlantComm,2020,1(4),100087.)，所以后将其改为Xa47(t)。利用Xa47(t)的共分离标记检测发现该基因带有元江普通野生稻血缘，目前从野生稻中克隆到的基因只有3个，分别为来自长雄野生稻(Oryza longistaminataA.chev et Roehr)的Xa21(Song WY,Wang GL,Chen LL,etal.A receptor kinase-like protein encoded by the rice disease resistancegene,Xa21.Science,1995,270(5243):1804-1806.)、来自普通野生稻的Xa23(ZhouYL,Uzokwe VNE,Zhang CH.Improvement of bacterial blight resistance of hybrid ricein China using the Xa23 gene derived from wild rice(Oryza rufipogon).CropProt,2011,30(6):637-644.)和来自小粒野生稻(Oryza minuta Presl.)的Xa27基因(GuK,Tian D,Yang F,et al.High-resolution genetic mapping of Xa27(t),a newbacterial blight resistance gene in rice,Oryza sativa L.Theor Appl Genet,2004,108(5):800-807.)，这3个基因的克隆方式基本都沿用了常规的图位克隆法，但该方法费时费力，随着测序技术的到来，利用测序技术高效且快速地分离Xa47(t)基因已成为可能。经接种9个白叶枯病菌发现，359份元江普通野生稻渗入系抗病谱多样化，存在67种抗病谱，抗病谱不同携带的抗白叶枯病基因可能有所不同，或者这些抗病基因很可能为同一个家族成员，由于这些渗入系遗传背景相似，参照来自渗入系G252中的Xa47(t)基因序列，利用元江普通野生稻的其他渗入系可大量地分离到Xa47(t)家族成员。那么，如何充分利用现代测序技术以及分子生物学技术从元江普通野生稻及其渗入系中高效地分离Xa47(t)基因及其家族成员成为了急需要解决的科学问题。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种高效分离带有野生稻血缘的抗白叶枯病基因及其家族成员的方法，能够高效快速地克隆到Xa47(t)基因及其家族成员。

为解决上述技术问题，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种高效分离带有野生稻血缘的抗白叶枯病基因的方法，所述方法包括：

通过对元江普通野生稻渗入系双亲进行建库和高通量测序获得连续基因组，将所述连续基因组与参考基因组进行共线性分析，根据目的基因定位情况，筛选出所述抗白叶枯病基因的候选基因，根据所述候选基因设计引物进行PCR扩增、PCR产物直接测序和抗病功能分析，从而分离出带有野生稻血缘的抗白叶枯病基因。

优选的，所述抗白叶枯病基因为Xa47(t)，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示；所述基因Xa47(t)的CDS序列如SEQ ID NO.14所示。

优选的，所述元江普通野生稻渗入系双亲为元江普通野生稻和栽培稻合系35；所述参考基因组为日本晴基因组；所述目的基因定位和所述PCR扩增的模板为元江普通野生稻渗入系G252。

优选的，所述引物为214QC-9F/R；所述214QC-9F的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，所述214QC-9R的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。

优选的，所述抗病功能分析包括功能互补试验和基因编辑试验分析候选基因的抗病功能。

本发明还提供了一种高效分离带有野生稻血缘的抗白叶枯病基因家族成员的方法，所述方法包括：

筛选获得含有Xa47(t)基因或其同源基因的元江普通野生稻渗入系材料；根据上述Xa47(t)基因序列，获得来自元江普通野生稻和合系35中的Xa47(t)基因，分别命名为Xa47(t)^YP和Xa47(t)^HX；

利用引物对所述元江普通野生稻渗入系不同材料进行扩增、测序，得到4种Xa47(t)基因的基因型：Xa47(t)^G252、Xa47(t)^YP、Xa47(t)^HX以及Xa47(t)^L234；对由4种基因型编码得到的蛋白质进行相似性分析，从而确定其是否为带有野生稻血缘的抗白叶枯病基因家族成员。

优选的，所述筛选的步骤包括：

利用Xa47(t)基因的共分离标记Hxjy-1对元江普通野生稻渗入系进行PCR扩增，得到扩增片段大小为167bp的渗入系，结合渗入系的抗病谱筛选出含有Xa47(t)基因或其同源基因的元江普通野生稻渗入系材料。

优选的，根据上述Xa47(t)基因序列，利用blast程序从元江普通野生稻和合系35基因组R13I14和Hxjy-14区段中进行检索，即获得来自元江普通野生稻和合系35中的Xa47(t)基因。

优选的，所述引物包括214QC-2F/R、48QC-9F/R和48QC-11F/R，所述214QC-2F的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示，所述214QC-2R的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示；所述48QC-9F的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示，所述48QC-9R的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示；所述48QC-11F的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示，所述48QC-11R的核苷酸序列如SEQID NO.22所示。

优选的，所述Xa47(t)^G252、Xa47(t)^YP、Xa47(t)^HX以及Xa47(t)^L234基因即以其供体材料进行命名的Xa47(t)基因；所述Xa47(t)^G252为上述的Xa47(t)基因；所述Xa47(t)^YP基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示；所述Xa47(t)^YP基因的CDS序列如SEQ ID NO.30所示；所述Xa47(t)^HX基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示；所述Xa47(t)^HX基因的CDS序列如SEQ IDNO.32所示；所述Xa47(t)^L234基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.27所示；所述Xa47(t)^L234基因的CDS序列如SEQ ID NO.28所示。

本发明提供了一种高效分离带有野生稻血缘的抗白叶枯病基因及其家族成员的方法，利用PacBio SMRT技术和Dovetail Hi-C技术成功地将元江普通野生稻和栽培稻合系35的基因组对应到水稻染色体上，并与日本晴基因组进行共线性分析，根据测序组装序列以及Xa47(t)基因的定位情况，快速获得了元江普通野生稻和合系35中Xa47(t)基因型。利用根据该基因型设计的引物扩增后的目的产物可直接进行测序获得目的基因的完整编码区，无需通过繁琐的载体连接、蓝白斑筛选以及酶切验证等步骤，该技术高效、快捷、省时省力，为分离新的基因提供了较好的借鉴方法。同时，本发明利用来自同一个亲本的多样化抗谱材料，高效快速地克隆到Xa47(t)基因及其家族成员，避免了常规图位克隆的繁琐和耗时费力，利用元江普通野生稻渗入系获得的家族成员，其遗传背景清晰，为后续研究家族成员的功能以及育种利用奠定了坚实的基础。

附图说明

图1为合系35与日本晴11号染色体共线性图。Chr11表示11号染色体；29021106Kb表示日本晴11号染色体总长度；29113644Kb表示合系35中11号染色体总长度。

图2为元江普通野生稻5与日本晴11号染色体共线性图。Chr11表示11号染色体；29021106Kb表示日本晴11号染色体总长度；31935697Kb表示元江普通野生稻11号染色体总长度。

图3为214QC-9F/R在元江普通野生稻渗入系G252中的扩增电泳图。M为DL5000的Marker，由5000bp、3000bp、2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp共8条链组成。

图4为Xa47(t)基因部分区域测序峰图。

图5为Xa47(t)^YP、Xa47(t)^G252、Xa47(t)^HX以及Xa47(t)^L2344个成员的蛋白结构域。

图6为Xa47(t)^L234成员与Xa47(t)^YP和Xa47(t)^HX成员的比对图；其中，Xa47_HX表示Xa47(t)^HX成员，Xa47_YP表示Xa47(t)^YP成员，Xa47_L234表示Xa47(t)^L234成员。

图7为Xa47(t)^G252成员与Xa47(t)^YP和Xa47(t)^HX成员的比对图；其中，Xa47_HX表示Xa47(t)^HX成员，Xa47_YP表示Xa47(t)^YP成员，Xa47_G252表示Xa47(t)^G252成员。

具体实施方式

本发明通过对元江普通野生稻渗入系双亲进行建库和高通量测序获得连续基因组。本发明中，所述建库和高通量测序之前优选的包括对元江普通野生稻渗入系双亲的DNA提取；所述提取的方法优选为CTAB法；所述元江普通野生稻渗入系双亲优选为元江普通野生稻和栽培稻合系35。本发明中，所述建库和高通量测序优选的包括PacBio Sequel_SMRT平台、Dovetail Hi-C建库技术和MECAT组装系统。

本发明将所述连续基因组与参考基因组进行共线性分析，筛选出所述抗白叶枯病基因的候选基因。本发明中，所述参考基因组为日本晴基因组；所述共线性分析优选的采用MCScanX软件进行。本发明中，所述筛选的方法优选包括：利用Soft Berry(https://linux1.softberry.com/)中的FGENESH程序对R13I14和Hxjy-14两个标记之间的序列进行基因注释分析，在Smart数据库(https://smart.embl-heidelberg.de/)预测注释基因的功能，根据注释的功能筛选出Xa47(t)候选基因。本发明中，所述抗白叶枯病基因为Xa47(t)；所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示；所述基因Xa47(t)的CDS序列如SEQ ID NO.14所示。

本发明根据所述候选基因设计引物进行PCR扩增、PCR产物直接测序和抗病功能分析，从而分离出带有野生稻血缘的抗白叶枯病基因。本发明中，所述目的基因定位和所述PCR扩增的模板优选为元江普通野生稻渗入系G252。所述抗病功能分析优选的包括功能互补试验和基因编辑试验分析候选基因的抗病功能。本发明中，所述引物优选为214QC-9F/R；所述214QC-9F的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，所述214QC-9R的核苷酸序列如SEQ IDNO.12所示。本发明中，所述测序的平台选择本领域常规测序平台即可。在本发明的实施例中，所述测序优选由华大生物科技(武汉)有限公司完成，PCR扩增产物测序优选由北京擎科生物技术有限公司昆明分公司完成。

利用引物对所述元江普通野生稻渗入系材料进行扩增、测序，得到4种Xa47(t)基因的基因型：Xa47(t)^YP、Xa47(t)^G252、Xa47(t)^HX以及Xa47(t)^L234；对由4种基因型编码得到的蛋白质进行相似性分析，从而确定其是否为带有野生稻血缘的抗白叶枯病基因家族成员。

本发明中，所述筛选的步骤包括：利用Xa47(t)基因的共分离标记Hxjy-1对元江普通野生稻渗入系进行PCR扩增，得到扩增片段大小为167bp的渗入系，结合渗入系的抗病谱筛选出含有Xa47(t)基因或其同源基因的元江普通野生稻渗入系材料。本发明中，根据所述Xa47(t)基因序列，利用blast程序从元江普通野生稻和合系35基因组R13I14和Hxjy-14区段中进行检索，即获得来自元江普通野生稻和合系35中的Xa47(t)基因。本发明中，所述引物包括214QC-2F/R、48QC-9F/R和48QC-11F/R，所述214QC-2F的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示，所述214QC-2R的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示；所述48QC-9F的核苷酸序列如SEQID NO.19所示，所述48QC-9R的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示；所述48QC-11F的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示，所述48QC-11R的核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示。

本发明中，所述Xa47(t)^G252、Xa47(t)^YP、Xa47(t)^HX以及Xa47(t)^L234基因即以其供体材料进行命名的Xa47(t)基因；所述Xa47(t)^G252为上述的Xa47(t)基因；所述Xa47(t)^YP基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示；所述Xa47(t)^YP基因的CDS序列如SEQ ID NO.30所示；所述Xa47(t)^HX基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示；所述Xa47(t)^HX基因的CDS序列如SEQID NO.32所示；所述Xa47(t)^L234基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.27所示；所述Xa47(t)^L234基因的CDS序列如SEQ ID NO.28所示。

本发明中，所述的栽培稻合系35为我国选育的高产优质粳稻品种，公布于文献(殷富有,张敦宇,叶玉,等.普通野生稻栽培稻杂交后代白叶枯病抗性评价.江西农业学报,2010,22(8):81-84.)。

所述的HZhj19、PXO99、PB、ScYc-b、T7147、Y8、YM1、YM187、YN24、YJDP-2和YJWS-2白叶枯病菌在非专利文献公开，申请人有保存，自本专利申请日起20年内可提供。

所述的HZhj19、YM1、YM187、YN24、YJDP-2和YJWS-2菌株为本实验室在2013～2017年从自然发病的病叶上分离而来，公布于文献(陈玲,张敦宇,陈越,等.云南药用野生稻种质资源的白叶枯病抗性评价.南方农业学报,2019,50(7):1417-1425.)。

所述的PXO99菌株为菲律宾标准菌株6，采集自菲律宾，公布于文献(Ji CH,Ji ZY,Liu B,et al.Xa1 allelic R genes activate rice blight resistance suppressed byinterfering TAL effectors.Plant Comm,2020,1(4),100087.)。

所述的PB菌株，为PXO99菌株的突变株系，公布于文献(陈玲,张敦宇,陈越,等.云南药用野生稻种质资源的白叶枯病抗性评价.南方农业学报,2019,50(7):1417-1425.)。

所述的Y8菌株为云南强致病型生理小种，采集自中国云南，公布于文献(殷富有,张敦宇,叶玉,等.普通野生稻栽培稻杂交后代白叶枯病抗性评价.江西农业学报,2010,22(8):81-84.)。

所述的ScYc-b(中国标准菌株5号)和YN24(中国标准菌株9号)菌株，采集自中国东北稻区，公布于文献(吴宪,许晶,温嘉伟,等.东北水稻白叶枯病菌株遗传多样性分析及品种对白叶枯病抗性评价.吉林农业大学学报,2015,37(3):290-295.)。

所述的T7147(日本标准菌株2号)，采集自日本，公布于文献(周永力,翟文学,章琦,等.Xa21转基因水稻对白叶枯病的抗性及其遗传.植物病理学报,2001,31(2):123-129.)

所述的栽培稻JG30，是我国选育的矮秆中晚熟籼稻(栽培稻)，公布于文献(金旭伟,王春连,杨清,等.水稻抗白叶枯病近等基因系CBB30的培育及Xa30(t)的初步定位.中国农业科学,2007,40(6):1094-1100.)。

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例对本发明进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

下述实施例中，为了避免因不必要的细节而模糊了本发明专利的技术方案，在实施例中仅出示了与本发明专利方案密切相关的技术方案和/或处理步骤，如无特殊说明，省略的其他细节方法均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1元江普通野生稻和栽培稻合系35基因组高通量测序

1.元江普通野生稻和栽培稻合系35的基因组DNA提取

基于CTAB方法提取基因组DNA：采取样品的幼嫩叶片约200mg，用液氮研磨成粉状，将组织转移到预热65℃的2.0mL管中，加入900μL 2％CTAB裂解缓冲液，涡旋混合。将离心管在65℃下孵育60分钟，然后在室温(RT)下以10,000rpm离心5分钟。用900μL体积的苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)提取上清液，重复2次，然后在新管中以10,000rpm的速度在室温下离心10分钟。加入2/3体积的预冷(-20℃)异丙醇，-20℃放置2小时以上沉淀DNA，室温12000rpm离心15分钟。加入75％无水乙醇洗涤沉淀并离心去除，然后将DNA沉淀风干3-5分钟。用200μL ddH₂O溶解沉淀后进行后续实验。

所述2％CTAB裂解缓冲液的配制方法为：取4g十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，16.364gNaCl，1M Tris-HCl 20mL(pH8.0)，0.5M EDTA8mL，先用70mL ddH₂O溶解，再定容至200mL灭菌备用。

2.元江普通野生稻和栽培稻合系35染色体级别的连续基因组获取

将步骤1提取得到的DNA送华大生物科技(武汉)有限公司，通过PacBio Sequel_SMRT平台进行建库和全基因组测序，结合Dovetail Hi-C建库技术以及MECAT组装系统，获得元江普通野生稻和栽培稻合系35染色体级别的连续基因组。

实施例2Xa47(t)的克隆

1.Xa47(t)候选基因的预测

选用MCScanX软件将实施例1中元江普通野生稻和栽培稻合系35的11号染色体的连续基因组与高质量参考基因组即日本晴基因组进行共线性分析。随后利用Soft Berry(https://linux1.softberry.com/)中的FGENESH程序对R13I14和Hxjy-14两个标记之间的序列进行基因注释分析，在Smart数据库(https://smart.embl-heidelberg.de/)预测注释基因的功能，根据注释的功能筛选出Xa47(t)候选基因。

根据Xa47(t)基因位于分子标记R13I14和Hxjy-14之间的事实，通过共线性分析得到图1和图2。从图1和图2可看出，Xa47(t)基因的此定位区段在元江普通野生稻、合系35和日本晴之间排列顺序比较一致，表明可参照目前研究较为清楚的日本晴基因组从该区段进行Xa47(t)基因的预测。进而根据上述步骤从该区域注释到3个候选基因，其中一个是含有NBS-LRR结构域的LOC_Os11g46200基因，其余两个基因与转座相关，与抗病不相关，因此将LOC_Os11g46200作为Xa47(t)基因的候选基因。

2.Xa47(t)候选基因的克隆

根据步骤1得到的候选基因的编码区上下游区域，设计10对特异引物，采用CTAB法提取Xa47(t)的供体亲本G252的基因组DNA，利用PCR进行扩增，取7μLPCR扩增产物在1％琼脂糖凝胶上5V/cm恒压电泳，凝胶成像系统成像后，根据PCR产物，筛选出一个特异引物214QC-9F/R，其中，214QC-9F的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，214QC-9R的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，该引物的扩增片段大小正确且带型清晰，结果如图3所示。将该PCR产物直接送北京擎科生物技术有限公司昆明分公司进行测序，测序结果如图4所示。由图4可见，测序峰图信号强，峰型完整且为单峰，表明测序结果较好。

所述的PCR扩增采用45μLPCR反应体系进行；45μLPCR反应体系为：

MaxMaster Mix 24μL，10μmol/L上、下游引物各2.4μL，20ng/μL模板DNA 6μL，ddH₂O 10.2μL；PCR反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性15sec，55℃复性15sec，68℃延伸5min，共35个循环；68℃延伸10min。

测序结果显示，Xa47(t)候选基因的核苷酸(DNA)长度为4240bp，编码区(CDS)序列为2409bp，编码802个氨基酸，具体核苷酸序列见序列表SEQ ID NO.13，具体CDS序列见序列表SEQ ID NO.13编码获得的氨基酸序列如SEQ ID NO.34所示。

实施例3候选基因功能分析

1.功能互补试验验证候选基因功能

提取Xa47(t)的供体亲本G252的总RNA，反转录为cDNA后，参照Xa47(t)候选基因编码区序列，利用软件BioXM2.6从Xa47(t)的DNA序列中预测出其编码区(CDS区)，在预测出的编码区两端设计特异引物G252-CDS-F/R，利用G252的cDNA进行PCR扩增，将预期大小正确的片段与载体pCE2连接，将连接产物送北京擎科生物技术有限公司昆明分公司进行测序，获得Xa47(t)编码区序列，同时获得pCE2-Xa47CDS质粒。

选择pCamBIA1305质粒作为植物表达载体骨架，用XbaI和BstEII对其进行双酶切，利用引物Ubi-F/R扩增质粒pJET-Ubi中的Ubiqutin启动子，利用Xa47-OE-F/R引物扩增质粒pCE2-Xa47CDS中的Xa47(t)CDS序列，切胶回收目的片段后，通过同源重组的方法构建Ubi-Xa47(t)过表达载体，通过农杆菌介导法转化感白叶枯病的栽培稻JG30材料。本实施例所采用的引物序列如下表1所示。

表1引物序列

对上述转化栽培稻JG30材料后的T₁代阳性转基因苗进行孕穗期接种HZhj19、PXO99、PB、ScYc-b、T7147、Y8、YM1、YM187、YN24、YJDP-2和YJWS-2共11个白叶枯病强致病菌，每个菌株接种3株转化苗，同时以感病材料金刚30作为对照，接种21天后调查病斑长度，结果如表2所示。其中，病斑长度的单位为cm。

表2 T₁代遗传转化苗Ubi-Xa47(t)表型鉴定

由表2可以看出，感病材料金刚30病斑在12cm以上，表现较强的感病特性，转化苗的病斑在5cm以下，对11个菌株达到抗到高抗的水平，说明遗传转化株系的白叶枯病抗性是由Xa47(t)基因提供，该基因具有很强的白叶枯病抗性，对于抗白叶枯病水稻育种具有重要应用价值。

2.基因编辑实验评估候选基因功能

根据CRISPR-P2.0在线软件(https://crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2)在Xa47(t)整个DNA序列(正反链)里找出含有GN20GG或N20GG的PAM序列，选择中靶效率评分大于0.5的特异性较高的作为sgRNA候选序列，通过查找共找到3个sgRNA序列，将3个sgRNA序列进行体外验证。将体外验证较好的sgRNA-2的PAM前面20bp的序列作为Spacer序列，分别设计上、下游sgRNA的Oligo序列sgF/R，并在sgF的5'端加入同源臂GGCA，sgR的5'端加入同源臂AAAC，送北京擎科生物技术有限公司昆明分公司合成。

利用合成的Oligo序列制备两端具有粘性末端的双链DNA片段(Oligo-Xa47(t))。利用CIP酶切10ug pOs-sgRNA载体，制作出线性化pOs-sgRNA载体。将线性化pOs-sgRNA载体与Oligo-Xa47(t)相连，转化大肠杆菌，获得阳性克隆，构建出pOs-sgRNA-Oligo-Xa47(t)载体。利用LR Clonase^TM II enzyme mix将pOs-sgRNA-Oligo-Xa47(t)质粒与pH-Ubi-cas9-7质粒进行LR反应，最终获得CRISPR/Cas9-Xa47(t)载体，并用引物Seq-U3和Seq-Cas对CRISPR/Cas9-Xa47(t)载体进行测序来验证其正确性，测序公司为北京擎科生物技术有限公司昆明分公司。将验证正确的载体通过农杆菌介导法转化Xa47(t)的供体亲本G252。本实施例所用引物序列如表3所示。

表3引物序列

对转化后的T₁代阳性基因敲除苗进行孕穗期接种上述11个白叶枯病菌株，供体亲本G252作为对照，结果显示G252对11个菌株均抗病，敲除苗对11个菌株都感病，该结果与过表达植株的表型相对应，表明本发明所述基因Xa47(t)抗不同的白叶枯病菌，具有广谱高抗的特性。

实施例4 Xa47(t)家族成员的分离

本实施例所述的PCR扩增程序和体系与实施例1相同。

1.Xa47(t)基因家族成员的供体亲本筛选

利用Xa47(t)的共分离标记Hxjy-1在359份元江普通野生稻渗入系中进行PCR扩增，筛选出扩增片段大小为167bp的渗入系有262份，且这262份渗入系抗病谱依然为67种类型，为了获得对白叶枯病菌具有广谱高抗的抗性基因，本实施例从262份渗入系中筛选出抗6-9个白叶枯病菌的渗入系，这些渗入系呈现出16个抗病谱，从16个抗病谱中选出1～3份代表材料用于Xa47(t)基因家族成员的分离，具体的材料抗病谱如表4。

表4部分渗入系抗病谱

2.元江普通野生稻和合系35基因的Xa47(t)基因获取

根据Xa47(t)基因序列，利用blast程序从元江普通野生稻和合系35基因组R13I14和Hxjy-14区段中进行检索，获得来自元江普通野生稻和合系35基因的Xa47(t)基因。得到的Xa47(t)^YP基因序列如SEQ ID NO.15所示，Xa47(t)^HX基因如SEQ ID NO.16所示。利用DNAMAN软件比对发现，Xa47(t)^HX基因与LOC_Os11g46200的编码区完全一致，相似性为100％。

3.Xa47(t)基因家族成员的基因分离

根据Xa47(t)^YP和Xa47(t)^G252基因的编码区上下游序列，设计特异引物，以及利用之前参照LOC_Os11g46200编码区上下游设计的10对特异引物，通过PCR技术在元江普通野生稻渗入系DNA中进行扩增，取7μLPCR扩增产物在1％琼脂糖凝胶上5V/cm恒压电泳，凝胶成像系统成像后，根据跑胶结果，共筛选出4对可从元江普通野生稻渗入系DNA中扩增的引物，引物序列如下表5，选取片段大小正确的PCR产物直接送北京擎科生物技术有限公司昆明分公司进行测序。

表5引物序列

根据测序结果发现渗入系中出现了4种基因型，包括Xa47(t)^YP、Xa47(t)^G252、Xa47(t)^HX以及Xa47(t)^L234基因型，通过比对，Xa47(t)^HX与日本晴中的LOC_Os11g46200基因完全一致，而LOC_Os11g46200基因的CDS区域已经明确。Xa47(t)^L234基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.27所示。利用软件BioXM2.6从Xa47(t)^YP和Xa47(t)^L234基因型的DNA序列中预测出其CDS区，在预测出的编码区两端设计特异引物对YP-CDS-F/R(其中YP-CDS-F的核苷酸序列如SEQID NO.23所示，YP-CDS-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示)和L234-CDS-F/R(其中L234-CDS-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示，L234-CDS-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.26所示)，这两对引物分别在元江普通野生稻和渗入系L234的cDNA中进行扩增，将预期大小正确的片段与载体pCE2连接，将连接产物进行测序，获得Xa47(t)^YP和Xa47(t)^L234编码区序列。根据4个成员的CDS序列通过BioXM2.6软件将其分别翻译成蛋白质序列，具体的序列如表6所示。继续利用DNAMAN软件分析4个蛋白之间的相似性，结果如表7所示。进一步利用在线软件SMART预测4个蛋白结构，结果如图5所示。

表6不同成员的序列

表7不同基因型蛋白相似性分析

	Xa47(t)<sup>HX</sup>	Xa47(t)<sup>YP</sup>	Xa47(t)<sup>G252</sup>	Xa47(t)<sup>L234</sup>
					Xa47(t)<sup>HX</sup>	100％	100％	/	/
Xa47(t)<sup>YP</sup>	95.2％	100％	/	/
					Xa47(t)<sup>G252</sup>	89.0％	91.9％	100％	/
Xa47(t)<sup>L234</sup>	94.8％	99.0％	92.1％	100％

从表7可见，4个蛋白之间相似性较高，说明它们极有可能互为同一个家族成员。从图5可见，4个蛋白结构域基本一致，综合说明4个基因型同为一个基因家族。那4个家族成员中，因Xa47(t)^YP和Xa47(t)^HX分别来自渗入系的双亲，说明Xa47(t)^YP是完全带有野生稻血缘的基因型，Xa47(t)^HX是来自栽培稻合系35。

随后利用DNAMAN软件将Xa47(t)^G252和Xa47(t)^L234蛋白分别与Xa47(t)^YP和Xa47(t)^HX进行多重比对，确定Xa47(t)^G252和Xa47(t)^L234是否带有野生稻血缘，结果如图6和图7所示。

可以看出，相对于Xa47(t)^YP和Xa47(t)^HX蛋白，Xa47(t)^G252和Xa47(t)^L234蛋白已发生变异，其中Xa47(t)L²³⁴蛋白变异较Xa47(t)^G252小，但2个成员的大部分蛋白区域还是与Xa47(t)^YP一致，说明Xa47(t)^G252和Xa47(t)^L234基因型携带了野生稻血缘。

本实施例从元江普通野生稻渗入系中获得了4个Xa47(t)家族成员，其中的3个成员都带有野生稻血缘，是具有利用价值的基因资源。所述的基因家族指来源于同一个祖先，由一个基因通过基因重复而产生两个或更多的拷贝而构成的一组基因，它们在结构和功能上具有明显的相似性，编码相似的蛋白质产物。

4.获得的家族成员在元江普通野生稻渗入系中的分布情况

根据上述结果分析4个成员在元江普通野生稻渗入系中分布情况，结果如表8所示。

表8 Xa47(t)基因不同家族成员在元江普通野生稻中的分布情况

可以看出，这些家族成员在渗入系中以纯合或杂合状态存在，表明元江普通野生稻渗入系中的Xa47(t)具有多样化，即存在一定变异也存在一定的保守型，它们互为基因家族，表明利用本发明所述方法还可从其余的渗入系材料中分离出新的家族成员。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

序列表

<110> 云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所

<120> 一种高效分离带有野生稻血缘的抗白叶枯病基因及其家族成员的方法

<160> 34

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgacggggg aggaagtc 18

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgtatgatg catgtcacg 19

<210> 3

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggtacccggg gatcctctag actgcagtgc agcgtct 37

<210> 4

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cccccgtcat ctgcagaagt aacaccaaac a 31

<210> 5

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

acttctgcag atgacggggg aggaag 26

<210> 6

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gggaaattcg agctggtcac cttaatacca tatacatgta tgatgcatgt 50

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ggcacaaggt gccggaaaaa agaa 24

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

aaacttcttt tttccggcac cttg 24

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

taccacctcg gctatccaca 20

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gacaagggca gggatttcg 19

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

tttagctgct ctaagttggt 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

agtcattagt ttcgaacggg 20

<210> 13

<211> 4240

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

atgacggggg aggaagtcga tgctttgtgc aaggatgagt tgatggcgga ggtgcgtgag 60

ctgtcctacg acatggacga cgccatcgac gaattcttct tagaggagcc catggcgggc 120

ggcgacggtg gccctttcga tgagctcaag acaagagttg aggatgtctc caagcggttc 180

tccgacagcc ggcggtggag gccacaggtg gagcaacatc aaccatccct aaccgccgca 240

accgtagact gtccacctcc tcacgctcgc ttcgtccaca acatgatgga tgtgtcagag 300

ctcgtggaga tggacaaact acatgagaca gagctcatca aattgctgga acaaggtgcg 360

gacacaagca tatatgcttc ccggtggcgc atcgcaacac catggcatga taaggaggta 420

aagacgacat ccttttattt cttttttatc tctacttctc tatttatata ttatattata 480

aaaatttaaa atgttttcgc tgtgtgtatt ttggtacgtc gtggctatct tcgtatcgta 540

ttcgatctcc cgttcagtat gttttgtgtt gtacgtctct agcttccaga tatatcatat 600

atctttccat tcctatgtta ttctttcttt ccaaattcca attattaatt atacctcatt 660

taatgaggga catttatacc attttatttc agtagtaatt tcatcctttc tcctagtgct 720

agaagtgcac ttgcatgagg atggaggcaa agctgaaata cccattcgtt gtgatgaaat 780

tttaaaagcg aactctaccg taaactctaa attaagcccc aaaaattata atgcaagtat 840

tcctgtttta atcaatattt ggcatcattt tttttacaat gtataattca gctacacaat 900

tttctcattt ttttttacaa ttgcttataa ttaagctaca caagctacca attcagctac 960

acaattggta catactacta tactagccaa atacccgtga tttgctacgt attaaaacaa 1020

attaatagtg agatttttgg ggcaattaat ttggttttgt agaagttata tcatagagaa 1080

attattttat aacggtaaag ttggttgaaa atatgatgga taatgtggta aataaaaaaa 1140

gtactatagt tggtggcaga ttcactgcca ttgccctctt ttgaaaggaa tatagaattt 1200

tatcttgtag aagttatatt gtacaagtga aatatgatgg aatcatatat gtagaataaa 1260

acattaaagt atgtgggggt atttggttga aaatatgatg gagtatgtgg taaatagaaa 1320

aaaaatacta tacttgatga tggggcgatg atagattcac tgccaccacc attgcatttt 1380

ttttaaaagg agtatataaa catatatagg aacccatcta ctcattactt ggtaagaggt 1440

cttacttggt aattgtgctg gacggtagca tgccagttta ccattcatca tcattattgg 1500

attccttttt tttcttaaaa aaaggtataa tatgatatgc aacttcttaa ttgctttatt 1560

tcttttctag attaatttta gataaaaatt ttattggata tggatcagct agcgtagtaa 1620

aaagtgaacg atacatgaga aaaaagattg atttgacaaa acaaaaacac aacccattaa 1680

attggagcgt cttattcccg tagactgtaa cagaatggtt cggtgatatg atcaactaat 1740

gttttttgtt gcagcaaagt attgtggtca aggtgccgga aaaaagaagg gacgacatga 1800

acgatgatgc attgcactgg gcggtgagtt cgttgcatgg agtgccctcg ggtggtacgt 1860

ctggagattg tagtaggttg cagttggatg gtgaaggcgc gaacatccgc aagctcttgt 1920

ccaccctccg gaataaggtg ggccacgccc agttggtgca ggtcgaggat aagagaaaaa 1980

gggtagagga ggcgacgaag ccttgtgaat ttcacgaggt caaaacaata tgcatccttg 2040

gattgcctgg cgcaggcaaa acaactcttg caaaactgtt gtactcccat cactcaacga 2100

cagagcagca attccaacac cgggctttcg tgtcactctc tccgggtgcc aatctcaccg 2160

acactcttac tgatatttta ttgcaagtag gagcatataa tgatgatgca acaccatatt 2220

gtgggaccgg aacaccgcac caacagtatc tcattgacaa catatcagct tatctcattg 2280

gcaaaaagta agcagagttc tttagaatga tgttatttta aataatatta ttttttttta 2340

aaaaaaatta acaatgtgta tttgatggaa ttaataaaaa tatgttttaa gagaaattaa 2400

taaaaaatat ttgatatcaa attctgcagg atggtcttaa ttagaatttc tataaaaaga 2460

gagtagatga gaaacaccca ggggctcttc tggctagctc cacaagccaa cctattatgt 2520

ttgaagcctc acccctacct atttaatatt aggtctttct ctaatattcg ctatttattt 2580

gatattaaat ccttccctaa tattcgtgtt tttaaaagag agtagatgac aaacagacat 2640

caaattaagc tgattgtttt tcgatcatct caaaggggaa gcttctcatg tgggtggact 2700

catatcttcg aaattattat atagttgcat gtattagtgc taatatattg aggcttattt 2760

actttttttc aacttctaaa gatatcttat tataattgat gacgtttggc gctgggaaga 2820

gtgggaagtc atcagaaagt ccattccaaa gaatgatctg ggtagcagaa taatcatgac 2880

tactcgtctt aattcaatag ctgagaagtg tcgcaatgat gacatggatg cgtttgttta 2940

tgaaactgag gctctggatt atgtggatgc ttggctgttg tgtgacaagg tagcaagaaa 3000

gtctgtcaca tgtatgaaca ttaatccatg ctatgatatc gtggacgtgt gctatggtat 3060

gccgttagca ctaattcgtg tgtcgtcagc attggcagaa gagatacaag ctttagacag 3120

tgatgaatgg caaatatgga gggctctgag acgggtagag gatggtattt tggacatccc 3180

atccttgaag ccattggcag agagtttatg ccttggttac gaccatcttc ctctctatct 3240

gaggactttg ttgttatgtt gtagtgtgta ccattggctt gatggtggga ttgttcaaag 3300

gggccgtttg gtcacaaggt ggattgctga aggatttgtt tcagaagaga aagcagcaga 3360

aggttacttt gatgagcttg tcgacagagg atggattaag catagagggt ggaacgagta 3420

tgagatctac cctatgatgc tggccatcct tagatacaag tcgaaggagt acaattttgt 3480

aacttgtttg ggtacgggat ttgatacttg tactagtgca tctctatcct actcctctcc 3540

aacaatggcg attcgccggc tttgtcttca aagggggtac ccaatgaaat gcttctcaag 3600

tatggatgtg tcacacactc gcagccttgt tatccttggc gacgtgatag gagtcccctt 3660

ggatatgttt aaaagattgc gagtgttgga ccttgaagat aatatcggta tagaggactc 3720

ccacctgaag aagatatgtg agcagctaga gagcctcagg ctgctcaagt acctaggtct 3780

caagggtacg cgaatcacta agctcccaca ggagatacag aagctgaagc atctggagat 3840

tttgtacgtg aggagcacag gcatcaaaga gctcccacgg gagatcgggg aagtgaaaca 3900

actgcggact ctggacgtga ggaacacgcg gatcagcgag ctcccgtcgc agatcgggga 3960

gctcaaacat ctgcggactc tggacgtgag gaacacgcgg atcagcgagc tcctgtcgca 4020

gatcggggag ctcaaacatc tgcggactct ggacgtgagg aacacgcgga tcagcgagct 4080

cccgtcgcag atcggggagc tcaaacatct gcggactctg gacgtgagga acacgcggac 4140

ttctatattt ttttattcta gaagaagaat aaaaaaatat agaagtactg atatctggct 4200

ctctgcacgt gacatgcatc atacatgtat atggtattaa 4240

<210> 14

<211> 2409

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

atgacggggg aggaagtcga tgctttgtgc aaggatgagt tgatggcgga ggtgcgtgag 60

ctgtcctacg acatggacga cgccatcgac gaattcttct tagaggagcc catggcgggc 120

ggcgacggtg gccctttcga tgagctcaag acaagagttg aggatgtctc caagcggttc 180

tccgacagcc ggcggtggag gccacaggtg gagcaacatc aaccatccct aaccgccgca 240

accgtagact gtccacctcc tcacgctcgc ttcgtccaca acatgatgga tgtgtcagag 300

ctcgtggaga tggacaaact acatgagaca gagctcatca aattgctgga acaaggtgcg 360

gacacaagca tatatgcttc ccggtggcgc atcgcaacac catggcatga taaggagcaa 420

agtattgtgg tcaaggtgcc ggaaaaaaga agggacgaca tgaacgatga tgcattgcac 480

tgggcggtga gttcgttgca tggagtgccc tcgggtggta cgtctggaga ttgtagtagg 540

ttgcagttgg atggtgaagg cgcgaacatc cgcaagctct tgtccaccct ccggaataag 600

gtgggccacg cccagttggt gcaggtcgag gataagagaa aaagggtaga ggaggcgacg 660

aagccttgtg aatttcacga ggtcaaaaca atatgcatcc ttggattgcc tggcgcaggc 720

aaaacaactc ttgcaaaact gttgtactcc catcactcaa cgacagagca gcaattccaa 780

caccgggctt tcgtgtcact ctctccgggt gccaatctca ccgacactct tactgatatt 840

ttattgcaag taggagcata taatgatgat gcaacaccat attgtgggac cggaacaccg 900

caccaacagt atctcattga caacatatca gcttatctca ttggcaaaaa gtatcttatt 960

ataattgatg acgtttggcg ctgggaagag tgggaagtca tcagaaagtc cattccaaag 1020

aatgatctgg gtagcagaat aatcatgact actcgtctta attcaatagc tgagaagtgt 1080

cgcaatgatg acatggatgc gtttgtttat gaaactgagg ctctggatta tgtggatgct 1140

tggctgttgt gtgacaaggt agcaagaaag tctgtcacat gtatgaacat taatccatgc 1200

tatgatatcg tggacgtgtg ctatggtatg ccgttagcac taattcgtgt gtcgtcagca 1260

ttggcagaag agatacaagc tttagacagt gatgaatggc aaatatggag ggctctgaga 1320

cgggtagagg atggtatttt ggacatccca tccttgaagc cattggcaga gagtttatgc 1380

cttggttacg accatcttcc tctctatctg aggactttgt tgttatgttg tagtgtgtac 1440

cattggcttg atggtgggat tgttcaaagg ggccgtttgg tcacaaggtg gattgctgaa 1500

ggatttgttt cagaagagaa agcagcagaa ggttactttg atgagcttgt cgacagagga 1560

tggattaagc atagagggtg gaacgagtat gagatctacc ctatgatgct ggccatcctt 1620

agatacaagt cgaaggagta caattttgta acttgtttgg gtacgggatt tgatacttgt 1680

actagtgcat ctctatccta ctcctctcca acaatggcga ttcgccggct ttgtcttcaa 1740

agggggtacc caatgaaatg cttctcaagt atggatgtgt cacacactcg cagccttgtt 1800

atccttggcg acgtgatagg agtccccttg gatatgttta aaagattgcg agtgttggac 1860

cttgaagata atatcggtat agaggactcc cacctgaaga agatatgtga gcagctagag 1920

agcctcaggc tgctcaagta cctaggtctc aagggtacgc gaatcactaa gctcccacag 1980

gagatacaga agctgaagca tctggagatt ttgtacgtga ggagcacagg catcaaagag 2040

ctcccacggg agatcgggga agtgaaacaa ctgcggactc tggacgtgag gaacacgcgg 2100

atcagcgagc tcccgtcgca gatcggggag ctcaaacatc tgcggactct ggacgtgagg 2160

aacacgcgga tcagcgagct cctgtcgcag atcggggagc tcaaacatct gcggactctg 2220

gacgtgagga acacgcggat cagcgagctc ccgtcgcaga tcggggagct caaacatctg 2280

cggactctgg acgtgaggaa cacgcggact tctatatttt tttattctag aagaagaata 2340

aaaaaatata gaagtactga tatctggctc tctgcacgtg acatgcatca tacatgtata 2400

tggtattaa 2409

<210> 15

<211> 4786

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

atgatggatg tgtcagagct cgtggagatg gacaaacaac atgagaaaga gctcatcaaa 60

ttgctggaac aaggtgcgga cacaagcata tatgcttccc ggtggcgcat cgcaacacca 120

tggcatgata aggaggtaaa gacgacatcc ttttatttct tttttatctc tacttctcta 180

tttatatatt atattatatt atattataaa aatttaaaat gttttcgctg tgtgtatttt 240

ggtacgtcgt ggctatcttc gtatcgtatt cgatctcccg ttcagtatgt tttgtgttgt 300

acgtctctag cttccagata tatcatatat ctttccattc ccatgttatt ctttctttcc 360

aaattccaat tattaattat acctcattta atgagggaca tttataccat tttatttcag 420

tagtaatttc atcctttctc ctagtgctag aagtgcactt gcatgaggat ggggatggag 480

gcaaagctga aatacccatt cgttgtgatg aaattttaaa agcgaaccct accgtaaact 540

ctaaattaag ccccaaaaat tataatgcaa gtattcctgt tttaatcaat atttggcatc 600

atttttttac aatgtataat tcagctacac aatttgctca ttttttttta caattgctta 660

taattaagct acacaagcta ccaattcagc tacacaattg gtacatacta ctatactagc 720

caaatacccg tgatttgcta cgtattaaaa caaattaata gtgagatttt tggggcaatt 780

aatttggttt tgtagaagtt atatcataga gaaattattt tataacggta aagttggttg 840

aaaatatgat ggagaatgtg gtaaataaaa aaaaatacta tagttggtgg cagattcact 900

gccaccgcca ttgccctctt ttgaaaggaa tatagaattt tatcttgtag aagttatatt 960

gtacaagtga aatatgatgg aatcatatat gtagaataaa acattaaagt atgtgggggt 1020

atttggttga aaatatgatg gagtatgtgg taaatagaaa aaaaatacta tacttgatga 1080

tggggcgatg atagattcac tgccaccacc attgcatttt tttaaaagga gtatataaac 1140

atatatagga acccaccaac tcattatttg gtaagaggtc ttacttggta attgtgctgg 1200

acggtagcat gccagtttac cattcatcat cattattgga ttcctttttt ttcttaaaaa 1260

aaggtataat atgatatgca acttcttaat tgctttattt cttttctaga ttaattttag 1320

ataaaaattt tattggatat ggatcagcta gcgtagtaaa aagtgaacga tacatgagaa 1380

aaaagattga tttgacaaaa caaaaacaca acccattaaa ttggagcgtc ttattcccgt 1440

agactgtaac agaatggttc ggtgatatga tcaactaatg ttttttgttg cagcaaagta 1500

ttgtggtcaa ggtgccggaa aaaagaaggg acgacatgta cgatgatgca ttgcactggg 1560

cggtgagttc gttgcatgga gtgccctcgg gtggtgcgtc tggagattgt agtaggttgc 1620

agttggatgg tgaaggcgcg aacatccgca agctcttgtc caccctccgg aataaggtgg 1680

gccgcgccca gttggtgcag gtcgaggata agagaaaaag ggtagaggag gcgacgaagc 1740

cttgtgaatt tcacgaggtc aaaacaatat gcatccttgg attgcctggc gcaggcaaaa 1800

caactcttgc aaaactgttg tactcccatc actcaacgac agagcagcaa ttccaacacc 1860

gggctttcgt gtcactctct ccgggtgcca atctcaccga cactcttact gatattttat 1920

tgcaagtagg agcatataat gatgatgcaa caccatattg tgggaccgga acaccgcacc 1980

aacagtatct cattgacaac atatcagctt atctcattgg caaaaagtaa gcagagttct 2040

ttagaatgat gttattttaa ataatattat ttttttaaaa aaaattaaca aacatgttga 2100

tgtgtatttg atggaattaa taaaaatatg ttttaagaga aattaataaa aaaatatttg 2160

atatcaaatt ctgcaggatg gtcttaatta gaatttctat aaaaagagag tagatgagaa 2220

acacccaggg gttcttctga ctagctccac aagccaacct atgtttgaag cctcacccct 2280

acctatttat ttaatattag gtctttctct aatattcgct atttatttga tattaaatcc 2340

ttccctaata ttcgtgtttt taaaagagag tagatgacaa acatatatca aattaagctg 2400

attgtttttc gatcatctca aaggggaagc ttctcatgtg ggtggactca tatcttcgaa 2460

attattatat agttgcatgt attagtgcta atatattgag gcttatttac tttttttcaa 2520

cttctaaagg tatcttatta taattgatga cgtttggcgc tgggaagagt gggaagtcat 2580

cagaaagtcc attccaaaga atgatctggg tagcagaata atcatgacta ctcgtcttaa 2640

ttcaatagct gagaagtgtc gcaatgatga catggatgcg tttgtttatg aaactgaggc 2700

tctggattat gtggatgctt ggttgttgtg tgacaaggta gcaagaaagt ctgtcacatg 2760

tatgaacatt aatccatgct atgatatcgt ggacatgtgc tatggtatgc cgttagcact 2820

aattcgtgtg tcgtcagcat tggcagaaga gatacaagct ttagacagtg atgaacggca 2880

aatatggagg gctctgagac gggtagagga tggtattttg gacatcccat ccttgaagcc 2940

attggcagag agtttatgcc ttggttacga ccatcttcct ctctatctga ggactttgtt 3000

gttatgttgt agtgtgtacc attggcttga tggtgggatt gttcaaaggg gccgtttggt 3060

cacaaggtgg attgctgaag gatttgtttc agaagagaaa gcagcagaag gttactttga 3120

tgagcttgtc ggcagaggat ggatgaagca tagagagttg aacgagtatg agatccaccc 3180

tatgatgctg gccatcctta gatacaagtc gaaggagtac aattttgtaa cttgtttggg 3240

tacgggatct gatacttgta ctagtgcatc tctatcctac tcctctccaa caatggcgat 3300

tcgccggctt tgtcttcaaa gggggtaccc aatgaaatgc ttctcaagta tggatgtgtc 3360

acacactcgc agccttgtca tccttggcga cgtgatagga gtccccttgg atatgtttaa 3420

aagattgcga gtgttggacc ttgaagacaa tctcgatata gatgactctc acctgaagaa 3480

gatatgtgag cagctagaga gcctcaggct gctcaagtac ctgggtatca agggtacacg 3540

gatcactaag ctcccacagg agatacagaa gctgaagcat ctggagattt tgtacgtgag 3600

gagcacaggc atcaaagagc tcccacggga gatcggggaa ttgaaacaac tgcggactct 3660

ggacatgagg aacacgcgga tcagcgagct cccgtcgcag atcggggagc tcaaacatct 3720

gcggactctg gacgtgagta acaacatgtg gaatatcagc gagctgccgt cgcaaatcgg 3780

ggagctgaag catctacaaa ctctggatgt gaggaatacg tcggtgagag agctgccatc 3840

gcaaatcggg gagctgaagc atctgcggac tctggatgtg aggaacacgg gggtgagaga 3900

gctgccatgg caagctggcc agatctcggg atcgctgcac gtgcatacag atgacagtga 3960

cgagggcatg cggctgccag aaggcgtatg cgaagatctg atcaagggta ttcccaaggc 4020

tgagctcgca aagtgcagtg aggtcctatc catcaatatt gtcgatcgtt taggatctcc 4080

ccctattggc atattcaagg ttattggctt gcacaagagt atcccgaagc tgatcaaaga 4140

tcatttcaat gttctttctt ccctagacat caggcggtac aacaagctag aggaggatga 4200

ccatgagttt ctagccaaca atatgcctaa cctccagatg cttgtactga ggttcgaggc 4260

cccacaaaga gagcccatca acattaaccg cacaggcttc cagatgatgg agagattcct 4320

tgtggagagc cgggtgccac ggataacctt ccaggaagga gccatgccca agctcaagca 4380

tctcgagttc aagttctacg ctggcccacc aagcaaagat cccataggaa tcacccacct 4440

caagagcctc caaaaggtgg tctttcgctg ctccaaatgg tacaagagcg acaaccctgg 4500

catcaaggct gccattgacg tcgtgaagaa agaagcaagg cagcatccca accggccgat 4560

cagccttctc atcactgagg gcgataagga ggtaccaaat attgaggcac acgggagcag 4620

tgaaaacatt gtcgttgtcc acgctgctcc tgacgacgcc atcagttgct ctagctgcgg 4680

ccgaaccagc actagtatcc aagagggaac agtccgagat cgaataccag ctatggattt 4740

gttctggccg gagtttaaca gctatgaaaa agcaaaaaga aactag 4786

<210> 16

<211> 5230

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

atggccgtat acagcgtcgc cacgggggcc ttggctcccg tcctatcgaa gctctccgct 60

ttgctgggcg acgagcactt ggatcttgcg gagaggaccc ggagcgacgc catgttcatc 120

aggtcccagc tggaggccgt gcactctctc ctcctcccga ggattagttg gggaatgacg 180

ggggaggaag tcgatgcttt gtgcaaggat gagttgatgg cggaggtgcg tgagctgtcc 240

tacgacatgg acgacgccat cgacgaattc ttcttagagg agcccatggc gggcggcgac 300

ggtggccctt tcgatgagct caagacaaga gttgaggatg tctccaagcg gttctccgac 360

agccggcggt ggaggccacc ggtggagcaa catcaaccat ccctaaccgc cgcaaccgta 420

gactgtccac ctcctcacgc tcgcttcgtc cacaacatga tggatgtgtc agagctcgtg 480

gagatggaca aacaacatga gaaagagctc atcaaattgc tggaacaagg tgcggacaca 540

agcatatatg cttcccggtg gcgcatcgca acaccatggc atgataagga ggtaaagacg 600

acatcctttt atttcttttt tatctctact tctctattta tatattatat tatattatat 660

tataaaaatt taaaatgttt tcgctgtgtg tattttggta cgtcgtggct atcttcgtat 720

cgtattcgat ctcccgttca gtatattttg tgttgtacgt ctctagcttc cagatatatc 780

atatatcttt ccattcccat gttattcttt ctttccaaat tccaattatt aattatacct 840

catttaatga gggacattta taccatttta tttcagtagt aatttcatcc tttcctagtg 900

ctagaagtgc acttgcatga ggatggaggc aaagctgaaa tacccattcg ttgtgatgaa 960

attttaaaag cgaaccctac cgtaaactct aaattaagcc ccaaaaatta taatgcaagt 1020

attcctgttt taatcaatat ttggcatcat ttttttacaa tgtataattc agctacacaa 1080

tttgctcatt tttttttaca attgcttata attaagctac acaagctacc aattcagcta 1140

cacaattggc acatactact atactagcca aatacccgtt attttctacg tattaaaaca 1200

aattaatagt gagatttttg gggcaattaa tttggttttg tagaagttat atcatagaga 1260

aattatttta taacggtaaa gttggttgaa aatatgatgg agaatgtggt aaataaaaaa 1320

aatactatag ttggtggcag attcactgcc accgccattg ccctcttttg aaaggaatat 1380

agaattttat cttgtagaag ttatattgta caagtgaaat atgatggaat catatatgta 1440

gaataaaaca ttaaagtatg tgggggtatt tggttgaaaa tatgatggag tatgtggtaa 1500

atagaaaaaa aatactatac ttgatgatgg ggcgatgata gattcactgc caccaccatt 1560

gcattttttt aaaaggagta tataaacata tataggaacc cacctactca ttacttggta 1620

agaggtctta cttggtaatt gtgctggacg gtagtatgcc agtttaccat tcatcatcat 1680

tattggattc cttttttttc ttaaaaaaag gtataatatg atatgcaact tcttaattgc 1740

tttatttctt ttctagatta attttagata aaaattttat tggatatgga tcagctagcg 1800

tagtaaaaag tgaacgatac atgagaaaaa agattgattt gacaaaacaa aaacacaacc 1860

cattaaattg gagtgtctta ttcccgtaga ctgcagtaac agaatggttc gatgatcaac 1920

taatgttttt tgctgcagca aagtactgtg gtcaaggtgc cggaaagaga gtggggcttc 1980

ccggacaatc ggaacagtcc atttatatgg gcgagtgatt cgtttgaacg attgcgttcg 2040

ggaagtttgt gtggagatac gttgcggttg gatggtgaag gcgcgaacat ccgcaagctc 2100

ttgtccaccc tccggaataa ggtgggccgc gcccagttgg tgcaggtcga ggataagaga 2160

aaaagggtag aggaggcgac gaagccttgt gaatttcacg aggtcaaaac aatatgcatc 2220

cttggattgc ctggcgcagg caaaacaact cttgcaaaac tgttgtactc ccatcactca 2280

acgacagagc agcaattcca acaccgggct ttcgtgtcac tctctccggg tgccaatctc 2340

accgacactc ttactgatat tttattgcaa gtaggagcat ataatgatga tgcaacacca 2400

tattgtggga ccggaacacc gcaccaacag tatctcattg acaatatatc agcttatctc 2460

attggcaaaa agtaagcaga gttctttaga atgatgttat tttaaataat aatatttttt 2520

tttaaaaaaa aattaacaaa catgttgatg tgtatttgat ggaattaata aaaatatgtt 2580

ttaagagaaa ttaataaaaa atatttgata tcaaattctg caggatggtc ttaattagaa 2640

tttctataaa aagagagtag atgagaaata cccaggggtt cttctggcta gctccacaag 2700

ccaatctatg tttgaagcct cacccctacc tatttattta atattaggtc tttccctaat 2760

attcgctatt tatttgatat taaatccttc cctaatattc gtgtttttaa aagagagtag 2820

atgacaaaca gacatcaaat taagctgatt gtttttcgat catctcaaag gggaagcttc 2880

tcatgtgggt ggactcatat cttcgaaatt attatatagt tgcatgtatt agtgctaata 2940

tattgaggct tatttacttt ttttcaactt ctgaaggtat cttattataa ttgatgacgt 3000

ttggcactgg gaagagtggg aagtcatcag aaagtccatt ccaaagaatg atctgggtag 3060

cagaataatc atgactactc gtcttaattc aatagctgag aagtgtcgca atgatgacat 3120

ggatgcgttt gtttatgaaa ctgaggctct ggattatgtg gatgcttggt tgttgtgtga 3180

caaggtagca agaaagtctg tcacatgtat gaacattaat ccatgctatg atatcgtgga 3240

catgtgctat ggtatgccgt tagcactaat tcgtgtgtcg tcagcattgg cagaagagat 3300

acaagcttta gacagtgatg aacggcaaat atggagggct ctgagacggg tagaggatgg 3360

tattttggac atcccatcct tgaagccatt ggcagagagt ttatgccttg gttacgacca 3420

tcttcctctc tatctgagga ctttgttgtt atgttgtagt gtgtaccatt ggcttgatgg 3480

tgggattgtt caaaggggcc gtttggtcac aaggtggatt gctgaaggat ttgtttcaga 3540

agagaaagca gcagaaggtt actttgatga gcttgtcggc agaggatgga tgaagcatag 3600

agggttgaac gagtatgaga tccaccctat gatgctggcc atccttagat acaaatcgaa 3660

ggagtacaat tttgtaactt gtttgggtac gggatctgat acttgtacta gtgcatctct 3720

atcctactcc tctccaacaa tggcgattcg ccggctttgt cttcaaaggg ggtacccaat 3780

gaaatgcttc tcaagtatgg atgtgtcaca cactcgcagc cttgtcatcc ttggcgacgt 3840

gataggagtc cccttggata tgtttaaaag attgcgagtg ttggaccttg aagataatat 3900

cggtatagag gactcccacc tgaagaagat atgtgagcag ctagagagcc tcaggctgct 3960

caagtaccta ggtctcaagg gtacgcgaat cactaagctc ccacaggaga tacagaagct 4020

gaagcaactg gagattttgt acgtgaggag cacaggcatc gaagagctcc catgggagat 4080

cggggaattg aaacaactgc ggactctgga cgtgaggaac acgcggatca gcgagctccc 4140

gtcgcagatc ggggagctca aacatctgcg gactctggac gtgagtaaca tgtggaatat 4200

cagcgagctg ccgtcgcaaa tcggggagct gaagcatcta caaactctgg atgtgaggaa 4260

cacgtcagtg agagagctgc catcgcaaat cggggagctg aagcatctgc ggactctgga 4320

tgtgaggaac acgggggtga gagagctgcc atggcaagct ggccagatct cgggatcgct 4380

gcacgtgcat acagatgaca gtgacgaggg catgcggctg ccagaaggcg tatgcgaaga 4440

tctgatcaag ggtattccca aggctgagct cgcaaagtgc agtgaggtcc tatccatcaa 4500

tattgtcgat cgtttaggat ctccccctat tggcatattc aaggttattg gcttgcacaa 4560

gagtatcccg aagctgatca aagatcattt caatgttctt tcttccctag acatcaggcg 4620

gtacaacaag ctagaggagg atgaccatga gtttctagcc aacaatatgc ctaacctcca 4680

gatgcttgta ctgaggttcg aggccccaca aagagagccc atcatcatta accgcacagg 4740

cttccagatg ctggagagat tccttgtgga gagccgggtg ccacggataa ccttccagga 4800

aggagccatg cccaagctca agcatctcga gtttaagttc tacgctggcc caccaagcaa 4860

agatcccata ggaatcaccc acctcaagag cctccaaaag gtggtctttc gctgctccaa 4920

atggtacaag agcgacaacc ctggcatcaa ggctgccatt gacgtcgtga agaaagaagc 4980

aaggcagcat cccaaccggc cgatcagcct tctcatcact gagggcgata aggaggtacc 5040

gaatattgag gcacacggga gcagtgaaaa cattgtcgtt gtccacgctg ctcctgacga 5100

cgccatcagt tgctctagct gcggccgaac cagcactagt atccaagagg gaacagtccg 5160

agatcgaata ccagctatgg atttgttctg gccggagttt aacagctatg aaaaagcaaa 5220

aagaaactag 5230

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

aagcagcacc tatagctaac 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

agcgtggcac tataaatgaa 20

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

cctgtgcata atagcttctc 20

<210> 20

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

atcctaggga tgaatgtggt c 21

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

atcggatgct cacttaactc 20

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

cgccccaatt ttgtttatcg 20

<210> 23

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

atgatggatg tgtcagagc 19

<210> 24

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

ctagtttctt tttgcttttt ca 22

<210> 25

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

atggccgtat acagcgtc 18

<210> 26

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

ctagtttctt tttgcttttt cat 23

<210> 27

<211> 5232

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

atggccgtat acagcgtcgc cacgggggcc ttggctcccg tcctatcgaa gctctccgct 60

ttgctgggcg acgagcactt ggatcttgcg gagaggaccc ggagcgacgc catgttcatc 120

aggtcccagc tggaggccgt gcactctctc ctcctcccga ggattagttg gggaatgacg 180

ggggaggaag tcgatgcttt gtgcaaggat gagttgatgg cggaggtgcg tgagctgtcc 240

tacgacatgg acgacgccat cgacgaattc ttcttagagg agcccatggc gggcggcgac 300

ggtggccctt tcgatgagct caagacaaga gttgaggatg tctccaagcg gttctccgac 360

agccggcggt ggaggccacc ggtggagcaa catcaaccat ccctaaccgc cgcaaccgta 420

gactgtccac ctcctcacgc tcgcttcgtc cacaacatga tggatgtgtc agagctcgtg 480

gagatggaca aactacatga gaaagagctc atcaaattgc tggaacaagg tgcggacaca 540

agcatatatg cttcccggtg gcgcatcgca acaccatggc atgataagga ggtaaagacg 600

acatcctttt atttcttttt tatctctact tctctattta tatattatat tatattataa 660

aaatttaaaa tgttttcgct gtgtgtattt tggtacgtcg tggctatctt cgtatcgtat 720

tcgatctccc gttcagtatg ttttgtgttg tacgtctcta gcttccagat atatcatata 780

tctttccatt cccatgttat tctttctttc caaattccaa ttattaatta tacctcattt 840

aatgagggac atttatacca ttttatttca gtagtaattt catcctttct tctagtgcta 900

gaagtgcact tgcatgagga tggaggcaaa gctgaaatac ccattcgttg tgatgaaatt 960

ttaaaagcga accctaccgt aaactctaaa ttaagcccca aaaattataa tgcaagtatt 1020

cctgttttaa tcaatatttg gcatcatttt tttacaatgt ataattcagc tacacaattt 1080

gctcattttt ttttacaatt gcttataatt aagctacaca agctaccaat tcagctacac 1140

aattggtaca tactactata ctagccaaat acccgtgatt tgctacgtat taaaacaaat 1200

taatagtgag atttttgggg caattaattt ggttttgtag aagttatatc atagagaaat 1260

tattttataa cggtaaagtt ggttgaaaat atgatggaga atgtggtaaa taaaaaaaaa 1320

tactatagtt ggtggcagat tcactgccac cgccattgcc ctcttttgaa aggaatatag 1380

aattttatct tgtagaagtt atattgtaca agtgaaatat gatggaatca tatatgtaga 1440

ataaaacatt aaagtatgtg ggggtatttg gttgaaaata tgatggagta tgtggtaaat 1500

agaaaaaaaa tactatactt gatgatgggg cgatgataga ttcactgcca ccaccattgc 1560

atttttttaa aaggagtata taaacatata taggaaccca ccaactcatt atttggtaag 1620

aggtcttact tggtaattgt gctggacggt agcatgccag tttaccattc atcatcatta 1680

ttggattcct tttttttctt aaaaaaaggt ataatatgat atgcaacttc ttaattgctt 1740

tatttctttt ctagattaat tttagataaa aattttattg gatatggatc agctagcgta 1800

gtaaaaagtg aacgatacat gagaaaaaag attgatttga caaaacaaaa acacaaccca 1860

ttaaattgga gcgtcttatt cccgtagact gtaacagaat ggttcggtga tatgatcaac 1920

taatgttttt tgttgcagca aagtattgtg gtcaaggtgc cggaaaaaag aagtgacgac 1980

atgaacgatg atgcattgca ctgggcggtg agtttgtcgc atggagtgcc ctcgggtggt 2040

acgtctggag attgtagtag gttgcagttg gatggtgaag gcgcgaacat ccgcaagctc 2100

ttgtccaccc tccggaataa ggtgggccac gcccagttgg tgcaggtcga ggataagaga 2160

aaaagggtag aggaggcgac gaagccttgt gaatttcacg aggtcaaaac aatatgcatc 2220

cttggattgc ctggcgcagg caaaacaact cttgcaaaac tgttgtactc ccatcactca 2280

acgacagagc agcaattcca acaccgggct ttcgtgtcac tctctccggg tgccaatctc 2340

accgacactc ttactgatat tttattgcaa gtaggagcat ataatgatga tgcaacacca 2400

tattgtggga ccggaacacc gcaccaacag tatctcattg acaacatatc agcttatctc 2460

attggcaaaa agtaagcaga gttctttaga atgatgttat tttaaataat attatttttt 2520

ttaaaaaaaa ttaacaaaca tgttgatgtg tatttgatgg aattaataaa aatatgtttt 2580

aagagaaatt aataaaaaaa tatttgatat caaattctgc aggatggtct taattagaat 2640

ttctataaaa agagagtaga tgagaaacac ccaggggttc ttctgactag ctccacaagc 2700

caacctatgt ttgaagcctc acccctacct atttatttaa tattaggtct ttctctaata 2760

ttcgctattt atttgatatt aaatccttcc ctaatattcg tgtttttaaa agagagtaga 2820

tgacaaacat atatcaaatt aagctgattg tttttcgatc atctcaaagg ggaagcttct 2880

catgtgggtg gactcatatc ttcgaaatta ttatatagtt gcatgtatta gtgctaatat 2940

attgaggctt atttactttt tttcaacttc taaaggtatc ttattataat tgatgacgtt 3000

tggcgctggg aagagtggga agtcatcaga aagtccattc caaagaatga tctgggtagc 3060

agaataatca tgactactcg tcttaattca atagctgaga agtgtcgcaa tgatgacatg 3120

gatgcgtttg tttatgaaac tgaggctctg gattatgtgg atgcttggtt gttgtgtgac 3180

aaggtagcaa gaaagtctgt cacatgtatg aacattaatc catgctatga tatcgtggac 3240

atgtgctatg gtatgccgtt agcactaatt cgtgtgtcgt cagcattggc agaagagata 3300

caagctttag acagtgatga acggcaaata tggagggctc tgagacgggt agaggatggt 3360

attttggaca tcccatcctt gaagccattg gcagagagtt tatgccttgg ttacgaccat 3420

cttcctctct atctgaggac tttgttgtta tgttgtagtg tgtaccattg gcttgatggt 3480

gggattgttc aaaggggccg tttggtcaca aggtggattg ctgaaggatt tgtttcagaa 3540

gagaaagcag cagaaggtta ctttgatgag cttgtcggca gaggatggat gaagcataga 3600

gagttgaacg agtatgagat ccaccctatg atgctggcca tccttagata caagtcgaag 3660

gagtacaatt tcgtaacttg tttgggtacg ggatctgata cttgtactag tgcatctcta 3720

tcctactcct ctccaacaat ggcgattcgc cggctttgtc ttcaaagggg gtacccaatg 3780

aaatgcttct caagtatgga tgtgtcacac actcgcagcc ttgtcatcct tggcgacgtg 3840

ataggagtcc ccttggatat gtttaaaaga ttgcgagtgt tggaccttga agacaatctc 3900

gatatagatg actctcacct gaagaagata tgtgagcagc tagagagcct caggctgctc 3960

aagtacctgg gtatcaaggg tacacggatc actaagctcc cacaggagat acagaagctg 4020

aagcatctgg agattttgta cgtgaggagc acaggcatca aagagctccc acgggagatc 4080

ggggaattga aacaactgcg gactctggac atgaggaaca cgcggatcag cgagctcccg 4140

tcgcagatcg gggagctcaa acatctgcgg actctggacg tgagtaacaa catgtggaat 4200

atcagcgagc tgccgtcgca aatcggggag ctgaagcatc tacaaactct ggatgtgagg 4260

aatacgtcgg tgagagagct gccatcgcaa atcggggagc tgaagcatct gcggactctg 4320

gatgtgagga acacgggggt gagagagctg ccatggcaag ctggccagat ctcgggatcg 4380

ctgcacgtgc atacagatga cagtgacgag ggcatgcggc tgccagaagg cgtatgcgaa 4440

gatctgatca agggtattcc caaggctgag ctcgcaaagt gcagtgaggt cctatccatc 4500

aatattgtcg atcgtttagg atctccccct attggcatat tcaaggttat tggcttgcac 4560

aagagtatcc cgaagctgat caaagatcat ttcaatgttc tttcttccct agacatcagg 4620

cggtacaaca agctagagga ggatgaccat gagtttctag ccaacaatat gcctaacctc 4680

cagatgcttg tactgaggtt cgaggcccca caaagagagc ccatcatcat taaccgcaca 4740

ggcttccaga tgatggagag attccttgtg gagagccggg tgccacggct aaccttccag 4800

gaaggagcca tgcccaagct caagcatctc gagttcaagt tctacgctgg cccaccaagc 4860

aaagatccca taggaatcac ccacctcaag agcctccaaa aggtggtctt tcgctgctcc 4920

aaatggtaca agagcgacaa ccctggcatc aaggctgcca ttgacgtcgt gaagaaagaa 4980

gcaaggcagc atcccaaccg gccgatcagc cttctcatca ctgagggcga taaggaggta 5040

ccaaatattg aggcacacgg gagcagtgaa aacattgtcg ttgtccacgc tgctcctgac 5100

gacgccatca gttgctctag ctgcggccga accagcacta gtatccaaga gggaacagtc 5160

cgagatcgaa taccagctat ggatttgttc tggccggagt ttaacagcta tgaaaaagca 5220

aaaagaaact ag 5232

<210> 28

<211> 3381

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

atggccgtat acagcgtcgc cacgggggcc ttggctcccg tcctatcgaa gctctccgct 60

ttgctgggcg acgagcactt ggatcttgcg gagaggaccc ggagcgacgc catgttcatc 120

aggtcccagc tggaggccgt gcactctctc ctcctcccga ggattagttg gggaatgacg 180

ggggaggaag tcgatgcttt gtgcaaggat gagttgatgg cggaggtgcg tgagctgtcc 240

tacgacatgg acgacgccat cgacgaattc ttcttagagg agcccatggc gggcggcgac 300

ggtggccctt tcgatgagct caagacaaga gttgaggatg tctccaagcg gttctccgac 360

agccggcggt ggaggccacc ggtggagcaa catcaaccat ccctaaccgc cgcaaccgta 420

gactgtccac ctcctcacgc tcgcttcgtc cacaacatga tggatgtgtc agagctcgtg 480

gagatggaca aactacatga gaaagagctc atcaaattgc tggaacaagg tgcggacaca 540

agcatatatg cttcccggtg gcgcatcgca acaccatggc atgataagga gcaaagtatt 600

gtggtcaagg tgccggaaaa aagaagtgac gacatgaacg atgatgcatt gcactgggcg 660

gtgagtttgt cgcatggagt gccctcgggt ggtacgtctg gagattgtag taggttgcag 720

ttggatggtg aaggcgcgaa catccgcaag ctcttgtcca ccctccggaa taaggtgggc 780

cacgcccagt tggtgcaggt cgaggataag agaaaaaggg tagaggaggc gacgaagcct 840

tgtgaatttc acgaggtcaa aacaatatgc atccttggat tgcctggcgc aggcaaaaca 900

actcttgcaa aactgttgta ctcccatcac tcaacgacag agcagcaatt ccaacaccgg 960

gctttcgtgt cactctctcc gggtgccaat ctcaccgaca ctcttactga tattttattg 1020

caagtaggag catataatga tgatgcaaca ccatattgtg ggaccggaac accgcaccaa 1080

cagtatctca ttgacaacat atcagcttat ctcattggca aaaagtatct tattataatt 1140

gatgacgttt ggcgctggga agagtgggaa gtcatcagaa agtccattcc aaagaatgat 1200

ctgggtagca gaataatcat gactactcgt cttaattcaa tagctgagaa gtgtcgcaat 1260

gatgacatgg atgcgtttgt ttatgaaact gaggctctgg attatgtgga tgcttggttg 1320

ttgtgtgaca aggtagcaag aaagtctgtc acatgtatga acattaatcc atgctatgat 1380

atcgtggaca tgtgctatgg tatgccgtta gcactaattc gtgtgtcgtc agcattggca 1440

gaagagatac aagctttaga cagtgatgaa cggcaaatat ggagggctct gagacgggta 1500

gaggatggta ttttggacat cccatccttg aagccattgg cagagagttt atgccttggt 1560

tacgaccatc ttcctctcta tctgaggact ttgttgttat gttgtagtgt gtaccattgg 1620

cttgatggtg ggattgttca aaggggccgt ttggtcacaa ggtggattgc tgaaggattt 1680

gtttcagaag agaaagcagc agaaggttac tttgatgagc ttgtcggcag aggatggatg 1740

aagcatagag agttgaacga gtatgagatc caccctatga tgctggccat ccttagatac 1800

aagtcgaagg agtacaattt cgtaacttgt ttgggtacgg gatctgatac ttgtactagt 1860

gcatctctat cctactcctc tccaacaatg gcgattcgcc ggctttgtct tcaaaggggg 1920

tacccaatga aatgcttctc aagtatggat gtgtcacaca ctcgcagcct tgtcatcctt 1980

ggcgacgtga taggagtccc cttggatatg tttaaaagat tgcgagtgtt ggaccttgaa 2040

gacaatctcg atatagatga ctctcacctg aagaagatat gtgagcagct agagagcctc 2100

aggctgctca agtacctggg tatcaagggt acacggatca ctaagctccc acaggagata 2160

cagaagctga agcatctgga gattttgtac gtgaggagca caggcatcaa agagctccca 2220

cgggagatcg gggaattgaa acaactgcgg actctggaca tgaggaacac gcggatcagc 2280

gagctcccgt cgcagatcgg ggagctcaaa catctgcgga ctctggacgt gagtaacaac 2340

atgtggaata tcagcgagct gccgtcgcaa atcggggagc tgaagcatct acaaactctg 2400

gatgtgagga atacgtcggt gagagagctg ccatcgcaaa tcggggagct gaagcatctg 2460

cggactctgg atgtgaggaa cacgggggtg agagagctgc catggcaagc tggccagatc 2520

tcgggatcgc tgcacgtgca tacagatgac agtgacgagg gcatgcggct gccagaaggc 2580

gtatgcgaag atctgatcaa gggtattccc aaggctgagc tcgcaaagtg cagtgaggtc 2640

ctatccatca atattgtcga tcgtttagga tctcccccta ttggcatatt caaggttatt 2700

ggcttgcaca agagtatccc gaagctgatc aaagatcatt tcaatgttct ttcttcccta 2760

gacatcaggc ggtacaacaa gctagaggag gatgaccatg agtttctagc caacaatatg 2820

cctaacctcc agatgcttgt actgaggttc gaggccccac aaagagagcc catcatcatt 2880

aaccgcacag gcttccagat gatggagaga ttccttgtgg agagccgggt gccacggcta 2940

accttccagg aaggagccat gcccaagctc aagcatctcg agttcaagtt ctacgctggc 3000

ccaccaagca aagatcccat aggaatcacc cacctcaaga gcctccaaaa ggtggtcttt 3060

cgctgctcca aatggtacaa gagcgacaac cctggcatca aggctgccat tgacgtcgtg 3120

aagaaagaag caaggcagca tcccaaccgg ccgatcagcc ttctcatcac tgagggcgat 3180

aaggaggtac caaatattga ggcacacggg agcagtgaaa acattgtcgt tgtccacgct 3240

gctcctgacg acgccatcag ttgctctagc tgcggccgaa ccagcactag tatccaagag 3300

ggaacagtcc gagatcgaat accagctatg gatttgttct ggccggagtt taacagctat 3360

gaaaaagcaa aaagaaacta g 3381

<210> 29

<211> 1126

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

Met Ala Val Tyr Ser Val Ala Thr Gly Ala Leu Ala Pro Val Leu Ser

1 5 10 15

Lys Leu Ser Ala Leu Leu Gly Asp Glu His Leu Asp Leu Ala Glu Arg

20 25 30

Thr Arg Ser Asp Ala Met Phe Ile Arg Ser Gln Leu Glu Ala Val His

35 40 45

Ser Leu Leu Leu Pro Arg Ile Ser Trp Gly Met Thr Gly Glu Glu Val

50 55 60

Asp Ala Leu Cys Lys Asp Glu Leu Met Ala Glu Val Arg Glu Leu Ser

65 70 75 80

Tyr Asp Met Asp Asp Ala Ile Asp Glu Phe Phe Leu Glu Glu Pro Met

85 90 95

Ala Gly Gly Asp Gly Gly Pro Phe Asp Glu Leu Lys Thr Arg Val Glu

100 105 110

Asp Val Ser Lys Arg Phe Ser Asp Ser Arg Arg Trp Arg Pro Pro Val

115 120 125

Glu Gln His Gln Pro Ser Leu Thr Ala Ala Thr Val Asp Cys Pro Pro

130 135 140

Pro His Ala Arg Phe Val His Asn Met Met Asp Val Ser Glu Leu Val

145 150 155 160

Glu Met Asp Lys Leu His Glu Lys Glu Leu Ile Lys Leu Leu Glu Gln

165 170 175

Gly Ala Asp Thr Ser Ile Tyr Ala Ser Arg Trp Arg Ile Ala Thr Pro

180 185 190

Trp His Asp Lys Glu Gln Ser Ile Val Val Lys Val Pro Glu Lys Arg

195 200 205

Ser Asp Asp Met Asn Asp Asp Ala Leu His Trp Ala Val Ser Leu Ser

210 215 220

His Gly Val Pro Ser Gly Gly Thr Ser Gly Asp Cys Ser Arg Leu Gln

225 230 235 240

Leu Asp Gly Glu Gly Ala Asn Ile Arg Lys Leu Leu Ser Thr Leu Arg

245 250 255

Asn Lys Val Gly His Ala Gln Leu Val Gln Val Glu Asp Lys Arg Lys

260 265 270

Arg Val Glu Glu Ala Thr Lys Pro Cys Glu Phe His Glu Val Lys Thr

275 280 285

Ile Cys Ile Leu Gly Leu Pro Gly Ala Gly Lys Thr Thr Leu Ala Lys

290 295 300

Leu Leu Tyr Ser His His Ser Thr Thr Glu Gln Gln Phe Gln His Arg

305 310 315 320

Ala Phe Val Ser Leu Ser Pro Gly Ala Asn Leu Thr Asp Thr Leu Thr

325 330 335

Asp Ile Leu Leu Gln Val Gly Ala Tyr Asn Asp Asp Ala Thr Pro Tyr

340 345 350

Cys Gly Thr Gly Thr Pro His Gln Gln Tyr Leu Ile Asp Asn Ile Ser

355 360 365

Ala Tyr Leu Ile Gly Lys Lys Tyr Leu Ile Ile Ile Asp Asp Val Trp

370 375 380

Arg Trp Glu Glu Trp Glu Val Ile Arg Lys Ser Ile Pro Lys Asn Asp

385 390 395 400

Leu Gly Ser Arg Ile Ile Met Thr Thr Arg Leu Asn Ser Ile Ala Glu

405 410 415

Lys Cys Arg Asn Asp Asp Met Asp Ala Phe Val Tyr Glu Thr Glu Ala

420 425 430

Leu Asp Tyr Val Asp Ala Trp Leu Leu Cys Asp Lys Val Ala Arg Lys

435 440 445

Ser Val Thr Cys Met Asn Ile Asn Pro Cys Tyr Asp Ile Val Asp Met

450 455 460

Cys Tyr Gly Met Pro Leu Ala Leu Ile Arg Val Ser Ser Ala Leu Ala

465 470 475 480

Glu Glu Ile Gln Ala Leu Asp Ser Asp Glu Arg Gln Ile Trp Arg Ala

485 490 495

Leu Arg Arg Val Glu Asp Gly Ile Leu Asp Ile Pro Ser Leu Lys Pro

500 505 510

Leu Ala Glu Ser Leu Cys Leu Gly Tyr Asp His Leu Pro Leu Tyr Leu

515 520 525

Arg Thr Leu Leu Leu Cys Cys Ser Val Tyr His Trp Leu Asp Gly Gly

530 535 540

Ile Val Gln Arg Gly Arg Leu Val Thr Arg Trp Ile Ala Glu Gly Phe

545 550 555 560

Val Ser Glu Glu Lys Ala Ala Glu Gly Tyr Phe Asp Glu Leu Val Gly

565 570 575

Arg Gly Trp Met Lys His Arg Glu Leu Asn Glu Tyr Glu Ile His Pro

580 585 590

Met Met Leu Ala Ile Leu Arg Tyr Lys Ser Lys Glu Tyr Asn Phe Val

595 600 605

Thr Cys Leu Gly Thr Gly Ser Asp Thr Cys Thr Ser Ala Ser Leu Ser

610 615 620

Tyr Ser Ser Pro Thr Met Ala Ile Arg Arg Leu Cys Leu Gln Arg Gly

625 630 635 640

Tyr Pro Met Lys Cys Phe Ser Ser Met Asp Val Ser His Thr Arg Ser

645 650 655

Leu Val Ile Leu Gly Asp Val Ile Gly Val Pro Leu Asp Met Phe Lys

660 665 670

Arg Leu Arg Val Leu Asp Leu Glu Asp Asn Leu Asp Ile Asp Asp Ser

675 680 685

His Leu Lys Lys Ile Cys Glu Gln Leu Glu Ser Leu Arg Leu Leu Lys

690 695 700

Tyr Leu Gly Ile Lys Gly Thr Arg Ile Thr Lys Leu Pro Gln Glu Ile

705 710 715 720

Gln Lys Leu Lys His Leu Glu Ile Leu Tyr Val Arg Ser Thr Gly Ile

725 730 735

Lys Glu Leu Pro Arg Glu Ile Gly Glu Leu Lys Gln Leu Arg Thr Leu

740 745 750

Asp Met Arg Asn Thr Arg Ile Ser Glu Leu Pro Ser Gln Ile Gly Glu

755 760 765

Leu Lys His Leu Arg Thr Leu Asp Val Ser Asn Asn Met Trp Asn Ile

770 775 780

Ser Glu Leu Pro Ser Gln Ile Gly Glu Leu Lys His Leu Gln Thr Leu

785 790 795 800

Asp Val Arg Asn Thr Ser Val Arg Glu Leu Pro Ser Gln Ile Gly Glu

805 810 815

Leu Lys His Leu Arg Thr Leu Asp Val Arg Asn Thr Gly Val Arg Glu

820 825 830

Leu Pro Trp Gln Ala Gly Gln Ile Ser Gly Ser Leu His Val His Thr

835 840 845

Asp Asp Ser Asp Glu Gly Met Arg Leu Pro Glu Gly Val Cys Glu Asp

850 855 860

Leu Ile Lys Gly Ile Pro Lys Ala Glu Leu Ala Lys Cys Ser Glu Val

865 870 875 880

Leu Ser Ile Asn Ile Val Asp Arg Leu Gly Ser Pro Pro Ile Gly Ile

885 890 895

Phe Lys Val Ile Gly Leu His Lys Ser Ile Pro Lys Leu Ile Lys Asp

900 905 910

His Phe Asn Val Leu Ser Ser Leu Asp Ile Arg Arg Tyr Asn Lys Leu

915 920 925

Glu Glu Asp Asp His Glu Phe Leu Ala Asn Asn Met Pro Asn Leu Gln

930 935 940

Met Leu Val Leu Arg Phe Glu Ala Pro Gln Arg Glu Pro Ile Ile Ile

945 950 955 960

Asn Arg Thr Gly Phe Gln Met Met Glu Arg Phe Leu Val Glu Ser Arg

965 970 975

Val Pro Arg Leu Thr Phe Gln Glu Gly Ala Met Pro Lys Leu Lys His

980 985 990

Leu Glu Phe Lys Phe Tyr Ala Gly Pro Pro Ser Lys Asp Pro Ile Gly

995 1000 1005

Ile Thr His Leu Lys Ser Leu Gln Lys Val Val Phe Arg Cys Ser Lys

1010 1015 1020

Trp Tyr Lys Ser Asp Asn Pro Gly Ile Lys Ala Ala Ile Asp Val Val

1025 1030 1035 1040

Lys Lys Glu Ala Arg Gln His Pro Asn Arg Pro Ile Ser Leu Leu Ile

1045 1050 1055

Thr Glu Gly Asp Lys Glu Val Pro Asn Ile Glu Ala His Gly Ser Ser

1060 1065 1070

Glu Asn Ile Val Val Val His Ala Ala Pro Asp Asp Ala Ile Ser Cys

1075 1080 1085

Ser Ser Cys Gly Arg Thr Ser Thr Ser Ile Gln Glu Gly Thr Val Arg

1090 1095 1100

Asp Arg Ile Pro Ala Met Asp Leu Phe Trp Pro Glu Phe Asn Ser Tyr

1105 1110 1115 1120

Glu Lys Ala Lys Arg Asn

1125

<210> 30

<211> 2920

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

atgatggatg tgtcagagct cgtggagatg gacaaacaac atgagaaaga gctcatcaaa 60

ttgctggaac aaggtgcgga cacaagcata tatgcttccc ggtggcgcat cgcaacacca 120

tggcatgata aggagcaaag tattgtggtc aaggtgccgg aaaaaagaag ggacgacatg 180

tacgatgatg cattgcactg ggcggtgagt tcgttgcatg gagtgccctc gggtggtgcg 240

tctggagatt gtagtaggtt gcagttggat ggtgaaggcg cgaacatccg caagctcttg 300

tccaccctcc ggaataaggt gggccgcgcc cagttggtgc aggtcgagga taagagaaaa 360

agggtagagg aggcgacgaa gccttgtgaa tttcacgagg tcaaaacaat atgcatcctt 420

ggattgcctg gcgcaggcaa aacaactctt gcaaaactgt tgtactccca tcactcaacg 480

acagagcagc aattccaaca ccgggctttc gtgtcactct ctccgggtgc caatctcacc 540

gacactctta ctgatatttt attgcaagta ggagcatata atgatgatgc aacaccatat 600

tgtgggaccg gaacaccgca ccaacagtat ctcattgaca acatatcagc ttatctcatt 660

ggcaaaaagt atcttattat aattgatgac gtttggcgct gggaagagtg ggaagtcatc 720

agaaagtcca ttccaaagaa tgatctgggt agcagaataa tcatgactac tcgtcttaat 780

tcaatagctg agaagtgtcg caatgatgac atggatgcgt ttgtttatga aactgaggct 840

ctggattatg tggatgcttg gttgttgtgt gacaaggtag caagaaagtc tgtcacatgt 900

atgaacatta atccatgcta tgatatcgtg gacatgtgct atggtatgcc gttagcacta 960

attcgtgtgt cgtcagcatt ggcagaagag atacaagctt tagacagtga tgaacggcaa 1020

atatggaggg ctctgagacg ggtagaggat ggtattttgg acatcccatc cttgaagcca 1080

ttggcagaga gtttatgcct tggttacgac catcttcctc tctatctgag gactttgttg 1140

ttatgttgta gtgtgtacca ttggcttgat ggtgggattg ttcaaagggg ccgtttggtc 1200

acaaggtgga ttgctgaagg atttgtttca gaagagaaag cagcagaagg ttactttgat 1260

gagcttgtcg gcagaggatg gatgaagcat agagagttga acgagtatga gatccaccct 1320

atgatgctgg ccatccttag atacaagtcg aaggagtaca attttgtaac ttgtttgggt 1380

acgggatctg atacttgtac tagtgcatct ctatcctact cctctccaac aatggcgatt 1440

cgccggcttt gtcttcaaag ggggtaccca atgaaatgct tctcaagtat ggatgtgtca 1500

cacactcgca gccttgtcat ccttggcgac gtgataggag tccccttgga tatgtttaaa 1560

agattgcgag tgttggacct tgaagacaat ctcgatatag atgactctca cctgaagaag 1620

atatgtgagc agctagagag cctcaggctg ctcaagtacc tgggtatcaa gggtacacgg 1680

atcactaagc tcccacagga gatacagaag ctgaagcatc tggagatttt gtacgtgagg 1740

agcacaggca tcaaagagct cccacgggag atcggggaat tgaaacaact gcggactctg 1800

gacatgagga acacgcggat cagcgagctc ccgtcgcaga tcggggagct caaacatctg 1860

cggactctgg acgtgagtaa caacatgtgg aatatcagcg agctgccgtc gcaaatcggg 1920

gagctgaagc atctacaaac tctggatgtg aggaatacgt cggtgagaga gctgccatcg 1980

caaatcgggg agctgaagca tctgcggact ctggatgtga ggaacacggg ggtgagagag 2040

ctgccatggc aagctggcca gatctcggga tcgctgcacg tgcatacaga tgacagtgac 2100

gagggcatgc ggctgccaga aggcgtatgc gaagatctga tcaagggtat tcccaaggct 2160

gagctcgcaa agtgcagtga ggtcctatcc atcaatattg tcgatcgttt aggatctccc 2220

cctattggca tattcaaggt tattggcttg cacaagagta tcccgaagct gatcaaagat 2280

catttcaatg ttctttcttc cctagacatc aggcggtaca acaagctaga ggaggatgac 2340

catgagtttc tagccaacaa tatgcctaac ctccagatgc ttgtactgag gttcgaggcc 2400

ccacaaagag agcccatcaa cattaaccgc acaggcttcc agatgatgga gagattcctt 2460

gtggagagcc gggtgccacg gataaccttc caggaaggag ccatgcccaa gctcaagcat 2520

ctcgagttca agttctacgc tggcccacca agcaaagatc ccataggaat cacccacctc 2580

aagagcctcc aaaaggtggt ctttcgctgc tccaaatggt acaagagcga caaccctggc 2640

atcaaggctg ccattgacgt cgtgaagaaa gaagcaaggc agcatcccaa ccggccgatc 2700

agccttctca tcactgaggg cgataaggag gtaccaaata ttgaggcaca cgggagcagt 2760

gaaaacattg tcgttgtcca cgctgctcct gacgacgcca tcagttgctc tagctgcggc 2820

cgaaccagca ctagtatcca agagggaaca gtccgagatc gaataccagc tatggatttg 2880

ttctggccgg agtttaacag ctatgaaaaa gcaaaaagaa 2920

<210> 31

<211> 974

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

Met Met Asp Val Ser Glu Leu Val Glu Met Asp Lys Gln His Glu Lys

1 5 10 15

Glu Leu Ile Lys Leu Leu Glu Gln Gly Ala Asp Thr Ser Ile Tyr Ala

20 25 30

Ser Arg Trp Arg Ile Ala Thr Pro Trp His Asp Lys Glu Gln Ser Ile

35 40 45

Val Val Lys Val Pro Glu Lys Arg Arg Asp Asp Met Tyr Asp Asp Ala

50 55 60

Leu His Trp Ala Val Ser Ser Leu His Gly Val Pro Ser Gly Gly Ala

65 70 75 80

Ser Gly Asp Cys Ser Arg Leu Gln Leu Asp Gly Glu Gly Ala Asn Ile

85 90 95

Arg Lys Leu Leu Ser Thr Leu Arg Asn Lys Val Gly Arg Ala Gln Leu

100 105 110

Val Gln Val Glu Asp Lys Arg Lys Arg Val Glu Glu Ala Thr Lys Pro

115 120 125

Cys Glu Phe His Glu Val Lys Thr Ile Cys Ile Leu Gly Leu Pro Gly

130 135 140

Ala Gly Lys Thr Thr Leu Ala Lys Leu Leu Tyr Ser His His Ser Thr

145 150 155 160

Thr Glu Gln Gln Phe Gln His Arg Ala Phe Val Ser Leu Ser Pro Gly

165 170 175

Ala Asn Leu Thr Asp Thr Leu Thr Asp Ile Leu Leu Gln Val Gly Ala

180 185 190

Tyr Asn Asp Asp Ala Thr Pro Tyr Cys Gly Thr Gly Thr Pro His Gln

195 200 205

Gln Tyr Leu Ile Asp Asn Ile Ser Ala Tyr Leu Ile Gly Lys Lys Tyr

210 215 220

Leu Ile Ile Ile Asp Asp Val Trp Arg Trp Glu Glu Trp Glu Val Ile

225 230 235 240

Arg Lys Ser Ile Pro Lys Asn Asp Leu Gly Ser Arg Ile Ile Met Thr

245 250 255

Thr Arg Leu Asn Ser Ile Ala Glu Lys Cys Arg Asn Asp Asp Met Asp

260 265 270

Ala Phe Val Tyr Glu Thr Glu Ala Leu Asp Tyr Val Asp Ala Trp Leu

275 280 285

Leu Cys Asp Lys Val Ala Arg Lys Ser Val Thr Cys Met Asn Ile Asn

290 295 300

Pro Cys Tyr Asp Ile Val Asp Met Cys Tyr Gly Met Pro Leu Ala Leu

305 310 315 320

Ile Arg Val Ser Ser Ala Leu Ala Glu Glu Ile Gln Ala Leu Asp Ser

325 330 335

Asp Glu Arg Gln Ile Trp Arg Ala Leu Arg Arg Val Glu Asp Gly Ile

340 345 350

Leu Asp Ile Pro Ser Leu Lys Pro Leu Ala Glu Ser Leu Cys Leu Gly

355 360 365

Tyr Asp His Leu Pro Leu Tyr Leu Arg Thr Leu Leu Leu Cys Cys Ser

370 375 380

Val Tyr His Trp Leu Asp Gly Gly Ile Val Gln Arg Gly Arg Leu Val

385 390 395 400

Thr Arg Trp Ile Ala Glu Gly Phe Val Ser Glu Glu Lys Ala Ala Glu

405 410 415

Gly Tyr Phe Asp Glu Leu Val Gly Arg Gly Trp Met Lys His Arg Glu

420 425 430

Leu Asn Glu Tyr Glu Ile His Pro Met Met Leu Ala Ile Leu Arg Tyr

435 440 445

Lys Ser Lys Glu Tyr Asn Phe Val Thr Cys Leu Gly Thr Gly Ser Asp

450 455 460

Thr Cys Thr Ser Ala Ser Leu Ser Tyr Ser Ser Pro Thr Met Ala Ile

465 470 475 480

Arg Arg Leu Cys Leu Gln Arg Gly Tyr Pro Met Lys Cys Phe Ser Ser

485 490 495

Met Asp Val Ser His Thr Arg Ser Leu Val Ile Leu Gly Asp Val Ile

500 505 510

Gly Val Pro Leu Asp Met Phe Lys Arg Leu Arg Val Leu Asp Leu Glu

515 520 525

Asp Asn Leu Asp Ile Asp Asp Ser His Leu Lys Lys Ile Cys Glu Gln

530 535 540

Leu Glu Ser Leu Arg Leu Leu Lys Tyr Leu Gly Ile Lys Gly Thr Arg

545 550 555 560

Ile Thr Lys Leu Pro Gln Glu Ile Gln Lys Leu Lys His Leu Glu Ile

565 570 575

Leu Tyr Val Arg Ser Thr Gly Ile Lys Glu Leu Pro Arg Glu Ile Gly

580 585 590

Glu Leu Lys Gln Leu Arg Thr Leu Asp Met Arg Asn Thr Arg Ile Ser

595 600 605

Glu Leu Pro Ser Gln Ile Gly Glu Leu Lys His Leu Arg Thr Leu Asp

610 615 620

Val Ser Asn Asn Met Trp Asn Ile Ser Glu Leu Pro Ser Gln Ile Gly

625 630 635 640

Glu Leu Lys His Leu Gln Thr Leu Asp Val Arg Asn Thr Ser Val Arg

645 650 655

Glu Leu Pro Ser Gln Ile Gly Glu Leu Lys His Leu Arg Thr Leu Asp

660 665 670

Val Arg Asn Thr Gly Val Arg Glu Leu Pro Trp Gln Ala Gly Gln Ile

675 680 685

Ser Gly Ser Leu His Val His Thr Asp Asp Ser Asp Glu Gly Met Arg

690 695 700

Leu Pro Glu Gly Val Cys Glu Asp Leu Ile Lys Gly Ile Pro Lys Ala

705 710 715 720

Glu Leu Ala Lys Cys Ser Glu Val Leu Ser Ile Asn Ile Val Asp Arg

725 730 735

Leu Gly Ser Pro Pro Ile Gly Ile Phe Lys Val Ile Gly Leu His Lys

740 745 750

Ser Ile Pro Lys Leu Ile Lys Asp His Phe Asn Val Leu Ser Ser Leu

755 760 765

Asp Ile Arg Arg Tyr Asn Lys Leu Glu Glu Asp Asp His Glu Phe Leu

770 775 780

Ala Asn Asn Met Pro Asn Leu Gln Met Leu Val Leu Arg Phe Glu Ala

785 790 795 800

Pro Gln Arg Glu Pro Ile Asn Ile Asn Arg Thr Gly Phe Gln Met Met

805 810 815

Glu Arg Phe Leu Val Glu Ser Arg Val Pro Arg Ile Thr Phe Gln Glu

820 825 830

Gly Ala Met Pro Lys Leu Lys His Leu Glu Phe Lys Phe Tyr Ala Gly

835 840 845

Pro Pro Ser Lys Asp Pro Ile Gly Ile Thr His Leu Lys Ser Leu Gln

850 855 860

Lys Val Val Phe Arg Cys Ser Lys Trp Tyr Lys Ser Asp Asn Pro Gly

865 870 875 880

Ile Lys Ala Ala Ile Asp Val Val Lys Lys Glu Ala Arg Gln His Pro

885 890 895

Asn Arg Pro Ile Ser Leu Leu Ile Thr Glu Gly Asp Lys Glu Val Pro

900 905 910

Asn Ile Glu Ala His Gly Ser Ser Glu Asn Ile Val Val Val His Ala

915 920 925

Ala Pro Asp Asp Ala Ile Ser Cys Ser Ser Cys Gly Arg Thr Ser Thr

930 935 940

Ser Ile Gln Glu Gly Thr Val Arg Asp Arg Ile Pro Ala Met Asp Leu

945 950 955 960

Phe Trp Pro Glu Phe Asn Ser Tyr Glu Lys Ala Lys Arg Asn

965 970

<210> 32

<211> 3378

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

atggccgtat acagcgtcgc cacgggggcc ttggctcccg tcctatcgaa gctctccgct 60

ttgctgggcg acgagcactt ggatcttgcg gagaggaccc ggagcgacgc catgttcatc 120

aggtcccagc tggaggccgt gcactctctc ctcctcccga ggattagttg gggaatgacg 180

ggggaggaag tcgatgcttt gtgcaaggat gagttgatgg cggaggtgcg tgagctgtcc 240

tacgacatgg acgacgccat cgacgaattc ttcttagagg agcccatggc gggcggcgac 300

ggtggccctt tcgatgagct caagacaaga gttgaggatg tctccaagcg gttctccgac 360

agccggcggt ggaggccacc ggtggagcaa catcaaccat ccctaaccgc cgcaaccgta 420

gactgtccac ctcctcacgc tcgcttcgtc cacaacatga tggatgtgtc agagctcgtg 480

gagatggaca aacaacatga gaaagagctc atcaaattgc tggaacaagg tgcggacaca 540

agcatatatg cttcccggtg gcgcatcgca acaccatggc atgataagga gcaaagtact 600

gtggtcaagg tgccggaaag agagtggggc ttcccggaca atcggaacag tccatttata 660

tgggcgagtg attcgtttga acgattgcgt tcgggaagtt tgtgtggaga tacgttgcgg 720

ttggatggtg aaggcgcgaa catccgcaag ctcttgtcca ccctccggaa taaggtgggc 780

cgcgcccagt tggtgcaggt cgaggataag agaaaaaggg tagaggaggc gacgaagcct 840

tgtgaatttc acgaggtcaa aacaatatgc atccttggat tgcctggcgc aggcaaaaca 900

actcttgcaa aactgttgta ctcccatcac tcaacgacag agcagcaatt ccaacaccgg 960

gctttcgtgt cactctctcc gggtgccaat ctcaccgaca ctcttactga tattttattg 1020

caagtaggag catataatga tgatgcaaca ccatattgtg ggaccggaac accgcaccaa 1080

cagtatctca ttgacaatat atcagcttat ctcattggca aaaagtatct tattataatt 1140

gatgacgttt ggcactggga agagtgggaa gtcatcagaa agtccattcc aaagaatgat 1200

ctgggtagca gaataatcat gactactcgt cttaattcaa tagctgagaa gtgtcgcaat 1260

gatgacatgg atgcgtttgt ttatgaaact gaggctctgg attatgtgga tgcttggttg 1320

ttgtgtgaca aggtagcaag aaagtctgtc acatgtatga acattaatcc atgctatgat 1380

atcgtggaca tgtgctatgg tatgccgtta gcactaattc gtgtgtcgtc agcattggca 1440

gaagagatac aagctttaga cagtgatgaa cggcaaatat ggagggctct gagacgggta 1500

gaggatggta ttttggacat cccatccttg aagccattgg cagagagttt atgccttggt 1560

tacgaccatc ttcctctcta tctgaggact ttgttgttat gttgtagtgt gtaccattgg 1620

cttgatggtg ggattgttca aaggggccgt ttggtcacaa ggtggattgc tgaaggattt 1680

gtttcagaag agaaagcagc agaaggttac tttgatgagc ttgtcggcag aggatggatg 1740

aagcatagag ggttgaacga gtatgagatc caccctatga tgctggccat ccttagatac 1800

aaatcgaagg agtacaattt tgtaacttgt ttgggtacgg gatctgatac ttgtactagt 1860

gcatctctat cctactcctc tccaacaatg gcgattcgcc ggctttgtct tcaaaggggg 1920

tacccaatga aatgcttctc aagtatggat gtgtcacaca ctcgcagcct tgtcatcctt 1980

ggcgacgtga taggagtccc cttggatatg tttaaaagat tgcgagtgtt ggaccttgaa 2040

gataatatcg gtatagagga ctcccacctg aagaagatat gtgagcagct agagagcctc 2100

aggctgctca agtacctagg tctcaagggt acgcgaatca ctaagctccc acaggagata 2160

cagaagctga agcaactgga gattttgtac gtgaggagca caggcatcga agagctccca 2220

tgggagatcg gggaattgaa acaactgcgg actctggacg tgaggaacac gcggatcagc 2280

gagctcccgt cgcagatcgg ggagctcaaa catctgcgga ctctggacgt gagtaacatg 2340

tggaatatca gcgagctgcc gtcgcaaatc ggggagctga agcatctaca aactctggat 2400

gtgaggaaca cgtcagtgag agagctgcca tcgcaaatcg gggagctgaa gcatctgcgg 2460

actctggatg tgaggaacac gggggtgaga gagctgccat ggcaagctgg ccagatctcg 2520

ggatcgctgc acgtgcatac agatgacagt gacgagggca tgcggctgcc agaaggcgta 2580

tgcgaagatc tgatcaaggg tattcccaag gctgagctcg caaagtgcag tgaggtccta 2640

tccatcaata ttgtcgatcg tttaggatct ccccctattg gcatattcaa ggttattggc 2700

ttgcacaaga gtatcccgaa gctgatcaaa gatcatttca atgttctttc ttccctagac 2760

atcaggcggt acaacaagct agaggaggat gaccatgagt ttctagccaa caatatgcct 2820

aacctccaga tgcttgtact gaggttcgag gccccacaaa gagagcccat catcattaac 2880

cgcacaggct tccagatgct ggagagattc cttgtggaga gccgggtgcc acggataacc 2940

ttccaggaag gagccatgcc caagctcaag catctcgagt ttaagttcta cgctggccca 3000

ccaagcaaag atcccatagg aatcacccac ctcaagagcc tccaaaaggt ggtctttcgc 3060

tgctccaaat ggtacaagag cgacaaccct ggcatcaagg ctgccattga cgtcgtgaag 3120

aaagaagcaa ggcagcatcc caaccggccg atcagccttc tcatcactga gggcgataag 3180

gaggtaccga atattgaggc acacgggagc agtgaaaaca ttgtcgttgt ccacgctgct 3240

cctgacgacg ccatcagttg ctctagctgc ggccgaacca gcactagtat ccaagaggga 3300

acagtccgag atcgaatacc agctatggat ttgttctggc cggagtttaa cagctatgaa 3360

aaagcaaaaa gaaactag 3378

<210> 33

<211> 1125

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

Met Ala Val Tyr Ser Val Ala Thr Gly Ala Leu Ala Pro Val Leu Ser

1 5 10 15

Lys Leu Ser Ala Leu Leu Gly Asp Glu His Leu Asp Leu Ala Glu Arg

20 25 30

Thr Arg Ser Asp Ala Met Phe Ile Arg Ser Gln Leu Glu Ala Val His

35 40 45

Ser Leu Leu Leu Pro Arg Ile Ser Trp Gly Met Thr Gly Glu Glu Val

50 55 60

Asp Ala Leu Cys Lys Asp Glu Leu Met Ala Glu Val Arg Glu Leu Ser

65 70 75 80

Tyr Asp Met Asp Asp Ala Ile Asp Glu Phe Phe Leu Glu Glu Pro Met

85 90 95

Ala Gly Gly Asp Gly Gly Pro Phe Asp Glu Leu Lys Thr Arg Val Glu

100 105 110

Asp Val Ser Lys Arg Phe Ser Asp Ser Arg Arg Trp Arg Pro Pro Val

115 120 125

Glu Gln His Gln Pro Ser Leu Thr Ala Ala Thr Val Asp Cys Pro Pro

130 135 140

Pro His Ala Arg Phe Val His Asn Met Met Asp Val Ser Glu Leu Val

145 150 155 160

Glu Met Asp Lys Gln His Glu Lys Glu Leu Ile Lys Leu Leu Glu Gln

165 170 175

Gly Ala Asp Thr Ser Ile Tyr Ala Ser Arg Trp Arg Ile Ala Thr Pro

180 185 190

Trp His Asp Lys Glu Gln Ser Thr Val Val Lys Val Pro Glu Arg Glu

195 200 205

Trp Gly Phe Pro Asp Asn Arg Asn Ser Pro Phe Ile Trp Ala Ser Asp

210 215 220

Ser Phe Glu Arg Leu Arg Ser Gly Ser Leu Cys Gly Asp Thr Leu Arg

225 230 235 240

Leu Asp Gly Glu Gly Ala Asn Ile Arg Lys Leu Leu Ser Thr Leu Arg

245 250 255

Asn Lys Val Gly Arg Ala Gln Leu Val Gln Val Glu Asp Lys Arg Lys

260 265 270

Arg Val Glu Glu Ala Thr Lys Pro Cys Glu Phe His Glu Val Lys Thr

275 280 285

Ile Cys Ile Leu Gly Leu Pro Gly Ala Gly Lys Thr Thr Leu Ala Lys

290 295 300

Leu Leu Tyr Ser His His Ser Thr Thr Glu Gln Gln Phe Gln His Arg

305 310 315 320

Ala Phe Val Ser Leu Ser Pro Gly Ala Asn Leu Thr Asp Thr Leu Thr

325 330 335

Asp Ile Leu Leu Gln Val Gly Ala Tyr Asn Asp Asp Ala Thr Pro Tyr

340 345 350

Cys Gly Thr Gly Thr Pro His Gln Gln Tyr Leu Ile Asp Asn Ile Ser

355 360 365

Ala Tyr Leu Ile Gly Lys Lys Tyr Leu Ile Ile Ile Asp Asp Val Trp

370 375 380

His Trp Glu Glu Trp Glu Val Ile Arg Lys Ser Ile Pro Lys Asn Asp

385 390 395 400

Leu Gly Ser Arg Ile Ile Met Thr Thr Arg Leu Asn Ser Ile Ala Glu

405 410 415

Lys Cys Arg Asn Asp Asp Met Asp Ala Phe Val Tyr Glu Thr Glu Ala

420 425 430

Leu Asp Tyr Val Asp Ala Trp Leu Leu Cys Asp Lys Val Ala Arg Lys

435 440 445

Ser Val Thr Cys Met Asn Ile Asn Pro Cys Tyr Asp Ile Val Asp Met

450 455 460

Cys Tyr Gly Met Pro Leu Ala Leu Ile Arg Val Ser Ser Ala Leu Ala

465 470 475 480

Glu Glu Ile Gln Ala Leu Asp Ser Asp Glu Arg Gln Ile Trp Arg Ala

485 490 495

Leu Arg Arg Val Glu Asp Gly Ile Leu Asp Ile Pro Ser Leu Lys Pro

500 505 510

Leu Ala Glu Ser Leu Cys Leu Gly Tyr Asp His Leu Pro Leu Tyr Leu

515 520 525

Arg Thr Leu Leu Leu Cys Cys Ser Val Tyr His Trp Leu Asp Gly Gly

530 535 540

Ile Val Gln Arg Gly Arg Leu Val Thr Arg Trp Ile Ala Glu Gly Phe

545 550 555 560

Val Ser Glu Glu Lys Ala Ala Glu Gly Tyr Phe Asp Glu Leu Val Gly

565 570 575

Arg Gly Trp Met Lys His Arg Gly Leu Asn Glu Tyr Glu Ile His Pro

580 585 590

Met Met Leu Ala Ile Leu Arg Tyr Lys Ser Lys Glu Tyr Asn Phe Val

595 600 605

Thr Cys Leu Gly Thr Gly Ser Asp Thr Cys Thr Ser Ala Ser Leu Ser

610 615 620

Tyr Ser Ser Pro Thr Met Ala Ile Arg Arg Leu Cys Leu Gln Arg Gly

625 630 635 640

Tyr Pro Met Lys Cys Phe Ser Ser Met Asp Val Ser His Thr Arg Ser

645 650 655

Leu Val Ile Leu Gly Asp Val Ile Gly Val Pro Leu Asp Met Phe Lys

660 665 670

Arg Leu Arg Val Leu Asp Leu Glu Asp Asn Ile Gly Ile Glu Asp Ser

675 680 685

His Leu Lys Lys Ile Cys Glu Gln Leu Glu Ser Leu Arg Leu Leu Lys

690 695 700

Tyr Leu Gly Leu Lys Gly Thr Arg Ile Thr Lys Leu Pro Gln Glu Ile

705 710 715 720

Gln Lys Leu Lys Gln Leu Glu Ile Leu Tyr Val Arg Ser Thr Gly Ile

725 730 735

Glu Glu Leu Pro Trp Glu Ile Gly Glu Leu Lys Gln Leu Arg Thr Leu

740 745 750

Asp Val Arg Asn Thr Arg Ile Ser Glu Leu Pro Ser Gln Ile Gly Glu

755 760 765

Leu Lys His Leu Arg Thr Leu Asp Val Ser Asn Met Trp Asn Ile Ser

770 775 780

Glu Leu Pro Ser Gln Ile Gly Glu Leu Lys His Leu Gln Thr Leu Asp

785 790 795 800

Val Arg Asn Thr Ser Val Arg Glu Leu Pro Ser Gln Ile Gly Glu Leu

805 810 815

Lys His Leu Arg Thr Leu Asp Val Arg Asn Thr Gly Val Arg Glu Leu

820 825 830

Pro Trp Gln Ala Gly Gln Ile Ser Gly Ser Leu His Val His Thr Asp

835 840 845

Asp Ser Asp Glu Gly Met Arg Leu Pro Glu Gly Val Cys Glu Asp Leu

850 855 860

Ile Lys Gly Ile Pro Lys Ala Glu Leu Ala Lys Cys Ser Glu Val Leu

865 870 875 880

Ser Ile Asn Ile Val Asp Arg Leu Gly Ser Pro Pro Ile Gly Ile Phe

885 890 895

Lys Val Ile Gly Leu His Lys Ser Ile Pro Lys Leu Ile Lys Asp His

900 905 910

Phe Asn Val Leu Ser Ser Leu Asp Ile Arg Arg Tyr Asn Lys Leu Glu

915 920 925

Glu Asp Asp His Glu Phe Leu Ala Asn Asn Met Pro Asn Leu Gln Met

930 935 940

Leu Val Leu Arg Phe Glu Ala Pro Gln Arg Glu Pro Ile Ile Ile Asn

945 950 955 960

Arg Thr Gly Phe Gln Met Leu Glu Arg Phe Leu Val Glu Ser Arg Val

965 970 975

Pro Arg Ile Thr Phe Gln Glu Gly Ala Met Pro Lys Leu Lys His Leu

980 985 990

Glu Phe Lys Phe Tyr Ala Gly Pro Pro Ser Lys Asp Pro Ile Gly Ile

995 1000 1005

Thr His Leu Lys Ser Leu Gln Lys Val Val Phe Arg Cys Ser Lys Trp

1010 1015 1020

Tyr Lys Ser Asp Asn Pro Gly Ile Lys Ala Ala Ile Asp Val Val Lys

1025 1030 1035 1040

Lys Glu Ala Arg Gln His Pro Asn Arg Pro Ile Ser Leu Leu Ile Thr

1045 1050 1055

Glu Gly Asp Lys Glu Val Pro Asn Ile Glu Ala His Gly Ser Ser Glu

1060 1065 1070

Asn Ile Val Val Val His Ala Ala Pro Asp Asp Ala Ile Ser Cys Ser

1075 1080 1085

Ser Cys Gly Arg Thr Ser Thr Ser Ile Gln Glu Gly Thr Val Arg Asp

1090 1095 1100

Arg Ile Pro Ala Met Asp Leu Phe Trp Pro Glu Phe Asn Ser Tyr Glu

1105 1110 1115 1120

Lys Ala Lys Arg Asn

1125

<210> 34

<211> 802

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

Met Thr Gly Glu Glu Val Asp Ala Leu Cys Lys Asp Glu Leu Met Ala

1 5 10 15

Glu Val Arg Glu Leu Ser Tyr Asp Met Asp Asp Ala Ile Asp Glu Phe

20 25 30

Phe Leu Glu Glu Pro Met Ala Gly Gly Asp Gly Gly Pro Phe Asp Glu

35 40 45

Leu Lys Thr Arg Val Glu Asp Val Ser Lys Arg Phe Ser Asp Ser Arg

50 55 60

Arg Trp Arg Pro Gln Val Glu Gln His Gln Pro Ser Leu Thr Ala Ala

65 70 75 80

Thr Val Asp Cys Pro Pro Pro His Ala Arg Phe Val His Asn Met Met

85 90 95

Asp Val Ser Glu Leu Val Glu Met Asp Lys Leu His Glu Thr Glu Leu

100 105 110

Ile Lys Leu Leu Glu Gln Gly Ala Asp Thr Ser Ile Tyr Ala Ser Arg

115 120 125

Trp Arg Ile Ala Thr Pro Trp His Asp Lys Glu Gln Ser Ile Val Val

130 135 140

Lys Val Pro Glu Lys Arg Arg Asp Asp Met Asn Asp Asp Ala Leu His

145 150 155 160

Trp Ala Val Ser Ser Leu His Gly Val Pro Ser Gly Gly Thr Ser Gly

165 170 175

Asp Cys Ser Arg Leu Gln Leu Asp Gly Glu Gly Ala Asn Ile Arg Lys

180 185 190

Leu Leu Ser Thr Leu Arg Asn Lys Val Gly His Ala Gln Leu Val Gln

195 200 205

Val Glu Asp Lys Arg Lys Arg Val Glu Glu Ala Thr Lys Pro Cys Glu

210 215 220

Phe His Glu Val Lys Thr Ile Cys Ile Leu Gly Leu Pro Gly Ala Gly

225 230 235 240

Lys Thr Thr Leu Ala Lys Leu Leu Tyr Ser His His Ser Thr Thr Glu

245 250 255

Gln Gln Phe Gln His Arg Ala Phe Val Ser Leu Ser Pro Gly Ala Asn

260 265 270

Leu Thr Asp Thr Leu Thr Asp Ile Leu Leu Gln Val Gly Ala Tyr Asn

275 280 285

Asp Asp Ala Thr Pro Tyr Cys Gly Thr Gly Thr Pro His Gln Gln Tyr

290 295 300

Leu Ile Asp Asn Ile Ser Ala Tyr Leu Ile Gly Lys Lys Tyr Leu Ile

305 310 315 320

Ile Ile Asp Asp Val Trp Arg Trp Glu Glu Trp Glu Val Ile Arg Lys

325 330 335

Ser Ile Pro Lys Asn Asp Leu Gly Ser Arg Ile Ile Met Thr Thr Arg

340 345 350

Leu Asn Ser Ile Ala Glu Lys Cys Arg Asn Asp Asp Met Asp Ala Phe

355 360 365

Val Tyr Glu Thr Glu Ala Leu Asp Tyr Val Asp Ala Trp Leu Leu Cys

370 375 380

Asp Lys Val Ala Arg Lys Ser Val Thr Cys Met Asn Ile Asn Pro Cys

385 390 395 400

Tyr Asp Ile Val Asp Val Cys Tyr Gly Met Pro Leu Ala Leu Ile Arg

405 410 415

Val Ser Ser Ala Leu Ala Glu Glu Ile Gln Ala Leu Asp Ser Asp Glu

420 425 430

Trp Gln Ile Trp Arg Ala Leu Arg Arg Val Glu Asp Gly Ile Leu Asp

435 440 445

Ile Pro Ser Leu Lys Pro Leu Ala Glu Ser Leu Cys Leu Gly Tyr Asp

450 455 460

His Leu Pro Leu Tyr Leu Arg Thr Leu Leu Leu Cys Cys Ser Val Tyr

465 470 475 480

His Trp Leu Asp Gly Gly Ile Val Gln Arg Gly Arg Leu Val Thr Arg

485 490 495

Trp Ile Ala Glu Gly Phe Val Ser Glu Glu Lys Ala Ala Glu Gly Tyr

500 505 510

Phe Asp Glu Leu Val Asp Arg Gly Trp Ile Lys His Arg Gly Trp Asn

515 520 525

Glu Tyr Glu Ile Tyr Pro Met Met Leu Ala Ile Leu Arg Tyr Lys Ser

530 535 540

Lys Glu Tyr Asn Phe Val Thr Cys Leu Gly Thr Gly Phe Asp Thr Cys

545 550 555 560

Thr Ser Ala Ser Leu Ser Tyr Ser Ser Pro Thr Met Ala Ile Arg Arg

565 570 575

Leu Cys Leu Gln Arg Gly Tyr Pro Met Lys Cys Phe Ser Ser Met Asp

580 585 590

Val Ser His Thr Arg Ser Leu Val Ile Leu Gly Asp Val Ile Gly Val

595 600 605

Pro Leu Asp Met Phe Lys Arg Leu Arg Val Leu Asp Leu Glu Asp Asn

610 615 620

Ile Gly Ile Glu Asp Ser His Leu Lys Lys Ile Cys Glu Gln Leu Glu

625 630 635 640

Ser Leu Arg Leu Leu Lys Tyr Leu Gly Leu Lys Gly Thr Arg Ile Thr

645 650 655

Lys Leu Pro Gln Glu Ile Gln Lys Leu Lys His Leu Glu Ile Leu Tyr

660 665 670

Val Arg Ser Thr Gly Ile Lys Glu Leu Pro Arg Glu Ile Gly Glu Val

675 680 685

Lys Gln Leu Arg Thr Leu Asp Val Arg Asn Thr Arg Ile Ser Glu Leu

690 695 700

Pro Ser Gln Ile Gly Glu Leu Lys His Leu Arg Thr Leu Asp Val Arg

705 710 715 720

Asn Thr Arg Ile Ser Glu Leu Leu Ser Gln Ile Gly Glu Leu Lys His

725 730 735

Leu Arg Thr Leu Asp Val Arg Asn Thr Arg Ile Ser Glu Leu Pro Ser

740 745 750

Gln Ile Gly Glu Leu Lys His Leu Arg Thr Leu Asp Val Arg Asn Thr

755 760 765

Arg Thr Ser Ile Phe Phe Tyr Ser Arg Arg Arg Ile Lys Lys Tyr Arg

770 775 780

Ser Thr Asp Ile Trp Leu Ser Ala Arg Asp Met His His Thr Cys Ile

785 790 795 800

Trp Tyr

Claims

1.一种高效分离带有野生稻血缘的抗白叶枯病基因的方法，其特征在于，所述方法包括：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述抗白叶枯病基因为Xa47(t)，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示；所述基因Xa47(t)的CDS序列如SEQ ID NO.14所示。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述元江普通野生稻渗入系双亲为元江普通野生稻和栽培稻合系35；所述参考基因组为日本晴基因组；所述目的基因定位和所述PCR扩增的模板为元江普通野生稻渗入系G252。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述引物为214QC-9F/R；所述214QC-9F的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，所述214QC-9R的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述抗病功能分析包括功能互补试验和基因编辑试验分析候选基因的抗病功能。

6.一种高效分离带有野生稻血缘的抗白叶枯病基因家族成员的方法，其特征在于，所述方法包括：

筛选获得含有Xa47(t)基因或其同源基因的元江普通野生稻渗入系材料；根据权利要求2所述Xa47(t)基因序列，获得来自元江普通野生稻和合系35中的Xa47(t)基因，分别命名为Xa47(t)^YP和Xa47(t)^HX；

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述筛选的步骤包括：

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，根据权利要求2所述的Xa47(t)基因序列，利用blast程序从元江普通野生稻和合系35基因组R13I14和Hxjy-14区段中进行检索，即获得来自元江普通野生稻和合系35中的Xa47(t)基因。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述引物包括214QC-2F/R、48QC-9F/R和48QC-11F/R，所述214QC-2F的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示，所述214QC-2R的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示；所述48QC-9F的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示，所述48QC-9R的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示；所述48QC-11F的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示，所述48QC-11R的核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示。

10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述Xa47(t)^G252、Xa47(t)^YP、Xa47(t)^HX以及Xa47(t)^L234基因即以其供体材料进行命名的Xa47(t)基因；所述Xa47(t)^G252为权利要求2所述的Xa47(t)基因；所述Xa47(t)^YP基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示；所述Xa47(t)^YP基因的CDS序列如SEQ ID NO.30所示；所述Xa47(t)^HX基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示；所述Xa47(t)^HX基因的CDS序列如SEQ ID NO.32所示；所述Xa47(t)^L234基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.27所示；所述Xa47(t)^L234基因的CDS序列如SEQ ID NO.28所示。