CN108377651A - 染色体互相作用的检测 - Google Patents

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Abstract

确定与伴随诊断相关的表观遗传染色体相互作用的方法。

Description

染色体互相作用的检测
技术领域
本发明涉及检测染色体相互作用。
背景技术
医疗保健成本在不断上升，因此需要使用现有的药来更有效地治疗人。
发明内容
发明人已经研究了使用表观遗传染色体相互作用作为伴随诊断(companiondiagnostics)的基础或者与伴随诊断结合使用，特别是用于检测表观遗传状态以确定对治疗(例如药物治疗)、对疾病/病症的倾向和/或监测残留疾病的响应性。发明人的工作显示了表观遗传相互作用在多种条件下所起的作用，并提供了用于鉴定相关染色体相互作用的方法。本发明包括基于观察存在于个体亚群(subgroup)中的染色体相互作用来鉴定相关染色体相互作用的方法。本发明还包括使用鉴定的染色体相互作用作为伴随诊断检验的基础。
因此，本发明的第一方面提供了确定与区分亚群的伴随诊断相关的表观遗传染色体相互作用的方法，包括使来自亚群的第一组核酸与代表染色体相互作用的索引群体的第二组核酸接触，以及允许互补序列杂交，其中第一组核酸和第二组核酸中的核酸代表了连接产物(ligated product)，所述连接产物包含来自已经在表观遗传染色体相互作用中聚在一起的两个染色体区域的序列，并且其中第一组核酸和第二组核酸之间的杂交模式允许确定哪些表观遗传染色体相互作用对群体中的亚群是特异性的，其中亚群在与伴随诊断相关的特征方面不同。
优选地，在本发明的第一方面(和/或任何其他方面)中：
-亚群是一种或某种动物(例如哺乳动物或线虫蠕虫)群体中的亚群，最优选是一种或某种人类群体中的亚群；和/或
-第一组核酸来自至少8个个体；和/或
-第一组核酸来自第一亚群的至少4个个体和来自优选与第一亚群不重叠的第二亚群的至少4个个体，和/或
-第二组核酸代表未选择的染色体相互作用组；和/或
-第二组核酸在限定的位置与阵列结合；和/或
-第二组核酸代表在最少100个不同基因或位点(locus，基因座，座位)中的染色体相互作用；和/或
-第二组核酸包含代表至少1000种不同的表观遗传染色体相互作用的至少1000个不同的核酸；和/或
-第一组核酸和第二组核酸包含长度为10个至100个核苷酸碱基的核酸序列；和/或
-进行该方法以确定哪个位点或基因与所述与伴随诊断相关的特征相关；
和/或
-亚群在以下方面不同：
(i)响应于特定的治疗和/或预防(特别是响应于特定的药物治疗和/或预防)，和/或
(ii)对特定病症的易感性，和/或
(iii)可能导致复发的残留疾病的存在；
和/或
-第一组核酸在包括以下步骤的方法中产生：
(i)已经在染色体相互作用中聚在一起的染色体区域的体外交联；
(ii)用酶对所述交联的DNA进行限制性消化切割；以及
(iii)连接所述交联的切割的DNA末端以形成第一组核酸(特别地包含所连接的DNA)；
和/或
-所述与同伴诊断相关的特征是：
(i)类风湿性关节炎患者中对甲氨蝶呤(或对另一种类风湿性关节炎药物)的响应性，和/或
(ii)对急性骨髓性白血病治疗的响应性，和/或
(iii)黑色素瘤复发的可能性。
优选地，在本发明的第一方面和/或其他方面中，特征“……第一组核酸和第二组核酸中的核酸代表了连接产物，所述连接产物包含来自已经在表观遗传染色体相互作用中聚在一起的两个染色体区域的序列……”可以包括或可以是：“……第一组核酸和第二组核酸中的核酸是一种或多种连接产物(优选为一种或多种连接的核酸，更优选为连接的DNA)的形式，所述连接产物包含来自已经在表观遗传染色体相互作用中聚在一起的两个染色体区域的序列”。
本发明的第二方面提供了伴随诊断测定方法，其选择具有与治疗和/或预防(特别是药物治疗和/或预防)相关的特征的亚群，所述方法包括：
(a)把位点已通过上述方法鉴定为对亚群具有表观遗传相互作用特征的位点归类，和/或
(b)检测至少5种表观遗传染色体相互作用的存在或不存在，所述至少5种表观遗传染色体相互作用优选地在至少5个不同的位点上，其是以下各项的特征：
i.响应于特定的治疗和/或预防(特别是特定的药物治疗和/或预防)，和/或
ii.对特定病症的易感性，和/或
iii.可能导致复发的残留疾病的存在。
优选地，在本发明的第二方面(和/或任何其他方面)中：
-该方法包括如本发明第二方面限定的步骤(a)，其中：
(1)所述位点是基因，和/或
(2)把单核苷酸多态性(SNP)归类，和/或
(3)从该位点表达微RNA(miRNA)，和/或
(4)从该位点表达非编码RNA(ncRNA)，和/或
(5)该位点表达编码至少10个连续氨基酸残基的核酸序列，和/或
(6)该位点表达调控元件，和/或
(7)所述归类(typing)包括测序或确定来自该位点的表达水平；
和/或
-该方法包括如本发明的第二方面限定的步骤(b)，其中：
-把5种至500种、优选20种至300种、更优选50种至100种表观遗传学染色体相互作用归类，所述表观遗传学染色体相互作用优选在至少5个不同的位点；和/或
-检测5种至500种、优选20种至300种、更优选50种至100种表观遗传染色体相互作用的存在或不存在，所述表观遗传学染色体相互作用优选在至少5个不同的位点。
本发明的第二方面(和/或任何其他方面)的其他优选或特定特征或者本发明的第二方面(和/或任何其他方面)中的其他优选或特定特征包括以下：
本发明第二方面的伴随诊断测定方法可以特别用于检测本文提及的任何特定的病症或特征的存在。
优选地，本发明的第二方面的伴随诊断方法被用于检测：
-类风湿关节炎患者中对甲氨蝶呤(或另一种类风湿性关节炎药物)的响应性，
-对急性髓细胞性白血病(AML)患者的治疗的响应性，
-黑色素瘤复发的可能性，
-发展前列腺癌和/或侵袭性前列腺癌的可能性，和/或
-发展和/或具有对神经变性疾病或病症的易感性的可能性，优选痴呆诸如阿尔茨海默病、轻度认知障碍，血管性痴呆、路易体痴呆、额颞叶痴呆，或更优选阿尔茨海默病，最优选β淀粉样蛋白聚集体诱导的阿尔茨海默病，和/或
-痴呆患者(优选阿尔茨海默病患者，更优选具有β淀粉样蛋白聚集体的阿尔茨海默病患者)与没有阿尔茨海默病的认知障碍患者之间特别是关于记忆和/或认知的一种或多种比较；
在所有情况下优选在人类中。
优选地，在本发明的第二方面和在所有其他方面，疾病或病症(特别是在人类中)包括：
-炎性疾病，优选类风湿性关节炎；特别是在人类中；
-血液癌症，优选急性骨髓性白血病(AML)；特别是在人类中；
-实体癌症/实体肿瘤，优选黑色素瘤、前列腺癌和/或侵袭性前列腺癌；特别是在人类中；和/或
-神经退行性疾病或病症，优选痴呆诸如阿尔茨海默病、轻度认知障碍、血管性痴呆、路易体痴呆、额颞叶痴呆，或更优选阿尔茨海默病，诸如β-淀粉样蛋白聚集体诱导的阿尔茨海默病；特别是在人类中，和/或
-对免疫疗法(诸如抗体疗法，优选抗PD1疗法)的响应性。
在一种实施方案中，在以下任何癌症中，优选地具有指出的阶段或类别中和/或优选地具有其他指出的特征(诸如病毒感染)的癌症中检测到对疗法(优选抗PD1疗法)的响应性：
-DLBCL_ABC：弥漫性大B细胞淋巴瘤亚型活化的B细胞
-DLBCL_GBC：弥漫性大B细胞淋巴瘤亚型生发中心B细胞
-HCC：肝细胞癌
-HCC_HEPB：具有乙型肝炎病毒的肝细胞癌
-HCC_HEPC：具有丙型肝炎病毒的肝细胞癌
-HEPB+R：在缓解的乙型肝炎
-Pca_Class3：3期前列腺癌
-Pca_Class2：2期前列腺癌
-Pca_Class1：1期前列腺癌
-BrCa_Stg4：4期乳腺癌
-BrCa_Stg3B：3B期乳腺癌
-BrCa_Stg2A：2A期乳腺癌
-BrCa_Stg2B：2B期乳腺癌
-BrCa_Stg1A：1A期乳腺癌
-BrCa_Stg1：1期乳腺癌。
病症或特征可以是：
-多发性硬化症患者中对IFN-B(IFN-β)治疗的响应性，和/或
-对复发-缓解型多发性硬化症的易感性，和/或
-原发进展型多发性硬化症(primary progressive multiple sclerosis)的可能性，和/或
-对肌萎缩侧索硬化(ALS)疾病状态(特别是在人类中)的易感性，和/或
-对快速进展的肌萎缩侧索硬化(ALS)疾病状态的易感性，和/或
-对侵袭性2型糖尿病疾病状态的易感性，和/或
-对2型糖尿病疾病状态的易感性，和/或
-对2型糖尿病前期状态的易感性，和/或
-对1型糖尿病疾病状态的易感性，和/或
-对系统性红斑狼疮(SLE)疾病状态的易感性，和/或
-对溃疡性结肠炎疾病状态的易感性，和/或
-溃疡性结肠炎患者结肠直肠癌复发的可能性，和/或
-神经纤维瘤病患者的恶性周围神经鞘瘤的可能性，和/或
-发展前列腺癌和/或侵袭性前列腺癌的可能性。
本发明的第三方面提供用于治疗和/或预防个体(特别是在人类个体中)的病症的治疗剂(特别是药物治疗剂)，其中所述个体已通过本发明第二方面的方法鉴定为需要所述治疗剂。本发明的第三方面还提供了治疗剂(例如药物治疗剂)在制备用于治疗和/或预防个体中(特别是在人类个体中)的病症的药剂(特别是包含治疗剂的药物组合物)中的用途，其中所述个体已通过本发明第二方面的方法鉴定为需要所述治疗剂。本发明的第三方面还提供了治疗和/或预防个体中(特别是在人类个体和/或有相应需要的个体中)的病症的方法，包括向个体施用治疗剂(例如药物治疗剂和/或有效量的治疗剂)，其中所述个体已通过本发明第二方面的方法鉴定为需要所述治疗剂。
优选地，在本发明的第三方面(和/或其他方面)中，治疗剂(特别是药物治疗剂)包含：
-适合用于治疗和/或预防炎性疾病的药物活性剂(例如化合物或生物学/生物制剂，诸如蛋白质或抗体)；特别是在人类中；
-优选适合用于治疗和/或预防类风湿性关节炎(RA)的药物活性剂(例如化合物或生物学/生物制剂，诸如蛋白质或抗体)；特别是在人类中；其中优选药物活性剂包含甲氨蝶呤；羟氯喹；柳氮磺胺吡啶；来氟米特；TNF-α(肿瘤坏死因子α)抑制剂，特别是单克隆抗体TNF-α抑制剂，诸如英夫利昔单抗、阿达木单抗、塞妥珠单抗或戈利木单抗，或循环受体融合蛋白TNF-α抑制剂，诸如依那西普；或T细胞共刺激抑制剂诸如阿巴西普；或白介素1(IL-1)抑制剂诸如阿那白滞素；或针对B细胞的单克隆抗体诸如利妥昔单抗或托珠单抗；
或者
-适合用于治疗和/或预防血液癌症(优选急性骨髓性白血病(AML))的药物活性剂(例如化合物或生物学/生物制剂，诸如蛋白质或抗体)；特别是在人类中；或者
-适合用于治疗和/或预防实体癌症/实体瘤(优选黑色素瘤、前列腺癌和/或侵袭性前列腺癌)的药物活性剂(例如化合物或生物学/生物制剂，诸如蛋白质或抗体)；特别是在人类中；或者
-适合用于治疗和/或预防神经退行性疾病或病症的药物活性剂(例如化合物或生物学/生物制剂，诸如蛋白质或抗体)，优选痴呆(诸如阿尔茨海默病、轻度认知障碍、血管性痴呆、路易体痴呆、额颞叶痴呆)，或更优选阿尔茨海默病，诸如β-淀粉状蛋白聚集体诱导的阿尔茨海默病；特别是在人类中。
本发明的第四方面提供了鉴定能够将个体的疾病状态从第一状态变为第二状态的剂的方法，包括确定候选剂是否能够将染色体相互作用从对应于第一状态的那些染色体互相作用变为对应于第二状态的染色体相互作用，其中优选第一状态和第二状态对应于以下的存在或不存在：
(i)对特定治疗和/或预防(特别是特定药物治疗和/或预防)的响应性，和/或
(ii)对特定病症的易感性，和/或
(iii)可能导致复发的残留疾病。
本发明的第五方面提供了确定药物效果的方法，包括检测由药物引起的表观遗传染色体相互作用的变化，其中所述效果优选为药物的作用机制或者为药物的药效学特性，并且其中所述染色体相互作用优选地对以下是特异性的：
(i)对特定治疗和/或预防(特别是对特定药物治疗和/或预防)的响应性，和/或
(ii)对特定病症的易感性，和/或
(iii)可能导致复发的残留疾病。
另外地或可替换地，根据本发明所有方面的优选实施方案，本发明不涉及确定受试者(例如哺乳动物诸如人受试者)对类风湿性关节炎的特定疗法(特别是特定药物疗法)的响应性的方法，包括检测存在或不存在5种或更多种(特别是7种或更多种，或者10种或更多种，或者15种或更多种，或者20种或更多种)染色体相互作用；其中所述染色体相互作用特别是位于5个或更多个(例如5个)不同的位点；和/或其中所述检测尤其包括对于每种相互作用确定是否已将作为相互作用一部分的染色体区域聚在一起。
附图说明
图1是包括与以下有关的饼图和图形的图：染色体构象特征EpiSwitchTM标志物将MTX响应者(R)与非响应者(NR)区分。基于DAS28(28个关节的疾病活动评分)EULAR(欧洲抗风湿病联盟)响应标准(参见方法)来选择响应者(R)和非响应者(NR)RA患者的发现队列(discovery cohort，检测组)。(A)饼图示出了基线和6个月时R和NR患者的CDAI评分的临床解释。(B)基线和6个月时R和NR患者的CDAI评分。(C)从R和NR以及健康对照(HC)诊断时获得的外周血单核细胞的EpiSwitchTM阵列分析鉴定了922个统计学显著的分层标志物候选者。进一步的分析显示了420个对NR具有特异性，210个对R具有特异性和159个对HC具有特异性。饼图示出了与筛选的13,322个状况染色体构象(conditional chromosomeconformation)相关的比例。所有标志物示出了调整的p<0.2。(D)热图示出了使用具有完全连锁群(complete linkage agglomeration)的曼哈顿距离度量的层次聚类(hierarchicalclustering)。使用二元图案波及3个组(R、NR和HC)进行的标志物选择，最初将922个EpiSwitchTM标志物减少到65个，然后减少到顶部30个标志物。
图2是包括与以下有关的饼图和图形的图：染色体构象特征EpiSwitchTM标志物的细化和验证。基于DAS28(28个关节的疾病活动评分)EULAR(欧洲抗风湿病联盟)响应标准(参见方法)来选择响应者(R)和非响应者(NR)RA患者的验证队列(validation cohort，验证组)。(A)饼图示出了基线和6个月时R和NR患者的CDAI评分的临床解释。(B)基线和6个月时R和NR患者的CDAI评分。用Dunn多重比较后期检验的Kruskal-Wallis检验****P<0.0001(C)分类的5个EpiSwitchTM标志物的相关图表。红色方框指示定义NR的标志物，而橙色方框指示定义R的标志物。(D)60名患者队列的主成分分析(PCA)，基于其分类的5个EpiSwitchTM标志物的二元评分(binary score)。
图3是包括与以下有关的图形的图：对甲氨蝶呤(MTX)治疗响应的预后分层和模型验证。(A)使用5个CCS标志物逻辑回归分类器的来自150个随机数据的5个所选择的接受者操作特征(ROC)曲线的代表性实例。(B)响应者(R)和非响应者(NR)RA患者与健康对照(HC)的因子分析，使用对于辨别MTX非响应者与MTX响应者所选择的EpiSwitchTMCCS标志物。
图4是3C提取过程的示意图。3C意味着染色质构象捕获或染色体构象捕获。
图5是说明用于DMARDS初治ERA患者的表观遗传分层生物标志物特征的发现和验证的设计的方案，所述患者在MTX治疗的6个月内被确认为响应者(N)或非响应者(NR)。表观遗传分层是基于通过EpiSwitchTMArray和PCR(聚合酶链式反应)平台所筛选和监测的状况染色体确认。通过针对健康对照(HC)进行分层来确认所鉴定的生物标志物的疾病特异性表观遗传性质。对60名RA患者(30名响应者和30名非响应者)和30名HC进行验证。
具体实施方式
本发明具有几个不同的方面：
-鉴定与(特别是区分亚群的)伴随诊断相关的染色体相互作用(特别是表观遗传学)的方法；
-伴随诊断方法；
-用于治疗和/或预防个体(例如治疗和/或预防个体(例如人类个体)的病症)的治疗剂，其中所述个体已特别通过本发明的伴随诊断方法被确定为需要治疗剂；
-筛选(鉴定)能够改变个体中或个体的疾病状态的剂(特别是治疗剂)的方法，包括确定候选剂是否能够改变染色体相互作用，特别是与疾病状态相关或关联的染色体相互作用；
-确定药效果的方法，包括检测由药引起的表观遗传染色体相互作用的变化。
表观遗传相互作用
如本文所用，术语“表观遗传”相互作用通常是指染色体上位点的远端区域之间的相互作用，所述相互作用是动态的，并且根据染色体区域的状态而改变、形成或中断。
在本发明的特定方法中，通过首先产生连接的核酸来检测染色体相互作用，所述连接的核酸包含来自为染色体相互作用一部分的染色体的两个区域的一个或多个序列。在此类方法中，区域可以通过任何合适的手段而被交联。在优选的实施方案中，相互作用使用甲醛被交联，但也可以通过任何醛或D-生物酰基-ε-氨基己酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯或地高辛-3-O-甲基羰基-ε-氨基己酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯而被交联。多聚甲醛可以交联相距4埃的DNA链。
例如如果被转录或抑制以响应于生理状况的变化的状况，则染色体相互作用可以反映染色体区域的状态。已经发现对如本文所定义的亚群特异性的染色体相互作用是稳定的，因此提供了测量两个亚群之间差异的可靠手段。
此外，例如与其他表观遗传标志物诸如甲基化或组蛋白结合的变化相比较，对疾病状况特异性的染色体相互作用将通常会在疾病过程的早期发生。因此，本发明的伴随诊断方法能够检测疾病状态的早期阶段。这使可能作为结果的早期治疗更有效。本发明的另一优点是不需要关于哪些位点与相关染色体相互作用的鉴定相关的先验知识。此外，同一亚群内个体之间的相关染色体相互作用几乎没有变化。检测染色体相互作用是高信息量的，每个基因有高达50种不同的可能的相互作用，因此本发明的方法可以询问500,000种不同的相互作用。
表观遗传相互作用的位置和原因
表观遗传染色体相互作用可重叠，并包括显示编码相关或未描述基因的染色体区域，但同样可在基因间区域中。还应当注意的是，发明人已经发现所有区域中的表观遗传相互作用在确定染色体位点的状态中是同样重要。这些相互作用不一定在位于位点的特定基因的编码区域中，并且可在基因间区域中。
在本发明中检测到的染色体相互作用可能由环境因素、DNA甲基化、非编码反义RNA转录物、非致突变致癌物质、组蛋白修饰、染色质重塑和特定局部DNA相互作用引起的潜在DNA序列的变化所引起。导致染色体相互作用的变化可能是由于潜在的核酸序列的变化所引起的，潜在的核酸序列的变化其本身不直接影响基因产物或基因表达模式。这些变化可以是例如基因内和/或外部的SNP，基因间DNA、微RNA和非编码RNA的基因融合和/或缺失。例如，已知大致上20％的SNP在非编码区域中，因此所描述的方法在非编码情况下也是信息性的。在一种实施方案中，聚在一起形成相互作用的染色体区域相距小于5kb、3kb、1kb、500个碱基对或200个碱基对。
在伴随诊断方法中检测到的染色体相互作用优选地是在本文表中所提及的任何基因内的染色体相互作用。然而，该染色体相互作用也可以在基因的上游或下游，例如来自基因或来自编码序列的上游或下游的高达50,000个、30,000个、20,000个、10,000个或5000个碱基。
被检测到的染色体相互作用可以是或可以不是在基因(包括编码序列)和其调控区域(诸如启动子)之间发生的染色体相互作用。被归类的染色体相互作用可以是或可以不是遗传的，例如基因区域的遗传印迹特征。
临床情况的类型
RA(类风湿性关节炎)的具体情况说明了一般原理。目前还没有临床医生可以事先使用来确定当患者首次被给予药时患者是否将对甲氨蝶呤(MTX)响应的检验。由于相当数量(约30％)的患者不对MTX响应，因此能够预测患者是否为响应者或非响应者将增加成功治疗RA的机会，并且节省时间和金钱。
这是发明人如何使待使用的本发明可视化的一个实例。更广泛地说，本发明的目的是允许检测和监测疾病。更详细地说，该技术允许基于与医疗病症相关的特定表型的生物标志物(即通过识别特定的染色体构象特征和/或该特定特征的变化)进行分层。
本发明的方法优选地用于与疾病相关的具体特点的情况，所述具体特点诸如对治疗和/或预防的响应性，最有效的疗法/药物的鉴定，监测疾病的过程，鉴定对疾病的易感性，和/或鉴定残留疾病的存在和/或复发的可能性。因此，这些方法可以用于或可以不用于诊断特定病症的存在。本发明的方法可用于把疾病机制处的位点归类为未知的、不清楚的或复杂的。染色体相互作用的检测提供了来跟踪不同调控水平的变化的有效的方式，其中一些变化是复杂的。例如，在一些情况下，大约37,000个非编码RNA可以被单个脉冲(impulse)激活。
亚群和个性化治疗
如本文所用，“亚群”优选地是指群体亚群(群体中的亚群)，更优选地是特定动物群体中的亚群，所述特定动物诸如特定哺乳动物(例如人类、非人类灵长类动物或啮齿动物例如小鼠或大鼠)或特定的线虫(例如秀丽线虫)。最优选地，“亚群”是指一个群体或人类群体中的亚群。
感兴趣的特定群体例如人类群体包括：人类群体总体、或患有特定病症/疾病(特别是炎性疾病例如RA，血液癌例如AML，实体癌症例如黑色素瘤或前列腺癌(PC)，或者神经变性疾病/病症例如阿尔茨海默病(AD))的一个群体或人类群体、人类健康群体(健康对照)、在未患有感兴趣的或研究的特定病症/疾病(例如RA、AML、黑色素瘤、PC或AD)的意义上健康的人类群体、对特定药物/疗法是响应者的人类群体(例如健康的和/或具有特定病症/疾病，例如RA、AML、黑色素瘤、PC或AD)或对特定药物/疗法是非响应者的人类群体(例如健康的和/或具有特定病症/疾病，例如RA、AML、黑色素瘤、PC或AD)。
本发明涉及检测和治疗群体中(优选一个群体或人类群体中)的特定亚群。在这些亚群内，将存在或不存在本文所讨论的特点(诸如对治疗和/或预防的响应性；特别是对一种或多种病症或疾病的特定治疗和/或预防的响应性，和/或对特定药物或治疗活性物质/治疗剂的响应性，特别是在治疗和/或预防一种或多种病症或疾病中)。一般而言，染色体上的表观遗传相互作用差异是基因组水平上存在的结构差异。本发明人已经发现这些在给定群体中的亚组(例如两个、或两个或更多个亚组(subset))之间不同。识别这些差异将允许医生将他们的患者作为该方法中所描述的群体的一个亚组的一部分来分类。因此，本发明为医生提供了一种基于患者的表观遗传染色体相互作用对患者个性化医疗的方法，并提供了一种可替换的更有效的治疗和/或预防方案。
在另一实施方案中，应用了阈值水平，该阈值水平用于确定受试者被定义为属于一个亚群而不属于群体的一个亚群或另一个亚群到什么程度。在一种优选的实施方案中，其中亚群包括对治疗和/或预防特定疾病的疗法的响应者对非响应者，所述阈值可以通过特别是对于类风湿性关节炎的DAS28(28个关节的疾病活动评分)评分的变化来测量。在一种实施方案中，高于1.2个单位的评分指示受试者落入响应者亚群，而低于1.2个单位的评分指示受试者被定义为非响应者。
通常，亚群将是总群体的至少10％、至少30％、至少50％或至少80％。
产生连接的核酸
本发明的某些实施方案利用了连接的核酸，特别是连接的DNA。这些连接的核酸包含来自在染色体相互作用中聚在一起的两个区域的序列，因此提供了关于相互作用的信息。本文所述的EpiSwitchTM方法使用这种连接的核酸的产生来检测染色体相互作用。
一种这样的方法，特别是一种检测染色体相互作用的特定方法和/或一种确定表观遗传染色体相互作用的特定方法和/或一种产生连接的核酸(例如DNA)的特定方法，包括以下步骤：
(i)存在于染色体位点处的所述表观遗传染色体相互作用的体外交联；
(ii)从所述染色体位点可选地分离交联的DNA；
(iii)将所述交联的DNA用至少切割一次的酶(特别是在所述染色体位点内切割至少一次的酶)进行限制性消化；
(iv)连接所述交联的切割的DNA末端(特别以形成DNA环)；以及
(v)鉴定所述连接的DNA和/或所述DNA环的存在，特别是使用诸如PCR(聚合酶链式反应)的技术来鉴定特异性染色体相互作用的存在。
WO2009/147386A1(Oxford Biodynamics Ltd(牛津生物动力有限公司))中公开了一种检测、确定和/或监测染色体相互作用和/或表观遗传变化的特别优选的方法，特别涉及上述交联、限制性消化、连接和鉴定的步骤，该申请的全部公开内容(特别是该申请的权利要求1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21)通过引用并入本文，如同完全阐述一样。可以在本发明的这些涉及一种或多种连接产物和/或一种或多种连接核酸的方法中使用的WO2009/147386A1的权利要求1公开了一种监测表观遗传变化的方法，其包括在至少一个染色体位点处监测状况长程染色体相互作用中的变化，在该染色体位点处长程相互作用的范围与特定生理状况相关，所述方法包括以下步骤：
(i)存在于所述至少一个染色体位点处的所述长程染色体相互作用的体外交联；
(ii)从所述染色体位点分离所交联的DNA；
(iii)使所述交联的DNA用在至少一个染色体位点内至少切割一次的酶进行限制性消化；
(iv)连接所述交联的切割的DNA末端以形成DNA环；以及
(v)鉴定所述DNA环的存在；
其中DNA环的存在指示了特定长程染色体相互作用的存在。
PCR(聚合酶链式反应)可用于检测或鉴定所连接的核酸，例如所产生的PCR产物的大小可以指示存在的特定染色体相互作用，并且因此可以被用于鉴定位点的状态。本领域技术人员将知道许多限制性内切酶，其可用于切割感兴趣的染色体位点内的DNA。显而易见的是，所用的特定酶将取决于所研究的位点和位于其中的DNA序列。可用于切割如本发明所述的DNA的限制性内切酶的非限制性实例是Taq I聚合酶。
诸如EpiSwitchTM技术的实施方案
EpiSwitchTM技术涉及微阵列EpiSwitchTM标志物数据在检测对表型特异性的表观遗传染色体构象特征中的用途。本发明人在本文描述了如何使用EpiSwitchTM阵列平台来发现对相对于健康对照特定不利表型亚群特定的潜在生物标志物的染色体特征库。本发明人还提供了从微阵列到PCR平台的染色体构象特征的有效使用和翻译的实例，以及来自在阵列上所检验的队列的亚群之间特定的几个标志物的实例。
以本文所描述的方式利用了连接的核酸(用于鉴定相关染色体相互作用并在伴随诊断方法中)的诸如EpiSwitchTM的实施方案具有若干优点。例如因为来自本发明第一组核酸的核酸序列与第二组核酸杂交或不能杂交，这些实施方案具有低水平的随机噪音。这提供了二元结果，其允许以相对简单的方式来测量表观遗传水平上的复杂机制。EpiSwitchTM技术还具有快的处理时间和低的成本。在一种实施方案中，处理时间是3小时至6小时。
样品和样品处理
样品将含有来自个体的DNA。样品通常将包含细胞。在一种实施方案中，样品通过微创手段获得，并且可以例如是血液。可以提取DNA并用标准限制性内切酶切割。这可以预先确定哪些染色体构象被保留，并将用EpiSwitchTM平台检测到。在一种实施方案中，其中样品是先前从患者获得的血液样品，所描述的方法是有利的，因为该过程是微创的。由于组织和血液之间的染色体相互作用的同步，包括水平转移，血液样品可以用于检测组织(诸如与疾病有关的组织)中的染色体相互作用。对于某些病症，诸如癌症，突变引起的遗传噪音可影响相关组织中的染色体相互作用“信号”，因此使用血液是有利的。
本发明的核酸的特性
本文的公开内容提及了第一核酸和第二核酸。此外，核酸用于伴随诊断方法中和其他实施方案中以(例如通过结合于样品所产生的连接的核酸)检测染色体相互作用的存在或不存在。本发明的核酸通常包含两个部分，每个部分包含来自在染色体相互作用中聚在一起的两个染色体区域中一个区域的序列。通常每个部分的长度为至少8个、10个、15个、20个、30个或40个核苷酸。优选的核酸包含来自表格中所提及的任何基因的序列，特别是当核酸在与该表格相关的条件相关的实施方案中使用时。优选的核酸包含在对于这种序列的特异性条件或片段或同源物的表格中所提及的特异性探针序列。优选地，核酸是DNA。应该理解的是，在提供特定序列的情况下，本发明可以使用如在特定实施方案中所要的互补序列(complementary)。
第二组核酸-“索引”序列
第二组核酸序列具有成为索引的功能，并且基本上是一组适于鉴定亚群特定序列的核酸序列。它们可以代表“背景”染色体相互作用，可以某种方式被选择或未被选择。它们通常是所有可能的染色体相互作用的亚组。
第二组核酸可以通过任何合适的方法得出。它们可以通过计算得出，或者它们可以基于个体中的染色体相互作用。它们通常代表比第一组核酸更大的群体群。在一种特定实施方案中，第二组核酸代表特定基因组中所有可能的表观遗传染色体相互作用。在另一特定实施方案中，第二组核酸代表存在于本文所描述的群体中的所有可能的表观遗传染色体相互作用的大部分。在一种特定实施方案中，第二组核酸代表至少20个、50个、100个或500个基因中至少50％或至少80％的表观遗传染色体相互作用。
第二组核酸通常代表至少100种可能的表观遗传染色体相互作用，其修改、调控或以任何方式介导群体中的疾病状态/表型。第二组核酸可代表影响物种中疾病状态的染色体相互作用，例如包含编码与任何疾病状态、易患疾病或疾病表型相关的细胞因子、激酶或调控物的核酸序列。第二组核酸包含代表与伴随诊断方法相关和不相关的表观遗传相互作用的序列。
在一种特定实施方案中，第二组核酸至少部分地来源于群体中天然发生的序列，并且通常通过生物信息学(in silico)方法获得。所述核酸与存在于天然发生的核酸中的核酸的相应部分相比还可以包含单个突变或多个突变。突变包括一个或多个核苷酸碱基对的缺失、取代和/或添加。在一种特定实施方案中，第二组核酸可包含代表与天然发生的物种中存在的核酸的相应部分具有至少70％序列同一性的同源物和/或直系同源物的序列。在另一特定实施方案中，提供了与天然发生的物种中存在的核酸的相应部分至少80％序列同一性或至少90％序列同一性。
第二组核酸的特性
在一种特定实施方案中，在第二组核酸中存在至少100个不同的核酸序列，优选至少1000个、2000个或5000个不同的核酸序列，以及高达100,000个、1,000,000个或10,000,000个不同的核酸序列。典型的数目是100个至1,000,000个诸如1,000个至100,000个不同的核酸序列。全部或至少90％或至少50％或这些将对应于不同的染色体相互作用。
在一种特定实施方案中，第二组核酸代表至少20个不同的位点或基因中的染色体相互作用，优选至少40个不同的位点或基因，以及更优选至少100个、至少500个、至少1000个或至少5000个不同的位点或基因，诸如100个至10,000个不同的位点或基因。
第二组核酸的长度适于它们根据与第一组核酸的沃森克里克(Watson Crick)碱基配对而特异性杂交，以允许鉴定对亚群特异的染色体相互作用。典型地，第二组核酸将包含两个部分，所述两部分序列上对应于在染色体相互作用中聚在一起的两个染色体区域。第二组核酸通常包含长度为至少10个、优选20个以及还优选30个碱基(核苷酸)的核酸序列。在另一实施方案中，核酸序列的长度可以是最多500个、优选最多100个以及还优选最多50个碱基对。在优选的实施方案中，第二组核酸包含17个至25个碱基对的核酸序列。在一种实施方案中，至少100％、80％或50％的第二组核酸序列具有如上所述的长度。优选地，不同的核酸不具有任何重叠的序列，例如至少100％、90％、80％或50％的核酸在至少5个连续的核苷酸上不具有相同的序列。
鉴于第二组核酸作为“索引”起作用，那么相同组的第二核酸可与不同组的第一核酸一起使用，所述第一核酸代表不同特点的亚群，即第二组核酸可代表能用于鉴定与不同疾病特点有关的染色体相互作用的“通用的”核酸集合。
第一组核酸
第一组核酸通常来自已知在两个或更多个不同亚群中的个体，所述亚群由与伴随诊断有关的特点(诸如本文所提及的任何这样的特点)的存在或不存在而被定义。第一核酸可以具有本文所提及的第二组核酸的任何特点和特性。第一组核酸通常来源于经过如本文所述的处理和加工(特别是EpiSwitchTM交联和切割步骤)的个体的样品。通常，第一组核酸代表取自个体的样品中存在的全部或至少80％或50％的染色体相互作用。
通常，与由第二组核酸代表的染色体相互作用相比，第一组核酸代表波及由第二组核酸代表的遍及位点或基因的较小的染色体相互作用群体，即第二组核酸是代表在所定义的一组位点或基因中的相互作用的背景或索引组。
核酸库
本文所述的核酸可以是包含来自第二组核酸的至少200个、至少500个、至少1000个、至少5000个或至少10000个不同核酸的文库的形式。本发明提供了核酸的特定库，其通常包含至少200个不同的核酸。核酸库可具有本文所提及的第二组核酸的任何特点或特性。文库可以以与阵列结合的核酸的形式。
杂交
本发明需要允许来自第一组核酸和第二组核酸的完全或部分互补的核酸序列杂交的手段。在一种实施方案中，全部第一组核酸在单次测定中即在单个杂交步骤中与全部第二组核酸接触。然而，可以使用任何合适的测定。
标记的核酸和杂交模式
优选地使用独立的标记诸如荧光团(荧光分子)或有助于检测成功杂交的放射性标记，可以对本文所提及的核酸进行标记。某些标记可以在紫外光下检测到。
例如在本文所描述的阵列上的杂交模式代表两个亚群之间的表观遗传染色体相互作用的差异，并因此提供了一种比较表观遗传染色体相互作用和确定哪些表观遗传染色体相互作用对本发明的群体中的亚群是特异性的方法。
术语“杂交模式”广泛地涵盖了第一组核酸和第二组核酸之间杂交的存在和不存在，即来自第一组的特定核酸与来自第二组的特定核酸杂交，并且因此其不受限于任何特定的测定或技术，或者需要具有表面或阵列，在该表面或阵列上能够检测到“模式”。
伴随诊断方法
本发明提供了一种基于由染色体相互作用所提供的信息的伴随诊断方法。提供了两种不同的伴随诊断方法，其鉴定个体是否具有与伴随诊断相关的特定特征。一种方法基于以任何合适的方式把位点归类，而另一种方法基于检测染色体相互作用的存在或不存在。该特点可以是本文所提及的与状况有关的任何一个特点。伴随诊断方法可以在多于一个时间点进行，例如在需要监测个体的情况下。
基于把位点归类的伴随诊断方法
鉴定对亚群特异性的染色体相互作用的本发明的方法可用于鉴定位点，该位点可以是根据伴随诊断检验基础而被归类的基因。许多不同的基因相关效应可能导致相同的染色体相互作用发生。在该实施方案中，可以把位点的任何特点归类，诸如位点中或所表达的核酸或蛋白质中存在多态性、从位点表达的水平、位点的物理结构或存在于位点中的染色体相互作用。在一种特定的实施方案中，所述位点可以是表中特别是在表1、3、5、6c、6E、18a、18b、18c、18d、18e、18f、22、23、24或25(特别是表1、3和/或5)中本文所提及的任何基因，或者发现与相关状况有关联的染色体相互作用附近的位点的特性。
基于检测染色体相互作用的伴随诊断方法
本发明提供了一种伴随诊断方法，其包括检测染色体相互作用的存在或不存在，通常5种至20种或5种至500种这样的相互作用，优选20种至300种或50种至100种相互作用，以确定是否在个体中存在或不存在特点。优选地，染色体相互作用是本文所提及的任何基因中的相互作用。在一种特定的实施方案中，例如当方法是出于确定存在或不存在这些表中所限定的特征的目的时，所归类的染色体相互作用是由本文表中特别是在本文表6b、6D、18b、18e、18f、22、23、24或25中所公开的核酸代表的相互作用。
具体状况
伴随诊断方法可用于检测本文提到的任何特定状况或特点的存在。伴随诊断方法可用于检测在类风湿性关节炎患者中对甲氨蝶呤(或另一类风湿性关节炎药)的响应性、急性骨髓性白血病(AML)患者对疗法的响应性、黑色素瘤复发的可能性、发展成前列腺癌和/或侵袭性前列腺癌的可能性和/或发展成β-淀粉样蛋白聚集体诱导的阿尔茨海默病的可能性。
在一种实施方案中，本发明的方法检测对免疫疗法(诸如抗体疗法)的响应性。优选地，例如在使用抗PD-1或抗PD-L1或联合的抗PD-1/抗PD-L1疗法的免疫疗法中检测癌症对抗体疗法的响应性。优选地，癌症是黑色素瘤、乳腺癌、前列腺癌、急性骨髓性白血病(AML)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、胰腺癌、甲状腺癌、鼻癌、肝癌或肺癌。在这种实施方案中，STAT5B和/或IL15中染色体相互作用的检测是优选的，诸如实施例中所述的。实施例中的工作与以下事实相一致：对免疫疗法的响应是免疫系统表观遗传学建立而不是癌症本身的特征。[“抗PD-1”是特异性结合于PD-1(程序性细胞死亡蛋白1)的抗体或抗体衍生物或片段。“抗PD-L1”是特异性结合于与作为PD-1的配体的PD-L1蛋白特异性结合的抗体或抗体衍生物或片段。]
本发明的一种或多种方法和/或伴随诊断方法可以用于：
-在多发性硬化症患者中(特别是在人类中)对IFN-B(IFN-β)治疗的响应性，和/或
-对复发缓解型多发性硬化症(特别是在人类中)的易感性，和/或
-原发进展型多发性硬化症(特别是在人类中)的可能性，和/或
-对肌萎缩侧索硬化(ALS)疾病状态(特别是在人类中)的易感性，和/或，
-对快速进展的肌萎缩性侧索硬化(ALS)疾病状态(特别是在人类中)的易感性，和/或
-对侵袭性2型糖尿病疾病状态(特别是在人类中)的易感性，和/或
-对2型糖尿病疾病状态(特别是在人类中)的易感性，和/或
-对2型糖尿病前期状态(特别是在人类中)的易感性，和/或
-对1型糖尿病疾病状态(特别是在人类中)的易感性，和/或
-对系统性红斑狼疮(SLE)疾病状态(特别是在人类中)的易感性，和/或
-对溃疡性结肠炎疾病状态(特别是在人类中)的易感性，和/或
-溃疡性结肠炎患者(特别是人类中)结肠直肠癌复发的可能性，和/或
-神经纤维瘤病患者(特别是人类中)的恶性周围神经鞘瘤的可能性，和/或
-发展前列腺癌和/或侵袭性前列腺癌(特别是在人类中)的可能性，和/或
-发展神经变性疾病或病症的可能性和/或对神经变性疾病或病症的易感性，神经变性疾病或病症优选痴呆诸如阿尔茨海默病、轻度认知障碍、血管性痴呆、路易体痴呆、额颞痴呆，或更优选阿尔茨海默病，最优选β-淀粉样蛋白聚集体诱导的阿尔茨海默病；特别是在人类中；和/或
-痴呆患者(优选阿尔茨海默病患者，更优选具有β淀粉样蛋白聚集体的阿尔茨海默病患者)与没有阿尔茨海默病的认知障碍患者之间特别是关于记忆和/或认知的比较；特别是在人类中。
优选地检测表中提及的任何相关基因内存在或不存在任何染色体相互作用。例如在任何一个表中提及的至少1、3、10、20、50个基因中。优选地，在方法中确定由表中的探针序列所代表的染色体相互作用的存在或不存在。例如，来自任何一个表的相关染色体相互作用中的至少1、3、10、20、50或100种。这些数目的基因或染色体相互作用可以用于本文提到的任何不同的实施方案中。
使用伴随诊断方法的个体检验
待检验的个体可能具有或可能不具有本文提到的任何疾病状况或特点的任何症状。个体可能处于任何这样的状况或特点的风险。个体可能已经恢复或正处于从状况或特点中恢复的过程中。个体优选是哺乳动物，诸如非人灵长类、人或啮齿动物。个体可以是男性或女性。个体可以是30岁或更年长。个体可以是29岁或更年轻。
筛选方法
本发明提供鉴定能够将个体的疾病状态从第一状态改变为第二状态的剂的方法，包括确定候选剂是否能够将染色体相互作用从与第一状态对应的染色体相互作用改变为对应于第二状态的染色体相互作用，其中优选第一和第二状态对应于存在或不存在：
-对特定治疗和/或预防的响应性，和/或
-对特定病症的易感性，和/或
-可能导致复发的残留疾病。
在一种实施方案中，该方法确定候选剂是否能够改变本文提到的任何染色体相互作用。
该方法可以在体外(细胞内或细胞外)或体内(在非人生物体上)进行。在一种实施方案中，该方法在细胞、细胞培养物、细胞提取物、组织、器官或生物体上进行，诸如包含一种或多种相关染色体相互作用的细胞、细胞培养物、细胞提取物、组织、器官或生物体。通常通过使候选剂与基因、细胞、细胞培养物、细胞提取物、组织、器官或生物体接触(或施用)来进行该细胞该方法。
在上述筛选方法中检验的合适的候选物质包括抗体剂(例如，单克隆抗体和多克隆抗体、单链抗体、嵌合抗体和CDR移植抗体)。此外，还可以检验组合文库、限定的化学身份、肽和肽模拟物、寡核苷酸和天然剂文库，例如展示文库(例如噬菌体展示文库)。候选物质可以是化学化合物，其通常衍生自围绕小分子的合成，所述小分子可具有本文提及的剂的任何性质。
优选的位点、基因和染色体相互作用
对于本发明的所有方面，表中提及了优选的位点、基因和染色体相互作用。对于本发明的所有方面，表中提供了优选的位点、基因和染色体相互作用。通常，从表中列出的至少1个、3个、10个、20个、30个或50个相关基因中检测方法染色体相互作用。优选检测任何一个表中由探针序列所代表的相关特定染色体相互作用中至少1种、3种、10种、20种、30种或50种的存在或不存在。
位点可以在本文提到的任何基因的上游或下游，例如上游50kb或下游20kb。
在每种病症的一种实施方案中，检测由表48中所示的p值或调整的p值的顶部范围表示的至少1种、3种、5种、10种、20种相关特异性染色体相互作用的存在或不存在。在每种病症的另一种实施方案中，检测由表48中所示的p值或调整的p值的中间范围表示的至少1种、3种、5种、10种、20种、30种或50种相关特异性染色体相互作用的存在或不存在。在每种病症的又一种实施方案中，检测由表48中所示的p值或调整的p值的底部范围表示的至少1种、3种、5种、10种、20种、30种或50种相关特异性染色体相互作用的存在或不存在。在每种病症的再一种实施方案中，检测由表48中所示的p值或调整的p值的顶部、中间和底部范围中的每一者的至少1种、2种、3种、5种或10种相关特异性染色体互相作用的存在或不存在，即总共至少3种、6种、9种、18种或30种。
可以检测染色体相互作用的特定组合(即，确定存在不存在)，其典型地代表本文表格或者来自表格的选择中公开的所有相互作用。如本文所提及的，可以从各个表中选择特定数目的互相作用。在一种实施方案中，检测了任何表中公开的或关于任何病症公开的至少10％、20％、30％、50％、70％或90％的相互作用。
被检测到的相互作用可以对应于特定特征的存在或不存在，例如本文所限定的，诸如在本文的任何表中。如果检测到相互作用的组合，则它们都可以与特征的存在相对应，或者它们都可以对应于特征的不存在。在一种实施方案中，检测到的相互作用的组合对应于与特征的存在相关的至少2种、5种或10种相互作用以及与特征的不存在相关的至少2种、5种或10种其他相互作用。
表49中所示的探针可以是本文提及的任何选择的一部分或与其组合，特别对于与癌症相关的病症和对疗法诸如抗PD1疗法的响应性。
关于遗传修饰的实施方案
在某些实施方案中，可以进行本发明的方法以检测与遗传修饰相关或受遗传修饰影响的染色体相互作用，即亚群在遗传修饰方面可以不同。显然，修饰可能是整个(非人类)生物体或生物体的一部分，诸如细胞。在确定哪些染色体相互作用与生物系统状态相关的方法中，第一组核酸可来自至少两个亚群，其中一个亚群具有限定的遗传修饰，另一个亚群不具有遗传修饰，并且该方法可以确定哪些染色体相互作用与遗传修饰相关和/或受其影响。修饰可以通过包括CRISPR技术的任何合适的手段来实现。
本发明包括确定对基因组的第一位点处的序列的遗传修饰是否影响基因组的其他位点的方法，包括在进行遗传修饰之后在一个或多个其他位点处检测染色体特征，其中优选遗传修饰改变系统特性，其中所述系统优选为代谢系统、免疫系统、内分泌系统、消化系统、皮肤系统、骨骼系统、肌肉系统、淋巴系统、呼吸系统、神经系统或生殖系统。所述检测染色体特征可选地包括检测5种或更多种(例如5种)不同染色体相互作用的存在或不存在，所述染色体相互作用优选在5个或更多个(例如5个)不同的位点处，优选如任何表中所限定的。优选地，染色体特征或相互作用通过本文提及的任何合适的方法来鉴定。
在一种实施方案中，所述遗传修饰通过以下方法实现，所述方法包括向细胞中引入(a)两种或更多种RNA引导的核酸内切酶或编码两种或更多种RNA引导的核酸内切酶的核酸和(b)两种或更多种引导RNA或编码两种或更多种引导RNA的DNA，其中每种引导RNA将RNA引导的核酸内切酶之一引导至染色体序列中的靶向位点，并且RNA引导的核酸内切酶在靶向位点处切割染色体序列的至少一条链。
在另一种实施方案中，所述修饰通过改变至少一种基因产物的表达的方法来实现，所述方法包括向含有和表达具有靶序列并编码基因产物的DNA分子的真核细胞中引入工程化的、非天然存在的成簇的规则间隔短回文重复(CRISPR)—CRISPR相关的(Cas)(CRISPR-Cas)系统，所述系统包含一种或多种载体，所述载体包含：
a)在真核细胞中可操作的第一调控元件，其可操作地连接至与所述靶序列杂交的编码CRISPR-Cas系统引导RNA的至少一种核苷酸序列，以及
b)在真核细胞中可操作的第二调控元件，其可操作地连接至编码II型Cas9蛋白的核苷酸序列，
其中组分(a)和组分(b)位于所述系统的相同或不同载体上，由此所述引导RNA靶向所述靶序列，且Cas9蛋白切割DNA分子，由此改变至少一种基因产物的表达；并且其中所述Cas9蛋白和所述引导RNA并非一起天然存在，其中优选地每种RNA引导的核酸内切酶衍生自Cas9蛋白并且包含至少两个核酸酶结构域，并且可选地其中所述两种RNA引导的核酸内切酶中的每种的核酸酶结构域之一被修饰使得每种RNA引导的核酸内切酶切割双链序列中的一条链，并且其中所述两种RNA引导的核酸内切酶一起在染色体序列中引入双链断裂，所述双链断裂通过DNA修复过程而得以修复使得染色体序列被修饰。
通常，修饰包括至少5个、20个、50个、100个或1000个碱基，优选地达10,000个或1000,000个碱基的缺失、插入或替代。
修饰可以在本文提及的任何位点处，例如在任何表中提及的任何区域或基因中。在其他(未修饰的)位点处检测到的染色体相互作用也可以在本文提及的任何位点中，例如在任何表中提及的任何区域或基因中。
涉及遗传修饰的实施方案可以在任何生物体上进行，包括真核生物、脊索动物、哺乳动物、植物、农业动物和植物以及非人类生物体。
本发明的方法和用途
本发明的方法可以以不同的方式进行描述。可以描述为一种制备连接的核酸的方法，该方法包括(i)已在染色体相互作用中聚在一起的染色体区域的体外交联；(ii)使所述交联的DNA进行切割或限制性消化切割；和(iii)连接所述交联的切割的DNA末端以形成连接的核酸，其中连接的核酸的检测可用于确定位点处的染色体状态，并且其中优选地：
-位点可以是本文提及的任何位点、区域或基因，
-和/或其中染色体相互作用可以是本文提及的任何染色体相互作用或对应于表中公开的任何探针，和/或
-其中连接产物可具有或包含(i)与本文公开的任何探针序列相同或同源的序列；或(ii)与(ii)互补的序列。
本发明的方法可以被描述为用于检测代表群体中不同亚群的染色体状态的方法，包括确定染色体相互作用是否存在或不存在于基因组的限定区域内，其中优选地：
-亚群由本文提及的特征的存在或不存在来限定，和/或
-染色体状态可以在本文提及的任何位点、区域或基因处；和/或
-染色体相互作用可以是本文提及或对应于本文公开的任何探针或引物对的任何染色体互相作用。
本发明包括检测本文提及的任何位点、基因或区域处的染色体相互作用。本发明包括使用本文提及的核酸和探针(或引物)来检测染色体相互作用，例如使用至少10个、50个、100个或500个这样的核酸或探针来检测至少10个、20个、100个或500个不同的位点或基因中的染色体相互作用。
本文提供的表
本文的表或者显示探针(EpiswitchTM标志物)数据或者显示代表存在于状况(第一个提及的组)中并且在对照组(通常是但不必是健康个体(第二个提及的组))中不存在的染色体相互作用的基因数据。探针序列显示可用于检测由已在染色体相互作用中聚在一起的基因区域的两个位点产生的连接产物的序列，即探针将包含与连接产物中的序列互补的序列。开始-结束位置的头两组显示探针位置，而开始-结束位置的第二个两组显示相关的4kb区域。探针数据表中提供了以下信息：
-超几何_统计(HyperG_Stats)：根据超几何富集的参数在位点中发现显著的EpiSwitchTM标志物的数目的概率的p值
-探针计数总数：在位点处检验的EpiSwitchTM构象的总数
-探针计数特征：在位点处被发现是统计显著性的EpiSwitchTM构象的数目
-FDR超几何(HyperG)：多重检验(错误发现率(False Discovery Rate))校正的超几何p值
-百分比特征：显著的EpiSwitchTM标志物相对于在位点处检验的标志物数目的百分比
-logFC：表观遗传率(FC)的底数为2的对数
-AveExpr：所有阵列和通道上探针的平均log2表达式
-T：主持t统计量(moderated t-statistic)
-p值：原始p值
-adj.p值：调整的p值或q值
-B-B统计量(lods或B)是基因被差异表达的log-odds。
-FC-非log倍数变化(non-log Fold Change)
-FC_1-以零为中心的非log倍数变化
-LS-与FC_1值相关的二进制值。如果FC_1值低于-1.1，则设置为-1，如果FC_1值高于1.1，则设置为1。在这些值之间，值为0
基因表数据显示已发现发生的相关染色体相互作用的基因。位点表中的p值与超几何_统计(HyperG_Stats)相同(基于超几何富集的参数在位点中发现显著的EpiSwitchTM标志物的数目的概率的p值)。
设计探针距Taq1位点30bp远。在PCR的情况下，PCR引物也被设计用于检测连接产物，但是它们距Taq1位点的位置是变化的。
探针位置：
起始1–在片段1上TaqI位点的上游的30个碱基
终止1–在片段1上的TaqI限制性位点
起始2-在片段2上的TaqI限制性位点
终止2-在片段2上的TaqI位点的下游的30个碱基
4kb序列位置：
起始1-在片段1上TaqI位点的上游的4000个碱基
终止1–在片段1上的TaqI限制性位点
起始2-在片段2上的TaqI限制性位点
终止2-在片段2上的TaqI位点的下游的4000个碱基
表中还提供了以下信息：
-GLMNET-拟合整个套索或弹性网正则化的程序。λ设置为0.5(弹性网)
-GLMNET_1-λ设置为1(套索)
-Fisher P值-Fisher精确检验P值
-Coef–逻辑回归系数，如果您将e(e^X)提高到系数的功率，您将得到变量的优势比
-S.E.-标准误差
-Wald-Wald方程统计量。Wald统计量是Wald检验的一部分，模型系数的最大似然估计值等于0。该检验假设最大似然估计值和0之间的差值是渐近正态分布的
-Pr(>|Z|)-逻辑模型内标志物的P值。低于<0.05的值在统计学上是显著的，且应该用在逻辑模型中。
样品制备和染色体相互作用检测的优选实施方案
本文描述了制备样品和检测染色体构象的方法。可以使用这些方法的优化(非常规)版本，例如本节所述。
通常，样品将包含至少2×105个细胞。样品可能包含高达5×105个细胞。在一个实施方案中，样品将包含2×105至5.5×105个细胞
本文描述了存在于染色体位点的表观遗传染色体相互作用的交联。这可以在细胞裂解发生之前进行。细胞裂解可以进行3至7分钟，例如4至6或约5分钟。在一些实施方案中，细胞裂解进行至少5分钟并少于10分钟。
本文描述了用限制性内切酶消化DNA。通常，DNA限制性酶切在约55℃至约70℃(例如约65℃)下进行约10至30分钟(诸如约20分钟)的时间段。
优选使用频繁的限制性切割酶，其产生平均片段大小高达4000碱基对的连接DNA片段。任选地，限制性内切酶产生的连接DNA片段具有约200至300个碱基对(诸如约256个碱基对)的平均片段大小。在一个实施方案中，典型的片段大小为200个碱基对至4,000个碱基对，例如400至2,000或500至1,000个碱基对。
在EpiSwitch方法的一个实施方案中，DNA限制性消化步骤与DNA连接步骤之间不进行DNA沉淀步骤。
本文描述了DNA连接。典型地，DNA连接进行5至30分钟，例如约10分钟。
样品中的蛋白质可以例如使用蛋白酶(任选地蛋白酶K)进行酶促消化。蛋白质可以进行酶促消化约30分钟到1小时(例如约45分钟)的时间段。在消化蛋白质(例如蛋白酶K消化)后的一个实施方案中，不存在交联反转或酚DNA提取步骤。
在一个实施方案中，PCR检测能够优选地以存在/不存在连接的核酸的二元读出来检测连接的核酸的单拷贝。
同源物
多核苷酸/核酸(例如DNA)序列的同源物在本文中被提及。这样的同源物通常例如在至少10个、15个、20个、30个、100个或更多个连续核苷酸的区域上或跨来自参与染色体相互作用的染色体区域的核酸部分具有至少70％同源性，优选至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％同源性。同源性可以基于核苷酸同一性(有时被称为“硬同源性(hard homology)”)来计算。
因此，在一个具体的实施方案中，通过提及％序列同一性来在本文中提及多核苷酸/核酸(例如DNA)序列的同源物。通常，这样的同源物例如在至少10个、15个、20个、30个、100个或更多个连续核苷酸的区域上，或跨来自参与染色体相互作用的染色体区域的核酸部分具有至少70％的序列同一性，优选至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。
例如，UWGCG程序包提供了可用于计算同源性和/或％序列同一性(例如在其默认设置下使用)的BESTFIT程序(Devereux等人(1984)Nucleic Acids Research 12，p387-395)。PILEUP和BLAST算法可以用于计算同源性和/或％序列同一性和/或对齐序列(例如鉴定等效或相应序列(通常在其默认设置下)，例如如在Altschul SF(1993)J MoI Evol 36：290-300；Altschul，S，F等人(1990)J Mol Biol 215：403-10中所述。
用于进行BLAST分析的软件可通过美国国家生物技术信息中心公开获得。该算法涉及首先通过在查询序列中鉴定长度为W的短字(word)来鉴定高得分序列对(HSP)，所述长度为W的短字当与数据库序列中具有相同长度的字对齐时匹配或满足某个正值阈值分数T。T称为邻近字得分阈值(Altschul等人，同上)。这些最初的邻近字命中充当种子来启动搜索以发现包含它们的HSP。字命中在沿每个序列的两个方向上延伸远至累积比对分数可以增加。在以下情况下，停止在每个方向上字命中的延伸：累积比对分数从其达到的最大值下降数量X；由于一个或多个负面得分残基比对的积累，累积分数为零或低于零；或者达到任一序列的结束。BLAST算法参数W5T和X确定比对的灵敏度和速度。BLAST程序使用以下作为缺省值：字长(W)为11，BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff和Henikoff(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915-10919)比对(B)oi 50，期望(E)为10，M＝5，N＝4，以及两条链的比较。
BLAST算法对两个序列之间的相似性进行统计分析；参见例如，Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5787。由BLAST算法提供的一种相似性度量是最小和概率(P(N))，其提供两个多核苷酸序列之间偶然发生匹配的概率的指示。例如，如果第一序列与第二序列的比较中的最小和概率小于约1，优选小于约0.1，更优选小于约0.01，并且最优选小于约0.001，则序列被认为与另一序列相似。
同源序列通常相差1个、2个、3个、4个或更多个碱基，例如少于10个、15个或20个碱基(其可以是核苷酸的取代、缺失或插入)。可以跨关于计算同源性和/或％序列同一性的上面提到的任何区域来测量这些变化。
阵列
第二组核酸可以与阵列结合，并且在一个实施方案中，具有与阵列结合的至少15,000个、45,000个、100,000个或250,000个不同的第二核酸，其优选地代表至少300个、900个、2000个或5000个位点。在一个实施方案中，第二核酸的不同群体中的一个或多个或全部与阵列的多于一个不同区域结合，实际上在阵列上重复从而允许检测错误。阵列基于Agilent SurePrint G3 Custom CGH微阵列平台。第一核酸与阵列结合的检测可以通过双色系统进行。
治疗剂
本文提到了治疗剂。本发明提供了用于预防或治疗相关状况的这样的剂。这可以包括向有需要的个体施用治疗有效量的剂。本发明提供了该剂在制造预防或治疗疾病的药物中的用途。本发明的方法可用于选择进行治疗的个体。本发明的方法，特别是伴随诊断测定方法，可以包括治疗步骤，其中由该方法鉴定的人随后可以被施用预防或治疗相关状况的剂。
剂的配制将取决于剂的性质。剂将以含有剂和药学上可接受的载体或稀释剂的药物组合物的形式提供。合适的载体和稀释剂包括等渗盐水溶液，例如磷酸盐缓冲盐水。典型的口服剂量组合物包括片剂、胶囊、液体溶液和液体悬浮液。该剂可以配制用于肠胃外、静脉内、肌内、皮下、透皮或口服施用。
剂的剂量可以根据各种参数确定，特别是根据使用的物质；待治疗的个体的年龄、体重和状况；施用途径；和所需的方案。医生将能够为任何特定剂确定所需施用的途径和剂量。然而，合适的剂量可以为0.1至100mg/kg体重，例如1至40mg/kg体重，例如，每日采取1至3次。
本文中提及的物质的形式
本文中提及的物质(诸如核酸或治疗剂)中任一种可以是纯化的或分离的形式。它们可以是一种与自然界中发现的不同的形式，例如它们可以与自然界中不存在的其他物质结合而存在。核酸(包括本文限定的序列的部分)可以具有与自然界中发现的序列不同的序列，例如在同源性部分中描述的序列中具有至少1个、2个、3个、4个或更多个核苷酸改变。核酸在5'或3'末端可以具有异源序列。核酸可以与自然中发现的核酸在化学上不同，例如它们可以以某种方式被修饰，但是优选地仍然能够进行沃森-克里克(Watson-Crick)碱基配对。在适当的情况下，将以双链或单链形式提供核酸。本发明以单链或双链形式提供了本文提及的所有特定核酸序列，因此包括公开的任何序列的互补链。
本发明还提供了用于实施本发明任何方法的试剂盒，包括检测与特定亚组相关的染色体相互作用。这样的试剂盒可以包括能够检测相关染色体相互作用的特定结合剂，例如能够检测通过本发明的工艺产生的连接的核酸的剂。存在于试剂盒中的优选的剂包括能够与连接的核酸或引物对杂交的探针，所述引物对例如如本文所述的能够在PCR反应中扩增连接的核酸。
本发明还提供了能够检测相关染色体相互作用的装置。该装置优选包含任何能够检测染色体相互作用的特定结合剂、探针或引物对，例如本文所述的任何此类剂、探针或引物对。
在本发明中用于特定所述病症的优选的治疗剂
A.对复发缓解型多发性硬化症(RRMS)的易感性
■用于治疗病症的药物：
ο疾病修饰疗法(DMT)：
·注射药物
οAvonex(干扰素β-1a)
οBetaseron(干扰素β-1b)
οCopaxone(醋酸格拉替雷)
οExtavia(干扰素β-1b)
οGlatopa(醋酸格拉替雷)
οPlegridy(聚乙二醇干扰素β-1a)
οRebif(干扰素β-1a)
·口服药物
οAubagio(特立氟胺)
οGilenya(芬戈莫德)
οTecfidera(富马酸二甲酯)
·输注药物
οalemtuzumab(阿伦单抗)
οNovantrone(米托蒽醌)
οTysabri(那他珠单抗)
ο管理复发：
·高剂量静脉注射(甲基泼尼松龙)
·高剂量口服(泼尼松)
·H.P.Acthar凝胶(ACTH)
ο类固醇：
·甲基泼尼松龙
B.原发进展型多发性硬化症(PPMS)的可能性
·用于治疗病症的药：
ο类固醇
ο免疫抑制疗法，诸如总淋巴放射、环孢菌素、甲氨蝶呤、2-氯脱氧腺苷、环磷酰胺、米托蒽醌、硫唑嘌呤、干扰素、类固醇和免疫球蛋白。
οCopaxone
οOcrelizumab(Genetech(基因泰克公司))。
C.对肌萎缩性侧索硬化(ALS)疾病状态的易感性
■用于治疗病症的药：
ο利鲁唑
ο巴氯芬。
D.对2型糖尿病疾病状态的易感性
■用于治疗病症的药：
ο二甲双胍
ο磺脲诸如：
■格列本脲
■格列齐特
■格列美脲
■格列吡嗪
■格列喹酮
ο格列酮类(噻唑烷二酮类，TZD)
οGliptins(DPP-4抑制剂)诸如：
■利格列汀
■沙格列汀
■西他列汀
■维格列汀
οGLP-1激动剂，诸如：
■艾塞那肽
■利拉鲁肽
ο阿卡波糖
ο那格列奈和瑞格列奈
ο胰岛素治疗。
E.对1型糖尿病疾病状态的易感性
·用于治疗病症的药：
οLantus(来得时)皮下
οLantus Solostar皮下
ο诺和平(Levemir)皮下
οNovolog Flexpen皮下
οNovolog(门冬胰岛素)皮下
οHumalog(优泌乐)皮下
οNovolog Mix 70-30 FlexPen皮下
οSymlinPen 60皮下
οHumalog KwikPen皮下
οSymlinPen 120皮下
ο诺和灵R注射
οToujeo SoloStar皮下
οApidra(谷赖胰岛素)皮下
οHumalog Mix 75-25皮下
ο优泌林(Humulin)70/30皮下
οHumalog Mix 75-25 KwikPen皮下
ο诺和灵N皮下
ο优泌林R注射
ο诺和灵70/30皮下
ο地特胰岛素皮下
οLevemir FlexTouch皮下
ο优泌林N皮下
ο甘精胰岛素皮下
οApidra SoloStar皮下
ο赖脯胰岛素皮下
ο胰岛素常规人体注射
ο胰岛素常规人体吸入
οHumalog Mix 50-50 KwikPen皮下
ο门冬胰岛素(insulin aspart，诺和锐)皮下
οNovolog Mix 70-30皮下
οHumalog Mix 50-50皮下
οAfrezza吸入
ο胰岛素NPH人重组皮下
ο胰岛素NPH和常规人皮下
ο门冬胰岛素精蛋白-门冬胰岛素皮下
ο优泌林70/30 KwikPen皮下
ο优泌林N KwikPen皮下
οTresiba FlexTouch U-100皮下
οTresiba FlexTouch U-200皮下
ο赖脯胰岛素精蛋白和赖脯胰岛素皮下
ο普兰林肽皮下
ο赖谷胰岛素皮下
οNovolog PenFill皮下
ο德谷胰岛素皮下
F.对系统性红斑狼疮(SLE)疾病状态的易感性
■用于治疗病症的药：
ο非甾体抗炎药(NSAIDS)：布洛芬、萘普生和双氯芬酸。
ο羟氯喹
ο皮质类固醇
ο免疫抑制剂：硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、麦考酚酸酯和环磷酰胺。
ο利妥昔单抗
ο贝利木单抗。
ο皮质类固醇：泼尼松、可的松和氢化可的松
οNSAIDs：吲哚美辛(Indocin)、萘丁美酮(Relafen)和塞来昔布(Celebrex)
ο抗炎药：阿司匹林和对乙酰氨基酚(泰诺)
ο疾病修饰抗风湿药物(DMARD)：羟氯喹(Plaqenil)、环孢菌素(Gengraf、Neoral、山地明(Sandimmune))和硫唑嘌呤(Azasan、Imuran)。
ο抗疟药：氯喹(Aralen)和羟氯喹(Plaquenil(硫酸羟氯喹片))。
οBLyS特异性抑制剂或单克隆抗体(MAbS)：贝利单抗(Benlysta)。
ο免疫抑制剂/免疫调节剂：硫唑嘌呤(Imuran)、甲氨蝶呤(Rheumatrex)和环磷酰胺(Cytoxan)。
ο抗凝剂：低剂量阿司匹林、肝素(肝素钙(Calciparine)、肝素钠(Liquaemin))和华法林(香豆定(3-(α-丙酮基苄基-4-羟基香豆素)，Coumadin))。
G.对溃疡性结肠炎疾病状态的易感性
■用于治疗病症的药：
ο抗炎药：氨基水杨酸-柳氮磺吡啶(水杨酰偶氮碘胺吡啶(Azulfidine))，以及某些5-氨基水杨酸，包括美沙拉嗪(Asacol、Lialda、Rowasa、Canasa等)，巴柳氮(Colazal)和奥沙拉秦(奥柳氮钠(Dipentum))和皮质类固醇-泼尼松和氢化可的松。
ο免疫系统抑制剂：硫唑嘌呤(Azasan、Imuran)、巯嘌呤(Purinethol、Purixam)、环孢菌素(Gengraf、Neoral、山地明)、英夫利昔单抗(Remicade)，阿达木单抗(Humira)、戈利木单抗(Simponi)和维多珠单抗(Entyvio)。
ο其他用于管理溃疡性结肠炎特定症状的药物：
■抗生素
■止泻药物
■止痛药
■铁补充剂。
H.溃疡性结肠炎患者结肠直肠癌复发的可能性
■用于治疗病症的药：
氨基水杨酸
UC类固醇
硫唑嘌呤
I.神经纤维瘤病患者的恶性周围神经鞘瘤的可能性
■治疗
MPNST的治疗包括手术、放疗和化疗。
J.发展前列腺癌和/或侵袭性前列腺癌的可能性
■用于治疗病症的药：
■促黄体生成激素释放激素(LHRH)激动剂
■抗雄激素治疗
■LHRH和抗雄激素联合治疗
ο类固醇
ο其他医学治疗：
■阿比特龙
■恩杂鲁胺
■多西他赛
■卡铂或顺铂化疗
K.阿尔茨海默病：
■用于治疗病症的药：
ο多奈哌齐(Donepezil)
ο利凡斯的明(Rivastigmine)
ο加兰他敏(Galantamine)
·美金刚胺(Memantine)
出版物
本文提及的所有出版物的内容通过引用并入本说明书中，并可用于进一步定义与本发明相关的特征。
具体实施方案
EpiSwitchTM平台技术检测位点处的正常和异常状况之间的调控性变化的表观遗传调控特征(signature，签名)。EpiSwitchTM平台识别并监测与人类染色体的调控性高阶结构(也被称为染色体构象特征)相关的基因调控的基本表观遗传水平。染色体特征是基因失调控(gene deregulation)级联中的独特的主要步骤。它们是高阶生物标志物，具有针对利用晚期表观遗传生物标志物和基因表达生物标志物(如DNA甲基化和RNA概况分析(RNAprofiling))的生物标志物平台的独一无二的一组优势。
EpiSwitchTM阵列分析
定制的EpiSwitchTM阵列筛选平台具有15K、45K、100K和250K独一无二的染色体构象的4种密度，每个嵌合片段在阵列上重复4次，使有效密度分别为60K、180K、400K和1百万(1M)。
定制设计的EpiSwitchTM阵列
15K EpiSwitchTM阵列可以筛选全基因组，包括使用EpiSwitchTM生物标志物发现技术进行询问的约300个位点。EpiSwitchTM阵列建立在Agilent SurePrint G3 Custom CGH微阵列平台上；该技术提供4种密度，60K、180K、400K和1M探针。每个阵列的密度减少到15K、45K、100K和250K，因为每个EpiSwitchTM探针显示为一式四份，因此允许对重现性进行统计评估。每遗传位点询问的潜在EpiSwitchTM标志物平均数为50；因此可以调查的位点数目为300、900、2000和5000。
EpiSwitchTM定制阵列流水线
EpiSwitchTM阵列是双色系统，其中一套样品在EpiSwitchTM文库生成后用Cy5标记，并且待比较/分析的其他样品(对照)用Cy3标记。使用Agilent SureScan扫描仪扫描阵列，并使用Agilent Feature Extraction(安捷伦特征提取)软件提取所得的特征。然后使用R中的EpiSwitchTM阵列处理脚本处理数据。使用R：Limma*中的Bioconductor中的标准双色程序包处理阵列。使用Limma*中的阵列功能中标准化的阵列功能进行阵列的标准化，并且这对芯片上的Agilent阳性对照和EpiSwitchTM阳性对照进行。基于Agilent Flag调用过滤数据，移除Agilent对照探针，并对技术重复探针取平均值，以便使用Limma*对其进行分析。基于探针在被比较的两个场景之间的差异对探针进行建模，然后通过使用FalseDiscover率对其进行纠正。具有为<＝-1.1或＝>1.1的变异系数(CV)<＝30％且通过p<＝0.1FDR p值的探针用于进一步筛选。为进一步减少探针组使用R中的FactorMineR程序包进行多因素分析。
*注意：LIMMA是微阵列实验中用于评估差异表达的线性模型和经验贝叶斯方法。Limma是用于分析由微阵列或RNA-Seq产生的基因表达数据的R程序包。
基于用于最终挑选的调整的p值、FC和CV<30％(任意截断点)参数对探针库进行最初选择。进一步的分析和最终的列表仅基于前两个参数(调整的p值；FC)绘制。
实施例
通过以下非限制性实施例来说明本发明。
统计流水线(Statistical Pipeline)
EpiSwitchTM筛选阵列使用R中的EpiSwitchTM分析程序包进行处理，以便选择高值的EpiSwitchTM标志物用于翻译到EpiSwitchTMPCR平台上。
步骤1
根据探针校正的p值(假发现率，FDR)选择探针，校正的p值是修正的线性回归模型的产物。低于p值<＝0.1的探针被选择，然后通过它们的表观遗传比率(ER)而被进一步降低，探针ER必须为<＝-1.1或＝>1.1以供选择用于进一步分析。最后一个滤器是变异系数(CV)，探针必须低于<＝0.3。
步骤2
基于来自统计列表中的前40个标志物的用于选择的ER对其进行选择作为用于PCR翻译的标志物。具有最高的负ER负荷的前20个标志物和具有最高的正ER负荷的前20个标志物形成了这个列表。
步骤3
由第1步得到的标志物，统计学上重要的探针形成了使用超几何富集(HE)进行富集分析的基础。这种分析使得能够从重要的探针列表中减少标志物，并且与来自步骤2的标志物一起形成翻译到EpiSwitchTMPCR平台上的探针列表。
统计探针由HE处理以确定哪些遗传位置富集统计学重要的探针，从而指示哪些遗传位置是表观遗传差异的中心。
选择基于校正的p值的最显著的富集位点用于探针列表生成。选择低于0.3或0.2的p值的遗传位置。映射到这些遗传位置的统计探针与来自步骤2的标志物形成用于EpiSwitchTMPCR翻译的高值标志物。
阵列设计和处理
阵列设计
1.使用SII软件(目前v3.2)处理遗传位点以：
a.在这些特定的基因位点(具有50kb上游和20kb下游的基因序列)抽出基因组的序列
b.限定该区域内的序列涉及CC的概率
c.使用特定RE剪切序列
d.确定哪些限制性片段可能以某种方向相互作用
e.排列不同的CC一起相互作用的可能性。
2.确定阵列大小，从而确定可用探针位置的数目(x)
3.抽出x/4种互相作用。
4.对于每种相互作用，限定1部分的限制性位点30bp和2部分的限制性位点30bp的序列。检查那些区域不是重复，如果是的话，排除并取沿着列表的下一种互相作用。连接两个30bp来限定探针。
5.创建x/4种探针加限定的对照探针的列表，并重复4次以创建要在阵列上创建的列表
6.将探针列表上载到Agilent Sure设计网站，以便定制CGH阵列。
7.使用探针组设计Agilent定制CGH阵列。
阵列处理
1.使用EpiSwitchTMSOP处理样品进行模板生产。
2.通过阵列处理实验室用乙醇沉淀清理。
3.按照Agilent SureTag完整DNA标记试剂盒-用于血液、细胞或组织的基因组DNA分析酶标记的基于CGH的Agilent寡核苷酸阵列处理样品
4.使用Agilent C扫描仪使用Agilent特征提取软件进行扫描。
实施例1：确定与区分用于治疗类风湿性关节炎的甲氨蝶呤的非响应者和响应者之间的伴随诊断相关的染色体相互作用的方法。
来源：格拉斯哥苏格兰教育研究协会(Glasgow Scottish Educational ResearchAssociation)(SERA)队列。
实施例1的引言和概述
个体患者的稳定表观遗传学谱(epigenetic profile)调节信号传导途径的敏感性，调控基因表达，影响疾病发展的途径，并且可导致负责药物的有效作用和对治疗的响应的调控性控制无效。在这里我们分析了类风湿性关节炎(RA)患者的表观遗传学谱，以评估其在定义针对甲氨蝶呤(MTX)治疗的非响应者中的作用。
对类风湿性关节炎中对一线疾病修饰的抗风湿药(DMARD，通常是甲氨蝶呤(MTX))的响应的可靠的临床预测目前是不可能的。目前，确定对一线DMARD(特别是甲氨蝶呤(MTX))的响应的能力取决于治疗后的经验临床测量。
在早期类风湿性关节炎(ERA)中，尚不可能预测对一线DMARD(特别是甲氨蝶呤(MTX))的响应，因此这种治疗决策主要依靠临床算法。将药物初治患者(drugpatient，未用药患者/此前未接受过药物的患者)分类为将对一线DMARD无响应的患者的能力将成为用于患者分层的宝贵工具。在这里，我们报告，早期RA患者的血液白细胞中的染色体构象特征(以前没有在RA中描述过的高信息量和稳定的表观遗传修饰)可以预测对MTX治疗非响应性。
方法：
从在苏格兰早期类风湿关节炎(SERA)初始队列招募的DMARD初治的ERA患者中获得外周血单核细胞(PBMC)。纳入本研究的依据是基于具有中至高的疾病活动度(DAS28≥3.2)的RA的诊断(满足2010年ACR/EULAR标准)和随后的甲氨喋呤(MTX)单药治疗。DAS28＝28个关节的疾病活动评分(Disease Activity Score)。EULAR＝欧洲风湿病联盟(TheEuropean League Against Rheumatism)。ACR＝美国风湿病学院(American College ofRheumatology)。在6个月时使用以下标准定义MTX响应性：响应者-DAS28缓解(DAS28<2.6)或良好响应(DAS28改善>1.2且DAS28 3.2)。非响应者-DAS28没有改善(≤0.6)。对4个MTX响应者、4个MTX非响应者和4个健康对照中的染色体构象特征(CCS)的初始分析使用含有13,322个独一无二探针的EpiSwitchTM阵列进行，所述探针覆盖309个RA相关的遗传位点。通过LIMMA*线性建模，随后的二元过滤和聚类分析来定义差异化CCS。使用EpiSwitchTMPCR平台针对差异化CCS筛选30例MTX响应者和30例非响应者的验证队列。使用二元评分和逻辑回归建模进一步细化差异化特征，以及通过ROC分析**确定的模型的准确性和稳健性(鲁棒性，robustness)。
*注意：LIMMA是微阵列实验中用于评估差异表达的线性模型和经验贝叶斯方法。Limma是用于分析由微阵列或RNA-Seq产生的基因表达数据的R程序包。
**注意：ROC是指接受者操作特征(Receiver Operating Characteristic)，并且是指ROC曲线。ROC曲线是说明当二元分类器系统(binary classifier system)的辨别阈值(discrimination threshold)改变时二元分类器系统的表现的绘图。通过在各种阈值设置下绘制真阳性率与假阳性率而产生曲线。
CCS EpiSwitchTM阵列分析鉴定了差异化响应者和非响应者ERA患者的30种标志物的分层谱。随后在我们的验证队列中对这个特征进行评估，将其改进为能够区分响应者和非响应者的5个标志物的CCS特征。预测建模为响应者和非响应者提供了概率分数，范围从0.0098到0.99(0＝响应者，1＝非响应者)。对于响应者的真阳性率为92％(95％置信区间[95％CI]75-99％)，以及对非响应者的真阴率为93％(95％CI 76-99％)。重要的是，验证这种分层模型的ROC分析表明，该特征具有92％的NR对MTX的敏感性的预测能力。
我们已经在DMARD初治的ERA患者的外周血中识别了高信息量的系统表观遗传状态，其具有在诊断时对患者进行分层的能力。使用基于血液的临床检验将患者事先差异化为非响应者的能力将是无价的临床工具；为分层医疗铺平道路，并在ERA临床中寻求更积极的治疗方案。
实施例1的详细版本
将患者事先区分为响应者(R)和非响应者(NR)的能力将是用于导致早期引入有效治疗的患者分层的无价工具。我们已使用EpiSwitchTM生物标志物发现平台来鉴定血液源白细胞中的染色体构象特征(CCS)，这些特征指示疾病状态和MTX响应性。因此，我们识别了包含在CXCL13、IFNAR1、IL-17A、IL-21R和IL-23位点中的表观遗传学特征，所述位点提供了使得初治早期RA(ERA)患者能够分层为MTX R和NR的首个预后分子特征。重要的是，这种分层模型具有92％的NR对MTX的敏感性的预测能力。这种表观遗传RA生物标志物特征可以区分ERA和健康对照(HC)。这种组合性的、预测性的外周血特征可以支持在临床上更早引入更积极的治疗剂，为RA中的个性化药物铺平道路。
RA是一种慢性自身免疫性疾病，影响全球人口的高达1％。发病机制是多因素的，其主要特点是免疫的宿主位点与环境因素(特别是吸烟和其他肺部刺激)相互作用。遗传易感个体暴露于这样的环境因素表明疾病发生和发展的表观遗传背景。染色质标志物(例如基因组的甲基化状态)的最近研究提供了与RA相关的表观遗传差异的第一个证据。然而，到目前为止，遗传学关联或表观遗传变化都不能为给定疗法的响应提供有效的预测标志物。此外，临床表现只能弱地预测常规DMARD的疗效和毒性。EULAR(欧洲抗风湿联盟)和ACR(美国风湿病学院)管理指南推荐的最常用的首选药物MTX8，经过6个月的治疗后，实现了临床意义的响应率为50％-65％。这样的响应，特别是显示出高障碍响应的相当小的比例目前不能在个体患者中预测。这就产生了一种基于“试验和错误”的治疗方案(单一或联合疗法)选择方法。预测个体患者中的药物响应性的能力将是一种无价的临床工具，因为对一线治疗的响应是长期结果的最重要的预测因素。
在此，我们重点关注来自苏格兰早期类风湿性关节炎(SERA)起始队列的DMARD-初治的ERA患者的表观遗传概况分析，以确定是否存在指示针对MTX治疗的NR的稳定的基于血液的表观遗传概况分析，从而能够进行事先识别并将此类患者分层为代替的治疗剂。来源表观遗传调节可强烈影响细胞活化和转录概况分析。可以想象，药物的作用模式可能受到表观遗传修饰的位点的影响。我们专注于CCS，也被称为长程染色质相互作用，因为它们反映了高信息量和稳定的高阶表观遗传状态，这对转录调控有重要意义。它们还提供了显著的优势15和与表型差异的早期功能联系16，并被报道为肿瘤学和其他疾病领域的信息生物标志物候选物。
我们使用由苏格兰早期类风湿性关节炎(SERA)初始队列提供的早期RA(ERA)。人口统计因素、临床因素和免疫因素在诊断和6个月时获得。纳入本研究的是基于具有中至高的疾病活动度(DAS28≥3.2)的RA的诊断(满足2010年ACR/EULAR标准)和随后用MTX的单药治疗。响应者被定义为在接受MTX后6个月时达到DAS28缓解(DAS28<2.6)或良好响应(DAS28改善>1.2且DAS28≤3.2)的患者。(DAS28＝28个关节的疾病活动评分)。
我们使用二元表观遗传生物标志物概况分析(profiling，概要描述)，其是通过分析跨功能上连接于RA的309个遗传位点的超过13,322个染色体构象特征(CCS)(13,322个独一无二探针)。CCS作为高信息量的表观遗传生物标志物类(1)，在EpiSwitchTM平台上被阅读、监测和评估，该平台已被成功地用于梅奥诊所(Mayo Clinic)早期黑色素瘤(2)队列的基于血液的分层，并且目前用于对PD-1/PD-L1免疫治疗的响应的预测分层。
使用GraphPad Prism、WEKA和R统计语言对初治RA患者的已鉴定的表观遗传学概况分析进行统计分析。通过使用EpiSwitchTM平台和90个临床样品的扩展队列，我们鉴定了超过922个表观遗传先导生物标志物的库，这些生物标志物对于响应者、非响应者、RA患者和健康对照具有统计学显著性。
为了鉴定ERA患者中的治疗前循环CCS状态，选择与RA发病机制相关的123个遗传位点(表1)，并使用EpiSwitchTM计算机模拟(in silico)预测程序包预测的染色体构象相互作用进行注释。EpiSwitchTM计算机模拟预测产生13,322个高置信度CCS标志物候选者(表1)。这些候选者用于产生定制的发现EpiSwitchTM阵列(图5)，以筛选来自4个MTX响应者(R)和4个MTX NR(全部在6个月治疗后被临床定义(图1A、图B和表2))和4个健康对照(HC)在诊断时(DMARD-初治)分离的外周血单核细胞。为了鉴定区分R、NR和HC的CCS，采用具有标准化表观遗传负荷的LIMMA*线性模型。鉴定了总共922个统计学显著的分层标志物(基于调整的p值和EpiSwitchTM比率评估的显著性)。在922个先导标志物中，420个与NR相关，210个与R相关和159个与HC相关(图1C)。对EpiSwitchTM标志物应用二元过滤和聚类分析以评估所鉴定的CCS的显著性。逐步层次聚类方法(使用利用完全连锁群的曼哈顿距离度量，并考虑到R对NR、HC对R&HC对NR)，将显著标志物的数量从922个减少到65个，最后得到30个标志物的分层谱(图1D和表3)。
*注意：LIMMA是微阵列实验中用于评估差异表达的线性模型和经验贝叶斯方法。Limma是用于分析由微阵列或RNA-Seq产生的基因表达数据的R程序包。
为了完善和验证CCS特征，使用EpiSwitchTMPCR平台(图5)，在R和NR的第二ERA患者队列(图2A、图B和表4)中用逐步的方法筛选30个已鉴定的标志物。首先，全部30个CCS标志物在12个ERA患者(6个R和6个NR)中进行。通过应用具有对二元评分的耶茨连续性校正(Yate’s continuity correction)的卡方独立性检验鉴定了最佳区分的CCS标志物，揭示了12个标志物的CCS谱(表5)。这12个CCS标志物在另外12个ERA患者(6个R和6个NR)上运行，并且将数据与前面的12个ERA合并。合并24个患者样品(12个R和12个NR)，构建WEKA分类平台中的逻辑回归模型(使用5倍交叉验证来给每个标志物的辨识能力评分)，并通过对初始数据集的随机数据重新采样运行10次来为生成模型生成10个不同的起点。选择平均分数最高的标志物，从而将谱减少到10个最佳辨识的CCS标志物(表5)。10个CCS标志物用于探测另外36个ERA样品(18个R和18个NR)。合并所有数据(30个R和30个NR)和使用相同的逻辑回归和分数计算分析揭示了区分MTX R与MTX R的5个CCS标志物特征(IFNAR1、IL-21R、IL-23、IL-17A和CXCL13)(图2C，表5)。CXCL13和IL-17A位点中的CCS与非响应者相关，而IFNAR1、IL-23和IL-21R位点中的CCS与响应者相关。鉴于对人类自身免疫中IL-17轴推定的中心作用，这是一个有趣的概况。
重要的是，分层特征的组成鉴定了可能控制对于确定MTX响应最重要的遗传位置的染色体构象的位置。分类5个EpiSwitchTMCCS标志物的二元评分的主成分分析(PCA)提供了ERA患者基于其MTX响应的清晰分离(图2D)。该模型为响应者和非响应者提供了预测概率分数，范围从0.0098到0.99(0＝响应者，1＝非响应者)。截止值对于响应者设为≤0.30，以及对于非响应者为≥0.70。≤0.30的分数具有92％的真阳性率(95％置信区间[95％CI]75-99％)，而≥0.70的分数具有93％的真阴性率(95％置信区间为76-99％)。表6显示了每个响应类别(针对MTX的R或NR)的观察到的患者和预测患者的数目。使用EpiSwitchTMCCS标志物模型，53名患者(88％)被分类为响应者或非响应者。
表6.使用EpiSwitchTMCCS模型的针对MTX单药治疗6个月时的R和NR的观察到的和预测的数目
表6的注释：基于针对MTX的响应概率选择截止水平，对于NR为(大约)>0.70，以及对于R为<0.3。NR和R如方法中所述而定义。
为了检验确定5个EpiSwitchTMCSS标志物的逻辑分类模型的“准确性”和“表现的稳健性”，通过R和NR数据的随机数据重新采样生成150个ROC**曲线(具有独特的起点)(图3A)。这导致数据被分成训练组(66％，相当于6000个已知类样品)和检验组(34％，相当于3000个未知类样品)；重要的是在交叉验证的数据中从未见过相同的分割。该模型的平均辨别能力(AUC)为89.9％(95％CI 87-100％)，对于NR的平均敏感度(对响应流行(responseprevalence)调整)为92％，以及对于R的平均特定为84％。为了确定模型的预测能力，使用贝叶斯流行定理将平均模型精度统计对于群体针对MTX的R/NR进行调整21。使用55％的MTX响应率，阳性预测值(PPV)为90.3％，同时阴性预测值(NPV)为86.5％。如果响应率调整到60％，这将PPV降至87％，同时将NPV提高至89％。
**注意：ROC是指接受者操作特征(Receiver Operating Characteristic)，并且是指ROC曲线。ROC曲线是说明当二元分类器系统的辨别阈值改变时二元分类器系统的表现的绘图。通过在各种阈值设置下绘制真阳性率与假阳性率而产生曲线。
作为对选定的5个EpiSwitchTMCCS标志物的辨别力的独立评估，进行了包含30个HC的混合数据的因子分析(FAMD)。这说明特征不仅有区分MTX R和MTX NR的能力，而且保留了区分健康个体和RA患者的足够的疾病特定特征(图3B)。
实施例1-表6D和6E-在RA-MTX响应者和非响应者之间的分层
下文中给出的在来自实施例1A的表6b+6c之后的表6D和延续表6E特别显示了大约54个DNA探针(60聚体)及其DNA序列的列表。这些探针代表实施例1中使用的一些探针。不受约束，认为表6D+6E中所示的大部分探针可能对RA-MTX响应者和RA-MTX非响应者之间的分层是重要的/有用的。所示的探针通过PCR进一步研究。P值＝概率值；adj.＝调整的。
实施例1-结论
综上所述，基于对R/NR的前瞻性临床评估，我们对DMARD初治ERA患者的表观遗传谱分类的研究已经鉴定出一致的表观遗传学特征，其辨别对MTX响应有利和不利的表观遗传学状态。这是我们所知的，早期RA患者中稳定和选择性区分基于血液的表观遗传生物标志物的第一个实施例，表现出疾病相关(与健康对照相比)且能够预测对一线MTX治疗的非响应性的。该模型用验证分类器提供了直接和实际的益处，该验证分类器基于5个有条件的CCS(conditional CCS)及其由工业ISO-13485EpiSwitchTM平台进行的检测，该平台在临床实践中具有在不远的将来常规可用的潜力。重要的是，通过采用这种预测性特征，应该有可能将MTX初治的ERA患者分层为R队列和NR队列。这提供了通过目前批准的ERA治疗策略寻求早期使用有效治疗剂从而导致“个性化”治疗方案来加速患者进展的潜力。此外，可以想象在RA患者(以及具有其他自身免疫性疾病的患者)中存在替代的CCS特征，其可用于证明临床中快速生物治疗方案的合理性。这将具有深远的社会经济影响，提供更具成本效益和稳健的治疗方法。
实施例1-材料和方法
实施例1-RA患者群体
本研究中的患者是苏格兰早期类风湿性关节炎(SERA)起始队列的一部分。在诊断和6个月时获得人口统计因素、临床因素和免疫学因素(表1)。纳入初始队列是基于在苏格兰的二级保健风湿病单位临床诊断未分化多发性关节炎或RA(≥1个肿大关节)。排除标准是之前或当前的DMARD/生物治疗和/或确定的替代诊断(即银屑病关节炎、反应性关节炎)。纳入本研究是基于具有中至高的疾病活动度(DAS28≥3.2)的RA的诊断(满足对RA的2010年ACR/EULAR标准)和随后的甲氨喋呤(MTX)单药治疗。[DAS28＝28个关节的疾病活动评分。EULAR＝欧洲风湿病联盟。ACR＝美国风湿病学院]。响应者被定义为在接受MTX后6个月时达到DAS28缓解(DAS28<2.6)或良好响应(DAS28改善>1.2且DAS28≤3.2)的患者。非响应者被定义为在接受MTX后6个月时DAS28没有改善(≤0.6)的患者。诊断(基线)时在EDTA管中收集血液样品并离心以产生含有PBMC的血沉棕黄层(buffy layer)，将其收获并储存于-80℃。当地伦理委员会批准研究方案并且所有患者在登记进入研究之前给出知情同意。
实施例1-EpiSwitchTM处理、阵列和PCR检测。EpiSwitchTM测定的探针设计和位置
使用模式识别方法来分析与人类基因组中转录单位相关的人类基因组数据。专有的EpiSwitchTM模式识别软件18,20提供了一个区域涉及染色质相互作用的概率评分。下载和处理来自123个位点的序列以产生13,322个最可能的染色体相互作用的列表。设计60mer探针以询问这些潜在的相互作用，并将其作为定制阵列上载到Agilent SureDesign网站。使用Primer323在选定的位点(site)设计序列特定寡核苷酸以通过巢式PCR筛选潜在标志物。使用寡核苷酸特定BLAST检验寡核苷酸的特定。
实施例1-来自患者PBMC的染色质构象特征分析
模板制备：使用EpiSwitchTM测定按照制造商的说明书(Oxford BioDynamics Ltd)从50μl的每种PBMC样品中提取染色质。简言之，较高级结构用甲醛固定，将染色质提取，用TaqI消化，在最大化分子内连接的条件下稀释和连接，然后进行蛋白酶K处理。EpiSwitchTM微阵列：按照制造商的说明书(Agilent)，使用Agilent系统使用定制的Agilent8×60k阵列进行EpiSwitchTM微阵列杂交。每个阵列包含55088个探针斑点，代表由EpiSwitchTM模式识别软件预测的13,322个潜在的染色体相互作用，一式四份，加上EpiSwitchTM和Agilent对照。简而言之，使用Agilent SureTag标记试剂盒标记1μg的EpiSwitchTM模板。进行对标记的DNA的处理。使用Agilent扫描仪和软件在洗涤后立即进行阵列分析。为了比较所有的实验，数据被背景校正和标准化。由于阵列中的每个斑点都以一式四份存在，因此计算阵列中每个探针的四个斑点的中值，并将其log2变换值用于进一步分析。对每个探针重复计算变异系数和p值。EpiSwitchTMPCR检测：在模板上检验寡核苷酸以确认每个引物组正确地工作。为了适应技术和重复的变化，每个样品被处理四次。汇集来自这四次重复的所有提取物，并对每种样品进行最后的巢式PCR。该程序允许以更高的准确度检测有限拷贝数的模板。通过使用LabChip DNA 1K版本2试剂盒(Perkin Elmer)在来自Perkin Elmer的GX中电泳使所有PCR扩增的样品可视化，并使用荧光染料根据制造商的方案将内部DNA标志物加载到DNA芯片上。通过激光检测荧光，并使用仪器软件将电泳图读出转化为凝胶图片上的模拟带。我们为视为阳性的带设定的阈值为30个荧光单位及以上。
实施例1-统计学方法和程序包
GraphPad Prism和SPSS用于临床数据的所有统计分析。使用卡方检验和Fisher精确检验(对于分类变量)，独立样品的t检验(对于连续的正态分布变量)和曼-惠特尼U检验(Mann-Whitney U test)(对于没有正态分布的连续变量)来鉴定差异。统计显著性水平设定为0.05，所有检验均为双侧。R(和适当的程序包)用于评估EpiSwitchTM数据。这包括用于卡方检验和GLM(logit)的Stats程序包，用于来自WEKA几率概率的ROC曲线的ROCR程序包，R中用于Heatmaps的gplot&stats程序包。FactorMiner程序包用于PCA和因子图(Factorplot)。Weka用于属性缩减(属性约简，Attribute Reduction)、数据随机化和再采样、Logistic模型分类器、AUC计算和模型精度计算。
实施例2：在治疗AML(急性骨髓性白血病)中抑制LSD1期间确定与伴随诊断相关的染色体相互作用作为药效学生物标志物的方法
来源：英国癌症研究所。
药效学生物标志物
药效学(PD)生物标志物是药物对生物体靶标的效应的分子指示物。PD生物标志物可用于检查药物方案、靶标效应和生物学肿瘤响应之间的联系。将新药开发与关注的PD生物标志物测量结合起来提供关键数据，以便做出知情的早期行动/不行动决定，以便选择靶向剂的合理组合，并以便优化组合药物方案的时间表。PD终点的使用还增强了药开发过程(从临床前模型中的先导化合物的选择到首次人体试验(国家癌症研究所(NationalCancer Institute)))中的合理性和假设检验能力。
发明人已经发现染色体特征可以用作药效学生物标志物以监测在与观察到的表型变化一致的时间点对多种药的响应。
EpiSwitchTM标志物-理想的药效学生物标志物
在MV4-11细胞系上进行BET(溴区结构域和额外末端)抑制剂的工作表明，BET抑制导致关键癌基因BCL2、CDK6和C-MYC的转录抑制。BET抑制剂如LSD1抑制剂是表观遗传疗法，靶向组蛋白的乙酰化状态和甲基化状态。因为位点处的拓扑变化在任何调控性变化之前，在具有EpiSwitchTM的MYC位点处的发现显示了由于LSD1抑制的调控性变化的证据。MV4-11细胞系隐藏表达MLL-AF4和FLT3-ITD的易位，而THP-1仅表达MLL-AF9。
AML(急性骨髓性白血病)的EpiSwitchTMLSD1抑制生物标志物研究
通过EpiSwitchTM平台鉴定的表观遗传生物标志物非常适合描绘LSD1去甲基化酶的表观遗传机制以及适合在细胞系内和细胞系之间对LSD1抑制剂的不同特异性进行分层。这项工作表明染色体构象特征可以用作LSD1抑制中机制相关的预测生物标志物。本研究中调查了标准LSD1抑制剂反苯环丙胺(TCP)。
EpiSwitchTMLSD1药效学生物标志物发现
细胞用1μM的反苯环丙胺(TCP)处理。用上述化合物测试两种AML(急性骨髓性白血病)细胞系THP-1和MV4-11。在表7中显示了在THP-1细胞中MYD88基因附近鉴定的染色体特征。表8中显示了在MV4-11细胞中MYD88基因附近鉴定的染色体特征。每种数目组合指向个体染色体相互作用。基于限制性位点以及检测的其他特征和引物效率来创建和选择跨基因的位置，然后分析相互作用。表7和表8中的结果表示没有特征检测。特征检测用数字1表示。以下是细胞系THP-1和MV4-11的MyD88位点的PCR EpiSwitchTM标志物结果。FACS分析用于分选CD11b±细胞的表达，作为分化的指示物。MyD88和MYC位点是在先前出版的研究基础上选择的，作为72小时处理变化的关键基因驱动因子(genetic driver)。
LSD1抑制剂(TCP)实验-发现结果
在较晚的时间点(72小时)相对于未处理的细胞改变的构象显示了2种细胞类型之间的最多一致性。这些是THP-1数据中显示的粗体双线之上的标志物，并由MV4-11数据中的阴影单元格突出。
LSD1抑制消除了与MYD88的ORF的5'上游的长程相互作用，改变了对于位点的调控景观。
LSD1抑制分析与基因表达数据–MYC位点构象与基因表达(GEX)的时间和结构相关性
MYC是驱动AML(急性骨髓性白血病)病理学的靶基因，但是在72小时的处理中，倍数变化太小而不足以作为标志物。表9中在MYC位点处72小时对于GEX数据所见的变化与在72小时鉴定的构象变化相关。相对于未处理的细胞，在MYC的GEX阴性变化符合干扰MYC增殖效果的要求。这个变化很小，也与在这个位点上由许多信号级联引出的严格控制一致。
与上述GEX数据不同的是，EpiSwitchTM生物标志物清楚地检测到与细胞分化以及它们通过细胞凋亡而死亡(表型变化)相对应的72小时处理的染色体构象特征的变化。
LSD1抑制分析与基因表达数据-MyD88位点构象与基因表达(GEX)的时间和结构相关性
在MyD88在72小时对于GEX数据所见的变化与在72小时鉴定的构象变化相关。相对于未处理的细胞，GEX变化是阳性的，这与用LSD1抑制剂处理后的这些AML(急性骨髓性白血病)细胞中所见的差异保持一致。
在由GEX和EpiSwitchTM二者鉴定的MYD88位点处用TCP处理72小时时，仅观察到1.5倍变化。微阵列基因表达分析中这种变化水平太受噪音影响。然而，对于染色体特征观察到的表观遗传变化是清楚的以遵循0或1的二进制格式。数据显示不同的变化模式。正如GEX数据中所显示的，MYC和MYD88二者都是表观遗传驱动因子，可能不会在基因表达中表现出强烈的响应，但是通过染色体特征可以被鉴定为关键的表观遗传变化是可见的。这两种基因驱动因子限定了成功治疗疗法所需的表型变化。在72小时细胞分化并发生凋亡。
表7 THP细胞-LSD1抑制剂(TCP)在48小时和72小时处理和未处理
THP-1 未处理 TCP处理48小时 TCP处理72小时
MYD88 1/29 1 1 0
MYD88 7/27 1 1 0
MYD88 9/17 1 1 0
MYD88 3/27 1 1 0
MYD88 1/13 1 1 0
MYD88 17/29 1 1 0
MYD88 3/19 1 1 0
MYD88 5/21 1 1 0
MYD88 5/29 1 1 0
MYD88 3/31 1 1 0
MYD88 7/23 1 1 1
MYD88 3/7 1 1 1
MYD88 1/25 0 0 1
MYD88 3/25 0 1 1
MYD88 1/27 0 1 1
MYD88 3/11 0 1 1
MYD88 11/27 0 1 1
MYD88 9/25 0 1 0
MYD88 13/25 0 1 1
MYD88 3/15 0 1 0
MYD88 13/29 0 1 0
MYD88 7/11 0 1 0
MYD88 7/31 0 1 0
表8.MV4-11细胞-LSD1抑制剂(TCP)在48小时和72小时处理和未处理
MV4-11 未处理 TCP处理48小时 TCP处理72小时
MYD88 3/27 0 0 0
MYD88 7/11 0 0 0
MYD88 7/27 0 1 0
MYD88 7/31 0 0 0
MYD88 1/13 1 1 0
MYD88 11/27 1 1 0
MYD88 1/25 1 1 0
MYD88 13/29 1 1 0
MYD88 1/17 1 1 1
MYD88 13/25 1 1 0
MYD88 1/29 1 1 0
MYD88 17/29 1 1 0
MYD88 5/21 1 1 1
MYD88 3/11 1 1 1
MYD88 3/15 1 1 0
MYD88 3/19 1 1 0
MYD88 3/31 1 1 1
MYD88 3/7 1 1 0
MYD88 5/25 1 1 1
MYD88 5/29 1 1 0
MYD88 7/23 1 1 0
MYD88 9/17 1 1 0
MYD88 9/25 1 1 0
表9.MYC的Illumina Human HT-12 V4.0表达微珠芯片GEX数据
表10.用TCP处理
表11.MYD88的Illumina Human HT-12 V4.0表达微珠芯片GEX数据
表12.用TCP处理
实施例3：确定与用于受治疗的患者中黑色素瘤复发的预后的伴随诊断相关的染色体相互作用的方法(PCR数据)。来源：梅奥诊所转移性黑色素瘤队列，美国
预后生物标志物预测疾病的过程或结果(例如结束、稳定或进展)。这项研究发现并证实可以作为复发的预后生物标志物的染色体特征，以鉴定在进行了手术治疗的监测的黑色素瘤患者中对于复发或恢复的体征的清楚的表观遗传染色体构象差异，并证实此类生物标志物有潜力成为用于监测黑色素瘤的复发的预后生物标志物。在这里，我们想呈现我们的实施例，染色体构象特征在向已经进行了原始生长切除手术治疗的已确认的黑色素瘤患者应用中经证实的预后使用，以鉴定可能在治疗2年内复发的候选人。
224名黑色素瘤患者进行了手术治疗以消除他们的癌症。然后观察他们两年时间段，在手术后>100天时抽取血液进行分析。
EpiSwitchTM预后生物标志物发现
对于通过下一代测序NGS的任何疾病特定长程相互作用，检验了与黑色素瘤相关的44个基因和其余基因组的染色体特征。通过深度测序对与黑色素瘤相关的染色体特征的非偏倚评估(non-biased assessment)提供了2500种候选标志物的初始库。由EpiSwitchTM平台对扩大的来自黑色素瘤患者和作为对照的非黑色素瘤皮肤癌(NMSC)患者的血液样品集进一步分析，将候选标志物的初始库减少到150种。随着样品数量的进一步扩大，其已经减少到32种，如表13中所示的。
表13.筛选的EpiSwitchTM标志物数目和使用的患者数目。
复发的预后
先前鉴定的用于从非黑色素瘤皮肤癌分层黑色素瘤的前15个标志物包括TBx2 7/15、TYR 1/9、TYR 13/17、TYR 3/11、TYR 3/23、P16 11/19、P16 7/23、P16 9/29、MITF 35/51、MITF 43/61、MITF 49/55、BRAF 5/11、BRAF 27/31、BRAF 21/31、BRAF 13/21，其取自总共8种基因：TBx2；TYR；BRAF；MITF；p16；BRN2；p21；TBx3
对黑色素瘤患者的表观遗传学图谱的3C分析揭示了具有成为预后生物标志物潜力的150种染色体特征，在扩大的测试样品队列集中减少到三种。显示染色体构象特征的转换的三种染色体特征与治疗并2年复发的结果高度一致，并且这是最好的潜在预后黑色素瘤标志物是：BRAF 5/11、p16-11/19和TYR 13/17。最后，三种染色体特征被作为预后生物标志物进行验证阶段。
表14.治疗后2年复发患者的EpiSwitchTM预后特征(0＝未检测到染色体构象，1＝检测到染色体构象)-A组
表14显示在上述患者中治疗后两年内已经观察到复发。通过对染色体特征完全无偏倚的分析，在治疗后这些疾病特异性的三种标志物在治疗后复发的大部分患者中仍然存在并且没有改变。
表15提供了作为治疗结果的染色体特征改变以反映更健康概况的证据。通过对染色体特征完全无偏倚的分析，相同的疾病特异性的三种标志物已经改变，并且在治疗后2年内没有复发的体征的大多数患者中不存在。
表16显示，相同的三种预后生物标志物在健康人群中显示出强烈的不存在倾向。来自最初发现阶段中鉴定的所有黑色素瘤特异性生物标志物，只有这三种标志物因治疗后它们的变化而具有预后价值，因为它们不同于诊断标志物。
这些结果证实这三种鉴定的染色体特征证明了染色体特征作为有效和稳健的预后生物标志物的证据。
表15.在黑色素瘤患者中成功治疗2年后未复发的患者的EpiSwitchTM预后特征(0＝未检测到染色体构象，1＝检测到染色体构象)-B组
表16.健康对照中EpiSwitchTM参考表观遗传学谱(HC＝健康对照，0＝未检测到染色体构象，1＝检测到染色体构象)-C组
样品编号 BRAF 5/11 P16 11/19 TYR 13/17 对照
JP74(5)-1 0 0 0 HC
JG80(6)-1 0 0 0 HC
JG80(6)-2 0 0 0 HC
MS80(7)-1 0 0 0 HC
MS80(7)-2 0 0 0 HC
RS86(8)-1 0 0 0 HC
ES86(9)-1 0 0 0 HC
DL(10)-1 0 0 0 HC
RM81(11)-1 0 0 0 HC
CS(12)-1 0 0 0 HC
CL84(13)-1 0 0 0 HC
ER83(14)-1 0 0 0 HC
AP57(15)-1 0 0 0 HC
AP57(15)-2 0 0 0 HC
SR86(17)-1 0 0 0 HC
YD80(18)-1 0 0 0 HC
KK69(19)-1 0 0 0 HC
KK69(19)-2 0 0 0 HC
RS84(20)-1 0 0 0 HC
AA85(21)-1 0 0 0 HC
AA85(21)-2 0 0 0 HC
AD75(22)-1 0 0 0 HC
JJ84(23)-1 0 0 0 HC
SP71(24)-1 0 0 0 HC
复发的预后(在治疗的黑色素瘤患者中监测残留病)
在根据术后血液检验的三种预后染色体特征进行分层的基础上，在治疗后复发的2年观察到224名黑色素瘤患者的交叉验证。表17显示了相关的混淆表。
表16b.
表17.混淆表
组 A B 分类为
A 49 11 仍有黑色素瘤
B 20 144 重新归类
用于药物响应的预测/药效生物标志物：转移性黑色素瘤患者中的抗PD-1(阵列数据)
黑色素瘤
恶性黑色素瘤是最不常见但最具侵袭性的皮肤癌形式。它发生在黑色素细胞中，黑色素细胞是负责合成黑色素的细胞。大多数恶性黑色素瘤是由强烈的太阳UV暴露引起的。大多数新的黑色素瘤病例被认为与对来自日光和日光浴的UV暴露的行为改变有关。全球范围内，2012年黑色素瘤发病232,000人并导致死亡55,000人。澳大利亚和新西兰的发病率最高。男性在世界范围内的发病率已经比任何其他癌症类型的发病率都增长迅速，在过去的十年中女性发病率增长第二快。1期和2期黑色素瘤个体的生存率非常好。然而，只有7-19％的癌症已经扩散到远处淋巴结或其他身体部位的黑色素瘤患者将存活超过5年。目前，准确诊断黑色素瘤的唯一方式是对可疑痣进行切除活检。治疗包括手术切除肿瘤。英国没有黑色素瘤筛查项目，但已经制定了教育项目来提高对黑色素瘤风险和症状的认识。在黑色素瘤发病率非常高的国家，例如，在澳大利亚，对于筛查项目的需求很高。这项工作涉及用于黑色素瘤免疫疗法的诊断、预后、残留病监测和伴随诊断的生物标志物。
研究背景
目前在癌症治疗中测试的所有免疫调节剂的主要问题是它们的低响应率。在晚期黑色素瘤的情况下，对于抗PD-1或抗PD-L1单克隆抗体，客观响应率仅为30-40％。这种疗法非常需要预测响应者相对于非响应者的生物标志物。PD-1位点由细胞因子表观遗传学地通过重排长程染色体构象特征来调控。
OBD技术
EpiSwitchTM平台技术理想地适用于在免疫疗法之前和在对免疫疗法响应中对PD-1表观遗传状态进行分层。EpiSwitchTM阵列已经被设计用于分析在对黑色素瘤患者中抗PD-1疗法的响应的控制和调节中涉及的>332个位点。
方法
使用EpiSwitchTM阵列分析的生物标志物鉴定：
1.通过EpiSwitchTM模式识别确定的332个基因位置的染色体构象。
2.PD1筛选阵列上的14,000个EpiSwitchTM标志物。
样品
所有患者以前都曾接受过以化疗和抗CTLA-4疗法的治疗。两个时间点考虑治疗前(基线样品)和治疗后(12周样本)
发现队列
·基线时4名响应者相对于4名非响应者
·12周时4名响应者相对于4名响应者(匹配的)
超几何分析
作为阵列数据分析的最后一步，进行超几何分析是为了鉴定调控枢纽(regulatory hub)，即最密集调控的基因，作为潜在的致病靶标和优选的分层位点。数据按照R相对于R 12W(12W_FC_1)的表观遗传率进行排序，BL二进制中的1表示在相对于非响应者的响应者中存在环，但是在响应者基线与12周时的响应者相比较时。表观遗传率表明在12周响应者患者样品中环的存在更丰富。这表明已经存在这个特征的扩大。
概要
这种用于潜在预测和药效学生物标志物的抗PD1疗法的表观遗传学筛选提供了大量新的调控知识，与先前的生物学证据一致。该工作提供了用于验证分析的预测性和药效学/响应EpiSwitchTM标志物的丰富的库。结果显示允许抗PD-1疗法的限定的表观遗传学谱的存在。允许抗PD1疗法的表观遗传学谱在基线初治患者(patient，未用药患者/此前未接受过药物的患者)中存在，并且在12周期间因治疗得到加强。
更多信息
这项工作涉及EpiSwitchTM作为诊断测试的基础，以通过全科医生解决黑色素瘤不良诊断的问题。从代表真实临床背景的86个患者样品的最初组中筛选和鉴定出15种主要的EpiSwitchTM生物标志物。然后在以下2个独立的患者队列中训练和验证生物标志物：一个来自澳大利亚(395个患者)以及一个来自Mayo Clinic(梅奥医学中心)(119个患者)：
·119个独立回顾性地注释的血液样品
·59个黑色素瘤样品
·60个对照(20个NMSC，20个良性病症，20个健康患者))
·2个在美国的诊所收集
通过统计学处理鉴定68种EpiSwitchTM标志物作为抗PD-1疗法基线的预测性生物标志物。(PD1-R相对于NR BL)。R是响应者，NR是非响应者。通过统计学处理鉴定的63种EpiSwitchTM标志物作为抗PD-1疗法的响应生物标志物。(PD1 R-BL相对于R-12W)。10种标志物都是用于预测性和响应标志物的良好候选者。
费歇尔精确检验结果：在独立患者队列上用EpiSwitchTMPCR平台验证的顶部8个预测性EpiSwitchTM阵列标志物(见表37)。参见表38的辨别标志物，所述辨别标志物来自对于在基线的响应者和在12周的响应者之间的PCR分析的费歇尔精确分析。1是构象存在。0是构象不存在/阵列：R12_W表示在12周时响应者中存在构象。
在基线的响应者相对于非响应者中测量的STAT5B_17_40403935_40406459_40464294_40468456_FR探针，并且构象存在于响应者中。在这个比较中，标志物在12周时的响应者中，这是因为用于检测构象的DNA的浓度在响应者相对于非响应者中大于在基线的响应者相对于在12周的响应者中的情况，表明表观遗传负荷在抗PD-1响应的患者中已经增加。标志物STAT5B和IL15是特别感兴趣的，并且参与负责有效响应于抗PD1疗法的关键个性化医疗和调控事件(见表39至40、43至47)。
下面的表36a至36f、37a、37b、38a和38b也涉及实施例3，并如下：
表36a.顶部探针(Top Probe)-抗PD1(黑色素瘤)-响应者
表36b.顶部探针-抗PD1(黑色素瘤)-响应者-探针序列
表36c.顶部探针-抗PD1(黑色素瘤)-响应者-位点
表36d.顶部探针-抗PD1(黑色素瘤)非响应者
表36e.顶部探针-抗PD1(黑色素瘤)非响应者
表36f.顶部探针-抗PD1(黑色素瘤)非响应者-探针序列和位点
表37a.抗PD1：药效学响应标志物
表37b.抗PD1：药效学响应标志物
表38a.抗PD1：药效学响应标志物–在基线响应者和基线非响应者中无差异，但在12周响应者中显示显著变化
表38b.探针位置-抗PD1：药效学响应标志物-在基线响应者和基线非响应者中无差异，但在12周响应者中显示显著变化
适应症实施例
实施例4-肌萎缩性侧索硬化(ALS)
运动神经元病肌萎缩性侧索硬化(ALS或葛雷克氏症(Lou Gehrig’s disease))是一种致命的神经退行性疾病，其特征在于中枢神经系统中主要运动神经元的进行性死亡。症状包括肌无力和肌肉萎缩、吞咽和承担日常任务困难。随着疾病的进展，负责呼吸的肌肉逐渐失效，造成呼吸困难，最后导致死亡。ALS的平均发病率为每100,000人中有2人，但在英国和美国则更高，高达每100,000人中有5人。据估计，美国有超过50,000名患者以及英国有5,000名患者具有该病症。ALS患者的死亡率很高：ALS诊断的中位生存期(即50％患者死亡的时间)在不同的研究中有所不同，但在最可靠的(无偏见的)人群体研究中，其是大约22个月具有18-30个月的范围。没有已知的治愈，ALS的治疗重点是支持性治疗(支持性护理，supportive care)。目前只有一种药物被批准用于治疗，利鲁唑可使ALS患者的生命期适度增加，但症状改善不大。尽管对ALS的生物学基础进行了深入研究，诊断和治疗方法以及疾病进展的监测仍然是挑战。这样的预后检验将通过允许根据临床异质性的生物介质对患者进行亚分层来极大地有利于ALS患者，可能通过鉴定快速和慢速进展者来允许更准确的预后和护理计划。OBD已经发现将ALS相对于健康对照以及快速进展的ALS相对于缓慢进展的ALS进行分层的EpiSwitchTM标志物，以开发和验证ALS的诊断的、预后的和预测的EpiSwitchTM生物标志物。
来源：东北肌萎缩侧索硬化联盟(NEALS)-美国。
参见表1、2、18和42以及下文中的将ALS相对于健康对照分层的ALS探针-EpiSwitchTM标志物。表27显示了该适应症的基因数据。
进行进一步的工作来验证顶部的ALS阵列标志物，并鉴定可以研究相互作用的引物。对阵列标志物的统计分析告知基于PCR的测定开发的候选名单选择。从最好的分层ALS阵列探针的列表中，将99种标志物带到PCR阶段。
使用集成DNA技术(IDT)软件(和Primer3web版4.0.0软件，如果需要)从微阵列鉴定的标志物来设计引物。在每个引物组上进行引物检验；每个组在样品的集合亚组上进行检验以确保适当的引物可以研究潜在的相互作用。存在来自PCR的扩增产物视为指示连接产物的存在，表明发生了特定的染色体相互作用。如果引物检验成功，则将引物组通过筛选。
使用单变量(LIMMA软件包，R语言)和多变量(GLMNET软件包，R语言)统计的组合来分离特征集(signature set)，并使用WEKA(机器学习算法包)中的逻辑建模进行验证。使用来自东北肌萎缩侧索硬化联盟(NEALS)的数据，选择最好的10种分层PCR标志物用于58个个体(29×ALS；29×健康对照-HC)的验证。这些是根据它们的费歇尔精确检验的P-值而选择的。来自所有3个检验的一贯好的标志物是CD36中的EpiSwitch标志物。表41中显示的前9个PCR标志物在ALS和HC之间分层，具有90％的等级区分指数。
针对牛津大学提供的小型独立队列样品来分析ALS标志物集。即使在小的样品亚组中，也基于生物标志物显示样品的分层。四种标志物将32个(16个ALS，16个健康对照)样品的亚组分层，p值<0.3。这些核心标志物分别是基因EGFR、DNM3、CD36和GLYCAM1中的ALS.21.23_2、DNM3.5.7_8、ALS.61.63_4和NEALS.101.103_32。费歇尔精确检验、GLMNET和贝叶斯逻辑模型将CLIC4标记为四种核心标志物的有价值补充。
表42中提供了在表41中给出的PCR标志物的引物的序列。
实施例5-II型糖尿病(DM)(T2DM)
2型糖尿病(也称为T2DM)是最常见的糖尿病形式。糖尿病可能是由于胰腺不能产生足够的调节血糖水平的激素胰岛素，或者由于胰岛素敏感性降低，身体不能有效地使用它产生的激素而发生。直到最近，T2DM才在成人中被诊断出来，但现在已经发生在儿童和年轻人身上。根据世界卫生组织(WHO)统计，糖尿病达到全球流行水平，全世界有3.46亿患者，其发病率预计在2030年达到双倍。仅在2004年，大约有340万人因糖尿病及其并发症而死亡，大部分死亡发生在低收入和中等收入国家。由于人口老龄化，生活方式的改变(诸如缺乏运动和吸烟)，以及饮食和肥胖，T2DM的发病率正在上升。T2DM不依赖于胰岛素，可以通过改变生活方式(诸如饮食、运动)来控制，和进一步以药物辅助。用胰岛素治疗的个体发生严重低血糖(低血糖水平)的风险较高，因此他们的药物和血糖水平需要常规监测。一般而言，患有T2DM的年长个体发生心血管疾病(CVD)和其他并发症的风险较高，因此通常比新近发现疾病的年轻成年人需要更多的治疗。据估计，英国有七百万人受糖尿病前期病症影响，这增加了进展为T2DM的风险。这样的个体特征在于升高的血糖水平，但通常是无症状的，因此多年来可能被忽视，从而对他们的健康有逐渐的影响。发明人开发糖尿病前期状态和T2DM的预后分层。本文提供了将糖尿病前期状态(Pre-T2DM)相对于健康对照进行分层的EpiSwitchTM标志物，以及发现将T2DM相对于健康对照进行分层的EpiSwitchTM标志物，以及将侵袭性T2DM相对于慢性T2DM分层的预后标志物。
来源：诺福克与诺维奇大学医院(NNUH)，NHS基金会信托-英国诺维奇
参见下文的表19a、19b、19c和19d的将2型糖尿病前期相对于健康对照分层的2型糖尿病前期探针-EpiSwitchTM标志物。表28显示了基因数据。
还参见下文的表20a、20b、20c、20d的将2型糖尿病相对于健康对照分层的2型糖尿病探针-EpiSwitchTM标志物。表29显示了基因数据。
实施例6-I型糖尿病(T1DM)
1型糖尿病(DM)(也称为T1DM；以前称为胰岛素依赖性糖尿病或青少年糖尿病)是由胰腺中产生胰岛素的β细胞的自身免疫性破坏引起的一种形式的糖尿病。经典症状是多尿(频尿)、多饮(增加口渴)、多食(增加饥饿)和体重减轻。虽然T1DM占所有糖尿病病例的5％，但它是儿童中最常见的内分泌和代谢病症之一。该糖尿病的原因是未知的，但相信与遗传因素和环境触发二者有关。全球范围内，患T1DM的人数尚不清楚，尽管估计每年约有80,000儿童患此病。新病例的发展因国家和地区而异。美国和北欧地区每年每100,000人有8-17个新病例。糖尿病的治疗涉及降低血糖和损害血管的其他已知危险因素的水平。胰岛素的施用对生存至关重要。胰岛素治疗必须无限期地继续进行，通常不会影响正常的日常活动。如果不治疗，糖尿病会导致许多严重的长期并发症，诸如心脏病、中风、肾衰竭、足部溃疡和眼睛损伤。急性并发症包括糖尿病酮症酸中毒和昏迷。OBD的糖尿病项目专注于开发用于T1DM诊断和预后分层的EpiSwitchTM生物标志物。
本文展示了用于将T1DM相对于健康对照分层的EpiSwitchTM标志物。
来源：设于格拉斯哥的Procurement Company Tissue Solutions(采购公司组织方案)收集的高加索人样品(俄罗斯收集的样品)；NEALS联盟对照(美国)。
参见下文的表21a、21b、21c和21d的将T1DM相对于健康对照分层的1型糖尿病(T1DM)探针-EpiSwitchTM标志物。表30显示了基因数据。
实施例7-溃疡性结肠炎(UC)
溃疡性结肠炎(UC)是一种胃肠道慢性炎性疾病，是肠的炎性疾病中最常见的类型，每年发病率为每100,000人中10人，患病率为每100,000人中243人。虽然UC可以发生在任何年龄的人中，但是在15和30岁以及大于60岁的年纪的人中更容易发展。溃疡性结肠炎的确切原因尚不清楚。然而，据信过度活跃的肠道免疫系统、家族史和环境因素(例如情绪应激)可能在引起UC中起作用。
在高加索人和德系犹太裔的人中比在其他种族和族裔亚群中更普遍。这种病症最常见的体征和症状是伴有血液或脓液和腹部不适的腹泻。该病也可以引起关节、脊柱、皮肤、眼睛、肝脏及其胆管的炎症。UC诊断通过取家族史、体格检查、实验室检查和大肠内镜检查进行。这种终身疾病伴有显著的发病率，尤其是如果控制不好，可能会造成社会和心理上的后遗症。估计有30-60％的溃疡性结肠炎患者每年将至少有一次复发。其中约80％为轻度至中度，约20％为严重。大约有25％的UC患者在其一生中会发作一次或多次急性重症结肠炎。其中20％需要首次入院手术切除全部或部分结肠(结肠切除术)，下次入院时切除40％。尽管30年来死亡率稳步改善，但急性重症结肠炎死亡率仍然高达2％。死亡率直接受干预(包括药物治疗和结肠切除术)时间的影响。
溃疡性结肠炎与结肠直肠癌的发展有很好的相关性，在长期和广泛的疾病中风险最大。复发的治疗可能取决于临床严重度、疾病程度和患者的偏好，可能包括使用氨基水杨酸、皮质类固醇或免疫调节剂。由此产生的广泛的药剂选择和给药方案在英国各地的管理中产生了广泛的异质性，以及强调全面的指导方针的重要性以有助于医疗保健专业人员提供一致的高质量护理。
本文提供了用于将UC相对于健康对照进行分层的EpiSwitchTM标志物，以用于发展UC的疾病特异性特征。
来源：设于格拉斯哥的Procurement Company Tissue Solutions(采购公司组织方案)收集的高加索人样品(俄罗斯收集的样品)；NEALS联盟对照(美国)。
参见下文的表22a、22b、22c和22d的将UC相对于健康对照分层的溃疡性结肠炎(UC)探针-EpiSwitchTM标志物。表31显示了基因数据。
实施例8-系统性红斑狼疮(SLE)
系统性红斑狼疮(SLE)又称盘状红斑狼疮或播散性红斑狼疮，是一种影响皮肤、关节、肾脏、大脑和其他器官的自身免疫性疾病。虽然“狼疮”包括许多不同的疾病，SLE是最常见的狼疮类型。SLE是具有一系列广泛临床表现的疾病，包括皮疹、光敏感、口腔溃疡、关节炎、肺和心脏周围内膜(lining，内衬)的炎症、肾脏问题、癫痫和精神病以及血细胞异常。症状可能会有所不同，并可能随着时间的推移而改变，且不是疾病特异性的，这使得诊断困难。该病发生于婴儿期至老年期，发病高峰在15至40岁之间。报告的人群体中SLE患病率为每100,000人有20至150例。在女性中，患病率为从每100,000人有164人(白人)到406人(非裔美国人)不等。由于轻度疾病的检测有所改善，发病率在20世纪最后40年几乎翻三倍。北美、南美、欧洲和亚洲的估计发病率为每100,000人有1人至25人。SLE的确切原因尚不清楚，但有几个因素与该疾病有关。狼疮患者经常有家族成员患有其他自身免疫性疾病症。有可能是环境触发，如紫外线、某些药物、病毒、身体或精神压力和创伤。SLE无法治愈，治疗就是缓解症状。这些将根据表现的症状而变化，并可能包括抗消炎药物、类固醇、皮质类固醇和抗疟疾药物。生存一直在改善，表明更多或更温和的病例正在得到承认。OBD一直在开发SLE的预后特征。
参见表23a、23b、23c和23d的将SLE相对于健康对照分层的SLE探针-EpiSwitchTM标志物。表32显示了基因数据。
来源：设于格拉斯哥的Procurement Company Tissue Solutions(采购公司组织方案)收集的高加索人样品(在美国收集的样品)；NEALS联盟对照。
实施例9-多发性硬化症(MS)
多发性硬化症(MS)是中枢神经系统(CNS)获得性慢性免疫介导的炎性病症，影响大脑和脊髓二者。MS的原因尚不清楚。相信在遗传易感的人中对环境触发的异常免疫响应导致免疫介导的急性炎症，然后是慢性炎症。炎症的起始阶段之后是神经系统中受影响细胞的进行性退化阶段。MS在欧洲、美国、加拿大、新西兰和澳大利亚各地区的人中比较常见，在亚洲和热带地区则较少见。该病影响了英国的大约100,000人。在美国，MS患者人数估计约为400,000人，每年诊断出约10,000新病例。MS患者通常在20至40岁之间形成症状，经历视觉和感觉障碍、四肢无力、步态问题以及膀胱和肠症状。他们最初可能会有部分恢复，但是随着时间的推移，会逐渐形成残疾。虽然没有治愈的方法，但治疗和管理MS有很多选择。这些选择包括药物治疗、运动和理疗、饮食和替代疗法。MS是一种潜在的高度残疾性疾患，具有相当大的个人、社会和经济后果。MS患者确诊后生存多年，对其工作能力有显著影响，以及对其生活质量和其家属的生活质量产生不利和通常使人高度虚弱的影响。OBD的MS项目涉及看到在原发性进行性和复发-缓解型MS之间的预后分层。
最常见(大约90％)的疾病模式是复发-缓解型MS(MSRR)。大多数患有此类MS的人首先在他们的早期20几岁时出现症状。此后，有周期性发作(复发)，之后部分或完全康复(缓解)。受影响的神经模式、发作的严重度、恢复的程度和复发的时间人与人都各不相同。最终，约三分之二患有复发-缓解型MS的人进入MS的继发性进展期。这发生在与复发无关的残疾逐渐累积时，这种复发变得不那么频繁或完全停止。
本文提供了EpiSwitchTM监测标志物，以对MS患者进行分层，所述MS患者是相对于非响应者对IFN-B治疗的响应者；EpiSwitchTM标志物将MSRR相对于健康对照进行分层以及EpiSwitchTM标志物将MSRR(复发缓解性MS类型)相对于MSPP(原发性进行性MS类型)进行分层。
来源：设于格拉斯哥的Procurement Company Tissue Solutions(采购公司组织方案)收集的高加索人样品(收集的样品MS-RR：俄罗斯；MS IFN-B R相对于NR：USA)；NEALS联盟对照(美国)
参见下文的表24a、24b、24c和24d的将MSRR相对于健康对照分层的复发-缓解型多发性硬化症(MSRR)探针-EpiSwitchTM标志物。表33显示了基因数据。
还参见下文的表25a、25b、25c和25d的将对(B)IFN-B(IFN-β)治疗响应者的MS患者相对于(A)非响应者分层的多发性硬化症(MS)探针-EpiSwitchTM监测标志物。表34显示了基因数据。
实施例10-神经纤维瘤病(NF)
在患有NF1突变的患者中，难以预测转变为恶性状态，因为它受患者的表观遗传背景支配。在NF2突变体中，疾病的预后非常可靠并且由遗传学本身强烈限定。本文呈现的是EpiSwitchTM标志物，用于将恶性周围神经鞘膜肿瘤(MPNST)相对于良性丛状物分层，显示在富集数据中的329种顶部探针。
来源：比利时-鲁汶大学
参见下文的表26a和26b的将良性丛状物相对于恶性周围神经鞘膜肿瘤(MPNST)分层的神经纤维瘤(NF)探针-EpiSwitchTM标志物。表35显示了基因数据。
实施例11-不同癌症中与抗-PD1响应性有关的染色体相互作用
表47显示在具有特定癌症的个体中对抗PD1的响应者(除非另有说明是NR(非响应者))中存在的染色体相互作用的模式。下面解释表中使用的术语。
DLBCL_ABC：弥漫性大B细胞淋巴瘤亚型活化的B细胞
DLBCL_GBC：弥漫性大B细胞淋巴瘤亚型生发中心B细胞
HCC：肝细胞癌
HCC_HEPB：具有乙型肝炎病毒的肝细胞癌
HCC_HEPC：具有丙型肝炎病毒的肝细胞癌
HEPB+R：在缓解的乙型肝炎
Pca_Class3：3期前列腺癌
Pca_Class2：2期前列腺癌
Pca_Class1：1期前列腺癌
BrCa_Stg4：4期乳腺癌
BrCa_Stg3B：3B期乳腺癌
BrCa_Stg2A：2A期乳腺癌
BrCa_Stg2B：2B期乳腺癌
BrCa_Stg1A：1A期乳腺癌
BrCa_Stg1：1期乳腺癌
PD_1_R_黑色素瘤：黑色素瘤响应者
PD_1_NR_黑色素瘤：黑色素瘤非响应者

Claims (18)

1.一种确定与区分亚群的伴随诊断相关的表观遗传染色体相互作用的方法，包括使来自亚群的第一组核酸与代表染色体相互作用的索引群体的第二组核酸接触，以及允许互补序列杂交，其中所述第一组核酸和所述第二组核酸中的核酸代表了连接产物，所述连接产物包含来自已经在表观遗传染色体相互作用中聚在一起的两个染色体区域的序列，并且其中所述第一组核酸和所述第二组核酸之间的杂交模式允许确定哪些表观遗传染色体相互作用对群体中的亚群是特异性的，其中亚群在与伴随诊断相关的特征方面不同。
2.根据权利要求1所述的方法，其中：
-所述亚群是人类群体的亚群，和/或
-所述第一组核酸来自至少8个个体；和/或
-所述第一组核酸来自第一亚群的至少4个个体和来自优选与所述第一亚群不重叠的第二亚群的至少4个个体，和/或
-所述第二组核酸代表未选择的染色体相互作用组，和/或
-所述第二组核酸在限定的位置与阵列结合，和/或
-所述第二组核酸代表最少100个不同基因或位点中的染色体相互作用，和/或
-所述第二组核酸包含代表至少1000种不同的表观遗传学染色体相互作用的至少1000个不同的核酸，和/或
-所述第一组核酸和所述第二组核酸包含长度为10个至100个核苷酸碱基的核酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，进行所述方法以确定哪个位点或基因与所述与伴随诊断相关的特征相关。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述亚群在以下方面不同：
(i)响应于特定的治疗和/或预防(特别是响应于特定的药物治疗和/或预防)，和/或
(ii)对特定病症的易感性，和/或
(iii)可能导致复发的残留疾病的存在。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述第一组核酸在包括以下步骤的方法中产生：
(i)已经在染色体相互作用中聚在一起的染色体区域的体外交联；
(ii)用酶对所述交联的DNA进行限制性消化切割；以及
(iii)连接所述交联的切割的DNA末端以形成所述第一组核酸(特别地包含所连接的DNA)。
6.一种伴随诊断测定方法，其确定人针对与治疗和/或预防(特别是药物治疗和/或预防)相关的特征而处于哪个亚群中，所述方法包括：
(a)把已通过权利要求1至5中任一项所述的方法鉴定为对亚群具有表观遗传相互作用特征的位点归类，和/或
(b)检测至少5种表观遗传染色体相互作用的存在或不存在，所述至少5种表观遗传染色体相互作用优选地在至少5个不同的位点上，其是以下各项的特征：
(i)响应于特定的治疗和/或预防(特别响应于特定的药物治疗和/或预防)，和/或
(ii)对特定病症的易感性，和/或
(iii)可导致复发的残留疾病的存在。
7.根据权利要求6所述方法，包括如权利要求6中限定的步骤(a)，
其中：
(1)所述位点是基因，和/或
(2)把单核苷酸多态性(SNP)归类，和/或
(3)从所述位点表达微RNA(miRNA)，和/或
(4)从所述位点表达非编码RNA(ncRNA)，和/或
(5)所述位点表达编码至少10个连续氨基酸残基的核酸序列，和/或
(6)所述位点表达调控元件，和/或
(7)所述归类包括测序或确定来自所述位点的表达水平。
8.根据权利要求6或7所述的方法，包括如权利要求6中限定的步骤(b)，其中把5种至500种、优选20种至300种、更优选50种至100种表观遗传学染色体相互作用归类，所述表观遗传学染色体相互作用优选在至少5个不同的位点。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述与伴随诊断相关的特征涉及：
-包含抗体的治疗，和/或
-与免疫系统或与癌症相关的病症。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述与伴随诊断相关的特征是：
-类风湿性关节炎患者中对甲氨蝶呤的响应性，和/或
-对急性骨髓性白血病治疗的响应性，和/或
-黑色素瘤复发的可能性，和/或
-黑色素瘤患者中对抗PD-1疗法的响应性，和/或
-对抗PD-1、抗PD-L1疗法或抗PD1-1/抗PD-L1联合疗法的响应性，优选在黑色素瘤、乳腺癌、前列腺癌、急性骨髓性白血病(AML)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、胰腺癌、甲状腺癌、鼻癌、肝癌或肺癌的治疗中。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述与伴随诊断相关的特征涉及以下系统中的任一种：代谢系统、免疫系统、内分泌系统、消化系统、皮肤系统、骨骼系统、肌肉系统、淋巴系统、呼吸系统、神经系统或生殖系统；并且其中所述特征优选是
-多发性硬化症患者中对IFN-B(IFN-β)治疗的响应性，和/或
-对复发-缓解型多发性硬化症的易感性，和/或
-原发进展型多发性硬化症的可能性，和/或
-对肌萎缩侧索硬化(ALS)疾病状态的易感性，和/或
-对快速进展的肌萎缩侧索硬化(ALS)疾病状态的易感性，和/或
-对侵袭性2型糖尿病疾病状态的易感性，和/或
-对2型糖尿病疾病状态的易感性，和/或
-对2型糖尿病前期状态的易感性，和/或
-对1型糖尿病疾病状态的易感性，和/或
-对系统性红斑狼疮(SLE)疾病状态的易感性，和/或
-对溃疡性结肠炎疾病状态的易感性，和/或
-溃疡性结肠炎患者结肠直肠癌复发的可能性，和/或
-神经纤维瘤病患者的恶性周围神经鞘瘤的可能性，和/或
-发展前列腺癌和/或侵袭性前列腺癌的可能性，和/或
-发展神经变性疾病或病症的可能性和/或对神经变性疾病或病症的易感性，所述神经变性疾病或病症优选痴呆诸如阿尔茨海默病、轻度认知障碍、血管性痴呆、路易体痴呆、额颞叶痴呆，或更优选阿尔茨海默病，最优选β淀粉样蛋白聚集体诱导的阿尔茨海默病，和/或
-痴呆患者(优选阿尔茨海默病患者，更优选具有β淀粉样蛋白聚集体的阿尔茨海默病患者)与没有阿尔茨海默病的认知障碍患者之间特别是关于记忆和/或认知的比较。
12.一种治疗剂，用于治疗和/或预防个体中的病症，其中，所述个体已通过如前述权利要求中任一项所述的方法鉴定为需要所述治疗剂。
13.一种鉴定能够将个体的疾病状态从第一状态变为第二状态的剂的方法，包括确定候选剂是否能够将染色体相互作用从与所述第一状态对应的染色体相互作用变为对应于所述第二状态的染色体相互作用，其中优选地，所述第一状态和所述第二状态对应于以下的存在或不存在：
(i)对特定治疗和/或预防(特别是对特定药物治疗和/或预防)的响应性，和/或
(ii)对特定病症的易感性，和/或
(iii)可能导致复发的残留疾病；和/或
其中优选所述疾病状态对应于与如权利要求1至11中任一项所限定的伴随诊断相关的特征。
14.一种确定药物效果的方法，包括检测由所述药物引起的表观遗传染色体相互作用的变化，其中所述效果优选为所述药物的作用机制或者为所述药物的药效学特性，并且其中所述染色体相互作用优选地对以下是特异性的：
(i)对特定治疗和/或预防(特别是对特定药物治疗和/或预防)的响应性，和/或
(ii)对特定病症的易感性，和/或
(iii)可能导致复发的残留疾病；和/或
其中优选地，所述染色体相互作用对应于与如权利要求1至11中任一项所限定的伴随诊断相关的特征。
15.一种确定对基因组的第一位点上的序列的遗传修饰是否影响所述基因组的其他位点的方法，包括在进行遗传修饰之后在一个或多个其他位点检测染色体相互作用的存在或不存在，其中优选地所述遗传修饰改变了系统特征，其中所述系统优选为代谢系统、免疫系统、内分泌系统、消化系统、皮肤系统、骨骼系统、肌肉系统、淋巴系统、呼吸系统、神经系统或生殖系统，其中：
-所述检测染色体特征可选地包括检测存在或不存在5种或更多种(例如5种)不同的染色体相互作用，所述染色体相互作用优选地位于5个或更多个(例如5个)不同的位点，优选地如权利要求7中限定的，和/或
-其中优选地，所述染色体特征或相互作用通过如权利要求1至5中任一项所限定的方法来鉴定，和/或
-其中修饰的位点和/或检测染色体存在或不存在染色体相互作用的一个或多个位点包括CTCF结合位点，和/或
-其中检测到的染色体相互作用对应于与如权利要求1至11中任一项所限定的伴随诊断相关的特征。
16.根据权利要求15所述的方法，其中，所述遗传修饰通过以下方法实现，所述方法包括向细胞中引入(a)两种或更多种RNA引导的核酸内切酶或编码两种或更多种RNA引导的核酸内切酶的核酸和(b)两种或更多种引导RNA或编码两种或更多种引导RNA的DNA，其中每种引导RNA将所述RNA引导的核酸内切酶之一引导至染色体序列中的靶向位点，并且所述RNA引导的核酸内切酶在靶向位点处切割染色体序列的至少一条链。
17.根据权利要求15所述的方法，其中，所述遗传修饰通过改变至少一种基因产物的表达的方法来实现，所述方法包括向含有和表达具有靶序列并编码所述基因产物的DNA分子的真核细胞中引入工程化的、非天然存在的成簇的规则间隔短回文重复(CRISPR)—CRISPR相关的(Cas)(CRISPR-Cas)系统，所述系统包含一种或多种载体，所述载体包含：
a)在真核细胞中可操作的第一调控元件，其可操作地连接至与所述靶序列杂交的编码CRISPR-Cas系统引导RNA的至少一种核苷酸序列，以及
b)在真核细胞中可操作的第二调控元件，其可操作地连接至编码II型Cas9蛋白的核苷酸序列，
其中组分(a)和组分(b)位于所述系统的相同或不同载体上，由此所述引导RNA靶向所述靶序列，且所述Cas9蛋白切割所述DNA分子，由此改变所述至少一种基因产物的表达；并且其中所述Cas9蛋白和所述引导RNA并非一起天然存在，其中优选地每种RNA引导的核酸内切酶衍生自Cas9蛋白并且包含至少两个核酸酶结构域，并且可选地其中所述两种RNA引导的核酸内切酶中的每种的核酸酶结构域之一被修饰使得每种RNA引导的核酸内切酶切割双链序列中的一条链，并且其中所述两种RNA引导的核酸内切酶一起在染色体序列中引入双链断裂，所述双链断裂通过DNA修复过程而得以修复使得所述染色体序列被修饰。
18.根据权利要求15至17中任一项所述的方法，其中，所述遗传修饰包括至少5个、20个、50个、100个或100个碱基，优选地达10,000个或1000,000个碱基的缺失、插入或替代。
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