CN111593107A - 阿尔兹海默症易感位点rs10119与rs71352238的检测方法及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
阿尔兹海默症易感位点rs10119与rs71352238的检测方法试剂盒，所述方法包括步骤：（1）提取样本的基因组DNA，扩增样品的TOMM40基因3'UTR中包含rs10119位点的区域及5'nearGene中包含rs71352238位点的区域，得到扩增产物；（2）使用HRM分析技术和Tagman分析技术检测扩增产物中rs10119及rs71352238的基因型。所述试剂盒用于执行所述方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测阿尔兹海默症易感位点的方法及试剂盒。
背景技术
阿尔兹海默症又称老年痴呆，是一种不可逆的神经退行性脑部疾病，是影响老年人的痴呆症的最常见原因。阿尔兹海默症的遗传学可分为早老性痴呆和老年性痴呆。早老性痴呆通常在65岁之前发作。老年性痴呆发病于65岁以后，是阿尔兹海默症的更普遍形式。老年性痴呆的遗传学较为复杂，涉及多个基因，只有中等程度的家族聚集。载脂蛋白E（APOE）是与老年性痴呆相关的最完善的基因，其中带有e4等位基因（APOE e4）的人罹患阿尔兹海默症的风险大大增加。但是大多数阿尔兹海默症遗传数据，包括APOE，都是基于对白种人的研究。先前的研究已经确定，并非白种人中发现的所有阿尔兹海默症易感基因位点在汉族人群中都具有相同的相关性，这表明汉族人群中的阿尔兹海默症的机制可能存在与高加索人中遗传风险因素不同的遗传风险因素。
近年来，越来越多的研究发现线粒体功能障碍在神经系统疾病中起重要作用。据报道，保持线粒体正常功能所需的蛋白质转移的TOMM40（线粒体外膜转移酶40）在相关疾病的发病机理中起着重要作用。TOMM40是由外膜转移酶（TOM）形成的化合物，是在蛋白质输入到线粒体重要入口通道的过程中形成的亚基，这对蛋白质转运到线粒体至关重要。随着阿尔兹海默症发病机制中线粒体功能障碍学说的相关研究增多，一些研究者对定位于19q13的TOMM40基因的多态性与阿尔兹海默症的相关性进行了研究，有研究报道TOMM40基因可能影响脑白质的完整性，并与阿尔兹海默症发病年龄有关，确定TOMM40多态性在汉族人群AD的发病机理中起着重要作用。一些研究认为TOMM40与阿尔兹海默症的发病有关，因为TOMM40中的SNP直接导致线粒体功能障碍，例如能量代谢功能障碍，氧化应激损伤等。但具体的SNP与阿尔海默茨症发病的关系目前尚无深入的研究，因此找到TOMM40基因中与阿尔兹海默症高度相关的易感位点并基于此提供一种易感位点的检测手段成为现有技术中亟待解决的问题。
发明内容
在先期研究中，我们对830多例阿尔兹海默症患者和630多例无阿尔兹海默症病症的健康老人进行分析，发现TOMM40基因中rs10119号SNP位点（以下均简称rs10119位点）及rs71352238号SNP位点（以下均简称rs71352238位点）与阿尔兹海默症具有强相关性，其不仅独立于APOE基因作用于阿尔兹海默症，而且与APOE协同对阿尔兹海默症发病起促进作用。此分析比较采用R×C×2检验，用SPSS软件进行统计分析，经过性别、年龄校正后的分析结果如下表所示：
基于上述发现，为解决所述技术问题，本发明采用的技术方案为：
为了解决上述问题，本发明提供的技术方案是：阿尔兹海默症易感位点rs10119与rs71352238的检测方法，所述方法包括步骤：（1）提取样本的基因组DNA，扩增样品的TOMM40基因3' UTR中包含rs10119位点的区域及5' nearGene中包含rs71352238位点的区域，得到扩增产物；（2）使用HRM分析技术和Tagman分析技术检测扩增产物中rs10119及rs71352238的基因型。
所述的阿尔兹海默症易感位点rs10119与rs71352238的检测方法，进一步的，TOMM40基因的rs10119的基因型带有TT，TOMM40基因的rs71352238的基因型带有CC。
进一步的，TOMM40基因的rs10119位点的基因型带有TT时，该TOMM40基因所属样品的测试者对于阿尔兹海默症的易感性高于基因型没有TT的测试者；TOMM40基因的rs71352238位点的基因型带有CC时，该TOMM40基因所属样品的测试者对于阿尔兹海默症的易感性高于基因型没有CC的测试者。
所述的阿尔兹海默症易感位点rs10119与rs71352238的检测方法，进一步的，使用特异性引物扩增样品的TOMM40基因中包含rs10119及rs71352238的区域，所述特异性引物是能特异性扩增出包含TOMM40基因上rs10119、rs71352238的DNA片段的引物对。
进一步的，所述特异性引物具有SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：5、SEQID NO：6所示的核苷酸序列。
进一步的，使用HRM分析技术和Tagman分析技术直接检测扩增后包含上述SNP位点的DNA片段的引物对的基因型。
进一步的，将扩增后包含上述SNP位点的DNA片段的引物对转移至分析装置，然后使用HRM分析技术和Tagman分析技术对该引物对的基因型进行分析。
进一步的，所述阿尔兹海默症易感位点的检测方法在体外诊断性检测阿尔兹海默症的易感性的应用。
本发明还提供了一种用于检测阿尔兹海默症易感位点的试剂盒，其特征是所述试剂盒用于对TOMM40基因3' UTR中包含rs10119的区域及5' nearGene中包含rs71352238的区域进行扩增及采用HRM分析技术和Tagman分析技术进行基因型分析。
进一步的，所述试剂盒包括特异性扩增TOMM40基因中包含rs10119和rs71352238的区域的特异性引物。
进一步的，所述特异性引物具有SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：5、SEQID NO：6所示的核苷酸序列。
进一步的，试剂盒的组分及含量包括150ul 2X HRM Analysis RreMix、1.5ul100uM Primer Mix、50ul 大于10ng/ul DNA、98.5ul H2O、具有SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列的特异性引物。
本发明还提供了所述方法和试剂盒在预测阿尔兹海默症易感性方面的应用。
本发明还提供了所述方法及试剂盒在检测阿尔兹海默症遗传风险因子单核苷酸多态性位点方面的应用。
在先期研究中，我们通过对大量病人和健康人群的rs10119和rs71352238的基因型进行分析发现，当TOMM40基因的rs10119的基因型带有TT， TOMM40基因的rs71352238的基因型带有CC时，与阿尔兹海默症的发病具有强相关性，其不仅独立于APOE基因作用于阿尔兹海默症，而且与APOE协同对阿尔兹海默症发病起促进作用。基于上述发现，本发明提供的方法及试剂盒：采用HRM分析技术和Tagman分析技术对扩增后的TOMM40基因中包含rs10119和rs71352238的区域进行基因型分析，该方法操作简单、快速，使用成本低，结果准确，可以实现批量检测。
附图说明
图1是Taqman分析技术基因分型结果截图，显示了rs10119位点的SNP基因型的结果；
图2是Taqman分析技术基因分型结果截图，显示了rs71352238位点的SNP基因型的结果；
图3是HRM分析技术基因分型结果截图，显示了rs10119位点的SNP基因型的结果；
图4是HRM分析技术基因分型结果截图，显示了rs71352238位点的SNP基因型的结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐明本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人、分子克隆、实验室手册（New York：Cold SpringHarbor Laboratory Press，1989）中所述的条件，或按照厂商所建议的条件。
本发明提供了的一种检测阿尔兹海默症易感位点的方法及试剂盒，所述方法包括步骤：
1）提取样本的基因组DNA，扩增样品的TOMM40基因3' UTR中包含rs10119的区域及5'nearGene中包含rs71352238的区域，得到扩增产物；
2）使用HRM分析技术和Tagman分析技术检测扩增产物中rs10119及rs71352238的基因型。该阿尔兹海默症易感位点的检测方法及试剂盒亦可用于预测阿尔兹海默症的易感性。
所述的rs10119位于TOMM40基因的3' UTR区域（片段重叠群conting：NT_011109.17 位置17662542 G>A），其中，脱氧核糖核苷酸（DNA）序列编号：rs10119位置基于SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列；引物1基于SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；引物2基于SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列；扩增产物基于SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列。
所述的rs71352238位于TOMM40基因的5' nearGene区域（片段重叠群conting：NT_011109.17 位置17650205 T>C），其中，脱氧核糖核苷酸（DNA）序列编号：rs71352238位置基于SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列；引物3基于SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列；引物4基于SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列；扩增产物基于SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列；
经过研究证明了TOMM40基因与阿尔兹海默症密切相关，而且发现了它的单核苷酸多态性位点rs10119及rs71352238的新功能：TOMM40基因的3' UTR区域的单核苷酸多态性（SNP，single nucleotide polymorphism）位点rs10119及TOMM40基因的5' nearGene区域的单核苷酸多态性（SNP）位点rs71352238中的基因型的改变将导致阿尔兹海默症的发病风险升高，其中关联研究结果显示，在TOMM40基因rs10119 G>A及TOMM40 T>C在病例和对照组中的分布存在极显著性差异（P<0.01）。
TOMM40基因的详细序列可参见登录号为rs10119及rs71352238的核苷酸序列（可参见网址https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）
实施例1：荧光PCR检测
一、实验材料
LightCycler480荧光定量PCR仪购自瑞士罗氏（Roche）公司，聚合酶链反应液（HRMAnalysis RreMix）由天根生化科技(北京)有限公司定制合成。
二、引物及探针设计与合成：
以TOMM40基因的3' UTR区域及5' nearGene区域的部分序列为模版，使用PrimerPremier5软件分析引物，并由无锡精合生物科技有限公司定制合成。
检测用引物：
TOMM40基因rs10119上游引物序列：
5’-TGGTGCTCAGAATCCTGCG-3’（SEQ ID NO：2）
TOMM40基因rs10119下游引物序列：
5’-CGCTTCGGGATTCTGAGTAGC-3’（SEQ ID NO：3）
TOMM40基因rs71352238上游引物序列：
5’-CCTGAAATGTCCTTTTGTATTGGTT-3’（SEQ ID NO：5）
TOMM40基因rs71352238下游引物序列：
5’-CTGCGAGCCAATGGGAAG-3’（SEQ ID NO：6）
三、样本检测：
实验共检测200例阿尔兹海默症病例和200例正常对照人群，每例收集血样标本约2mL，用酚/氯仿抽提基因组DNA，抽提结果用微量紫外/可见光分光光度计（Themo Fisher公司）检测。
按如下体系进行荧光PCR扩增，最后用Roche LC480 Software 1.5扫描并聚类分析
四、基因型检测结果：
基因组DNA抽提的检测结果：
所有样本的基因组DNA符合检测要求（260/280>1.8，浓度>10ng/ul）
实施例2:Tagman法检测阿尔兹海默症rs10119及rs71352238位点的基因型
用Tagman法检测阿尔兹海默症遗传风险基因TOMM40基因的rs10119及rs71352238位点。挑选上述阿尔兹海默症病例——对照组样本各200例进行Tagman分型实验，判断rs10119及rs71352238的基因型。
一、实验方法
Tagman探针方法使用美国应用生物系统公司的Tagman探针和Tagman GenotypingMaster Mix。
按如下体系进行PCR扩增，最后用Roche LC480 Software 1.5扫描并聚类分析
二、实验结果
Taqman分析技术基因分型结果截图如图1、图2所示,HRM分析技术基因分型结果截图如图3，图4所示。
最终，400例的Tagman分型结果与实施例1中Light Cycler 480荧光PCR的HRM分析结果完全一致。
三、TOMM40基因rs10119及rs71352238基因型和阿尔兹海默症易感的关联分析
TOMM40基因rs10119及rs71352238位点在阿尔兹海默症病人和对照中分布的比较采用R×C×2检验，用SPSS软件进行统计分析的分析结果如下表所示：
实施例3:阿尔兹海默症易感位点的检测试剂盒
本发明提供的检测试剂盒可以对TOMM40基因3' UTR中包含rs10119位点的区域及5'nearGene中包含rs71352238位点的区域进行扩增及HRM技术分析和Tagman技术分析，该检测试剂盒可以检测阿尔兹海默症的易感性，其包含有可扩增出TOMM40基因3' UTR中包含rs10119位点及5' nearGene中包含rs71352238位点的特异性引物，及其他PCR-HRM相应试剂，PCR扩增与HRM分析的组分含量相同。
检测试剂盒供50人份检测应用，与-20oC避光保存，每50人份的检测试剂盒其组分及含量包括：
150ul 2X HRM Analysis RreMix
3ul 100uM Primer Mix
50ul 大于10ng/ul DNA
98.5ul H2O
具有SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列的特异性引物各0.75ul。
本发明具有实用性的例证：
检测该个体的TOMM40基因中rs10119及rs71352238位点的基因型，以此判断该个体患阿尔兹海默症的发病风险是否高于普通人群。
TOMM40基因中rs10119号及rs71352238的多态性可直接用于阿尔兹海默症的预防指导。
检测TOMM40基因中rs10119及rs71352238位点的基因型也可用于阿尔兹海默症患者的个性化治疗。
正常对照与阿尔茨海默患者中，TOMM40基因中rs10119号及rs71352238的多态性和直接用于阿尔兹海默症的预防指导，相关分布的比较数据如下表：
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用做参考，就如同每一篇文献被引用作为参考那样。
本发明的技术内容和技术特点已揭示如上，然而熟悉本领域的技术人员仍可能基于本发明的教示及揭示进行种种不背离发明精神的替换和修饰。因此，本发明的保护范围应不限于实施方式所揭示的内容，而包括各种不背离本发明的替换和修饰，均为本专利申请权利要求所涵盖。
序列表
<110> 丁玎
<120> 阿尔兹海默症易感位点rs10119与rs71352238的检测方法及试剂盒
<141> 2020-01-15
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 61
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
gtgctcagaa tcctgcgtgc ccctcaattc tggaatccct cccgggaccc caggcccact 60
g 61
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
tggtgctcag aatcctgcg 19
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
cgcttcggga ttctgagtag c 21
<210> 4
<211> 61
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 4
caatgggaag ggtgggaggg gcgccgtggc taccctgcga gtgagaacca atacaaaagg 60
a 61
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
cctgaaatgt ccttttgtat tggtt 25
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
ctgcgagcca atgggaag 18
<210> 7
<211> 98
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
tggtgctcag aatcctgcgt gcccctcaat tcgggaatcc ctcccgggac cccaggccca 60
ctgggcatgc tgcccctgct actcagaatc ccgaagcg 98
<210> 8
<211> 78
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
cctgaaatgt ccttttgtat tggttctcac tcgcagggta gccacggcgc ccctcccacc 60
cttcccattg gctcgcag 78
<210> 9
<211> 61
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 9
gtgctcagaa tcctgcgtgc ccctcaattc cggaatccct cccgggaccc caggcccact 60
g 61
<210> 10
<211> 61
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 10
caatgggaag ggtgggaggg gcgccgtggc caccctgcga gtgagaacca atacaaaagg 60
a 61
Claims (10)
1.阿尔兹海默症易感位点rs10119与rs71352238的检测方法，其特征是所述方法包括步骤：（1）提取样本的基因组DNA，扩增样品的TOMM40基因3' UTR中包含rs10119位点的区域及5' nearGene中包含rs71352238位点的区域，得到扩增产物；（2）使用HRM分析技术和Tagman分析技术检测扩增产物中rs10119及rs71352238的基因型。
2.如权利要1所述阿尔兹海默症易感位点rs10119与rs71352238的检测方法，其特征是，TOMM40基因的rs10119位点的基因型带有TT时，该TOMM40基因所属样品的测试者对于阿尔兹海默症的易感性高于基因型没有TT的测试者；TOMM40基因的rs71352238位点的基因型带有CC时，该TOMM40基因所属样品的测试者对于阿尔兹海默症的易感性高于基因型没有CC的测试者。
3.如权利要求1~2任一所述的阿尔兹海默症易感位点rs10119与rs71352238的检测方法，其特征是，使用特异性引物扩增样品的TOMM40基因中包含rs10119及rs71352238的区域，所述特异性引物是能特异性扩增出包含TOMM40基因上rs10119、rs71352238的DNA片段的引物对。
4.如权利要求3所述的阿尔兹海默症易感位点rs10119与rs71352238的检测方法，其特征是所述特异性引物具有SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列。
5.如权利要求4所述的阿尔兹海默症易感位点rs10119与rs71352238的检测方法，其特征是，使用HRM分析技术和Tagman分析技术直接检测扩增后包含阿尔兹海默症易感位点rs10119与rs71352238的DNA片段的引物对的基因型。
6.如权利要求1~5任一所述阿尔兹海默症易感位点rs10119与rs71352238的检测方法在体外诊断性检测阿尔兹海默症的易感性的应用。
7.一种用于检测阿尔兹海默症易感位点rs10119与rs71352238的试剂盒，其特征是所述试剂盒用于对TOMM40基因3' UTR中包含rs10119的区域及5' nearGene中包含rs71352238的区域进行扩增及采用HRM分析技术和Tagman分析技术进行基因型分析。
8.如权利要求7所述一种用于检测阿尔兹海默症易感位点rs10119与rs71352238的试剂盒，其特征是所述试剂盒包括特异性扩增TOMM40基因中包含rs10119和rs71352238的区域的特异性引物，所述特异性引物具有SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：5、SEQ IDNO：6所示的核苷酸序列。
9.如权利要求8所述一种用于检测阿尔兹海默症易感位点rs10119与rs71352238的试剂盒，其他特征是，试剂盒的组分及含量包括150ul 2X HRM Analysis RreMix、1.5ul100uM Primer Mix、50ul 大于10ng/ul DNA、98.5ul H2O、具有SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列的特异性引物。
10.如权利要求1~5所述方法和如权利要求6~9所述试剂盒在预测阿尔兹海默症易感性方面的应用。
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2020
- 2020-01-15 CN CN202010041290.XA patent/CN111593107A/zh active Pending
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