CN111926002B - TrpE的突变体及其在产L-色氨酸的基因工程菌中的应用 - Google Patents

TrpE的突变体及其在产L-色氨酸的基因工程菌中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种TrpE蛋白的突变体，及其在产L‑色氨酸的基因工程菌中的应用。具体利用基因工程的手段解除L‑色氨酸代谢分支途径关键基因TrpE的反馈抑制，获得L‑色氨酸高产的基因工程菌。进一步地，通过过表达L‑色氨酸代谢途径关键基因，提高前体物供给，去除途径中负调控因子，扩大L‑色氨酸合成途径代谢流，以提高L‑色氨酸的产量。

Description

TrpE的突变体及其在产L-色氨酸的基因工程菌中的应用
技术领域
本发明属于基因工程和微生物领域，具体涉及TrpE的突变体、以及产L-色氨酸的基因工程菌，其构建方法和在产L-色氨酸中的应用。
背景技术
L-色氨酸作为人体和动物八种必须氨基酸中第二大必需氨基酸，参与人体蛋白质合成和代谢网络调节，并广泛存在于自然界，同时也是芳香族氨基酸的重要成员之一。L-色氨酸是多种重要生物活性物质的前体，比如色素、5-羟基色胺、吲哚、生物碱和褪黑素等，广泛应用于医药、食品及饲料等行业。随着L-色氨酸国内外需求量的不断增加，使其成为重要的研究热点。L-色氨酸的生产方法有化学合成法、转化法和微生物发酵法。其中，微生物发酵法因其原料易得、廉价、终产物纯度高、易于提取和绿色环保等优点已被广泛应用于L-色氨酸的生产。大肠杆菌作为应用广泛的模式菌株，因其遗传背景清晰、遗传改造简单、繁殖较快及容易培养等优势，已被广泛应用于工业化商品的代谢工程改造中。
随着基因重组技术的发展，利用基因工程手段改造L-色氨酸合成途径逐步发展起来。在不涉及化学诱变的情况下，赵志军等运用代谢工程的研究策略，在不产L-色氨酸的E. coli W3110的基础上，通过一系列的基因操作，使L-色氨酸的产量提高至17.7g/L（赵志军.L-色氨酸生产菌株的构建及代谢调控研究[D]. 无锡: 江南大学, 2011.）。2017年，Chen等通过基因工程纯理性改造的方法得到L-色氨酸工程菌株S028，发酵61h后，L-色氨酸产量达到了40.3g/L（Chen L et al., Applied microbiology and biotechnology, 2017, 101(2): 559-568.）。在1993年，Syoji Azuma等在发酵培养时添加pluronic L-61使L-色氨酸结晶，从而使L-色氨酸产量达到了54.5g/L（Azuma S et al., Applied Microbiology andBiotechnology, 1993, 39(4-5): 471-476.）。
发明内容
本发明的目的在于通过基因工程的方法对细菌尤其大肠杆菌中L-色氨酸相关代谢途径基因进行改造，从而获得L-色氨酸生产菌株。
本发明首先提供一种邻氨基苯甲酸合酶TrpE的突变体，以使得TrpE蛋白的催化口袋始终处于闭合状态，因而无论L-色氨酸是否存在，TrpE蛋白始终可以行使正常的催化功能生成邻氨基苯甲酸。优选地，其多肽氨基酸序列相对于野生型序列仅存在下述突变：第63位氨基酸A替换为V。优选地，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1。进一步提供编码所述的突变体的编码基因，以及含有所述的突变体的编码基因的重组宿主细胞。
本发明进一步提供一种产L-色氨酸的基因工程菌，其中在出发细菌中的导入突变TrpE蛋白基因，以解除了L-色氨酸对TrpE的抑制作用，或者通过基因定点突变方法将出发细菌中的TrpE蛋白基因突变以解除L-色氨酸对TrpE的抑制作用。优选地，所述突变是将在TrpE蛋白中的A63位氨基酸残基替换为V，进一步的，所述出发细菌是大肠杆菌，更优选地，所述出发细菌是大肠杆菌菌株KW（Chen, Y et al. Journal of Industrial Microbiol &Biotechnology, 2018, 45(5): 357-367.）。
优选的，所述基因工程菌中过表达AroG，和/或TrpE，和/或PpsA，和/或对TrpR进行了敲除。其中，过表达可以通过常规转化所述基因来实现，对TrpR进行敲除可以采用同源重组，基因编辑等方法来实现。更优选，所述基因工程菌中过表达AroG，TrpE，PpsA，并对TrpR进行了敲除。其中，通过携带有表达框的质粒导入基因工程菌以实现AroG，TrpE的过表达；通过所基因工程菌中的基因组上通过引入tac启动子以过表达ppsA基因，
本发明还提供一种构建产L-色氨酸的基因工程菌的方法，其是出发细菌中的导入能够解除L-色氨酸对TrpE的抑制作用的突变的TrpE蛋白基因，优选地，所述突变是将在TrpE蛋白中的A63位氨基酸残基替换为V。
更进一步地，还通过基因工程技术在基因工程菌中过表达AroG，和/或TrpE，和/或PpsA，和/或对TrpR进行了敲除。优选地，通过基因工程技术在基因工程菌中同时过表达AroG，TrpE，PpsA，并对TrpR进行了敲除。
一个具体实施方式中，所述的构建L-色氨酸基因工程菌的方法，包括以下步骤：
1)大肠杆菌菌株KW中，导入含有基因aroG和trpEDCBA的重组质粒，构建菌株KBD1；
2)基因组上过表达ppsA基因，构建菌株KBD2；
3)敲除trpR基因；构建菌株KBD3；
4)在KBD3菌株中，通过置换邻氨基苯甲酸（ANTA）合酶TrpE第63位氨基酸残基A63为V,获得抗终产物色氨酸抑制突变体TrpEfbr，构建得菌株KBD4，其中突变的TrpE（A63V）的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的蛋白质；
本发明进一步提供上述基因工程菌生产L-色氨酸的应用。具体地，通过对所述基因工程菌进行发酵，然后收集L-色氨酸的步骤，具体是从发酵上清液中收集L-色氨酸。其中将所述基因工程菌经过38-42h发酵培养后，从发酵液上清中收集L-色氨酸。更优选地，还包括纯化L-色氨酸的步骤。
本发明通过上构建的基因工程菌，通过摇瓶发酵验证表明，通过引入TrpE(A63V)突变，解除终产物色氨酸对TrpE的反馈抑制，L-色氨酸的产量有明显提高，相比对照菌株KW，提升达到1.68倍。因此，利用本发明获得的基因工程菌进行发酵，可以获得产物L-色氨酸的有效积累，为L-色氨酸的产业化生产奠定了基础，具有较强的实用和应用价值。
附图说明
图1：PH5a-aroG-trpEDCBA质粒图谱。
图2：TrpE蛋白动力学模拟图。
图3：L-色氨酸生产菌株摇瓶发酵结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
突变体TrpE（A63V）的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
KW菌株记载于如下文献中：Chen, Y.et al. Rational design and analysis ofan Escherichia coli strain for high-efficiency tryptophan production. Journalof Industrial Microbiol & Biotechnology, 45(5), 357-367 (2018).
实施例1、构建L-色氨酸生产菌株KBD1
L-色氨酸代谢途径是由葡萄糖进入胞内，经过糖酵解途径和磷酸戊糖途径分别合成L-色氨酸的两个重要前体物磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）和赤藓糖4-磷酸（E4P），从而经DAHP合酶AroG缩合进入莽草酸途径最终生成分支酸。随后，分支酸经邻氨基苯甲酸合酶TrpE催化进入L-色氨酸分支合成途径，从而最终生成目标产物L-色氨酸。因此，为了构建L-色氨酸生产菌株，首先过表达了L-色氨酸合成途径中两个占据关键节点的酶AroG和TrpE。
PH5a-aroG-trpEDCBA质粒构建：以野生型大肠杆菌MG1655为模板，用引物aroG-F、aroG-R扩增带接头的aroG片段。以PH5a质粒做模板，PH5a-M-F、PH5a-M-R扩增带接头的PH5a-M片段。以aroG片段和PH5a-M片段为模板，aroG-F、PH5a-M-R引物扩增得到用于Gibsonassembly的aroG-M-Gibson片段。以MG1655为模板，用引物trpEDCBA-F、trpEDCBA-R扩增带接头的trpEDCBA-Gibson片段。以PH5a-ver-F、PH5a-ver-R扩增带接头的质粒骨架，与上面的aroG-M-Gibson片段、trpEDCBA-Gibson片段通过Gibson assembly得到PH5a-aroG-trpEDCBA质粒，质粒图谱如图1所示。
表1 构建L-色氨酸生产菌株KBD1所用到的引物
引物名称 核苷酸序列（5’-3’）
引物aroG-F(SEQ ID NO：3) CGCATCCGACAATTAAACCTTACCCGCGACGCGCTTTTA
引物aroG-R(SEQ ID NO：4) TGGCAACACTGGAACAGACATGAATTATCAGAACGACGA
引物PH5a-M-F(SEQ ID NO：5) CGTCGTTCTGATAATTCATGTCTGTTCCAGTGTTGCCAT
引物PH5a-M-R(SEQ ID NO：6) AGCGGCGACGCGCAGTTAATCCCACAGCCGCCAGTTCCG
引物trpEDCBA-F(SEQ ID NO：7) GGAACTGGCGGCTGTGGGATTAACTGCGCGTCGCCGCTT
引物trpEDCBA-R(SEQ ID NO：8) ACAAAATTAGAGAATAACAATGCAAACACAAAAACCGAC
引物PH5a-ver-F(SEQ ID NO：9) TCGGTTTTTGTGTTTGCATTGTTATTCTCTAATTTTGTT
引物PH5a-ver-R(SEQ ID NO：10) AAAAGCGCGTCGCGGGTAAGGTTTAATTGTCGGATGCGC
把质粒PH5a-aroG-trpEDCBA化转入菌株KW，构建色氨酸生产菌株KBD1。本部分所用到的菌株及质粒如下：
表2 构建L-色氨酸生产菌株KBD1所用菌株和质粒
菌株或质粒 相关性质
菌株MG1655 F<sup>-</sup> λ<sup>-</sup> ilvG- rfb-50 rph-1
菌株KW 大肠杆菌W3110衍生菌株，L-色氨酸生产菌株
菌株KBD1 KW衍生菌株，KW菌株中过表达<i>aroG</i>和<i>trpEDCBA</i>
质粒PH5a PH5a ori；Tet<sup>R</sup>；Tac启动子
质粒PH5a-aroG-trpEDCBA PH5a衍生质粒，过表达<i>aroG</i>，<i>trpEDCBA</i>
实施例2、构建L-色氨酸生产菌株KBD2
PEP是L-色氨酸合成的一个重要前体物，而PEP合成酶PpsA可以将丙酮酸催化生成PEP，因此，为了提高PEP的供给，对PpsA进行了过表达。
cas9-ppsA质粒构建：以野生型大肠杆菌MG1655为模板，用引物ppsA-up-F、ppsA-up-R扩增带接头的ppsA-UP片段，用引物ppsA-down-F、ppsA-down-R扩增带接头的ppsA-Down片段。ppsA-UP片段和ppsA-Down片段通过组装成ppsA-UD片段。以cas9质粒为模板，用引物ppsA-N20-F、ppsA-ver-R扩增质粒骨架ppsA-ver1片段，用引物ppsA-ver-F、ppsA-N20-R扩增质粒骨架tnaA-ver2片段。质粒骨架ppsA-ver1、ppsA-ver2与上面的片段ppsA-UD通过Gibson assembly（Gibson assembly方法是Gibson等发明的将多个DNA片段在1次反应中实现分子间连接）得到cas9-ppsA质粒。
表3 构建L-色氨酸生产菌株KBD2所用到的引物
Figure 251080DEST_PATH_IMAGE001
在菌株KBD1的基因组上通过引入tac启动子过表达ppsA基因，构建色氨酸生产菌株KBD2。本部分所用到的菌株及质粒如下：
表4 构建L-色氨酸生产菌株KBD2所用菌株和质粒
菌株或质粒 相关性质
菌株MG1655 F<sup>-</sup> λ<sup>-</sup> ilvG- rfb-50 rph-1
菌株KBD1 KW衍生菌株，KW菌株中过表达<i>aroG</i>和<i>trpEDCBA</i>
菌株KBD2 KBD1衍生菌株，KBD1菌株中过表达<i>ppsA</i>
质粒CRISPR/Cas9 pSC101 ori；AMP<sup>R</sup>；araBAD启动子
质粒cas9-ppsA cas9衍生质粒，用于替换<i>ppsA</i>基因启动子为tac启动子
实施例3、构建L-色氨酸生产菌株KBD3
TrpR调节因子参与色氨酸的生物合成、运输和调节。TrpR是色氨酸转录抑制因子，负调控trp调节子的表达，以响应细胞内色氨酸水平。TrpR通过干扰RNA聚合酶与启动子相互作用来抑制基因转录。当细胞内色氨酸浓度达到一定量时，即引发TrpR抑制多个基因的转录。因此，为了解除色氨酸的抑制作用，将TrpR进行了敲除。
cas9-trpR质粒构建：以野生型大肠杆菌MG1655为模板，用引物trpR-up-F、trpR-up-R扩增带接头的trpR-UP片段，用引物trpR-down-F、trpR-down-R扩增带接头的trpR-Down片段。trpR-UP片段和trpR-Down片段通过组装成trpR-UD片段。以cas9质粒为模板，用引物trpR-N20-F、trpR-ver-R扩增质粒骨架trpR-ver1片段，用引物trpR-ver-F、trpR-N20-R扩增质粒骨架trpR-ver2片段。质粒骨架trpR-ver1、trpR-ver2与上面的片段trpR-UD通过Gibson assembly（Gibson assembly方法是Gibson等发明的将多个DNA片段在1次反应中实现分子间连接）得到cas9-trpR质粒。
本部分所用引物如下：
表5 构建L-色氨酸生产菌株KBD3所用到的引物
引物名称 核苷酸序列（5’-3’）
引物trpR-up-F(SEQ ID NO：19) AATCCATGGGCCTGTAGCAGCTTATAACGCCGGA
引物trpR-up-R(SEQ ID NO：20) ATCAGGCCTACAAAAAATATGTCGCCATTGTTAGC
引物trpR-down-F(SEQ ID NO：21) CAATGGCGACATATTTTTTGTAGGCCTGATAAGAC
引物trpR-down-R(SEQ ID NO：22) CCAAGCTTCCATTCATGGTCCCGTGATGTCGCGT
引物trpR-ver-F(SEQ ID NO：23) ACATCACGGGACCATGAATGGAAGCTTGGATTCTC
引物trpR-ver-R(SEQ ID NO：24) GCGTTATAAGCTGCTACAGGCCCATGGATTCTTC
引物trpR-N20-F(SEQ ID NO：25) GCCAGATGAGCGCGAAGCGTGTTTTAGAGCTAGAAATAGC
引物trpR-N20-R(SEQ ID NO：26) ACGCTTCGCGCTCATCTGGCGCTAAGATCTGACTCCATAA
在菌株KBD2中敲除调控因子trpR后，构建色氨酸生产菌株KBD3。本部分所用到的菌株及质粒如下：
表6构建L-色氨酸生产菌株KBD3所用菌株和质粒
菌株或质粒 相关性质
菌株MG1655 F<sup>-</sup> λ<sup>-</sup> ilvG- rfb-50 rph-1
菌株KBD2 KBD1衍生菌株，KBD1菌株中过表达<i>ppsA</i>
菌株KBD3 KBD2衍生菌株，KBD2菌株中敲除<i>tryR</i>
质粒CRISPR/Cas9 pSC101 ori；AMP<sup>R</sup>；araBAD启动子
质粒cas9-trpR cas9衍生质粒，用于敲除基因<i>trpR</i>
实施例4、构建L-色氨酸生产菌株KBD4
ANTA合酶TrpE将莽草酸途径衍生而来的分支酸和谷氨酰胺催化生成邻氨基苯甲酸，此反应为色氨酸末端分支途径的第一步反应。但是，TrpE受到终产物色氨酸的抑制作用，即生成一定量的色氨酸后，其会抑制TrpE酶的活性，从而阻碍更多色氨酸的生成，这在很大程度上导致了色氨酸产量无法提升。
为了探究L-色氨酸对TrpE蛋白的抑制机理，对TrpE蛋白在L-色氨酸缺失及存在的情况下，分别进行了动力学模拟。结果如图2所示，在L-色氨酸不存在的情况下，TrpE蛋白的催化口袋处于正常状态，即闭合状态（灰色）。当L-色氨酸存在时，它可以结合到TrpE蛋白中，从而引起TrpE蛋白的结构发生变化并导致其催化口袋由闭合状态转变为张开状态（灰白）。在张开状态下，TrpE蛋白无法结合底物分支酸，从而阻碍了其催化功能，无法生成邻氨基苯甲酸。当在TrpE蛋白中的A63位氨基酸引入V,通过动力学模拟，无论有无L-色氨酸存在，TrpE蛋白的催化口袋始终处于闭合状态。也就是说，无论L-色氨酸是否存在，TrpE蛋白始终可以行使正常的催化功能生成邻氨基苯甲酸。因此，为了解除终产物色氨酸对TrpE的抑制作用，在TrpE的A63位残基引入了V。突变体TrpE（A63V）的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。本实施例中采用的其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示
PH5a-aroG-trpEfbrDCBA质粒构建：以质粒PH5a-aroG-trpEDCBA为模板，用引物trpE-M1-F、trpE-M1-R扩增带接头的trpE1-Gibson片段。以质粒PH5a-aroG-trpEDCBA为模板，用引物trpE-M2-F、trpE-M2-R扩增带接头的trpE2-Gibson片段，与上面的trpE1-Gibson片段通过Gibson assembly得到PH5a-aroGfbr-trpEfbrDCBA质粒。
本部分所用引物如下：
表7 构建L-色氨酸生产菌株KBD4所用到的引物
引物名称 核苷酸序列（5’-3’）
引物trpE-M1-F(SEQ ID NO：27) GCTGCGCATTACAGTTTTAGGTGACACTGTCACAA
引物trpE-M1-R(SEQ ID NO：28) CGCCCCAGCTCATCAGGTCAGCGAGATATTGTGGG
引物trpE-M2-F(SEQ ID NO：29) CCACAATATCTCGCTGACCTGATGAGCTGGGGCGC
引物trpE-M2-R(SEQ ID NO：30) CAGTGTCACCTAAAACTGTAATGCGCAGCGCACTG
把质粒PH5a-aroG-trpEfbrDCBA导入菌株KW中，或者在菌株KBD1基础上，把质粒PH5a-aroG-trpEfbrDCBA替换掉菌株KBD3中的PH5a-aroG-trpEDCBA质粒，得到菌株KBD4（即事先不加抗生素培养菌株KBD3，使其丢失其中的质粒PH5a-aroG-trpEDCBA，然后再导入PH5a-aroG-trpEfbrDCBA质粒，本实施例采用后者，由于前已有菌株KBD3这种材料）。本部分所用到的菌株及质粒如下：
表8 构建L-色氨酸生产菌株KBD4所用菌株和质粒
菌株或质粒 相关性质
菌株MG1655 F<sup>-</sup> λ<sup>-</sup> ilvG- rfb-50 rph-1
菌株KBD3 KBD2衍生菌株，KBD2菌株中敲除<i>tryR</i>
菌株KBD4 KBD3衍生菌株，含有质粒PH5a-aroG-trpE<sup>fbr</sup>DCBA
质粒PH5a-aroG-trpE<sup>fbr</sup>DCBA PH5a-aroG-trpEDCBA衍生质粒，突变TrpE的A63位氨基酸为V
实施例5、L-色氨酸生产菌株的制备L-色氨酸
1、L-色氨酸生产菌株的的发酵
大肠杆菌L-色氨酸生产菌株KW和KBD1-KBD4摇瓶发酵工艺如下：
（1）斜面活化培养：从-80oC冰箱取出保藏菌种划线于含有四环素抗性的固体培养基，37oC培养12-18h。
（2）种子培养：用接种环从新鲜活化斜面上挑取单菌落于种子基本培养基中（500mL三角瓶中装50mL LB培养基，封口膜封口），37oC、220r/min振荡培养6-8h至OD600约为2-3。
（3）摇瓶分批发酵培养：将种子培养液按10%的接种量接入含有四环素抗性发酵基本培养基中（500mL三角瓶，装液量为50mL，封口膜封口），37oC、220r/min振荡培养进行L-色氨酸分批发酵36-42h。摇瓶发酵培养基表15：
表9 L-色氨酸发酵培养基配方
培养基成分 含量
葡萄糖 20g/L
(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub> 10g/L
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub> 5g/L
yeast 2g/L
mops 0.4M
MgSO<sub>4</sub> 5g/L
FeSO<sub>4</sub>7H<sub>2</sub>O 15mg/L
Sodium citrate 0.5g/L
VB1 100mg/L
CuSO<sub>4</sub>·5H<sub>2</sub>O 4mg/L
ZnSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O 4mg/L
MnSO<sub>4</sub>H<sub>2</sub>O 15mg/L
2、发酵菌株高效液相色谱法（HPLC）检测
将发酵液在冷冻离心机中5500rpm/min离心15-20min，收集上清，上清经0.22μm滤膜过滤后做HPLC检测。
HPLC条件为：色谱柱为ZORBAX Eclipse AAA（氨基酸分析）色谱柱，流动相A：40mMNa2HPO4，pH 7.8,流动相B：甲醇：乙腈：水=45:45:10，v/v/v。洗脱梯度为0-1min,100% A;9.8min:43% A+57% B;10min:100% B;12min:100% B;12.5min:100% A。流速2.0mL/min，串联连接RID、VWD检测器，检测池温度控制在40oC，进样量为10μL，分析时间26min，紫外检测波长338nm。
3、L-色氨酸生产菌株KW和KBD1-KBD4发酵结果及分析
菌株KW、KBD1-KBD4在经过38-42h发酵培养后，对发酵液上清进行了HPLC检测，结果如图3所示。由发酵结果可以看出，在菌株KW的基础上，引入DAHP合酶AroG和邻氨基苯甲酸合酶TrpE后，菌株KBD1生产色氨酸的能力在KW菌株的基础上提高了38%，L-色氨酸产量达到了0.32g/L。在此基础上，过表达PpsA，并敲除TrpR后，菌株KBD3的色氨酸产量进一步提高到0.44g/L。由此可以看出，提高前体物PEP的供给和去除色氨酸负调控因子后，L-色氨酸合成途径效率确实有所提高。最后，通过引入TrpE(A63V)突变，解除终产物色氨酸对TrpE的反馈抑制，L-色氨酸的产量提高到0.62g/L，相比对照菌株KW，提升了1.68倍。
序列表
<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所
<120> TrpE的突变体及其在产L-色氨酸基因工程菌中的应用
<160> 30
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 520
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 1
Met Gln Thr Gln Lys Pro Thr Leu Glu Leu Leu Thr Cys Glu Gly Ala
1 5 10 15
Tyr Arg Asp Asn Pro Thr Ala Leu Phe His Gln Leu Cys Gly Asp Arg
20 25 30
Pro Ala Thr Leu Leu Leu Glu Ser Ala Asp Ile Asp Ser Lys Asp Asp
35 40 45
Leu Lys Ser Leu Leu Leu Val Asp Ser Ala Leu Arg Ile Thr Val Leu
50 55 60
Gly Asp Thr Val Thr Ile Gln Ala Leu Ser Gly Asn Gly Glu Ala Leu
65 70 75 80
Leu Ala Leu Leu Asp Asn Ala Leu Pro Ala Gly Val Glu Ser Glu Gln
85 90 95
Ser Pro Asn Cys Arg Val Leu Arg Phe Pro Pro Val Ser Pro Leu Leu
100 105 110
Asp Glu Asp Ala Arg Leu Cys Ser Leu Ser Val Phe Asp Ala Phe Arg
115 120 125
Leu Leu Gln Asn Leu Leu Asn Val Pro Lys Glu Glu Arg Glu Ala Met
130 135 140
Phe Phe Gly Gly Leu Phe Ser Tyr Asp Leu Val Ala Gly Phe Glu Asp
145 150 155 160
Leu Pro Gln Leu Ser Ala Glu Asn Asn Cys Pro Asp Phe Cys Phe Tyr
165 170 175
Leu Ala Glu Thr Leu Met Val Ile Asp His Gln Lys Lys Ser Thr Arg
180 185 190
Ile Gln Ala Ser Leu Phe Ala Pro Asn Glu Glu Glu Lys Gln Arg Leu
195 200 205
Thr Ala Arg Leu Asn Glu Leu Arg Gln Gln Leu Thr Glu Ala Ala Pro
210 215 220
Pro Leu Pro Val Val Ser Val Pro His Met Arg Cys Glu Cys Asn Gln
225 230 235 240
Ser Asp Glu Glu Phe Gly Gly Val Val Arg Leu Leu Gln Lys Ala Ile
245 250 255
Arg Ala Gly Glu Ile Phe Gln Val Val Pro Ser Arg Arg Phe Ser Leu
260 265 270
Pro Cys Pro Ser Pro Leu Ala Ala Tyr Tyr Val Leu Lys Lys Ser Asn
275 280 285
Pro Ser Pro Tyr Met Phe Phe Met Gln Asp Asn Asp Phe Thr Leu Phe
290 295 300
Gly Ala Ser Pro Glu Ser Ser Leu Lys Tyr Asp Ala Thr Ser Arg Gln
305 310 315 320
Ile Glu Ile Tyr Pro Ile Ala Gly Thr Arg Pro Arg Gly Arg Arg Ala
325 330 335
Asp Gly Ser Leu Asp Arg Asp Leu Asp Ser Arg Ile Glu Leu Glu Met
340 345 350
Arg Thr Asp His Lys Glu Leu Ser Glu His Leu Met Leu Val Asp Leu
355 360 365
Ala Arg Asn Asp Leu Ala Arg Ile Cys Thr Pro Gly Ser Arg Tyr Val
370 375 380
Ala Asp Leu Thr Lys Val Asp Arg Tyr Ser Tyr Val Met His Leu Val
385 390 395 400
Ser Arg Val Val Gly Glu Leu Arg His Asp Leu Asp Ala Leu His Ala
405 410 415
Tyr Arg Ala Cys Met Asn Met Gly Thr Leu Ser Gly Ala Pro Lys Val
420 425 430
Arg Ala Met Gln Leu Ile Ala Glu Ala Glu Gly Arg Arg Arg Gly Ser
435 440 445
Tyr Gly Gly Ala Val Gly Tyr Phe Thr Ala His Gly Asp Leu Asp Thr
450 455 460
Cys Ile Val Ile Arg Ser Ala Leu Val Glu Asn Gly Ile Ala Thr Val
465 470 475 480
Gln Ala Gly Ala Gly Val Val Leu Asp Ser Val Pro Gln Ser Glu Ala
485 490 495
Asp Glu Thr Arg Asn Lys Ala Arg Ala Val Leu Arg Ala Ile Ala Thr
500 505 510
Ala His His Ala Gln Glu Thr Phe
515 520
<210> 2
<211> 1563
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 2
atgcaaacac aaaaaccgac tctcgaactg ctaacctgcg aaggcgctta tcgcgacaat 60
cccaccgcgc tttttcacca gttgtgtggg gatcgtccgg caacgctgct gctggaatcc 120
gcagatatcg acagcaaaga tgatttaaaa agcctgctgc tggtagacag tgcgctgcgc 180
attacagttt taggtgacac tgtcacaatc caggcacttt ccggcaacgg cgaagccctc 240
ctggcactac tggataacgc cctgcctgcg ggtgtggaaa gtgaacaatc accaaactgc 300
cgtgtgctgc gcttcccccc tgtcagtcca ctgctggatg aagacgcccg cttatgctcc 360
ctttcggttt ttgacgcttt ccgtttattg cagaatctgt tgaatgtacc gaaggaagaa 420
cgagaagcca tgttcttcgg cggcctgttc tcttatgacc ttgtggcggg atttgaagat 480
ttaccgcaac tgtcagcgga aaataactgc cctgatttct gtttttatct cgctgaaacg 540
ctgatggtga ttgaccatca gaaaaaaagc acccgtattc aggccagcct gtttgctccg 600
aatgaagaag aaaaacaacg tctcactgct cgcctgaacg aactacgtca gcaactgacc 660
gaagccgcgc cgccgctgcc agtggtttcc gtgccgcata tgcgttgtga atgtaatcag 720
agcgatgaag agttcggtgg cgtagtgcgt ttgttgcaaa aagcgattcg cgctggagaa 780
attttccagg tggtgccatc tcgccgtttc tctctgccct gcccgtcacc gctggcggcc 840
tattacgtgc tgaaaaagag taatcccagc ccgtacatgt tttttatgca ggataatgat 900
ttcaccctat ttggcgcgtc gccggaaagc tcgctcaagt atgatgccac cagccgccag 960
attgagatct acccgattgc cggaacacgc ccacgcggtc gtcgcgccga tggttcactg 1020
gacagagatc tcgacagccg tattgaactg gaaatgcgta ccgatcataa agagctgtct 1080
gaacatctga tgctggttga tctcgcccgt aatgatctgg cacgcatttg cacccccggc 1140
agccgctacg tcgccgatct caccaaagtt gaccgttatt cctatgtgat gcacctcgtc 1200
tctcgcgtag tcggcgaact gcgtcacgat cttgacgccc tgcacgctta tcgcgcctgt 1260
atgaatatgg ggacgttaag cggtgcgccg aaagtacgcg ctatgcagtt aattgccgag 1320
gcggaaggtc gtcgccgcgg cagctacggc ggcgcggtag gttatttcac cgcgcatggc 1380
gatctcgaca cctgcattgt gatccgctcg gcgctggtgg aaaacggtat cgccaccgtg 1440
caagcgggtg ctggtgtagt ccttgattct gttccgcagt cggaagccga cgaaacccgt 1500
aacaaagccc gcgctgtact gcgcgctatt gccaccgcgc atcatgcaca ggagactttc 1560
tga 1563
<210> 3
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 3
cgcatccgac aattaaacct tacccgcgac gcgctttta 39
<210> 4
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 4
tggcaacact ggaacagaca tgaattatca gaacgacga 39
<210> 5
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 5
cgtcgttctg ataattcatg tctgttccag tgttgccat 39
<210> 6
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 6
agcggcgacg cgcagttaat cccacagccg ccagttccg 39
<210> 7
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 7
ggaactggcg gctgtgggat taactgcgcg tcgccgctt 39
<210> 8
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 8
acaaaattag agaataacaa tgcaaacaca aaaaccgac 39
<210> 9
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 9
tcggtttttg tgtttgcatt gttattctct aattttgtt 39
<210> 10
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 10
aaaagcgcgt cgcgggtaag gtttaattgt cggatgcgc 39
<210> 11
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 11
gaatccatgg gcctgttgaa agcataaatt aaaaacg 37
<210> 12
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 12
ttaaacaaaa ttattgggga attgttatcc gctcacaatt ccacacat 48
<210> 13
<211> 89
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 13
attccccaat aattttgttt aactttaaga aggagatata catatgtcca acaatggctc 60
gtcaccgctc gtgctttggt ataaccaacp psupOgaatc catgggcctg ttgaaagcat 120
aaattaaaaa cgppsupOtt aaacaaaatt attggggaat tgttatccgc tcacaattcc 180
acacattata cgagccgatg attaattgtc aacgaacaat ccttttgtga tappsdownO 240
attccccaat aattttgttt aactttaaga aggagatata catatgtcca acaatggctc 300
gtcaccgctc gtgctttggt ataaccaacp psdownOtcc aagcttccat tcagaaggga 360
gtgtcgataa tccppsverO tcgacactcc cttctgaatg gaagcttgga ttctcppsve 420
rOaatttatg ctttcaacag gcccatggat tcttcppsOt agccaacaat ggctcgtcac 480
cgcgttttag agctagaaat agcppsOcgc ggtgacgagc cattgttggc taagatctga 540
ctccataa 548
<210> 14
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 14
tccaagcttc cattcagaag ggagtgtcga taatcc 36
<210> 15
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 15
tcgacactcc cttctgaatg gaagcttgga ttctc 35
<210> 16
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 16
aatttatgct ttcaacaggc ccatggattc ttc 33
<210> 17
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 17
tagccaacaa tggctcgtca ccgcgtttta gagctagaaa tagc 44
<210> 18
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 18
cgcggtgacg agccattgtt ggctaagatc tgactccata a 41
<210> 19
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 19
aatccatggg cctgtagcag cttataacgc cgga 34
<210> 20
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 20
atcaggccta caaaaaatat gtcgccattg ttagc 35
<210> 21
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 21
caatggcgac atattttttg taggcctgat aagac 35
<210> 22
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 22
ccaagcttcc attcatggtc ccgtgatgtc gcgt 34
<210> 23
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 23
acatcacggg accatgaatg gaagcttgga ttctc 35
<210> 24
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 24
gcgttataag ctgctacagg cccatggatt cttc 34
<210> 25
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 25
gccagatgag cgcgaagcgt gttttagagc tagaaatagc 40
<210> 26
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 26
acgcttcgcg ctcatctggc gctaagatct gactccataa 40
<210> 27
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 27
gctgcgcatt acagttttag gtgacactgt cacaa 35
<210> 28
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 28
cgccccagct catcaggtca gcgagatatt gtggg 35
<210> 29
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 29
ccacaatatc tcgctgacct gatgagctgg ggcgc 35
<210> 30
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 30
cagtgtcacc taaaactgta atgcgcagcg cactg 35

Claims (4)

1.产L-色氨酸的基因工程菌在生产L-色氨酸中的应用，其特征在于，所述产L-色氨酸的基因工程菌，其通过基因定点突变方法将出发细菌中的TrpE蛋白基因突变以解除L-色氨酸对TrpE的抑制作用，所述突变是将在TrpE蛋白中的A63位氨基酸残基替换为V；所述出发细菌中的TrpE蛋白基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；其中所述的出发细菌是大肠杆菌。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述出发细菌中的TrpE蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，还通过基因工程技术在所述基因工程菌中过表达AroG，TrpE和PpsA，并对TrpR进行敲除。
4.如权利要求1至3任一项所述的应用，其特征在于，通过对所述基因工程菌进行发酵，然后收集L-色氨酸。
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