CN110913900A - 利尿剂抵抗的治疗 - Google Patents

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Abstract

本公开提供了通过向需要利尿的患者施用IL‑6拮抗剂来治疗利尿剂抵抗的方法。在典型的实施方案中，患者患有心力衰竭。任选地，患者具有升高的尿液IL‑6水平、血浆IL‑6水平或者尿液和血浆IL‑6水平两者。

Description

利尿剂抵抗的治疗
1.相关申请的交叉引用
本申请要求2017年2月1日提交的美国临时申请No.62/453,257的权益，该临时申请通过引用整体并入本文。
2.关于联邦政府资助的研究或开发的声明
本发明是在国立卫生研究院授予的资助5R01HL128973和4K23HL114868的政府支持下完成的。政府拥有本发明的某些权利。
3.关于联合研究协议的声明
本发明是耶鲁大学、MedImmune Ltd.，AstraZeneca Pharmaceuticals LP和Corvidia Therapeutics，Inc.及之间的联合研究协议下完成的。
4.序列表
本申请包含已经通过EFS-Web提交的序列表，并且其通过引用整体并入本文。在2018年XX月创建的所述ASCII拷贝命名为XXXXXUS_sequencelisting.txt，大小为X，XXX，XXX字节。
5.背景技术
肾损伤是通常在心力衰竭中观察到，且心力衰竭通常在肾病中观察到。术语心肾综合征(“CRS”)涵盖其中心脏、肾脏或两者的功能障碍导致两个器官的加速衰竭的各种临床病症。这种不利的器官串扰的迹象预示高发病率和死亡率。尽管其可怕的临床影响，CRS的机制基础现在才开始被阐明。
需要治疗心力衰竭患者的肾损伤和肾损害的新方法。还需要检测心肾综合征、确定哪些心肾患者对治疗起反应和监测治疗功效的新方法。
利尿剂是治疗心力衰竭的主要支柱。然而，某些患者对利尿剂有抗性或变得对其有抗性。对于治疗需要利尿剂但对利尿剂有抗性的患者的新方法存在着需要。
6.发明内容
如下文在实施例1中进一步描述的，将在门诊治疗中心接受高剂量利尿剂疗法的连续性心力衰竭(“HF”)患者入组一项前瞻性观察性研究。测量血浆IL-6水平以探询这一促炎性细胞因子与各种疾病参数的系统相关性，并测量尿液IL-6水平以探询IL-6与局部炎症和肾组织水平的神经激素活化的相关性。
发现尿液IL-6水平和血浆IL-6水平彼此仅略微相关。
在这些心力衰竭患者中，尿液IL-6水平的增加与肾损害的量度显著相关，例如利尿剂抵抗、较低的估计肾小球滤过率(“eGFR”)和增加的组织水平肾素-血管紧张素-醛固酮系统(“RAAS”)激活。
尽管也观察到利尿效率(diuretic efficiency)和血浆IL-6之间的负相关性，但在eGFR调节时，仅尿液IL-6保持与这些患者中的低利尿效率的风险显著相关。此外，当尿液IL-6和血浆IL-6均进入逻辑回归模型中时，仅尿液IL-6保持与低利尿效率的风险相关，而血浆IL-6未显示出这种相关性。
这些数据表明尿液IL-6水平是肾脏炎症的有用生物标志物，并且可用于在心力衰竭(心肾综合征)的情况下测量肾功能障碍。该数据进一步表明，尿液IL-6的系列测量可用于测量施用于心力衰竭患者，特别是具有心肾综合征的心力衰竭患者的治疗的肾脏益处。
尿液IL-6数据，以及在某种程度上血浆IL-6数据，也预测IL 6拮抗剂的治疗对于减少心力衰竭患者的肾脏炎症应当是有效的，即治疗心肾综合征的肾脏症状。
然而，因为感染通常是心力衰竭患者中急性失代偿的诱因，所以将抗细胞因子和其他免疫抑制疗法限制于那些可能对改善的肾脏和/或心脏功能有反应的心力衰竭患者是重要的。慢性IL-6拮抗剂治疗的成本也促进将治疗限制于那些可能对改善的肾脏和/或心脏功能有反应的心力衰竭患者。
将分析扩展至129名患者，并进一步评估每个患者的跨膜蛋白酶丝氨酸6(“TMPRSS6”)中rs855791单核苷酸多态性(“SNP”)处的基因型。
仅在具有至少一个拷贝的TMPRSS6 rs855791SNP主要等位基因(AG和GG)的患者中，尿液IL-6水平与利尿效率呈负相关；对于次要等位基因(AA)纯合的患者中，尿液IL-6水平不与利尿效率显著相关。血浆IL-6水平仅在具有至少一个拷贝的TMPRSS6 rs855791SNP主要等位基因的患者中与利尿效率负相关；在对于次要等位基因纯合的患者中，血浆IL-6水平不与利尿效率显著相关。
这些数据表明，心力衰竭患者中的利尿剂抵抗(低利尿效率)可以用IL-6拮抗剂治疗，但仅在具有至少一个拷贝的TMPRSS6rs855791主要等位基因的患者中。
在与对于TMPRSS6 rs855791主要等位基因纯合的人细胞基因型类似的小鼠M1CCD细胞中，IL-6的添加与离子转运蛋白，NKCC2、ENaC-β和NCC，的表达相关。这些离子转运蛋白的表达增加提供了IL-6介导的利尿剂抵抗的推定机制。
因为IL-6介导的离子转运蛋白表达的增加未知与铁调素表达相关联，这些数据表明IL-6拮抗作用也可有效地治疗对于TMPRSS6rs855791次要等位基因纯合的患者的利尿剂抵抗。
来自另外两个大的心力衰竭临床试验的数据的二次分析证实了利尿剂抵抗与IL-6水平的相关性(实施例5)，其与TMPRSS6 rs855791基因型无关(实施例6)，从而提供了IL-6拮抗作用也有效治疗对于TMPRSS6 rs855791次要等位基因纯合的患者中的利尿剂抵抗的证据。
因此，在第一方面，提供了用于治疗需要利尿但对利尿剂有抗性的患者的方法。该方法包括与利尿剂组合对患者施用治疗有效量的IL-6拮抗剂。
在一些实施方案中，患者具有升高的治疗前血浆IL 6水平。在某些实施方案中，患者的治疗前血浆IL-6水平大于2pg/mL。在某些实施方案中，患者的治疗前IL-6水平大于3pg/mL。在某些实施方案中，患者的治疗前IL-6水平大于5pg/mL。在某些实施方案中，患者的治疗前IL-6水平大于10pg/mL。
在一些实施方案中，患者的利尿效率低于500。在一些实施方案中，患者的利尿效率低于200。在一些实施方案中，患者的利尿效率低于150。在一些实施方案中，患者的利尿效率低于100。
在一些实施方案中，患者患有利尿剂抗性心力衰竭。在某些实施方案中，患者患有急性心力衰竭。在某些实施方案中，患者患有慢性心力衰竭。
在一些实施方案中，患者患有心肾综合征。在这些实施方案的一些中，患者患有4型心肾综合征。
在一些实施方案中，患者患有肾病。在某些实施方案中，患者患有肝肾综合征。
在一些实施方案中，患者具有至少一个拷贝的TMPRSS6rs855791主要等位基因。
在某些实施方案中，IL-6拮抗剂是抗IL-6抗体或其抗原结合片段或衍生物。在特定实施方案中，抗IL-6抗体或抗原结合片段或衍生物对于结合人IL-6具有小于100nM，小于50nM，小于10nM，甚至小于1nM的KD。
在某些实施方案中，抗IL-6抗体或抗原结合片段或衍生物在静脉内施用后具有至少7天、至少14天、至少21天或至少30天的消除半衰期。
在某些实施方案中，IL-6拮抗剂是全长单克隆抗IL-6抗体。在特定的实施方案中，抗体是IgG1或IgG4抗体。在某些实施方案中，抗体是IgG1抗体。
在某些实施方案中，抗IL-6抗体或抗原结合片段或衍生物是全人的。在某些实施方案中，抗IL-6抗体或抗原结合片段或衍生物是人源化的。
在某些实施方案中，抗IL-6抗体或抗原结合片段或衍生物包含MED5117的所有六个可变区CDR。在具体的实施方案中，抗体包含MED5117的VH和VL。在特定的实施方案中，抗体是MED5117。
在某些实施方案中，抗IL-6抗体或抗原结合片段或衍生物包含选自下组的抗体的所有六个可变区CDR：司妥昔单抗、gerilimzumab、sirukumab、clazakizumab、olokizumab、elsilimomab、VX30(VOP-R003；Vaccinex)、EB-007(EBI-029；Eleven Bio)、ARGX-109(ArGEN-X)、FM101(Femta Pharmaceuticals，Lonza)和ALD518/BMS-945429(AlderBiopharmaceuticals，Bristol-Myers Squibb)。在某些实施方案中，抗IL-6抗体或抗原结合片段或衍生物包含选自以下的抗体的重链V区和轻链V区：司妥昔单抗、gerilimzumab、sirukumab、clazakizumab、olokizumab、VX30(VOP-R003；Vaccinex)、EB-007(EBI-029；Eleven Bio)、ARGX-109(ArGEN-X)、FM101(Femta Pharmaceuticals，Lonza)和ALD518/BMS-945429(Alder Biopharmaceuticals，Bristol-Myers Squibb)。在具体的实施方案中，抗IL-6抗体或抗原结合片段或衍生物是选自司妥昔单抗、gerilimzumab、sirukumab、clazakizumab、olokizumab、VX30(VOP-R003；Vaccinex)、EB-007(EBI-029；Eleven Bio)、ARGX-109(ArGEN-X)、FM101(Femta Pharmaceuticals，Lonza)和ALD518/BMS-945429(AlderBiopharmaceuticals，Bristol-Myers Squibb)的抗体。
在某些实施方案中，IL-6拮抗剂是单结构域抗体、VHH纳米抗体、Fab或scFv。
在某些实施方案中，IL-6拮抗剂是抗IL-6R抗体或其抗原结合片段或衍生物。在某些实施方案中，抗IL-6R抗体、抗原结合片段或衍生物包含托珠单抗(tocilizumab)或vobarilizumab的6个CDR。
在某些实施方案中，IL-6拮抗剂是JAK抑制剂。在某些实施方案中，JAK抑制剂选自下组：托法替尼(Xeljanz)、decernotinib、鲁索替尼、upadacitinib、巴瑞替尼、filgotinib、来他替尼、pacritinib、peficitinib、INCB-039110、ABT-494、INCB-047986和AC-410。
在某些实施方案中，IL-6拮抗剂是STAT3抑制剂。
在某些实施方案中，IL-6拮抗剂胃肠外施用。在特定的实施方案中，IL-6拮抗剂皮下施用。
在某些实施方案中，IL-6拮抗剂口服施用。
在某些实施方案中，IL-6拮抗剂以足以增加利尿效率的剂量、时间表和时间段施用。在某些实施方案中，IL-6拮抗剂以足以提高利尿效率至正常水平的剂量、时间表和时间段施用。在某些实施方案中，IL-6拮抗剂以足以增加eGFR的剂量、时间表和时间段施用。在具体的实施方案中，IL-6拮抗剂以足以使eGFR增加至正常水平的剂量、时间表和时间段施用。
在某些实施方案中，该方法还包括测定尿液中的IL-6水平、测定血浆中的IL-6水平或测定尿液和血浆中的IL-6水平的后续步骤。在具体的实施方案中，该方法进一步包括基于在紧接前一步骤中测定的IL-6水平调节用于后续施用的IL-6拮抗剂剂量的最终步骤。
7.附图说明
当结合附图阅读时，将更好地理解本发明的优选实施例的以下详细描述。出于说明本发明的目的，在附图中示出了目前优选的实施方案。然而，应该理解，本发明不限于附图中所示实施方案的精确设置和手段。
图1A是显示在接受高剂量利尿剂治疗的129名心力衰竭(“HF”)患者中尿液IL-6按照三分位数的利尿效率(“DE”)的条形图，所述患者入组本文实施例1中所描述的研究。盒须(whisker)从第10百分位延伸到第90百分位。
图1B是显示129名心力衰竭(“HF”)患者中血浆IL-6按照三分位数的利尿效率(“DE”)的条形图，其数据显示在图1A中。盒须从第10百分位延伸到第90百分位。
图2A描绘了进一步按基因型分层的图1A和1B中报告的患者中按照尿液IL-6的三分位数的DE，左图显示对于TMPRSS6 rs855791SNP次要等位基因(2321G→A；A736V)纯合的患者的结果，和右图显示具有至少一个拷贝的TMPRSS6 rs855791 SNP主要等位基因(2321G；A736)的患者的结果。
图2B描绘了进一步按基因型分层的图1A和1B中报告的患者中按照血浆IL-6的三分位数的DE，左图显示对于TMPRSS6 rs855791SNP次要等位基因(2321G→A；A736V)纯合的患者的结果，和右图显示具有至少一个拷贝的TMPRSS6 rs855791SNP主要等位基因(2321G；A736)的患者的结果。
图3A和3B描绘了图1和2报告的129名患者中的98名患者子集中(A)尿液IL-6水平和(B)血浆IL-6水平与以下临床测定的相关性：降低的肾功能、低利尿效率(“DE”)、增加的神经激素激活和死亡风险。盒须代表95％置信区间(“CI”)。所有分析均对于尿液和血浆IL-6水平进行调整。尿液IL-6水平针对尿肌酐进行指数化(indexed)。由于尿液和血浆IL-6变量的偏态分布，在进行逻辑和Cox回归之前应用对数变换。缩写：OR＝优势比。HR＝危险比。IL＝白细胞介素。SD＝标准偏差。eGFR＝估计的肾小球滤过率。*＝针对血管紧张素转化酶抑制剂(ACE-I)或血管紧张素受体阻滞剂(ARB)的使用调整的。**＝针对基线特征调整的，该基线特征包括年龄、种族、氨基末端pro B型利尿钠肽(NT-proBNP)、ACE-1或ARB的使用、家用袢利尿剂(loop diuretic)剂量和eGFR。
图4A、4B和4C显示用IL-6和/或鲁索替尼处理后M1 CCD细胞中NKCC2、ENaC-β和NCC的表达，其中图4A显示用IL-6和/或鲁索替尼处理后NKCC2的表达；图4B显示用IL-6和/或鲁索替尼处理后ENaC-β的表达；和图4C显示用IL-6和/或鲁索替尼处理后NCC的表达。
图5A、5B和5C显示用IL-6和/或螺内酯处理后M1CCD细胞中NKCC2、ENaC-β和NCC的表达，其中图5A显示用IL-6和/或螺内酯处理后NKCC2的表达；图5B显示用IL-6和/或螺内酯处理后ENaC-β的表达；和图5C显示用IL-6和/或螺内酯处理后NCC的表达。
图6显示了实施例5中描述的PROTECT试验中基线特征与较高的IL-6水平的相关性。
图7A和7B显示了按照IL-6的三分位数的Kaplan-Meier存活曲线，其中图7A显示了180天的全因死亡率，和图7B显示60天的全因死亡率或心血管相关的再入院率。
图8A和8B显示了基线和第7天之间对于IL-6变化的Kaplan-Meier存活曲线，其中图8A显示了180天的全因死亡率，和图8B显示60天的全因死亡率或心血管相关的再入院率。
图9显示了实施例6中描述的BIOSTAT-CHF研究中基线特征与较高的IL-6水平的相关性。
图10A和10B显示了按照IL-6的三分位数的Kaplan-Meier存活曲线，其中图10A显示了2年的全因死亡率和/或对于心力衰竭的再入院率，和图10B显示了2年的全因死亡率。
图11显示了铁蛋白水平与IL-6的三分位数之间的分析。
8.具体实施方式
8.1定义
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。还应理解，本文使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，而不旨在是限制性的。
“跨膜蛋白酶丝氨酸6(TMPRSS6)多肽”是指与NCBI登录号NP_001275929提供的氨基酸序列具有至少约85％或更高氨基酸同一性的并具有丝氨酸蛋白酶活性的多肽或其片段。TMPRSS6多肽，也称为Matriptase-2(膜型丝氨酸蛋白酶2)(MT2)，切割铁调素调节蛋白并抑制骨形态发生蛋白信号传导。以下提供了在736位具有丙氨酸(736A)的示例性TMPRSS6氨基酸序列：
Figure BDA0002211791250000091
以下提供在736位具有缬氨酸(736V)的示例性TMPRSS6氨基酸序列：
Figure BDA0002211791250000092
“TMPRSS6核酸分子”是指编码TMPRSS6多肽(Matriptase-2；MT2)的多核苷酸。示例性TMPRSS6核酸分子序列以NCBI登录号NM_001289000提供。以下提供了在核苷酸位置2321处具有G的TMPRSS6核酸序列(“G等位基因”；“主要等位基因”)：
Figure BDA0002211791250000093
Figure BDA0002211791250000101
Figure BDA0002211791250000111
以下提供了在核苷酸位置2321处具有A的TMPRSS6核酸序列：
Figure BDA0002211791250000112
Figure BDA0002211791250000121
“变体”是指与参考序列不同在于一个或多个核苷酸或者一个或多个氨基酸的多核苷酸或多肽序列。示例性TMPRSS6变体是TMPRSS6(A736V)，其由SNP rs855791(G→A)产生。
“单核苷酸多态性”或“SNP”是指天然存在的DNA序列变体，其中基因组中的单个核苷酸在生物物种的成员之间或个体中的成对染色体之间不同。SNP可用作变体等位基因的遗传标志物。在一个实施方案中，TMPRSS6 SNP是rs855791。
“rs855791”是指人TMPRSS6基因中的单核苷酸多态性(SNP)，2321G→A，其在由该TMPRSS6基因编码的Matriptase-2(MT2)的催化结构域中产生丙氨酸-缬氨酸置换(A736V)。人群中频率最高的等位基因(主要等位基因)是2321G，其编码736A。人群中最低频率的等位基因(次要等位基因)是2321A，其编码736V。
“杂合的”是指染色体基因座具有两个不同的等位基因。在本文所述方法的一个实施方案中，杂合的是指其中一个等位基因具有编码在氨基酸位置736处具有丙氨酸的TMPRSS6多肽的TMPRSS6核酸序列(例如，在TMPRSS6核酸分子的核苷酸位置2321处具有G或C)(rs855791主要等位基因)，和另一个等位基因具有编码在氨基酸位置736处包含缬氨酸的TMPRSS6多肽的变体TMPRSS6核酸序列(例如，在TMPRSS6核酸分子的核苷酸位置2321处具有A或T)(rs855791次要等位基因)的基因型。
“纯合的”是指染色体基因座具有两个相同的等位基因。在本文所述方法的某些实施方案中，纯合的是指其中两个等位基因都具有编码在氨基酸位置736处包含丙氨酸的TMPRSS6多肽的TMPRSS6核酸序列(例如，在TMPRSS6核酸分子的核苷酸位置2321处具有G或C)(rs855791纯合主要等位基因)的基因型。在某些实施方案中，纯合的是指其中两个等位基因都具有编码包含氨基酸位置736处的缬氨酸的TMPRSS6多肽的TMPRSS6核酸序列(例如，在TMPRSS6核酸分子的核苷酸位置2321处具有A或T)(rs855791纯合次要等位基因)的基因型。
“确定患者具有至少一个拷贝的TMPRSS6 rs855791主要等位基因”包括但不限于进行分析以确定患者具有至少一个拷贝的TMPRSS6 rs855791主要等位基因；定购分析以确定患者具有至少一个拷贝的TMPRSS6 rs855791主要等位基因；规定分析以确定患者具有至少一个拷贝的TMPRSS6 rs855791主要等位基因；另外指导或控制进行分析以确定患者具有至少一个拷贝的TMPRSS6 rs855791主要等位基因；及审核TMRSS6基因型分析数据或者蛋白质或核酸序列数据以确定患者具有至少一个拷贝的TMPRSS6 rs855791主要等位基因。
“白细胞介素6”或“IL-6”或“IL-6多肽”是指与NCBI登录号NP_000591提供的氨基酸序列具有至少约85％或更高氨基酸同一性并具有IL-6生物活性的多肽或其片段。IL-6是具有多种生物学功能的多效细胞因子。示例性IL-6生物活性包括免疫刺激和促炎活性。以下提供示例性IL-6氨基酸序列：
Figure BDA0002211791250000141
“白细胞介素6(IL-6)核酸”是指编码白细胞介素6(IL-6)多肽的多核苷酸。在NCBI登录号NM_000600中提供示例性白细胞介素6(IL-6)核酸序列。NCBI登录号NM_000600的示例性序列在下面提供。
Figure BDA0002211791250000142
“白细胞介素6受体(IL-6R)复合物”是指包含IL-6受体亚基α(IL-6Rα)和白细胞介素6信号转导糖蛋白130(也称为白细胞介素6受体亚基β(IL-6Rβ))的蛋白质复合物。
“白细胞介素6受体亚基α(IL-6Rα)多肽”是指与NCBI登录号NP_000556或NP_852004中提供的氨基酸序列具有至少约85％或更高氨基酸同一性且具有IL-6受体生物学活性的多肽或其片段。示例性IL-6Rα生物学活性包括与IL-6的结合、与糖蛋白130(gp130)的结合以及细胞生长和分化的调节。以下提供示例性IL-6R序列：
Figure BDA0002211791250000151
“白细胞介素6受体亚基β(IL-6Rβ)多肽”是指与NCBI登录号NP_002175、NP_786943或NP_001177910中提供的氨基酸序列具有至少约85％或更高氨基酸同一性并具有IL-6受体生物学活性的多肽或其片段。示例性IL-6Rβ生物活性包括与IL-6Rα的结合、IL-6受体信号传导活性及细胞生长、分化、铁调素表达等的调节。以下提供示例性IL-6Rβ序列：
Figure BDA0002211791250000152
“IL-6拮抗剂”是指能够降低IL-6的生物活性的药剂。IL-6拮抗剂包括降低血清中的IL-6多肽水平的药剂，其包括降低IL-6多肽或核酸的表达的药剂；降低IL-6结合IL-6R的能力的药剂；降低IL-6R表达的药剂；和降低IL-6R受体被IL-6结合时的信号转导的药剂。在优选的实施方案中，IL-6拮抗剂使IL-6生物活性降低至少约10％、20％、30％、50％、70％、80％、90％、95％或甚至100％。如下文第6.3.4节中进一步描述的，IL-6拮抗剂包括IL-6结合多肽，如抗IL-6抗体及其抗原结合片段或衍生物；IL-6R结合多肽，如抗IL-6R抗体及其抗原结合片段或衍生物；及合成化学分子，如JAK1和JAK3抑制剂。
“IL-6抗体”或“抗IL-6抗体”是指特异性结合IL-6的抗体。抗IL-6抗体包括对IL-6特异性的单克隆和多克隆抗体，及其抗原结合片段或衍生物。IL-6抗体在以下第8.3.6.1节中更详细地描述。
如本文所用，“利尿效率”根据Hanberg等，Circ.Heart Fail.2016；9：e003180(其公开内容通过引用整体并入本文)中描述的方法计算为每袢利尿剂剂量加倍的mmol尿钠(mmol Na/袢利尿剂剂量加倍)。
“利尿剂抗性心力衰竭”是指其中患者的利尿效率小于100的心力衰竭。
如本文所用的术语“生物标志物”或“标志物”是指可以被检测的分子。因此，根据本发明的生物标志物包括但不限于核酸、多肽、碳水化合物、脂质、无机分子、有机分子，它们各自的大小和性质可以变化很大。“生物标志物”可以是与身体状况或疾病有关的身体物质。“生物标志物”可以使用本领域已知的任何方法或通过仅在技术人员考虑标志物时才变得明显的先前未知的方式检测。
如本文所用，本发明背景中的“生物标志物”包括但不限于蛋白质、核酸和代谢物，以及它们的多态性、突变、变体、修饰、亚基、片段、蛋白质-配体复合物及降解产物、元素、相关代谢物和其他分析物或样品衍生的量度。生物标志物还可包括突变的蛋白质或突变的核酸。生物标志物还包括非血液源的因子或健康状态的非分析物生理标志物，如临床参数，以及传统的实验室风险因子。根据美国食品和药物管理局(FDA)的定义，生物标志物是“作为正常生物学过程、病理过程或对治疗干预或其他干预的药理学反应的指标而被客观地测量和评估”的特征(例如可测量的DNA和/或RNA或蛋白质)。生物标志物还包括数学上创建的任何计算的指数或者前述测量中的任何一个或多个的组合，包括时间趋势和差异。生物标志物可以在任何水平空间或时间定位上测量，包括但不限于肿瘤内、细胞内或细胞的膜上。
“药剂”是指适合在治疗中施用的任何化合物或组合物，并且明确地包括化学化合物；蛋白质，包括抗体或其抗原结合片段；肽；和核酸分子。
“受试者”或“个体”是指人或非人哺乳动物，包括但不限于牛、马、犬、羊、猫和啮齿动物(包括小鼠(murine)和大鼠(rattus))受试者。“患者”是人类受试者。
如本文所用，术语“治疗”、“处理”、“疗法”等是指减轻或改善病症和/或与其相关的体征或症状，或减缓或停止其进展。应当理解，尽管不是排除的，治疗障碍或病症不需要完全消除障碍、病症或与其相关的症状。
“治疗前”是指在根据本文所述的方法首次施用IL-6拮抗剂之前。治疗前不排除且通常包括事先施用IL-6拮抗剂之外的治疗，例如用利尿剂如袢利尿剂的治疗。
“生物样品”是指源自生物体(例如人类受试者)的任何组织、细胞、流体或其他物质。在某些实施方案中，生物样品是血清、血浆、尿液或全血。
如本文所用，“说明材料”包括在用于检测本文公开的生物标志物的试剂盒中可用于传达本发明的组分的功用的出版物、记录、图表或任何其他表达介质。本发明的试剂盒的说明材料可以例如固定在含有本发明组分的容器上，或者与含有该组分的容器一起运输。或者，说明材料可以与容器分开运输，意图是说明材料和组分由接收者协同使用。
一种或多种生物标志物的“水平”是指通过测量mRNA、cDNA、小有机分子、核苷酸、离子或蛋白质或其任何部分如寡核苷酸或肽测定的样品中生物标志物的绝对或相对量或浓度。基于背景，生物标志物的水平可以指总体水平或生物体的某些子部分内或特定样品内的水平，作为非限制性实例，水平可以指尿液样品中生物标志物的量或浓度，或者水平可以指血浆样品中相同生物标志物的量或浓度。
“测量”或“量度”或者可选地“检测”或“侦测”是指确定临床或受试者来源的样品中任一给定物质的存在、不存在、数量或量(其可以是有效量)，包括此类物质的定性或定量浓度水平的推导，或以其他方式确定受试者临床参数的值或分类。
生物标志物的“参考水平”是指指示特定表型或特征的存在或不存在的生物标志物的水平。当受试者中生物标志物的水平高于生物标志物的参考水平时，其指示特定表型或特征的存在或相对升高的水平。当受试者中生物标志物的水平低于生物标志物的参考水平时，其指示特定表型或特征的缺乏或相对缺乏。
8.1其它解释性规则
除非另有说明，否则抗体恒定区残基编号是根据如Kabat中的EU索引。
范围：在整个本公开中，本发明的各个方面可以以范围形式呈现。范围包括所述的端点。应当理解，范围形式的描述仅仅是为了方便和简洁，而不应该被解释为对本发明范围的不可改变的限制。因此，应该认为范围的描述具体公开了该范围内的所有可能的子范围以及单个数值。例如，范围的描述如1至6应当认为具体公开了在该范围内的子范围，例如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等，以及单个数字，例如，1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。无论范围的广度如何，这都适用。
除非具体陈述或从上下文中显而易见，否则如本文所用的术语“或”理解为包括性的。
除非具体陈述或从上下文中显而易见，否则如本文所用的术语“一”、“一个”和“该”应理解为单数或复数的。也就是说，这里使用的冠词“一”和“一个”是指一个或多于一个(即至少一个)该冠词的语法对象。举例来说，“一元素”表示一个元素或多于一个元素。
在本公开中，“包含”、“包涵”、“含有”、“具有”、“包括”、“包括有”及其语言变体具有美国专利法中赋予它们的含义，其允许存在超出那些明确述及者以外的另外的组分。
除非特别说明或从上下文中显而易见，否则如本文所用的术语“约”应理解为在本领域的正常耐受范围内，例如在平均值的2个标准偏差内，并且意在包括所述值的±20％或±10％，更优选±5％，甚至更优选±1％，还更优选±0.1％的变化。
在报告抗体平衡解离常数(KD)的情况中，KD通过表面等离子体共振用固定在配体在其上流动的芯片表面上的抗体(或其抗原结合片段)测定。
8.2实验观察的总结
如下文实施例1中进一步描述的，在门诊治疗中心接受高剂量利尿剂治疗的连续性心力衰竭(consecutive heart failure)(“HF”)患者入组前瞻性观察研究。测量血浆IL-6水平以查询该促炎细胞因子与各种疾病参数的系统相关性，并测量尿液IL-6水平以查询IL-6与局部炎症和肾组织水平的神经激素激活的相关性。
血浆和尿液IL-6水平彼此仅适度相关。
在这些心力衰竭患者中，尿液IL-6水平的提高与肾损害的量度显著相关，如利尿剂抵抗、较低的估计肾小球滤过率(“eGFR”)和增加的组织水平肾素-血管紧张素-醛固酮系统(“RAAS”)激活。
虽然也观察到利尿效率和血浆IL-6之间的反相关，但在对于eGFR调整时，这些患者中仅尿液IL-6保持与低利尿效率的风险显著相关。此外，当尿液IL-6和血浆IL-6均进入逻辑回归模型时，仅尿液IL-6保持与低利尿效率的风险相关，而血浆IL-6未显示出这种相关性。
这些数据证明尿液IL-6水平是肾脏炎症的有用生物标志物，并且可用于在心力衰竭(心肾综合征)的情况下计量肾功能障碍。该数据进一步表明，尿液IL-6的系列测量可用于测量施用于心力衰竭患者的治疗的肾脏益处，特别是具有心肾综合征的心力衰竭患者。
尿液IL-6数据以及在某种程度上血浆IL-6数据预测IL-6拮抗剂的治疗应有效地减少心力衰竭患者的肾脏炎症，即治疗心肾综合征的症状。然而，由于感染通常是心力衰竭患者中急性失代偿的诱因，因此将抗细胞因子和其他免疫抑制疗法限制于那些可能对改善的肾和/或心脏功能有反应的心力衰竭患者是重要的。慢性IL-6拮抗剂治疗的成本也导致限制治疗于那些可能对改善的肾和/或心脏功能有反应的心力衰竭患者。
如下文实施例2中详述的，将实施例1中进行的分析扩展至129名患者。图1A是显示按照尿液IL-6的三分位数的利尿效率(“DE”)的条形图，证实了98个患者子集中观察到的尿液IL-6水平与利尿效率的反相关。图1B是显示这129名患者中按照血浆IL-6的三分位数的利尿效率(“DE”)的条形图，证实了血浆IL-6水平与利尿效率的反相关。
评估了129名患者中每一个的跨膜蛋白酶丝氨酸6(“TMPRSS6”)中rs855791单核苷酸多态性(“SNP”)处的基因型。TMPRSS6多肽，也称为Matriptase-2(MT2)，切割铁调素调节蛋白并抑制骨形态发生蛋白信号传导。rs855791(G2321A)SNP改变TMPRSS6蛋白质序列：人群中最高频率的等位基因(主要等位基因)是2321G，其编码736A；人群中最低频率的等位基因(次要等位基因)是2321A，其编码736V。
如图2A所示，仅在具有至少一个拷贝的TMPRSS6 rs855791SNP的主要等位基因的患者中，尿液IL-6水平与利尿效率呈负相关(图2A，右图，“AG+GG”)；在对于次要等位基因纯合的患者中，尿液IL-6水平与利尿效率不显著相关(图2A，左图，“AA”)。
如图2B所示，仅在具有至少一个拷贝的TMPRSS6 rs855791 SNP的主要等位基因的患者中，血浆IL-6水平与利尿效率呈负相关(图2B，右图，“AG+GG”)；在对于次要等位基因纯合的患者中，血浆IL-6水平与利尿效率不显著相关(图2B，左图，“AA”)。
这些数据表明，心力衰竭患者中的利尿剂抵抗(低利尿效率)可以用IL-6拮抗剂治疗，但仅在具有至少一个拷贝的TMPRSS6rs855791主要等位基因的那些患者中。
在与对于TMPRSS6 rs855791主要等位基因纯合的人细胞基因型上类似的小鼠M1CCD细胞中，IL-6的添加与离子转运蛋白，NKCC2、ENaC-β和NCC，的表达相关。这些离子转运蛋白的表达增加提供了IL-6介导的利尿剂抵抗的推定机制。并且因为不知道增加的表达与铁调素表达相关联，这些数据表明，即使在对于TMPRSS6rs855791次要等位基因纯合的患者中，IL-6拮抗作用也可有效治疗利尿剂抵抗。
来自不同心力衰竭患者群体的两个大型临床试验的数据的二次分析证实了利尿剂抵抗与IL-6水平的相关性(实施例5)，其与TMPRSS6 rs855791基因型无关(实施例6)，从而提供了在对于TMPRSS6 rs855791次要等位基因纯合的患者中IL-6拮抗作用也应有效治疗利尿剂抵抗的证据。
8.3治疗利尿剂抵抗的方法
因此，在第一方面，提供了用于治疗需要利尿但对利尿剂有抗性的患者的方法。该方法包括与利尿剂组合向患者施用治疗有效量的IL-6拮抗剂。
在某些实施方案中，患者具有升高的治疗前尿液IL-6水平。在一些实施方案中，患者具有升高的治疗前血浆IL-6水平。在某些实施方案中，患者具有升高的治疗前尿液和血浆IL-6水平。
在一些实施方案中，患者患有利尿剂抗性心力衰竭。在各种实施方案中，患者患有心肾综合征。
在一些实施方案中，确定患者具有至少一个拷贝的TMPRSS6rs855791主要等位基因。在其他实施方案中，患者对于TMPRSS6rs855791次要等位基因是纯合的。
8.3.1利尿效率
在本文所述的方法中，需要IL-6拮抗剂治疗的患者患有需要利尿的疾病或病症，并且是利尿剂抗性的。
在某些实施方案中，患者已经或正在用噻嗪类利尿剂如氯噻嗪
Figure BDA0002211791250000221
氯噻酮、氢氯噻嗪
Figure BDA0002211791250000222
吲达帕胺或美托拉宗治疗。在某些实施方案中，患者已经或正在用袢利尿剂如布美他尼
Figure BDA0002211791250000223
依他尼酸
Figure BDA0002211791250000224
呋塞米
Figure BDA0002211791250000225
或托拉塞米
Figure BDA0002211791250000226
治疗。在某些实施方案中，患者已经或正在用保钾利尿剂如阿米洛利、依普利酮
Figure BDA0002211791250000227
螺内酯
Figure BDA0002211791250000228
或三氨蝶呤
Figure BDA0002211791250000229
治疗。在一些实施方案中，患者已经或正在用超过一种利尿剂治疗。在一些实施方案中，患者已经或正在用多种不同类型的利尿剂治疗。
按照定义，对利尿剂有抗性的患者具有低利尿效率。利尿效率计算为每个袢利尿剂剂量加倍的钠输出增加，以40mg的IV呋塞米当量的剂量为中心：利尿效率＝(mmol Na输出)/(log2(施用的袢利尿剂剂量)-4.32)。参见Hanberg等，Circ.Heart Fail.2016；9：e003180，其公开内容通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，患者的利尿效率小于500，例如小于450、400、350、300、250或200。在一些实施方案中，患者的利尿效率小于200，例如，小于195、190、185、180、175、170、165、160、155或150。在一些实施方案中，患者的利尿效率小于150，例如小于145、140、135、125、120、110、105或100。在一些实施方案中，患者的利尿效率小于100，例如小于95、90、85、80、75、70、65、60、55或50。在特定实施方案中，患者的利尿效率小于50，例如小于45、40、35、30或甚至小于25、20、15或10。
在一些实施方案中，对利尿剂有抗性的患者需要每日不小于40mg的呋塞米(或当量)的利尿剂治疗。在这些实施方案的一些中，患者需要每日不小于80mg的呋塞米(或当量)的利尿剂治疗。在这些实施方案的一些中，患者需要每日不小于120mg的呋塞米(或当量)的利尿剂治疗。
8.3.2治疗前IL-6水平
8.3.2.1治疗前尿液IL-6水平
在某些实施方案中，患者具有超过5.0pg IL-6/g肌酐、6.0pg IL-6/g肌酐、7.0pgIL-6/g肌酐、8.0pg IL-6/g肌酐、9.0pg IL-6/g肌酐或10.0pg IL-6/g肌酐的治疗前尿液IL-6水平。在某些实施方案中，患者具有超过11.0pg IL-6/g肌酐、12.0pg IL-6/g肌酐、13.0pg IL-6/g肌酐、14.0pg IL-6/g肌酐或15.0pg IL-6/g肌酐的治疗前尿液IL-6水平。在进一步的实施方案中，患者具有超过16.0pg IL-6/g肌酐、17.0pg IL-6/g肌酐、18.0pg IL-6/g肌酐、19.0pg IL-6/g肌酐或20.0pg IL-6/g肌酐的治疗前尿液IL-6水平。在特定的实施方案中，患者具有超过21.0pg IL-6/g肌酐、22.0pg IL-6/g肌酐、23.0pg IL-6/g肌酐、24.0pg IL-6/g肌酐、25.0pg IL-6/g肌酐、26.0pg IL-6/g肌酐、27.0pgIL-6/g肌酐、28.0pgIL-6/g肌酐、29.0pg IL-6/g肌酐或甚至超过30.0pg IL-6/g肌酐的治疗前尿液IL-6水平。在某些实施方案中，患者具有超过35.0 Pg/g肌酐的治疗前尿液IL-6水平。
在某些实施方案中，患者具有超过14.2pg IL-6/g肌酐的治疗前尿液水平(“升高的尿液IL-6水平”)。在其它实施方案中，患者具有小于14.2pg IL-6/g肌酐的治疗前尿液水平。
在某些实施方案中，患者在用IL-6拮抗剂治疗之前和在用袢利尿剂治疗之前具有大于5.0pg IL-6/g肌酐、6.0pg IL-6/g肌酐、7.0pg IL-6/g肌酐、8.0pg IL-6/g肌酐、9.0pgIL-6/g肌酐或10.0pg IL-6/g肌酐的尿液IL-6水平。在这些实施方案的一些中，患者具有大于11.0pg IL-6/g肌酐、12.0pg IL-6/g肌酐、13.0pg IL-6/g肌酐、14.0pg IL-6/g肌酐或15.0pg IL-6/g肌酐的尿液IL-6水平。在进一步的实施方案中，患者在用IL-6拮抗剂治疗之前和在用袢利尿剂治疗之前具有大于16.0pg IL-6/g肌酐、17.0pg IL-6/g肌酐、18.0pgIL-6/g肌酐、19.0pgIL-6/g肌酐或20.0pg IL-6/g肌酐的尿液IL-6水平。在特定的实施方案中，患者具有大于21.0pg IL-6/g肌酐、22.0pg IL-6/g肌酐、23.0pg IL-6/g肌酐、24.0pgIL-6/g肌酐、25.0pg IL-6/g肌酐、26.0pg IL-6/g肌酐、27.0pg IL-6/g肌酐、28.0pg IL-6/g肌酐、29.0pg IL-6/g肌酐或甚至大于30.0pg IL-6/g肌酐的尿液IL-6水平。在某些实施方案中，患者在用IL-6拮抗剂治疗之前和在用袢利尿剂治疗之前具有大于35.0pg/g肌酐的尿液IL-6水平。
在某些实施方案中，患者在用IL-6拮抗剂治疗之前和在用袢利尿剂治疗之前具有大于14.2pg IL-6/g肌酐的尿液IL-6水平。在其它实施方案中，患者在用IL-6拮抗剂治疗之前和在用袢利尿剂治疗之前具有小于14.2pg IL-6/g肌酐的尿液IL-6水平。
8.3.2.2治疗前血浆IL-6水平
在各种实施方案中，患者具有升高的治疗前血浆IL-6水平。
在某些实施方案中，患者具有大于2.0pg/mL的治疗前血浆IL-6水平。在其它实施方案中，患者具有小于2.0pg/mL的治疗前血浆IL-6水平。
在某些实施方案中，患者具有大于1.0pg/ml、1.1pg/ml、1.2pg/ml、1.3pg/ml、1.4pg/ml、1.5pg/ml、1.6pg/ml、1.7pg/ml、1.8pg/ml、1.9pg/ml或2.0pg/ml的治疗前血浆IL-6水平。在某些实施方案中，患者具有大于2.1pg/ml、2.2pg/ml、2.3pg/ml、2.4pg/ml、2.5pg/ml、2.6pg/ml、2.7pg/ml、2.8pg/ml、2.9pg/ml或3.0pg/ml的治疗前血浆IL-6水平。在某些实施方案中，患者具有大于3.1pg/ml、3.2pg/ml、3.3pg/ml、3.4pg/ml、3.5pg/ml、3.6pg/ml、3.7pg/ml、3.8pg/ml或3.9pg/ml的治疗前血浆IL-6水平。
在一些实施方案中，患者具有大于2pg/mL的治疗前血浆IL-6水平，如大于3pg/mL、4pg/mL、5pg/mL、6pg/mL、8pg/mL、10pg/mL、15pg/mL或20pg/mL。在某些实施方案中，患者具有大于3pg/mL的治疗前血浆IL-6水平。在某些实施方案中，患者具有大于5pg/mL的治疗前血浆IL-6水平。在某些实施方案中，患者具有大于10pg/mL的治疗前血浆IL-6水平。
8.3.2.3治疗前IL-6水平的测量
可以使用本领域已知的任何标准分析来测定尿液、血浆和血清中IL-6的浓度。当在尿液中测量IL-6时，可以将其水平针对另一生物标志物(在某些实施方案中，尿肌酐)指数化(indexed)或标准化。
在特定的实施方案中，浓度使用MesoScale Discovery(MSD)平台(Meso Scalediagnostics，Gaithersburg，MD，USA)测量。
8.3.3心力衰竭
在本文所述方法的典型实施方案中，患者患有心力衰竭。
在某些实施方案中，患者患有NYHA功能性I类心力衰竭。在某些实施方案中，患者患有NYHA功能性II类心力衰竭。在某些实施方案中，患者患有NYHA功能性III类心力衰竭。在某些实施方案中，患者患有NYHA功能性IV类心力衰竭。
在某些实施方案中，患者患有急性心力衰竭。在某些实施方案中，患者患有慢性心力衰竭。
在某些实施方案中，患者患有选自以下表1的心力衰竭类型。
Figure BDA0002211791250000251
Figure BDA0002211791250000261
Figure BDA0002211791250000271
在某些实施方案中，患者患有心肾综合征。在特定的实施方案中，患者患有1型心肾综合征。在特定的实施方案中，患者患有2型心肾综合征。在特定的实施方案中，患者患有3型心肾综合征。在特定的实施方案中，患者患有4型心肾综合征。
在某些实施方案中，患者患有利尿剂抗性心力衰竭。在这些实施方案的某些中，心力衰竭患者具有低于100、95、90、85、80、75、70、65、60、55或50的利尿效率。在特定的实施方案中，患者具有低于45、40、35、30或甚至低于25、20、15或10的利尿效率。
8.3.4肾病
在本文所述方法的一些实施方案中，患者患有肾病。
在某些实施方案中，患者患有利尿剂抗性肾病。在这些实施方案的某一些中，肾病患者具有低于100、95、90、85、80、75、70、65、60、55或50的利尿效率。在特定的实施方案中，患者具有低于45、40、35、30或甚至低于25、20、15或10的利尿效率。
在特定的实施方案中，患者患有肝肾综合征。
8.3.5 TMPRSS6 rs855791基因型
在某些实施方案中，患者先前已确定具有至少一个拷贝的TMPRSS6 rs855791主要等位基因。在其它实施方案中，该方法还包括确定患者具有至少一个拷贝的TMPRSS6rs855791主要等位基因的较早步骤。
优选地，确定两个等位基因处的基因型，从而允许鉴定和区分对于TMPRSS6rs855791主要等位基因纯合的、对于主要和次要TMPRSS6 rs855791等位基因杂合的和对于TMPRSS6 rs855791次要等位基因纯合的患者。
使用标准技术测定TMPRSS6基因中SNP rs855791(2321G→A)的缺失(主要等位基因)或存在(次要等位基因)。
通常，PCR用于扩增从患者获得的生物样品。
在某些实施方案中，多态性的不存在或存在使用实时PCR(RT-PCR)用扩增同时检测。在某些实施方案中，RT-PCR测定使用5′核酸酶(
Figure BDA0002211791250000281
探针)、分子信标和/或FRET杂交探针。在Espy等，Clin.Microbiol.Rev.2006January；19(1)：165-256中综述，其全部内容通过引用并入本文。在典型的实施方案中，使用市售的测定法。在选择的实施方案中，市售测定法选自TaqManTM SNPGenotyping Assays(ThermoFisher)；PCR SNP GenotypingAssay(Qiagen)；Novallele Genotyping Assays(Canon)；和SNP TypeTM分析(之前的SNPtype)(Fluidigm)。
在某些实施方案中，多态性的不存在或存在使用与SNPrs855791特异性的探针的杂交进行扩增、限制性内切核酸酶消化、核酸测序、引物延伸、微阵列或基因芯片分析、质谱和/或DNA酶保护分析后检测。在某些实施方案中，等位基因变体通过测序调用。在某些实施方案中，使用Sanger测序。在某些实施方案中，使用多种下一代测序技术之一，包括例如选自微阵列测序、Solexa测序(Illumina)、Ion Torrent(Life Technologies)、SOliD(Applied Biosystems)、焦磷酸测序、单分子实时测序(Pacific Bio)、纳米孔测序和隧道电流测序的测序技术。
在某些实施方案中，多态性的不存在或存在使用下面实施例2中所示的程序检测。
8.3.6IL-6拮抗剂
用于本文所述方法的IL-6拮抗剂能够降低IL-6的生物活性。
8.3.6.1抗IL-6抗体
在某些实施方案中，IL-6拮抗剂是抗IL-6抗体或其抗原结合片段或衍生物。
在某些实施方案中，IL-6拮抗剂是全长抗IL-6单克隆抗体。在特定的实施方案中，全长单克隆抗体是IgG抗体。在某些实施方案中，全长单克隆抗体是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体。在某些实施方案中，IL-6拮抗剂是包含多种全长抗IL-6抗体种类的多克隆组合物，所述多种抗体中每一种具有独特的CDR。在某些实施方案中，IL-6拮抗剂是选自Fab、Fab′和F(ab′)2片段的抗体片段。在某些实施方案中，IL-6拮抗剂是scFv、二硫键连接的Fv(dsFv)或单结构域抗体，如骆驼来源的VHH单结构域纳米抗体。在某些实施方案中，IL-6拮抗剂是包含IL-6抗原结合片段的免疫缀合物或融合物。在某些实施方案中，抗体是双特异性或多特异性的，其中至少一个抗原结合部分对IL-6具有特异性。
在某些实施方案中，抗体是全人的。在某些实施方案中，抗体是人源化的。在某些实施方案中，抗体是嵌合的并且具有非人V区和人C区结构域。在某些实施方案中，抗体是鼠的。
在典型的实施方案中，抗IL-6抗体对于结合人IL-6的KD低于100nM。在某些实施方案中，抗IL-6抗体对于结合人IL-6的KD低于75nM、50nM、25nM、20nM、15nM或10nM。在特定的实施方案中，抗IL-6抗体对于结合人IL-6的KD低于5nM、4nM、3nM或2nM。在选择的实施方案中，抗IL-6抗体对于结合人IL-6的KD低于1nM、750pM或500pM。在具体的实施方案中，抗IL-6抗体对于结合人IL-6的KD不大于500pM、400pM、300pM、200pM或100pM。
在典型的实施方案中，抗IL-6抗体中和IL-6的生物活性。在某些实施方案中，中和抗体阻止IL-6与IL-6受体的结合。
在典型的实施方案中，抗IL-6抗体在静脉内施用后具有至少7天的消除半衰期。在某些实施方案中，抗IL-6抗体具有至少14天、至少21天或至少30天的消除半衰期。
在某些实施方案中，抗IL-6抗体具有含至少一个氨基酸置换人IgG恒定区，其与未置换的人IgG恒定结构域相比延长血清半衰期。
在某些实施方案中，IgG恒定结构域在残基252、254和256处包含置换，其中氨基酸残基252处的氨基酸置换是酪氨酸的置换，氨基酸残基254处的氨基酸置换是苏氨酸的置换，并且氨基酸残基256处的氨基酸置换是谷氨酸的置换(“YTE”)。参见美国专利号7,083,784，其全部内容通过引用并入本文。在某些延长的半衰期的实施方案中，IgG恒定结构域包含选自T250Q/M428L(Hinton等，J.Immunology 176：346-356(2006))；N434A(Yeung等，J.Immunology182：7663-7671(2009))；或T307A/E380A/N434A(Petkova等，InternationalImmunology，18：1759-1769(2006))的置换。
在某些实施方案中，抗IL-6抗体的消除半衰期通过利用人血清白蛋白的FcRN结合特性增加。在某些实施方案中，抗体与白蛋白缀合(Smith等，Bioconjug.Chem.，12：750-756(2001))。在某些实施方案中，抗IL-6抗体与细菌白蛋白结合结构域融合(Stork等，Prot.Eng.Design Science 20：569-76(2007))。在某些实施方案中，抗IL-6抗体与白蛋白结合肽融合(Nguygen等，Prot Eng Design Sel 19：291-297(2006))。在某些实施方案中，抗IL抗体是双特异性的，一种特异性针对IL-6和一种特异性针对人血清白蛋白(Ablynx，WO2006/122825(双特异性纳米抗体))。
在某些实施方案中，抗IL-6抗体的消除半衰期通过PEG化(Melmed等，NatureReviews Drug Discovery 7：641-642(2008))；通过HPMA共聚物缀合(Lu等，NatureBiotechnology17：1101-1104(1999))；通过葡聚糖缀合(Nuclear MedicineCommunications，16：362-369(1995))；通过与同型氨基酸聚合物的缀合(HAPs；HAPylation)(Schlapschy等，Prot Eng Design Sel 20：273-284(2007))；或通过聚唾液酸化(Constantinou等，Bioconjug.Chem.20：924-931(2009))增加。
8.3.6.1.1 MEDI5117和衍生物
在某些实施方案中，抗IL-6抗体或其抗原结合部分包含MEDI5117的全部六个CDR。在特定的实施方案中，抗体或其抗原结合部分包含MEDI5117重链V区和轻链V区。在具体的实施方案中，抗体是全长MEDI5117抗体。MEDI5117抗体描述于WO2010/088444和US2012/0034212中，其公开内容通过引用整体并入本文。MEDI5117抗体具有以下CDR及重链和轻链序列：
MEDI5117 VH CDR1
Figure BDA0002211791250000311
MEDI5117 VH CDR2
Figure BDA0002211791250000312
MEDI5117 VH CDR3
Figure BDA0002211791250000313
MEDI5117 VL CDR1
Figure BDA0002211791250000314
MEDI5117 VL CDR2
Figure BDA0002211791250000315
MEDI5117 VL CDR3
Figure BDA0002211791250000316
MEDI5117重链
Figure BDA0002211791250000317
MEDI5117轻链
Figure BDA0002211791250000318
在某些实施方案中，抗IL-6抗体是MED5117的衍生物。
在某些实施方案中，MED5117衍生物包含MED5117重链和/或轻链V区中的一个或多个氨基酸置换。
在某些实施方案中，衍生物相对于MEDI5117抗IL-6抗体的原始VH和/或VL包含少于25个氨基酸置换、少于20个氨基酸置换、少于15个氨基酸置换、少于10个氨基酸置换、少于5个氨基酸置换、少于4个氨基酸置换、少于3个氨基酸置换、少于2个氨基酸置换或1个氨基酸置换，同时保留对人IL-6的特异性。
在某些实施方案中，MED5117衍生物包含与MEDI5117的VH和VL结构域的氨基酸序列至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同的氨基酸序列。序列百分同一性采用BLAST算法使用默认参数确定。
在某些实施方案中，MED5117衍生物包含的氨基酸序列中，CDR包含与MEDI5117的相应CDR的氨基酸序列至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同的氨基酸序列。序列百分同一性采用BLAST算法使用默认参数确定。
在某些实施方案中，VH和/或VL CDR衍生物包含在一个或多个预测的非关键氨基酸残基(即，对抗体特异性结合人IL-6非关键的氨基酸残基)处的保守氨基酸置换。
8.3.6.1.2其它抗IL-6抗体
在某些实施方案中，抗IL-6抗体包含来自选自下组的抗体的六个CDR：司妥昔单抗、gerilimzumab、sirukumab、clazakizumab、olokizumab、elsilimomab、VX30(VOP-R003；Vaccinex)、EB-007(EBI-029；Eleven Bio)、ARGX-109(ArGEN-X)、FM101(FemtaPharmaceuticals，Lonza)和ALD518/BMS-945429(Alder Biopharmaceuticals，Bristol-Myers Squibb)。在某些实施方案中，抗IL-6抗体包含来自选自下组的抗体的重链V区和轻链V区：司妥昔单抗、gerilimzumab、sirukumab、clazakizumab、olokizumab、elsilimomab、VX30(VOP-R003；Vaccinex)、EB-007(EBI-029；Eleven Bio)、ARGX-109(ArGEN-X)、FM101(Femta Pharmaceuticals，Lonza)和ALD518/BMS-945429(Alder Biopharmaceuticals，Bristol-Myers Squibb)。在特定的实施方案中，抗IL-6抗体是选自司妥昔单抗、gerilimzumab、sirukumab、clazakizumab、olokizumab、elsilimomab、VX30(VOP-R003；Vaccinex)、EB-007(EBI-029；Eleven Bio)、ARGX-109(ArGEN-X)、FM101(FemtaPharmaceuticals，Lonza)和ALD518/BMS-945429(Alder Biopharmaceuticals，Bristol-Myers Squibb)的抗体。
在某些实施方案中，抗IL-6抗体包含来自选自US 2016/0168243、US 2016/0130340、US 2015/0337036、US 2015/0203574、US 2015/0140011、US 2015/0125468、US2014/0302058、US 2014/0141013、US 2013/0280266、US 2013/0017575、US 2010/0215654、US 2008/0075726、US专利No.5，856，135、US 2006/0240012、US 2006/0257407或U.S.专利No.7291721中所描述的那些的抗体的六个CDR，其公开内容整体通过引用并入本文。
8.3.6.2抗IL-6受体抗体
在某些实施方案中，IL-6拮抗剂是抗IL-6受体抗体或其抗原结合片段或衍生物。
在某些实施方案中，IL-6拮抗剂是全长抗IL-6受体单克隆抗体。在特定的实施方案中，全长单克隆抗体是IgG抗体。在某些实施方案中，全长单克隆抗体是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体。在某些实施方案中，IL-6拮抗剂是包含多种全长抗IL-6受体抗体种类的多克隆组合物，所述多种抗体中每一种都具有独特的CDR。在某些实施方案中，IL-6拮抗剂是选自Fab和Fab′片段的抗体片段。在某些实施方案中，IL-6拮抗剂是scFv、单结构域抗体，包括骆驼来源的VHH单结构域纳米抗体。在某些实施方案中，抗体是双特异性或多特异性的，其中至少一个抗原结合部分对IL-6R具有特异性。
在某些实施方案中，抗体是全人的。在某些实施方案中，抗体是人源化的。在某些实施方案中，抗体是嵌合的并且具有非人V区和人C区结构域。在某些实施方案中，抗体是鼠的。
在典型的实施方案中，抗IL-6受体抗体对于结合人IL-6R的KD低于100nM。在某些实施方案中，抗IL-6R抗体对于结合人IL-6R的KD低于75nM、50nM、25nM、20nM、15nM或10nM。在特定的实施方案中，抗IL-6受体抗体对于结合人IL-6R的KD低于5nM、4nM、3nM或2nM。在选择的实施方案中，抗IL-6受体抗体对于结合人IL-6R的KD低于1nM、750pM或500pM。在具体的实施方案中，抗IL-6受体抗体对于结合人IL-6R的KD不大于500pM、400pM、300pM、200pM或100pM。
在典型的实施方案中，抗IL-6R降低IL-6的生物活性。
在典型的实施方案中，抗IL-6R抗体在静脉内施用后具有至少7天的消除半衰期。在某些实施方案中，抗IL-6R抗体具有至少14天、至少21天或至少30天的消除半衰期。
在某些实施方案中，抗IL-6R抗体具有含至少一个氨基酸置换人IgG恒定区，其与未置换的人IgG恒定结构域相比延长血清半衰期。
在某些实施方案中，IgG恒定结构域在残基252、254和256处包含置换，其中氨基酸残基252处的氨基酸置换是酪氨酸的置换，氨基酸残基254处的氨基酸置换是苏氨酸的置换，并且氨基酸残基256处的氨基酸置换是谷氨酸的置换(“YTE”)。参见美国专利号7,083,784，其全部内容通过引用并入本文。在某些延长的半衰期的实施方案中，IgG恒定结构域包含选自T250Q/M428L(Hinton等，J.Immunology 176：346-356(2006))；N434A(Yeung等，J.Immunology182：7663-7671(2009))；或T307A/E380A/N434A(Petkova等，InternationalImmunology，18：1759-1769(2006))的置换。
在某些实施方案中，抗IL-6R抗体的消除半衰期通过利用人血清白蛋白的FcRN结合特性增加。在某些实施方案中，抗体与白蛋白缀合(Smith等，Bioconjug.Chem.，12：750-756(2001))。在某些实施方案中，抗IL-6R抗体与细菌白蛋白结合结构域融合(Stork等，Prot.Eng.Design Science 20：569-76(2007))。在某些实施方案中，抗IL-6抗体与白蛋白结合肽融合(Nguygen等，Prot Eng Design Sel 19：291-297(2006))。在某些实施方案中，抗IL抗体是双特异性的，一种特异性针对IL-6R，和一种特异性针对人血清白蛋白(Ablynx，WO2006/122825(双特异性纳米抗体))。
在某些实施方案中，抗IL-6R抗体的消除半衰期通过PEG化(Melmed等，NatureReviews Drug Discovery 7：641-642(2008))；通过HPMA共聚物缀合(Lu等，NatureBiotechnology 17：1101-1104(1999))；通过葡聚糖缀合(Nuclear MedicineCommunications，16：362-369(1995))；通过与同型氨基酸聚合物的缀合(HAPs；HAPylation)(Schlapschy等，Prot Eng Design Sel 20：273-284(2007))；或通过聚唾液酸化(Constantinou等，Bioconjug.Chem.20：924-931(2009))增加。
在某些实施方案中，抗IL-6R抗体或其抗原结合部分包含托珠单抗的全部六个CDR。在特定的实施方案中，抗体或其抗原结合部分包含托珠单抗重链V区和轻链V区。在具体的实施方案中，抗体是全长托珠单抗抗体。
在某些实施方案中，抗IL-6R抗体或其抗原结合部分包含sarilumab的全部六个CDR。在特定的实施方案中，抗体或其抗原结合部分包含sarilumab重链V区和轻链V区。在具体的实施方案中，抗体是全长sarilumab抗体。
在某些实施方案中，抗IL-6R抗体或其抗原结合部分包含VX30(Vaccinex)、ARGX-109(arGEN-X)、FM101(Formatech)、SA237(Roche)、NI-1201(NovImmune)或US 2012/0225060中描述的抗体的全部六个CDR。
在某些实施方案中，抗IL-6R抗体或其抗原结合部分是单结构域抗体。在特定的实施方案中，单结构域抗体是骆驼VHH单结构域抗体。在具体的实施方案中，抗体是vobarilizumab(ALX-0061)(Ablynx NV)。
8.3.6.3抗IL-6：IL-6R复合物抗体
在某些实施方案中，L-6拮抗剂是对于IL-6和IL-6R的复合物特异性的抗体。在某些实施方案中，抗体具有选自US 2011/0002936中所述的那些的抗体的六个CDR，其通过引用整体并入本文。
8.3.6.4 JAK和STAT抑制剂
IL-6已知通过JAK-STAT途径发信号。
在某些实施方案中，IL-6拮抗剂是JAK信号传导途径的抑制剂。在某些实施方案中，JAK抑制剂是JAK1-特异性抑制剂。在某些实施方案中，JAK抑制剂是JAK3-特异性抑制剂。在某些实施方案中，JAK抑制剂是泛-JAK抑制剂。
在某些实施方案中，JAK抑制剂选自托法替尼(Xeljanz)、decernotinib、鲁索替尼、upadacitinib、巴瑞替尼、filgotinib、来他替尼、pacritinib、peficitinib、INCB-039110、ABT-494、INCB-047986和AC-410。
在某些实施方案中，IL-6拮抗剂是STAT3抑制剂。在具体的实施方案中，抑制剂是AZD9150(AstraZeneca，Isis Pharmaceuticals)，一种STAT3反义分子。
8.3.6.5另外的IL-6拮抗剂
在某些实施方案中，IL-6拮抗剂是拮抗剂肽。
在某些实施方案中，IL-6拮抗剂是C326(Avidia的IL-6拮抗剂，也称为AMG220)或FE301(一种IL-6的重组蛋白质抑制剂)(FerringIntemational Center S.A.，ConarisResearch Institute AG)。在某些实施方案中，抗IL-6拮抗剂包含可溶性gp130，FE301(Conaris/Ferring)。
8.3.7剂量方案
8.3.7.1抗体、抗原结合片段、肽
在典型的实施方案中，抗体/抗原结合片段和肽IL-6拮抗剂肠胃外施用。
在一些肠胃外实施方案中，IL-6拮抗剂静脉内施用。在某些静脉内实施方案中，IL-6拮抗剂以推注形式施用。在某些静脉内实施方案中，IL-6拮抗剂作为输注施用。在某些静脉内实施方案中，IL-6拮抗剂以推注然后输注施用。在一些肠胃外实施方案中，IL-6拮抗剂皮下施用。
在某些实施方案中，抗体、抗原结合片段或肽IL-6拮抗剂以与患者体重或表面积无关的剂量(固定剂量(flat dose))施用。
在某些实施方案中，静脉内固定剂量是1mg、2mg、3mg、4mg、5mg、6mg、7mg、8mg、9mg或10mg。在某些实施方案中，静脉内固定剂量是11mg、12mg、13mg、14mg、15mg、16mg、17mg、18mg、19mg或20mg。在某些实施方案中，静脉内固定剂量是25mg、30mg、40mg或50mg。在某些实施方案中，静脉内固定剂量是60mg、70mg、80mg、90mg或100mg。在某些实施方案中，静脉内固定剂量是1-10mg、10-15mg、15-20mg、20-30mg、30-40mg或40-50mg。在某些实施方案中，静脉内固定剂量是1-40mg或50-100mg。
在某些实施方案中，皮下固定剂量是10mg、20mg、30mg、40mg、50mg、60mg、70mg、80mg、90mg或100mg。在某些实施方案中，皮下固定剂量是110mg、120mg、130mg、140mg、150mg、160mg、170mg、180mg、190mg或200mg。在某些实施方案中，皮下固定剂量是210mg、220mg、230mg、240mg或250mg。在某些实施方案中，皮下固定剂量是10-100mg、100-200mg或200-250mg。在某些实施方案中，皮下固定剂量是10-20mg、20-30mg、30-40mg、40-50mg、50-60mg、60-70mg、70-80mg、80-90mg或90-100mg。在某些实施方案中，皮下固定剂量是100-125mg、125-150mg、150-175mg、175-200mg或200-250mg。
在某些实施方案中，抗体、抗原结合片段或肽IL-6拮抗剂作为基于患者体重的剂量施用。
在某些实施方案中，拮抗剂以0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.3mg/kg、0.4mg/kg、0.5mg/kg、0.6mg/kg、0.7mg/kg、0.8mg/kg、0.9mg/kg或1.0mg/kg的静脉内剂量施用。在某些实施方案中，拮抗剂以1.5mg/kg、2mg/kg、2.5mg/kg、3mg/kg、3.5mg/kg、4mg/kg、4.5mg/kg或5mg/kg的剂量施用。
在某些实施方案中，基于体重的皮下剂量是0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.3mg/kg、0.4mg/kg、0.5mg/kg、0.6mg/kg、0.7mg/kg、0.8mg/kg、0.9mg/kg或1.0mg/kg。在某些实施方案中，拮抗剂以1.5mg/kg、2mg/kg、2.5mg/kg、3mg/kg、3.5mg/kg、4mg/kg、4.5mg/kg或5mg/kg的剂量施用。
在各种静脉内实施方案中，IL-6拮抗剂每7天施用一次，每14天施用一次，每21天施用一次，每28天施用一次，或每月施用一次。在各种皮下实施方案中，IL-6拮抗剂每14天施用一次，每28天施用一次，每月施用一次，每两个月施用一次(每隔一个月一次)，或每三个月施用一次。
在某些优选的实施方案中，IL-6拮抗剂是MEDI5117抗体。在某些实施方案中，MEDI5117每周一次以1-30mg IV的固定剂量施用。在某些实施方案中，MEDI5117抗体每周一次以1、2、3、4、5、7.5、10、15、20、25或30mg IV的固定剂量施用。在某些实施方案中，MEDI5117抗体每月一次至每三个月一次以25-250mg s.c.的固定剂量施用。在特定的实施方案中，MEDI5117每月一次、每两个月一次或每3个月一次以30mg、45mg、60mg、75mg、100mg、120mg、125mg、150mg、175mg、200mg、225mg、240mg或250mgs.c.的剂量施用。
在某些实施方案中，IL-6拮抗剂是托珠单抗。在某些实施方案中，托珠单抗每周一次对于≥100kg的患者以162mg的起始剂量s.c.施用。在某些实施方案中，托珠单抗每4周一次以4mg/kg的剂量静脉内施用，然后基于临床反应每4周增加至8mg/kg。
8.3.7.2 JAK和STAT抑制剂
在典型的实施方案中，小分子JAK抑制剂和STAT抑制剂口服施用。
在某些实施方案中，抑制剂每天一次或两次以1-10mg、10-20mg、20-30mg、30-40mg或40-50mg的口服剂量施用。在某些实施方案中，抑制剂每天一次或两次以50-60mg、60-70mg、70-80mg、80-90mg或90-100mg的剂量施用。在某些实施方案中，抑制剂一天一次或两次以5、10、15、20、25、30、35、40、45或50mg PO的剂量施用。在某些实施方案中，抑制剂以75mg PO QD或BID，100mg PO QD或BID的剂量施用。
在某些实施方案中，JAK抑制剂是托法替尼，且以5mg PO BID或11mg PO qDay的剂量施用。
在某些实施方案中，JAK抑制剂是decernotinib，且以25mg、50mg、100mg或150mgPO BID的剂量施用。
在某些实施方案中，抑制剂是鲁索替尼，且以25mg PO BID，20mg PO BID，15mg POBID，10mg PO BID或5mg PO BID的剂量施用。
8.3.7.3治疗目标
在某些实施方案中，IL-6拮抗剂以足以增加利尿效率的剂量、时间表和时间段施用。在这些实施方案的某些中，IL-6拮抗剂以足以使利尿效率增加至正常水平的剂量、时间表和时间段施用。
在某些实施方案中，IL-6拮抗剂以足以增加eGFR的剂量、时间表和时间段施用，并且在这些实施方案的某些中，IL-6拮抗剂以足以使eGFR增加至正常水平的剂量、时间表和时间段施用。
8.3.7.4 IL-6水平监测
在某些实施方案中，可以通过测量来自患者的尿液或血浆样品中IL-6的水平来监测IL-6拮抗剂治疗对心肾参数的影响。特别考虑的是，本发明的方法可用于监测心肾综合征的治疗功效，且可促进例如剂量或治疗的变化。
因此，在某些实施方案中，该方法还包括测定尿液、血浆或尿液和血浆两者中IL-6水平的后续步骤。在这些实施方案的某些中，该方法还包括基于紧接前一步骤中测定的IL-6水平调节IL-6拮抗剂的至少一次后续施用的剂量的最终步骤。
8.3.8另外的治疗剂
在本文所述方法的某些实施方案中，该方法还包括施用除IL-6拮抗剂之外的至少一种治疗剂，其中另外的治疗剂治疗心力衰竭的一种或多种心血管或肾脏症状。具体治疗将由主治医师根据个案具体情况确定。
8.3.8.1标准心力衰竭药剂
在某些实施方案中，另外的治疗剂是利尿剂。
在特定的实施方案中，利尿剂是袢利尿剂。在选择的实施方案中，袢利尿剂选自呋塞米、托拉塞米、布美他尼和依地尼酸。在特定的实施方案中，袢利尿剂是呋塞米。在某些实施方案中，呋塞米口服施用。在某些实施方案中，呋塞米静脉内施用。在某些实施方案中，利尿剂是噻嗪类利尿剂。在特定的实施方案中，噻嗪类利尿剂是氯噻嗪、氢氯噻嗪、氯噻酮、吲达帕胺或美托拉宗。在某些实施方案中，利尿剂是保钾利尿剂。
在某些实施方案中，另外的治疗剂是ACE抑制剂。在某些实施方案中，ACE抑制剂选自苯那普利、卡托普利、依那普利、福辛普利、赖诺普利、莫西普利、培哚普利、喹那普利、雷米普利和群多普利。
在某些实施方案中，另外的治疗剂是血管紧张素受体阻断剂(“ARB”)。在某些实施方案中，ARB是依普沙坦、奥美沙坦、缬沙坦、替米沙坦、氯沙坦、阿齐沙坦酯、坎地沙坦或厄贝沙坦。
在某些实施方案中，另外的治疗剂是β-阻滞剂、钙拮抗剂或盐皮质激素受体拮抗剂。
在某些实施方案中，另外的治疗剂是利尿钠肽，例如B型利尿钠肽或N-末端pro-B型利尿钠肽。
在某些实施方案中，另外的治疗剂是腺苷拮抗剂，例如rolofylline。
具体治疗由主治医师根据个案情况确定。
8.3.8.2硝酰基供体
在某些实施方案中，另外的治疗剂是硝酰基供体，并且该方法还包括施用治疗有效量的硝酰基供体。
在特定的实施方案中，硝酰基供体选自美国专利No.9,499,511；9,487,498；9,464,061；9,458,127；9,221,780；9,181,213；9,156,804；9,115,064；9,018,411；8,987,326；RE45,314；8,674,132；8,227,639；和8,030,356的一个或多个中描述的化合物，其公开内容通过引用整体并入本文。
在选择的实施方案中，硝酰基供体选自美国专利No.RE45,314中所描述的化合物。在具体的实施方案中，硝酰基供体选自美国专利No.9,156,804中所描述的化合物。
8.3.8.3无钠氯化物补充
在某些实施方案中，另外的治疗剂是无钠氯化物盐。在某些实施方案中，该药剂是赖氨酸氯化物。
8.4改善心力衰竭治疗的方法
在另一个方面，提供了通过中断无效的治疗来改善心力衰竭治疗的方法，从而减少副作用并降低成本而不损失治疗功效。该方法包括停止向患有心力衰竭的患者施用IL-6拮抗剂，其中患者已经确定对于TMPRSS6 rs855791次要等位基因是纯合的。在一系列实施方案中，患者先前已确定对于TMPRSS6 rs855791次要等位基因是纯合的。在另一系列实施方案中，该方法还包括确定患者对于TMPRSS6rs855791次要等位基因是纯合的较早步骤。
在某些实施方案中，患者的治疗前尿液IL-6水平升高。在某些实施方案中，患者的治疗前血浆IL-6水平升高。在某些实施方案中，患者的治疗前尿液IL-6水平升高并且治疗前血浆IL-6水平升高。
在特定的实施方案中，患者患有心肾综合征。
8.5诊断、预后和治疗指导方法
在另一个方面，提供了用于确定受试者是否将受益于心力衰竭的IL-6拮抗剂治疗的方法。该方法包括测量来自受试者的尿液样品或血浆样品中的IL-6水平，将测量的IL-6水平与预定参考水平进行比较，并确定测量的IL-6水平是否大于相应的参考水平，其中当测量的IL-6水平大于相应的参考水平时，推荐IL-6拮抗剂治疗。
可以根据上文6.3.2.3节中所述的方法在血浆或尿液中测量IL-6。尿液和血浆中IL-6的参考水平可以通过测量参照群体中的IL-6水平来确定。本领域技术人员能够基于临床经验和来自群体的样品中生物标志物的常见水平来确定群体中生物标志物水平的参考水平。
在进一步的方面中，提供了采用上述方法用于确定受试者是否需要肾小球滤过受损、低利尿效率、高尿液血管紧张素、高血浆肾素的IL-6拮抗剂治疗或者由于心肾综合征而具有死亡风险的方法。如图3所示和在下文的实施例1中讨论的，尿液或血浆中的高IL-6水平与这些参数相关。
8.6试剂盒
在进一步的方面，提供了试剂盒。通常，试剂盒将包含适用于检测感兴趣的生物标志物的存在的检测试剂和根据本发明的方法使用的说明书。试剂盒可包含能够结合IL-6的抗体或其他免疫组织化学试剂。该试剂盒可含有捕获和检测抗体，其适于进行用于测量尿液或血浆中的IL-6的ELISA。在某些实施方案中，试剂盒可以含有用于制备用于ELISA的尿液和血浆样品，或用于将尿液中的IL-6针对另一种生物标志物的浓度进行指数化的工具和试剂，在某些实施方案中，IL-6针对肌酐指数化。
8.7进一步的实施方案
进一步的实施方案在以下编号的实施方案中提供。
1.一种治疗心力衰竭的方法，包括：
向患有心力衰竭的患者施用治疗有效量的IL-6拮抗剂，
其中所述患者确定为具有至少一个拷贝的TMPRSS6 rs855791主要等位基因。
2.如实施方案1的方法，其中所述患者之前确定为具有至少一个拷贝的TMPRSS6rs855791主要等位基因。
3.如实施方案1的方法，进一步包括以下较早步骤：
确定所述患者具有至少一个拷贝的TMPRSS6 rs855791主要等位基因。
4.如实施方案1-3任一项的方法，其中所述患者具有升高的治疗前尿液IL-6水平。
5.如实施方案1-4任一项的方法，其中所述患者具有升高的治疗前血浆IL-6水平。
6.如实施方案1-5任一项的方法，其中所述患者患有急性心力衰竭。
7.如实施方案1-5任一项的方法，其中所述患者患有慢性心力衰竭。
8.如实施方案1-7任一项的方法，其中所述患者患有心肾综合征。
9.如实施方案8的方法，其中所述患者患有4型心肾综合征。
10.如实施方案1-9任一项的方法，其中所述患者患有利尿剂抗性心力衰竭。
11.如实施方案10的方法，其中所述患者的利尿效率低于95。
12.如实施方案11的方法，其中所述患者的利尿效率低于90。
13.如实施方案12的方法，其中所述患者的利尿效率低于85。
14.如实施方案13的方法，其中所述患者的利尿效率低于80。
15.如实施方案14的方法，其中所述患者的利尿效率低于75。
16.如实施方案15的方法，其中所述患者的利尿效率低于70。
17.如实施方案16的方法，其中所述患者的利尿效率低于65。
18.如实施方案1-17任一项的方法，其中所述患IL-6拮抗剂是抗IL-6抗体或者其抗原结合片段或衍生物。
19.如实施方案18的方法，其中所述抗IL-6抗体或者抗原结合片段或衍生物对于结合人IL-6具有小于100nM的KD。
20.如实施方案19的方法，其中所述抗IL-6抗体或者抗原结合片段或衍生物对于结合人IL-6具有小于50nM的KD。
21.如实施方案20的方法，其中所述抗IL-6抗体或者抗原结合片段或衍生物对于结合人IL-6具有小于10nM的KD。
22.如实施方案21的方法，其中所述抗IL-6抗体或者抗原结合片段或衍生物对于结合人IL-6具有小于1nM的KD。
23.如实施方案18-22任一项的方法，其中所述抗IL-6抗体或者抗原结合片段或衍生物在静脉内施用后具有至少7天的消除半衰期。
24.如实施方案23的方法，其中所述抗IL-6抗体或者抗原结合片段或衍生物在静脉内施用后具有至少14天的消除半衰期。
25.如实施方案24的方法，其中所述抗IL-6抗体或者抗原结合片段或衍生物在静脉内施用后具有至少21天的消除半衰期。
26.如实施方案25的方法，其中所述抗IL-6抗体或者抗原结合片段或衍生物在静脉内施用后具有至少30天的消除半衰期。
27.如实施方案18-26任一项的方法，其中所述IL-6拮抗剂是全长单克隆抗IL-6抗体。
28.如实施方案27的方法，其中所述抗体是IgG1或IgG4抗体。
29.如实施方案28的方法，其中所述抗体是IgG1抗体。
30.如实施方案18-29任一项的方法，其中所述抗IL-6抗体或者抗原结合片段或衍生物是全人的。
31.如实施方案18-29任一项的方法，其中所述抗IL-6抗体或者抗原结合片段或衍生物是人源化的。
32.如实施方案18-31任一项的方法，其中所述抗IL-6抗体或者抗原结合片段或衍生物包含MED5117的所有六个可变区CDR。
33.如实施方案32的方法，其中所述抗体包含MED5117的VH和VL。
34.如实施方案33的方法，其中所述抗体是MED5117。
35.如实施方案18-31任一项的方法，其中所述抗IL-6抗体或者抗原结合片段或衍生物包含选自下组的抗体的所有六个可变区CDR：司妥昔单抗、gerilimzumab、sirukumab、clazakizumab、olokizumab、elsilimomab、VX30(VOP-R003；Vaccinex)、EB-007(EBI-029；Eleven Bio)、ARGX-109(ArGEN-X)、FM101(Femta Pharmaceuticals，Lonza)和ALD518/BMS-945429(Alder Biopharmaceuticals，Bristol-Myers Squibb)。
36.如实施方案35的方法，其中所述抗IL-6抗体或者抗原结合片段或衍生物包含选自下组的抗体的重链V区和轻链V区：司妥昔单抗、gerilimzumab、sirukumab、clazakizumab、olokizumab、VX30(VOP-R003；Vaccinex)、EB-007(EBI-029；Eleven Bio)、ARGX-109(ArGEN-X)、FM101(Femta Pharmaceuticals，Lonza)和ALD518/BMS-945429(AlderBiopharmaceuticals，Bristol-Myers Squibb)。
37.如实施方案36的方法，其中所述抗IL-6抗体或者抗原结合片段或衍生物是选自下组的抗体：司妥昔单抗、gerilimzumab、sirukumab、clazakizumab、olokizumab、VX30(VOP-R003；Vaccinex)、EB-007(EBI-029；Eleven Bio)、ARGX-109(ArGEN-X)、FM101(FemtaPharmaceuticals，Lonza)和ALD518/BMS-945429(Alder Biopharmaceuticals，Bristol-Myers Squibb)。
38.如实施方案18-26任一项的方法，其中所述IL-6拮抗剂是单结构域抗体、VHH纳米抗体、Fab或scFv。
39.如实施方案1-17任一项的方法，其中所述IL-6拮抗剂是抗IL-6R抗体或其抗原结合片段或衍生物。
40.如实施方案39的方法，其中所述抗IL-6R抗体、抗原结合片段或衍生物包含托珠单抗的6个CDR。
41.如实施方案39的方法，其中所述抗IL-6R抗体、抗原结合片段或衍生物包含vobarilizumab的6个CDR。
42.如实施方案1-17任一项的方法，其中所述IL-6拮抗剂是JAK抑制剂。
43.如实施方案42的方法，其中所述JAK抑制剂选自托法替尼(Xeljanz)、decernotinib、鲁索替尼、upadacitinib、巴瑞替尼、filgotinib、来他替尼、pacritinib、peficitinib、INCB-039110、ABT-494、INCB-047986和AC-410。
44.如实施方案1-17任一项的方法，其中所述IL-6拮抗剂是STAT3拮抗剂。
45.如实施方案18-41任一项的方法，其中所述IL-6拮抗剂肠胃外施用。
46.如实施方案45的方法，其中所述IL-6拮抗剂皮下施用。
47.如实施方案42或43的方法，其中所述IL-6拮抗剂口服施用。
48.如实施方案1-47任一项的方法，其中所述IL-6拮抗剂以足以增加利尿效率的剂量、时间表和时间段施用。
49.如实施方案48的方法，其中所述IL-6拮抗剂以足以增加利尿效率至正常水平的剂量、时间表和时间段施用。
50.如实施方案1-49任一项的方法，其中所述IL-6拮抗剂以足以增加eGFR的剂量、时间表和时间段施用。
51.如实施方案50的方法，其中所述IL-6拮抗剂以足以增加eGFR至正常水平的剂量、时间表和时间段施用。
52.如实施方案1-51任一项的方法，还包括测定尿液中IL-6水平的后续步骤。
53.如实施方案1-51任一项的方法，还包括测定血浆中IL-6水平的后续步骤。
54.如实施方案1-51任一项的方法，还包括测定尿液和血浆中IL-6水平的后续步骤。
55.如实施方案52-54任一项的方法，进一步包括基于在紧接前一步骤中测定的IL-6水平调节用于后续施用的IL-6拮抗剂剂量的最终步骤。
56.一种确定受试者是否需要心肾综合征的治疗的方法，该方法包括：
a)测量来自受试者的尿液或血浆样品中的IL-6水平，
b)将测量的IL-6水平与预定的参考水平相比较，
c)确定测量的IL-6水平是否大于相应的参考水平，
其中当测量的IL-6水平大于相应的参考水平时，受试者患有心肾综合征，且推荐治疗。
57.一种确定受试者是否需要受损的肾小球滤过的治疗的方法，包括：
a)测量来自受试者的尿液样品中的IL-6水平，
b)将测量的IL-6水平与预定的参考水平相比较，
c)确定测量的IL-6水平是否大于相应的参考水平，
其中当测量的IL-6水平大于相应的参考水平时，受试者具有受损的肾小球滤过率，且推荐治疗。
58.一种确定受试者是否需要低利尿效率的治疗的方法，包括：
a)测量来自受试者的尿液样品中的IL-6水平，
b)将测量的IL-6水平与预定的参考水平相比较，
c)确定测量的IL-6水平是否大于相应的参考水平，
其中当测量的IL-6水平大于相应的参考水平时，受试者具有低利尿效率，且推荐治疗。
59.一种确定受试者是否需要高尿血管紧张素的治疗的方法，包括：
a)测量来自受试者的尿液样品中的IL-6水平，
b)将测量的IL-6水平与预定的参考水平相比较，
c)确定测量的IL-6水平是否大于相应的参考水平，
其中当测量的IL-6水平大于相应的参考水平时，受试者具有高尿血管紧张素，且推荐治疗。
60.一种确定受试者是否需要高血浆尿素的治疗的方法，包括：
a)测量来自受试者的血浆样品中的IL-6水平，
b)将测量的IL-6水平与预定的参考水平相比较，
c)确定测量的IL-6水平是否大于相应的参考水平，
其中当测量的IL-6水平大于相应的参考水平时，受试者具有高血浆尿素，且推荐治疗。
61.一种确定受试者是否处于由于心肾综合征导致的死亡风险中和需要治疗的方法，包括：
a)测量来自受试者的血浆样品中的IL-6水平，
b)将测量的IL-6水平与预定的参考水平相比较，
c)确定测量的IL-6水平是否大于相应的参考水平，
其中当测量的IL-6水平大于相应的参考水平时，受试者处于由于心肾综合征导致的死亡风险中，且推荐治疗。
62.如实施方案56-61任一项的方法，其中所述患者是心力衰竭患者。
63.如实施方案56-62任一项的方法，其中所述IL-6水平使用酶联免疫吸附分析(ELISA)测量。
64.一种治疗患者的心肾综合征的方法，包括：
a)测量来自患者的尿液样品或血浆样品中的IL-6水平，
b)将测量的IL-6水平与预定的参考水平相比较，
c)确定测量的IL-6水平是否大于相应的参考水平，
其中当测量的IL-6水平大于相应的参考水平时，施用心肾综合征的治疗。
65.如实施方案64的方法，其中所述患者是心力衰竭患者。
66.如实施方案64或实施方案65的方法，其中所述IL-6水平使用酶联免疫吸附分析(ELISA)测量。
67.如实施方案64-66任一项的方法，其中针对心肾综合征施用的治疗包括施用至少一种利尿剂、血管紧张素转化酶抑制剂、血管紧张素受体阻滞剂、利尿钠肽、腺苷拮抗剂、IL-6拮抗剂或其任意组合中的一种或多种。
68.如实施方案67的方法，其中治疗心肾综合征包括施用至少一种抗IL-6抗体或抗IL-6R抗体。
69.一种试剂盒，包括用于测量IL-6水平的分析的试剂及书面说明，该书面说明包括：
a)测量来自受试者的尿液样品或血浆样品中的IL-6水平，
b)将测量的IL-6水平与预定的参考水平相比较，
c)确定测量的IL-6水平是否大于相应的参考水平，
其中当测量的IL-6水平大于相应的参考水平时，受试者患有心肾综合征，且推荐治疗。
70.如实施方案69的试剂盒，其中所述说明指导所述试剂盒用于心力衰竭患者。
71.如实施方案69或70的试剂盒，其中所述试剂盒含有用于使用酶联免疫吸附分析(ELISA)测量IL-6水平的试剂。
8.8实验实施例
通过参考以下实验实施例进一步详细描述本发明。提供这些实施例仅用于说明的目的，且除非另有说明，它们不意图是限制性的。因此，本发明决不应被解释为限于以下实施例，而是应该被解释为包括由于本文提供的教导而变得明显的任何和所有变化。
无需进一步描述，据信本领域普通技术人员可以使用前述说明和以下说明性实施例实施本发明要求保护的方法。因此，以下工作实施例具体指出了本发明的优选实施方案，并且不应解释为以任何方式限制本公开的其余部分。
现在描述本文公开的实验中使用的材料和方法。
8.8.1实施例1：心力衰竭患者中尿液和血浆IL-6的相关性
方法.在Yale Transitional Care Clinic(YTCC)接受高剂量利尿剂治疗的连续性心力衰竭(“HF”)患者参加了前瞻性观察研究。
YTCC是门诊诊所，其重点在于利尿和体液状况管理。患者接受4-8小时治疗，在此期间接受1-3剂袢利尿剂。给药方案由患者体液状况决定；口服(PO)托拉塞米或静脉注射(IV)布美他尼的选择由治疗医师决定。在治疗期间，产生的所有尿液保存在累积的收集容器中，并在诊治结束时送到临床实验室进行电解质测量。在治疗期间进行累积尿液收集。在利尿剂施用之前和施用之后1小时保存另外的点尿样本。
测定.Randox RxDaytonaTM自动化临床化学分析仪用于使用离子选择性电极测量尿液和血清电解质。根据制造商的说明书(Randox LaboratoriesTM，UK)，使用Randox试剂测量尿素、肌酐、碳酸氢盐和半胱氨酸蛋白酶抑制剂C。使用MesoScale Discovery(MSD)平台(Meso Scale diagnosticsTM，Gaithersburg，MD，USA)测量白细胞介素10和IL-6的浓度。氨基末端pro B型利尿钠肽(NT-proBNP)的水平在耶鲁临床实验室在Roche Elecsys 120分析仪(Roche Diagnostics，Indianapolis，USA)上测量。使用来自ALPCOTM的市售竞争性ELISA试剂盒按照制造商的说明书(ALPCOTM，Salem，NH，USA)测量血浆肾素活性(PRA)、血管紧张素原和活性肾素。还使用市售ELISA试剂盒(R&D SystemsTM，Minneapolis，USA)分析总肾素。来自R&DsystemsTM的总肾素免疫测定试剂盒识别活性肾素和肾素原两者。该试验的平均可检测限对于总肾素为4.43pg/ml，和对于活性肾素为0.81pg/ml。液相色谱质谱法用于测量尿液中布美他尼和托塞米的水平。在Agilent Infinity 1290UPLC系统TM上进行超高效液相色谱。在Zorbax Bonus RPTM 2.1x50mm 1.8μ柱上以0.6ml/min的流速实现色谱分离。流动相含有0.1％甲酸(缓冲液A)和0.1％甲酸中的80％乙腈(缓冲液B)。以正离子模式在Agilent Q-TOF系统TM(AgilentTM，Santa Clara，CA，USA)上进行质谱分析。
计算和定义.eGFR使用慢性肾病流行病学协作(CKD-EPI)公式计算。袢利尿剂的剂量转化为呋塞米当量，其中1mg布美他尼＝20mg托拉塞米＝40mg静脉内呋塞米＝80mg口服呋塞米。如之前所公布的，利尿效率定义为袢利尿剂剂量每增加一倍，治疗期间尿钠输出的增加，以40mg呋塞米当量为中心；选择该标度以说明这些药物的S形剂量-反应曲线。通过将尿中利尿剂的浓度乘以利尿剂施用后前3小时内产生的尿液体积来计算尿利尿剂排泄量；考虑到患者接受的特定利尿剂(布美他尼或托拉塞米)的公布的尿清除率，然后将该估计的利尿剂量针对以呋塞米当量计的施用利尿剂剂量标准化。使用下式计算钠和钾的分数排泄率：X的排泄分数(FEX)＝[X]尿液*[肌酐]血清/([X]血清或血浆*[肌酐]尿液)。尿蛋白(包括肾素、血管紧张素原和IL-6)对于尿肌酐指数化。低的尿IL-6定义为小于14.2pg/g尿肌酐中值的值。低血浆IL-6定义为小于2.0pg/mL中值的值。高的尿液和血浆肾素和血管紧张素原水平定义为大于或等于这些变量的群组中值的值。
统计学分析.报告的值是平均值+/-SD、中值(四分位数1-四分位数3)和百分比。连续变量之间的相关性是Spearman的rho，调整的相关性除外。Pearson’s卡方检验用于比较组间的类别变量。为了比较组间的连续变量，使用Student′s t检验或Wilcoxon秩和检验。对偏态变量进行对数转换，包括血浆IL-6、尿液IL-6和NT-pro-BNP，然后将它们输入多变量模型和部分相关分析中。逻辑回归分析用于评估低利尿剂效率、eGFR＜60mL/min/1.73m2、高水平尿液或血浆神经激素参数的发生比(odds)与血浆和尿液IL-6水平(两者均为单变量水平且具有对于血浆或尿液IL-6和/或eGFR的调整)之间的相关性。Cox比例危险率模型用于评估与全因死亡率的时间-事件相关性。使用IBM SPSS Statistics版本23(IBM Corp.，Armonk，NY)和Stata版本13(StataCorpTM，College Station，TX)进行统计学分析。统计显著性对于所有分析定义为双侧p＜0.05。
我们的群体的基线特征描述于以下表2中。在该子集中，98名患者经历血液和尿液中IL-6水平的测定。中位(IQR)利尿前尿液IL-6水平为14.2Pg/g肌酐(5.6-36.2Pg/g)，而中位血浆IL-6水平为2.0pg/mL(1.2-3.9pg/mL)。血浆和尿液IL-6水平仅适度相关(r＝0.40，p＜0.001)。值得注意的是，往往是年轻人，高加索人，更通常进行血管紧张素受体阻滞剂(ARB)或血管紧张素转化酶(ACE-I)治疗的，具有低于中位尿液IL-6的那些人更可能患有伴有降低的射血分数(HFrEF)、较高的GFR和NT-proBNP水平的显著较低血浆水平的心力衰竭。由低于中值血浆IL-6定义的患者的分布有些不同，但在很大程度上反映了相同的趋势。
Figure BDA0002211791250000531
Figure BDA0002211791250000541
Figure BDA0002211791250000551
8.8.1.1肾功能和IL-6
如表2中所示，在具有高尿液或血浆IL-6的患者中eGFR较低，但这种相关性仅在eGFR和尿液IL-6之间是显著的(p＝0.01)。观察到血浆IL-6和eGFR(r＝-0.26，p＝0.01)以及尿液IL-6和eGFR(r＝-0.38，p＜0.001)之间的相关性。然而，在对于尿液IL-6调整时，血浆IL-6和eGFR之间不再存在显著相关性(p＝0.20)，而在对于血浆IL-6调整后尿液IL-6和eGFR之间仍保持显著相关性(部分r＝-0.32，p＝0.002)。类似地，如通过eGFR＜60mL/min/1.73m2定义的降低的eGFR的风险随着较高的尿液IL-6水平而增加(OR＝1.9/SD增加，95％CI＝1.2，3.1，p＝0.006)而不随较高的血浆IL-6水平增加(OR＝1.3/SD增加，95％CI＝0.8-2.0，p＝0.25)。
8.8.1.2利尿剂反应和IL-6
利尿效率与尿液IL-6(r＝-0.43，p＜0.001)和血浆IL-6(r＝-0.31，p＝0.002；图3)之间存在负相关。低利尿剂效率的发生比随着尿液IL-6(OR＝2.3/SD增加，95％CI 1.4-3.8，p＝0.001)或血浆IL-6(OR＝1.7/SD增加，95％CI＝1.1-2.7，p＝0.02)的较高水平而增加。在对于eGFR调整后，仅尿液IL-6保持与低利尿效率的风险显著相关(调整的OR＝1.8/SD增加，95％CI 1.1-3.1，p＝0.02；图3)。此外，当尿液IL-6和血浆IL-6都进入逻辑回归模型时，仅尿液IL-6保持与低利尿效率的风险相关(调整的OR＝2.1/SD增加，95％CI 1.3-3.5，p＝0.004)，而血浆IL-6没有显示这种相关性(OR＝1.4，95％CI 0.9-2.2，p＝0.17)。
8.8.1.3神经激素激活
血浆IL-6与较高的血浆肾素水平相关(表3和图3)。值得注意的是，较高的血浆IL-6水平带来了额外的高血浆总肾素的风险(OR＝1.9/SD增加，95％CI 1.2-3.0，p＝0.008)，且尽管对于ACE-I或ARB的使用和尿液IL-6水平调整，这仍然持续(调整的OR＝2.3/SD增加，95％CI 1.3-3.9，p＝0.003)。尿液IL-6与高血浆肾素的风险增加不相关(OR＝1.0，95％CI0.7-1.5，p＝0.98)。
尿液IL-6与通过尿液血管紧张素原(OR＝4.2/SD增加，95％CI2.2-7.9，p＜0.001)和尿液肾素(OR＝2.1/SD增加，95％CI 1.3-3.4，p＝0.002；图3)测量的高水平的组织水平RAAS激活强烈相关。这些相关性在对于血浆IL-6水平和ACE-I或ARB使用调整后持续(对于高尿液血管紧张素原调整的OR＝4.2/SD增加，95％CI 2.2-8.3，p＜0.001；对于高尿液肾素调整的OR＝2.0/SD增加，95％CI 1.2-3.3，p＝0.005)。血浆IL-6不表现出与高尿肾素风险的单变量相关性(OR＝1.3/SD增加，95％CI 0.9-2.0，p＝0.16)。虽然观察到对于与尿液血管紧张素原相关性的趋势(OR＝1.5/SD增加，95％CI 0.98-2-3，p＝0.06)，但其通过对于尿液IL-6的调整消除(调整的OR＝1.1，95％CI 0.7-1.7，p＝0.76)。
8.8.1.4与生存率的相关性
在713天的中位随访时间内，发生了32例死亡。与先前的报道一致，血浆IL-6的增加与较高的死亡风险相关(单变量HR＝2.8/SD增加，95％CI 2.0-4.0，p＜0.001)。在对于基线特征(包括年龄、种族、基线NT-proBNP水平、ACE-I或ARB的使用、家庭袢利尿剂剂量和eGFR)的多变量调整后，血浆IL-6仍与死亡率相关(调整的HR＝2.3/SD增加，95％CI＝1.5-3.7，p＜0.001)。相反，尿液IL-6与死亡风险不相关(单变量HR＝1.3/SD增加，95％CI 0.9-1.8，p＝0.15；调整的HR＝1.02，95％CI＝0.6-1.6，p＝0.93)。
8.8.1.5总结
血浆和尿液IL-6水平捕获IL-6在心肾疾病病理生理学中的作用的独特方面。血浆IL-6水平与疾病严重程度如死亡风险的总体量度相关。相反，尿液IL-6(可能是肾脏炎症的量度)与这些心力衰竭患者的心肾综合征(“CRS”)的多个量度强烈相关，包括利尿剂抵抗、肾素血管紧张素醛固酮系统(RAAS)激活和较低的估计肾小球滤过率(eGFR)。
这些数据表明尿液IL-6水平是肾脏炎症的有用生物标志物，并且特别适用于评估心力衰竭患者的肾脏症状。此外，连续尿液IL-6水平应证明可用于监测和评估心力衰竭中治疗性干预的肾脏益处。
8.8.2实施例2：TMPRSS6基因型对其肾脏症状预测为对IL-6拮抗剂是反应性的心力衰竭患者进行分层
实施例1中获得的数据还预测用IL-6拮抗剂的治疗应该有效减少心力衰竭患者的肾脏炎症。
然而，因为感染通常是心力衰竭患者急性失代偿的诱因，重要的是将抗细胞因子和其他免疫抑制疗法限制于可能对改善的肾脏和/或心脏功能有反应的那些心力衰竭患者。慢性IL-6拮抗剂治疗的成本也导致限制治疗于可能对改善的肾和/或心脏功能有反应的那些心力衰竭患者。
将实施例1中进行的分析扩展至129名患者。图1A是显示按照尿液IL-6的三分位数的利尿效率(“DE”)的条形图，证实了尿IL-6与98名患者子集中观察到的利尿效率的反相关。图1B是显示这129名患者中按照血浆IL-6的三分位数的利尿效率(“DE”)的条形图，证实了血浆IL-6与利尿效率的反相关(未通过尿IL-6水平校正的)。
进一步评估跨膜蛋白酶丝氨酸6(“TMPRSS6”)中rs855791单核苷酸多态性(“SNP”)处每个患者的基因型。TMPRSS6多肽，也称为Matriptase-2(MT2)，切割铁调素调节蛋白并抑制骨形态发生蛋白信号传导。rs855791(G2321A)SNP改变TMPRSS6蛋白质序列：人群中最高频率的等位基因(主要等位基因)是2321G，其编码736A；人群中最低频率的等位基因(次要等位基因)是2321A，其编码736V。
在HSM仪器(Promega，Madison，USA)上使用ReliaPrep大体积HT gDNA分离系统从血沉棕黄层分离基因组DNA。通过Nanodrop评估分离的DNA的纯度。基因分型在耶鲁大学基因组分析中心(Yale Centre for Genome analysis)进行。使用来自Illumina的
Figure BDA0002211791250000581
Exome-24v1.0 BeadChip Kit采用制造商建议的标准方案(Illumina，Inc.，San Diego，CA)进行全基因组基因分型。扩增、片段化、沉淀、再悬浮和杂交步骤是手动完成的。阵列在Illumina Hiscan仪器上扫描。Illumina HiScan或iScan系统扫描BeadChip，使用激光激发珠上单碱基延伸产物的荧光团。扫描仪记录从荧光团发射的光的高分辨率图像。Illumina InfomeStudio基因分型模块(与Illumina InfiniumAssay系统一起包括的)用于从自Illumina HiScan系统收集的强度数据文件(*.idat文件)提取基因分型数据。Infinium Exome-24v1.0BeadChip包含超过240,000个推定的功能性外显子变体，其选自超过12,000个个体人类外显子组和全基因组序列。＞240,000个标志物代表多样的人群(包括欧洲人、非洲人、中国人和西班牙裔个体)以及一系列常见病症，如2型糖尿病、癌症、代谢和精神障碍。详细的Illumina基因分型实验方案在http：//support.illumina.com上可得(infinium_hts_assay_protocol_user_guide_15045738_a.pdf)。此外显子组芯片中SNP的详细信息在http：//support.illumina.com/downloads/infinium-exome-24-v1-0-product-files.html上可得。
如图2A所示，仅在具有至少一个拷贝的TMPRSS6 rs855791SNP的主要等位基因的患者中，尿液IL-6水平与利尿剂效率呈负相关(图2A，右图，“AG+GG”)；在对于次要等位基因纯合的患者中，尿液IL-6水平与利尿效率不显著相关(图2A，左图，“AA”)。
如图2B所示，仅在具有至少一个拷贝的TMPRSS6 rs855791 SNP主要等位基因的患者中，血浆IL-6水平与利尿效率反相关(图2B，右图，“AG+GG”)；在对于次要等位基因纯合的患者中，血浆IL-6水平与利尿效率不显著相关(图2B，左图，“AA”)。
这些数据表明用IL-6拮抗剂治疗心力衰竭仅改善具有至少一个拷贝的TMPRSS6rs855791主要等位基因的心力衰竭患者的肾脏症状。
8.8.3实施例3：在鲁索替尼不存在或存在的情况下IL-6与NKCC2、ENaC-β和NCC表达的相关性
方法
小鼠M1 CCD细胞系(American Type Culture Collection(ATCC)，Cat#CRL-2038)在补充5％胎牛血清(FBS)、1％青霉素-链霉素(Thermo Fisher Scientific，Cat#15140-122)、1％胰岛素-转铁蛋白-硒(Thermo Fisher Scientific，Cat#51500-056)和100nM地塞米松(Sigma-Aldrich，Cat#D4902-100MG)的含相等量的DMEM(Sigma-Aldrich，Cat#D6046)和Han F12(Sigma-Aldrich，Cat#11765-047)的细胞培养基中维持。
将M1 CCD细胞在6孔板中以1百万/孔接种在细胞培养基中，并在第0天在37℃，5％CO2培养箱中孵育过夜。在第1天将细胞培养基更换为DMEM/F12无血清培养基，且细胞在37℃，5％CO2培养箱中孵育过夜。在第2天，除去无血清培养基并将细胞培养基加入到每个孔。在以10ng/mL、100ng/mL或500ng/mL终浓度添加IL-6(Sigma-Aldrich，Cat#SRP3096-20UG)之前10分钟，以1μM或100μM的终浓度添加鲁索替尼(Selleckchem，Cat#S1378)。包括没有鲁索替尼或IL-6的对照孔。细胞用IL-6和/或鲁索替尼处理24小时。用1xPBS将每个孔的细胞洗涤一次，并收集在补充有1％蛋白酶抑制剂混合物(100x，Thermo Fisher Scientific，Cat#78430)的250μL1xPIPA缓冲液(10x，Millipore，Cat#20-188)中。样品使用抗-NKCC2抗体(Millipore，Cat#AB3562P)、抗-ENaC-β抗体(Millipore，Cat#AB3532P)或抗NCC抗体(Millipore，Cat#AB3553)通过免疫印迹分析，并且定量蛋白质表达。每个实验一式三份进行。
结果
我们检查了在不存在或存在JAK抑制剂鲁索替尼的情况下IL-6处理后小鼠M1CCD细胞系中NKCC2(Na-K-Cl协同转运蛋白2)、ENaC-β(上皮钠通道，β亚基)和NCC(氯化钠同向转运体)蛋白的表达。小鼠M1 CCD细胞在基因型上类似于TMPRSS6 rs855791主要等位基因纯合的人细胞。如图4A、4B和4C所示，IL-6的处理增加了NKCC2、ENaC-β和NCC的表达。鲁索替尼阻断IL-6对离子转运蛋白的作用。
这些离子转运蛋白的表达增加提供了IL-6介导的利尿剂抵抗的推定机制。
因为未知增加的表达与铁调素表达关联，所以这些数据表明，即使在TMPRSS6rs855791次要等位基因纯合的患者中，IL-6拮抗作用可有效治疗利尿剂抵抗。
8.8.4实施例4：在螺内酯不存在或存在的情况下IL-6与NKCC2、ENaC-β和NCC表达的相关性
方法
小鼠M1CCD细胞系(American Type Culture Collection(ATCC)，Cat#CRL-2038)在补充5％胎牛血清(FBS)、1％青霉素-链霉素(Thermo Fisher Scientific，Cat# 15140-122)、1％胰岛素-转铁蛋白-硒(Thermo Fisher Scientific，Cat#51500-056)和100nM地塞米松(Sigma-Aldrich，Cat#D4902-100MG)的含相等量的DMEM(Sigma-Aldrich，Cat#D6046)和Han F12(Sigma-Aldrich，Cat#11765-047)的细胞培养基中维持。
将M1 CCD细胞在6孔板中以1百万/孔接种在细胞培养基中，并在第0天在37℃，5％CO2培养箱中孵育过夜。在第1天将细胞培养基更换为DMEM/F12无血清培养基，且将细胞在37℃，5％CO2培养箱中孵育过夜。在第2天，除去无血清培养基并将细胞培养基加入到每个孔中。在以10ng/mL、100ng/mL或500ng/mL终浓度添加IL-6(Sigma-Aldrich，Cat#SRP3096-20UG)之前，以1μM或100μM的终浓度加入螺内酯(Selleckchem，Cat#S4054)。包括没有螺内酯或IL-6的对照孔。用IL-6和/或螺内酯处理细胞24小时。用lxPBS将每个孔的细胞洗涤一次，并收集在补充有1％蛋白酶抑制剂混合物(100x，Thermo Fisher Scientific，Cat#78430)的250μL 1xPIPA缓冲液(10x，Millipore，Cat#20-188)中。使用抗-NKCC2抗体(Millipore，Cat#AB3562P)、抗-ENaC-β抗体(Millipore，Cat#AB3532P)或抗NCC抗体(Millipore，Cat#AB3553)通过免疫印迹分析样品，并且定量蛋白质表达。每个实验一式三份进行。
结果
我们检查了在不存在或存在保钾利尿剂螺内酯的情况下IL-6处理后小鼠M1 CCD细胞系中NKCC2(Na-K-Cl协同转运蛋白2)、ENaC-β(上皮钠通道，β亚基)和NCC(氯化钠同向转运体)蛋白的表达。小鼠M1 CCD细胞在基因型上类似于TMPRSS6 rs855791主要等位基因纯合的人细胞。如图5A、5B和5C中所示，IL-6的处理增加了NKCC2、ENaC-β和NCC的表达。螺内酯阻断IL-6对离子转运蛋白的作用。
这些离子转运蛋白的表达增加提供了IL-6介导的利尿剂抵抗的推定机制。
因为不知道增加的表达与铁调素表达相关联，所以这些数据表明，即使在TMPRSS6rs855791次要等位基因纯合的患者中，IL-6拮抗作用也可有效治疗利尿剂抵抗。
8.8.5实施例5：急性心力衰竭(HF)住院的患者中IL-6与利尿剂反应的相关性
方法.来自PROTECT试验(Weatherley等，2010，J.Card.Fail.16：25-35；Massie等，2010，N.Engl.J.Med.363：1419-1428)的数据根据IL-6的三分位数分析。PROTECT试验是随机安慰剂对照试验，其测试了腺苷A1受体拮抗剂Rolofylline对呼吸困难缓解、肾功能恶化风险和临床结果的影响。试验的主要入组和排除标准如下所示。
Figure BDA0002211791250000621
*ADHF：静息时或最小活动时的呼吸困难及随机化时通过至少下列情况之一表现的体液超量的迹象：JVP＞8cm，或肺部罗音≥1/3上肺区域，咳嗽不清，或
Figure BDA0002211791250000632
外周性水肿或骶前水肿
总共2033名具有ADHF的患者被纳入PROTECT研究中。在这些患者中，入院时(基线)1445名患者、第2天(基线后24小时)时1462名患者和第7天1445名患者中IL-6通过Singulex测量。利尿剂反应定义为从基线到第3天施用的每40mg呋塞米(或等效剂量)的第4天体重变化。该研究的主要终点是180天的全因死亡。
统计学分析。基线特征根据IL-6的三分位数呈现。在适当的情况下，使用单因素方差分析(ANOVA)、Kruskal Wallis或卡方检验测试基线特征的三分位数之间的差异。单变量线性回归使用利尿剂反应作为因变量和对于与利尿剂反应相关的临床相关变量校正的基线的(对数转换的)IL-6作为自变量进行。存活分析使用对于临床相关变量校正的Cox回归分析和PROTECT风险模型进行(O’Connor等，2012，Eur.J.Heart Fail.14：605-612)。PROTECT风险模型包括：之前的HF入院、水肿、收缩压、钠水平、BUN、肌酐和入院时白蛋白。
结果。群体的基线特征描述于下表4中。基线时的较高IL-6水平与较高的BNP水平、贫血、eGFR＜60和较老年龄相关(图6)。
Figure BDA0002211791250000631
Figure BDA0002211791250000641
Figure BDA0002211791250000651
IL-6水平和利尿剂反应的相关性显示在下表5中。利尿剂反应定义为从基线到第3天施用的每40mg呋噻米(或等效剂量)的第4天体重变化。
Figure BDA0002211791250000652
表6及图7A和7B显示IL-6水平与180天的全因死亡率的相关性以及IL-6水平与60天全因死亡率和/或心血管相关住院(CV hosp)的相关性。
Figure BDA0002211791250000653
模型1：年龄，性别
模型2：模型1+eGFR，BMI
模型3：模型2+BNP
PROTECT模型：年龄，之前的HF住院，入院时水肿，钠，bun(对数)，肌酐(对数)和白蛋白
表7及图8A和8B显示，与基线相比第7天的IL-6水平的增加预示不良结果。
Figure BDA0002211791250000654
Figure BDA0002211791250000661
模型1：年龄，性别
模型2：模型1+eGFR，BMI
模型3：模型2+BNP
PROTECT模型：年龄，之前的HF住院，入院时水肿，钠，bun(对数)，肌酐(对数)和白蛋白
8.8.6实施例6：心力衰竭恶化群体中IL-6水平与预后的相关性方法.分析了来自BIOlogy Study to TAilored Treatment in Chronic Heart Failure(BIOSTAT-CHF)研究的数据以调查心力衰竭恶化患者中IL-6与预后的相关性。简而言之，BIOSSTAT-CHF是多中心、多国性、前瞻性、观察性研究，其包括来自11个欧洲国家的69个中心的2516名患者(Voors等，2016，Eur.J.Heart Fail.18：716-726)。我们在BIOSTAT-CHF研究中进行了二次分析，从后续分析中排除了铁蛋白＜100的患者。索引群组的入组标准包括：年龄＞18岁，具有新发或恶化HF症状(如分别通过LVEF≤40％或者BNP和/或NT-proBNP血浆水平＞400pg/ml或＞2,000pg/ml证实)的患者。此外，这些患者先前未用ACEi/ARB和/或β-阻滞剂治疗，或者他们在入组时正在接受这些药物目标剂量的≤50％且预期开始或调升ACEi/ARB和B-阻滞剂。所有患者均需袢利尿剂的治疗。
Figure BDA0002211791250000662
Figure BDA0002211791250000671
总共对来自BIOSTAT-CHF研究的2329名恶化HF患者进行IL-6测量。这项研究的主要结果是全因死亡率和HF住院的综合结果。
统计学分析.基线特征根据IL-6的三分位数表示。在适当情况下，使用单向方差分析(ANOVA)、Kruskal Wallis或卡方检验来测试基线特征的三分位数之间的差异。使用对临床相关变量校正的Cox回归分析和BIOSTAT-CHF风险模型进行生存分析。用于全因死亡率和/或HF住院的BIOSTAT-CHF风险模型包括：年龄、N末端pro-B型利尿钠肽(NT-proBNP)、血红蛋白(Hb)、入组时β-阻滞剂的使用、入组前一年的HF住院、外周性水肿、收缩压、高密度脂蛋白胆固醇和钠(Voors等，2017，Eur.J.Heart Fail.19：627-634)。对于主要结果，我们进行了铁蛋白水平和IL-6之间的相互作用分析。调查IL-6与取决于TMPSR6 SNP(rs855791)的位置的预后的相关性。
结果.群体的基线特征在下表8中描述。基线时较高的IL-6水平与较高的NTproBNP水平和贫血相关(图9)。
Figure BDA0002211791250000672
Figure BDA0002211791250000681
如表9及图10A和10B所示，基线时测量的IL-6水平与两年的全因死亡率和/或HF住院的综合结果以及单独全因死亡率相关。
Figure BDA0002211791250000691
模型1：年龄，性别
模型2：模型1+BMI、国家、高血压(史)、糖尿病(史)和贫血
模型3：模型2+基线时β-阻滞剂、基线时ACEi/ARB和基线时MRA
BIOSTAT模型：年龄、N末端pro-B型利尿钠肽(NT-proBNP)、血红蛋白(Hb)、入组时β-阻滞剂的使用、入组前一年HF住院、外周性水肿、收缩压、高密度脂蛋白胆固醇和钠
如表10和图11中所示，取决于铁蛋白状态，IL-6与预后没有差异相关性。
Figure BDA0002211791250000692
模型1：年龄，性别
模型2：模型1+BMI、国家、高血压(史)、糖尿病(史)和贫血
模型3：模型2+基线时β-阻滞剂、基线时ACEi/ARB和基线时MRA
BIOSTAT模型：年龄、N末端pro-B型利尿钠肽(NT-proBNP)、血红蛋白(Hb)、入组时β-阻滞剂的使用、入组前一年HF住院、外周性水肿、收缩压、高密度脂蛋白胆固醇和钠
如表11中所示，取决于TMPRSS6基因型，IL-6与结果之间没有差异相关性。
Figure BDA0002211791250000701
9.通过引用并入
本文引用的各个和每个专利、专利申请和出版物的公开内容均通过引用整体并入本文。
10.等同
尽管已经参考具体实施方案公开了本发明，但显而易见的是，在不脱离本发明的真实精神和范围的情况下，本领域其他技术人员可以设计出本发明的其他实施方案和变化形式。所附权利要求旨在被解释为包括所有这样的实施方案和等同变型。

Claims (56)

1.一种治疗需要利尿但对利尿剂有抗性的患者的方法，包括：
与利尿剂组合对所述患者施用治疗有效量的IL6拮抗剂。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述患者具有升高的治疗前血浆IL-6水平。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述患者的治疗前血浆IL-6水平大于2pg/mL。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述患者的治疗前IL-6水平大于3pg/mL。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述患者的治疗前IL-6水平大于5pg/mL。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述患者的治疗前IL-6水平大于10pg/mL。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述患者的利尿效率低于500。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述患者的利尿效率低于200。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述患者的利尿效率低于150。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述患者的利尿效率低于100。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述患者患有利尿剂抗性心力衰竭。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述患者患有急性心力衰竭。
13.根据权利要求11所述的方法，其中所述患者患有慢性心力衰竭。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述患者患有心肾综合征。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述患者患有4型心肾综合征。
16.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述患者患有肾病。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述患者患有肝肾综合征。
18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述患者具有至少一个拷贝的TMPRSS6 rs855791主要等位基因。
19.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述IL-6拮抗剂是抗IL-6抗体或者其抗原结合片段或衍生物。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述抗IL-6抗体或者抗原结合片段或衍生物对于结合人IL-6具有小于100nM的KD。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述抗IL-6抗体或者抗原结合片段或衍生物对于结合人IL-6具有小于50nM的KD。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述抗IL-6抗体或者抗原结合片段或衍生物对于结合人IL-6具有小于10nM的KD。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述抗IL-6抗体或者抗原结合片段或衍生物对于结合人IL-6具有小于1nM的KD。
24.根据权利要求19-23中任一项所述的方法，其中所述抗IL-6抗体或者抗原结合片段或衍生物在静脉内施用后具有至少7天的消除半衰期。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述抗IL-6抗体或者抗原结合片段或衍生物在静脉内施用后具有至少14天的消除半衰期。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述抗IL-6抗体或者抗原结合片段或衍生物在静脉内施用后具有至少21天的消除半衰期。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述抗IL-6抗体或者抗原结合片段或衍生物在静脉内施用后具有至少30天的消除半衰期。
28.根据权利要求19-27中任一项所述的方法，其中所述IL-6拮抗剂是全长单克隆抗IL-6抗体。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述抗体是IgG1或IgG4抗体。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述抗体是IgG1抗体。
31.根据权利要求19-30中任一项所述的方法，其中所述抗IL-6抗体或者抗原结合片段或衍生物是全人的。
32.根据权利要求19-30中任一项所述的方法，其中所述抗IL-6抗体或者抗原结合片段或衍生物是人源化的。
33.根据权利要求19-32中任一项所述的方法，其中所述抗IL-6抗体或者抗原结合片段或衍生物包含MED5117的所有六个可变区CDR。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述抗体包含MED5117的VH和VL。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述抗体是MED5117。
36.根据权利要求19-32中任一项所述的方法，其中所述抗IL-6抗体或者抗原结合片段或衍生物包含选自下组的抗体的所有六个可变区CDR：司妥昔单抗、gerilimzumab、sirukumab、clazakizumab、olokizumab、elsilimomab、VX30(VOP-R003；Vaccinex)、EB-007(EBI-029；Eleven Bio)、ARGX-109(ArGEN-X)、FM101(Femta Pharmaceuticals,Lonza)和ALD518/BMS-945429(Alder Biopharmaceuticals,Bristol-Myers Squibb)。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述抗IL-6抗体或者抗原结合片段或衍生物包含选自下组的抗体的重链V区和轻链V区：司妥昔单抗、gerilimzumab、sirukumab、clazakizumab、olokizumab、VX30(VOP-R003；Vaccinex)、EB-007(EBI-029；Eleven Bio)、ARGX-109(ArGEN-X)、FM101(Femta Pharmaceuticals,Lonza)和ALD518/BMS-945429(AlderBiopharmaceuticals,Bristol-Myers Squibb)。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述抗IL-6抗体或者抗原结合片段或衍生物是选自下组的抗体：司妥昔单抗、gerilimzumab、sirukumab、clazakizumab、olokizumab、VX30(VOP-R003；Vaccinex)、EB-007(EBI-029；Eleven Bio)、ARGX-109(ArGEN-X)、FM101(FemtaPharmaceuticals,Lonza)和ALD518/BMS-945429(Alder Biopharmaceuticals,Bristol-Myers Squibb)。
39.根据权利要求19-27中任一项所述的方法，其中所述IL-6拮抗剂是单结构域抗体、VHH纳米抗体、Fab或scFv。
40.根据权利要求1-18中任一项所述的方法，其中所述IL-6拮抗剂是抗IL-6R抗体或其抗原结合片段或衍生物。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述抗IL-6R抗体、抗原结合片段或衍生物包含托珠单抗的6个CDR。
42.根据权利要求40所述的方法，其中所述抗IL-6R抗体、抗原结合片段或衍生物包含vobarilizumab的6个CDR。
43.根据权利要求1-18中任一项所述的方法，其中所述IL-6拮抗剂是JAK抑制剂。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述JAK抑制剂选自托法替尼(Xeljanz)、decernotinib、鲁索替尼、upadacitinib、巴瑞替尼、filgotinib、来他替尼、pacritinib、peficitinib、INCB-039110、ABT-494、INCB-047986和AC-410。
45.根据权利要求1-18中任一项所述的方法，其中所述IL-6拮抗剂是STAT3拮抗剂。
46.根据权利要求19-42中任一项所述的方法，其中所述IL-6拮抗剂肠胃外施用。
47.根据权利要求46所述的方法，其中所述IL-6拮抗剂皮下施用。
48.根据权利要求43或44所述的方法，其中所述IL-6拮抗剂口服施用。
49.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述IL-6拮抗剂以足以增加利尿效率的剂量、时间表和时间段施用。
50.根据权利要求49所述的方法，其中所述IL-6拮抗剂以足以增加利尿效率至正常水平的剂量、时间表和时间段施用。
51.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述IL-6拮抗剂以足以增加eGFR的剂量、时间表和时间段施用。
52.根据权利要求51所述的方法，其中所述IL-6拮抗剂以足以增加eGFR至正常水平的剂量、时间表和时间段施用。
53.根据前述权利要求中任一项所述的方法，还包括测定尿液中IL-6水平的后续步骤。
54.根据权利要求1-52中任一项所述的方法，还包括测定血浆中IL-6水平的后续步骤。
55.根据权利要求1-52中任一项所述的方法，还包括测定尿液和血浆中IL-6水平的后续步骤。
56.根据权利要求53-55中任一项所述的方法，其进一步包括基于在紧接前一步骤中测定的IL-6水平调节用于后续施用的IL-6拮抗剂剂量的最终步骤。
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