CN109689687A - 抗met抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及激动性抗MET抗体及其在疾病治疗性处理中的应用。抗体以高亲和力结合人和小鼠肝细胞生长因子(HGF)受体，也被称为MET，并且是人和小鼠中MET的激动剂，从而产生类似于HGF结合作用的分子和细胞效应。

Description

抗MET抗体及其应用
技术领域
本发明涉及以高亲和力结合人和小鼠肝细胞生长因子(HGF)受体(也被称为MET)的抗体和抗原结合片段。该抗体和抗原结合片段是人和小鼠中MET的激动剂，从而产生类似于HGF结合作用的分子和细胞效应。本发明还涉及抗体和抗原结合片段作为MET激动剂的治疗用途。
背景技术
HGF是间充质来源的多效细胞因子，其介导包括细胞增殖、运动、分化和存活的生物功能特征性阵列。HGF受体，也被称为MET，由多种组织表达，多种组织包括：所有上皮细胞、内皮细胞、肌细胞、神经元细胞、成骨细胞、造血细胞以及免疫系统的各种组分。
HGF和MET信号传导在胚胎发育过程中起着重要作用，它可以引导前体细胞的迁移并决定细胞的存活或死亡。在成人中，HGF/MET信号传导通常是静止的并且在伤口愈合和组织再生期间恢复。一些癌症和肿瘤篡夺HGF/MET信号传导，以促进肿瘤在宿主生物体中的存活和增殖。因此，尽管成功有限，但抑制HGF-MET轴已成为抗癌治疗的流行靶标。
由于其在组织愈合和再生中的作用，重组HGF也已被研究用于治疗许多病症，包括：退行性疾病、炎性疾病、自身免疫疾病、代谢疾病和移植相关病症。然而，重组HGF具有差的药理学性质：它需要蛋白水解活化以具有生物活性；一旦激活，它具有极短的体内半衰期；并且其工业制造复杂且昂贵。
已经提出了以模拟HGF的方式激活MET的激动性抗MET抗体作为替代物。
已经描述了至少部分模拟HGF活性的以下抗体：(i)3D6小鼠抗人MET抗体(美国专利第6,099,841号)；(ii)5D5小鼠抗人MET抗体(美国专利第5,686,292号)；(iii)NO-23小鼠抗人MET抗体(美国专利第7,556,804 B2号)；(iv)B7人幼稚抗人MET抗体(美国专利申请第2014/0193431 A1号)；(v)DO-24小鼠抗人MET抗体(Prat等人，Mol Cell Biol.11，5954-5962，1991；Prat等人，J Cell Sci.111，237-247，1998)；以及(vi)DN-30小鼠抗人MET抗体(Prat等人，Mol Cell Biol.11，5954-5962，1991；Prat等人，J Cell Sci.111，237-247，1998)。
发明内容
迄今为止产生的激动性抗MET抗体，例如背景技术部分中描述的那些，经常作为旨在识别拮抗性分子的过程的副产物而被获得，并且未被明确设计成为治疗用途的激动剂分子。此外，现有技术抗MET抗体的最显著限制是它们已在小鼠系统中产生(除了使用人幼稚噬菌体文库识别的B7外)；结果，这些抗体不太可能展示与小鼠MET发生的交叉反应性。即使与自身抗原的微小交叉反应性原则上是可能的，这些相互作用也通常具有非常低的亲和力。
虽然没有交叉反应性不是小鼠癌症模型的关注(因为他们使用人异种移植物)，但是人和小鼠MET之间的抗体的交叉反应性是再生医学或非肿瘤学人疾病的临床前小鼠模型的重要需求，这需要抗体在小鼠组织和细胞上发挥作用。
不仅需要激动性抗MET抗体与小鼠MET交叉反应以便在临床前模型中评估抗体，而且还期望抗体以与其对人MET的亲和力相同或者相似的亲和力结合小鼠MET，以及抗体在小鼠系统中引发与其在人系统中引起的效果相同或相似的效果——否则在临床前模型中进行的实验将不能预测人的情况。如实施例中所证明的，现有技术的抗MET激动性抗体都没有表现出对小鼠MET的亲和力，并且当然现有技术抗体都没有在小鼠和人系统中表现出相同或相似的结合和激动作用。
本申请提供了通过设计以高亲和力结合人和小鼠MET而制备的抗MET激动性抗体。这些抗体：(i)在人和小鼠MET生物系统中表现出激动活性——即它们诱导MET信号传导——一些具有与HGF相比相似或更高的效力；(ii)引发全谱的HGF诱导的生物活性，因此代表重组HGF的有效替代物；(iii)当与现有技术抗体直接比较时表现出优秀的与小鼠MET的结合；(iv)在低至1pM的浓度下表现出生物学上显著的激动活性；(v)在小鼠中表现出数日的血浆半衰期，剂量为1μg/kg时已经达到药理学饱和浓度，这对于治疗性抗体来说是非常低的；(vi)在急性肾损伤的小鼠模型中保持肾功能和肾完整性；(vii)在急性肝损伤小鼠模型中预防肝功能衰竭并且拮抗肝细胞损伤；(viii)在慢性肝损伤的小鼠模型中表现出抗纤维化、抗炎和促再生活性；(ix)在溃疡性结肠炎的小鼠模型和炎性肠病的小鼠模型中预防体重减轻、减轻肠出血、保持结肠完整性、抑制炎症并且促进上皮再生；(x)在I型糖尿病的小鼠模型中促进胰岛素依赖性葡萄糖摄取；(xi)在II型糖尿病的小鼠模型中克服胰岛素抵抗；(xii)在非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的小鼠模型中改善脂肪肝、抑制纤维化并且恢复肝功能；(xiii)在糖尿病性溃疡的小鼠模型中加速伤口愈合；(xiv)与褐家鼠(Rattusnorvegicus)MET和食蟹猴(Macaca fascicularis)MET交叉反应，从而允许在申请首次人试验之前需要的对这两种脊椎动物进行毒理学和药理学研究；(xv)识别在人、小鼠、大鼠和食蟹猴中保守的表位，从而在动物模型中提供更大的效用。
因此，在第一方面，本发明提供了一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段以高亲和力结合人MET蛋白(hMET)，并且以高亲和力结合小鼠MET蛋白(mMET)，其中，所述抗体或其抗原结合片段是hMET激动剂和mMET激动剂。在某些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段包含至少一个重链可变域(VH)和至少一个轻链可变域(VL)，其中，所述VH和VL域，当作为Fab片段进行测试时，对hMET表现出1×10-3s-1至1×10-2s-1、任选地1×10-3s-1至6×10-3s-1的解离速率(通过Biacore测得的k解离)，并且对mMET表现出1×10-3s-1至1×10-2s-1、任选地1×10-3s-1至6×10-3s-1的解离速率(通过Biacore测得的k解离)。在某些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段对hMET和mMET具有等同的亲和力。
在某些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段诱导hMET的磷酸化，并且诱导mMET的磷酸化。在某些实施方式中，所述抗体或抗原结合片段以小于3.0nM、任选地小于2.0nM的EC50(通过磷酸化-MET ELISA测得)诱导hMET的磷酸化，并且以小于3.0nM、任选地小于2.0nM的EC50(通过磷酸化-MET ELISA测得)诱导mMET的磷酸化。在某些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段等同地诱导hMET和mMET的磷酸化。
在某些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段对hMET表现出高的磷酸化效力，并且对mMET表现出高的磷酸化效力。在某些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段以小于1nM的EC50和/或至少80％的Emax(以磷酸化MET ELISA中HGF诱导激活的百分比表示)诱导hMET的磷酸化，并且以小于1nM的EC50和/或至少80％的Emax(以磷酸化MET ELISA中HGF诱导激活的百分比表示)诱导mMET的磷酸化。在某些替代实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段对hMET表现出低的磷酸化效力，并且对mMET表现出低的磷酸化效力。在某些这样的实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段以1nM～5nM的EC50和/或60～80％的Emax(以磷酸化METELISA中HGF诱导激活的百分比表示)诱导hMET的磷酸化，并且以1nM～5nM的EC50和/或60～80％的Emax(以磷酸化MET ELISA中HGF诱导激活的百分比表示)诱导mMET的磷酸化。
在某些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段在与人细胞接触时诱导HGF样细胞应答，并且在与小鼠细胞接触时诱导HGF样细胞应答。在某些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段在与人细胞接触时和在与小鼠细胞接触时完全诱导HGF样细胞应答。在某些实施方式中，HGF样细胞应答的完全诱导在出现以下中的一者、任何两者或全部情况时是可测量的：
(i)在细胞分散检测中，当所述抗体或其抗原结合片段的浓度为0.1～1.0nM时，所述抗体或其抗原结合片段诱导与最大HGF诱导的分散相当的细胞分散；
(ii)在抗凋亡细胞检测中，所述抗体或其抗原结合片段表现出EC50小于HGF的EC50的1.1倍，和/或Emax(作为非凋亡对照细胞的总ATP含量的％被测量)大于对HGF观察到的Emax的90％；和/或
(iii)在分枝化形态发生检测中，经所述抗体处理的细胞表现出每个由相同(非零)浓度的HGF诱导的球状体大于90％的分枝数
在某些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段在与人细胞接触时和在与小鼠细胞接触时部分诱导HGF样细胞应答。在某些实施方式中，HGF样细胞应答的部分诱导在出现以下(i)-(iii)的情况时是可测量的：
(i)在细胞分散检测中，当所述抗体的浓度为1nM或更低时，所述抗体或其抗原结合片段诱导由0.1nM同源HGF诱导的至少25％的细胞分散；
(ii)在抗凋亡细胞检测中，所述抗体或其抗原结合片段表现出EC50不大于HGF的EC50的7.0倍，和/或Emax细胞存活率为对HGF观察到的至少50％；和/或
(ii)在分枝化形态发生检测中，经所述抗体处理的细胞表现出每个由相同(非零)浓度的HGF诱导的球状体至少25％的分枝数；
并且所述抗体或抗原结合片段不能完全诱导HGF样细胞应答。
在某些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段是HGF竞争剂。在某些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段以不大于5nM的IC50和/或至少50％的Imax与hHGF竞争结合hMET，并且以不大于5nM的IC50和/或至少50％的Imax与mHGF竞争结合mMET。在某些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段与hHGF和mHGF等同地竞争。在某些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段是完全HGF竞争剂。在某些这样的实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段以小于2nM的IC50和/或大于90％的Imax与hHGF竞争，并且以小于2nM的IC50和/或大于90％的Imax与mHGF竞争。在某些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段是部分HGF竞争剂。在某些这样的实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段以2～5nM的IC50和/或50％～90％的Imax与hHGF竞争，并且以2～5nM的IC50和/或50％～90％的Imax与mHGF竞争。
本发明的抗体或其抗原结合片段可以表现出与猴来源的MET如食蟹猴(Macacacynomolgus)MET的交叉反应性，并且可以表现出与大鼠来源的MET(褐家鼠(Rattusnorvegicus))的交叉反应性。
本发明的抗体或其抗原结合片段可以结合人MET的氨基酸残基123至223的人MET的表位(在整个文件中，人MET的编号是指GenBank序列X54559号)。还提供了本发明的抗体或其抗原结合片段，其可以结合人MET的氨基酸224-311之间的人MET的表位。还提供了本发明的抗体或其抗原结合片段，其可以结合人MET的氨基酸314-372之间的人MET的表位。还提供了本发明的抗体或其抗原结合片段，其可以结合人MET的氨基酸546-562之间的人MET的表位。
还提供了本发明的抗体或其抗原结合片段，其可以结合包含氨基酸残基Ile367的人MET的表位。还提供了本发明的抗体或其抗原结合片段，其可结合包含人MET的氨基酸残基Asp372的人MET的表位。在某些实施方式中，抗体或其抗原结合片段结合包含人MET的氨基酸残基Ile367和Asp372的人MET的表位。
还提供了本发明的抗体或其抗原结合片段，其可结合包含人MET的氨基酸残基Thr555的人MET的表位。
本发明还提供了一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变域和轻链可变域，所述重链可变域包括H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3，所述轻链可变域包括L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3，其中：
H-CDR1包含选自SEQ ID NO：2、9、16、23、30、37、44、51、58、65和72的氨基酸序列；
H-CDR2包含选自SEQ ID NO：4、11、18、25、32、39、46、53、60、67和74的氨基酸序列；
H-CDR3包含选自SEQ ID NO：6、13、20、27、34、41、48、55、62、69和76的氨基酸序列；
L-CDR1包含选自SEQ ID NO：79、86、93、100、107、114、121、128、135、142和149的氨基酸序列；
L-CDR2包含选自SEQ ID NO：81、88、95、102、109、116、123、130、137、144和151的氨基酸序列；并且
L-CDR3包含选自SEQ ID NO：83、90、97、104、111、118、125、132、139、146和153的氨基酸序列。
[71G2]在一个实施方式中，本发明提供了一种抗体或抗原结合片段，其包含重链可变域和轻链可变域，所述重链可变域包括H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3，所述轻链可变域包括L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3，其中：
H-CDR1包含SEQ ID NO：44所示的氨基酸序列；
H-CDR2包含SEQ ID NO：46所示的氨基酸序列；
H-CDR3包含SEQ ID NO：48所示的氨基酸序列；
L-CDR1包含SEQ ID NO：121所示的氨基酸序列；
L-CDR2包含SEQ ID NO：123所示的氨基酸序列；并且
L-CDR3包含SEQ ID NO：125所示的氨基酸序列。
[71G2]在一个这样的实施方式中，所述抗体或片段的重链可变域包含SEQ ID NO：167的氨基酸序列，或与其至少90％、95％、97％或99％同一性的序列；并且所述轻链可变域包含SEQ ID NO：168的氨基酸序列，或与其至少90％、95％、97％或99％同一性的序列。
[71D6]在另一个实施方式中，本发明提供了一种抗体或抗原结合片段，其包含重链可变域和轻链可变域，所述重链可变域包括H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3，所述轻链可变域包括L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3，其中：
H-CDR1包含SEQ ID NO：30所示的氨基酸序列；
H-CDR2包含SEQ ID NO：32所示的氨基酸序列；
H-CDR3包含SEQ ID NO：34所示的氨基酸序列；
L-CDR1包含SEQ ID NO：107所示的氨基酸序列；
L-CDR2包含SEQ ID NO：109所示的氨基酸序列；并且
L-CDR3包含SEQ ID NO：111所示的氨基酸序列。
[71D6]在一个这样的实施方式中，所述抗体或抗原结合片段的重链可变域包含SEQ ID NO：163的氨基酸序列，或与其至少90％、95％、97％或99％同一性的序列；并且所述轻链可变域包含SEQ ID NO：164的氨基酸序列，或与其至少90％、95％、97％或99％同一性的序列。
[71G3]在又一个实施方式中，本发明提供了一种抗体或抗原结合片段，其包含重链可变域和轻链可变域，所述重链可变域包括H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3，所述轻链可变域包括L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3，其中：
H-CDR1包含SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列；
H-CDR2包含SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列；
H-CDR3包含SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列；
L-CDR1包含SEQ ID NO：86所示的氨基酸序列；
L-CDR2包含SEQ ID NO：88所示的氨基酸序列；并且
L-CDR3包含SEQ ID NO：90所示的氨基酸序列。
[71G3]在一个实施方式中，所述抗体或抗原结合片段的重链可变域包含SEQ IDNO：157的氨基酸序列，或与其至少90％、95％、97％或99％同一性的序列；并且所述轻链可变域包含SEQ ID NO：158的氨基酸序列，或与其至少90％、95％、97％或99％同一性的序列。
在另外实施方式中，本发明提供了一种抗体或抗原结合片段，其包含含有H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3的重链可变域和含有L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3的轻链可变域，其中，H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3选自表3中所示的Fab的一组CDR(CDR1、CDR2和CDR3)，并且L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3是表4中所示的相同Fab的相应CDR(CDR1、CDR2和CDR3)。
在某些实施方式中，抗体或抗原结合片段的重链可变域包含表5的VH氨基酸序列或与其至少90％、95％、97％或99％同一性的序列，并且轻链可变域包含表5中的相应VL氨基酸序列或与其至少90％、95％、97％或99％同一性的序列。
VH域的氨基酸序列表现出与限定的VH域氨基酸序列(例如SEQ ID NO：x)小于100％序列同一性的实施方式尽管可以包含与SEQ ID NO：x的VH的HCDR1、HCDR2和HCDR3相同的重链CDR，但是在骨架区内表现出氨基酸序列变异。例如，骨架区的一个或多个氨基酸残基可被在由人种系编码的人VH域中的等同位置中出现的氨基酸残基所取代。同样地，VL域的氨基酸序列表现出与限定的VL域氨基酸序列(例如SEQ ID NO：y)小于100％序列同一性的实施方式尽管可以包含与SEQ ID NO：y的VH的LCDR1、LCDR2和LCDR1相同的轻链CDR，但是在骨架区内表现出氨基酸序列变异。例如，骨架区的一个或多个氨基酸残基可被在由人种系编码的人VL域中的等同位置中出现的氨基酸残基所取代。
本发明还提供了抗体和抗原结合片段，其包含前述抗体的VH和VL域的人源化/种系变体，和亲和变体以及如本文所定义的保守氨基酸取代的变体。具体提供了嵌合抗体，其含有上述大羊驼衍生的Fab的VH和VL域，或其与人抗体(特别是人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的恒定域融合的人种系变体。前述抗体的重链和轻链可变域，或其种系变体、亲和变体或其保守变体可被包括于常规四链抗体或其他抗原结合蛋白，例如Fab、Fab′、F(ab′)2、双特异性Fab、和Fv片段、双抗体、线性抗体、单链抗体分子、单链可变片段(scFv)和多特异性抗体。重链可变域或其种系变体、亲和变体或其保守变体也可被用作单域抗体。
在另外方面中，本发明还提供了：一种分离的多核苷酸，其编码根据本发明的抗体或抗原结合片段；一种表达载体，其包含与调节序列可操作地连接的所述多核苷酸，所述调节序列允许所述抗体或其抗原结合片段在宿主细胞或无细胞表达系统中表达；以及一种宿主细胞或无细胞表达系统，其含有所述表达载体。本发明还提供了一种生产重组抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括在允许表达所述抗体或抗原结合片段的条件下培养所述宿主细胞或无细胞表达系统并且回收表达的抗体或抗原结合片段。
在另一方面中，本发明提供了一种药物组合物，其包含本发明的抗体或抗原结合片段和至少一种药学上可接受的载体或赋形剂。
在另一方面中，本发明提供了本发明的抗体或抗原结合片段或本发明的药物组合物在治疗中的应用。
在另一方面中，本发明提供了一种治疗或预防人患者肝损伤的方法，所述肝损伤任选为急性肝损伤或慢性肝损伤，所述方法包括向有需要的患者给药治疗有效量的MET激动剂抗体。在某些实施方式中，MET激动剂抗体是根据本发明的抗体或抗原结合片段。
在另一方面中，本发明提供了一种治疗或预防人患者肾损伤的方法，所述肾损伤任选为急性肾损伤，所述方法包括向有需要的患者给药治疗有效量的MET激动剂抗体。在某些实施方式中，MET激动剂抗体是根据本发明的抗体或抗原结合片段。
在另一方面中，本发明提供了一种治疗或预防人患者炎性肠病的方法，所述炎性肠病任选为溃疡性结肠炎，所述方法包括向有需要的患者给药治疗有效量的MET激动剂抗体。在某些实施方式中，MET激动剂抗体是根据本发明的抗体或抗原结合片段。
在另一方面中，本发明提供了一种治疗或预防人患者糖尿病的方法，所述糖尿病任选为I型或II型糖尿病，所述方法包括向有需要的患者给药治疗有效量的MET激动剂抗体。在某些实施方式中，MET激动剂抗体是根据本发明的抗体或抗原结合片段。
在另一方面中，本发明提供了一种治疗或预防人患者非酒精性脂肪性肝炎的方法，所述方法包括向有需要的患者给药治疗有效量的MET激动剂抗体。在某些实施方式中，MET激动剂抗体是根据本发明的抗体或抗原结合片段。
在另一方面中，本发明提供了一种治疗或促进人患者伤口愈合的方法，所述人患者任选为患有糖尿病的患者，所述方法包括向有需要的患者给药治疗有效量的MET激动剂抗体。在某些实施方式中，MET激动剂抗体是根据本发明的抗体或抗原结合片段。
附图说明
图1：通过ELISA测定用人MET-Fc免疫的大羊驼的免疫应答。将人MET ECD(hMET)或小鼠MET ECD(mMET)重组蛋白固定在固相中，并且在免疫之前(PRE)或之后(POST)暴露于来自大羊驼的血清的连续稀释液。使用小鼠抗大羊驼IgG1和HRP缀合的驴抗小鼠抗体来揭示结合(binding)。OD：光密度；AU：任意单位。
图2：用于识别负责mAb结合的MET域的人MET缺失突变体的示意图。ECD：胞外域；aa：氨基酸；L.肽：前导肽；SEMA：脑信号蛋白(semaphorin)同源域；PSI或P：丛状蛋白-脑信号蛋白-整合蛋白(plexin-semaphorin-integrin)同源域；IPT：免疫球蛋白-转录因子-丛蛋白同源域。在右侧，人MET的相应残基是根据UniProtKB#P08581报道的。
图3：用于精细定位由抗MET抗体识别的表位的大羊驼-人嵌合MET蛋白的示意图。大羊驼MET和人MET的胞外部分分别由931个和932个氨基酸(aa)组成(大羊驼MET具有2个aa的短的前导肽但在第163位aa后具有插入)。两种受体胞外域均包含前导肽、脑信号蛋白同源域(SEMA)、丛蛋白-脑信号蛋白-整合蛋白同源域(PSI或P)和四个免疫球蛋白-转录因子-丛蛋白同源域(IPT)。嵌合体CH1-5具有N末端大羊驼部分，接着是C末端人部分。嵌合体CH6-7具有N末端人部分，接着是C末端大羊驼部分。
图4：通过蛋白质印迹法测定的人和小鼠细胞中人/小鼠等价抗MET抗体的激动活性。对A549人肺癌细胞和MLP29小鼠肝前体细胞进行血清饥饿，然后用递增浓度的mAb或重组人HGF(hHGF；A549)或小鼠HGF(mHGF；MLP29)进行刺激。通过使用抗磷酸化-MET抗体(第1234-1235位酪氨酸)的蛋白质印迹测定MET自磷酸化。相同的细胞裂解液还通过使用抗全人MET抗体(A549)或抗全小鼠MET抗体(MLP29)的蛋白质印迹法进行分析。
图5：通过使用LOC人肾上皮细胞和MLP29小鼠肝前体细胞的分枝化形态发生检测测定的人/小鼠等价抗MET抗体的生物活性。将细胞球状体接种在胶原层内，然后暴露于递增浓度的mAb或重组人HGF(LOC)或小鼠HGF(MLP29)。随着时间的推移通过显微镜观察分枝化形态发生，并在5天后对菌落拍照。
图6：与现有技术抗体的比较：人-鼠交叉反应性。将人或小鼠MET ECD固定在固相中并暴露于溶液中递增浓度的抗体(均为小鼠IgG/λ形式)。结合通过使用HRP缀合的抗小鼠Fc抗体的ELISA进行揭示。
图7：与现有技术抗体比较：MET自磷酸化。对A549人肺癌细胞和MLP29小鼠肝脏前体细胞进行剥夺血清生长因子48小时，然后用递增浓度的抗体进行刺激。在刺激15分钟后，细胞裂解，并且磷酸化-MET水平通过使用用于捕获的抗MET抗体和用于揭示的抗磷酸化酪氨酸抗体的ELISA进行测定。
图8：与现有技术抗体的比较：分枝化形态发生。将LOC人肾上皮细胞球状体接种在胶原层中，然后用递增浓度的mAb进行孵育。随着时间的推移通过显微镜观察分枝化形态发生，并在5天后对菌落拍照。
图9：与现有技术抗体的比较：分枝化形态发生。将MLP29小鼠肝脏前体细胞球状体接种在胶原层中，然后用递增浓度的mAb进行孵育。随着时间的推移通过显微镜观察分枝化形态发生，并在5天后对菌落拍照。
图10：人/小鼠等价抗MET抗体的血浆稳定性。腹腔注射1mg/kg或10mg/kg抗体的单次推注，并且在注射后3、6、12和24小时从尾静脉采集血液样品。对血液样品进行处理并且通过ELISA测定血浆中的抗体浓度。(A)注射的抗体的高峰和低谷水平。(B)抗体血浆半衰期通过抗体浓度Ln变换的线性拟合进行计算。
图11：急性肝衰竭模型：肝功能标志物的血浆浓度。急性肝损伤通过皮下注射CCl4溶液在BALB/c小鼠中进行诱导。在中毒后不久，将小鼠随机分成4大组(arm)，其接受71G3、71D6、71G2或仅载体(PBS)的单次推注。抗体通过腹腔注射剂量为5mg/kg进行施用。每个大组包含三组小鼠，其在中毒后的不同时间(12、24和48小时)处死。在注射后的不同时间(0、12、24和48小时)采集血液样品。在尸检时，收集血液和肝脏进行分析。肝标志物天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)和胆红素(BIL)的血浆水平通过标准临床生物化学方法进行测定。
图12：急性肝衰竭模型：肝脏切片的组织学检查。如图11图例中所描述，在BALB/c小鼠中诱导急性肝损伤。在尸检时，提取肝脏并将其包埋在石蜡中用于组织学分析。切片用苏木精和伊红进行染色，并通过显微镜进行检查。每个治疗大组的代表性图像被示出。放大倍数：100倍。
图13：慢性肝损伤模型：肝功能标志物的血浆浓度。BALB/c小鼠中的肝损伤和纤维化通过长期暴露于CCl4数周进行诱导。在第一次CCl4注射后不久，将小鼠随机分成4大组，其接受分别用71G3、71D6、71G2或仅载体(PBS)进行的处理。抗体通过每周三次腹腔注射剂量为1mg/kg进行施用。另外的第五对照大组未接受CCl4或抗体并且用作健康对照。在慢性CCl4中毒6周后处死小鼠。在尸检时，收集血液和肝脏进行分析。肝标志物天冬氨酸转氨酶(AST)和丙氨酸氨基转移酶(ALT)的血浆水平通过标准临床生物化学方法进行测定。
图14：慢性肝损伤模型：用Picro天狼星红染色的肝脏切片的组织学检查。如图13图例中所描述，BALB/c小鼠中的肝损伤和纤维化通过长期暴露于CCl4数周进行诱导。在尸检时，提取肝脏并将其包埋在石蜡中用于免疫组织化学分析。切片用Picro天狼星红(PicroSirius red)进行染色。每个治疗大组的代表性图像被示出。放大倍数：100倍。
图15：慢性肝损伤模型：用抗α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)抗体染色的肝脏切片的组织学检查。如图13图例中所描述，BALB/c小鼠中的肝损伤和纤维化通过长期暴露于CCl4进行诱导。在尸检时，提取肝脏并将其包埋在石蜡中用于免疫组织化学分析。切片用抗α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)抗体进行染色。每个治疗大组的代表性图像被示出。放大倍数：100倍。
图16：急性肾损伤模型：肾功能标志物的血浆水平。急性肾衰竭通过腹腔注射单次推注的HgCl2在BALB/c小鼠中进行诱导。在HgCl2中毒后不久，将小鼠随机分成4个大组，其中经受用71G3、71D6、71G2或仅载体(PBS)进行的处理。抗体通过每24小时腹腔注射剂量为5mg/kg进行施用。在注射HgCl272小时后处死小鼠。在尸检时，收集血液和肾脏进行分析。血尿素氮(BUN)和肌酸酐(CRE)血浆水平通过标准临床生物化学方法进行测定。
图17：急性肾损伤模型：肾脏切片的组织学分析。如图16图例中所描述，急性肾衰竭通过HgCl2注射在BALB/c小鼠中进行诱导。在尸检时，提取肾脏并将其包埋在石蜡中用于组织学分析。肾脏切片用苏木精和伊红进行染色。每个治疗大组的代表性图像被示出。放大倍数：400倍。
图18：溃疡性结肠炎模型：体重、疾病活动指数(DAI)和结肠长度。溃疡性结肠炎通过向饮用水中加入葡聚糖硫酸钠(DSS)10天在BALB/c小鼠中进行诱导。在第10天，中断DSS治疗并将小鼠放回至进行正常水中。从第1天开始，将小鼠随机分成7个大组，其接受用71G3、71D6、71G2(剂量为1mg/kg或5mg/kg)或仅载体(PBS)进行的处理。另外的第八对照大组未接受DSS或抗体并且用作健康对照。在第12天，即，在中断DSS施用后2天，处死小鼠。在尸检时，对结肠进行收集、洗净，并用尺子测定它们的长度。在测量后，将结肠包埋在石蜡中并对其进行处理用于组织学分析。在整个实验过程中，定期监测小鼠体重，并通过测定粪便血液、直肠出血和粪便稠度来评估溃疡性结肠炎的临床症状。每个参数被评分为0(没有症状)至3(症状的最大表现)分。将相对于单个参数的评分相加在一起以产生0至9的DAI。(A)体重随时间的变化(相对于时间0的百分比)。(B)DAI随时间的变化。(C)尸检时的结肠长度。为清楚起见，1mg/kg大组和5mg/kg大组的数据在单独的图中示出。
图19：溃疡性结肠炎模型：结肠切片的组织学分析。如图18图例中所描述，溃疡性结肠炎通过暴露于葡聚糖硫酸钠(DSS)在BALB/c小鼠中进行诱导。在尸检时，将结肠收集、测量，然后包埋在石蜡中并进行处理，用于组织学分析。结肠切片用苏木精和伊红进行染色，通过显微镜进行检查，并进行拍照。实验大组、抗体剂量和放大倍数在每个图像附近示出。请参阅图像分析的正文。
图20：炎性肠病模型：体重和结肠长度。结肠损伤和炎症通过直肠注射溶解在乙醇中的2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)在C57BLKS/J小鼠中进行诱导。在TNBS给药后不久，将小鼠随机分成4大组，其分别接受用71G3、71D6、71G2或仅载体(PBS)进行的处理。另外的第五对照大组未接受TNBS或抗体并且用作健康对照。在TNBS给药后5天处死小鼠。在尸检时，收集并测量结肠。在测量后，将结肠包埋在石蜡中并对其进行处理，用于组织学分析。在整个实验过程中，每天测量小鼠体重。(A)体重随时间的变化(相对于时间0的百分比)。(B)尸检时的结肠长度。
图21：炎性肠病模型：结肠切片的组织学分析。如图20图例中所描述，结肠损伤和炎症通过直肠注射2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)在BALB/c小鼠中进行诱导。在尸检时，收集并测量结肠。在测量后，将结肠包埋在石蜡中并对其进行处理，用于组织学分析。结肠切片用苏木精和伊红进行染色，通过显微镜进行检查，并进行拍照。请参阅图像分析的正文。
图22：I型糖尿病模型：在糖尿病小鼠中对葡萄糖摄取和与胰岛素的联合的促进。胰腺β-细胞变性通过腹腔注射链脲霉素(STZ)在BALB/c小鼠中进行诱导。STZ处理的小鼠表现出与未治疗的小鼠相比两倍的平均基础血糖。将STZ处理的小鼠随机分成4个大组，其分别接受用71G3、71D6、71G2或仅载体(PBS)进行的处理。另外的第五对照大组未接受STZ或抗体并且用作健康对照。随时监测禁食条件下的血糖浓度，持续5周。在第5周结束时，进行葡萄糖耐量测试(GTT)和胰岛素耐量测试(ITT)。(A)空腹条件下基础血糖水平随时间变化的分析。(B)GTT：在对禁食动物口服给药葡萄糖后，随时间监测血糖水平。(C)ITT：在对部分禁食动物腹腔注射胰岛素后，随时间监测血糖水平。
图23：I型糖尿病模型：在培养细胞中对葡萄糖摄取和与胰岛素的联合的促进。对C2C12小鼠成肌细胞进行诱导以分化成肌细胞，然后用人/小鼠等价激动性抗MET抗体(71G3、71D6、71G2)对其进行孵育。在24小时后，将抗体处理的细胞分成3大组，其在荧光葡萄糖类似物2-(N-7-硝基-2，1，3-苯并恶二唑-4-氨基)-2-脱氧-D-葡萄糖(2-NBDG)的存在下经受用0nM、100nM或1000nM人重组胰岛素进行的急性刺激1小时。2-NBDG摄取通过流式细胞术进行测定。(A)通过人/小鼠等价激动性抗MET抗体或胰岛素对2-NBDG摄取进行的诱导。(B)在不存在或存在胰岛素的情况下对71G3的2-NBDG摄取进行的诱导。(C)在不存在或存在胰岛素的情况下对71D6的2-NBDG摄取进行的诱导。(D)在不存在或存在胰岛素的情况下对71G2的2-NBDG摄取进行的诱导。
图24：II型糖尿病模型：db/db小鼠中的血糖水平归一化和克服胰岛素抵抗。在8周龄时，将雌性db/db小鼠(在瘦蛋白受体基因lepr中具有点突变的C57BLKS/J变体)随机分成4大组，其接受分别用71G3、71D6、71G2或仅载体(PBS)进行的处理。抗体通过每周两次腹腔注射剂量为1mg/kg进行施用。每10天监测禁食条件下的血糖浓度，持续7周。在治疗结束时，即在小鼠为15周龄时，使用年龄匹配的野生型C57BLKS/J小鼠作为对照进行葡萄糖耐量测试(GTT)和胰岛素耐量测试(ITT)。(A)血糖浓度随时间的变化。(B)GTT：在对禁食动物口服给药葡萄糖后，随时间监测血糖水平。(C)ITT：在对部分禁食的动物腹腔注射胰岛素后，随时间监测血糖水平。
图25：非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的小鼠模型：通过组织学确定的脂肪肝改善。将8周龄的雌性db/db小鼠随机分成4大组，其接受分别用71G3、71D6、71G2或仅载体(PBS)进行的处理。抗体通过每周两次腹腔注射剂量为1mg/kg进行施用。在处理8周后，处死小鼠并对其进行尸检。收集血液用于分析肝功能标志物。提取肝脏，将其包埋在石蜡中并处理用于组织学检查。肝脏切片用苏木精和伊红进行染色。脂肪细胞的细胞质看起来是空的且白色的，因为在样品的酒精处理过程中脂质已被冲走。每个治疗大组的代表性图像被示出。放大倍数：200倍。
图26：非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的小鼠模型：通过Picro天狼星红染色测定的纤维化的抑制。如图25图例中所描述的，将8周龄雌性db/db小鼠随机化并对其进行治疗。在尸检时，处理肝脏用于组织学检查。肝脏切片用天狼星红进行染色以突出纤维化。每个治疗大组的代表性图像被示出。放大倍数：200倍。
图27：非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的小鼠模型：肝功能标志物的归一化。如图25图例中所描述，8周龄的雌性db/db小鼠仅用纯化的71G3、71D6、71G2或仅载体进行处理。在处理7周后，收集血液用于分析肝功能标志物。(A)天冬氨酸转氨酶(AST)的血浆水平。(B)丙氨酸氨基转移酶(ALT)的血浆水平。
图28：糖尿病溃疡的小鼠模型：伤口的加速愈合。对8周龄的db/db糖尿病小鼠进行麻醉，然后用0.8cm宽的圆形穿孔刀片切割以进行皮肤活检，以在右后侧产生圆形伤口。移除整个表皮层。在手术后第二天，将小鼠随机分成4大组，其接受用纯化的71G3、71D6和71G2或仅用载体(PBS)进行的处理。抗体每隔一天通过腹腔注射剂量为5mg/kg进行递送。每天使用卡尺测量伤口直径。(A)伤口面积随时间的变化。(B)通过对伤口闭合的每日百分比取平均所确定的平均再上皮化率。
图29：通过ELISA测定的与褐家鼠和食蟹猴交叉反应性。为了测试泛种交叉反应性，选择代表SEMA结合物(71D6、71C3、71D4、71A3、71G2)和PSI结合物(76H10、71G3)的限制性抗体组。5D5现有技术抗体被用作对照。将人、小鼠、大鼠或猴子METECD固定在固相中并暴露于溶液中递增浓度的mAb(以其人IgG1/λ形式)。结合通过使用HRP缀合的抗人Fc抗体进行揭示。
图30：来自智人(H.sapiens)、小家鼠(M.musculus)、褐家鼠(R.norvegicu)、食蟹猴(M.fascicularis)和大羊驼(L.glama)的MET ECD域之间的氨基酸序列比对。(A)相对于由SEMA结合抗体(71D6、71C3、71D4、71A3和71G2)识别的区的序列比对(人MET序列SEQ IDNO：239；小鼠MET序列SEQ ID NO：240；大鼠MET序列SEQ ID NO：241；食蟹猴MET序列SEQ IDNO：242；大羊驼MET序列SEQ ID NO：243)。由表12中所示的人-大羊驼嵌合体方法所识别的氨基酸标有下划线。在该区内，存在在人和小鼠MET中保守但在大羊驼MET中不保守的5个残基(Ala 327、Ser 336、Phe 343、Ile 367、Asp 372)。这些氨基酸用黑框和渐进数字1-5进行表示。其中，4个残基(Ala 327、Ser 336、Ile 367、Asp 372)在大鼠和食蟹猴MET中也是保守的。负责结合SEMA结合抗体的氨基酸用“S”(对于SEMA)进行表示。负责结合5D5/Onartuzumab的氨基酸用“O”(对于Onartuzumab)进行表示。(B)相对于由PSI结合抗体76H10和71G3识别的区的序列比对(人MET序列SEQ ID NO：244；小鼠MET序列SEQ ID NO：245；大鼠MET序列SEQ ID NO：246；食蟹猴MET序列SEQ ID NO：247；大羊驼MET序列SEQ ID NO：248)。由表12中所示的人-大羊驼嵌合体方法所识别的氨基酸标有下划线。在该区内，存在在人和小鼠MET中保守但在大羊驼MET中不保守的三个残基(Arg 547、Ser 553、Thr 555)。这些氨基酸用黑框和渐进数字6-8进行表示。其中，两个残基(Ser 553和Thr 555)在大鼠和食蟹猴MET中也是保守的。负责结合PSI结合抗体的氨基酸用“P”(对于PSI)进行表示。
图31：用于精细表位定位的MET突变体的示意图。使用人MET ECD作为模板，用图30中的渐进数字1-8表示的关键残基以不同的排列进行诱变，以产生突变体A-L。这些突变体中的每一个都完全是人的，除了指示的残基(它们是大羊驼)之外。
具体实施方式
如本文所用，术语“免疫球蛋白”包括具有两条重链和两条轻链的组合的多肽，无论其是否具有任何相关的特异性免疫反应性。“抗体”是指对感兴趣的抗原(例如MET)具有显著已知的特异性免疫反应活性的组装体。术语“MET抗体”或“抗MET抗体”在本文中是指对MET蛋白具有免疫学特异性的抗体。抗体和免疫球蛋白包含轻链和重链，它们之间具有或不具有链间共价键。脊椎动物系统中的基本免疫球蛋白结构相对容易理解。
通用术语“免疫球蛋白”包括可以在生物化学上区分开的五种不同类的抗体。尽管所有五类抗体都在本发明的范围内，但以下讨论通常涉及IgG类免疫球蛋白分子。关于IgG，免疫球蛋白包含分子量约为23,000道尔顿的两条相同的轻多肽链和分子量为53,000-70,000的两条相同的重链。四条链以“Y”构型通过二硫键连接，其中，轻链把从“Y”的口开始并且继续通过可变区的重链括在一起。
抗体的轻链被分类为κ或λ(κ、λ)。每种重链类可以与κ或λ轻链结合。通常，轻链和重链彼此共价结合，并且，当B细胞或基因工程化的宿主细胞产生免疫球蛋白时，两条重链的“尾部”部分通过共价二硫键或非共价键而相互连接。在重链中，氨基酸序列从Y构型的分叉末端处的N末端延伸至每条链的底部处的C末端。本领域技术人员将理解，重链被分类为γ、μ、α、δ或ε(γ、μ、α、δ、ε)，其中有一些亚类(例如，γ1-γ4)。是该链的性质分别将抗体的“类”确定为IgG、IgM、IgA、IgD或IgE。免疫球蛋白亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1等，被充分表征并且已知赋予功能特化。鉴于本公开内容，这些类和同种型中的每一种的修饰形式容易被本领域技术人员辨别，因此落入在本发明的范围内。
如上所述，抗体的可变区允许抗体选择性识别并特异性结合抗原上的表位。也就是说，抗体的VL域和VH域组合形成限定三维抗原结合位点的可变区。该四级抗体结构形成存在于Y的每个臂末端的抗原结合位点。更具体而言，抗原结合位点由VH链和VL链中的每一个上的三个互补决定区(CDR)限定。
如本文所用，术语“MET蛋白”或“MET抗原”或“MET”可互换使用，并且是指以野生型形式结合肝细胞生长因子(HGF)的受体酪氨酸激酶。术语“人MET蛋白”或“人MET受体”或“人MET”或“hMET”可互换使用以指代人MET(GenBank登录号：X54559)，包括在人宿主中和/或在人培养细胞系的表面上自然表达的天然人MET蛋白，以及其重组形式和片段以及天然存在的突变形式。术语“小鼠MET蛋白”或“小鼠MET受体”或“小鼠MET”或“mMET”可互换使用以指代小鼠MET(GenBank登录号：NM_008591)，包括在小鼠宿主中和/或在小鼠培养细胞系的表面上自然表达的天然小鼠MET蛋白，以及其重组形式和片段以及天然存在的突变形式。
如本文所用，术语“结合位点”包含多肽的区，其负责选择性结合感兴趣的靶抗原(例如hMET)。结合域包含至少一个结合位点。示例性结合域包括抗体可变域。本发明的抗体分子可包含单个结合位点或多个(例如，两个、三个或四个)结合位点。
如本文所用，术语“衍生自”指定蛋白质(例如MET抗体或其抗原结合片段)是指多肽的来源。在一个实施方式中，衍生自特定起始多肽的多肽或氨基酸序列是CDR序列或与其相关的序列。在一个实施方式中，衍生自特定起始多肽的氨基酸序列不是连续的。例如，在一个实施方式中，一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR衍生自起始抗体。在一个实施方式中，衍生自特定起始多肽或氨基酸序列的多肽或氨基酸序列具有这样的氨基酸序列，该氨基酸序列与起始序列或其部分(其中，该部分由至少3-5个氨基酸、至少5-10个氨基酸、至少10-20个氨基酸、至少20-30个氨基酸或至少30-50个氨基酸组成)的氨基酸序列基本相同，或者被本领域普通技术人员可识别为其起源于起始序列。在一个实施方式中，改变衍生自起始抗体的一个或多个CDR序列以产生变体CDR序列，例如，亲和变体，其中，变体CDR序列维持MET结合活性。
“骆驼科动物衍生的”——在某些优选的实施方式中，本发明的MET抗体分子包含源自通过用MET衍生的抗原主动免疫骆驼科动物而产生的骆驼科动物常规抗体的骨架氨基酸序列和/或CDR氨基酸序列。然而，包含骆驼科动物来源的氨基酸序列的MET抗体可以被工程改造为包含衍生自人氨基酸序列(即人抗体)或其他非骆驼科哺乳动物物种的骨架和/或恒定区序列。例如，人或非人灵长类动物骨架区、重链部分和/或铰链部分可被包含在主题MET抗体中。在一个实施方式中，一种或多种非骆驼科氨基酸可以存在于“骆驼科动物来源的”MET抗体的骨架区中，例如，骆驼科骨架氨基酸序列可以包含一个或多个氨基酸突变，其中存在相应的人或非人灵长类动物氨基酸残基。此外，如本文其他地方广泛描述的，骆驼科动物来源的VH和VL域或其人源化变体可以与人抗体的恒定域连接以产生嵌合分子。
如本文所用，“保守氨基酸取代”是指氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基替换的氨基酸取代。本领域已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族，包括碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)、β-支链侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，免疫球蛋白多肽中的非必需氨基酸残基可以被来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基替换。在另一个实施方式中，一串氨基酸可以被结构相似但侧链家族成员的顺序和/或组成上不同的一串氨基酸替换。
如本文所用，术语“重链部分”包括衍生自免疫球蛋白重链恒定域的氨基酸序列。包含重链部分的多肽包含以下中的至少一种：CH1域、铰链(例如，上部、中部和/或下部铰链区)域、CH2域、CH3域或其变体或片段。在一个实施方式中，本发明的抗体或抗原结合片段可包含免疫球蛋白重链的Fc部分(例如，铰链部分、CH2域和CH3域)。在另一个实施方式中，本发明的抗体或抗原结合片段可缺少至少一部分的恒定域(例如，全部或部分CH2域)。在某些实施方式中，至少一个且优选所有恒定域衍生自人免疫球蛋白重链。例如，在一个优选的实施方式中，重链部分包含全人铰链域。在其他优选的实施方式中，重链部分包含全人Fc部分(例如，来自人免疫球蛋白的铰链、CH2和CH3域序列)。在某些实施方式中，重链部分的组成恒定域来自不同的免疫球蛋白分子。例如，多肽的重链部分可包含衍生自IgG1分子的CH2域和衍生自IgG3或IgG4分子的铰链区。在其他实施方式中，恒定域是包含不同免疫球蛋白分子部分的嵌合域。例如，铰链可包含来自IgG1分子的第一部分和来自IgG3或IgG4分子的第二部分。如上所述，本领域普通技术人员将理解，可以将重链部分的恒定域修饰成它们在氨基酸序列方面与天然存在的(野生型)免疫球蛋白分子不同。也就是说，本文公开的本发明的多肽可包含对一个或多个重链恒定域(CH1、铰链、CH2或CH3)和/或轻链恒定区域(CL)进行的改变或修饰。示例性修饰包括在一个或多个域中添加、缺失或取代一个或多个氨基酸。
如本文所用，“嵌合”蛋白质包含与(在自然界中天然不连接的)第二氨基酸序列连接的第一氨基酸序列。氨基酸序列通常可以存在于在融合多肽中聚集在一起的单独蛋白质中，或者它们通常可以存在于同一种蛋白质中，但在融合多肽中以新的排列方式存在。例如，通过化学合成，或通过产生和翻译肽区以所需关系编码的多核苷酸，可以产生嵌合蛋白。示例性嵌合MET抗体包括融合蛋白，其包含与人抗体的恒定域(例如，人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)融合或与小鼠抗体的恒定域(例如，小鼠IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG2c或IgG3)融合的骆驼科动物来源的VH和VL域，或其人源化变体。
如本文所用，术语“可变区”和“可变域”可互换使用并且旨在具有等同含义。术语“可变”是指：可变域VH和VL的某些部分在抗体之间在序列上大不相同，并且用于每种特定抗体对其靶抗原的结合和特异性。然而，变异性在整个抗体的可变域中不是均匀分布的。它集中在每个VL域和VH域中被称为“高变环”的三个区段中，其形成抗原结合位点的一部分。Vλ轻链域的第一、第二和第三高变环在本文中被称为L1(λ)、L2(λ)和L3(λ)，并且可被定义为包含VL域中的第24-33位残基(L1(λ)，由9、10或11个氨基酸残基组成)、第49-53位残基(L2(λ)，由3个残基组成)和第90-96位残基(L3(λ)，由5个残基组成)(Morea等人，Methods 20，267-279，2000)。Vκ轻链域的第一、第二和第三高变环在本文中被称为L1(κ)、L2(κ)和L3(κ)，并且可被定义为包含VL域中的第25-33位残基(L1(κ)，由6、7、8、11、12或13个残基组成)、第49-53位残基(L2(κ)，由3个残基组成)和第90-97位残基(L3(κ)，由6个残基组成)(Morea等人，Methods 20，267-279，2000)。VH域的第一、第二和第三高变环在本文中被称为H1、H2和H3，并且可被定义为包含VH域中的第25-33位残基(H1，由7、8或9个残基组成)、第52-56位残基(H2，由3或4个残基组成)和第91-105位残基(H3，长度高度可变)(Morea等人，Methods 20，267-279，2000)。
除非另有说明，否则术语L1、L2和L3分别是指VL域的第一、第二和第三高变环，并且涵盖从Vκ和Vλ同种型获得的高变环。术语H1、H2和H3分别是指VH域的第一、第二和第三高变环，并且涵盖从任何已知的重链同种型获得的高变环，包括γ、ε、δ、α或μ。
高变环L1、L2、L3、H1、H2和H3可各自包含如下文所定义的“互补决定区”或“CDR”的一部分。术语“高变环”和“互补决定区”不是严格同义的，因为高变环(HV)是基于结构定义的，而互补决定区(CDR)是基于序列变异性定义的(Kabat等人，免疫学蛋白质序列，第5版，公共卫生服务，国立卫生研究院，贝塞斯达，MD，1991年(Kabat etal.，Sequences ofProteins of Immunological Interest，5th Ed.Public Health Service，NationalInstitutes of Health，Bethesda，MD，1991))，并且HV和CDR的限制可能在一些VH和VL域中是不同的。
VL和VH域的CDR通常可被定义为包含以下氨基酸：轻链可变域中的第24-34位残基(CDRL1)、第50-56位残基(CDRL2)和第89-97位残基(CDRL3)；以及重链可变区中的第31-35或31-35b位残基(CDRH1)、第50-65位残基(CDRH2)和第95-102位残基(CDRH3)(Kabat等人，免疫学蛋白质序列，第5版，公共卫生服务，国立卫生研究院，贝塞斯达，MD，1991年(Kabatet al.，Sequences of Proteins of Immunological Interest，5th Ed.Public HealthService，National Institutes of Health，Bethesda，MD，1991))。因此，HV可被包含在相应的CDR内，并且本文对VH和VL域的“高变环”的提及应该被解释为还包括相应的CDR，反之亦然，除非另有说明。
可变域的更高度保守的部分被称为如下文所定义的骨架区(FR)。天然重链和轻链的可变域各自包含四个FR(分别为FR1、FR2、FR3和FR4)，其主要采用通过三个高变环连接的β-折叠构型。每条链中的高变环通过FR而紧密靠近地保持在一起，并且通过来自另一条链的高变环而有助于形成抗体的抗原结合位点。抗体的结构分析揭示了序列与由互补决定区形成的结合位点的形状之间的关系(Chothia等人，分子生物学学报，227期，799-817页，1992年(Chothia et al.，J.Mol.Biol.227，799-817，1992)；Tramontano等人，分子生物学学报，215期，175-182页，1990年(Tramontano et al.，J.Mol.Biol，215，175-182，1990))。尽管它们具有高序列变异性，但六个环中的五个仅采用一小部分主链构象，被称为“典型结构”。这些构象首先由环的长度所决定，其次由环中和骨架区中的某些位置处的关键残基的存在所决定，其决定通过它们填充的构象、氢键或呈现不寻常的主链构象的能力。
如本文所用，术语“CDR”或“互补决定区”是指在重链和轻链多肽的可变区内均发现的非连续抗原结合位点。这些特定区已被Kabat等人，分子生物学学报，252期，6609-6616页，1977年(Kabat et al.，J.Biol.Chem.252，6609-6616，1977)、Kabat等人，免疫学蛋白质序列，第5版，公共卫生服务，国立卫生研究院，贝塞斯达，MD，1991年；Chothia等人，分子生物学学报，196期，901-917页，1987年(Chothia et al.，J.Mol.Biol.196，901-917，1987)和MacCallum等人，分子生物学学报，262期，732-745页，1996年(MacCallum et al.，J.Mol.Biol.262，732-745，1996)描述，其中定义包括当彼此比较时氨基酸残基的重叠或子集。列出了涵盖由上述每篇参考文献所定义的CDR的氨基酸残基用于比较。优选地，术语“CDR”是由Kabat基于序列比较所定义的CDR。
表1：CDR定义。
1残基编号遵循Kabat等人的命名法，同上。
2残基编号遵循Chothia等人的命名法，同上。
3残基编号遵循MacCallum等人的命名法，同上。
如本文所用，术语“骨架区”或“FR区”包括作为可变区的一部分而不是CDR的一部分的氨基酸残基(例如，使用CDR的Kabat定义)。因此，可变区骨架的长度在约100-120个氨基酸之间，但仅包括CDR之外的那些氨基酸。对于重链可变域的具体实例和对于由Kabat等人所定义的CDR，骨架区1对应于包含第1-30位氨基酸的可变区的域；骨架区2对应于包含第36-49位氨基酸的可变区的域；骨架区3对应于包含第66-94位氨基酸的可变区的域；并且骨架区4对应于从第103位氨基酸到可变区末端的可变区的域。轻链的骨架区域类似地被每个轻链可变区CDR分开。类似地，通过使用Chothia等人或McCallum等人的CDR定义，骨架区边界被如上所述的相应CDR末端分开。在优选的实施方式中，CDR如Kabat所定义。
在天然存在的抗体中，存在于每个单体抗体上的六个CDR是短的、非连续的氨基酸序列，其被特异性地定位以形成抗原结合位点，因为抗体在水性环境中呈现其三维构型。重链和轻链可变域的其余部分在氨基酸序列中表现出较小的分子间变异性，并且被称为骨架区。骨架区主要采用β-折叠构象并且CDR形成环，该环连接β-折叠结构并且在一些情况下形成β-折叠结构的一部分。因此，这些骨架区起到形成支架的作用，该支架提供用于通过链间非共价相互作用将六个CDR定位在正确的方向上。由定位的CDR形成的抗原结合位点限定了与免疫反应性抗原上的表位互补的表面。该互补表面促进抗体与免疫反应性抗原表位的非共价结合。本领域普通技术人员可以容易地识别CDR的位置。
如本文所用，术语“铰链区”包括将CH1域连接至CH2域的重链分子部分。该铰链区包含约25个残基并且是柔性的，因此允许两个N-末端抗原结合区独立地移动。铰链区可被细分为三个不同的域：上部、中部和下部铰链域(Roux等人，J.Immunol.161，4083-4090，1998)。包含“全人”铰链区的MET抗体可含有下表2中所示的铰链区序列之一。
表2：人铰链序列
如本文所用，术语“CH2域”包含重链分子的一部分，其例如使用常规编号方案从抗体的约第244位残基延伸至第360位残基(Kabat编号系统，第244位残基至第360位残基；EU编号系统，第231-340位残基；Kabat等人，免疫学蛋白质序列，第5版，公共卫生服务，国立卫生研究院，贝塞斯达，MD，1991年)。CH2域的独特之处在于它不与另一个域紧密配对。而是，两个N-连接的支链碳水化合物链插入完整天然IgG分子的两个CH2域之间。还充分证明了，CH3域从CH2域延伸至IgG分子的C-末端并且包含约108个残基。
如本文所用，术语“片段”是指抗体或抗体链的部分或一部分，其包含比完整或完全抗体或抗体链更少的氨基酸残基。术语“抗原结合片段”是指免疫球蛋白或抗体的多肽片段，其结合抗原或与用于抗原结合的完整抗体(即，衍生它们的完整抗体)竞争(即，特异性结合hMET和MMET)。如本文所用，术语抗体分子的“片段”包括抗体的抗原结合片段，例如抗体轻链可变域(VL)、抗体重链可变域(VH)、单链抗体(scFv)、F(ab’)2片段、Fab片段、Fd片段、Fv片段和单域抗体片段(DAb)。例如通过完整或完全抗体或抗体链的化学或酶处理或通过重组方法，可获得片段。
如本文所用，术语“化合价”是指多肽中潜在的靶结合位点的数目。每个靶结合位点特异性结合靶分子上的一个靶分子或特异位点。当多肽包含大于一个靶结合位点时，每个靶结合位点可特异性结合相同或不同的分子(例如，可结合不同的配体或不同的抗原，或同一抗原上的不同表位)。主题结合分子具有至少一个对hMET特异的结合位点。
如本文所用，术语“特异性”是指与给定靶标(例如，hMET、mMET)结合(例如，免疫反应)的能力。多肽可以是单特异性的并且含有特异性结合靶标的一个或多个结合位点；或者多肽可以是多特异性的并且含有特异性结合相同或不同靶标的两个或更多个结合位点。在一个实施方式中，本发明的抗体是对大于一种靶标特异的。例如，在一个实施方式中，本发明的多特异性结合分子结合hMET和第二靶分子。在本文中，第二靶分子是除hMET或mMET之外的分子。
术语“表位”是指与抗体接触的抗原(例如人MET)的部分。表位可以是线性的，即涉及结合单个氨基酸序列；或可以是构象的，即涉及结合抗原的各个区中的两个或更多个氨基酸序列，其可能不一定是连续的。本文提供的抗体可结合人MET蛋白的胞外域内的不同(重叠或非重叠)表位。
如本文所用，关于多肽的术语“合成的”包括含有非天然存在的氨基酸序列的多肽。例如，非天然存在的多肽是天然存在的多肽的修饰形式(例如，包含如添加，取代或缺失的突变)，或者包含以氨基酸的线性序列与(在自然界中天然不连接的)第二个氨基酸序列(其可以是或可不是天然存在的)连接的第一氨基酸序列(其可以是或可不是天然存在的)。
如本文所用，术语“工程化”包括通过合成方式(例如，通过重组技术、体外肽合成，通过肽的酶促或化学偶联、或这些技术的一些组合)操作核酸或多肽分子。优选地，本发明的抗体是工程化的，包括例如人源化抗体和/或嵌合抗体，以及已被工程化成改善一种或多种性质如抗原结合、稳定性/半衰期或效应功能的抗体。
如本文所用，术语“经修饰的抗体”包括：合成形式的抗体，其被改变成它们不是天然存在的，例如，包含至少两个重链部分但不包含两个完整重链的抗体(如，域缺失的抗体或微抗体)；多特异性形式的抗体(例如，双特异性，三特异性等)，其被改变以结合两种或更多种不同抗原或单一抗原上的不同表位；与scFv分子连接的重链分子等。ScFv分子是本领域已知的并被描述于例如美国专利5,892,019号中。另外，术语“经修饰的抗体”包括多价形式的抗体(例如，三价抗体、四价抗体等，其与同一抗原的三个或更多个拷贝结合的抗体)。在另一个实施方式中，本发明的经修饰的抗体是融合蛋白，其包含至少一个缺少CH2域的重链部分并且包含多肽的结合域，该多肽包含受体配体对的一个成员的结合部分。
术语“经修饰的抗体”在本文中也可用于是指本发明的MET抗体的氨基酸序列变体。本领域普通技术人员将理解，可修饰本发明的MET抗体以产生变体MET抗体，其与衍生它的MET抗体相比氨基酸序列不同。例如，可以(例如，在CDR和/或骨架残基中)进行导致“非必需”氨基酸残基处的保守取代或改变的核苷酸或氨基酸取代。氨基酸取代可包括用天然存在的或非天然的氨基酸取代一个或多个氨基酸。
如本文所用，术语“人源化取代”是指其中存在于本发明的MET抗体的VH或VL域中的特定位置处的氨基酸残基(例如骆驼科动物来源的MET抗体)被参比人VH或VL域中的等价位置处存在的氨基酸残基替换的氨基酸取代。参比人VH或VL域可以是由人种系编码的VH或VL域。可在本文定义的MET抗体的骨架区和/或CDR中进行人源化取代。
如本文所用，术语“人源化变体”是指与参比MET抗体相比含有一个或多个“人源化取代”的变体抗体，其中参比抗体的一部分(例如VH域和/或VL域或其含有至少一个CDR的部分)具有衍生自非人物种的氨基酸序列，并且“人源化取代”发生在衍生自非人物种的氨基酸序列内。
术语“种系变体”在本文中用于具体是指“人源化变体”，其中“人源化取代”导致由人种系编码的参比人VH或VL域中的等价位置处存在的氨基酸残基取代本发明的MET抗体的VH或VL域中的特定位置处存在的一个或多个氨基酸残基(例如骆驼科动物来源的MET抗体)。通常，对于任何给定的“种系变体”，取代到种系变体中的取代氨基酸残基完全或主要来自单个人种系编码的VH或VL域。术语“人源化变体”和“种系变体”在本文中通常可互换使用。将一个或多个“人源化取代”引入骆驼科动物来源的(例如大羊驼来源的)VH或VL域导致产生骆驼科动物(大羊驼)来源的VH或VL域的“人源化变体”。如果取代的氨基酸残基主要或完全来源于单个人种系编码的VH或VL域序列，那么结果可以是骆驼科动物(大羊驼)来源的VH或VL域的“人源种系变体”。
如本文所用，术语“亲和变体”是指与本发明的参比MET抗体相比表现出氨基酸序列中的一个或多个变化的变体抗体，其中亲和变体与参比抗体比较表现出对hMET和/或mMET改变的亲和力。优选地，与参比MET抗体相比，亲和变体表现出对hMET和/或mMET改善的亲和力。对于hMET和/或对于mMET的较低的KD或者对于hMET和/或对于mMET的较慢的解离速率而言，这种改善可以是显而易见的。与参比MET抗体相比，亲和变体通常表现出CDR中的氨基酸序列中的一个或多个变化。此类取代可导致不同的氨基酸残基(其可以是天然存在的氨基酸残基或非天然存在的氨基酸残基)取代CDR中给定位置处存在的原始氨基酸。氨基酸取代可以是保守的或非保守的。
如本文所用，具有“高人同源性”的抗体是指包含重链可变域(VH)和轻链可变域(VL)的抗体，其一起表现出与最接近匹配的人种系VH和VL序列至少90％的氨基酸序列同一性。具有高人同源性的抗体可包括含有天然非人抗体的VH和VL域的抗体，其表现出与人种系序列足够高百分比的序列同一性，人种系序列包括例如包含骆驼科动物常规抗体的VH和VL域的抗体，和这种抗体的工程化的、特别是人源化或种系化的变体以及“全人”抗体。
在一个实施方式中，具有高人同源性的抗体的VH域可表现出与骨架区FR1、FR2、FR3和FR4中的一个或多个人VH域80％或更高的氨基酸序列同一性或序列同源性。在其他实施方式中，本发明的多肽的VH域与最接近的匹配的人种系VH域序列之间的氨基酸序列同一性或序列同源性可以是85％或更高、90％或更高、95％或更高、97％或更高，或高达99％或甚至100％。
在一个实施方式中，与最接近的匹配的人VH相比，具有高人同源性的抗体的VH域可含有对骨架区FR1、FR2、FR3和FR4中的一个或多个(例如1至10个)氨基酸序列错配。
在另一个实施方式中，具有高人同源性的抗体的VL域可表现出与骨架区FR1、FR2、FR3和FR4中的一个或多个人VL域80％或更高的序列同一性或序列同源性。在其他实施方式中，本发明多肽的VL域与最接近的匹配的人种系VL域序列之间的氨基酸序列同一性或序列同源性可以是85％或更高、90％或更高、95％或更高、97％或更高，或高达99％或甚至100％。
在一个实施方式中，与最接近的匹配的人VL序列相比，具有高人同源性的抗体的VL域可含有对骨架区FR1、FR2、FR3和FR4中的一个或多个(例如1至10个)氨基酸序列错配。在分析具有高人同源性的抗体与人种系VH和VL之间的百分比序列同一性之前，可确定规范的折叠，这允许识别具有H1和H2或L1和L2(和L3)的规范折叠的相同组合的人种系区段家族。随后，选择具有对感兴趣的抗体的可变区最高程度的序列同源性的人种系家族成员进行对序列同源性的评分。确定最接近的匹配的人种系和确定％序列同一性/同源性的方法是本领域技术人员公知的。
具有高人同源性的抗体可包含具有人或人样规范折叠结构的高变环或CDR。在一个实施方式中，具有高人同源性的抗体的VH域或VL域中的至少一个高变环或CDR可获得自或衍生自非人抗体的VH或VL域，例如来自骆驼科物种的常规抗体，但表现出预测的或实际的规范折叠结构，其与在人抗体中发生的规范折叠结构基本相同。在一个实施方式中，具有高人同源性的抗体的VH域中的H1和H2均表现出预测的或实际的规范折叠结构，其与在人抗体中发生的规范折叠结构基本相同。
具有高人同源性的抗体可包含VH域，其中高变环H1和H2形成规范折叠结构的组合，其与已知的至少一个人种系VH域中存在的规范结构的组合相同。已经观察到，仅H1和H2的规范折叠结构的某些组合实际上存在于由人种系编码的VH域中。在一个实施方式中，具有高人同源性的抗体的VH域中的H1和H2可获得自非人物种例如骆驼科物种的VH域，但形成预测的或实际的规范折叠结构的组合，其与已知在人种系或体细胞突变的VH域中存在的规范折叠结构的组合相同。在非限制性实施方式中，具有高人同源性的抗体的VH域中的H1和H2可获得自非人物种例如骆驼科物种的VH域，并且形成以下规范折叠组合之一：1-1、1-2、1-3、1-6、1-4、2-1、3-1和3-5。具有高人同源性的抗体可含有VH域，其表现出与人VH高的序列同一性/序列同源性并且含有表现出与人VH的结构同源性的高变环。
就总体一级氨基酸序列同一性方而言可能是有利的是，具有高人同源性的抗体的VH域中的H1和H2处存在的规范折叠及其组合对于人VH种系序列是“正确的”，该人VH种系序列代表与具有高度人同源性的抗体的VH域最接近的匹配。举例来说，如果最接近的序列匹配是与人种系VH3域匹配，那么可能有利的是H1和H2形成也天然存在于人VH3域中的规范折叠的组合。在衍生自非人物种的具有高人同源性的抗体，例如含有衍生自骆驼科动物常规抗体的VH和VL域的抗体，尤其是含有人源化骆驼科动物VH和VL域的抗体的情况下，这可能是特别重要的。
因此，在一个实施方式中，具有高人同源性的MET抗体的VH域可表现出与骨架区FR1、FR2、FR3和FR4中的人VH域80％或更高、85％或更高、90％或更高、95％或更高、97％或更高、高达99％或甚至100％的序列同一性或序列同源性；并且相同抗体中的H1和H2获得自非人VH域(例如衍生自骆驼科物种，优选大羊驼)，但形成预测的或实际的规范折叠结构的组合，其与已知的相同人VH域中天然存在的规范折叠组合相同。
在其他实施方式中，具有高人同源性的抗体的VL域中的L1和L2均获得自非人物种的VL域(例如，骆驼科动物来源的VL域)，并且均呈现出预测的或实际的规范折叠结构，其与人抗体中存在的规范折叠结构基本相同。具有高人同源性的抗体的VL域中的L1和L2可形成预测的或实际的规范折叠结构的组合，其与已知的人种系VL域中存在的规范折叠结构的组合相同。在非限制性实施方式中，具有高人同源性的抗体的Vλ域中的L1和L2(例如含有骆驼科动物来源的VL域的抗体或其人源化变体)可形成以下规范性折叠组合之一：11-7、13-7(A，B，C)、14-7(A，B)、12-11、14-11和12-12(如Williams等人，分子生物学学报，264期，220-232页，1996年(Williams et al.，J.Mol.Biol.264，220-232，1996)中所定义，并且如http：//www.bioc.uzh.ch/antibody/Sequences/Germlines/VBase_hVL.html所示)。在非限制性实施方式中，Vκ域中的L1和L2可形成以下规范折叠组合之一：2-1、3-1、4-1和6-1(如Tomlinson等人，EMBO杂志，14期，4628-4638页，1995年(Tomlinson et al.，EMBO J.14，4628-4638，1995)中所定义，并且如http：//www.bioc.uzh.ch/antibody/Sequences/Germlines/VBase_hVK.html所示)。在另一个实施方式中，具有高人同源性的抗体的VL域中的L1、L2和L3三者都可以表现出基本上人的结构。优选的是，具有高人同源性的抗体的VL域表现出与人VL高的序列同一性/序列同源性，并且VL域中的高变环表现出与人VL的结构同源性。
在一个实施方式中，具有高人同源性的MET抗体的VL域可以表现出与骨架区FR1、FR2、FR3和FR4中的人VL域80％或更高、85％或更高、90％或更高、95％或更高、97％或更高，或高达99％或甚至100％的序列同一性；并且高变环L1和高变环L2可形成预测的或实际的规范折叠结构的组合，其与已知的相同人VL域中天然存在的规范折叠组合相同。
当然，可以设想，将表现出与人VH高的序列同一性/序列同源性并且与人VH的高变环的结构同源性的VH域与表现出与人VL高的序列同一性/序列同源性并且与人VL的高变环的结构同源性的VL域组合，以提供含有VH/VL配对(例如骆驼科动物来源的VH/VL配对)的高人同源性，并具有与人编码VH/VL配对最大的序列和结构同源性的抗体。
评价骆驼科动物来源的(例如大羊驼来源的)CDR、VH域或VL域中存在人样规范折叠结构的方法被描述于WO2010/001251和WO2011/080350中，其全部内容通过引用而被并入本文。
如本文所用，术语“亲和力”或“结合亲和力”应基于抗体结合的背景下本领域的通常含义来理解，并且反映抗体或其抗原结合片段上的抗原和结合位点之间结合的强度和/或稳定性。
本文提供的抗MET抗体的特征在于与人MET(hMET)的高亲和力结合以及与小鼠MET(mMET)的高亲和力结合。可以使用本领域技术人员已知的标准技术来评价对hMET和mMET的结合亲和力。
在一个实施方式中，可以使用表面等离振子共振，例如使用BiacoreTM系统，来评价包含确定的VH/VL配对的Fab克隆的结合亲和力。包含本发明的抗体和抗原结合片段的VH/VL配对的Fab克隆通常表现出由BiacoreTM测量为1×10-3至1×10-2s-1，任选地1×10-3至6×10-3s-1的hMET解离速率。该范围内的解离速率可被视为Fab和相应的二价mAb表现出与hMET的高亲和力结合的指示。类似地，所附实施例所描述，包含本发明的抗体和抗原结合片段的VH/VL配对的Fab克隆通常表现出由BiacoreTM测量为1×10-3至1×10-2s-1，任选地1×10-3至6×10-3s-1的mMET解离速率。该范围内的解离速率可被视为Fab和相应的二价mAb表现出与mMET的高亲和力结合的指示。因此，表现出落入所述范围内的人和鼠MET的解离速率的Fab显示出与hMET的高亲和力结合，以及与mMET的高亲和力结合，即，Fab在hMET和mMET之间是交叉反应的。(单独地)表现出落入所述范围内的人和鼠MET的解离速率的包含两个Fab的二价mAb也被认为表现出与人MET的高亲和力结合以及与鼠MET的高亲和力结合。
结合亲和力也可以表示为对特定抗体的解离常数，或KD。KD值越小，抗体与其靶抗原之间结合的相互作用越强。例如，可以通过组合由SPR测量确定的K结合和K解离速率来确定KD。通常，当以mAb测量时，本发明的抗体和抗原结合片段表现出对mMET和对hMET的KD小于0.1nMol/L。
还可以使用如所附实施例中所述的基于细胞的系统来评价对人和鼠MET的结合亲和力，在基于细胞的系统中例如使用ELISA或流式细胞术测试mAb与表达MET的哺乳动物细胞系的结合。对hMET或mMET的高亲和力可以例如通过实施例3中描述的ELISA中的EC50不大于0.5nM进行指示。
如上所述，本发明至少部分涉及以高亲和力结合hMET和mMET的抗体及其抗原结合片段。现将对根据本发明的MET抗体和抗体片段的性质和特征进行更详细的描述。
本文所述的高亲和力hMET和mMET交叉反应抗体和抗原结合片段是MET激动剂。如本文所用，MET激动剂在结合MET受体时(部分或完全)诱导MET信号传导。根据本发明的MET激动剂抗体和抗原结合片段是hMET和mMET的激动剂。本文所述抗体对hMET或mMET结合的激动剂活性可通过(至少部分地)模拟在同源HGF-MET结合(即，结合人HGF的hMET、结合小鼠HGF的mMET)时所诱导的分子和/或细胞应答进行指示。刺激这种应答的抗体在本文中也被称为“抗MET激动剂”、“激动剂抗体”及其语法变体。类似地，部分或完全刺激此类应答的抗体在本文中分别被称为“部分MET激动剂”或“部分激动剂”，或者“完全MET激动剂”或“完全激动剂”。需要强调的是，本发明的抗体和抗原结合片段在人和小鼠系统中诱导MET信号传导，即，它们是hMET和mMET的激动剂。因此，以下讨论既适用于通过本发明的抗体和抗原结合片段结合hMET所诱导的应答，也适用于通过本发明的抗体和抗原结合片段结合mMET所诱导的应答。
由本发明的抗体和抗原结合片段对MET的激动可以通过分子应答如MET受体的磷酸化和/或细胞应答如在细胞分散检测、抗凋亡检测和/或分枝化形态发生检测中可检测到的细胞应答来指示。这些分子和细胞应答进一步描述如下：
(i)MET受体的磷酸化。在这种情况下，在抗体或抗原结合片段的结合在没有受体-配体结合的情况下引起MET的自磷酸化(即在不存在hHGF的情况下，抗体或抗原结合片段结合人hMET引起hMET的磷酸化并且在不存在mHGF的情况下抗体或抗原结合片段结合mMET引起mMET的磷酸化)时，MET激动剂抗体或抗原结合片段将MET磷酸化。MET的磷酸化可以通过本领域已知的检测如蛋白质印迹或磷酸化-MET ELISA(如实施例6所描述，并且如Basilico等人，临床调查杂志，124期，3172-3186页，2014年所描述(Basilico et al.，J ClinInvest.124，3172-3186，2014))来确定。本文所述的抗体和抗原结合片段可表现出对hMET“高的磷酸化效力”或“低的磷酸化效力”，并且可表现出对mMET“高的磷酸化效力”或“低的磷酸化效力”。在这种情况下，当抗体或片段表现出EC50与HGF相似(＜1nM)和/或EMAX为至少80％(以最大HGF诱导的活化的百分比表示)的对mMET的效力并且表现出EC50与HGF相似(＜1nM)和/或EMAX为至少80％(以最大HGF诱导的活化的百分比表示)的对hMET的效力时，抗体或抗原结合片段表现出“高的磷酸化效力”。当抗体表现出EC50为1nM-5nM和/或EMAX为60-80％(以最大HGF诱导的活化的百分比表示)的对mMET的效力并且表现出EC50为1nM-5nM和/或EMAX为60-80％(以最大HGF诱导的活化的百分比表示)的对hMET的效力时，抗体或抗原结合片段表现出“低的磷酸化效力”。
(ii)诱导HGF样细胞应答。MET激动可通过使用检测如本实施例中描述的细胞分散检测、抗凋亡检测和/或分枝化形态发生检测来进行测量。在本文中，根据本发明的MET激动剂抗体或抗原结合片段在细胞检测中诱导应答，如类似于(至少部分地)暴露于同源HGF后观察到的应答。例如，MET激动剂可被指示为：与暴露于对照抗体(例如IgG1)的细胞相比，响应于抗体的细胞分散的增加；与未处理的细胞相比，EC50小于小于32nM和/或Emax细胞存活率大于20％的对药物诱导的细胞凋亡的保护效力；和/或暴露于抗体或抗原结合片段的细胞球状体制剂中每个球状体的分枝数的增加。
根据所用的检测，本文所述的抗体和抗原结合片段当与人细胞接触时可以“完全诱导”或“部分诱导”HGF样细胞应答，并且当与小鼠细胞接触时可以“完全诱导”或“部分诱导”HGF样细胞应答。
在这种情况下，抗体或片段对HGF样细胞应答的“完全诱导”可被测量为：
在细胞分散检测中，当抗体浓度为0.1-1nM时，抗体或抗原结合片段诱导细胞分散增加至少相当于0.1nM同源HGF；
在抗凋亡检测中，抗体或抗原结合片段表现出EC50不大于HGF的EC50的1.1倍和/或Emax细胞存活率大于对于HGF观察到的Emax的90％；和/或
在分枝化形态发生检测中，用抗体或抗原结合片段处理的细胞表现出每个由相同(非零)浓度的HGF诱导的球状体大于90％的分枝数。
在这种情况下，如果抗体或抗原结合片段不能“完全诱导”如上定义的HGF样细胞应答，那么HGF样细胞应答的“部分诱导”可被测量为：
在细胞分散检测中，当抗体浓度为1nM或更低时，抗体或抗原结合片段诱导由0.1nM同源HGF诱导的至少25％的细胞分散水平；
在抗凋亡检测中，抗体或抗原结合片段表现出EC50不大于HGF的EC50的7.0倍和/或Emax细胞存活率至少为对于HGF观察到的50％；
在分枝化形态发生检测中，用抗体或抗原结合片段处理的细胞表现出每个由相同(非零)浓度的HGF诱导的球状体为至少25％的分枝数。
如已经描述的，根据本发明的抗体和抗原结合片段是hMET激动剂和mMET激动剂。因此，在抗体(部分或完全)诱导HGF样细胞应答的实施方式中，HGF样细胞应答在抗体或抗原结合片段与人细胞接触时被(部分或完全)诱导并且在抗体或抗原结合片段与小鼠细胞接触时被(部分或完全)诱导。
结合区定位(实施例4)证明了本发明的抗MET抗体识别MET的PSI域或MET的SEMA域中的MET的表位。因此，在某些实施方式中，本发明的抗体或抗原结合片段识别MET(优选人MET)的PSI域中的表位。在某些替代实施方式中，本发明的抗体或抗原结合片段识别MET(优选人MET)的SEMA域中的表位。
在某些实施方式中，识别SEMA域中的表位的抗体或抗原结合片段识别位于SEMAβ-螺旋桨的叶片上的表位。在某些实施方式中，表位位于SEMAβ-螺旋桨的叶片4或5上。在某些此类实施方式中，表位位于人MET的第314-372位氨基酸之间。在某些实施方式中，表位位于SEMA β-螺旋桨的叶片1-4或1-3上。在某些实施方式中，表位位于人MET的第27-313位氨基酸之间，或位于人MET的第27-225位氨基酸之间。
在某些实施方式中，识别MET的PSI域中的表位的抗体或抗原结合片段识别位于MET(优选人MET)的第516-545位氨基酸之间的表位。在某些实施方式中，识别MET的PSI域中的表位的抗体或抗原结合片段识别位于MET(优选人MET)的第546-562位氨基酸之间的表位。
在某些方面中，本文所述的抗体识别MET胞外域中的表位，所述表位包含人和小鼠MET中保守的一个或多个氨基酸残基。在优选的实施方式中，本文所述的抗体识别MET胞外域中的表位，所述表位包含人MET、小鼠MET、大鼠MET和猴(例如食蟹猴)MET中保守的一个或多个氨基酸残基。
在某些实施方式中，本发明的抗体识别位于人MET的第123位氨基酸残基至第223位残基的区中的人MET的表位。在某些实施方式中，本发明的抗体识别位于人MET的第224位氨基酸残基至第311位残基的区中的人MET的表位。在某些实施方式中，本发明的抗体识别位于人MET的第314位氨基酸残基至第372位残基的区中的人MET的表位。在某些实施方式中，本发明的抗体识别位于人MET的第546位氨基酸残基至第562位残基的区中的人MET的表位。
在某些实施方式中，本发明的抗体或抗原结合片段识别包含氨基酸残基Ile367的人MET的表位。在某些实施方式中，本发明的抗体或抗原结合片段识别包含人MET的氨基酸残基Asp372的人MET的表位。在某些实施方式中，本发明的抗体或抗原结合片段识别包含氨基酸残基Ile367和Asp372的人MET的表位。
在某些此类实施方式中，本发明的抗体或抗原结合片段识别位于人MET的第314位氨基酸残基至第372位残基的区中的人MET的表位，其中表位包含氨基酸残基Ile367。在某些此类实施方式中，本发明的抗体或抗原结合片段识别位于人MET的第314位氨基酸残基至第372位残基的区中的人MET的表位，其中表位包含氨基酸残基Asp371。在某些此类实施方式中，本发明的抗体或抗原结合片段识别位于人MET的第314位氨基酸残基至第372位残基的区中的人MET的表位，其中表位包含氨基酸残基Ile367和Asp372。
在某些实施方式中，本发明的抗体或抗原结合片段结合包含人MET的氨基酸残基Thr555的人MET的表位。
在某些此类实施方式中，本发明的抗体或抗原结合片段识别位于人MET的第546位氨基酸残基至第562位残基的区中的人MET的表位，其中表位包含氨基酸残基Thr555。
应理解，抗体或其抗原结合片段可识别由许多氨基酸残基组成的表位。表位可以是线性的，构象的，或组合。当表位被指定为在氨基酸的某个区中时，表位可由该与抗体或片段接触的区中的一个或多个氨基酸形成。因此，应当理解，在本发明的某些实施方式中，抗体或其片段可识别由指定区内(例如，第314-372位氨基酸，或第546至562位氨基酸)的多个氨基酸残基(连续或非连续)组成的表位，条件是识别的表位包括指定的氨基酸残基(例如Ile367、Asp372、Thr555)。用于确定被识别为抗体表位的一部分的残基的方法是本领域技术人员熟悉的，并且包括例如实施例4和26中描述的那些。
由于本发明的抗MET抗体和抗原结合片段结合与HGF所识别的结合域重叠或接近的表位，因此抗体和抗原结合片段能够(至少部分地)与HGF竞争结合同源MET(即，与人HGF竞争hMET结合，并且与小鼠HGF竞争mMET结合)。也就是说，抗体或抗原结合片段在结合检测(例如实施例5中所述的ELISA)中直接或间接地阻止HGF结合同源MET。因此，在某些实施方式中，本发明的MET抗体和抗原结合片段与小鼠和人HGF竞争结合同源MET。以这种方式与HGF竞争的抗体或抗原结合片段在本文中也被称为“HGF竞争剂”。确定抗体或抗原结合片段是否与HGF竞争MET结合的检测是本领域技术人员熟知的，例如，在竞争ELISA中，HGF竞争剂可表现出不大于5nM的IC50和/或至少50％的Imax(饱和时最大百分比竞争)。本发明的抗体和抗原结合片段与小鼠HGF竞争mMET结合，并且与人HGF竞争hMET结合。
本发明的抗体或抗原结合片段可与HGF“完全竞争”或“部分竞争”同源MET结合。在本文中，“完全竞争剂”可以是在竞争检测例如ELISA中表现出小于2nM的IC50和/或至少90％的Imax的抗体或抗原结合片段。在某些实施方式中，“完全竞争剂”表现出小于1nM的IC50和/或大于90％的Imax。“部分竞争剂”可以是在竞争检测例如ELISA中表现出IC50为2-5nM和/或Imax为50-90％的抗体或抗原结合片段。给定值适用于与小鼠HGF和人HGF竞争结合同源MET。
如已经描述的，本发明的抗体和抗原结合片段由于其识别人和小鼠MET的能力而是有利的。本文所述的抗体或其抗原结合片段在当它们在结合mMET和hMET时表现出相同的特性时是特别有利的。这种等价性允许在临床前鼠疾病模型中分析抗体，期望抗体在人环境中表现出相同或相似的特性。
因此，在某些实施方式中，本发明的抗体和结合片段表现出对hMET和mMET等价的结合亲和力。在该上下文中，“等价结合亲和力”被认为是指抗体或抗原结合片段对hMET的亲和力是该抗体对mMET的亲和力的0.5-1.5倍。在某些实施方式中，本发明的抗体和抗原结合片段表现出对hMET的亲和力是该抗体或抗原结合片段对mMET的亲和力的0.8-1.2倍。
作为说明和举例，对mMET和hMET具有等价亲和力的抗体或抗原结合片段当作为Fab片段测量时可表现出hMET的解离速率为对mMET表现出的解离速率的0.5-1.5倍。例如，对mMET和hMET具有等效亲和力的抗体表现出对于mMET的解离速率为2.6×10-3s-1，并且表现出对于hMET的解离速率为1.3-3.9×10-3s-1的。通过进一步的实例，对mMET和hMET具有等价亲和力的抗体或抗原结合片段可表现出对于hMET的EC50(例如通过ELISA或流式细胞术测定)为该抗体或片段对于mMET的EC50的0.5-1.5倍。例如，对mMET和hMET具有等价亲和力的抗体表现出对于mMET的EC50为0.1nMol/L，并且表现出对于hMET的EC50为0.05-0.15nMol/L。
在某些实施方式中，本发明的抗体和抗原结合片段是mMET和hMET的等价激动剂。在本文中，“等价”是指结合hMET时诱导的MET激动水平是结合mMET时诱导的信号传导水平的0.5-1.5倍。在某些实施方式中，本发明的抗体和抗原结合片段在结合hMET时诱导MET信号传导，信号传导的水平是结合mMET时诱导的信号传导水平的0.8-1.2倍。
在某些实施方式中，当通过本文所述的至少一种MET激动检测进行测量时，本发明的抗体或抗原结合片段是等价的mMET和hMET激动剂。例如，本发明的抗体或抗原结合片段可诱导等价的MET磷酸化，表现出等价的对药物诱导的细胞凋亡的保护功效，和/或在分枝化形态发生检测中诱导等价的分枝化水平。在某些实施方式中，当通过所有所述检测进行测量时，抗体或抗原结合片段表现出等价的MET激动作用。
作为说明，本发明的抗体对MET的等价磷酸化可被检测为，该抗体对hMET的EC50是对mMET的EC50的0.5-1.5倍。例如，如果对mMET的EC50是2.9nM，对hMET的EC50为1.45-4.35nM，则该抗体将等价地诱导hMET磷酸化。类似地，抗凋亡检测中指示的等价MET激动可被检测为，人细胞中的Emax是小鼠细胞中的Emax的0.5-1.5倍。例如，如果小鼠细胞中的Emax为37.5％，人细胞的Emax为18.75-56.25％，则该抗体将是等价的hMET激动剂。在分枝化形态发生检测中指示的等价MET激动可以是可被检测为，将人细胞球状体暴露于抗体后观察到的分枝数是将小鼠细胞球状体暴露于相同(非零)抗体浓度后观察到的分枝数的0.5-1.5倍。例如，如果暴露于0.5nM抗体后的小鼠细胞所表现的分枝数为14，暴露于0.5nM抗体后人细胞所表现的分枝数为7-21，则该抗体将是等价的hMET激动剂。
类似地，hMET和mMET的等价激动可通过等价的细胞分散进行指示。这种检测的输出的性质意味着应用0.5-1.5因子是不合适的。在细胞分散检测中，hMET和mMET的等价激动可通过暴露于抗体的人细胞的细胞分散得分为+/-1暴露于相同(非零)浓度的相同抗体的小鼠细胞的细胞分散得分来指示。例如，如果暴露于0.33nM抗体的小鼠细胞所表现出的细胞分散得分为2，暴露于0.33nM相同抗体的人细胞所表现出细胞分散得分为1-3，则该抗体将是hHGF的等价激动剂。
在某些实施方式中，本发明的抗体和抗原结合片段表现出在mMET和hMET之间等价的HGF竞争。在这种情况下，“等价HGF竞争”被认为是指抗体或抗原结合片段对hMET所表现出的与人HGF竞争水平是抗体或抗原结合片段对于mMET所表现出的与小鼠HGF竞争水平的0.5-1.5倍。在某些实施方式中，本发明的抗体和抗原结合片段对于mMET表现出与人HGF的竞争水平是抗体或抗原结合片段对于mMET所表现出的与小鼠HGF的竞争水平的0.8-1.2倍。
作为举例，抗体与人HGF和小鼠HGF的等价竞争可被检测为，与人HGF-hMET结合竞争的抗体的IC50是与小鼠HGF-mMET结合竞争的抗体的IC50的0.5-1.5倍。例如，如果mHGF-mMET结合的IC50为0.34nM，hHGF-hMET结合的IC50在0.17-0.51nM，则抗体与hHGF和mHGF等价竞争。
在某些实施方式中，本发明的抗体和抗原结合片段与大鼠MET和/或猕猴MET交叉反应。与大鼠和猕猴MET中的一种或两种的交叉反应性具有可在大鼠和/或猕猴模型系统中进行毒理学研究的优点。在这方面，抗体是否表现出与食蟹猴或大鼠MET的交叉反应性可通过如随附的实施例25中描述的ELISA进行测定。
本文所述的抗体或其抗原结合片段可包含至少一个从骆驼科物种的VH域或VL域获得的高变环或互补决定区。特别地，抗体或抗原结合片段可包含通过具有人MET抗原的远交骆驼科动物(例如大羊驼)的主动免疫获得的VH和/或VL域或其CDR。
“从骆驼科物种的VH域或VL域获得的高变环或互补决定区”是指高变环(HV)或CDR具有与由骆驼科免疫球蛋白基因编码的高变环或CDR的氨基酸序列相同或基本相同的氨基酸序列。在本文中，“免疫球蛋白基因”包括种系基因、经历重排的免疫球蛋白基因，以及体细胞突变基因。因此，从骆驼科物种的VH或VL域获得的HV或CDR的氨基酸序列可与成熟骆驼科常规抗体中存在的HV或CDR的氨基酸序列相同。在该上下文中，术语“从......获得/获得自”意味着以下结构关系：MET抗体的HV或CDR包含最初由骆驼科免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列(或其较小的变体)。然而，就用于制备MET抗体的生产方法而言，这不一定意味着特定的关系。
骆驼科动物来源的MET抗体可衍生自任何骆驼科动物物种，尤其包括大羊驼、单峰骆驼、羊驼、骆马、原驼或骆驼。
包含骆驼科动物来源的VH和VL域或其CDR的MET抗体通常是重组表达的多肽，并且可以是嵌合多肽。术语“嵌合多肽”是指人工(非天然存在的)多肽，其通过并置两个或更多个肽片段而产生，该肽片段不会连续出现。该定义包括通过并置由两个或更多个物种(例如骆驼科动物和人)编码的肽片段产生的“物种”嵌合多肽。
骆驼科动物来源的CDR可包含下述表3和4中所示的CDR序列之一。
在一个实施方式中，整个VH域和/或整个VL域可从骆驼科物种中获得。在具体的实施方式中，骆驼科动物来源的VH域可包含SEQ ID NO：155、157、159、161、163、165、167、169、171、173或175所示的氨基酸序列，而骆驼科动物来源的VL域可包含SEQ ID NO：156、158、160、162、164、166、168、170、172、174或176所示的氨基酸序列。然后可对骆驼科动物来源的VH域和/或骆驼科动物来源的VL域进行将一个或多个氨基酸取代、插入或缺失引入骆驼科动物氨基酸序列的蛋白质工程化。这些工程化的改变优选包括相对于骆驼科动物序列的氨基酸取代。这些变化包括“人源化”或“种系化”，其中骆驼科动物编码的VH或VL域中的一个或多个氨基酸残基被来自同源人编码的VH或VL域的等价残基所替换。
通过用人MET抗原主动免疫骆驼科动物(例如大羊驼)所获得的分离的骆驼科VH和VL域可被用作工程化根据本发明的MET抗体的基础。从完整的骆驼科动物VH和VL域开始，可工程化一个或多个偏离起始骆驼科动物序列的氨基酸取代、插入或缺失。在某些实施方式中，此类取代、插入或缺失可存在于VH域和/或VL域的骨架区中。这种一级氨基酸序列变化的目的可以是降低可能的不利性质(例如人宿主中的免疫原性(所谓的人源化)、潜在产物异质性和/或不稳定性(糖基化、脱酰胺、异构化等)的位点，或者增强分子的一些其他有利性质(例如溶解性、稳定性、生物利用度等))。在其他实施方式中，一级氨基酸序列变化可在由主动免疫所获得的骆驼科VH和/或VL域的一个或多个高变环(或CDR)中进行工程化。可以引入这样的变化来增强抗原结合亲和力和/或特异性，或者降低可能的不利性质，例如，人宿主中的免疫原性(所谓的人源化)、潜在产物异质性和/或不稳定性、糖基化、脱酰胺、异构化等的位点，或者增强分子的一些其他有利性质，例如溶解性、稳定性、生物利用度等。
因此，在一个实施方式中，本发明提供了变体MET抗体，其与骆驼科动物来源的VH或VL域相比在VH域或VL域的至少一个骨架或CDR区中含有至少一个氨基酸取代，其实例包括但不限于：包含SEQ ID NO：155、157、159、161、163、165、167、169、171、173或175所示的氨基酸序列的骆驼科VH域以及包含SEQ ID NO：156、158、160、162、164、166、168、170、172、174或176所示的氨基酸序列的骆驼科VL域。
在某些实施方式中，提供了“嵌合”抗体分子，其包含骆驼科动物来源的VH和VL域(或其工程化变体)和来自非骆驼科动物抗体的一个或多个恒定域，例如人源编码的恒定域(或其工程化变体)。在此类实施方式中，优选的是，VH域和VL域均获得自骆驼科动物的相同物种，例如VH和VL均可来自大羊驼(在引入工程化的氨基酸序列变异之前)。在此类实施方式中，VH和VL域均可衍生自单个动物，特别是已经用人MET抗原主动免疫的单个动物。
在某些实施方式中，本发明可包括嵌合骆驼科动物/人抗体，特别是VH和VL域是全骆驼科动物序列(例如大羊驼或羊驼)而抗体的其余部分是全人序列的嵌合抗体。MET抗体可包括包含骆驼科动物来源的VH和VL域或其CDR的“人源化”或“种系化”变体的抗体，以及骆驼科动物/人嵌合抗体，其中VH和VL域与通过用人MET抗原主动免疫骆驼科动物获得的骆驼科VH和VL域相比在骨架区中含有一个或多个氨基酸取代。这种“人源化”通过用人种系编码的VH或VL域中发现的等价残基替换起始骆驼科VH或VL域中的错配氨基酸残基来增加与人种系VH或VL域的序列同一性百分比。
在某些实施方式中，本发明可包括嵌合骆驼科动物/小鼠抗体，特别是VH和VL域是全骆驼科动物序列(例如大羊驼或羊驼)而抗体的其余部分是全小鼠序列的嵌合抗体。
本发明的MET抗体和抗原结合片段也可以是移植CDR的抗体，其中衍生自骆驼科动物抗体的CDR(或高变环)，例如通过用人MET蛋白主动免疫而产生的或由骆驼科动物基因编码的骆驼科动物MET抗体，被移植到人VH和VL骨架上，而抗体的其余部分也是全人源的。这种移植CDR的MET抗体可含有具有下表3和表4中所示氨基酸序列的CDR。
骆驼科动物来源的MET抗体包括这样的变体，其中VH域和/或VL域的高变环或CDR获得自针对人MET产生的常规骆驼抗体，但其中至少一个所述(骆驼科动物来源的)高变环或CDR已被工程化成包括相对于骆驼科动物编码序列的一个或多个氨基酸取代、添加或缺失。这些变化包括高变环/CDR的“人源化”。已经以这种方式工程化的骆驼科动物来源的HV/CDR仍然可表现出与骆驼科动物编码的HV/CDR的氨基酸序列“基本上相同”的氨基酸序列。在这种情况下，“基本同一性”可允许与骆驼科动物编码的HV/CDR不大于一个或不大于两个氨基酸序列错配。MET抗体的特定实施方式可含有表3和表4中所示的CDR序列的人源化变体。
骆驼科动物(例如大羊驼)常规抗体为制备用作人治疗剂的抗体提供了有利的起点，这是由于US12/497,239(其通过引用而被并入本文)中讨论的以下因素：
1)骆驼科VH和VL域及其人对应物之间高的序列同源性百分比；
2)骆驼科动物VH和VL域的CDR与其人对应物(即人样规范折叠结构和规范折叠的人样组合)之间的高度结构同源性。
骆驼科动物(例如大羊驼)平台在可获得的MET抗体的功能多样性方面也提供了显著的优势。
包含骆驼科动物VH和/或骆驼科动物VL域的MET抗体用于人治疗可通过天然骆驼科动物VH和VL域的“人源化”得到进一步改善，例如使它们在人宿主中具有较低的免疫原性。人源化的总体目标是产生这样的分子，其中VH和VL域在引入人受试者时表现出最小的免疫原性，同时保留由亲本VH和VL域形成的抗原结合位点的特异性和亲和力。
一种人源化(即所谓的“种系化”)方法涉及改变骆驼科动物VH或VL域的氨基酸序列，以使其更接近人VH或VL域的种系序列。
就选择要改变的骆驼科动物氨基酸残基(在给定的VH或VL域中)而言以及就选择合适的替换氨基酸残基而言，确定骆驼科VH(或VL)域与人VH(或VL)域之间的同源性是人源化过程中的关键步骤。
已经基于大量新型骆驼科动物VH(和VL)域序列的比对开发了骆驼科动物常规抗体的种系化方法，其中，新型骆驼科动物VH(和VL)域序列通常是已知与靶抗原结合的、具有人种系VH(或VL)序列、人VH(和VL)共有序列以及可用于羊驼(llama pacos)的种系序列信息的体细胞突变的VH(或VL)域。
WO2011/080350(其内容通过引用而被并入本文)中描述的方法可被应用于：(i)选择“骆驼科动物”氨基酸残基用于在骆驼科动物来源的VH或VL域或其CDR中进行替换，和(ii)在当人源化任何给定的骆驼科动物VH(或VL)域时选择替换人”氨基酸残基进行替换。该方法可用于制备具有表3和表4中所示氨基酸序列的骆驼科动物来源的CDR的人源化变体，并且还用于具有表5中所示序列的骆驼科动物来源的VH和VL域的种系化。
MET抗体可采用其中存在VH域和VL域的各种不同实施方式。本文中术语“抗体”以最广泛的含义使用，并且包括但不限于：单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)，只要它们表现出对人MET蛋白和小鼠MET蛋白适当的免疫学特异性即可。如本文所用的术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群体获得的抗体，即，除了少量存在的可能自然发生的突变之外，构成群体的各个抗体是相同的。单克隆抗体是针对单个抗原位点高度特异性的。此外，与通常包括针对抗原上不同决定簇(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制剂相反，每种单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇或表位。
“抗体片段”包含全长抗体的一部分，通常是其抗原结合域或可变域。抗体片段的实例包括：Fab、Fab′、F(ab′)2、双特异性Fab，和Fv片段、双体(diabodies)、线性抗体、单链抗体分子、单链可变片段(scFv)和由抗体片段形成的多特异性抗体(参见Holliger和Hudson，自然生物技术，23期，1126-1136页，2005年(Holliger and Hudson，NatureBiotechnol.23：1126-1136，2005)，其内容通过引用而并入本文)。
在非限制性实施方式中，本文提供的MET抗体可包含CH1域和/或CL域，其氨基酸序列完全或基本上是人的。如果MET抗体用于人治疗用途，则它通常使抗体的整个恒定区或其至少一部分具有完全或基本上人氨基酸序列。因此，CH1域、铰链区、CH2域、CH3域和CL域(和CH4域，如果存在的话)中的一个或多个或任何组合就其氨基酸序列而言可以是完全或基本上人的。此类抗体可以是任何人同种型，例如IgG1。
有利地，CH1域、铰链区、CH2域、CH3域和CL域(和CH4域，如果存在的话)可全部或基本上具有人氨基酸序列。在人源化或嵌合抗体或抗体片段的恒定区的背景下，术语“基本上人”是指与人恒定区至少90％、或至少92％、或至少95％、或至少97％、或至少99％的氨基酸序列同一性。本文中的术语“人氨基酸序列”是指由人免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列，其包括种系、重排和体细胞突变的基因。此类抗体可以是任何人同种型，特别优选人IgG4和IgG1。
还提供了包含除了明确要求存在“全人”铰链区的那些实施方式之外，已经通过对人序列进行一个或多个氨基酸添加、缺失或取代而被改变的“人”序列的恒定域的MET抗体，。
本发明的MET抗体中“全人”铰链区的存在对抗体的免疫原性最小化和稳定性优化而言都是有益的。
本文提供的MET抗体可以是任何同种型。用于人治疗用途的抗体通常是IgA、IgD、IgE、IgG、IgM型，常常是IgG型，在这种情况下，它们可属于IgG1、IgG2a和IgG2b、IgG3或IgG4四个亚类中的任何一者。在这些亚类中的每一个内，允许在Fc部分内进行一个或多个氨基酸取代、插入或缺失，或进行其他结构修饰，例如以增强或降低Fc依赖性功能。
在非限制性实施方式中，预期可在重链和/或轻链的恒定区内，特别是在Fc区内，进行一个或多个氨基酸取代、插入或缺失。氨基酸取代可导致用不同的天然存在的氨基酸或用非天然或修饰的氨基酸替换取代的氨基酸。还允许其他结构修饰，例如改变糖基化模式(例如通过添加或缺失N-或O-连接的糖基化位点)。根据MET抗体的预期用途，可能需要对本发明的抗体的关于其与Fc受体的结合特性进行修饰，例如以调节效应功能。
在某些实施方式中，MET抗体可包含给定抗体同种型的Fc区，例如人IgG1，其被修饰成降低或基本上消除与该抗体同种型天然相关的一种或多种抗体效应功能。在非限制性实施方式中，MET抗体可基本上不含任何抗体效应功能。在本文中，“抗体效应功能”包括抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、补体依赖性细胞毒性(CDC)和抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)中的一种或多种或全部。
MET抗体的Fc部分的氨基酸序列可含有一个或多个突变，如氨基酸取代、缺失或插入，其具有降低一种或多种抗体效应功能的作用(与不具有所述突变的野生型对应抗体相比)。几种这样的突变在抗体工程化领域中是已知的。适合包含在本文所述的MET抗体中的非限制性实例包括人IgG4或人IgG1的Fc域中的以下突变：N297A、N297Q、LALA(L234A、L235A)、AAA(L234A、L235A、G237A)或D265A(根据人IgG1中的EU编号系统编号的氨基酸残基)。
与本文公开的MET抗体“交叉竞争”的单克隆抗体或其抗原结合片段是在与本发明MET抗体结合的位点相同或重叠的位点处结合人MET并且在与本发明MET抗体结合的位点相同或重叠的位点处结合小鼠MET的那些单克隆抗体或其抗原结合片段。竞争性单克隆抗体或其抗原结合片段可例如通过抗体竞争检测进行识别。例如，纯化或部分纯化的人MET的样品可与固体支持物结合。然后，加入本发明的抗体化合物或其抗原结合片段以及疑似能够与本发明这种抗体化合物竞争的单克隆抗体或其抗原结合片段。标记了两个分子中的一者。如果标记的化合物和未标记的化合物结合到MET上的分开且离散的位点，则标记的化合物将结合至相同的水平，无论是否存在疑似竞争化合物。然而，如果相互作用的位点相同或重叠，则未标记的化合物会竞争，并且与抗原结合的标记化合物的量会降低。如果未标记的化合物过量存在，则很少(如果有的话)标记的化合物会结合。出于本发明的目的，竞争性单克隆抗体或其抗原结合片段是降低本发明抗体化合物与MET结合约50％、约60％、约70％、约80％、约85％、约90％、约95％或约99％的那些。进行这种竞争检测的程序的细节在本领域中是公知的，并且可被发现于Harlow和Lane，《抗体：实验室手册》，冷泉港实验室出版社，纽约州冷泉港1988年，567-569页，1988年，ISBN 0-87969-314-2(Harlow and Lane，Antibodies，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，New York，1988，567-569，1988，ISBN 0-87969-314-2)。这些检测可通过使用纯化的抗体进行定量。通过自身滴定一种抗体，即，相同的抗体用于标记和竞争剂，来建立标准曲线。滴定未标记的竞争性单克隆抗体或其抗原结合片段抑制标记分子与板结合的能力。将结果绘制，并比较达到所期望结合抑制程度所需的浓度。
本发明还提供了：多核苷酸分子，其编码本发明的MET抗体；表达载体，其含有与调节序列可操作地连接的、编码本发明的MET抗体的核苷酸序列，调节序列允许抗体或其抗原结合片段在宿主细胞或无细胞表达系统中表达；以及宿主细胞或无细胞表达系统，其含有这种表达载体。
编码本发明的MET抗体的多核苷酸分子包括例如重组DNA分子。如本文所使用的术语“核酸”、“多核苷酸”或“多核苷酸分子”可互换使用，并且是指任何单链或双链的DNA或RNA分子，如果是单链的话，则也指其互补序列的分子。在讨论核酸分子中，本文可根据提供5′至3′方向序列的常规惯例描述特定核酸分子的序列或结构。在本发明的一些实施方式中，核酸或多核苷酸是“分离的”。当应用于核酸分子时，该术语是指与在其起源的生物体的天然存在的基因组中与其立即连续的序列分离的核酸分子。例如，“分离的核酸”可包含插入载体如质粒或病毒载体中或整合到原核或真核细胞或非人宿主生物的基因组DNA中的DNA分子。当应用于RNA时，术语“分离的多核苷酸”主要指由如上定义的分离的DNA分子编码的RNA分子。或者，该术语可指已经从在其天然状态中(即，在细胞或组织中)与其相关的其他核酸中纯化/分离出的RNA分子。分离的多核苷酸(DNA或RNA)可进一步代表通过生物或合成方法直接产生的分子，并且与其产生过程中存在的其他组分分离。
为了重组产生根据本发明的MET抗体，(使用标准分子生物学技术)制备编码它的重组多核苷酸，并将其插入可复制的载体中用于在选择的宿主细胞或无细胞表达系统中表达。合适的宿主细胞可以是原核细胞、酵母细胞或高等真核细胞，特别是哺乳动物细胞。有用的哺乳动物宿主细胞系的实例是：由SV40转化的猴肾CV1系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚肾细胞系(293细胞或亚克隆用于在悬浮培养中生长的293细胞，Graham等人，普通病毒学杂志，36期，59-74页，1977年(293 or 293 cells subcloned for growth in suspensionculture，Graham et al.，J.Gen.Virol.36：59-74，1977))；小仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL10)；中国仓鼠卵巢细胞/DHFR(CHO，Urlaub等人，美国国家科学院院刊，77期，4216页，1980年(CHO，Urlaub et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216，1980))；小鼠支持细胞(TM4；Mather，繁殖生物学，23期，243-252页，1980年(Mather，Biol.Reprod.23：243-252，1980))；小鼠骨髓瘤细胞SP2/0-AG14(ATCC CRL 1581；ATCC CRL 8287)或NS0(HPA培养物保藏号85110503)；猴肾细胞(CV1 ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；水牛大鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI细胞(Mather等人，纽约科学院年刊，383期，44-68页，1982年(Mather et al.，Annals N.Y.Acad.Sci.383：44-68，1982))；MRC 5细胞；FS4细胞；和人肝癌细胞系(Hep G2)，以及DSM的PERC-6细胞系。适用于这些宿主细胞中的每一种的表达载体也是本领域公知的。
应注意，术语“宿主细胞”通常是指培养的细胞系。引入了编码根据本发明的抗原结合多肽的表达载体的全人类明确排除在“宿主细胞”的定义之外。
在一个重要方面，本发明还提供了一种生产本发明的MET抗体的方法，其包括在允许表达MET抗体的条件下培养含有编码MET抗体的多核苷酸(例如表达载体)的宿主细胞(或无细胞表达系统)，并回收表达的MET抗体。这种重组表达方法可用于大规模生产根据本发明的MET抗体，包括用于人治疗用途的单克隆抗体。用于大规模生产适于体内治疗用途的重组抗体的合适载体、细胞系和生产方法通常是本领域可获得的并且是本领域技术人员公知的。
本文提供的MET抗体具有治疗用途，特别是疾病的治疗性处理，特别是受益于MET功能刺激的病症，包括但不限于：退行性疾病、炎性疾病、自身免疫疾病、代谢疾病、移植相关疾病和伤口愈合。在这方面中，本文提供的MET抗体是更广泛类别的在治疗所述病症中具有治疗效用的MET激动剂(例如HGF)的实例。
肝细胞表达MET并且是HGF的主要靶标，其促进它们增殖并保护它们免于凋亡。本文(实施例16和17)显示了诱导MET信号传导的MET抗体，以保护肝损伤(急性肝损伤和慢性损伤)的小鼠模型中的肝细胞。如本文已经描述的，本发明的抗体在人系统中表现出与在小鼠系统中等价的性质，因此，可预期在人肝损伤的情况下赋予类似的保护作用。因此，在一个方面中，本发明提供了一种治疗或预防人患者肝损伤的方法，该方法包括向有需要的患者给药治疗有效量的MET抗体，该MET抗体诱导MET信号传导。在某些实施方式中，该方法是治疗或预防急性肝损伤的方法。在某些实施方式中，该方法是治疗或预防慢性肝损伤的方法。在某些实施方式中，抗体是如本文所述的抗体。
肾上皮细胞表达显著水平的MET并且对HGF刺激敏感。本文(实施例18)显示了诱导MET信号传导的MET抗体，以在急性肾损伤的小鼠模型中赋予保护作用。如本文已经描述的，本发明的抗体在人系统中表现出与在小鼠系统中等价的性质，因此，可预期在人肾损伤的情况下赋予类似的保护作用。因此，在一个方面中，本发明提供了一种治疗或预防人患者肾损伤的方法，该方法包括向有需要的患者给药治疗有效量的MET抗体，该MET抗体诱导MET信号传导。在某些实施方式中，该方法是治疗或预防急性肾损伤的方法。在某些实施方式中，抗体是如本文所述的抗体。
本文(实施例19和20)还证明了，诱导MET信号传导的MET抗体的给药在炎性肠病(IBD)的小鼠模型中，例如在溃疡性结肠炎中，提供有效治疗。因此，在一个方面中，本发明提供了一种治疗或预防人患者IBD的方法，该方法包括向有需要的患者给药治疗有效量的MET抗体，该MET抗体诱导MET信号传导。在某些实施方式中，该方法是治疗或预防溃疡性结肠炎的方法。在某些实施方式中，抗体是如本文所述的抗体。
本文进一步证明了，诱导MET信号传导的MET抗体的给药能够恢复在糖尿病包括I型和II型糖尿病(实施例21和22)中的代谢功能。特别地，在I型糖尿病模型(实施例21)中，MET抗体显示出促进葡萄糖摄取。此外，MET抗体与胰岛素的给药产生了对葡萄糖摄取的协同效应。在II型糖尿病模型(实施例22)中，MET抗体显示出使葡萄糖控制正常化并降低胰岛素抗性。因此，在一个方面中，本发明提供了一种治疗或预防人患者糖尿病的方法，该方法包括向有需要的患者给药治疗有效量的MET抗体，该MET抗体诱导MET信号传导。在某些实施方式中，该方法是治疗或预防I型糖尿病的方法。在某些此类实施方式中，该方法还包括向患者给药胰岛素。在某些实施方式中，该方法是治疗II型糖尿病的方法。在某些实施方式中，抗体是如本文所述的抗体。
本文进一步证明，诱导MET信号传导的MET抗体的给药能够在非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的小鼠模型中降低脂肪肝的程度(实施例23)。特别是，MET抗体能够减少脂肪细胞的数量和纤维化的水平。因此，在一个方面中，本发明提供了一种治疗或预防人患者NASH的方法，该方法包括向有需要的患者给药治疗有效量的MET抗体，该MET抗体诱导MET信号传导。在某些实施方式中，抗体是如本文所述的抗体。
本文进一步证明了，诱导MET信号传导的MET抗体的给药能够促进伤口愈合(实施例24)。此外，MET抗体能够促进表现出伤口愈合受损的糖尿病小鼠的伤口愈合。因此，在一个方面中，本发明提供了一种促进人患者伤口愈合的方法，该方法包括向有需要的患者给药治疗有效量的MET抗体，该MET抗体诱导MET信号传导。在某些实施方式中，人患者患有糖尿病，任选地患有I型糖尿病。在某些实施方式中，抗体是如本文所述的抗体。
实施例
现将参照以下非限制性实验例进一步理解本发明。
实施例1：大羊驼的免疫
如上所述，进行大羊驼的免疫接种和外周血淋巴细胞(PBL)的收获，以及随后的RNA提取和抗体片段的扩增(De Haard等人，细菌杂志，187期，4531-4541页，2005年(DeHaard et al.，J.Bact.187：4531-4541，2005))。通过肌内注射嵌合蛋白来使两只成年大羊驼(Lama glama)免疫，该嵌合蛋白由与人IgG1的Fc部分融合的人MET(MET-Fc；R&DSystems)的胞外域(ECD)组成。每只大羊驼每周接受一次注射，持续六周，总共注射六次。每次注射在于弗氏不完全佐剂中的0.2mg蛋白质，其在颈部被分成超过两个分叉。
在免疫前和免疫后收集10ml的血液样品用于研究免疫应答。在最后一次免疫后大约一周，收集400ml血液并使用Ficoll-Paque方法获得PBL。通过苯酚-硫氰酸胍法(Chomczynski等人，分析生物化学，162期，156-159页，1987年(Chomczynski et al.，Anal.Biochem.162：156-159，1987))提取总RNA，并通过使用SuperScriptTM III第一链合成系统试剂盒(Life Technologies)将其用作随机cDNA合成的模板。如上所述，进行编码大羊驼IgG1的VH-CH1区和VL-CL域(K和λ)的cDNA的扩增并亚克隆到噬菌粒载体pCB3中(deHaard等人，生物化学杂志，274期，18218-18230页，1999年(de Haard et al.，J BiolChem.274：18218-18230，1999))。使用重组噬菌粒转化大肠杆菌菌株TG1(荷兰细菌培养收藏(Netherland Culture Collection of Bacteria))，以产生4种不同的Fab表达噬菌体文库(每个免疫的大羊驼一个λ和一个K文库)。多样性为108-109。
通过ELISA研究对抗原的免疫应答。为此，我们通过标准蛋白质工程技术获得人MET(UniProtKB#P08581；第1-932位aa)和小鼠MET(UniProtKB#P16056.1；第1-931位aa)的ECD。将人或小鼠MET ECD重组蛋白固定在固相(100ng/孔，96孔板)中，并在免疫之前(第0天)或之后(第45天)暴露于来自大羊驼的血清的系列稀释液。使用小鼠抗大羊驼IgG1(Daley等人，疫苗免疫临床，12期，2005年(Daley et al.，Clin.Vaccine Immunol.12，2005))和HRP缀合的驴抗小鼠抗体(Jackson Laboratories)来揭示结合。如图1所示，两只大羊驼都表现出对人MET ECD的免疫应答。与人MET的胞外部分与其小鼠同源基物显示出87％同源性的观点一致，对小鼠MET ECD也观察到程度相当好的交叉反应性。
实施例2：结合人和小鼠MET的Fab的选择和筛选。
根据标准噬菌体展示方案产生来自上述文库的表达Fab的噬菌体。对于选择，首先将噬菌体吸附到固定的重组人MET ECD上、洗涤，然后用胰蛋白酶洗脱。在用人MET ECD选择两个循环后，使用小鼠MET ECD以相同的方式进行另外两个循环。平行地，我们还选择了将人MET ECD循环与小鼠MET ECD循环交替、总共四个循环的噬菌体。将通过两种方法所选择的噬菌体合并在一起，然后将其用于感染TG1大肠杆菌。分离单个菌落并使用IPTG(Fermentas)诱导Fab的分泌。收集含有Fab的周质部分的细菌，并通过表面等离子体共振(SPR)测试其结合人和小鼠MET ECD的能力。通过使用在乙酸钠缓冲液(GE Healthcare)中的胺偶联将人或小鼠MET ECD固定在CM-5芯片上。将含有Fab的周质提取物加载到流速为30μl/min的BIACORE 3000装置(GE Healthcare)中。在两分钟的时间内测量Fab解离速率(k解离)。通过使用固相中的MET ECD和溶液中的周质粗提取物的ELISA进一步表征Fab与人和小鼠MET的结合。因为Fab用MYC标记进行工程化，所以使用HRP缀合的抗MYC抗体(ImTecDiagnostics)来揭示结合。
选择在SPR和ELISA中与人和小鼠MET结合的Fab，并对它们相应的噬菌体进行测序(LGC Genomics)。基于VH CDR3序列长度和含量将交叉反应性Fab序列分成家族。VH家族的内部编号不是基于IMTG(国际免疫遗传学信息系统)命名法。总之，我们可识别出属于8个VH家族的11种不同的人/小鼠交叉反应Fab。重链可变区的CDR和FR序列示于表3中。轻链可变区的CDR和FR序列示于表4中。重链和轻链可变区的完整氨基酸序列示于表5中。重链和轻链可变区的完整DNA序列示于表6中。
表3：结合人和小鼠MET的Fab的VH域的骨架区和CDR序列。
表4：结合人和小鼠MET的Fab的VL域的骨架区和CDR序列。
表5：结合人和小鼠MET的Fab的可变域氨基酸序列。
表6：结合人和小鼠MET的Fab的可变域核苷酸序列。
各种Fab家族及其结合人和小鼠MET的能力如表7所示。
表7：结合人MET(hMET)和小鼠MET(mMET)的Fab。基于Fab的VH CDR3序列将Fab分组到家族中。通过表面等离子体共振(SPR)并通过ELISA来测定Fab与人和小鼠MET ECD的结合。SPR值代表k解离(s-1)。ELISA值表示450nm处的光密度(OD)(AU，任意单位)。SPR和ELISA均使用粗周质提取物来进行。提取物中的Fab浓度未被测定。值是三次独立测量结果的平均值。
实施例3：将Fab嵌合到mAb中
分别将编码所选Fab片段的VH和VL(κ或λ)域的cDNA工程化到两个单独的pUPE哺乳动物表达载体中(U-protein Express)，所述pUPE哺乳动物表达载体含有编码人IgG1的CH1、CH2和CH3或人CL(κ或λ)的cDNA。大羊驼-人嵌合抗体重链和轻链的完整氨基酸序列示于表8中。
表8：结合人和小鼠MET的大羊驼-人嵌合mAb的完整重链和轻链氨基酸序列。
所得嵌合大羊驼-人IgG1分子的生产(通过瞬时转染哺乳动物细胞)和纯化(通过蛋白A亲和层析)被外包给U蛋白速递公司(U-protein Express)。通过使用固相中的hMET或mMET ECD和溶液中递增浓度的抗体(0-20nM)的ELISA来测定嵌合mAb与MET的结合。结合通过使用HRP缀合的抗人Fc抗体(Jackson免疫研究实验室(Jackson Immuno ResearchLaboratories))进行揭示。该分析揭示，所有嵌合的大羊驼-人抗体以皮摩尔亲和力结合人和小鼠MET，显示出0.06nM～0.3nM的EC50。虽然可能是由于固定化抗原中的部分表位暴露，结合能力(EMAX)因抗体与抗体而异，但在人和小鼠环境中是相似的。EC50和EMAX值示于表9中。
表9：通过使用固相中固化的MET ECD和溶液中递增浓度的抗体(0-20nM)的ELISA来测定嵌合mAb与人和小鼠MET的结合。EC50值以nMol/L表示。EMAX值以450nm处的光密度(OD)(AU，任意单位)表示。
我们还分析了嵌合抗MET抗体是否与活细胞中的天然人和小鼠MET结合。为此，将递增浓度的抗体(0-100nM)与A549人肺癌细胞(美国模式培养物集存库(American TypeCulture Collection))或MLP29小鼠肝脏前体细胞(意大利都灵坎迪奥洛省道142公里3.95的都灵大学Enzo Medico教授(Prof.Enzo Medico，University of Torino，StradaProvinciale 142km 3.95，Candiolo，Torino，Italy)的礼物；梅迪科等人，分子和细胞生物学，7期，495-504页，1996年(Medico et al.，Mol Biol Cell 7，495-504，1996))孵育，它们都表达生理水平的MET。通过使用藻红蛋白缀合的抗人IgG1抗体(eBioscience)和CyAn ADP分析仪(Beckman Coulter)的流式细胞术来分析与细胞结合的抗体。作为人MET结合的阳性对照，我们使用商业小鼠抗人MET抗体(R&D Systems)和藻红蛋白缀合的抗小鼠IgG1抗体(eBioscience)。作为小鼠MET结合的阳性对照，我们使用商业山羊抗小鼠MET抗体(R&DSystems)和藻红蛋白缀合的抗山羊IgG1抗体(eBioscience)。所有抗体均表现出EC50为0.2nM～2.5nM的与人和小鼠细胞的剂量依赖性结合。与在ELISA中获得的数据一致，最大结合(EMAX)根据抗体而变化，但在人和小鼠细胞中相似。这些结果表明，嵌合大羊驼-人抗体在人和小鼠细胞系统中识别其天然构象的膜结合的MET。EC50和EMAX值示于表10中。
表10：通过使用递增浓度的抗体(0-50nM)的流式细胞术来测定嵌合mAb与人和小鼠细胞的结合。EC50值以nMol/L表示。EMAX值以相对于对照的百分比表示。
实施例4：负责抗体结合的受体区
为了定位与人和小鼠MET结合的抗体识别的受体区(下文中被称为人/小鼠等价抗MET抗体)，我们测量了它们与衍生自所述生成的人MET的一组工程化蛋白结合的能力(Basilico等人，分子生物学学报，283期，21267-21227页，2008年(Basilico et al，JBiol.Chem.283，21267-21227，2008))。该组包括(图2)：整个MET ECD(Decoy MET)；缺少IPT域3和4的MET ECD(SEMA-PSI-IPT 1-2)；缺少IPT域1-4的MET ECD(SEMA-PSI)；分离的SEMA域(SEMA)；含有IPT域3和4的片段(IPT 3-4)。将工程化的MET蛋白固定在固相中并暴露于溶液中递增浓度的嵌合抗体(0-50nM)中。结合通过使用HRP缀合的抗人Fc抗体(JacksonImmuno Research Laboratories)进行揭示。如表11所示，该分析显示出：7种mAb识别SEMA域内的表位，而其他4种识别PSI域内的表位。
表11：人/小鼠等价的抗MET抗体与图2中描述的MET缺失突变体组的结合。负责抗体结合的MET域示于右侧的最后一栏中。
为了更精细地定位负责抗体结合的MET区，我们利用了我们的抗体和大羊驼MET(用于产生这些免疫球蛋白的生物体)之间不存在交叉反应性。为此，我们产生了所描述的跨越整个MET ECD的一系列大羊驼-人和人-大羊驼嵌合MET蛋白(Basilico等人，临床调查杂志，124期，3172-3186页，2014年(Basilico et al.，J Clin Invest.124，3172-3186，2014))。将嵌合体(图3)固定在固相中，然后暴露于溶液中递增浓度的mAb(0-20nM)中。结合通过使用HR缀合的抗人Fc抗体(Jackson免疫研究实验室(Jackson Immuno ResearchLaboratories))进行揭示。该分析揭示了5个SEMA结合mAb(71D6、71C3、71D4、71A3、71G2)识别位于人MET的第314-372位氨基酸之间的表位，对应于7叶片SEMA β螺旋桨的4-5叶片的区(Stamos等人，EMBO杂志，23期，2325-2335页，2004年(Stamos et al.，EMBO J.23，2325-2335，2004)。其他2个SEMA结合mAb(74C8、72F8)分别识别位于第123-223位氨基酸之间和第224-311位氨基酸之间的表位，对应于SEMA β-螺旋桨的叶片1-3和1-4。PSI结合mAb(76H10、71G3、76G7、71G12)似乎不显示与任何两种PSI嵌合体的任何显著的结合。考虑到表11中呈现的结果，这些抗体可能识别位于人MET的第546～562位氨基酸之间的表位。这些结果总结在表12中。
表12：通过ELISA测定的人/小鼠等价的抗MET抗体识别的表位的定位。将图3中描述的人MET ECD(hMET)或大羊驼MET ECD(1MET)以及大羊驼-人MET嵌合蛋白(CH1-7)固定在固相中，然后暴露于递增浓度的mAb。
实施例5：HGF竞争检测
上述分析表明，被一些人/小鼠等价抗MET抗体识别的表位可能在HGF结合MET时与HGF涉及的表位重叠(Stamos等人，EMBO杂志，23期，2325-2335页，2004年(Stamos et al.，EMBO J.23，2325-2335，2004)；Merchant等人，美国国家科学院院刊，110期，E2987-2996页，2013年(Merehant et al.，Proc Natl Acad Sci USA 110，E2987-2996，2013)；Basilico等人，临床调查杂志，124期，3172-3186页，2014年(Basilico et al.，J Clin Invest.124，3172-3186，2014))。为了沿着这条线进行研究，我们通过ELISA测试了mAb和HGF之间的竞争。使用NHS-LC-生物素(Thermo Scientific)，在N-末端将重组人和小鼠HGF(R&DSystems)生物素化。将人或小鼠MET-Fc蛋白(R&D Systems)固定在固相中，然后在递增浓度(0-120nM)的抗体的存在下暴露于0.3nM生物素化的人或小鼠HGF。使用HRP缀合的链霉亲和素(Sigma-Aldrich)揭示与MET结合的HGF。如表13所示，该分析允许将人/小鼠等价的抗METmAb分为两组：完全HGF竞争剂(71D6、71C3、71D4、71A3、71G2)和部分HGF竞争剂(76H10、71G3、76G7、71G12、74C8、72F8)。
表13：通过ELISA测定的人/小鼠等价的抗MET抗体与HGF竞争结合MET的能力。将(人或小鼠)MET-Fc嵌合蛋白固定在固相中，然后在递增浓度的抗体的存在下暴露于固定浓度的生物素化HGF(人或小鼠)。使用HRP缀合的链霉亲和素揭示与MET结合的HGF。抗体HGF竞争被表示为IC50(达到50％竞争的浓度)和IMAX(饱和时达到的最大竞争百分比)。
作为一般规则，SEMA结合剂比PSI结合剂更有效地替换HGF。特别地，识别SEMA β螺旋桨的叶片4和5内的表位的那些抗体是最有效的HGF竞争剂(71D6、71C3、71D4、71A3、71G2)。该观察结果与SEMA刀片5含有对HGF的α链的高亲和力结合位点的观点一致(Merchant等人，美国国家科学院院刊，110期，E2987-2996页，2013年(Merchant et al.，Proc Natl Acad Sci USA 110，E2987-2996，2013))。PSI域尚未显示直接参与HGF，但已被建议起到调节HGF在SEMA域和IPT区之间适应性的“铰链”的作用(Basilico等人，临床调查杂志，124期，3172-3186页，2014年(Basilico et al.，J Clin Invest.124，3172-3186，2014))。因此，与PSI(76H10、71G3、76G7、71G12)结合的mAb可能通过干扰该过程或通过空间位阻，而不是通过与配体的直接竞争，来阻碍HGF与MET的结合。最后，已证明，SEMA β螺旋桨的叶片1-3负责HGF的β链的低亲和力结合，其在MET活化中起核心作用，但仅部分地有助于HGF-MET结合强度(Stamos等人，EMBO杂志，23期，2325-2335页，2004年(Stamos et al.，EMBO J.23，2325-2335，2004))。这可解释为什么结合MET的区的mAb(74C8、72F8)是HGF的部分竞争剂。
实施例6：MET活化检测
由于它们的二价性质，针对受体酪氨酸激酶的免疫球蛋白可表现出受体激动活性，从而模拟天然配体的作用。为了沿着这条线进行研究，我们测试了人/小鼠等价的抗MET抗体在受体活化检测中促进MET自磷酸化的能力。将A549人肺癌细胞和MLP29小鼠肝脏前体细胞剥夺血清生长因子48小时，然后用递增浓度(0-5nM)的抗体或重组HGF(A549细胞，重组人HGF，R&D Systems；MLP29细胞，重组小鼠HGF，R&D Systems)进行刺激。在刺激15分钟后，用冰冷的磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞两次，然后进行所述的裂解(Longati等人，癌基因，9期，49-57页，1994年(Longati et al.，Oncogene 9，49-57，1994))。蛋白质裂解液通过电泳来进行分解，然后通过使用对磷酸化形式的人或小鼠MET特异性的抗体(第1234-1235位酪氨酸)(细胞信号传导技术(Cell Signaling Technology))的蛋白质印迹进行分析。相同的裂解液还通过使用抗全人MET抗体(Invitrogen)或抗全小鼠MET抗体(R&D Systems)的蛋白质印迹法进行分析。该分析显示，所有人/小鼠等价的抗体均表现出MET激动活性。如图4所示，一些抗体促进MET自磷酸化的程度与HGF相当(71G3、71D6、71C3、71D4、71A3、71G2、74C8)。一些其他抗体(76H10、76G7、71G12、72F8)效果较差，并且这在较低的抗体浓度下特别明显。没有观察到MET活化活性和HGF竞争活性之间的明确相关性。
为了获得更多的定量数据，还通过磷酸化-MAT ELISA来表征抗体的激动活性。为此，如上所述对A549和MLP29细胞进行血清饥饿，然后用递增浓度(0-25nM)的mAb进行刺激。使用重组人(A549)或小鼠(MLP29)HGF作为对照。如上所述(Basilico等人，临床调查杂志，124期，3172-3186页，2014年(Basilico et al.，J Clin Invest.124，3172-3186，2014))，裂解细胞并且通过ELISA测定磷酸化-MET水平。简而言之，用小鼠抗人MET抗体或大鼠抗小鼠MET抗体(均来自R&D Systems)包被96孔板，然后与细胞裂解液一起孵育。在洗涤后，将捕获的蛋白质与生物素缀合的抗-磷酸化-酪氨酸抗体(Thermo Fisher)一起孵育，并使用HRP-缀合的链霉亲和素(Sigma-Aldrich)来显示结合。
该分析的结果与通过蛋白质印迹获得的数据一致。如表14所示，71G3、71D6、71C3、71D4、71A3、71G2和74C8有力地激活MET，而76H10、76G7、71G12和72F8引起不太明显的效果。在任何情况下，所有抗体在人和小鼠细胞中表现出相当的效果。
表14：通过ELISA测定的人和小鼠细胞中人/小鼠等价抗MET抗体的激动活性。对A549人肺癌细胞和MLP29小鼠肝前体细胞进行血清饥饿，然后用递增浓度的mAb进行刺激。使用重组人HGF(hHGF；A549)或小HGF(hHGF；A549)作为对照。细胞裂解液通过使用用于捕获的抗全MET抗体和用于揭示的抗磷酸化酪氨酸抗体的ELISA进行分析。激动活性表示为EC50(nM)和EMAX(HGF活性百分比)。
实施例7：分散检测
为了评价人/小鼠等价的抗MET抗体的激动活性是否可转化成生物活性，我们对人和小鼠上皮细胞进行了分散检测。为此，用递增浓度的重组HGF(人或小鼠；均来自R&DSystems)刺激HPAF-II人胰腺癌细胞(美国模式培养物集存库)和MLP29小鼠肝前体细胞，并在24小时后通过如前所述的显微镜检查来测定细胞分散(Basilico等人，临床调查杂志，124期，3172-3186页，2014年(Basilico et al.，J Clin Invest.124，3172-3186，2014))。该初步分析揭示了：HGF诱导的细胞分散是线性的，直到它在两种细胞系中达到约0.1nM的饱和度。基于这些HGF标准曲线，我们详细阐述了从0(在不存在HGF的情况下完全没有细胞分散)到4(在0.1nM HGF存在下的最大细胞分散)的评分系统。用递增浓度的人/小鼠等价的抗MET抗体刺激HPAF-II和MLP29细胞，并在24小时后使用上述评分系统测定细胞分散。如表15所示，该分析揭示了：所有测试的mAb促进入和小鼠细胞系统中的细胞分散，两种物种的结果基本上重叠。71D6和71G2表现出与HGF完全相同的活性；71G3和71A3的效力略低于HGF；71C3和74C8需要显著更高的浓度以匹配HGF的活性；在该检测中，71D4、76G7、71G12和72F8未达到饱和。
表15：在基于细胞的分散检测中测定的人/小鼠等价的抗MET抗体的生物活性。用递增浓度的人/小鼠等价的抗MET抗体刺激HPAF-II人胰腺癌细胞和MLP29小鼠肝前体细胞，并在24小时后使用文中描述的评分系统来测定细胞分散(0，不存在细胞分散；4，最大细胞分散)。
HPAF-II人胰腺癌细胞
MLP29小鼠肝脏前体细胞
实施例8：保护药物诱导的细胞凋亡
几个系列的实验证据表明：HGF对表达MET的细胞表现出强力的抗细胞凋亡作用(由Nakamura等人，胃肠病学和肝脏病学杂志，26期增1，188-202页，2011年(Nakamura etal.，J Gastroenterol Hepatol.26 Suppl 1，188-202，2011)综述)。为了测试人/小鼠等价的抗MET抗体的潜在抗凋亡活性，我们进行了基于细胞的药物诱导的存活检测。将MCF10A人乳腺上皮细胞(美国典型培养物保藏中心)和MLP29小鼠肝前体细胞与递增浓度的星形孢菌素(Sigma Aldrich)一起孵育。在48小时后，通过使用CellTiter Glo试剂盒(Promega)和Victor X4多标记板读数器(Perkin Elmer)测量总ATP浓度来测定细胞活力。该初步分析揭示了：诱导约50％细胞死亡的药物浓度对于MCF10A细胞为60nM，而对于MLP29细胞为100nM。接下来，我们在递增浓度(0-32nM)的抗MET mAb或重组HGF(人或小鼠；均来自R&D Systems)存在下将MCF10A细胞和MLP29细胞与上述确定的药物浓度一起孵育。如上所述，在48小时后测定细胞活力。表16中提供的该分析结果表明：人/小鼠等价的抗体在相当程度上保护人和小鼠细胞免受星形孢菌素诱导的细胞死亡。虽然一些单克隆抗体(71G3、71D6、71G2)表现出与HGF相似或更高的保护活性，但其他分子(76H10、71C3、71D4、71A3、76G7、71G12、74C8、72F8)在人或在小鼠细胞系统中仅表现出部分保护作用。
表16：通过基于细胞的药物诱导的细胞凋亡检测所测量的人/小鼠等价的抗MET抗体的生物活性。在递增浓度的抗MET mAb或重组HGF(人或小鼠)存在下，将MCF10A人乳腺上皮细胞和MLP29小鼠肝前体细胞与固定浓度的星形孢菌素一起孵育，并在48小时后测定总ATP含量。细胞存活率被计算为相对于既不用星形孢菌素也不用抗体处理的细胞的总ATP含量百分比，并被表示为EC50和EMAX。
实施例9：分枝化形态发生检测
如背景技术部分所讨论的，HGF是一种多效细胞因子，其促进独立生物活动的谐波调节，包括细胞增殖、运动、侵袭、分化和存活。更好地概括所有这些活性的基于细胞的检测是分枝化形态发生检测，其在胚胎发生过程中复制管状器官和腺体的形成(Ros á rio和Birchmeier，细胞生物学趋势，13期，328-335页，2003年(Ros á rio and Birchmeier，Trends Cell Biol.13，328-335，2003)所综述)。在该检测中，将上皮细胞的球状体接种在3D胶原基质内并被HGF刺激以生长出小管，其最终形成分枝化结构。这些分枝化小管类似于上皮腺的中空结构，例如乳腺，它们表现出被极化细胞包围的管腔。该检测是能在体外进行的最完整的HGF检测。
为了测试人/鼠等价的抗MET抗体在该检测中是否表现出激动活性，我们将LOC人肾上皮细胞(Michieli等人，自然生物技术，20期，488-495页，2002年(Michieli et al.，Nat Biotechnol.20，488-495，2002))和MLP29小鼠肝脏前体细胞接种于如所述的胶原层(Hultberg等人，癌症研究，75期，3373-3383页，2015年(Hultberg et al.，Cancer Res.75，3373-3383，2015))，然后将它们暴露于递增浓度的mAb或重组HGF(人或小鼠，均来自R&DSystems)。随着时间的推移通过显微镜观察分枝化形态发生，并在5天后对菌落进行拍照。代表性的图像示于图5。通过计数每个球状体的分枝数量来获得分枝化形态发生活性的定量。如表17所示，所有测试的抗体诱导了分枝化小管的剂量依赖性形成。然而，与MET自磷酸化检测和细胞分散检测中获得的数据一致，71D6、71A3和71G2表现出最强效的激动活性，类似于或优于重组HGF。
表17：分枝化形态发生检测。将LOC人肾上皮细胞或MLP29小鼠肝前体细胞的细胞球状体制剂接种于胶原层，然后与递增浓度(0、0.5、2.5和12.5nM)的mAb或重组HGF(LOC，人HGF；MLP29，小鼠HGF)一起孵育。随着时间的推移通过显微镜观察分枝化形态发生，并在5天后对菌落拍照。通过计算每个球状体的分枝数量(主要分枝加上次要分枝)来量化分枝。
LOC细胞
mAb 0nM 0.5nM 2.5nM 12.5nM
76H10 3.3±1.5 7.3±0.6 11.7±1.5 16.7±1.5
71G3 3.0±1.0 13.7±1.5 19.0±2.6 22.3±2.1
71D6 3.0±1.0 29.0±2.0 29.0±2.6 32.7±1.5
71C3 3.3±0.6 8.7±1.5 12.7±2.1 15.7±2.1
71D4 3.0±1.0 9.0±2.6 15.7±1.2 18.7±1.5
71A3 3.0±1.7 24.0±4.6 30.3±3.2 31.3±1.5
71G2 3.7±1.5 25.3±2.1 29.3±3.5 31.7±3.5
76G7 2.7±0.6 6.7±0.6 13.3±4.2 16.3±5.7
71G12 3.3±0.6 7.0±2.6 15.3±5.5 16.0±4.6
74C8 3.0±1.0 10.3±4.2 17.0±4.6 18.7±4.9
72F8 3.3±1.5 9.0±3.5 12.3±2.1 16.0±3.0
hHGF 3.0±1.0 18.0±2 27.7±2.5 20.3±2.1
MLP29细胞
mAb 0nM 0.5nM 2.5nM 12.5nM
76H10 0.3±0.6 10.7±4.0 14.3±3.2 24.7±6.0
71G3 0.3±0.6 24.7±4.5 34.3±5.5 29.3±8.0
71D6 1.3±1.2 32.7±3.5 39.0±7.5 41.3±8.0
71C3 0.3±0.6 11.7±3.5 15.7±6.5 24.7±6.5
71D4 0.7±1.2 16.0±2.6 14.7±4.5 21.7±5.5
71A3 0.7±0.6 30.3±2.1 42.0±6.2 42.7±8.0
71G2 1.0±1.0 34.0±2.6 46.3±4.7 45.0±7.0
76G7 0.3±0.6 14.7±2.1 18.7±4.5 24.7±6.5
71G12 1.0±1.0 14.0±2.6 14.7±5.5 22.7±6.0
74C8 0.7±0.6 17.3±2.5 15.3±6.0 22.3±9.0
72F8 1.0±1.0 12.7±3.1 11.7±3.5 18.7±2.5
mHGF 0.7±1.2 32.3±4.0 43.7±4.2 36.0±7.2
实施例10：人-小鼠等价的激动性抗MET抗体提供了调节MET活性的充分机会
基于迄今为止描述的生化和生物学检测，我们进行了旨在比较抗体功能的综合分析。在所进行的测定中测量的各种mAb的性质总结在表18中。通过分析该表发现，人-小鼠等价的激动性抗MET抗体表现出广泛的生化和生物活性，从而提供了以定制方式调节MET活性的充分机会。根据所选择的翻译或临床应用，抗体可选择自经鉴定与HGF完全或部分竞争的那些，其强力地或轻度地引起MET活化、强烈或每周地促进细胞侵袭，或者强烈或轻柔地拮抗细胞凋亡。从这个角度来看，激动性抗体与HGF相比更通用且更具塑性，因为它们允许与HGF的开启或关闭性质相比诱导更多的渐变响应。
从药理学角度来看，在MET下游引发选择性生物活性的可能性非常有用。例如，肿瘤学领域中的某些应用有益于配体，其使HGF的营养特性与其促侵袭(pro-invasive)活性解离(Michieli等人，自然生物技术，20期，488-495页，2002年(Michieli et al.，NatBiotechnol.20，488-495，2002))。肝病学领域的其他应用理想地需要在不促进细胞侵袭的情况下保护肝细胞免于凋亡的因子(Takahara等人，肝病，47期，2010-2025页，2008年(Takahara et al.，Hepatology，47，2010-2025，2008))。在肌营养不良领域的其他应用中，成肌细胞分化成肌细胞一方面需要关闭HGF诱导的增殖，另一方面需要保护分化相关的细胞凋亡(Cassano等人，PLoS One，3期，e3223期，2008年(Cassano et al.，PLoS One 3，e3223，2008))。在所有这些应用和其他类似情况中，人们可设想使用部分激动性mAb，其一方面替换内源性HGF并且另一方面引起轻度MET活化，从而增强HGF的某些生物活性并同时降低其他生物活性。
相反，再生医学领域中的各种应用需要强力的促存活信号和快速的组织修复，以防止不可逆的细胞损伤或变性。例如，在突然肝衰竭、急性肾损伤或重度胰腺炎的情况下发现这种情况(由Nakamura等人，胃肠病学和肝脏病学杂志，26期增1，188-202页，2011年所综述(Nakamura et al.，J Gastroenterol Hepatol.26 Suppl 1，188-202，2011))。在所有这些应用和其他类似情况中，人们宁愿使用完全激动性mAb，其尽可能有效地推动组织愈合和再生。HGF竞争在这种情况下并不真正起作用，因为完全激动性mAb与HGF一样有效(如果不是更有效)，并且可达到高于发现内源配体的生理水平的药理浓度对数。
在其他涉及HGF的非规范的、不太特征化的功能的病理情况中，如在如涉及免疫系统(炎性疾病、自身免疫疾病、移植相关并发症)、造血系统(干细胞动员、造血)和神经系统(神经生长、神经元变性)的那些病理情况中，HGF/MET途径的作用仍然很少研究。虽然几个系列的实验证据表明了重组HGF或HGF基因治疗在临床前模型中改善这些疾病(由Nakamura等人，胃肠病学和肝脏病学杂志，26期增1，188-202页，2011年所综述(Nakamura et al.，JGastroenterol Hepatol.26 Suppl 1，188-202，2011))，我们没有足够的信息来确定HGF的所有功能或仅部分功能是否有益。对于这些治疗应用，与HGF相比，用高度多样化的MET激动性抗体组精细调节MET活性的可能性是潜在有利的(而没有提到如发明的发明内容部分所讨论的使用重组HGF作为药物中隐含的众多药理学问题)。
总之，我们建议所有鉴定的人-小鼠等价的抗MET抗体可能对治疗应用有潜在作用，无论其与HGF是完全竞争还是部分竞争，并且无论其完全激活MET受体还是部分激活MET受体。
表18：人/小鼠等价的抗MET抗体的主要生化和生物特征。该表总结了每种mAb的以下能力：结合纯化的MET ECD的能力(ELISA)、识别MET表达细胞上的天然MET的能力(FACS)、与HGF竞争MET结合的能力(HGF竞争)、在受体自磷酸化检测中活化MET的能力(MET活化)、促进细胞分散的能力(分散检测)、保护细胞免受药物诱导的细胞凋亡的能力(存活检测)，和促进上皮细胞球状体的分枝化形态发生的能力(分枝化形态发生)。对于每种检测，该评分基于任何给定的mAb相对于其他抗体的相对活性(+，下限50％；++，上限50％)。由于所有抗体在人和小鼠系统中表现出类似的活性，因此每个检测仅显示一个分数。
实施例11：恒定区交换不改变人/小鼠等价的抗体的生化和生物特征
由于本发明的目的是产生和鉴定在人和小鼠系统中等价良好地起作用的激动性抗MET抗体，我们试图确定人重链和轻链恒定区与相应的小鼠恒定区的交换是否影响代表性抗体组的主要生化和生物活性。为此，我们从人/小鼠等价的抗体组中选择出3种代表性分子(71G3，HGF的部分竞争剂和生物检测中的部分激动剂；71D6和71G2，HGF的完全竞争剂和生物检测中的完全激动剂)。将71G3、71D6和71G2的VH和VL区安装在小鼠IgG1/λ抗体骨架上。所有小鼠免疫球蛋白变体的序列可获得自公共数据库，如ImMunoGeneTics信息系统(www.imgt.org)。可通过标准基因工程程序实现与所期望可变区的融合。产生的大羊驼-小鼠嵌合抗体的重链和轻链的完整氨基酸序列示于表19中。
表19：结合人和小鼠MET的大羊驼-小鼠嵌合mAb的完整重链和轻链氨基酸序列。
重组免疫球蛋白的产生和纯化可通过按照良好建立的方案分别在哺乳动物细胞中进行瞬时转染和亲和层析来获得。此后，我们将小鼠形式的71G3、71D6和71G2的生化和生物活性与人形式的相同抗体的生化和生物活性进行了比较。
我们通过ELISA评价抗体与纯化的人或小鼠MET ECD结合的能力、通过FACS评价识别人或小鼠细胞上的天然MET的能力、诱导人和小鼠上皮细胞的分散的能力，以及促进胶原中的分枝化形态发生的能力。表20中总结的该分析结果表明，人与小鼠恒定区交换基本上不影响所分析的任何性质。
表20：恒定区交换不会改变人/小鼠等价的抗体的生化和生物特征。对小鼠或人形式的三种代表性激动性抗体(71G3、71D6和71G2)进行几种旨在表征它们的主要生化和生物学性质的体外检测。
实施例12：与现有技术的抗体的比较：人-小鼠交叉反应性。
如在背景技术部分中详细讨论的，一些其他研究已经描述了至少部分地模拟HGF活性的激动性抗MET抗体。在撰写本发明时，这些包括：(i)3D6小鼠抗人MET抗体(美国专利第6,099,841号)；(ii)5D5小鼠抗人MET抗体(美国专利第5,686,292号)；(iii)NO-23小鼠抗人MET抗体(美国专利第7,556,804 B2号)；(iv)B7人幼稚抗人MET抗体(美国专利申请第2014/0193431 A1号)；(v)DO-24小鼠抗人MET抗体(Prat等人，分子和细胞生物学，11期，5954-5962页，1991年；普拉特等人，细胞科学学报，111期，237-247页，1998年(Prat etal.，Mol Cell Biol.11，5954-5962，1991；Prat et al.，J Cell Sci.111，237-247，1998))；以及(vi)DN-30小鼠抗人MET抗体(普拉特等人，细胞科学学报，11期，5954-5962页，1991年；Prat等人，细胞科学学报，111期，237-247页，1998年(Prat et al.，Mol CellBiol.11，5954-5962，1991；Prat et al.，J Cell Sci.111，237-247，1998))。
我们获得如下所有现有技术的激动性抗MET抗体。3D6杂交瘤购自美国模式培养物集存库(目录号ATCC-HB-12093)。通过标准亲和色谱方案从杂交瘤条件培养基中纯化3D6抗体。
基于美国专利第7,476,724 B2号中公开的VH和VL序列合成编码5D5抗体可变区的cDNA、拮抗性抗MET抗体Onartuzumab的二价祖细胞(Merchant等人，美国国家科学院院刊，110期，E2987-2996页，2013年(Merchant et al.，Proc Natl Acad Sci USA 110，E2987-2996，2013))。通过标准蛋白质工程方案，将获得的DNA片段与小鼠恒定IgG1/λ域融合，并产生为二价单克隆抗体。
NO-23抗体获得自意大利诺瓦拉大学的玛丽亚普拉特(Maria Prat)教授(NO-23的发明人；美国专利第7,556,804 B2号)。No-23抗体还可通过向意大利热那亚的高级生物技术中心(ABC)的国际保藏机构实验室间细胞采集(Interlab Cell Line Collection(ICLC))请求相应的杂交瘤(Clone No.ICLC 03001)来获得。
基于美国专利申请第2014/0193431 A1号中公开的VH和VL序列合成编码B7抗体可变区的cDNA。如上所述，将获得的DNA片段与小鼠恒定IgG1/λ域融合，并产生为二价单克隆抗体。
DO-24和DN-30抗体获得自意大利诺瓦拉大学的玛丽亚普拉特教授(他首先鉴定并表征了DO-24和DN-30；Prat等人，分子和细胞生物学，11期，5954-5962页，1991年；Prat等人，细胞科学学报，111期，237-247页，1998年(Prat et al.，Mol Cell Biol.11，5954-5962，1991；Prat et al.，J Cell Sci.111，237-247，1998))。现已停产的DO-24抗体商购自Upstate Biotechnology多年。DN-30抗体还可通过向意大利热那亚的高级生物技术中心(ABC)的国际保藏机构实验室间细胞采集(Interlab Cell Line Collection(ICLC))请求相应的杂交瘤(Clone No.ICLC PD 05006)来获得。
因为绝大多数人疾病的动物模型使用小鼠作为宿主，与小鼠抗原的交叉反应性是抗体的必要先决条件，其生物活性需要在临床前系统中得到验证。由于现有技术的所有抗体都是在小鼠中产生的(除了使用人幼稚噬菌体文库鉴定的B7外)，这些分子不太可能与小鼠MET发生交叉反应。即使与自身抗原的微小交叉反应原则上是可能的，这些相互作用也通常具有非常低的亲和力。
如美国专利第6,099,841号中所详述，3D6抗体不结合小鼠MET，并且发明人必须使用雪貂和水貂来证明它们的抗体具有体内活性。很明显，这些动物模型既不代表用于模拟人疾病的理想系统，它们在临床前医学中的用途也没有建立。此外，该发明人未提供与人系统和雪貂或水貂系统之间的抗体亲和力和活性差异有关的任何定量数据。
明确显示出5D5抗体及其衍生物不结合小鼠MET(Merchant等人，美国国家科学院院刊，110期，E2987-2996页，2013年(Merchant et al.，Proc Natl Acad Sci USA 110，E2987-2996，2013))。没有关于其与其他临床前物种的交叉反应性的信息。
同样，美国专利申请第2014/0193431 A1号没有提供关于B7抗体与小鼠MET或其他物种MET的交叉反应性的信息。
美国专利第7,556,804 B2号声称NO-23抗体与小鼠、大鼠和狗MET交叉反应，但没有提供定量实验证据来支持该声明。该发明人使用单一饱和剂量的NO-23从小鼠、大鼠、人或狗细胞的裂解液中免疫沉淀MET，然后将免疫沉淀的蛋白质与放射性32P-ATP一起孵育。在放射性标记后，通过放射自显影来使掺入的32P-ATP可视化。这种方法非常敏感并且绝不是定量的；不可能知道凝胶上的带对应的交叉反应性的百分比是多少。
类似地，建议DO-24抗体与小鼠MET交叉反应，因为含有DO-24的基质胶颗粒在植入小鼠腹腔时促进血管募集(Prat等人，细胞科学学报，111期，237-247页，1998年(Prat etal.，J Cell Sci.111，237-247，1998))。然而，这也可能是由于炎症增加和没有提供DO-24与小鼠MET相互作用的直接证据。在另一项不同的研究中，显示单一饱和剂量的DO-24(20nM)引起大鼠心肌细胞系H9c2和小鼠心肌细胞系HL-5中MET的自磷酸化(Pietronave等人，美国生理学杂志-心脏和循环生理学，298期，H1155-65页，2010年(Pietronave et al.，Am J Physiol Heart Circ Physiol.298，H1155-65，2010；图1))。在相同的实验中，显示低得多的剂量的重组HGF(0.5nM)导致MET磷酸化至相当的程度。正如作者自己在讨论部分中所承认的，这些结果表明DO-24在这些啮齿动物细胞系中的效力明显低于HGF。由于同一作者声称DO-24是与人细胞模型中的HGF活性匹配的完全激动性mAb(Prat等人，细胞科学学报，111期，237-247页，1998年(Prat et al.，J Cell Sci.111，237-247，1998))，因此应该得出DO-24在人和小鼠细胞中不引起相同的功效或效力的结论。此外，应注意到：Pietronave等人所示的实验不是定量的并且不能用于提取DO-24与小鼠或大鼠MET之间发生的交叉反应程度的信息，其测量需要进行如我们所完成的头对头剂量反应研究(见下文)。在第三项工作中，使用DO-24和DN-30抗体的混合物从小鼠间充质干细胞裂解液中免疫沉淀MET(Forte等人，干细胞，24期，23-33页，2006年(Forte et al.，Stem Cells.24，23-33，2006))。DN-30的存在和检测类型(从细胞裂解液中免疫沉淀)都阻止获得关于DO-24与天然小鼠MET相互作用的能力的精确信息。总之，没有任何实验证据证明DO-24抗体在人和小鼠细胞中引起相当的生物响应。
最后，明确显示出DN-30抗体不与小鼠MET相互作用(Prat等人，细胞科学学报，111期，237-247页，1998年(Prat et al.，J Cell Sci.111，237-247，1998)；和Petrelli等人，美国国家科学院院刊，103期，5090-9095页，2006年(Petrelli et al.，Proc Natl AcadSci USA 103，5090-9095，2006)的补充材料)。
为了直接确定现有技术的激动性抗MET抗体是否与小鼠MET交叉反应以及以何种程度与小鼠MET交叉反应，并且为了将它们与我们的人/小鼠等价的抗MET抗体进行比较，我们进行了ELISA检测。由于所有现有技术的抗体均以小鼠IgG/λ形式获得或工程化，因此我们使用71G3、71D6和71G2的小鼠IgG/λ形式。将人或小鼠MET ECD固定在固相(100ng/孔，96孔板)中，并暴露于溶液中递增浓度(0-40nM)的抗体。结合通过使用HRP缀合的抗小鼠Fc抗体(Jackson免疫研究实验室(Jackson Immuno Research Laboratories))进行揭示。如表21所示，该分析揭示了；虽然现有技术的抗体以0.059nM(B7)至4.935nM(3D6)的Kd与人MET结合，但它们即使在高达40nM的浓度下也均未表现出对小鼠MET的任何亲和力。在测试的抗体中，只有71G3、71D6和71G2与人和小鼠MET结合，并且它们具有难以区分的亲和力和容量。所有抗体的完整结合曲线如图6所示。
表21：通过ELISA测定的人和小鼠MET的抗MET抗体的结合亲和力和容量。亲和力以EC50(nMol/L)表示。容量以EMAX(450nm处的光密度；n.c.，未收敛)表示。对于整个结合曲线，请参见图6。
实施例13：与现有技术的抗体比较：MET自磷酸化
为了比较现有技术的抗体的激动活性与人/小鼠等价抗MET抗体的激动活性，我们使用人和小鼠细胞进行MET自磷酸化实验。对A549人肺癌细胞和MLP29小鼠肝脏前体细胞进行剥夺血清生长因子48小时，然后用递增浓度(0-25nM)的抗体进行刺激。在刺激15分钟后，用冰冷的磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞两次，然后进行所述的裂解(Longati等人，癌基因，9期，49-57页，1994年(Longati et al.，Oncogene 9，49-57，1994))。如上所述(Basilico等人，临床调查杂志，124期，3172-3186页，2014年(Basilico et al.，J ClinInvest.124，3172-3186，2014))，通过用于捕获的抗MET抗体(R&D Systems)和用于揭示的抗磷酸化酪氨酸(R&D Systems)的ELISA来测定磷酸化-MET水平。
该分析揭示了：现有技术的抗体与本文件中描述的人/小鼠等价抗MET抗体之间的两个主要差异。首先，与结合实验中获得的结果一致，仅71G3、71D6和71G2可促进人和小鼠细胞中的MET自磷酸化。现有技术的抗体(包括DO-24和NO-23)仅在人细胞中诱导MET活化；而在我们分析的系统中没有检测到对小鼠细胞的活性。其次，与71G3、71D6和71G2相比，所有现有技术的抗体总是表现出较低的激动活性。最具激动性的现有技术mAb是5D5和B7，其表现出略低于71G3、71D6和71G2的活性。最不具激动性的现有技术mAb是3D6。其他分子表现出中间活性。该分析的结果示于图7中。
实施例14：与现有技术的抗体的比较：分枝化形态发生
为了比较现有技术的抗体的生物活性与人/小鼠等价的抗MET抗体的生物活性，我们进行了分枝化形态发生检测。该检测概括了HGF的所有相关生物活性，包括细胞增殖、分散、分化和存活。如上所述，将LOC人肾上皮细胞和MLP29小鼠肝前体细胞接种于胶原层，然后与递增浓度的mAb或重组HGF(人或小鼠，均来自R&D Systems)一起孵育。随着时间的推移通过显微镜观察分枝化形态发生，并在5天后对菌落拍照。分枝化形态发生活性的定量通过对从每个球状体中发芽的分枝小管的数量进行计数来实现，并示于表22。球状体的代表性图像示于图8(LOC细胞)和图9(MLP29细胞)。
表22：分枝化形态发生检测。将LOC人肾上皮细胞或MLP29小鼠肝前体细胞的细胞球状体制剂接种于胶原层，然后与递增浓度(0、0.04、0.2、1和5nM)的mAb或重组人HGF(LOC)或小鼠HGF(MLP29)一起孵育。随着时间的推移通过显微镜观察分枝化形态发生，并在5天后对菌落拍照。通过计算每个球状体(主要分枝加上次要分枝)的分枝数量来量化分枝。
LOC细胞
mAb 0nM 0.04nM 0.2nM 1nM 5nM
71G3 2.7±0.6 9.0±1.0 13.3±1.5 17.7±1.5 20.7±1.2
71D6 2.3±0.6 18.7±3.2 29.3±2.5 30.7±2.1 30.3±1.2
71G2 2.7±1.5 22.3±2.3 26.3±2.1 30.0±2.0 30.3±3.5
3D6 2.3±0.6 4.0±1.0 7.0±1.0 10.7±1.5 19.3±4.2
5D5 4.3±1.5 15.7±1.5 18.3±1.5 21.3±2.1 27.7±1.5
B7 3.3±1.5 8.7±1.5 13.3±1.5 19.7±1.5 24.0±2.0
NO-23 3.3±1.2 6.0±1.0 7.0±1.0 8.7±1.2 8.7±1.5
DO-24 3.3±2.1 8.0±1.0 12.0±1.0 12.3±1.2 17.7±2.1
DN-30 3.3±0.6 6.3±1.5 8.3±1.5 9.7±1.5 10.3±1.5
hHGF 4.7±1.5 10.7±1.5 16.7±1.5 28.3±3.5 24.7±7.6
MLP29细胞
mAb 0nM 0.04nM 0.2nM 1nM 5nM
71G3 0.3±0.6 19.3±1.5 23.7±2.1 32.7±2.5 28.7±1.2
71D6 0.7±0.6 21.0±2.0 32.0±1.0 42.7±5.5 37.0±2.0
71G2 0.0±0.0 15.0±1.7 36.0±4.6 50.7±5.5 48.0±3.6
3D6 0.3±0.6 0.7±0.6 0.7±0.6 0.7±0.6 0.7±0.6
5D5 1.0±1.0 0.7±1.2 0.3±0.6 1.3±1.5 1.0±1.0
B7 0.3±0.6 0.7±0.6 0.3±0.6 1.3±1.5 0.7±1.2
NO-23 0.7±1.2 0.3±0.6 0.7±0.6 1.0±1.0 0.7±0.6
DO-24 1.0±1.0 0.7±1.2 0.7±0.6 0.7±1.2 0.7±1.2
DN-30 0.7±0.6 0.3±0.6 1.0±1.0 0.7±0.6 0.7±0.6
mHGF 0.3±0.6 26.0±4.4 34.0±5.0 46.0±2.6 37.0±2.0
所示的数据导致以下观察结果。在人细胞中，71D6、71G2和5D5表现出与人HGF相当的活性；71G3、3D6、B7和DO-24表现为部分激动剂；NO-23和DN-30表现出非常少的激动活性。在小鼠细胞中，只有71G3、71D6和71G2有效诱导分枝化小管的形成；所有其他抗体，与它们在ELISA中不能结合小鼠MET一致，根本不诱导分枝化形态发生。
我们得出结论：与人/小鼠等价抗MET抗体相比，现有技术的抗体在人和小鼠系统中引发不同的生物活性。
实施例15：人/小鼠等价的抗MET抗体的血浆半衰期
接下来，我们将选定的人/鼠等价的抗MET抗体转移到体内研究中。作为初步分析，我们确定了它们在小鼠中的高峰和低谷水平。为此，我们通过腹腔注射将亲和纯化的71G3、71D6和71G2(以其小鼠IgG/λ形式)注射到7周龄雌性BALB/c小鼠(Charles River)中。注射1mg/kg或10mg/kg的单次推注，并且在注射后3、6、12和24小时从尾静脉采集血液样品。对血液样品进行处理并且通过ELISA测定血浆中的抗体浓度。如实施例1中所述，用人METECD(100ng/孔)包被标准96孔板，然后暴露于递增稀释的小鼠血浆以捕获抗MET抗体。在用PBS反复洗涤后，使用HRP缀合的驴抗小鼠抗体(Jackson Laboratories)揭示抗MET抗体的存在。为了定量结合的抗体，我们在相同条件下建立纯化的71G3、71D6和71G2的标准曲线。
该分析的结果示于图10中。血浆中的抗体浓度对于所有测试的抗体是相似的，并且与注射的蛋白质的量成正比。在24小时后，血浆中的抗体浓度对于1mg/kg推注为约15nM，并且对于10mg/kg推注为250nM。考虑到这些抗体在最苛刻的检测(分枝化形态发生检测)中的激动活性在5nM或更低的浓度下达到饱和，我们可安全地得出结论：通过腹腔注射获得的抗体的血浆水平从生物学观点来看是与低至1mg/kg的推注相关。
此外，我们还计算了注射抗体的血浆半衰期。这是通过将抗体浓度转换为自然对数(Ln)、将数据拟合成一条线然后计算线的斜率来实现的。该分析导致估计71G3、71D6和71G2的半衰期非常相似，并且对于1mg/kg推注对应约3天并且对于10mg/kg推注为约9天。这是与已报道其在啮齿动物中具有2.4分钟的半衰期的重组HGF(Ido等人，肝病学研究，30期，175-181页，2004年(Ido et al.，Hepatol Res.30，175-181，2004))相比显著更高的稳定性。整组的血浆稳定性数据总结在表23中。
这些数据表明：在需要全身给药HGF的所有临床应用中，人/鼠等价的抗MET抗体可有利地代替重组HGF。
表23：人/小鼠等价抗体的血浆稳定性。通过腹腔注射将亲和纯化的71G3、71D6和71G2的单次推注(1mg/kg或10mg/kg)给药至7周龄雌性BALB/c小鼠。在注射3、6、12和24小时后，从尾静脉采集血液样品，并通过ELISA测定血浆中的抗体浓度。通过线性拟合抗体浓度的自然对数转换来计算血浆半衰期。
实施例16：体内活性：保护急性肝损伤
肝细胞表达MET并且是HGF的主要靶标，HGF促进它们增殖并保护它们免于细胞凋亡(由Nakamura等人，胃肠病学和肝脏病学杂志，188-202页，2011年综述(Nakamura etal.，J Gastroenterol Hepatol.1，188-202，2011))。因此，我们测试了人/小鼠等价的激动性抗MET抗体是否在急性肝衰竭的小鼠模型中表现出保护活性。为此，我们将单剂量的CCl4(0.2ml的橄榄油中10％溶液；均来自Sigma-Aldrich)注射到7周龄雌性BALB/c小鼠(Charles River)的皮下区室中。在CCl4注射后不久，将小鼠随机分成4大组，每大组6只小鼠，每只小鼠接受纯化的71G3、71D6、71G2或仅载体(PBS)的单次推注。抗体通过腹腔注射剂量为5mg/kg进行给药。在注射后的不同时间(0、12、24和48小时)采集血液样品。另外的第五对照大组包含6只小鼠，其未接受CCl4或抗体并且在实验结束时被处死。在尸检时，收集血液和肝脏进行分析。肝标志物天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)和胆红素(BIL)的血浆水平通过标准临床生化方法进行测定。将肝脏包埋在石蜡中并使用标准方案对其进行处理用于组织学分析。
如图11所示，对照小鼠中的CCl4注射引起所分析的所有三种血液参数的水平的快速且显著的增加，这种增加在中毒12-24小时后达到峰值。在对照大组中，CCl4注射引起AST、ALT和胆红素水平分别升高286、761和13倍。在所有抗体大组中，这些增加显著降低(71G3，53％、62％和46％；71D6，37％、34％和48％；71G2，50％、39％和54％)。就肝脏保护而言，最有效的抗体是71D6。
在尸检时肝脏的组织学检查揭示了：CCl4在每个肝脏模块的中央静脉周围引起显著的组织损伤，其特征在于嗜酸性染色和大的细胞质，典型为患病肝细胞。细胞-细胞相互作用显得松散，从而允许浸润从受损血管中渗出的红细胞。在抗体处理的大组中，这些中心周围受损区较小并且表现出较少的耐受迹象，这可以通过较少的嗜酸性染色、正常的细胞质大小和降低的血细胞浸润来证明。用苏木精和伊红染色的肝脏切片的代表性图像示于图12。
这些结果表明：人/小鼠等价的激动性抗MET抗体可用于临床以治疗急性肝脏疾病，急性肝脏疾病的特征在于肝功能障碍发展迅速，通常导致肝脏生化值异常、黄疸、凝血功能障碍、脑水肿和脑病。这些病理状况包括但不限于：对乙酰氨基酚过量、对药物(例如四环素)的特异性反应、药物滥用(摇头丸、可卡因)、病毒感染(甲型肝炎、乙型肝炎、戊型肝炎)。
实施例17：体内活性：保护慢性肝损伤
我们还测试了人/小鼠等价激动性抗MET抗体是否在慢性肝损伤的小鼠模型中表现出治疗效果。事实上，已知HGF在肝脏中具有抗纤维化活性(由Matsumoto和Nakamura，汽巴基金会研讨会，212期，198-211页；讨论211-214页，1997年(Matsumoto and Nakamura，Ciba Found Symp.212，198-211；discussion 211-214，1997)所综述)。为此，将7周龄雌性BALB/c小鼠(Charles River)长期暴露于CCl4数周。第一周，用0.1ml的CCl4在橄榄油中的5％溶液(均来自Sigma-Aldrich)皮下注射小鼠两次。接下来的几周，CCl4的剂量增加(0.1ml在橄榄油中的10％溶液)，同时注射频率保持不变(每周两次)。在第一次注射后不久，将小鼠随机分成4大组，每大组7只小鼠，其接受分别用纯化的71G3、71D6、71G2或仅载体(PBS)进行的处理。抗体通过每周三次腹腔注射剂量为1mg/kg进行给药。另外的第五对照大组包含7只小鼠，其未接受CCl4或抗体并且用作健康对照。在慢性CCl4中毒6周后处死小鼠。在尸检时，收集血液和肝脏进行分析。肝标志物天冬氨酸转氨酶(AST)和丙氨酸氨基转移酶(ALT)的血浆水平通过标准临床生化方法进行测定。将肝脏包埋在石蜡中并使用标准方案对其进行处理用于组织学分析。
如图13所示，通过较高的AST和ALT血浆水平确定了，对照小鼠长期暴露于CCl4导致肝功能受损。与引起肝脏标志物水平急剧但短暂爆发的急性模型相反，慢性CCl4中毒诱导AST和ALT水平的更温和增加，与未治疗小鼠相比约为5倍。值得注意的是，抗体治疗可完全阻止AST浓度的增加，实际上将其降低至低于基础水平。抗体也可显著预防ALT水平的爆发，尽管不像对于AST观察到的那样惊人。
通过旨在检测纤维化组织的各种技术(包括Masson三色染色、Picro天狼星红和抗α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)抗体)对肝脏切片进行染色。还进行苏木精和伊红染色以检查一般组织学结构。该分析揭示了：慢性CCl4处理导致在小叶间空间中形成显著量的纤维化组织，特别是其特征在于对Picro天狼星红和抗α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)抗体染色呈阳性。纤维化组织形成一种连接门静脉三联体的“带状物”，从而证明肝脏单元的六边形形状。值得注意的是，接受CCl4和激动性抗MET抗体的动物来源的肝脏切片表现出在染色强度方面更轻微的纤维化，并且纤维化区似乎局限于门静脉周围空间。用Picro天狼星红和抗α-SMA抗体染色的肝脏切片的代表性图像分别示于图14和图15。
这些数据表明，人/小鼠等价的激动性抗MET抗体可用于临床以治疗与慢性肝损伤相关的病理状况，其特征在于肝实质的进行性破坏和再生以及导致肝硬化和纤维化。激动性抗MET抗体可用于减少或预防纤维化，从而使肝脏结构和功能恢复。它们还可用于抑制炎症和免疫反应，从而通常加重慢性肝病。
实施例18：体内活性：保护急性肾损伤
肾上皮细胞表达显著水平的MET并且对HGF刺激非常敏感(由Mizuno等人，前生物科学，13期，7072-7086页，2008年(Mizuno et al.Front Biosci.13，7072-7086，2008)所综述)。因此，我们测试了人/小鼠等价的激动性抗MET抗体是否在急性肾衰竭的小鼠模型中表现出保护作用。为此，我们通过腹腔注射单次推注的HgCl2(3mg/kg)来诱导7周龄雌性BALB/c小鼠(Charles River)的肾小管损伤。在HgCl2中毒后不久，将小鼠随机分成4个大组，其经受用71G3、71D6、71G2或仅载体(PBS)进行的处理。抗体通过每24小时剂量为10mg/kg的腹腔注射进行施用。每个大组包含6只小鼠，其在注射HgCl272小时后被处死。在尸检时，收集血液和肾脏进行分析。血尿素氮(BUN)和肌酸酐(CRE)血浆水平通过标准临床生化方法进行测定。使用标准方案处理肾脏用于组织学分析。
如图16所示，HgCl2注射到对照小鼠中引起BUN和CRE水平的急剧增加。在对照大组中，BUN和CRE分别增加了6倍和12倍。在所有抗体大组中，这些增加显著降低(分别为：71G3，52％和54％；71D6，39％和30％；71G2，45％和44％)。就肾脏保护而言，最有效的抗体是71D6。
肾脏的组织学检查揭示了：HgCl2引起广泛的肾小管损伤，其特征在于近端小管扩张、萎缩和坏死。肾小球结构塌陷并且从周围基质中脱离，从而基本上增加了肾小球周围空间。在抗体处理的大组中，近端小管细胞坏死较少，并且肾小球的组织学结构看起来完整。用苏木精和伊红染色的肾脏切片的代表性图像示于图17。
我们建议：人/小鼠等价的激动性抗MET抗体可用于临床以治疗与急性肾衰竭相关的病理状况，其可能是由例如缺血性或肾毒性损伤、低血容量性休克、尿液收集系统阻塞、动脉粥样硬化、败血症、糖尿病、自身免疫性疾病或横纹肌溶解症引起的。激动性抗MET抗体可用于预防或逆转急性肾衰竭，保护肾小管上皮细胞免于细胞凋亡，加速上皮细胞再生并且恢复肾功能。
实施例19：体内活性：在溃疡性结肠炎的小鼠模型中保护急性结肠损伤、减少炎症 和促进再生
众所周知，肠上皮细胞表达MET，并且HGF在胃肠道的内稳态和再生中起关键作用(Nakamura等人，胃肠病学和肝脏病学杂志，188-202页，2011年(Nakamura et al.，JGastroenterol Hepatol.1，188-202，2011))。因此，我们测试了人/小鼠等价的激动性抗MET抗体是否可在溃疡性结肠炎的小鼠模型中促进肠保护和再生。为此，我们将7周龄雌性BALB/c小鼠(Charles River)暴露于饮用水中的葡聚糖硫酸钠(DSS)10天。在第10天，中断DSS治疗并将小鼠放回正常水中。从第1天开始，将小鼠随机分成7个大组，每个大组7只小鼠，接受用71G3、71D6、71G2(剂量为1mg/kg或5mg/kg)或仅载体(PBS)进行的处理。抗体通过每周三次腹腔注射进行施用。另外的第八对照大组包含7只小鼠，其未接受DSS或抗体并且用作健康对照。在第12天，即，在中断DSS给药后2天，处死小鼠。在尸检时，对结肠进行收集、洗净，并用尺子测定它们的长度。在测量后，将结肠包埋在石蜡中并对其进行处理，用于组织学分析。
在整个实验过程中，定期监测小鼠体重，并通过测定粪便血液、直肠出血和粪便稠度来评估溃疡性结肠炎的临床症状。通过使用在临床前模型中使用的标准评分系统(Kim人，可视化实验杂志，60期，pii：3678页，2012年(Kim et al.，J Vis Exp.60，pii：3678，2012))来实现定量：每个参数评分为从0(没有症状)到3(症状的最大表现)。将相对于单个参数的评分相加在一起以产生0至9的疾病活动指数(DAI)。
如图18所示，在PBS大组中暴露于DSS导致体重损失高达25％；DAI升至4分或更高；并且结肠的长度降低了多达40％。值得注意的是，所有分析的抗体都以剂量依赖的方式逆转了这些作用，从而在测试的较低剂量下已表现出显著的活性。71D6是最有效的抗体：在短暂下降后，它使体重恢复到正常值，与PBS组中观察到的相当；它抑制了DAI的增加，从而大大抑制了所有的临床症状；并且它防止结肠短小，从而将其限制在微不足道的变化范围内。
结肠切片用苏木精和伊红进行染色，并通过显微镜进行检查。如图19所示，DSS给药对结肠粘膜造成严重损伤。上皮层出现了侵蚀并被淋巴细胞浸润。结肠粘膜被隐蔽性脓肿部位散布，并被导致组织破坏的泡沫巨噬细胞严重定植。周围内脏淋巴结出现了肿大。粘液腺的特征在于萎缩并表现出明显的粘液消耗，其被炎性浸润物(包括泡沫状巨噬细胞、淋巴细胞和中性粒细胞)取代。若干溃疡明显受到粒细胞或巨噬细胞渗出物的侵袭，从而导致腺体成分完全消失。值得注意的是，用DSS和激动性抗MET抗体处理的小鼠表现出更轻微的变性和炎症症状。具体而言，不存在急性炎症的成分，包括巨噬细胞和粒细胞；粘膜仅出现轻微损伤，表现为稀疏的腺体扭曲和稀疏；粘蛋白分泌得到恢复，并且完全没有糜烂和溃疡。虽然这些保护作用在所有抗体组中都是剂量依赖性的，但它们在1mg/kg时已经很明显，这表明用该剂量达到的抗体浓度非常接近饱和(参见实施例15中的血浆稳定性)。在该模型中，最有效的抗体似乎是71D6。
实施例20：体内活性：在炎症性肠病的小鼠模型中保护急性结肠损伤、减少炎症和 免疫抑制
在上述结果的推动下，我们还测试了激动性抗MET抗体是否在炎症性肠病的更特异性小鼠模型中表现出治疗效果。为此，我们通过直肠注射溶解在乙醇中的2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)在7周龄雌性C57BL/6小鼠(Charles River)中诱导急性结肠损伤。已知TNBS/乙醇组合通过免疫和侵蚀过程诱导结肠直肠炎症(由Jones-Hall和Grisham，病理生理学，21期，267-288页，2014年(Jones-Hall and Grisham，Pathophysiology 21，267-288，2014)所综述)。溶解于50％乙醇中的TNBS以5mg/小鼠的剂量通过灌肠进行给药。在TNBS给药后不久，将小鼠随机分成4大组，每大组6只小鼠，接受用纯化的71G3、71D6、71G2或仅载体(PBS)进行的处理。抗体每隔一天通过腹腔注射剂量为1mg/kg进行给药。另外的第五对照大组包含6只小鼠，其未接受TNBS或抗体并且用作健康对照。每日监测小鼠体重。在TNBS给药后5天处死小鼠。如上所述，在尸检时，收集并测量结肠。在测量后，将结肠包埋在石蜡中并对其进行处理，用于组织学分析。
如图20所示，暴露于TNBS导致了体重减轻约15％并且结肠长度减少超过20％。尽管与由DSS引起的效果相比更温和，但这些效果与在所有抗体大组中观察到的效果显著不同。事实上，用71G3、71D6和71G2进行的处理几乎完全抑制TNBS诱导的体重减轻和结肠缩短，从而使抗体处理的动物几乎不能与健康对照小鼠区分开。
结肠切片用苏木精和伊红进行染色，并通过显微镜进行检查。如图21所示，TNBS给药引起淋巴细胞性结肠炎的典型症状的发作，该典型症状的特征在于周围内脏淋巴结增大、出现粘膜下层和粘膜中的淋巴细胞聚集，以及淋巴细胞浸润增加。几种全深度溃疡是可见的，其与基质过度增殖以及淋巴细胞和中性粒细胞浸润有关。所有这些病理过程在激动性抗MET抗体大组中被强烈抑制，表现出减少的淋巴细胞浸润和减少的粘膜损伤。即使存在淋巴细胞，它们也不会与粘液损伤或上皮损伤相关。
这些结果和先前实施例中报道的数据表明：人/小鼠等价激动性抗MET抗体可用于临床以治疗与溃疡性结肠炎相关的病理状况或更通常与炎性肠病相关的病理状况。用激动性抗MET抗体进行的处理可减少肠损伤、促进上皮细胞增殖并减少炎性细胞浸润，从而改善疾病的临床过程。
实施例21：体内活性：在I型糖尿病小鼠模型中促进葡萄糖摄取和与胰岛素的协同
据报道，HGF在培养的小鼠骨骼肌细胞中促进胰岛素依赖性葡萄糖摄取(Perdomo等人，生物化学杂志，283期，13700-13706页，2008年(Perdomo et al.，J Biol Chem.283，13700-13706，2008))。因此，我们测试了我们的激动性抗MET抗体是否可降低I型糖尿病小鼠模型的高血糖水平。为此，我们通过腹腔注射链脲霉素(STZ；Sigma Aldrich)来诱导7周龄雌性BALB/c小鼠(Charles River)的胰腺β-细胞变性。STZ以每天40mg/kg的剂量注射，连续5天。在最后一次注射后一周，使用标准葡萄糖条(GIMA)来测定禁食条件下的血糖水平。此时，STZ处理的小鼠表现出与未治疗的小鼠相比两倍的平均基础血糖(240mg/dL对120mg/dL)。将小鼠随机分成4个大组，每大组7只小鼠，每只小鼠基于基础血糖分别接受纯化的71G3、71D6、71G2或仅载体(PBS)进行的处理。抗体通过每周两次腹腔注射剂量为1mg/kg进行给药。另外的第五对照大组包含7只小鼠，其未接受STZ或抗体并且用作健康对照。随时监测禁食条件下的血糖浓度，持续5周。在第5周结束时，我们进行了葡萄糖耐量测试(GTT)和胰岛素耐量测试(ITT)。GTT包括通过口服灌胃向禁食动物给药葡萄糖，然后在不同时间点测量血糖水平。ITT包括通过腹腔注射或静脉注射向部分禁食动物给药胰岛素，然后在不同时间点测量血糖水平。
如图22A所示，STZ处理的小鼠的基础血糖水平在整个实验期间持续增加。这是由于慢性胰腺炎症，其逐渐加重器官损伤。相反，抗体处理的动物表现出稳定降低的血糖水平，该稳定降低的血糖水平在治疗的第二周后最终达到平台期。抗体给药没有使血糖完全正常化，但使其降低了高达25％，因此使其在STZ处理的小鼠和对照小鼠中观察到的水平之间的大约一半。考虑到在该模型中高血糖症是由于缺乏β细胞来源的胰岛素，我们想知道抗体大组中较低的葡萄糖水平是否是由于胰岛素水平增加。然而，对血液样品的ELISA检测揭示出情况并非如此(未显示)。在GTT中，接受抗体治疗的小鼠虽然从较低的血糖水平开始，但未能表现出正常的葡萄糖摄取曲线(图22B)。相反，抗体处理的小鼠确实在ITT中表现出对胰岛素更快的响应(图22C)。在胰岛素注射15分钟后，经历慢性抗体治疗的小鼠的葡萄糖血液水平相对于时间零下降至约30-40％，这显著低于在STZ处理的小鼠和对照动物中观察到的水平(图22D)。这些结果表明：在没有胰岛素的情况下，激动性抗MET抗体促进葡萄糖摄取。他们还提出：激动性抗MET抗体和胰岛素在两者都存在时协同调节葡萄糖摄取。
在使用小鼠骨骼肌细胞的基于细胞的测定中测试该假设。根据提供者的推荐，诱导C2C12小鼠成肌细胞(获得自美国模式组织物集存库(American Tissue TypeCollection))分化成肌细胞，然后与人/小鼠等价激动性抗MET抗体(71G3、71D6、71G2)一起孵育。在24小时后，将抗体处理的细胞分成3大组，经历在荧光葡萄糖类似物2-(N-7-硝基-2，1，3-苯并恶二唑-4-氨基)-2-脱氧-D-葡萄糖(2-NBDG；Life Technologies)的存在下用0nM、100nM或1000nM人重组胰岛素(Sigma Aldrich)进行的急性刺激1小时。2-NBDG摄取通过流式细胞术进行测定。
如图23所示，71G3、71D6和71G2以剂量依赖性方式促进葡萄糖摄取。与单独的胰岛素和单独的抗体相比，胰岛素和激动性抗MET抗体的组合产生了协同效应并且促进了更高的葡萄糖摄取。这些数据与在培养细胞中调节葡萄糖代谢的HGF和胰岛素协同中的发现一致(Fafalios等人，自然医学，17期，1577-1584页，2011年(Fafalios et al.Nat Med.17，1577-1584，2011))，并且证实了我们的假设，即，激动性抗MET抗体能够增强胰岛素非依赖性和依赖性葡萄糖摄取。
实施例22：体内活动：在II型糖尿病小鼠模型中血糖水平正常化和克服胰岛素抵 抗
在观察到人/小鼠等价激动性抗MET抗体可与胰岛素协同促进葡萄糖摄取的推动下，我们在II型糖尿病小鼠模型中测试了它们的治疗潜力。II型糖尿病的特征在于高血糖水平、高胰岛素血症和胰岛素抵抗。II型糖尿病最具特征的小鼠模型之一是db/db小鼠，一种在瘦蛋白受体基因lepr中带有点突变的C57BLKS/J菌株。该突变导致饱腹感丧失并因此导致无限摄食，从而导致肥胖和上述II型糖尿病临床标志(由王等人，目前的糖尿病综述，10期，131-145页，2014年(Wang et al.Curr Diabetes Rev.10，131-145，2014)所综述)。
雌性db/db小鼠在7周龄时从Charles River(JAXTM Mice Strain BKS.Cg-Dock7m+/+LeprdbJ)获得。一周后，将小鼠随机分成4大组，每大组5只小鼠，接受分别用纯化的71G3、71D6、71G2或仅载体(PBS)进行的处理。抗体通过每周两次腹腔注射剂量为1mg/kg进行给药。每14天监测禁食条件下的血糖浓度，持续8周。在治疗7周后，即在小鼠为15周龄时，进行葡萄糖耐量测试(GTT)和胰岛素耐量测试(ITT)。
如图24所示，PBS大组中的平均基础血糖浓度在随机化时约为230mg/dL，这绝对对应于糖尿病患者的水平。这些值倾向于随时间增加，并且在实验结束时(即8周后)PBS大组中的平均血糖浓度约为330mg/dL。相反，在接受抗体处理的大组中，禁食条件下的基础血糖随时间不断下降。在实验结束时，71G3、71D6和71G2大组的平均血糖浓度分别为173mg/dL、138mg/dL和165mg/dL。
在治疗7周后，即在小鼠为15周龄时，我们测试了它们对葡萄糖和胰岛素攻击的急性响应。应记住，这些小鼠与用STZ处理的小鼠(参见实施例21)相比是高胰岛素血症并且显示高血糖水平，因为它们是胰岛素抵抗的。事实上，当在GTT中用葡萄糖攻击时，PBS大组的小鼠未能表现出正常的葡萄糖摄取曲线。所有小鼠显示出血糖急剧增加，其在整个测试期间仍然升高。对称地，当进行ITT时，相同的小鼠显示出对胰岛素的反常响应，从而表现出葡萄糖水平的轻微且短暂的增加。至少在临床前模型中，这种反常响应是胰岛素抵抗的标志。
抗体大组的小鼠虽然从较低的基础水平开始，但在GTT中也未表现出正常的葡萄糖摄取曲线，因此表明激动性抗MET抗体不能中和血糖水平的急性爆发。然而，值得注意的是，抗体治疗确实显著改善了ITT中对胰岛素的响应，从而逆转了在PBS大组中观察到的反常效应并且使得ITT曲线看起来更类似于非糖尿病小鼠(C57BLKS/J；Charles Rivet)所显示的。我们得出结论：使用激动性抗MET抗体的长期治疗改善了db/db小鼠的II型糖尿病，并且部分克服胰岛素抵抗。
基于这些结果和前面实施例中提供的结果，我们建议人/小鼠等价的激动性抗MET抗体可用于临床以治疗与高血糖水平相关的病理状况。这些可包括：I型糖尿病、II型糖尿病或其他以高葡萄糖和/或胰岛素抵抗为特征的糖尿病样病症(例如代谢综合征)。
实施例23：体内活性：非酒精性脂肪性肝炎小鼠模型中的脂肪肝改善
已经显示出，肝脏中MET的靶向基因缺失导致小鼠中严重的非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的发病(Kroy等人，肝病学杂志，61期，883-890页，2014年(Kroy et al.JHepatol.61，883-890，2014))。在一项独立研究(Kosone等人，美国生理学杂志-胃肠道和肝脏生理学，293期，G204-210页，2007年(Kosone et al.，Am J Physiol GastrointestLiver Physiol.293，G204-210，2007))中，HGF通过活化微粒体甘油三酯转运蛋白(MTP)和载脂蛋白B(ApoB)来改善小鼠中高脂饮食诱导的脂肪肝，从而最大限度地减少脂肪酸的储存。
高胰岛素db/db小鼠也广泛用作NASH的模型，更通常用于脂肪肝疾病的模型。在正常饮食中，这些小鼠在其肝细胞中积累了大量的脂质，从而导致肝脏脂肪变性、纤维化和慢性肝衰竭。通过将小鼠置于高脂肪饮食可进一步加剧这种情况(由Anstee与Goldin，国际实验病理学杂志，87期，1-16页，2006年(Anstee and Goldin，Int J Exp Pathol.87，1-16，2006)所综述)。
在上述观察和考虑的推动下，我们测试了人/小鼠等价的激动性抗MET抗体是否能够改善正常饮食中db/db小鼠的中度肝脂肪变性。为此，我们获得了如上所述的雌性db/db小鼠。当动物为8周龄时，将它们随机分成4大组，每大组6只小鼠，接受分别用纯化的71G3、71D6、71G2或仅载体(PBS)进行的处理。抗体通过每周两次腹腔注射剂量为1mg/kg进行给药。在处理8周后，处死小鼠并对其进行尸检。提取肝脏，将其包埋在石蜡中并处理用于组织学检查。收集血液用于分析肝功能标志物。
肝脏切片用苏木精和伊红或Picro天狼星红进行染色以突出纤维化。如图25所示，来自PBS大组的肝脏表现出明显的脂肪变性，通常集中在中央静脉周围。肝细胞显著扩大并富含脂质。脂肪肝细胞与正常肝细胞混合在一起，并且脂肪变性占据中心周围空间的高达60％。相反，来自抗体处理的动物的肝脏含有显著较少的脂肪细胞，并且总体看起来非常正常。如图26所示，Picro天狼星红染色证实了：PBS组中有中度的门周纤维化，其特征在于肝三联体(门静脉、肝动脉和胆管)周围的基质层增厚，有时扩展到小叶间隙。值得注意的是，来自所有抗体大组的肝脏切片表现出低得多的纤维化(如果有的话)。对血浆中肝功能标志物AST和ALT的分析证实了这些观察结果(参见图27)。事实上，用激动性抗MET抗体治疗的动物表现出异常低的AST和ALT血浆浓度，其比PBS组低约2.5倍并且比正常小鼠的平均AST和ALT水平低2倍。
这些数据表明：人/小鼠等价的激动性抗MET抗体可用于临床以治疗NASH或与脂肪肝相关的其他病理状况。激动性抗MET抗体可用于抑制肝细胞中的脂质积累、预防或逆转肝细胞增多症，并抑制脂肪酸积聚和巨噬细胞浸润之间发生的恶性循环。慢性炎症总是导致细胞外基质的沉积。因此，激动性抗MET抗体也可用于减少脂肪变性相关的纤维化。
实施例24：体内活动：糖尿病小鼠的伤口愈合
临床相关的糖尿病并发症表现为溃疡增加和伤口愈合受损。由于HGF与伤口愈合有关(Nakamura等人，胃肠病学和肝脏病学杂志，1，188-202页，2011年(Nakamura et al.，JGastroenterol Hepatol.1，188-202，2011))，我们试图确定人/小鼠等价的抗MET抗体是否可促进糖尿病背景中伤口的愈合。为此，我们获得了如上所述的db/db糖尿病小鼠。在8周龄时，我们对动物进行麻醉，然后使用圆形穿孔刀片在右后侧切割0.8cm宽的圆形伤口进行皮肤活检(GIMA)。移除整个表皮层。在手术后第二天，将小鼠随机分成4大组，接受用纯化的71G3、71D6和71G2或仅用载体(PBS)进行的处理。抗体每隔一天通过腹腔注射剂量为5mg/kg进行递送。每天使用卡尺测量伤口直径。
如图28所示，抗体治疗显著加速伤口闭合和再上皮化。当对照大组以每天平均5％的速率修复实验伤口时，这个值在71G3大组中增加到8％，在71D6大组中增加到12％，并且在71G2大组中增加到11％。
我们建议：人/小鼠等价的激动性抗MET抗体可用于临床以治疗糖尿病相关的溃疡和通常表现出愈合受损的伤口。糖尿病相关的溃疡代表了未满足的医疗需求。在美国，糖尿病是非创伤性下肢截肢的主要原因。激动性抗MET抗体可用于加速愈合、改善再上皮化并促进高血糖诱导的溃疡的血管形成。
实施例25：与褐家鼠(Rattus norvegicus)和食蟹猴(Macaca fascicularis)MET 的交叉反应性
由于绝大多数人疾病的动物模型使用小鼠作为宿主，与小鼠抗原的交叉反应性是抗体的先决条件，其需要在临床前系统中得到验证。这是促使我们识别人-小鼠等价的抗MET抗体的基本原理。然而，一些临床前程序(例如器官移植和需要复杂外科手术的其他实验实践)优选在较大的啮齿动物或灵长类动物中进行。此外，药效学和药代动力学研究优选在高等脊椎动物(通常是大鼠和猴子)中进行。最后也是最重要的是，治疗性抗体的毒理学评价理想地在猴子中进行；或者，如果这是不可能的，则在两种不同的啮齿动物物种中进行。因此，与大鼠和猴子的交叉反应性也是理想期望的。
为此，我们研究了我们的人/小鼠等价的抗MET抗体是否与来自其他物种(包括褐家鼠(Rattus norvegicus)和食蟹猴(Macaca fascicularis))发生MET交叉反应。通过标准蛋白质工程技术获得大鼠MET ECD(NCBI#NP_113705.1；第1-931位aa)和猴MET ECD(NCBI#XP_005550635.2；第1-948位aa)。人和小鼠MET ECD被用作对照。选择代表SEMA结合物(71D6、71C3、71D4、71A3、71G2)和PSI结合物(76H10、71G3)的限制性抗体组。5D5现有技术的抗体被用作对照。将MET ECD蛋白质固定在固相(100ng/孔，96孔板)中，并暴露于溶液中递增浓度(0-40nM)的抗体(具有人恒定区)。结合通过使用HRP缀合的抗人Fc抗体(Jackson免疫研究实验室(Immuno Research Laboratories))进行揭示。如图29所示，测试的所有人/小鼠等价的抗体以相似的亲和力和容量结合人、小鼠、大鼠和猴MET，而5D5仅结合人和猿MET。我们得出结论：至少如通过ELISA所测定，71D6、71C3、71D4、71A3、71G2、76H10和71G3抗体以相似的亲和力和容量结合人MET、小鼠MET、大鼠MET和猿MET。
实施例26：精细表位定位
为了精细定位人/小鼠等价的抗MET抗体识别的MET表位，我们采用以下策略。我们推断：如果在大羊驼中产生并针对人MET的抗体与小鼠MET发生交叉反应，那么这种抗体可能识别出在智人(H.sapiens)和小家鼠(M.musculus)保守但在智人、小家鼠和大羊驼(L.glama)中不保守的残基。同样的推断可扩展到褐家鼠(R.norvegicus)和食蟹猴(M.fascicularis)。
为了沿着这条线进行研究，我们比对并比较了人(UniProtKB#P08581；第1-932位aa)、小鼠(UniProtKB#P16056.1；第1-931位aa)、大鼠(NCBI#NP_113705.1；第1-931位aa)、食蟹猴(NCBI#XP_005550635.2；第1-948位aa)和大羊驼MET(GenBank#KF042853.1；第1-931位aa)彼此之间的氨基酸序列(图30)。参考表12，我们将注意力集中在负责结合71D6、71C3、71D4、71A3和71G2抗体(人MET的第314-372位aa)和结合76H10和71G3抗体(人MET的第546-562位aa)的MET区内。在人MET的前面区域(第314-372位aa)内，存在在人和小鼠MET中保守但在大羊驼MET中不保守的5个残基(Ala 327、Ser 336、Phe 343、Ile 367、Asp 372)。在图30中，这些氨基酸用黑框和渐进数字1-5进行表示。其中，4个残基(Ala 327、Ser 336、Ile367、Asp 372)在大鼠和食蟹猴MET中也是保守的。在人MET的后面区域(第546-562位aa)内，存在在人和小鼠MET中保守但在大羊驼MET中不保守的三个残基(Arg 547、Ser 553、Thr555)。在图30中，这些氨基酸用黑框和渐进数字6-8进行表示。其中，两个残基(Ser 553和Thr 555)在大鼠和食蟹猴MET中也是保守的。
使用人MET作为模板，我们以不同的排列诱变这些残基中的每一个，从而产生一系列除了特定残基(大羊驼)之外全人的MET突变体。突变体的示意图示于图31。接下来，我们通过ELISA测试了所选择的SEMA结合mAb(71D6、71C3、71D4、71A3、71G2)和PSI结合mAb(76H10和71G3)对这些MET突变体的亲和力。为此，将各种MET蛋白固定在固相(100ng/孔，96孔板)中，然后暴露于递增浓度的抗体(0-50nM)溶液。由于使用的抗体是其人恒定区形式，因此使用HRP缀合的抗人Fc二抗(Jackson Immuno Research Laboratories)揭示结合。野生型人MET用作阳性对照。该分析的结果列于表24。
表24：负责激动性抗体结合的MET的表位代表在智人、小家鼠、褐家鼠、食蟹猴中保守但在相同物种和大羊驼之间不保守的残基。通过ELISA来测试在人、小鼠、大鼠、食蟹猴中保守单在大羊驼MET中不保守的残基与结合激动性mAb的相关性。将野生型(WT)或突变型(MT)人MET ECD固定在固相中，并暴露于溶液中递增浓度的mAb。使用抗人Fc二抗揭示结合。将所有结合值归一化为WT蛋白，并表示为与WT MET相比的结合百分数(EMAX)。每个突变体(A-L)含有至少2个突变(1-8)，如图31所示。
上面给出的结果提供了结合我们的激动性抗体的相关残基的明确且清晰的图像。
所有测试的SEMA结合物(71D6、71C3、71D4、71A3、71G2)似乎结合相同表位，其含有位于SEMA β-螺旋桨的叶片5内的2个在人、小鼠、食蟹猴和大鼠MET中保守但在大羊驼MET中不保守的关键氨基酸：Ile 367和Asp 372。事实上，Ala 327、Ser 336或Phe 343的突变根本不影响结合；Ile 367的突变使结合部分受损；Ile 367和Asp 372的突变完全消除了结合。我们得出结论：人MET的Ile 367和Asp 372对于结合所测试的SEMA定向抗体而言是至关重要的。这三个残基在图30中用“S”(对于SEMA)表示。
另外，测试的PSI结合物(76H10、71G3)似乎结合相同的表位。然而，与SEMA表位相反，PSI表位仅含有一个也在人、小鼠、食蟹猴和大鼠MET中保守但在大羊驼MET中不保守的关键氨基酸：Thr 555。事实上，Arg 547或Ser 553的突变根本不影响结合，而Thr 555的突变完全消除了结合。我们得出结论：Thr 555代表了对于测试的PSI定向抗体结合而言至关重要的决定因素。该残基在图30中用“P”(对于PSI)表示。
实施例27：人/小鼠等价激动抗体的独特性
实施例26中呈现的精细表位定位结果提供了分子详细的证明，即，本发明提供的激动性抗体具有任何现有技术分子所不具有的独特特征。通过执行以下分析可最好地理解这种独特性。
对于实施例12-14中讨论的大多数现有技术的抗体，不存在关于它们在MET上识别的精确表位的可用信息。然而，我们知道这些表位必须与我们的抗体识别的表位不同，因为现有技术的分子都没有与小鼠MET交叉反应。这种多样性的一个有启发性的实例由5D5/Onartuzumab提供，它是现有技术中唯一的注释有关于其与MET相互作用的详细分子信息的抗MET抗体。5D5/Onartuzumab识别位于SEMA β-螺旋桨的叶片5内的4种不同残基，非常接近负责与我们的SEMA结合抗体相互作用的氨基酸(Merchant等人，美国国家科学院院刊，110期，E2987-2996页，2013年(Merchant et al.，Proc Natl Acad Sci USA 110，E2987-2996，2013))。在图30中用“O”(对于Onartuzumab)表示的这些残基对应于Gln 328、Arg 331、Leu337和Asn 338。
值得注意的是，这些残基在智人和小家鼠之间都不是保守的。这与使用小鼠作为宿主产生5D5/Onartuzumab的概念完全一致，并解释了为什么它不与小鼠MET交叉反应(Merchant等人(见上文)，以及我们在图6和图29中列出的数据)。此外，这些残基中没有一个在智人和褐家鼠之间是保守的，但它们在智人和食蟹猴之间都是保守的。这解释了为什么5D5/Onartuzumab不结合大鼠MET，但它确实结合食蟹猴MET(图29)。
与5D5/Onartuzumab和本文讨论的所有其他现有技术分子相反，我们的人/小鼠等价的抗体通过使用大羊驼作为宿主来产生，并且明确筛选它们与人和小鼠MET交叉反应的能力。由于在智人和小家鼠之间保守但在智人、小家鼠和大羊驼中不保守的少数氨基酸中的大多数(图30中的黑框中所示)也在褐家鼠和小家鼠中保守，机会确定了所选抗体也与大鼠和猴子交叉反应。
总之，免疫策略和筛选设计都使得本发明的抗体是独特的。一方面，用于免疫的物种(大羊驼(L.glama))与智人、小家鼠、褐家鼠和食蟹猴相距足够远，从而保证与来自其他物种的MET相比大羊驼MET的氨基酸序列中存在足够的错配(见图30)。这些错配是至关重要的，因为免疫的宿主不能产生针对其识别为“自身”的表位的抗体。另一方面，人/小鼠双重筛选方案迫使选择那些识别在这两个物种之间保守的表位的抗体。该步骤也是必要的，因为在没有两种物种淘选的情况下，人们只需简单地选择最具代表性的抗体或表现出更高的亲和力的抗体，但不一定是交叉反应性的抗体。引入这两个标准(第五个物种和′双浸′方案)使我们能够鉴定具有新的独特特征的抗体。
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Claims (60)

1.一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段以高亲和力结合人MET蛋白(hMET)并且以高亲和力结合小鼠MET蛋白(mMET)，其中，所述抗体或其抗原结合片段是hMET激动剂和mMET激动剂。
2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段包含至少一个重链可变域(VH)和至少一个轻链可变域(VL)，其中，当所述VH和VL域作为Fab片段进行测试时，所述VH和VL对hMET表现出1×10-3s-1至1×10-2s-1、任选地1×10-3s-1至6×10-3s-1的解离速率(通过Biacore测得的k解离)，并且对mMET表现出1×10-3s-1至1×10-2s-1、任选地1×10-3s-1至6×10-3s-1的解离速率(通过Biacore测得的k解离)。
3.根据权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段对hMET和mMET具有等价的亲和力。
4.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段诱导hMET的磷酸化，并且诱导mMET的磷酸化。
5.根据权利要求4所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或抗原结合片段以小于3.0nM、任选地小于2.0nM的EC50(通过磷酸化MET ELISA测得)诱导hMET的磷酸化，并且以小于3.0nM、任选地小于2.0nM的EC50(通过磷酸化MET ELISA测得)诱导mMET的磷酸化。
6.根据权利要求4或5所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段等价地诱导hMET和mMET的磷酸化。
7.根据权利要求4至6所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段对hMET表现出高的磷酸化效力，并且对mMET表现出高的磷酸化效力。
8.根据权利要求7所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段以小于1nM的EC50和/或至少80％的Emax(以磷酸化MET ELISA中HGF诱导激活的百分比表示)诱导hMET的磷酸化，并且以小于1nM的EC50和/或至少80％的Emax(以磷酸化MET ELISA中HGF诱导激活的百分比表示)诱导mMET的磷酸化。
9.根据权利要求1至6所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段对hMET表现出低的磷酸化效力，并且对mMET表现出低的磷酸化效力。
10.根据权利要求9所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段以1nM～5nM的EC50和/或60～80％的Emax(以磷酸化MET ELISA中HGF诱导激活的百分比表示)诱导hMET的磷酸化，并且以1nM～5nM的EC50和/或60～80％的Emax(以磷酸化MET ELISA中HGF诱导激活的百分比表示)诱导mMET的磷酸化。
11.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段在与人细胞接触时诱导HGF样细胞应答，并且在与小鼠细胞接触时诱导HGF样细胞应答。
12.根据权利要求11所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段在与人细胞接触时和在与小鼠细胞接触时完全诱导HGF样细胞应答。
13.根据权利要求11或12所述的抗体或其抗原结合片段，其中，HGF样细胞应答的完全诱导在出现以下中的一者、任何两者或全部情况时是可测量的：
(i)在细胞分散检测中，当所述抗体或其抗原结合片段的浓度为0.1～1.0nM时，所述抗体或其抗原结合片段诱导与最大HGF诱导的分散相当的细胞分散；
(ii)在抗凋亡细胞检测中，所述抗体或其抗原结合片段表现出EC50小于HGF的EC50的1.1倍，和/或Emax(以非凋亡对照细胞的总ATP含量的％来测量)大于对HGF观察到的Emax的90％；和/或
(iii)在分枝化形态发生检测中，用所述抗体处理的细胞表现出每个由相同(非零)浓度的HGF诱导的球状体大于90％的分枝数。
14.根据权利要求11所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段在与人细胞接触时和在与小鼠细胞接触时部分诱导HGF样细胞应答。
15.根据权利要求14所述的抗体或其抗原结合片段，其中，HGF样细胞应答的部分诱导在出现以下(i)-(iii)的情况时是可测量的：
(i)在细胞分散检测中，当所述抗体的浓度为1nM或更低时，所述抗体或其抗原结合片段诱导的细胞分散是由0.1nM同源HGF诱导的细胞分散的至少25％；
(ii)在抗凋亡细胞检测中，所述抗体或其抗原结合片段表现出EC50不大于HGF的EC50的7.0倍，和/或Emax细胞存活率为对HGF观察到的Emax细胞存活率的至少50％；和/或
(iii)在分枝化形态发生检测中，用所述抗体处理的细胞表现出每个由相同(非零)浓度的HGF诱导的球状体至少25％的分枝数；
并且所述抗体或抗原结合片段不完全诱导HGF样细胞应答。
16.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段是HGF竞争剂。
17.根据权利要求16所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段以不大于5nM的IC50和/或至少50％的Imax与hHGF竞争结合hMET，并且以不大于5nM的IC50和/或至少50％的Imax与mHGF竞争结合mMET。
18.根据权利要求16或17所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段与hHGF和mHGF等价地竞争。
19.根据权利要求16至18中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段是完全HGF竞争剂。
20.根据权利要求19所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段以小于2nM的IC50和/或大于90％的Imax与hHGF竞争，并且以小于2nM的IC50和/或大于90％的Imax与mHGF竞争。
21.根据权利要求16至18所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段是部分HGF竞争剂。
22.根据权利要求21所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段以2～5nM的IC50和/或50％～90％的Imax与hHGF竞争，并且以2～5nM的IC50和/或50％～90％的Imax与mHGF竞争。
23.一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段识别位于人MET的第123位氨基酸残基至第223位残基、人MET的第224位氨基酸残基至第311位残基、人MET的第314位残基至第372位残基或者人MET的第546位残基至第562位残基的区域中的人MET的表位。
24.一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段识别MET的胞外域中的表位，所述MET的胞外域包括在人和小鼠MET中保守的一个或多个氨基酸。
25.一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段识别人MET的表位，所述人MET的表位包括人MET的氨基酸残基Ile367和/或Asp372，任选地其中，所述表位位于人MET的第314位氨基酸残基至第372位残基的区域中。
26.一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段识别人MET的表位，所述人MET的表位包括人MET的氨基酸残基Thr555，任选地其中，所述表位位于人MET的第546位氨基酸残基至第562位残基的区域中。
27.一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变域和轻链可变域，所述重链可变域包括H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3，所述轻链可变域包括L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3，其中：
H-CDR1包含选自SEQ ID NO：2、9、16、23、30、37、44、51、58、65和72的氨基酸序列；
H-CDR2包含选自SEQ ID NO：4、11、18、25、32、39、46、53、60、67和74的氨基酸序列；
H-CDR3包含选自SEQ ID NO：6、13、20、27、34、41、48、55、62、69和76的氨基酸序列；
L-CDR1包含选自SEQ ID NO：79、86、93、100、107、114、121、128、135、142和149的氨基酸序列；
L-CDR2包含选自SEQ ID NO：81、88、95、102、109、116、123、130、137、144和151的氨基酸序列；并且
L-CDR3包含选自SEQ ID NO：83、90、97、104、111、118、125、132、139、146和153的氨基酸序列。
28.根据权利要求23至27中任一项所述的抗体，其是根据权利要求1至22中任一项所述的抗体或抗原结合片段。
29.[71G2]一种抗体或抗原结合片段，其包含重链可变域和轻链可变域，所述重链可变域包括H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3，所述轻链可变域包括L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3，其中：
H-CDR1包含SEQ ID NO：44所示的氨基酸序列；
H-CDR2包含SEQ ID NO：46所示的氨基酸序列；
H-CDR3包含SEQ ID NO：48所示的氨基酸序列；
L-CDR1包含SEQ ID NO：121所示的氨基酸序列；
L-CDR2包含SEQ ID NO：123所示的氨基酸序列；并且
L-CDR3包含SEQ ID NO：125所示的氨基酸序列。
30.[71G2]根据权利要求23所述的抗体或抗原结合片段，其中，所述重链可变域包含SEQ ID NO：167的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：167的氨基酸序列至少90％、95％、97％或99％同一性的序列；并且所述轻链可变域包含SEQ ID NO：168的氨基酸序列，或与SEQ IDNO：168的氨基酸序列至少90％、95％、97％或99％同一性的序列。
31.根据权利要求29或30所述的抗体或抗原结合片段，其是根据权利要求1至22中任一项所述的抗体或抗原结合片段。
32.[71D6]一种抗体或抗原结合片段，其包含重链可变域和轻链可变域，所述重链可变域包括H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3，所述轻链可变域包括L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3，其中：
H-CDR1包含SEQ ID NO：30所示的氨基酸序列；
H-CDR2包含SEQ ID NO：32所示的氨基酸序列；
H-CDR3包含SEQ ID NO：34所示的氨基酸序列；
L-CDR1包含SEQ ID NO：107所示的氨基酸序列；
L-CDR2包含SEQ ID NO：109所示的氨基酸序列；并且
L-CDR3包含SEQ ID NO：111所示的氨基酸序列。
33.[71D6]根据权利要求25所述的抗体或抗原结合片段，其中，所述重链可变域包含SEQ ID NO：163的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：163的氨基酸序列至少90％、95％、97％或99％同一性的序列；并且所述轻链可变域包含SEQ ID NO：164的氨基酸序列，或与SEQ IDNO：164的氨基酸序列至少90％、95％、97％或99％同一性的序列。
34.根据权利要求32或33所述的抗体或抗原结合片段，其是根据权利要求1至22中任一项所述的抗体或抗原结合片段。
35.[71G3]一种抗体或抗原结合片段，其包含重链可变域和轻链可变域，所述重链可变域包括H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3，所述轻链可变域包括L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3，其中：
H-CDR1包含SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列；
H-CDR2包含SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列；
H-CDR3包含SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列；
L-CDR1包含SEQ ID NO：86所示的氨基酸序列；
L-CDR2包含SEQ ID NO：88所示的氨基酸序列；并且
L-CDR3包含SEQ ID NO：90所示的氨基酸序列。
36.[71G3]根据权利要求27所述的抗体或抗原结合片段，其中，所述重链可变域包含SEQ ID NO：157的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：157的氨基酸序列至少90％、95％、97％或99％同一性的序列；并且所述轻链可变域包含SEQ ID NO：158的氨基酸序列，或与SEQ IDNO：158的氨基酸序列至少90％、95％、97％或99％同一性的序列。
37.根据权利要求35或36所述的抗体或抗原结合片段，其是根据权利要求1至22中任一项所述的抗体或抗原结合片段。
38.一种根据权利要求1至37中任一项所述的抗体或抗原结合片段的亲和变体或人种系变体。
39.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其含有人IgG的铰链区、CH2域和/或CH3域，任选地IgG1的铰链区、CH2域和/或CH3域。
40.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其包含具有与人IgG、优选IgG1至少90％、95％、97％或99％同一性的序列的CH2和/或CH3域，任选地其中，所述CH2和/或CH3域已被修饰以降低或基本消除一种或多种抗体效应功能。
41.根据前述权利要求中任一项的抗体或抗原结合片段，其中，所述VH和/或VL域或者一个或多个CDR衍生自骆驼科动物。
42.根据权利要求41所述的抗体或抗原结合片段，其中，所述动物是大羊驼。
43.一种分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸编码根据权利要求1至42中任一项所述的抗体或抗原结合片段。
44.一种表达载体，所述表达载体包含与调节序列可操作地连接的根据权利要求43所述的多核苷酸，所述调节序列允许所述抗体或其抗原结合片段在宿主细胞或无细胞表达系统中表达。
45.一种宿主细胞或无细胞表达系统，所述宿主细胞或无细胞表达系统含有根据权利要求43所述的表达载体。
46.一种生产重组抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括在允许表达所述抗体或抗原结合片段的条件下培养根据权利要求45所述的宿主细胞或无细胞表达系统并且回收表达的抗体或抗原结合片段。
47.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1至42中任一项所述的抗体或抗原结合片段和至少一种药学上可接受的载体或赋形剂。
48.根据权利要求1至42中任一项所述的抗体或抗原结合片段或根据权利要求47所述的药物组合物在治疗中的应用。
49.一种治疗或预防人患者肝损伤的方法，所述肝损伤任选为急性肝损伤或慢性肝损伤，所述方法包括向有需要的患者给药治疗有效量的MET激动剂抗体。
50.根据权利要求49所述的方法，其中，所述MET激动剂抗体是根据权利要求1至42中任一项所述的抗体或抗原结合片段。
51.一种治疗或预防人患者肾损伤的方法，所述肾损伤任选为急性肾损伤，所述方法包括向有需要的患者给药治疗有效量的MET激动剂抗体。
52.根据权利要求51所述的方法，其中，所述MET激动剂抗体是根据权利要求1至42中任一项所述的抗体或抗原结合片段。
53.一种治疗或预防人患者炎性肠病的方法，所述炎性肠病任选为溃疡性结肠炎，所述方法包括向有需要的患者给药治疗有效量的MET激动剂抗体。
54.根据权利要求53所述的方法，其中，所述MET激动剂抗体是根据权利要求1至42中任一项所述的抗体或抗原结合片段。
55.一种治疗或预防人患者糖尿病的方法，所述糖尿病任选为I型糖尿病或II型糖尿病，所述方法包括向有需要的患者给药治疗有效量的MET激动剂抗体。
56.根据权利要求55所述的方法，其中，所述MET激动剂抗体是根据权利要求1至42中任一项所述的抗体或抗原结合片段。
57.一种治疗或预防人患者非酒精性脂肪性肝炎的方法，所述方法包括向有需要的患者给药治疗有效量的MET激动剂抗体。
58.根据权利要求57所述的方法，其中，所述MET激动剂抗体是根据权利要求1至42中任一项所述的抗体或抗原结合片段。
59.一种治疗或促进人患者伤口愈合的方法，所述人患者任选为患有糖尿病的患者，所述方法包括向有需要的患者给药治疗有效量的MET激动剂抗体。
60.根据权利要求59所述的方法，其中，所述MET激动剂抗体是根据权利要求1至42中任一项所述的抗体或抗原结合片段。
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