CN112105359B - 作为cccDNA抑制剂用于治疗乙型肝炎病毒(HBV)感染的吡咯并[2,3-b]吡嗪化合物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及针对乙型肝炎病毒(HBV)感染的新治疗剂,特别是用于HBV治愈的关键障碍的病毒共价闭合环状DNA(cccDNA)的抑制剂。因此,本发明提供了如本文所述和定义的式(I)的吡咯并[2,3‑b]吡嗪化合物,其用于治疗HBV感染。本文提供的化合物对HBV感染高度有效,并且能够改善治疗,特别是对于慢性HBV感染和HBV反弹。本发明还涉及用于鉴定抗HBV感染的治疗剂、特别是cccDNA抑制剂的新的筛选测定法,该测定法在肝细胞样细胞中进行,所述肝细胞样细胞涵盖了在患者来源的HBV感染后的完整的HBV生命周期。
Description
本发明涉及针对乙型肝炎病毒(HBV)感染的新型治疗剂,特别是代表HBV治愈的关键病毒学障碍的病毒共价闭合环状DNA(cccDNA)抑制剂。因此,本发明提供了如本文所述和定义的式(I)的吡咯并[2,3-b]吡嗪化合物,其用于治疗HBV感染。本文提供的化合物对HBV感染高度有效,并且能够改善治疗,特别是对于慢性HBV感染和HBV反弹。本发明还涉及用于鉴定抗HBV感染的治疗剂、特别是cccDNA抑制剂的新的筛选测定法,该测定法在肝细胞样细胞中进行,所述肝细胞样细胞涵盖了患者来源的HBV感染后的完整的HBV生命周期。
慢性乙型肝炎病毒(CHB)感染影响全世界约2.48亿人,每年造成约686,000例死亡(GBD 2013;Schweitzer等人,2015)。长期研究表明,高病毒载量与肝硬化、肝细胞癌(HCC)和死亡率增加相关(Chen等人,2006;Iloeje等人,2006;Iloeje等人,2007;Liu等人,2016)。因此,在没有治愈性治疗的情况下,大多数被CHB感染的个体有发展为肝硬化和/或肝癌的风险。
当前的标准护理(SOC)治疗可有效抑制乙型肝炎病毒(HBV)DNA复制,但不能治愈,因为它不靶向于病毒遗传模板,即共价闭合环状DNA(cccDNA),这是HBV治愈的病毒学障碍。cccDNA驻留在被感染的肝细胞核中,产生了生产性感染所需的所有HBV RNA转录物,并在CHB感染的自然过程中导致了病毒的持久性(Locarnini&Zoulim,2010)。cccDNA是停止SOC治疗后病毒反弹、免疫抑制剂治疗后病毒再次活化或肝移植后病毒反弹的来源(Nassal,2015;Kumar等人,2016)。因此,迫切需要靶向于cccDNA的新疗法。
但是,鉴定cccDNA抑制剂的药物开发工作具有挑战性。HBV在体外传播较差,替代模型例如经过工程化以表达cccDNA的肝癌细胞系(Ladner等人,1997;Guo等人,2007)的cccDNA形成效率非常低,因此HBV转基因而非cccDNA充当了主要的转录模板(Nassal,2015,Zhang等人,2016)。使用此类系统发现cccDNA抑制剂需要在更相关的测定中进行多次反复筛选,以确认化合物是否作用于cccDNA,而不作用于转基因。
此外,现有的HBV系统不能捕获HBV基因型(GT)多样性,因为它们主要基于一个GT。在全球范围内,HBV病毒以10种GT形式存在,约有40种亚型;每个GT在地理分布、传播方式和病毒学特征方面均具有独特的属性。HBV GT是HBV发病机理中的重要参数之一,因为它影响病毒的发病机理、疾病进展、对治疗的反应(例如用干扰素-α治疗)、以及肝硬化和HCC发生的危险因素(Buster等人,2009;Lin&Kao,2017;Rajoriya等人,2017)。
如上所述,现有的HBV系统主要依靠特定HBV GT的实验室株系,因此无法在体内捕获HBV GT的多样性。在药物发现工作中使用实验室株系代替临床HBV分离株也可能导致对“真实世界”HBV的化合物效力的过高估计。此外,这些系统主要基于肝癌细胞系,例如HepG2细胞系,其已显示与人肝细胞的相似性较差(Uhlen等人,2015)。
因此,非常需要提供一种不仅适用于高通量筛选(HTS),而且适合评估针对“真实世界”病原体(即来自各种GT的临床HBV分离株)的化合物效力范围的HBV测定法。总体上,迫切需要改进的HBV系统以鉴定新型cccDNA抑制剂。理想情况下,此类测定应具有四个显著特征,即i)稳定,ii)自然感染后可涵盖完整的病毒生命周期,iii)适用于筛选针对临床HBV分离株的化合物,以及iv)在生理细胞类型(例如原代细胞或干细胞)中进行。后者被认为是增加临床前研究结果转化为临床的关键参数之一(Eglen&Reisine,2011;Vincent等人,2015)。
然而,实际上,原代人肝细胞(PHH)的供应有限、快速去分化以及供体与供体之间的变异性使其不适合用作HTS平台(Frazcek等人,2013;Mabit等人,1996)。在这方面,诱导的多能干细胞(iPS)有望成为PHH的替代品,因为它们具有分化为多种疾病相关细胞类型的能力和自我更新的潜力(Eglen&Reisine,2011;Shi等人,2017;Ursu等人,2017)。
已经描述了用于鉴定HBV cccDNA抑制剂的筛选方法,例如Antiviral Res,2016,132:26-37和Cai D等人,Antimicrob Agents Chemother,2012,56(8):4277-88。但是,相应的筛选方法使用重组HepG2细胞系作为cccDNA的替代模型;不知道在这样一个系统中鉴定出的任何化合物是否都证实能在更相关的系统即PHH中抑制临床HBV分离株的cccDNA。在WO2011/144585中已经描述了某些吡咯并吡嗪化合物作为JAK和SYK抑制剂,用于治疗自身免疫病和炎性疾病。
在本发明的上下文中,已经开发了一种新的疾病相关测定法,即,感染了来自四(4)个主要GT(A-D)的临床HBV分离株的干细胞衍生的肝样细胞(本文称为HLC)或PHH。这是首次在原代样细胞中进行的HTS,其可涵盖感染患者来源的HBV后的完整的HBV生命周期。在该测定法中,反复筛选级联(包括在PHH中进行早期命中验证)导致鉴定出在自然感染情况下靶向于难以捉摸的HBV cccDNA的化合物。这种方法表明,源自iPS的肝样细胞(HLC)代表了模式转换,以发现新的cccDNA抑制剂,这是HBV治愈的关键障碍。
在对约24 7,000种化合物的库进行HTS后,用于HBV药物发现的该HLC平台已成功用于发现新的且有效的cccDNA抑制剂。也如实施例1中所述,设计了定制的筛选级联来解决被感染细胞中cccDNA固有的低水平(0.1-1个拷贝/细胞),这是基于可通过其更丰富的转录产物依次鉴定cccDNA抑制剂(HBsAg>>>HBeAg>>pgRNA>cccDNA)。因此,将多重测定(HBsAg、HBeAg和白蛋白)用作主要的HTS读数,以鉴定HBsAg和HBeAg的双重抑制剂,并排除非特异性的/毒性的化合物(白蛋白是抗毒素筛选)。随后对已筛出的化合物针对pgRNA(cccDNA转录活性的代表读数)进行测试,最后通过基于cccDNA的新型数字PCR测定法(dPCR试验)测试选中的化合物。这种方法的优势在于,它可以使用384孔板(HTS的常见平板模式)中存在的少量细胞(~30,000个细胞)直接评估化合物对cccDNA的活性。然后在Southern印迹法试验中确认在dPCR试验中有活性的化合物,Southern印迹法试验是一种经验证的cccDNA检测方法,但灵敏度较低,与dPCR相比需要约15倍的细胞量。
这种方法成功鉴定了新的HBV抑制剂,尤其是引起至少部分cccDNA降解的新的cccDNA抑制剂,如对PHH中来自主要GT(A-D)的患者来源的HBV的cccDNA所示。化合物对各种HBV标志物的效力分析表明,化合物对HBsAg和HBeAg可能具有很高的效力,但是其效力(HBsAg和HBeAg IC50)并不总是与其cccDNA IC50相关,这突出了直接测量cccDNA对cccDNA抑制剂效能的准确评估的重要性。此外,当针对细胞培养来源的HBV和/或在非PHH细胞中进行测试时,化合物效力可能会有所不同,这一事实突显了化合物测试在疾病相关的测定法中的重要性,所述测定法更好地模拟体内条件,以提高其在临床中的可转换性。
因此,本发明解决了提供满足上述需求的疾病相关筛选测定的问题,特别是高通量筛选测定法,其使用HLC中的临床分离物涵盖了完整的HBV生命周期,并允许鉴定有效的抗HBV感染的治疗剂,即HBV cccDNA的抑制剂。本发明同样解决了提供用于治疗HBV感染的新的和/或改进的治疗剂的问题,特别是充当cccDNA抑制剂并因此对HBV非常有效的化合物,包括在慢性HBV感染的治愈性治疗中以及治疗或抑制HBV再活化/反弹中非常有效的化合物。
因此,本发明提供了用于治疗乙型肝炎病毒感染的下式(I)的化合物或其可药用盐:
在式(I)中,基团L1选自:
-CO-N(RL1)-、-N(RL1)-CO-、-CO-、-N(RL1)-、-C(=O)O-、-O-C(=O)-、-SO-、-SO2-、-SO2-N(RL1)-和-N(RL1)-SO2-。
RL1各自独立地选自氢和C1-5烷基。
R1是C1-12烷基、C2-12烯基或C2-12炔基,其中所述烷基、所述烯基或所述炔基是被一个或多个基团R10取代,并且进一步地其中所述烷基、所述烯基或所述炔基任选地被一个或多个基团R11取代。
R10各自独立地选自-OH、-O(C1-5烷基)以及具有至少一个环氧原子的杂环基。
R11各自独立地选自-O(C1-5亚烷基)-OH、-O(C1-5亚烷基)-O(C1-5烷基)、-SH、-S(C1-5烷基)、-S(C1-5亚烷基)-SH、-S(C1-5亚烷基)-S(C1-5烷基)、-NH2、-NH(C1-5烷基)、-N(C1-5烷基)(C1-5烷基)、卤素、C1-5卤代烷基、-O-(C1-5卤代烷基)、-CF3、-CN、-CHO、-CO-(C1-5烷基)、-COOH、-CO-O-(C1-5烷基)、-O-CO-(C1-5烷基)、-CO-NH2、-CO-NH(C1-5烷基)、-CO-N(C1-5烷基)(C1-5烷基)、-NH-CO-(C1-5烷基)、-N(C1-5烷基)-CO-(C1-5烷基)、-SO2-NH2、-SO2-NH(C1-5烷基)、-SO2-N(C1-5烷基)(C1-5烷基)、-NH-SO2-(C1-5烷基)、-N(C1-5烷基)-SO2-(C1-5烷基)、碳环基和杂环基,其中所述碳环基和所述杂环基各自任选地被一个或多个基团R12取代;并且进一步地其中连接在相同碳原子上的任意两个基团R11(如果存在)与其所连接的碳原子一起任选地形成5-至8-元碳环或杂环,其中所述5-至8-元碳环或杂环任选地被一个或多个基团R12取代。
R12各自独立地选自C1-5烷基、C2-5烯基、C2-5炔基、-(C0-3亚烷基)-OH、-(C0-3亚烷基)-O(C1-5烷基)、-(C0-3亚烷基)-SH、-(C0-3亚烷基)-S(C1-5烷基)、-(C0-3亚烷基)-NH2、-(C0-3亚烷基)-NH(C1-5烷基)、-(C0-3亚烷基)-N(C1-5烷基)(C1-5烷基)、-(C0-3亚烷基)-卤素、-(C0-3亚烷基)-(C1-5卤代烷基)、-(C0-3亚烷基)-O-(C1-5卤代烷基)、-(C0-3亚烷基)-CF3、-(C0-3亚烷基)-CN、-(C0-3亚烷基)-CHO、-(C0-3亚烷基)-CO-(C1-5烷基)、-(C0-3亚烷基)-COOH、-(C0-3亚烷基)-CO-O-(C1-5烷基)、-(C0-3亚烷基)-O-CO-(C1-5烷基)、-(C0-3亚烷基)-CO-NH2、-(C0-3亚烷基)-CO-NH(C1-5烷基)、-(C0-3亚烷基)-CO-N(C1-5烷基)(C1-5烷基)、-(C0-3亚烷基)-NH-CO-(C1-5烷基)、-(C0-3亚烷基)-N(C1-5烷基)-CO-(C1-5烷基)、-(C0-3亚烷基)-SO2-NH2、-(C0-3亚烷基)-SO2-NH(C1-5烷基)、-(C0-3亚烷基)-SO2-N(C1-5烷基)(C1-5烷基)、-(C0-3亚烷基)-NH-SO2-(C1-5烷基)和-(C0-3亚烷基)-N(C1-5烷基)-SO2-(C1-5烷基)。
R2选自氢、C1-5烷基、C2-5烯基、C2-5炔基、-(C0-3亚烷基)-OH、-(C0-3亚烷基)-O(C1-5烷基)、-(C0-3亚烷基)-SH、-(C0-3亚烷基)-S(C1-5烷基)、-(C0-3亚烷基)-NH2、-(C0-3亚烷基)-NH(C1-5烷基)、-(C0-3亚烷基)-N(C1-5烷基)(C1-5烷基)、-(C0-3亚烷基)-卤素、-(C0-3亚烷基)-(C1-5卤代烷基)、-(C0-3亚烷基)-O-(C1-5卤代烷基)、-(C0-3亚烷基)-CF3、-(C0-3亚烷基)-CN、-(C0-3亚烷基)-CHO、-(C0-3亚烷基)-CO-(C1-5烷基)、-(C0-3亚烷基)-COOH、-(C0-3亚烷基)-CO-O-(C1-5烷基)、-(C0-3亚烷基)-O-CO-(C1-5烷基)、-(C0-3亚烷基)-CO-NH2、-(C0-3亚烷基)-CO-NH(C1-5烷基)、-(C0-3亚烷基)-CO-N(C1-5烷基)(C1-5烷基)、-(C0-3亚烷基)-NH-CO-(C1-5烷基)、-(C0-3亚烷基)-N(C1-5烷基)-CO-(C1-5烷基)、-(C0-3亚烷基)-SO2-NH2、-(C0-3亚烷基)-SO2-NH(C1-5烷基)、-(C0-3亚烷基)-SO2-N(C1-5烷基)(C1-5烷基)、-(C0-3亚烷基)-NH-SO2-(C1-5烷基)、-(C0-3亚烷基)-N(C1-5烷基)-SO2-(C1-5烷基)、-(C0-3亚烷基)-碳环基和-(C0-3亚烷基)-杂环基,其中所述-(C0-3亚烷基)-碳环基的碳环基部分和所述-(C0-3亚烷基)-杂环基的杂环基部分各自任选的被一个或多个基团R12取代。
R3选自氢、C1-5烷基和-CO(C1-5烷基)。
R4和R5各自独立地选自氢、C1-5烷基、C2-5烯基、C2-5炔基、-(C0-3亚烷基)-OH、-(C0-3亚烷基)-O(C1-5烷基)、-(C0-3亚烷基)-SH、-(C0-3亚烷基)-S(C1-5烷基)、-(C0-3亚烷基)-NH2、-(C0-3亚烷基)-NH(C1-5烷基)、-(C0-3亚烷基)-N(C1-5烷基)(C1-5烷基)、-(C0-3亚烷基)-卤素、-(C0-3亚烷基)-(C1-5卤代烷基)、-(C0-3亚烷基)-O-(C1-5卤代烷基)、-(C0-3亚烷基)-CF3、-(C0-3亚烷基)-CN、-(C0-3亚烷基)-CHO、-(C0-3亚烷基)-CO-(C1-5烷基)、-(C0-3亚烷基)-COOH、-(C0-3亚烷基)-CO-O-(C1-5烷基)、-(C0-3亚烷基)-O-CO-(C1-5烷基)、-(C0-3亚烷基)-CO-NH2、-(C0-3亚烷基)-CO-NH(C1-5烷基)、-(C0-3亚烷基)-CO-N(C1-5烷基)(C1-5烷基)、-(C0-3亚烷基)-NH-CO-(C1-5烷基)、-(C0-3亚烷基)-N(C1-5烷基)-CO-(C1-5烷基)、-(C0-3亚烷基)-SO2-NH2、-(C0-3亚烷基)-SO2-NH(C1-5烷基)、-(C0-3亚烷基)-SO2-N(C1-5烷基)(C1-5烷基)、-(C0-3亚烷基)-NH-SO2-(C1-5烷基)、-(C0-3亚烷基)-N(C1-5烷基)-SO2-(C1-5烷基)、-(C0-3亚烷基)-碳环基和-(C0-3亚烷基)-杂环基,其中所述-(C0-3亚烷基)-碳环基的碳环基部分和所述-(C0-3亚烷基)-杂环基的杂环基部分各自任选的被一个或多个基团R12取代。
本发明进一步提供了用于治疗乙型肝炎病毒感染的药物组合物,其中所述药物组合物包含式(I)的化合物或其可药用盐和任选的可药用赋形剂。
本发明同样涉及式(I)化合物或其可药用盐在制备用于治疗乙型肝炎病毒感染的药物中的用途。
此外,本发明提供了治疗乙型肝炎病毒感染的方法,该方法包括施用式(I)的化合物或其可药用盐(或包含式(I)的化合物或其可药用盐以及任选地包含可药用赋形剂的药物组合物)给有需要的个体(例如人)。该方法特别包括向个体施用治疗有效量的式(I)的化合物或其可药用盐。
本发明的化合物在治疗HBV感染,包括抑制HBV重新活化/反弹方面是高度有利的。具体而言,本发明提供了病毒cccDNA的抑制剂,即抑制HBV cccDNA稳定性和/或其转录活性的治疗剂,因此提供了HBV治愈的可能性。此外,本发明的化合物被认为在实际临床条件下特别有效,正如所附实施例中所证实的那样,其中已证明示例性的式(I)化合物针对四种主要HBV基因型的有效功效。
因此,本发明特别涉及在治疗乙型肝炎病毒(HBV)感染中用作cccDNA抑制剂的式(I)的化合物或其可药用盐(或包含式(I)的化合物或其可药用盐以及任选地可药用赋形剂的药物组合物)。本发明同样涉及式(I)的化合物或其可药用盐(或相应的药物组合物,即包含式(I)的化合物或其可药用盐以及任选地可药用赋形剂的药物组合物),其用于通过抑制HBV cccDNA治疗HBV感染。此外,本发明还涉及式(I)化合物或其可药用盐(或相应的药物组合物),其用于通过使HBV cccDNA不稳定来治疗HBV感染。
对根据本发明进行治疗的乙型肝炎病毒感染没有特别限制。例如,它可能是任何一种或多种乙型肝炎病毒基因型的感染,例如HBV/A(即,乙型肝炎病毒基因型A)、HBV/B、HBV/C、HBV/D、HBV/E、HBV/F、HBV/G、HBV/H、HBV/I和/或HBV/J,特别是HBV/A、HBV/B、HBV/C、HBV/D和/或HBV/E中的任何一种或多种,更优选HBV/A、HBV/B、HBV/C和/或HBV/D中的任何一种或多种。尽管待治疗的HBV感染还可以是例如急性HBV感染或慢性HBV感染,但是本发明特别涉及慢性HBV感染(包括由前述任何一种或多种HBV基因型,例如HBV/A、HBV/B、HBV/C、HBV/D、HBV/E、HBV/F,HBV/G、HBV/H、HBV/I和/或HBV/J引起的慢性感染或慢性感染性疾病)的治疗。本发明要治疗的HBV感染也可以是暴发性的(或严重)HBV感染。此外,本发明还涉及在免疫功能低下的和/或HIV阳性的个体或免疫抑制的个体(特别是相应的人类个体)中治疗HBV感染(尤其包括任何上述具体类型的HBV感染)。
在HBV感染后,尤其是在使用标准护理药物治疗HBV感染后,HBV遗传模板(即cccDNA)仍然存在于个体体内,最终可能导致HBV感染的再活化或复发。HBV再活化现象(或HBV复发或HBV反弹)在医学领域是众所周知的,对HBV患者构成严重风险(参见例如Roche B等人,Liver Int,2011,31Suppl1:104-10;Mastroianni CM等人,World J Gastroenterol,2011,17(34):3881-7;或Vierling JM,Clin Liver Dis,2007,11(4):727-59)。本发明提供了可以靶向病毒cccDNA的化合物,因此可以通过抑制或破坏HBV cccDNA来治愈HBV感染。因此,本发明还涉及使用本文提供的cccDNA抑制剂,特别是式(I)的化合物或其可药用盐来治疗或抑制HBV再活化(或HBV复发或反弹)。
因此,本发明还涉及式(I)的化合物或其可药用盐(或相应的药物组合物,即,包含式(I)的化合物或其可药用盐以及任选地可药用赋形剂的药物组合物),其用于治疗或抑制HBV再活化。本发明同样提供了用于治疗或抑制HBV复发(或HBV感染的复发)的式(I)化合物或其可药用盐(或相应的药物组合物)。本发明还涉及用于治疗或抑制HBV反弹(或HBV感染的反弹)的式(I)化合物或其可药用盐(或相应的药物组合物)。根据本发明的HBV再活化(或HBV复发或HBV反弹)的治疗或抑制尤其包括HBV再活化(或HBV复发或反弹)的预防性治疗(即预防)。本发明还涉及式(I)的化合物或其可药用盐(或相应的药物组合物)在制备用于治疗或抑制HBV再活化、或用于治疗或抑制HBV复发、或用于治疗或抑制HBV反弹的药物中的用途。此外,本发明同样提供了一种治疗或抑制HBV再活化(或HBV复发或HBV反弹)的方法,该方法包括将式(I)化合物或其可药用盐(或相应的药物组合物)施用于有需要的个体。
本发明还涉及式(I)的化合物或其可药用盐作为乙型肝炎病毒cccDNA的抑制剂(即,作为HBV cccDNA抑制剂)在研究中的用途,特别是作为用于抑制HBV cccDNA的研究工具化合物的用途。因此,本发明涉及式(I)的化合物或其可药用盐作为HBV cccDNA抑制剂的体外用途,以及特别是涉及式(I)的化合物或其可药用盐作为研究工具化合物用作HBVcccDNA抑制剂的体外用途。本发明同样涉及抑制HBV cccDNA(例如使HBV cccDNA失稳或沉默)的方法,特别是体外方法,该方法包括应用式(I)化合物或其可药用盐。本发明进一步涉及抑制HBV cccDNA的方法,该方法包括将式(I)化合物或其可药用盐施用于测试样品(例如,生物学样品)或测试动物(即,非人的测试动物)。本发明还涉及在样品(例如生物样品)中抑制HBV cccDNA的方法,特别是体外方法,该方法包括将式(I)化合物或其可药用盐施用于所述样品。本发明进一步提供了抑制HBV cccDNA的方法,该方法包括使测试样品(例如,生物学样品)或测试动物(即,非人的测试动物)与式(I)的化合物或其可药用盐接触。术语“样品”、“测试样品”和“生物样品”包括但不限于:细胞、细胞培养物或者细胞或亚细胞提取物;从动物(例如人)获得的活检材料或其提取物;或血液、血清、血浆、唾液、尿液、粪便或任何其它体液或其提取物。应当理解,术语“体外”在此特定上下文中以“在活的人或动物体外”的意义使用,其尤其包括使用在人工环境(例如可以在例如培养瓶、试管、培养皿、微量滴定板等中提供的水溶液或培养基)中的细胞、细胞或亚细胞提取物和/或生物分子进行的实验。
本发明还提供了鉴定HBV cccDNA抑制剂的方法,该方法包括:
-提供感染了HBV的干细胞衍生的肝细胞样细胞;
-将测试化合物经受感染了HBV的干细胞衍生的肝细胞样细胞;
-测定测试化合物对感染的干细胞衍生的肝细胞样细胞中HBsAg和HBeAg的抑制作用;
-任选地测定测试化合物对感染的干细胞衍生的肝细胞样细胞中白蛋白的抑制作用,以及如果发现测试化合物抑制白蛋白,则将其排除在进一步测试之外;
-如果发现测试化合物抑制HBsAg和HBeAg,则测定测试化合物对HBV pgRNA的抑制作用;
-如果发现测试化合物抑制HBV pgRNA,则测定测试化合物对HBV cccDNA的抑制作用;和
-如果发现测试化合物抑制HBV cccDNA,则选择测试化合物作为HBV cccDNA抑制剂。
此筛选方法的高度优势在于,它可以使用涵盖整个HBV生命周期并使用多重HBV基因型的临床HBV分离株的生理系统,鉴定HBV cccDNA抑制剂,尤其是能够使HBV cccDNA失稳的化合物(即HBV cccDNA去稳定剂),从而很好地捕捉了“真实世界”中发现的HBV基因型多样性。如本文结合式(I)的化合物所述,用该方法鉴定的化合物可用于HBV治疗。特别地,如此鉴定的HBV cccDNA抑制剂可用于治疗(或治愈)HBV感染(包括慢性HBV感染),或用于治疗或抑制HBV再活化(或HBV反弹或衰退)。该筛选方法也可以称为鉴定HBV cccDNA抑制剂的体外方法。
如上所述,该方法包括提供感染了HBV(优选患者来源的HBV)的干细胞衍生的肝细胞样细胞的步骤。肝细胞样细胞衍生自干细胞,特别是衍生自诱导干细胞,更优选衍生自诱导多能干细胞(iPS)。相应的干细胞(例如诱导的多能干细胞)可以是哺乳动物细胞(例如小鼠细胞),并且优选是人细胞(或已经由人细胞产生)。因此,术语“干细胞衍生的肝细胞样细胞”是指已经分化/成熟为肝细胞(或换句话说,为肝细胞样细胞)的干细胞(特别是诱导的多能干细胞),且在本文中与“源自干细胞的肝细胞”或“获自干细胞的肝细胞”或“获自干细胞的肝细胞样细胞”同义。
被HBV感染的干细胞衍生的肝细胞样细胞优选被患者来源的HBV感染,特别是被从临床样品中分离的HBV感染。尽管HBV(或患者来源的HBV)可以是任何基因型(GT),但优选使用两组或更多组源自干细胞的肝细胞样细胞,其中每组细胞用不同的HBV GT感染,且更优选使用至少四组干细胞衍生的肝细胞样细胞,其分别用来自患者的HBV GT A、B、C和D感染。
提供感染了HBV的干细胞衍生的肝细胞样细胞的步骤优选包括(即,优选通过执行以下步骤进行):
-用WO 2014/140058中公开的化合物(优选如下所示的化合物MB-1或MB-2或其可药用盐)处理干细胞(优选多能干细胞,更优选诱导的多能干细胞)以获得干细胞衍生的肝细胞样细胞;和
-由此获得的细胞用HBV(优选用患者来源的HBV,更优选用患者来源的GT A、B、C或D的HBV)感染,以获得感染了HBV的干细胞衍生的肝细胞样细胞。
上述“WO 2014/140058中公开的化合物”可以是如在WO 2014/140058中描述和定义的任何式I的化合物,包括该文件中描述的任何一种具体/示例性的化合物之一或这些化合物的任何可药用盐之一。在US 2015/0197726和US2015/0158840中也描述了相应的化合物。优选地,“WO 2014/140058中公开的化合物”是以下化合物MB-1至MB-7中任何一种或其可药用盐:
该化合物还可以是上述化合物MB-1、MB-2或MB-3中的任何一种的立体异构体,特别是对映异构体或非对映异构体,或其可药用盐。更优选地,该化合物是MB-1或MB-2或其可药用盐,甚至更优选地,它是MB-1或其可药用盐。
因此,特别优选用化合物MB-1或MB-2或其可药用盐(甚至更优选地用化合物MB-1或其可药用盐)处理干细胞(或诱导的多能干细胞),以获得干细胞衍生的肝细胞样细胞,然后将如此获得的细胞用HBV(优选用HBV基因型A、B、C或D的临床HBV分离株)感染以获得用HBV感染的干细胞衍生的肝细胞样细胞。
优选的,不同的干细胞衍生的肝细胞样细胞集合分别被不同基因型的HBV感染。优选地,用两种或更多种HBV基因型,更优选地三种或更多种HBV基因型,更优选地四种或更多种HBV基因型,甚至更优选地五种或更多种HBV基因型,甚至更优选地六种或多种HBV基因型感染细胞集合。HBV基因型可以选自HBV基因型A、B、C、D、E、F、G、H、I和J,优选选自HBV基因型A、B、C、D、E和F。特别优选地,不同的干细胞衍生的肝细胞样细胞的单独集合分别被至少来自HBV基因型A、B、C和D的临床HBV分离株感染,甚至更优选地被至少来自于HBV基因型A、B、C、D、E和F的临床HBV分离株感染。为了测试几种不同的HBV GT,试验化合物可以经受多种不同的干细胞衍生的肝细胞样细胞集合(每个细胞集合都用不同的特定GT的HBV感染)。因此,尽管这些细胞适合于感染所有HBV基因型,但对于化合物检测,优选一个细胞集合仅感染一种基因型,因此,例如需要10个不同的感染实验来检测化合物针对所有10种HBV基因型。
该方法还包括使试验化合物经受用HBV感染的干细胞衍生的肝细胞样细胞的步骤(优选至少四组干细胞衍生的肝细胞样细胞集合,其中所述细胞集合分别被患者来源的具有基因型A、B、C和D的HBV感染)。通常情况下,多种试验化合物(例如,至少约100种试验化合物,或至少约1000种试验化合物,或至少约10,000种试验化合物,或至少约100,000种试验化合物)将同时经受感染的干细胞衍生的肝细胞样细胞。原则上,任何化合物都可以用作试验化合物,包括特别是小分子化合物(例如,分子量等于或小于约900Da的化合物,优选分子量等于或小于约500Da的化合物)。
在将试验化合物(或多种试验化合物)经受感染了HBV的干细胞衍生的肝细胞样细胞的步骤之后,该方法包括一系列步骤的级联,其中各个试验化合物针对(i)HBsAg和HBeAg、(ii)pgRNA和(iii)cccDNA的抑制作用(或抑制活性)使用HBV感染的干细胞衍生的肝细胞样细胞测定(也如图3B、14A和14B所示)。依次测定试验化合物对这些HBV感染标志物/靶标的抑制作用,可首先仅选择同时抑制HBsAg和HBeAg的试验化合物(同时排除任何不抑制HBsAg和HBeAg的试验化合物进行进一步的检测),然后仅选择另外还抑制pgRNA的试验化合物(同时排除任何不抑制pgRNA的试验化合物进行进一步测试),然后仅选择还抑制cccDNA的试验化合物。例如,如实施例1中所述,可以测定试验化合物对HBsAg和HBeAg、对pgRNA和/或对cccDNA的抑制作用。特别地是,可以评估试验化合物对病毒蛋白HBsAg和HBeAg的表达和/或分泌的影响,以测定确定该化合物对HBsAg和HBeAg的抑制作用。此外,可以评估试验化合物对HBV前基因组RNA(pgRNA)水平(例如在细胞上清液或细胞裂解物中)的影响,以测定该化合物对pgRNA的抑制作用。同样,可以例如通过评估试验化合物对细胞裂解物中的cccDNA水平(cccDNA拷贝数)的影响来测定试验化合物对cccDNA的抑制作用;这可以例如通过使用基于PCR的测定,特别是通过数字PCR(例如,如实施例1中所述)来完成。
该方法可以任选地包括测定试验化合物对感染的干细胞衍生的肝细胞样细胞中白蛋白的抑制作用的步骤,并且如果已经发现试验化合物抑制白蛋白,则将其排除在进一步试验之外。该步骤可以与上述测定试验化合物对HBsAg和HBeAg的抑制作用的步骤同时进行(例如,使用实施例1中所述的多重测定法),并且其优点在于可以将非特异性的和/或有毒化合物排除在进一步试验之外,因此以鉴定/获得安全且耐受良好的cccDNA抑制剂。
该方法可以进一步包括以下步骤:使试验化合物经受PHH(也被HBV感染,如本文关于干细胞衍生的肝细胞样细胞所述)并测定其对(i)HBsAg和HBeAg,和/或(ii)pgRNA,和/或(iii)cccDNA的抑制作用,以确认试验化合物的活性。根据细胞的可用性,可以在发现试验化合物在干细胞衍生的肝细胞样细胞中显示出对抗HBsAg和HBeAg双重活性后,或者在发现其在干细胞衍生的肝细胞样细胞中显示出对抗pgRNA的活性后,或在发现其干细胞衍生的肝细胞样细胞中显示出对抗cccDNA的活性之后,启动PHH测试。因此,例如,如果发现一种试验化合物在干细胞衍生的肝细胞样细胞中显示出对抗HBsAg和HBeAg的双重活性,而在PHH中没有,则可以将其排除在进一步试验之外。
可以选择/鉴定在该方法中抑制HBV cccDNA的试验化合物作为HBV cccDNA的抑制剂,特别是作为HBV cccDNA去稳定剂。上述方法还可用于鉴定范围更广的针对HBV感染的高效治疗剂,包括减少、抑制或沉默cccDNA转录但不一定使HBV cccDNA不稳定(或引起其降解)的化合物。因此,如果发现一种试验化合物能够抑制HBV pgRNA(使用这种方法),则可以选择它作为抗HBV感染的治疗剂。总之,该方法不仅可以鉴定cccDNA去稳定剂,而且还可以鉴定潜在的cccDNA沉默剂。相应的方法也可以称为鉴定针对HBV感染的治疗剂的方法。
式(I)化合物将在下面更详细地描述:
在式(I)中,基团L1选自:
-CO-N(RL1)-、-N(RL1)-CO-、-CO-、-N(RL1)-、-C(=O)O-、-O-C(=O)-、-SO-、-SO2-、-SO2-N(RL1)-和-N(RL1)-SO2-。
优选地,L1选自:
-CO-N(RL1)-、-N(RL1)-CO-、-C(=O)O-、-O-C(=O)-、-SO2-N(RL1)-和-N(RL1)-SO2-。更优选L1是-CO-N(RL1)-或-N(RL1)-CO-,其中-CO-N(RL1)-基团通过其碳原子与式(I)所示的吡咯并[2,3-b]吡嗪部分的环碳原子结合,并通过其氮原子与R1基团结合,并且其中-N(RL1)-CO-基团通过其氮原子与式(I)所示的吡咯并[2,3-b]吡嗪部分的环碳原子结合,并通过其碳原子与基团R1结合。甚至更优选地,L1为-CO-N(RL1)-。
RL1各自独立地选自氢和C1-5烷基。优选地,RL1各自独立地选自氢、甲基和乙基.更优选地,RL1各自独立地选自氢和甲基。甚至更优选地,RL1各自是氢。
因此,特别优选的是L1是-CO-N(RL1)-,其中RL1是氢或C1-5烷基(更优选其中RL1是氢或甲基,且甚至更优选其中RL1是氢),且式(I)化合物具有以下结构:
R1是C1-12烷基、C2-12烯基或C2-12炔基,其中所述烷基、所述烯基或所述炔基被一个或多个(例如一个、两个或三个)基团R10取代,并且其中所述烷基、所述烯基或所述炔基还任选地被一个或多个(例如一个、两个或三个)基团R11取代。
优选地,R1是C1-12烷基,其中所述烷基被一个或多个(例如一个、两个或三个)基团R10取代,并且其中所述烷基还任选地被一个或多个(例如一个、两个或三个)基团R11取代。更优选地,R1是C2-10烷基,其中所述烷基被一个或多个基团R10取代,并且其中所述烷基还任选地被一个或多个基团R11取代。甚至更优选地,R1是-C(R13)(R13)-C(R13)(R13)-R10,其中R13各自独立地选自氢和C1-4烷基,条件是所有基团R13中的碳原子总数等于或少于8,其中R13各自任选地被一个或多个基团R10取代,且其中R13还各自任选地被一个或多个基团R11取代。然而甚至更优选地,R1是-C(R13)(R13)-C(R13)(R13)-R10,其中R13各自独立地选自氢、甲基和乙基,其中R13任选地被一个或多个(例如一个或两个)基团R10取代,并且其中R13还任选地被一个或多个(例如一个、两个或三个)基团R11取代。R1特别优选的实施例包括但不限于-CH(-CH2OH)-CH2-OH、-CH(-CH3)-CH2-OH、-C(-CH3)(-CH3)-C(-CH3)(-CH3)-OH、-(1-(羟甲基)环戊-1-基)、-CH(-CH2CH3)-CH2-OH、-CH(-CH2CH2OH)-C(-CH3)(-CH3)-OH或-C(-CH3)(-CH3)-CH2-OH。
R10各自独立地选自-OH、-O(C1-5烷基)和具有至少一个环氧原子的杂环基。优选地,R10各自独立地选自-OH、-O(C1-5烷基)和具有至少一个环氧原子的杂环烷基。更优选地,R10各自独立地选自-OH和-O(C1-5烷基),甚至更优选R10各自独立地选自-OH、-OCH3和-OCH2CH3,且然而甚至更优选R10各自独立地选自-OH和-OCH3。最优选地,R10各自是-OH。
如上文所述,R10可以是具有至少一个环氧原子的杂环基。如果R10是具有至少一个环氧原子的杂环基,那么优选地是所述杂环基具有至少一个环氧原子的杂环烷基。进一步优选地是所述杂环基或所述杂环烷基具有5-10个环原子(包含至少一个环氧原子);更优选地,其是单环且具有5、6或7个环原子,特别是5或6个环原子。该杂环基或杂环烷基的环原子(包含上述5-10个环原子,或5、6或7个环原子,或者5或6个环原子),优选包含1个氧原子和x个其它独立地选自氧、氮和硫的杂原子,其中x是0、1或2,且其中剩余环原子是碳原子。该杂环基或杂环烷基基团的实例包括,特别是四氢呋喃基(例如四氢呋喃-2-基或四氢呋喃-3-基)、四氢吡喃基(例如四氢吡喃-2-基、四氢吡喃-3-基或四氢吡喃-4-基)或吗啉基(例如吗啉-4-基)。
R11各自独立地选自-O(C1-5亚烷基)-OH、-O(C1-5亚烷基)-O(C1-5烷基)、-SH、-S(C1-5烷基)、-S(C1-5亚烷基)-SH、-S(C1-5亚烷基)-S(C1-5烷基)、-NH2、-NH(C1-5烷基)、-N(C1-5烷基)(C1-5烷基)、卤素、C1-5卤代烷基、-O-(C1-5卤代烷基)、-CF3、-CN、-CHO、-CO-(C1-5烷基)、-COOH、-CO-O-(C1-5烷基)、-O-CO-(C1-5烷基)、-CO-NH2、-CO-NH(C1-5烷基)、-CO-N(C1-5烷基)(C1-5烷基)、-NH-CO-(C1-5烷基)、-N(C1-5烷基)-CO-(C1-5烷基)、-SO2-NH2、-SO2-NH(C1-5烷基)、-SO2-N(C1-5烷基)(C1-5烷基)、-NH-SO2-(C1-5烷基)、-N(C1-5烷基)-SO2-(C1-5烷基)、碳环基和杂环基,其中所述碳环基和所述杂环基各自任选地被一个或多个(例如一个、两个或三个)基团R12取代;并且进一步地其中与相同碳原子结合的任何两个基团R11(如果存在)可以任选地与其所连接的碳原子一起形成5-至8-元碳环或杂环,其中所述5-至8-元碳环或杂环任选地被一个或多个(例如一个、两个或三个)基团R12取代。
优选地,R11各自独立地选自-SH、-S(C1-5烷基)、-NH2、-NH(C1-5烷基)、-N(C1-5烷基)(C1-5烷基)、卤素、C1-5卤代烷基、-O-(C1-5卤代烷基)、-CF3和-CN;并且进一步地其中与相同碳原子结合的任何两个基团R11(如果存在)可以任选地与其所连接的碳原子一起形成5-或6-元碳环或杂环,其中所述5-或6-元碳环或杂环任选地被一个或多个基团R12取代。
如果两个基团R11与相同碳原子结合,且如果它们与其所连接的碳原子一起形成5-至8-元碳环或杂环(或者,特别是5-或6-元碳环或杂环),其中所述环任选地被一个或多个基团R12取代,那么优选所述环是饱和的。更优选地,所述环是饱和5-或6-元碳环或杂环,其任选地被一个或多个基团R12取代。上述饱和5-或6-元杂环优选地包含1或2个环氧原子,且全部剩余环原子都是碳原子。对于相应碳环或杂环的实例包括特别是环戊基环、环己基环、四氢呋喃基环或四氢吡喃基环(其中各个上述的环可任选地被一个或多个基团R12取代)。
R12各自独立地选自C1-5烷基、C2-5烯基、C2-5炔基、-(C0-3亚烷基)-OH、-(C0-3亚烷基)-O(C1-5烷基)、-(C0-3亚烷基)-SH、-(C0-3亚烷基)-S(C1-5烷基)、-(C0-3亚烷基)-NH2、-(C0-3亚烷基)-NH(C1-5烷基)、-(C0-3亚烷基)-N(C1-5烷基)(C1-5烷基)、-(C0-3亚烷基)-卤素、-(C0-3亚烷基)-(C1-5卤代烷基)、-(C0-3亚烷基)-O-(C1-5卤代烷基)、-(C0-3亚烷基)-CF3、-(C0-3亚烷基)-CN、-(C0-3亚烷基)-CHO、-(C0-3亚烷基)-CO-(C1-5烷基)、-(C0-3亚烷基)-COOH、-(C0-3亚烷基)-CO-O-(C1-5烷基)、-(C0-3亚烷基)-O-CO-(C1-5烷基)、-(C0-3亚烷基)-CO-NH2、-(C0-3亚烷基)-CO-NH(C1-5烷基)、-(C0-3亚烷基)-CO-N(C1-5烷基)(C1-5烷基)、-(C0-3亚烷基)-NH-CO-(C1-5烷基)、-(C0-3亚烷基)-N(C1-5烷基)-CO-(C1-5烷基)、-(C0-3亚烷基)-SO2-NH2、-(C0-3亚烷基)-SO2-NH(C1-5烷基)、-(C0-3亚烷基)-SO2-N(C1-5烷基)(C1-5烷基)、-(C0-3亚烷基)-NH-SO2-(C1-5烷基)和-(C0-3亚烷基)-N(C1-5烷基)-SO2-(C1-5烷基)。
优选地,R12各自独立地选自C1-5烷基、C2-5烯基、C2-5炔基、-OH、-O(C1-5烷基)、-SH、-S(C1-5烷基)、-NH2、-NH(C1-5烷基)、-N(C1-5烷基)(C1-5烷基)、卤素、C1-5卤代烷基、-O-(C1-5卤代烷基)、-CF3、-CN、-CHO、-CO-(C1-5烷基)、-COOH、-CO-O-(C1-5烷基)、-O-CO-(C1-5烷基)、-CO-NH2、-CO-NH(C1-5烷基)、-CO-N(C1-5烷基)(C1-5烷基)、-NH-CO-(C1-5烷基)、-N(C1-5烷基)-CO-(C1-5烷基)、-SO2-NH2、-SO2-NH(C1-5烷基)、-SO2-N(C1-5烷基)(C1-5烷基)、-NH-SO2-(C1-5烷基)和-N(C1-5烷基)-SO2-(C1-5烷基)。更优选地,R12各自独立地选自C1-5烷基、-OH、-O(C1-5烷基)、-SH、-S(C1-5烷基)、-NH2、-NH(C1-5烷基)、-N(C1-5烷基)(C1-5烷基)、卤素、C1-5卤代烷基、-O-(C1-5卤代烷基)、-CF3和-CN。
R2选自氢、C1-5烷基、C2-5烯基、C2-5炔基、-(C0-3亚烷基)-OH、-(C0-3亚烷基)-O(C1-5烷基)、-(C0-3亚烷基)-SH、-(C0-3亚烷基)-S(C1-5烷基)、-(C0-3亚烷基)-NH2、-(C0-3亚烷基)-NH(C1-5烷基)、-(C0-3亚烷基)-N(C1-5烷基)(C1-5烷基)、-(C0-3亚烷基)-卤素、-(C0-3亚烷基)-(C1-5卤代烷基)、-(C0-3亚烷基)-O-(C1-5卤代烷基)、-(C0-3亚烷基)-CF3、-(C0-3亚烷基)-CN、-(C0-3亚烷基)-CHO、-(C0-3亚烷基)-CO-(C1-5烷基)、-(C0-3亚烷基)-COOH、-(C0-3亚烷基)-CO-O-(C1-5烷基)、-(C0-3亚烷基)-O-CO-(C1-5烷基)、-(C0-3亚烷基)-CO-NH2、-(C0-3亚烷基)-CO-NH(C1-5烷基)、-(C0-3亚烷基)-CO-N(C1-5烷基)(C1-5烷基)、-(C0-3亚烷基)-NH-CO-(C1-5烷基)、-(C0-3亚烷基)-N(C1-5烷基)-CO-(C1-5烷基)、-(C0-3亚烷基)-SO2-NH2、-(C0-3亚烷基)-SO2-NH(C1-5烷基)、-(C0-3亚烷基)-SO2-N(C1-5烷基)(C1-5烷基)、-(C0-3亚烷基)-NH-SO2-(C1-5烷基)、-(C0-3亚烷基)-N(C1-5烷基)-SO2-(C1-5烷基)、-(C0-3亚烷基)-碳环基和-(C0-3亚烷基)-杂环基,其中所述-(C0-3亚烷基)-碳环基的碳环基部分和所述-(C0-3亚烷基)-杂环基的杂环基部分各自任选地被一个或多个(例如一个、两个或三个)基团R12取代。
优选地,R2选自氢、C1-5烷基、C2-5烯基、C2-5炔基、-OH、-O(C1-5烷基)、-SH、-S(C1-5烷基)、-NH2、-NH(C1-5烷基)、-N(C1-5烷基)(C1-5烷基)、卤素、C1-5卤代烷基、-O-(C1-5卤代烷基)、-CF3、-CN、-CHO、-CO-(C1-5烷基)、-COOH、-CO-O-(C1-5烷基)、-O-CO-(C1-5烷基)、-CO-NH2、-CO-NH(C1-5烷基)、-CO-N(C1-5烷基)(C1-5烷基)、-NH-CO-(C1-5烷基)、-N(C1-5烷基)-CO-(C1-5烷基)、-SO2-NH2、-SO2-NH(C1-5烷基)、-SO2-N(C1-5烷基)(C1-5烷基)、-NH-SO2-(C1-5烷基)和-N(C1-5烷基)-SO2-(C1-5烷基)。更优选地,R2选自氢、C1-5烷基、-OH、-O(C1-5烷基)、-SH、-S(C1-5烷基)、-NH2、-NH(C1-5烷基)、-N(C1-5烷基)(C1-5烷基)、卤素、C1-5卤代烷基、-O-(C1-5卤代烷基)、-CF3和-CN。甚至更优选地,R2是氢。
R3选自氢、C1-5烷基和-CO(C1-5烷基)。
优选地,R3是氢或C1-5烷基。更优选地,R3是氢、甲基或乙基。甚至更优选地,R3是氢。
R4和R5各自独立地选自氢、C1-5烷基、C2-5烯基、C2-5炔基、-(C0-3亚烷基)-OH、-(C0-3亚烷基)-O(C1-5烷基)、-(C0-3亚烷基)-SH、-(C0-3亚烷基)-S(C1-5烷基)、-(C0-3亚烷基)-NH2、-(C0-3亚烷基)-NH(C1-5烷基)、-(C0-3亚烷基)-N(C1-5烷基)(C1-5烷基)、-(C0-3亚烷基)-卤素、-(C0-3亚烷基)-(C1-5卤代烷基)、-(C0-3亚烷基)-O-(C1-5卤代烷基)、-(C0-3亚烷基)-CF3、-(C0-3亚烷基)-CN、-(C0-3亚烷基)-CHO、-(C0-3亚烷基)-CO-(C1-5烷基)、-(C0-3亚烷基)-COOH、-(C0-3亚烷基)-CO-O-(C1-5烷基)、-(C0-3亚烷基)-O-CO-(C1-5烷基)、-(C0-3亚烷基)-CO-NH2、-(C0-3亚烷基)-CO-NH(C1-5烷基)、-(C0-3亚烷基)-CO-N(C1-5烷基)(C1-5烷基)、-(C0-3亚烷基)-NH-CO-(C1-5烷基)、-(C0-3亚烷基)-N(C1-5烷基)-CO-(C1-5烷基)、-(C0-3亚烷基)-SO2-NH2、-(C0-3亚烷基)-SO2-NH(C1-5烷基)、-(C0-3亚烷基)-SO2-N(C1-5烷基)(C1-5烷基)、-(C0-3亚烷基)-NH-SO2-(C1-5烷基)、-(C0-3亚烷基)-N(C1-5烷基)-SO2-(C1-5烷基)、-(C0-3亚烷基)-碳环基和-(C0-3亚烷基)-杂环基,其中所述-(C0-3亚烷基)-碳环基的碳环基部分和所述-(C0-3亚烷基)-杂环基的杂环基部分各自任选地被一个或多个(例如一个、两个或三个)基团R12取代。
优选地,R4和R5中之一是碳环基或杂环基,其中所述碳环基或所述杂环基任选地被一个或多个基团R12取代,且R4和R5中的另一个选自氢、C1-5烷基、C2-5烯基、C2-5炔基、-(C0-3亚烷基)-OH、-(C0-3亚烷基)-O(C1-5烷基)、-(C0-3亚烷基)-SH、-(C0-3亚烷基)-S(C1-5烷基)、-(C0-3亚烷基)-NH2、-(C0-3亚烷基)-NH(C1-5烷基)、-(C0-3亚烷基)-N(C1-5烷基)(C1-5烷基)、-(C0-3亚烷基)-卤素、-(C0-3亚烷基)-(C1-5卤代烷基)、-(C0-3亚烷基)-O-(C1-5卤代烷基)、-(C0-3亚烷基)-CF3、-(C0-3亚烷基)-CN、-(C0-3亚烷基)-CHO、-(C0-3亚烷基)-CO-(C1-5烷基)、-(C0-3亚烷基)-COOH、-(C0-3亚烷基)-CO-O-(C1-5烷基)、-(C0-3亚烷基)-O-CO-(C1-5烷基)、-(C0-3亚烷基)-CO-NH2、-(C0-3亚烷基)-CO-NH(C1-5烷基)、-(C0-3亚烷基)-CO-N(C1-5烷基)(C1-5烷基)、-(C0-3亚烷基)-NH-CO-(C1-5烷基)、-(C0-3亚烷基)-N(C1-5烷基)-CO-(C1-5烷基)、-(C0-3亚烷基)-SO2-NH2、-(C0-3亚烷基)-SO2-NH(C1-5烷基)、-(C0-3亚烷基)-SO2-N(C1-5烷基)(C1-5烷基)、-(C0-3亚烷基)-NH-SO2-(C1-5烷基)、-(C0-3亚烷基)-N(C1-5烷基)-SO2-(C1-5烷基)、-(C0-3亚烷基)-碳环基和-(C0-3亚烷基)-杂环基,其中所述-(C0-3亚烷基)-碳环基的碳环基部分和所述-(C0-3亚烷基)-杂环基的杂环基部分各自任选地被一个或多个基团R12取代。更优选地,R5是环烷基,且R4选自氢、C1-5烷基、C2-5烯基、C2-5炔基、-(C0-3亚烷基)-OH、-(C0-3亚烷基)-O(C1-5烷基)、-(C0-3亚烷基)-SH、-(C0-3亚烷基)-S(C1-5烷基)、-(C0-3亚烷基)-NH2、-(C0-3亚烷基)-NH(C1-5烷基)、-(C0-3亚烷基)-N(C1-5烷基)(C1-5烷基)、-(C0-3亚烷基)-卤素、-(C0-3亚烷基)-(C1-5卤代烷基)、-(C0-3亚烷基)-O-(C1-5卤代烷基)、-(C0-3亚烷基)-CF3、-(C0-3亚烷基)-CN、-(C0-3亚烷基)-CHO、-(C0-3亚烷基)-CO-(C1-5烷基)、-(C0-3亚烷基)-COOH、-(C0-3亚烷基)-CO-O-(C1-5烷基)、-(C0-3亚烷基)-O-CO-(C1-5烷基)、-(C0-3亚烷基)-CO-NH2、-(C0-3亚烷基)-CO-NH(C1-5烷基)、-(C0-3亚烷基)-CO-N(C1-5烷基)(C1-5烷基)、-(C0-3亚烷基)-NH-CO-(C1-5烷基)、-(C0-3亚烷基)-N(C1-5烷基)-CO-(C1-5烷基)、-(C0-3亚烷基)-SO2-NH2、-(C0-3亚烷基)-SO2-NH(C1-5烷基)、-(C0-3亚烷基)-SO2-N(C1-5烷基)(C1-5烷基)、-(C0-3亚烷基)-NH-SO2-(C1-5烷基)、-(C0-3亚烷基)-N(C1-5烷基)-SO2-(C1-5烷基)、-(C0-3亚烷基)-碳环基和-(C0-3亚烷基)-杂环基,其中所述-(C0-3亚烷基)-碳环基的碳环基和所述-(C0-3亚烷基)-杂环基的杂环基部分各自任选地被一个或多个基团R12取代。甚至更优选地,R5是C3-7环烷基(例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基或环庚基;特别是环丙基),且R4选自氢、C1-5烷基、C2-5烯基、C2-5炔基、-(C0-3亚烷基)-OH、-(C0-3亚烷基)-O(C1-5烷基)、-(C0-3亚烷基)-SH、-(C0-3亚烷基)-S(C1-5烷基)、-(C0-3亚烷基)-NH2、-(C0-3亚烷基)-NH(C1-5烷基)、-(C0-3亚烷基)-N(C1-5烷基)(C1-5烷基)、-(C0-3亚烷基)-卤素、-(C0-3亚烷基)-(C1-5卤代烷基)、-(C0-3亚烷基)-O-(C1-5卤代烷基)、-(C0-3亚烷基)-CF3、-(C0-3亚烷基)-CN、-(C0-3亚烷基)-CHO、-(C0-3亚烷基)-CO-(C1-5烷基)、-(C0-3亚烷基)-COOH、-(C0-3亚烷基)-CO-O-(C1-5烷基)、-(C0-3亚烷基)-O-CO-(C1-5烷基)、-(C0-3亚烷基)-CO-NH2、-(C0-3亚烷基)-CO-NH(C1-5烷基)、-(C0-3亚烷基)-CO-N(C1-5烷基)(C1-5烷基)、-(C0-3亚烷基)-NH-CO-(C1-5烷基)、-(C0-3亚烷基)-N(C1-5烷基)-CO-(C1-5烷基)、-(C0-3亚烷基)-SO2-NH2、-(C0-3亚烷基)-SO2-NH(C1-5烷基)、-(C0-3亚烷基)-SO2-N(C1-5烷基)(C1-5烷基)、-(C0-3亚烷基)-NH-SO2-(C1-5烷基)、-(C0-3亚烷基)-N(C1-5烷基)-SO2-(C1-5烷基)、-(C0-3亚烷基)-碳环基和-(C0-3亚烷基)-杂环基,其中所述-(C0-3亚烷基)-碳环基的碳环基部分和所述-(C0-3亚烷基)-杂环基的杂环基部分各自任选地被一个或多个基团R12取代;其中R4更优选地选自氢、C1-5烷基、C2-5烯基、C2-5炔基、-OH、-O(C1-5烷基)、-SH、-S(C1-5烷基)、-NH2、-NH(C1-5烷基)、-N(C1-5烷基)(C1-5烷基)、卤素、C1-5卤代烷基、-O-(C1-5卤代烷基)、-CF3、-CN、-CHO、-CO-(C1-5烷基)、-COOH、-CO-O-(C1-5烷基)、-O-CO-(C1-5烷基)、-CO-NH2、-CO-NH(C1-5烷基)、-CO-N(C1-5烷基)(C1-5烷基)、-NH-CO-(C1-5烷基)、-N(C1-5烷基)-CO-(C1-5烷基)、-SO2-NH2、-SO2-NH(C1-5烷基)、-SO2-N(C1-5烷基)(C1-5烷基)、-NH-SO2-(C1-5烷基)、-N(C1-5烷基)-SO2-(C1-5烷基)、碳环基和杂环基,其中所述碳环基和所述杂环基各自任选地被一个或多个基团R12取代;其中R4甚至更优选地选自氢、C1-5烷基、-OH、-O(C1-5烷基)、-SH、-S(C1-5烷基)、-NH2、-NH(C1-5烷基)、-N(C1-5烷基)(C1-5烷基)、卤素、C1-5卤代烷基、-O-(C1-5卤代烷基)、-CF3和-CN;且其中R4还更优选氢。甚至更优选地,R5是环丙基,且R4选自氢、C1-5烷基、C2-5烯基、C2-5炔基、-OH、-O(C1-5烷基)、-SH、-S(C1-5烷基)、-NH2、-NH(C1-5烷基)、-N(C1-5烷基)(C1-5烷基)、卤素、C1-5卤代烷基、-O-(C1-5卤代烷基)、-CF3、-CN、-CHO、-CO-(C1-5烷基)、-COOH、-CO-O-(C1-5烷基)、-O-CO-(C1-5烷基)、-CO-NH2、-CO-NH(C1-5烷基)、-CO-N(C1-5烷基)(C1-5烷基)、-NH-CO-(C1-5烷基)、-N(C1-5烷基)-CO-(C1-5烷基)、-SO2-NH2、-SO2-NH(C1-5烷基)、-SO2-N(C1-5烷基)(C1-5烷基)、-NH-SO2-(C1-5烷基)、-N(C1-5烷基)-SO2-(C1-5烷基)、碳环基和杂环基,其中所述碳环基和所述杂环基各自任选地被一个或多个基团R12取代;其中R4更优选地选自氢、C1-5烷基、-OH、-O(C1-5烷基)、-SH、-S(C1-5烷基)、-NH2、-NH(C1-5烷基)、-N(C1-5烷基)(C1-5烷基)、卤素、C1-5卤代烷基、-O-(C1-5卤代烷基)、-CF3和-CN;且其中R4还更优选氢。还更优选地,R5是环丙基,且R4是氢。
特别优选的式(I)化合物是下式(II)的化合物或其可药用盐:
其中式(II)中包含的基团/变量,特别是R1、RL1、R2、R3和R4具有与本文针对式(I)中所包含的相应基团/变量的描述和定义相同的含义,包括相同的优选含义。
特别地,式(I)或(II)化合物的实例包括以下化合物以及这些化合物中任何一种的可药用盐:
式(I)或(II)化合物的优选实例特别包括以下化合物及其可药用盐:
式(I)或(II)的特别优选的示例性化合物是下式的化合物(在本文中也称为“化合物7”)或其可药用盐:
式(I)化合物可以通过合成化学领域中已知的方法制备。例如,这些化合物可以根据或类似于WO 2011/144585(其内容通过引用整体并入本文)中所述的任何合成途径来制备,特别是在第93-101页和/或在WO 2011/144585的工作实施例中。
除非另外特别指出,否则以下定义适用于整个说明书和权利要求书。
术语“烃基”是指由碳原子和氢原子组成的基团。
术语“脂环族”与环状基团结合使用,表示相应的环状基团是非芳香族的。
如本文所用,术语“烷基”是指可以是直链或支链的一价饱和且非环状的(即,非环的)烃基。因此,“烷基”基团不包含任何碳-碳双键或任何碳-碳三键。“C1-5烷基”表示具有1-5个碳原子的烷基基团。优选的示例性烷基基团是甲基、乙基、丙基(例如正丙基或异丙基)或丁基(例如正丁基、异丁基、仲丁基或叔丁基)。除非另外定义,术语“烷基”优选是指C1-4烷基,更优选甲基或乙基,且甚至更优选甲基。
如本文所用,术语“烯基”是指可以是直链或支链且包含一个或多个(例如一个或两个)碳-碳双键但其不包含任何碳-碳叁键的单价不饱和且非环状的烃基。术语“C2-5烯基”表示具有2-5个碳原子的烯基基团。优选的示例性烯基基团是乙烯基、丙烯基(例如丙-1-烯-1-基、丙-1-烯-2-基或丙-2-烯-1-基)、丁烯基、丁二烯基(例如丁-1,3-二烯-1-基或丁-1,3-二烯-2-基)、戊烯基或戊二烯基(例如异戊烯基)。除非另外定义,术语“烯基”优选指C2-4烯基。
如本文所用,术语“炔基”是指可以是直链或支链且包含一个或多个(例如一个或两个)碳-碳叁键和任选一个或多个(例如一个或两个)碳-碳双键的单价不饱和且非环状的烃基。术语“C2-5炔基”表示具有2-5个碳原子的炔基基团。优选的示例性炔基基团是乙炔基、丙炔基(例如炔丙基)或丁炔基。除非另外定义,术语“炔基”优选是指C2-4炔基。
如本文所用,术语“亚烷基”是指链烷二基基团,即,可以是直链或支链的二价饱和且非环状的烃基。“C1-5亚烷基”表示具有1-5个碳原子的亚烷基基团,且术语“C0-3亚烷基”是指共价键(对应于选项“C0亚烷基”)或存在C1-3亚烷基。优选的示例性亚烷基基团是亚甲基(-CH2-)、亚乙基(例如-CH2-CH2-或-CH(-CH3)-)、亚丙基(例如-CH2-CH2-CH2-、-CH(-CH2-CH3)-、-CH2-CH(-CH3)-或-CH(-CH3)-CH2-)或亚丁基(例如-CH2-CH2-CH2-CH2-)。除非另外定义,术语“亚烷基”优选是指C1-4亚烷基(包括特别是直链C1-4亚烷基),更优选亚甲基或亚乙基,且甚至更优选亚甲基。
如本文所用,术语“碳环基”(或“碳环”)是指烃环基团,包括单环以及桥环、螺环和/或稠环系统(可能由例如两个或三个环组成),其中所述的环基团可以是饱和、部分不饱和(即,不饱和但非芳族)或芳族的。除非另外定义,“碳环基”(或“碳环”)优选是指芳基、环烷基或环烯基。
如本文所用,术语“杂环基”(或“杂环”)是指环基团,包括单环以及桥环、螺环和/或稠环系统(可能由例如两个或三个环组成),其中所述的环基团包含一个或多个(例如一个、两个、三个或四个)独立地选自O、S和N的环杂原子,其余的环原子是碳原子,其中一个或多个S环原子(如果存在)和/或一个或多个N环原子(如果存在)可以任选地被氧化,其中一个或多个环碳原子可任选被氧化(即形成氧代基),并且进一步的其中所述环基可为饱和、部分不饱和(即不饱和但非芳族)或芳族。例如,包含在所述环基团中的每个含杂原子的环可包含一个或两个O原子和/或一个或两个S原子(其可任选被氧化)和/或一个、两个、三个或四个N原子(其可任选被氧化),条件是相应的含杂原子的环中的杂原子总数为1-4,并且相应的含杂原子的环中至少有一个环碳原子(其可以任选被氧化)。除非另外定义,“杂环基”(或“杂环”)优选是指杂芳基、杂环烷基或杂环烯基。
如本文所用,术语“芳基”是指芳族烃环基团,包括单环芳环以及含有至少一个芳环的桥环和/或稠合环系统(例如由两个或三个稠合环组成的环系统,其中这些稠合环中的至少一个是芳族的;或由两个或三个环组成的桥环体系,其中这些桥环中至少一个是芳族的)。“芳基”可以例如是指苯基、萘基、二氢萘基(即1,2-二氢萘基)、四氢萘基(即1,2,3,4-四氢萘基)、茚满基、茚基(例如1H-茚基)、蒽基、菲基、9H-芴基或甘菊环基。除非另外定义,“芳基”优选具有6-14个环原子,更优选6-10个环原子,甚至更优选是指苯基或萘基,且最优选是指苯基。
如本文所用,术语“杂芳基”是指芳环基,包括单环芳环以及含有至少一个芳环的桥环和/或稠合环系统(例如由两个或三个稠合环组成的环系统,其中这些稠合环中的至少一个是芳族的;或由两个或三个环组成的桥环系统,其中这些桥环中至少一个是芳族的),其中所述芳环基团包含一个或多个(例如一个、两个、三个或四个)独立地选自O、S和N的环杂原子,且其余的环原子是碳原子,其中一个或多个S环原子(如果存在)和/或一个或多个N环原子(如果存在)可以任选地被氧化,并且进一步其中一个或多个环碳原子可任选被氧化(即形成氧代基团)。例如,包含在所述芳族环基团中的每个含杂原子的环可包含一个或两个O原子和/或一个或两个S原子(其可任选被氧化)和/或一个、两个、三个或四个N原子(其可任选被氧化),条件是在相应的含杂原子的环中杂原子的总数为1至4,并且在相应的含杂原子的环中存在至少一个环碳原子(可以任选地被氧化)。“杂芳基”可以例如是指噻吩基(即噻吩基)、苯并[b]噻吩基、萘并[2,3-b]噻吩基、噻蒽基、呋喃基(即呋喃基)、苯并呋喃基、异苯并呋喃基、苯并二氢吡喃基、苯并吡喃基(例如2H-1-苯并吡喃基或4H-1-苯并吡喃基)、异苯并吡喃基(例如1H-2-苯并吡喃基)、色酮基、呫吨基、吩噁噻基、吡咯基(例如1H-吡咯基)、咪唑基、吡唑基、吡啶基(即吡啶基;例如2-吡啶基、3-吡啶基或4-吡啶基)、吡嗪基、嘧啶基、哒嗪基、吲哚基(例如3H-吲哚基)、异吲哚基、吲唑基、吲嗪基、嘌呤基、喹啉基、异喹啉基、酞嗪基、萘啶基、喹喔啉基、噌啉基、蝶啶基、咔唑基、β-咔啉基、菲啶基、吖啶基、泊啶基、菲咯啉基(例如[1,10]菲咯啉基、[1,7]菲咯啉基或[4,7]菲咯啉基)、吩嗪基、噻唑基、异噻唑基、吩噻嗪基、噁唑基、异噁唑基、噁二唑基(例如1,2,4-噁二唑基、1,2,5-噁二唑基(即呋咱基)或1,3,4-噁二唑基)、噻二唑基(例如1,2,4-噻二唑基、1,2,5-噻二唑基或1,3,4-噻二唑基)、吩噁嗪基、吡唑并[1,5-a]嘧啶基(例如吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)、1,2-苯并异噁唑-3-基、苯并噻唑基、苯并噻二唑基、苯并噁唑基、苯并异噁唑基、苯并咪唑基、苯并[b]噻吩基(即苯并噻吩基)、三唑基(例如1H-1,2,3-三唑基、2H-1,2,3-三唑基、1H-1,2,4-三唑基或4H-1,2,4-三唑基)、苯并三唑基、1H-四唑基、2H-四唑基、三嗪基(例如1,2,3-三嗪基、1,2,4-三嗪基或1,3,5-三嗪基)、呋喃并[2,3-c]吡啶基、二氢呋喃并吡啶基(例如2,3-二氢呋喃并[2,3-c]吡啶基或1,3-二氢呋喃并[3,4-c]吡啶基)、咪唑并吡啶基(例如咪唑并[1,2-a]吡啶基或咪唑并[3,2-a]吡啶基)、喹唑啉基、噻吩并吡啶基、四氢噻吩并吡啶基(例如4,5,6,7-四氢噻吩并[3,2-c]吡啶基)、二苯并呋喃基、1,3-苯并二氧杂环戊烷基、苯并二噁烷基(例如1,3-苯并二噁烷基或1,4苯并二噁烷基)或香豆基。除非另外定义,术语“杂芳基”优选是指5至14元(更优选5至10元)单环或稠环系统,其包含一个或多个(例如,一个、两个、三个或四个)环杂原子,所述杂原子独立地选自O、S和N,其中一个或多个S环原子(如果存在)和/或一个或多个N环原子(如果存在)任选地被氧化,并且其中一个或多个碳环原子任选地被氧化;甚至更优选地,“杂芳基”是指5或6元单环,包含一个或多个(例如一个、两个或三个)环杂原子,这些杂原子独立地选自O、S和N,其中一个或多个S环原子(如果存在)和/或一个或多个N环原子(如果存在)任选地被氧化,并且其中一个或多个碳环原子任选地被氧化。此外,除非另外定义,“杂芳基”的特别优选的实例包括吡啶基(例如2-吡啶基、3-吡啶基或4-吡啶基)、咪唑基、噻唑基、1H-四唑基、2H-四唑基、噻吩基(即噻吩基)或嘧啶基。
如本文所用,术语“环烷基”是指饱和烃环基团,包括单环以及桥环、螺环和/或稠合环系统(其可由例如两个或三个环组成;例如,由两个或三个稠环组成稠合环系统)。“环烷基”可以例如指环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、十氢萘基(即十氢萘基)或金刚烷基。除非另外定义,“环烷基”优选是指C3-11环烷基,更优选是指C3-7环烷基。特别优选的“环烷基”是具有3至7个环成员的单环饱和烃环。此外,除非另外定义,“环烷基”的特别优选的实例包括环己基或环丙基,特别是环己基。
如本文所用,术语“杂环烷基”是指饱和的环基,包括单环以及桥环、螺环和/或稠环系统(其可由例如两个或三个环组成;例如,由两个或三个稠合环组成的稠合环系统),其中所述环基包含一个或多个(例如一个、两个、三个或四个)独立地选自O、S和N的环杂原子,且其余的环原子为碳原子,其中一个或多个S环原子(如果存在)和/或一个或多个N环原子(如果存在)可以任选地被氧化,并且其中另外一个或多个碳环原子可以任选地被氧化(即形成氧代基团)。例如,包含在所述饱和环基团中的每个含杂原子的环可包含一个或两个O原子和/或一个或两个S原子(其可任选被氧化)和/或一个、两个、三个或四个N原子(其可任选被氧化),条件是在相应的含杂原子的环中杂原子的总数为1至4,并且在相应的含杂原子的环中存在至少一个碳环原子(其可任选地被氧化)。“杂环烷基”可以例如是指吖丙啶基、氮杂环丁烷基、吡咯烷基、咪唑烷基、吡唑烷基、哌啶基、哌嗪基、氮杂环庚烷基、二氮杂环庚烷基(例如1,4二氮杂环庚烷基)、噁唑烷基、异噁唑烷基、噻唑烷基、异噻唑烷基、吗啉基(例如吗啉-4-基)、硫吗啉基(例如硫吗啉-4-基)、氧杂氮杂环庚烷基、环氧乙烷基、氧杂环丁基、四氢呋喃基、1,3-二氧杂环戊烷基、四氢吡喃基、1,4-二氧杂环己烷基、氧杂环庚基、硫杂环丙基、硫杂环丁基、四氢噻吩基(即硫杂环戊基)、1,3-二硫杂环戊烷基、噻烷基、硫杂环庚基、十氢喹啉基、十氢异喹啉基或2-氧杂-5-氮杂双环[2.2.1]庚-5-基。除非另外定义,“杂环烷基”优选是指3到11元的饱和环基团,其是单环或稠环系统(例如,由两个稠环组成的稠环系统),其中所述环基包含一个或多个(例如一个、两个、三个或四个)独立地选自O、S和N的环杂原子,其中一个或多个S环原子(如果存在)和/或一个或多个N环原子(如果存在)任选地被氧化,且其中一个或多个碳环原子可任选被氧化;更优选地,“杂环烷基”是指含有一个或多个(例如一个、两个或三个)独立地选自O、S和N的环杂原子的5至7元饱和单环基团,其中一个或多个S环原子(如果存在)和/或一个或多个N环原子(如果存在)任选地被氧化,并且其中一个或多个碳环原子任选地被氧化。此外,除非另外定义,“杂环烷基”的特别优选的实例包括四氢吡喃基、哌啶基、哌嗪基、吗啉基、吡咯烷基或四氢呋喃基。
如本文所用,术语“环烯基”是指不饱和脂环族(非芳族)烃环基,包括单环以及桥环、螺环和/或稠合环系统(其可由例如两个或三个环组成;例如,由两个或三个稠合环组成的稠合环系统),其中所述烃环基团包含一个或多个(例如一个或两个)碳-碳双键,并且不包含任何碳-碳叁键。例如,“环烯基”可以指环丙烯基、环丁烯基、环戊烯基、环己烯基、环己二烯基、环庚烯基或环庚二烯基。除非另外定义,“环烯基”优选是指C3-11环烯基,并更优选是指C3-7环烯基。特别优选的“环烯基”是具有3至7个环成员并且包含一个或多个(例如一个或两个;优选一个)碳-碳双键的单环不饱和脂环族烃环。
如本文所用,术语“杂环烯基”是指不饱和脂环(非芳族)环基,包括单环以及桥环、螺环和/或稠合环系统(其可由两个或三个环组成;例如,由两个或三个稠合环组成的稠合环系统),其中所述环基包含一个或多个(例如一个、两个、三个或四个)独立地选自O、S和N的环杂原子,并且其余的环原子是碳原子,其中一个或多个S环原子(如果存在)和/或一个或多个N环原子(如果存在)可以任选地被氧化,其中一个或多个碳环原子可以任选地被氧化(即形成氧代基团),并且其中所述的环基团还在相邻的环原子之间包含至少一个双键,并且在相邻的环原子之间不包含任何叁键。例如,包含在所述不饱和脂环族环基团中的每个含杂原子的环可含有一个或两个O原子和/或一个或两个S原子(其可任选被氧化)和/或一个、两个、三个或四个N原子(其可任选被氧化),条件是相应的含杂原子的环中的杂原子总数为1-4,并且在相应的含杂原子的环中至少有一个碳环原子(其可任选被氧化)。“杂环烯基”可以例如是指咪唑啉基(例如2-咪唑啉基(即4,5-二氢-1H-咪唑基)、3-咪唑啉基或4-咪唑啉基)、四氢吡啶基(例如1,2,3,6-四氢吡啶基)、二氢吡啶基(例如1,2-二氢吡啶基或2,3-二氢吡啶基)、吡喃基(例如2H-吡喃基或4H-吡喃基)、噻喃基(例如2H-噻喃基或4H-噻喃基)、二氢吡喃基、二氢呋喃基、二氢吡唑基、二氢吡嗪基、二氢异吲哚基、八氢喹啉基(例如1,2,3,4,4a,5,6,7-八氢喹啉基)或八氢异喹啉基(例如1,2,3,4,5,6,7,8-八氢异喹啉基)。除非另外定义,“杂环烯基”优选是指3至11元不饱和脂环族基团,其为单环或稠合环体系(例如,由两个稠合环组成的稠合环体系),其中所述环基包含一个或多个(例如一个、两个、三个或四个)独立地选自O、S和N的环杂原子,其中一个或多个S环原子(如果存在)和/或一个或多个N环原子(如果存在)任选地被氧化,其中一个或多个碳环原子任选地被氧化,其中所述环基在相邻的环原子之间包含至少一个双键,并且在相邻的环原子之间不包含任何叁键;更优选地,“杂环烯基”是指含有一个或多个(例如一个、两个或三个)独立地选自O、S和N的环杂原子的5至7元单环不饱和非芳族环基,其中一个或多个S环原子(如果存在)和/或一个或多个N环原子(如果存在)任选地被氧化,其中一个或多个碳环原子任选地被氧化,并且其中所述环基团在相邻的环原子之间包含至少一个双键,并且在相邻的环原子之间不包含任何叁键。
如本文所用,术语“卤素”是指氟(-F)、氯(-Cl)、溴(-Br)或碘(-I)。
如本文所用,术语“卤代烷基”是指被一个或多个(优选1至6,更优选1至3)个卤素原子取代的烷基,所述卤素原子独立地选自氟、氯、溴和碘,且优选全部为氟原子。应当理解,卤素原子的最大数量受可用的连接位点的限制,因此取决于卤代烷基基团的烷基部分中所包含的碳原子数。“卤代烷基”可以例如是指-CF3、-CHF2、-CH2F、-CF2-CH3、-CH2-CF3、-CH2-CHF2、-CH2-CF2-CH3、-CH2-CF2-CF3或-CH(CF3)2。特别优选的“卤代烷基”基团是-CF3。
如本文所用,术语“任选”、“任选地”和“可以”表示所指示的特征可以存在但也可以不存在。每当使用术语“任选”、“任选地”或“可以”时,本发明特别涉及这两种可能性,即存在相应的特征,或者不存在相应的特征。例如,表述“X任选地被Y取代”(或“X可以被Y取代”)是指X被Y取代或未被取代。同样,如果指示组合物的成分是“任选的”,则本发明具体涉及两种可能性,即,存在相应的成分(包含在组合物中)或组合物中不存在相应的组分。
在本说明书中,多种基团被称为“被任选取代的”。通常,这些基团可带有一个或多个取代基,例如一个、两个、三个或四个取代基。应当理解,取代基的最大数目受到取代部分上可用的连接位点的数目限制。除非另外定义,本说明书中的“任选取代的”基团优选带有不超过两个取代基,并且特别地可以仅带有一个取代基。此外,除非另外定义,优选不存在任选的取代基,即相应的基团是未取代的。
本领域技术人员应当理解,包含在本发明化合物中的取代基可通过相应的特定取代基的多个不同位置连接至相应化合物的其余部分。除非另外定义,各种具体取代基的优选连接位置如本文所述的相应示例性化合物中所示。
如本文所用,术语“cccDNA抑制剂”或“HBV cccDNA抑制剂”是指能够抑制乙型肝炎病毒(HBV)的共价闭合环状DNA(cccDNA)的化合物,例如通过抑制HBV cccDNA的稳定性和/或转录活性。使HBV cccDNA失稳定、导致cccDNA完全或至少部分降解的cccDNA抑制剂,也可以称为“cccDNA失稳定剂”或“HBV cccDNA失稳定剂”,使cccDNA转录活性沉默的cccDNA抑制剂(例如经表观遗传机制),而不必诱导现有HBV cccDNA的降解,也可以称为“cccDNA沉默剂”或“HBV cccDNA沉默剂”。本发明涵盖任何此类cccDNA抑制剂,包括用作HBV cccDNA去稳定剂和/或沉默剂的化合物,并且特别涉及HBV cccDNA去稳定剂。可以使用例如实施例1中描述的cccDNA测定法来评估化合物使cccDNA不稳定的能力。
如本文所用,除非另有明确说明或与上下文矛盾,否则术语“一种”、“一个”和“该”与“一个或多个”和“至少一个”可互换使用。因此,例如,包含“一种”式(I)化合物的组合物可以解释为是指包含“一种或多种”式(I)化合物的组合物。
如本文所用,术语“约”优选为所指数值的±10%,更优选为所指数值的±5%,尤其是所指精确数值。如果将术语“约”与某个范围的端点结合使用,则它优选是指从其指示数值的较低端点-10%到其指示的数值的较高端点+10%的范围,更优选到范围从下限-5%到上限+5%,甚至更优选下限和上限的精确数值所定义的范围。如果将术语“约”与开放式范围的端点结合使用,则其优选是指从较低端点-10%开始或从较高端点+10%开始的相应范围,更优选从较低端点-5%开始或从较高的端点+5%开始,甚至更优选由相应端点的精确数值定义的开放式范围。
如本文所用,术语“包含”(或“包括”或“含有”),除非另有明确说明或与上下文矛盾,否则具有“除其他外,包含”的含义,即“在其他任选元素中,包含……”。除此之外,该术语还包括“基本上由...组成”和“由...组成”的较窄含义。例如,术语“包含B和C的A”的含义是“除其他外,A包含B和C”,其中A可以包含其他任选元素(例如“A包含B、C和D”也将包含在内),但是该术语还包括“基本上由B和C组成的A”的含义和“由B和C组成的A”(即A中不包含B和C以外的其他组分)的含义。
本发明的范围包括可以通过例如用无机或有机酸使带有易质子化的电子孤对(例如氨基)的原子质子化而形成的式(I)化合物的所有可药用盐形式,或作为带有生理学上可接受的阳离子酸基(例如羧酸基)的盐。示例性的碱加成盐包括例如:碱金属盐,例如钠或钾盐;碱土金属盐,例如钙或镁盐;锌盐;铵盐;脂族胺盐,例如三甲胺、三乙胺、二环己基胺、乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、普鲁卡因盐、葡甲胺盐、乙二胺盐或胆碱盐;芳烷基胺盐,如N,N-二苄基亚乙基二胺盐、苄星盐、苯乙胺盐;杂环芳族胺盐,例如吡啶盐、甲基吡啶盐、喹啉盐或异喹啉盐;季铵盐,例如四甲基铵盐、四乙基铵盐、苄基三甲基铵盐、苄基三乙基铵盐、苄基三丁基铵盐、甲基三辛基铵盐或四丁基铵盐;和碱性氨基酸盐,例如精氨酸盐、赖氨酸盐或组氨酸盐。示例性的酸加成盐包括例如:无机酸盐,例如盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硫酸盐(例如硫酸盐或硫酸氢盐)、硝酸盐、磷酸盐(例如磷酸盐、磷酸氢盐或磷酸二氢盐)、碳酸盐、碳酸氢盐、高氯酸盐、硼酸盐或硫氰酸盐;有机酸盐,例如乙酸盐、丙酸盐、丁酸盐、戊酸盐、己酸盐、庚酸盐、辛酸盐、环戊烷丙酸盐、癸酸盐、十一烷酸盐、油酸盐、硬脂酸盐、乳酸盐、马来酸盐、草酸盐、富马酸盐、酒石酸盐、苹果酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐、己二酸盐、葡萄糖酸盐、乙醇酸盐、烟酸盐、苯甲酸盐、水杨酸盐、抗坏血酸盐、扑酸盐(双羟萘酸盐)、樟脑酸盐、葡庚酸盐或新戊酸盐;磺酸盐,例如甲磺酸盐(甲磺酸盐)、乙磺酸盐(乙磺酸盐)、2-羟基乙磺酸盐(羟乙磺酸盐)、苯磺酸盐(苯磺酸盐)、对甲苯磺酸盐(甲苯磺酸盐)、2-萘磺酸盐(萘磺酸盐)、3-苯基磺酸盐或樟脑磺酸盐;甘油磷酸盐;以及酸性氨基酸盐,例如天冬氨酸盐或谷氨酸盐。式(I)化合物的优选可药用盐包括盐酸盐、氢溴酸盐、甲磺酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、富马酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐和磷酸盐。式(I)化合物的特别优选的可药用盐是盐酸盐。因此,优选式(I)化合物,包括本文所述的任何式(I)的特定化合物,是以盐酸盐、氢溴酸盐、甲磺酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、富马酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐的形式,特别优选的是式(I)化合物为盐酸盐形式。
式(I)的化合物或其可药用盐也可以溶剂化形式(即作为溶剂化物)存在。因此,本发明的范围还包括任何溶剂化形式的式(I)化合物或其可药用盐,包括例如与水形成的溶剂化物(即水合物)或含有机溶剂例如甲醇、乙醇或乙腈的溶剂化物(即为甲醇化物、乙醇化物或乙腈化物)。本发明同样包括任何物理形式、特别是任何固体形式、包括无定形形式或任何结晶形式的式(I)化合物或其可药用盐。
此外,式(I)的化合物可以以不同的异构体的形式存在,特别是立体异构体(包括例如几何异构体(或顺/反式异构体)、对映异构体和非对映异构体)或互变异构体(尤其包括质子互变异构体)。式(I)化合物的所有此类异构体以混合物或纯的或基本上纯的形式都被认为是本发明的一部分。对于立体异构体,本发明包括本发明化合物的分离的光学异构体及其任何混合物(特别是外消旋混合物/外消旋物)。外消旋物可通过物理方法拆分,例如分步结晶、非对映异构体衍生物的分离或结晶,或通过手性柱色谱法分离。各个旋光异构体也可以由外消旋物通过与旋光活性酸形成盐然后结晶而获得。本发明进一步包括本文提供的化合物的任何互变异构体。
本发明的范围还包括式(I)的化合物,其中一个或多个原子被相应原子的特定同位素代替。例如,本发明包括式(I)的化合物,其中一个或多个氢原子(或所有氢原子)被氘原子(即2H;也称为“D”)代替。因此,本发明还包括富含氘的式(I)化合物。天然存在的氢是包含约99.98mol-%氢-1(1H)和约0.0156mol-%氘(2H或D)的同位素混合物。使用本领域已知的氘化技术可以增加式(I)化合物中一个或多个氢位置的氘含量。例如,可以使用例如重水(D2O)使式(I)化合物的合成中使用的式(I)化合物或反应物或前体进行H/D交换反应。其它合适的氘化技术如下所述:Atzrodt J等人,Bioorg Med Chem,20(18),5658-5667,2012;William JS等人,Journal of Labelled Compounds and Radiopharmaceuticals,53(11-12),635-644,2010;或Modvig A等人,J Org Chem,79,5861-5868,2014。氘的含量可以例如使用质谱法或NMR光谱法确定。除非另外特别指出,否则优选式(I)化合物不富含氘。因此,优选在式(I)化合物中存在天然存在的氢原子或1H氢原子。通常,优选式(I)化合物中的原子都不被特定的同位素取代。
本文提供的化合物可以本身作为化合物施用或可以配制成药物。该药物/药物组合物可任选地包含一种或多种可药用的赋形剂,例如载体、稀释剂、填充剂、崩解剂、润滑剂、粘合剂、着色剂、颜料、稳定剂、防腐剂、抗氧化剂和/或溶解度增强剂。
药物组合物可包含一种或多种溶解度增强剂,例如聚乙二醇,包括分子量为约200至约5,000Da的聚乙二醇(例如PEG 200、PEG 300、PEG 400或PEG600)、乙二醇、丙二醇、甘油、非离子表面活性剂、替洛沙泊、聚山梨酯80、聚乙二醇-15-羟基硬脂酸酯(例如HS 15、CAS 70142-34-6)、磷脂、卵磷脂、二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、环糊精、α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精、羟乙基-β-环糊精、羟丙基-β-环糊精、羟乙基-γ-环糊精、羟丙基-γ-环糊精、二羟丙基-β-环糊精、磺丁基醚-β-环糊精、磺丁基醚-γ-环糊精、葡糖基-α-环糊精、葡糖基-β-环糊精、二葡糖基-β-环糊精、麦芽糖基-α-环糊精、麦芽糖基-β-环糊精、麦芽糖基-γ-环糊精、麦芽三糖基-β-环糊精、麦芽三糖基-γ-环糊精、二麦芽糖基-β-环糊精、甲基-β-环糊精、羧基烷基硫醚、羟丙基甲基纤维素、羟丙基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、乙酸乙烯酯共聚物、乙烯基吡咯烷酮、十二烷基硫酸钠、磺基琥珀酸二辛酯钠,或其任意组合。
可以通过本领域技术人员已知的技术来配制药物组合物,例如在“Remington:TheScience and Practice of Pharmacy”,Pharmaceutical Press,第22版中公开的技术。可以将药物组合物配制成用于任何所需施用途径,优选用于口服施用的剂型。用于口服施用的剂型包括例如包衣和未包衣的片剂、软明胶胶囊、硬明胶胶囊、锭剂、含片、溶液、乳剂、混悬剂、糖浆、酏剂、用于重构的粉末和颗粒剂、可分散的粉末和颗粒剂、药用口香糖、咀嚼片和泡腾片。
尽管可以通过任何方便的施用途径将式(I)的化合物或上述包含式(I)化合物的药物组合物向个体施用,但是优选将它们口服施用(特别是通过食入/吞咽)。
因此,所述化合物或药物组合物可以以片剂、胶囊、卵状剂型、酏剂、溶液或混悬液的形式口服施用,其可以包含调味剂或着色剂,用于即刻、延迟、修饰、持续、脉冲或控释应用。
所述片剂可包含赋形剂例如微晶纤维素、乳糖、柠檬酸钠、碳酸钙、磷酸氢钙和甘氨酸,崩解剂例如淀粉(优选玉米、马铃薯或木薯淀粉)、羟乙酸淀粉钠、交联羧甲基纤维素钠和某些复杂的硅酸盐,以及制粒粘合剂例如聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羟丙基纤维素(HPC)、蔗糖、明胶和阿拉伯胶。另外,可以包括润滑剂,例如硬脂酸镁、硬脂酸、山嵛酸甘油酯和滑石粉。相似类型的固体组合物也可用作明胶胶囊中的填充剂。在这方面,优选的赋形剂包括乳糖、淀粉、纤维素或高分子量聚乙二醇。对于水性悬浮液和/或酏剂,活性剂可以与各种甜味剂或调味剂、着色剂或染料、乳化剂和/或助悬剂以及稀释剂如水、乙醇、丙二醇和甘油及其组合结合。
本发明的化合物或药物组合物可以在HBV感染发作之前或之后,优选在HBV感染发作之后,向个体/患者施用。此外,可以每天或依次施用几个分开的剂量以及交错剂量。此外,药物组合物或制剂的剂量可以根据治疗或预防情况的紧急程度成比例地增加或减少。
可以使用已知方法,以在个体/患者中有效治疗HBV感染的剂量和时间段,向个体/患者(优选人)施用本发明的化合物或药物组合物。实现治疗效果所必需的治疗化合物的有效量可以根据例如患者的疾病或病症的状态、患者的年龄、性别和体重以及治疗化合物治疗感染HBV患者的能力等因素而变化。可以调整剂量方案以提供最佳的治疗反应。例如,如治疗情况的紧急情况所示,可以每天施用数个分次剂量或可以成比例地减少剂量。本发明的式(I)化合物的有效剂量范围的非限制性实例是每天约1至约5000mg/kg体重。本领域技术人员可以容易地研究相关因素并确定化合物的有效量而无需过度实验。
可以改变本发明药物组合物中活性成分的实际剂量水平,以便获得有效地实现对特定患者、组合物和施用方式所需的治疗反应的活性成分的量,并且对病人无毒。具体而言,选择的剂量水平将取决于多种因素,包括所使用的特定化合物的活性、施用时间、化合物的排泄速率、治疗的持续时间,用于与该化合物组合治疗的其他药物、化合物或材料,被治疗患者的年龄、性别、体重、病症、一般健康状况和先前的病史,以及医学领域众所周知的类似因素。医生,例如具有本领域普通技术的医师可以容易地确定并开出所需化合物或药物组合物的有效量。例如,医师可以从低于达到所期望治疗效果所需的剂量水平的药物组合物中使用的本发明化合物剂量开始,并逐渐增加剂量直至获得所需效果。
具体而言,以剂量单位形式配制化合物是有利的,其易于施用且剂量均匀。如本文所用的剂量单位形式,是指适合作为要治疗的个体/患者的单位剂量的物理上离散的单位。计算包含预定量的治疗化合物的每个单元,以结合所需的药物载体产生期望的治疗效果。本发明的剂量单位形式通过以下描述并直接取决于(a)治疗化合物的独特特征和要达到的特定治疗效果,以及(b)混合/配制这种用于治疗患者HBV感染的治疗化合物的领域中固有的局限性。
例如,本发明的化合物或药物组合物可以每天一次至五次或更多的剂量施用于个体/患者。或者,本发明的化合物或药物组合物可以以一定剂量范围施用于个体/患者,所述剂量包括但不限于每天一次、每两天一次、每三天一次至一周一次,以及每两周一次。对于本领域技术人员而言显而易见的是,本发明的各种组合组合物的施用频率将因个体而异,这取决于许多因素,包括但不限于年龄、疾病状态、性别、总体健康状况等因素。因此,本发明不应被解释为限于任何特定的剂量方案。主治医师或兽医将考虑与患者有关的所有因素,确定向任何患者施用的确切剂量和药物组合物。
本发明的化合物或药物组合物可以例如以如下剂量(指非盐形式的式(I)的各个化合物的剂量)口服施用:约1μg至约10,000mg、约20μg至约9,500mg、约40μg至约9,000mg、约75μg至约8,500mg、约150μg至约7,500mg、约200μg至约7,000mg、约3050μg至约6,000mg、约500μg至约5,000mg、约750μg至约4,000mg、约1mg至约3,000mg、约10mg至约2,500mg、约20mg至约2,000mg、约25mg至约1,500mg、约30mg至约1,000mg、约40mg至约900mg、约50mg至约800mg、约60mg至约750mg、约70mg至约600mg、约80mg至约500mg,或两者之间的全部或部分增量。
如上所述,本发明化合物的治疗有效量或剂量将取决于个体/患者的年龄、性别和体重、个体/患者的当前医学状况以及待治疗的个体/病人中HBV感染的进展。技术人员可以根据这些和其他因素确定合适的剂量。本发明化合物的合适剂量可以在每天约0.01mg至约5,000mg的范围内,例如约0.1mg至约1,000mg,例如约1mg至约500mg,例如每天约5毫克至约250毫克。
该剂量可以以单剂量或多剂量给药,例如每天1-4次或更多次。当使用多剂量时,每个剂量的量可以相同或不同。例如,每天1mg的剂量可以以两个0.5mg的剂量给药,两次给药之间间隔约12小时。应当理解,在非限制性实例中,每天给药的化合物的量可以每天,每隔一天,每2天,每3天,每4天或每5天施用。例如,每隔一天施用每天5mg剂量,则可以在星期一开始每天5mg的剂量,随后在星期三施用每天5mg的第一个后续剂量,在星期五施用每天5mg的第二个后续剂量,依此类推。
一旦个体/患者的状况得到改善,必要时可以施用维持剂量。随后,可以根据病毒载量将施用剂量或频率或两者降低至保持疾病改善的水平。在一个实施方案中,个体/患者在症状和/或感染的任何复发时需要长期的间歇治疗。
本发明的化合物可以配制成单位剂型。术语“单位剂型”是指适合作为个体/患者接受治疗的单位剂量的物理上离散的单位,其中每个单位包含预定量的经计算产生期望的治疗效果的活性物质,以及任选的合适的药物载体。单位剂型可以是单次日剂量或多次日剂量(例如每天约1至4次)之一。当使用多次日剂量时,每个剂量的单位剂型可以相同或不同。
此类治疗方案的毒性和治疗功效任选地在细胞培养物或实验动物中确定,包括但不限于CC50(导致50%的存活细胞死亡的化合物的细胞毒性浓度)和IC50(抑制50%病原体的最低浓度)。毒性和治疗效果之间的剂量比是治疗指数,其表示为CC50和IC50之间的比值。表现出高治疗指数的化合物是优选的。从细胞培养测定法和动物研究中获得的数据任选地用于配制用于人类个体/患者的剂量范围。这类化合物的剂量优选在循环浓度范围内,其包括具有最小毒性的IC50。剂量任选地在此范围内变化,这取决于所采用的剂型和所采用的施用途径。
式(I)化合物或包含式(I)化合物的药物组合物可以单一疗法施用(例如,不同时施用抗HBV感染的任何其他治疗剂)。然而,式(I)化合物或包含式(I)化合物的药物组合物也可以与一种或多种其他治疗剂,特别是与一种或多种其他抗HBV剂(即一种或多种其他抗HBV感染的治疗剂)组合施用。
所述其他抗HBV剂可以是例如HBV聚合酶抑制剂、逆转录酶抑制剂、病毒进入抑制剂、病毒成熟抑制剂、衣壳装配抑制剂/调节剂、TLR激动剂、HBV疫苗、免疫调节剂、干扰素或聚乙二醇化干扰素。逆转录酶抑制剂(或HBV聚合酶抑制剂)的实例包括,特别是齐多夫定、去羟肌苷、扎西他滨、2’,3’-双脱氧腺苷(ddA)、司他夫定、拉米夫定、阿巴卡韦、恩曲他滨、恩替卡韦、阿立他滨(apricitabine)、阿替韦拉平(atevirapine)、利巴韦林、阿昔洛韦、泛昔洛韦、伐昔洛韦、更昔洛韦、缬更昔洛韦、替诺福韦、阿德福韦、西多福韦、依非韦伦、奈韦拉平、地拉韦定、依曲韦林(etravirine)、替比夫定(telbivudine)或上述药物中任何一种的可药用的盐、酯或前药(例如替诺福韦艾拉酚胺、替诺福韦艾拉酚胺富马酸酯、替诺福韦二吡呋酯(tenofovir disoproxil)、富马酸替诺福韦二吡呋酯或阿德福韦双特戊酰氧甲酯)。衣壳装配抑制剂/调节剂的实例包括特别是BAY4114109或其可药用盐、酯或前药。TLR激动剂的实例包括特别是TLR7激动剂或TLR9激动剂;TLR7激动剂可以是例如SM360320(或9-苄基-8-羟基-2-(2-甲氧基-乙氧基)腺嘌呤)、AZD 8848(或[3-({[3-(6-氨基-2-丁氧基-8-氧代-7,8-二氢-9H-嘌呤-9-基)丙基][3-(4-吗啉基)丙基]氨基}甲基)苯基]乙酸甲酯)或其可药用盐、酯或前药。干扰素的实例包括特别是干扰素α(例如干扰素α-2a或干扰素α-2b)、干扰素γ或干扰素λ。聚乙二醇化干扰素的实例包括特别是聚乙二醇化干扰素α(例如,聚乙二醇化干扰素α-2a或聚乙二醇化干扰素α2b)、聚乙二醇化干扰素γ或聚乙二醇化干扰素λ。抗HBV剂的其他实例包括但不限于AT-61(或(E)-N-(1-氯-3-氧代-1-苯基-3-(哌啶-1-基)丙-1-烯-2-基)苯甲酰胺)、AT-130(或(E)-N(1-溴-1-(2-甲氧基苯基)-3-氧代-3-(哌啶-1-基)丙-1-烯-2-基)-4-硝基苯甲酰胺)或其可药用盐、酯或前药。
如果将式(I)化合物与其他抗HBV试剂组合使用,则每种化合物的剂量可能与单独使用相应化合物时的剂量不同,特别是可以使用更低剂量的各种化合物。式(I)化合物与一种或多种其他抗-HBV剂的组合可包括同时/伴随施用式(I)化合物和其他抗-HBV剂,可以是单一药物制剂,也可以是分开的药物制剂,或式(I)化合物和其他抗HBV剂依次/分开施用。如果依次施用,则可以首先施用本发明的式(I)化合物或一种或多种其他抗HBV剂。如果同时施用,则所述一种或多种其他抗HBV剂可包含在与式(I)化合物相同的药物组合物/制剂中(特别是作为固定剂量的组合使用),或者它们可以两种或多种不同的(单独)药物组合物/制剂(或不同剂型)施用。所述不同的药物组合物/制剂可以通过相同的施用途径或通过不同的施用途径来给药(例如,一种药物可以口服给药,而另一种药物可以肠胃外给药)。可以根据预期的施用途径适当地选择每种不同药物组合物/制剂的剂型。两种(或更多种)不同的药物组合物/制剂(或不同的剂型)也可以包含在同一包装中,特别是在组合包装(或便利包装)中。因此,如上所述,可以提供式(I)化合物和一种或多种其他抗HBV剂,例如以固定剂量组合(即在同一药物组合物中)或组合包装形式(即在同一包装中包含的分开的药物组合物中)。
因此,本发明涉及式(I)的化合物或其可药用盐,或包含所述化合物与可药用赋形剂的药物组合物,其用于治疗HBV感染(包括任何上文所述特定的HBV感染类型),其中所述化合物或药物组合物应与一种或多种其他抗HBV剂(例如上述一种或多种具体的抗HBV药剂,例如干扰素α(例如,干扰素α-2a或干扰素α-2b)、干扰素γ、干扰素λ、聚乙二醇化干扰素α(例如聚乙二醇化干扰素α-2a或聚乙二醇化干扰素α-2b)、聚乙二醇化干扰素γ、聚乙二醇化干扰素λ、齐多夫定、去羟肌苷、扎西他滨、2’,3’-双脱氧腺苷(ddA)、司他夫定、拉米夫定、阿巴卡韦、恩曲他滨、恩替卡韦、阿立他滨、阿替韦拉平、利巴韦林、阿昔洛韦、泛昔洛韦、伐昔洛韦、更昔洛韦、缬更昔洛韦、替诺福韦、替诺福韦艾拉酚胺、替诺福韦艾拉酚胺富马酸酯、替诺福韦二吡呋酯、富马酸替诺福韦二吡呋酯、阿德福韦、阿德福韦双特戊酰氧甲酯、西多福韦、依法韦仑、奈韦拉平、地拉韦定、依曲韦林、替比夫定、BAY 41-4109、SM360320、AZD8848、AT-61、AT-130,或上述任何一种药物的可药用盐、酯或前药)。本发明化合物或药物组合物与一种或多种其它抗HBV剂的组合施用可例如通过同时/伴随施用(在单一药物制剂中或在分开的药物制剂中)或依次/单独施用来实现。
本发明要治疗的个体或患者可以是动物(例如非人类动物)。优选地,所述个体/患者是哺乳动物。更优选地,个体/患者是人类(例如男性或女性)或非人类哺乳动物(例如土拨鼠、豚鼠、仓鼠、大鼠、小鼠、兔子、狗、猫、马、猴、猿、绒、狒狒、大猩猩、黑猩猩、猩猩、长臂猿、绵羊、牛或猪)。最优选地,本发明要治疗的个体/患者是人。个体/患者(其优选为人类个体)可以进一步是例如免疫受损的个体、HIV阳性个体、免疫抑制的个体或器官移植接受者。
如本文所用,除非上下文矛盾,否则术语“治疗”或“处理”(疾病或病症)是指治愈、缓解、减轻或预防疾病或病症的一种或多种症状或临床相关表现,或缓解、逆转或消除疾病或病症,或预防疾病或病症的发作,或预防、减轻或延迟疾病或病症的进展。例如,还未鉴定出相应疾病或病症的症状或临床相关表现的个体或患者的“治疗”是预防或预防性治疗,而已鉴定出相应疾病或病症的症状或临床相关表现的个体或患者的“治疗”可以是例如治愈或姑息治疗。这些治疗形式中的每一种都可以被认为是本发明的不同方面。
病症或疾病的“治疗”可能会例如导致病症或疾病的进展停顿(例如,症状无恶化),或病症或疾病的进展延迟(如果进展停顿只是暂时性的)。病症或疾病的“治疗”还可以导致患有病症或疾病的个体/患者的部分反应(例如症状减轻)或完全反应(例如,症状消失)。因此,对病症或疾病的“治疗”还可以指病症或疾病的改善,例如,这可能导致病症或疾病的进展停顿或病症或疾病的进展延迟。这样的部分或完全反应之后可能会复发。应当理解,个体/患者可能经历对治疗的广泛反应(例如,如上文所述的示例性反应)。病症或疾病的治疗尤其可以包括病症或疾病的治愈性治疗(优选导致病症或疾病的完全反应并最终治愈)、姑息治疗(包括症状缓解)或预防性治疗(包括预防)。
应当理解,本发明具体涉及本文所述的特征和实施方案的每个和每种组合,包括一般和/或优选的特征/实施方案的任何组合。特别地,本发明具体涉及式(I)中所包括的各种基团和变量的含义(包括一般和/或优选的含义)的每种组合。
还应理解,除非另有说明或与上下文矛盾,否则本文描述的任何方法的所有步骤通常可以任何合适的顺序进行。优选地,任何这样的方法步骤均以所示的它们的特定顺序进行。
在本说明书中,引用了许多文件,包括专利或专利申请、科学文献和制造商的手册。这些文件的公开内容虽然被认为与本发明的可专利性无关,但其全部内容通过引用并入本文。更具体地,所有参考文献通过引用的方式并入,就好像每个单独文件被具体地和单独地指示通过引用并入一样。
本说明书中对任何在先出版物(或由此衍生的信息)的引用都不是也不应被视为承认或接受相应的在先出版物(或从中得出的信息)构成本说明书所涉及的技术领域中公知常识的一部分或任何形式的提示。
通过以下说明性附图也描述了本发明。附图显示:
图1:成熟度筛选鉴定了增强HLC成熟度的小分子。(A)HLC成熟筛选级联。(B)在用MB-1处理后,在HLC上进行了全基因组转录组微阵列,显示了137个肝特征基因的mRNA表达(在肝中高表达、特异性指数gini>0.8的那些)。1-3泳道,分别是7d、24h和2h的MB-1(5μM)。4-6泳道,分别是7d、24h和2h的MB-1(0.5μM)。(C)将HLC转录组的BioQC肝得分分析(在用MB-1处理2h、24h和7天之后)与PHH、HepaRG和HepG2的进行了比较。(D)用MB-1或1%DMSO处理14天后,HLC中AAT-1α的表达。(E)MB-1处理的HLC支持稳定的HBV感染:HLC(在96孔板中)用MB-1(1μM)或1%DMSO处理4天,然后用来自患者的HBV(MOI 10,一式三份)感染。在指定的时间点收获培养基并分析HBsAg。
图2:HLC是用于HBV的疾病相关模型。(A)HBV生命周期示意图。(B-F)HLC和PHH中HBV感染的动力学:将细胞(在96孔板中)感染HBV(MOI 40,一式三份),并培养14天。在指定的时间点收获培养基和细胞裂解物,并分析所示的各种HBV标记。(G)通过Southern印迹分析检测HBV感染的细胞中的cccDNA:用患者来源的HBV感染HLC和PHH,并在感染后第10天通过Hirt提取法收获。样品在上样到凝胶之前用T5核酸外切酶消化。将全长3.2kb HBV(+)链RNA探针用于HBV DNA检测。(H)用抗HBs和抗HBc抗体对HLC和PHH感染细胞进行免疫染色。(I)HLC支持来自多种GT的临床HBV分离株的稳定感染(MOI 40,一式三份,384孔板)。在感染后第14天检测HBsAg和HBeAg。
图3:HLC中的约247K HTS,用于发现新的cccDNA抑制剂。(A)HLC和PHH分析的重现性:在MOI 40时用患者来源的HBV感染细胞。在感染后第3天,从100μM开始以3倍稀释度添加参考化合物。在HLC中重复实验30次,在PHH中重复实验62次;每条线代表每个实验的HBsAg或HBeAg IC50曲线。(B)HTS测试(在HLC中)和筛选级联(在PHH中)的示意图。(C)HLC初筛所选出的化合物:基于多重读出的HLC初筛所选出的化合物的堆积点图(分析中排除了抑制白蛋白>40%的化合物)。图中的每个点均显示出一种化合物,该化合物可抑制HBsAg(蓝色)或HBeAg(绿色)。红色虚线框突出显示了3752种抑制这两种HBV抗原均>60%的化合物。(D)在PHH中HLC所选出化合物的效力(n=1027)。在PHH中测试了HLC所选出的化合物,并显示了它们在HLC和PHH中对HBsAg和HBeAg的IC50值。虚线表示每种细胞类型中所有化合物的平均HBsAg和HBeAg IC50值。(E)在HLC和PHH中HLC所选出的化合物的HBsAg/HBeAg与pgRNA活性之间的相关性:HLC所选出的化合物(n=244)显示它们对HBsAg和HBeAg的效力(中位IC50值分别为1.72μM和1.55μM)与对pgRNA活性(中位数IC50为2.64μM)之间具有良好的相关性。在PHH中用127种化合物获得了相似的结果,其HBsAg、HBeAg和pgRNA的IC50中位值分别为11.40μM、10.90μM和12.20μM。(F)通过Southern印迹法测定法证实在PHH中cccDNA去稳定剂的活性。PHH用HBV(GT D)感染,并在感染后第3天,以2或6μM的浓度用化合物7和参考化合物1处理。在感染后第10天,制备了Hirt提取物,并通过Southern印迹法进行分析。线粒体DNA(mtDNA)用作每个样品的上样对照。
图4:在PHH中cccDNA去稳定剂的分子表型分析。(A)主成分分析(PCA):感染HBV(或用1%DMSO处理)三天后,将PHH与化合物7和参考化合物1(均采用较低活性的异构体)孵育6小时,然后收获。所有实验条件一式三份进行。显示的PCA基于917个途径报道基因的AmpliSeq-RNA数据。(B)cccDNA去稳定剂的途径热图:受HBV或化合物7或参考化合物1显著(p<0.001)调节的途径在热图中可见。
图5:化合物7对PHH中患者来源的HBV GT A-D的抗病毒活性。接种在384孔板中的PHH一式三份用患者来源的HBV(GT A-D)以MOI 40感染。在注射后第3天,以3倍稀释液添加化合物7;起始浓度为156μM。1%DMSO用作阴性对照。每两天补充一次新鲜的培养基和化合物,并在感染后第10天收获细胞。(A-B)在不存在化合物的情况下,在接种后第10天,释放到培养基中的HBsAg和HBeAg的基线水平以及HBV基因型A-D的cccDNA拷贝数/孔(384孔板格式)。(C)基于HBsAg、HBeAg和HBV DNA读数,化合物7对HBV GT A-D的抗病毒活性。白蛋白是细胞毒性标志物。(D)基于cccDNA读数(数字PCR)的化合物7对HBV GT A-D的抗病毒活性。
图6:MB-1对HLC中96种肝脏富集基因表达的影响。用在1%DMSO中的MB-1(1、5或10μM)或1%DMSO(一式三份)处理接种在被I型胶原蛋白包被的6孔板上的HLC 4天。收获细胞,通过微流控RT-qPCR(Fluidigm)分析96种肝富集基因的表达。
图7:通过OptiPrepTM梯度从患者血清中纯化HBV。使用在SW41管(BD Biosciences)中的OptiPrepTM密度梯度(100,000xg在4℃下2小时)从CHB个体血清中纯化HBV。从顶部收集二十个流份(每个500μl),分析每个流分的等分试样的HBV DNA和HBsAg。合并含有大量HBVDNA(病毒颗粒)的峰值流份,用于感染实验。
图8:建立用于cccDNA定量的dPCR测定法。(A)TaqMan-PCR测定的检测范围限制了从96和384孔板准确测定cccDNA拷贝数。通过TaqMan-PCR将3.2kb线性化的质粒HBV用作HBVDNA相对定量的标准曲线。将质粒进行10倍稀释(从2x109拷贝/μl至2x103拷贝/μl),并使用核心引物扩增HBV DNA(Werle-Lapostolle等人,2004);该测定法的LLOD(~1x103拷贝/μl)与在384孔板中生长的细胞中存在的cccDNA的较低水平重叠。384孔板中HLC和PHH中cccDNA的总量约为1200-12,000个拷贝/孔(假设接种的约30K个细胞的感染率为40%,且平均有0.1-1个cccDNA拷贝/细胞)(Nassal,2015)。(B)测试引物和PCR特异性并去除过量的RC-DNA。与TaqMan-PCR(相对定量方法)不同,数字PCR(dPCR)是绝对定量方法,不需要标准曲线。它也比TaqMan-PCR更灵敏(~50倍);可以通过测试每个样品更多的重复(阵列/通孔)来提高测定精度。第一步–测试引物和PCR特异性。血清来源的HBV(包含RC-DNA,不含cccDNA)被用作dPCR的DNA模板,使用两组引物(用于HBV核心和cccDNA区域)(Werle-Lapostolle等人,2004)。在QuantStudio 12K Flex实时PCR系统(AB)上通过dPCR扩增样品;每个样品使用4个子阵列(256个通孔)。用cccDNA引物检测到低信号,表明RC-DNA的非特异性扩增。第二步–去除多余的RC-DNA。将接种在96孔中的PHH感染HBV。在感染后第6天,将细胞裂解物在37℃下用质粒安全、ATP依赖的DNAse(PSAD)、T5核酸外切酶或T5核酸外切酶后用EcoRI消化1小时。使用cccDNA引物在QuantStudio 12K Flex实时PCR系统(AB)上通过dPCR扩增样品;每个样品使用4个子阵列(256个通孔)。在dPCR之前,用T5核酸外切酶处理可有效去除过量的RC-DNA。(C)恩替卡韦(ETV)和罗扰素对PHH中HBV DNA、HBsAg、HBeAg和cccDNA的影响。为了验证用于自然感染细胞中cccDNA检测的dPCR分析,将PHH用患者来源的HBV(GT D,以MOI40)感染,三天后,用所示浓度的ETV和罗扰素处理。两种化合物对HBV DNA均具有很高的效力,但对其他病毒标志物没有影响。每2天补充一次新鲜的培养基和化合物。在感染后第10天,收获培养基并测量HBV DNA、HBsAg和HBeAg。白蛋白被用作体外毒性标志物的替代物。裂解细胞并用T5核酸外切酶处理,然后在QuantStudio 12K Flex实时PCR系统(AB)上通过dPCR测定cccDNA;每个样品使用4个子阵列(256个通孔)。(D)恩替卡韦(ETV)和罗扰素(Rof)对PHH中HBV DNA、HBsAg和HBeAg的影响。从感染(患者来源的HBV,GT D)后第3天开始,以指定浓度的化合物处理细胞。每2天补充一次新鲜的培养基和化合物。在感染后第10天收获细胞;从培养基中检测病毒标志物和白蛋白。
图9:通过Southern印迹法检测HBV感染的PHH和HLC中的cccDNA。用患者来源的HBV(GT D)感染在24孔板中生长的细胞,并在第10天通过Hirt提取法进行收获。(左,PHH)为了验证在HBV感染的细胞(泳道2)中检测到的主要条带是cccDNA,将样品在85℃加热5分钟以使rcDNA和dslDNA变性为ssDNA(泳道3),并用EcoRI消化以将cccDNA转换为dslDNA(泳道4),或用T5核酸外切酶消化以去除任何有切口的/线性的DNA片段(泳道5)。泳道2-5各自对应~100万个细胞。将全长3.2kb HBV(+)链RNA探针用于HBV DNA检测。rcDNA,松弛环状DNA;dslDNA,双链线性DNA;cccDNA,共价闭合环状DNA。
图10:患者来源的HBV(GT A)感染的HLC和PHH的免疫染色。将接种于384孔板的细胞感染患者来源的HBV(以MOI 40的GT A),并在感染后第12天固定并用抗HBV核心和抗HBs抗体染色。
图11:多重测定作为主要的HTS读数。(A)Z-值的测定:将384孔板中接种的HLC在1%DMSO的存在下(19板)用患者来源的HBV(MOI 40)感染,或用参考化合物(1板)处理(共20板)。在感染后第14天,通过基于Luminex的多元测定法(Radix BioSolutions,Georgetown,TX)同时测量所有平板的培养基中的HBsAg、HBeAg和白蛋白。通过GeneData软件执行数据分析,并捕获每个板上每种分析物的图像。数字表示各个(384孔)板。(B)白蛋白作为化合物毒性的预测因子:接种于384孔板的HLC感染患者衍生的HBV(MOI 40),并从感染后第3天开始用385种化合物处理。每2天补充一次新鲜的培养基和化合物。在感染后第14天,收获培养基并通过多重测定分析白蛋白抑制,并通过标准的体外毒性测定法(细胞增殖试剂/WST-1;目录号11 644 807 001,Roche Diagnostics)分析细胞裂解物。三幅图,每个图用4个象限描绘,表明白蛋白可以预测WST-1检测到的94.81%的化合物毒性(第一象限)。重要的是,白蛋白抑制作用可用于滤除WST-1未检测到的非特异性抑制剂(192种化合物,49.87%)(第二象限)。
图12:分子表型分析(受核苷类似物和干扰素-α影响的宿主途径的热图)。感染后第3天,PHH用1x IC90值的核苷类似物(ETV)或IFN-α处理6小时。使用RLT缓冲液(QIAGEN)提取总RNA,进行逆转录,并使用Ion AmpliSeqTMRNA文库试剂盒(Life Technologies,Carlsbad,USA,cat#4482335)扩增cDNA产物。使用CAMERA方法(Wu&Smyth,2012)进行路径分析,并将基因集存储在内部可用的数据库(RONET)中,该数据库集成了公众可用的基因集例如MSigDB(Liberzon等人,2011)和REACTOME(Fabregat等人,2016)。CAMERA的结果由富集得分表示,其由CAMERA返回的经log10转换的绝对p值乘以+1(基因集的正向调节)或-1(基因集的负向调节)来定义。
图13:PHH中的全基因型(GT A-D)HBV感染。细胞以MOI 40用每种HBV分离株/GT感染。十天后,用抗HBs和抗HBc抗体进行免疫染色。
图14:(A)筛选级联原理以增加鉴定cccDNA抑制剂的可能性。(B)鉴定cccDNA抑制剂的筛选级联的优选标准。
图15:PHH(患者来源的HBV,GT D)中吡咯并[2,3-b]吡嗪化合物的(A)HBeAg和HBsAg活性,(B)白蛋白活性,(C)pgRNA活性和(D)cccDNA活性。参见实施例2。
图16:化合物7对PHH中患者来源的HBV GT A-D的抗病毒活性(参见实施例2)。(A)使用抗-HBs和抗-HBc抗体对PHH感染的细胞进行免疫染色。(B-C)在没有化合物存在的感染后第10天,释放到培养基中的HBsAg和HBeAg水平以及HBV基因型A-D的cccDNA拷贝数/孔。(D)基于HBsAg、HBeAg和HBV DNA读数的化合物7对HBV GT A-D的抗病毒活性。白蛋白是细胞毒性标志物。(E)基于cccDNA读数的化合物7对HBV GT A-D的抗病毒活性。
图17:化合物7对HBV GT A-D的全部GT的cccDNA活性(见实施例2)。
现在将参考以下实施例描述本发明,这些实施例仅是示例性的,并且不应解释为对本发明范围的限制。
实施例
实施例1:在干细胞衍生的肝细胞样细胞中进行表型筛选,这些细胞涵盖了临床分离物的完整HBV生命周期,从而发现cccDNA抑制剂
方法
患者血清纯化
使用OptiPrepTM(Axis-Shield,Norway)密度梯度纯化来自CHB个体血清的HBV。简要地说,将OptiPrepTM储备溶液(60%)在PBS中稀释至50%和10%;然后将等体积的每种溶液添加到SW41管(BD Biosciences)中。通过将管放在Gradient Master 108TM(Biocomp)上,设置为80°,25rpm,30”,进行线性梯度。将200微升(200μl)血清覆盖在梯度的顶部,并将样品在100,000xg下于4℃离心2小时。从顶部收集组分(500μl)并将每个组分的等分试样使用核心引物5'-CTGTGCCTTGGGTGGCTTT(正向)、5'-AAGGAAAGAAGTCAGAAGGCAAAA(反向)、56-FAM/AGCTCCAAATTCTTTATAAGGGTCGATGTCCATG/3IABlk_FQ/(探针)(Werle-Lapostolle等人,2004年)分析HBV DNA和HBsAg。合并含有HBV DNA峰的组分,并用作所有感染实验的病毒接种物。所有组分均储存在-80℃直至使用。
iPS衍生的肝细胞样细胞(HLC)
根据制造商的建议,将冷冻保存的HLC解冻并接种。简要地说,将冷冻保存的细胞在37℃水浴中融化2分钟,然后将冷冻管的内容物倒入装有12ml 37℃ iCell肝细胞培养基B(KryoThaw组分A 7.8ml、KryoThaw组分B 4.2ml)的15ml管中。将试管缓慢倒置(~5次),然后在室温下以110xg离心10分钟。吸出培养基后,加入2ml RT iCell肝细胞培养基C(RPMI含B27补充剂、制瘤素M 20ng/ml、地塞米松1μM和庆大霉素25μg/ml),并对细胞计数。然后将细胞悬浮液在含有0.25mg/ml Matrigel的培养基C中以1百万个细胞/ml稀释。将细胞以40,000个细胞/孔(384孔板)或100,000个细胞/孔(96孔板)的浓度接种到胶原蛋白I包被的细胞培养板上,在37℃的培养箱中于5%CO2的潮湿环境中培养。接种后24小时,用含有Matrigel 0.25mg/ml和1μM MB-1的培养基D(含有B27补充剂的RPMI、制瘤素M 20ng/ml、地塞米松0.1μM和庆大霉素25μg/ml)替换培养基。新鲜培养基和MB-1每2天更换一次。
HLC成熟筛选
将HLC接种在胶原蛋白I包被的96孔板上的100μl含0.25mg/ml Matrigel的培养基D中。下一天(第1天),将化合物库以在1%DMSO中的终浓度4μM加入细胞中。2天后(第3天)补充新鲜的培养基和化合物。在第4天,使用Cells-to-Ct裂解试剂盒(Ambion/ThermoFisher)收获细胞,对总RNA进行逆转录,然后将所得cDNA产物上样至微流体96.96DynamicArrayTM IFC中,并在Biomark HD系统(Fluidigm)上针对32种肝脏富集基因进行检测。以DMSO对照中的管家基因(PPIA)为参考,根据ΔCt值计算相对基因表达;然后将ΔCt值转换为倍数变化值。与DMSO对照相比,在HLC中将肝脏富集的基因表达提高了≥3倍的化合物在剂量-效应(1、5、10和50μM)中进行进一步测试。如上所述,使用96个肝脏富集的基因进行二次筛选。使用HLC的所有实验均使用最高候选物(MB-1)。
PXB-PHH
从人源化小鼠(uPA/SCID小鼠)收获的新鲜原代人肝细胞(PXB-PHH)(本文称为PHH)获自PhoenixBio有限公司(日本)。将细胞以以下细胞密度接种在胶原蛋白I包被的板上:35,000细胞/孔(384孔),70,000细胞/孔(96孔)或400,000细胞/孔(24孔)在改良肝细胞克隆生长培养基(dHCGM)中。dHCGM是一种DMEM培养基,包含100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、20mM Hepes、44mM NaHCO3、15μg/ml L-脯氨酸、0.25μg/ml胰岛素、50nM地塞米松、5ng/ml EGF、0.1mM Asc-2P、2%DMSO和10%FBS(Ishida等人,2015)。将细胞在37℃的培养箱中于5%CO2的潮湿气氛中进行培养。接种后24小时和每2天更换培养基直至收获。
HBV感染和化合物处理
用1μM MB-1成熟4天后,将HLC与HBV(从CHB个体纯化)在无PEG的感染复数(MOI)10-40下孵育24小时;第二天取出病毒接种物。PHH中的HBV感染是在MOI 40+4%PEG下进行。感染后第3天开始在HLC和PHH中进行化合物处理。将化合物(粉末状)溶于DMSO;加入细胞的DMSO终浓度为1%。每2天补充一次新鲜化合物,直到在第10天(PHH)或第14天(HLC)收获细胞。通过多重测定(HBsAg、HBeAg、白蛋白),分支DNA(pgRNA)或数字PCR(cccDNA)测量化合物对HBV的作用和细胞毒性,并表示为与DMSO对照相比的抑制百分比。使用Spotfire软件制图。
高通量筛选(HTS)
用1μM MB-1处理接种在胶原蛋白I包被的384孔板中的HLC 4天(每2天补充一次培养基和化合物)。第4天,以MOI 40用HBV(从CHB个体血清中纯化)感染细胞24小时;取出病毒接种物,并加入新鲜培养基。在感染后第3天,以终浓度4μM在1%DMSO中的溶液加入化合物库;每2天补充新鲜培养基和化合物,直到第14天。在整个18天的HTS分析中,将细胞在37℃的培养箱中于5%CO2的潮湿环境中培养;所有液体处理均在BSL3**设施中使用机器人设备进行。在感染后第14天,收获培养基并进行处理以进行多重测定。每次运行中筛选大约20,000种化合物。
HTS读出
多重测定——初步读出
Radix BioSolutions(Georgetown,TX)开发了基于Luminex的定制多重分析方法,可同时测量HBeAg、白蛋白和HBsAg。这是一种夹心免疫测定;每个捕获抗体均与xMAPTMLuminex磁珠偶联。分析物检测的动态范围如下:HBeAg(1-316ng/ml)、白蛋白(3.1-10,000ng/ml)和HBsAg(0.1-100ng/ml),变异系数(CV)≤25%。在FlexMAP 3D(Luminex)上读取样品,通过Genedata软件进行分析。下表显示,针对每种分析物的多重磁珠和检测抗体在分析物之间没有交叉反应(数字报告为平均荧光强度/MFI)。
pgRNA测定(分支DNA)——第二次读出
使用QuantiGene Singleplex 2.0测定法(Affymetrix)检测受感染细胞(96孔板)中pgRNA的水平,这是一种基于杂交的分析方法,利用xMAPTM Luminex磁珠和分支DNA(bDNA)信号放大技术。根据制造商的建议,该实验在96孔板上进行。简而言之,将细胞裂解,并将裂解物与HBV探针组在50-55℃下孵育30分钟,然后在-80℃下保存。通过前置放大器、放大器和标记探针的顺序杂交可实现信号放大。加入抗生蛋白链菌素藻红蛋白(SAPE)底物后,使用FlexMap3D(Luminex)仪器读取信号。
cccDNA测定(数字PCR)——第三次读出
按照生产商的说明(Thermo Scientific),使用Cells-to-CT裂解试剂裂解感染HBV的细胞(在384孔或96孔板上)。为了除去过量的RC-DNA,用T5核酸外切酶(10U)(NewEngland Biolabs)在37℃下消化1小时;在80℃下加热样品15分钟使酶失活。将DNA样品(1.2μl)添加到含有cccDNA引物5'-CTCCCCGTCTGTGCCTTCT(正向)、5'-GCCCCAAAGCCACCCAAG(反向)和CGTCGCATGGAGAGACCACCGTGAACGCC(探针)的数字PCR Master Mix(QuantStudio数字PCR试剂盒,Thermo Scientific)(Werle-Lapostolle等人,2004)中,总体积为5μl,使用AccuFill System(AB)加载到dPCR阵列。将每个样品装入4个子阵列/256个通孔中。在QuantStudio 12K Flex(AB)上运行数字PCR测定,并通过Digital Suite软件(AB)分析数据。
cccDNA测定(Southern印迹)——确认/第四次读出
如上所述,将HLC或PHH以12孔板形式接种并用HBV感染。在第10天,如下从细胞制备HIRT提取物。简言之,将500μl HIRT裂解缓冲液添加到每个孔中,并按照标准HIRT提取程序(Cai等人,2013)将来自三个孔的裂解物合并以分离出无蛋白的HBV DNA。对于Southern印迹分析,使用0.2μl Quick-Load 1-kb DNA阶梯(New England Biolabs),2pg 1x HBV基因组长度(3.2kb)PCR产品(引物P1/P2,Guenther等人,1995),在每个泳道中分别装入5μgHIRT提取的DNA,并在1x Tris-乙酸-EDTA缓冲液中于1.0%(w/v)的琼脂糖凝胶中于50V电泳3.5小时。电泳后,按照描述的方法(Cai等人,2013)对DNA进行纯化、变性和中和,然后使用TurboBlotter系统(GE Healthcare)将其转移到Hybond XL膜(Amersham)上。HBV DNA采用从带有T7启动子的1x HBV基因组长度(3.2kb)PCR产物转录的DIG标记(+)链HBV RNA探针(HBV T7+正向引物5'-TAATACGACTCACTATAGGGTTTTTCACCTCTGCCTAATCATC-3'、HBV反向引物5'-CCTCTAGAGCGGCCGCAAAAAGTTGCATGGTGCTGGT-3’)根据制造商的说明使用DIG Northern入门试剂盒(Roche)检测。用与线粒体基因组的ND1基因区域结合的RNA探针检测线粒体DNA(Ducluzeau等人,1999)。按照制造商的说明进行杂交、洗涤并用CDP-Star(Roche)进行检测。用FUSION Fx(Vilber)采集图像,并使用FUSION-CAPT软件通过光密度测定法对条带进行定量。
免疫染色
使用Image-iTTM固定/透过试剂盒(Thermo Fisher,目录号R37602)进行免疫染色。在感染后第10天,将细胞在室温(RT)的1ml固定液中固定15分钟,然后用2ml的洗涤缓冲液洗涤3次,每次2-5分钟。将细胞与在含有3%BSA、组分V、去脂的新西兰源的D-PBS缓冲液中稀释的一抗和随后的二抗孵育,分别在室温下孵育1小时。一抗:抗HBs mAb,MAK_M_RF18(Roche)浓度为1.25μg/mL,或抗HBV核心抗体浓度为0.1μg/mL(DAKO,目录号B0586)。二抗:山羊抗兔IgG(H+L)交叉吸附二抗,Alexa Fluor 594(Thermo Fisher目录号A-11012),或山羊抗小鼠IgG(H+L)交叉吸附二抗,Alexa Fluor 488(Thermo Fisher目录号A-11001),浓度为2μg/ml。用2ml洗涤缓冲液洗涤三次2-5分钟后,将细胞用Hoechst 33342三盐酸盐三水合物(Thermo Fisher目录号H3570)在室温在1μg/ml孵育15分钟。用Axio Observer倒置显微镜(Zeiss)和Zeiss ZEN软件分析免疫染色。
分子表型分析
在感染后第3天,将细胞用化合物或1%DMSO处理6小时。使用RLT缓冲液(QIAGEN,Hombrechtikon,瑞士)提取总RNA,将样品保存在-80℃下。每个生物复制物中的十(10)ng总RNA被逆转录;根据Ion AmpliSeq RNA文库试剂盒(Life Technologies,Carlsbad,美国,目录号4482335)提供的方法扩增cDNA产物。引物消化后,将衔接子和条码连接至扩增子,然后进行磁珠纯化。将纯化的文库扩增、纯化并在-20℃下保存。扩增子的大小和DNA浓度是使用安捷伦高灵敏度DNA试剂盒(Agilent Technologies,Waldbronn,德国)根据制造商指南进行测量。使用CAMERA方法(Wu&Smyth,2012)进行路径分析,并将基因集存储在内部可用数据库(RONET)中,该数据库集成了公众可用的基因集例如MSigDB(Liberzon等人,2011)和REACTOME(Fabregat等人,2016)。CAMERA的结果由富集得分表示,富集得分由CAMERA返回的经log10转换的绝对p值乘以+1(基因集的正向调节)或-1(基因集的负向调节)来定义。
结果
鉴定增强HLC成熟的小分子
为了充分显示HLC作为与HBV药物开发的疾病相关检测方法的潜力,它们必须满足以下标准:肝细胞样、可扩展性、检测稳定性和可重复性。众所周知,HLC仍表现出不成熟的表型,即更像胎儿,而不是成人肝细胞(Baxter等人,2015;Godoy等人,2015;Goldring等人,2017)。使用当前方案获得完全成熟的HLC的困难是多方面的,包括供体来源的可变性(Kajiwara等人,2012;Heslop等人,2017),以及不能很好地模拟包括肝区划在内的肝结构复杂性的培养条件(Goldring等人,2017)。事实上,根据肝细胞沿肝门中心轴的位置,肝细胞差异化表达关键的肝基因,因此具有不同的代谢功能(Halpern等人,2017;Soto-Gutierrez等人,2017;Torre等人,2010)。HLC在药物开发中应用的另一个关键问题是可扩展性;运行HTS以及随后的多次所选出化合物的跟踪循环需要数十亿个细胞(具有高纯度且批次间差异最小)。发明人从商业来源(CDI,Madison,WI)选择了HLC,并且他们的第一个努力是使用由约700种生物活性化合物组成的小分子文库来改善其成熟。根据制造商的建议(Lu等人,2016)培养细胞,并与化合物文库(4μM)一起孵育。为了鉴定增强肝成熟的有效化合物,发明人基于32个(第一次筛选)或96个(第二次筛选)肝脏富集基因的上调应用了两步筛选级联(参见图1A和表1)。根据其以相对较低的浓度(≤5μM)增强肝脏富集基因的mRNA表达的能力来选择最好的化合物MB-1(参见图6)。全基因组微阵列分析显示,MB-1以时间和剂量依赖性的方式上调了HLC中肝组织特征基因,即约237个肝脏富集基因(见表2)的mRNA表达,其中137个基因在肝脏中高度表达(特异性阈值:基尼指数分别>0.7和>0.8;参见Zhang等人,2017对基尼指数的定义)(参见图1B)。其中包括HBV依赖性因子,例如SLC10A1(NTCP,HBV受体)以及转录因子HNF4α、RXRα和PPAR,它们是HBV前基因组RNA合成和病毒DNA复制所必需的(Tang&McLachlan,2001)。发明人使用BioQC分析将HLC的肝组织特征与其他HBV系统(HepG2、HepaRG和PHH)的肝组织特征进行了比较。BioQC是受监督的生物信息学软件,可将任何基因表达数据与150个组织富集的基因特征进行比较;结果以每个样本的每个组织特征的富集分数形式报告为log10p(Wilcoxon测试的log10转换后的绝对p值)(Zhang等人,2017)。在基线时,HLC的肝得分可与HepaRG相当;MB-1治疗可显著提高HLC的肝得分,甚至高于HepaRG(参见图1C)。MB-1不足以进一步将HLC分化为成年肝细胞,这可能归因于单层培养条件以及其他未知因素。HLC和HepaRG均比HepG2表现出更多的肝样表型。众所周知,HepG2细胞系与PHH的相似性很差,许多肝脏富集的基因在HepG2中要么被下调,要么被完全“关闭”(Uhlen等人,2015)。在蛋白质水平上也观察到了MB-1对HLC的肝成熟的影响;HLC表达了更高水平的肝细胞特异性AAT1α蛋白(参见图1D)。
表1.用于在肝成熟筛选中初筛(32)和二次筛选(96)的肝脏富集的基因列表
表2.被MB-1上调的237个肝特异性基因(肝特征性;特异性基尼指数>0.7)列表(第一部分)
表2.被MB-1上调的237个肝特异性基因(肝特征性;特异性基尼指数>0.7)列表(第二部分)
表2.被MB-1上调的237个肝特异性基因(肝特征性;特异性基尼指数>0.7)列表(第三部分)
表2.被MB-1上调的237个肝特异性基因(肝特征性;特异性基尼指数>0.7)列表(第四部分)
然后,发明人询问MB-1对HLC治疗是否能够从临床分离株中引起稳定的HBV感染。使用NycodenzTM梯度从CHB个体血清中纯化HBV颗粒。此步骤成功地从过量的HBsAg空颗粒中分离了HBV Dane颗粒(参见图7),并且在整个研究过程中,从CHB患者中纯化的HBV被用于所有感染实验中。将HLC(在96孔板中)用MB-1(在1%DMSO中为1μM)或仅DMSO(1%)处理4天,然后以感染复数(MOI)10感染HBV。仅用MB-1处理而不用DMSO处理的HLC支持HBV感染;在感染后(pi)第11天,检测到HBsAg的峰值(~16ng/ml)(参见图1E)。相比之下,以相似的MOI(10)或更高(100)用HepG2.2.15产生的病毒感染HLC不会导致可检测到的HBsAg信号(参见表3),证实了长期以来的观察结果,即只有在存在聚乙二醇(PEG)的情况下并且以很高的MOI(Gripon等人,2002;Schreiner&Nassal,2017),才能使用细胞培养物产生的HBV进行感染,聚乙二醇(PEG)是已知具有融合特性的化学品(Pontecorvo,1977)。
表3:HLC中的HBV感染:患者来源的与HepG2.2.15来源的HBV(96孔)之间的比较。在MB-1或1%DMSO存在的情况下,在96孔板中接种的HLC以所示的MOI感染患者来源的HBV或细胞培养物衍生的(HepG2.2.15)病毒。每两天测量一次病毒动力学(HBsAg释放到培养基中),直到感染后第14天。
HLC作为用于HBV药物开发的与疾病有关的测定法
要被视为用于HBV药物开发的与疾病有关的测定法,理想的是HLC检测方法必须与PHH相当,可以在384孔板中小型化,并且适合测试各种GT的临床HBV样品。
可以通过代表HBV生命周期关键步骤的各种病毒标志物来评估生产性HBV感染(参见图2A)。HBV病毒粒子进入肝细胞后,病毒基因组(~3.2kb)易位至细胞核并转化为cccDNA微型染色体(Seeger和Mason,2000)。cccDNA产生四个(3.5、2.4、2.1和0.7kb)病毒mRNA转录本,被翻译成乙型肝炎核心抗原(HBcAg)、乙型肝炎e抗原(HBeAg)和聚合酶蛋白(来自3.5kb的前基因组RNA/pgRNA);病毒包膜蛋白(2.4、2.1kb mRNA的大、中、小或HBsAg);X蛋白(来自0.7kb mRNA)。3.5kb的pgRNA具有双重作用:既可作为核衣壳和聚合酶蛋白的mRNA,又可作为病毒基因组逆转录的模板,从而产生包装在病毒粒子中的松弛环状DNA(RC-DNA)(Locarnini&Zoulim,2010)。被感染的细胞还分泌HBsAg和HBeAg。另一方面,pgRNA和cccDNA驻留在被感染的细胞内(最近的研究表明,含有pgRNA的HBV颗粒也在血浆中循环,Wang等人,2016)。CHB个体肝脏中cccDNA和pgRNA的水平与病毒活性和HBV感染的阶段有关;因此,可以使用组合标志物评估HBV cccDNA的存在和复制活性(Laras等人,2006)。然而,由于基于qPCR的检测方法对cccDNA的特异性检测非常低(0.1-1.5个拷贝/细胞),并且细胞中存在过量的RC-DNA(≥1,000个拷贝/细胞),因此是一个巨大的挑战(Nassal,2015,Schreiner&Nassal,2017)。为了解决qPCR的某些局限性,开发了一种基于数字PCR(dPCR)的cccDNA测定法。用T5核酸外切酶处理样品可有效去除过量的RC-DNA(Schreiner&Nassal,2017)(参见图8A-8C),且Southern印迹法用于确认dPCR活性(参见图9)。
发明人用相同的病毒接种物(MOI 40)感染HLC和PHH(在96孔板中),并在14天的测定中基于5次病毒读数来跟踪HBV感染的动力学。HLC中所有HBV标志物的水平均与PHH中观察到的水平相当(参见图2B-2F和表4)。通过dPCR最早在感染后第2天就检测到了非常低的cccDNA水平,并在PHH中的第6天(HLC的第10天)达到了稳定状态,为~11,000-13,000cccDNA拷贝/孔(参见图2B)。在感染高峰期(第14天),在HLC和PHH中,pgRNA的水平分别在~963,000至~1,410,000拷贝/孔之间(参见图2C)。还根据释放到培养基中的病毒标志物(HBV DNA、HBsAg和HBeAg)(参见图2D-2F和表4)和Southern印迹法检测证明了HLC和PHH之间相当的感染率;Southern印迹法证明在两种细胞类型中强度相当的cccDNA条带(参见图2G)。由于通常~40%的细胞(~40,000个细胞)被MOI 40感染(参见图2H和10),这表明HLC和PHH产生差不多等量的cccDNA(~0.3拷贝/细胞)和pgRNA(24-35拷贝/细胞)。值得注意的是,CHB患者肝脏中cccDNA和pgRNA的中位拷贝数根据疾病阶段分别为1.5个拷贝/细胞(0.003-40个拷贝/细胞)和6.5个拷贝/细胞(0.01-8,730个拷贝/细胞)(Laras等人,2006)。
发明人进一步证明,HLC能够支持多种临床HBV分离株的感染。使用来自17个CHB血清(GT A-D)的纯化HBV以MOI 40感染HLC(在384孔板中)。在17个分离株中,有10个在HBsAg和HBeAg的水平上非常有效地繁殖,范围在分别为2-150ng/ml和1-22ng/ml之间(参见图2I)。其他人也观察到了在HBV GT之间的体外复制能力的明显差异(Mabit等人,1996;Sozzi等人,2016)。
HLC上鉴定新型cccDNA抑制剂的首次HTS
从理论上说,在感染了患者来源的HBV的HLC中进行表型筛选会增加发现真正的cccDNA抑制剂的可能性,但是这种HTS在启动之前需要进行严格的可行性评估。首先,HLC分析的持续时间(14天)远远长于其他基于细胞的表型筛选(1-3天),这增加了技术复杂性和潜在的测定变异性。通过进行~7,000例HBV感染(在384孔板中以MOI 40)评估HLC分析的性能(Z'因子)。Z'因子是一种分析质量的统计量度,同时考虑了测定的稳定性和信号变异性(标准偏差);Z'因子>0.5的分析被认为非常适合进行HTS(Zhang等人,1999)。三种分析物(HBsAg0.6;HBeAg 0.45;白蛋白0.8)的Z'因子(参见图11A)提供了高度的信心,即HLC测定对于HTS而言是可靠的。为了确保测定的一致性,选择了来自4个CHB个体的血清(在HLC中具有相同的感染率)作为病毒接种源。这些血清(一个GT A、两个GT B和一个GT C)也可广泛覆盖HBV主要基因型。其次,cccDNA固有的低水平和dPCR分析的低通量使其不适合作为初步的HTS读出。发明人推测,随后可以通过其更丰富的转录产物(HBsAg、HBeAg和pgRNA)鉴定出cccDNA活性的有效化合物。HBsAg和HBeAg从两种不同的病毒mRNA中翻译而来,两种抗原都从感染细胞中以高丰度分泌(HBsAg>>HBeAg)。开发了一种多重测定法,以同时测量HBsAg、HBeAg和白蛋白作为初步的HTS读数。白蛋白抑制作用可作为对有毒化合物和潜在充当非特异性分泌抑制剂的物质的反向筛选(参见图11B)。第二次读数使用pgRNA测量作为cccDNA转录活性的代表(Laras等人,2006);在HLC中,pgRNA的存在也比cccDNA高~80-100倍(参见图2C),从而提高了测定的灵敏度。这种筛选级联的优势在于,可以从384孔板中的同一样品上进行初次读数(从上清液进行多重测定)和二次读数(来自细胞裂解物的pgRNA)。然后将在dPCR分析中测试HBsAg/HBeAg/pgRNA活性化合物。第三,PHH中的验证将建立对HLC所选出的化合物生物学相关性的信心。使用从人源化uPA/SCID小鼠中分离的新鲜人肝细胞(PXB-PHH,在本文中称为PHH)建立了PHH分析法(Ishida等人,2015)。使用在两种细胞类型中多次测试的参考化合物来评估HLC和PHH测定的可重复性;HLC始终显示出比PHH更小的测定变异性(参见图3A)。值得注意的是,在HLC中化合物针对HBsAg和HBeAg的效价与在PHH中相比改变5.5倍至7.6倍。
HTS分析和筛选级联的示意图如图3B所示。简言之,用MB-1处理HLC 4天,然后以MOI 40感染患者来源的HBV;24小时后去除病毒接种物。在感染后第3天,将化合物文库(~247K,4μM)添加到细胞中;每2天补充一次新鲜培养基和化合物。在感染后第14天收获培养基并通过多重分析进行测试;使用Genedata Screener软件进行数据分析。发明人鉴定了~3,752个初筛有效化合物,定义为抑制HBsAg和HBeAg分泌>60%而白蛋白抑制<40%的化合物,代表总体约1.5%的命中率(参见图3C)。在所选出化合物的12个点的剂量效应验证后,>85%的所选出的化合物对HBsAg和HBeAg仍然具有活性,证明了HLC测定的可重复性。
在PHH中通过对HLC所选出的化合物验证鉴定新的cccDNA去稳定剂
为了提高HLC选出的化合物谱分析的效率,在PHH中进行了筛选级联(参见图3B)。在PHH中测试~1,000个HLC所选出的化合物,结果显示,其中许多在PHH中也都有活性,但是它们的效价却变化了约10倍(HBsAg和HBeAg的平均IC50在HLC中为1.36-1.46μM,在PHH中为12.05-13.5μM)(参见图3D);类似于先前对参考化合物的观察(参见图3A)。接下来,发明人测试了同时抑制HBeAg和HBsAg的化合物是否更有可能抑制pgRNA;实际上,其中>70%的化合物也抑制pgRNA(参见图3E),随后对其cccDNA活性进行了测试。至少有四种靶向cccDNA的方法:i)预防cccDNA的产生(通过阻止病毒进入或在病毒进入后阻止从RC DNA转化为cccDNA),ii)通过细胞内转化途径降低cccDNA的扩增,iii)通过表观遗传机制使cccDNA的转录活性沉默,以及iv)cccDNA微型染色体的去稳定导致其降解。第一种机制不适用于本研究,因为所有化合物的添加均在感染细胞中的cccDNA池建立后的感染后第3天开始进行。第二种机制是在其他HBV相关病毒(鸭乙型肝炎病毒,DHBV)中观察到的,但尚不清楚该机制是否也在人的HBV中发生。第三种机制(cccDNA沉默)将减少所有cccDNA下游产物(pgRNA、HBeAg、HBsAg和HBV DNA),但极有可能不会减少通过基于PCR的方法(例如dPCR)和Southern印迹法检测的cccDNA拷贝数。通过dPCR分析,我们确定了降低PHH中cccDNA水平(cccDNA去稳定剂)且IC50<10μM的化合物;使用Southern印迹法进一步证实了它们的活性。图3F显示了此类化合物的两个实例(化合物7和参考化合物1),当从感染后第3天开始添加时,它们将cccDNA水平降低最多34-49%。总之,这些结果提供了概念证明,即在HLC测定法中的HTS成功鉴定了对PHH中的临床HBV分离物有活性的真正的cccDNA去稳定剂。
分子谱分析表明cccDNA去稳定剂诱导宿主途径的广泛调节
表型发现的主要挑战是目标识别和了解化合物的作用方式(MOA),这可能会影响其安全性评估(Moffat等人,2017)。大多数情况下,当所选出的化合物分类通常基于化学结构(化学型)聚类和化合物效力进行分类时,此信息在HTS后不可用。小分子也可以与多个靶标结合(多药理学),增加脱靶安全风险(Peters等人,2012)。在没有分子靶标的情况下,作为所选出化合物的优先顺序的一部分,表现发现可以从转录组或表型水平的早期化合物谱分析中获益,以发现所选化合物系列的潜在安全可靠性并根据需要开发降低风险的策略(Moffat等人,2017)。
发明人应用了转录组谱分析法来评估不同种类的cccDNA去稳定剂如何调节PHH中的细胞途径。分子表型分析是一种基于917个通路报告基因的基因表达测定,这些通路报告基因代表154个人类信号传导和代谢网络(Zhang等人,2017)。这些通路报告基因参与了53%的注释基因-基因相互作用,它们在这些相互作用中充当上游转录调节子或下游调节靶标。化合物处理后报告基因表达的调节使人们对涉及各种感兴趣的生物过程的途径有了多重视角,包括那些导致不良副作用的通路(Zhang等人,2017)。发明人测试了化合物7和参考化合物1(以及它们各自的活性较低的异构体)和两种市售的HBV药物恩替卡韦(ETV,具有良好安全性的核苷类似物)和干扰素-α(与多种副作用相关的免疫调节剂)作为此测定法中的对照。用HBV(或DMSO)感染PHH,3天后,与每种药物以其1xIC90值孵育6小时。提取总细胞RNA,并使用AmpliSeq-RNA方法测量报告基因对每种药物的主要反应。正如预期的那样,ETV诱导了微小的变化,这与其作为直接作用的抗病毒药物的MOA一致。相反,罗扰素强烈诱导干扰素-α和-λ信号通路及IFN信号的下游通路(参见图12)。图4A显示了化合物7和参考化合物1的主成分分析(PCA)。两种化合物显示出两种完全不同的PCA谱;参考化合物1引起的响应比化合物7显著得多且更广泛。对于每个系列,观察到活性化合物与其活性较低的异构体之间的PCA差异,而HBV的存在仅产生较小的影响。受这些化合物影响的宿主通路的热图如图4B所示。参考化合物1表现出多效作用,它在两个方向(上调和下调)上调节各种宿主信号传导和代谢通路,表明该化合物可能潜在地引起脱靶效应。相比之下,化合物7引起更有选择性的反应;它显著调节两条通路,即生物氧化和异种生物代谢的上调,以及半胱天冬酶调节和凋亡的下调。
cccDNA去稳定剂在不同HBV基因型之间的效力
大部分HBV体外研究(包括评估化合物抗病毒活性)均在感染了细胞培养物产生的HBV(例如HepG2.2.15-产生的病毒GT D)的肝癌细胞系(HepaRG或HepG2-NTCP)中进行。由于在PHH中使用患者来源的HBV GT D对cccDNA去稳定剂进行了评估(参见图3F和4A-4B),发明人询问当测试对抗来自其他GT的患者来源的HBV分离株或细胞培养物来源的病毒(HepG2.2.15)时化合物效价是否相似。为了解决第一个问题,PHH(在384孔板中)感染了四种临床HBV分离株(GT A-D,MOI 40)。在感染后第3天,每隔一天用化合物7或DMSO处理细胞,直至收获并在感染后第10天进行分析。有几点值得注意。首先,跨GT的临床HBV分离株在PHH中的复制能力各不相同;如更早在HLC中发现(参见图2I)以及其他人(Mabit等人,1996;Sozzi等人,2016)所述。GT A分离株表现出非常稳定的复制能力,HBsAg和HBeAg水平分别达到~370ng/ml和~58ng/ml,其次是GT C、D和B分离株(参见图5A)。对于每种分离株,分泌的病毒抗原的数量与它们的cccDNA水平密切相关;因此,GT A分离株的cccDNA含量最高(~11,000拷贝/孔),其次是GT C、B和D(参见图5B)。在HBV GT之间的HBsAg和cccDNA分泌量的明显差异不能归因于它们的感染率差异;所有四种分离株在PHH中均表现出差不多相当的细胞内HBsAg和HBcAg染色(参见图13)。确实,以前已经观察到HBV复制活性与其蛋白表达/分泌之间的差异,特别是对于HBV GT B、C和D(Sozzi等人,2016)。尽管如此,所有四个HBV分离株均被化合物7相同地抑制。有趣的是,化合物7对各种HBV标志物表现出一定的效力;它对HBV DNA(IC50为0.020-0.025μM)高度有效,其次为HBsAg和HBeAg(IC50为0.24-0.45μM),pgRNA(IC50 1.48μM),以及最后是cccDNA(IC50 6.2-7.15μM)(参见图5C-5D和表5)。因此,直接测量cccDNA对于准确评估cccDNA去稳定剂的效能非常重要。接下来,发明人评估了化合物7的抗病毒活性是否会受到病毒接种源的影响。大多数HBV体外研究都是在肝癌细胞系(例如HepaRG或HepG2细胞系)中进行的,使用的是HepG2产生的HBV作为病毒接种物。PHH和HepaRG(Gripon等人,2002年)感染了源自患者或HepG2.2.15-的HBV(应注意两种病毒均为GT D),并在感染后第3天开始用化合物7治疗。在所测试的MOI水平上(40和125),化合物7在PHH和HepaRG中对患者来源的HBV具有同等活性,但在这两种细胞类型中对HepG2.2.15产生的病毒的效力都明显较弱(表6)。
总之,这些结果表明抗HBV的化合物效力可能受病毒接种物来源的影响。可以对来自不同基因型的大量HBV分离株进行进一步测试,以证实这一发现。
讨论
尽管是世界上第七大死亡原因(Stanaway等人,2016),世卫组织认识到病毒性肝炎“直到最近仍被作为健康和发展的优先领域而被忽略”。确实,全世界诊断出的慢性病毒性肝炎少于5%,而只有约1%的病毒性肝炎得到了治疗(世卫组织,2016年)。即使在美国(HBV患病率约为129万例),诊断出的HBV感染率不到35%,并且只有45%的合格CHB患者接受了治疗(Buckley&Strom,2017)。如果不扩大干预,估计在未来40-50年内,患有CHB感染的人数仍将维持在目前的高水平,2015年至2030年之间将有2千万人死亡(WHO,2016年)。因此,需要采取全球性策略来治愈乙型肝炎(Revill等人,2016;WHO,2016)。由于在感染的早期阶段可能会发生HBV DNA整合进入宿主染色体的事件(Mason等人,2016),因此将根除HBV包括肝内cccDNA和整合的HBV DNA进行真正的治愈可能并不可行(Lok等人,2017)。取而代之的是一种可以达成目标的功能治愈方法,其可以停止治疗且没有病毒学复发和肝病进展的风险(Lok等人,2017)。功能性治愈的定义是:在有限的治疗过程后,血清中的持续性、不可检测的HBsAg和HBV DNA会导致残余肝损伤的缓解,并随着时间的推移降低HCC的风险。设想了几种水平的功能性治愈方法,包括完全沉默cccDNA转录,消除cccDNA以及完全解决肝损伤(Lok等人,2017)。
靶向cccDNA最有可能需要cccDNA微型染色体网络的干扰。HBV劫持宿主因子以建立cccDNA并调节其转录活性。例如,宿主DNA损伤反应系统参与了新感染细胞中HBV RC-DNA(从传入病毒体)到cccDNA的转化(Nassal,2015;Schreiner&Nassal,2017)。cccDNA形成后,它会募集组蛋白和非组蛋白以及病毒蛋白来建立其功能单元,即微染色体(Guo&Guo,2015;Levrero,2009;Nassal,2015;Schreiner&Nassal,2017)。cccDNA微染色体可以以两种不同的拓扑结构存在,最有可能具有与其转录活性相关的不同组相互作用伴侣(Newbold等人,1995)。可以想象,cccDNA-宿主相互作用基因组的化学扰动可能导致cccDNA不稳定和/或使其转录活性沉默;但是,对于cccDNA稳定性和功能所必需的关键相互作用伴侣仍然难以捉摸,并且对cccDNA生物学的了解仍然很少。在这方面,表型筛选是一种以与靶标无关的方式发现新型cccDNA抑制剂的有效方法。但是,由于缺少稳定的感染系统,cccDNA药物开发工作受到了阻碍。尽管PHH作为HBV测定的金标准,但由于其在培养物中的快速去分化作用(Frazcek等人,2013)以及供体对供体对HBV的易感性差异较大(Mabit等人,1996),因此并未常规使用。近三十年来,HBV实验系统主要取决于非感染系统,例如改造成可从转基因表达HBV的HepG2细胞系(Sureau等人,1986;Sells等人,1987;Ladner等人,1997;Guo等人,2007)。支持天然HBV感染的肝癌细胞系HepaRG(Gripon等人,2002)和HBV受体NTCP(Yan等,2012)的发现代表了新的工具,即用于HBV的感染系统,可以进行病毒进入和自然感染后的cccDNA生物学研究。iPS技术的快速发展(Shi等人,2017年),包括HLC,已使新疾病模型的开发有望比肿瘤细胞系更具生理相关性,从而更好地概括了人类疾病生物学。
在药物研发中使用生理系统被认为是增加临床前研究成果可转化为临床的第一步(Eglen&Reisine,2011;Vincent等人,2015;Horvath等人,2016;Ursu等人,2017)。确实,跨治疗领域的新候选药物的高流失率引起了人们对用于药物研发的临床前模型有效性的担忧(Vincent等人,2015;Horvath等人,2016)。例如,在2008年至2015年期间,由于缺乏疗效,二、三期试验中候选药物的失败率始终在50%至60%之间(Arrowsmith&Miller,2013;Harrison,2016)。通常在永生化/肿瘤细胞系中常规进行两种主要的药物研发策略,即表型和基于靶标的筛选,其通常通过工程化被改造成过表达目的分子靶标。大量肿瘤细胞系表现出实质性的遗传异常和改变的宿主途径,以致于细胞系与患者来源的细胞之间的相关性较弱(Uhlen等人,2015;Vincent等人,2015)。分子靶标的过表达旨在提供一种具有可接受信噪比的测定方法,还导致人为提高蛋白质水平,从而影响生理条件下未发生的信号通路激活和信号传导,从而导致体内外差异活动(Eglen等人,2008)。相反,默认假定原代细胞中的内源性靶标在细胞环境中的水平和细胞环境中表达,与人体内的靶标更为相似。因此,预期化合物在原代细胞中的生物学活性对其体内活性具有更强的预测作用(Eglen&Reisine,2011;Vincent等人,2015;Horvath等人,2016;Ursu等人,2017)。
HLC可能代表下一代HBV体外感染系统。但是,现有的HLC仍不成熟(Baxter等人,2015;Godoy等人,2015),对HBV的敏感性较弱(Shlomai等人,2014;Kaneko等人,2016;Samurai等人,2017)。为了充分体现HLC在HBV药物研发中的前景,需要改进HLC的成熟度。鉴定增强HLC肝成熟的小分子(MB-1)是朝这个方向迈出的第一步。MB-1并不是“魔术子弹”;仍然需要HLC的进一步成熟,这很可能需要多种方法的结合,包括紧密模拟肝脏结构的培养条件(Goldring等人,2017年)。肝脏中的肝细胞在基因表达方式上高度异质,并且基于它们在肝小叶内的位置(肝区带)表现出清晰的梯度(Soto-Gutierrez等人,2017;Torre等人,2010);~50%的肝基因实际上是按区域划分的(Halpern等人,2017)。毫无疑问,单层培养物中的HLC只能模拟归因于肝脏的约500种重要功能中的部分功能,但并非全部都能模拟(Goldring等人,2017年)。
即使在没有PEG(聚乙二醇,一种通常用于感染细胞培养物来源的HBV的融合剂)的情况下,HLC仍支持来自低MOI(10-40)的各种GT的临床分离株的强力HBV感染,并且重要的是,与PHH中观察到的结果相当。由于多种原因,在药物研发中使用来自各种GT的患者来源的HBV很重要。HBV GT影响病毒的发病机制、疾病进展和治疗反应。混合性GT感染和GT间重组,尤其是在GT A和C之间,已在CHB感染中得到越来越多的认识,而且它们在发病机制和治疗反应中也可能具有作用(Lin&Kao,2017)。发明人和其他人(Mabit等人,1996;Sozzi等人,2016)观察到,HBV GT在复制活性和蛋白质分泌方面表现出明显的差异;这些差异可能影响它们对具有新型MOA的化合物的敏感性。仅依靠一种HBV GT进行化合物筛选可能会导致高估所有HBV GT和亚型的化合物效价。此外,已知各种病原体的实验室菌株可快速适应体外条件,并经常失去重要的病理生理特性(Bukh等人,2002;Fux等人,2005;Horvath等人,2016)。
在HLC上进行14天的HTS分析并非易事。经过工程改造以过表达目的靶标的基于肿瘤细胞系的HTS平台的主要优势是同质性和可重复性,因为几乎所有细胞都表达目的靶标,提供了HTS所需的强大且可重现的信号。另一方面,即使在PHH中,天然HBV感染在体外的重现性也具有挑战性(Mabit等人,1996)。本研究表明,HLC检测具有高度重复性,Z'得分分别为0.6(HBsAg)、0.45(HBeAg)和0.8(白蛋白)。值得注意的是,HTS分析的Z'因子>0.5被认为是基于复杂细胞的分析(例如与iPS衍生细胞相关的分析)的高标准(Engle&Vincent,2014)。为了在自然感染的情况下鉴定新的cccDNA抑制剂,设计了一个筛选级联,其前提是可以通过其更丰富的转录产物(HBsAg、HBeAg和pgRNA)顺序鉴定cccDNA活性化合物。如Southern印迹分析所证实,该方法成功地在PHH中发现了几种cccDNA活性化合物序列。值得注意的是,其他人已经报道,CHB个体血浆中循环的pgRNA和HBV核心相关抗原(HBcrAg)可用作肝脏cccDNA转录活性的代表读数(Wang等人,2016;Chen等人,2017)。
基于各种HBV标志物的化合物效价评估提供了一些重要见解。首先,cccDNA去稳定剂(化合物7)对PHH中的四种临床HBV分离株(GT AD)同样有效,但对各种HBV标志物显示出一定的效力等级(HBV DNA IC50<<HBsAg和HBeAg和pgRNA IC50<cccDNA IC50)。效力的这种变化可能反映了HBV标志物的丰度/半衰期,测定的动态范围或抑制目标的难度。实际上,cccDNA在细胞中非常稳定(半衰期33-57天)(Nassal,2015年)。相反,血液中含HBV DNA的病毒粒子具有较短的半衰期(~4.4小时)(Murray等人,2006年),这可能部分解释了化合物7对HBV DNA的效力比其他HBV标志物更高。因此,cccDNA IC50的测量对于准确评估化合物的效力至关重要。
有趣的是,化合物7对源自HepG2.2.15的病毒的效力低很多。尽管化合物7的分子靶标尚不清楚,但表型筛选常能鉴定出靶向宿主因子的化合物;有人可能假设化合物7可以靶向于维持cccDNA和转录活性所需的宿主因子。实际上,病毒进入后,HBV劫持各种宿主因子以建立cccDNA微型染色体并调节其转录活性(Nassal,2015年)。化合物7对源自HepG2.2.15的HBV的效力降低可能反映了cccDNA维持所需的宿主因子和两种病毒功能的差异。HepG2.2.15产生的HBV在重组HepG2细胞系中产生,该细胞系在抗生素选择下永久传代。值得注意的是,HepG2是人类肝癌细胞系,据报道其对原代肝细胞的模拟性较差(Uhlen等人,2015年和本研究,图1C)。这种观察并非HBV独有。D'Aiuto等人,2017年报道了与iPS衍生的神经元相比,猴上皮(Vero)细胞对HSV-1的复合效力差异,并得出结论,如果筛查基于Vero细胞将无法鉴定出许多对神经元有活性的药物。这些结果凸显了测试化合物针对不同来源的HBV的重要性,不仅针对细胞培养衍生的HBV,而且还针对各种GT的临床分离株。
能够触发部分cccDNA降解的化合物的发现令人兴奋,但在不知道其分子靶标或潜在脱靶活性的情况下也令人生畏。潜在的安全可靠性的药理学评估通常是通过对化合物进行安全相关靶标筛选来进行的。由于成本和通量,此类筛选通常在先导化合物优化的高级阶段对少量关键化合物进行。此时的任何安全性发现要么需要对已经优化的化合物进行大量修改,要么甚至需要损失的原因(Peters等人,2012)。事实上,非临床的毒理学是导致四个主要医药公司中>800多种临床前化合物流失的最大原因,占失败者的40%(Waring等人,2015)。因此,需要在HTS之后的所筛选化合物的选择过程中以及所筛选化合物至先导化合物阶段的早期评估化合物的脱靶活性(Peters等人,2012;Moffat等人,2017)。如本研究中所示,转录组谱分析法可用于此目的,不仅可以用于肝细胞,而且可以用于其他类型的细胞,例如心肌细胞,从而扩大了其作为体外毒性工具的一部分的应用范围。
总而言之,发明人提供了概念证明,即HLC平台代表了HBV药物发现的范例改变,其可能潜在地导致发现了用于HBV治愈的新疗法。同时,需要继续努力改善HLC的肝成熟,因为它将不仅有益于HBV药物开发和疾病建模,而且还有益于体外毒理学。由于药物开发工作是一个漫长的过程(从靶标识别到获得监管批准平均需要13.5年的时间)(Paul等人,2010年),需要投入巨资,实施与疾病相关的测定法和其他降低安全风险的工具应当尽早开始,并贯穿整个化合物进展过程中,以防止昂贵的损失,例如在临床后期发现不希望的结果。
实施例2:吡咯并[2,3-b]吡嗪化合物对原发性人类肝细胞(PHH)中患者来源的HBV的活性
按照如实施例1中所述的步骤,测试了各种式(I)的吡咯并[2,3-b]吡嗪化合物对PHH中HBV的活性(患者来源的HBV,GT D),其是与疾病相关的HBV模型的金标准。
被测试化合物的结构及其各自的化合物ID如下所示:
这些化合物对PHH(患者来源的HBV,GT AD)中的HBeAg、HBsAg、白蛋白、pgRNA和cccDNA的活性,如图15A-15D、16D-16E和17以及以下表7所示:
表7:吡咯并[2,3-b]吡嗪化合物1至9对PHH中患者来源的HBV(GT D)的抗病毒活性。N,重复数;SD,标准差。
如上所示,发现本发明的所有化合物1至9均以IC 50值<10μM抑制HBsAg和HBeAg。化合物2、4、7、8和9对pgRNA表现出有利的高抑制作用(IC50<10μM),化合物7在降低cccDNA水平方面特别有效(IC50<10μM)。因此已经证明,式(I)的化合物,包括特别是上述化合物1至9,可以用于治疗HBV感染。对于化合物2、4、7、8和9,特别是对于化合物7,已证明其对HBV具有特别有利的活性。
进一步测试了化合物7在PHH中针对患者来源的HBV GT A-D的活性。简言之,将接种于384孔板的PHH一式三份以患者来源的HBV(GT A-D)感染。在感染后第3天,以从156μM开始的3倍系列稀释液添加化合物7。1%DMSO用作阴性对照。每两天补充一次新鲜的培养基和化合物,并在感染后第10天收获细胞。
所获得的结果显示于图16A至16E和17以及表5中。
因此,发现化合物7对所有4种主要HBV基因型A至D表现出有效的cccDNA抑制活性,这进一步证实了式(I)的化合物,包括特别是化合物7,可以有利地改善HBV感染的治疗。
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Claims (20)
1.下式(I)的化合物或其可药用盐在制备用于治疗乙型肝炎病毒感染的药物中的用途:
其中:
L1是-CO-N(RL1)-;
RL1各自独立地选自氢和C1-5烷基;
R1是C2-10烷基,其中所述烷基被一个或多个基团R10取代,并且进一步地其中所述烷基任选地被与所述烷基的相同碳原子结合的两个基团取代且它们与其所连接的碳原子一起形成环戊基环或四氢吡喃基环;
R10各自独立地是-OH;
R2是氢;
R3是氢;
R4是氢;且
R5是环丙基。
2.如权利要求1所述的用途,其中R1是-C(R13)(R13)-C(R13)(R13)-R10,其中R13各自独立地选自氢、甲基和乙基,其中R13各自任选地被一个或多个基团R10取代。
3.如权利要求1所述的用途,其中所述化合物是下式(II)的化合物或其可药用盐:
其中基团R1、RL1、R2、R3和R4具有与式(I)中相同的含义。
4.如权利要求1所述的用途,其中所述化合物是具有下式中任何一种的化合物或其可药用盐:
5.如权利要求1所述的用途,其中所述化合物是具有下式中任何一种的化合物或其可药用盐:
6.如权利要求1所述的用途,其中所述化合物是下式化合物或其可药用盐:
7.如权利要求1-6中任一项所述的用途,其中所述乙型肝炎病毒感染是慢性乙型肝炎病毒感染。
8.下式(I)的化合物或其可药用盐在制备用于治疗或抑制乙型肝炎病毒再活化的药物中的用途:
其中:
L1是-CO-N(RL1)-;
RL1各自独立地选自氢和C1-5烷基;
R1是C2-10烷基,其中所述烷基被一个或多个基团R10取代,并且进一步地其中所述烷基任选地被与所述烷基的相同碳原子结合的两个基团取代且它们与其所连接的碳原子一起形成环戊基环或四氢吡喃基环;
R10各自独立地是-OH;
R2是氢;
R3是氢;
R4是氢;且
R5是环丙基。
9.如权利要求8所述的用途,其中R1是-C(R13)(R13)-C(R13)(R13)-R10,其中R13各自独立地选自氢、甲基和乙基,其中R13各自任选地被一个或多个基团R10取代。
10.如权利要求8所述的用途,其中所述化合物是下式(II)的化合物或其可药用盐:
其中基团R1、RL1、R2、R3和R4具有与式(I)中相同的含义。
11.如权利要求8所述的用途,其中所述化合物是具有下式中任何一种的化合物或其可药用盐:
12.如权利要求8所述的用途,其中所述化合物是具有下式中任何一种的化合物或其可药用盐:
13.如权利要求8所述的用途,其中所述化合物是下式化合物或其可药用盐:
14.如权利要求8-13中任一项所述的用途,其中所述药物用于治疗人。
15.下式(I)的化合物或其可药用盐作为乙型肝炎病毒cccDNA抑制剂的非治疗体外用途:
其中:
L1是-CO-N(RL1)-;
RL1各自独立地选自氢和C1-5烷基;
R1是C2-10烷基,其中所述烷基被一个或多个基团R10取代,并且进一步地其中所述烷基任选地被与所述烷基的相同碳原子结合的两个基团取代且它们与其所连接的碳原子一起形成环戊基环或四氢吡喃基环;
R10各自独立地是-OH;
R2是氢;
R3是氢;
R4是氢;且
R5是环丙基。
16.如权利要求15所述的非治疗体外用途,其中R1是-C(R13)(R13)-C(R13)(R13)-R10,其中R13各自独立地选自氢、甲基和乙基,其中R13各自任选地被一个或多个基团R10取代。
17.如权利要求15所述的非治疗体外用途,其中所述化合物是下式(II)的化合物或其可药用盐:
其中基团R1、RL1、R2、R3和R4具有与式(I)中相同的含义。
18.如权利要求15所述的非治疗体外用途,其中所述化合物是具有下式中任何一种的化合物或其可药用盐:
19.如权利要求15所述的非治疗体外用途,其中所述化合物是具有下式中任何一种的化合物或其可药用盐:
20.如权利要求15所述的非治疗体外用途,其中所述化合物是下式化合物或其可药用盐:
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