CN114395032A - 一种从血浆中提取人抗凝血酶ⅲ的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从血浆中提取人抗凝血酶Ⅲ的方法，属于生物制药领域。本发明从去冷沉淀人血浆中提取人抗凝血酶Ⅲ的方法，包括新鲜冰冻人血浆去除冷沉淀；DEAE SephadexA‑50凝胶吸附；聚乙二醇(PEG‑4000)提纯处理；亲和层析；巴氏病毒灭活；亲和层析；超滤浓缩；除菌过滤；纳米膜除病毒过滤；分装；冷冻干燥。本发明通过改善人抗凝血酶Ⅲ的提取工艺，制得的人抗凝血酶Ⅲ，稳定性好，产品纯度高，安全可靠，比活可达13IU/mg蛋白质以上，满足市场的需求，也提高了珍贵血浆资源的利用价值。
Description
技术领域
本发明属于生物制药领域，涉及血液制品的提取工艺，特别涉及一种人抗凝血酶Ⅲ的提取方法。
背景技术
人抗凝血酶III(Human Antithrombin III，AT-III)是控制生理性凝血反应过程和起抗凝血作用的重要因子，主要存在于人体血浆系统中，正常人血浆中AT-III含量为180-300mg/L，主要在肝内合成，也可在血管内皮细胞合成。AT-III是一种强效天然抗凝血剂和丝氨酸蛋白酶抑制剂，其能使凝血级联反应中多种酶失活，其主要通过对凝血酶和FXa的抑制来发挥作用，也可通过对FIXa、FXIa、FXIIa和纤溶酶的抑制来发挥作用。AT-III可在没有肝素的条件下单独发挥抗凝血作用，而在有肝素存在的条件下，AT-III能与肝素结合形成复合物，其灭活凝血酶和FXa的速度可提高1000-3500倍。
AT-III分子为单链糖蛋白，由432个氨基酸残基组成，其分子量为58000Da，含3个二硫基，4个寡糖基，寡糖基分别连于肽链第96、135、155、192位的Asn上，其蛋白质结构如图1所示。血浆来源的AT-III分子中约有10％为亚糖基化AT-III(β-AT-III)，其肽链Asn155上缺乏寡糖基。AT-III的等电点pI＝4.8，体内平均半衰期为3天。
作为血浆中抑制凝血的关键物质，AT-III的主要生理功能为参与维持体内正常抗凝血功能，保持纤溶系统与凝血系统的动态平衡，其所发挥的抗凝作用约占体内总抗凝物质作用的 80％左右，是人体内的最主要抗凝血成分，AT-III活性降低，如低于正常的70％时，可显著增加形成血栓的危险。1965年，Egeberg首次报道了因遗传性AT-III缺乏引起的家族性血栓形成体质(ThromboPhi1ia)，初步明确了AT-III的缺乏和血栓形成倾向间的关系。因此，AT-III 制品临床上主要用于治疗AT-III缺乏症，分为遗传性和获得性两种。
人抗凝血酶Ⅲ制剂最初的制备采用氧化铝、磷酸钙等吸附，分子筛过滤、用离子交换层析等手段，不仅费时费力，制品的收获率也很低。1968年，Abildgaard最先提纯的ATⅢ的平均收率只有2％。1974年，Miller-Andersson等用肝素-Sepharose亲和层析从血浆中分离人抗凝血酶Ⅲ，再经DEAE-Sephadex层析和SephadexG-200凝胶过摅，收率约为34％，该法已被视为经典方法；其它方法大同小异，但这些方法用于大规模的工业化制备人抗凝血酶Ⅲ尚受到一定条件的限制。
1975年，Thaler等报道了两步分离法，即先在肝素琼脂上作亲和层析、再用聚乙二醇(PEG) 沉淀，或先用PEG沉淀、后用肝素-琼脂亲和层析、另外加入硫酸铵沉淀步骤以除去PEG和微量污染物，经SDS—PAGE鉴定，制品是均一的，经人ATⅢ末端分析，显示为N2末端氨基酸为组氨酸。该纯化制剂既有进行性抗凝血酶话性，又有肝素辅助因子活性，可从10-20L血浆分离出>lg的抗凝血酶Ⅲ，收率为60％，其比活性是血浆的550倍。1979年，Wicker等首先叙述了工业规模制备临床用途的抗凝血酶Ⅲ浓缩物，其原料为工业生产丢弃的Cohn组分Ⅳ-l或除去冷沉淀和以20％PEG沉淀后的血浆。1985年，Smith等开发出巴斯德法灭活的临床用人抗凝血酶Ⅲ浓缩物，将除去冷沉淀和凝血酶原复合物的血浆，批量吸附于肝素 -Sepharose，以高盐浓度洗脱，在枸橼酸盐存在下，60℃巴斯德法灭活l0h，Sephadex G-25柱脱盐，然后除菌过滤、冻干。用这种方法制备的7批制品的平均产量为269U/kg血浆，成品全部通过了常规动物安生性和热原质试验，并已成功地用于遗传性ATⅢ缺乏患者的治疗。
人抗凝血酶Ⅲ的分离纯化方法上几乎都采用肝素亲和层析方法，因而在人抗凝血酶Ⅲ的分离纯化过程中，肝素亲和层析是关键步骤。目前在国内此类亲和介质主要依靠进口，价格贵，制备方法保密。国内有报道对亲和介质进行了研究。2002年，赵莹歆等以聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球(PGMA)为基质，利用还原氨化方法将肝素键合在其表面上，得到一种以肝素为配基的高效亲和色谱填料，该填料对人抗凝血酶Ⅲ的亲和容量为1.2mg/g，对人抗凝血酶Ⅲ和人血白蛋白的回收率分别为96.9％和94.4％；利用前沿色谱法测定了肝素与抗凝血酶Ⅲ之间的表观解离常数为1.96×10-5mol/L，利用该填料可直接从人血浆中分离出抗凝血酶Ⅲ制剂。
2005年，穆成华等以自制琼脂糖凝胶6FF为基质，肝素为配基，利用还原胺化方法制备了肝素-琼脂糖凝胶6FF介质，考察了肝素偶联反应的影响因素，并对其进行了优化，得到肝素配基的含量为2.7mg/ml，用所制介质从人血浆中分离出抗凝血酶Ⅲ，从血浆开始计算的人抗凝血酶Ⅲ活性回收率为31.76％，与商品Heparin-Sepharose CL-6B的分离效果相当。
在国内也有几家企业对人抗凝血酶Ⅲ的分离纯化进行了深入的研究，在实验室水平上能达到85％以上的纯度，但由于国内开展人抗凝血酶Ⅲ制剂的生产研究比较晚，绝大多数关于人抗凝血酶Ⅲ的研究尚停留在实验室研制阶段，并且至今未见取得新药证书与生产批文的报道，究其原因主要在于未能建立适合于工业化规模的制备工艺因此，如何将实验室研究成果转化适用于工业化生产的工艺成为产业发展的关键所在。
本发明开发一种新的优化工艺提取人抗凝血酶Ⅲ，开发出适合于工业生产规模的人抗凝血酶Ⅲ制剂制备工艺，具有稳定性好，纯度高，病毒灭活效果更好的特点的人抗凝血酶Ⅲ提取工艺。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种人抗凝血酶Ⅲ的提取方法，所制得的人抗凝血酶Ⅲ制剂纯度高，稳定性高，病毒灭活效果好。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种从血浆中提取人抗凝血酶Ⅲ的方法，包括如下步骤：
(1)新鲜冰冻人血浆去除冷沉淀：将新鲜冰冻人血浆融化混合均匀后，经过流式离心机去除冷沉淀，取得离心后的血浆上清液；
(2)DEAE Sephadex A-50凝胶吸附：在步骤(1)所得到的血浆上清液中加入DEAESephadex A-50凝胶，干凝胶的加入量为0.5-1.5g/kg料液，干凝胶预先用70℃以上热注射用水进行溶胀，再用25℃以下冷注射用水进行冷却，最后用平衡缓冲液平衡，适当转速(确保凝胶在溶液中混合分布均匀同时不宜太快)搅拌1.0-2.0小时，过滤得滤液，凝胶经过再生后保存可以重复使用；
(3)聚乙二醇(PEG-4000)提纯处理：将步骤(2)所得的滤液pH调整至6.0-7.0，加入10％-20％(w/v)聚乙二醇(PEG-4000)，离心去除沉淀得上清液，再向所得上清液中加入20％-30％(w/v)聚乙二醇(PEG-4000)，离心并回收沉淀；
(4)亲和层析：肝素亲和柱先用平衡液充分平衡，将步骤(3)所得沉淀用平衡液溶解，然后用0.45μm滤芯过滤后上样，上样后先用平衡液冲40个柱体积，再用洗涤缓冲液冲15个柱体积，最后用洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱液；
(5)巴氏病毒灭活：向步骤(4)所得洗脱液中加入稳定剂，然后调整料液pH至7.0-8.0，将溶液置于60℃环境中处理10小时；
(6)亲和层析：肝素亲和柱先用平衡液充分平衡，将步骤(5)所得料液用0.45μm滤芯过滤后上样，上样后先用平衡液冲40个柱体积，再用洗涤缓冲液冲15个柱体积，最后用洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱液；
(7)超滤浓缩：用10KD超滤膜浓缩步骤(6)所得洗脱液，然后用透析液等体积透析5-6倍，最后浓缩至人抗凝血酶Ⅲ效价约50IU/mL；
(8)除菌过滤：用0.22μm滤芯对制品进行除菌过滤；
(9)纳米膜除病毒过滤：先用0.1μm滤芯预过滤，再用15纳米滤芯进行除病毒过滤；
(10)分装；
(11)冷冻干燥：采取预冷，速冻、退火及一次干燥与二次干燥，最后得到人抗凝血酶Ⅲ冻干粉。
所述步骤(2)中所述的DEAE Sephadex A-50凝胶吸附，采用的是本公司的血浆吸附过滤装置(中国发明专利CN201810248696.8一种用于凝血因子类血液制品生产的血浆吸附过滤装置)。
所述步骤(2)中所述的平衡缓冲液配方为：0.01-0.02M枸橼酸钠，0.15-0.25M氯化钠， pH为7.0-8.0。
所述步骤(4)中所述的亲和层析中平衡液配方为：0.1-0.2M Tris-HCl，0.01-0.02M柠檬酸三钠，0.2-0.3M氯化钠，pH 7.0-8.0，洗涤缓冲液配方为：0.1-0.2M Tris-HCl，0.01-0.02M柠檬酸三钠，0.3-0.4M氯化钠，pH 7.0-8.0，洗脱缓冲液配方为：0.1-0.2MTris-HCl，0.01-0.02M 柠檬酸三钠，1.5-2.5M氯化钠，pH 7.0-8.0。
所述步骤(5)所述的稳定剂配方为：5％-10％柠檬酸钠，1.5-2.5M氯化钠，50-60％(w/v) 山梨醇，pH 7.0-8.0。
所述步骤(7)中所述的透析液配方为：甘氨酸：1-4％(w/w)，pH：7.0-8.0，液温：常温。
本发明的优点：
(1)DEAE Sephadex A-50凝胶吸附，中试规模采用的是本公司的血浆吸附过滤装置(中国发明专利CN201810248696.8一种用于凝血因子类血液制品生产的血浆吸附过滤装置)。可以实现凝胶自动过滤和收集的流水化处理，大大降低工作人员劳动强度，同时整个过滤过程中压差稳定可控，对后续制作的凝血因子成分和凝胶颗粒起到了较好的保护作用，适用于工业生产规模。
(2)整个工艺只涉及到两个层析系统，相比现有的一些工艺三步层析，减少了层析系统及配套设施和场地的配备。
(3)相比较于传统的S/D病毒灭活和离子交换层析的组合，除去了吐温80和磷酸三丁酯的引入和去除残留的风险。通过添加适合的稳定剂，采用病毒灭活效果相对好的巴氏病毒灭活法。
(4)采用15纳米纳滤除病毒，保证更好的病毒过滤效果，安全性更高。
附图说明
图1为人抗凝血酶Ⅲ蛋白质结构
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
(1)新鲜冰冻人血浆去除冷沉淀：取500L新鲜冰冻人血浆融化混合均匀后，经过流式离心机去除冷沉淀，取得离心后的血浆上清液；
(2)DEAE Sephadex A-50凝胶吸附：在步骤(1)所得到的血浆上清液中加入DEAESephadex A-50凝胶，干凝胶的加入量为500g，干凝胶预先用70℃以上热注射用水进行溶胀，再用25℃以下冷注射用水进行冷却，最后用平衡缓冲液平衡，适当转速(确保凝胶在溶液中混合分布均匀同时不宜太快)搅拌1.0小时，过滤得滤液，凝胶经过再生后保存可以重复使用；平衡缓冲液配方为：0.02M枸橼酸钠，0.2M氯化钠，pH为7.0
(3)聚乙二醇(PEG-4000)提纯处理：将步骤(2)所得的滤液pH调整至6.5，加入10％(w/v)聚乙二醇(PEG-4000)，离心去除沉淀得上清液，再向所得上清液中加入20％(w/v) 聚乙二醇(PEG-4000)，离心并回收沉淀；
(4)亲和层析：肝素亲和柱先用平衡液充分平衡，将步骤(3)所得沉淀用平衡液溶解，然后用0.45μm滤芯过滤后上样，上样后先用平衡液冲40个柱体积，再用洗涤缓冲液冲15个柱体积，最后用洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱液；平衡液配方为：0.1M Tris-HCl，0.01M柠檬酸三钠，0.2M氯化钠，pH 7.0，洗涤缓冲液配方为：0.1M Tris-HCl，0.01M柠檬酸三钠， 0.3M氯化钠，pH 7.0，洗脱缓冲液配方为：0.1M Tris-HCl，0.01M柠檬酸三钠，1.5M氯化钠， pH7.0。
(5)巴氏病毒灭活：向步骤(4)所得洗脱液中加入稳定剂，然后调整料液pH至7.0，将溶液置于60℃环境中处理10小时；稳定剂配方为：5％柠檬酸钠，1.5M氯化钠，50％(w/v)山梨醇，pH 7.0。
(6)亲和层析：肝素亲和柱先用平衡液充分平衡，将步骤(5)所得料液用0.45μm滤芯过滤后上样，上样后先用平衡液冲40个柱体积，再用洗涤缓冲液冲15个柱体积，最后用洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱液；平衡液配方为：0.1M Tris-HCl，0.01M柠檬酸三钠，0.2M氯化钠，pH 7.0，洗涤缓冲液配方为：0.1M Tris-HCl，0.01M柠檬酸三钠，0.3M氯化钠，pH 7.0，洗脱缓冲液配方为：0.1M Tris-HCl，0.01M柠檬酸三钠，1.5M氯化钠，pH 7.0。
(7)超滤浓缩：用10KD超滤膜浓缩步骤(6)所得洗脱液，然后用透析液等体积透析6倍，最后浓缩至人抗凝血酶Ⅲ效价约50IU/mL；透析液配方为：甘氨酸：1％(w/w)，pH： 7.0，液温：常温。
(8)除菌过滤：用0.22μm滤芯对制品进行除菌过滤；
(9)纳米膜除病毒过滤：先用0.1μm滤芯预过滤，再用15纳米滤芯进行除病毒过滤；
(10)分装；
(11)冷冻干燥：采取预冷，速冻、退火及一次干燥与二次干燥，最后得到人抗凝血酶Ⅲ冻干粉。
实施例2
(1)新鲜冰冻人血浆去除冷沉淀：取800L新鲜冰冻人血浆融化混合均匀后，经过流式离心机去除冷沉淀，取得离心后的血浆上清液；
(2)DEAE Sephadex A-50凝胶吸附：在步骤(1)所得到的血浆上清液中加入DEAESephadex A-50凝胶，干凝胶的加入量为960g，干凝胶预先用70℃以上热注射用水进行溶胀，再用25℃以下冷注射用水进行冷却，最后用平衡缓冲液平衡，适当转速(确保凝胶在溶液中混合分布均匀同时不宜太快)搅拌1.5小时，过滤得滤液，凝胶经过再生后保存可以重复使用；平衡缓冲液配方为：0.015M枸橼酸钠，0.2M氯化钠，pH为7.5
(3)聚乙二醇(PEG-4000)提纯处理：将步骤(2)所得的滤液pH调整至6.5，加入15％(w/v)聚乙二醇(PEG-4000)，离心去除沉淀得上清液，再向所得上清液中加入25％(w/v) 聚乙二醇(PEG-4000)，离心并回收沉淀；
(4)亲和层析：肝素亲和柱先用平衡液充分平衡，将步骤(3)所得沉淀用平衡液溶解，然后用0.45μm滤芯过滤后上样，上样后先用平衡液冲40个柱体积，再用洗涤缓冲液冲15个柱体积，最后用洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱液；平衡液配方为：0.15M Tris-HCl，0.01M柠檬酸三钠，0.2M氯化钠，pH 7.5，洗涤缓冲液配方为：0.15M Tris-HCl，0.01M柠檬酸三钠，0.3M氯化钠，pH 7.5，洗脱缓冲液配方为：0.1M Tris-HCl，0.01M柠檬酸三钠，1.5M氯化钠，pH 7.5。
(5)巴氏病毒灭活：向步骤(4)所得洗脱液中加入稳定剂，然后调整料液pH至7.5，将溶液置于60℃环境中处理10小时；稳定剂配方为：8％柠檬酸钠，2.0M氯化钠，55％(w/v)山梨醇，pH 7.5。
(6)亲和层析：肝素亲和柱先用平衡液充分平衡，将步骤(5)所得料液用0.45μm滤芯过滤后上样，上样后先用平衡液冲40个柱体积，再用洗涤缓冲液冲15个柱体积，最后用洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱液；平衡液配方为：0.15M Tris-HCl，0.01M柠檬酸三钠，0.2M氯化钠，pH 7.5，洗涤缓冲液配方为：0.15M Tris-HCl，0.01M柠檬酸三钠，0.3M氯化钠，pH 7.5，洗脱缓冲液配方为：0.1M Tris-HCl，0.01M柠檬酸三钠，1.5M氯化钠，pH 7.5。
(7)超滤浓缩：用10KD超滤膜浓缩步骤(6)所得洗脱液，然后用透析液等体积透析6倍，最后浓缩至人抗凝血酶Ⅲ效价约50IU/mL；透析液配方为：甘氨酸：3％(w/w)，pH： 7.0，液温：常温。
(8)除菌过滤：用0.22μm滤芯对制品进行除菌过滤；
(9)纳米膜除病毒过滤：先用0.1μm滤芯预过滤，再用15纳米滤芯进行除病毒过滤；
(10)分装；
(11)冷冻干燥：采取预冷，速冻、退火及一次干燥与二次干燥，最后得到人抗凝血酶Ⅲ冻干粉。
实施例3
(1)新鲜冰冻人血浆去除冷沉淀：取1000L新鲜冰冻人血浆融化混合均匀后，经过流式离心机去除冷沉淀，取得离心后的血浆上清液；
(2)DEAE Sephadex A-50凝胶吸附：在步骤(1)所得到的血浆上清液中加入DEAESephadex A-50凝胶，干凝胶的加入量为1500g，干凝胶预先用70℃以上热注射用水进行溶胀，再用25℃以下冷注射用水进行冷却，最后用平衡缓冲液平衡，适当转速(确保凝胶在溶液中混合分布均匀同时不宜太快)搅拌2小时，过滤得滤液，凝胶经过再生后保存可以重复使用；平衡缓冲液配方为：0.015M枸橼酸钠，0.2M氯化钠，pH为7.5
(3)聚乙二醇(PEG-4000)提纯处理：将步骤(2)所得的滤液pH调整至6.5，加入15％(w/v)聚乙二醇(PEG-4000)，离心去除沉淀得上清液，再向所得上清液中加入25％(w/v) 聚乙二醇(PEG-4000)，离心并回收沉淀；
(4)亲和层析：肝素亲和柱先用平衡液充分平衡，将步骤(3)所得沉淀用平衡液溶解，然后用0.45μm滤芯过滤后上样，上样后先用平衡液冲40个柱体积，再用洗涤缓冲液冲15个柱体积，最后用洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱液；平衡液配方为：0.15M Tris-HCl，0.01M柠檬酸三钠，0.2M氯化钠，pH 7.5，洗涤缓冲液配方为：0.15M Tris-HCl，0.01M柠檬酸三钠，0.3M氯化钠，pH 7.5，洗脱缓冲液配方为：0.1M Tris-HCl，0.01M柠檬酸三钠，1.5M氯化钠，pH 7.5。
(5)巴氏病毒灭活：向步骤(4)所得洗脱液中加入稳定剂，然后调整料液pH至7.5，将溶液置于60℃环境中处理10小时；稳定剂配方为：10％柠檬酸钠，2.0M氯化钠，55％(w/v)山梨醇，pH 7.5。
(6)亲和层析：肝素亲和柱先用平衡液充分平衡，将步骤(5)所得料液用0.45μm滤芯过滤后上样，上样后先用平衡液冲40个柱体积，再用洗涤缓冲液冲15个柱体积，最后用洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱液；平衡液配方为：0.15M Tris-HCl，0.01M柠檬酸三钠，0.2M氯化钠，pH 7.5，洗涤缓冲液配方为：0.15M Tris-HCl，0.01M柠檬酸三钠，0.3M氯化钠，pH 7.5，洗脱缓冲液配方为：0.1M Tris-HCl，0.01M柠檬酸三钠，1.5M氯化钠，pH 7.5。
(7)超滤浓缩：用10KD超滤膜浓缩步骤(6)所得洗脱液，然后用透析液等体积透析6倍，最后浓缩至人抗凝血酶Ⅲ效价约50IU/mL；透析液配方为：甘氨酸：3％(w/w)，pH： 7.0，液温：常温。调整后料液人抗凝血酶Ⅲ比活达到13IU/mg蛋白质。
(8)除菌过滤：用0.22μm滤芯对制品进行除菌过滤；
(9)纳米膜除病毒过滤：先用0.1μm滤芯预过滤，再用15纳米滤芯进行除病毒过滤；
(10)分装；
(11)冷冻干燥：采取预冷，速冻、退火及一次干燥与二次干燥，最后得到人抗凝血酶Ⅲ冻干粉。
上述实施例仅为本发明的较佳实施方式之一，并非以此限制本发明的保护范围，故：凡依本发明的工艺所做的等效变化，只要在本发明的要旨范围内，均应涵盖于本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种从血浆中提取人抗凝血酶Ⅲ的方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)新鲜冰冻人血浆去除冷沉淀：将新鲜冰冻人血浆融化混合均匀后，经过流式离心机去除冷沉淀，取得离心后的血浆上清液；
(2)DEAE Sephadex A-50凝胶吸附：在步骤(1)所得到的血浆上清液中加入DEAESephadex A-50凝胶，干凝胶的加入量为0.5-1.5g/kg料液，干凝胶预先用70℃以上热注射用水进行溶胀，再用25℃以下冷注射用水进行冷却，最后用平衡缓冲液平衡，适当转速(确保凝胶在溶液中混合分布均匀同时不宜太快)搅拌1.0-2.0小时，过滤得滤液，凝胶经过再生后保存可以重复使用；
(3)聚乙二醇(PEG-4000)提纯处理：将步骤(2)所得的滤液pH调整至6.0-7.0，加入10％-20％(w/v)聚乙二醇(PEG-4000)，离心去除沉淀得上清液，再向所得上清液中加入20％-30％(w/v)聚乙二醇(PEG-4000)，离心并回收沉淀；
(4)亲和层析：肝素亲和柱先用平衡液充分平衡，将步骤(3)所得沉淀用平衡液溶解，然后用0.45μm滤芯过滤后上样，上样后先用平衡液冲40个柱体积，再用洗涤缓冲液冲15个柱体积，最后用洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱液；
(5)巴氏病毒灭活：向步骤(4)所得洗脱液中加入稳定剂，然后调整料液pH至7.0-8.0，将溶液置于60℃环境中处理10小时；
(6)亲和层析：肝素亲和柱先用平衡液充分平衡，将步骤(5)所得料液用0.45μm滤芯过滤后上样，上样后先用平衡液冲40个柱体积，再用洗涤缓冲液冲15个柱体积，最后用洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱液；
(7)超滤浓缩：用10KD超滤膜浓缩步骤(6)所得洗脱液，然后用透析液等体积透析5-6倍，最后浓缩至人抗凝血酶Ⅲ效价约50IU/mL；
(8)除菌过滤：用0.22μm滤芯对制品进行除菌过滤；
(9)纳米膜除病毒过滤：先用0.1μm滤芯预过滤，再用15纳米滤芯进行除病毒过滤；
(10)分装；
(11)冷冻干燥：采取预冷，速冻、退火及一次干燥与二次干燥，最后得到人抗凝血酶Ⅲ冻干粉。
2.所述步骤(2)中所述的DEAE Sephadex A-50凝胶吸附，采用的是本公司的血浆吸附过滤装置(中国发明专利CN201810248696.8一种用于凝血因子类血液制品生产的血浆吸附过滤装置)。
3.所述步骤(2)中所述的平衡缓冲液配方为：0.01-0.02M枸橼酸钠，0.15-0.25M氯化钠，pH为7.0-8.0。
4.所述步骤(4)中所述的亲和层析中平衡液配方为：0.1-0.2M Tris-HCl，0.01-0.02M柠檬酸三钠，0.2-0.3M氯化钠，pH 7.0-8.0，洗涤缓冲液配方为：0.1-0.2M Tris-HCl，0.01-0.02M柠檬酸三钠，0.3-0.4M氯化钠，pH 7.0-8.0，洗脱缓冲液配方为：0.1-0.2M Tris-HCl，0.01-0.02M柠檬酸三钠，1.5-2.5M氯化钠，pH 7.0-8.0。
5.所述步骤(5)所述的稳定剂配方为：5％-10％柠檬酸钠，1.5-2.5M氯化钠，50-60％(w/v)山梨醇，pH 7.0-8.0。
6.所述步骤(7)中所述的透析液配方为：甘氨酸：1-4％(w/w)，pH：7.0-8.0，液温：常温。
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Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103613662A (zh) * | 2013-11-26 | 2014-03-05 | 中国医学科学院输血研究所 | 一种从人血浆中分离纯化人抗凝血酶-ⅲ的方法 |
| CN104672328A (zh) * | 2015-02-13 | 2015-06-03 | 山东泰邦生物制品有限公司 | 一种人抗凝血酶ⅲ的生产方法 |
| CN105315365A (zh) * | 2015-11-17 | 2016-02-10 | 上海洲跃生物科技有限公司 | 一种人抗凝血酶iii的制备方法 |
| CN113652414A (zh) * | 2021-09-12 | 2021-11-16 | 广东双林生物制药有限公司 | 一种高纯人凝血酶的制备方法 |
-
2022
- 2022-02-24 CN CN202110946978.7A patent/CN114395032A/zh active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103613662A (zh) * | 2013-11-26 | 2014-03-05 | 中国医学科学院输血研究所 | 一种从人血浆中分离纯化人抗凝血酶-ⅲ的方法 |
| CN104672328A (zh) * | 2015-02-13 | 2015-06-03 | 山东泰邦生物制品有限公司 | 一种人抗凝血酶ⅲ的生产方法 |
| CN105315365A (zh) * | 2015-11-17 | 2016-02-10 | 上海洲跃生物科技有限公司 | 一种人抗凝血酶iii的制备方法 |
| CN113652414A (zh) * | 2021-09-12 | 2021-11-16 | 广东双林生物制药有限公司 | 一种高纯人凝血酶的制备方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 倪道明等: "人抗凝血酶Ⅲ及其抗血清的研制", 中国生物制品学杂志, vol. 2, no. 1, pages 32 - 35 * |
| 穆成华等: "肝素-琼脂糖凝胶6FF的制备及其在抗凝血酶III分离纯化中的应用", 过程工程学报, vol. 5, no. 5, pages 545 - 549 * |
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