CN112839962A

CN112839962A - 用于治疗癌症的抗mertk抗体

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Publication number: CN112839962A
Application number: CN201980067679.7A
Authority: CN
Inventors: T·E·小斯皮尔斯; M·奎格利; V·拉方特; G·C·拉凯斯特拉; L·梁; K·A·奥古斯丁-劳赫
Original assignee: Bristol Myers Squibb Co
Current assignee: Bristol Myers Squibb Co
Priority date: 2018-10-09
Filing date: 2019-10-08
Publication date: 2021-05-25
Also published as: JP2022512642A; EP3864046A1; WO2020076799A1; KR20210072059A; US20210395392A1

Abstract

本公开提供特异性结合细胞表面上表达的MerTK并抑制由表达MerTK的细胞的胞葬作用的分离的抗体。本公开提供了用于治疗罹患癌症的受试者的方法，包括将治疗有效量的抗MerTK抗体作为单一疗法或联合检查点抑制剂(如抗PD‑1或抗PD‑L1抗体)施用于受试者。

Description

用于治疗癌症的抗MERTK抗体

在整个本申请中，在括号中通过作者姓名和日期或专利号或专利公开号引用了各种出版物。就在权利要求前的说明书末尾处可以找到这些出版物的完整引用信息。这些出版物的公开内容通过引用以其整体并入本文中，以便更全面地描述截至本文所述和要求保护的发明的日期时本领域技术人员已知的现有技术水平。然而，仅在并入的信息与本文明确的公开内容所提供的信息之间不存在冲突的程度上，将这些公开内容通过引用并入本申请中。此外，本文对参考文献的引用不应被理解为承认该参考文献是本发明的现有技术。

相关申请的交叉引用

本申请要求2018年10月9日提交的美国临时申请No.62/743,507的权益，将其完整内容通过引用结合到本文中。

序列表

本申请含有已经以ASCII格式电子提交的序列表并通过引用以其整体结合到本申请中。ASCII副本生成于2019年10月4日，名称为12970WOPCT_Seq_List_ST25.txt，并且大小为135,398字节。

发明领域

本公开涉及特异性结合原癌基因酪氨酸-蛋白激酶MER(MerTK)的单克隆抗体(mAb)，以及用于治疗受试者癌症的方法，所述方法包括将抗MerTK抗体(Ab)作为单一疗法或联合抗癌剂(如免疫检查点抑制剂)、化疗剂和/或放疗施用于受试者。

发明背景

人类癌症含有许多遗传学和表观遗传学改变，产生了可能被免疫系统识别的新抗原(Chakravarthi等，2016)。由T和B淋巴细胞组成的适应性免疫系统具有强大的抗癌潜力，具有应答多种肿瘤抗原的广谱能力和极度灵敏的特异性。此外，免疫系统证明了相当大的可塑性和记忆成分。成功利用适应性免疫系统的所有这些特性使免疫疗法在所有癌症治疗方式中独树一帜。

过去的十年已经见证了用于治疗癌症的特异性免疫检查点通路抑制剂的发展(Chen和Mellman，2013；Lesokhin等，2015)，包括用于治疗晚期黑色素瘤患者的结合并抑制细胞毒性T淋巴细胞抗原-4的Ab，伊匹单抗(ipilimumab

以及如特异性结合PD-1受体并阻断抑制性PD-1/PD-1配体(PD-L1)信号转导途径的纳武单抗(nivolumab)

和派姆单抗(pembrolizumab)

这样的Ab的发展(Iwai等，2017)。该途径还可以被特异结合PD-L1的Ab破坏，所述Ab包括阿妥珠单抗(atezolizumab)

德瓦鲁单抗(durvalumab)

)和阿维单抗(avelumab)

纳武单抗是一种完全人免疫球蛋白(Ig)G4(S228P)单克隆抗体mAb，其选择性地防止与PD-1配体PD-L1和PD-L2的相互作用(美国专利No.8,008,449；Wang等，2014)，由此阻断针对外来抗原(包括肿瘤)和自身抗原两者的抗原特异性T细胞应答的下调，并增强对抗这些抗原的免疫应答。纳武单抗最近已获批准用于几种癌症，包括黑色素瘤、肺癌、肾细胞癌、经典霍奇金淋巴瘤、头颈癌、尿路上皮癌、MSI-H或dMMR转移性结直肠癌和肝细胞癌，并且目前正作为其他癌症类型中的单一疗法或结合其他抗癌剂进行临床评估。但是，只有一小部分患者(通常少于约25％)会得益于检查点抑制剂的治疗，并且现在大量的精力集中于使用检查点抑制剂和其他抗癌剂或疗法的组合来提高免疫疗法的疗效。由于PD-1/PD-L1抑制剂已被证明在治疗广谱癌症中都是非常成功的，因此它们被认为很可能是免疫肿瘤学中各种未来药物联合的主力，并且正在竞赛研发最有效的组合(参见，例如，Mahoney等，2015；Ott等，2017)。

MerTK(c-Mer酪氨酸激酶；原癌基因酪氨酸-蛋白激酶MER)是蛋白受体酪氨酸激酶(RTK)的TMA(Tyro3/Axl/Mer)家族的成员，其呈现出相似的整体结构，所述结构从N-末端包括两个Ig样C2型结构域、两个III型纤连蛋白(Fn)结构域，接着是疏水性跨膜结构域和胞内酪氨酸激酶结构域。两个Ig样结构域作为TAM的配体结合区。

TAM RTK在多种人类癌症中，尤其是在血液学和上皮性恶性肿瘤中异位表达或过表达，并且人们越来越有兴趣了解TAM受体在调节抗肿瘤免疫反应中的作用。在肿瘤微环境中，MerTK主要在与肿瘤相关的巨噬细胞上表达，在单核细胞和树突细胞(DC)上的表达较低。TAM RTK在肿瘤细胞中的诱导主要促进存活、化学抗性和运动性，而不是起致癌作用(Linger等，2008；Graham等，2014)。尽管MerTK敲低仅轻度促进细胞培养中的细胞凋亡并减慢增殖，但在应激条件下(如与血清饥饿或在软琼脂或异种移植物中生长相结合时)，这种作用更为明显(Lee-Sherick等，2013年；Linger等，2013)。这表明TAM存活信号在肿瘤微环境中可能尤其重要，在该环境中，有限的氧和营养供应加剧了蛋白毒性和遗传毒性。

生长停滞特异性蛋白6(Gas6)和蛋白S1(PROS1)是研究最深入的该受体家族的配体，并作为桥接分子，通过其N末端GLA结构域结合凋亡细胞外膜上的磷脂酰丝氨酸并通过其C末端结构域直接结合MerTK(Graham等，2014)。这些配体结合并激活TAM受体(Stitt等，1995)。另外报道的两种配体Tubby和Tubby-Like蛋白1(Tulp1)也通过啮合凋亡细胞的高度保守的C末端PPBD(吞噬作用的猎物结合结构域)结构域和N末端MPD(最小吞噬决定簇)结构域类似地作为MerTK的桥连配体(Caberoy等，2010)。也有报道说半凝乳素-3(Gal-3)也可以直接结合MerTK，但这种假定的相互作用还是少有了解(Caberoy等，2012)。

除了一些血液学和上皮癌，MerTK主要在肿瘤相关的巨噬细胞、耐受性树突细胞和自然杀伤(NK)细胞上表达(Graham等，2014)。它也在其是免疫系统的专业吞噬细胞的组织驻留巨噬细胞群以及正常上皮细胞(如红髓巨噬细胞)和视网膜上皮上表达。配体由许多细胞表达，包括髓样细胞、激活的T细胞和许多癌细胞/类型(Graham等，2014)。通常，表达MerTK或其他TAM家族受体的细胞是表达一种或多种配体的相同细胞，从而带来潜在的自分泌介导的激活。各种配体与TAM受体家族的表达和结合调节多种生理过程，包括细胞存活、迁移、分化和胞葬作用(efferocytosis)(特异性靶向和吞噬凋亡细胞的过程)。

巨噬细胞上MerTK的表达对于它们在健康和受伤组织中的吞噬功能至关重要。MerTK是胞葬作用的关键介质，并且被认为有助于肿瘤微环境中的免疫抑制和耐受。已经显示MerTK的过表达足以向细胞系灌输功能能力的增强，并使它们能够有效地吞噬凋亡细胞，并且，通过敲除MerTK表达会实现功能丧失(Nguyen等，2014)。

使用MerTK^-/-小鼠的公开报道已证明了在免疫原性环境(如PyVMT乳腺癌模型)中具有免疫介导的增强的抗肿瘤活性，并且甚至在难以治疗的环境(如B16F10黑色素瘤模型)中，肿瘤生长延迟也增加了(Cook等，2013年)。与拟议的与MerTK阻断机制有关的机制一致，还显示出CD8Teff细胞功能是这些抗肿瘤益处所必需的(Cook等，2013)。巨噬细胞摄取凋亡细胞的重要特征是其随后倾向于下调促炎细胞因子的产生并上调与免疫抑制有关的因子。各种研究都支持如下想法：凋亡肿瘤细胞的MerTK依赖性吞噬作用会导致有利于巨噬细胞促进肿瘤的极化的信号转导级联，并且这些促进肿瘤发生的程序增强了帮助肿瘤生长的免疫抑制细胞因子的产生(参见Akalu等，2017)。另外，已经显示在体外和体内用磷脂酰丝氨酸阻断剂(例如，膜联蛋白V)阻断胞葬作用导致免疫抑制因子(例如，TGF-β)减少、促炎因子(例如TNF-α)增加和增强的巨噬细胞介导的T细胞增殖(Barker等，2002；Bondanza等，2004)。这些数据以及其他数据表明了使用特异性针对MerTK的拮抗性配体阻断Ab阻断胞葬作用可能作为抗癌治疗剂而有效的可能性。因此，进行了本研究以鉴定以高亲和力结合MerTK并抑制胞葬作用的Ab用于治疗癌症。此类Abs与重振T细胞反应的药剂(如检查点抑制剂)和/或在肿瘤微环境中诱导凋亡反应的治疗(如某些化疗化合物和放疗)联合使用可能尤其有效(Jinushi等，2013)。

最近的PCT公开(WO 2016/106221)描述了以高亲和力特异性结合人MerTK(或人和小鼠MerTK)、抑制Gas6与MerTK结合并激动内皮细胞上MerTK信号转导的mAb的分离。WO2016/106221还提供了通过向受试者施用特异性结合MerTK并激动内皮细胞上的MerTK信号转导(即激活内皮细胞上的MerTK磷酸化)的Ab来治疗癌症的方法。两种mAb在人类乳腺癌的小鼠模型中显示出抑制肿瘤进展。MerTK激动剂治疗癌症的能力被合理化，其基础是内皮细胞上的MerTK的Gas-6激活导致癌细胞抑制内皮细胞募集，这是癌细胞的一个关键特征，其允许肿瘤血管生成、肿瘤生长和转移。因此，激活内皮细胞而不是癌细胞上的MerTK信号转导的化合物可有效减少肿瘤血管生成和转移。第二个PCT公开(WO 2019/005756)描述了M6和M19的Ab-药物缀合物的生产及其在治疗癌症中的用途。

本公开涉及抗MerTK Ab的生产及其在治疗癌症中的效力和适用性的评估。本公开还涉及通过抗MerTK Ab联合检查点阻断(例如，PD-1/PD-L1信号转导途径的抑制)来治疗癌症的功效的评估。抗-MerTK和抗-PD-1/抗-PD-L1的作用机制的结合提供了增加肿瘤细胞杀灭的独特机会。

发明概述

本发明提供了分离的Ab，优选mAb，其结合细胞表面上表达的MerTK并呈现出各种功能特性(包括治疗性Ab所需的特性)。这些特性包括，与MerTK的高亲和力结合、抑制由表达MerTK的细胞(主要是巨噬细胞)的胞葬作用、抑制生长停滞特异性蛋白6(Gas6)与hMerTK的结合、破坏MerTK和Gas6之间的相互作用、抑制MerTK/Gas6信号转导、作为单一疗法或结合另一种抗癌剂施用于受试者时抑制受试者中肿瘤细胞的生长，以及作为单一疗法或结合另一种抗癌剂施用于受试者时治疗罹患癌症的受试者。在某些实施方案中，公开的抗-MerTK mAb结合MerTK，后者是人MerTK(hMerTK)、食蟹猴MerTK(cMerTK)、鼠MerTK(mMerTK)或这些MerTK靶的组合。在优选的实施方案中，受试者是人类受试者。

在某些实施方案中，抗MerTK Ab以约1nM或更低，优选约0.04nM至约0.7nM之间的IC₅₀抑制由表达hMerTK的细胞的胞葬作用。在某些其他实施方案中，抗MerTK Ab以约10nM或更低，优选约0.1nM至约5nM之间的IC₅₀抑制hMerTK/Gas6信号转导。在更多实施方案中，抗MerTK Ab以约70nM或更低，优选约2nM至约25nM之间的K_D特异性结合hMerTK。在再另外的实施方案中，抗MerTK Ab以高亲和力特异性结合hMerTK、cMerTK和mMerTK。

本文提供的抗MerTK Ab已经分配给三个表位箱(bin)。在某些实施方案中，Ab属于箱1。箱1 Ab结合跨越大约氨基酸105至165的区域内的MerTK的第一Ig结构域。在优选实施方案中，Ab属于箱2。箱2Ab结合跨越大约氨基酸195至270的区域内的MerTK的第二Ig结构域。在更多实施方案中，Ab属于箱3。箱3Ab结合跨越大约氨基酸420至490的区域内的纤连蛋白(Fn)结构域。

本公开提供了分离的Ab，优选mAb，或其抗原结合部分，其特异性结合细胞表面上表达的hMerTK，并在以下每个重链和轻链可变区对中包含CDR1、CDR2和CDR3结构域：

(a)包含具有SEQ ID NO：217所示序列的连续连接的氨基酸的V_H和包含具有SEQID NO：218所示序列的连续连接的氨基酸的V_L；

(b)包含具有SEQ ID NO：221所示序列的连续连接的氨基酸的V_H和包含具有SEQID NO：222所示序列的连续连接的氨基酸的V_L；

(c)包含具有SEQ ID NO：225所示序列的连续连接的氨基酸的V_H和包含具有SEQID NO：226所示序列的连续连接的氨基酸的V_L；

(d)包含具有SEQ ID NO：229所示序列的连续连接的氨基酸的V_H和包含具有SEQID NO：230所示序列的连续连接的氨基酸的V_L；

(e)包含具有SEQ ID NO：233所示序列的连续连接的氨基酸的V_H和包含具有SEQID NO：234所示序列的连续连接的氨基酸的V_L；

(f)包含具有SEQ ID NO：237所示序列的连续连接的氨基酸的V_H和包含具有SEQID NO：238所示序列的连续连接的氨基酸的V_L；

(g)包含具有SEQ ID NO：241所示序列的连续连接的氨基酸的V_H和包含具有SEQID NO：242所示序列的连续连接的氨基酸的V_L；

(h)包含具有SEQ ID NO：245所示序列的连续连接的氨基酸的V_H和包含具有SEQID NO：246所示序列的连续连接的氨基酸的V_L；

(i)包含具有SEQ ID NO：249所示序列的连续连接的氨基酸的V_H和包含具有SEQID NO：250所示序列的连续连接的氨基酸的V_L；

(j)包含具有SEQ ID NO：253所示序列的连续连接的氨基酸的V_H和包含具有SEQID NO：254所示序列的连续连接的氨基酸的V_L；

(k)包含具有SEQ ID NO：255所示序列的连续连接的氨基酸的V_H和包含具有SEQID NO：256所示序列的连续连接的氨基酸的V_L；或

(l)包含具有SEQ ID NO：257所示序列的连续连接的氨基酸的V_H和包含具有SEQID NO：258所示序列的连续连接的氨基酸的V_L。

可变区的序列可以通过各种方法来定义，包括Kabat、Chothia、AbM、contact和IMGT定义。

本公开还提供了编码本文所述的任何Ab或其抗原结合部分的分离的核酸。本公开提供了包含所述分离核酸的表达载体和包含所述表达载体的宿主细胞。这个宿主细胞可以用于制备抗MerTK mAb或其抗原结合部分的方法中，所述方法包括在所述宿主细胞中表达mAb或其抗原结合部分并从宿主细胞分离mAb或其抗原结合部分。

在某些实施方案中，本公开提供了用于治疗罹患癌症的受试者的方法，所述方法包括将治疗有效量的本文所述的任何抗MerTK mAb或抗原结合部分施用于受试者，从而受试者得到治疗。在其他实施方案中，本公开提供了一种用于抑制受试者中的肿瘤细胞生长的方法，所述方法包括将治疗有效量的本文所述的任何抗MerTK mAb或抗原结合部分施用于受试者，从而受试者中的肿瘤细胞的生长得到抑制。在这些方法的某些实施方案中，抗MerTK mAb抑制表达MerTK的细胞的胞葬作用。在某些其他实施方案中，抗MerTK mAb抑制MerTK与其配体的结合并抑制MerTK/配体信号转导。

本公开进一步提供了一种用于治疗罹患癌症的受试者的方法，所述方法包括将治疗有效量的以下组合施用于受试者：(a)本文所述的任何抗MerTK mAb或抗原结合部分。和(b)用于治疗癌症的其他治疗剂。在某些优选实施方案中，其他治疗剂是特异性结合PD-1或PD-L1的拮抗性Ab或其抗原结合部分。

通过以下不应解释为限制的详述和实施例，本发明的其他特征和优点将变得显而易见。在本申请全文中引用的所有引用的参考文献的内容，包括科学文章、GenBank条目、专利和专利申请，均明确通过引用并入本文中。

附图简述

图1A-1C显示了与单独的抗PD-1 Ab治疗相比，小鼠抗mPD-1 Ab(4H2)和小鼠抗mMerTK Ab的组合对肿瘤生长的作用，如通过MC38小鼠结肠腺癌肿瘤模型中用Ab治疗的10只个体小鼠中肿瘤体积的变化测量：图1A，对照小鼠IgG1 Ab；图1B，抗小鼠PD-1 Ab(克隆4H2)；图1C，抗PD-1 Ab和抗小鼠MerTK(克隆4E9)Ab的联合。在联合组中，10只小鼠中的七只被治愈了，即，显示出100％的肿瘤收缩，而使用单独的抗PD-1治疗的小鼠中没有一只被治愈。

图2显示了通过用抗MerTK联合抗PD1治疗治愈的MC38小鼠对肿瘤再激发的抵抗力。所有七只再激发的小鼠对MC38肿瘤生长均有抵抗力。

图3A-3H显示了与单独的抗PD-1 Ab治疗相比，抗小鼠PD-1 Ab(4H2)联合具有不同FcR效应子功能的不同小鼠抗mMerTK Ab(4E9和2D9)对肿瘤生长的作用，如通过MC38肿瘤模型中用Ab治疗的个体小鼠中的肿瘤体积变化所测量的：图1A，对照小鼠IgG1 Ab；图1B，抗mMerTK Ab(2D9-IgG1)；图1C，抗mMerTK Ab(2D9-D265A)；图1D，抗mMerTK Ab(4E9-D265A)；图1E，抗mPD-1 Ab；图1F，抗mPD-1 Ab和抗mMerTK Ab(2D9-IgG1)的组合；图1G，抗mPD-1 Ab和抗mMerTK Ab(2D9-D265A)的组合；图1H，抗mPD-1 Ab和抗mMerTK Ab(4E9-D265A)的组合。不论FcR效应子功能是IgG1或是IgG1-D265A，使用两种不同的抗MerTK Ab观察到相似的功效。

图4A-4D显示了在CT26小鼠结肠癌肿瘤模型中单独或联合使用的抗mPD-1 Ab(4H2)和抗mMerTK Ab对肿瘤生长的作用：图1A，对照小鼠IgG1 Ab；图1B，抗mPD-1 Ab；图1C，抗mMerTK Ab(4E9-IgG1)；图1D，抗mPD-1 Ab和抗mMerTK Ab(4E9-IgG1)的组合。在接受联合治疗的小鼠中，10只中有四只小鼠被治愈，而用抗-MerTK和抗-PD-1 Ab单一疗法治疗的小鼠则分别没有被治愈和有一只被治愈。

图5A-5D显示了在MC38肿瘤模型中单独或组合使用的抗mPD-1 Ab(4H2)和抗mMerTK Ab对肿瘤生长的作用：图1A，对照小鼠IgG1 Ab；图1B，抗mPD-1 Ab；图1C，抗mMerTK抗体(16B9-D265A)；图1D，抗mPD-1 Ab和抗mMerTK Ab(16B9-D265A)的组合。在接受联合治疗的小鼠中，10只小鼠中有七只被治愈，而分别使用抗MerTK和抗PD-1 Ab单一疗法治疗的小鼠则没有被治愈和一只被治愈。

发明详述

本发明涉及特异性结合MerTK的mAb，并涉及用于治疗患者癌症的方法，所述方法包括将抗MerTK Ab单独或结合抗癌剂(如免疫检查点抑制剂)施用于患者。

术语

为了可以更容易地理解本发明的公开内容，首先定义某些术语。如在本申请中使用的，除非本文另有明确规定，否则以下每个术语应具有以下阐述的含义。在整个申请中阐述了其他定义。

“施用”是指使用本领域技术人员已知的各种方法和递送系统中的任何一种，将治疗剂或包含治疗剂的组合物物理引入受试者中。治疗性Ab(如抗PD-1和抗MerTK Ab)的优选施用途径是静脉内施用。其他施用途径包括肌内、皮下、腹膜内或其他胃肠外施用途径，例如，通过注射或输注。如本文使用的短语“胃肠外施用”表示肠和局部施用以外的其他施用方式。施用也可以例如进行一次、多次和/或在一个或多个延长的时间段内进行。

“抗体”(Ab)应当包括，不限于，特异性结合抗原并包含由二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白免疫球蛋白(Ig)，或其抗原结合部分。每条H链包含重链可变区(在本文缩写为V_H)和重链恒定区。IgG Ab的重链恒定区包括三个恒定结构域，C_H1、C_H2和C_H3。每条轻链包含轻链可变区(在本文缩写为V_L)和轻链恒定区。IgG Ab的轻链恒定区包括一个恒定结构域，C_L。V_H和V_L区可以进一步细分成高变区，称为互补决定区(CDR)，间插着更保守的称为框架区(FR)的区域。每个V_H和V_L包括三个CDR和四个FR，以以下顺序从氨基末端排列至羧基末端：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。已经使用多种方法来描绘Ab内的CDR结构域，包括Kabat、Chothia、AbM、contact和IMGT定义。Ab的恒定区可以介导Ig与宿主组织或因子的结合，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)。

Ig可以源自任何通常已知的同种型，包括但不限于IgA、分泌型IgA、IgG和IgM。IgG亚类也是本领域技术人员公知的并且包括但不限于人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。“同种型”是指由重链恒定区基因编码的Ab类别或亚类(例如，IgM、IgG1或IgG4)。术语“抗体”包括例如天然产生的和非天然产生的Ab、单克隆和多克隆Ab、嵌合和人源化Ab、人或非人Ab、完全合成的Ab和单链Ab。非人Ab可以是通过重组方法部分或完全人源化，以降低其在人类中的免疫原性。在没有明确陈述的情况中，并且除非文中另外表示，术语“抗体”还包括上述任一种Ig的抗原结合片段或抗原结合部分，并且包括单价和二价片段或部分，和单链Ab。

“分离的”Ab是指基本上不含具有不同抗原特异性的其他Ab的Ab(例如，分离的特异性结合MerTK的Ab基本上不含特异性结合MerTK以外的其他抗原的Ab，诸如结合Axl或Tyro3的Ab)。然而，分离的特异性结合hMerTK的Ab可以与其他抗原具有交叉反应性，所述其他抗原如来自不同物种(如小鼠和食蟹猴)的MerTK多肽。此外，分离的Ab还表示纯化的以致基本上不含其他细胞材料和/或化学物质的Ab。

术语“单克隆”Ab(mAb)是指单分子组成的Ab分子的非天然产生的制备物，即，一级序列基本相同的并且呈现出对特定表位的单一结合特异性和亲和性的Ab分子。mAb是分离的Ab的实例。mAb可以通过本领域技术人员已知的杂交瘤、重组、转基因或其他技术来生产。

“嵌合”Ab是指其中可变区源自一个物种而恒定区源自另一个物种的Ab，如其中可变区源自小鼠Ab而恒定区源自人Ab的Ab。

“人”mAb(HuMAb)是指具有其中框架和CDR区都源自人种系免疫球蛋白序列的可变区的mAb。此外，如果Ab含有恒定区，则恒定区也源自人种系免疫球蛋白序列。发明的人Ab可以包括不是由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。然而，如本文使用的，术语“人”Ab不意图包括其中源自另一个哺乳动物物种(如小鼠)种系的CDR序列已经嫁接到人框架序列上的Ab。术语“人”Ab和“完全人”Ab同义使用。

“人源化”mAb是指其中非人mAb的CDR结构域外的一些、大部分或全部氨基酸被相应的源自人免疫球蛋白的氨基酸替代的mAb。在人源化形式的Ab的一个实施方案中，CDR结构域外的一些、大部分或全部氨基酸已经被来自人免疫球蛋白的氨基酸替代，而一个或多个CDR区内的一些、大部分或全部氨基酸是未改变的。小的氨基酸添加、缺失、插入、取代或修饰是允许的，只要它们没有消除Ab结合特定抗原的能力。“人源化”Ab保留与原始Ab相似的抗原特异性。

“抗-抗原”Ab是指特异性结合抗原的Ab。例如，抗PD-1 Ab是特异性结合PD-1的Ab，而抗MerTK Ab是特异性结合MerTK的Ab。如本文使用的，“抗PD-1/抗PD-L1”Ab是用于破坏PD-1/PD-L1信号转导途径的Ab，其可以是抗PD-1Ab或抗PD-L1 Ab。

Ab的“抗原结合部分”(也称为“抗原结合片段”)是指保留了特异性结合由完整Ab结合的抗原的能力的一个或多个Ab片段。

Ab的“分箱(Binning)”是指确定抗原特异性Ab文库的表位结合特征的方法。分箱方法通常是基于使用诸如表面等离振子共振(SPR)、酶联免疫测定(ELISA)或流式细胞术这样的技术测量Ab文库中每个Ab与其共同抗原的竞争性结合。为每个Ab创建相对于文库中其他Ab的竞争性阻断谱。使用参考Ab来定义Ab的分箱。如果第二Ab不能与参考抗体同时结合到抗原，则称第二Ab与参考抗体属于同一箱。相反，如果第二Ab能够与参考抗体同时结合抗原，则称第二Ab属于分开的箱。属于相同分箱的Ab通常结合抗原的相同表位区域，即它们可以结合相同或重叠的表位。但是，在某些情况下，同一分箱中的Ab可能结合分开的表位，但结合其表位的一个Ab在空间上阻碍了另一个Ab在其不同表位上的结合。属于不同箱的Ab通常结合分开的表位。

“癌症”指表征为异常细胞在身体中的不受控生长的多种疾病的一个大组。失调的细胞分裂和生长导致恶性肿瘤的形成，其可侵入邻近组织，也可以通过淋巴系统或血流转移至身体的远端部分。

“酪氨酸蛋白激酶Mer”(MerTK；在本领域中也称为例如原癌基因c-Mer、受体酪氨酸激酶MerTK或Mer跨膜受体酪氨酸激酶糖型)是Tyro3/Axl/Mer(TAM)受体酪氨酸激酶(RTK)家族中的跨膜蛋白。它在巨噬细胞、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞和树突细胞(DC)上表达，并且在多种癌症中常常也过表达或被激活，所述癌症包括白血病、非小细胞肺癌、胶质母细胞瘤、黑色素瘤、前列腺癌、乳腺癌、结肠癌、胃癌、垂体腺瘤和横纹肌肉瘤。MerTK结合几种不同的配体、生长停滞特异性6(Gas6)蛋白、蛋白S、tubby、tubby-样蛋白1(Tulp1)和galectin-3，它们均诱导MerTK自磷酸化。如本文所用的术语“MerTK”包括人MerTK(hMerTK)，hMerTK的变体，同工型，物种同源物，如食蟹猴MerTK(cMerTK)和小鼠MerTK(mMerTK)，以及具有至少一个与hMerTK的共同表位的类似物。完整的hMerTK、cMerTK和mMerTK氨基酸序列可分别在

登录号NP_006334.2、XP_005575320.1和NP_032613.1下找到。

术语“免疫疗法”是指通过包括诱导、增强、抑制或另外改变免疫应答的方法治疗患有疾病或处于感染疾病或遭受疾病复发的风险中的受试者。受试者的“治疗(treatment)”或“疗法(therapy)”是指是对受试者进行的任何类型的干预或过程，包括将活性剂施用于受试者，目的在于逆转、减轻、缓解、抑制、减缓或防止与疾病相关的症状、并发症或病症，或生物化学指标的发作、进展、发展、严重程度或复发。

“程序性死亡-1”(PD-1)是指主要在体内之前激活的T细胞上表达的属于CD28家族的免疫抑制受体，并结合两种配体，PD-L1和PD-L2。如本文使用的，术语“PD-1”包括人PD-1(hPD-1)，hPD-1的变体、同工型和物种同系物，以及与hPD-1具有至少一个共同表位的类似物。完整的hPD-1序列可以在

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“程序性死亡配体-1”(PD-L1)是指结合PD-1时下调T细胞激活和细胞因子分泌的PD-1的两种细胞表面糖蛋白配体之一(另一种配体是PD-L2)。如本文使用的，术语“PD-L1”包括人PD-L1(hPD-L1)，hPD-L1的变体、同工型和物种同系物，以及与hPD-L1具有至少一个共同表位的类似物。完整的hPD-L1序列可以在

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“受试者”包括任何人类或非人动物。术语“非人动物”包括但不限于脊椎动物，如非人灵长类、绵羊、狗和啮齿动物，如小鼠、大鼠和豚鼠。在优选实施方案中，受试者是人类。术语“受试者”和“患者”在本文可互换使用。

药物或治疗剂的“治疗有效量”或“治疗有效剂量”是单独或联合另一种治疗剂使用时保护受试者对抗疾病发作或促进疾病消退的药物或活性剂的任何含量，所述疾病消退通过疾病症状严重程度的降低、无疾病症状阶段的频率或持续时间的增加或对由于疾病折磨引起的损伤或残疾的预防或减少来证明。此外，关于治疗的术语“有效的”和“有效性”包括药理有效性和生理安全性。药理有效性是指药物促进患者疾病消退(例如，癌症消退)的能力。生理安全性是指可接受的毒性或由药物施用引起的在细胞、器官和/或生物体层面的其他不良生理作用(不良作用)的水平。可以使用熟练的从业人员已知的各种方法来评价治疗剂的效力，如在临床试验阶段中在人受试者中、在预测在人类中的效力的动物模型系统中，或通过在体外测定中测定活性剂的活性。

作为肿瘤治疗的实例，治疗有效量的抗癌剂优选相对于未治疗的受试者将细胞生长或肿瘤生长抑制至少约20％，优选至少约40％，更优选至少约60％，甚至更优选至少约80％，并且再更优选约100％。在本发明的优选实施方案中，可以观察到肿瘤消退并且持续至少约30天，更优选至少约60天，或甚至更优选至少约6个月。尽管对治疗有效性进行了这些最终测量，但对免疫治疗药物的评估还必须允许“免疫相关”的反应模式。

“免疫相关”反应模式是指经常在接受免疫治疗剂治疗的癌症患者中观察到的临床反应模式，这些免疫治疗剂通过诱导癌症特异性免疫反应或通过改变天然免疫过程产生抗肿瘤作用。该反应模式的特征在于肿瘤负荷的最初增加或新病变的出现之后的有益的治疗效果，这在评估传统化学治疗剂中将被分类为疾病进展，并与药物治疗失败同义。因此，对免疫治疗剂的正确评估可能需要长期监测这些活性剂对目标疾病的影响。

药物的治疗有效量包括“预防有效量”，其是单独或联合另一种治疗剂施用于处于患病风险的(例如患有恶性前病变的受试者，其处于发展为癌症的风险中)或遭受疾病复发的受试者时，抑制了疾病(例如癌症)的发展或复发的任何药物含量。在优选实施方案中，预防有效量完全防止疾病的发展或复发。“抑制”疾病的发展或复发是指降低疾病的发展或复发的可能性，或完全防止疾病的发展或复发。

选择性词(例如，“或”)的使用应当理解为表示选择对象中的任一个、两个或其任意组合。如本文使用的，不定冠词“一(a)”或“一个(an)”应当理解是指“一个或多个”任何所述的或列举的成分。

术语“约”是指对于特定值、组成或特征在可接受误差范围内的数值、组成或特征，如通过本领域普通技术人员所确定的，其将部分取决于怎样测量或测定数值、组成或特征，即，测量系统的限制。例如，“约”可以表示表示正负20％的范围，更通常是正负10％的范围。在本申请和权利要求中提供特定的值、组成或特性时，除非另有说明，否则应将“约”的含义假定为在对于该特定的值、组成或特征的可接受误差范围内。

术语“基本上相同的”或“实质上相同的”是指两个或更多个数值、组成或特征之间足够高的相似度，使得本领域技术人员认为这些值、组成或特征之间的差异在所测量的属性背景范围内具有很小的或没有生物学和/或统计学显著性。被测量的数值之间的差异可以例如小于约50％，优选地小于约30％，并且更优选地小于约10％。

如本文所述的，任何浓度范围、百分比范围、比率范围或整数范围理解为包括所述范围内的任何整数值，并且合适时，包括其分数(如整数的十分之一和百分之一)，除非另外指出。

在以下分段中进一步详细地描述本发明的各个方面。

抗MerTK mAb

在某些实施方案中，本公开涉及分离的Ab，特别是mAb或其抗原结合部分，其特异性结合细胞表面上表达的MerTK。mAb与其结合的MerTK包括hMerTK，其序列如SEQ ID NO：259所示；cMerTK，其序列如SEQ ID NO：260所示；和/或mMerTK，其序列如SEQ ID NO：261所示。

通过抗MerTK mAb抑制胞葬作用

巨噬细胞的胞葬作用有助于肿瘤微环境的免疫抑制和耐受(Nguyen等，2014；Akalu等人，2017)，并且凋亡细胞清除中涉及的通路的抑制可能会增强抗肿瘤发生的反应。确实，已经证实了胞葬作用的阻断导致体内和体外免疫抑制因子的减少，以及增强的巨噬细胞介导的T细胞增殖(Barker等，2002；Bondanza等，2004)。鉴于MerTK在介导胞葬作用中的关键作用，分离了抑制胞葬作用的拮抗性配体阻断性抗MerTK Ab(参见实施例2)，以评估此类Ab是否可增强上调T细胞反应的药剂(如抗PD-1 Ab)的抗肿瘤功效。胞葬作用的抑制剂还可以与在肿瘤微环境中诱导凋亡反应的疗法(如某些化疗化合物和放射疗法)协同作用(Jinushi等，2013)。

所公开的发明的某些方面包括抑制由表达MerTK的细胞的胞葬作用的抗MerTK Ab或其抗原结合部分。在某些实施方案中，本发明的抗MerTK Ab或其抗原结合部分抑制由表达hMerTK的细胞的胞葬作用，IC₅₀为约5nM或更低；优选约1nM或更低；或更优选约0.1nM或更低。在某些实施方案中，抗MerTK Ab以约0.01nM至约1nM的IC₅₀抑制胞葬作用。在某些其他实施方案中，抗MerTK Ab以约0.01nM至约0.7nM的IC₅₀抑制胞葬作用。在某些优选的实施方案中，抗MerTK Ab以约0.04nM至约0.7nM的IC₅₀抑制胞葬作用。在更优选的实施方案中，抗MerTK Ab以约0.04nM至约0.1nM的IC₅₀抑制胞葬作用。这些IC₅₀值是基于实施例2中所述的测定方法。

通过抗MerTK mAb抑制MerTK/配体信号转导

在某些实施方案中，本发明的mAb或其抗原结合部分抑制Gas6与MerTK(例如，hMerTK)的结合，并抑制MerTK/Gas6信号转导。在某些实施方案中，抗MerTK Ab或其抗原结合部分抑制MerTK/Gas6信号转导，IC₅₀为约50nM或更低；约10nM或更低；约5nM或更低；优选约1nM或更低；更优选约0.5nM或更低；甚至更优选约0.1nM或更低。在某些实施方案中，抗MerTK Ab以约0.01nM至约10nM的IC₅₀抑制MerTK/Gas6信号转导。在某些其他实施方案中，抗MerTK Ab以约0.05nM至约6nM的IC₅₀抑制MerTK/Gas6信号转导。在某些优选实施方案中，抗MerTK Ab以约0.08nM至约2nM的IC₅₀抑制MerTK/Gas6信号转导。在更优选的实施方案中，抗MerTK Ab以约0.2nM至约2nM的IC₅₀抑制MerTK/Gas6信号转导。这些IC₅₀值是基于实施例2中所述的测定方法。

以高亲和力结合MerTK的抗MerTK mAb

本发明的某些抗MerTK mAb以高亲和力结合MerTK。Ab通常以高亲和力特异性结合其同源抗原，通过1μM至10pM或更低的解离常数(K_D)来反应。通常认为任何高于约100μM的K_D表示是非特异性结合。如本文使用的，“特异性结合”抗原的IgG Ab是指以高亲和力与抗原和基本上相同的抗原结合的Ab，这表示具有约100nM或更低的K_D，优选约10nM或更低，更优选约5nM或更低，并且甚至更优选约50nM至0.1nM或更低，但不以高亲和力结合不相关的抗原。如果呈现出与给定抗原高度的序列同一性，例如，如果呈现出与给定抗原的序列至少80％，至少90％，优选至少95％，更优选至少97％，或甚至更优选至少99％的序列同一性，则抗原与给定抗原“基本上相同”。例如，特异性结合hMerTK的Ab还与来自某些灵长类物种的MerTK抗原具有交叉反应性，但与来自某些啮齿动物物种的MerTK抗原或除了MerTK以外的其他抗原(例如，Axl或PD-1抗原)不交叉反应。

如本文使用的，术语“K_D”旨在是指针对特定Ab-抗原相互作用的解离常数，其获自k_off与k_on的比例(即，k_off/k_on)，并且表示为摩尔浓度(例如，nM)。术语“k_on”是指Ab与其抗原相互作用结合的结合速率或“on速率”，而术语“k_off”是指Ab-抗原复合物的解离速率。可以使用本领域非常完善的方法如表面等离子体共振(SPR)或生物层干涉仪(BLI；ForteBio，Fremont，CA)，来测定Ab的K_D值。通过不同方法确定的单个Ab的K_D值可能会发生很大的变化，例如，高达1000倍。因此，在比较不同Ab的K_D值时，重要的是使用相同的方法确定这些K_D值。在没有明确说明的地方，并且除非上下文另有说明，否则本文公开的Ab结合的K_D值是使用

生物传感器系统(GE Healthcare，Chicago，IL)通过SPR测定的。

在本发明公开的某些实施方案中，抗MerTK mAb或其抗原结合部分以以下KD结合人MerTK：约100nM，或约50nM，或更低；优选约10nM，或约5nM，或更低；更优选约1nM，或约0.5nM，或更低；并且甚至更优选约0.1nM，或约0.05nM，或更低。在某些实施方案中，抗MerTKmAb或其抗原结合部分以约100nM至约0.1nM的KD结合人MerTK。在某些优选实施方案中，KD为约50nM至约0.5nM。在更优选的实施方案中，抗MerTK mAb或其抗原结合部分以约10nM至约1nM的KD结合人MerTK。在其他更优选的实施方案中，mAb或其抗原结合部分以约6nM至约2nM的KD结合人MerTK。

在选择抗MerTK HuMAb中，针对与cMerTK的交叉反应性筛选结合hMerTK的杂交瘤。因此，本公开提供了以高亲和力特异性结合cMerTK的抗MerTK mAb或其抗原结合部分。在某些实施方案中，抗MerTK mAb或其抗原结合部分以以下K_D结合cMerTK：约100nM，或约50nM，或更低；优选约10nM，或约5nM，或更低；更优选约1nM，或约0.5nM，或更低；并且甚至更优选约0.1nM或更低。在某些实施方案中，抗MerTK mAb或其抗原结合部分以约100nM至约0.1nM的K_D结合cMerTK。在某些优选实施方案中，抗MerTK mAb或其抗原结合部分以约50nM至约0.5nM的K_D结合cMerTK。在更优选的实施方案中，抗MerTK mAb或其抗原结合部分以约10nM至约1nM的K_D结合cMerTK。在其他更优选的实施方案中，mAb或其抗原结合部分以约5nM至约1nM的K_D结合cMerTK。

还产生了特异性结合mMerTK的MAb。因此，本公开提供了以以下K_D特异性结合mMerTK的mAb或其抗原结合部分：约100nM，或约50nM，或更低；优选约10nM，或约5nM，或更低；更优选约1nM，或约0.5nM，或更低；并且甚至更优选约0.1nM或更低。在某些实施方案中，抗MerTK mAb或其抗原结合部分以约100nM至约0.1nM的K_D结合mMerTK。在某些优选实施方案中，抗MerTK mAb或其抗原结合部分以约50nM至约0.5nM的K_D结合mMerTK。在更优选的实施方案中，抗MerTK mAb或其抗原结合部分以约10nM至约1nM的K_D结合mMerTK。在其他更优选的实施方案中，mAb或其抗原结合部分以约5nM至约1nM的K_D结合mMerTK。

本文公开的某些抗MerTK mAb，例如，moMAb 2D9和4E9，及其人源化形式，2L105和4M60，以高亲和力与所有m-、h-和cMerTK交叉反应，即，特异性结合。其他mAb，例如，HuMAb1B4、10K11、22I16、25J60、25J80、8N42和4K10与h-和cMerTK交叉反应，但不结合mMerTK。还有其他mAb，例如，moMAb 16B9，特异性结合mMerTK，但不结合h-和cMerTK。因此，本公开提供了与h-和cMerTK两者交叉反应的抗MerTK mAb或其抗原结合部分；与h-和mMerTK两者交叉反应的抗MerTK mAb或其抗原结合部分；以及与h-、c-和mMerTK交叉反应的抗MerTK mAb或其抗原结合部分。在某些实施方案中，抗MerTK或其抗原结合部分以以下K_D特异性结合h-、c-和mMerTK中的每一种：约70nM或更低，优选约50nM至约1nM；并且更优选约25nM至约3nM。在某些其他实施方案中，抗MerTK mAb或其抗原结合部分以以下K_D特异性结合至少h-和cMerTK两者：约70nM或更低；优选约50nM至约1nM；并且更优选约25nM至约2nM。

抗MerTK mAb的分箱以及这些Ab与特异性表位的结合

使用hMerTK的分箱实验鉴定了3个已经分配了MerTK Ab的表位箱。将经分箱的大部分抗MerTK HuMAb(13个中11个)分配给了箱1。通过氢-氘交换质谱(HDX-MS)和/或酵母展示进行的表位作图将箱1的表位映射到hMerTK的第一个Ig结构域，根据特定的克隆，在跨越大约氨基酸105至165的线性区域内。本公开了提供了特异性结合hMerTK上的箱1表位的mAb，或其抗原结合部分。在某些实施方案中，箱1表位位于跨越大约氨基酸残基105至165的区域内的hMerTK的第一个Ig结构域中，如通过酵母展示和/或氢-氘交换质谱(HDX-MS)表位作图确定的。在某些其他实施方案中，箱1表位位于跨越大约氨基酸126至155的hMerTK的区域内，如通过HDX-MS表位作图测定的。在更多实施方案中，如通过HDX-MS表位作图测定的，箱1表位包括氨基酸残基126至155中的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、十个、二十个或全部。

将分箱的抗MerTK HuMab之一，25B10，分配给箱2。将抗-hMerTK HuMAb优化以减轻序列负担(liabilities)、增强结合亲和力并还原为种系氨基酸(实施例2)后，由mAb 25B10衍生了多个mAb，其中mAb 25J60和25J80包括在表1和表2中。MoMAbs 2D9和4E9及其人源化变体2L105和4M60也分别分配给箱2。通过HDX-MS和/或酵母展示进行的表位作图将箱2表位作图于hMerTK的第二个Ig结构域，根据特定的克隆，在跨越大约氨基酸195至270的线性区域内。

所公开的发明包括分离的Ab，优选mAb，或其抗原结合部分，其特异性结合hMerTK上的箱2表位。在某些实施方案中，箱2表位位于跨越大约氨基酸残基195至270的区域内的hMerTK的第二个Ig结构域中，如通过酵母展示和/或HDX-MS表位作图确定的。在某些其他实施方案中，箱2表位位于跨越大约氨基酸残基231至249(²³¹WVQNSSRVNEQPEKSPSVL²⁴⁹)的hMerTK的区域内，如通过HDX-MS表位作图确定的。在更多实施方案中，箱2表位包括氨基酸残基N234、S236、R237、E240、Q241、P242和G269中的一个、两个、三个、四个、五个、六个或全部，如通过酵母展示表位作图确定的。在某些优选实施方案中，箱2表位包括氨基酸残基N234、S236、R237、E240、Q241、P242和G269。在其他实施方案中，箱2表位包括氨基酸残基231至249中的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、十个或全部和氨基酸残基G269，如通过HDX-MS和酵母展示表位作图确定的。

箱1和箱2表位区域与基于Gas6/Axl晶体结构的同源性建模的配体阻断相一致。但是，使用与箱1或箱2表位结合的代表性mAb对食蟹猴进行初步毒理学研究的结果表明结合箱1表位的两种不同mAb会对猴子造成严重的不良反应，特别是周围神经病变，而结合箱2表位的mAb耐受性良好。因此，结合箱2表位的抗MerTK mAb似乎对于治疗用途是优选的。在优选实施方案中，抗MerTK mAb结合箱2表位。

将分箱的单个抗MerTK HuMAb分配给箱3。本公开提供了特异性结合hMerTK上的箱3表位的Ab，优选mAb，或其抗原结合部分。在某些实施方案中，箱3表位位于跨越大约氨基酸残基420至490的区域内的hMerTK的Fn结构域中，如通过酵母展示和/或HDX-MS表位作图确定的。

与参照Ab交叉竞争结合MerTK的抗MerTK mAb

所公开发明的范围内还包括分离的Ab，优选mAb，或其抗原结合部分，其特异性结合细胞表面上表达的hMerTK并与参照Ab或其参照抗原结合部分交叉竞争结合hMerTK。一对Ab“交叉竞争”结合抗原(例如，MerTK)的能力表明第一Ab与第二Ab结合基本上相同的抗原表位区并在空间上阻碍第二Ab与特定表位区的结合，并且反之，第二Ab与第一Ab结合基本上相同的抗原表位区并在空间上阻碍第一Ab结合该表位区。因此，测试Ab竞争性地抑制例如mAb 2L105与hMerTK的结合证明了测试Ab与mAb 2L105结合基本上相同的人PD-1的表位区。

如果第一Ab将第二Ab与抗原的结合降低了至少约40％，则认为第一Ab与第二Ab结合“基本上相同的表位”。优选地，第一Ab将第二Ab与抗原的结合降低超过约50％(例如，至少约60％或至少约70％)。在更优选的实施方案中，第一Ab将第二Ab与抗原的结合降低超过约70％(例如，至少约80％，至少约90％，或约100％)。第一和第二Ab的顺序可以颠倒，即，“第二”Ab可以是首先结合到表面，而此后将“第一”在“第二”Ab存在下接触表面。如果观察到与抗原结合的竞争性降低，与其中将Ab添加至固定化抗原的顺序无关，则认为Ab“交叉竞争”。

由于结合基本上相同的抗原表位区(如MerTK受体)，预期交叉竞争Ab具有与参照Ab特性非常相似的功能特性。交叉竞争的程度越高，功能特性就越相似。例如，如果两个交叉竞争的Ab各自抑制彼此与表位的结合至少约80％，则预期它们具有实质上相同的功能特性。如果按竞争解离常数(K_D)测量，交叉竞争的Ab对于结合表位呈现出相似的亲和力，则预期这种功能的相似性甚至更接近。

可以使用重组抗原分子或细胞表面表达的抗原分子，在标准抗原结合测定(包括

分析、ELISA测定或流式细胞术)中基于其可检测地竞争的能力来容易地鉴定交叉竞争抗抗原Ab。例如，一种简单的用来确定测试Ab是否与HuMAb 25J80竞争结合人MerTK的竞争测定可以涉及：(1)测量以饱和浓度施加的25J80与其上固定了人MerTK的

芯片(或其他适用于SPR分析的合适介质)的结合，和(2)测量25J80与人MerTK包被的之前已经结合了测试Ab的

芯片(或其他合适的介质)的结合。比较了测试Ab存在和不存在的情况下，25J80与MerTK-1包被的表面的结合。在测试Ab存在的情况下，25J80的结合显著(例如，超过约40％)降低，表明两种Ab识别基本上相同的表位，使得它们竞争结合MerTK靶标。第一Ab与抗原的结合被第二Ab抑制的百分比可以计算为：[1-(检测到的第二Ab存在时第一Ab的结合)/(检测到的第二Ab不存在时第一Ab的结合)]×100。为了确定Ab是否交叉竞争，重复竞争性结合测定，除了在25J80存在的情况下，测量测试Ab与MerTK包被的芯片的结合。

本文公开的任何抗MerTK Ab可以作为交叉竞争测定中的参照Ab。在某些实施方案中，参照Ab包括：

(a)包含具有SEQ ID NO：217、221、225、229、233、237、241、245、249、253、255或257所示序列的连续连接的氨基酸的V_H；和

(b)包含具有SEQ ID NO：218、222、226、230、234、238、242、246、250、254、256或258所示序列的连续连接的氨基酸的V_L；

在更多实施方案中，参照Ab或其参照抗原结合部分包括：

结构限定的抗MerTK mAb

本公开还提供了分离的Ab，优选mAb，或其抗原结合部分，其特异性结合细胞表面上表达的hMerTK，并包含CDR1、CDR2和CDR3结构域，在以下每个中：

已经开发了不同的方法来描绘Ab内的CDR结构域。除了广泛使用的Kabat定义，已经使用其他定义以寻求解决Kabat定义的缺陷，包括Chothia、AbNum、AbM、contact和IMGT定义。

Kabat和同事(Wu和Kabat，1970；Kabat等，1983)的方法是基于这样的假设：CDR包括Ab中变化最大的位置，并且因此可以通过比对当时可用的相当有限数量的Ab序列进行鉴定。基于这种比对，Kabat等介绍了一种针对高变区中的残基的编号方案，并确定了哪个位置标记每个CDR的开始和结尾(https://bioinf.org.uk/abs/simkab.html)。

Chothia定义是基于对少量Ab结构的分析，以确定Ab序列与其CDR的结构环区域之间的关系(Chothia等，1987；1989；Al-Lazikani等，1997；https://bioinf.org.uk/abs/chothia.html)。确定了FR和CDR的边界，并且后者已经显示出基于CDR和侧翼FR中关键位置上某些残基的存在而采用受限的构象集。所得到的Chothia编号方案几乎与Kabat方案相同，但是基于结构的考虑，将插入放置在V_LCDR1和V_H CDR1中的不同位置。随着更多实验数据的获得，CDR的边界一直在进行重新分析和重新定义。Abhinandan和Martin(2008)在结构范围中分析了Ab序列比对，并发现了手动注释的Kabat数据库中大约10％的序列包含错误或不一致。他们提出了Chothia方案的校正版本，其在结构上校正了整个CDR和框架，并开发了以自动且可靠的方式适用于Kabat、Chothia和改进的Chothia编号的软件工具(AbNum；可从https://www.bioinf.org.uk/abs/abnum/获得)。另一种方法，即AbM定义，代表了Kabat和Chothia定义之间的折衷，并通过Oxford Molecular Group’s AbM Ab建模软件来使用(https://www.bioinf.org.uk/abs；Martin等，1989)。

contact定义是基于对Protein Data Bank(https://bioinf.org.uk/abs/；MacCallum等，1996)中可用的复杂晶体结构中Ab和抗原之间的接触的分析。

定义CDR的最新尝试是IMGT数据库的(Lefranc等(2003；https://www.imgt.org))，其收集有关Ig、T细胞受体(TcR)和主要组织相容性复合体(MHC)分子的核苷酸序列信息。它基于比对5000多个Ig和TcR可变区序列，提出了一个统一的用于Ig和TcR序列的编号系统。

已经使用Kabat、Chothia和IMGT定义(参见表3-14)描绘了本文公开的抗MerTKmAb的CDR。对于任何给定的mAb，可以使用表3-14中所示的Kabat、Chothia和IMGT定义及其任何组合来鉴定CDR。因此，本公开提供了分离的Ab，优选mAb，其包含与表3-14中所示的CDR序列相对应的六个CDR组。

例如，基于mAb 1B4，本公开提供了分离的Ab，优选mAb，或其抗原结合部分，其包含以下如Kabat、Chothia和/或IMGT方法定义的CDR结构域：

(a)包含具有SEQ ID NO：1-3任一所示序列的连续连接的氨基酸的重链可变区CDR1；

(b)包含具有SEQ ID NO：4-6任一所示序列的连续连接的氨基酸的重链可变区CDR2；

(c)包含具有SEQ ID NO：7-9任一所示序列的连续连接的氨基酸的重链可变区CDR3；

(d)包含具有SEQ ID NO：10-12任一所示序列的连续连接的氨基酸的轻链可变区CDR1；

(e)包含具有SEQ ID NO：13-15任一所示序列的连续连接的氨基酸的轻链可变区CDR2；和

(f)包含具有SEQ ID NO：16-18任一所示序列的连续连接的氨基酸的轻链可变区CDR3。

本公开还提供了分离的Ab，优选mAb，或其抗原结合部分，其包含以下通过IMGT方法定义的CDR结构域：

(a)包含具有SEQ ID NO：3所示序列的连续连接的氨基酸的重链可变区CDR1；

(b)包含具有SEQ ID NO：6所示序列的连续连接的氨基酸的重链可变区CDR2；

(c)包含具有SEQ ID NO：9所示序列的连续连接的氨基酸的重链可变区CDR3；

(d)包含具有SEQ ID NO：12所示序列的连续连接的氨基酸的轻链可变区CDR1；

(e)包含具有SEQ ID NO：15所示序列的连续连接的氨基酸的轻链可变区CDR2；和

(f)包含具有SEQ ID NO：18所示序列的连续连接的氨基酸的轻链可变区CDR3。

作为另一个实例，基于mAb 25J80，本公开提供了分离的Ab，优选mAb，或其抗原结合部分，其包含以下通过Kabat、Chothia和/或IMGT方法定义的CDR结构域：

(a)包含具有SEQ ID NO：73-75任一所示序列的连续连接的氨基酸的重链可变区CDR1；

(b)包含具有SEQ ID NO：76-78任一所示序列的连续连接的氨基酸的重链可变区CDR2；

(c)包含具有SEQ ID NO：79-81任一所示序列的连续连接的氨基酸的重链可变区CDR3；

(d)包含具有SEQ ID NO：82-84任一所示序列的连续连接的氨基酸的轻链可变区CDR1；

(e)包含具有SEQ ID NO：85-87任一所示序列的连续连接的氨基酸的轻链可变区CDR2；和

(f)包含具有SEQ ID NO：88-90任一所示序列的连续连接的氨基酸的轻链可变区CDR3。

(a)包含具有SEQ ID NO：73所示序列的连续连接的氨基酸的重链可变区CDR1；

(b)包含具有SEQ ID NO：76所示序列的连续连接的氨基酸的重链可变区CDR2；

(c)包含具有SEQ ID NO：79所示序列的连续连接的氨基酸的重链可变区CDR3；

(d)包含具有SEQ ID NO：82所示序列的连续连接的氨基酸的轻链可变区CDR1；

(e)包含具有SEQ ID NO：85所示序列的连续连接的氨基酸的轻链可变区CDR2；和

(f)包含具有SEQ ID NO：88所示序列的连续连接的氨基酸的轻链可变区CDR3。

尽管是在没有可用的关于Ab的结构信息时开发出来的，但Kabat定义是最常用的预测CDR结构域的方法。在没有明确说明的情况下，并且除非上下文另有说明，否则本文公开的CDR已经使用Kabat定义进行了定义。

所公开的发明还包括分离的Ab，优选mAb，或其抗原结合部分，其特异性结合细胞表面上表达的hMerTK，其中分离的Ab或其抗原结合部分包含：

本发明进一步包括分离的Ab，优选mAb，或其抗原结合部分，其特异性结合细胞表面上表达的hMerTK，其中分离的Ab或其抗原结合部分包含：

(a)包含具有SEQ ID NO：219所示序列的连续连接的氨基酸的重链和包含具有SEQID NO：220所示序列的连续连接的氨基酸的轻链；

(b)包含具有SEQ ID NO：223所示序列的连续连接的氨基酸的重链和包含具有SEQID NO：224所示序列的连续连接的氨基酸的轻链；

(c)包含具有SEQ ID NO：227所示序列的连续连接的氨基酸的重链和包含具有SEQID NO：228所示序列的连续连接的氨基酸的轻链；

(d)包含具有SEQ ID NO：231所示序列的连续连接的氨基酸的重链和包含具有SEQID NO：232所示序列的连续连接的氨基酸的轻链；

(e)包含具有SEQ ID NO：235所示序列的连续连接的氨基酸的重链和包含具有SEQID NO：236所示序列的连续连接的氨基酸的轻链；

(f)包含具有SEQ ID NO：239所示序列的连续连接的氨基酸的重链和包含具有SEQID NO：240所示序列的连续连接的氨基酸的轻链；

(g)包含具有SEQ ID NO：243所示序列的连续连接的氨基酸的重链和包含具有SEQID NO：244所示序列的连续连接的氨基酸的轻链；

(h)包含具有SEQ ID NO：247所示序列的连续连接的氨基酸的重链和包含具有SEQID NO：248所示序列的连续连接的氨基酸的轻链；或

(i)包含具有SEQ ID NO：251所示序列的连续连接的氨基酸的重链和包含具有SEQID NO：252所示序列的连续连接的氨基酸的轻链。

包含具有与上述任何抗MerTK Ab的氨基酸序列高度相似或同源的氨基酸序列的V_H和V_L区的并且保留这些Ab的功能特性的抗MerTK抗体也适用于本发明的方法。例如，合适的Ab包括包含V_H和V_L区的mAb，每个V_H和V_L区包含具有分别与SEQ ID No.245和/或246所示氨基酸序列至少80％相同的序列的连续连接的氨基酸。在更多实施方案中，例如，V_H和/或V_L氨基酸序列分别呈现出与SEQ ID No.245和/或246所示序列的至少85％，90％，95％或99％的同一性。如本文所用的，两个氨基酸序列之间的序列同一性百分比是该序列相对于所比较的序列的长度共有的相同位置数的函数(即，％同一性＝相同位置数/总位置数×100)，考虑了任何缺口的数目以及每个这样的缺口的长度，引入以最大化两个序列之间的序列同一性的程度。可以使用本领域普通技术人员公知的数学算法来完成序列的比较和确定两个序列之间的同一性百分比。

在某些实施方案中，分离的抗MerTK Ab或其抗原结合部分包含其是人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型的重链恒定区。在某些优选实施方案中，重链恒定区是人IgG4同种型的。在其他优选实施方案中，分离的抗MerTK Ab或其抗原结合部分是人IgG1同种型的。在某些实施方案中，分离的抗MerTK Ab是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型的全长Ab。在更多实施方案中，全长Ab是IgG1或IgG4同种型的。

抗MerTK Ab的功能性抗原结合部分

本公开提供的抗MerTK Ab除了全长Ab以外还包括抗原结合片段。已经充分证明了Ab的抗原结合功能可以通过全长Ab的片段来执行。术语Ab的“抗原结合部分”内涵盖的结合片段的实例包括：(i)Fab片段，由V_L，V_H，C_L和C_H1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab’)₂片段，在铰链区通过二硫键连接的两个Fab片段组成的二价片段；(iii)由V_H和C_H1结构域组成的Fd片段；(iv)由Ab单臂的V_L和V_H结构域组成的Fv片段；(v)单结构域Ab(sdAb)或纳米抗体，由Ab的单个单体可变结构域组成。除常规Ab外，骆驼科动物(如骆驼、羊驼和美洲驼)和软骨鱼类(如鲨鱼和鳐)还包含由重链同型二聚体组成的重链Ab(hcAb)的子集，所述重链同型二聚体包含三个CDR，但缺乏轻链。第一种sdAb最初是从骆驼科动物(这些被称为V_HH片段)或软骨鱼(V_NAR片段)中发现的hcAb工程化而成的，但也可以通过分裂来自常规Ab的二聚可变结构域来产生。除衍生自重链可变结构域的sdAb外，衍生自轻链的纳米抗体也已显示出选择性地结合特定的抗原。

Ab片段，最初通过用酶(如木瓜蛋白酶和胃蛋白酶)的蛋白水解获得，随后工程化成单价和多价抗原结合片段。例如，尽管Fv片段的两个结构域，V_L和V_H，通过分开的基因编码，但它们可以使用重组方法通过合成的接头肽连接在一起，所述合成的接头肽能够使它们制成单个蛋白链，其中V_L和V_H区配对形成称为单链可变片段(scFv)的单价分子。可以通过连接单个肽链内的两个scFv来工程化二价或双价scFv(二-scFv或双-scFv)，称为串联scFv，其含有两个V_H和两个V_L区。可以使用少于10个氨基酸的接头肽来形成scFv二聚体和高阶多聚体，少于10个氨基酸的肽接头对于两个可变区折叠在一起太短，这迫使scFv二聚化并产生双体抗体(diabody)或形成其他多聚体。双体抗体已经显示出以高于相应scFv高得多的亲和力结合其同源抗原，解离常数比scFv的K_D值低40倍。非常短的接头(≤3氨基酸)导致三价三链抗体(triabody)或四价四链抗体(tetrabody)的形成，其呈现出比双体抗体更高的针对其抗原的亲和力。其他变体包括迷你抗体(minibodies)，其是scFv-C_H3二聚体，和较大的scFv-Fc片段(scFv-C_H2-C_H3二聚体)，并且甚至分离的CDR可以呈现出抗原结合功能。使用本领域技术人员已知的常规重组技术对这些Ab片段工程化，并针对实用性以与完整Ab相同的方式来筛选片段。Ab及相关变体的所有上述蛋白水解和工程化片段(对于更多详细内容，参见Hollinger和Hudson，2005；Olafsen和Wu，2010)均包含在术语Ab的“抗原结合部分”内。

在所公开发明的某些方面中，分离的抗MerTK Ab的抗原结合部分是Ab片段或单链Ab。在某些实施方案中，Ab片段选自Fab、F(ab’)₂、Fd和Fv片段、sdAb、单链可变片段(scFv)、二价scFv(二-scFv)和双价scFv(双-scFv)、双抗、迷你抗体和CDR。在某些优选实施方案中，Ab片段选自Fab、F(ab’)₂、Fd和Fv片段，以及单链可变片段(scFv)。

在某些实施方案中，分离的抗MERTK Ab或其抗原结合部分是人Ab或其片段。在其他实施方案中，是人源化Ab或其片段。在更多实施方案中，是嵌合Ab或其片段。在其他实施方案中，分离的抗MERTK Ab或其抗原结合部分是小鼠Ab或其片段。对于施用于人受试者，Ab优选是嵌合Ab，或更优选，人源化或人Ab。这样的嵌合、人源化、人或小鼠mAb可以通过本领域公知的方法来制备和分离。

抗MerTK免疫缀合物

在另一个方面中，本发明涉及连接治疗剂(如细胞毒素或放射性同位素)的本文公开的任一种分离的抗MerTK Ab，或其抗原结合部分。这样的缀合物在本文中称为“免疫缀合物”。可以使用本领域可利用的接头技术，将细胞毒素与本发明的Ab缀合。用于制备放射性免疫缀合物的方法在本领域中也已建立。

双特异性分子

在另一个方面中，本发明涉及包含连接具有不同于抗MerTK mAb或其抗原结合部分的结合特异性的结合结构域的本文公开的任一种分离的抗MerTK Ab或其抗原结合部分的双特异性分子。所述结合结构域可以是功能性分子，例如，另一种Ab，或Ab的抗原结合部分，或受体的配体，使得所产生的双特异性分子结合至少两个不同的结合位点或靶分子。

编码抗MerTK Ab的核酸和表达Ab的用途

本公开的另一个方面涉及编码本发明的分离的抗MerTK Ab的核酸。本公开提供了分离的编码本文所述的任何抗MerTK Ab或其抗原结合部分的核酸。“分离的”核酸是指显著不同的核酸物质组成，即，具有与存在于自然界的核酸截然不同的化学身份、性质和效用。例如，分离的DNA，与天然DNA不同，是天然DNA的独立部分，而不是自然界中发现的较大结构复合物染色体的组成部分。此外，与天然DNA不同，分离的DNA可以用作PCR引物或杂交探针，特别是用于测量基因表达和检测生物标志物基因或突变以诊断疾病或预测治疗剂的功效。使用本领域公知的标准技术，也可以纯化分离的核酸以使其基本上不含其他细胞组分或其他污染物，例如其他细胞核酸或蛋白质。

可以使用标准分子生物学技术获得本发明的核酸。对于由杂交瘤表达的Ab(例如，如实施例1中所述的，从携带人Ig基因的转基因小鼠制备的杂交瘤)，可以通过标准PCR扩增技术获得编码由杂交瘤产生的Ab的轻链和重链或可变区的cDNA。一旦获得了编码V_H和V_L片段的DNA片段，就可以使用标准重组DNA技术进一步操纵这些DNA片段，例如，将可变区DNA转换成全长Ab链基因、Fab片段基因或scFv基因。对于从Ig基因库获得的Ab(例如，使用噬菌体展示技术)，可以从该库中回收编码Ab的核酸。

本发明的核酸可以是例如RNA或DNA，如cDNA或基因组DNA。在优选的实施方案中，核酸是cDNA。

本公开还提供了表达载体，其包含编码抗MerTK Ab或其抗原结合部分的分离核酸。本公开进一步提供了包含所述表达载体的宿主细胞。真核细胞，且最优选哺乳动物宿主细胞，优选作为用于表达Ab的宿主细胞，因为这种真核细胞，且特别是哺乳动物细胞，比原核细胞更可能装配和分泌正确折叠且具有免疫活性的Ab。用于表达本发明的重组Ab的优选哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(Kaufman和Sharp，1982)、NSO骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。

宿主细胞可以用于制备抗MerTK mAb或其抗原结合部分的方法中，所述方法包括在宿主细胞中表达mAb或其抗原结合部分并从宿主细胞分离mAb或其抗原结合部分。宿主细胞可以离体或在体内使用。可以将编码Ab重链和轻链的DNA插入分开的表达载体，或更常见地，将两者都插入同一载体中。通过将编码这些可变区的DNA插入已经编码所需同种型的重链和轻链恒定区的表达载体中，Ab的V_H和V_L区段可用于形成任何同种型的全长Ab，使得V_H区段可操作地连接载体内的一个或多个C_H区段，并且Vκ区段与载体内的C_L区段可操作地连接。

本发明的另一个方面涉及包括人Ig重链和轻链转基因的转基因小鼠，其中小鼠表达本文公开的任何抗MerTK HuMAb。本发明还包括从所述小鼠制得的杂交瘤，其中所述杂交瘤产生HuMAb。

适用于所公开的治疗方法中的抗MerTK Ab

适用于本文公开的方法中的抗MerTK Ab是以高特异性和亲和力特异地结合细胞表面上表达的MerTK的分离的Ab，优选mAb或其抗原结合部分。在某些优选实施方案中，抗MerTK Ab与hMerTK和cMerTK两者交叉反应，这促进了Ab在食蟹猴中的毒理学研究。在某些实施方案中，抗MerTK Ab与hMerTK、cMerTK和mMerTK交叉反应。在某些实施方案中，抗MerTKAb或其抗原结合部分抑制Gas6与MerTK的结合并抑制MerTK/Gas6信号转导。在某些优选实施方案中，抗MerTK Ab或其抗原结合部分抑制由表达MerTK的细胞的胞葬作用。在某些实施方案中，抗MerTK Ab或其抗原结合部分结合位于跨越大约氨基酸105至165的区域内的hMerTK的表位、位于跨越氨基酸195至270的区域内的表位或位于跨越大约氨基酸420至490的区域内的表位。在某些优选实施方案中，抗MerTK Ab或其抗原结合部分结合位于跨越大约氨基酸195至270的区域内的hMerTK的表位，或更具体地位于跨越大约氨基酸231至249的区域内的表位。在其他优选实施方案中，抗MerTK Ab或其抗原结合部分结合包含残基N234、S236、R237、E240、Q241、P242和G269中的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个或全部的hMerTK的表位。再在其他优选实施方案中，抗MerTK Ab或其抗原结合部分在降低体内癌细胞生长中与检查点抑制剂(如抗-PD-1/抗-PD-L1 Ab)协同相互作用。如果这些Ab组合的抗肿瘤功效大于每个Ab单独显示的抗肿瘤功效之和，则在本文中认为Ab是协同相互作用的。

尽管本文主要使用抗PD-1 Ab证明了抗MerTK Ab和检查点抑制剂联合治疗的功效，但已鉴定出几种其他调节T细胞应答的共刺激性和抑制性受体和配体。刺激性受体的实例包括诱导性T细胞共刺激物(ICOS)、CD137(4-1BB)、CD134(OX40)、CD27、糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白(GITR)和疱疹病毒进入介体(HVEM)，而抑制性受体除PD-1/PD-L1以外，包括细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)、B和T淋巴细胞衰减剂(BTLA)、T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域3(TIM-3)、淋巴细胞激活基因3(LAG-3)、杀伤免疫球蛋白样受体(KIR)、腺苷A2a受体(A2aR)、杀伤细胞凝集素样受体G1(KLRG-1)、自然杀伤细胞受体2B4(CD244)、CD160、具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)以及T细胞激活的V结构域Ig抑制剂的受体(VISTA)(Mellman等，2011；Pardoll，2012；Baitsch等，2012)。这些受体及其配体为设计用于刺激免疫反应或预防免疫反应的抑制从而攻击肿瘤细胞的治疗剂提供了靶标(Weber，2010；Mellman等，2011；Pardoll，2012)。刺激性受体或受体配体被激动剂靶向，而抑制性受体或受体配体被阻断剂靶向。因为许多免疫检查点是由配体-受体相互作用引发的，所以它们很容易被Ab阻断或受重组形式的配体或受体调节。除PD-1/PD-L1以外，一种或多种调节T细胞反应的共刺激性和抑制性受体和配体可提供与本文公开的抗MerTK Ab协同作用以抑制肿瘤生长的靶标。确实，在抗免疫治疗的小鼠4T1乳腺癌模型中使用抗MerTKAb，4E9和CTLA4阻断剂的组合以及在CT26和MC38小鼠同源肿瘤模型中使用抗OX40和抗GITR激动剂Ab已证明具有协同的抗肿瘤功效(数据未显示)。

本公开提供了某些抗-MerTK-1 mAb，它们可有效增强检查点抑制剂(例如抗-PD-1)的抗肿瘤功效，并呈现出至少一种、几种或所有以下所需的特征：(a)通过SPR

分析测定的，以约100nM或更低的K_D，优选以约50nM或更低的K_D结合hMerTK和cMerTK；(b)基本上不与人Axl或Tyro3结合；(c)以约1nM或更低IC₅₀抑制由表达MerTK的细胞的胞葬作用；(d)以约10nM或更低，优选约1nM或更低的IC₅₀抑制Gas6与MerTK的结合并抑制hMerTK/Gas6信号转导；(e)抑制体内肿瘤细胞生长；和(f)在降低体内癌细胞生长中，与检查点抑制剂(如抗PD-1/抗PD-L1 Ab)协同相互作用。可用于本文所述的治疗方法、组合物或药盒中的某些抗MerTK抗体包括以高亲和力特异性结合hMerTK并呈现出至少三个，并且优选全部前述特征的mAb。

适用于所公开的治疗方法中的抗PD-1/抗PD-L1 Ab

适用于本文公开的癌症治疗方法、组合物或药盒中的抗PD-1 Ab包括分离的Ab，优选mAb或其抗原结合部分，其以高特异性和亲和力结合PD-1，阻断PD-L1和/或PD-L2与PD-1的结合，并抑制PD-1信号转导途径的免疫遏制作用。相似地，适用于这些方法中的抗PD-L1Ab是分离的Ab，优选mAb或其抗原结合部分，其以高特异性和亲和力结合PD-L1，阻断PD-L1与PD-1和CD80(B7-1)的结合，并抑制PD-1信号转导途径的免疫遏制作用。在本文公开的任何疗法方法中，抗PD-1或抗PD-L1 Ab包括分别结合PD-1受体或PD-L1配体的抗原结合部分或片段，并且在抑制受体-配体结合和逆转T细胞活性抑制由此上调免疫应答中呈现出与完整Ab的那些相似的功能特性。

抗PD-1 Ab

以高亲和力特异性结合PD-1的mAb已公开于美国专利No.8,008,449中。其他抗PD-1 mAb已描述于例如美国专利No.7,488,802、8,168,757、8,354,509和9,205,148。美国专利No.8,008,449中公开的抗PD-1 mAb已证明了呈现以下的几个或全部特征：(a)以约50nM或更低的K_D结合人PD-1，如通过SPR

生物传感器系统测定的；(b)基本上不结合人CD28、CTLA-4或ICOS；(c)在混合淋巴细胞反应(MLR)测定中提高T-细胞增殖、干扰素-γ产生和IL-2分泌；(d)结合人PD-1和食蟹猴PD-1；(e)抑制PD-L1和PD-L2与PD-1的结合；(f)释放Treg细胞对CD4⁺CD25^-T细胞的增殖和干扰素-γ产生强加的抑制；(g)刺激抗原特异性记忆应答；(h)刺激Ab应答；和(i)抑制体内肿瘤细胞生长。在所公开的治疗方法、组合物或药盒中有用的抗PD-1 Ab包括以高亲和力特异性结合人PD-1并呈现至少五个和优选全部前述特征的mAb。例如，适用于本文公开的治疗方法中的抗PD-1 Ab(a)以约10nM至0.1nM的K_D结合人PD-1，如通过SPR

生物传感器系统测定的；(b)在MLR测定中提高T细胞增殖、干扰素-γ产生和IL-2分泌；(c)抑制PD-L1和PD-L2与PD-1的结合；(d)逆转Treg对CD4⁺CD25^-T细胞的增殖和干扰素-γ产生强加的抑制；(e)刺激抗原特异性记忆应答；和(f)抑制体内肿瘤细胞生长。

其他抗PD-1 mAb已经描述于例如美国专利No.6,808,710、7,488,802、8,168,757、8,354,509和9,987,500，美国公开No.2016/0272708和PCT公开No.WO 2008/156712、WO2012/145493、WO 2014/179664、WO 2014/194302、WO 2014/206107、WO 2015/035606、WO2015/085847、WO 2015/112900、WO 2016/106159、WO 2016/197367、WO 2017/020291、WO2017/020858、WO 2017/024465、WO 2017/024515、WO 2017/025016、WO 2017/025051、WO2017/040790、WO 2017/106061、WO 2017/123557、WO 2017/132827、WO 2017/133540，将每篇全部按引用并入本文中。

在某些实施方案中，抗PD-1 mAb选自纳武单抗(

之前称为5C4、BMS-936558、MDX-1106或ONO-4538)、派姆单抗(

之前称为lambrolizumab和MK-3475；参见WO 2008/156712A1)、PDR001(参见WO 2015/112900)、MEDI-0680(之前称为AMP-514；参见WO 2012/145493)、REGN-2810(参见WO 2015/112800)、JS001(参见Liu和Wu，2017)、BGB-A317(参见WO 2015/035606和US 2015/0079109)、INCSHR1210(SHR-1210；参见WO 2015/085847；Liu和Wu，2017)、TSR-042(ANB011；参见WO 2014/179664)、GLS-010(WBP3055；参见Liu和Wu，2017)、AM-0001(参见WO 2017/123557)、STI-1110(参见WO 2014/194302)、AGEN2034(参见WO 2017/040790)和MGD013(参见WO 2017/106061)。

在本文所述的包括施用抗PD-1 Ab的任何治疗方法的某些优选实施方案中，所述抗PD-1 Ab是已被美国食品和药物管理局(FDA)批准的用于治疗多种不同癌症的纳武单抗

纳武单抗是选择性地防止与PD-1配体(PD-L1和PD-L2)相互作用的完全人IgG4(S228P)PD-1免疫检查点抑制剂Ab，从而阻断抗肿瘤T细胞功能的下调(在美国专利NO.8,008,449中描述为mAb C5；Wang等，2014)。在其他优选实施方案中，抗PD-1 Ab是派姆单抗(

针对PD-1的人源化单克隆IgG4 Ab，并在美国专利No.8,354,509中描述为h409A11)，其也已被批准用于多种癌症适应症。

可用于所公开的方法、组合物或药盒中的抗PD-1 Ab还包括特异性结合人PD-1(hPD-1)并与本文所述的任一抗PD-1 Ab(例如：纳武单抗(5C4；参见，例如，美国专利No.8,008,449；WO 2013/173223)和派姆单抗)交叉竞争结合人PD-1的分离抗体，优选mAb。可以在标准PD-1结合测定(如

分析、ELISA测定或流式细胞术)中容易地鉴定出与参照Ab(如纳武单抗或派姆单抗)交叉竞争结合抗原(在这种情况下为人PD-1)的Ab(参见，例如，WO 2013/173223)。在某些实施方案中，抗PD-1 Ab结合与本文所述的任何抗PD-1抗体(例如纳武单抗或派姆单抗)相同的表位。

可用于所公开的发明的方法中的抗PD-1抗体还包括抗原结合部分，包括Fab、F(ab’)₂、Fd或Fv片段、sdAb、scFv、di-scFv或bi-scFv、双体抗体、迷你抗体和分离的CDR(对于更多详细信息，参见Hollinger和Hudson，2005年；Olafsen和Wu，2010年)。

在某些实施方案中，分离的抗PD-1 Ab或其抗原结合部分包含其是人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型的重链恒定区。在某些优选实施方案中，抗PD-1 Ab或其抗原结合部分包含其是人IgG4同种型的重链恒定区。在其他实施方案中，抗PD-1 Ab或其抗原结合部分是人IgG1同种型的。在某些其他实施方案中，抗PD-1 Ab或其抗原结合部分的IgG4重链恒定区含有S228P突变(使用Kabat系统编号；Kabat等，1983)，其用通常在IgG1同种型Ab的相应位置上发现的脯氨酸残基代替铰链区中的丝氨酸残基。该突变存在于纳武单抗中，防止Fab臂与内源性IgG4 Ab交换，同时保留了激活与野生型IgG4 Ab相关的Fc受体的亲和力(Wang等，2014)。再在其他实施方案中，Ab包含其是人κ或λ恒定区的轻链恒定区。

在本方法的其他实施方案中，抗PD-1 Ab或其抗原结合部分是mAb或其抗原结合部分。为了施用于人受试者，抗PD-1 Ab优选是嵌合Ab，或更优选是人源化或人Ab。这样的嵌合、人源化或人mAb可以通过本领域众所周知的方法来制备和分离，例如，如美国专利No.8,008,449中所述的。

抗PD-L1 Ab

因为抗PD-1和抗PD-L1靶向相同的信号转导途径，并且已在临床试验中显示出在各种癌症中呈现出相当水平的功效(参见，例如Brahmer等，2012；WO 2013/173223)，在本文公开的联合疗法方法中，抗PD-L1 Ab可以代替抗PD-1 Ab。

适用于所公开的方法、组合物或药盒中的抗PD-L1 Ab是分离的Ab，其以高特异性和亲和力结合PD-L1，阻断PD-L1与PD-1和CD80的结合，并抑制PD-1信号转导途径的免疫遏制作用。在美国专利No.7,943,743中已经公开了以高亲和力特异性结合PD-L1的mAb。其他抗PD-L1 mAb已经描述于例如美国专利No.8,217,149、8,779,108、9,175,082、9,624,298和9,938,345以及PCT公开号WO 2012/145493中。已证明美国专利No.7,943,743中公开的抗PD-1 HuMAb呈现出以下的一个或多个特征：(a)以约50mM或更低的K_D结合人PD-1，如通过SPR测定的

(b)在MLR测定中增加T细胞增殖、干扰素-γ产生和IL-2分泌；(c)刺激Ab应答；(d)抑制PD-L1与PD-1的结合；和(e)逆转Treg对T细胞效应细胞和/或树突细胞的遏制作用。用于本文公开的治疗方法中的抗PD-L1 Ab包括分离的Ab，优选mAb，其以高亲和力特异性结合人PD-L1并表现出至少一个，在一些实施方案中，至少三个，优选全部，前述特征。例如，适用于这些方法中的抗PD-L1 Ab(a)以约50mM至0.1mM的K_D结合人PD-1，如通过表面等离子体共振

测定的；(b)在MLR测定中增加T细胞增殖、γ干扰素产生和IL-2分泌；(c)抑制PD-L1与PD-1和CD80的结合；和(d)逆转Treg对T细胞效应细胞和/或树突细胞的遏制作用。

用于本发明方法中的合适的抗PD-L1 Ab是BMS-936559(之前为MDX-1105；在美国专利No.7,943,743中指定为12A4)。其他合适的抗PD-L1抗体包括阿妥珠单抗(

之前称为RG7446和MPDL3280A；在美国专利No.8,217,149中指定为YW243.55S70；也请参见Herbst等，2014)、德瓦鲁单抗(

之前称为MEDI-4736；在美国专利No.8,779,108中指定为2.14H9OPT)、阿维单抗(

以前称为MSB-0010718C；在美国专利No.9,624,298中指定为A09-246-2)、STI-A1014(在美国专利No.9,175,082中指定为H6)、CX-072(参见WO 2016/149201)、KN035(参见Zhang等，2017)、LY3300054(参见，例如，WO 2017/034916)和CK-301(参见Gorelik等，2017)。

适用于所公开的方法、组合物或药盒中的抗PD-L1 Ab还包括特异性结合人PD-L1的以及与参照Ab交叉竞争结合人PD-L1的分离Ab，所述参照Ab可以是本文公开的任一抗PD-L1 Ab，例如BMS-936559(12A4；参见，例如，美国专利No.7,943,743；WO 2013/173223)、阿妥珠单抗、德瓦鲁单抗、阿维单抗或STI-A1014。Ab与参照Ab交叉竞争结合人PD-L1的能力证明了这样的Ab与参照Ab结合相同的PD-L1表位区域，并通过其结合基本上相同的PD-L1的表位区，预期与参照Ab具有极为相似的功能特性。在一些实施方案中，抗PD-L1Ab结合与本文所述的任何抗PD-L1 Ab相同的表位，例如阿妥珠单抗、德瓦鲁单抗、阿维单抗或STI-A1014。可以在本领域技术人员众所周知的标准PD-L1结合测定(如

分析、ELISA测定或流式细胞术)中基于与参照Ab(如阿妥珠单抗或阿雏单抗)交叉竞争的能力，容易地鉴定出交叉竞争的Ab(参见例如WO 2013/173223)。

在某些优选的实施方案中，用于本发明方法中的分离抗PD-L1 Ab是mAb。在其他实施方案中，尤其是对于施用于人受试者，这些Ab优选是嵌合Ab，或更优选是人源化或人Ab。嵌合、人源化或人mAb可以通过本领域众所周知的方法来制备和分离，例如，如美国专利No.7,943,743中所述的。

在某些实施方案中，抗PD-L1 Ab或其抗原结合部分包括其是人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型的重链恒定区。在某些其他实施方案中，抗PD-L1 Ab或其抗原结合部分是人IgG1或IgG4同种型的。在更多实施方案中，抗PD-L1 Ab或其抗原结合部分的IgG4重链恒定区的序列含有S228P突变。在其他实施方案中，Ab包含其是人κ或λ恒定区的轻链恒定区。

本发明的抗PD-L1 Ab还包括以上Ab的抗原结合部分，包括Fab、F(ab’)₂、Fd、Fv和scFv、二-scFv或双-scFv、以及scFv-Fc片段、纳米抗体、双体抗体、三链抗体、四链抗体和分离的CDR，其结合PD-L1并在受体结合和上调免疫系统中呈现出与完整Ab的那些相似的功能性质。

治疗方法

用抗MerTK Ab作为单一疗法的癌症治疗

本公开提供了一种用于治疗罹患癌症的受试者的方法，包括将治疗有效量的本文公开的任一种抗MerTK Ab、免疫缀合物或双特异性分子，或包含任一种所述的抗MerTK Ab、免疫缀合物或双特异性分子的药物组合物施用于受试者，使得受试者得到治疗。

本公开还提供了一种用于抑制受试者中的肿瘤细胞生长的方法，包括将治疗有效量的本文公开的任一种抗MerTK Ab、免疫缀合物或双特异性分子，或包含所述任一种所述的抗MerTK Ab、免疫缀合物或双特异性分子的药物组合物施用于受试者，使得受试者中的肿瘤细胞的生长得到抑制。

如实施例6-8中所述的，三种不同的抗MerTK moMAb，2D9、4E9和16B9，在MC38和CT26结肠腺癌肿瘤模型中只显示出轻微的肿瘤生长抑制，但在这些模型中与抗PD-1 Ab联合时显示出非常强有力的抗肿瘤活性(参见实施例4-8)。因此，在某些生理环境中，与检查点抑制剂(如抗PD-1 Ab)联合时，抗MerTK Ab在抑制肿瘤生长中显示出比使用抗MerTK Ab的单一疗法有效得多。

用抗MerTK Ab结合另一种抗癌剂治疗癌症

本公开提供了一种用于治疗罹患癌症的受试者的方法，包括向受试者施用治疗有效量的：(a)本文公开的任一种抗MerTK Ab、免疫缀合物或双特异性分子，或包含任一种所述的抗MerTK Ab、免疫缀合物或双特异性分子的药物组合物；(b)用于治疗癌症的其他治疗剂，使得受试者得到治疗。

本公开还提供了用于一种用于抑制受试者中的肿瘤细胞生长的方法，包括向受试者施用治疗有效量的：(a)本文公开的任一种抗MerTK Ab、免疫缀合物或双特异性分子，或包含任一种所述的抗MerTK抗体、免疫缀合物或双特异性分子的药物组合物；(b)用于治疗癌症的其他治疗剂，使得受试者中的肿瘤细胞的生长得到抑制。

在本发明任何方法的某些优选实施方案中，受试者是人患者。在其他优选实施方案中，抗MerTK Ab抑制由表达MerTK的巨噬细胞的胞葬作用。在进一步的实施方案中，MerTKAb结合hMerTK的箱2表位。

在某些实施方案中，其他治疗剂是降低免疫系统抑制的化合物。例如，其他治疗剂可以是小分子化合物、大环肽、融合蛋白或Ab。在更多实施方案中，所述的其他治疗剂是特异性结合PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG-3、BTLA、TIM-3、KIR、KLRG-1、A2aR、TIGIT、VISTA受体、CD244或CD160的拮抗性Ab。在其他实施方案中，其他治疗剂是特异性结合ICOS、CD137、CD134、CD27、GITR或HVEM的激动性Ab。实施例4-8中呈现的数据证实了MerTK介导的胞葬作用的抑制带来了肿瘤微环境中提高的抗原呈递、共刺激和促炎性细胞因子产生，由此使肿瘤对T细胞相关的免疫治疗敏感的假设。在某些优选的实施方案中，其他治疗剂是特异性结合PD-1的拮抗性Ab或其抗原结合部分。在其他优选实施方案中，其他治疗剂是特异性结合PD-L1的拮抗性Ab或其抗原结合部分。在更多实施方案中，其他治疗剂是特异性结合CTLA-4的拮抗性Ab或其抗原结合部分。

通过所公开的方法可治疗的癌症

依赖于利用免疫系统的几乎无限的灵活性来攻击和破坏癌细胞的免疫肿瘤学可用于治疗非常广泛的癌症(参见，例如，Yao等，2013；Callahan等，2016；Pianko等，2017；Farkona等，2016；Kamta等，2017)。抗PD-1 Ab，纳武单抗，已经在许多不同类型的癌症治疗中显示出有效性(参见，例如，Brahmer等，2015；Guo等，2017；Pianko等，2017；WO 2013/173223)，并且目前在在多种实体和血液学癌症中进行临床试验。因此，所公开的使用MerTK受体的阻断或PD-1和MerTK受体的双重阻断的方法适用于治疗多种实体和液体肿瘤。

可治疗的多种癌症

因为本文公开的癌症治疗方法中使用的Ab不直接靶向癌细胞，而是通过PD-1信号转导途径和MerTK介导的胞葬作用的双重阻断来靶向并增强免疫系统，促进增强的免疫系统攻击和破坏癌细胞，因此这些Ab适用于治疗多种癌症。纳武单抗在治疗多种癌症中的有效性已经得到了证明，证据是这种药批准用于治疗晚期黑素瘤、晚期非小细胞肺癌、转移性肾细胞癌、经典霍奇金淋巴瘤、晚期头颈鳞状细胞癌、转移性尿路上皮癌、MSI-H或dMMR转移性结直肠癌、肝细胞癌和小细胞肺癌(Drugs.com-Opdivo Approval History：https://www.drugs.com/history/opdivo.html)，并有许多其他癌症正在进行临床试验。类似的，抗PD-L1药物，如阿妥珠单抗

德瓦鲁单抗

和阿维单抗

已在各种适应症中获得批准。因此，使用本文公开的抗MerTK Ab，并且尤其是抗MerTK和抗PD-1/PD-L1 Ab的组合可以治疗多种不同的癌症。所证明的这种联合治疗剂的高效力使得可以专注于因未满足的医疗需求困扰的癌症。

在某些实施方案中，所公开的联合治疗方法可以用于治疗其是实体肿瘤的癌症。在罹患快速进展的疾病的患者中或在使用检查点抑制剂治疗时快速进展的患者中，其需要立即消除肿瘤并且免疫原性增强可以证明是有效的，本发明组合特别有效。因此，在某些实施方案中，实体瘤是选自小细胞肺癌(SCLC)、鳞状非小细胞肺癌(NSCLC)、非鳞状NSCLC和三阴性乳腺癌(TNBC)的癌症。

本发明的抗MerTK Ab和检查点抑制剂(如抗PD-1/PD-L1 Ab)的组合在其中化疗和/或放疗是关键治疗方式并且其中需要促进持续的抗肿瘤免疫的疾病的早期阶段中也是有效的。在某些实施方案中，实体肿瘤是选自食道癌、胃癌、直肠癌、非小细胞肺癌(NSCLC)和头颈鳞状细胞癌(SCCHN)的癌症。

在某些其他实施方案中，将包括抗MerTK Ab的联合治疗用于治疗巨噬细胞含量高的不发炎的肿瘤，以增强肿瘤免疫原性并促进炎症反应。例如，所述组合可用于治疗选自胰腺导管腺癌(PDAC)、转移性去势抗性前列腺癌(mCRPC)和多形胶质母细胞瘤(GBM)的实体瘤。

在某些其他实施方案中，实体肿瘤选自黑素瘤、肾癌、NSCLC、结直肠癌、胃癌、膀胱癌和胶质母细胞瘤。

在某些其他实施方案中，实体肿瘤是选自SCLC、NSCLC、鳞状NSCLC、非鳞状NSCLC、鳞状细胞癌、胰腺癌(PAC)、胰腺导管腺癌(PDAC)、卵巢癌、宫颈癌、输卵管癌，子宫(内膜)癌、子宫内膜癌、子宫肉瘤、子宫颈癌、阴道癌、外阴癌、尿道癌、输尿管癌、前列腺癌、转移性去势抗性前列腺癌(mCRPC)、睾丸癌、阴茎癌、膀胱癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌(TNBC)、男性乳腺癌、生殖细胞瘤、肉瘤、皮肤癌、基底细胞癌、鳞状细胞癌、默克尔细胞癌、骨癌、黑素瘤、头颈癌、头颈鳞状细胞癌(SCCHN)、甲状腺癌、口腔癌、嘴癌、唾液腺癌、喉癌、食道癌、胃肠道癌、胃癌、小肠癌、胆囊和胆管癌、结直肠癌、结肠癌，直肠癌、肛门癌、肝癌，肝细胞癌、肾癌、肾细胞癌、内分泌系统癌、胸腺肿瘤、胸腺瘤、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、间皮瘤、肾盂癌、中枢神经系统肿瘤(CNS)、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊髓轴肿瘤、脑癌、神经胶质瘤、脑干神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、多形胶质母细胞瘤(GBM)、神经母细胞瘤、垂体腺瘤、表皮样癌、儿童期实体瘤、小儿肉瘤、横纹肌肉瘤、转移性癌，原发性未知的癌、环境诱发的癌、病毒相关的癌症、艾滋病相关的癌症、卡波济肉瘤、病毒起源的癌症，晚期、难治性和/或复发性实体瘤，以及前述实体瘤的任何组合。在某些实施方案中，癌症是晚期、不可切除、转移性、难治性癌症和/或复发性癌症。

在某些实施方案中，本发明的联合治疗方法可以用于治疗是血液系统恶性肿瘤的癌症。血液系统恶性肿瘤包括源自两个主要血细胞系的液体肿瘤，即，骨髓细胞系(其产生粒细胞、红细胞、血小板、巨噬细胞和肥大细胞)或淋巴样细胞系(其产生B、T、NK和浆细胞)，包括所有类型的白血病、淋巴瘤和骨髓瘤。可以使用本发明的联合治疗方法的血液系统恶性肿瘤包括，例如，选自急性淋巴母细胞白血病(ALL)、急性粒细胞性白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性髓性白血病(CML)、霍奇金淋巴瘤(HL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、多发性骨髓瘤、阴燃骨髓瘤、意义未定的单克隆丙种球蛋白病(MGUS)、晚期、转移性、难治性和/或复发性血液学恶性疾病，以及所述血液学恶性疾病的任何组合的癌症。

在其他实施方案中，血液学恶性肿瘤是选自急性、慢性、淋巴细胞性(淋巴母细胞性)和/或骨髓性白血病，如ALL、AML、CLL和CML；淋巴瘤，如HL、NHL，其中约85％是B细胞淋巴瘤，包括弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤(FL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)/小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)、套细胞淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤(黏膜相关淋巴样组织(MALT)淋巴瘤、结节边缘区B细胞淋巴瘤和脾边缘区B细胞淋巴瘤)、伯基特淋巴瘤、淋巴浆细胞样淋巴瘤(LPL；也称为

巨球蛋白血症(WM))、毛细胞淋巴瘤和原发性中枢神经系统(CNS)淋巴瘤，是T细胞淋巴瘤的NHL，包括前体T淋巴母细胞淋巴瘤/白血病，T淋巴母细胞淋巴瘤/白血病(T-Lbly/T-ALL)，外周T细胞淋巴瘤，如皮肤T细胞淋巴瘤(CTLC，即蕈样真菌病，Sezary综合征等)，成人T细胞淋巴瘤/白血病，血管免疫母细胞T细胞淋巴瘤，结节外天然杀伤/T细胞淋巴瘤鼻型，与肠病相关的肠T细胞淋巴瘤(EATL)，间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)和未明确的外周T细胞淋巴瘤，急性髓细胞样淋巴瘤，淋巴浆细胞样淋巴瘤，单核细胞样B细胞淋巴瘤，血管中心性淋巴瘤，肠T细胞淋巴瘤，原发性纵隔B细胞淋巴瘤，移植后淋巴增生性疾病，真性组织细胞淋巴瘤，原发性渗出性淋巴瘤，弥漫性组织细胞淋巴瘤(DHL)，免疫母细胞性大细胞淋巴瘤和前体B淋巴母细胞淋巴瘤；骨髓瘤，如多发性骨髓瘤，阴燃骨髓瘤(也称为无痛性骨髓瘤)，意义未定的单克隆丙种球蛋白病(MGUS)，孤立性浆细胞瘤，IgG骨髓瘤，轻链骨髓瘤，非分泌性骨髓瘤和淀粉样变性；以及所述血液学恶性疾病的任何组合。本发明的方法还适用于治疗晚期、转移性、难治性和/或复发性血液学恶性肿瘤。

抗MerTK和抗PD-1/抗PD-L1 Ab的医学用途

如上所述，本公开提供了分离的抗MerTK Ab，优选mAb或其抗原结合部分，用于治疗罹患癌症的受试者的方法中。本公开进一步提供了分离的抗MerTK Ab，优选mAb或其抗原结合部分，和检查点抑制剂，如分离的抗PD-1/抗PD-L1 Ab，优选mAb或其抗原结合部分，联合用于治疗罹患癌症的受试者的方法中，所述方法包括胞葬作用和检查点通路(例如，PD-1/PD-L1信号转导通路)的双重阻断。抗MerTK Ab可以用作单一疗法或联合检查点抑制剂(如抗PD-1/抗PD-L1 Ab)，用于治疗本文公开的所有范围的癌症。

所公开的发明的一个方面需要本发明的分离的抗MerTK Ab或其抗原结合部分在制备用于治疗罹患癌症的受试者的药物中的用途。抗MerTK Ab可单独使用或联合检查点抑制剂(如分离的抗PD-1/抗PD-L1 Ab或其抗原结合部分)，用于制备治疗癌症患者的药物。任何这样的抗MerTK Ab和抗PD-1/抗PD-L1 Ab在制备药物中的用途广泛适用于本文公开的所有癌症。

本公开还提供了抗MerTK Ab或其抗原结合部分联合检查点抑制剂(如分离的抗PD-1/抗-PD-L1 Ab或其抗原结合部分)，用于治疗癌症的方法中，所述方法对应于使用本文描述的这种治疗剂组合的治疗方法的所有实施方案。

药物组合物和剂量方案

本文公开的任何疗法方法中使用的Ab可以构成组合物，例如，药物组合物，其含有Ab和药学上可接受的载体。如本文使用的，“药学上可接受的载体”包括生理上相容的任何和全部溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等。优选，用于含有Ab的组合物的载体适用于静脉内(IV)、肌内、皮下(SC)、胃肠外、脊髓或表皮施用(例如，通过注射或输注)。

SC注射的选择基于Halozyme Therapeutics的

药物递送技术，其涉及将Ab与重组人透明质酸酶(rHuPH20)共同配制，从而消除了由于胞外基质传统上对可皮下递送的生物制剂和药物体积的限制(美国专利No.7,767,429)。还可以将联合疗法中使用的两种Ab共同配制成用于SC施用的单一组合物。

本发明的药物组合物可以包括一种或多种药学上可接受的盐、抗氧化剂、水性和非水性载体和/或佐剂，如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。

剂量方案可以调节，以提供最佳的所需应答，例如，最大的治疗应答和/或最小的副作用。对于抗MerTK、抗PD-1或抗PD-L1 Ab或其抗原结合部分的施用，包括联合使用，剂量范围可以为约0.01至约20mg/kg受试者体重，优选约0.1至约10mg/kg受试者体重。例如，剂量可以为约0.1，0.3，1，2，3，5或10mg/kg体重，并且更优选，约0.3，1，3或10mg/kg体重。或者，可以施用固定剂量或平剂量，例如，约50-2000mg Ab或其抗原结合部分，替代基于体重的剂量。给药时间表通常设计成基于Ab的典型药代动力学特性获得导致持续的受体占用(RO)的暴露。示例性治疗方案需要每周一次，每2周一次，每3周一次，每4周一次，每月一次，每3-6月或更长时间一次。在某些优选实施方案中，约每2周一次，将抗MerTK、抗PD-1或抗PD-L1 Ab或其抗原结合部分施用于受试者。在其他优选实施方案中，每3周一次施用Ab或其抗原结合部分。剂量和时间表在治疗过程期间可以改变。

联合使用时，可以使用一种或两种Ab的亚治疗剂量，例如抗MerTK、抗PD-1和/或抗PD-L1 Ab或其抗原结合部分的剂量低于典型或批准的单一疗法剂量。例如，将低于批准剂量每2周3mg/kg的纳武单抗的剂量，例如，每2、3或4周1.0mg/kg或更少，视为亚治疗剂量。15名给药0.3mg/kg至10mg/kg纳武单抗的受试者的RO数据表明了在这个剂量范围内，PD-1的占用似乎非剂量依赖的。在所有剂量下，平均占用率为85％(范围为70％至97％)，平均平台占用率为72％(范围为59％至81％)(Brahmer等，2010)。因此，0.3mg/kg的剂量可以允许足够的暴露以导致显著的生物活性。

在小鼠肿瘤模型中观察到的抗MerTK和抗PD-1/抗PD-L1 Ab或其抗原结合部分之间的协同相互作用可以允许以亚治疗剂量给癌症患者施用这些治疗剂中的一种或两种。在所公开的联合疗法方法的某些实施方案中，将抗MerTK Ab或其抗原结合部分以亚治疗剂量施用于癌症患者。在其他实施方案中，将抗PD-1/抗PD-L1 Ab或其抗原结合部分以亚治疗剂量施用于患者。在进一步的实施方案中，抗PD-1/抗PD-L1和抗MerTK Ab或其抗原结合部分各自以亚治疗剂量施用于患者。

与在单一疗法中使用更高剂量的单个Ab相比，这种亚治疗剂量的一种或两种Ab的施用可以减少不良事件。因此，所公开的联合疗法方法的成功不仅可以通过Ab组合相对于使用这些Ab的单一疗法的疗效提高来衡量，而且可以通过使用相对于单一疗法剂量的联合药物的较低剂量而提高的安全性(即，降低的不良事件的发生率)来衡量。

在本文公开的任何方法的某些实施方案中，抗MerTK、抗PD-1和/或抗PD-L1 Ab配制用于静脉内(IV)施用或皮下(SC)注射。在某些实施方案中，将抗MerTK Ab或其抗原结合部分和抗PD-1/抗PD-L1 Ab或其抗原结合部分按序施用于受试者。“按序”施用表示抗MerTK和抗PD-1/抗PD-L1 Ab中的一种在另一种之前施用。任一种Ab可以先施用；即，在某些实施方案中，抗PD-1/抗PD-L1 Ab可以在抗MerTK Ab前施用，而在其他实施方案中，抗MerTK Ab在抗PD-1/抗PD-L1 Ab之前施用。在某些实施方案中，每种Ab通过IV输注施用，例如，通过在约60分钟的时间段中输注。在其他实施方案中，至少一种Ab通过SC注射来施用。

在按序IV施用的某些实施方案中，为了患者的方便，抗MerTK和抗PD-1/抗PD-L1Ab或其部分彼此在30分钟内施用。通常，抗MerTK和抗PD-1/抗PD-L1 Ab两者在同一天通过IV施用递送时，对于每次输注，使用分开的输注袋和过滤器。在开始输注第二种Ab前，第一种Ab输注后及时用盐水冲洗以清洗Ab线。在其他实施方案中，两种Ab彼此在1、2、4、8、24或48h内施用。

至少一种Ab通过SC施用的递送缩短了施用所需的健康护理操作者的时间并缩短了药物施用的时间。例如，使用SC注射可以缩短IV施用所需的时间，通常为约30-60min，缩短至约5min。在按序SC施用的某些实施方案中，抗MerTK和抗PD-1/抗PD-L1 Ab或其部分彼此在10min内施用。

因为检查点抑制剂Ab已经显示出产生非常持久的应答，这部分是由于免疫系统的记忆成分引起的(参见，例如，WO2013/173223；Lipson等，2013；Wolchok等，2013)，施用的抗PD-1/抗PD-L1 Ab的活性可以持续数周、数月或甚至数年。在某些实施方案中，本发明涉及按序施用的联合疗法方法需要将抗MerTK Ab施用于之前已经用抗PD-1/抗PD-L1 Ab治疗的患者。在更多实施方案中，将抗MerTK Ab施用于之前已经用抗PD-1/抗PD-L1 Ab治疗的并且进展的患者。在其他实施方案中，本发明涉及按序施用的联合疗法方法需要将抗PD-1/抗PD-L1 Ab施用于之前已经用抗MerTK Ab治疗的患者，任选其癌症在用抗MerTK Ab治疗后已经进展的患者。

在某些其他实施方案中，抗PD-1/抗PD-L1和抗MerTK Ab同时施用，在药学上可接受的制剂中混合成用于同时施用的单一组合物，或作为分开的组合物同时施用，每种Ab配制于药学上可接受的组合物中。

药盒

本发明的范围内还包括包含用于治疗用途的抗merTK Ab和抗PD-1/抗PD-L1 Ab的药盒。药盒通常包括表明药盒内容物的预期用途和使用说明的标签。术语标签包括药盒上提供的或随药盒提供的或另外随药盒附带的任何文字或记录材料。因此，本公开提供用于治疗罹患癌症的受试者的药盒，所述药盒包括：(a)一个或多个剂量范围为约0.1至约20mg/kg体重的特异性结合MerTK的mAb或其抗原结合部分；和(b)在本文公开的任何方法中使用mAb或其部分的说明。本公开进一步提供一种用于治疗罹患癌症的受试者的药盒，所述药盒包括：(a)一个或多个剂量范围为约0.1至约20mg/kg体重的特异性结合MerTK的mAb或其抗原结合部分；(b)一个或多个剂量的检查点抑制剂，如约3mg/kg体重或200至约1600mg的抗PD-1/抗PD-L1 mAb或其抗原结合部分；和(c)在本文公开的任何联合治疗方法中使用抗MerTK mAb和检查点抑制剂(例如，抗PD-1/抗PD-L1)的说明。

在某些实施方案中，Ab可以以单位剂型共同包装。在用于治疗人类患者的某些优选实施方案中，药盒包括本文公开的抗人PD-1 Ab，例如，纳武单抗或派姆单抗。

通过以下实施例来进一步说明本发明，其不应当解释为进一步的限制。将整个申请中引用的所有参考文献的内容明确按引用并入本文中。

实施例1

抗MERTK Mab的产生

通过用人MerTK(hMerTK)抗原免疫表达人Ab基因的转基因小鼠，以在小鼠中引起MerTK特异性的人Ig库，以及通过用小鼠MerTK(mMerTK)抗原或mMerTK和hMerTK抗原的混合物免疫MerTK敲除小鼠，从而产生人和小鼠抗MerTK mAb。

人免疫球蛋白转基因小鼠的免疫

通过用包含在其C-末端连接小鼠IgG2a Fc的hMerTK的胞外部分的重组hMerTK-mFc融合蛋白(R&D Systems，Minneapolis，MN)对人Ig转基因小鼠株系Hco42：01[J/K](HCo42(289729p)+^；JHD++；JKD++；KCo5(9272)+^；)(Lonberg，1994；Lonberg等，1994)进行免疫来产生针对hMerTK的HuMAb。抗原与Ribi佐剂1∶1混合，并且每周一次通过腹膜内和皮下免疫小鼠。在四次和六次注射后监测血清滴度。在最终收获前2天和3天，通过静脉内(IV)和腹膜内(IP)注射，小鼠接受了hMerTK-mFc蛋白的两次最终增强。收集淋巴结和脾脏进行后续融合。

MerTK敲除小鼠的免疫

通过用混合了hMerTK-hFc融合蛋白(R&D Systems)的重组mMerTK-hFc融合蛋白(R&D Systems)或单独使用mMerTK-hFc免疫MerTK敲除(KO)小鼠来产生小鼠抗MerTK mAb。将抗原与Ribi佐剂1∶1混合，并使用足垫免疫每周注射一次。在4次注射后监测血清滴度，然后在最终收获前2天和3天对小鼠进行两次最终的脚垫增强。收集淋巴结用于后续融合。

产生针对MerTK的MAb的杂交瘤的产生

从如上所述的免疫小鼠分离小鼠淋巴细胞，并使用Cyto Pulse Hybrimmune大室细胞融合电穿孔仪(BTX/Harvard Apparatus，Holliston，MA)通过基于电场的电融合，通过与小鼠骨髓瘤融合伴侣的融合产生杂交瘤。将来自免疫小鼠的淋巴细胞的单细胞悬浮液与等数量P3X63 Ag8.6.53(ATCC)非分泌型小鼠骨髓瘤细胞融合(对于人Ig转基因小鼠，融合号为5760-5763，对于MerTK KO小鼠，融合号为5712和5775)。将所得到的细胞接种在平底微量滴定板中的补充有氨蝶呤(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)的培养基E(StemCellTechnologies，Seattle，WA)中以选择杂交瘤。

实施例2

人抗人MERTK MAb的筛选和选择

筛选选择性地结合人和食蟹猴MerTK的MAb

为了产生结合hMerTK的HuMAb，如实施例1所述用hMerTK抗原免疫人Ig转基因小鼠。

对于源自这些人Ig转基因动物的杂交瘤，在10至12天后使用均相时间分辨荧光(HTRF)测定(Cisbio，Bedford，MA)筛选单个孔中人IgG/人κ轻链(hIgG/hκ)Ab的存在。通过荧光激活细胞分选(FACS)测试来自hIgG/hκ阳性的孔的杂交瘤上清液对于用全长hMerTK的激酶突变形式转染的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞的结合。简而言之，用冷的FACS缓冲液(含1％胎牛血清(FBS)磷酸盐缓冲盐水(PBS))洗涤用hMerTK传染的CHO细胞，并将～1×10⁵细胞在50μl中等分至96孔U底平板的每个孔，接着添加50μl杂交瘤上清液。样品与细胞在冰上孵育30min。用FACS缓冲液洗涤细胞2次。每样品按100μl添加1∶200稀释的PE偶联的山羊抗人IgGFc特异性Ab(Jackson ImmunoResearch，West Grove，PA)。将细胞洗涤两次并转移到FACSCalibur细胞仪(BD Biosciences，San Jose，CA)并读取。还使用上述的染色方案，通过FACS，使用用食蟹猴MerTK转染的CHO细胞，筛选了人MerTK-阳性杂交瘤与食蟹猴MerTK的交叉反应性。通过FACS针对选择性进一步对杂交瘤进行反筛选，通过不存在与Axl和/或Tyro3以及非特异性蛋白(如匙孔血蓝蛋白(KLH))的结合来证明。筛选了大约3,300个HuMAb克隆，发现约300个对MerTK具有选择性，并与人和食蟹猴MerTK两者都结合。

功能性筛选拮抗性抗MerTK mAb

将使用基于细胞的测定(Zizzo等，2012)功能筛选选定的HuMAb克隆用于鉴定抑制胞葬作用的Ab。还使用了信号转导测定来测量靶标啮合以及在抑制配体(Gas6)诱导的信号转导中的效力(Tsou等，2014)，并且针对激动剂潜能对克隆进行了反筛选。基于以下内容选择克隆用于进一步的表征：以亚纳摩尔的EC₅₀结合人细胞(肿瘤细胞系和原代细胞)上的MerTK；以低至亚nM的EC₅₀结合食蟹猴细胞(转染的细胞系和原代细胞)上的MerTK；以亚纳摩尔的IC₅₀将胞葬作用抑制超过最大信号的80％；和以亚纳摩尔的IC₅₀将Gas6介导的信号转导抑制超过对照的80％并且没有激动能力。通过下一代测序将这些Ab中的可变区DNA进行测序，并且对于多样性，基于序列同源性和有限的潜在序列负担(例如天冬酰胺脱酰胺、甲硫氨酸氧化和糖基化位点)选择了约35个HuMAb。基于编码可变区的核苷酸序列，在选择的HuMAb中鉴定了六个序列家族。还使用计算机方法基于序列对于免疫原性潜力分析了选择的35个HuMAb，并使用标准的高内涵方法测试了它们诱导受体内化的潜力。任何表现出免疫原性或诱导受体内化潜力的克隆都被降低优先级。

抗hMerTK HuMAb的结合亲和力和结合动力学的表征

选定的HuMAb的亲和力和结合动力学通过用

仪器(GEHealthcare，Chicago，IL)在37℃下的表面等离子体共振(SPR)分析来表征，该仪器使用具有固定化抗人Fc捕获试剂(GE Healthcare)的CM4传感器芯片(GE Healthcare)和运行缓冲液，所述缓冲液由10mM HEPES pH 7.4、150mM NaCl，0.05％(v/v)表面活性剂P20和1g/lBSA组成。MerTK Ab被捕获在芯片上。分别注入以多种浓度作为分析物的人、食蟹猴和小鼠MerTK多肽胞外域的重组可溶形式。将得到的传感图进行双重参考，并通过传质(masstransport)拟合到1∶1 Langmuir结合模型。

抗hMerTK HuMAb的表位分箱(Binning)

在显示出强拮抗功能作用的HuMAb中，将包含6个序列家族的13个代表性HuMAb接受了SPR结合竞争研究，以鉴定与hMerTK抗原上相同或重叠表位竞争的mAb，并因此可以将其分配给相同的表位箱(bin)。鉴定了三个表位箱，其中绝大多数分配给箱1：将11个mAb分配给了箱1，1个mAb分配给了箱2，和1个mAb分配给了箱3。

通过酵母展示和氢氘交换(HDX)进行表位作图

基于表位binning数据选择选定的Ab，以通过酵母展示和/或氢-氘交换质谱法(HDX-MS)进行表位作图分析，以进一步阐明Ab结合区。制备了mAb的Fab片段，并用于HDX-MS表位作图，因为Fab片段给出的结果比整个Ab更清楚。发现箱1Ab与跨越大约105至165氨基酸的线性区域内的hMerTK的第一个Ig结构域结合，具体区域取决于特定克隆。例如，将8N42Fab片段的表位作图定位于人MerTK(SEQ ID NO：259)的氨基酸126至155(¹²⁶TTISWWKDGKELLGAHHAITQFYPDDEVTA¹⁵⁵)的区域。

发现箱2Ab(HuMab和moMAb)与跨越大约195至270氨基酸的区域内的MerTK的第二个Ig结构域结合，具体区域取决于特定克隆。例如，将HuMAb 25B10(从其衍生出mAb 25J60和25J80)的Fab片段的表位作图定位到跨越hMerTK(SEQ ID NO：259)的氨基酸231至249(²³¹WVQNSSRVNEQPEKSPSVL²⁴⁹)的线性区域。这些数据与酵母展示作图的表位一致，对于mAb25B10，其鉴定到氨基酸残基N234、S236、R237、E240、Q241、P242和G269构成了表位。箱1和箱2结合区均与基于Gas6/Axl晶体结构的同源性建模的配体阻断相一致。

单个箱3HuMAb结合跨越氨基酸420至490的区域内的Fn结构域。

抗hMerTK HuMAb的优化

基于抑制胞葬作用的效力和持续时间、结合动力学、分箱多样性和序列家族多样性，选择了某些mAb用于PROmAb优化，以减轻序列负担，优化结合亲和力并恢复成种系氨基酸。还通过各种手段(如分析性尺寸排阻色谱、毛细管等电聚焦、疏水性评估、热稳定性和聚集潜力)分析了选定mAb的生物物理特性，以鉴定适于开发的克隆。在PROmAb优化过程中丢失了一种唯一被选为代表序列家族之一的mAb；因此，在优化过程中产生的13个Abs中，代表了5个序列家族和3个箱。

表1中显示了13个选定的HuMAb中的7个代表性样品(HuMAbs 1B4、10K11、22I16、25J60、25J80、8N42和4K10)的分箱数据以及胞葬作用和信号转导测定结果。表中包括了一个分配给箱3的HuMAb以及源自一个分配给箱2的单个HuMAb的两个紧密相关的Ab，其余是四个分配给箱1的HuMAb。表1中呈现了所有5个序列家族。

表1中7个代表性HuMAb的结合动力学数据，即解离常数(K_D)，结合反应的速率常数(k_on)，解离反应的速率常数(k_off)值和寿命(t_1/2)，显示于表2中。

表3-9分别显示了使用Kabat、Chothia和IMGT方法对HuMAb 1B4、10K11、22I16、25J60、25J80、8N42和4K10定义的6个CDR结构域的氨基酸序列。

表15-21分别显示了HuMAbs 1B4、10K11、22I16、25J60、25J80、8N42和4K10的V_H、V_L、重链和轻链的氨基酸序列。

表1.代表性的抗MerTK Ab的分箱和功能表征

dnb：不结合表达hMerTK的细胞

nd：无数据

实施例3

小鼠抗MERTK MAb的筛选和选择

筛选特异性结合人和食蟹猴MerTK的MAb

用mMerTK和hMerTK抗原免疫MerTK KO小鼠，以产生结合mMerTK和/或hMerTK的小鼠Ab，如实施例1中所述的。

使用荧光微量体积测定技术(FMAT)直接测试了源自这些MerTK KO小鼠的杂交瘤的上清液与小鼠和人MerTK CHO转染子的结合。使用与AlexaFluor647偶联的山羊抗小鼠IgG(Fc)(Jackson ImmunoResearch)作为次级试剂，通过FMAT筛选杂交瘤。简而言之，用hMERTK或mMERTK转染的CHO细胞经洗涤并以2×105细胞/ml的终浓度重悬浮于FMAT缓冲液中。将1∶15稀释的杂交瘤细胞上清液以及与终浓度为250ng/ml的山羊抗小鼠IgG FcAb的混合物添加到细胞中，并在室温下孵育2小时。然后在FMAT 8200细胞检测系统仪器(AppliedBiosystems，Foster City，CA)上读取平板，并使用Tibco Spotfire软件(Palo Alto，CA)分析数据。使用PE偶联的山羊抗小鼠IgG Fc特异性Ab(Jackson ImmunoResearch)，如实施例2所述的，通过FACS证实通过FMAT鉴定的阳性克隆。通过FACS对杂交瘤进行反筛选，以排除与Axl和/或Tyro3以及非特异性蛋白质(如KLH)结合的克隆。获得了约2,000个与人和/或小鼠MerTK选择性结合的moMAb克隆。

拮抗性抗MerTK moMAb的功能筛选

如实施例2中所述的，使用测定来测量胞葬作用的抑制和Gas6介导的信号转导的抑制，从而对这些moMAb克隆进行筛选，并针对激动剂潜力进行反筛选。基于以下内容选择克隆用于进一步表征：以亚纳摩尔的EC₅₀结合人和/或小鼠细胞(肿瘤细胞系和原代细胞)上的MerTK；以及以亚纳摩尔的IC₅₀将胞葬作用抑制到最大信号的80％以上；以及以亚纳摩尔的IC₅₀将Gas6介导的信号转导抑制到对照的80％以上，且无激动能力。通过下一代测序对这些克隆中编码Ab可变区的DNA进行测序，并基于抑制胞葬作用和MerTK介导的信号转导的潜力、序列多样性和有限的潜在序列负担，选择了约200个克隆。三个moMAb表现出强大的拮抗活性，即在信号测定中的IC₅₀值小于10nM，并被选择用于进一步分析。

抗MerTK moMAb的结合亲和力、结合动力学和分箱的表征

通过SPR分析表征了三个选择的moMAb对抗小鼠、人和食蟹猴MerTK的亲和力和结合动力学。这些Ab中的两个2D9和4E9显示出强大的拮抗活性，并以高亲和力结合小鼠、人和食蟹猴，而第三个选择的moMAb 16B9结合mMerTK，但不结合人或食蟹猴MerTK，表明mAb16B9结合与2D9或4E9所结合的不同的表位。SPR结合竞争研究可鉴定hMerTK抗原上相同或重叠表位竞争的mAb，其将2D9和4E9都分配给箱2。

产生了2D9和4E9的人源化变体。针对2D9、4E9和16B9，以及针对人源化Ab 2L105和4M60(分别由moMAb 2D9和4E9产生)的分箱数据以及胞葬作用和信号转导测定的结果包括在表1中。

针对选定的moMAb及其人源化形式获得的结合动力学数据包括在表2中。

人源化mAb 2L105和4M60的6个CDR的序列分别显示于表10和11中，而moMAb 2D9、4E9和16B9的6个CDR的序列分别显示于表12-14中。

人源化mAb 2L107和4M60的V_H、V_L、重链和轻链的氨基酸序列分别显示于表22和23中，而moMAb 2D9、4E9和16B9的V_H和V_L区的序列分别显示于表24-26中。

人、食蟹猴和小鼠MerTK多肽的氨基酸序列分别显示于表27-29中。

实施例4

抗MERTK增强了抗PD-1在MC38肿瘤模型中的抗肿瘤活性

在MC38结肠腺癌小鼠肿瘤模型中，与抗小鼠PD-1 Ab，4H2结合评估了小鼠抗MerTKmAb 4E9(小鼠IgG1同种型)的抗肿瘤活性。4H2是从大鼠IgG2a抗小鼠PD-1 Ab构建的嵌合大鼠-小鼠抗mPD-1 Ab，其中Fc部分被来自小鼠IgG1同种型的Fc部分替代(WO 2006/121168)。其阻断mPD-L1和mPD-L2与mPD-1的结合，刺激T细胞反应，并在多种小鼠肿瘤模型中表现出抗肿瘤活性。

给每只C57BL/6小鼠SC注射10⁶个MC38肿瘤细胞。肿瘤达到大约100mm³的中值大小后6天，将小鼠随机分配给治疗组(10只小鼠/组)。在PBS中配制的所有测试药剂(单一Ab或组合)，在第6天、第10天和第14天以200μl体积中200μg/剂进行IP给药。记录肿瘤体积、体重和临床观察结果以建立测试药剂的功效和耐受性。使用以下公式将肿瘤卡尺的测量值转换为肿瘤体积：体积＝1/2(长×宽×高)。植入后监测肿瘤生长和体重长达85天。从首次肿瘤测量为零起至少有45天没有残留肿瘤的小鼠被视为已正式“治愈”。

在研究中，小鼠接受了无菌的啮齿动物食物和水随意摄取，并被饲养在无菌的滤顶笼中，使用12小时的明/暗循环。所有实验均按照国际实验动物评估和认可协会的指导进行。

图1B显示了与使用对照小鼠IgG1 mAb(具有小鼠IgG1同种型的人抗白喉毒素(DT)mAb；简称“IgG1”)对照治疗的肿瘤生长速率相比，用抗PD-1 Ab治疗小鼠显著降低了肿瘤生长的速率，但到第47天也没有完全缩小任何小鼠中的肿瘤(图1A)。用抗PD-1和抗MerTK4E9-IgG1mAb组合治疗小鼠进一步显著降低了肿瘤生长速率，在植入后第34天，10只小鼠中的7只得到了有效的肿瘤治愈(图1C)。因此，抗PD-1和抗MerTK的组合在抑制MC38结肠腺癌的生长中显示出强烈的协同作用。如果组合的抗肿瘤作用大于每种Ab单独呈现的抑制水平的总和，则认为Ab的组合是协同作用的。

实施例5

来自抗MERTK和抗PD-1组合治疗的小鼠的治愈小鼠在再次挑战时能抵抗肿瘤生长

在这个实验中，将7只用抗PD-1和抗MerTK Ab联合治疗治愈的MC38肿瘤C57BL/6小鼠(实施例4)通过SC注射10⁶个MC38肿瘤细胞进行再挑战。10只C57BL/6小鼠的对照组各自SC注射10⁶个MC38肿瘤细胞，并且在植入后监测两组小鼠中的肿瘤生长至少23天。

对照组中的肿瘤快速生长，在植入后15-23天达到了1,500mm³的体积。相反，所有7只治愈的小鼠完全能抵抗MC38肿瘤生长(图2)。

实施例6

包含不同Fc区的两种不同抗MERTK Ab呈现出相似的抗肿瘤活性和相似的抗PD-1效力增强

在MC38肿瘤模型中，作为单一疗法或结合抗PD-1 Ab，4H2，评估了小鼠抗MerTKAb，2D9和4E9的抗肿瘤活性。使用了MerTK Ab的两种同种型，IgG1同种型和IgG1-D265A同种型，后者是非FcγR结合突变体(Clynes等，2000)。这个IgG1-D265A同种型已经显示出，与小鼠IgG2a和IgG1同种型相比，降低了MC38肿瘤模型中的抗CTLA4和抗GITRAb的抗肿瘤活性，相反，抗PD-1 IgG2a同种型呈现出低于抗IgG1或IgG1-D265A同种型的抗肿瘤活性(WO2014/089113)。

按照之前所述的(实施例4)，给每只C57BL/6小鼠SC注射10⁶个MC38肿瘤细胞，并随机分配给治疗组(10只小鼠/组)。如图3中所示，测试药剂包括小鼠IgG1对照、抗MerTK mAb2D9的IgG1和IgG1-D265A同种型、抗MerTK mAb 4E9的IgG1-D265A同种型、抗PD-1 mAb 4H2，以及抗MerTK和抗PD-1 Ab的组合。

2D9-IgG1 Ab(图3B)与IgG1对照(图3A)相比，引起了肿瘤生长的轻微抑制。2D9-D265A同种型(图3C)引起了与IgG1同种型大体相似或略高的肿瘤生长抑制水平。由2D9-D265A和4E9-D265A Ab诱导的肿瘤生长抑制水平相似。

抗PD-1产生了显著的肿瘤生长抑制，治疗的10只小鼠中有2只肿瘤完全抑制(图3E)。

抗PD-1和抗MerTK 2D9-IgG1 Ab的联合引起了甚至更强的肿瘤生长抑制，9只治疗的小鼠中有5只肿瘤完全抑制(图3F)。抗PD-1和抗MerTK 2D9-D265A或4E9-D265A Ab的组合产生了相似的肿瘤生长抑制的协同水平，治疗的小鼠中分别在9只中有7只以及10只中有5只肿瘤完全排斥(图3G和H)。因此，用给药的两种不同的小鼠抗MerTK Ab(4E9和2D9)观察到了相似的肿瘤生长抑制效力的协同水平，并且观察到了与Fc受体(FcR)效应子功能无关的相似效力，即IgG1同种型与IgG1-D265A相比。

与抗PD-1单一疗法相比，抗PD-1和抗MerTK抗体的组合在MC38模型中抑制肿瘤生长的增强功效在一系列抗MerTK Ab剂量下均可重现。作为单一疗法给药时，以1mg/kg体重的剂量给药的抗MerTK 4E9几乎没有呈现出抑制肿瘤生长的作用，但以1mg/kg的剂量显示出对肿瘤生长的中度抑制作用，尽管远低于用抗PD-1观察到的肿瘤生长抑制作用(数据未显示)。以1或3mg/kg的抗MerTK 4E9-IgG1与抗PD-1与的组合均能显著抑制肿瘤生长，分别有11只小鼠中的7只和11只小鼠中的9只显示出完全的肿瘤排斥(数据未显示)。抗PD-1与10mg/kg抗MerTK4E9-IgG1的组合几乎在所有小鼠中显著抑制肿瘤生长，但治愈率保持不变，其中11只小鼠中有8只显示出完全肿瘤抑制(数据未所示)。

实施例7

抗MERTK在CT26肿瘤模型中增强了抗PD-1的抗肿瘤活性还在CT26结肠腺癌小鼠肿瘤模型中作为单一疗法以及结合抗PD-1 Ab评估了mAb 4E9的抗肿瘤活性。

给每只BALB/c小鼠SC注射10⁶个CT26肿瘤细胞。肿瘤达到大约100mm³的中值大小后6天，将小鼠随机分配给治疗组，10只小鼠/组，并在第6天、第10天和第14天以200μl体积中200μg/剂进行IP给药Ab(单个Ab或组合)。植入后每周测量肿瘤体积两次长达85天，以建立正式治愈。

如图4B中所示的，与用小鼠IgG1对照治疗的肿瘤的生长速率相比(图4A)，抗PD-1Ab的治疗在降低大多数小鼠的肿瘤生长速率方面具有中等效果，但是一只小鼠的肿瘤生长被显著抑制，另一只小鼠显示出完全肿瘤排斥。与IgG1对照相比，4E9-IgG1 Ab在抑制肿瘤生长方面显示出轻微的活性(图4C)，而抗PD-1和抗MerkT 4E9-IgG1 Ab的联合治疗强有力地降低了肿瘤的生长速度，在植入后第38天，其中10只小鼠中有4只的肿瘤已治愈(图4D)。因此，抗PD-1和抗MerTK抗体也协同相互作用抑制了CT26结肠腺癌的生长。总体而言，CT26肿瘤对抗PD-1、抗MerTK或两种Ab联合治疗的反应模式(图4)与MC38肿瘤模型中看到的(图1和3)相似，但在MC38模型中，生长抑制作用大体上更为明显一些。

实施例8

抗MERTK MAB 16B9在MC38肿瘤模型中增强了抗PD-1的抗肿瘤活性

如实施例4和6中所示的，抗MerTK单克隆抗体2D9和4E9与抗PD-1联合协同作用，强有力地抑制了MC38结肠腺癌的生长。如实施例3中所述的，mAb 2D9和4E9在其都以高亲和力结合小鼠、人和食蟹猴MerTK，并被分配给hMerTK上的箱2的程度上是类似的。第三种抗-MerTK moMAb 16B9与2D9和4E9的不同之处在于，以高亲和力结合mMerTK，但不结合人或食蟹猴MerTK。由于它不结合hMerTK，因此无法分配给任何hMerTK分箱，但是这种与hMerTK结合的缺乏表明mAb16B9结合到与2D9或4E9所结合表位不同的表位。

在MC38肿瘤模型中，单独或与抗PD-1 mAb 4H2联合评估了抗MerTK mAb 16B9-D265A的抗肿瘤活性。如实施例4中所述的，将Ab施用于10只植入了MC38肿瘤的C57BL/6小鼠组中。如先前在实施例4和6中所证明的，与抗DT IgG1对照(“同种型”；图5A)相比，抗PD1治疗显著抑制了MC38肿瘤生长(图5B)，10只抗PD-1治疗的小鼠中有1只显示出完全肿瘤排斥。相反，用16B9-D265A抗MerTK抗体没有发现抑制肿瘤生长的单一药物活性，其产生的结果与IgG1对照相当。尽管不存在16B9-D265A对肿瘤生长的抑制，但该Ab和抗PD-1的组合仍产生了强大的协同相互作用，这可以通过与抗PD-1观察到的抗肿瘤活性的大幅增强来证明，包括10只小鼠中有7只完全肿瘤抑制(图5D)。

参考文献

Abhinandan KR，Martin AC(2008)Analysis and improvements to Kabat andstructurally correct numbering of antibody variable domains.Mol Immunol 45：3832-3839.

Akalu YT，Rothlin CV，Ghosh S(2017)TAM receptor tyrosine kinases asemerging targets of innate immune checkpoint blockade for cancertherapy.Immunol Rev 276(1)：165-77.

Al-Lazikani，Lesk AM，Chothia C(1997)Standard conformations for thecanonical structures of immunoglobulins.J Mol Biol 273(4)：927-48.

Baitsch L，Legat A，Barba L，Fuertes Marraco SA，Rivals JP等(2012)Extended co-expression of inhibitory receptors by human CD8 T-cells dependingon differentiation，antigen-specificity and anatomical localization.PloS One 7(2)：e30852.

Barker RN，Erwig LP，Hiu KS，Devine A，Pearce WP等(2002)Antigenpresentation by macrophages is enhanced by the uptake of necrotic，but notapoptotic，cells.Clin Exp Immunol 127(2)：220-5.

Bondanza A，Zimmermann VS，Rovere-Querini P，Turnay J，Dumitriu IE等(2004)Inhibition of phosphatidylserine recognition heightens theimmunogenicity of irradiated lymphoma cells in vivo.J Exp Med 200(9)：1157-1165.

Brahmer JR，Drake CG，Wollner I，Powderly JD，Picus J等(2010)Phase Istudy of single-agent anti-programmed death-1(MDX-1106)in refractory solidtumors：safety，clinical activity，pharmacodynamics，and immunologic correlates.JClin Oncol 28：3167-75.

Brahmer JR，Hammers H，Lipson EJ(2015)Nivolumab：targeting PD-1 tobolster antitumor immunity.Future Oncol 11(9)：1307-26.

Brahmer JR，Tykodi SS，Chow LQ，Hwu WJ，Topalian SL等(2012)Safety andactivity of anti-PD-L1 antibody in patients with advanced cancer.N Engl J Med366：2455-65.

Callahan M，Postow MA，Wolchok JD(2016)Targeting T cell co-receptorsfor cancer therapy.Immunity 44(5)：1069-78.

Caberoy NB，Alvarado G，Bigcas JL and Li W(2012)Galectin-3 is a newMerTK-specific eat-me signal.J Cell Physiol 227(2)：401-7.

Caberoy NB，Zhou Y，Li W(2010)Tubby and tubby-like protein 1 are newMerTK ligands for phagocytosis.EMBO J 29(23)：3898-910.

Callahan MK，Postow MA，Wolchok JD(2016)Targeting T Cell Co-receptorsfor Cancer Therapy.Immunity 44(5)：1069-78.

Chakravarthi BVSK，Nepal S，Varambally S(2016)Genomic and epigenomicalterations in cancer.Am J Pathol 186(7)：1724-35.

Chen DS，Mellman I(2013)Oncology meets immunology：the cancer-immunitycycle.Immunity 39(1)，1-10.

Chothia C，Lesk AM(1987)Canonical structures for the hypervariableregions of immunoglobulins.J Mol Biol 196：901-17.

Chothia C，Lesk AM，Tramontano A，Levitt M，Smith-Gill JS等(1989)Conformations of immunoglobulin hypervariable regions.Nature 342：877-83.

Clynes RA，Towers TL，Presta LG，Ravetch JV等(2000)Inhibitory Fcreceptors modulate in vivo cytotoxicity against tumor targets.Nat Med6：443-46.

Cook RS，Jacobsen KM，Wofford AM，DeRyckere D，Stanford J等(2013)MerTKinhibition in tumor leukocytes decreases tumor growth and metastasis.J ClinInvest 123(8)：3231-42.

Drugs.com-Opdivo Approval History：https://www.drugs.com/history/opdivo.html，last accessed October 8，2018.

Farkona等(2016)Cancer immunotherapy：the beginning of the end ofcancer？BMC Medicine 14：73.

Gorelik L，Avgerinos G，Kunes Y，Marasco WA(2017)Preclinicalcharacterization of a novel fully human IgG1 anti-PD-L1 mAb CK-301.In：Proceedings of the American Association for Cancer Research(AACR)AnnualMeeting，Apr 1-5，2017，Cancer Res 77(13 Suppl)：Abstract No.4606.

Graham DK，DeRyckere D，Davies KD，Earp HS(2014)The TAM family：phosphatidylserine sensing receptor tyrosine kinases gone awry incancer.Nature Rev Cancer 14：769-85.

Guo L，Zhang H，Chen B(2017)Nivolumab as Programmed Death-1(PD-1)inhibitor for targeted immunotherapy in tumor.J Cancer 8(3)：410-416.

Herbst RS，Soria JC，Kowanetz M，Fine GD，Hamid O等(2014)Predictivecorrelates of response to the anti-PD-L1 antibody MPDL3280A in cancerpatients.Nature 515：563-7.

Hollinger和Hudson(2005)Engineered antibody fragments and the rise ofsingle domaius.Nature Biotech 23(9)：1126-36.

Iwai Y，Hamanishi J，Chamoto K，Honjo T(2017)Cancer immunotherapiestargeting the PD-1 signaling pathway.J Biomed Sci 24(1)：26.

Jinushi M，Yagita H，Yoshiyama H，Tahara H(2013)Putting the brakes onanticancer therapies：suppression of innate immune pathways by tumor-associated myeloid cells.Trends Mol Med 19(9)：536-45.

Kabat EA，Wu TT，Bilofsky H，Reid-Miller M，Perry H(1983)Sequence ofproteius of immunological interest.Bethesda：National Institute of Health；1983.323

Kamta J，Chaar M，Ande A，Altomare DA，Ait-Oudhia S(2017)Advancing cancertherapy with present and emerging immuno-oncology approaches.Front Oncol 18(7)：64.

Kaufman RJ，Sharp PA(1982)Amplification and expression of sequencescotransfected with a modular dihydrofolate reductase complementary DNAgene.Mol Biol 159：601-21.

Lee-Sherick AB，Eisenman KM，Sather S，McGranahan A等(2013)Aberrant MERreceptor tyrosine kinase expression contributes to leukemogenesis in acutemyeloid leukemia.Oncogene 32：5359-68.

Lefranc MP，Pommie C，Ruiz M，Giudicelli V，Foulquier E等(2003)IMGTunique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains andIg superfamily V-like domains.Dev Comp Immunol 27：55-77.

Lesokhin AM，Callahan MK，Postow MA，Wolchok JD(2015)On being lesstolerant：enhanced cancer immunosurveillance enabled by targeting checkpointsand agonists of T cell activation.Sci Transl Med 7(280)：280sr1.

Linger RM，Cohen RA，Cummings CT，Sather S等(2013)MER or AXL receptortyrosine kinase inhibition promotes apoptosis，blocks growth and enhanceschemosensitivity of human non-small cell lung cancer.Oncogene 32：3420-3431.

Linger RM，Keating AK，Earp HS，Graham DK(2008)TAM receptor tyrosinekinases：biologic functions，signaling，and potential therapeutic targeting inhuman cancer.Adv Cancer Res 100：35-83.

Lipson EJ，Sharfman WH，Drake CG，Wollner I，Taube JM等(2013)Durablecancer regression off-treatment and effective reinduction therapy with ananti-PD-1 antibody.Clin Cancer Res 19：462-8.

Liu SY，Wu YL(2017)Ongoing clinical trials of PD-1 and PD-L1inhibitors for lung cancer in China.J Hematol Oncol 10(1)：136.

Lonberg，N(1994)Transgenic approaches to human monoclonalantibodies.Handbook of Experimental Pharmacology 113：49-101.

Lonberg N，Taylor LD，Harding FA，Trounstine M，Higgins KM等(1994)AntigeH-specific human antibodies from mice comprising four distinct geneticmodifications.Nature 368(6474)：856-9.

Mahoney KM，Rennert PD，Freeman GJ(2015)CombiHation cancerimmunotherapy and new immunomodulatory targets.Nat Rev Drug Discov 14(8)：561-84.

Martin A，Cheetham JC，Rees AR(1989)Modeling antibody hypervariableloops：a combined algorithm.Proc Natl Acad Sci USA 86(23)：9268-72.

MacCallum RM.，Martin ACR，Thornton JT(1996)Antibody-antigeninteractions：contact analysis and binding site topography.J Mol Biol 262：732-745.

Mellman I，Coukos G，Dranoff(2011)Cancer immunotherapy comes ofage.Nature 480：480-9.

Nguyen KQ，Tsou WI，Calarese DA，Kimani SG，Singh S等(2014).Overexpression of MERTK receptor tyrosine kinase in epithelial cancer cellsdrives efferocytosis in a gain-of-function capacity.J Biol Chem 289(37)：25737-49.

Olafsen和Wu(2010)Antibody vectors for imaging.Semin Nucl Med 40(3)：167-81.

Ott PA，Hodi FS，Kaufman HL，Wigginton JM，Wolchok JD(2017)Combinationimmunotherapy：a road map.J Immunother Cancer 5：16.

Pardoll DM(2012)The blockage of immune checkpoints in cancerimmunotherapy.Nat Rev Cancer 12：252-64.

PCT公开No.WO 2006/121168，公开于2006年11月16日，ONO Pharmaceutical Co.，Ltd.和Medarex，Inc.

PCT公开No.WO 2008/156712，公开于2008年12月24日，Organon NV.

PCT公开No.WO 2012/145493，公开于2012年10月26日，Amplimmune，Inc.

PCT公开No.WO 2013/173223，公开于2013年11月21日，Bristol-Myers SquibbCo.

PCT公开No.WO 2014/089113，公开于2014年6月12日，Bristol-Myers Squibb Co.

PCT公开No.WO 2014/179664，公开于2014年11月6日，AnaptysBio，Inc.

PCT公开No.WO 2014/194302，公开于2014年12月4日，Sorrento Therapeutics，Inc.

PCT公开No.WO 2014/206107，公开于2014年12月31日，Shanghai JunshiBiosciences Inc.

PCT公开No.WO 2015/035606，公开于2015年3月19日，Beigene，Ltd.

PCT公开No.WO 2015/085847，公开于2015年6月18日，Shanghai HengruiPharmaceutical Co.，Ltd.

PCT公开No.WO 2015/112800，公开于2015年7月30日，RegeneronPharmaceuticals，Inc.

PCT公开No.WO 2015/112900，公开于2015年7月30日，Dana-Farber CancerInstitute，Inc.and Novartis AG

PCT公开No.WO 2016/106159，公开于2016年6月30日，Enumeral BiomedicalHoldings，Inc.

PCT公开No.WO 2016/106221，公开于2016年6月30日，The RockefellerUniversity.

PCT公开No.WO 2016/149201，公开于2016年9月22日，Cytomx Therapeutics，Inc.

PCT公开No.WO 2016/197367，公开于2016年12月15日，Wuxi Biologics(Shanghai)Co.Ltd.

PCT公开No.WO 2017/020291，公开于2017年2月9日，Wuxi Biologics(Shanghai)Co.Ltd.

PCT公开No.WO 2017/020858，公开于2017年2月9日，Wuxi Biologics(Shanghai)Co.Ltd.

PCT公开No.WO 2017/024465，公开于2017年2月16日，Innovent Biologics(Suzhou)Co.，Ltd.

PCT公开No.WO 2017/024515，公开于2017年2月16日，Wuxi Biologics(Cayman)Inc.

PCT公开No.WO 2017/025016，公开于2017年2月16日，Innovent Biologics(Suzhou)Co.，Ltd.

PCT公开No.WO 2017/025051，公开于2017年2月16日，Wuxi Biologics(Cayman)Inc.

PCT公开No.WO 2017/034916，公开于2017年3月2日，Eli Lilly and Co.

PCT公开No.WO 2017/040790，公开于2017年3月9日，Agenus Inc.

PCT公开No.WO 2017/106061，公开于2017年6月22日，Macrogenics，Inc.

PCT公开No.WO 2017/123557，公开于2017年7月20日，Armo Biosciences，Inc.

PCT公开No.WO 2017/132827，公开于2017年8月10日，Innovent Biologics(Suzhou)Co.，Ltd.

PCT公开No.WO 2017/133540，公开于2017年8月10日，Innovent Biologics(Suzhou)Co.，Ltd.

PCT公开No.WO 2019/005756，公开于2019年1月3日，The RockefellerUniversity and Rgenix，Inc.

Pianko MJ，Liu Y，Bagchi S，Lesokhin AM(2017)Immune checkpoint blockadefor hematologic malignancies：a review.Stem Cell Investig 4：32.

Stitt TN，Conn G，Gore M，Lai C，Bruno J等(1995)The anticoagulationfactor protein-S and its relative，Gas6，are ligands for the Tyro 3/Axl familyof receptor tyrosine kinases.Cell 80：661-70.

Tsou WI，Nguyen KQ，Calarese DA，Garforth SJ，Antes AL等(2014)Receptortyrosine kinases，TYRO3，AXL，and MER，demonstrate distinct patterns and complexregulation of ligand-induced activation.J Biol Chem 289(37)：25750-63.

U.S.专利No.6,808,710，于2004年10月26日授权于Wood等。

U.S.专利No.7,488,802，于2009年2月10日授权于Collins等。

U.S.专利No.7,943,743，于2011年3月17日授权于Korman等。

U.S.专利No.7,767,429，于2010年8月3日授权于Bookbinder等。

U.S.专利No.8,008,449，于2011年8月30日授权于Korman等。

U.S.专利No.8,168,757，于2012年5月1日授权于Finnefrock等。

U.S.专利No.8,217,149，于2012年7月10日授权于Irving等。

U.S.专利No.8,354,509，于2013年1月15日授权于Carven等。

U.S.专利No.8,779,108，于2014年7月15日授权于Queva等。

U.S.专利No.9,175,082，于2015年11月3日授权于Zhou等。

U.S.专利No.9,205,148，于2015年12月3日授权于Langermann等。

U.S.专利No.9,624,298，于2017年4月18日授权于Nastri等。

U.S.公开No.2015/0079109，由Li等公开于2015年3月19日、

U.S.公开No.2016/0272708，由Chen等公开于2016年9月22日。

Wang C，Thudium KB，Han M，Wang XT等(2014)In vitro characterization ofthe anti-PD-1 antibody nivolumab，BMS-936558，and in vivo toxicology in non-human primates.Cancer Imm Res 2(9)：846-56.

Weber J(2010)Immune checkpoint proteins：a new therapeutic paradigmfor cancer-preclinical background：CTLA-4 and PD-1 blockade.Semin Oncol 37(5)：430-9.

Wolchok JD，Weber JS，Maio M，Neyns B，Harmankaya K等(2013)Four-yearsurvival rates for patients with metastatic melanoma who received ipilimumabin phase II clinical trials.Ann Oncol 24(8)：2174-80.

Wu TT，Kabat EA(1970)An analysis of the sequences of the variableregions of Bence Jones proteins and myeloma light chains and theirimplications for antibody complementarity.J Exp Med 132：211-250.

Yao S，Zhu Y，Chen L(2013)Advances in targeting cell surface signallingmolecules for immune modulation.Nature Rev Drug Discov 12：130-46.

Zhang F，Wei H，Wang X，Bai Y，Wang P等(2017)Structural basis of a novelPD-L1 nanobody for immune checkpoint blockade.Cell Discov 3：17004.

Zizzo G，Hilliard BA，Monestier M，Cohen PL(2012)Efficient clearance ofearly apoptotic cells by human macrophages requires M2c polarization andMerTK induction.J Immunol 189(7)：3508-20.

Claims

1.一种特异性结合细胞表面上表达的原癌基因酪氨酸-蛋白激酶MER(MerTK)并抑制由表达MerTK的细胞的胞葬作用的单克隆抗体，或其抗原结合部分。

2.根据权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其以以下的IC₅₀抑制表达人MerTK(hMerTK)的细胞的胞葬作用：

(a)约5nM或更低；

(b)约1nM或更低；

(c)约0.1nM或更低；

(d)约0.01nM至约1nM之间；

(e)约0.01nM至约0.7nM之间；

(f)约0.04nM至约0.7nM之间；或

(g)约0.04nM至约0.1nM之间。

3.根据权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其抑制生长停滞特异性蛋白6(Gas6)与hMerTK的结合并抑制MerTK/Gas6信号转导。

4.根据权利要求3所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其以以下的IC₅₀抑制MerTK/Gas6信号转导：

(a)约50nM或更低；

(b)约10nM或更低；

(c)约5nM或更低；

(d)约1nM或更低；

(e)约0.5nM或更低；

(f)约0.1nM或更低；

(g)约0.01nM至约10nM之间；

(h)约0.05nM至约6nM之间；

(i)约0.08nM至约2nM之间；或

(j)约0.2nM至约2nM之间。

5.根据权利要求1-4任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其特异性结合人MerTK，所述人MerTK的序列如SEQ ID NO:259所示。

6.根据权利要求5所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其以以下K_D结合人MerTK：

(a)约100nM或更低；

(b)约50nM或更低；

(c)约10nM或更低；

(d)约5nM或更低；

(e)约1nM或更低；

(f)约0.5nM或更低；

(g)约0.1nM或更低；

(h)约0.05nM或更低；

(i)约0.01nM或更低；

(j)约100nM至约0.1nM之间；

(k)约50nM至约0.5nM之间；

(l)约10nM至约1nM之间；或

(m)约6nM至约2nM之间。

7.根据权利要求1-4任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其特异性结合食蟹猴MerTK，所述食蟹猴MerTK的序列如SEQ ID NO:260所示。

8.根据权利要求7所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其以以下K_D结合食蟹猴MerTK：

(a)约100nM或更低；

(b)约50nM或更低；

(c)约10nM或更低；

(d)约5nM或更低；

(e)约1nM或更低；

(f)约0.5nM或更低；

(g)约0.1nM或更低；

(h)约100nM至约0.1nM之间；

(i)约50nM至约0.5nM之间；

(j)约10nM至约1nM之间；或

(k)约5nM至约1nM之间。

9.根据权利要求1-4任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其特异性结合小鼠MerTK，所述小鼠MerTK序列如SEQ ID NO:261所示。

10.根据权利要求9所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其以以下K_D结合小鼠MerTK：

(a)约100nM或更低；

(b)约50nM或更低；

(c)约10nM或更低；

(d)约5nM或更低；

(e)约1nM或更低；

(f)约0.5nM或更低；

(g)约0.1nM或更低；

(h)约100nM至约0.1nM之间；

(i)约50nM至约0.5nM之间；

(j)约10nM至约1nM之间；或

(k)约5nM至约1nM之间。

11.根据权利要求1-10任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其与以下的交叉反应：

(a)至少人和食蟹猴MerTK；

(b)至少人和小鼠MerTK；或

(c)人、食蟹猴和小鼠MerTK。

12.一种单克隆抗体，或其抗原结合部分，其特异性结合人原癌基因酪氨酸-蛋白激酶MER(hMerTK)上的箱1表位，所述hMerTK序列如SEQ ID NO:259所示，其中该表位位于跨越大约氨基酸残基105至165的区域内的hMerTK的第一Ig结构域中，如通过酵母展示和/或氢-氘交换质谱(HDX-MS)表位作图确定的。

13.根据权利要求12所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中箱1表位：

(a)位于hMerTK的跨越大约氨基酸残基126至155的区域内，如通过HDX-MS表位作图确定的；或

(b)包含氨基酸残基126至155中的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、十个、二十个或全部，如通过HDX-MS表位作图确定的。

14.一种单克隆抗体，或其抗原结合部分，其特异性结合人原癌基因酪氨酸-蛋白激酶MER(hMerTK)上的箱2表位，所述hMerTK序列如SEQ ID NO:259所示，其中该表位位于跨越大约氨基酸残基195至270的区域内的hMerTK的第二Ig结构域中，如通过酵母展示和/或氢-氘交换质谱(HDX-MS)表位作图确定的。

15.根据权利要求14所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中箱2表位：

(a)位于hMerTK的跨越大约氨基酸残基231至249的区域内，如通过HDX-MS表位作图确定的；

(b)包含氨基酸残基N234、S236、R237、E240、Q241、P242和G269中的一个、两个、三个、四个、五个、六个或全部，如通过酵母展示表位作图确定的；

(c)包含氨基酸残基N234、S236、R237、E240、Q241、P242和G269，如通过酵母展示表位作图确定的；或

(d)包含氨基酸残基231至249中的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、十个或全部，如通过HDX-MS和酵母展示表位作图确定的。

16.一种单克隆抗体，或其抗原结合部分，其特异性结合人原癌基因酪氨酸-蛋白激酶MER(hMerTK)上的箱3表位，所述hMerTK序列如SEQ ID NO:259所示，其中该表位位于跨越大约氨基酸残基420至490的区域内的hMerTK的纤连蛋白(Fn)结构域中，如通过酵母展示和/或氢-氘交换质谱(HDX-MS)表位作图确定的。

17.一种单克隆抗体，或其抗原结合部分，其特异性结合细胞表面上表达的人原癌基因酪氨酸-蛋白激酶MER(hMerTK)，并在以下每个中包含CDR1、CDR2和CDR3结构域：

(a)包含具有SEQ ID NO:217所示序列的连续连接的氨基酸的V_H和包含具有SEQ ID NO:218所示序列的连续连接的氨基酸的V_L；

(b)包含具有SEQ ID NO:221所示序列的连续连接的氨基酸的V_H和包含具有SEQ ID NO:222所示序列的连续连接的氨基酸的V_L；

(c)包含具有SEQ ID NO:225所示序列的连续连接的氨基酸的V_H和包含具有SEQ ID NO:226所示序列的连续连接的氨基酸的V_L；

(d)包含具有SEQ ID NO:229所示序列的连续连接的氨基酸的V_H和包含具有SEQ ID NO:230所示序列的连续连接的氨基酸的V_L；

(e)包含具有SEQ ID NO:233所示序列的连续连接的氨基酸的V_H和包含具有SEQ ID NO:234所示序列的连续连接的氨基酸的V_L；

(f)包含具有SEQ ID NO:237所示序列的连续连接的氨基酸的V_H和包含具有SEQ ID NO:238所示序列的连续连接的氨基酸的V_L；

(g)包含具有SEQ ID NO:241所示序列的连续连接的氨基酸的V_H和包含具有SEQ ID NO:242所示序列的连续连接的氨基酸的V_L；

(h)包含具有SEQ ID NO:245所示序列的连续连接的氨基酸的V_H和包含具有SEQ ID NO:246所示序列的连续连接的氨基酸的V_L；

(i)包含具有SEQ ID NO:249所示序列的连续连接的氨基酸的V_H和包含具有SEQ ID NO:250所示序列的连续连接的氨基酸的V_L；

(j)包含具有SEQ ID NO:253所示序列的连续连接的氨基酸的V_H和包含具有SEQ ID NO:254所示序列的连续连接的氨基酸的V_L；

(k)包含具有SEQ ID NO:255所示序列的连续连接的氨基酸的V_H和包含具有SEQ ID NO:256所示序列的连续连接的氨基酸的V_L；或

(l)包含具有SEQ ID NO:257所示序列的连续连接的氨基酸的V_H和包含具有SEQ ID NO:258所示序列的连续连接的氨基酸的V_L。

18.根据权利要求17所述的单克隆抗体，其包含以下通过Kabat方法定义的CDR结构域：

(a)包含具有SEQ ID NO:1所示序列的连续连接的氨基酸的重链可变区CDR1；包含具有SEQ ID NO:4所示序列的连续连接的氨基酸的重链可变区CDR2；包含具有SEQ ID NO:7所示序列的连续连接的氨基酸的重链可变区CDR3；包含具有SEQ ID NO:10所示序列的连续连接的氨基酸的轻链可变区CDR1；包含具有SEQ ID NO:13所示序列的连续连接的氨基酸的轻链可变区CDR2；和包含具有SEQ ID NO:16所示序列的连续连接的氨基酸的轻链可变区CDR3；或

(b)包含具有SEQ ID NO:73所示序列的连续连接的氨基酸的重链可变区CDR1；包含具有SEQ ID NO:76所示序列的连续连接的氨基酸的重链可变区CDR2；包含具有SEQ ID NO:79所示序列的连续连接的氨基酸的重链可变区CDR3；包含具有SEQ ID NO:82所示序列的连续连接的氨基酸的轻链可变区CDR1；包含具有SEQ ID NO:85所示序列的连续连接的氨基酸的轻链可变区CDR2；和包含具有SEQ ID NO:88所示序列的连续连接的氨基酸的轻链可变区CDR3。

19.根据权利要求17所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含：

20.根据权利要求17所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含

(a)包含具有SEQ ID NO:219所示序列的连续连接的氨基酸的重链和包含具有SEQ IDNO:220所示序列的连续连接的氨基酸的轻链；

(b)包含具有SEQ ID NO:223所示序列的连续连接的氨基酸的重链和包含具有SEQ IDNO:224所示序列的连续连接的氨基酸的轻链；

(c)包含具有SEQ ID NO:227所示序列的连续连接的氨基酸的重链和包含具有SEQ IDNO:228所示序列的连续连接的氨基酸的轻链；

(d)包含具有SEQ ID NO:231所示序列的连续连接的氨基酸的重链和包含具有SEQ IDNO:232所示序列的连续连接的氨基酸的轻链；

(e)包含具有SEQ ID NO:235所示序列的连续连接的氨基酸的重链和包含具有SEQ IDNO:236所示序列的连续连接的氨基酸的轻链；

(f)包含具有SEQ ID NO:239所示序列的连续连接的氨基酸的重链和包含具有SEQ IDNO:240所示序列的连续连接的氨基酸的轻链；

(g)包含具有SEQ ID NO:243所示序列的连续连接的氨基酸的重链和包含具有SEQ IDNO:244所示序列的连续连接的氨基酸的轻链；

(h)包含具有SEQ ID NO:247所示序列的连续连接的氨基酸的重链和包含具有SEQ IDNO:248所示序列的连续连接的氨基酸的轻链；或

(i)包含具有SEQ ID NO:251所示序列的连续连接的氨基酸的重链和包含具有SEQ IDNO:252所示序列的连续连接的氨基酸的轻链。

21.一种包含连接到治疗剂的根据权利要求1-20任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合部分的免疫缀合物，任选地其中治疗剂是细胞毒素或放射性同位素。

22.一种包含根据权利要求1-20任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合部分且其连接到具有不同于该单克隆抗体或其抗原结合部分的结合特异性的结合结构域的双特异性分子，。

23.一种组合物，其包含：

(a)权利要求1-20任一项的单克隆抗体或其抗原结合部分；

(b)权利要求21的免疫缀合物；或

(c)权利要求22的双特异性分子，

和药学上可接受的载体。

24.一种用于治疗罹患癌症的受试者的方法，包括将治疗有效量的权利要求1-20任一项的单克隆抗体或其抗原结合部分、权利要求21的免疫缀合物、权利要求22的双特异性分子或权利要求23的药物组合物，以及任选地联合用于治疗癌症的其他治疗剂，施用于受试者，使得受试者得到治疗。

25.权利要求24的方法，其中其他治疗剂是：

(a)特异性结合程序性死亡-1(PD-1)、程序性死亡配体-1(PD-L1)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)、淋巴细胞激活基因3(LAG-3)、B和T淋巴细胞衰减剂(BTLA)、T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域3(TIM-3)、杀伤免疫球蛋白样受体(KIR)、杀伤细胞凝集素样受体G1(KLRG-1)、腺苷A2a受体(A2aR)、自然杀伤细胞受体2B4(CD244)或CD160的拮抗性抗体；或

(b)特异性结合诱导性T细胞共刺激物(ICOS)、CD137(4-1BB)、CD134(OX40)、CD27、糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白(GITR)和疱疹病毒进入介体(HVEM)的激动性抗体。

26.一种用于治疗罹患癌症的受试者的药盒，所述药盒包含：

(a)范围为约0.1至约20mg/kg体重的一个或多个剂量的特异性结合MerTK的单克隆抗体或其抗原结合部分；

(b)任选地范围为200至约1600mg的一个或多个剂量的特异性结合PD-1或PD-L1的单克隆抗体或其抗原结合部分；和

(c)在权利要求24或25的方法中使用特异性结合MerTK的单克隆抗体或其部分和任选地特异性结合PD-1或PD-L1的抗体或其部分的说明。