CN113186285B - 一种辅助诊断胃癌的方法及其使用的miRNA组合 - Google Patents

一种辅助诊断胃癌的方法及其使用的miRNA组合 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种胃癌早筛的方法，包括如下步骤：根据胃癌患者和健康者的外周血样本中miR‑126‑3p、miR‑150‑5p、miR‑199a‑3p、miR‑221‑3p和miR‑424‑5p的表达量，进行二元Logistic回归分析，得到LogitP值计算公式并确定阈值；检测待测者的外周血样本中上述miRNA的表达量并代入LogitP值计算公式，得到待测者的LogitP值；之后进行如下判断：如果待测者的LogitP值大于阈值，则待测者患有胃癌；如果待测者的LogitP值为阈值以下，则待测者不患有胃癌。实验证明，本发明提供的早筛胃癌的方法特异性好、灵敏度高且准确率高。本发明具有重要的应用价值。

Description

一种辅助诊断胃癌的方法及其使用的miRNA组合
技术领域
本发明属于生物医学领域，具体涉及一种辅助诊断胃癌的方法及其使用的miRNA组合。
背景技术
胃癌是一种发病率很高的恶性肿瘤。目前，虽然针对胃癌的诊疗市场巨大，然而市场上普遍缺乏一类新型的胃癌辅助诊断技术。为了能够精准地对早期胃癌进行筛查，防止胃癌发展成为严重危害人民身体健康、降低国民身体素质、增加医疗系统负担的不可逆的慢性病，除了发展有效的治疗方法外，癌症的诊断，尤其早期诊断，对癌症的预防和治疗具有重大的意义。目前，对早期胃癌的诊断仍依靠内镜和组织病理学检查，由于费用较高、痛苦较大和操作要求高等原因降低了患者愿意做该项检查的程度，由于普查不系统以及缺乏敏感性高、特异性强的血清学诊断标志物，大多数胃癌患者有症状时就诊已处于进展期。因此，简单可靠、无创或微创的大通量胃癌早期筛查的检查方法显得尤为重要。
目前，能够辅助诊断胃癌的无创方法有循环肿瘤细胞(CTC)检测、循环肿瘤DNA(ctDNA)检测、DNA甲基化检测以及高通量测序。但CTC和ctDNA的检测早期灵敏度低，DNA甲基化胃癌方向尚未深入研究，高通量测序则时间长、成本高，不同方法都具有一定的不足，因此限制了在临床上的应用。
miRNA是一类内源基因编码长度约为19-24nt的非编码单链RNA分子。由于miRNA能够很好的识别并配对后转录基因进而调控蛋白的表达，所以它与动物体内的生物过程息息相关。研究表明，miRNA与多种肿瘤发生有着密切的关系，它可能像癌基因或抑癌基因一样在肿瘤发生、发展过程中发挥重要的调控作用。当miRNA的行为异常时会导致疾病的发生，如miRNA-122是肝癌细胞发病的肿瘤标志物。此外，miRNA不仅存在于组织和细胞中，还稳定地存在于外周血及体液当中。所以在众多癌症的筛查、诊断及治疗过程中，miRNA是一个重要的生物指标。
发明内容
本发明的目的为对胃癌进行早筛或评估待测者的胃癌风险。
本发明首先保护一种胃癌早筛的方法，可包括如下步骤：
(1)根据若干胃癌患者的外周血样本和若干健康者的外周血样本中miR-126-3p、miR-150-5p、miR-199a-3p、miR-221-3p和miR-424-5p的表达量，进行二元Logistic回归分析，得到LogitP值计算公式并确定阈值；
(2)检测待测者的外周血样本中miR-126-3p、miR-150-5p、miR-199a-3p、miR-221-3p和miR-424-5p的表达量并代入步骤(1)得到的LogitP值计算公式，得到待测者的LogitP值；之后进行如下判断：
如果待测者的LogitP值大于阈值，则待测者患有胃癌或疑似患有胃癌；
如果待测者的LogitP值为阈值以下，则待测者不患有胃癌或疑似不患有胃癌；
所述miR-126-3p的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；
所述miR-150-5p的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；
所述miR-199a-3p的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；
所述miR-221-3p的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；
所述miR-424-5p的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；
所述方法用于非疾病的诊断与治疗。
上述方法可用于疾病的预防。
上述方法中，所述表达量可为相对表达量。
上述方法中，所述相对表达量可为目的miRNA相对内参的表达量。目的miRNA可为miR-126-3p、miR-150-5p、miR-199a-3p、miR-221-3p或miR-424-5p。内参可为miR-16-5p。所述miR-16-5p的核苷酸序列可如SEQ ID NO:1所示。
本发明还保护miRNA组合甲在制备用于胃癌早筛的产品中的应用；
miRNA组合甲可为A1)或A2)：
A1)包括所述miR-126-3p、所述miR-150-5p、所述miR-199a-3p、所述miR-221-3p和所述miR-424-5p；
A2)由所述miR-126-3p、所述miR-150-5p、所述miR-199a-3p、所述miR-221-3p和所述miR-424-5p组成；
所述应用用于非疾病的诊断与治疗。
本发明还保护miRNA组合乙在制备用于胃癌早筛的产品中的应用；
miRNA组合乙可为B1)或B2)：
B1)包括所述miR-16-5p、所述miR-126-3p、所述miR-150-5p、所述miR-199a-3p、所述miR-221-3p和所述miR-424-5p；
B2)由所述miR-16-5p、所述miR-126-3p、所述miR-150-5p、所述miR-199a-3p、所述miR-221-3p和所述miR-424-5p组成；
所述应用用于非疾病的诊断与治疗。
本发明还保护一种评估胃癌风险的方法，可包括如下步骤：
(1)根据若干胃癌患者的外周血样本和若干健康者的外周血样本中miR-126-3p、miR-150-5p、miR-199a-3p、miR-221-3p和miR-424-5p的表达量，进行二元Logistic回归分析，得到LogitP值计算公式并确定阈值；
(2)检测待测者的外周血样本中miR-126-3p、miR-150-5p、miR-199a-3p、miR-221-3p和miR-424-5p的表达量并代入步骤(1)得到的LogitP值计算公式，得到待测者的LogitP值；之后进行如下判断：
如果待测者的LogitP值大于阈值，则待测者患有胃癌的风险高；
如果待测者的LogitP值为阈值以下，则待测者患有胃癌的风险低；
所述miR-126-3p的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；
所述miR-150-5p的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；
所述miR-199a-3p的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；
所述miR-221-3p的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；
所述miR-424-5p的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；
所述方法用于非疾病的诊断与治疗。
上述方法可用于疾病的预防。
上述方法中，所述表达量可为相对表达量。
上述方法中，所述相对表达量可为目的miRNA相对内参的表达量。目的miRNA可为miR-126-3p、miR-150-5p、miR-199a-3p、miR-221-3p或miR-424-5p。内参可为miR-16-5p。所述miR-16-5p的核苷酸序列可如SEQ ID NO:1所示。
上述任一所述的方法中，检测外周血样本中miR-126-3p、miR-150-5p、miR-199a-3p、miR-221-3p和miR-424-5p的相对表达量的方法可如下：
(1)获得外周血样本的cDNA；
(2)以外周血样本的cDNA为模板，采用通用扩增引物(核苷酸序列为：5’-CAGTGCAGGGTCCGAGGT-3’)和相应的目的miRNA的特异扩增引物组成的引物对进行实时荧光定量PCR，获得目的miRNA的表达量；以外周血样本的cDNA为模板，采用通用扩增引物和5’-TTCGGTAGCAGCACGTAAATA-3’组成的引物对进行实时荧光定量PCR，获得miR-16-5p的表达量；
(3)将实时荧光定量PCR的结果通过ABI 7300plus Real-Time PCR Softwarev2.4输出，即每个样本的Ct值；之后计算ΔCt目的miRNA，ΔCt目的miRNA＝Ct目的miRNA-CtmiR-16-5p。ΔCt即为目的miRNA的相对表达量(以miR-16-5p为内参)。
所述步骤(1)中，获得外周血样本的cDNA是以外周血样本的的RNA为模板，采用反转录酶进行逆转录得到的。进行反转录的RT引物可为5’-CAGTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCACCTGGGCAATTTTTTTTTTTVN-3’。
所述步骤(2)中，目的miRNA的特异扩增引物的核苷酸序列见表2。
上述任一所述miRNA组合甲在制备用于评估胃癌风险的产品中的应用也属于本发明的保护范围；
所述应用用于非疾病的诊断与治疗。
上述任一所述miRNA组合乙在制备用于评估胃癌风险的产品中的应用也属于本发明的保护范围；
所述应用用于非疾病的诊断与治疗。
在本发明的一个实施例中，检测140个健康者的外周血样本和60个胃癌患者的外周血样本中miR-126-3p、miR-150-5p、miR-199a-3p、miR-221-3p和miR-424-5p的表达量，进行二元Logistic回归分析，得到LogitP值计算公式为：LogitP＝ΔCtmiR-126-3p×(3.076)+ΔCtmiR-150-5p×(-7.676)+ΔCtmiR-199a-3p×(-1.758)+ΔCtmiR-221-3p×5.262+ΔCtmiR-424-5p×(-1.603)+2.095。根据这200个样本的LogitP值，利用MedCalc 19制作ROC曲线。结果显示对胃癌诊断的敏感性为90.00％，特异性为90.71％，阈值为-0.0852。
实验证明，本发明提供的早筛胃癌或胃癌风险评估的方法特异性好、灵敏度高且准确率高。本发明具有重要的应用价值。
附图说明
图1为利用MedCalc 19对200个样本的LogitP值制作的ROC曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中，采用SPSS 25.0软件进行统计学分析，P<0.05被认为具有统计学意义。
下述实施例中，10种miRNA的名称和核苷酸序列如表1中第2行至第11行所示。
表1
Figure BDA0003057714120000041
Figure BDA0003057714120000051
实施例、
一、阳性样本和阴性样本的获得
1、胃癌组
胃癌组由79份阳性样本组成，依次命名为P001-P079。
分别抽取临床上已确诊为胃癌的79例患者(所有患者均知情同意)的外周血5-6mL，置于含EDTA抗凝采血管，上下颠倒5-6次(目的为抗凝液和外周血混匀)，之后3000rpm离心10min，收集上清，得到79份阳性样本。
2、健康对照组
健康对照组由163份阴性样本组成，依次命名为N001-N163。
分别抽取163例健康人(均知情同意)的外周血5-6mL，置于含EDTA抗凝采血管，上下颠倒5-6次(目的为抗凝液和外周血混匀)，之后3000rpm离心10min，收集上清，得到163份阴性样本。
二、cDNA的获得
1、分别取242份样本(即79份阳性样本和163份阴性样本组成)，获取相应的血浆。
2、采用TRIzol试剂分别提取242份血浆的RNA，即获得242份样本的RNA。
3、完成步骤2后，分别取(少量)242份样本的RNA，使用Qubit 4.0(LifeTechnologies)进行定量(即测量242份样本的RNA的浓度)。
4、完成步骤3后，分别以242份样本的RNA为模板(约10ng RNA)，采用反转录酶进行逆转录，得到相应的cDNA。进行反转录的RT引物为5’-CAGTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCACCTGGGCAATTTTTTTTTTTVN-3’。
三、目的miRNA的筛选和基于5种目的miRNA的相对表达量辅助诊断胃癌
目的miRNA为miR-126-3p、miR-150-5p、miR-199a-3p、miR-221-3p、miR-424-5p、miR-21-5p、miR-182-5p、miR-195-5p或miR-214-3p。
1、实时荧光定量PCR检测
分别以步骤二得到的cDNA为模板，采用通用扩增引物(核苷酸序列为：5’-CAGTGCAGGGTCCGAGGT-3’)和相应的目的miRNA的特异扩增引物组成的引物对进行实时荧光定量PCR(每个模板做三个平行样)，获得目的miRNA的表达量。目的miRNA的特异扩增引物的核苷酸序列见表2。
表2
目的miRNA 特异扩增引物的核苷酸序列(5’-3’)
miR-126-3p TCGGTCGTACCGTGAGTAAT
miR-150-5p CGGTCTCCCAACCCTTGTA
miR-199a-3p TCGGACAGTAGTCTGCACAT
miR-221-3p TGGAGCTACATTGTCTGCTG
miR-424-5p TCGGCAGCAGCAATTCATGT
miR-21-5p TTCGGTAGCTTATCAGACTGA
miR-182-5p TGGTTTGGCAATGGTAGAACT
miR-195-5p GTCGGTAGCAGCACAGAAAT
miR-214-3p TGGACAGCAGGCACAGACA
分别以步骤二得到的cDNA为模板，采用通用扩增引物和5’-TTCGGTAGCAGCACGTAAATA-3’组成的引物对进行实时荧光定量PCR(每个模板做三个平行样)，获得miR-16-5p的表达量。
2、将步骤1得到的实时荧光定量PCR的结果通过ABI 7300plus Real-Time PCRSoftware v2.4(美国Thermo Fisher Scientific公司的产品)输出，即每个样本的Ct值。Ct值越小，目的miRNA的表达量越高(经统计分析，将Ct值大于35视作不表达)。之后计算ΔCt目的miRNA，ΔCt目的miRNA＝Ct目的miRNA-CtmiR-16-5p。ΔCt即为目的miRNA的相对表达量(以miR-16-5p为内参)。
其中200份样本的目的miRNA的Ct见表3-1和表3-2。
表3-1
Figure BDA0003057714120000061
Figure BDA0003057714120000071
Figure BDA0003057714120000081
Figure BDA0003057714120000091
Figure BDA0003057714120000101
Figure BDA0003057714120000111
表3-2
Figure BDA0003057714120000112
Figure BDA0003057714120000121
Figure BDA0003057714120000131
Figure BDA0003057714120000141
Figure BDA0003057714120000151
3、目的miRNA的筛选
采用SPSS 25.0软件对步骤2中9个miRNA的相对表达量(以miR-16-5p为内参)进行统计学分析。结果表明，miR-21-5p、miR-182-5p、miR-195-5p和miR-214-3p在阳性样本和阴性样本之间没有显著差异。因此，最终确认的用于辅助诊断的目的miRNA为5个，分别为miR-126-3p、miR-150-5p、miR-199a-3p、miR-221-3p和miR-424-5p。
4、辅助诊断
(1)根据200份样本中的ΔCtmiR-126-3p、ΔCtmiR-150-5p、ΔCtmiR-199a-3p、ΔCtmiR-221-3p和ΔCtmiR-424-5p，利用SPSS 25.0进行二元Logistic回归分析(向前LR)，获得如下公式：
LogitP＝ΔCtmiR-126-3p×(3.076)+ΔCtmiR-150-5p×(-7.676)+ΔCtmiR-199a-3p×(-1.758)+ΔCtmiR-221-3p×5.262+ΔCtmiR-424-5p×(-1.603)+2.095
(2)根据上述公式计算出每个样本的LogitP值，之后利用MedCalc 19制作ROC曲线。
ROC曲线见图1。结果显示对胃癌诊断的敏感性为90.00％，特异性为90.71％，阈值为-0.0852，即如果LogitP>-0.0852，则样本为阳性，即样本的提供者患有胃癌；否则样本的提供者不患有胃癌。
5、验证
以步骤2中其它的42份样本进行验证，具体为19份阳性样本(样本编号为P61-P79)和23份阴性样本(样本编号为N141-N163)。
42份样本的6个miRNA的Ct见表4。
表4
Figure BDA0003057714120000161
Figure BDA0003057714120000171
分别将42份样本中的ΔCtmiR-126-3p、ΔCtmiR-150-5p、ΔCtmiR-199a-3p、ΔCtmiR-221-3p和ΔCtmiR-424-5p代入步骤4的公式，得到相应的LogitP值，并进行如下判断：LogitP>-0.0852，则样本为阳性，即样本的提供者患有胃癌；否则样本的提供者不患有胃癌。
检测结果见表5。
表5
Figure BDA0003057714120000172
Figure BDA0003057714120000181
利用SPSS 25.0软件进行Kappa一致性检验。Kappa值为0.8078，一致性较好。
上述结果表明，采用本发明提供的方法检测胃癌具有较高的准确率。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
<110>深圳市展行生物有限公司
<120>一种辅助诊断胃癌的方法及其使用的miRNA组合
<160>10
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211>22
<212>RNA
<213> Artificial sequence
<400> 1
uagcagcacg uaaauauugg cg 22
<210> 2
<211>22
<212>RNA
<213> Artificial sequence
<400> 2
ucguaccgug aguaauaaug cg 22
<210> 3
<211>22
<212>RNA
<213> Artificial sequence
<400> 3
ucucccaacc cuuguaccag ug 22
<210> 4
<211>22
<212>RNA
<213> Artificial sequence
<400> 4
acaguagucu gcacauuggu ua 22
<210> 5
<211>23
<212>RNA
<213> Artificial sequence
<400> 5
agcuacauug ucugcugggu uuc 23
<210> 6
<211>22
<212>RNA
<213> Artificial sequence
<400> 6
cagcagcaau ucauguuuug aa 22
<210> 7
<211>22
<212>RNA
<213> Artificial sequence
<400> 7
uagcuuauca gacugauguu ga 22
<210> 8
<211>24
<212>RNA
<213> Artificial sequence
<400> 8
uuuggcaaug guagaacuca cacu 24
<210> 9
<211>21
<212>RNA
<213> Artificial sequence
<400> 9
uagcagcaca gaaauauugg c 21
<210> 10
<211>22
<212>RNA
<213> Artificial sequence
<400> 10
acagcaggca cagacaggca gu 22

Claims (3)

1.检测miRNA组合中各个miRNA的表达水平的引物组在制备用于胃癌筛查的试剂中的应用；
所述miRNA组合由miR-126-3p、miR-150-5p、miR-199a-3p、miR-221-3p和miR-424-5p组成。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：
所述引物组由用于检测miR-126-3p的表达水平的引物对1、用于检测miR-150-5p的表达水平的引物对2、用于检测miR-199a-3p的表达水平的引物对3、用于检测miR-221-3p的表达水平的引物对4和用于检测miR-424-5p的表达水平的引物对5组成；
所述引物对1由通用扩增引物和miR-126-3p特异扩增引物组成；
所述引物对2由所述通用扩增引物和miR-150-5p特异扩增引物组成；
所述引物对3由所述通用扩增引物和miR-199a-3p特异扩增引物组成；
所述引物对4由所述通用扩增引物和miR-221-3p特异扩增引物组成；
所述引物对5由所述通用扩增引物和miR-424-5p特异扩增引物组成。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：
所述通用扩增引物的核苷酸序列为5’-CAGTGCAGGGTCCGAGGT-3’；
所述miR-126-3p特异扩增引物的核苷酸序列为5’-TCGGTCGTACCGTGAGTAAT-3’；
所述miR-150-5p特异扩增引物的核苷酸序列为5’-CGGTCTCCCAACCCTTGTA-3’；
所述miR-199a-3p特异扩增引物的核苷酸序列为5’-TCGGACAGTAGTCTGCACAT-3’；
所述miR-221-3p特异扩增引物的核苷酸序列为5’-TGGAGCTACATTGTCTGCTG-3’；
所述miR-424-5p特异扩增引物的核苷酸序列为5’-TCGGCAGCAGCAATTCATGT-3’。
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