CN110494445A - 抗α-SYN抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本申请公开了一种优先识别α‑syn聚集体的抗α‑syn抗体。根据本申请的抗体以高亲和力和特异性结合α‑syn聚集体，从而抑制其积累或其细胞间通讯，因此可以有效地用于检测、诊断和/或治疗或预防由α‑syn聚集体积累引起的各种疾病。

Description

抗α-SYN抗体及其用途
技术领域
本发明涉及抗α-syn抗体及其用途。
背景技术
α-突触核蛋白(α-syn)是由140个氨基酸组成的蛋白质，主要在神经元的突触前末梢表达。它是正常条件下的天然未折叠单体。已知α-突触核蛋白维持突触小泡在突触前末梢的供应并调节作为控制自主或不自主运动的神经递质的多巴胺的释放。
然而，在病理条件下，α-突触核蛋白通过与液滴、磷脂双层或脂质膜等的结合和相互作用而经历结构变化，从而通过形成α-突触核蛋白的折叠或折叠α-螺旋二级结构来形成包括例如二聚体、寡聚体和/或纤维分子的聚集体。已知这些聚集体对细胞产生毒性，并且是在帕金森病、路易体痴呆和各种其他疾病的神经元中发现的路易体异常蛋白质聚集体的主要成分。此外，还已知翻译后修饰例如α-突触核蛋白的磷酸化或泛素化涉及α-突触核蛋白的聚集和神经毒性。
已知α-突触核蛋白聚集与帕金森病(PD)、帕金森病痴呆(PDD)、路易体痴呆(DLB)、多系统萎缩(MSA)和包括许多神经轴突疾病的各种神经退行性疾病(称为α-突触核蛋白病)的病因有关(Kim等人，阿尔茨海默研究与治疗(Alzheimer′s Research&Therapy)2014，6：73)。
此外，在患有帕金森病的患者的脑脊液和血浆样品中发现了α-突触核蛋白的寡聚体形式和单体形式，表明分子量小的α-突触核蛋白聚集体可以穿透细胞膜并进入细胞外空间。还已经表明，折叠的α-突触核蛋白可以通过胞吐作用从细胞中释放，然后像朊病毒蛋白那样通过细胞间转移从大脑的一个区域转移到另一个区域(Brundin P.等人.Nat Rev MolCell Biol 2010，11：301-307)。
因此，α-突触核蛋白是用于开发α-突触核蛋白病(例如帕金森病)的治疗剂的靶标。主要的开发策略包括聚集体形成的抑制、基因沉默和聚集体的去除。在前一种情况下，包括表没食子儿茶素-3-没食子酸酯(EGCG)(Bieschke J.等人，Proc Natl Acad Sci USA2010 107：7710-7715)，3-(1，3-苯并二氧戊环-5-基)-5-(3-溴苯基)-1H-吡唑(anle138b)(Wagner J.等人，Acta Neuropathol 2013，125：795-813)、CLR0120(Prabhudesai S.等人，神经治疗(Neurotherapeutics)2012，9：464-476)和脯氨酰寡肽酶抑制剂KYP-20479(Myohanen TT等人.Brit J Pharmacol 2012，166：1097-1113)。结合α-突触核蛋白的抗体在专利US 8,609,820、US 8,940,276等中公开。
分子量低的化合物由于靶特异性结合能力低并且半衰期短而应当以高剂量施用。与分子量低的化合物相比，抗体具有靶特异性和长半衰期。然而，为了增加对疾病的治疗潜力，需要优先以高亲和力结合聚集体的抗体。
因此，为了治疗与α-Syn聚集体的异常积累相关的疾病，需要开发能够优先结合α-突触核蛋白，特别是α-突触核蛋白聚集体的抗体。
发明内容
技术问题
本发明提供特异性识别α-syn，特别是结合亲和力高的α-syn聚集体的抗体。
技术方案
在一个方面，本发明提供了一种特异性地结合α-syn聚集体的分离的抗体或抗原结合片段，其中根据本发明的抗体或其抗原结合片段包含(i)CDRH1、CDRH2和CDRH3的互补决定区和/或(ii)CDRL1、CDRL2和CDRL3的互补决定区，CDRH1是选自SEQ ID NO：1至14中的任一种；CDRH2是选自SEQ ID NO：15至28中的任一种；CDRH3是选自SEQ ID NO：29至42中的任一种；CDRL1是选自SEQ ID NO：43至56中的任一种；CDRL2是选自SEQ ID NO：57至70中的任一种；CDRL3是选自SEQ ID NO：71至84中的任一种。
在其他实施方式中，根据本发明的抗体或抗原结合片段包含：(i)重链可变区，其包含CDRH1、CDRH2和CDRH3的互补决定区，和/或(ii)轻链可变区，其包含CDRL1、CDRL2和CDRL3的互补决定区：
(aa)CDRH1、CDRH2和CDRH3分别是SEQ ID NO：1、15和29，CDRL1、CDRL2和CDRL3分别是SEQ ID NO：43、57和71；
(ab)CDRH1、CDRH2和CDRH3分别是SEQ ID NO：2、16和30，CDRL1、CDRL2和CDRL3分别是SEQ ID NO：44、58和72；
(ac)CDRH1、CDRH2和CDRH3分别是SEQ ID NO：3、17和31，CDRL1、CDRL2和CDRL3分别是SEQ ID NO：45、59和73；
(ad)CDRH1、CDRH2和CDRH3分别是SEQ ID NO：4、18和32，CDRL1、CDRL2和CDRL3分别是SEQ ID NO：46、60和74；
(ae)CDRH1、CDRH2和CDRH3分别是SEQ ID NO：5、19和33，CDRL1、CDRL2和CDRL3分别是SEQ ID NO：47、61和75；
(af)CDRH1、CDRH2和CDRH3分别是SEQ ID NO：6、20和34，CDRL1、CDRL2和CDRL3分别是SEQ ID NO：48、62和76；
(ag)CDRH1、CDRH2和CDRH3分别是SEQ ID NO：7、21和35，CDRL1、CDRL2和CDRL3分别是SEQ ID NO：49、63和77；
(ah)CDRH1、CDRH2和CDRH3分别是SEQ ID NO：8、22和36，CDRL1、CDRL2和CDRL3分别是SEQ ID NO：50、64和78；
(ai)CDRH1、CDRH2和CDRH3分别是SEQ ID NO：9、23和37，CDRL1、CDRL2和CDRL3分别是SEQ ID NO：51、65和79；
(aj)CDRH1、CDRH2和CDRH3分别是SEQ ID NO：10、24和38，CDRL1、CDRL2和CDRL3分别是SEQ ID NO：52、66和80；
(ak)CDRH1、CDRH2和CDRH3分别是SEQ ID NO：11、25和39，CDRL1、CDRL2和CDRL3分别是SEQ ID NO：53、67和81；
(al)CDRH1、CDRH2和CDRH3分别是SEQ ID NO：12、26和40，CDRL1、CDRL2和CDRL3分别是SEQ ID NO：54、68和82；
(am)CDRH1、CDRH2和CDRH3分别是SEQ ID NO：13、27和41，CDRL1、CDRL2和CDRL3分别是SEQ ID NO：55、69和83；或
(an)CDRH1、CDRH2和CDRH3分别是SEQ ID NO：14、28和42，CDRL1、CDRL2和CDRL3是SEQ ID NO：56、70和84。
在一种实施方式中，根据本发明的特异性结合α-syn聚集体的分离抗体或其抗原结合片段的重链可变区包括选自SEQ ID NO：85至98的氨基酸序列、与选自SEQ ID NO：85至98的氨基酸序列具有至少90％或更高序列同一性的氨基酸序列、或与选自SEQ ID NO：85至98的氨基酸序列具有至少95％或更高序列同一性的氨基酸序列。
在一种实施方式中，根据本发明的特异性结合α-syn聚集体的分离的抗体或其抗原结合片段的轻链可变区包括选自SEQ ID NO：99至112的氨基酸序列、与选自SEQ ID NO：99至112的氨基酸序列具有至少90％或更高序列同一性的氨基酸序列、或与选自SEQ IDNO：99至112的氨基酸序列具有至少95％或更高序列同一性的氨基酸序列。
在一种实施方式中，根据本发明的特异性结合α-syn聚集体的分离的抗体或其抗原结合片段包括如下重链可变区和轻链可变区中的任一种。重链可变区和轻链可变区序列可包括SEQ ID NO：85和99；SEQ ID NO：86和100；SEQ ID NO：87和101；SEQ ID NO：88和102；SEQ ID NO：89和103；SEQ ID NO：90和104；SEQ ID NO：91和105；SEQ ID NO：92和106；SEQID NO：93和107；SEQ ID NO：94和108；SEQ ID NO：95和109；SEQ ID NO：96和110；SEQ IDNO：97和111；或SEQ ID NO：98和112。
一些抗体或其抗原结合片段可以是单克隆抗体或scFV片段，并且抗体或其抗原结合片段与α-Syn聚集体结合。
本发明的抗体可以是人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
本发明的单克隆抗体可以是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4型。
抗体或其其抗原结合片段可以是单克隆抗体、Fab片段、Fab′片段、F(ab’)片段、双抗体或scFV。
在一种实施方式中，根据本发明的特异性结合α-syn聚集体的分离的抗体或其抗原结合片段包括如下重链和轻链中的任一种。重链和轻链的序列是SEQ ID NO：113和SEQID NO：141；SEQ ID NO：114和SEQ ID NO：142；SEQ ID NO：115和SEQ ID NO：143；SEQ IDNO：116和SEQ ID NO：144；SEQ ID NO：117和SEQ ID NO：145；SEQ ID NO：118和SEQ ID NO：146；SEQ ID NO：119和SEQ ID NO：147；SEQ ID NO：120和SEQ ID NO：148；SEQ ID NO：121和SEQ ID NO：149；SEQ ID NO：122和SEQ ID NO：150；SEQ ID NO：123和SEQ ID NO：151；SEQID NO：124和SEQ ID NO：152；SEQ ID NO：125和SEQ ID NO：153；或SEQ ID NO：126和SEQ IDNO：154。抗体包括小鼠IgG2a作为恒定区。
在一种实施方式中，根据本发明的特异性结合α-syn聚集体的分离的抗体或其抗原结合片段包括如下重链和轻链中的任一种。重链和轻链的序列是SEQ ID NO：127和SEQID NO：155；SEQ ID NO：128和SEQ ID NO：156；SEQ ID NO：129和SEQ ID NO：157；SEQ IDNO：130和SEQ ID NO：158；SEQ ID NO：131和SEQ ID NO：159；SEQ ID NO：132和SEQ ID NO：160；SEQ ID NO：133和SEQ ID NO：161；SEQ ID NO：134和SEQ ID NO：162；SEQ ID NO：135和SEQ ID NO：163；SEQ ID NO：136和SEQ ID NO：164；SEQ ID NO：137和SEQ ID NO：165；SEQID NO：138和SEQ ID NO：166；SEQ ID NO：139和SEQ ID NO：167；或SEQ ID NO：140和SEQ IDNO：168。抗体包括人IgG1作为恒定区。
根据本发明的抗体或抗原结合片段可用于抑制α-Syn聚集体的细胞间转移；降解α-Syn聚集体；或抑制α-Syn聚集体形成。
另一方面，本发明还提供了编码根据本发明的抗体或抗原结合片段的分离的多核苷酸。这样的多核苷酸的实例包括SEQ ID NO：169至224所示的序列。
另一方面，本发明还提供了包含根据本发明的多核苷酸的表达载体。
另一方面，本发明还提供了用根据本发明的表达载体转化的原核细胞或细胞系、或真核细胞或细胞系。
在另一种实施方式中，本发明进一步提供了产生特异性结合α-Syn的分离的抗体或其抗原结合片段的方法，包括在充分表达抗体或其抗原结合片段的条件下培养本发明的细胞；从细胞系中分离抗体或其抗原结合片段。
在另一种实施方式中，本发明还提供了包含根据本发明的抗体或其抗原结合片段的试剂盒或组合物，其中所述组合物可以作为药物组合物或诊断组合物提供。药物组合物可包含药学上可接受的载体或赋形剂，诊断组合物可进一步包含诊断或检测所需的试剂。
根据本发明的药物组合物或试剂盒可用于治疗α-突触核蛋白病。例如，α-突触核蛋白病可以选自由帕金森病(PD)、帕金森病痴呆(PDD)、路易体痴呆(DLB)、阿尔茨海默病路易体变异型(LBV)、阿尔茨海默病合并帕金森病、或多系统萎缩(MSA)。
在另一种实施方式中，本发明提供了检测生物样品中α-Syn聚集体的方法，包括提供根据本发明的抗体或抗原结合片段，使所述抗体或其抗原结合片段与待检测α-Syn聚集体的生物样品接触。生物样品包括需要检测α-Syn聚集体的各种样品，包括：例如，脑脊液、包括血浆的血液、或尿液，以及细胞、组织或器官。该方法可以在体外或体内进行。体内成像可以使用例如正电子发射断层扫描(PET)、单光子发射断层扫描(SPECT)、近红外(NIR)光学成像、或磁共振成像(MRI)来执行。
在另一种实施方式中，本发明提供了治疗受试者的α-突触核蛋白病或调节受试者中α-Syn聚集物浓度、将本发明的抗体或其抗原结合片段或包含该抗体或其抗原结合片段的组合物施用于需要治疗α-突触核蛋白病和/或调节α-Syn聚集体浓度的受试者的方法。
在另一种实施方式中，本发明提供了诊断需要诊断α-突触核蛋白病的受试者的α-突触核蛋白病的方法，其中该方法包括使用任何本发明的抗体或其抗原结合片段来测量/检测受试者中α-Syn聚集物的浓度或细胞间位置，并将在受试者中测量的α-Syn聚集体的浓度或细胞间位置与对照样品的浓度或细胞间位置进行比较，并且其中与对照样品结果相比的相似性或差异表示受试者患有α-突触核蛋白病。在该方法中，对照组可以是正常样品或患有α-突触核蛋白病的患者样品。
在另一种实施方式中，本发明提供抗体及其抗原结合片段或包含所述抗体及其抗原结合片段的组合物在治疗患有α-突触核蛋白病的受试者中的α-突触核蛋白病中的用途，其中所述抗体及其抗原结合片段或包含所述抗体及其抗原结合片段的组合物抑制α-Syn聚集体的细胞间转移，降解α-Syn聚集体；或抑制受试者中或受试者大脑中的α-Syn聚集体形成。
在另一种实施方式中，本发明提供了抗体及其抗原结合片段或包含所述抗体及其抗原结合片段的组合物在调节脑细胞中α-Syn聚集体浓度中的用途，其中所述抗体及其抗原结合片段或者包含所述抗体及其抗原结合片段的组合物抑制α-Syn聚集体的细胞间转移，降解α-Syn聚集体；或抑制受试者大脑中的α-Syn聚集体。
有益效果
本文公开的抗体优先以高结合亲和力结合α-Syn，尤其是α-Syn聚集体。具有高亲和力的抗体和抗原结合片段可以减少α-Syn聚集体形成并降低脑中聚集体的浓度。此外，对α-Syn聚集体具有高亲和力的抗体和抗原结合片段可以减少中枢神经系统外的α-Syn聚集体形成，从而通过改变血脑屏障边界中α-Syn形式的平衡状态来降低中枢神经系统中聚集体的浓度。
它还具有由于高亲和力而以低剂量施用的优点。这具有很大的临床优势，因为例如抗体可以以与更简单的皮下注射相同的方式施用以实现足够的功效，但不限于此。
本文公开的抗体可有效去除α-Syn聚集体并促进降解，并抑制α-Syn的细胞间转移，从而可用于治疗与α-Syn聚集体积聚相关的疾病。
附图说明
图1是斑点印迹结果，显示了由于测量单克隆抗体是否特异性识别聚集形式的天然α-syn的结果，所产生的单克隆抗体优先结合α-syn聚集体。
图2是本发明的一种实施方式中产生的单克隆抗体的亲和力的ELISA分析。本发明的抗体优先以高亲和力结合α-syn聚集体，但是由于与单体的亲和力低于聚集体或不结合单体，因此不能获得对单体的亲和力。这些结果表明，有可能有效地去除或抑制具有α-突触核蛋白发病机理的神经退行性疾病(例如帕金森病)的致病因子的活性。
图3a是在本发明的一种实施方式中产生的单克隆抗体与α-syn聚集体的优先结合特异性和亲和力的BIAcore分析结果。结果表明，本发明的抗体优先以高亲和力结合α-syn聚集体。这些结果表明，有可能有效地去除或抑制具有α-突触核蛋白发病机理的神经退行性疾病(例如帕金森病)的致病因子的活性。
图3b是表示图3a的结果的表。
图4是在本发明的一种实施方式中产生的单克隆抗体优先结合α-Syn聚集体的优先结合特异性的Octet分析结果。结果显示本发明的抗体优先结合α-syn聚集体，并且该结果与图1的结果一致。发现用作比较组的#274抗体与单体和聚集体结合良好。
图5是斑点印迹结果，显示了由于测量单克隆抗体是否特异性识别聚集形式的天然α-syn的结果，在本发明的一种实施方式中的通过噬菌体展示技术选择的单克隆抗体优先结合α-syn聚集体。
图6是用于图5中使用的单克隆抗体与α-syn聚集体的优先结合特异性的Octet分析结果。结果表明，本发明的抗体优先与α-syn聚集体结合。该结果表明，有可能有效地去除或抑制具有α-突触核蛋白发病机理的神经退行性疾病(例如帕金森病)的致病因子的活性。
图7示出了分析在本发明的一种实施方式中产生的单克隆抗体是否抑制α-syn的细胞间传递的原理和实验结果。在此，蓝色是细胞核，绿色是当从一个细胞释放的α-syn传播到其他细胞并通过遇到另一个α-syn形成聚集体时的信号。当处理根据本发明的抗体9B11、3A9和11F11时，显示绿色信号的细胞数量相比于阴性对照IgG的细胞数量显著减少。该结果表明，本发明的抗体以高亲和力特异性结合聚集体，可有效抑制α-syn的细胞间转移。
图8a示出了通过将抗体施用于小鼠并测量后，用p-129α-syn染色小鼠脑组织来分析本发明的实施方式中产生的单克隆抗体是否在过表达人α-Syn的小鼠动物模型(TG)中去除α-Syn聚集体的结果。在该图中，HP是海马体，p-129α-syn是α-syn的磷酸化的第129位残基形式的聚集体的标记物，箭头表示磷酸化的α-syn。该结果表明，本发明的抗体可以显著地消除α-syn。WT和IgG是阴性对照，抗体274是结合单体和聚集体的比较组。这些结果表明，本发明的抗体可以有效地抑制α-syn聚集体的积累，因此可以有效地用于预防和/或治疗与α-syn发病机理有关的疾病。
图8b是与图8a相同的实验结果，除了用抗α-syn抗体作为标记物以外。箭头表示人α-syn。9B11、11F4和11F11抗体有效抑制α-syn的积累。α-syn检测表明本发明的抗体具有清除突触核蛋白本身并抑制α-syn的细胞间传递的能力。在另一方面，它还可以解释为抑制单体形成聚集体，或除去所有单体。
图9a示出了在将抗体施用于小鼠并测量后，通过用Iba-1(小胶质细胞增生)作为标记物染色小鼠脑组织来分析本发明的实施方式中产生的单克隆抗体是否可以减少体内小胶质细胞增生的结果。箭头表示活化的小胶质细胞，结果表明在给予3A9、9B11和11F11抗体的小鼠脑中小胶质细胞激活显著减少。
图9b示出了在将抗体施用于小鼠并测量后，通过用GFAP(星形胶质细胞增生)抗体染色小鼠脑组织来分析本发明实施方式中产生的单克隆抗体是否可以减少体内小胶质细胞增生的结果。箭头表示活化的雌激素，结果表明抗体3A9、9B11和11F11有效抑制星形胶质细胞增生至显著水平。
图9c示出了在将抗体施用于小鼠并测量后，通过用IL-1β抗体作为标记物染色小鼠脑组织来分析本发明实施方式中产生的单克隆抗体是否可以减少体内炎性细胞因子的结果。箭头表示表达IL-1β的细胞。IL-1β诱导各种神经细胞的炎症和死亡。在用本发明的抗体施用的小鼠的脑组织中IL-1β显著降低。
图9d示出了在将抗体施用于小鼠并测量后，通过用IL-6抗体作为标记物染色小鼠脑组织来分析本发明实施方式中产生的单克隆抗体是否可以减少体内炎性细胞因子的结果。箭头表示表达炎性细胞因子的IL-6的细胞。结果表明，在用本发明的抗体施用的小鼠的脑组织中IL-6减少。
图10a和10b示出了在本发明的一种实施方式中产生的单克隆抗体3A9和11F11可以分别特异性识别人脑组织中的路易体和路易神经突的测量结果。它表明本发明的抗体与路易体(箭头)和路易神经突(左下线状)结合。这些结果表明，本发明的抗体可以特异性地结合人脑组织中的α-syn聚集体，并且可以有效地用于预防和/或治疗与α-Syn发病机理相关的疾病。
图11是本发明中产生的抗体的表位定位结果的图解表示，并且本发明的抗体主要结合于C-末端区域。识别N末端的α-syn抗体不识别其他疾病例如属于突触核蛋白病(synucleionopathy)的多系统萎缩(MSA)的聚集体，识别C末端的α-syn抗体具有不仅识别帕金森病而且识别其他各种突触核蛋白病的聚集体的优点。
具体实施方式
本发明涉及一种基于开发能够以高特异性结合α-Syn聚集体的抗体检测α-Syn聚集体以及减少α-Syn聚集体、抑制α-Syn聚集体和/或α-Syn聚集体形成和/或抑制α-Syn聚集体细胞转移的方法。
本部分中使用的标题仅为了便于说明，并不限制本发明。
除非本文另有定义，否则本文使用的科学和技术术语具有与本领域技术人员通常理解的含义相同的含义。此外，除非上下文特别要求，否则单数包括复数，并且复数包括单数。
定义
本文中，“多核苷酸”或“核酸”包括单链或双链核苷酸聚合物。包含这种多核苷酸的核苷酸可以是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或其修饰形式。
除非本文另有说明，否则本文所述多核苷酸的左端是5′端，其右端代表3′端。
本文中，“分离的核酸分子”是指基因组来源的DNA或RNA或合成来源的mRNA、cDNA、或它们的组合，它们全部或部分地与自然界存在的多核苷酸无关，或与自然界中观察不到的多核苷酸有关。出于本发明的目的，包含特定核酸序列的核酸分子不包含完整染色体。相反，包含特定核酸序列的分离的核酸分子除了其特定序列外还可以包含至少几种另外的蛋白质编码序列，或者可以进一步包含用于表达特定核酸序列的调节序列和/或载体。
本文中，术语“调节序列”是指通过与编码序列可操作地连接而影响编码序列的表达和加工的多核苷酸序列。调节序列的这种性质可能受到各种宿主的影响。例如，适用于原核细胞的调节序列可包括启动子，偶尔包括操纵子、核糖体结合位点和转录终止序列。在真核细胞中，调节序列可包括包含多个识别位点的启动子、转录增强子、多腺苷酸化序列和转录终止序列。调节序列可以进一步包含读者序列(reader sequence)和/或融合伴侣序列。
本文中，“载体”是指用于将编码蛋白质的核酸分子递送至宿主细胞的任何分子，包括例如核酸、质粒、噬菌体或病毒。
本文中，“表达载体”是指适合转化宿主细胞的载体，并且包含与表达载体可操作地连接并调节编码靶蛋白的异源序列的表达的核酸序列。该表达载体也可以与编码序列可操作地连接，并且在转录、翻译和存在内含子的情况下，它可以包含调节RNA剪接或影响它的序列。
本文中，“可操作地连接”是指待连接的核酸序列被定位以便在适当条件下执行靶向功能。例如，如果编码序列的转录在适当条件下在包含编码序列和调节序列的载体中受调节序列影响，则该编码序列被可操作地连接。
本文中，“宿主细胞”是指可以表达通过靶核酸序列转化或待通过靶核酸序列转化的靶基因的细胞。该术语包括只要表达靶基因而无论宿主细胞的形态和形式以及遗传构成如何的宿主细胞的后代。
本文中，“转导”通常是指通过噬菌体将核酸从一种细菌移动到另一种细菌。例如，它包括使用不能复制的逆转录病毒将核酸移动到真核细胞。
本文中，“转染”是指细胞摄取外来或外源DNA，在这种情况下，DNA通过细胞膜导入细胞。这可以参考本领域已知的方法，例如Sambrook等人，分子克隆：实验手册(MolecularCloning：A Laboratory Manual)，第4版.，冷泉港实验室出版社，冷泉港，N.Y.(2012)，Ausubel等人，分子生物学通用方法(Current Protocols in Molecular Biology)，格林出版公司。
本文中，“转化”是指细胞遗传特性的改变，该细胞被修饰以使细胞包含新的DNA或RNA。例如，通过由转染、转导或其他技术引入新的遗传物质，可以转化细胞，从而改变遗传特异性。通过包括转导或转染等方法转化的DNA可以通过物理整合到细胞的染色体中而存在，或者可以作为不复制的附加体形式或可复制的质粒而暂时存在。当转化的DNA伴随宿主细胞分裂而复制时，它被认为是稳定转化的。
本文中，“氨基酸”包括本领域中理解的共同含义。二十种天然存在的氨基酸及其缩写与本领域常用的一样(免疫学-A合成(Immunology-A Synthesis)，第二版，E.S.Golub和D.R.Green编，Sinauer公司：马萨诸塞州桑德兰.1991)。氨基酸包括典型氨基酸，20种典型氨基酸的立体异构体(D-氨基酸)、非天然氨基酸，例如α-，α-二取代氨基酸、N-烷基氨基酸和其他非典型氨基酸。作为非典型氨基酸的实例，包括4-羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、ε-N，N，N-三甲基赖氨酸、ε-N-乙酰基赖氨酸、O-磷酸丝氨酸、N-乙酰基丝氨酸、N-甲酰基甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟基赖氨酸、σ-N-甲基精氨酸和其他类似的氨基酸和亚氨基酸(例如，4-羟基脯氨酸)。在本文使用的多肽标记中，如本领域常用的，序列的左侧是氨基末端，右侧代表羧基末端。
本文中，“多肽”或“蛋白质”是指氨基酸残基的聚合物，并且在本文中可互换使用。这不仅包括天然存在的氨基酸残基的聚合物，还包括其类似物或模拟物的聚合物。此外，多肽或蛋白质可以包含修饰，例如添加碳水化合物用于磷酸化或糖基化等。此外，多肽或蛋白质可以在重组或天然发现的细胞中产生。此外，多肽或蛋白质可包括其中一部分野生型序列或氨基酸序列缺失、添加和/或取代的多肽或蛋白质。此外，多肽或蛋白质包括抗体，例如抗α-syn抗体(或称为α-syn抗体)、α-syn结合蛋白或抗原结合片段、或缺失、添加和/或取代序列中一个或多个氨基酸的序列。此外，“多肽片段”是指与全长蛋白质相比具有氨基末端缺失、羧基末端缺失和/或内部缺失的多肽。与全长蛋白质相比，该片段还可包括修饰的氨基酸。在一种实施方式中，片段的长度可为约5至500个氨基酸，例如，长度为至少5、6、8、10、14、20、50、70、100、110、150、200、250、300、350、400或450个或更多个氨基酸。考虑到本发明的目的，这种有用的片段包括CDR序列，所述CDR序列包含1、2或3个重链或轻链或包含重链或轻链的可变区或恒定区的抗体链的全部或一部分，但不限于此。
本文中，“分离的多肽、抗体或蛋白质”是指通常没有任何其他的蛋白质与它们一起被发现，并且至少天然与它们连接的脂质、碳水化合物和多核苷酸的至少约50％或更多被除去。通常，分离的蛋白质、多肽或抗体在某种组合物中包含至少约5％、至少约10％、至少约25％或至少约50％。该多肽可以由合成来源的基因组DNA、cDNA、mRNA或其他RNA或其任意组合编码。特别地，分离的蛋白质、多肽或抗体基本上不含干扰其治疗、诊断和预防性研究或其他用途的应用的其他蛋白质或其他多肽的污染物。
本文中，多肽的“变体”，例如抗原结合片段、蛋白质或抗体，是与另一个多肽序列相比插入、缺失、添加和/或取代一个或多个氨基酸残基的多肽，并且包括融合多肽。另外，蛋白质变体包括通过蛋白质酶切割，磷酸化或其他翻译后修饰来修饰但保持本文公开的抗体生物活性(例如，结合α-syn)和特异性的蛋白质变体。变体可以与本文公开的抗体或其抗原结合片段的序列相比约99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、83％、82％、81％或80％相同。
本文多肽的“衍生物”是指通过与其他化学部分缀合而在一个或多个残基中化学修饰的多肽，该衍生物不同于插入、缺失、添加或取代变体。
本文中，关于多肽、核酸、宿主细胞等使用的术语“天然发现的”是指天然存在的物质。
如本文所用，“α-Syn”是天然α-Syn(NCBI ID：NP_000336)，其由SNCA基因编码的140个氨基酸组成，并且“α-Syn”包括加工的各种形式以及全长的未加工的蛋白质。此外，α-Syn包括天然存在的α-Syn变体，例如突变体、剪接变体或等位基因变体。变体可包括缺失外显子3或外显子5的126个和112个残基蛋白形式(CAG3339.1)。还已知SNCA基因的特异性多态性或错义突变与帕金森病的发生有关(Singleton AB等人，Science 2003，302：841)。这些变体也被包括在α-Syn的变体中，β-Syn和γ-Syn与α-Syn同源。在一种实施方式中，根据本发明的抗体特异性识别α-Syn。α-Syn的氨基酸序列在SEQ ID NO：225中示出。
如本文所用，术语“α-Syn聚集体”由于α-Syn的构象的变化而形成，并且是指包括由于α-Syn构象的变化而形成的低聚物、原纤丝和/或原纤丝中的至少一种的结构或聚集体。
本文中“同一性”是指两种或更多种多肽或两种或更多种多核苷酸的序列相似性，其通过排列和比较两种或更多种多肽或两种或更多种多核苷酸来确定。序列之间的这种同一性通常用“同一性百分比”表示，这意味着待比较的分子之间相同氨基酸或核苷酸的比例，并且这基于待比较分子中最小的分子大小计算。以下文献可用于通过排列核酸或多肽来计算许多分子之间的同一性的方法：计算分子生物学(Computational MolecularBiology)，(Lesk，A.M.编)，1988，纽约牛津大学出版社；生物计算信息学和基因组计划(Biocomputing Informatics and Genome Projects)，(Smith，D.W.编)，1993，纽约学术出版社；序列数据的计算机分析，第一部分(Computer Analysis of Sequence Data，PartI)，(Griffin，A.M.和Griffin，H.G.，编)，1994，新泽西胡马纳出版社；von Heinje，G.，1987，分子生物学中的序列分析(Sequence Analysis in Molecular Biology)，纽约学术出版社；序列分析引物(Sequence Analysis Primer)，(Gribskov，M.和Devereux，J.，eds.)，1991，纽约M.斯托克顿出版社；和Carillo等人，1988，SIAM J.Applied Math.48：1073。
当计算同一性百分比时，要比较的序列以提供序列之间的最大匹配的方式排列，并且在排列的序列中，可以存在间隙、匹配和不匹配，并且这通过特定的数学模型或计算机算法来处理。在一种实施方式中，可使用包括GAP程序的GCG程序包确定该同一性百分比，所述GAP程序使用Needlman和Wunsch算法以最大化待比较序列之间的匹配并最小化空位数的方式排列两个序列(Devereux等人，1984，Nucl.Acid Res.1984，12：387；美国威斯康辛州麦迪逊市威斯康辛大学遗传学计算机小组)。计算机算法GAP通过在两个待比较的多肽和多核苷酸序列以最大化它们之间的匹配并最小化空位数的方式排列两个序列的来确定“匹配跨度”。该算法还一起使用空位开放罚分[计算为3×平均对角线(average diagonal)，其中“平均对角线”是要使用的比较矩阵的对角线的平均值；并且“对角线”是通过特定比较矩阵为每个完整氨基酸匹配分配的分数或数字]和空位扩展罚分(这通常是间隙开放罚分的1/10倍)，以及比较矩阵(例如PAM 250或BLOSUM 62)。在特别的实施方式中，标准比较矩阵(PAM 250比较矩阵参考Dayhoff等人，1978，蛋白质序列和结构图册(Atlas of ProteinSequence and Structure)1978，5：345-352为；BLOSUM 62比较矩阵参考Henikoff等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1992，89：10915-10919)。在一种实施方式中，推荐用于确定使用GAP程序的多肽或多核苷酸的同一性百分比的参数如下：算法：Needleman等人，J.Mol.Biol.1970，48：443-453；比较矩阵：BLOSUM 62(Henikoff等人，1992，同上)；空位罚分：12(对末端空位不予罚分)；空位长度罚分：4；相似度阈值：0。
当使用特定参数排列两个序列时，尽管两个序列之间没有显著关系，但是可以导出它们以高度的同一性在短序列区域中匹配的结果。在这种情况下，为了通过至少50个连续氨基酸排列两个序列，可以校正用作GAP程序的算法的参数。
本文使用的术语“基本上纯的”是靶向分子作为主要种类存在。换句话说，这意味着基于摩尔，浓度高于同一混合物中的任何其他个体种类。在一种实施方式中，基本上纯的分子在组合物中所包含的所有聚合物中的含量为至少约50％(基于摩尔)、至少约80％、约85％、至少约90％或至少约99％。在其他实施方式中，靶分子被基本上同质地纯化直到通过使用常规方法未检测到任何更多污染物，因此组合物包含一种同质聚合物物质。
在一方面，本发明涉及特异性结合α-syn蛋白或人α-syn蛋白或其抗原结合片段的重组抗体。在这方面，“重组蛋白”是使用重组技术，即通过表达本发明中描述的重组核酸来制备的蛋白质。用于产生重组蛋白的方法和技术在本领域中是众所周知的。
本文中，“亲和力”、“亲和力程度”或“结合亲和力”是抗体或其抗原结合片段与抗原之间相互作用的强度，并且该强度由抗原的性质如抗原的大小、形状和/或电荷以及抗体或抗原结合片段的CDR序列来决定。用于确定亲和力的方法在本领域中是已知的，并且可以参考以下内容。
当解离常数(KD)为≤10-6M时，抗体或其抗原结合片段被称为与其靶标(例如抗原)“特异性结合”。当KD为≤1×10-8M时，抗体以“高亲和性”与靶标结合。根据本发明的抗体和抗原结合片段对聚集体具有≤1×10-9M，特别是≤1×10-10M，或更特别是≤1×10-11M的高亲和力。
如本文所用，“优先结合”包括仅与α-Syn聚集体结合，或与α-Syn单体和α-Syn聚集体的结合但是与聚集体的结合力比与单体更高。在一种实施方式中，根据本发明的抗体或其抗原结合片段特异性地以高亲和力结合聚集体，但不结合α-Syn单体。在另一种实施方式中，根据本发明的抗体或其抗原结合片段可以与单体和聚集体结合，但以比与单体结合更高的亲和力结合α-Syn聚集体。在一种实施方式中，对α-Syn聚集体的亲和力比对α-Syn单体的亲和力高至少两倍，或者对α-Syn聚集体的亲和力是低结合力，这种结合力不能被确定为作为抗体特异性结合或具有在抗体的实验浓度范围内不可测量的结合力。
在根据本发明的一种实施方式中，本发明的抗体或抗原结合片段对α-Syn聚集体的高亲和力是KD≤1.0×10-8M；在另一种实施方式中，KD≤1.0×10-9M；在进一步的实施方式中，KD≤1.0×10-10；KD≤1x10-11M；在另一种实施方式中，KD≤1×10-12M。，具有如此高亲和力的抗体和抗原结合片段可以以与亲和力较低的抗体相比较低的剂量施用，例如大于KD10-7M或10-8M，但不限于此。在临床实践中有很大的优点，因为通过以与简单的皮下注射相同的方式施用可以获得足够的功效。此外，对α-Syn聚集体具有高亲和力的抗体和抗原结合片段可以减少α-Syn聚集体形成，导致脑中聚集体浓度降低。此外，对α-Syn聚集体具有高亲和力的抗体和抗原结合片段可以减少中枢神经系统外的α-Syn聚集体形成，从而改变血脑屏障边界中α-Syn形式的平衡状态，从而降低中枢神经系统内聚集体的浓度。
本文中，“抗原结合区或位点”是指与特定抗原特异性结合的蛋白质或蛋白质的一部分，例如包括通过与抗原相互作用为抗体提供与抗原结合的特异性和亲和性的氨基酸残基的抗体的一部分。抗原结合区通常包含一个或多个“互补决定区(CDR)”。特定的抗原结合区还包含一个或多个“骨架(FR)”区域。骨架区有助于维持这些CDR的适当构象，从而促进抗原结合区和抗原之间的结合。
本文中，“抗体”是指能够为与任意同种型的完整免疫球蛋白或靶抗原结合而与完整抗体竞争的抗原结合片段。例如，它包括嵌合的、人源化的、完整的人和双特异性抗体或其抗原结合片段。抗体本身就是一种抗原结合蛋白。完整抗体通常包含至少2个全长重链和2个全长轻链，但在一些情况下，如在骆驼科动物中天然存在的，抗体可仅包含重链。抗体或其抗原结合片段可以仅来源于一种来源或嵌合。嵌合抗体包含来源自两种不同抗体的部分，并在下面更详细地描述。抗体或其抗原结合片段可由杂交瘤、重组DNA技术或完整抗体的酶促或化学切割产生。除非另有说明，否则本文中，术语抗体包括含有2条全长重链和2条全长轻链的抗体，及其衍生物、变体、片段和突变体，它们的实例如下所述。
本文中，“轻链”包括具有可变区序列的全长轻链，所述可变区序列足以提供与抗原或表位及其片段的结合特异性。全长轻链包含可变区结构域VL和恒定区结构域CL。轻链的可变区结构域存在于轻链多肽的氨基末端。轻链的种类包括κ和λ链。
本文中，“重链”包括具有可变区序列的全长重链，所述可变区序列足以提供与抗原或表位及其片段的结合特异性。全长重链包含可变区结构域VH和3个恒定区结构域CH1、CH2和CH3。VH结构域存在于重链多肽的氨基末端，CH结构域存在于羧基末端，CH3位于最靠近羧基末端的位置。重链包含IgG(包含IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgG4亚型)、IgA(包含IgA1和IgA2亚型)、以及IgM和IgE的同种型。
抗体或免疫球蛋白的链(重链或轻链)的术语“抗原结合片段”包括与全长链相比缺少一些氨基酸但可以特异性结合抗原的抗体的一部分。该片段可以被认为具有生物活性，在一方面它可以特异性结合靶抗原，或者可以与其他抗体或抗原结合片段竞争结合特定表位。在一方面，该片段包含存在于全长轻链或重链中的至少一个CDR，并且在一些实施方式中，该片段包含短链重链和/或轻链或其部分。该生物活性片段可以通过重组DNA技术产生，或者可以通过例如酶促或化学切割完整抗体来产生。免疫功能性免疫球蛋白片段包括Fab、Fab′、F(ab’)2、Fv、结构域抗体和单链Ab，但不限于此，并且可以来源自任何哺乳动物，包括人、小鼠、大鼠、骆驼科动物或兔，但不限于此。抗体的功能部分例如本文所述的一个或多个CDR可以通过共价键与二级蛋白质或小分子化合物连接，从而用作对特定靶标的靶向治疗剂。
本文中，“Fab片段”由1条轻链和1条重链组成，所述重链包含可变区和仅CH1。Fab片段可与其他重链形成二硫键。
本文中，“Fc”区包含两个重链片段，所述两个重链片段包括抗体的CH2和CH3结构域。这两个重链片段通过两个或更多个二硫键和CH3结构域的疏水相互作用相互结合。
本文中，“Fab′片段”除了Fab片段外还包含重链CH1和CH2结构域之间的区域，并且它可以在两个Fab′片段分子的两条重链之间形成二硫键，以形成F(ab’)2分子。
本文中，“F(ab’)2片段”包含两条轻链和两条重链，所述重链包含可变区CH1和CH1与CH2结构域之间的恒定区的一部分，如上所述，从而在2个重链之间形成链内二硫键。因此，F(ab’)2片段由两个Fab′片段组成，并且两个Fab′片段通过它们之间的二硫键彼此会合。
本文中，“Fv区”是包含重链和轻链的每个可变区但不包含恒定区的抗体片段。sdFV是重链和轻链通过二硫键连接的抗体片段。scFc是Fv通过柔性接头连接的抗体片段。scFv-Fc是Fc与scFV连接的抗体片段。小型抗体是CH3与scFV相连的抗体片段。双抗体包含两个scFV分子。
本文中，“单链抗体(scAb)”是重链和轻链可变区通过柔性接头连接的包含重链或轻链恒定区的一个可变区的单一多肽链。短链抗体可以参考例如美国专利第5,260,203号，并且在此通过引用公开。
本文中，“结构域抗体(dAb)”是免疫功能性免疫球蛋白片段，其仅包含重链可变区或轻链可变区。在一种实施方式中，两个或更多个VH区通过肽接头通过共价键连接，以形成二价结构域抗体。该二价结构域抗体的两个VH区可以靶向相同或不同的抗原。
本文中，“二价抗原结合蛋白”或“二价抗体”包含两个抗原结合位点。该二价抗体中包含的两个抗原结合位点可具有相同的抗原特异性或可以分别结合不同的双特异性抗体。
本文中，“多特异性抗原结合蛋白”或“多特异性抗体”靶向两种或更多种抗原或表位。
本文中，“双特异性”，“双重特异性”抗原结合蛋白或抗体是具有2个不同抗原结合位点的杂合抗原结合蛋白或抗体。该双特异性抗体是一种多特异性抗原结合蛋白或多特异性抗体，并且可以通过已知的各种方法，例如杂交瘤的融合或Fab′片段的连接等方法来制备。例如，可以参考Songsivilai和Lachmann，Clin.Exp.Immunol.1990，79：315-321；Kostelny等人，J.Immunol.1992，148：1547-1553等。特异性抗原结合蛋白或抗体结合的两个抗原结合位点可以位于相同或不同蛋白质靶标中的两个不同表位。
本文中，术语“抗原”或“免疫原”是指例如抗原结合蛋白(例如，抗体或其免疫功能性抗原结合片段)可以结合的分子或分子的一部分，并可以用于在动物中产生可与抗原结合的抗体。抗原可包含一个或多个可与不同抗体或其片段相互作用的表位。在根据本发明的一种实施方式中，抗原是全长α-syn蛋白或C端缺失1至120个氨基酸残基的部分α-syn蛋白。
本文中，“表位”是由抗原结合蛋白或抗体结合或识别的分子的一部分，并且包括例如能够特异性结合抗原结合蛋白(例如抗体或T细胞受体)的决定簇分子。表位可以是连续的或不连续的，例如，可以是在多肽序列中处于分开位置且不连续的氨基酸残基，并且通过一种抗原结合蛋白结合，正如构象表位。在一种实施方式中，表位包括与用于产生抗体的表位相似但就不包括用于抗体产生的表位中的所有残基或残基的一部分而言可以是模拟物的三维结构。通常，表位是蛋白质，但它可能是其他种类的物质，如核酸。表位决定因子可以是通过诸如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基的分子在表面上形成的化学活性基团，或者可以具有特定的三维结构性质和/或特定电荷性质。通常，对特定靶抗原特异的抗体可以识别蛋白质和/或聚合物复合物中靶抗原的表位。本发明的抗体可识别C末端。在一种实施方式中，根据本发明的抗体识别α-Syn蛋白的C末端，特别是在其他实施方式中，识别110至120个残基或111至122个残基。特别地，当抗体识别110至122个残基时，抗体显示出对聚集体的优先结合特性。
本文中，“缀合物”是指与本文公开的抗体或其抗原结合片段不同的分子，特别是与下述的特别是血脑屏障转运剂或治疗剂的嵌合分子。在缀合物中，根据本发明的抗体或其抗原结合片段通过共价键、范德华力或疏水相互作用、包封、包埋或其组合方法与其他分子结合。在一种实施方式的缀合物中，根据本发明的抗体或其抗原结合片段可以通过肽接头连接。另外，在缀合物中，根据本发明的抗体或其抗原结合片段可以使用常规化学合成方法(例如，US2010/0028370)通过醇基、酸基、羰基、巯基或胺基与治疗剂连接。本文中，当根据本发明的抗体或其抗原结合片段通过共价键或肽连接体与其他肽连接时，形成融合蛋白。
如本文所用，术语“血脑屏障”或BBB是由在在脑，脊柱及其周围的循环系统之间存在的脑的毛细血管内皮细胞膜中的紧密连接形成的屏障。这些屏障非常稳健，并且限制具有约60Da分子量的小分子进入脑中。血脑屏障，血管脊髓屏障和血管视网膜屏障是中枢神经系统内的连续毛细血管屏障，通常称为BBB。
术语“血脑屏障转运剂”是指可以通过血脑屏障并递送根据本发明的抗体和抗原结合片段的包括肽和多肽的蛋白质、核酸、抗体或具有低分子量的化合物。
本文中，“治疗剂”是指为了目标治疗效果而施用于受试者的分子。受试者包括非人哺乳动物，例如灵长类动物或人类。治疗剂的实例包括含有肽和多肽的蛋白质、核酸、抗体或小分子化合物。在另一方面，治疗剂可以通过与本发明的抗体结合而用作与α-syn聚集体相关的疾病的治疗剂。
本文中，术语“治疗”意指减轻、缓解、减轻或治疗疾病的损伤、疾病或疾病的症状或病症；使患者能够承受疾病的损伤、疾病或疾病的症状或病症；延迟损伤、疾病或疾病的症状或病态病症的恶化；或减轻或治疗损伤、疾病或疾病的症状或病症，包括改善患者精神或身体生活质量的客观或主观参数。可以基于身体检查、与疾病相关的各种指标的检查和成像检查的结果来确定损伤、疾病或疾病的症状或病症的缓解或治疗。在一种实施方式中，该术语包括在本发明的方法中治疗与α-syn相关的疾病，降低疾病发生频率，降低疾病严重性和/或缓解与α-syn相关的疾病的症状。
如本文所用，术语“与α-Syn聚集体相关的疾病”是一组称为α-突触核蛋白病的神经退行性疾病，并且在包括神经元和神经胶质细胞群的病变中发现Syn聚集体，以多巴胺系统的退化，运动表现的改变，认知障碍以及路易体和Lewy神经突的形成为特征(Kim等人.阿尔茨海默病研究与治疗2014，6：73；McKeith等人，神经病学(Neurology)(1996)47：1113-24)。这些疾病包括帕金森病(PD)、帕金森病痴呆(PDD)、路易体痴呆(DLB)、阿尔茨海默病路易体变异型(LBV)、阿尔茨海默病合并帕金森病、多系统萎缩症(MSA)和与神经轴突有关的其他各种疾病，但不限于此。在一种实施方式中，本发明的抗体可用于治疗PD。
本文中，“有效剂量”通常是指足以降低由于疾病，特别是与α-syn相关的疾病引起的症状的严重性和/或发生频率的量，足以去除由于疾病，特别是与α-syn相关的疾病和/或疾病发生的根本原因引起的症状的量，或足以防止由于疾病，特别是与α-syn相关的疾病和/或疾病发生的根本原因引起的症状发生的量，和/或足以改善或纠正由疾病，特别是与α-syn相关的疾病引起的损伤的量。在一些实施方式中，有效剂量是治疗有效剂量或预防有效剂量。“治疗有效剂量”是足以治疗疾病，特别是与α-syn相关的症状或病症的量，或足以预防、延迟疾病，特别是与α-syn相关的症状或病症的量，或足以逆转其进展的量。“预防有效剂量”是用于预防或延迟疾病，特别是与α-syn或疾病症状有关的疾病，特别是与α-syn有关的疾病发生或再发生并降低其概率的量。完全治疗或预防效果可以通过几次施用而不通过单次施用来引起。因此，治疗或预防有效剂量可通过一次或多次施用来递送。
抗体或抗原结合片段
本发明公开了一种与包括人α-syn的α-syn蛋白特异性结合的抗体。如本文所公开的，根据本发明的抗体是包含一个或多个互补决定区或位点(CDR)的多肽。
在一种实施方式中，CDR包含在“骨架”区域中，并且骨架与CDR对齐，使得该CDR可以具有合适的抗原结合特性。
根据本发明的抗体与源自人的α-syn蛋白，特别是α-syn聚集体特异性结合。
在一种实施方式中，根据本发明的抗体可以以高亲和力优先与α-Syn聚集体结合并降低其浓度。通过根据本发明的抗体及其抗原结合片段减少或降解α-Syn聚集体涉及由抗原-抗体复合物引起的病原体的有效切割和降解，以促进细胞中溶酶体对α-Syn聚集体的降解。
在又一种实施方式中，抗体或其抗原结合片段以高亲和力优先结合α-Syn聚集体，因此可以防止α-Syn聚集体的额外形成，降低浓度，抑制细胞间转运，并在药物开发中降低有效剂量。
在另一种实施方式中，抗体或其抗原结合片段以高亲和力优先结合α-Syn聚集体，从而抑制或阻止α-Syn聚集体形式从一个细胞转移至另一个细胞。
在一种实施方式中，抗体包括单克隆抗体、双特异性抗体、双抗体、多特异性抗体、多抗体、微抗体、域抗体、抗体模拟物(或合成抗体)、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体或抗体融合体(或抗体缀合物)及其片段，但不限于此，并且抗体包括本文公开的各种形式的抗体。在一种实施方式中，本文公开的抗体的抗体片段包括Fab、Fab′、F(ab’)2、Fv、双抗体或重链和轻链通过间隔区连接的单链抗体分子。在其他实施方式中，本文公开的抗体可包括包含表1a和表1b中公开的可变区的仅轻链或仅重链的多肽。
本文公开的抗体与本文公开的另一种抗体共享特定区域或序列。在一种实施方式中，它可以共享抗体或抗原结合片段的恒定区。在另一种实施方式中，它可以共享Fc区。在另一种实施方式中，它可以共享可变区的骨架。
已经证实，本文公开的抗体以高亲和力结合人α-Syn聚集体。如实施例中另外描述的，测试了多个抗体克隆并发现其具有位于C端的110至120或111至122个残基中的表位。尽管不限于该理论，但与识别C端处的121至130个残基的常规抗体相比，本发明中抗体聚集体的优选结合和高亲和力可能是由于识别110至120个残基。
在一种实施方式中，根据本发明的抗体具有自然界中发现的抗体的典型结构。骆驼科动物产生由单个重链组成的抗体，但该抗体的结构单元通常包含四聚体多肽，并且四聚体包含两个由不同的2个多肽链组成的一对多肽链体。在典型的抗体中，一对多肽链体包含一条全长轻链(约25kDa)和一条全长重链(约50至70kDa)。每条链显示出特征性的折叠模式，并且由数个由约90至110个氨基酸组成的免疫球蛋白结构域组成。这些结构域是由抗体多肽组成的基本单元。每条链的氨基末端部分通常包含作为识别抗原部分的被称为可变区或V区的部分。羧基末端部分在进化上比氨基末端更保守，并且它包含被称为恒定区或C区的部分。人轻链通常分类为κ和λ轻链，它们分别包含一个可变区和一个恒定区。重链通常分为μ、δ、γ、α或ε链，这些分别定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE同种型。IgG包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，但具有无限多种亚型。IgM亚型包括IgM和IgM2。IgA亚型包括IgA1和IgA2。在人类中，IgA和IgD同种型包含4条重链和4条轻链；IgG和IgE同种型包含2条重链和2条轻链，IgM同种型包含5条重链和5条轻链。重链恒定区通常显示效应子功能，但包含一个或多个结构域。重链恒定区结构域的数量根据同种型而不同。例如，IgG重链包含分别称为CH1、CH2和CH3的3个C区。本文公开的抗体可以是这些同种型和亚型中的任何一种。在一种实施方式中，根据本发明的抗体是IgG1、IgG2、IgG2a、IgG2b、IgG3或IgG4亚型。
根据本发明的重链可变区和轻链可变区可以与人恒定区的至少一部分连接。恒定区的选择可以通过是否部分地需要抗体依赖性细胞介导的细胞毒性、抗体依赖性细胞吞噬作用和/或补体依赖性细胞毒性来确定。例如，人同种型IgG1和IgG3具有补体依赖性细胞毒性，人同种型IgG2和IgG4不具有这种细胞毒性。此外，人IgG1和IgG3比人IgG2和IgG4诱导更强的细胞介导的效应子功能。轻链恒定区可以是λ或κ。
在一种实施方式中，根据本发明的抗α-syn抗体可以是人抗体，并且重链恒定区可以是IgG1型、IgG2型、IgG3型或IgG4型。在进一步的实施方式中，本发明的抗体是IgG1型或IgG2型。
在全长轻链和重链中，可变区和恒定区通过长度为约12个或更多个氨基酸的“J”区连接，并且重链还包含约10个或更多个氨基酸的“D”区。例如，可参考基础免疫学(Fundamental Immunology)，第二版，Ch.7(Paul，W.编)1989，纽约雷文出版社。通常，抗体的轻链/重链对的可变区形成抗原结合位点。
免疫球蛋白链的可变区通常具有相同的总体结构，并且包含由称为“互补决定位点或区或域”或CDR(互补决定区)的3个高变区连接的相对保守的骨架区(FR)。衍生自由重链/轻链对组成组成的每条链的可变区的CDR通常根据骨架区排列，从而形成与靶蛋白(α-syn)的特定表位特异性结合的结构。天然存在的轻链和重链区的这些因子通常以如下顺序从N端到C端而被包含：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。可变区中对应于它们中的每一个的氨基酸序列的位置可以通过Kabat编号系统确定(免疫相关蛋白的Kabat序列(1987和1991，马里兰州贝塞斯达NIH)，或Chothia&Lesk，J.Mol.Biol.1987，196：901-917；Chothia等人.1989，Nature 1989，342：878-883)。
CDR序列分别由表1a至表1b中公开的根据本发明的抗体或抗原结合片段的重链和轻链可变区组成。在每个可变区中，CDR序列加下划线并分别以从前到后的顺序表示CDR1、CDR2和CDR3序列。可变区中的CDR序列以下划线显示。CDR1、CDR2和CDR3序列分别以从前到后的顺序显示。
[表1a]
[表1b]
在本发明的一种实施方式中，表1a和表1b中公开的抗体或抗原结合片段的重链和轻链可变区可以以各种方式组合以制备不同的抗体。此外，表1a和表1b中公开的抗体或抗原结合片段的重链和轻链可变区可以自由组合而不限制任何方法。
本文公开的每个重链和轻链可变区可以与作为靶标的各种重链和轻链恒定区结合以分别形成完整抗体的重链和轻链。另外，与这样的恒定区结合的重链和轻链序列中的每个也可以组合以形成完整的抗体结构。
根据本发明的抗体的重链和轻链的任意可变区可以与恒定区的至少一部分连接。可以根据是否需要抗体依赖性细胞介导的细胞毒性、抗体依赖性细胞吞噬作用和/或补体依赖性细胞毒性等来选择恒定区。例如，人同种型IgG1和IgG3具有补体依赖性细胞毒性，并且人同种型IgG2和IgG4不具有细胞毒性。人IgG1和IgG3还比人IgG2和IgG4诱导更强的细胞介导的效应子功能。例如，重链可变区可以结合IgG恒定区，包括IgG1、IgG2、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgG4，并且轻链可变区可以结合κ或λ恒定区。对于恒定区，可以根据需要使用适当的恒定区，例如，可以使用人或小鼠来源的恒定区。
在一种实施方式中，本文公开的重链可变区可以与鼠IgG2a恒定区或人IgG1恒定区连接，其可以在SEQ ID NO：113至126(包括鼠IgG2a恒定区)或SEQ ID NO：127至140(包括人IgG1恒定区)中示出。
在另一种实施方式中，本文公开的轻链可变区可以与小鼠κ恒定区或人κ恒定区连接，其可以在SEQ ID NO：141至154(小鼠κ恒定区)和SEQ ID NO：155至168(人κ恒定区)中示出。
另外，待与本文公开的可变区组合的这类恒定区序列是示例性的，并且本领域技术人员将知道包括可以用于稳定性、表达、可制造性或其他靶向性质的修饰恒定区的其他恒定区。
本发明包括与本文公开的一种或多种氨基酸序列具有实质的序列同一性的一种或多种氨基酸序列。实质的同一性意味着存在序列变异，但保持本文公开的效果。在一种实施方式中，它与表1a中公开的重链可变区具有约90％、95％或99％的同一性。在其他实施方式中，它与表1b中公开的轻链可变区具有约90％、95％或99％的同一性。例如，在变体显示与本文公开的抗体或抗原结合片段具有90％，95％或99％的同一性的情况下，任何变异发生在可变区的骨架中而不是CDR。
本文公开了编码本文公开的抗体或其抗原结合片段部分的一部分或全部的核酸。核酸包括PCR或序列分析引物，所述PCR或序列分析引物用于扩增、研究、分析或突变诱导编码每个抗体链、或抗体的片段、其突变体、衍生物或变体的多核苷酸，编码轻链或重链可变区或仅CDR的多核苷酸，足以用作杂交探针的多核苷酸，以及编码多肽的多核苷酸。核酸可以是任何长度。这些可以是长度为例如5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、750、1000或1500个或更多个的多核苷酸和/或可包含一种或多种其他序列(例如调节序列)，和/或可以是更大的核酸，例如载体的一部分。核酸可以是单链或双链，并且可以包含RNA和/或DNA多核苷酸，及其人工变体(例如肽核酸)。
在一种实施方式中，编码本文公开的抗体或其片段的核酸是编码本文公开的CDR、包含CDR的可变区、包含可变区和恒定区的全长抗体的核酸。当确定氨基酸序列时，考虑到已知的逆转录程序和密码子使用等，可以有用地确定核酸序列。示例性核酸序列可以是SEQID NO：169至182(包含小鼠IgG2a恒定区的重链)，SEQ ID NO：83至196(包含人IgG1恒定区的重链)，SEQ ID NO：197至210(包含小鼠κ恒定区的轻链)和SEQ ID NO：211至224(包括人κ恒定区的轻链)。
本发明还包括与本文公开的一种或多种核酸序列具有实质的序列同一性的一种或多种核酸序列。实质的同一性意味着由核酸编码的抗体或抗原结合片段保持本文公开的效果，甚至在引起保守取代或氨基酸变异的情况下，其中核酸的变异不伴随氨基酸取代。
抗体对聚集体的特异性和亲和力
根据本发明的抗体或抗原结合片段特别地具有对α-syn聚集体的特异性和高亲和力。在一种实施方式中，根据图6，对聚集体的亲和力为KD≤1.0×10-9M；在另一种实施方式中，亲和力为KD≤1.0×10-10M；在另一种实施方式中，亲和力为KD≤1.0×10-11M。具有高亲和力的根据本发明的抗体或抗原结合片段具有的优点在于，与具有低亲和力的抗体(例如，亲和力为10-7M或10-8M)相比，可以以较低的施用量施用。这并不限制抗体，例如抗体尽管通过更简单的方式施用(例如皮下注射)，但由于可以获得足够的功效，在临床上具有很大的优势。
此外，对α-Syn聚集体具有高亲和力的抗体及其抗原结合片段可以抑制和/或减少α-Syn聚集体的形成和/或积累，和/或细胞间转运，从而降低聚集体的浓度。此外，对α-Syn聚集体具有高亲和力的抗体和抗原结合片段可以减少中枢神经系统外的α-Syn聚集体形成，从而通过改变在血脑屏障边界形成α-Syn的平衡状态来降低中枢神经系统内聚集体的浓度。尽管不限于该理论，但是根据本发明的抗体或抗原结合片段可以通过去除单体，或者去除单体和聚集体两者来抑制聚集体的形成。
抗体的可变区
本发明涉及表1a和表1b中所示的抗体轻链可变区或抗体重链可变区，以及包括轻链可变区和重链可变区的免疫功能片段、衍生物、突变蛋白和变体的抗体(和相应的核酸序列)。
此外，包括编码表1a和1b中所示可变区的核酸序列。核酸序列未另外公开，因为它们包含在SEQ ID NO：169至182(包含鼠IgG2a恒定区的重链)、SEQ ID NO：183至196(包含人IgG1恒定区的重链)、SEQ ID NO：197至210(包含小鼠κ恒定区的轻链)和SEQ ID NO：211至224(包含人κ恒定区的轻链)中公开的编码全长抗体的核酸序列。基于表1中列出的可变区的氨基酸序列，本领域技术人员可以容易地获得编码蛋白质序列的核酸序列。
根据本发明的重链可变区和轻链可变区不同组合的抗体可以用“VHx/VLy”表示，其中“x”对应于重链可变区的SEQ ID NO，“y”对应于轻链可变区的SEQ ID NO。在一种实施方式中，根据本发明的可变区域可包括以下组合，但不限于此：
VH85/VL99、VH85/VL100、VH85/VL101、VH85/VL102、VH85/VL103、VH85/VL104、VH85/VL105、VH85/VL106、VH85/VL107、VH85/VL108、VH85/VL109、VH85/VL110、VH85/VL111、VH85/VL112；VH86/VL99、VH86/VL100、VH86/VL101、VH86/VL102、VH86/VL103、VH86/VL104、VH86/VL105、VH86/VL106、VH86/VL107、VH86/VL108、VH86/VL109、VH86/VL110、VH86/VL111、VH86/VL112；VH87/VL99、VH87/VL100、VH87/VL101、VH87/VL102、VH87/VL103、VH87/VL104、VH87/VL105、VH87/VL106、VH87/VL107、VH87/VL108、VH87/VL109、VH87/VL110、VH87/VL111、VH87/VL112；VH88/VL99、VH88/VL100、VH88/VL101、VH88/VL102、VH88/VL103、VH88/VL104、VH88/VL105、VH88/VL106、VH88/VL107、VH88/VL108、VH88/VL109、VH88/VL110、VH88/VL111、VH88/VL112；VH89/VL99、VH89/VL100、VH89/VL101、VH89/VL102、VH89/VL103、VH89/VL104、VH89/VL105、VH89/VL106、VH89/VL107、VH89/VL108、VH89/VL109、VH89/VL110、VH89/VL111、VH89/VL112；VH90/VL99、VH90/VL100、VH90/VL101、VH90/VL102、VH90/VL103、VH90/VL104、VH90/VL105、VH90/VL106、VH90/VL107、VH90/VL108、VH90/VL109、VH90/VL110、VH90/VL111、VH90/VL112；VH91/VL99、VH91/VL100、VH91/VL101、VH91/VL102、VH91/VL103、VH91/VL104、VH91/VL105、VH91/VL106、VH91/VL107、VH91/VL108、VH91/VL109、VH91/VL110、VH91/VL111、VH91/VL112；VH92/VL99、VH92/VL100、VH92/VL101、VH92/VL102、VH92/VL103、VH92/VL104、VH92/VL105、VH92/VL106、VH92/VL107、VH92/VL108、VH92/VL109、VH92/VL110、VH92/VL111、VH92/VL112；VH93/VL99、VH93/VL100、VH93/VL101、VH93/VL102、VH93/VL103、VH93/VL104、VH93/VL105、VH93/VL106、VH93/VL107、VH93/VL108、VH93/VL109、VH93/VL110、VH93/VL111、VH93/VL112；VH94/VL99、VH94/VL100、VH94/VL101、VH94/VL102、VH94/VL103、VH94/VL104、VH94/VL105、VH94/VL106、VH94/VL107、VH94/VL108、VH94/VL109、VH94/VL110、VH94/VL111、VH94/VL112；VH95/VL99、VH95/VL100、VH95/VL101、VH95/VL102、VH95/VL103、VH95/VL104、VH95/VL105、VH95/VL106、VH95/VL107、VH95/VL108、VH95/VL109、VH95/VL110、VH95/VL111、VH95/VL112；VH96/VL99、VH96/VL100、VH96/VL101、VH96/VL102、VH96/VL103、VH96/VL104、VH96/VL105、VH96/VL106、VH96/VL107、VH96/VL108、VH96/VL109、VH96/VL110、VH96/VL111、VH96/VL112；VH97/VL99、VH97/VL100、VH97/VL101、VH97/VL102、VH97/VL103、VH97/VL104、VH97/VL105、VH97/VL106、VH97/VL107、VH97/VL108、VH97/VL109、VH97/VL110、VH97/VL111、VH97/VL112；VH98/VL99、VH98/VL100、VH98/VL101、VH98/VL102、VH98/VL103、VH98/VL104、VH98/VL105、VH98/VL106、VH98/VL107、VH98/VL108、VH98/VL109、VH98/VL110、VH98/VL111或VH98/VL112。
如上所述的可变区的各种组合可以用作完整抗体和各种形式的包含scFV等的抗体。
CDR
本文公开的抗体是其中移植、插入和/或连接一个或多个根据本发明的CDR的多肽。在一种实施方式中，抗体可具有1、2、3、4、5或6个CDR。因此，抗体可以具有例如一个重链CDR1(“CDRH1”)和/或一个重链CDR2(“CDRH2”)和/或一个重链CDR3(“CDRH3”)，和/或一个轻链CDR1(“CDRL1”)和/或一个轻链CDR2(“CDRL2”)和/或一个轻链CDR3(“CDRL3”)。
对应于抗体在可变区中的互补决定区(CDR)和骨架区(FR)的氨基酸序列的位置可以通过Kabat确定(Kabat等，免疫相关蛋白的序列，第五版，美国卫生与人类服务部，PHS，NIH，NIH出版物编号91-3242，1991)。
表1a至1b中公开了待包含在根据本发明的抗体的重链和轻链中的CDR(或重链CDRH1由SEQ ID NO：1至14表示，重链CDR H2由SEQ ID NO：15至28表示，重链CDR H3由SEQ IDNO：29至42表示，轻链CDR L1由SEQ ID NO：43至56表示，轻链CDR L2由SEQ ID NO：57至70表示，轻链CDR L3由SEQ ID NO：71至84表示)。
本发明还包含与表1a至1b中公开的一种或多种CDR的氨基酸序列具有实质的序列同一性的一种或多种氨基酸序列。实质的同一性意味着存在序列变异，但保持本文公开的效果。
天然存在的抗体的CDR的结构和性质如上所述。简言之，在典型的抗体中，CDR被包含在由参与抗原结合和识别的区组成的重链可变区和轻链可变区的骨架中。可变区在骨架区中包含至少3个重链或轻链CDR(Kabat等人.1991，免疫相关蛋白的序列，马里兰州贝塞斯达N.I.H.公共卫生服务；或Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.1987，196：901-917；Chothia等人.1989，Nature 1989，342：877-883)。然而，本文公开的CDR用于定义抗原结合域的典型抗体结构，此外，如本文所公开的，CDR可以包含在其他各种多肽结构中。
本领域技术人员将理解，当抗体包含一种或多种本文公开的CDR时，公开的每种CDR可以彼此独立地选择和组合。因此，抗体具有1、2、3、4、5或6个独立选择的CDR。另外，本领域技术人员可以知道，当选择CDR用于组合时，不重复使用相同种类的CDR，例如，通常不将抗体制备为包含两个CDRH2区。
单克隆抗体
另外，可以通过使用本领域已知的任何技术制备单克隆抗体。例如，它可以通过对从免疫的转化动物收集的脾细胞永生化产生。脾细胞可以通过使用本领域已知的任何技术永生化，例如，通过将它们与骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤。用于产生杂交瘤的融合过程的骨髓瘤细胞优选是非抗体生产性的，具有高融合效率，并且使它们不能在缺乏某些酶并且仅支持靶融合细胞(杂交瘤)的生长的特定选择性培养基中生长。用于小鼠融合的合适细胞系的实例包括Sp-20、P3-X63/Ag8、P3-X63-Ag8.653、NS1/1.Ag 41、Sp210-Ag14、FO、NSO/U、MPC-11、MPC11-X45-GTG 1.7和S194/5XXO Bul，用于大鼠融合的细胞系的实例包括R210.RCY3、Y3-Ag1.2.3、IR983F和4B210。用于细胞融合的其他细胞系可以是U-266、GM1500-GRG2、LICR-LON-HMy2和UC729-6。
在一些情况下，杂交瘤细胞系通过从动物收集脾细胞(例如，具有人免疫球蛋白序列的转化动物，通过α-syn免疫原免疫的动物)；将收集的脾细胞与骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤细胞；由杂交瘤细胞建立杂交瘤细胞系，以及鉴定产生与α-syn结合的抗体的杂交瘤细胞系来产生。
可以通过使用本领域已知的技术来纯化由杂交瘤细胞系分泌的单克隆抗体。
嵌合和人源化抗体
出于各种目的，还可以通过各种方法来修饰抗体。可以提供嵌合抗体和人源化抗体。嵌合抗体是来源于不同抗体的多肽片段通过共价键连接形成免疫功能性轻链、重链或其片段的抗体。通常，嵌合抗体的轻链和/或重链的一部分是属于某个物种或某个类或亚型的序列，其余序列属于其他物种或其他类或亚型。对于制备嵌合抗体的方法，可以参考例如美国专利第4,816,567号；和Morrison等人，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6851-6855。对于CDR移植，可以参考例如美国专利第6,180,370号、第5,693,762号、第5,693,761号、第5,585,089号和第5,530,101号。
通常，制备嵌合抗体的目的是最大化在使用抗体的生物体中发现的氨基酸的数量。一个实例是“CDR移植的”抗体，其中所述抗体包含一种或多种来源于某个物种或某个类或亚型的CDR，其余部分来源于其他物种或其他类或亚型的抗体。例如，为了将其用于人，通过将啮齿动物抗体的可变区或选择的CDR移植到人抗体中，替换人抗体的天然存在的可变区或CDR，反之亦然。
最有用的嵌合抗体型是“人源化”抗体。通常，人源化抗体由最初在非人动物中产生的单克隆抗体产生。在这种单克隆抗体中，通常构成抗体的非抗原识别部分的特定氨基酸残基被修饰为与人抗体的相应同种型的相应残基同源。可以用各种已知方法进行人源化，例如用人抗体的相应区域取代啮齿动物可变区的至少一部分(美国专利第5,585,089和5,693,762号；Jones等人，Nature 1986，321：522-525；Riechmann等人，Nature 1988，332：323-27；Verhoeyen等人，Science 1988，239：1534-1536)。
在一个方面，将本文公开的抗体的轻链可变区和重链可变区的CDR植入到来自系统发育的相同或不同物种的抗体的骨架区(FR)中。例如，可以将本文公开的重链可变区和轻链可变区的CDR移植到保守的人FR中。为了产生保守的人FR，可以通过比对几种类型的人重链氨基酸序列或轻链氨基酸序列并从比对的序列中提取保守序列来获得FR的共有氨基酸序列。在其他实施方式中，本文公开的重链或轻链的FR被不同重链或轻链的FR取代。在一个方面，虽然仅在抗-α-Syn抗体的重链和轻链的FR中发现的特定氨基酸不被替换，不过可以替换剩余的FR氨基酸。特定氨基酸通常是存在于在FR中未观察到的位置处的特定氨基酸。可供选择地，从一条重链或轻链移植的可变区可以与不同于如本文公开的特定重链或轻链的恒定区的恒定区一起使用。在其他实施方式中，移植的可变区可以是单链Fv抗体的一部分。本文公开的抗体的轻链可变区和重链可变区的CDR可以以移植形式用于任何抗体。
另外，在一种实施方式中，对于来源于除人以外的物种的恒定区，可以使用与来源于人的可变区组合的杂合抗体。
完整的人抗体
本文还公开了完整的人抗体。可以制备对某些抗原特异的完整人抗体(“完整人抗体”)而不将人暴露于抗原。产生完整人抗体的一种方法是“人源化”小鼠体液免疫系统。内源Ig基因可以将人免疫球蛋白(Ig)遗传基因座引入未活化的小鼠，从而在小鼠中产生完整的人单克隆抗体(mAb)。如果使用完整的人抗体，可通过将小鼠或小鼠衍生的mAb施用于人体而引起的免疫原性反应和过敏反应可以被最小化。
这种完整的人抗体可以通过免疫转化的动物(通常是小鼠)来产生，所述转化的动物可以通过缺乏产生内源免疫球蛋白而产生人抗体。用于此目的的抗原通常具有6个或更多个连续氨基酸，并且随机地与载体(例如半抗原)缀合。例如，可以参考以下内容：Jakobovits等人，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：2551-2555；Jakobovits等人，1993，Nature 362：255-258；和Bruggermann等人，1993，Year in Immunol.7：33。作为一个实例，在该方法中，通过使编码小鼠重链和轻链免疫球蛋白链的内源性小鼠免疫球蛋白基因座失活并插入包含编码人重链和轻链蛋白的人基因组DNA的基因座片段来产生转化的动物。通过交叉交配部分包含人免疫球蛋白基因座的部分修饰的小鼠，产生其中引入完整人免疫球蛋白基因座的小鼠。当向动物施用免疫原时，对免疫原具有免疫特异性但包含可变区的抗体具有非鼠的人氨基酸序列。该方法参考例如WO96/33735和WO94/02602。与转化的小鼠相关用于制备人抗体的方法可参见美国专利第5,545,807号；第6,713,610号；第6,673,986号；第6,162,963号；第5,545,807号；第6,300,129号；第6,255,458号；第5,877,397号；美国专利第5,874,299号和第5,545,806号；WO91/10741、WO90/04036和EP 546073B1。
通过使用杂交瘤技术，然后可以产生具有所需特异性的抗原特异性人mAb，并从转基因小鼠(例如上述那些)中选择。可以使用合适的载体和宿主细胞克隆和表达这些抗体，或者可以从培养的杂交瘤细胞中收获抗体。
完整的人抗体也可以来源于噬菌体展示文库(Hoogenboom等人，1991，J.Mol.Biol.227：381；和Marks等人，1991，J.Mol.Biol.222：581)。噬菌体展示技术是模拟一种免疫选择的方法，其在丝状噬菌体的表面上展示抗体库，并从中筛选与靶抗原结合的噬菌体。这一种技术可以参考本文的实施例或BWO99/10494。在一种实施方式中，通过噬菌体展示方法(Krebber等人，J.Immunol.Methods.1997，201：35)分选本发明的完整人α-syn抗体。
双特异性或双功能性抗体
在一种实施方式中，本文公开的抗体还包含双特异性或双功能性抗体，所述双特异性或双功能性抗体包含一个或多个CDR或一个或多个可变区，如上所述。在一些情况下，双特异性或双功能性抗体是具有2个不同重链/轻链对和两个不同结合位点的人工杂合抗体，并且双特异性抗体可以通过使用各种方法制备，例如融合杂交瘤或Fab′片段的连接(Songsivilai和Lachmann，1990，Clin.Exp.Immunol.79：315-321；Kostelny等人，1992，J.Immunol.148：1547-1553)。
在根据本发明的一种实施方式中，本发明的抗体可以采取双特异性抗体的形式，所述双特异性抗体还包括与载体结合以通过血脑屏障递送。通过血脑屏障递送药物的一种方式涉及使用固有的递送系统(例如葡萄糖和氨基酸转运蛋白)以及受体介导的受体对胰岛素或转铁蛋白的转胞吞作用。受体介导的转胞吞作用中受体的例子如下：
胰岛素受体(如人胰岛素受体)、转铁蛋白受体、LRP(如LRP1、LRP6和LRP8)、黑皮质素受体、烟碱乙酰胆碱受体、VACM-1受体、IGFR、EPCR、EGFR、TNFR、瘦素受体、M6PR、脂蛋白受体、NCAM、LIFR、LfR、MRP1、AchR、DTr、谷胱甘肽转运蛋白、SR-B1、MYOF、TFRC、ECE1、LDLR、PVR、CDC50A、SCARF1、MRC1、HLA-DRA、RAMP2、VLDLR、STAB1、TLR9、CXCL16、NTRK1、CD74、DPP4、内皮生长因子受体1、2和3、糖皮质激素受体、离子型谷氨酸受体、M3受体、芳香烃受体、GLUT-1、肌醇-1，4，5-三磷酸(IP3)受体、N-甲基-D-天冬氨酸受体、S1P1、P2Y受体、TMEM30A和RAGE。
各种抗体变体
本文公开的抗体也是本文公开的抗体的变体。例如，一部分抗原在包含上文公开的重链或轻链、可变区或CDR序列的一个或多个残基中的保守氨基酸取代。天然存在的氨基酸可以基于侧链性质的共同特性分类如下：1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；2)中性，亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；3)酸性：Asp、Glu；4)碱性：His、Lys、Arg；5)影响链方向的残基：Gly、Pro；和6)芳香族：Trp、Tyr、Phe。
保守氨基酸的取代是指在分类中属于同一类别的不同残基的取代。保守氨基酸的取代还可以包含非天然存在的氨基酸残基(例如肽模拟物)，并且该残基通常通过化学合成而非细胞来引入。
非保守取代包括对上述分类中属于其他分类的残基的取代。可以在抗体的与人抗体同源的区域或非同源区域中引入该取代。
为了引入该取代，在一种实施方式中，可以考虑显示氨基酸的疏水性或亲水性的指数(亲水指数)。通过指定每种氨基酸的指数，然后重复平均这些值来计算蛋白质的指数谱(亲水性谱)。每种氨基酸的指数基于疏水性和电荷性质指定如下：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。
为了给蛋白质提供相互作用的生物学功能，指数谱的重要性是本领域已知的(Kyte等人，1982，J.Mol.Biol.157：105-131)。已知特定氨基酸可以被具有相似数值指数或分数的其他氨基酸取代，并且可以保持相似的生物活性。在一种实施方式中，为了基于指数执行改变，包括指数在±2、±1或±0.5内的取代。
另外，相似氨基酸之间的取代，特别是当通过取代产生的蛋白质是具有如本文所述的免疫学活性的蛋白质时，可以基于亲水性进行。在一种实施方式中，由亲密氨基酸的亲水性决定的蛋白质的最大局部平均亲水性值与蛋白质的生物学性质(例如免疫原性和抗原结合性质)有关。
氨基酸残基的亲水性值如下：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)和色氨酸(-3.4)。在基于相似亲水性值的取代的情况下，在一种实施方式中，包括其亲水性值在±2、±1或±0.5内的氨基酸取代。另外，可以基于亲水性从一级氨基酸序列鉴定表位。另外，这些区域被称为“表位核心区域”。
表2中显示了氨基酸的示例性保守取代。
[表2]氨基酸的保守取代
原始残基 示例性取代
Ala Ser
Arg Lys
Asn Gln，His
Asp Glu
Cys Ser
Gln Asn
Glu Asp
Gly Pro
His Asn，Gln
Ile Leu，Val
Leu Ile，Val
Lys Arg，Gln，Glu
Met Leu，Ile
Phe Met，Leu，Tyr
Ser Thr
Thr Ser
Trp Tyr
Tyr Trp，Phe
Val Ile，Leu
本领域技术人员将使用已知技术确定本文公开的多肽的合适变体。本领域技术人员将发现，通过靶向认为对多肽中的活性不重要的区域，可以在不破坏活性的情况下改变蛋白质的位点。本领域技术人员还将鉴定相似多肽之间保守的残基或部分。另外，在其他实施方式中，对于被认为对生物活性或结构重要的部分，可以进行保守氨基酸取代，而不破坏生物活性或对多肽结构产生负面影响。
此外，本领域技术人员可以进行结构-功能分析以鉴定类似多肽中对活性或结构重要的残基。通过该分析，在一种蛋白质中，可以通过找到与对与该蛋白质类似的蛋白质的活性或结构的重要氨基酸残基对应的残基来预测靶蛋白质中的重要氨基酸残基。本领域技术人员可以将由此预测的重要氨基酸残基替换为与其化学相似的氨基酸。
此外，本领域技术人员可以基于类似多肽的三维结构和与其相关的氨基酸序列分析来预测与抗体的三维结构相关的氨基酸残基。本领域技术人员不引入快速变化，因为预测为在蛋白质表面上存在的氨基酸残基可能参与与另一分子的重要相互作用。此外，本领域技术人员可以产生测试变体，该测试变体包括在每个靶向氨基酸残基中取代单个氨基酸。然后通过使用对抗原的结合能力筛选这些变体，从而收集关于哪种氨基酸取代与目的匹配的信息。使用此信息，本领域可以容易地确定待取代的位置或待避免的位置。
另外，可以基于蛋白质的二级结构确定待取代的位置。例如，一种预测二级结构的方法基于同源性建模。例如，可具有超过30％的序列同一性或超过40％的相似性的2种多肽或蛋白质可具有相似的结构相(Holm等人，1999，Nucl.Acid.Res.27：244-247)。对于预测二级结构的其他方法，包括“穿线”(Jones，1977，Curr.Opin.Struct.Biol.7：377-387；Sippl等人，1996，Structure 4：15-19)、“谱分析”(Bowie等人，1991，Science 253：164-170；Gribskov等人，1990，Meth.Enzym.183：146-159；Gribskov等人，1987，Proc.Nat.Acad.Sci.84：4355-4358)和“进化联系”(Holm，1999，同上；和Brenner，1997，同上)。
在一些实施方式中，氨基酸取代能够(1)降低对蛋白质分解的敏感性，(2)降低对氧化的敏感性，(3)改变对形成蛋白质复合物的结合亲和力，(4)修饰抗原结合亲和力和/或(5)修饰以提供具有其他物理化学或功能特性的蛋白质。例如，包括保守取代的单个或多个氨基酸的取代可以不在涉及分子间接触的结构域中进行取代，而是在其他部分进行取代。在该实施方式中，可以使用基本上不改变亲本序列的结构特性的保守氨基酸取代，例如，对一个或多个不改变抗体二级结构的氨基酸的取代。本领域已知的多肽的二级和三级结构的实例可以参考蛋白、结构和分子原理(Proteins，Structures and Molecular Principles)(Creighton编)，1984，W.H.纽约弗里曼公司；蛋白质结构介绍(Introduction to ProteinStructure)(Branden and Tooze编)，1991，纽约加兰出版；和Thornton等人，1991，Nature354：105)。
在另外优选的抗体变体中，包括其中在亲本序列中一个或多个半胱氨酸残基缺失的变体或半胱氨酸残基被其他氨基酸(例如丝氨酸)取代的变体。半胱氨酸变体尤其是其中抗体具有生物活性的结构，并且当需要再次折叠时，它是有用的。与亲本抗体相比，半胱氨酸变体可具有少量半胱氨酸残基，并且通常可包含偶数以便使由于未成对的半胱氨酸引起的相互作用最小化。
本文公开的重链和轻链，可变区结构域和CDR可用于制备包含可特异性结合α-syn的抗原结合区的多肽。例如，表1a至表1f中公开的CDR中的一个或多个可以与如多肽的分子非共价或共价结合，因此它们可以用作免疫原性粘附分子。该免疫原性粘附分子可以是CDR整合在大聚合物中，或CDR与另一多肽连接。该免疫原性粘附分子允许特异性结合靶向与其连接的多肽或其他物质(例如α-syn或表位)的抗原。
还提供了基于本文公开的可变区和CDR的肽模拟物。该模拟物可以是肽、非肽或肽和非肽的组合，并且可以参考以下内容：F Fauchere，1986，Adv.Drug Res.15：29；Veber和Freidinger，1985，TINS p.392；以及Evans等人，1987，J.Med.Chem.30：1229。结构上与一种有用的多肽类似的肽模拟物具有与原始多肽类似的效果。该化合物可以通过使用计算机化的分子模型来开发。通常，肽模拟物在结构上类似于显示与本文的α-syn特异性结合的能力的抗体，但肽键中的一个或多个可以通过本领域广为人知的方法被选自-CH2NH-、-CH2S-、-CH2-CH2-、-CH-CH-(顺式和反式)、-COCH2-、-CH(OH)CH2-和CH2SO-键取代。为了产生更稳定的蛋白质，保守序列的一个或多个残基可以被取代为相同类型的D-氨基酸(例如，D-赖氨酸取代L-赖氨酸)。另外，可以使肽环化的分子可以在内部引入形成半胱氨酸残基的交联，从而产生结构上对保守序列施加限制的肽(Rizo和Gierasch，1992，Ann.Rev.Biochem.61：387)。
本发明还提供了本文公开的抗体的衍生物。衍生化抗体可包含提供靶向性质(例如在抗体或其片段的某些用途中增加的半衰期)的任何分子或物质。衍生化抗体可包含可检测(或标记)的残基(例如：与放射性、比色性、抗原性或酶分子、可检测的珠子(例如磁性或电子致密的(例如金)珠子)或其他分子(例如生物素或链霉抗生物素蛋白)结合的分子)、治疗或诊断残基(例如：放射性、细胞毒性或药物活性残基)，或增加抗体对特殊用途(例如，施用于受试者(例如人受试者)或其他体内或体外用途)的适应性的分子。对于用于衍生抗体的分子的实例，包括白蛋白(例如人血清白蛋白)和聚乙二醇(PEG)。可以通过使用本领域广泛已知的技术来制备抗体的白蛋白连接和聚乙二醇化衍生物。在一种实施方式中，包括聚乙二醇化单链多肽。在另一种实施方式中，抗体可以与转甲状腺素蛋白(TTR)或TTR变体缀合或连接。TTR或TTR变体可以通过选自由以下组成的组中的化学物质进行化学改性：例如，葡聚糖、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)、聚乙二醇、丙二醇同聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇和聚乙烯醇。
其他衍生物包括α-syn结合蛋白与其他蛋白质或多肽的共价或凝聚缀合物，其可以例如通过表达包含在α-syn蛋白的N端或C端融合的异源多肽的重组融合蛋白来制备。例如，缀合的肽可以是异源信号(或读者)多肽(例如酵母α-因子读者)、或肽(例如表位标签)。含有α-syn抗体的融合蛋白可以包含添加的肽，以便容易地纯化或鉴定α-syn结合蛋白(例如：poly-His)。如Hopp等人，1988，Bio/Technology 6：1204；和美国专利第5,011,912号所述，α-syn结合蛋白也可以与FLAG肽连接。FLAG肽具有优异的抗原性，因此充当待被特异性单克隆抗体(mAb)可逆结合的表位，从而允许快速确认并容易地纯化重组蛋白。
在一种实施方式中，涉及包含多个α-syn结合多肽的寡聚体，所述多个α-syn结合多肽待通过与α-syn结合蛋白融合的肽残基之间的共价或非共价相互作用结合。待结合的肽可以是肽，例如肽接头(间隔区)或具有促进寡聚化的性质的亮氨酸拉链。在一种实施方式中，寡聚体包含2或4个α-syn结合蛋白。低聚物的α-syn结合蛋白残基可以是上述任何形式，例如变体或片段。优选地，寡聚体包含具有α-syn结合活性的α-syn结合蛋白。
在一种实施方式中，通过使用来源于免疫球蛋白的多肽制备寡聚体。包含与抗体衍生的多肽的各种位点(包括Fc结构域)融合的异源多肽的融合蛋白的制备可以参考例如Ashkenazi等人，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：10535；Byrn等人，1990，Nature 344：677；和Hollenbaugh等人，1992“免疫球蛋白融合蛋白的构建”，免疫学常用方案，Suppl.4，第10.19.1-10.19.11页。
其他实施方式涉及包含2种融合蛋白的二聚体，其中α-syn结合蛋白与抗体的Fc区融合。二聚体可以通过将编码融合蛋白的基因融合体插入合适的表达载体中，在通过重组表达载体转化的宿主细胞中表达基因融合体，并使表达的融合蛋白与抗体分子类似地组合来制备，并且就此而言，在Fc残基之间形成链之间的二硫键以收集二聚体。
本文使用的术语“Fc多肽”是来源于抗体Fc区的多肽，并且包括野生型或突变型。还包括包含促进二聚化的铰链区的切割形式的多肽。包含Fc或由其形成的寡聚物的融合蛋白具有容易使用蛋白A或蛋白G柱用亲和层析分离的优点。
对于合适的Fc多肽的实例，有美国专利第5,426,048号和第5,262,522号、第5,457,035号和Baum等人，1994，EMBO J.13：3992-4001描述的那些。在该突变蛋白的氨基酸序列中，野生型氨基酸的第19个残基从Leu取代为Ala，氨基酸的第20个残基从Leu取代为Glu，氨基酸的第22个残基从Gly取代为Ala。在突变蛋白中，对Fc受体的亲和力降低。
在其他实施方式中，本文公开的α-syn结合蛋白的重链和/或轻链的可变区可以被取代并进入另一抗体的重链和/或轻链的可变区。
标签和效应子基团
在一些实施方式中，根据本发明的抗体或抗原结合片段可包含一种或多种标记。“标记”是指任何可检测的物质。合适的标记基团例如，包括但不限于放射性同位素或放射性核素(例如：3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I)、荧光基团(例如FITC、罗丹明、镧系荧光物质)，酶基团(例如辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶，荧光素酶，碱性磷酸酶)，化学发光基团、生物素基团或由第二报告分子识别的某些多肽表位(例如，亮氨酸拉链对序列、二抗结合位点、金属结合结构域、表位标签)。在一些实施方式中，标记基团通过各种长度的空间臂与抗体偶联以减少潜在的空间位阻。标记蛋白质的各种方法是本领域已知的，并且本领域技术人员将针对特定目的选择合适的标记和适当的方法。
术语“效应子基团”是与抗体或物质偶联或缀合以起细胞毒性剂作用的物质。用于治疗的适当材料的实例包括用于治疗的放射性物质，例如放射性同位素或放射性核素(例如：3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I)。在一些实施方式中，效应子基团通过各种长度的间隔臂与抗体偶联以减少潜在的空间位阻。
通常，标签可根据检测方法分类：a)放射性或同位素标记；b)磁性标记(例如磁性颗粒)；c)氧化还原活性残基；d)光学染料；酶基团(例如辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶)；e)生物素基团；f)由第二报告分子识别的某些多肽表位(例如：亮氨酸拉链对序列，二抗结合位点，金属结合结构域，表位标签等)。在一些实施方式中，标记基团通过各种长度的间隔臂与抗体偶联以减少潜在的空间位阻。用于标记蛋白质的各种方法是本领域已知的。
在一种实施方式中，标记物包含光学染料，所述光学染料包含发色团、磷光体和荧光物质，但不限于此。荧光物质可以是小分子荧光物质或蛋白质荧光物质。
“荧光标记”是指通过物质所具有的荧光特性来检测的任何分子。荧光标记例如，包括但不限于荧光素、罗丹明，四甲基罗丹明，曙红，赤藓红，香豆素，甲基香豆素，芘，孔雀石绿，二苯乙烯，荧光黄，级联蓝J，德克萨斯红，IAEDANS，EDANS，BODIPY FL，LC红640，Cy 5，Cy 5.5，LC红705，俄勒冈绿，alexa-fluor染料(alexa-fluor 350，alexa-fluor 430，alexa-fluor 488，alexa-fluor 546，alexa-fluor 568，alexa-fluor 594，alexa-fluor633，alexa-fluor 647，alexa-fluor 660，alexa-fluor 680)，级联蓝(cascade blue)，级联黄(cascade yellow)和R-藻红蛋白(PE)，FITC，Cy5，Cy5.5和Cy7等。各种光学染料可以参考分子探针手册(Molecular Probes Handbook)，Richard P.Haugland。
蛋白质荧光标记物质包括：绿色荧光蛋白，其包括海肾(Renilla)，海笔(Ptilosarcus)或多管水母(Aequorea)物种的GFP(Chalfie等人，1994，Science 263：802-805)，EGFP(Clontech Labs公司，Genbank登录号U55762)、蓝色荧光蛋白(BFP，加拿大魁北克Quantum Biotechnologies公司；Stauber，1998Biotechniques 24：462-471；Heim等人，1996，Curr.Biol.6：178-182)，增强黄色荧光蛋白(EYFP，Clontech Labs公司)，荧光素酶(Ichiki等人，1993，J.Immunol.150：5408-5417)，β半乳糖苷酶(Nolan等人，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85：2603-2607)，但不限于此。
核酸
在一个方面，本发明涉及在特定杂交条件下与本文公开的核酸杂交的核酸。核酸的杂交方法在本领域中是众所周知的。例如，可参考分子生物学通用方法，John Wiley&Sons，NY(1989)，6.3.1-6.3.6。本文中，严格杂交条件使用包含5×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)、0.5％SDS、1.0mM EDTA(pH8.0)的预洗涤溶液；约50％甲酰胺、6×SSC的杂交缓冲液，杂交温度为55℃(或其他类似的杂交溶液，例如包含约50％甲酰胺的溶液，杂交温度为42℃)，洗涤条件为在0.5x SSC，0.1％SDS中60℃。严格杂交条件是在45℃下用6×SSC杂交，然后在68℃下用0.1×SSC杂交，在0.2％SDS中洗涤一次或多次。此外，本领域技术人员将选择所需的适当杂交条件，使得包含至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％相同核苷酸序列的核酸序列之间通常保持彼此杂交的状态。
影响杂交条件和适当条件选择的基本参数可以参考例如Sambrook，Fritsch和Maniatis，(2001，分子克隆：实验手册，冷泉港实验室出版社，纽约冷泉港，如上；以及分子生物学通用方案，1995，Ausubel等编，John Wiley&Sons公司，第2.10和6.3-6.4节中。这些条件可以由本领域技术人员基于例如核酸的长度和/或碱基组成(A、G、C和T(U)的构型)等容易地确定。
本文公开的核酸还包括突变体变体。核酸编码的多肽(抗体或抗体衍生物)的氨基酸序列的变化可以通过核酸中的突变来诱导。可以通过使用本领域已知的任何技术引入突变体。例如，可以使用定点诱变方法、随机诱变方法。针对具有靶向性质的多肽分选如此制备的核酸突变体。
在不显著改变由核酸编码的多肽的生物活性的情况下，可以将突变体引入核酸中。例如，可以进行核苷酸取代，所述核苷酸取代在非必需氨基酸残基中引起氨基酸取代。可供选择地，可以将一种或多种选择性改变由核酸编码的多肽的生物活性的突变体引入核酸中。例如，突变体可以定量或定性地改变生物活性。定量变化的实例包括活性的增加、减少或消除。定性变化的实例包括对抗体的抗原的特异性改变。在一种实施方式中，可以通过使用本领域广泛已知的分子生物学技术突变编码本文公开的任何抗体或其片段的核酸，从而修饰氨基酸序列。
另一方面，本发明还涉及适合用作检测本文公开的核酸序列的引物或杂交探针的核酸分子。该核酸可以包含待用作探针或引物的全长核酸序列的一部分，例如，编码全长多肽的核酸片段、或编码多肽的活性部分(α-syn结合部分)的片段核酸。
基于核酸序列制备的引物和探针可用于检测编码本文公开的核酸或类似核酸或多肽的转录组。在一种实施方式中，该探针可用于鉴定表达根据本发明的多肽的细胞。引物或探针可以用标记物质(例如放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子)来标记。
另一方面，此外，本发明提供了载体，其包含编码根据本发明的多肽或其部分的核酸(例如，包含一个或多个CDR或一个或多个可变区结构域的片段)。载体的实例包括质粒、病毒载体、非附加体哺乳动物载体和(重组)表达载体等，但不限于此。重组表达载体可包含用于在宿主细胞中表达核酸的合适形式的核酸。重组表达载体包含基于待用于表达的宿主细胞的一种或多种调节序列，并且这些调节序列与待表达的核酸序列可操作地连接。在调节序列中，例如，包括：SV40初始基因增强子；启动子，例如Rous肉瘤病毒启动子和巨细胞病毒启动子，所述启动子可以控制各种宿主细胞中核苷酸序列的表达；或者，仅在特定宿主细胞中控制核苷酸序列的表达的组织特异性调节序列，例如组织特异性调节序列(Voss等人，1986，Trends Biochem.Sci.11：287，Maniatis等人，1987，Science 236：1237)，以及通过响应于特殊处理或条件而指示诱导表达核苷酸序列，例如在哺乳动物细胞中起作用的金属硫蛋白启动子，以及在原核生物和真核生物系统中起作用的tet反应性和/或链霉素反应性启动子。考虑到诸如待转化的宿主细胞的种类、靶蛋白的表达程度等因素，本领域技术人员将选择合适的载体和调节序列。选择的表达载体可以在宿主细胞中递送，并且可以用于产生由本文公开的核酸编码的蛋白质。
另一方面，本发明提供了引入重组表达载体的宿主细胞。宿主细胞可以是任何原核生物(例如大肠杆菌)或真核生物(例如，酵母、昆虫或哺乳动物细胞)。可以通过已知的转化或转染技术将载体DNA引入原核或真核细胞中。已知在哺乳动物细胞中稳定转染的情况下，取决于所用表达载体的种类和转化技术，只有少数细胞可以在其基因组中整合通过转染而递送的DNA。因此，为了鉴定和选择转染的细胞，通常将编码选择标记(例如抗生素抗性标记)的基因与靶向基因一起引入宿主细胞。对于优选的选择标记，包括药物，例如，提供对例如G418、潮霉素和甲氨蝶呤的抗性的那些药物。通过仅通过药物处理选择存活细胞，可以实现对稳定引入靶核酸的细胞的分选。
抗体的制备
本文中，非人抗体可以来源于例如任何产生抗体的动物，例如小鼠、大鼠、兔、山羊、驴或非人灵长类动物(例如，猴子，例如食蟹猴或恒河猴)或类人猿(例如，黑猩猩)。可通过使用本领域已知的方法免疫动物来产生非人抗体。抗体可以是多克隆的、单克隆的、或者可以通过表达重组DNA在宿主细胞中合成。通过将抗原施用于包含人免疫球蛋白基因座的转化动物，或用抗原处理表达人抗体库的噬菌体展示文库，然后选择目的抗体，可以制备完整的人抗体。
单克隆抗体(mAb)可以通过各种技术产生，所述技术包括常规的单克隆抗体方法，例如文献的标准体细胞杂交技术(参见：Kohler和Milstein，1975，Nature)。256：495)。可供选择地，例如，可以使用将B淋巴细胞转化为病毒或肿瘤基因并使用的方法。鼠系统是广泛使用的用于产生杂交瘤细胞的动物系统。免疫方案和用于融合的免疫小鼠的脾细胞的分离技术在本领域中是众所周知的。在该方法中，来自免疫小鼠的B细胞与例如永生化融合配偶体细胞(例如鼠骨髓瘤细胞系)融合。如果必要，可以免疫大鼠或其他哺乳动物而不免疫小鼠，并且可以将源自这些动物的B细胞与鼠骨髓瘤细胞系融合，以产生杂交瘤。可供选择地，作为用于融合的骨髓瘤细胞系，可以使用来源于除小鼠以外的动物的细胞系。
本文公开的单一抗体可以通过使用氨基酸交联(短肽接头)连接重链和轻链可变结构域(Fv区)片段来产生。该单链Fv(scFv)可以通过在编码2个可变结构域多肽(VL和VH)的DNA之间融合编码肽接头的DNA来制备。制备的多肽可以通过折叠形成抗原结合二聚体，或者可以根据2个可变结构域之间的柔性接头的长度形成聚合物(例如，二聚体、三聚体或四聚体)(Kortt等人，1997，Prot.Eng.10：423；Kortt等人，2001，Biomol.Eng.18：95-108)。通过组合包含不同的VL和VH的多肽，可以形成与不同表位结合的聚合scFv((Kriangkum等人，2001，Biomol.Eng.18：31-40)。进一步地，用于产生另外的单链抗体的技术可以参考例如以下：美国专利第4,946,778号；Bird，1988，Science 242：423；Huston等人，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85：5879；Ward等人，1989，Nature 334：544，de Graaf等人，2002，Methods Mol Biol.178：379-387。本文公开的单链抗体包括scFv，scFv包含表1a至1f中所述的重链和轻链可变区的结构域的组合，或包含表1a至表1中所述的CDR的轻链和重链可变结构域的组合，但不限于此。
本文公开的抗体还可以通过亚型转换修饰为不同亚型的抗体。因此，IgG抗体可以来源于例如IgM抗体，反之亦然。通过该技术，制备具有与亲本抗体相同的抗原结合特性但对改变的亚型具有与亲本抗体不同的特征生物学特性的新抗体。对于这种转换，可以使用重组DNA技术。例如，可以使用编码靶同种型抗体的恒定结构域的DNA来制备该抗体。例如，可以参考Lantto等人，2002，Methods Mol.Biol.178：303-316。此外，在转换IgG4的情况下，为了降低在重链中形成可能导致IgG4抗体的异质性的二硫键的倾向，可优选在铰链区引入点突变(CPSCP-＞CPPCP)，如文献Bloom等人，1997，Protein Science 6：407中所述。
因此，本文公开的抗体包含可变结构域组合抗体，该可变结构域组合抗体例如用本文公开的靶同种型(例如，IgA、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgE和IgD)转换。
另外，还已知制备具有不同性质的抗体的技术，比如对抗原具有各种亲和力的抗体。该技术例如是通过在丝状噬菌体表面上展示免疫球蛋白可变结构域基因库(被称为噬菌体展示)来进行的链改组。另一种技术可参考Marks等人，1992，BioTechnology 10：779中的公开内容。
为了产生具有靶向优选的功能和生物化学性质的α-syn结合蛋白，可以对表1a和表1b中描述的重链和轻链可变区或者表1b中描述的CDR进行保守修饰(和对应于编码核酸的修饰)。进行该修饰的方法如前所述。
可以以各种方法进一步修饰α-syn抗体。例如，当用于治疗目的时，为了增加血清半衰期或改善蛋白质递送，它可以与聚乙二醇缀合，即聚乙二醇化。可供选择地，可以将本发明的抗体或其片段的可变区与不同抗体分子的Fc区融合。用于此目的的Fc区不与补体结合，因此当融合蛋白用作治疗剂时，其在减少患者细胞裂解发生的方向上被修饰。另外，本发明的抗体或其功能片段可以与人血清白蛋白缀合，以改善抗体或其抗原结合片段的血清半衰期。抗体或其抗原结合片段的另一种有用的融合配偶体是转甲状腺素蛋白(TTR)。TTR具有形成四聚体的能力，因此抗体-TTR融合蛋白可以形成蛋白质的结合亲合力增加的多价抗体。
可供选择地，可以通过重链和轻链的氨基酸序列中的取代来实现对本文公开的抗体的功能和/或生物化学性质的实质性修饰，它显著影响例如(a)取代位点中的分子骨架结构，如片状或螺旋状，(b)分子在靶位点的电荷或疏水性，或(c)侧链的松散性。
本文公开的抗体的氨基酸取代(保守的或非保守的)可以由本领域技术人员通过应用常规技术进行。氨基酸取代可用于鉴定本文公开的抗体的重要残基，或增加或降低抗体对人α-syn的亲和力，或改变本文公开的另一种抗体的结合亲和力。
表达抗体的方法
本发明还涉及包含至少一种如上所述的多核苷酸的质粒、表达载体、转录或表达盒形式的表达系统和构建体，包含该表达系统或构建体的宿主细胞，以及使用表达系统或宿主细胞制备抗体的方法。
可以通过使用上述技术制备本文公开的抗体。例如，α-Syn抗体可以使用重组表达系统，根据本领域已知的技术，参考单克隆抗体，杂交瘤：生物学分析的新次元(MonoclonalAntibodies，Hybridomas：A New Dimension in Biological Analyses)，Kennet等人(编)纽约Plenum出版社(1980)；和抗体：实验手册，Harlow和Lane(编)，冷泉港实验室出版社，纽约冷泉港(1988)来制备。
抗体可以在除杂交瘤之外的杂交瘤细胞系或表达细胞系中表达。可以使用编码抗体的表达构建体来转化哺乳动物、昆虫或微生物宿主细胞。如上所述，可以通过使用各种任何已知的将多核苷酸导入宿主细胞的方法来执行诸如质粒的构建体。根据宿主细胞的种类，详细方法可能不同。在哺乳动物细胞中引入异源多核苷酸的方法在本领域中是众所周知的，例如，它可以通过例如葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、聚凝胺介导的转染、原生质体融合、电穿孔、使用脂质体递送的多核苷酸的包封、混合核酸和带正电荷的脂质，以及将DNA直接显微注射到核内来进行，但不限于此。
重组表达结构通常包含编码多肽的核酸分子，所述多肽包含以下中的一种或多种：本文公开的一种或多种CDR；轻链恒定区；轻链可变区；重链可变区；重链恒定区(例如，CH1、CH2和/或CH3)；和/或α-syn抗体的其他支架部分。通过使用标准连接技术将核酸序列插入合适的表达载体中。在一种实施方式中，重链或轻链恒定区与抗α-syn特异性重链或轻链可变区的C端连接，并连接到表达载体中。选择载体以便在使用载体的特定宿主细胞中起作用。换句话说，载体应使用待使用的宿主细胞的机构扩增和/或表达载体中包含的基因。在一种实施方式中，使用以蛋白质-片段互补分析的载体，所述蛋白质-片段互补分析使用蛋白质报告分子(例如美国专利第6,270,964号中公开的二氢叶酸还原酶)。适当的表达载体可以商业购买，例如，从Life Technologies或BD Biosciences等公司购买。用于克隆和表达抗体和片段的其他载体的实例可以参考Bianchi和McGrew，2003，Biotech.Biotechnol.Bioeng.84：439-44；酶学方法(Methods Enzymol.)，第185卷(D.V.Goeddel编)，1990，纽约学术出版社，公开的那些。
通常，用于任何宿主细胞的表达载体可包含质粒维持和克隆以及表达外源核苷酸序列所需的基本序列。在具体实施方式中，这种基本序列通常包含下列核苷酸序列的一种或多种：启动子、一个或多个增强子序列、复制起点、转录终止序列、包含供体和受体剪接位点的完整内含子序列、编码用于多肽分泌的读者序列的序列、核糖体结合位点、多腺苷酸化序列、用于插入编码待表达多肽的核酸的多接头区、和选择标记序列。
选择性地，载体可以包含“标签”-编码序列，换句话说，位于α-syn结合蛋白编码序列的5′或3′端的寡核苷酸分子；所述寡核苷酸序列可编码多聚His(例如：六聚His)或存在于可商购获得的抗体的其它“标签”，例如，HA(血凝素流感病毒)、Fc或myc。通常，这些标签可以与多肽融合并表达，并且在从宿主细胞分离α-syn结合蛋白期间用作亲和纯化或检测的工具。可以例如通过使用用于标签的抗体作为亲和基质的柱色谱法来实现亲和纯化。选择性地，这些标签可以通过包括使用特定的肽酶的各种方法从纯化的α-syn结合蛋白中去除。
上述基本序列可以是同质的、异质的、或杂合的、合成的或固有的。在这方面，基本序列来自任何原核生物或真核生物、任何脊椎动物或无脊椎动物，或任何植物，只要它可以被激活并在宿主细胞机构中起作用。
包含在载体中的有用的基本序列可以通过本领域广泛已知的各种方法收集。通常，本文使用的基本序列通过作图和/或限制性酶切预先确认，因此，可以使用适当的限制酶将其与适当的组织供应源分离。在一些情况下，基本序列的总核苷酸序列可以是已知的，并且可以通过使用本文公开的核酸合成或克隆方法合成基本序列。
无论基本序列的总序列或部分序列是否已知，可以通过使用聚合酶链式反应(PCR)和/或用合适的探针(例如来自相同或不同物种的寡核苷酸和/或基本序列片段)筛选基因组文库来收集基本序列。如果基本序列未知，则可以将包含基本序列的DNA片段与例如编码序列或甚至可包含其他基因的较大DNA片段分开。可以通过使用限制酶处理、琼脂糖凝胶纯化和柱层析或本领域技术人员已知的其他方法来分离靶向片段。显然，本领域技术人员可以选择合适的酶来达到这样的目的。
复制起点是宿主细胞中载体扩增所必需的，并且通常，它包含在商业上可获得的原核表达载体中。如果选择的载体不包含复制起点，则可以基于已知序列化学合成，并连接到载体中。例如，质粒pBR322(美国马萨诸塞州比弗利New England Biolabs公司)的复制起点适用于大多数革兰氏阴性细菌，各种病毒来源(例如，SV40、多瘤病毒、腺病毒、水疱性口炎病毒(VSV)或乳头瘤病毒如HPV或BPV)可用于在哺乳动物细胞中克隆载体。通常，哺乳动物表达载体不需要复制起点(例如，也使用SV40起点，因为它包含病毒初始启动子)。
通常，转录终止序列位于多肽编码区的3′端并起到终止转录的作用。通常，原核生物中的转录终止序列是后面跟随有聚-T序列的富含GC的片段。这样的序列可以容易地从文库克隆，或商业购买，或通过使用本文公开的核酸合成方法收集。
选择标记基因编码在宿主细胞的可选择培养基中存活和生长所需的蛋白质。典型的选择标记基因编码蛋白质，所述蛋白质(a)提供对抗生素或其他毒素的抗性，例如，在原核宿主细胞的情况下，提供氨苄青霉素、四环素或卡那霉素；(b)补充细胞的营养缺陷；或(c)提供无法从复杂介质或特定介质中获得的重要营养素。在一种实施方式中，选择标记是卡那霉素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因。新霉素抗性基因也可用于原核和真核宿主细胞的选择。
可使用其他可选择基因来扩增待表达的基因。扩增是在后续代的重组细胞的染色体中连续复制产生对细胞生长或存活重要的蛋白质所需的基因的过程。作为适用于哺乳动物细胞的选择标记的实例包括二氢叶酸还原酶(DHFR)和不合启动子的胸苷激酶基因。对于哺乳动物细胞转化体，应用选择压力，该选择压力仅允许转化体通过载体中存在的可选择基因存活。选择压力可以通过逐渐增加培养基中包含的选择剂的浓度来施加，并在该条件下培养细胞以扩增编码与α-syn结合的抗体的所有基因。从而，可以增加通过扩增的DNA表达的多肽(例如抗体)的量。
核糖体结合位点通常是mRNA翻译起始所需要的，并且由Shine-Dalgarno序列(原核生物)或Kozak序列(真核生物)表征。这通常位于启动子的3′和待表达多肽的编码序列的5′。
当在真核宿主细胞表达系统中需要糖基化时，为了改善糖基化或产量，可以制造各种前(pre-/pro-)序列。例如，可以修饰特定信号肽的肽酶切割位点，或者可以添加可以影响糖基化的前序列。最终的蛋白质产物在没有完全去除这些氨基酸的同时，可以在-1位置(成熟蛋白质的第一个氨基酸)具有一个或多个另外的氨基酸。例如，最终的蛋白质产物可以具有在肽切割位点中发现的添加到氨基末端的1或2个氨基酸残基。可供选择地，如果使用蛋白质切割酶，在切割位点包含在靶蛋白质的情况下，可以产生切割形式的蛋白质。
表达和克隆通常可包括使用与编码被宿主生物体识别的α-syn结合蛋白的分子可操作地连接的启动子。启动子是调节结构基因转录的结构基因的起始密码子的上游(通常，在约100至1000bp内)，即位于5′的非转录序列。启动子被分类为诱导型启动子和恒定启动子。诱导型启动子响应于培养条件的变化(例如培养基的特定成分的存在或不存在)或温度变化，并启动或控制与其连接的DNA的转录。另一方面，恒定启动子不控制与其可操作连接的基因的转录，并且恒定表达。各种宿主细胞识别的许多启动子是众所周知的。通过在使用限制酶从模板DNA中移出启动子后，将该启动子插入载体中，将适当的启动子与编码包含α-syn结合蛋白的重链或轻链的DNA连接。
适合与酵母宿主一起使用的启动子也是本领域众所周知的。除了酵母启动子之外，还可以使用酵母增强子。适用于哺乳动物宿主细胞的启动子包括从病毒(例如多瘤病毒、咽病毒、腺病毒(例如腺病毒2)、牛乳头瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙型肝炎病毒和类人猿病毒40(SV40)，但不限于此)的基因组中收集的启动子。其他合适的哺乳动物启动子的实例包括异源哺乳动物启动子，例如热激启动子和肌动蛋白启动子。
对于另外的启动子，包括SV40初始启动子(Benoist和Chambon，1981，Nature 290：304-310)；CMV启动子(Thornsen等人，1984，Proc.Natl.Acad.U.S.A.81：659-663)；包含在劳氏肉瘤病毒的3′长端重复序列中的启动子(Yamamoto等人，1980，Cell 22：787-797)；疱疹胸苷激酶启动子(Wagner等人，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78：1444-1445)；金属硫蛋白基因的启动子和调节序列(Prinster等人，1982，Nature 296：39-42)；和原核启动子，例如β-内酰胺酶启动子(Villa-Kamaroff等人，1978，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.75：3727-3731)；或tac启动子(DeBoer等人，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80：21-25)，但不限于此。另外，可以使用如下的动物转录调节区，所述动物转录调节区用于显示组织特异性的转化动物：弹性蛋白酶I基因调节区，其在胰腺腺泡细胞中有活性(Swift等人，1984，Cell 38：639-646；Ornitz等人，1986，冷泉港Symp.Quant.Biol.50：399-409；MacDonald，1987，肝脏学7：425-515)；在胰腺β细胞中有活性的胰岛素基因调控区(Hanahan，1985，Nature 315：115-122)；在淋巴样细胞中有活性的免疫球蛋白基因调节区(Grosschedl等人，1984，Cell 38：647-658；Adames等人，1985，Nature 318：533-538；Alexander等人，1987，Mol.Cell.Biol.7：1436-1444)；在睾丸、乳腺、淋巴和肥大细胞中具有活性的小鼠乳腺肿瘤病毒调节区(Leder等人，1986，Cell 45：485-495)；在肝脏中有活性的白蛋白基因调节区(inkert等人，1987，Genes and Devel.1：268-276)；在肝脏中有活性的α-胎蛋白基因调节区(Krumlauf等人，1985，Mol.Cell.Biol.5：1639-1648；Hammer等人，1987，Science253：53-58)；在肝脏中有活性的α1-抗胰蛋白酶基因调节区(Kelsey等人，1987，Genes和Devel.1：161-171)；在骨髓细胞中有活性的β-珠蛋白基因调节区(Mogram等人，1985，Nature 315：338-340；Kollias等人，1986，Cell 46：89-94)；在脑中少突胶质细胞中有活性的髓鞘碱性蛋白基因调节区(Readhead等人，1987，Cell 48：703-712)；在骨骼肌中具有活性的肌球蛋白轻链-2基因调节区(Sani，1985，Nature 314：283-286)；和在下丘脑中具有活性的促性腺激素释放激素基因调节区(Mason等人，1986，Science 234：1372-1378)。
可以将增强子序列插入载体中以增加编码包含高等真核生物中的人α-syn结合蛋白的轻链或重链的DNA的转录。增强是通常长约为10至300bp的DNA的顺式作用因子，其作用于启动子并增加转录。在转录单元的5′和3′位置观察到增强子，并且相对地，不受位置和方向的影响。各种增强子序列在哺乳动物基因(例如，球蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、α-胎蛋白和胰岛素)中是已知的。然而，通常使用源自病毒的增强子。本领域已知的用于激活启动子的示例性增强子包括SV40增强子、巨细胞病毒初始启动子增强子、多瘤增强子和腺病毒增强子。用于激活真核启动子的增强子可以排列在载体中编码序列的5′或3′，但通常位于启动子的5′位点。编码适当的固有或异源信号序列(读者序列或信号肽)的序列可以整合到表达截体中以促进抗体的细胞外分泌。根据产生抗体的宿主细胞的种类确定信号肽或读者序列的选择，并且可以用异源信号序列替换固有信号序列。哺乳动物宿主细胞中功能性信号肽的实例包括美国专利第4,965,195号中描述的白细胞介素-7(IL-7)的信号序列；文献Cosman等人，1984，Nature 312：768中描述的白细胞介素-2受体的信号序列；EP专利第0367566号中描述的白细胞介素-4受体的信号序列；美国专利第4,968,607号中描述的I型白细胞介素-1受体信号肽；EP专利第0 460 846号中描述的II型白细胞介素-1受体信号肽。
在本文中，表达载体可以通过使用商业上可获得的载体制备。该表达载体可包含靶基本序列的全部或部分或完全不包含该靶基本序列。当本文所述的一种或多种基本序列预先不存在于载体中时，可以将它们单独收集并连接到载体中。收集包含在基本序列中的每个序列的方法是本领域技术人员公知的。
在制备载体并将包含轻链、重链或α-syn抗原结合序列的编码轻链和重链的核酸分子插入载体的适当位点后，可将该重组载体导入适当的宿主细胞中，用于扩增和/或表达多肽。将抗体表达载体导入选定的宿主细胞的方法可以通过转染、感染、磷酸钙共沉淀、电穿孔、显微注射、脂质转染、DEAE-葡聚糖介导的转染或其他众所周知的方法来实现。导入方法根据主要使用的宿主细胞的种类来确定。该方法是本领域技术人员公知的，例如，可以参考上述文献Sambrook等人，2001。
随后，在适当条件下培养宿主细胞后，从培养基中收集抗体(在细胞将抗体分泌到培养基中的情况下)，或者直接从产生它的宿主细胞中收集抗体(在抗体不分泌的情况下)。适当宿主细胞的选择可受各种因素的影响，例如，靶表达水平、其对于活性(例如，糖基化或磷酸化)是优选或必需的多肽修饰、以及折叠以产生生物活性分子的容易性等。
可用于表达的哺乳动物细胞系在本领域中是众所周知的，例如，包括可从ATCC(美国典型培养物保藏中心)购买的永生化细胞，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(例如Hep G2)和许多其他细胞系，但不限于此。在一种实施方式中，可以根据具有α-syn结合特性的抗体以高表达水平表达来确定细胞系。在其他实施方式中，细胞系可以选自具有制备和分泌异源抗体的能力的B细胞系统，尽管它不能制备其自身的抗体。
α-syn在疾病中的作用
α-Syn是由140个氨基酸组成的蛋白质，主要在神经元的突触前位点表达。它在正常条件下作为在细胞质中天然未折叠形式的单体存在。α-Syn的确切功能尚未阐明，并且似乎在成熟的突触前末梢维持突触小泡的供应中起重要作用，因为它仅在突触发育后检测到(Murphy DD等人.J Neurosci 2000，20：3214-3220)。α-Syn可以调节调控非自主或自主运动的多巴胺的释放或可以影响记忆和认知功能(Kokhan VS等人，Behav Brain Res 2012，231：226230)。特别是，随着突触活动的增加和衰老，α-Syn的功能很重要，并且是神经变性的重要因素。
在病理状态中，α-syn通过与脂滴(lipid droplets)、磷脂双层或脂质膜结合和相互作用而经历结构变化，以形成折叠的α-螺旋二级结构，从而导致形成包括二聚体、寡聚体和纤维形式的聚集体。
特别是，α-syn聚集与一组称为α-突触核蛋白病的神经退行性疾病的发病机制有关，α-突触核蛋白病包括帕金森病(PD)、帕金森病痴呆(PDD)、路易体痴呆(DLB)、多系统萎缩(MSA)和许多神经轴突疾病，并且在阿尔茨海默病中是次要的(Kim等人，阿尔茨海默研究与治疗2014，6：73)。
此外，在患有帕金森病的患者的脑脊液和血清样品中发现了α-突触核蛋白的寡聚体和单体形式，表明具有小分子量的α-突触核蛋白聚集体渗透细胞膜以进入细胞外空间。还表明，错误折叠的α-突触核蛋白可以通过胞吐作用从细胞中释放出来，然后如朊病毒蛋白那样通过细胞间转运从大脑的一个区域转移到另一个区域(Brundin P等人Nat Rev MolCell Biol 2010，11：301-307)。
α-突触核蛋白病是一组神经退行性疾病，其特征在于在细胞内存在含有α-Syn聚集体的实体或小体。这些小体在外观上取决于疾病而有所不同，在帕金森病(PD)和路易体痴呆(DLB)中被称为路易体，在多系统萎缩(MSA)中被称为神经节细胞质体，在神经轴突疾病中被称为轴突球状体。根据本发明的抗体优先且特异地识别α-Syn聚集体，从而识别这些体。
路易体病(LBD)或α-突触核蛋白神经元疾病的特征在于多巴胺能系统的变性、运动损伤、认知障碍和路易体(LB)的形成(McKeith等人，神经病学1996，47：1113-24)。路易体是在神经细胞中发现的球形蛋白质沉积物。路易体通过干扰大脑中包括乙酰胆碱和多巴胺的化学信使的作用来阻断大脑的正常功能。路易体病包括帕金森病(包括特发性帕金森病(PD))、弥漫性路易体病(DLBD)(也称为路易体痴呆)、阿尔茨海默病合并帕金森病和多系统萎缩(MSA)。DLBD与阿尔茨海默病和帕金森病症状相同，但路易体的位置与帕金森病的位置不同。在DLBD中，白细胞主要存在于皮质中，而在帕金森病中主要存在于黑质中。
其他路易体病包括纯自主神经衰竭、路易体紊乱(吞咽困难)、偶发性LBD、遗传性LBD(例如α-syn基因突变体、PARK3和PARK4基因)和多系统萎缩(MSA，例如，橄榄核桥脑小脑萎缩(Olivopontocerebellar Atrophy)、纹状体黑质变性(Striatonigral Degeneration)和夏-德综合征(Shy-Drager Syndrome))。
以高亲和力特异性识别α-Syn聚集体的本发明的抗α-Syn抗体可用于诊断或检测这些疾病。此外，特异性识别根据本发明的α-Syn聚集体的α-Syn抗体抑制α-Syn聚集体的形成或降解聚集体，并抑制聚集体的细胞间转移，从而抑制α-突触核蛋白病，特别是路易体疾病和帕金森病。
使用人α-syn抗体用于诊断和治疗目的
本文公开的抗体可用于检测α-Syn，特别是α-Syn聚集体(例如路易体)，以及鉴定生物样品中含有α-Syn聚集体的细胞或组织。例如，抗α-Syn抗体可用于诊断，例如检测和/或定量分析生物样品(例如含有血清的血液、脑脊液(CSF)或尿液)或组织或细胞内表达的α-Syn聚集体，和/或基于此的α-突触核蛋白病的诊断。
特别地，根据本发明的特异性结合聚集体的抗体可用于治疗需要治疗、诊断和/或检测与α-Syn聚集体有关的疾病的受试者的α-Syn聚集体相关的疾病。根据本发明的抗体或抗原结合片段可通过抑制α-Syn聚集体的产生、促进α-Syn聚集体的降解和抑制α-Syn聚集体的细胞间转移而有效地用于治疗如上所述的与α-Syn聚集体有关的疾病。
诊断方法
本文公开的抗体可有效地用于检测、诊断或监测α-syn相关的疾病或症状。
在一种实施方式中，本发明的方法是在需要诊断α-突触核蛋白病的受试者中诊断α-突触核蛋白病的方法，其中该方法包括使用根据本发明的抗体和抗原结合片段来测定受试者中α-Syn聚集体的浓度或细胞间位置；并且将受试者中测量的α-Syn聚集体的浓度或细胞间位置与对照样品的结果进行比较，并且与对照结果的相似性或差异表明受试者患有α-突触核蛋白病。
在该方法中，受试者包括没有症状或在出现症状之前的患者。在一种实施方式中，对照可以是患有包括PD、DLB或MSA的α-突触核蛋白病的患者，其中在比较步骤中与对照组的相似性提供受试者是α-突触核蛋白病患者的诊断。在另一种实施方式中，当对照是来自正常人的样品时，在比较步骤中与对照组的差异(例如聚集体浓度的增加)提供了受试者具有α-突触核蛋白病的诊断。在另一种实施方式中，可以匹配受试者的年龄和对照。该方法可以在体内进行或者在从受试者分离的生物样品(例如血液、脑脊髓液(CSF)或尿液样品)中进行。
该方法可以用体内成像进行。可以使用例如正电子发射断层扫描(PET)、单光子发射断层扫描(SPECT)、近红外(NIR)光学成像或磁共振成像(MRI)来执行体内成像。
该方法可以在体外进行。该方法可以使用蛋白质印迹、免疫沉淀、ELISA、放射免疫测定(RIA)或本领域技术人员熟知的免疫组织化学方法进行，例如，Tijssen，1993，酶免疫测定的实验和理论(Practice and Theory of Enzyme Immunoassays)，第15卷(Eds)RHBurdon和PH van Knippenberg，阿姆斯特丹Elsevier)；Zola，1987，单克隆抗体：技术手册(Monoclonal Antibodies：A Manual of Techniques)，第147-158页(CRC出版社公司)；Jalkanen等人，1985，J.Cell.Biol.101：976-985；Jalkanen等人，1987，J.Cell Biol.105：3087-3096)。α-syn的检测可以在体内或体外进行。另外，包括ELISA(酶联免疫吸附测定)和放射免疫测定(RIA)。
对于检测或诊断用途，通常，抗体可以用可检测的标记物质标记。适当的标记物质包括放射性同位素或放射性核素(例如，3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I)、荧光物质(例如，FITC、罗丹明、镧系荧光物质)、酶(例如，辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶)、化学发光基团、生物素基团、或由第二报告分子识别的多肽表位(例如，亮氨酸拉链对序列、第二抗体结合位点、金属结合结构域、表位标签)，但不限于此。在一些实施方式中，标记物质可以通过各种长度的间隔臂与抗体偶联以减少潜在的空间位阻。用于标记蛋白质的各种方法是本领域已知的并且可以在本文中应用。
在其它方面，本发明的抗体可用于鉴定包含α-syn聚集体的组织。在具体实施方式中，抗体用标记物质标记，并检测α-syn聚集体与标记抗体的结合。在一种实施方式中，在体内检测抗体与α-syn聚集体的结合。
在其它方面，本发明公开了测或分选与本文公开的抗体竞争结合α-syn聚集体的测试物质检。例如，在存在或不存在测试物质的情况下，包括检测包含α-syn聚集体的溶液中游离抗体的量的步骤。游离抗体浓度的增加，即未与α-syn聚集体结合的抗体可以指示测试分子可以与抗体竞争α-syn结合。在一种实施方式中，抗体用标记基团标记。可供选择地，标记测试物质并通过抗体的存在或不存在监测游离测试物质的量。
除此之外，本文公开的抗体或抗原结合片段具有各种用途。例如，它可以用于特异性结合分析、基于亲和力的α-syn纯化、或用于α-syn拮抗剂研究的筛选方法等。
治疗方法：药物制剂，施用途径
根据本发明的抗体或抗原结合片段可用于通过抑制α-Syn聚集体的产生，促进α-Syn聚集体的降解和抑制α-Syn聚集体的细胞间转运来治疗如上所述的与α-Syn聚集体相关的疾病。
因此，还提供了使用根据本发明的抗体和抗原结合片段的治疗方法。在一种实施方式中，将抗体提供给患者。以上描述了可以通过根据本发明的抗体和抗原结合片段有效治疗的疾病和患者。
在一种实施方式中，根据本公开的抗体可以是与递送载体连接的形式以通过血脑屏障。公开了许多通过血脑屏障递送药物的方法。例如，存在通过使用诸如Brad奎宁或HIGU(高强度聚焦超声)的方法来分解BBB的渗透压的方法。它们还涉及使用细胞递送系统(例如葡萄糖和氨基酸转运和受体介导的胰岛素或转铁蛋白的转胞吞作用)或阻断糖蛋白的外排转运蛋白。受体介导的转胞吞作用系统中受体的实例描述如下：胰岛素受体(例如，人胰岛素受体)，转铁蛋白受体，LRP(例如，LRP1、LRP6和LRP8)、黑皮质素受体、烟碱型乙酰胆碱受体、VACM-1受体、IGFR、EPCR、EGFR、TNFR、瘦素受体、M6PR、脂蛋白受体、NCAM、LIFR、LfR、MRP1、AchR、DTr、谷胱甘肽转运蛋白、SR-B1、MYOF、TFRC、ECE1、LDLR、PVR、CDC50A、SCARF1、MRC1、HLA-DRA、RAMP2、VLDLR、STAB1、TLR9、CXCL16、NTRK1、CD74、DPP4、内皮生长因子受体1、2和3、糖皮质激素受体、离子移变型谷氨酸受体、M3受体、芳香烃受体、GLUT-1、肌醇-1，4，5-三磷酸(IP3)受体、N-甲基-D-天冬氨酸受体、S1P1、P2Y受体、TMEM30A和RAGE。
在又另一种实施方式中，根据本发明的抗体可以以与其他治疗剂的连接形式使用，以治疗与α-Syn聚集体相关的疾病。
还提供了药物组合物，所述药物组合物包含治疗有效剂量的抗体和药学上可接受的稀释剂、载体、增溶剂、乳化剂、防腐剂和/或补充剂。另外，例如，包括通过施用这种药物组合物来治疗癌症患者的方法。术语“患者”包括与α-syn相关的人类患者。
可接受的制剂物质在使用的容量和浓度下对接受者无毒。在具体实施方式中，提供了包含治疗有效剂量的人α-syn抗体的药物组合物。
在具体实施方式中，可接受的制剂物质优选在使用的容量和浓度下无毒。在一种实施方式中，例如，药物组合物可包含特定制剂物质，所述特定制剂物质用于组合物的pH、渗透压度(osmolality)、粘度、透明度、颜色、等渗性、气味、无菌性、稳定性、溶解或释放速率、改性、维持或保持吸收或渗透。在该实施方式中，合适的制剂物质包括氨基酸(例如：甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸)；抗菌剂；抗氧化剂(例如：抗坏血酸，亚硫酸钠或亚硫酸氢钠)；缓冲剂(例如：硼酸盐，碳酸氢盐，Tris-HCl，柠檬酸盐，磷酸盐或其他有机酸)；蓬松剂(例如：甘露醇或甘氨酸)；螯合剂(例如：乙二胺四乙酸(EDTA))；络合剂(例如：咖啡因，聚乙烯吡咯烷酮，β-环糊精或羟丙基-β-环糊精)；填充剂；单糖；二糖；和其他碳水化合物(例如：葡萄糖，甘露糖或糊精)；蛋白质(例如：血清白蛋白，明胶或免疫球蛋白)；着色剂，调味剂和稀释剂；乳化剂；亲水性聚合物(例如：聚乙烯吡咯烷酮)；低分子多肽；成盐平衡离子(例如：钠)；防腐剂(例如：苯扎氯铵，苯甲酸，水杨酸，硫柳汞，苯乙醇，对羟基苯甲酸甲酯，对羟基苯甲酸丙酯，氯己啶，山梨酸或过氧化物)；溶剂(例如：甘油，丙二醇或聚乙二醇)；糖醇(例如：甘露醇或山梨糖醇)；悬浮剂；表面活性剂或润湿剂(例如：普朗尼克类(Pluronics)，PEG，脱水山梨糖醇酯，聚山梨醇酯，例如聚山梨醇酯20，聚山梨醇酯，聚乙二醇辛基苯基醚(triton)，氨丁三醇，卵磷脂，胆固醇，泰洛沙泊)；稳定性增强剂(例如：蔗糖或山梨糖醇)；稳健性增强剂(例如：碱金属卤化物(优选氯化钠或氯化钾)，甘露醇，山梨糖醇)；递送溶媒；稀释剂；赋形剂和/或药物补充剂，但不限于此。例如，可以参考雷明顿药学科学(REMINGTON′S PHARMACEUTICAL SCIENCES)，第18版(AR Genrmo编)1990，Mack出版公司。
在具体实施方式中，最佳药物组合物可以由本领域技术人员根据例如靶向施用途径、递送方法和靶向能力来确定(参见如上所述的雷明顿药学科学)。在具体实施方式中，该组合物可以影响本文公开的抗体的物理条件、稳定性、体内释放速率和体内清除速率。在具体实施方式中，药物组合物中的主要溶媒或载体可以是水性或非水性的。例如，合适的溶媒或载体可以是注射用水，补充有在用于肠胃外施用的组合物中常用的其他材料的生理盐水溶液。此外，中性缓冲盐水溶液或与血清白蛋白混合的盐水溶液可用作溶媒。在具体实施方式中，药物组合物可包含约pH 7.0至8.5Tris缓冲液，或约pH 4.0至5.5乙酸盐缓冲液，并可进一步包含山梨糖醇或适当的替代物。在具体实施方式中，人α-syn抗体组合物可以通过将具有目标纯度的选定组合物以冻干的块状物或水溶液的形式与任何配制剂(参见雷明顿药学科学)混合用于储存来制备。进一步地，在具体实施方式中，可以使用合适的赋形剂(例如蔗糖)将人α-syn抗体配制为冻干产物。
药物组合物可以肠胃外递送。可供选择地，组合物可以吸入或通过消化道递送，例如口服。该药学上可接受的组合物的制备在本领域的技术水平内。
制剂所需的组分优选以施用部位可接受的浓度存在。在具体实施方式中，缓冲液用于将组合物维持在生理pH或略低的pH或通常在约5至约8的pH范围内。
在肠胃外施用的情况下，治疗组合物包含在药学上可接受的溶媒中的靶人α-syn结合蛋白，并且其可以以不包含热原的肠胃外可接受的水溶液形式提供。特别适用于肠胃外注射的溶媒是无菌蒸馏水，在此，人α-syn抗体用适当保守的无菌等渗溶液配制。在具体实施方式中，该制剂可以伴随使用提供可以通过长效注射剂来递送的组合物的受控释放或持续释放的药剂而配制，所述长效注射剂例如可注射的微球、可生物降解的颗粒、聚合化合物(例如：聚乳酸或聚乙醇酸)、珠子或脂质体。在具体实施方式中，还可以使用具有增加血液中持续时间的效果的透明质酸。在具体实施方式中，为了递送靶抗体，还可以使用可植入药物递送装置。
此外，配制药物组合物用于吸入。在一些实施方式中，将人α-syn抗体配制为干燥可吸入粉末。在具体实施方式中，人α-syn抗体吸入溶液也可以配制成用于气溶胶递送的推进剂。在具体实施方式中，可以喷雾溶液。在PCT申请号PCT/US94/001875中进一步描述了该肺部施用和配制方法。一些制剂可以口服施用。以这种方式施用的人α-syn抗体可以用固体剂型例如，通常用于纯化和制备胶囊的载体或不含这种载体配制。在具体实施方式中，胶囊可以设计成在胃肠道中的位置处释放制剂的活性部分，其中生物利用度最大化并且前全身性降解最小化。为了促进人α-syn抗体的吸收，可以包含另外的试剂。还可以使用稀释剂、调味剂、低熔点蜡、植物油、润滑剂、悬浮液、片剂崩解剂和粘合剂。
一些药物组合物包含有效剂量的人α-syn抗体，其与适于制备片剂的无毒赋形剂混合。通过将片剂溶解在无菌水或其他适当的溶媒中，可以将溶液制备成单位剂量形式。合适的赋形剂包括：惰性稀释剂，例如碳酸钙、碳酸钠、碳酸氢钠、乳糖或磷酸钙；或粘合剂，例如淀粉、明胶或阿拉伯胶；或润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石，但不限于此。
包含含有其它人α-syn抗体的制剂的另外的药物组合物对本领域技术人员是显而易见的，所述制剂包含持续或控制递送制剂。各种其他持续或控制递送方式，例如，用于配制脂质体载体、生物侵蚀颗粒或多孔珠和长效注射物质的技术也是本领域技术人员已知的。例如，可以参考PCT/US93/00829，其中描述了多孔聚合物颗粒的受控释放。持续释放剂可包括模制产品，例如，半透性聚合物基质的薄膜或微胶囊形式。持续释放基质可包含聚酯、水凝胶、聚丙交酯(描述于美国专利第3,773,919号和EP 058481中)、L-谷氨酸和γ-乙基-L-谷氨酸的共聚物(Sidman等人，1983，Biopolymers 2：547-556)、聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)(Langer等人，1981，J.Biomed.Mater.Res.15：167-277；和Langer，1982，Chem.Tech.12：98-105)、乙烯醋酸乙烯酯(Langer等人，1981，如上)或聚-D(-)-3-羟基丁酸(EP133,988)。持续释放组合物还可包含通过已知的各种方法之一制备的脂质体。例如，可参考Eppstein等人，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82：3688-3692；EP 036,676；EP088,046和EP 143,949。
用于体内施用的药物组合物通常可以作为无菌剂提供。可以通过无菌过滤膜过滤来实现无菌。当将组合物冻干时，应将其溶解在溶液中并冷冻干燥的过程无菌地进行。用于肠胃外施用的组合物可以以冻干形式或溶液储存。例如，肠胃外组合物通常包含在具有无菌进入口的容器中，例如带有皮下注射针可以进入的盖子的小瓶或用于静脉内施用的溶液袋。
在具体实施方式中，可以将表达本文所述重组抗体的细胞包封用于递送(Invest.Ophthalmol Vis Sci 43：3292-3298，2002；和Proc.Natl.Acad.Science 103：3896-3901，2006)。
在具体的制剂中，抗体的浓度为例如，至少10mg/ml、20mg/ml、30mg/ml、40mg/ml、50mg/ml、60mg/ml、70mg/ml、80mg/ml、90mg/ml、100mg/ml或150mg/ml。一些制剂包含缓冲剂、蔗糖和聚山梨醇酯。制剂的一个实例是包含50至100mg/ml抗体、5至20mM乙酸钠、5至10％w/v蔗糖、和0.002至0.008％w/v的聚山梨酯。具体片剂包含例如65至75mg/ml抗体在9至11mM乙酸钠缓冲液中的溶液、8至10％w/v蔗糖、和0.005至0.006％w/v的聚山梨酯。该特定制剂的pH在4.5至6的范围内。其他制剂的pH为5.0至5.5(例如，pH为5.0、5.2或5.4)。
一旦配制药物组合物，可将其作为溶液、悬浮液、凝胶、乳液、固体、晶体或脱水或冻干粉末储存在无菌小瓶中。该制剂可以以立即可用的形式或在施用前重构的形式(例如冻干)储存。还提供了用于产生单剂量施用单元的试剂盒。该试剂盒包括具有干燥蛋白质的第一容器和具有水性制剂的第二容器。在具体实施方式中，提供了一种试剂盒，其包括具有单室和多室的预填充注射器。待使用的含人α-syn抗体的药物组合物的治疗有效剂量可受到例如治疗情况和目的的影响。本领域技术人员可以理解，适于治疗的剂量可以至少部分地根据使用人α-syn抗体的疾病、施用途径和患者的身体状况(体重、体表或器官大小)和/或条件(年龄和整体健康)而不同。在具体实施方式中，临床医生可以确定最佳剂量并改变施用途径以获得最佳治疗效果。
考虑到前述因素，典型的剂量可以为约1μg/kg至约30mg/kg或更高。在具体的实施方式中，剂量可以为10μg/kg至约30mg/kg，选择性地，为0.1mg/kg至约30mg/kg，或可供选择地，为0.3mg/kg至约20mg/kg。在某些情况下，剂量为0.5mg/kg至20mg/kg。在某些情况下，抗体以0.3mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg、3mg/kg、10mg/kg或20mg/kg施用。
施用频率可能受所用人α-syn抗体制剂的药代动力学参数的影响。通常，临床医生施用组合物直至达到实现靶向效果的剂量。因此，组合物可以随时间，作为单剂量或2倍或更多剂量施用，或者通过可植入装置或导管连续注射施用。可以通过使用适当的剂量反应数据确认适当的剂量。在具体实施方式中，可以长时间将抗体施用于患者。长期施用抗体可以使有害的免疫反应或过敏反应最小化，免疫反应或过敏反应通常伴随非完整人抗体，例如在非人动物中对人抗原产生的抗体，例如，非人动物中产生的非完整人抗体或非人抗体。
药物组合物的施用途径可以使用已知的方法，例如通过口服注射；静脉注射、腹膜内、脑内(间质)、心室内、肌肉内、眼内、动脉内、门脉内或病灶内途径；持续释放系统或植入装置。在具体实施方式中，组合物可以通过弹丸注射，或注射或植入装置连续施用。
另外，组合物可以通过其中靶分子被吸收或包封的植入膜、海绵或其他适当的材料来局部施用。在具体实施方式中，在使用植入装置的情况下，可以将装置植入任何适当的组织或器官，并且可以通过扩散、定时推注或连续施用来实现靶分子的递送。
另外，可优选在体外使用人α-syn抗体药物组合物。在这种情况下，从患者体内取出的细胞、组织或器官可以暴露于人α-syn抗体药物组合物，然后将细胞、组织和/或器官植入患者体内。
特别地，可以使用本文所述方法通过植入基因工程改造的特定细胞来递送人α-syn抗体，以表达和分泌多肽。在具体实施方式中，该细胞可以是动物或人细胞，并且可以是自体的、非自体的或非同源的。在具体实施方式中，细胞可以是永生化的。在其他实施方式中，为了减少免疫反应，可以将细胞包封以避免渗透到周围组织中。在另外的实施方式中，包封物质通常允许蛋白质产物的释放，但它是防止来自患者的免疫系统或周围组织的其他有害因子破坏细胞的生物相容性半渗透性聚合物外壳或膜。
在下文中，呈现了期望的实施例以便于理解本发明。然而，提供以下实施例是为了更好地理解本发明，并且本发明的范围不受以下实施例的限制。
本文使用的涉及细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学、蛋白质和核酸化学以及杂交的术语和技术在本领域中广泛使用和已知。另外，本文公开的方法和技术可以使用常规技术实施，所述常规技术在细胞生物学、细胞培养、分子生物学、遗传转化技术、微生物学、DNA重组技术、免疫学等领域的技术人员的技能范围内。可以在以下书籍和文献中找到对常用技术的更详细描述。对于分子生物学和生物化学的一般方法，可以参考分子克隆：实验手册，第3版(Sambrook等人，港实验室出版社2001)；分子生物学简明方案(Short Protocols in Molecular Biology)，第4版(Ausubel等人，John Wiley&Sons1999)；DNA克隆，第一卷和第二卷(DNA Cloning，Volumes I and II)(Glover编，1985年)；寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis)(Gait编，1984)；核酸杂交(Nucleic AcidHybridization)(Hames和Higgins编，1984)；转录和翻译(Transcription AndTranslation)(Hames和Higgins编，1984)；动物细胞培养(Culture Of Animal Cells)(Freshney和Alan，Liss公司，1987)；哺乳动物细胞的基因转移载体(Gene TransferVectors for Mammalian Cells)(Miller和Calos编)；分子生物学现代方案和分子生物学简明方案(Current Protocols in Molecular Biology and Short Protocols inMolecular Biology)，第3版(Ausubel等编)；和重组DNA方法学(Recombinant DNAMethodology)(Wu，ed编，学术出版社)；Harlow和Lane抗体：实验手册冷泉港出版社，纽约冷泉港(1990)。
蛋白质反应和纯化技术在本领域中常规进行或根据本文所述的制造商方法进行。在本发明中，与分析化学、合成有机化学以及医药和药物化学实验室技术和方法相关的术语是本领域公知的并且是常用的。标准技术可用于化学合成、化学分析、药物制备、药物制剂和施用、患者治疗等。
实施例1：α-syn抗体的制备
实施例1-1：小鼠单克隆抗体
免疫接种
将具有全长(140个残基)的α-syn单体或切割C端21个残基的α-syn单体(119个残基)置于37℃的热混合器中，在1050rpm振荡下聚集14天，并超声处理。将1mg/ml的α-syn纤丝的140个残基和119个残基中的每个与助剂以1∶1(vol∶vol)的比例混合。
然后，将200μL制备的混合物皮下注射到5至7周龄的BALB/c雌性小鼠中。2周后，进一步皮下注射200μL制备的混合物用于抗体加强。在加强一周后，收集血液并使用施用的抗原通过ELISA方法进行免疫滴定。随后，通过单独皮下注射抗原进行第三次加强免疫。
杂交瘤生产
去除免疫小鼠的脾脏，从脾脏中获得脾细胞。将脾细胞悬浮于补充有10％FBS的杂交瘤-SFM培养基(Thermo Fisher Scientific，USA)中。为了制备杂交瘤，将鼠骨髓瘤细胞的脾细胞和SP2/0-Ag14在不含血清的杂交瘤-SFM培养基中混合，然后离心去除培养基。然后，将PEG添加到获得的细胞沉淀中并在37℃下孵育1分钟以诱导细胞融合。
单细胞克隆
在融合2周后，使用施用于小鼠的抗原和细胞培养基，用ELISA法确认与产生抗体的小鼠B细胞的融合。然后，使用杂交瘤进行单细胞克隆以选择16个产生单克隆抗体的杂交瘤。使用全长(140个残基)α-Syn作为抗原的聚集体获得1E4和9B11(分别为IgG1κ、IgG3κ和IgG3κ)克隆，使用切割C端的21个残基的α-Syn聚集体作为抗原获得3A9、10F10和11F11(分别为IgG2bκ、IgG2aκ、IgG2bκ)的克隆。
抗体的纯化
每种杂交瘤在含有10％FBS的RPMI1640培养基中培养。对于抗体生产，将培养基替换为无血清SFM培养基并培养约4天。分离细胞培养上清液，离心，用0.22μm过滤器过滤，并用IgG1型蛋白G柱纯化，剩余抗体用蛋白A柱纯化。
可变区序列的确定
可变区和CDR序列通过参考公开内容Ahn等人，Mol.Cells 2004，18(2)：237-241确定。培养杂交瘤并离心，仅分离细胞。通过添加三唑从分离的杂交瘤中分离RNA，并作为模板用于合成cDNA。通过测序确认可变区和CDR序列。
氨基酸序列示于表1中，核苷酸序列示于表2中。
实施例1-2：噬菌体文库筛选
文库噬菌体的制备
在30℃下将1×1010个来自人的具有多样性的单链可变片段(ScFv)的感受态细胞(获得自梨花女子大学(EHWA WOMANS UNIVERSITY))接种于含有34μg/ml氯霉素(Sigma，C0857)、2％葡萄糖(Sigma，G5400)和5mM MgCl2(Sigma，C0857)的2×YT培养基[17g胰化蛋白胨(CONDA，1612.00)，10g酵母提取物(CONDA，1702.00)和5g NaCl(Sigma，S7653)]中，持续3小时，至OD600为0.5至0.7。然后，用辅助噬菌体感染细胞，并在30℃下在含有34μg/ml氯霉素，5mM MgCl2、70μg/ml卡那霉素(Sigma，K1876)和1mM IPTG(ELPISBIO，IPTG025)的2×YT培养基中培养6小时，以诱导噬菌体包装。将培养液在4500rpm，4℃下离心15分钟。向上清液中添加4％PEG6000(Fluka，81253)和3％NaCl(Sigma，S7653)并在冰上温育1小时。将产物在4℃下以8000rpm离心20分钟，然后将沉淀物悬浮在PBS中并再次在4℃和12,000rpm下离心10分钟以获得含有噬菌体文库的上清液。将获得的上清液在4℃下储存直至后续使用。
噬菌体展示淘选
为了选择优先于单体而结合α-突触核蛋白聚集体的抗体，使用实施例1中制备的全长α-突触核蛋白聚集体进行淘选，并如下进行总共三次淘选。
将牛血清白蛋白(BSA)以3μg/ml的浓度在试管中添加到细胞中，4℃过夜，在免疫管(maxisorp 444202)中向PBS中添加10μg/ml重组α-syn聚集体和单体，将溶液添加到试管中，并保护其没有吸附α-syn聚集体和单体的表面。排空试管后，将分散于BSA 3％溶液中的1012CFU的抗体噬菌体文库放入免疫管中，其中α-syn聚集体和单体被吸收并反应1小时(阴性选择)。然后，噬菌体不与α-syn聚集体结合，回收单体并在室温下在α-syn聚集体中反应2小时，并吸附单体。使用磷酸盐缓冲盐水(0.05％吐温20)溶液回收100μM三乙胺溶液，通过使用PBS-T溶液回收。大肠杆菌在37℃下保持1小时，将感染的大肠杆菌在2×YT琼脂培养基上涂布并在37℃下培养过夜(pH 7.4)，将它们用ER2537感染。第二天，将培养的大肠杆菌悬浮于4ml 2×YT羧苄青霉素培养液中，添加15％甘油，将一部分保存在-80℃下，其余的则用于制备噬菌体以用于下次实验。通过总共重复3轮该过程，扩增并浓缩α-syn抗原特异性噬菌体库。随着淘选轮次的进展，使用PBS-T的洗涤次数增加以扩增和浓缩抗原特异性噬菌体。
具体而言，在4℃下过夜将蛋白质吸附在试管表面后，将浓度为10μl/ml的重组α-syn聚集体和单体的PBS溶液添加到免疫管(maxisorp 444202)，将牛血清白蛋白(BSA)3％溶液添加到试管中，并保护其中没有吸附α-syn聚集体和单体的表面。排空试管后，将分散于BSA 3％溶液中的1012CFU的抗体噬菌体文库放入免疫管中，其中α-syn聚集体和单体被吸收并反应1小时(阴性选择)。然后，回收未与α-syn聚集体和单体结合的噬菌体，并在室温下在α-syn聚集体和单体被吸附的免疫管中反应2小时。将非特异性结合的噬菌体用PBS-T(磷酸盐缓冲盐水-0.05％吐温20)溶液洗涤5次至30次以除去，并通过使用100mM三乙胺溶液回收剩余的抗原特异性噬菌体抗体。用1M Tris缓冲液(pH7.4)中和回收的噬菌体后，将其在37℃下用ER2537大肠杆菌感染1小时，将感染的大肠杆菌涂在2×YT琼脂培养基上，37℃下培养过夜。次日，将培养的大肠杆菌悬浮于4ml的2×YT羧苄青霉素培养液中，并添加15％甘油，将一部分储存在-80℃下，其余部分用于制备噬菌体以用于下次实验。通过总共重复3轮该过程，扩增并浓缩α-syn抗原特异性噬菌体库。
随着淘选轮次的进行，使用PBS-T的洗涤次数增加以扩增和浓缩抗原特异性噬菌体。
单克隆筛选
为了从通过淘选获得的噬菌体库中对特异性结合突触核蛋白聚集体的单克隆抗体进行分选，进行如下实验。
为了从浓缩库中分离单克隆，在LB-四环素/羧苄青霉素琼脂培养基上涂布噬菌体库并培养后，确保单个菌落。然后，在每孔添加400μl 2×YT-四环素/羧苄青霉素培养基的96孔深孔板上接种单克隆并培养过夜后，将10μl培养液置于添加390μl 2×YT-四环素/羧苄青霉素培养基的新的96孔深孔板上，并在37℃培养4小时。将1mM IPTG加入培养液中，在30℃下培养过夜。将培养过夜的培养液离心分离，得到上清液。
然后，通过如下使用ELISA方法选择表达与突触核蛋白聚集体结合的单克隆可溶性scFv的克隆(Steinberger.Rader and Barbas III.2000.噬菌体展示载体.In：噬菌体展示实验手册(Phage display vectors.In：Phage Display Laboratory Manual).第一版.美国纽约冷泉港出版社pp.11.9-11.12)。具体地，将实施例1-1中的所选抗体置于96孔板(Nunc-Immuno Plates，NUNC，USA)上并在4℃下包被过夜。向各孔中添加3％BSA，添加量为200μL，然后在37℃下封闭2小时。然后，以100ng/孔的浓度加样突触核蛋白聚集体和单体，在37℃下反应2小时，并用300μL PBS-T洗涤5次。制备的单克隆上清液以1∶1的体积比与3％BSA混合(vol∶vol)，将100μL溶液加样到与聚集体和单体结合的板上，然后在37℃下反应2小时。用300μL PBS-T洗涤细胞5次，并用抗HA HRP缀合的抗体在37℃下温育1小时，然后用PBS-T洗涤5次。添加100μL TMB(四甲基联苯胺，Sigma，T0440)后，通过添加50μL的1N H2SO4终止反应以测量450nm处的吸光度。吸光度为0.5或更高的克隆通过结合被认为是阳性反应，并且排除了与非特异性结合BSA的克隆。
因此，选择了特异性结合突触核蛋白聚集体的AC8、AE8、AA9、DG5、AD2、AD7、DG11、DG8和DA9抗体克隆，并通过测序蛋白质和核苷酸序列进行。克隆的核酸序列在SEQ ID NO：169-224中公开。
实施例2使用α-Syn抗体分析抗原结合特异性和结合亲和力
实施例2-1：使用小鼠单克隆抗α-Syn抗体的斑点印迹分析
进行斑点印迹实验以分析根据本发明的抗体是否与天然状态的单体或聚集体结合。对于该实验，将50ng或100ng的α-syn单体或纤维蛋白(由首尔大学的Lee Seung-jae教授制造；Bae等人，J.Neurosci 32：13454，2012)加样在硝酸纤维素膜上。将两倍稀释的单体或纤丝蛋白从膜的右侧依次加样到左侧(12.5、25、50、100ng)。用具有TBST组成的5％脱脂干乳将膜在室温下封闭1小时。将1mg/ml实施例1中制备的α-syn抗体添加到含有1％牛血清白蛋白的TBST中，并在室温下温育1小时。用TBST洗涤后，根据制造商手册，使用作为底物的化学发光底物(NEN)和缀合有HRP(辣根过氧化物酶)的二抗分析信号。使用LAS-3000发光图像分析系统(FUJIFILM Life Science)对结果成像。结果如图1所示。如其中所示出的，发现与α-syn单体相比，根据本发明的α-syn抗体优先仅与聚集体结合。特别地，1E4、9B11、3A9和11F11仅与聚集体结合，10F10与聚集体和单体两者结合。使用结合单体和聚集体两者的274抗体(Bae等人，J Neurosci.2012 Sep 26；32(39)：13454-13469)作为比较抗体。
实施例2-2：使用小鼠单克隆抗α-Syn抗体的ELISA分析
进行ELISA分析以定量分析本发明的抗体与抗原的结合亲和力。为此，将本发明的α-突触核蛋白抗体以1mg/ml的浓度在96孔板上包被，并用10、100、1000和10000ng/ml的α-突触核蛋白纤丝聚集体处理。用PBS洗涤后，处理与HRP缀合的链霉亲和素和与生物素缀合的二抗抗体，然后与作为底物的TMB反应。测量吸光度。结果如图2所示。如其中所示出的，发现本发明的抗体优先结合具有高结合亲和力的聚集体。ELISA结果显示，优先与聚集体结合的抗体具有0.1×10-9M至2×10-9M的亲和力，而与单体和聚集体两者结合的抗体显示出～1×10-10M的更高值。
实施例2-3.使用小鼠单克隆抗α-Syn抗体进行BIAcore分析
使用BIAcore分析进行实施例1中制备的α-突触核蛋白抗体与单体和聚集抗原的结合的定量分析。
使用的仪器是T200(GE Healthcare，S/N：1565888)。使用蛋白质A作为芯片(GEHealthcare，Cat.29-1275-56)。10mM甘氨酸-HCl pH 1.5(GE Healthcare，Cat.BR-1003-54)是再生缓冲液。运行缓冲液、分析物稀释液和样品稀释缓冲液是HBS-EP。用1×HBS-EP(GE Healthcare，Cat.BR-1006-69)稀释实施例1中制备的α-syn抗体(3A9，9B11和11F11)，将α-突触核蛋白单体(1mg/ml)和纤丝蛋白(3mg/ml)一式两份地连续稀释，并在包括0nM在内的总共6种浓度(0、0.39、1.56、6.25、25、100nM)下进行分析。对于捕获，单体的RU为800(理论值)，纤丝的RU为100(理论值)。捕获阶段在60秒的接触时间，30μl/min的流速和180秒的稳定期下进行。缔合阶段在120秒的缔合时间和30μl/min的流速下进行。解离阶段在360秒的解离时间和30μl/min的流速下进行。再生阶段在240秒(初级)和60秒(次级)的再生时间和30μl/min的流速下进行两次。使用1∶1结合模型进行拟合，评估软件是BIACore T200评估软件(GE healthcare)。结果如图3a和图3b所示。在所分析的四种α-突触核蛋白抗体中，在上述其他方法中优先与聚集体结合的3A9、9B11和11F11仅在BIAcore中与聚集体以1至3×10-9M的高亲和力结合。
实施例2-4.使用小鼠单克隆抗α-Syn抗体进行Octet分析
使用Octet进行实施例1中制备的α-突触核蛋白抗体(3A9、9B11、11F11)与单体和聚集体抗原的结合的定量分析。
具体而言，在1000rpm下使用运行缓冲液，所述运行缓冲液为1×KB缓冲液(目录号18-1092)或1×PBS缓冲液，固定化缓冲液为乙酸钠，pH5(10mM，Cat.18-1068)，将α-syn单体固定于α-syn抗原，将纤丝固定于测试抗体。单体的目标浓度为20μg/ml，纤丝的目标浓度为0.4μg/ml。动力学浓度针对单体从50nM依次稀释两倍，针对纤丝从100nM依次稀释两倍，分别共给出7个点。单体的缔合/解离时间为5分钟/20分钟，纤丝的缔合/解离时间为5分钟/25分钟。生物传感器为ARG2，并使用1∶1拟合模型进行拟合。
结果如图4所示。如图所示，3A9、9B11和11F11显示与单体很少结合(红色虚线框)以及与聚集体良好结合(红色虚线框中的上升图)。这些结果与斑点印迹、Octet和ELISA中的结果相似或一致。结果，在测试的四种α-syn抗体中，在其他方法中优先与聚集体结合的抗体3A9、9B11和11F11在Octet分析中也仅与聚集体结合。
实施例2-5.使用抗α-Syn抗体的ScFV进行斑点印迹
使用实施例1-2中选择的ScFV抗α-Syn抗体，如实施例2-1中所述地进行斑点印迹。抗原从左侧第一行按6.25ng、12.5ng、25ng和50ng的顺序加样。以1μg/ml的浓度处理抗体，并通过抗人Fc-HRP第二抗体确认。
结果如图5所示。M代表单体抗原，A代表聚集抗原。右表中显示了每种抗体与单体或聚集体的选择性结合。结果表明AA9、AD2、AD7、AC8、DG8、DG11、DA9和DG5仅与聚集体结合，而AE8优先与聚集体结合并与单体弱结合。
实施例2-6.使用ScFV抗α-Syn抗体进行Octet分析
使用实施例1-2中选择的ScFV抗Syn抗体，如实施例2-4中所述地进行Octet分析。结果在图6中示出。发现这些抗体对α-Syn聚集体具有约10-9至约10-11M的高亲和力。
实施例3.小鼠单克隆抗α-Syn抗体对细胞介导的α-突触核蛋白聚集体转运的抑制作用
由于提出α-突触核蛋白聚集体的细胞间转移是α-突触核蛋白聚集体相关疾病的致病原因，因此能够抑制它们的抗体可用作治疗剂。为此目的，如下进行BiFC(双分子荧光互补)分析。BiFc原理在图7的上部示意性地示出。
用于BiFC分析的细胞培养
分别表达α-突触核蛋白和一半的金星荧光蛋白(Venus 1-αSyn(V1S)和αSyn-Venus2(SV2))的SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞系如先前所述进行培养(Lee HJ等人，J.Neurosci.2004；24：1888-1896)，在实验之前，将180000个表达V1S和SV2的细胞在盖玻片上混合并培养3天。每48小时对共培养物进行传代培养，证实α-突触核蛋白的连续细胞间迁移。因为在单独的实验中转移程度在传代数为6时最大(数据未显示)，所以使用六次传代的共培养物分析抗体对细胞间转运的抑制作用。
BiFC实验/抗体处理
在成像前一天，向共培养物中添加50μg/ml的IgG或测试抗体(3A9、9B11、11F11)。每个共培养物中Venus通道中的信号代表由α-突触核蛋白聚集产生的聚集体，其被认为是由α-syn从一个细胞迁移到另一个细胞所形成的聚集体。用IN细胞分析仪自动分析这些信号(仪器设置：斑大小：0.1至0.4μm，强度：4000至7000)。
结果如图7所示。如图所示，蓝色表示核，绿色表示从一个细胞中出来的α-突触核蛋白与其他细胞的α-syn相遇并形成聚集体。右侧的图表显示了信号的强度。在9B11、11F11和3A9治疗组中，与阴性对照IgG相比显示绿色信号的细胞数减少。结果表明，本发明的抗体可有效抑制聚集体的细胞间转移。
实施例4.通过小鼠单克隆抗α-Syn抗体分析α-突触核蛋白聚集体的体内去除效果
为了分析本发明中产生的α-Syn抗体的体内效应，将10mg/kg人α-突触核蛋白或IgG转染到转基因小鼠(mThy-1人α-突触核蛋白，UC San Diego)中。对于过表达人α-突触核蛋白的转基因小鼠(mThy-1人α-突触核蛋白，UC San Diego)，每周腹膜内施用3个月。每组使用6只小鼠，使用非转基因同窝小鼠作为对照。然后如下进行灌注。
在最后一次施用完成后，对于脑的病理学分析，根据人道规则将动物用水合氯醛麻醉，然后用0.9％盐水进行心肺灌注。将灌注的脑的矢状切片储存在4％多聚甲醛在磷酸盐缓冲液中的溶液(pH7.4，4℃)中，直至后续分析，另一半在冷冻(70℃)下储存。
病理分析如下进行。使用振动切片机通过自由浮动方法将固定在多聚甲醛中的一半脑切成40μm厚的连续切片。为了确认施用组脑中α-Syn的表达水平，将含有皮质、纹状体和海马体的切片与α-syn抗体(作为聚集体的标记物的p 129α-syn抗体，abcam，ab59264或总α-syn抗体，Cell Signaling Technology，#2642)在4℃下过夜温育。为了鉴定星形胶质细胞的活性或小胶质细胞的活性，用抗GFAP(胶质纤丝酸性蛋白)(AB5804，millipore)或Iba1(019-19741，Wako)的抗体分别处理切割样品。为了确定神经炎症的程度，切割样品分别用针对IL-6(NB600-1131，Novus Biologicals)或IL-1β(ab9722，abcam)的抗体处理。在与一抗温育后，处理生物素缀合的山羊抗兔IgG(1∶100，Vector Laboratories)和抗生物素蛋白D-辣根过氧化物酶(1∶200，ABC Elite，Vector Laboratories)，并用二氨基联苯胺(DAB)检测。用明视野显微镜观察每个免疫染色的切片以测量光密度。
结果在图8a和8b中示出。图8a是示出作为α-Syn聚集体的标记物的p-129α-Syn抗体(识别在Ser129磷酸化的α-syn的抗体)的分析结果的图。结果，与仅施用IgG的对照小鼠相比，TG(TransGenic)小鼠显示皮质和海马体的CA1和CA3中的聚集水平显著降低(相关部分由IgG样品中的箭头指示)。图8b示出用总α-Syn抗体染色的结果。通过施用抗体有效地除去TG小鼠中增加的人α-syn。这些结果表明，根据本发明的抗体有效地减少了α-Syn聚集体，并且可以有效地用于治疗诸如帕金森病的α-突触核蛋白病。
实施例5：小鼠单克隆抗α-Syn抗体减少小胶质细胞增生和星形胶质细胞增生和减少炎性细胞因子释放的分析
胶质增生是胶质细胞中的非特异性反应，其响应于由BBB损伤、TGF-β或白细胞介素引发的中枢神经系统的损伤。代表性实例包括小胶质细胞增生和星形胶质细胞增生，它们分别以Iba-1和GFAP蛋白作为标记物。
如实施例4中所述地，在小鼠中分析了根据本发明的抗体对由此引发的小胶质细胞增生和星形胶质细胞增生和炎性细胞因子释放的减少的作用。
结果显示在图9a、9b、9c和9d中。如图中所示，发现与对照相比，本发明的抗体减少了小神经胶质细胞增生和星形胶质细胞增生，以及减少了引发小神经胶质细胞增生和星形胶质细胞增生的炎性细胞因子IL-1β和IL-6的释放。
实施例6.通过小鼠单克隆抗α-Syn抗体检测人脑组织中的Lew体
通过使用实施例5中的本发明的抗体对使用从厚度为10微米的死于帕金森病的患者(悉尼大学的Halliday博士)获得的石蜡包埋脑切片中的路易体和路易神经突如下进行染色。将组织切片用90％甲酸处理3分钟以进行抗原修复，然后用1％H2O2(50％乙醇基)抑制组织的过氧化物酶活性。处理10％正常马血清以防止组织的非特异性结合。用磷酸盐缓冲液洗涤后，将相邻切片用本发明的3A9、11F11和11F11抗体在4℃下处理过夜。用磷酸盐缓冲液洗涤后，将生物素缀合的抗人IgG抗体在37℃下处理30分钟，抗生物素蛋白-生物素复合物在室温下反应30分钟(Vectastatin Elite试剂盒；Vector Laboratories)。然后，用含有0.005％H2O2的DAB显色。每个切片用0.5％甲酚紫复染，以区分每个细胞。
结果如图10a和图10b所示。如图中所示，显示根据本发明的抗体有效地与路易体和路易神经突结合(由箭头指示)。该结果意味着它能够有效地结合作为人脑组织的路易体的组分的α-Syn聚集体。结果表明，递送至人脑的抗体可有效且特异性地与α-syn聚集体结合。
实施例7.小鼠单克隆抗α-Syn抗体的表位分析
通过请求PEPSCAN(荷兰)进行肽等位基因分析来进行对根据本发明的3A9和11F11抗体的表位作图。
结果显示在图11中。如图11所示，发现根据本发明的抗体以优选结合聚集体的形式识别C-末端部分，特别是如上所述的第110至122个氨基酸残基部分。
本领域普通技术人员将理解，在不脱离由所附权利要求限定的本发明的精神和范围的情况下，可以在形式和细节上进行各种改变。

Claims (29)

1.一种特异性地结合α-syn聚集体的分离的抗体或抗原结合片段，其中，所述抗体或抗原结合片段包含(i)CDRH1、CDRH2和CDRH3的互补决定区和(ii)CDRL1、CDRL2和CDRL3的互补决定区，并且
CDRH1选自SEQ ID NO：1至14；CDRH2选自SEQ ID NO：15至28；CDRH3选自SEQ ID NO：29至42，和
CDRL1选自SEQ ID NO：43至56；CDRL2选自SEQ ID NO：57至70；CDRL3选自SEQ ID NO：71至84。
2.根据权利要求1所述的特异性地结合α-syn聚集体的分离的抗体或抗原结合片段，其中，所述重链可变区的CDRH1、CDRH2和CDRH3和轻链可变区的CDRL1、CDRL2和CDRL3的序列是以下中的任一种：
(aa)CDRH1、CDRH2和CDRH3分别是SEQ ID NO：1、15和29，CDRL1、CDRL2和CDRL3分别是SEQ ID NO：43、57和71；
(ab)CDRH1、CDRH2和CDRH3分别是SEQ ID NO：2、16和30，CDRL1、CDRL2和CDRL3分别是SEQ ID NO：44、58和72；
(ac)CDRH1、CDRH2和CDRH3分别是SEQ ID NO：3、17和31，CDRL1、CDRL2和CDRL3分别是SEQ ID NO：45、59和73；
(ad)CDRH1、CDRH2和CDRH3分别是SEQ ID NO：4、18和32，CDRL1、CDRL2和CDRL3分别是SEQ ID NO：46、60和74；
(ae)CDRH1、CDRH2和CDRH3分别是SEQ ID NO：5、19和33，CDRL1、CDRL2和CDRL3分别是SEQ ID NO：47、61和75；
(af)CDRH1、CDRH2和CDRH3分别是SEQ ID NO：6、20和34，CDRL1、CDRL2和CDRL3分别是SEQ ID NO：48、62和76；
(ag)CDRH1、CDRH2和CDRH3分别是SEQ ID NO：7、21和35，CDRL1、CDRL2和CDRL3分别是SEQ ID NO：49、63和77；
(ah)CDRH1、CDRH2和CDRH3分别是SEQ ID NO：8、22和36，CDRL1、CDRL2和CDRL3分别是SEQ ID NO：50、64和78；
(ai)CDRH1、CDRH2和CDRH3分别是SEQ ID NO：9、23和37，CDRL1、CDRL2和CDRL3分别是SEQ ID NO：51、65和79；
(aj)CDRH1、CDRH2和CDRH3分别是SEQ ID NO：10、24和38，CDRL1、CDRL2和CDRL3分别是SEQ ID NO：52、66和80；
(ak)CDRH1、CDRH2和CDRH3分别是SEQ ID NO：11、25和39，CDRL1、CDRL2和CDRL3分别是SEQ ID NO：53、67和81；
(al)CDRH1、CDRH2和CDRH3分别是SEQ ID NO：12、26和40，CDRL1、CDRL2和CDRL3分别是SEQ ID NO：54、68和82；
(am)CDRH1、CDRH2和CDRH3分别是SEQ ID NO：13、27和41，CDRL1、CDRL2和CDRL3分别是SEQ ID NO：55、69和83；或
(an)CDRH1、CDRH2和CDRH3分别是SEQ ID NO：14、28和42，CDRL1、CDRL2和CDRL3是SEQID NO：56、70和84。
3.根据权利要求1所述的特异性地结合α-syn聚集体的分离的抗体或抗原结合片段，其中，所述重链可变区是：
选自SEQ ID NO：85至98的氨基酸序列，
与选自SEQ ID NO：85至98的氨基酸序列具有至少90％或更高序列同一性的氨基酸序列，或
与选自SEQ ID NO：85至98的氨基酸序列具有至少95％或更高序列同一性的氨基酸序列。
4.根据权利要求1所述的特异性地结合α-syn聚集体的分离的抗体或抗原结合片段，其中，所述轻链可变区是
选自SEQ ID NO：99至112的氨基酸序列，
与选自SEQ ID NO：99至112的氨基酸序列具有至少90％或更高序列同一性的氨基酸序列，或
与选自SEQ ID NO：99至112的氨基酸序列具有至少95％或更高序列同一性的氨基酸序列。
5.根据权利要求1所述的特异性地结合α-syn聚集体的分离的抗体或抗原结合片段，其中，所述重链可变区和所述轻链可变区包含以下氨基酸序列：
SEQ ID NO：85和99；
SEQ ID NO：86和100；
SEQ ID NO：87和101；
SEQ ID NO：88和102；
SEQ ID NO：89和103；
SEQ ID NO：90和104；
SEQ ID NO：91和105；
SEQ ID NO：92和106；
SEQ ID NO：93和107；
SEQ ID NO：94和108；
SEQ ID NO：95和109；
SEQ ID NO：96和110；
SEQ ID NO：97和111；或
SEQ ID NO：98和112。
6.根据权利要求1所述的特异性地结合α-syn聚集体的分离的抗体或抗原结合片段，其中，所述抗体或抗原结合片段是单克隆抗体、Fab、Fab′、F(ab’)、双抗体或scFV。
7.根据权利要求6所述的特异性地结合α-syn聚集体的分离的抗体或抗原结合片段，其中，所述单克隆抗体是人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
8.根据权利要求6所述的特异性地结合α-syn聚集体的分离的抗体或抗原结合片段，其中，所述单克隆抗体是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4型。
9.根据权利要求1所述的特异性地结合α-syn聚集体的分离的抗体或抗原结合片段，其中，所述抗体包含重链和轻链，所述重链和轻链包含以下序列：
SEQ ID NO：113和SEQ ID NO：141；
SEQ ID NO：114和SEQ ID NO：142；
SEQ ID NO：115和SEQ ID NO：143；
SEQ ID NO：116和SEQ ID NO：144；
SEQ ID NO：117和SEQ ID NO：145；
SEQ ID NO：118和SEQ ID NO：146；
SEQ ID NO：119和SEQ ID NO：147；
SEQ ID NO：120和SEQ ID NO：148；
SEQ ID NO：121和SEQ ID NO：149；
SEQ ID NO：122和SEQ ID NO：150；
SEQ ID NO：123和SEQ ID NO：151；
SEQ ID NO：124和SEQ ID NO：152；
SEQ ID NO：125和SEQ ID NO：153；或
SEQ ID NO：126和SEQ ID NO：154。
10.根据权利要求1所述的特异性地结合α-syn聚集体的分离的抗体或抗原结合片段，其中，所述抗体包含重链和轻链，所述重链和轻链包含以下序列：
SEQ ID NO：127和SEQ ID NO：155；
SEQ ID NO：128和SEQ ID NO：156；
SEQ ID NO：129和SEQ ID NO：157；
SEQ ID NO：130和SEQ ID NO：158；
SEQ ID NO：131和SEQ ID NO：159；
SEQ ID NO：132和SEQ ID NO：160；
SEQ ID NO：133和SEQ ID NO：161；
SEQ ID NO：134和SEQ ID NO：162；
SEQ ID NO：135和SEQ ID NO：163；
SEQ ID NO：136和SEQ ID NO：164；
SEQ ID NO：137和SEQ ID NO：165；
SEQ ID NO：138和SEQ ID NO：166；
SEQ ID NO：139和SEQ ID NO：167；或
SEQ ID NO：140和SEQ ID NO：168。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的特异性地结合α-syn聚集体的分离的抗体或抗原结合片段，其中，所述抗体或抗原结合片段抑制α-Syn聚集体的细胞间转移；降解α-Syn聚集体；或抑制α-Syn聚集体的形成。
12.一种分离的多核苷酸，其编码根据权利要求1至10中任一项所述的抗体或抗原结合片段。
13.一种表达载体，其包含根据权利要求12所述的多核苷酸。
14.一种细胞，其用根据权利要求13所述的表达载体转化。
15.一种制备特异性地结合α-syn聚集体的分离的抗体或抗原结合片段的方法，包括：
培养根据权利要求14所述的细胞；和
从所述细胞中分离抗体或抗原结合片段。
16.一种组合物，其包含根据权利要求1至10中任一项所述的抗体或抗原结合片段。
17.根据权利要求16所述的组合物，其中，所述组合物用于治疗α-突触核蛋白病，并且还包含药学上可接受的载体或赋形剂。
18.根据权利要求17所述的组合物，其中，所述α-突触核蛋白病是帕金森病(PD)、帕金森病痴呆(PDD)、路易体痴呆(DLB)、阿尔茨海默病路易体变异型(LBV)、阿尔茨海默病合并帕金森病、或多系统萎缩(MSA)。
19.一种在体内或体外检测生物样品中的α-Syn聚集体的方法，包括使需要检测α-Syn聚集体的生物样品与根据权利要求1至10中任一项所述的抗体或抗原结合片段接触的步骤。
20.一种治疗受试者的α-突触核蛋白病或调节α-Syn聚集体浓度的方法，包括将权利要求1至10中任一项所述的抗体或抗原结合片段施用于需要治疗α-突触核蛋白病或调节α-Syn聚集体浓度的受试者。
21.根据权利要求20所述的方法，其中，所述α-突触核蛋白病是帕金森病(PD)、帕金森病痴呆(PDD)、路易体痴呆(DLB)、阿尔茨海默病路易体变异型(LBV)、阿尔茨海默病合并帕金森病、或多系统萎缩(MSA)。
22.一种诊断受试者的α-突触核蛋白病的方法，包括：
用根据权利要求1至10中任一项所述的抗体或抗原结合片段测定受试者的α-syn聚集体的浓度和/或细胞间位置，和
比较在受试者中测量的α-syn聚集体的浓度和/或细胞间位置与对照样品的结果，其中，与对照组的结果的相似性或差异表明受试者患有α-突触核蛋白病。
23.根据权利要求22所述的方法，其中，所述α-突触核蛋白病是帕金森病(PD)、帕金森病痴呆(PDD)、路易体痴呆(DLB)、阿尔茨海默病路易体变异型(LBV)、阿尔茨海默病合并帕金森病、或多系统萎缩(MSA)。
24.根据权利要求1至10中任一项所述的抗体或抗原结合片段、或包含所述抗体或抗原结合片段的组合物用于治疗患有α-突触核蛋白病的受试者的α-突触核蛋白病的用途，其中，所述抗体或抗原结合片段或包含所述抗体或抗原结合片段的组合物抑制受试者脑中的α-Syn聚集体的细胞间转移、降解α-Syn聚集体或抑制α-Syn聚集体的形成。
25.根据权利要求24所述的用途，其中，所述α-突触核蛋白病是帕金森病(PD)、帕金森病痴呆(PDD)、路易体痴呆(DLB)、阿尔茨海默病路易体变异型(LBV)、阿尔茨海默病合并帕金森病、或多系统萎缩(MSA)。
26.根据权利要求1至10中任一项所述的抗体或抗原结合片段、或包含所述抗体或抗原结合片段的组合物用于调节脑细胞中α-Syn聚集体的浓度的用途，其中，所述抗体或抗原结合片段或包含所述抗体或抗原结合片段的组合物抑制α-Syn聚集体的细胞间转移、降解α-Syn聚集体或抑制α-Syn聚集体的形成。
27.根据权利要求1至10中任一项所述的抗体或抗原结合片段，用于调节受试者脑中α-Syn聚集体的浓度的方法中的用途，其中，所述抗体或抗原结合片段抑制α-Syn聚集体的细胞间转移；降解α-Syn聚集体；或抑制α-Syn聚集体的形成。
28.根据权利要求1至10中任一项的抗体或抗原结合片段，用于治疗α-突触核蛋白病的用途。
29.根据权利要求28所述的抗体或抗原结合片段，其中，所述α-突触核蛋白病是帕金森病(PD)、帕金森病痴呆(PDD)、路易体痴呆(DLB)、阿尔茨海默病路易体变异型(LBV)、阿尔茨海默病合并帕金森病、或多系统萎缩(MSA)。
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