CN107531781B - 用于阿尔茨海默病和相关紊乱的抗体分子和肽递送系统 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于治疗和管理阿尔茨海默病和相关紊乱的抗体分子和肽递送系统。具体而言，所述的抗体分子优选地以单一结构域的形式结合寡聚体形式的β‑淀粉样肽，并且所述的肽递送系统促进此类抗体分子以及其他的货物分子特异性地运输穿越血脑屏障。本发明还涉及抗体分子和递送肽的构建体，以及包含有效量的抗体分子、递送肽和/或它们的构建体的药物组合物，其中包括人源化形式的抗体分子和构建体。本发明进一步涉及制备这些产物及其药物组合物的方法；以及使用该药物组合物治疗或预防阿尔茨海默病和相关紊乱的方法，例如涉及β‑淀粉样肽或其他在脑中聚集的肽的累积的那些；并且本发明还涉及诊断这些紊乱的方法和试剂盒。

Description

用于阿尔茨海默病和相关紊乱的抗体分子和肽递送系统
技术领域
本发明涉及用于治疗和管理阿尔茨海默病和相关紊乱的抗体分子和肽递送系统。具体而言，所述的抗体分子优选地以单一结构域形式与寡聚体形式的β-淀粉样肽结合，并且所述的肽递送系统有利于此类抗体分子以及其他货物分子特异性地运输穿越血脑屏障。本发明还涉及抗体分子和递送肽的构建体以及包含有效量的抗体分子、递送肽和/或它们的构建体(包括人源化形式的抗体分子和构建体)的药物组合物。本发明进一步涉及制备这些产物以及它们的药物组合物的方法；以及使用所述的药物组合物治疗或预防阿尔茨海默病和相关紊乱(例如涉及β-淀粉样肽或其他在脑中聚集的肽的累积的那些)的方法；及用于诊断这些紊乱的方法和试剂盒。
相关申请的交叉引用
本申请要求2015年1月29日提交的葡萄牙专利申请号108182D和2015年1月29日提交的葡萄牙专利申请号108181C的外国优先权，这些申请的每一份的完全公开内容以引用方式并入本文。
序列表
本申请包含序列表，该序列表以ASCII形式以电子方式提交，并且以引用方式全文并入本文。所述的于2016年1月28日创建的ASCII拷贝命名为14116-105015PC_SL.txt，其大小为168,632字节。
背景技术
由于人类群体的老龄化，诸如阿尔茨海默病、帕金森病和亨廷顿病之类的神经退行性疾病越来越普遍。这些疾病称为“蛋白质病”，因为它们的特征在于特定蛋白质的功能障碍，导致蛋白质聚集体的细胞外和细胞内累积。
阿尔茨海默病(AD)是全世界最普通形式的痴呆。近来的数据显示阿尔茨海默病患者的病例数呈指数增加，突显研发有效治疗方法的需要。今天，全世界大约35600000人忍受这种疾病；到2050年，预计数量接近于115000000人。事实上，在制药工业中具有最高成长潜力的部门关注神经疾病药品的研发。
AD在神经病理学上的特征为β-淀粉样肽(BAP)的累积，其是由淀粉样前体蛋白质(APP)的加工得到的。BAP构成了老年斑的主要成分，其是AD发病机理的起点。
尽管近年来，在理解和治疗脑病理学方面具有一些进展，但是中枢神经系统(CNS)的许多紊乱，包括AD，一直是毁灭性的和难以治愈的。治疗这些紊乱中的一个问题在于许多药品不能穿越血脑屏障(BBB)到达CNS，这是使用大分子药品时特别遇见的问题。BBB由专门的内皮细胞(脑内皮细胞)形成，这些细胞排成供应脑的毛细管，并且防止或阻止物质由血液穿越进入CNS中。
已经尝试多种方法克服所述的困难。例如使用控释系统，但是这些系统有时干扰BBB的操作。另一种方法涉及研发亲脂性药品，但是这些药品具有被快速排出至血流中的缺点。例如使用甘露醇注射以减小细胞尺寸并在细胞之间留下空隙，还检验了暂时打开血脑屏障的手术过程，但是该过程可能是不安全的、潜在地导致肿胀、抽搐以及增加的易感染性。递送药品穿越BBB的另一种方法涉及将药品与对BBB上的受体具有特异性的抗体连接，所述BBB上的受体例如胰岛素、瘦蛋白或铁递送蛋白受体，并且利用现有的“入口”穿越BBB(利用受体介导的细胞增多)。然而，使用这种方法的递送受到受体饱和以及差的渗透至血管外组织中的限制。此外，这些受体在其他组织中表达，并且与重要的细胞代谢功能有关，从而产生安全性风险。
备选方法涉及使用具有转运能力的细胞穿透肽(CPP)。根据以下发现：触角同源结构域的第三个螺旋结构穿越生物膜，研究者研究了能够携带多种货物装载物到达细胞内部的不同CPP，所述货物包括低分子的药品、脂质体、质粒、抗体和纳米颗粒。然而，CPP作为递送系统的用途受到CPP介导的货物递送中缺乏细胞特异性的限制。
此外，穿越BBB，对于治疗剂而言有利的是发挥其治疗作用，然后高效地从脑和CNS中清除，并返回至一般循环用于从患者肌体中消除。
因此，本领域仍需要用于治疗和管理AD和相关紊乱的治疗剂，特别是需要能够特异地穿越BBB，然后高效地从其中清除的治疗剂，以及安全地将治疗剂递送穿越屏障到达CNS的递送系统。还需要早期和晚期AD的的有效诊断。本发明解决了这些和其他的需要。
发明概述
本发明的一个方面涉及选择性靶向非纤维状形式的β-淀粉样肽(例如单体和寡聚体形式)超过靶向纤维状形式的肽的抗体分子。在具体的实施方案中，抗体分子为单一结构域抗体，其对β-淀粉样肽的寡聚体具有免疫原性，所述的β-淀粉样肽称为β-淀粉样肽42，例如包含如下氨基酸序列的单一结构域抗体，所述的氨基酸序列选自SEQ ID NO:1-21；以及该抗体的嵌合形式和人源化形式，其中所述序列的一个或多个CDR与相应的人类抗体结构域的构架区结合。在具体的实施方案中，抗体分子与递送系统联合使用从而促进穿越血脑屏障。
本发明的另一个方面涉及穿越血脑屏障的肽，特别是相当于SEQ ID NO:127的氨基酸序列的片段，所述的片段特异性地穿越所述的屏障。所述的肽提供递送系统，促进货物分子转运穿越血脑屏障，用于递送至脑和中枢神经系统。在具体的实施方案中，本发明的抗体分子与递送肽连接，从而形成具有穿越血脑屏障的更高能力的抗体-肽构建体，并且比不具有连接的肽的抗体分子更特异性地穿越血脑屏障。在具体的实施方案中，抗体-肽构建体则比不具有连接的肽的抗体分子则更高效地从脑中清除。
本发明的另一个方面涉及制备上文所述的抗体分子、递送肽和抗体-肽构建体的方法。本发明还提供了编码多肽的多核苷酸，所述的多肽包括本发明所述的抗体分子、递送肽和/或抗体-肽构建体；以及载体和包含载体的宿主细胞，特别是表达载体和允许多肽表达的宿主细胞。
本发明的另一个方面涉及包含有效量的上文所述的抗体分子、递送肽和/或抗体-肽构建体的药物组合物，以及制备该药物组合物的方法，例如与药物可接受的载体混合。在具体的实施方案中，配制所述药物组合物用于肠胃外施用。
本发明的另一个方面涉及用于治疗或预防神经紊乱，例如阿尔茨海默病、相关紊乱或其症状的药物组合物的用途。在具体的实施方案中，将本发明的药物组合物(包含有效量的与递送肽连接或未连接的抗体分子)施用给阿尔茨海默病患者以预防或减少斑块在脑中形成，其是通过穿越血脑屏障并特异性地结合寡聚体和/或单体形式的β-淀粉样肽42、但是优选地不结合纤维状形式的β-淀粉样肽42，由此预防或减少斑块的形成。在具体的实施方案中，与递送肽连接或未连接的抗体分子则从脑中清除，从而快速高效地返回至循环中以便于排出。
本发明的另一个方面涉及抗体分子、递送肽和抗体-肽构建体的诊断用途，例如诊断阿尔茨海默病或相关紊乱。本发明还提供了包含本发明的抗体分子、递送肽和/或抗体-肽构建体的试剂盒，例如用于诊断阿尔茨海默病或相关紊乱的试剂盒。
附图简述
图1描绘了BAP42聚集方案，由肽的单体发展成二聚体、寡聚体、然后发展成能够形成斑块的原纤维。
图2示出BAP42的摩尔吸光系数的测定，其中使用已知浓度的肽的不同的溶液来测量吸光率并与其相关联，以便计算系数ε280nm＝0.3265±0.0043(mg/mL)-1cm-1或±1474.041ε280nm＝19,287M-1cm-1。
图3A-3B描绘了制备不同种类的BAP42以得到寡聚体(图3A)或原纤维(图3B)的代表性方案。
图4描绘了使用硫磺素T测定法在优化的工艺中分离的BAP42种类的特征。
图5示出通过SDS-PAGE电泳分离的BAP42种类混合物的Western印迹的结果。
图6A-B示出分离的BAP42种类的动力学光散射分析，其中不同颗粒的百分信号强度表示为颗粒直径的函数。图6A示出在单体(灰色)、寡聚体(红色)和纤维(绿色)样品中存在的单个颗粒的尺寸分布谱；图6B示出级别尺寸分布谱，即，信号强度百分比的分布谱，所述的信号强度百分比为不同尺寸颗粒的颗粒直径的函数。
图7描绘了用于分离单体和寡聚体BAP42种类的代表性色谱。
图8A-8B示出在免疫后第26天，用BAP42单体(图8A)或BAP42寡聚体(图8B)免疫的兔的ELISA的免疫应答。
图9A-9B示出在免疫后第74天(最后出血)，用BAP42单体(图9A)或BAP42寡聚体(图9B)免疫的兔的ELISA的免疫应答。
图10描绘了使用膜噬菌体展示(Western淘洗)的一轮生物淘洗中用于对BAP42寡聚体特异性sdAb进行选择的示意图。
图11示出针对寡聚体形式的BAP42通过ELISA分析的94个克隆的结合谱和连接值(M-单体；O-寡聚体；F-纤维；X-BSA 3％)。
图12示出分别针对单体形式的BAP42通过ELISA分析的94个克隆的结合谱和连接值(M-单体；O-寡聚体；F-纤维；X-BSA 3％)。
图13示出在Western印迹上对本发明示例性抗体分子的检测。
图14示出在PVDF膜中不同BAP42同种型的Western印迹分析上对大部分单体和寡聚体的识别。
图15示出示例性抗体分子与寡聚体形式的BAP42的BIAcore分析和结合谱。
图16A-16D示出4种示例性抗体分子(候选抗-BAP42寡聚体抗体)的BIAcore动力学研究，称为“VL#26”(图16A)，“VL#20”(图16B)，“VL#6”(图16C)和“VL#2”(图16D)。
图17示出对于辅助噬菌体的样品、DEN-噬菌体和穿越BBB的阳性对照(+噬菌体)而言，基于比较在顶部和基部(在体外BBB模型的任一侧)中相对于总的初始噬菌体(母液)的噬菌体的效价，在与肽形成融合体(DEN-噬菌体)中，噬菌体的迁移。
图18示出体外BBB模型的内皮屏障完整性，其是使用40kDa右旋糖苷荧光分子(FD40)检验的，其中使用无细胞对照(空白)、具有bEnd3细胞的BBB模型(细胞)以及使用与噬菌体温育后的BBB模型(噬菌体)。
图19A-19F示出不同DEN2C肽的HPLC结果。
图20A-20F示出不同DEN2C肽的MS结果。
图21A-21F示出在transwell系统的顶部和基部回收的％99mTc-放射性肽，表明在与bEnd3细胞(BBB模型)和无细胞(对照)的组织培养物插入物温育5小时后不同DEN2C肽的迁移。
图22A-22F示出在transwell系统的顶部和基部回收的％99mTc-放射性肽，表明在与bEnd3细胞(BBB模型)的组织培养物插入物温育15分钟、5小时和24小时后不同DEN2C肽的迁移。
图23A-23E示出在温育15分钟、5小时和24小时后在BBB细胞中不同DEN2C肽的内化能力。
图24A-24E示出在BBB细胞上不同浓度所选DEN2C肽的毒性的缺乏。
图25A-25C示出荧光分子(母液)穿越不具有BBB细胞的过滤器(过滤器)、穿越bEnd3屏障(BBB)和穿越与不同肽预温育的bEnd3屏障的迁移能力。
图26A-26C示出所选的DEN2C肽与di-8-ANEPPS-标记的脂质组成的膜模型(LUV)的双极电势中的相互作用和干扰，所述的组成为：POPC；POPC:POPS(4:1)；POPC:POPS(3:2)；POPC:POPS(1:4)；POPC:POPG(4:1)；和POPC:Chol(2:1)。
图27示出通过trp的固有荧光，对DEN2C肽pepH3的Kp常数的测定。
图28A-28D示出使用HPLC分析，在注射至小鼠中之前以及之后5分钟和60分钟，在血液(图28A)和尿(图28B)中的pepH1稳定性、以及在血液(图28C)和尿(图28D)中的pepH3稳定性。
图29A-29B示出使用2种比例的本发明的抗体分子和抗体-肽构建体对BAP42聚集的抑制，所述的比例为：1:5(每5个BAP42分子1个sdAb分子)(图29A)和1:20(每20个BAP42分子1个sdAb分子)(图29B)。
图30A-30B示出在使用本发明的示例性抗体分子“A”或示例性抗体-肽构建体“B”、或者对照“C”处理的5xFAD转基因小鼠的海马体(图30A)或皮质(图30B)中噻嗪红染色的结果。
图31A-31D示出噻嗪红染色的结果，表明在使用本发明的示例性抗体分子“A”或示例性抗体-肽构建体“B”、或者对照“C”处理的5xFAD转基因小鼠的海马体中的归一化的斑块负荷/mm(图31A)和斑块/mm(图31B)；以及皮质中的归一化的斑块负荷/mm(图31C)和斑块/mm(图31D)。
图32A-32B示出分别在注射后2和60分钟，在小鼠中99Tc-标记的sdAb-pep构建体的SPECT图像。
发明内容
1.定义
“神经疾病或紊乱”是指神经系统的疾病或紊乱，包括但不限于癫痫、全局和局部缺血和出血性中风、头部创伤、脊髓损伤、在心脏停搏或新生儿窒息中的缺氧诱导的神经细胞损伤、以及癌症有关的神经学状况、和神经退行性疾病。
“神经退行性疾病”是指包括但不限于阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病和侧索硬化(ALS)的疾病。阿尔茨海默病(AD)还称为阿尔茨海默病氏病或老年痴呆，是一种慢性神经退行性紊乱，其特征在于进行性认知功能减退，涉及记忆丧失增加以及语言、判断和问题解决方面的问题，其导致不能执行每天的任务并最终痴呆。
“β-淀粉样肽”(BAP)是指在AD的疾病过程中起重要作用的在脑中形成的肽。疾病过程与斑块形成有关，这是由于异常折叠的β-淀粉样肽(BAP)的累积，所述的肽的长度为37-42个氨基酸，其为更大的淀粉样前体蛋白质(APP)的片段。APP为穿透神经元细胞膜并且在神经元生长、存活和修复中起作用的跨膜蛋白质。一种BAP(特别是由APP的最初的42个氨基酸组成的C-末端片段)在本发明中称为“BAP42”、“Aβ42”、“βA42”、“β-淀粉样肽42”或“β-淀粉样肽1-42”。该片段具有高的聚集倾向，有助于原纤维形成，原纤维一起簇集在神经元外部的沉积物中，并因此在AD的“老年斑”特征的形成中起重要作用。
BAP42的“非纤维状形式”是指肽分子的单体、二聚体、三聚体和低级别的寡聚体，其不能足够紧密地簇集在一起以形成斑块。“寡聚体形式”或“BAP42寡聚体”是指分子量为10-200kDa的肽的寡聚体，相当于2个结合的单体的二聚体，或者超过2个单体的结合，例如3、4、6、8或10个单体；以及BAP42的15、20、25、30、35和40个单体结合。
BAP42的“纤维状形式”或“BAP42原纤维”是指BAP42分子的更高级别的簇集，其形成AD的老年斑特征。样品中的“颗粒”或“种类”是指单个的单体、二聚体、寡聚体等，样品中的复合体。样品中存在的不同种类的分布可以通过给出样品中单个种类的百分比来描述。
“抗体分子”是指免疫特异性多肽或其结合片段，其包含免疫球蛋白的至少一个结构域，例如天然形成的免疫球蛋白的重链结构域或轻链结构域，或者合成(例如重组)的结合蛋白质(例如人源化的抗体、单链抗体、嵌合抗体等)的相应结构域。天然形成的免疫球蛋白(例如IgG)的基础结构单元为具有2条轻链(L)和2条重链(H)的四聚体，通常表示为大约150,000Da的糖蛋白。各个轻链通常由可变结构域(VL)和恒定结构域(CL)构成；而各个重链通常涉及可变结构域(VH)和3个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)，以及铰链区(H)。抗体或抗体片段的可变区包括互补性决定区(CDR)，其包含与抗原接触的残基；以及非CDR链段，其是指构架链段或构架区(FR或FwR)，其通常保持结构并决定CDR环的定位(但是某些构架残基也可以接触抗原)。
抗体片段可以完整的传统的IgG生成，并且包括抗原结合片段、Fc结构域、Fab片段(F(ab))、F(ab’)片段、单链Fv片段(scFv)、VH-VL二聚体、仅重链结构域、仅轻链结构域、以及单个(单一)结构域，例如VH结构域、VL结构域、CH1结构域、CH2结构域、CH1结构域、CL结构域等。
术语“抗体单一结构域”、“单一结构域抗体”、“小结构域抗体”或“sdAb”是指抗体片段，其包含或由抗体的单一单体片段组成，仅具有轻链可变结构域(VL)或重链可变结构域(VH)。类似于完整抗体，单一结构域抗体可以免疫特异性地结合特异抗原。然而，与整体抗体不同，单一结构域抗体不显示补体系统引发的细胞毒性，这是因为它们缺乏Fc区。2个或更多个单一结构域抗体可以组合，从而得到二聚体或它们更高级别的结构。
如本文所用，术语“人源化的抗体分子”是指包含至少一个免疫球蛋白可变区的多肽，所述的可变区包含人类构架区和本发明的抗体分子的一个或多个CDR。在一些实施方案中，本发明的抗体分子不包含完整的免疫球蛋白，例如其可以包含单一免疫球蛋白可变结构域(例如VH或VL结构域)，但是不包含任何其他的免疫球蛋白结构域或区(例如不包含Fc、CH1、CH2、CH3、CL等)。提供CDR的抗体分子(例如VL结构域)被称为“供体”，而提供框架的人类免疫球蛋白或其片段(例如人类可变结构域)被称为“受体”。恒定区无需存在，但是如果它们存在，则它们优选地是与人类免疫球蛋白恒定区基本一致，即，至少大约85-90％、优选地大约95％或更高是一致的。因此，根据其中本发明的抗体分子是人源化的实施方案，抗体分子的所有部分，除了可能的CDR，与天然人类免疫球蛋白序列的相应部分基本一致。由于预计所得的人源化的分子与提供CDR的供体抗体结合相同的抗原，则说供体分子被“人源化”。通常，人源化的免疫特异性分子为人类免疫球蛋白(或者其可变结构域和/或片段)，其中超变区残基被得自非人类物种(例如得自兔VL结构域的供体CDR)的超变区残基替代，其中所述的非人类物种的超变区残基具有所需的特异性、亲和力和能力。
此外，人源化的分子可以包含在受体抗体和供体抗体中均不能找到的残基。进行这些修饰以便进一步改善功能性，例如免疫特异性或者降低免疫原性。通常，人源化的抗体分子包含至少一个可变结构域的基本上全部，其中所有的或者基本上所有的超变区对应于兔的可变结构域的超变区，并且所有的或者基本上所有的FR是人类免疫球蛋白序列的FR。在一些实施方案中，本发明的人源化的抗体分子为变体。此类人源化的分子在一个或多个非人类(例如兔)CDR中可以包含氨基酸残基的取代、删除或加入。当人源化的分子的变体与亲代人源化的抗体分子比较时，其可以基本上具有相同的结合、更好的结合或更差的结合。
如本文所用，术语“免疫特异性”是指在生理学条件下分子特异性地结合抗原(例如表位或免疫复合物)、但是不特异性地结合了另一种分子的能力。可以说抗体分子“免疫特异性地结合”或“免疫特异性地识别”其靶抗原，优选地结合该抗原超过其他部分。对给定抗原具有免疫特异性的分子可以描述为对于该特特定抗原为“抗原-结合”或“抗原-特异性”。例如可以通过免疫测定、BIAcore或本领域技术人员已知的其他技术鉴定免疫特异性结合抗原的分子。免疫特异性结合可以在最小结合参数方面定量地定义，例如大约0.001nM至大约1,000pM。免疫特异性结合抗原的分子可以结合其他部分(或者与其他部分“交叉反应”)，但是以更低的亲和力、优选为更低很多的亲和力结合其他部分，其可以通过例如免疫测定、BIAcore或本领域已知的其他测试来测定。
“血脑屏障”或“BBB”是指将循环血液与CNS中的脑细胞外液分开的屏障。BBB具有高的选择渗透性，并且通过脑内皮细胞(“BEC”或“bEnd3细胞”)在脑毛细血管水平通过紧密连接而连接形成的。BBB比肌体中其他处的毛细管中的内皮细胞更高程度地限制物质由血流通过。例如BBB限制微生物细菌和大的或亲水性分子扩散，仅允许小的疏水性分子扩散，例如氧、二氧化碳和某些激素。BBB的细胞还使用特定的蛋白质主动地运输代谢产物(例如葡萄糖和氨基酸)穿越屏障。相反，“非脑内皮细胞层”是指由除了脑内皮细胞以外的细胞形成的内皮细胞层，例如除了血脑屏障以外的内皮细胞层。
“肽递送系统”是指使用“递送肽”递送货物分子的方法，在本发明中还称为“转座子肽”或“细胞穿透肽”(CPP)。CPP为具有穿越细胞膜并由此可以将多种货物负荷转运至细胞内部的能力的短肽，包括转运低分子量药品、脂质体、质粒、抗体和纳米颗粒。货物分子通过共价或非共价相互作用于肽结合。CPP通常通过内吞作用(特别是吸收介导的胞转作用)过程在细胞内递送它们的货物分子。
CPP通常具有包含丰富的正电荷氨基酸的氨基酸组成，例如赖氨酸或精氨酸残基；或者显示极性/带电氨基酸和非极性/疏水性氨基酸的备选方式。这2种类型的CPP分别称为聚阳离子和两性的。第三种类型的CPP为疏水性肽，其包含丰富的非极性残基，具有较低的净电荷，或者有利于细胞吸收的丰富的疏水性氨基酸基团。CPP的多种实例包括来自人类免疫缺陷型病毒1(HIV-1)的反式激活转录活化因子(TAT)；触角同源结构域的第三螺旋，pAntp(4358)；以及登革热2型病毒的衣壳蛋白(“DEN2C”)。DEN2C为形成对称二聚体的12kDa蛋白质，其具有用于与RNA相互作用的碱性残基，以及用于与膜相互作用的非极性区域。所述的蛋白质由4个结构域：α1、α2、α3和α4形成(Ma,et al.,Proc Natl Acad Sci USA(2004)101(10):3414-3419)。
“血脑屏障特异性”或“BBB特异性”是指递送肽穿越血脑屏障、并由此穿透脑并将货物分子递送至CNS(比其穿越肌体中其他膜或屏障更高程度)的能力。
如本文所用，在多肽内容中，术语“衍生物”或“变体”是指包含氨基酸序列的多肽，所述的氨基酸序列通过引入氨基酸残基的取代、删除或加入而改变。术语“衍生物”或“变体”还是指(即)通过任何类型的分子与多肽共价连接而被修饰的多肽。例如但不限于多肽可以通过糖基化、乙酰基化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/封闭基团衍生化、蛋白水解裂解、与细胞配体或其他蛋白质连接等来修饰。衍生的多肽可以使用本领域技术人员已知的技术通过化学修饰而产生，包括但不限于特定的化学断裂、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成等。此外，衍生的多肽可以包含一个或多个非传统的氨基酸。多肽衍生物或其变体具有与衍生该多肽的多肽相似的或一致的功能。如“衍生自”有机体的多肽所用，术语“衍生的”还可以指多肽与所述的有机体(例如细菌细胞或噬菌体)直接分离。
术语“受试对象”、“宿主”和“患者”可交换使用，如本文所用，受试对象优选为哺乳动物，例如非灵长动物(例如牛、猪、马、猫、狗、大鼠等)或灵长动物(例如猴和人类)，最优选的是人类。
如本文所用，术语“治疗试剂”是指可以用于治疗、管理或减轻与阿尔茨海默病或相关紊乱有关的症状的任何试剂，阿尔茨海默病或相关紊乱包括脑中与寡聚体β-淀粉样肽累积而形成原纤维或者与其他倾向于聚集的肽的累积有关的病况。如本文所用，“治疗有效量”是指当施用给遭受目标疾病或紊乱的受试对象时，在目标疾病或紊乱的治疗或管理中提供至少一种治疗益处的试剂的量(例如在本发明的药物组合物中单一结构域抗体或者抗体与递送肽的构建体的量)。此外，对于本发明的试剂，治疗有效量是指在疾病或紊乱的治疗或管理中提供至少一种治疗益处的单独的或者当与其他治疗结合时的试剂的量。
在阿尔茨海默病的情况下，抗体分子或其构建体的治疗有效量可以减少疾病的一种或多种认知或感情症状，例如减少短期记忆丧失；减少方向障碍、情绪波动或缺乏动力；以及离开看护者(否则是疾病晚期的典型状况)，增加独立性。
如本文所用，术语“预防试剂”是指可以用于预防、延迟或减慢阿尔茨海默病或相关紊乱、或它们的症状的进程的任何试剂。如本文所用，“预防有效量”是指当施用给倾向于目标疾病或紊乱的受试对象时，在预防或延迟目标疾病或紊乱中提供至少一种预防益处的预防试剂的量(例如在本发明的药物组合物中单一结构域抗体或者抗体与递送肽的构建体的量)。预防有效量还可以指足以预防、延迟或减少目标疾病或紊乱的发生；或者减慢目标疾病或紊乱的进程；或者延迟或减少目标疾病或紊乱的发作；或者预防或延迟目标疾病或紊乱的重现或复发的试剂的量。预防有效量还可以指足以预防或延迟目标疾病或紊乱的症状的恶化的试剂的量。此外，预防有效量是指在疾病或紊乱的预防或延迟中提供至少一种预防益处的单独的或者与其他试剂结合时的预防试剂的量。
本发明的预防试剂可以施用给“倾向于”目标疾病或紊乱，即，倾向于阿尔茨海默病或相关紊乱，包括与非纤维状β-淀粉样肽或其他倾向于聚集的寡聚体的累积有关的病况的受试对象。“倾向于”疾病或紊乱的受试对象为显示与疾病或紊乱的发展有关的症状或者具有遗传构成、环境暴露或对于此类疾病或紊乱而言的其他风险因素的受试对象，但是其中所述的症状还尚未处于被诊断为疾病或紊乱的水平。例如具有阿尔茨海默病家族史的患者可以定性为倾向于阿尔茨海默病的人。
如本文所用，术语“组合”是指多于一种预防和/或治疗试剂或活性试剂的使用。术语“组合”的使用没有限定其中预防试剂和/或治疗试剂施用给受试对象的顺序。第一预防或治疗试剂可以在将第二预防或治疗试剂(不同于第一预防或治疗试剂)施用给有需要的受试对象之前(例如之前5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周)、同时或之后(例如之后5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周)施用。
2.靶向非纤维状形式的β-淀粉样肽的抗体分子
本发明的一个方面涉及抗体分子，其优选地结合非纤维状形式的β-淀粉样肽42(BAP42)(例如单体或寡聚体形式)超过纤维状形式的肽。例如与纤维状形式的肽相比，抗体分子可以显示至少大约10、至少大约100、至少大约1,000、至少大约2,000、至少大约4,000、至少大约6,000、至少大约8,000或至少大约10,000倍高的与寡聚体形式的结合。具体而言，提供了抗体分子，其对一种或多种寡聚体形式的BAP42具有免疫特异性，但是对BAP42原纤维不显示免疫特异性(或者对原纤维显示极低的免疫特异性)。
在一些实施方案中，抗体分子包含衍生自和/或在兔免疫球蛋白中鉴定的可变结构域、氨基酸序列或残基，该分子免疫特异性地结合BAP42单体和/或寡聚体、或者它们的表位。通过本领域已知的用于评估抗原/蛋白质结合特异性的任何标准的方法来测定免疫特异性结合。用于测定抗体或其抗原结合片段对抗原或表位的结合特异性的测定包括但不限于ELISA、Western印迹、表面等离子体共振(例如BIAcore)和放射性免疫测定。本领域已知的用于评估结合特异性的任何方法都可以用于鉴定本发明的抗体分子。在优选的实施方案中，本发明的分离的单一结构域抗体分子展现出大于0.001nM、大于0.005nM、大于0.01nM、大于0.05nM、大于0.1nM、大于0.5nM、大于1nM、大于2nM；但是不大于5nM、不大于10nM、不大于20nM、不大于30nM、不大于40nM、不大于50nM、不大于60nM、不大于70nM、不大于80nM、不大于90nM或不大于100nM的Kd。在某些实施方案中，本发明的分离的单一结构域抗体分子展现出大约10nM、大约15nM、大约20nM、大约25nM、大约30nM、大约35nM、大约40nM、大约45nM、大约50nM、大约55nM、大约60nM、大约65nM、大约70nM、大约75nM、大约80nM、大约85nM或大约90nM的Kd。还参见图16A-16D。
在优选的实施方案中，所述的抗体分子优选地结合寡聚体形式的BAP42超过纤维状形式的BAP42。例如所述的抗体分子可以比结合原纤维更强地结合BAP42寡聚体，例如强至少大约2倍、至少大约3倍、至少大约5倍、至少大约10倍、至少大约20倍或至少大约50倍。在一些实施方案中，所述的抗体分子未显示或者基本上未显示对BAP42原纤维的免疫特异性结合，例如不能通过本领域已知的用于评估结合特异性的标准方法检测到。
本发明的抗体分子可以是多价的或一价的。多价抗体分子包括二价(例如本发明的单一结构域抗体分子的二聚体)、三价和更高级别的价数，例如具有2个抗原结合位点的二价IgG复合物，每个结合位点均识别相同的表位。在优选的实施方案中，所述的抗体分子是一价的，每个分子呈现单一的抗原结合位点。在具体的实施方案中，所述的抗体分子为单一结构域抗体或其抗原结合片段，例如单一的轻链可变结构域(VL)或单一的重链可变结构域(VH)，更优选的是兔的VL或VH，或者VH或VL的抗原结合结构域。
编码免疫球蛋白VH或VL结构域的核苷酸序列可以得自原初的兔或者之前已经使用抗原免疫的兔，所述抗原例如是BAP42单体或寡聚体。兔的免疫以及编码兔VH或VL结构域的核苷酸序列(例如cDNA)的分离可以通过本领域已知的或本发明所述的任何方法实施。在某些实施方案中，编码VH或VL结构域的核苷酸序列可以得自原初的或免疫的兔的任何组织，但是优选的是得自富含浆细胞(例如B细胞)的组织来源。在某些实施方案中，包含编码VH或VL结构域的核苷酸序列的兔的组织为骨髓。在其他的实施方案中，包含编码VH或VL结构域的核苷酸序列的兔的组织为阑尾组织和/或淋巴组织，例如脾或淋巴结组织(例如参见Goncalves等人的WO 2008/136694，其以引用方式全文并入本文)。
在某些实施方案中，本发明的抗体分子为单克隆抗体、多特异性抗体、人源化抗体、合成抗体、嵌合抗体、多克隆抗体、单链Fvs(scFv)、VH-VL二聚体、单链抗体、抗独特性(抗Id)抗体(包括例如针对本发明抗体的抗Id抗体和抗-抗-Id抗体)、双价抗体、微抗体、纳米抗体或上文所述的任意一项的抗原结合片段，包括但不限于Fab片段、F(ab')片段、二硫化物连接的双特异性Fvs(sdFv)和细胞内抗体。
本发明的抗体分子可以是双特异性的或多特异性的，例如具有2个抗原结合位点的双特异性分子，所述的抗原结合位点对不同抗原或不同表位展现出亲和力。本发明的双特异性或多特异性分子可以使用本领域公知的方法形成，例如本发明的一个或多个单一结构域抗体分子彼此和/或与不同的表位结合多肽的化学缀合。例如本发明的抗体分子可以包含第一和第二VL结构域，或者第一和第二VH结构域，其中所述的第一和第二结构域具有不同的结合特异性(即，与不同的抗原结合)。
在某些实施方案中，本发明的抗原分子或其抗原结合片段不包含CH1结构域。在其他的实施方案中，本发明的抗体分子或其抗原结合片段不包含CH1结构域、CH2结构域、CL结构域、CH3结构域或H结构域中的一种或多种，或者不包含CH1结构域、CH2结构域、CL结构域、CH3结构域或H结构域中的任意一种。在其他的实施方案中，本发明的抗体分子或其抗原结合片段包含CH1结构域、H结构域、CH2结构域、CL结构域或CH3结构域中的一种，并且不包含衍生自免疫球蛋白的任何其他的恒定结构域或铰链区。
在某些实施方案中，本发明的抗体分子包含VH CDR1结构域、VH CDR2结构域、VHCDR3结构域、VL CDR1结构域、VL CDR2结构域和/或VL CDR3结构域中的一种或多种。在某些实施方案中，所述的抗体分子包含VH CDR1结构域、VH CDR2结构域和VH CDR3结构域的每一种；或者VL CDR1结构域、VL CDR2结构域和VL CDR3结构域的每一种。在优选的实施方案中，抗体分子包含VL CDR1结构域、VL CDR2结构域和VL CDR3结构域的每一种。
本发明的抗体分子可以包含衍生自任何物种(例如兔、小鼠、大鼠)的免疫球蛋白分子，但是优选的是可以为任何类型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)或者种类(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类的人类的或人源化的免疫球蛋白分子。本发明的抗体分子或其抗原结合片段可以通过本领域已知的任何方法生产，例如化学合成或重组技术。
在某些实施方案中，本发明的抗体分子是去免疫的(de-immunized)。即，抗体分子可以经修饰而降低其免疫原性，例如其中至少一个TH表位被消除和/或减少。在一些实施方案中，抗体分子突变而提供改善的溶解性和/或免疫特异性，以及降低的免疫原性(或者与免疫原性分离)。具有降低的免疫原性的抗体分子被称为“去免疫的”抗体分子。通常，抗体分子在一个或多个氨基酸位置处包含取代，从而减少或消除结合一个或多个HLA II类受体的表位。本发明的去免疫的抗体分子在预期的宿主(例如在人类患者中)中得到降低的免疫原性。
去免疫可以通过本领域已知的和/或本发明所述的任何工艺来实现。在一种方法中，建立抗体分子的3-D结构模型。然后，提出取代列表，以最小化TH表位的数量，优选的是消除最重要的表位，而不影响抗体分子的稳定性或者与其与靶物(例如BAP42寡聚体)的结合亲和力。在一些实施方案中，去免疫的抗体分子包含消除至少大约10个TH表位、至少大约15个TH表位、至少大约20个TH表位、至少大约25个TH表位、至少大约个30TH表位、至少大约40个TH表位或至少大约50个TH表位的取代。在优选的实施方案中，与去免疫之前的抗原分子相比，所述的取代不影响或者至少不会实质上影响抗体分子的免疫特异性结合。
在某些实施方案中，本发明的抗体分子与Fc结构域结合，优选的是人类Fc结构域，从而例如增加抗体分子的半衰期。抗体分子可以与Fc结构域直接连接，或者通过连接体间接连接，例如包含或者由肽连接体组成的介入氨基酸序列。在优选的实施方案中，抗体分子与人类Fc结构域的N-末端连接，形成融合产物，从而得到二价构建体(还参见Farrington等人的WO 2013/106577(Biogen))。在一些实施方案中，本发明的2个抗体分子优选地通过肽连接体与完整Fc区的2个Fc结构域的每一个的N-末端连接，其中所述的2个抗体分子可以是相同的或不同的。在一些实施方案中，抗体分子与scFv分子的N-末端连接。
不希望被理论所束缚，本发明的抗体分子可以通过干扰脑中BAP42或其他倾向于聚集的肽的聚集而起作用，从而在阿尔茨海默病或相关紊乱中产生有利的治疗/预防作用。在阿尔茨海默病患者的脑中，BAP42发生不同形式的结合。BAP42为具有高寡聚能力的一组分子之一，并且其具有形成纤维的能力，这是一种涉及肽通过不同成熟阶段的过程，示意性地示于图1中。
如图1所示，根据聚集方案，BAP42聚集，由肽的单体发展成能够形成斑块的纤维。所述的肽具有高的寡聚能力，并且通过自结合开始，从而得到小的寡聚体，其随后与该肽的其他分子结合。肽的结构改变，从而提供富含β-片(纤维的特征)的二级结构。BAP42和其他淀粉样蛋白质的毒性并不在于累积的不溶性原纤维，而是可溶性寡聚体中间体(Rakez etal (2003)Science 300:486-489；Selkoe(1991)Neuron 6:487-498；and Hardy (1992)Science 256:184–185)。根据这种假说，脑中BAP42的生产与清除或降解的失衡是阿尔茨海默病的引发事件，最终导致突触和神经元功能障碍和退化，及随后的认知障碍。
优选地靶向非纤维状BAP42的抗体分子可以由本发明公开的序列信息开始通过重组手段获得，或者通过增加或分离选择BAP42形式的免疫球蛋白而发展得到，根据本发明公开的过程。实施例1示例性地示出该过程。简言之，制备不同形式的BAP42并表征；然后将单体或寡聚体形式用于免疫兔。分离的兔抗体用于构建VL抗体文库，和通过噬菌体展示而选择的抗BAP42抗体。
在具体的实施方案中，使用“噬菌体展示膜”优化噬菌体展示过程，包括针对通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离的并且在聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上电印迹的蛋白质来选淘噬菌体展示的抗体库。这些膜比其他膜提供了显著更低水平的背景噬菌体结合的益处(Marks et al.(2001)“Towards Proteome-wide Production ofMonoclonal Antibody by Phage Display”J.Mol.Biol.315:1063-1073)。因此，单体和寡聚体形式的BAP42固定化在PVDF膜上，从而选淘对这些形式具有特异性的单一结构域抗体分子。本发明的另一个方面涉及用于选淘抗体文库的不同形式的BAP42的膜组件。
本发明的抗体分子通常提供与阿尔茨海默病和相关紊乱有关的治疗和预防方法，并具有超过现有方法的益处。例如单一结构域形式的抗体分子具有小尺寸和稳定性，而且对非纤维状形式的BAP42具有高的免疫特异性，从而提供用于阿尔茨海默病免疫治疗的有利的试剂。
在一些实施方案中，所述的抗体分子的尺寸小，例如小于大约30kDa，小于大约20kDa，小于大约15kDa或小于大约10kDa；和/或大于大约5kDa，大于大约10kDa或大于15kDa。在特别优选的实施方案中，抗体分子为尺寸大约12至15kDa的单一结构域抗体。该小尺寸大约为小于IgG1分子的尺寸的数量级(大约150kDa)。小尺寸可以增加向组织中的穿透，并且具有结合全尺寸的抗体不易接近的蛋白质靶物的腔或活性位点的能力。小尺寸还可以得到更高的摩尔量/克产物，增加每剂量的效力，并减少整体制造成本。小尺寸还有利于穿越BBB(单独的或者与递送肽融合的)，如下文更详细描述的那样。
在某些实施方案中，本发明的抗体分子包含VL结构域，并且不包含VH结构域。在具体的实施方案中，抗体分子由单一结构域抗体组成，优选的兔VL结构域或者由其衍生的人源化的VL结构域。单一结构域抗体的长度通常为大约100个氨基酸，例如长度为大约90、大约100、大约110或大约115个氨基酸。
在一些实施方案中，抗体分子为单体并且可溶的，优选的是不形成聚集体或者不能显著地形成聚集体(或者可以经改造而减少聚集)。本发明的单一结构域抗体分子提供了在生产中的其他益处，例如它们通常在细菌、酵母和/或哺乳动物细胞系统中良好地表达。在一些实施方案中，抗体分子是稳定的，例如单一结构域抗体在循环中通常比全尺寸的抗体更稳定，并且可以经改造而进一步增加其稳定性。在一些实施方案中，例如使用用于增加半衰期的方法使抗体分子的血清半衰期由几分钟或几小时增加至几周，例如但不限于PEG化、与人血清白蛋白(HAS)融合、以及与HAS结合肽融合(还参见例如在da Silva等人的WO2013/043071中所述的方法，该文献以引用方式全文并入本文)。本发明的抗体分子具有增加的稳定性，可以提供口服施用或通过肺部途径递送的选择，和/或可以能够穿透BBB。具有增加的稳定性的抗体分子能够更好地保留活性，例如在纯化、储存和/或运输过程中。例如在一些实施方案中，抗体分子在经历严厉条件(例如冷冻干燥或热变性)后保留活性。
在具体的实施方案中，使用改进的CAT-融合测定针对稳定性来选择抗体分子(例如参见Goncalves等人的WO 2008/136694，该文献以引用方式全文并入本文)。还参见下文提供的实施例1的部分(c)的子部分(iv)，描述了使用CAT-融合测定选择稳定的sdAb文库。简言之，通过推断的结构域与氯霉素乙酰基转运酶的融合来选择稳定的结构域，其中表达融合体(包含稳定的结构域)的细菌对氯霉素更具有抗性。稳定性可以根据这种测定来定义，例如本发明的稳定的抗体分子可以定义为当与CAT融合并在给定的细菌中表达时，允许某一定量的细菌集落在定义量的氯霉素存在下在某一段的时间内生长的抗体分子。
在具体的实施方案中，抗体分子的稳定性定义为可以使400-600个集落的转化的大肠杆菌在37℃和在1.86mM氯霉素存在下在24小时内生长，这是由于使用1个集落形成单位的载体(编码与氯霉素乙酰基转运酶融合的所述抗体分子)转化，并由转化的大肠杆菌表达融合体。参见下文的实施例1中的表6。稳定性可以根据其他参数来定义，例如表6中和附文中提供的参数。
在优选的实施方案中，所述的抗体分子干扰单体或寡聚体种类的BAP42的聚集，从而减少、逆转、防止、减慢或延迟寡聚体在脑中纤维化和/或聚集，从而形成原纤维；或者使得脑中的斑块大约解聚。在具体的实施方案中，所述的抗体分子阻止BAP42在脑中纤维化达到至少大约20％、至少大约30％、至少大约40％、至少大约50％、至少大约60％、至少大约70％或至少大约80％。可以例如使用候选抗寡聚体BAP42抗体分子，通过体外测定来评估纤维化被阻止的程度。这种体外测试的实例参见实施例1部分(c)的子部分(v)。
在一些实施方案中，所述的抗体分子穿越包含脑内皮细胞的内皮细胞层，例如人类BBB。在施用之后，例如肠胃外施用给受试对象之后，所述的抗体分子可以穿越BBB到达脑和CNS。在优选的实施方案中，所述的抗体分子未使用递送肽而穿越BBB。在更优选的实施方案中，所述的抗体分子比其他的内皮细胞层，例如不包含脑内皮细胞的屏障，更大程度地穿越BBB。
在优选的实施方案中，所述的抗体分子在未与递送肽融合的情况下，显示穿越模型BBB的有效的转运。例如本发明的抗体分子在BBB模型中在温育24小时内优选地显示至少大约40％、至少大约50％、至少大约60％、至少大约70％或至少大约80％转运，例如通过标记的抗体分子的放射活性来测量的。在特别优选的实施方案中，转运在不与或者基本不与BBB的细胞相互作用的情况下发生的，例如没有或者基本上没有被内化并且在BBB细胞内累积。因此，在非常优选的实施方案中，本发明的抗体分子令人惊奇地组合具有在水性介质中的高溶解性，并且高效地转运穿越BBB，以及少诱陷(entrapment)于脑内皮细胞中。
在优选的实施方案中，所述的抗体分子具有有利的生物分布谱，用于到达受试对象的脑中，和/或随后从脑中清除，并最终从受试对象的肌体中消除。生物分布谱可以通过本领域已知的或者本发明所述的技术测定。例如使用一种或多种放射性同位素来标记抗体分子，并注射至测试动物中。在注射后的不同时间处死后，不同的器官/组织(包括脑组织)被移出，称重并针对放射活性进行测试。穿越BBB或者转运穿越BBB还可以通过本领域已知的或本发明所述的技术在体内测量。例如使用健康的或5xFAD转基因小鼠，其中对动物注射与递送肽融合的或未融合的抗体分子，然后对脑部成像，从而测定抗体分子的转运。实施例4提供了关于该方法的其他细节，其中在施用本发明的示例性抗体分子后，在双光子显微镜下使用Thiazin Red鉴定斑块。
在具体的实施方案中，本发明的抗体分子包含一种或多种单一结构域抗体，其包含或者由选自SEQ ID NO:1-21、或者SEQ ID NO:1-21任意一个的BAP42寡聚体结合片段中的一个氨基酸序列组成。在具体的实施方案中，本发明的抗体分子为单一结构域抗体，其包含或者由选自SEQ ID NO:1-21、或者其BAP42寡聚体结合片段中的一个氨基酸序列组成。BAP42寡聚体结合片段是指截平形式的鉴定的抗体分子，其保留了亲代分子的免疫特异性，或者基本保留了肠胃外免疫特异性。例如所述的片段可以保留与BAP42寡聚体的优选的免疫特异性结合，同时不会免疫特异性地结合BAP42的纤维。可以通过生成给定氨基酸序列的长度改变的片段并针对BAP42寡聚体的结合超过BAP42纤维来选择保留该活性的片段，如本发明所述的以及在以下实施例1中详细列出的那样。
在某些实施方案中，本发明的抗体分子是人源化的。例如本发明的人源化的抗体分子可以包含人类可变结构域和/或其片段，其中超变区残基被得自兔VL结构域的超变区残基替代，其中所述的兔VL结构域具有优选的且免疫特异性的结合BAP42寡聚体和/或单体。在优选的实施方案中，人源化的抗体分子包含基本上所有的人类VL结构域，其中所有的或基本上所有的超变区对应于兔VL结构域的超变区，并且所有的或基本上所有的FR为人类免疫球蛋白序列的FR。
在一些实施方案中，本发明的人源化的抗体分子为变体。此类人源化的分子在一个或多个非人类(例如兔)CDR中包含氨基酸残基的取代、删除或加入。人源化抗体分子的变体与亲代人源化抗体分子相比，对于例如一种或多种BAP42寡聚体或BAP42单体可以具有基本上相同的结合或更好的结合；和/或当与本发明的亲代人源化抗体分子相比时，对于BAP42原纤维可以具有基本上相同的结合或更差的结合。在一些实施方案中，基于本领域已知的方法，本发明的人源化抗体分子包含得自兔单一结构域抗体的接枝于人类构架区中的VL CDR1结构域、VL CDR2结构域和VL CDR3结构域中的一个或多个。在另一个实施方案中，基于本领域已知的方法，可以对构架区进行其他的改变，从而与亲代相比，进一步改进结合，例如增加对于一种或多种BAP42寡聚体或BAP42单体的免疫特异性结合；和/或降低对BAP42原纤维的结合。
在某些实施方案中，本发明涵盖了SEQ ID NO:1-21氨基酸序列的人源化变体或衍生物，例如包含得自SEQ ID NO:1-21的任意一个的一个或多个CDR，其中CDR被接枝到人类构架区中，并且其中人源化变体或衍生物保留了亲代序列至少一种活性。例如人源化变体或其片段可以优选地并免疫特异性地结合BAP42寡聚体和/或单体。可以通过保留亲代序列的一个或多个VL CDR，使用人类抗体结构域的相应区域或氨基酸残基替代其他的区域或氨基酸残基，以及针对与BAP42寡聚体或单体的结合超过BAP42的纤维进行测试来选择保留该活性的人源化变体(及其片段)，如本发明所述的以及下文实施例1中详细列出的那样。
在某些实施方案中，本发明涵盖了SEQ ID NO:1-21氨基酸序列的变体或衍生物(其保留了亲代序列的至少一种活性)，或者所述的变体或衍生物的片段(其也保留了亲代的至少一种活性)。例如所述的变体或片段可以优选地并且免疫特异性地结合BAP42寡聚体和/或单体。可以通过生成给定氨基酸序列的变体，并针对与BAP42寡聚体或单体的结合超过BAP42的纤维进行测试来选择包括这种活性的变体(及其片段)，如本发明所述的以及下文实施例1中详细列出的那样。
在某些实施方案中，本发明的抗体分子为包含或由如下氨基酸序列组成的变体，所述的氨基酸序列与相同长度(即，由相同数量的残基组成)的第二氨基酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列一致性，所述的第二氨基酸序列选自SEQ ID NO:1-21和/或其片段，并且其中所述的变体展现出衍生该变体的亲代序列的至少一种活性(例如优选地并且免疫特异性地结合BAP42寡聚体和/或单体)。
本发明的抗体分子的氨基酸序列变体可以通过本领域已知的技术，基于本发明中关于候选序列而提供的发明公开来生成。在一些实施方案中，变体可以是取代的、插入的和/或删除的变体。删除变体缺乏亲代氨基酸序列的一个或多个残基，其通常不是功能(例如BAP42寡聚体的结合)必要的。插入突变体通常包括在多肽中的非末端点位加入物质。
取代的变体通常涉及氨基酸序列中的一个或多个位点处，一个氨基酸与另一个氨基酸交换，并且经设计而调控抗体分子的一种或多种性质，例如对抗蛋白水解的稳定性，优选的其他功能或性质不损失(或者基本不损失)。这种取代优选地是保守的，即，一种氨基酸被相似形状和电荷的另一种氨基酸替代。保守性取代是本领域公知的，并且包括例如以下变化：丙氨酸变成丝氨酸；精氨酸变成赖氨酸；天冬酰胺变成谷氨酰胺或组氨酸；天冬氨酸变成谷氨酸；半胱氨酸变成丝氨酸；谷氨酰胺变成天冬酰胺；谷氨酸变成天冬氨酸；甘氨酸变成脯氨酸；组氨酸变成天冬酰胺或谷氨酰胺；异亮氨酸变成亮氨酸或缬氨酸；亮氨酸变成缬氨酸或异亮氨酸；赖氨酸变成精氨酸；甲硫氨酸变成亮氨酸或异亮氨酸；苯丙氨酸变成酪氨酸，亮氨酸或甲硫氨酸；丝氨酸变成苏氨酸；苏氨酸变成丝氨酸；色氨酸变成酪氨酸；酪氨酸变成色氨酸或苯丙氨酸；以及缬氨酸变成异亮氨酸或亮氨酸。
本领域的任一技术人员都可以生成例如单一的氨基酸改变，优选的是在SEQ IDNO:1-21中的非保守的位置处，从而以更高的特性鉴定哪个氨基酸残基在免疫特异性结合中是重要的。优选的是，氨基酸突变创建了等价的、或者甚至改善的第二代抗体分子。例如某些氨基酸可以取代其他的氨基酸而不会产生可检测的或实质上的功能损失(例如优选地与BAP42寡聚体结合)。在形成此类改变中，可以考虑氨基酸的亲水指数。氨基酸亲水指数在赋予免疫特异性中的重要性是本领域通常理解的。应该接受的是氨基酸的相对亲水特性有助于所得蛋白质的二级结构，其相应地定义了蛋白质与其他分子的相互作用，例如对BAP42寡聚体或单体的免疫特异性结合超过原纤维。基于各种氨基酸疏水性和电荷特征，每种氨基酸已经赋值了疏水指数，例如：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/cystine(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。本领域还应该理解的是基于亲水性可以高效地进行类似氨基酸的取代。类似于疏水性，已经对各种氨基酸赋予了亲水性值：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0+1)；谷氨酸(+3.0+1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5+1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)和色氨酸(-3.4)。可以通过一种氨基酸取代另一种氨基酸来获得等价的分子，其中它们的疏水指数和/或它们的亲水性指数彼此之间在+2的范围内，优选的是在+1的范围内，或者最优选的在+5范围内。
在某些实施方案中，本发明涵盖了相对于本发明公开的氨基酸序列包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多的氨基酸修饰(例如插入、取代、删除等)的抗体分子。在优选的实施方案中，进行突变使得免疫特异性得以保留或基本上保留。
3.穿越血脑屏障的肽
本发明的另一个方面涉及穿越血脑屏障的肽，特别是具有SEQ ID NO:127氨基酸序列的多肽的片段，其中该片段特异性地穿越BBB。所述的肽提供了递送系统，促进货物分子(例如治疗和预防试剂)转移穿越BBB，从而递送至脑和CNS。在具体的实施方案中，所述的递送肽包含大约10至大约30个氨基酸的片段，优选为长度为大约15至大约25个氨基酸的片段，或者大约10至大约20个氨基酸。
本发明的递送肽展现出穿越包含脑内皮细胞的内皮细胞层，例如哺乳动物的BBB，优选为人类的BBB的能力。在某些实施方案中，所述的递送肽比包含其他细胞的内皮细胞层(例如除了血脑屏障以外的内皮细胞层)更高程度地穿越脑内皮细胞层。在具体的实施方案中，递送肽选择性或者优选地穿越BBB，比其穿越其他内皮细胞层更高程度地穿越所述的屏障，即使BBB通常更难以穿越。
选择性或优选地递送至BBB称为“BBB特异性递送”，并且实现此类递送的肽称为“BBB特异性递送肽”或“BBB特异性肽”。例如所述的递送肽比不包含脑内皮细胞的内皮细胞层更高程度地穿越BBB，高至少大约2倍、至少大约3倍、至少大约5倍、至少大约10倍、至少大约20倍、至少大约50倍、至少大约60倍、至少大约70倍或至少大约80倍。在一些实施方案中，所述的肽分子除了BBB以外不穿越或者基本上不穿越内皮细胞层。
可以通过本领域已知的技术或者如本发明所述来测量穿越或转运穿越血脑屏障。实施例2提供了用于测量BBB穿越的多种示例性方法。例如可以使用体外BBB模型，其由在transwell系统中在组织培养物插入物中生长的脑内皮细胞(BEC，例如bEnd3细胞)构成。BEC可以在微孔膜上生长，在所述的系统的上方分隔区(顶部)和下方分隔区(基部)之间形成体外内皮细胞屏障。经分离和标记的、或者通过噬菌体展示技术呈现的递送肽可以被引入至顶部，并温育多个时间段。在给定温育时间段后检测基部中的标记或噬菌体并将这些测量值与顶部中标记或噬菌体的量比较，将测定肽穿越模型BBB的程度。实施例2中的部分(a)(还参见图17)以及实施例2的部分(c)(还参见图22A-22F)提供了该方法的其他细节。
在某些实施方案中，所述的递送肽优选地与带负电荷的膜相互作用，这是由于正电荷而组合了疏水性和亲水性。氨基酸的疏水性和亲水性如上文所述，并且对于给定的肽，可以基于其氨基酸组成来计算疏水性和亲水性。可以在体外和体内模型中测试与不同的膜的相互作用。体外测定包括测量被模型BBB的细胞的吸收，从而测定肽的内化能力。例如实施例2的部分(c)提供了该方法的其他细节(还参见图23A-23E和表9)。
此外测定还包括测量膜电势、分配系数或者递送肽与多种膜(例如经设计具有不同脂质组成并且其表面上具有不同量的负电荷的膜模型)的亲和常数。例如实施例2的部分(e)提供了该方法的其他细节(还参见图26A-26C，图27和表10)。鉴于大部分的真核细胞在它们的膜内部都具有带负电荷的脂质，所以与得自其他内皮的细胞相比，得自BBB的内皮细胞具有更高的负电荷表面。这种负电荷不仅是由于带负电荷的脂质，还由于更高水平的糖基化。模拟负电荷BBB的膜模型可以分析它们与本发明的递送肽的静电学相互作用。在优选的实施方案中，所述的递送肽仅显示与富含负电荷的膜相互作用，例如富含负电荷磷脂的膜，例如由磷脂制成的模型膜，其中至少大约50％的磷脂是带负电荷的。在更优选的实施方案中，所述的递送肽显示仅与膜相互作用，其中所述的膜中，至少大约60％、至少大约70％、至少大约80％或至少大约90％的磷脂是带负电荷的。带负电荷的脂质包括但不限于1-棕榈酰-2-油酰-磷脂酰丝氨酸(POPS)和1-棕榈酰-2-油酰-磷脂酰甘油(POPG)。
在优选的实施方案中，所述的递送肽显示穿越BBB的有效转运。例如本发明的递送肽在BBB模型中在温育24小时内优选地显示至少大约40％、至少大约50％、至少大约60％、至少大约70％或至少大约80％转运或迁移，例如通过标记的递送肽的放射活性所测量的。在特别优选的实施方案中，转运是在不与或者基本上不与BBB的细胞相互作用的情况下发生的，例如没有或基本上没有内化于BBB细胞中和在BBB细胞中累积。因此，在非常优选的实施方案中，本发明的递送肽在水性介质中具有高度的溶解性和穿越BBB的高效的转运，以及少的诱陷于脑内皮细胞中。
本发明的递送肽提供了递送货物穿越BBB的益处，包括例如不干扰BBB的整体性和/或缺乏对内皮细胞的毒性，特别是缺乏对脑内皮细胞的毒性。
在优选的实施方案中，本发明的递送肽缺乏对内皮细胞的毒性，特别是缺乏对脑内皮细胞的毒性。该毒性可以通过本领域已知的或者本发明所述的技术来测量。例如可以使用比色测试(例如MTT测试)体外测量对BBB细胞的毒性，从而评估在改变浓度的递送肽存在下，细胞的代谢情况。实施例2的部分(d)提供了关于上述方法的其他细节(还参见图24A-24E)。缺乏对脑内皮细胞毒性的递送肽可以定义为对于给定的温育时间，当与某种浓度的肽温育时，不会降低层中细胞的活力的递送肽。例如缺乏对血脑屏障的内皮细胞的毒性的递送肽可以定义为在与100μM肽温育24小时后，导致内皮细胞的活性降低不超过20％、或者降低不超过10％的肽。缺乏毒性可以根据其他的参数进行定义，例如图24A-24E以及附文中提供的参数。
在优选的实施方案中，所述的递送肽具有用于到达受试对象的脑和/或随后从脑中清除并最后从受试对象的肌体中消除的有利的生物分布谱。生物分布谱可以通过本领域已知的或本发明所述的技术来测定。例如递送肽可以使用一种或多种放射性同位素标记，并注射至测试动物中。在处死后，不同的器官/组织(包括脑组织)被移出、称重和针对反射活性进行测试。实施例2的部分(f)提供了关于所述的方法的其他细节，鉴定了显示快速脑吸收的递送肽(还参见表11)。显示快速脑吸收的递送肽可以定义为在注射某种量的递送肽后在某段时间内到达测试动物的脑的递送肽。例如在使用104μg肽注射小鼠大约2分钟内到达小鼠脑中的递送肽可以鉴定为在快速脑吸收方面显示所需的生物分布。快速脑吸收可以在其他参数方面进行定义，例如表11中和附文中提供的参数。
生物分布不仅关于递送肽如何快速地穿越BBB并到达脑中，还关于其随后如何从脑中快速地清除，返回至循环而排泄。从脑中清除可以称为“脑洗出”，其中所需的递送肽为显示快速穿透至脑中、随后被快速脑洗出的递送肽。脑清除可以通过本领域已知的或者本发明所述的技术来定义，例如在注射放射线标记的候选肽后针对放射活性测量处死动物的脑。实施例2的部分(f)提供了关于所述的方法的其他细节，鉴定了显示快速脑清除的递送肽(还参见表11)。注射某种量的肽之后的某段时间内，在脑中保留的肽的百分比或者相反地从脑中清除的百分比方面来定义所需的递送肽从脑中的清除。例如在优选的实施方案中，到达小鼠的脑中的递送肽的至少大约90％可以在使用104μg肽注射小鼠的60分钟内从脑中清除。快速清除可以在其他参数方面进行定义，例如表11和附文提供的参数。
生物分布还关于递送肽除了在排泄器官中累积以外，是否在其他的器官中累积。如上文所述和/或本领域已知的那样，生成生物分布谱的方法可以用于进一步测定该特征。例如还参见实施例2的部分(f)和表11。
因此，本发明的递送肽包括SEQ ID NO:127的片段，其由于带正电荷的氨基酸残基而仅与或者基本上仅与模拟BBB的带负电荷的膜相互作用，因此组合了疏水性和亲水性；优选的是在BEC中不累积或者基本上不累积，和/或不破坏或者基本上不破坏BBB膜，和/或不降低或者基本上降低BEC活力；更优选的是在动物模型中显示快速的脑吸收和/或快速的脑清除。本发明的方法提供了BBB特异性递送肽，其优选地且高效地穿越BBB，并且高于或者与文献中所述的其他分子相当地、令人吃惊地有效递送至脑(Muruganandam,et al.(2002)FASEB J,16(2):240-241；and Abulrob,et al.(2005)J Neurochem 95(4):1201-1214)。例如其他生物标记的肽(例如TAT、穿膜肽(penetratin)、synB1等)的脑吸收的百分比范围仅为组织的0.2-0.9％ID/g(Sarko,et al.,Mol Pharm(2010)7(6):2224-2231)。
在具体的实施方案中，本发明的递送肽包含或由至少一条氨基酸序列组成，所述氨基酸序列选自SEQ ID NO:22-25，或者SEQ ID NO:22-25的任意一种的BBB特异性片段。在具体的实施方案中，递送肽包含或由一条氨基酸序列组成，所述氨基酸序列选自SEQ IDNO:22-25，或者其BBB特异性片段。BBB特异性片段是指截短形式的鉴定的递送肽，其保留了亲代分子的能力，或者基本保留亲代选择性穿越BBB的能力。例如所述的片段可以保留比非脑内皮细胞层更高程度地穿越BBB的能力。可以通过生成给定氨基酸序列的改变长度片段并针对优选的BBB的穿越进行测试来选择保留这种活性的片段，如本发明所述以及以下实施例2中详细列出的那样。
在某些实施方案中，本发明涵盖了SEQ ID NO:22-25氨基酸序列的变体或衍生物，其保留了亲代序列的至少一种活性；或者所述的变体或衍生物的片段，其也保留了亲代的至少一种活性。例如所述的变体或其片段可以优选地穿越BBB。可以通过生成给定的氨基酸序列的变体并针对优选的BBB的穿越进行测试来选择保留这种活性的变体(及其片段)，如本发明所述以及以下实施例2中详细列出的那样。
在某些实施方案中，本发明的递送肽为包含或由如下氨基酸序列组成的变体，所述的氨基酸序列与相同长度(即，由相同数量的残基组成)的第二氨基酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列一致性，该第二氨基酸序列选自SEQ ID NO:22-25，和/或其片段，并且其中所述的变体展示衍生该变体的亲代序列的至少一种活性(例如比其他内皮细胞层更高程度地穿越BBB)。
本发明的递送肽的氨基酸序列可以基于本发明中关于候选序列提供的公开内容，通过本领域已知的技术生成。在一些实施方案中，变体可以为取代的、插入的和/或删除的变体，包括上文所述的保守性取代。在形成此类变化中，如上文所述，可以考虑氨基酸的亲水指数；和/或还如上文所述的疏水性级别。例如可以通过制备保守性取代而创建变体，所述的保守性取代不改变递送肽的疏水性得分，或者创建具有更高的整体疏水性的变体。在某些实施方案中，本发明涵盖了递送肽，其包含相对于本发明公开所述的氨基酸序列的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多的氨基酸修饰(例如插入、取代、删除等)。在优选的实施方案中，可以形成突变，使得亲代肽的BBB特异性递送得以保留或基本上保留。
不希望被理论所束缚，递送肽(例如SEQ ID NO:24的肽(pepH3))以受体依赖的方式穿越脑血管上皮细胞膜。不依赖于受体的穿越提供了其他益处，这是因为运输既不受到受体表达的限制，也不受到饱和度的限制。
在具体的实施方案中，递送肽与货物分子结合。货物分子与递送肽的结合通常增加货物分子穿越脑内皮细胞层，例如BBB的转运。货物分子可以为例如用于治疗、预防或诊断用途的或者用于进一步基础研究(例如货物分子与脑或CNS中的结构相互作用的分析)的任何分子，其中理想的是增强分子运输穿越BBB。货物分子可以包括例如核酸、多肽、抗体分子、多糖、小分子化合物、纳米颗粒、合成聚合物、病毒、质粒、金属、脂质、脂质体、大分子、大分子复合物、毒素或标记。
可以作为为合适的货物分子的核酸的实例包括本领域技术人员已知的任何核酸，例如DNA、RNA、单链DNA、cDNA或其衍生物，包括寡核苷酸、多核苷酸、单链或双链靶物的反义序列、核糖体和反义RNA。类似物包括带电荷的和不带电荷的主链类似物，例如膦酸酯、甲基膦酸酯、氨基磷酸酯(例如N-3'或N-5')、硫代磷酸酯、不带电荷的吗啉代聚合物、以及蛋白质核酸(PNA)。核酸还可以包括质粒。质粒可以包括与染色体DNA分离并且能够自主复制的任何染色体外遗传物质。例如质粒可以包括能够在真核细胞中自主复制的DNA分子，并且其编码目的多肽，例如治疗蛋白质。
可以作为合适的货物分子的多肽的实例包括本领域技术人员已知的任何多肽，包括具有已知的治疗或预防作用的蛋白质，例如某些酶或激素，或者可以作为标记的蛋白质，例如EGFP或荧光素。治疗多肽可以包括但不限于肿瘤抑制蛋白质、转录因子、激酶抑制剂、激酶、细胞因子、调节蛋白质、凋亡蛋白质、抗凋亡蛋白质、微生物抗原、病毒抗体、细菌抗原、寄生虫抗原或细胞抗原；以及某些抗细菌试剂、抗真菌试剂、抗病毒试剂、抗增殖试剂、免疫抑制试剂、组胺受体拮抗剂、粘附分子和受体分子。多肽还包括糖蛋白。
与递送体一起使用的激素的实例包括但不限于前列腺素、5-羟色胺、组胺、缓激肽、激肽释放酶、和胃肠道激素、释放激素、垂体激素、胰岛素、抗利尿激素(ADH)、胰高血糖素和脑磷脂。与递送肽一起使用的粘附分子的实例包括但不限于IgSF CAM(例如NCAM、ICAM-1、VCAM-1、PECAM-1、L1、CHL1、MAG、整合素或凝集素)以及已知在细胞粘附过程中与细胞或细胞外基质(ECM)结合的其他分子。与递送肽一起使用的受体分子的实例包括但不限于在细胞膜上、在细胞质中或在核中已知与配体结合从而例如诱导信号的促代谢受体、G蛋白偶联受体、毒蕈碱乙酰胆碱受体、腺甙受体、肾上腺素受体、GABA受体、血管紧张素受体、大麻素受体、胆囊收缩素受体、多巴胺受体、胰高血糖素受体、代谢型谷氨酸受体、组胺受体、嗅觉受体、阿片受体、趋化因子受体、钙敏感受体、生长抑素受体、5-羟色胺受体或分泌素受体和其他蛋白质。
可以作为与递送肽一起使用的货物分子的抗体分子的实例包括本领域技术人员已知的任何抗体或者本发明所述的任何抗体。抗体分子可以包括免疫抑制试剂，包括抑制、减少或延迟哺乳动物免疫系统的活性的抗体分子。已知的免疫抑制试剂包括但不限于抗IL-2受体抗体、抗-OKT3抗体、抗-CD3抗体和TNF-α结合抗体。
可以作为合适的货物分子的多糖的实例包括本领域技术人员已知的任何多糖或者本领域所述的任何多糖。
可以作为合适的货物分子的小分子化合物的实例包括任何有机分子，例如具有治疗活性的传统药品分子，以及某些化疗试剂，例如维生素、止痛试剂、抗炎试剂等。小分子化合物还可以包括抗病毒试剂和抗细菌试剂，包括分别抑制病毒或细菌物种生长的化合物。小分子化合物还可以包括抗真菌试剂，包括抑制真菌物种生长的化合物。
与递送肽一起使用的抗真菌试剂的实例包括但不限于两性霉素、伊曲康唑、酮康唑、霉康唑、制霉菌素、克霉唑、氟康唑、环吡司、益康唑、萘替芳、特比萘芬和灰黄霉素。与递送肽一起使用的抗病毒试剂的实例包括但不限于无环鸟苷、法昔洛韦、更昔洛韦、膦甲酸、碘苷、索利夫定、曲氟尿苷(三氟吡啶)、伐昔洛韦、西多福韦、双脱氧胞甙、司他夫定、扎西他宾、齐多呋定、利巴韦林和rimantatine。与递送肽一起使用的抗细菌试剂的实例包括但不限于β-内酰胺抗生素或喹诺酮抗生素、萘夫西林、苯唑西林、青霉素、阿莫西林、氨苄青霉素、头孢菌素、头孢噻肟、头孢曲松、利福平、米诺环素、环丙沙星、诺氟沙星、红霉素、四环素、庆大霉素、大环内酯、喹诺酮、β-内酯、P-内酰胺酶抑制剂、水杨酰胺、万古霉素、磺胺、磺胺甲噁唑、磺胺醋酰、磺胺异噁唑、磺胺嘧啶、青霉素(例如青霉素G和V)、甲氧苯青霉素、苯唑西林、乙氧萘胺青霉素、氨苄青霉素、阿莫西林、羧苄青霉素、替卡西林、美洛西林、哌拉西林、头孢菌素(例如先锋霉素、唑啉头孢菌素、头孢氨苄、头孢羟氨苄、头孢孟多、头孢西丁、氯氨苄青霉素、呋肟头孢菌素、洛拉卡比、头孢尼西、头孢替坦、头孢雷特、头孢噻肟、头孢泊肟、普塞、头孢唑肟、头孢哌酮钠第三代头孢菌素类药、头孢他啶和头孢吡)、氨基糖苷类(例如正大霉素、托普霉素、阿米卡星、达地米星、新霉素、卡那霉素、链霉素等)、四环素(例如氯四环素、土霉素、地美环素、甲烯土霉素、多西环素和米诺环素)以及大环内酯(例如红霉素、克拉霉素和阿奇霉素)或它们的类似物。
小分子化合物还可以包括抗增殖试剂，包括抑制或限制细胞增殖的化合物。与递送肽一起使用的抗增殖试剂的实例包括但不限于甲氨蝶呤、咪唑硫嘌呤、氟尿嘧啶、羟基脲、6-硫代鸟嘌呤、环磷酰胺、双(氯乙基)甲胺盐酸盐、卡氯芥、环孢霉素、紫杉酚、他克莫司、长春碱、氨苯砜、奈多罗米、色甘酸(cromoglycic acid)和柳氮磺胺吡啶。小分子化合物还可以包括抗肿瘤试剂，包括抑制、减少或延迟肿瘤的化合物。与递送肽一起使用的抗肿瘤试剂的实例包括但不限于喷司他丁、6-巯基嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、甲氨蝶呤、博来霉素、依托泊苷、替尼泊苷、放线菌素D、道诺霉素、阿霉素、米托蒽醌、羟基脲、5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷、氟达拉滨、丝裂霉素、顺铂、甲基苄肼、氮烯唑胺、特素、秋水仙碱和长春花生物碱。
可以作为与递送肽一起使用的合适的货物分子的纳米颗粒的实例包括至少一个维度小于400nm的任何小颗粒，或者本领域技术人员已知的任何其他合适的形式和尺寸，例如金颗粒、量子点负荷的聚合胶束或某些脂质体。更优选的是，纳米颗粒具有至少一个维度小于大约300nm、小于大约200nm、小于大约100nm、小于大约50nm、小于大约20、小于大约10nm或小于3nm。
可以作为与递送肽一起使用的合适的货物分子的合成聚合物的实例包括本领域技术人员已知的任何人造的聚合物或者本发明所述的任何人造的聚合物。
可以作为与递送肽一起使用的合适的货物分子的病毒的实例包括本领域技术人员已知的任何类型的病毒或病毒颗粒，例如但不限于腺病毒、腺病毒相关病毒、疱疹病毒(herpes virus)、单纯疱疹病毒(simplex virus)、慢病毒和逆转录病毒。病毒还可以进行修饰，例如经改造而增加或降低感染性的病毒。病毒颗粒包括包含衍生自病毒的遗传元件的病毒载体。通常，在病毒载体中，病毒复制所必需的病毒基因组的一部分被删除，因此必须提供辅助病毒从而产生新的病毒粒子。
可以作为与递送肽一起使用的合适的货物分子的金属的实例包括本领域技术人员已知的任何金属，例如金、铂、镧系金属、锕系金属等，以及放射性金属，其中所述的货物分子有利于检测和/或成像。
可以作为与递送肽一起使用的合适的货物分子的毒素的实例包括在与肌体组织接触或吸收时能够导致细胞死亡的任何分子。其实例包括但不限于肉毒杆菌毒素、破伤风毒素、百日咳毒素、热稳定性的和不耐热的大肠杆菌肠毒素、霍乱毒素、志贺毒素、细胞膨胀致死毒素、气管细胞毒素、白喉毒素、梭状芽胞杆菌毒素、河豚毒素(Tetrodotoxin)、蟾毒素(Batrachotoxin)、莫鲁蝎毒素(Maurotoxin)、蝎毒素(Agitoxin)、卡律蝎毒素(Charybdotoxin)、玛格斑蝎毒素(Margatoxin)、斯罗毒素(Slotoxin)、希拉毒素(Scyllatoxin)、钙抑蛋白(Calciseptine)、太卡毒素(Taicatoxin)和钙阻蛋白(Calcicludine)。
可以作为与递送肽一起使用的合适的货物分子的脂质的实例包括本领域技术人员已知的任何脂质，包括但不限于脂肪酸(例如饱和的、不饱和的大于4个碳链长度，前列腺素类、白细胞三烯、类二十烷酸等)、中性脂质(例如胆固醇及其酯、甘油三酯、类固醇、鲸脑(鲸蜡)、蜡、脂肪醇等)、磷脂(例如磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、乙醇胺、磷脂酰肌醇、血小板活化因子、脂肪酸甘油醚、心肌磷脂等)和复合脂质(例如鞘脂、神经酰胺、糖脂、神经节苷脂、硫脂等)。
在某些实施方案中，货物分子为在穿越BBB时提供治疗和/或预防益处的治疗或预防试剂。在具体的实施方案中，递送肽不仅与货物分子连接，如本发明所述，而且额外地与靶向试剂连接，例如用于指导货物分子至CNS/脑中的特定结构或受体。此类连接键可以为本发明所述的任何连接键，并且优选地为肽键。靶向试剂的实例包括但不限于细胞受体的配体(例如NGF、EGF等)以及针对受体的抗体。
在某些实施方案中，所述的货物包括用于成像或检测递送肽的位置的标记，以及还可以为与其有关的任何分子。在本发明的内容中，“标记”包括任何诊断成像剂或造影剂，其允许在宏观或微观水平下使分子和/或细胞过程显现。标记的实例包括但不限于mTc葡庚糖酸盐；在磁共振成像(MRI)过程中使用的物质，例如钆掺杂的螯合试剂，例如Gd-DTPA；当表达时编码可检测蛋白质的标志物基因，例如β-半乳糖苷酶、绿色荧光蛋白、辣根过氧化物酶(HRP)、荧光素酶或适用于构成细胞的其他酶；重金属；卤素；酶；酶底物；酶辅助因子；酶抑制剂；配体；和半抗原；以及荧光部分，例如氟石；荧光猝灭部分、放射性部分例如放射性核；透射部分；顺磁部分；纳米颗粒；囊泡；分子信标；同位素；标志物、染料、放射致敏剂(例如用于放射治疗)、或者其他诊断成像试剂或造影剂。
示例性荧光标记包括但不限于荧光染料、荧光素、半导体量子点、含镧系原子的复合物和荧光蛋白质。示例性荧光蛋白质包括但不限于天然形成的和修饰的(即，突变的)绿色荧光蛋白(Prasher et al.,Gene 111:229-233(1992)；PCT申请WO 95/07463,该文献以引用方式全文并入本文)；天然形成的和修饰的蓝色荧光蛋白(Karatani et al.,Photochem.Photobiol.55(2):293-299(1992)；Lee et al.,Methods Enzymol.(Biolumin.Chemilumin.)57:226-234(1978)；Gast et al.,Biochem.Biophys.Res.Commun.80(1):14-21(1978),该文献以引用方式全文并入本文)；以及衍生自蓝细菌和真核藻类的类型的藻胆蛋白(Apt et al.,J.Mol.Biol.238:79-96(1995)；Glazer,Ann.Rev.Microbiol.36:173-198(1982)；Fairchild et al.,J.Biol.Chem.269:8686-8694(1994)；Pilot et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6983-6987(1984)；Lui et al.,Plant Physiol.103:293-294(1993)；Houmard et al.,J.Bacteriol.170:5512-5521(1988),该文献以引用方式全文并入本文)，其中多种可购自ProZyme,Inc.(San Leandro,Calif.).
可以作为合适的货物分子用于标记递送肽的同位素的实例包括任何放射性同位素。放射性同位素的实例包括但不限于N15、C13、P31、F19或I131。优选的同位素包括锝(例如99mTc)和镓(例如GaCl3)。实施例2的部分(b)提供了关于这些同位素标记本发明的递送肽以用在BBB模型的体外测试用途中的其他细节；实施例2的部分(f)提供了用于在小鼠中体内生物分布研究的细节。
可以作为合适的货物分子用于标记递送肽的染料的实例包括用于分子用途的任何着色物质。染料的实例包括但不限于Cy2、Cy3、Cy5、Cy7、Texas Red、Calcein、FITC、FluorXTM、Alexa 405、430、488、546、559、594、633、660、674、680、700、若丹明染料、级联蓝、Pacific Blue、5-FAM、Oregon GreenTM500、Oregon GreenTM488、RiboGreenTM、MagnesiumGreenTM、Calcium GreenTM、564/570、Magnesium OrangeTM、Phycoerythrin、CalciumOrangeTM、Pyronin Y、Cy3.5TM、Calcium CrimsonTM、AlexaTM594、Nile Red、R-phycocyanin、C-Phycocyanin、DiD DilC(5)、CySTM、Thiadicarbocyanine和Cy5.5TM。示例性的镧系原子包括但不限于Ce、Pr、Nd、Pm、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb和Lv。其中Nd、Er和Tb是优选的，这是因为它们常用于成像应用中。
所述的递送肽可以通过共价和/或非共价相互作用与其货物分子结合，从而优选地形成用于递送穿越BBB的稳定的构建体或复合物。例如递送肽及其货物分子可以通过静电相互作用、范德华力和/或氢键而非共价结合。优选的是，所述的结合是通过共价方式进行，例如在递送肽上的基团与货物分子上的基团之间形成化学键。该化学键可以是直接的或间接的，例如使用连接体。在具体的实施方案中，连接体为肽连接体。货物分子可以与递送肽的N-末端或C-末端连接，或者与其氨基酸序列中的位点连接。
在其中货物分子包含多肽的一些实施方案中，货物分子可以作为融合体与递送肽连接。例如货物分子和递送肽可以由单一核酸(或多核苷酸)作为单一连续的区域表达。本发明考虑了编码这些融合体蛋白质的多核苷酸，包含这些核酸的载体或宿主细胞，以及包含这些宿主细胞、载体和/或多核苷酸的药物组合物。
本发明所述的递送系统可以与一种或多种其他的递送方法联合使用(例如参见在Neuwelt et al.“Strategies to advance translational research into brainbarriers”Lancet Neurol.2008(7):8496；Pardridge,Pharmaceutical research(2007)24:1733-1744；Pardridge,Drug Discov Today(2007)12(1-2):54-61；Pardridge,Nat RevDrug Discov(2002)1(2):131-139；Strazielle,et al.Mol Pharm(2013)10(5):1473-1491；Abbott,et al.Neurobiol Dis.(2010)37:13-25；Patel,et al.,CNS Drugs(2009)23(1):35-58；Neuwelt,et al.Nature reviews Neuroscience(2011)12:169-182；Interlandi,Scientific American(2013)308:52-57；Niewoehner,et al.Neuron.(2014)81:49-60；Yu,et al.Science translational medicine(2014)6:261ra154；Sharma,etal.Journal of pharmaceutical sciences(2012)101:2468-2478；Derossi,et al.TheJournal of biological chemistry(1994)269:10444-10450；Zou,et al.CurrNeuropharmacol(2013)11(2):197-208；and Gupta,et al.Advanced drug deliveryreviews(2005)57:637-651中所讨论的方法，这些文献的每一份均以引用方式全文并入本文)。
在具体的实施方案中，货物分子包括在本领域中使用的或者在阿尔茨海默病或相关紊乱的治疗中待测试的活性试剂。例如货物分子可以为以下中的一种或多种：ELN 0005，寡聚体形成的抑制剂；CAD 106(Novartis)，提供了由BAP的N-末端B细胞表位衍生的BAP1-6肽；ACC-001(Affitope AD02)，提供了BAP1-6氨基末端片段；以及V950，提供了与ISCO-MATRIX缀合的氨基-末端BAP。这些活性试剂的任一一种的一个或多个可以与本发明的一种或多种递送肽结合，例如形成融合体，从而改善向CNS和脑的递送。
在具体的实施方案中，货物分子包括在本领域中使用的或者在阿尔茨海默病或相关紊乱的治疗中待测试的抗体。在优选的实施方案中，货物分子包括免疫特异性结合BAP的抗体分子或其片段，例如本发明所述的或本领域已知的。本领域的抗BAP抗体的实例包括人源化单克隆抗-BAP抗体Bapineuzumab(Wyeth and Elan)，其结合可溶性的和纤维状形式的BAP(Bard et al.(2000)Nature Medicine 6:916-919,该文献以引用方式全文并入本文)；BAN2401，人源化单克隆抗体靶向原细纤维；Crenezumab，针对BAP1-40和BAP42的人源化抗体；Gantenerumab，针对BAP1-11的人源化单克隆抗体；GSK933776，针对BAP的N-末端的人源化IgG1单克隆抗体；以及Solanezumab(Eli Lilly)，优选地结合可溶性BAP的BAP16-24的人源化单克隆抗体(Teich(2012)Biochem.J.446:165–177,该文献以引用方式全文并入本文)，以及在Sumbria等人“Disaggregation of amyloid plaque in brain of Alzheimer's disease transgenic mice with daily subcutaneous administration of atetravalent bispecific antibody that targets the transferrin receptor and thebeta amyloid peptide”Molecular pharmaceutics(2013)10:3507-3513(该文献以引用方式全文并入本文)中所述的抗体。这些抗体的任一一种的一个或多个可以与本发明的一种或多种递送肽结合，例如形成融合体，从而改善向CNS和脑的递送。
在更优选的实施方案中，货物分子包括本发明的抗体分子，例如与本发明的递送肽融合，例如下文中更详细描述的那样。
4.抗体-肽构建体
在具体的实施方案中，本发明的抗体分子与本发明的递送肽连接，从而形成抗体-肽构建体。通常，抗体-肽构建体显示穿越血脑屏障的更高的能力，并且特别是比不具有连接的肽的抗体分子更是如此。抗体分子的递送在阿尔茨海默病或其相关紊乱(包括与脑中倾向于聚集肽的累积有关的病况)中可以提供治疗和/或预防益处。如上文所注释的那样，递送肽可以提供用于治疗和预防用途的益处，例如在优选的实施方案中，断裂成非毒性的化合物，和/或提供了用于体内药品-药品相互作用的低潜力。与大的蛋白质相比，递送肽通常还具有导致免疫反应的低可能性，从而提供如同载体分子的较低的免疫原性。
增多的血脑屏障通道促进了本发明的抗体分子递送至脑，其中所述的抗体分子在脑中起作用于减少、防止、减慢、延迟或逆转BAP42寡聚体纤维化。在优选的实施方案中，抗体-肽构建体与不具有连接的肽的抗体分子相比，将BBB穿越增加至少大约2倍、至少大约2.5倍、至少大约3倍、至少大约3.5倍、至少大约4倍、至少大约4.5倍、至少大约5倍、至少大约5.5倍、或至少大约6倍。
在特别优选的实施方案中，抗体-肽构建体优选地穿越BBB，比其穿越其他内皮细胞层更高程度地穿越该屏障，即使BBB通常更难以穿越。例如抗体-肽构建体可以比不包含脑内皮细胞的内皮细胞层更高程度地穿越BBB，达到至少大约2倍、至少大约3倍、至少大约5倍、至少大约10倍、至少大约20倍、至少大约50倍、至少大约60倍、至少大约70倍、或至少大约80倍。在一些实施方案中，抗体-肽构建体除了血脑屏障以外，不穿越、或者基本上不穿越内皮细胞层。
在具体的实施方案中，所述的抗体分子与递送肽共价连接，优选地形成融合体。所述的抗体分子和递送肽可以相对于彼此以任何顺序排列，例如递送肽可以与抗体分子的N-末端的上游融合，或者递送肽可以与抗体分子的C-末端的下游融合。在一些实施方案中，抗体分子通过连接体与递送肽连接，所述连接体优选地是肽连接体。例如连接体可以连接抗体分子的N-末端的上游，或者抗体分子的C-末端的下游，并且递送肽与连接体的游离末端连接。
在一些实施方案中，多于一个的抗体分子可以与给定递送肽连接，其中多个抗体分子可以是相同的或不同的抗体分子。例如可以连接2个VL抗体分子，从而形成二聚体，其本身与递送肽连接，或者与2个或多个递送肽连接，如下文中更详细讨论的那样。
换言之，在一些实施方案中，多于一个的递送肽可以与给定抗体分子连接，其中多个递送肽可以是相同的或不同的递送肽。在具体的实施方案中，2个、3个或4个递送肽与给定的抗体分子连接，例如在一排中与抗体分子的C-末端或N-末端连接，或者1个递送肽可以与抗体分子的C-末端连接，并且2个递送肽在一排中与抗体分子的N-末端连接，或者2个递送肽在一排中与抗体分子的C-末端连接，并且1个递送肽与抗体分子的N-末端连接。在给定的构建体中使用的多个递送肽可以彼此是相同的，或者可以使用2个、3个或多个不同的递送肽。每个抗体分子使用多于一个的递送肽增加了亲合力，并且优选地增加了构建体穿越BBB的能力。
抗体-肽构建体优选地具有本发明的抗体分子的一个或多个优选的特征，如上文讨论的那样；和/或本发明的递送肽的一个或多个优选的特征，也如上文讨论的那样。
此外，抗体-肽构建体优选地显示出在宿主细胞中的稳定性、溶解性和/或高表达的特征。与抗体分子(例如单一结构域抗体分子)连接从而得到具有这些特征的构建体的合适的递送肽可以通过克隆测试的单一结构域抗体，并测定它们的稳定性、溶解性和/或表达来选择。实施例3的部分(a)-(b)提供了递送肽的测试克隆示例性实施方案和测量测试抗体-肽构建体表达的细节。例如可以选择与测试抗体具有至少相同的高表达的测试构建体，已知所述的测试抗体在合适的条件下在给定的宿主细胞中由给定的表达载体良好地表达。还可以选择与测试抗体具有至少相同的高稳定性和/或至少相同的高溶解性的测试构建体，已知所述的测试抗体在合适的条件下在给定的宿主细胞中由给定的表达载体稳定地且以可溶形式表达。例如参见实施例3的部分(b)，其中结果与对照pT7-sdAb相当，其显示高的表达水平。
本发明的优选的抗体-肽构建体通常干扰BAP42的寡聚体种类的聚集，从而减少、逆转、防止、减慢或延迟寡聚体在脑中的纤维化。在优选的实施方案中，所述的构建体与不具有连接的递送肽的抗体分子相同或基本相同地程度地执行上述作用。例如与缺乏候选抗体分子或抗体-肽构建体情况下的纤维化相比，抗体-肽构建体可以阻止纤维化达到至少大约20％、至少大约30％、至少大约40％、至少大约50％、至少大约60％、至少大约70％、或至少大约80％。在体外测定中阻止纤维化的程度可以表明脑中被本发明的给定抗体-肽构建体阻止纤维化的程度。实施例3的部分(c)提供了测试本发明的示例性构建体用于阻止BAP42聚集的能力的细节(还参见图29A-29B)。
本发明的优选的抗体-肽构建体通常具有用于到达受试对象的脑中和/或用于随后从脑中清除并最终从受试对象的肌体中消除的有利的生物分布谱。生物分布谱可以通过本领域已知的和/或本发明所述的技术来测定。例如可以使用一种或多种放射性同位素标记抗体-肽构建体，并将其注射至测试动物中，然后在给定时间间隔后，针对放射活性测量处死动物的脑，如上文所述。实施例3的部分(e)提供了关于上述方法的其他细节，其中鉴定显示快速脑吸收和/或快速脑洗出的抗体-递送构建体(还参见表14-16)。显示快速脑吸收的抗体-肽构建体可以定义为在注射某种量的肽之后在某一时间段内到达测试动物的脑中的构建体。例如向小鼠注射大约0.1mM至大约0.2mM抗体-肽构建体的大约2分钟内到达小鼠脑中的抗体-肽构建体在快速脑吸收方面可以鉴定为显示理想的生物分布。可以根据在注射某种量的抗体-肽构建体后的某个时间段内保留在测试动物的脑中的肽的百分比或者相反地从测试动物的脑中清除的百分比来定义抗体-肽构建体从脑中的理想清除。例如在优选的实施方案中，到达小鼠脑中的抗体-肽构建体的至少大约90％可以在注射小鼠大约0.1mM至大约0.2mM抗体-肽构建体的60分钟内从其中清除(0.1mM至大约0.2mM相当于大约150μg至大约250μg抗体或抗体-肽构建体)。可以根据其他的参数来定义所需的生物分布(包括快速脑吸收和快速脑清除)，例如在表14-16中和附文中提供的参数。
在优选的实施方案中，与不具有连接的递送肽的相应抗体分子相比，所述的构建体显示令人惊讶的改善的生物分布谱。例如与未连接的抗体分子相比，抗体-肽构建体可以显示脑吸收增加至少大约1.5、至少大约2、至少大约4、至少大约6、至少大约8或至少大约10倍。与未连接的抗体分子相比，抗体-肽构建体可以显示增加的脑洗出，或者可以显示与脑吸收的改善相比，脑洗出降低至更低的程度。例如表14惊人地显示将“#2”sdAb与递送肽“pepH3”连接使其在2分钟内在脑中的存在增加为大约3倍，并且在1小时后，仅减慢其从脑中的洗出为大约2倍。换言之，大约3倍的抗体在2分钟内到达脑中，同时仅大约2倍的抗体在1小时后被保留(即，没有被洗出)。甚至更惊人地，表16显示将“#27in”sdAb与递送肽“pepH3”连接使其在2分钟内在脑中的存在增加为大约6倍，并且在1小时后，仅减慢其从脑中的洗出为大约2倍。换言之，大约6倍的抗体在2分钟内到达脑中，同时仅大约2倍的抗体在1小时后被保留。
本发明优选的抗体-肽构建体通常显示体内效力，例如在动物模型中。用于阿尔茨海默病或相关紊乱的合适的动物模型包括本领域已知的或本发明所述的那些。例如可以使用5xFAD转基因小鼠(Jawhar,et al.(2012)Neurobiology of Aging 33(1):96.e29–196.e40)，其中使用抗体分子或其肽构建体注射动物，然后成像，从而测定β-淀粉样斑块在动物的脑中的存在情况和程度。实施例4提供了关于这种方法的其他细节，其中使用Thiazin Red在施用本发明的示例性抗体-肽构建体后在双光子显微镜下鉴定斑块。
在具体的实施方案中，本发明的抗体-肽构建体包含或由至少一条氨基酸序列组成，该氨基酸序列选自SEQ ID NO:28-111或者SEQ ID NO:28-111任意一条的片段，所述片段保留了亲代序列的BAP42寡聚体免疫特异性和/或BBB特异性，或者基本上保留了亲代的BAP42寡聚体免疫特异性和/或BBB特异性。在具体的实施方案中，所述的抗体-肽构建体包含或由一条氨基酸序列组成，该氨基酸序列选自SEQ ID NO:28-111，或者其BAP42寡聚体免疫特异性、BBB特异性片段。可以通过生成给定氨基酸序列的长度改变的片段，并针对与BAP42寡聚体的优选的结合及优选地穿越BBB进行测试来选择保留这些活性的片段，如本发明所述。
在某些实施方案中，本发明涵盖了保留了亲代序列的至少一种活性的SEQ ID NO:28-111氨基酸序列的变体或衍生物；或者也保留了亲代序列的至少一种活性的所述的变体或衍生物的片段。例如所述的变体或片段可以优选地穿越BBB，并且免疫特异性地并优选地结合BAP42寡聚体和/或单体。可以通过生成给定氨基酸序列的片段，并针对与BAP42寡聚体和/或单体的免疫特异性结合及优选的BBB穿越进行测试来选择保留这些活性的变体(及其片段)，如本发明所述。
在某些实施方案中，本发明的抗体-肽构建体为包含或由如下氨基酸序列组成的变体，其中所述的氨基酸序列与相同长度(即，由相同数量的残基组成)的第二氨基酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列一致性，其中所述的第二氨基酸序列选自SEQ ID NO:26-109和/或其变体，并且其中所述的变体展现衍生该变体的亲代序列的至少一种活性(例如比其他内皮细胞层更高程度地优选地并且免疫特异性地结合BAP42寡聚体和/或穿越BBB)。
本发明的抗体-肽构建体的氨基酸序列变体可以基于本发明提供的关于候选序列的公开内容通过本领域已知的技术而生成。在一些实施方案中，变体可以为取代的、插入的和/或删除的变体，包括上文所述的保守性取代。在形成此类改变中，可以考虑氨基酸的亲水指数，如上文所述；和/或疏水性级别，也如上文所述。
在某些实施方案中，本发明涵盖了相对于本发明公开的氨基酸序列，包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多氨基酸修饰(例如插入、取代、删除等)的抗体-肽构建体。在优选的实施方案中，进行突变使得BAP42寡聚体结合和BBB特异性递送被保留或基本上被保留。
在某些实施方案中，本发明的抗体-肽构建体是去免疫的。换言之，抗体-肽构建体可以被修饰，从而降低其免疫原性，例如其中至少一个TH表位被删除和/或减少。具体而言，具有或不具有与递送体的融合的抗体分子可以被修饰，其中所述的修饰降低免疫原性。在一些实施方案中，融合的递送肽可以单独地去免疫。具体而言，本发明涵盖了抗体分子，其包含与一个或多个递送肽融合的一个或多个抗体单一结构域，其中所述的一个或两个结构域可以通过本领域已知的和/或本发明所述的任何方法修饰，从而降低抗体-肽构建体的免疫原性。
去免疫可以通过本领域已知的和/或本发明所述的任何过程完成，如上文所注释。因此，在一些实施方案中，提供了去免疫的抗体分子及其与递送肽的融合体。“去免疫的”多肽经突变而降低了TH表位的含量，并且包含降低了免疫原性的一个或多个取代。通常，抗体-肽构建体包含在一个或多个氨基酸位置处的取代，从而降低或消除结合一个或多个HLAII类受体的表位。
取代可以在例如抗体单一结构域中(例如在轻链可变结构域中)形成；和/或在融合的递送肽中形成。在一些实施方案中，去免疫的抗体分子包含消除至少10个TH表位、至少15个TH表位、至少20个TH表位、至少25个TH表位、至少30个TH表位、至少40个TH表位或至少50个TH表位的取代。在优选的实施方案中，与去免疫之前的抗体分子和/或递送肽相比，所述的取代不影响或者至少基本上不影响抗体分子的免疫特异性结合，和/或不影响或至少基本上不影响递送肽的BBB特异性。
本发明的抗体-肽构建体在用于治疗或预防阿尔茨海默病和相关紊乱的方法和药物组合物中具有应用，以及在用于诊断这些紊乱的方法和试剂盒中具有应用，如下文更详细讨论的那样。
5.药物组合物和制备该药物组合物的方法
本发明的另一个方面涉及药物组合物以及制备本发明的药物组合物的方法。所述的药物组合物可以通过使用本发明的至少一种抗体分子、递送肽或抗体-肽构建体，并且与药物可接受的载体混合来配制。抗体分子、递送肽或抗体-肽构建体被认为是本发明的“活性试剂”，并且可以为治疗或预防活性试剂，还称为“治疗或预防试剂”。由于所述的药物组合物对CNS或脑的作用，其可以称为“神经药物”。在一些实施方案中，药物组合物包含编码本发明的至少一种抗体分子、递送肽或抗体-肽构建体的多核苷酸，其是使用药物可接受的载体配制的，用于在施用给有需要的受试对象后的表达。
通常基于预期的施用方式以及待递送的活性试剂来选择药物可接受的载体。在具体的实施方案中，术语“药物可接受的”是指经联邦或州政府的监管机构批准的或者由美国药典或其他用于动物(和更特别的在人类中)的一般公认的药典中列出的。所述的术语还可以指与活性试剂使用的配制物，例如在本发明的实施例中。
术语“载体”是指与所述的试剂一起施用的稀释剂、佐剂(例如弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂)、赋形剂或媒介物。此类药物载体可以是无菌液体，例如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些，例如包括花生油、大豆油、矿物质油、芝麻油等。当静脉内施用药物组合物时，水为普通的载体。生理盐水溶液以及水性右旋糖和甘油溶液也可以用作液体载体，特别是用于可注射的溶液。合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、凝胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。药物可接受的载体、赋形剂和稳定剂的其他实例包括但不限于缓冲剂，例如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸；低分子量的多肽；蛋白质，例如血清白蛋白和凝胶；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合试剂，例如EDTA；糖醇，例如甘露醇或山梨醇；盐形成抗衡离子，例如钠；和/或非离子表面活性剂，例如TWEENTM、聚乙二醇(PEG)和PLURONICSTM，如本领域已知。这些组合物可以采用溶液、悬液、乳液、粉末、持续释放配制物等形式。
在某些实施方案中，提供根据本发明的方法来使用的药物组合物，所述的药物组合物包含治疗和/或预防有效量的本发明的活性试剂，以及药物可接受的载体。本方面的药物组合物可以通过本领域已知的和/或本发明所述的任何技术来制备。
在一些实施方案中，所述的药物组合物包含用于肠胃外施用的本发明的一种或多种抗体分子、一种或多种递送肽和/或一种或多种抗体-肽构建体。肠胃外施用包括例如静脉内、皮内、皮下、腹膜内和肌肉内施用。其他用于递送活性试剂的施用途径包括例如口服、吸入、经皮(局部)和经粘膜施用，以及鼻内和膜内施用。
用于肠胃外施用的溶液或悬液可以包括以下成分：无菌稀释液，例如用于注射的水、生理盐水溶液、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他的合成试剂；缓冲剂，例如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；用于调节渗透压的试剂，例如氯化钠或右旋糖；抗细菌试剂，例如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合试剂，例如乙二胺四乙酸。肠胃外制备物可以封闭在由玻璃或塑料制造的安瓿、一次性注射器或多剂量瓶中。
适用于可注射用途的药物组合物包括无菌水性溶液或分散液、以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。对于静脉内施用，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor EL.(BASF,Parsippany,N.J.)或磷酸盐缓冲的生理盐水(PBS)。所述的载体可以为包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液态聚乙二醇等)和它们的合适的混合物的溶剂或分散介质。可以使用例如表面活性剂保持合适的流动性。抑制微生物有机体的作用可以通过多种抗细菌和抗真菌试剂取得，例如对羟基本甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等。可注射组合物的延长的吸收可以通过在所述的组合物中包含延迟的试剂例如单硬脂酸铝和凝胶来实现。
可以通过引入处于适当溶剂中的所需量的抗体分子、递送肽或抗体-肽构建体以及上文列出的一种或多种组分，然后过滤灭菌来制备无菌可注射溶液。通常，通过使用包含碱性分散液介质的无机媒介物来制备分散液。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，可以使用真空干燥或冷冻干燥。
在一些实施方案中，所述的药物组合物包含与标记结合的本发明的抗体分子、递送肽或抗体-肽构建体，例如用于成像和/或诊断目的。所述的标记可以是本领域已知的或本发明所述的任何标记。在优选的实施方案中，所述的标记有利于在施用后对患者的脑或CSF的成像。具体的标记包括但不限于放射性标记，例如放射性同位素，例如锝或镓；荧光标记或者适用于SPECT或PET成像、或者CT或MRI扫描的任何标记。在优选的实施方案中，所用的标记对患者是无害的。实施例2的部分(b)提供了关于使用锝或镓标记本发明的试剂的细节；实施例5的部分(b)提供了关于本发明的放射性标记的试剂在成像中的用途的细节。
本发明的组合物包含用于制造药物组合物(例如不纯的或无菌的组合物)以及药物组合物(即，适用于施用受试对象或患者的组合物)的原料药组合物。原料药组合物可以用于制备单位剂型，例如包含预防或治疗有效量的本发明公开的活性试剂或者这些试剂与药物可接受的载体的组合。在优选的实施方案中，本发明的抗体分子、递送肽或抗体-肽构建体是基本纯的(即，基本不含限制其作用或产生不理想的副作用的物质)。
本发明进一步提供了可以用于本发明公开的方法中的试剂盒。在一个实施方案中，试剂盒包含本发明的一种或多种活性试剂，例如在一个或多个容器中。在另一个实施方案中，所述的试剂盒在一个或多个容器中进一步包含用于阿尔茨海默病或其相关紊乱的一种或多种其他的预防或治疗试剂。例如在一些实施方案中，本发明提供了包含一个或多个容器的药物包装和试剂盒，其中所述的容器装有本发明的药物组合物的一种或多种活性试剂。可任选地，与此类容器有关的可以是管理药物或生物产品的制造、使用或出售的政府机构所规定的形式的通知，该通知反映了制造、使用或出售的机构的批准，用于人类的施用；和/或使用说明书。
通常，本发明的药物组合物的组分可以分开提供或者在单位剂型中混合在一起提供，例如处于密封容器(例如表明活性试剂的量的安瓿或sachette)中的干燥粉末或不含水的浓缩物。在所述的组合物将口服施用的情况下，可以在一个或多个片剂或胶囊中提供所述的组合物，例如提供用于施用的一种或多种活性试剂的每一种的单位剂量。备选地，在所述的组合物口服施用的情况下，其可以以粉末形式提供，用于加入水或其他饮料，从而制备用于饮用的溶液。在所述的组合物通过输注施用的情况下，其可以分配在包含无菌药品级水或生理盐水的输液瓶中。在所述的组合通过注射施用的情况下，可以提供用于注射的无菌水或生理盐水的安瓿，使得活性试剂和其他组分可以在施用之前混合。
在药物组合物(其包含本发明的抗体分子或抗体-肽构建体、或者包含本发明的递送肽的构建体以及本领域中用于治疗阿尔茨海默病或相关紊乱的不同的活性试剂)中，抗体分子或构建体可以以唯一的活性组分的形式提供。备选地，抗体分子、抗体-肽构建体或构建体(其包含本发明的递送肽以及本领域中用于治疗阿尔茨海默病或相关紊乱的抗体)可以与一种或多种用于阿尔茨海默病或相关紊乱的其他治疗或预防试剂或方法组合提供。例如包含本发明的抗体分子或者抗体-肽构建体的药物组合物可以进一步包含the USFood and Drug Administration(FDA)批准的用于治疗阿尔茨海默病的5种药品的一种或多种，即，NMDA受体的非竞争性拮抗剂(美金刚)，以及胆碱脂酶抑制剂(多奈哌齐、加兰他敏、利凡斯的明和塔可忍)。
包含本发明的抗体分子或抗体-肽构建体的药物组合物可以与以下用于治疗阿尔茨海默病的一种或多种方法组合使用：基于tau的疗法(例如tau磷酸化抑制、微管稳定、阻断tau寡聚化、增强tau降解、以及基于tau的免疫疗法)；其他的基于淀粉体的策略(例如分泌酶的调控、淀粉体转运、抑制淀粉体聚集和促进淀粉体清除)；调控细胞内信号传导级联；氧化应激减少(例如外源抗氧化剂补充和增强内源防御)；靶向线粒体的治疗；细胞钙平衡的调控和抗炎疗法，以及促性腺激素的补充、脂质调节剂(例如他汀类药物)、生长因子的补充、金属螯合、表观遗传修饰剂、半胱天冬酶抑制剂、一氧化氮合成酶的调控、核酸药品、和定向多靶物的配体。
包含本发明的抗体分子或抗体-肽构建体的药物组合物可以进一步包含用于治疗阿尔茨海默病或相关紊乱的一种或多种活性试剂。例如本发明的药物组合物可以与以下中的一种或多种组合使用：ELN 0005，寡聚体配制物的抑制剂；CAD 106(Novartis)，一种提供多拷贝的BAP1-6肽(衍生自BAP的N-末端B细胞表位)的疫苗，其与包含180个拷贝的噬菌体Qβ衣壳蛋白的载体偶联；ACC-001(Affitope AD02)，另一种提供BAP1-6氨基末端片段的疫苗；以及V950，其包含与ISCO-MATRIX缀合的氨基末端BAP。例如这些活性试剂的任意的一种或多种可以组合在包含本发明的抗体分子或抗体-肽构建体的药物组合物中。此外，这些活性试剂的任意的一种或多种可以与本发明的一种或多种递送肽结合，例如作为融合体，从而改善向CNS和脑中的递送，并且在本发明的药物组合物中提供。
包含本发明的抗体分子或抗体-肽构建体的药物组合物可以进一步包含用于治疗阿尔茨海默病或相关紊乱的一种或多种其他的抗体。例如本发明的药物组合物可以与Ohshima-Hosoyama,S.,et al.,PLoS One(2012)7(6):e39036；and Couch,et al.,SciTransl Med(2013)5(183):183ra57,1-12中公开的一种或多种抗体组合使用。本发明的抗体分子还可以与一种或多种其他的抗BAP抗体的被动免疫组合使用，例如避免促炎T细胞反应。其他抗BAP抗体的实例包括人源化单克隆抗-BAP抗体Bapineuzumab(Wyeth和Elan)，其与可溶性和纤维状形式的BAP结合；BAN2401，靶向原细纤维的人源化单克隆抗体；Crenezumab，针对BAP1-40和BAP42的人源化抗体；Gantenerumab，针对BAP1-11的人源化单克隆抗体；GSK933776，针对BAP的N-末端的人源化IgG1单克隆抗体；以及Solanezumab(EliLilly)，针对BAP16-24的人源化单克隆抗体，其优选地结合可溶性BAP(但是，Solanezumab本身不能证明在脑淀粉体累积方面显著的功能改善和改变(Williams(2013)Pharmacology85:289-305；该文献以引用方式并入本文))。例如这些其他抗-BAP抗体的任意的一种或多种可以与包含本发明的抗体分子或抗体-肽构建体的药物组合物组合。此外，这些抗-BAP抗体的任意的一种或多种可以与本发明的一种或多种递送肽结合，例如作为融合体，从而改善向CNS和脑中的递送，并且在本发明的药物组合物中提供。
本发明的药物组合物在针对阿尔茨海默病或相关紊乱的治疗和/或预防策略中具有用途，如下文中更详细描述的那样。
6.治疗和预防用途
本发明的另一个方面涉及这样的策略，其包括向有需要的受试对象施用根据本发明的药物组合物用于延迟、减慢、预防、治疗、逆转、减少神经疾病或紊乱的发生率，和/或管理神经疾病或紊乱，和/或减轻与神经紊乱有关的一种或多种症状。有需要的受试对象包括遭受所述的疾病或紊乱的受试对象，或者倾向于所述的疾病或紊乱的受试对象，例如处于发展或具有所述的疾病或紊乱的复发风险的受试对象。
神经紊乱包括神经退行性疾病，包括但不限于阿尔茨海默病(AD)、帕金森病、亨廷顿病和侧索硬化(ALS)。神经紊乱还包括与其他倾向于聚集的寡聚体肽在脑中累积有关的病况。
在组织病理学水平下，阿尔茨海默病为复杂的进行性病况，其依次与病理学级联相互作用，并且结合下游过程，例如炎症和氧化应激，所有这些都有助于突触完整性的损失、有效的神经网络连接性的损失和进行性局部神经退行性病变。阿尔茨海默病的2种主要的神经病理学特点是细胞外β-淀粉样斑块和衍生自tau(τ)蛋白质高度磷酸化的细胞内神经元纤维缠结。阿尔茨海默病的脑显示β-淀粉体在老年斑中沉积。这种蛋白质是通过淀粉样前体蛋白质(APP)的断裂产生的，所述的淀粉样前体蛋白质在细胞分化以及可能的突触的建立(通过β-分泌酶和γ-分泌酶)中具有重要的发育功能。
除了在阿尔茨海默病的发展过程中的β-淀粉样物累积以外，tau蛋白质还在神经元纤维缠结中累积。这种蛋白质是微管的整体的部分，其是将营养物、囊泡、线粒体和染色体由细胞体运输至轴突和末端并运输回来的内部支撑结构。在阿尔茨海默病中，tau蛋白质变成高度磷酸化的。这种磷酸化导致蛋白质结合在一起，并形成缠结的线，从而导致运输被破坏并最终造成神经元死亡。
据信tau和β-淀粉体导致情景记忆的形成，所述的情景记忆需要内侧颞叶中内嗅皮层和海马体的小区域的神经元连接(海马体和海马旁回)。通过看见、听见和感觉所获取的大量信息在新皮质中处理，并且通过由基本上所有的新皮层区域投射至内鼻区而被汇集(funneled)。据信tau和β-淀粉体的异常(例如上文所述)会干扰这些过程，导致阿尔茨海默病的临床表现。
本发明提供了用于在有需要的受试对象中延迟、减慢、预防、减少阿尔茨海默病或相关紊乱的发生率，治疗、逆转和/或管理阿尔茨海默病或相关紊乱，或减轻阿尔茨海默病或相关紊乱的一个或多个症状的方法。所述的方法通常包括向所述的受试对象施用治疗或预防有效量的本发明的药物组合物，例如包含本发明的抗体分子或抗体-肽构建体、或者包含本发明的递送肽的构建体以及不同的活性试剂的组合物。在具体的实施方案中，本发明提供了减慢或推迟疾病本身的进展，以及预防或延迟处于阿尔茨海默病或相关紊乱风险的受试对象的疾病发作。
本发明的药物组合物提供了针对阿尔茨海默病和/或相关紊乱的治疗和/或预防益处。相关紊乱包括与CNS有关的其他病况，例如涉及BAP(特别是BAP42，寡聚体或更高级别形式)累积的其他的神经病理学病况，以及其他的痴呆。相关紊乱还包括涉及不同的倾向于聚集的寡聚体的病况，其也可以被本发明的抗体分子靶向，换言之，特征在于其他的神经退行性疾病或阮病毒紊乱的其他的倾向于聚集的肽。其他倾向于聚集的肽的实例包括例如衍生自以下重组疾病蛋白质的可溶性寡聚体：α-突触核蛋(涉及帕金森病有关、胰岛淀粉样多肽(IAPP，与II型糖尿病有关)、具有延长的聚谷氨酰胺伸展的亨廷顿病(与亨廷顿病有关)；以及朊病毒蛋白质(PrP，涉及可传播和遗传性海绵状脑病)。
不希望被理论所束缚，这些不同的倾向于聚集的寡聚体可以具有一些共同的结构特征，使得完全不同序列的可溶性肽可以折叠成富含β-片结构，其包含一个或多个共有的构象表位。其后，由不同的导致疾病的蛋白质产生的组件可以引发相似的细胞毒性机制，此外，可以使用本发明的抗体分子通过它们共同的结构而被靶向，用于治疗和/或预防干预。
阿尔茨海默病和一些与其相关的紊乱的症状包括例如记忆丧失、方向障碍、痴呆、认知障碍、轻度认知障碍以及与语言、判断和问题解决有关的问题。这些问题通常导致不能执行每日的任务，并最终痴呆。最普通的早期症状是难以记忆近期的事件(短期记忆丧失)，随后通常为说话、容易迷路、情绪波动、缺乏动力和不能自理管理的问题。阿尔茨海默病分成4个阶段：痴呆前，类似于老龄化对记忆丧失产生的作用；早期阶段，健忘增强以及在不熟悉的环境下产生混乱；中期阶段，伴有难以记忆近期学到的信息和独立能力丧失；以及晚期阶段，特征在于完全依赖于护理人员，可能会有语言损失和卧床不起。逐渐地，甚至肌体的功能损失，最终导致死亡。
在优选的实施方案中，包含本发明的抗体分子或抗体-肽构建体、或者包含本发明的递送肽的构建体以及不同的活性试剂的药物组合物在阿尔茨海默病的早期阶段施用，更优选的是在痴呆前的过程中施用，或者施用给未显示痴呆前的迹象的倾向于阿尔茨海默病的患者。倾向于或者处于阿尔茨海默病风险的受试对象可以通过疾病的生物标志物而鉴定，例如本领域已知的和/或本发明公开的生物标志物。倾向于或者处于阿尔茨海默病风险的受试对象可以通过家族史、或者家族史与生物标志物信息的组合而鉴定。不希望被理论所束缚，在早期或痴呆前、或者甚至在这些阶段之前进行干预，可以在老年斑形成之前或者在老年斑形成达到明显的量之前防止老年斑的形成，从而保护正常的脑的构造和功能。
本发明的药物组合物通常在有效地用于获得所需的治疗和/或预防益处的时间和量进行施用。在优选的实施方案中，配制的和/或施用的有效量不会产生实质的毒性，甚至在长期使用下。从细胞培养物测定和动物研究得到的数据可以用于配制本发明的活性试剂用于人类的剂量的范围和/或时间表。鉴于本发明提出的公开内容，提供治疗和/或预防有效剂量的本发明的活性试剂的量可以通过临床技术测定。例如有效剂量可以从CD1小鼠中的生物分布研究(参见实施例3的部分(e))和5xFAD小鼠中的效力研究(参见实施例4)而推算，其提供了关于本发明的示例性抗体分子和抗体-肽构建体的的合适剂量和施用途径的信息。此类信息可以用于更精确地测定人类中有用的剂量。
剂量和频率可以根据各个患者特定的因素，根据施用的具体的治疗或预防试剂、疾病的严重性和类型、施用途径、以及年龄、体重、应答和患者的既往病史而改变，并且在一些实施方案中，根据执业医生的判断和各个患者的环境而决定。本领域的任一技术人员可以通过考虑所述的因素并根据例如在文献中报告的和在the Physician's DeskReference(56th ed.,2002)中建议的剂量来选择合适的剂量和方案。可以重复施用治疗或预防试剂。所述的过程的多个方面可以改变，例如施用治疗或预防试剂的短期方案，以及此类试剂是单独施用还是与其他的试剂组合施用。
预防和/或治疗试剂、以及它们的组合可以在用于人类之前在合适的动物模型系统中进行测试。此类动物模型系统包括但不限于小鼠、大鼠、牛、猴子、猪、狗、兔等。可以使用本领域公知的任何动物系统。此类模型系统被广泛使用，并且是技术人员公知的，例如5xFAD小鼠模型。在一些优选的实施方案中，使用阿尔茨海默病或相关紊乱的动物模型系统，其基于大鼠、小鼠或其他小型哺乳动物。例如在具体的实施方案中，在5xFAD小鼠模型中，测试BBB特异性的BAP42寡聚体免疫特性的抗体-肽构建体的推定的治疗和/或预防组合物。
一旦本发明的预防和/或治疗试剂在动物模型中测试，便可以在临床试验中测试这些试剂而建立效力。根据本领域任一技术人员已知的通用方法学来进行建立临床试验，并且可以建立最佳的剂量和施用途径，以及本发明的试剂的毒性谱。例如可以设计临床试验，以针对在患有阿尔茨海默病的人类患者中的效力和毒性，测试包含人源化抗体-肽构建体的药物组合物，其中所述的构建体包含选自SEQ ID NO:1-21的氨基酸序列的一个或多个CDR。在一些实施方案中，施用剂量为大约0.1ng至大约1g的人源化抗体-肽构建体，以治疗阿尔茨海默病。大约0.1ng至大约1g的的剂量可以在治疗过程中作为单一剂量施用，或者作为多剂量施用。
本发明的预防和/或治疗试剂的毒性和效力可以通过细胞培养或试验动物中的标准药物过程来测定，例如用于测定LD50(群体的50％致死的剂量)和ED50(有效治疗50％群体的剂量)。毒性与治疗效果之间的剂量比值为治疗指数，例如表示为比值LD50/ED50。展示大的治疗指数的预防和/或治疗试剂是优选的。此外，本发明的试剂的特异性(例如在显示与BAP42寡聚体的免疫特异性结合并优选地转运穿越BBB的优选的实施方案中)有利于在毒性范围之外取得良好的效力。
此外，本领域的任一技术人员可以通过考虑本发明公开中关于在阿尔茨海默病和相关紊乱内容中BAP42寡聚体免疫特异性和BBB特异性试剂的多种特征来选择有效剂量和剂量方案。例如在优选的实施方案中，如上文所讨论，本发明的抗体分子或者构建体的抗体分子成分提供对BAP42寡聚体和/或单体超过BAP42原纤维的高免疫特异性。在优选的实施方案中，如上文所讨论，本发明的抗体分子、或者构建体的抗体分子成分是小的、一价的和/或稳定的。在优选的实施方案中，如上文所讨论，本发明的递送肽、或者构建体的递送肽成分提供了优选的BBB转运、对脑内皮细胞的低毒性、快速脑吸收和/或快速脑清除。在优选的实施方案中，如上文所讨论，本发明的抗体-肽构建体组合了上文所述的特征，更优选地进一步显示稳定的和/或可溶形式的高表达。
本发明的活性试剂可以单独施用，或者与本发明的不同的活性试剂或其他的预防和/或治疗试剂组合施用。各种预防或治疗试剂可以同时在相同的或分开的配制物中施用；或者依次地在分开的配制物中在不同的时间点以任何顺序施用；然而，如果不是同时施用，它们应该以充分接近的时间施用，从而提供所需的治疗或预防作用，包括任何协同作用。各种治疗/预防试剂可以分开地以任何合适的形式并通过任何合适的途径施用。
在多种实施方案中，不同的预防和/或治疗试剂相隔小于1小时、相隔大约1小时、相隔大约1小时至大约2小时、相隔大约2小时至大约3小时、相隔大约3小时至大约4小时、相隔大约4小时至大约5小时、相隔大约5小时至大约6小时、相隔大约6小时至大约7小时、相隔大约7小时至大约8小时、相隔大约8小时至大约9小时、相隔大约9小时至大约10小时、相隔大约10小时至大约11小时、相隔大约11小时至大约12小时、相隔不超过24小时、或者相隔不超过48小时施用。
使用治疗或预防有效量的本发明的活性试剂治疗受试对象可以包括单次施用，或者可以包括在治疗过程中的一系列施用。例如包含本发明的抗体分子(其对BAP42寡聚体具有特异性)的药物组合物可以每日一次、每日两次或每日三次进行施用。在一些实施方案中，活性试剂可以每日一次、每两日一次、一周一次、一周两次、每两周一次、一个月一次、每隔一个月一次、每六周一次、每年两次或每年一次进行施用。在优选的实施方案中，使用每周一次的剂量，更优选的是每周一次的剂量在疾病的过程中持续。还应该理解的是具体活性试剂的有效剂量可以在治疗过程中增加或减少，例如根据在治疗过程中受试对象的改善情况。
在一些实施方案中，显示需要不间断的治疗，例如在长期的基础上，例如在慢性疾病(例如阿尔茨海默病)的不间断的治疗和/或管理。例如在具体的实施方案中，本发明的活性试剂在一段时间内施用，例如至少6个月、至少一年、至少两年、至少五年、至少十年、至少十五年、至少二十年或者在有需要的受试对象的生命的剩余时期。
多种递送系统是已知的，并且可以用于施用本发明的活性试剂。施用本发明的活性试剂的方法包括但不限于肠胃外施用(例如皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内和皮下，包括输注或团注)；硬脑膜上；口服施用(例如在用于食用的胶囊、片剂或溶液中)；膜内施用以及通过上皮、粘膜皮肤或粘膜内侧的吸收(例如鼻内、口腔粘膜、直肠和肠粘膜等)。
对于鼻内或吸入施用而言，本发明的活性试剂可以以干粉吸入剂或气溶胶喷雾呈现的形式而递送。气溶胶可以通过加压容器、泵、喷雾器或雾化器递送，其中优选的是使用合适的推进剂，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、氢氟烷烃(例如1,1,1,2-四氟乙烷(HFA 134ATM)或1,1,1,2,3,3,3-七氟丙烷(HFA 227EATM))、二氧化碳或其他合适的气体。在加压气溶胶的情况下，剂量单位可以通过提供递送计量的阀来测定。加压容器、泵、喷雾器或雾化器可以包含活性试剂的溶液或悬液，例如使用乙醇和推进剂的混合物作为溶剂，其可以另外包含润滑剂，例如去水山梨糖醇三油酸酯。用于吸入剂或吹入药的胶囊和盒(例如由凝胶制成)可以配制成包含例如抗体分子与合适的粉末基(例如乳糖或淀粉)的粉末混合物。
在另一个具体的实施方案中，本发明的活性试剂可以通过鞘内(IT)注射而递送，即，蛋白质施用至脑脊液(CSF)。鞘内注射提供了超过其他标准施用途径的益处，因为CSF提供了对脑和脑膜的更优的接近。CSF覆盖脑，并且提供与表层神经元的大表面积的接触，多至达到表面以下6mm，从而使本发明的抗体分子或抗体-肽构建体、或者包含本发明的递送肽的构建体以及不同的活性试剂更有效地穿透至脑组织中。
在另一个具体的实施方案中，本发明的活性试剂可以在持续释放配制物中递送，例如其中所述的配制物提供了所施用试剂的延长的释放并由此提供延长的半衰期。通用存储装置包括例如膜、胶囊、膜涂敷的胶囊、微胶囊、脂质体和中空的纤维。整体(基质)装置为第二类型的扩散控制系统，其中所述的药物组合物分散或溶解于速度控制基质(例如聚合物基质)中。本发明的活性试剂可以均匀地分散于整个速度控制基质中，并且释放的速度由通过基质中的扩散来控制。适用于整体基质装置中的聚合物包括天然形成的聚合物、合成聚合物、合成的修饰的天然聚合物以及聚合物衍生物。
7.诊断用途
本发明的抗体分子或抗体-肽构建体、或者包含本发明的递送肽以及不同的活性试剂的构建体可以鉴定用于阿尔茨海默病和相关紊乱的生物标志物，优选的是提供用于诊断应用的抗体识别模式。在具体的实施方案中，如本发明所公开，抗体分子和抗体-肽构建体提供了用于诊断脑/神经疾病的组合物、试剂盒和方法，其中所述的疾病涉及脑中BAP42或其他倾向于聚集的肽的异常。在具体的实施方案中，所述的组合物、试剂盒和方法有利于对痴呆前或早期阿尔茨海默病的早期临床诊断，或者预测受试对象的发展阿尔茨海默病的风险。在更优选的实施方案中，本发明有利于对阿尔茨海默病患者的轻度认知障碍(MCI)进展的诊断。
阿尔茨海默病通常基于对其他形式的痴呆的排除进行临床诊断。该诊断可以通过特定脑区中的大量神经炎(衰老)斑块和神经元纤维缠结(NFT)的证明进行神经病理学的证实。
本发明的抗体分子和抗体-肽构建体免疫特异性地结合BAP42单体和寡聚体，和/或在阿尔茨海默病或相关紊乱的患者或倾向于阿尔茨海默病或相关紊乱的患者的脑、CSF或血液(血清)中以改变的水平存在的其他倾向于聚集的肽，其中改变的水平与升高的纤维化有关。换言之，对于阿尔茨海默病或相关紊乱的患者或者处于阿尔茨海默病或相关紊乱的患者的风险的患者而言，BAP42单体和寡聚体、和/或其他倾向于聚集的肽的水平通常处于健康的对照受试对象的正常范围之外。对免疫特异性结合(形成免疫复合物)的检测可以在体外内容方面或通过体内成像提供诊断，以及用于监测疾病或紊乱的进展或者测定治疗或预防试剂在治疗过程中的效力的其他信息。
在具体的实施方案中，测试样品得自受试对象，例如从而实施体外诊断。测试样品可以为血清、脑组织或CSF的样品。在优选的实施方案中，测试样品包含CSF。CSF样品可以通过本领域已知的方法获得，例如腰椎穿刺或脊椎抽液。通常，在患者侧躺的情况下，将双膝拉向胸部，卫生保健提供体将局部麻醉药物(麻醉剂)注射至脊椎，然后插入脊椎穿刺针，通常插入背部较下方的区域，从而收集测试样品。在一些情况下，荧光透射法用于帮助指导穿刺针。备选的方法包括小脑延髓池穿刺，其使用在枕骨(头骨的后面)的下方放置的针；以及脑室穿刺，其涉及在头骨中钻洞并将针直接插入一个脑室中。
例如基于家族史和/或其他早期标志物，患者或受试对象可以患有任何阶段的阿尔茨海默病或相关紊乱，或者可以疑似处于阿尔茨海默病或相关紊乱的风险。在优选的实施方案中，患者处于早期阶段，特征在于轻度认知障碍(MCI)。例如测试样品可以得自具有认知障碍、记忆问题和/或鉴定为痴呆的患者，或者通过脑成像(CT扫描、MRI、PET、SPECT)被鉴定为早期阿尔茨海默病的患者。
例如还可以由未患阿尔茨海默病或任何相关紊乱的和/或未处于阿尔茨海默病或任何相关紊乱的风险的受试对象收集对照样品。预计对照样品具有正常量的与阿尔茨海默病和相关紊乱有关的倾向于聚集的寡聚体肽(在本发明的内容中称为“相关脑肽”)。例如对照样品通常具有健康范围的量的BAP42寡聚体、α-突触核蛋白的肽(在帕金森病中指示)、胰岛淀粉样多肽的肽(在II型糖尿病中指示)、亨廷顿的肽(在亨廷顿病中指示)；和/或阮病毒蛋白质的肽(在海绵状脑病中指示)。在一些实施方案中，不收集对照样品，例如其中关于正常的健康受试对象中关于相关脑肽的量的信息已经获得，例如在未患有阿尔茨海默病或相关紊乱以及未处于阿尔茨海默病或相关紊乱风险的受试对象的CSF、脑或血清中相关脑肽的浓度。
将本发明的抗体分子与得自患有或者倾向于阿尔茨海默病或相关紊乱的受试对象的测试样品接触，通常得到一定水平的免疫特异性结合，该水平处于与对照样品接触时获得的范围之外。具体而言，为了测定测试样品中BAP42寡聚体或其他相关脑肽的量，使测试样品与本发明的一种或多种抗体分子或其肽构建体接触，从而使得免疫特异性结合。在一定的条件下，使抗体分子和/或抗体-肽构建体与测试样品接触，其中所述的条件使得抗体分子或构建体的抗体成分与其免疫特异性识别和结合的抗原之间形成免疫复合物。在具体的实施方案中，抗体分子或构建体在与早期阿尔茨海默病患者的CSF接触时显示适度升高的或统计学显著升高的免疫特异性结合。
在一些实施方案中，当与测试样品接触时，抗体分子或抗体-肽构建体被固定化。例如大量的抗体分子或构建体可以固定化在合适的支持物上。该支持物可以为任何固体或半固体材料，例如树脂、芯片(例如微流控芯片)、微阵列、珠、玻璃、小瓶、色谱柱、平板、陶瓷、改造的热塑性塑料、粘土、聚酯纤维、Teflon、聚乙烯、聚丙烯、或者生物或人造膜、或者根据本领域技术人员已知的任何免疫测试形式。
固定化可以通过共价或非共价相互作用，将抗体分子或其构建体与支持物连接而实现，如本发明所述的或本领域已知的。非共价相互作用包括静电吸引、范德华力和/或氢键。优选的是，固定化是通过共价相互作用，例如在抗体分子或其构建体上的基团与支持物上的基团之间形成化学键。固定化可以与支持物直接发生，或者例如通过连接体或结合的抗体间接发生，其中所述的结合的抗体本身识别并结合本发明的抗体分子或抗体-肽构建体。此外，本领域的任一技术人员将认识到固定化以以下方式发生，所述的方式保持了抗体分子或其构建体的抗体成分的功能性，例如保持或者基本上保持与BAP42寡聚体或其他相关脑肽的优选的和免疫特异性的结合。
所述的样品在与固定化的抗体分子或抗体-肽构建体接触之前经历一个或多个步骤。例如BAP42寡聚体或其他相关脑肽可以在样品中浓缩，或者通过除去某些杂质(例如可以干扰与本发明的抗体分子免疫特异性结合的材料)而部分纯化。备选地，样品中的相关脑肽可以固定化在例如上文所述的合适的支持物上，然后与本发明的抗体分子或抗体-肽构建体接触。
可以检测测试样品中与相关脑肽(例如BAP42寡聚体)的免疫特异性结合。可以通过本领域已知的用于检测、测量或定量抗体分子与其靶抗原的免疫复合物的形成的手段进行检测，即，用于使用免疫测定来检测免疫特异性结合。可以使用的免疫测定包括但不限于使用多种技术的竞争和非竞争性测定系统，其中所述的技术例如Western印迹、放射性免疫测试、ELISA(酶联免疫吸附测定)、“夹心”免疫测试、免疫沉淀测定、沉淀素反应、凝胶扩散沉淀素反应、免疫扩散测定、凝集反应测定、补体结合测定、免疫放射测定、荧光免疫测定、蛋白质A免疫测定等，以及BIAcore分析。此类测试在本领域中有所描述(例如参见Ausubelet al,eds,1994,Current Protocols in Molecular Biology,Vol.1,John Wiley&Sons,Inc.,New York,该文献以引用方式全文并入本文)。还可以使用例如流式细胞仪或闪烁测定来检测、测量或定量免疫特异性结合。例如可以使用放射性标记(例如99Tc、67Ga、68Ga、32P、35S和125I)、荧光标记(例如异硫氰酸荧光素、若丹明、藻红蛋白、藻青蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二醛和荧光胺)或本发明所述的或本领域已知的标记来标记本发明的抗体分子或抗体-肽结构域，从而检测免疫特异性结合。
对免疫特异性结合的检测表明样品中存在的相关脑肽的量，其可以相当于正常量或者大于或小于正常量，其中正常量相当于在对照样品中检测的量，所述的对照样品得自未患有、和未倾向于患有阿尔茨海默病或相关紊乱的受试对象。
处于使用对照样品获得的范围外的或者接近于所述的范围的极低或极高一端的免疫特异性结合可以提供对阿尔茨海默病或相关紊乱的诊断。例如免疫特异性结合BAP42寡聚体的本发明的抗体分子可以表明得自受试对象的CSF样品中适当升高量(统计学意义的升高)的BAP42寡聚体，由此诊断所述的受试对象患有阿尔茨海默病，特别是在与其他诊断测量结合时。免疫特异性结合的程度可以表明阿尔茨海默病的不同阶段，例如其中稍微处于正常范围以外的BAP42寡聚体的量表明痴呆前或早期阶段的阿尔茨海默病，并且更突出的改变表明更晚期的阶段。实施例5的部分(a)提供了使用本发明的示例性抗体分子和抗体-肽构建体的体外诊断的其他细节。
本发明的不同的抗体分子还可以表明不同阶段的阿尔茨海默病，例如其中通过第一抗体分子的免疫特异性结合的异常水平表明较早期的阶段，而通过第二抗体分子的免疫特异性结合的异常水平表明较晚期的阶段。因此，本发明鉴定了用于阿尔茨海默病的特定阶段的生物标志物，特别是早期阶段和与MCI有关的阶段。
本发明还提供了体内诊断或成像方法。具体而言，本发明的抗体分子和抗体-肽构建体免疫特异性地结合BAP42单体和寡聚体，和/或其他的倾向于聚集的肽，它们在阿尔茨海默病或相关紊乱的患者或者倾向于阿尔茨海默病或相关紊乱的患者的脑或CSF中与健康的对照受试对象相比，以改变的量和/或改变的分布方式存在。通过体内成像检测免疫特异性结合可以提供对所述的疾病或紊乱的诊断。
在具体的实施方案中，本发明提供了用于在患者肌体中对倾向于聚集的肽进行成像的方法。例如本发明的抗体分子或抗体-肽构建体可以与标记结合并施用患者。所述的标记可以是本领域已知的或本发明所述的任何标记。在优选的实施方案中，所述的标记有利于在施用之后对患者的脑或CSF进行成像。具体的标记包括但不限于放射性标记或荧光标记。在优选的实施方案中，所用的标记对患者无害。
施用通常涉及肠胃外施用，优选地以有利于递送抗体分子或抗体-肽构建体穿越受试对象的脑或CNS的BBB的方式。在优选的实施方案中，用于体内成像的抗体分子或抗体-肽构建体是人源化的，并且显示BBB特异性的转运和/或BAP42寡聚体免疫特异性结合，如本发明所述。在更优选的实施方案中，所用的抗体分子或抗体-肽构建体不引起对患者BBB的破坏，再次如本发明所述。
倾向于聚集的肽可以为BAP42寡聚体或其他相关的脑肽，如本发明所述。免疫特异性结合的检测表明在患者的脑中存在的相关脑肽的量，其相当于正常量或者大于或小于正常量，其中正常量相当于未患有、和未倾向于患有阿尔茨海默病或相关紊乱的受试对象中检测的量。
在具体的实施方案中，显示对BAP42寡聚体的适当升高(统计学意义的升高)的免疫特异性结合的图像提供了对阿尔茨海默病的诊断。此外，免疫特异性结合的程度和/或方式可以表明阿尔茨海默病的不同阶段，如本发明所讨论的那样。实施例5的部分(b)提供了使用本发明的示例性抗体分子及其构建体的体内成像和诊断的其他细节。
本发明的不同的抗体分子或抗体-肽构建体还可以表明阿尔茨海默病的不同的阶段，例如其中第一抗体分子表明较早期的阶段，而第二抗体分子表明较晚期的阶段。因此，本发明鉴定了用于阿尔茨海默病的特定阶段的生物标志物或结合方式，特别是早期阶段和与MCI相关的阶段。
本发明所述的诊断方法可以单独使用，或者彼此结合使用，或者与用于诊断阿尔茨海默病的一种或多种其他的测量组合使用。在一些实施方案中，用于tau蛋白质(T-tau)和磷酸化的tau蛋白质(P-tau181)的总量的测定可以与根据本发明的方法组合使用。在具体的实例中，与BAP42寡聚体测量组合的对T-tau的分析对于阿尔茨海默病中轻度认知障碍的进展，提供了83％特异性和95％灵敏性。在另一个具体的实施方案中，与BAP42寡聚体/P-tau的比值组合的对T-tau的分析提供了95％灵敏性和87％特异性。在CSF中，这些蛋白质的组合构成了用于阿尔茨海默病中轻度认知障碍的进展的预测生物标志物，并且可以包含在用于阿尔茨海默病诊断的标准中。
使用本发明的抗体分子或抗体-肽构建体的诊断可以提供关于患者中神经化学异常的信息，从而对潜在的患者进行特定的治疗干预和/或选择用于使用新的神经保护性疗法的临床试验。例如在一些实施方案中，在本发明所述的体外或体内诊断后，进行治疗干预，例如将本发明所述的治疗有效量的药物组合物施用经诊断的患者，和/或施用本领域已知的和/或本发明所述的任何其他的阿尔茨海默病疗法。在具体的实施方案中，施用给患者的本发明的抗体分子或抗体-肽构建体是用于提供体外或体内诊断的相同的抗体分子或抗体-肽构建体、或其人源化的形式。
本领域的任一技术人员将认识到，由于在特定的患者中，抗体分子或构建体对鉴定为以异常量或异常方式存在的脑肽显示免疫特异性，之后施用相同的抗体分子或其构建体，提供了有前途的治疗试剂以中和与治疗所述的特定的患者有关的脑肽。在具体的实施方案中，治疗所述的患者的步骤包括施用合适的治疗试剂，例如包含本发明的抗体分子的药物组合物。在具体的实施方案中，治疗所述的患者的步骤包括形成关于诊断的信息，所述的诊断信息是随后施用治疗的卫生保健提供体可利用的。
本发明的方法还可以针对给定的受试对象或受试对象的群体通过重复体内成像和/或体外测定，用于在一段时间内监测阿尔茨海默病或相关紊乱。在所述的受试对象在治疗过程中接受治疗中，例如在临床或研究背景下，重复测试可以用于评估整个治疗过程的效力。例如可以在开始治疗之前，例如在施用本发明的抗体分子之前，测试患者，然后在多次施用或者每次施用活性试剂之后再次测试患者。测定在一定时间内例如在CFS样品或脑成像中，BAP42寡聚体或其他倾向于聚集的肽的量的改变，可以提供关于待施用的试剂的效力的信息。
具体而言，第二测试样品可以在后来的时间得自相同的受试对象。可以将第二测试样品与本发明的抗体分子或抗体-肽构建体接触，然后监测免疫特异性结合。在不同的时间点下，与免疫特异性结合的量相比，可以监测受试对象中倾向于聚集的肽的量。例如得自受试对象的CSF样品中的BAP42寡聚体的升高/降低水平可以表明在一段时间内阿尔茨海默病的改善，其中所述的水平接近于正常范围，由此证明在施用的治疗的效力。类似地，在一段时间内对患者的脑重复体内成像可以提供一系列图像，其显示倾向于聚集的肽的量和/或方式的改变，例如阿尔茨海默病患者中BAP42寡聚体的改变。在患者的脑中显示向着BAP42寡聚体的正常量和/或正常方式的趋势的图像，可以表明在一段时间内阿尔茨海默病的改善，由此证明在施用的治疗的效力。
8.诊断试剂盒
本发明的另一个方面涉及包含本发明的抗体分子、递送肽和/或抗体-肽构建体的试剂盒，例如用于诊断阿尔茨海默病或相关紊乱的试剂盒。本发明提供了用于上文所述的体外或体内诊断方法的试剂盒。
在一些实施方案中，本发明提供了包含大量本发明的抗体分子或抗体-肽构建体的试剂盒。大量抗体分子或抗体-肽构建体是指多于一个分子的相同类型的抗体或其构建体，其以一起使用的集合提供。在具体的实施方案中，大量的抗体分子或抗体-肽构建体提供了足量的分子，从而允许体外检测与靶抗原的免疫特异性结合，例如与CSF样品中的BAP42寡聚体的结合。在具体的实施方案中，大量的抗体分子或抗体-肽构建体提供了足量的分子，从而允许体内检测与靶抗原的免疫特异性结合，例如提供与患者脑中的BAP42寡聚体形成的免疫复合物的图像。本领域的任一技术人员将认识到所需的量取决于用于测定、测量或定量免疫特异性结合的检测方法或免疫测定。
在一些实施方案中，所述的试剂盒可以包含人源化形式的抗体分子或抗体-肽构建体，例如其中试剂意图用于施用给患者(例如在体内成像或诊断方法中)。在一些实施方案中，所述的试剂盒还包括有利于检测免疫特异性结合的标记。所述的标记可以包含在试剂盒的分开的分隔区内，或者可以与所述的抗体分子或抗体-肽构建体结合。合适的标记包括本发明公开的和/或本领域已知的用于免疫测定的任何标记。
在特别优选的实施方案中，大量的抗体分子或抗体-肽构建体固定化在合适的支持物上。所述的支持物可以为任何固体或半固体材料，如上文所讨论的那样，并且固定化可以通过任何共价或非共价相互作用来实现，再次如上文列出的那样。
在一些实施方案中，所述的试剂盒包含本发明的一种类型的抗体分子或抗体-肽构建体。在一些实施方案中，所述的试剂盒包含两种或更多种不同的抗体分子或抗体-肽构建体。如上文所讨论，本发明的不同的抗体分子可以显示不同的免疫特异性结合方式，允许诊断不同阶段的阿尔茨海默病和/或相关紊乱。因此，在一些实施方案中，所述的试剂盒提供了第一大量的本发明的第一抗体分子或抗体-肽构建体，和第二大量的本发明的第二抗体分子或抗体-肽构建体。
在关于体外检测的具体的实施方案中，当与由早期阶段的阿尔茨海默病患者得到的测试样品接触时，第一抗体分子或构建体显示异常水平的免疫特异性结合；当与由晚期阶段的阿尔茨海默病患者得到的测试样品接触时，第二抗体分子或构建体显示异常水平的免疫特异性结合。在关于体内成像的具体的实施方案中，在早期阶段的阿尔茨海默病患者的脑中，第一抗体分子或构建体显示适当升高的(统计学意义的升高)免疫特异性结合；以及在晚期阶段的阿尔茨海默病患者的脑中，第二抗体分子或构建体显示适当升高的(统计学意义的升高)免疫特异性结合。本领域的任一技术人员将理解的是，可以提供试剂盒具有针对不同阶段的阿尔茨海默病的多种不同的抗体分子或抗体-肽构建体，从而有利于对受试对象的疾病的不同阶段的诊断。
在关于体外诊断的特别优选的实施方案中，不同大量的不同抗体分子或抗体-肽构建体固定化在在试剂盒中合适的支持物上可区分的位置处或不同的支持物上或不同的分隔区内。可区分的位置是指试剂盒中分开的位点，在2个大量的抗体分子或抗体-肽构建体的每一个的免疫特异性结合的检测过程中能够区别于第一位点。在一些实施方案中，不同大量的不同的抗体分子或抗体-肽构建体是可区分地标记的，使得2个大量的抗体分子或抗体-肽构建体的每一个的免疫特异性结合都是可以区分的，例如即使所述的抗体分子或抗体-肽构建体被固定化在重叠的位置，或者即使它们没被固定化。
9.制备抗体分子、递送肽和它们的构建体的方法
本发明的另一个方面涉及制备本发明的抗体分子、递送肽和抗体-肽构建体、以及它们的BBB特异性和/或BAP42寡聚体结合片段或衍生物(包括去免疫的和/或人源化的变体)的方法。在一些实施方案中，抗体分子、递送肽、抗体-肽构建体、以及它们的片段和变体是通过重组DNA技术或其他的蛋白质合成技术(例如通过使用肽合成仪)生产的。
在一些实施方案中，抗体分子或其抗体-肽构建体包括多于一个的抗体单一结构域，所述结构域是连接的，从而形成例如二聚体、三聚体、四聚体等，例如VL-VL二聚体。用于生产二聚体多肽和更高级别的多肽构建体的方法是本领域已知的。例如可以将编码第一抗体单一结构域的核酸克隆至包含第二抗体单一结构域的表达载体中，使得2个结构域在框内连接，其中使用或未使用干涉连接体。例如参见Morrison,1985,Science 229:1202；Oiet al.,1986,BioTechniques 4:214；Gillies et al.,1989,J.Immunol.Methods 125:191-202；以及美国专利号6,311,415；5,807,715；4,816,567和4,816,397，这些文献的内容以引用方式全文并入本文。
在一些实施方案中，本发明的抗体分子与递送肽融合。融合蛋白质还可以通过标准的重组DNA技术或者通过蛋白质合成技术而生产，例如使用肽合成仪或通过PCR扩增。除了重组融合体以外，与递送肽的连接可以涉及例如化学缀合，包括共价和非共价缀合。
所述的连接不必是直接的，但是可以通过连接体序列或者通过化学缀合而形成。可以选择目的抗体分子与递送肽之间的蛋白质连接体，从而得以保持挠性和合适的折叠，优选的是使得连接的产物显示BBB特异性以及BAP42寡聚体免疫原性。可以选择例如允许与BAP42寡聚体良好的同时结合以及选择性地穿越BBB的连接体。这种结合可以通过本领域的技术人员已知的和/或本发明所述的技术来测试。
本发明的多核苷酸还涵盖载体，例如用于表达本发明的抗体分子的载体。可以使用本领域技术人员公知的方法来构建表达载体，其包含根据本发明的抗BAP42寡聚体抗体的编码序列，以及合适的转录和翻译控制信号。这些方法包括例如体外重组DNA技术、合成技术和体内遗传重组(例如参见在Sambrook et al.,1990,Molecular Cloning,ALaboratory Manual,2d Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.和Ausubel et al.eds.,1998,Current Protocols in Molecular Biology,JohnWiley&Sons,NY中所述的技术)。
可以通过传统的技术(例如电穿孔、脂质体转染和磷酸钙沉淀)将包含本发明的抗体分子(例如与本发明所述的递送肽形成的融合蛋白质)的核苷酸序列的表达载体转移至宿主细胞中，然后可以通过传统的技术培养转染的细胞，从而生产本发明的构建体。在具体的实施方案中，抗体分子或抗体-肽融合体的表达通过构成型启动子进行调节。在另一个实施方案中，表达通过诱导型启动子进行调节。根据这些实施方案，启动子可以为组织特异性启动子。
在具体的实施方案中，使用这样的载体，其包含与编码蛋白质的核酸可操作地连接的启动子，一个或多个复制起点，以及可任选的一个或多个可选择的标记(例如抗生素抗性基因)。可以使用多种宿主表达载体系统来表达本发明的抗体分子和递送肽、和/或它们的融合体。用于表达重组抗体分子、递送肽或它们的融合体的宿主细胞可以为例如细菌细胞(例如大肠杆菌(Escherichia coli))和真核细胞。合适的细菌细胞的实例包括细菌大肠杆菌或枯草芽孢杆菌(B.subtilis)，它们被重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体所转化。
在具体的实施方案中，大肠杆菌TunerTM(DE3)细胞用于本发明的抗体分子、递送肽和抗体-肽构建体的大规模表达。“TunerTM菌株”为大肠杆菌BL21的lacZY缺陷型突变体，其有利于对细胞培养中蛋白质表达水平的受控的调节。通过lac透性酶(lacY)突变，控制表达水平，所述的突变允许IPTG均匀地进入群体中的细胞，从而响应于变化的IPTG浓度而产生浓度依赖的均匀的诱导。“DE3”表明宿主为
Figure BDA0001400017140000641
的溶原体，其携带处于lacUV5启动子控制之下的T7RNA聚合酶基因的染色体拷贝。
本发明的抗体分子、递送肽或抗体-肽构建体的表达水平可以通过例如载体扩增而增加(综述参见Bebbington and Hentschel,The use of vectors based on geneamplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNAcloning,Vol.3.(Academic Press,New York,1987))。当表达本发明所述多肽的载体系统中的标记是可扩增的时，培养介质的改变可以增加标志物基因的拷贝数。由于扩增区域可以与编码本发明的抗体分子、递送肽或抗体-肽构建体的核苷酸序列相结合，所以所述的试剂生产也可以增多(Crouse et al.,1983,Mol.Cell.Biol.3:257)。
为了重组蛋白质的长期高产率的生产，稳定的表达是优选的。例如稳定地表达本发明的抗体分子、递送肽或抗体-肽构建体的细胞系可以被改造。不使用包含病毒复制起点的表达载体，可以使用受到合适的表达控制元件(例如启动子、增强子序列、转录终止子、多腺苷酸化位点等)和可选择的标志物控制的DNA来转化宿主细胞。在引入外来DNA后，可以使改造的细胞在富集的介质中生长1-2天，然后换成选择性介质。在重组质粒中的可选择的标志物赋予对选择的抗性，并允许细胞将质粒稳定地整合至它们的染色体中并生长而形成集落(foci)，其进而可以被克隆并扩散至细胞系中。这种方法可以有利地用于改造细胞系以用于长期高产率的生产，其中所述的细胞系表达本发明的抗体分子、递送肽或抗体-肽构建体。此类改造的细胞系还可以特别用于筛选和评价与抗体分子、递送肽和/或它们的融合体直接或间接相互作用的化合物。
一旦本发明的抗体分子、递送肽或抗体-肽构建体被重组表达，则其可以通过本领域已知的用于试剂纯化的任何方法来进行纯化，例如通过色谱(例如离子交换、亲和力(特别是通过在Protein A后对特定抗原的亲和力)和尺寸柱色谱)、离心、差别溶解度、或者通过用于蛋白质纯化的任何其他标准的技术。本发明的多肽可以与标志物序列(例如肽)融合，从而有利于纯化。在一些实施方案中，标志物氨基酸序列为六组氨酸肽，例如在pQE载体中提供的标签(QIAGEN,Inc.,9259Eton Avenue,Chatsworth,Calif,91311)等，许多标志物氨基酸序列是市售可得的。如Gentz et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86:821 824,1989(该文献以引用方式全文并入本文)中所述，例如六组氨酸标签提供了对抗体分子、递送肽或其融合体的方便的纯化。用于纯化的其他肽标签包括但不限于血凝素“HA”标签，其对应于得自流感血凝素蛋白质的表位(Wilson et al.,Cell,37:767 1984,该文献以引用方式并入本文)和“flag”标签(Knappik et al.,Biotechniques,17(4):754-761,1994)，这些文献的每一份均以引用方式全文并入本文。另一种技术涉及在大肠杆菌中表达后用于内毒素去除的镍亲和色谱。
可以使用用于减少或消除多肽中一个或多个TH表位的技术来生成本发明的去免疫的抗体分子、递送肽或抗体-肽构建体，如上文详细描述的那样。在氨基酸水平的取代显示编码相同氨基酸的相应核酸的构建体，也如下文更详细描述的那样。
可以使用用于得自人类抗体的相应的区域或氨基酸残基替代非人类抗体的区域或氨基酸残基的技术来生成本发明的人源化的抗体分子或抗体-肽构建体，如上文详细描述的那样。通常，人源化的抗体分子为人类免疫球蛋白(或者它们的可变结构域和/或片段)，其中超变区残基被得自非人类物种的超变区残基替代(例如得自兔VL结构域的供体CDR)，其中所述的非人类物种的超变区残基具有所需的免疫特异性。
10.编码本发明的试剂的多核苷酸
本发明提供了包含如下核苷酸序列的多核苷酸，其中所述的核苷酸序列编码本发明的多肽，例如抗体分子、递送肽、抗体-肽构建体或它们的片段或变体。在具体的实施方案中，本发明的多核苷酸包含或由编码本发明公开的抗体分子的核酸组成，所述抗体分子例如SEQ ID NO:1-21的一个或多个、或其BAP42寡聚体结合片段、或其人源化的变体，例如包含接枝于人类抗体结构域的构架区的SEQ ID NO:1-21的一个或多个CDR。在具体的实施方案中，本发明的多核苷酸包含或由编码本发明公开的递送肽的核酸组成，例如SEQ ID NO:22-25的一个或多个。在具体的实施方案中，本发明的多核苷酸包含或由编码本发明公开的抗体-肽构建体的核酸组成，例如SEQ ID NO:28-111的一个或多个、或其BAP42寡聚体结合和/或BBB特异性片段、或其人源化变体。本发明还涵盖在高度严谨、中等严谨或低严谨的杂交条件下与编码本发明的多肽的多核苷酸杂交的多核苷酸，如上文所述。
所述的多核苷酸可以通过本领域已知的任何方法获得，并且所述的多核苷酸的核苷酸序列可以通过本领域已知的任何方法测定。例如编码本发明的试剂的多核苷酸可以由得自合适来源(例如BAP42寡聚体免疫的兔)的核酸而生成。如果包含编码特定多肽的核酸的来源不可用，但是本发明的试剂的氨基酸序列是已知的，则可以化学合成编码所述试剂的核酸，并使用本领域公知的方法将其克隆至可复制的克隆载体中。
一旦测定本发明的多核苷酸的核苷酸序列，则可以使用本领域公知的用于核苷酸序列操作的方法来操作核苷酸序列，例如重组DNA技术、定点诱变、PCR等(例如参见在Sambrook et al.,1990,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,2d Ed.,Cold SpringHarbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY和Ausubel et al.,eds.,1998,CurrentProtocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,NY中所述的技术，这些文献以引用方式全文并入本文)，从而生成具有不同的氨基酸序列的多肽，例如创建氨基酸取代、删除和/或插入。如上文所述，此类突变的序列可以提供具有增强的药物性质的本发明的试剂，例如改善的免疫特异性、BBB特异性和/或降低的免疫原性。
编码融合产物的多核苷酸可以通过本领域公知的和通常实施的重组技术得到。此类多核苷酸可以称为“嵌合多核苷酸”。重组嵌合多核苷酸通常是通过将2个或更多个基因或其部分(其最初编码不同的蛋白质)连接而创建的。单个序列通常对应于各个蛋白质的每一个的功能结构域的编码序列，使得融合多肽编码具有双重功能性的融合蛋白质(例如与BAP42寡聚体结合并特异性地穿越BBB)。例如第一编码序列或其部分可以与第二编码序列或其部分在框内连接，这通常是通过连接或重叠延伸PCR而实现的。连接与创建嵌合基因的常规方法一起使用，称为“盒诱变方法”。在该方法中，可以通过限制性内切酶在限制性内切酶识别位点的作用，将DNA切成特定的片段，然后可以连接特定的片段。特定的片段可以被具有相容末端的异源片段取代，从而将其连接至亲代DNA中。例如参见Wellset al.,Gene34:315-23(1985)，该文献以引用方式并入本文。
备选地，可以使用涉及PCR的多种方法，例如重叠延伸PCR方法。例如参见Ho,S.N.,et al(1989)。通过重叠延伸的定点诱变使用了聚合酶链式反应。Gene.77:51-59,该文献以引用方式全文并入本文。所述的PCR方法的多种改变是已知的，并且已经用于生成融合产物。例如一种此类的方法涉及修改的重叠延伸PCR，从而在限制性酶缺乏的条件下在3个步骤中创建嵌合基因：(i)传统的PCR步骤，使用5’末端与相邻的片段部分互补的引物，其中所述的片段待融合而创建嵌合分子；(ii)第二个PCR步骤，其中使用引物的互补性末端来融合第一步骤中生成的PCR片段；以及(iii)第三个步骤，涉及融合产物的PCR扩增。最终的PCR产物为使用不同的扩增的PCR片段构建的嵌合基因。例如参见Wurch,T.et al(1998)。经修改的重叠延伸的PCR方法用于在限制性酶缺乏的条件下创建嵌合基因。BiotechnologyTechniques.12(9):653-657，该文献以引用方式全文并入本文。任何连接和/或基于PCR的重组方法都可以用于创建本发明的嵌合(融合)多核苷酸。
备选地，可以化学合成编码融合产物的核酸。例如使用本发明的抗体-肽构建体的所需氨基酸序列，设计相应的氨基酸序列，化学合成，并使用例如本领域公知的方法将其克隆至可复制的克隆载体中。
本发明进一步提供了包含编码本发明的试剂的至少一个多核苷酸的载体。在一些实施方案中，所述的载体为表达载体。本发明进一步提供了包含本发明的一个或多个载体的宿主细胞，例如运行表达所编码的多肽的宿主细胞。所述的载体、表达载体和宿主细胞可以包括上文所讨论的那些多核苷酸的任意一个。
实施例
以下实施例证明抗体分子的研发，其中所述的抗体分子以单一结构域的形式特异性地靶向非纤维状形式的β-淀粉样肽；和肽的研发，所述的肽特异性地穿越血脑屏障；以及肽与单一结构域抗体的构建体。以下实施例进一步证明意外的结果：抗体分子和构建体在阿尔茨海默病动物模型中高效地减少和防止老年斑的形成，以及提供用于体外诊断和体内成像以鉴定早期阶段的所述的疾病的生物标志物。
实施例1—生产靶向非纤维状BAP42的sdAb
研发特异性识别单体和寡聚体形式的BAP42的单一结构域抗体(sdAb)，但是该抗体不识别纤维状形式的BAP42。sdAb的研发设计3部分过程，如下文(a)-(c)所概括。简言之，(a)制备不同的BAP42形式，和(b)表征这些BAP42形式；然后(c)通过使用单体或寡聚体形式免疫兔，并使用兔抗体针对2种形式的每一种，建立VL结构域的单一结构域抗体文库，研发特异性靶向非纤维状形式的sdAb。使用“噬菌体展示膜”优化上述选择过程，其中不同形式的抗体被固定化，从而提供对BAP42单体和寡聚体形式具有特异性的sdAb的面板。
a.生产不同形式的BAP42
如上文所述，BAP42在阿尔茨海默病患者的脑中，形成不同的结合形式。BAP42具有高度的寡聚化能力，并且能够形成纤维，该过程被认为涉及经过不同成熟阶段的肽，如图1中示意性绘出。
如图1所示，根据聚集方案的BAP42聚集体(由肽的单体进展成纤维)能够形成斑块。所述的肽具有高度的寡聚化能力，并且通过自动结合开始，得到小的寡聚体，随后该寡聚体与肽的其他分子结合。所述的肽的结构改变，从而提供富含β-片(纤维的特征)的二级结构。
因此，作为第一个步骤，建立肽的再构建方案，从而生产不同种类的(单体、寡聚体、原纤维)BAP42。所用的起始材料为冻干的合成BAP42，其被再次悬浮于PBS缓冲剂pH 7.4中，至最终浓度为10mg/mL。在这种浓度和pH下，肽是不可溶的。通过使用氨水的滴定优化溶解pH。在pH 10下，肽变得可溶。然后，在PBS中将肽稀释至肽工作浓度1mg/mL，并使pH返回至7.4。为了使用分光光度法定量肽的浓度，测定在λ＝280nm的摩尔吸光率系数，如图2所示。
图2示出了对BAP42的摩尔吸光系数的测定。简言之，使用已知浓度的肽的不同溶液，测量吸光率，并相关联，从而计算系数ε280nm＝0.3265±0.0043(mg/mL)-1cm-1或±1474.041ε280nm＝19,287M-1cm-1。
为了获得不同种类的BAP42，在蛋白质再构建后，使用5kDa孔的过滤器过滤所述的蛋白质，其保持可能的寡聚体/纤维状种类的肽，其中洗脱具有较低分子量的单体种类，用于立即使用。用于制备不同种类的BAP42的代表性方法经优化，得到寡聚体或纤维，如图3A-3B所示。
如图3A所示，及上文所述，第一个步骤涉及通过以下过程对冻干的合成BAP42的溶解：升高pH，然后返回至7.4；之后使用溶解的BAP42进行centricon离心，并收集流出物，从而提供单体。单体种类用于在寡聚化反应中生产寡聚体，其中所述的寡聚化反应是通过在37℃对1mg/mLBAP42恒定搅动(搅拌)16个小时来促进的。在此之后，通过超速离心分离所得的纤维，并通过离心上清液而分离单体，如上文所述。保留在过滤器的级份对应于寡聚体BAP42，其可以使用事先计算的系数通过分光光度法而测定。寡聚体的浓度测定为1mg/mL。
如图3B所示，在不同的反应中，基于在37℃将1mg/mL BAP42恒定搅动40个小时，单体种类用于生产原纤维。所得的原纤维再次通过超速离心进行分离，并收集沉淀物。通过计算样品中存在的单体的初始量与上清液(得自超速离心)中存在的最终量之间的差异(包含单体和寡聚体)来测定原纤维的量。
b.不同形式的BAP42的表征
在分离不同形式的BAP42之后，如上文所述，通过3种方法表征这些BAP42：(i)硫磺素T-结合；(ii)动态光散射(DLS)；以及(iii)分子排阻色谱。
i.通过硫磺素T-结合的表征
使用硫磺素T荧光首先表征分离的BAP42种类。硫磺素T化合物为荧光探针，其特异性地结合富含β-片二级结构的蛋白质混合物，然后其放射更高的波长，并伴有荧光产率(fluorescence yield)的增加。因此，这种技术将荧光信号强度与蛋白质样品中存在的纤维浓度相关联。具体而言，单体未展示与硫磺素T的反应性，寡聚体级份显示低水平的反应性，而原纤维级份显示高水平的反应性。图4示出硫磺素T测定表征在优化过程中分离的BAP42种类的结果，如上文所述。
通过Western印迹，在变性条件下使用聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)进一步分析单体、寡聚体和纤维样品，从而根据其分子量分辨肽的种类。使用兔衍生的多克隆血清进行Western印迹检测，如下文中对于多种兔免疫更详细描述的那样。图5示出通过SDS-PAGE电泳分离的BAP42种类的混合物的Western印迹结果。
参照图5，BAP42单体的质量为大约5kDa(在分辨率小于10kDa分子量的膜区域中发现)；寡聚体在10-200kDa中分辨(这表明该群体在不同的寡聚体的组合中是异源的，并且单体单元的数量改变)；并且原纤维种类保留在凝胶的染色部分中(这表明它们的分子量大于300kDa)。还通过原子力显微镜评价样品的形态学，从而完成对不同种类的表征。
ii.通过动态光散射(DLS)的表征
还通过动态光散射(DLS)表征分离的BAP42种类。该技术测定颗粒尺寸的分布作为悬浮谱。
在不同形式的分离的BAP42稀释至浓度0.1mg/mL之后，使用Zetasizer Nano ZS(Malvern,UK)对各个独立的试验获得8次测量。不同颗粒的百分比信号强度表示为颗粒直径的函数，从而得到在单体、寡聚体和纤维的样品中存在的单个颗粒的尺寸分布谱；以及得到级别尺寸的分布谱，其中每个分布都具有直径范围内的颗粒。使用得自独立分离的样品，在3个重复中进行所有的分析，结果示于图6A-6B中。
图6A示出在单体(灰色)、寡聚体(红色)和纤维(绿色)样品中的尺寸分布谱。单体种类显示示出分布，其中最大峰值强度对应于122nm直径，以及强度大于大于2,500nm的小群体。寡聚体种类在具有最大强度对应于164nm直径的群体中显示相同的谱，但是除此以外，寡聚体种类显示直径大于2,500nm的更显著的颗粒群体。原纤维种类显示3个不同的群体，最大强度对应于直径尺寸为142nm、531nm和大于2,500nm。
图6B示出对级别尺寸分布谱进行分析，即，信号强度百分比的分布谱为不同尺寸的颗粒范围的水动力颗粒直径的函数。与单体样品相比，寡聚体样品显示向更大直径的所预计变化。对于寡聚体样品，归于小于100nm的种类的信号强度的比例为36.7％，而归于直径100-250nm的种类的信号强度的比例为29.1％；因此当与相似尺寸的单体(其显示对于直径小于100nm的种类的强度为39.9％；对于直径为100-250nm的种类的强度为35.2％)比较时，分别显示降低8％和17％。然而，251-500nm的种类的百分比是一致的。对于501-1,000nm直径范围和超过1mm直径范围的种类而言，单体样品显示百分信号强度分别为4.9％和3.6％；对于相同范围或级别而言，寡聚体样品显示强度分别为5.8％和12.1％。在这些范围内，寡聚体样品清楚地显示与单体样品相比，更高的百分比强度，对于501-1,000nm直径范围的颗粒而言，寡聚体样品显示相对单体样品升高20％；而对于直径范围超过1mm的颗粒而言，升高234％。
关于纤维样品，与单体的差异进一步突出。在纤维样品中，对于较大的颗粒，百分比强度大升高，并且对于251-500nm直径范围、501-1,000nm直径范围和超过1mm直径范围的颗粒而言，百分比强度分别为23.3％、20.9％和16.6％。因此，纤维与单体相比，对于251-500nm直径范围的种类而言，升高42％；对于501-1,000nm直径范围的种类而言，升高330％；并且对于超过1000nm直径范围的种类而言，升高361％。
综上，单体形式的BAP42的样品事实上主要具有较小尺寸的群体，对应于单体种类的群体。寡聚体形式的样品除了具有与单体样品相似的群体以外，还具有更大种类的群体，直径大于1000nm，事实上对应于寡聚的BAP42。纤维样品除了具有小直径的群体以外，还具有直径尺寸为501-1,000nm的种类的更大的群体；以及尺寸超过直径1000nm的种类的另一个群体，该群体事实上显示较晚阶段的寡聚化和纤维化。
iii.尺寸排阻色谱的表征(SEC)
通过分子尺寸排阻色谱，评估寡聚化混合物中BAP42种类的形成。该技术根据各种颗粒的分子质量和水动力半径分开各种类。更高的结合(具有更高的分子量)首先不与柱的固体基质和洗脱液相互作用，而单体种类(具有更低的分子量)在更长的停留时间后与固体基质和洗脱液相互作用。
如上文所述，1mg/mL BAP42制备物在37℃经过16个小时恒定的搅拌。此后，通过超速离心分离所得的纤维，并将收集的上清液应用至尺寸排阻柱上。结果示于图7中。
参见图7，单体和寡聚体种类的BAP42均存在于所述的混合物中。用于分离单体和寡聚体BAP42种类的代表性色谱显示在一定的停留时间洗脱的单体级份(蓝色曲线)，其仅对应于肽单体。在37℃恒定搅拌16个小时得到的混合物(绿色曲线)的色谱进样显示在更短的停留时间下，不仅洗脱单体，而且还洗脱寡聚体种类。
c.研发靶向非纤维状BAP42的sdAb
为了研发特异性靶向非纤维状形式的sdAb，应遵循5个阶段的过程。简言之，(i)使用单体或寡聚体形式免疫兔；然后(ii)获得兔抗体，并将其用于构建针对这2种形式的每一种的单一结构域抗体文库(VL)；(iii)使用膜噬菌体展示，选择特异性靶向单体和寡聚体BAP42形式的单一结构域抗体；(iv)在ELISA中，通过它们的结合和表达进一步选择，此后使用CAT-融合测定，针对稳定性，仍进一步选择所选的克隆；以及(v)最后，对首选的候选物进行测序和分析。
i.使用不同的BAP42形式的兔免疫
如上文中关于生产不同形式的BAP42的部分所述，使用单体和寡聚体形式的BAP42免疫2种新西兰白兔的每一种。根据方案，免疫持续74天，使用大约100-150μg的各种纯化的抗原、单体和寡聚体，其中根据制造商的指导(Ribi Immunochem Research,Hamilton,Mont.)以2-3周间隔在1mL佐剂中4次皮下注射对兔进行施用。在整个免疫过程中，收集血清，并通过ELISA评价样品，从而测定对各种抗原的免疫应答的进展。结果使用图8A-8B和图9A-9B中。
如图8A-8B和图9A-9B所示，在免疫中，血清效价升高，证明单体和寡聚体形式的每一种的富集和特异性。此外，由兔得到的血清证明抗体对纤维状BAP42的更低的效价。在第26天(图8A-8B)和第74天(最后的出血)(图9A-9B)，评价血清效价和抗体特异性。
具体而言，图8A-8B显示使用BAP42单体免疫的兔(图8A)或者使用BAP42寡聚体免疫的兔(图8B)的ELISA的免疫应答。结果对应于血清抗体的效价(其对应于第二次出血)(第26天)，其中使用HRP缀合的山羊抗兔Fc多克隆抗体作为二级抗体(PIERCE)，通过ELISA，针对200ng单体、寡聚体和原纤维BAP42的结合，分析得自免疫动物的抗血清。
图9A-9B显示如上文所述，当在第74天(最后的出血)评价血清效价和抗体特异性时，使用BAP42单体免疫的兔(图9A)或者使用BAP42寡聚体免疫的兔(图9B)的ELISA的后期免疫应答。所得的结果是非常有希望的，显示所述的免疫方案产生对单体和寡聚体形式的BAP42的每一种更具特异性的抗体。
ii.sdAb文库的构建
在第74天处死动物，然后移出产生初级抗体并使其成熟的器官，即，骨髓和脾。然后从所述器官提取RNA，并合成cDNA用于构建单一结构域抗体的文库(PCR产物的扩增和在噬菌粒中的克隆)。
具体而言，收获组织样品，并根据制造商的方案，使用TRI试剂(MolecularResearch Centre)制备总RNA分离物。将分离的总RNA溶解于500μl不含RNase的水中，并通过分光光度法测定浓度和纯度。根据制造商的方案，使用oligo(dT)引物和逆转录酶(Superscript；Invitrogen)从总RNA合成第一链cDNA。
使用表1中提供的正义引物(可变区的5'部分)和表2中提供的反义引物(轻链恒定区的3’部分)，对编码轻链的可变区的基因进行初步扩增。
表1.用于从cDNA制备物分离兔VL结构域的正义引物
Figure BDA0001400017140000731
Figure BDA0001400017140000741
表2.用于从cDNA制备物分离兔VL结构域的反义引物
Figure BDA0001400017140000742
使用25pmol的各种引物，在50μl反应体积下实施初步PCR。使用2.5μl随机引发的或oligo-dT cDNA用作模板(5μg mRNA当量)。用于初步PCR的反应条件为在94℃11min，然后在54/55/72℃分别30/60/120sec，共30个循环，以及在72℃5min。所有的反应都是使用2.5mM MgCl2、200μM dNTP(Roche Diagnostics,Brussels,Belgium)和1.25U AmpliTaqGold DNA聚合酶(Roche)实施的。因此，得自各个兔子的cDNA经过分开的30个循环的聚合酶链式反应，并且10种特异性寡核苷酸引物的组合用于兔VL sdAb(9x Vκ和1x Vλ)编码序列的扩增。
在2％琼脂糖凝胶上分离PCR产物，并使用the QIAquick凝胶提取试剂盒或QIAEXII(Qiagen)洗脱DNA。在RNA提取和cDNA合成后，测定纯度和浓度。
所有的质粒均具有SfiI位点。最终的PCR产物是SfiI-切除的、纯化的并克隆至适当切除的噬菌体载体中。噬菌体包含抑制子终止密码子和编码用于纯化(His6)和检测(HA)的肽标签的序列。
使用所述载体来形成文库并转化大肠杆菌。具体而言，大约1.4μg线性化的载体DNA(通过凝胶电泳，针对已知的量来测定)与大约1-3倍过量的插入物在包含1X连接酶缓冲剂(50mM Tris pH 7.5、5mM MgCl2、1mM二硫代赤藓醇、1mM ATP，pH 7.5)和1U T4DNA连接酶(Roche)的20μL反应物中连接，用于粘性末端连接物的连接。将连接物在12-14℃温育16-18小时。
将连接的产物所得与相应数量的小玻璃瓶在冰上温育10min。同时，将电感受态大肠杆菌在冰上解冻。2μL各种连接反应物加入至电感受态细菌中，转移至小玻璃瓶中，并在冰上储存1min。在2.5kV、25μF和200Ω下实施电穿孔。将小玻璃瓶立即用1ml SOC介质在室温下冲洗，并将培养物在37℃或30℃在250rpm摇动1h。然后将培养物铺展在包含100μg/mL氨苄青霉素和10μg/mL四环素的LB琼脂平板上，并在37℃或30℃过夜温育。
分离噬菌体质粒，并根据制造商的方案将其电穿孔至宿主细胞中。在电穿孔后，加入5mL SOC，并将培养物在37℃摇动1h。然后，加入10mLSB，在37℃1h。接着加入4.5μL100mg/mL羧苄青霉素，并将培养物在37℃再摇动1h，然后将1mL的VSCM13(辅助噬菌体；1013pfu/mL)加入至各15mL培养物中。将总量170mL SB介质/carb加入培养物中，将其在37℃摇动2h。加入280μL的50mg/mL卡那霉素，并将培养物继续在37℃过夜摇动。第二天早晨，将培养物离心，并通过加入25mL PEG-8000(聚乙二醇)/NaCl使噬菌体上清液沉淀，并在冰上温育30min。从上清液离心得到噬菌体，并将团块再次悬浮于2mL TBS/BSA 1％中，离心下来并通过0.2μm过滤器过滤至无菌管中。
在构建不同的文库后，选择目的sdAb，如下文所述。
iii.选择针对非纤维状BAP42的sdAb—膜噬菌体展示
替代传统的噬菌体展示(其中抗原固定化在96孔聚苯乙烯微量滴定板上)(参见Barbas,et al.(1991).Assembly of combinatorial antibody libraries on phagesurfaces:The gene III site.Proc.Natl.Acad.Sci.88:7978-7982)，实施通过膜的噬菌体展示，其示意性地示于图10中。研发该方法作为用于选择针对不同形式BAP42的抗体的选择技术，确保它们满足所需的形状并且不会发生聚集。该方法学涉及通过SDS-PAGE分离不同形式的BAP42，其随后通过Western印迹转移至PVDF膜上，然后在所述的膜上实施所有的选择轮次，所述膜起到固定化靶抗原的作用。该过程还称为“Western淘洗”(Ravn et al.(2000)“Identification of phage antibodies toward the Werner protein byselection on Western blots”Electrophoresis 21:509-516)。
为了优化在印迹膜上的噬菌体展示的条件，进行多次测试，以便设计用于选择针对BAP42单体或寡聚体的小结构域抗体的方案。这些测试包括：封闭条件；洗涤条件和洗脱。根据相同的方案，分别测试这些条件，从而鉴定优选的条件。使用VCSM13辅助噬菌体和不具有印迹抗原的PVDF膜(BioRad)实施所述的方案，以分析背景(即，与膜的非特异性结合)以及所使用的溶液。在各测试前，第一步为使用甲醇(Applichem)处理来活化所述的膜，其使得膜对非特异性的噬菌体结合更具有抗性。
所述的优化开始于标准的方案：使用甲醇活化后，使用PBST中的5％milk将膜封闭1小时30分钟，并使用PBST 0.2％洗涤3次。然后，加入1.0x 1011CFU/mL辅助噬菌体(在PBST0.2％中的1％奶中)，在室温1小时，并使用PBST 0.2洗涤5次。接着，使用甘氨酸pH 3.0和Tris HCL pH 10.5洗脱噬菌体，并通过对数期大肠杆菌(具体而言，ER2738或SS320电感受态细胞)感染来测定结合噬菌体的效价。
所评价的第一个条件为封闭溶液。评价6种封闭溶液：PBST 0.2％中的奶5％；PBST0.2％中的BSA 3％；Blocking Pierce；PBST 0.2％中的凝胶5％，PBST 0.2％中的干酪素0.5％；以及VCSM13辅助噬菌体作为封闭溶液。所有这些都在4℃过夜评价。对于洗涤条件的评价而言，测试3种不同的溶液：PBST 0.5％；PBST 0.2％中的1M NaCl处于；以及PBST0.2％中的0.5M NaCl。这些测试都根据相同的标准的方案，并且除了洗涤步骤。
为了评价洗脱步骤，对于2种不同类型的溶液的每一种，使用之前选择的条件进行测试：使用甘氨酸洗脱和使用胰蛋白酶洗脱。通过对结合的噬菌体的滴定，比较结果，其是通过对数期大肠杆菌(特异性的ER2738电感受态细胞)的感染测定的。
膜淘洗如下进行：使用甲醇100％活化具有1μg/孔印迹的BAP的PVDF膜，然后使用Pierce封闭液或BSA 3％在4℃过夜封闭。期间，将1μg原纤维固定化在ELISA平板的4个孔中，将其在4℃过夜温育。实施该步骤，从而除去对纤维具有高度特异性的噬菌体/抗体。第二天，使用PBS1x洗涤膜和孔，并进行封闭。使用与膜中使用的相同的封闭溶液封闭ELISA平板，在37℃1h。封闭后，将1％结合溶液(例如PBS-Pierce)中的1.1mL新鲜制备的噬菌体加入至原纤维ELISA平板中，在室温(RT)15min。将膜与辅助噬菌体(1x1012噬菌体/mL)在RT下在30min内温育，然后使用PBS 1x洗涤。
洗涤后，将所述的膜与由原纤维ELISA平板提供的新鲜制备的噬菌体温育，在20-25℃2h，并且温和的震动。接着弃去噬菌体溶液，并将膜使用PBS/Tween 0.2％或0.5％在震动平台中洗涤5x，从而消除对抗原不具有特异性的噬菌体。在对应于单体、寡聚体和原纤维的区域使用剪刀切膜，然后加入1mL新鲜制备的胰蛋白酶10mg/mL，在37℃30min，以便覆盖膜中对抗原具有特异性的抗体。
在噬菌体洗脱后，通过使用对应于目的抗原的噬菌体洗脱液感染大肠杆菌SS320培养物(O.D.大约等于0.6)，在37℃30min，从而进行噬菌体的再次扩增。温育后，将3μL100mg/mL氨苄青霉素加入培养物中，并在37℃在250rpm温育1小时。然后，加入4.5μL的100mg/mL氨苄青霉素，并且在37℃在250rpm再摇动1小时。最后，加入包含46μL的100μg/mL氨苄青霉素和184μL的5mg/mL四环素的85mL预温热的SB介质。将培养物在37℃在210rpm温育过夜。第二天，通过加入包含100mg/mL氨苄青霉素和10mg/mL四环素的5-95mL的SB介质来稀释培养物，直至O.D.达到大约0.6。接着，使用1mL VCSM13辅助噬菌体来感染培养物，并在37℃在210rpm温育2h。加入140μL的50mg/mL卡那霉素，并在37℃在210rpm持续摇动过夜。所产生的噬菌体通过如之前所述使用PEG8000和NaCl的沉淀来回收，并进行新一轮的选择。
在使用膜噬菌体展示的第4次膜淘洗(选择轮次)后，获得如下：对寡聚体形式的BAP42具有特异性的7.5 x 105噬菌体/mL；以及对单体形式的BAP42具有特异性的1.8 x 105噬菌体/mL。表3显示使用标准的噬菌体展示方案，使用固定化在ELISA孔中的寡聚体形式在第4次淘洗(选择轮次)后得到的结果。使用膜噬菌体展示的结果以及用于各轮次的条件示于下表4-5中。
表3
Figure BDA0001400017140000781
表4
Figure BDA0001400017140000782
表5
Figure BDA0001400017140000783
iv.使用CAT-融合测定来选择稳定的单一结构域抗体文库
在合并对靶种类(单体和寡聚体)具有特异性的稳定的抗体后，下一个目标是选择显示对相应的抗原具有高免疫特异性的候选物。因此，实施筛选，然后通过ELISA针对抗寡聚体和抗单体的活性进行评价，从而测定与各抗原的结合谱。结果示于图11-12中。
具体而言，图11示出通过ELISA分析的并且衍生自膜噬菌体展示(使用寡聚体形式的BAP42)的94个克隆的结合谱和连接值(M-单体；O-寡聚体；F-纤维；X-BSA 3％)；图12示出通过ELISA分析的并且衍生自模噬菌体展示(使用单体形式的BAP42)的94个克隆的结合谱和连接值(M-单体；O-寡聚体；F-纤维；X-BSA 3％)。
如上文所述，使用修改的CAT-融合测定针对稳定性进一步选择克隆(例如参见Goncalves等人的WO 2008/136694)。具体而言，CAT基因通过PCR由pCAT扩增(Stratagene)，并且使用EcoRI和SphI限制性位点插入至pET衍生的质粒中，从而创建pE-CAT。也对最初用于克隆可变结构域的5’PCR引物进行设计，从而包含2个相继的且不同的SfiI克隆位点，并且琥珀密码子(TAG)就位于CAT基因开始之前。
为了将单一结构域抗体文库克隆至CAT基因中，由通过淘洗选择的噬菌粒载体通过PCR生成SDVL片段。所得的SDVL PCR片段经过凝胶纯化，使用限制性内切酶SfiI进行消化，并独立地克隆至合适的SfiI-切割的载体pE-CAT中。pSDVL-CAT构建体处于强Lac启动子的控制之下，其中所述的强Lac启动子还包含N-末端His6亲和标签和氨苄青霉素抗性基因。备选地，SDVL片段可以克隆至容易获得的载体中，其中所述的载体经设计而表达克隆的序列，如与CAT的融合蛋白，例如PCFN1载体(参见Maxwell,et al(1999)J Prot Sci 8:1908-1911，该文献以引用方式全文并入本文)。
通过使用各个单一结构域CAT-融合文库转化ER2783细胞(New England Biolabs,Inc)来进行氯霉素抗性测试。将转化混合物接种于5mLSOC中，并在37℃温育1小时。接着，将具有3μL的100mg/ml氨苄青霉素的10mL SB介质加入各文库中。将总量15mL各培养物在37℃摇动1小时。随后，加入4.5μL的100mg/ml氨苄青霉素，并在37℃将培养物摇动1小时。接着，加入具有85μL的100mg/ml氨苄青霉素的85mL SB介质，并使培养物在37℃过夜生长。第二天，使用600μL各种培养物用于接枝包含100μg/mL氨苄青霉素的20mL SB介质。
当培养物的光学密度达到0.9时(在600nM)，通过加入0.5mM IPTG诱导CAT-融合单一结构域蛋白质的表达。在37℃温育2小时后，将各文库的100μL等分物平铺于具有IPTG(200μg/mL)和多种浓度的氯霉素的琼脂平板上。将平板在37℃温育16-20小时。抗性水平定量为在37℃的温育时间后出现集落的氯霉素的最高水平。在氯霉素浓度为1.86mM或更高检测到的集落被选择作为稳定的。结果示于下表6中，其中+++表明在相应的氯霉素浓度检测到超过600个集落；++表明在相应的氯霉素浓度检测到400-600个集落；+表明在相应的氯霉素浓度检测到1-399个集落；以及-表明在相应的氯霉素浓度没有检测到集落。“sdAb2”、“sdAb6”、“sdAb20”和“sdAb26”为结合BAP42寡聚体的sdAb候选物。
表6
Figure BDA0001400017140000801
v.分析针对非纤维状BAP42的所选sdAb
在通过ELISA分析的克隆中，对单体和寡聚体具有高特异性、但不识别纤维状BAP42的某些克隆进行测序。序列信息提供与序列表中，如SEQ ID NO:1-21。在测序后，评价候选物之间的同源性，进行同源性比对，并构建同源性的树。
选择10种抗体，通过Western印迹，评价它们对不同BAP42形式的识别。结果示于图13和图14中。
具体而言，图13示出经纯化并且通过Western印迹检测的10个克隆的检测，其后纯化10个克隆并且通过ELISA针对寡聚体BAP42进行分析。图14示出在PVDF膜中，在不同BAP42同种型的Western印迹分析上，大部分单体和寡聚体的识别。其他所选的抗寡聚体sdAb在识别BAP42寡聚体形式中显示相似的谱。
一旦经纯化并证实识别BAP42寡聚体，则针对抗寡聚体抗体抑制所述的肽聚集形成纤维状形式的能力对其进行测试。该测定是使用硫磺素T(ThT)进行的，如上文所讨论，其为识别富含“β-片”二级结构的探针，其中所述的结构实际上的特征在于纤维状BAP42。因此，候选抗寡聚体sdAb对聚集的抑制越高，则原纤维的形成越少，因此在测定过程中，ThT发出的信号越小。其他所选的抗寡聚体sdAb显示相似的聚集抑制。
关于抗寡聚体sdAb与BAP42寡聚体的相对结合谱，通过BIAcore进一步表征抗寡聚体sdAb。结果示于图15中。
最后，在通过BIAcore分析的抗体中，选择显示对寡聚体形式的BAP42具有最佳结合谱的候选物(即，“VL#26”、“VL#20”、“VL#6”和“VL#2”)用于进一步的BIAcore和生物分布研究中的动力学研究。结果分别示于下文提供图16A-16D中(动力学研究)和表14-16(生物分布研究)中。
实施例2-研发从病毒衣壳蛋白质得到的BBB特异性递送肽
基于衣壳蛋白质(DEN2C)制备递送肽。利用绿色荧光蛋白(GFP)的表达，DEN2C的链段显示实施细胞内化DNA货物的能力(Freire,et al.FEBS(2014)281(1):191-215)。DEN2C蛋白质在本实施例中用于在6个阶段的过程中构建对血脑屏障(BBB)具有特异性的肽文库。简言之，(a)测定完整DEN2C蛋白质的转运能力；(b)生产并放射性标记DEN2C肽；然后(c)针对BBB特异性转运和BBB细胞内化进行体外测试；以及(d)针对对BBB细胞的毒性进行测试；(e)关于它们的膜潜在作用和分配系数进行研究；以及最后，(f)针对生物分布和稳定性进行体内测试。
a.在体外BBB模型中DEN2C转运能力的测定
首先，由DEN2C编码的完整蛋白质序列暴露在噬菌体的表面上，并用于测试与BBB模型的相互作用。
将包含目的基因的噬菌粒DNA(DEN2C-pIII融合噬菌粒)引入大肠杆菌SS320细胞中，并在细胞的周质中表达编码所述的肽的基因。通过包装信号缺陷型辅助噬菌体提供对形成M13噬菌体重要的包膜蛋白质和基因。噬菌粒和辅助噬菌体对宿主细菌的共同感染产生杂交病毒粒子(噬菌体-DEN2和DEN-噬菌体)，从而暴露pIII-DEN2融合体。
使用在transwell系统中生长的BEC制备体外BBB模型。具体而言，transwell系统由微孔膜上的bEnd3细胞构成，从而在“组织培养物插入物”的上方分隔区(顶部)和下方分隔区(基部)之间形成体外内皮细胞屏障。然后，将噬菌体-DEN2与bEnd3细胞温育。即，将制备的噬菌体加入至上方分隔区(顶部)并温育30分钟。使用辅助噬菌体、与衣壳蛋白质融合的噬菌体(DEN-噬菌体)和穿越BBB的阳性对照(+噬菌体)的样品重复所述的试验。根据比较在模型-BBB的两侧上顶部和基部中噬菌体的效价(相对于总的初始噬菌体(母液))，针对辅助噬菌体、DEN-噬菌体和阳性对照的样品，测定DEN-噬菌体的迁移能力。结果示于图17中。
如图17证明的那样，DEN2C基因相对于阳性对照而言，增强了噬菌体的转运能力。结果显示，穿越模型BBB，在顶部和基部之间得到平衡，其中顶部和基部具有相同的噬菌体效价1012。这些结果惊人地证明，DEN-噬菌体自由地移动通过内皮细胞屏障。从基部收集具有转运通过所述的屏障的能力的噬菌体并再次扩增。
进行测试以确保模型屏障的完整性。可以以多种方式测试屏障的完整性，例如使用不同分子质量的荧光分子。具体而言，在所用的体外BBB系统中，使用具有40kDa右旋糖苷(FD40)的荧光分子来测试内皮屏障的完整性。在将FD40施加于顶部后，使用不含细胞的对照(空白)，使用具有bEnd3细胞的BBB模型(细胞)，以及使用与噬菌体温育后的BBB模型(噬菌体)测试基部中的荧光。结果示于图18中。
如图18所示，与不具有屏障的情况相比(大约8％FD40在基部)，在具有细胞屏障的情况下，分子更多地保留(小于2％的FD40穿过)。此外，屏障的完整性似乎不受噬菌体温育的影响(在噬菌体存在下，仍有大约2％FD40穿过)。
b.DEN2C肽的生产和放射性标记
在固相上，基于Fmoc化学，合成由所述蛋白质的DEN2C结构域衍生的小肽(具有大约5个至大约25个氨基酸)，由偶联-洗涤、洗涤和脱保护的重复循环组成。
然后，将这些肽(根据SEQ ID NO:22-27和127)与螯合物缀合或使用放射性同位素(锝或镓)标记。然后，将所述的化合物与bEnd3细胞相互作用，用于分析BBB体外模型中肽转运的能力以及它们细胞内化的能力。在这些分析中使用2种不同的标签，从而可以证实结果。
更具体而言，缀合涉及以下步骤：使树脂膨胀；对末端氨基基团脱保护；使用活化试剂和碱实施缀合反应；以及在断裂结束时，得到肽-螯合物的产物。所用的螯合物为吡唑衍生物，例如t-BuPz4(Morais,et al.J Med Chem(2013)56(5):1961-73)，从而有利于使用锝进行标记；以及NODA-GA(tBu)3(4-(4,7-双(2-叔丁氧基)-2-氧代乙基)-1,4,7-三氮杂壬烷-1-基)-5-(叔丁氧基)5-氧代戊酸)，其有利于使用镓进行标记。
实施HPLC(高效液相色谱)来纯化肽-螯合物，并通过质谱(MS)证实该纯化。结果示于图19A-19F(得自不同肽的HPLC结果)和图20A-20F(不同的肽的MS结果，其中t-BuPz4的MW为326.6gmol-1)。HPLC结果显示2种主要的种类，其对应于单独的肽(更短的停留时间)，以及与螯合物缀合的肽(更长的停留时间)。MS结果证明肽-螯合物种类的纯化(比单独的肽具有更高的MW)。类似地，使用NODA-GA(tBu)3分析缀合物(数据未示出)。最终，肽被放射性标记，最终浓度为8 x 10-5M。
下表7中概括原始的肽和缀合的肽的特征。表7列出各种肽的名称、等电点(PI)、电荷(正电荷残基的数量)、计算质量(以Da计)和所发现的离子；以及对于相应的缀合物，列出名称、计算质量和发现的离子；并且还列出在HPLC中的停留时间和分配系数(log Po/w)。这些值可以测定肽的亲水本性，其中penH1和pepH4被鉴定为最具亲水性的肽。
表7
Figure BDA0001400017140000831
Figure BDA0001400017140000841
c.DEN2C肽的BBB特异性转运和细胞内化的体外测试
使用上文所述的BBB的相同体外模型，针对穿越内皮屏障的能力，测试使用锝和镓标记的肽。对于各种肽而言，将在“组织培养物插入物”上培养的bEnd3细胞与5μCimL-1-标记的肽温育不同的温育时间：15min、5h和24h。作为对照，使用不具有细胞的模型(不具有细胞的对照)或(过滤器)，并与具有细胞(BBB)的模型或(细胞)比较。5小时温育的结果示于图21A-21F中。
图21A-21F显示使用BBB模型或无细胞模型(作为对照)，在与上文所述的体外模型温育5小时后，放射性同位素锝标记的肽在顶部和基部的百分比活性；并且数值得自2个独立的测定。放射性同位素活性显示，在使用锝标记的肽温育5h后的迁移在屏障存在下与不存在下是有差异的，进一步证明细胞事实上形成的屏障，该屏障干扰肽的自由通过。此外，结果表明有前途的候选物。具体而言，对于pepH1和pepH3的每一种，在对照中通过50％，与此相比，在细胞屏障存在下，仅通过20％。在对照模型中和BBB模型中均未观察到pepH2的转运。对于PepR'而言，所述的通过类似于对照和模型BBB。
温育15分钟、5小时和24小时的结果一起示于图22A-22F中。即，图22A-22F示出使用BBB模型或无细胞模型(作为对照)，在与上文所述的体外模型温育15分钟、5小时和24小时后，放射性同位素锝标记的肽在顶部和基部的百分比活性；并且数值得自2个独立的测试。再次观察到差异，证明屏障的完整性，以及鉴定了穿越屏障的肽。具体而言，pepH2甚至在24h后，显示有限的转运，仅9％的肽穿越屏障，如上文所述，证明具有高屏障能力的屏障形成。然而，pepH1和pepH3惊人地显示穿越该屏障的有效的转运，即，每一种均显示在24小时后在基部大约70％的放射活性。PepH4和pepM也展现转运和迁移的良好的能力(分别显示大约60％和50％)。在穿越所述的屏障中，PepR’是更有限的；其强烈地与插入物的表面相互作用，并且难以恢复。因此，PepR’被排除进一步的测试。
除了BBB测试模型以外，实施吸收测试来测定候选肽的内化能力。将BEnd3细胞在24孔平板中培养。在各时间点，收集包含肽的介质，其未与细胞相互作用。在下一步骤中，使用酸性缓冲剂洗涤细胞，所述的酸性缓冲剂释放更强地结合细胞膜的肽(样品的酸洗涤)。最后，细胞被裂解，从而释放内化的肽，并定量细胞内部的活性。结果示于图23A-23E中。
图23A-23E示出在与bEnd3细胞温育15分钟、5小时和24小时后，在介质、洗涤缓冲剂(酸洗涤)和裂解物中放射性同位素锝标记的肽的百分比活性；并且数值得自2个独立的测试。结果显示，具有良好的转运BBB模型的肽与细胞也具有低的相互作用。具体而言，pepH1、pepH3和pepH4主要保留在温育介质中。观察到pepH2与细胞高相互作用，并被内化，从而在裂解物种显示超过40％的放射活性。PepM’(显示高迁移，大约50％)也显示被内化，并在细胞内累积(在裂解物中大约13％的放射活性)。
这些有前途的结果惊人地证明pepH1和pepH3提供了BBB特异性递送肽。表8提供了序列信息，如下：
表8
Figure BDA0001400017140000851
Figure BDA0001400017140000861
表9概括了基于放射性肽的百分比回收率，在温育15分钟、5小时和24小时后，对于锝和镓标记的肽而言，关于吸收(内化)和细胞相互作用的结果，以及穿越BBB体外模型的迁移。表格列出了多种肽，其中提供了各种肽的名称，在分别温育25分钟、5小时和24小时后的BBB迁移％、细胞相互作用％、和内化％。
表9
Figure BDA0001400017140000862
如表9所示，对于2种类型的标记而言，迁移结果是可重复的。PepH1和pepH3均显示更高的迁移(大约70％)和与细胞的更低的相互作用，从而提供BBB特异性递送肽。相反，pepH2似乎与细胞强相互作用，并且显示低转运；而pepH4和pepM显示与细胞相互作用，并且具有迁移能力。总之，BBB体外测试证明pepH1和pepH3的高转运(24h中>70％)，和低的细胞相互作用/累积。但是，pepH2呈现低的BBB转运以及高的细胞相互作用和内化(>40％)。此外，结果证明pepH1和pepH3组合了在水性介质中的高溶解性和穿越BBB的改善的转运，以及在BEC中的低诱陷。d.毒性：在pepH1和pepH3存在下测试细胞活力和BBB完整性
为了测试所选肽对BBB细胞的可能的毒性，在96孔平板中培养5 x 104bEnd3细胞，100μL/孔，并温育24小时。然后，加入浓度为0.1-100μM的肽，除了pepM’之外(其以0.1-50μM浓度加入)。作为提供100％活力的对照，包括具有无血清的介质的孔。
在温育24小时之后，实施MTT测定，其是用于评估细胞代谢活性的比色测定。将PBS中5mg/mL的MTT溶液加入各孔中，并温育2小时。在这段时间之后，除去溶液并加入DMSO，从而溶解形成的结晶紫。在540nm测量吸光率。计算活力百分比[吸光率肽处理的细胞/吸光率未处理的细胞)*100]，并由3个独立的测定计算IC50值。结果示于图24A-24E中。
如图24A-24E所示，所选的肽对细胞活力不具有影响，具体而言，使用所述的测定没有可观察到、也没有可测量到的影响。然而，对于pepH2和pepM’的每一种而言，观察到活力小幅降低，这实际上是由于用于稀释肽的DMSO浓度造成(通过将这些结果与使用DMSO对照获得的结果比较而得到的结论)。
除了测定细胞活力和肽毒性以外，实施测定以证明在所选的肽存在下，屏障的完整性。使用不穿越BBB的荧光右旋糖苷FD4和FD40(其分子量分别为4kDa和40kDa)，类似于上文所述。使用分子量为326Da的荧光素分子(FITC)作为对照(基于文献，分子量小于500Da的分子可以具有迁移能力)。
如上文所述，在“组织培养物插入物”中培养bEnd3细胞，并与每一种浓度为大约0.1μM和1μM的多种肽温育24小时。即，使用放射性标记的肽，将细胞与5μCimL-1(大约0.1μM)温育24h；以及在浓度为100倍以上。PepH2和PepM’需要DMSO用于溶解；更高浓度的肽/DMSO得到更高的误差，并且更多的细胞死亡。对于40μM以下的浓度而言，没有细胞死亡。数值得自2个独立的测定。结果示于图25A-25C中。
图25A-25C显示荧光分子(母液)穿越不具有BBB细胞的过滤器(对照)、穿越bEnd3屏障以及穿越与不同的肽预温育的bEnd3屏障的迁移能力。各种荧光分子显示对照(过滤器)试验比使用细胞的试验(BBB)中，更高的转运，证明功能性体内BBB模型测定。将由BBB试验得到的结果与BBB加肽试验得到的结果比较，显示对于更高分子量的分子而言，迁移能力更低，如所预计的那样。
重要的是，在不同的肽存在下，从顶部清除荧光探针(FITC、FD4和FD40)类似于对照的情况，这证明细胞屏障中窗孔的缺乏和旁细胞渗漏。此外，细胞活力测定显示甚至在100μM肽的情况下，活细胞的百分比高于90％。因此，由活力和屏障完整性测试得到的结果证明所选的肽惊人地不具有毒性。
e.对肽pepH1和pepH3的膜电位以及pepH3的Kp的作用
研究肽pepH1和pepH3与膜模型(具体而言100nm单层囊泡(“LUV”))的相互作用，并且关于迁移能力，包括pepH2作为阴性对照。使用不同的脂质组合物制备囊泡，其中具有不同量的脂质膜成分，例如POPC、POPS、POPG和胆固醇(ChoI)。POPC为具有类似于在生物膜中发现的流动性质的脂质。在POPC存在下，胆固醇赋予流动膜以刚性，从而允许形成已知在真核生物膜的双层中存在的“脂质木筏样平台(lipidic rafts-like platforms)”。POPS和POPG为负电荷脂质，其分别存在于真核和细菌细胞中。如上文所述，尽管大部分的真核细胞在它们的膜内测部分具有负电荷的脂质，得自BBB的内皮细胞比得自其他内皮的细胞，具有更高的负电荷的表面。这种负电荷不仅由于带负电荷的脂质，还由于更高水平的糖基化作用。任意一种方式，POPS和POPG的负电荷都提供了模仿带负电荷BBB的模型，从而可以分析所选的肽的静电相互作用。
测试不同的脂质组合物：POPC；POPC:POPS(4:1)；POPC:POPG(4:1)；POPC:Chol(2:1)；POPC:POPS(3:2)；和POPC:POPS(1:4)。结果示于图26A-26C中。
图26A-26C显示使用探针di-8ANEPPS的测定中获得的结果，从而评价膜双极电位的分布。PepH1显示在不同的光谱中没有改变，呈现在所测试的不同的膜模型中无相互作用。PepH3显示在光谱中的改变，表明与膜的相互作用，特别是与带负电荷的膜，例如POPC:POPS(1:4)。最后，pepH2显示与所测试的不同的膜模型的高相互作用。这些结果与使用BBB模型的结果良好地关联，对于BBB模型而言，pepH2显示高的内化百分比以及比pepH1和pepH3的更高的细胞相互作用。
对于pepH3而言，还测定“分配系数”或“亲和常数”，这是由于这种肽固有地存在色氨酸，因此，成功地施用脂质组合物可以测定pepH3的亲和常数。结果示于图27和表10中。
如图27和表10所示，该测定证明pepH3与富含POPS的膜模型的更高的相互作用，这是因为POPC:POPS(1:4)的亲和常数比所研究的其他脂质组合物(例如与POPC:POPS(4:1)相比，Kp＝324)的亲和常数是5倍高以上(Kp＝1,558)。PepH2和pepH3为具有最高疏水性的肽(Po/w)。此外，pepH2与膜模型的多种脂质组合物相互作用，而pepH3仅与富含PS的膜(带负电荷的磷脂)相互作用。所得的荧光光谱证明pepH1不与所研究的脂质膜相互作用，并且显示对于不同的膜模型，双极电位没有改变；而pepH2显示与所有膜模型的更高的相互作用；pepH3显示对于富含负电荷的脂质模型(例如PS)而言，更高的相互作用。
表10
脂质膜 K<sub>p</sub>±SD
POPC -
POPC:POPS(4:1) 342±102
POPC:Chol(2:1) -
POPC:POPS(3:2) 455±46
POPC:POPS(1:4) 1,558±216
这些研究还促进了对这些肽的迁移机制的理解，例如其中还使用用于不同的细胞分隔区或细胞抑制剂的特异性标志物。
f.用于肽pepH1和pepH3的生物分布和稳定性的体内测试
为了评价体内穿越BBB的能力，在CD1小鼠中，针对生物分布分析所选的肽pepH1和pepH3。使用最终浓度为8.5 x 10-5M的锝标记肽，并在PBS中稀释。注射CD1小时(iv注射，鼠尾静脉)。在培养5和60分钟后，通过颈脱位法处死小鼠。解剖目的组织，并洗涤，从而除去过量的血液，称重并针对放射活性测量。对不同的器官测量不同肽的锝放射活性。
最初的结果列于表11中，其中％I.A.是指“％注射活性”，即，与最初注射的总量相比，在给定的器官中测量的放射活性的量。
表11
Figure BDA0001400017140000901
如表11所示，当使用10μg的pepH1和pepH3注射小鼠时，测定脑中的放射活性为0.11-0.15％。考虑到排泄器官(例如肾和肝脏)中的累积，观察在60分钟后，大量的肽被排出。对于所测试的剂量，脑中收集的百分比为大约0.15％，从而提供对于所选肽的惊人的良好的转运百分比(与Rosler et al.Neuropharmacology(2011)61:1413-1418；和Yu etal.Sci Transl Med(2011)84(3):84ra44相比)。
使用更高剂量的各种肽(具体而言升高100倍)，以及使用pepH2作为阴性对照，并培养2分钟和60分钟，重复生物分布研究。测量组织生物分布谱(以每克组织/器官的注射放射性肽活性的百分比计)并将结果列于表12中。
表12
Figure BDA0001400017140000902
Figure BDA0001400017140000911
140μg的肽对应于以下摩尔量：对于pepH1，140μg等于1.15mM；对于pepH2，140μg等于0.84mM；对于pepH3，140μg等于1.67mM；并且对于pepH4，140μg等于0.524mM。如表12所示，当将肽pepH1和pepH3的剂量升高至140μg并将pepH2的剂量升高至80μg时，脑中由于pepH3的放射活性加倍(0.31％)；而由于pepH1的％放射活性没有升高。对于这些肽(pepH1和pepH3)而言，经过60min，观察到排泄器官(例如肾和肝脏)中累积的放射活性大幅降低，表明大部分的这些肽到所述的时间时被排泄。
PepH2除了在用于排泄的器官中以外，还在其他器官中累积，例如在肺中，并且显示在60min后，在肺中累积增加。关于在脑中的放射活性的水平，在60分钟后pepH2和pepH3均显示为0.37％；而pepH2显示为0.2％。此外，与pepH1和pepH3(分别为32.7％和36％)相比，在60min后排泄更少的pepH2(12.7％)，预计是由于pepH2的高疏水性，如上文所述。
总之，pepH1、pepH2和pepH3证明快速脑吸收(在2min后)，对于pepH1和pepH3，脑吸收后是快速的脑洗出，伴随着总的放射活性由大部分的器官的快速消除。放射性肽由血液、肝脏、肾和高度关注的器官快速清除，在肠中累积。在1h时，排出注射活性的重要级份(>30％)。具体而言，pepH2被脑吸收，但是脑洗出更慢。还观察到在肝脏、脾和肺中累积。这些结果符合pepH2的高疏水性。不希望被理论所束缚，数据符合BBB转运的AMT机制。
最后，测定肽的稳定性。从死亡后的动物取尿和血液，过滤，并通过RT-HPLC进行分析。进行HPLC分析以评估在施用后5分钟和60分钟，与各原始制备物相比，pepH1和pepH3肽在血液和尿中的稳定性。结果示于图28A-28D中。
图28A-28D示出在注射至动物中之前，以及然后在注射后5分钟和60分钟后，在血液和尿中，pepH1和pepH3各自在其原始制备物中的谱。结果证明，所述的肽在血液和尿中惊人的稳定，但是新的种类(具有更短的停留时间)在60分钟后出现在尿中。
总之，体外和体内结果显示所选的DEN2C肽高效地穿越BBB。具体而言，如上文所述，结果惊人地证明pepH3穿透脑并返回至血液循环待排出。因此，pepH3被鉴定为示例性递送肽，其显示以大于或相当于文献中所述的其他分子(Muruganandam,et al.(2002)FASEBJ,16(2):240-241；and Abulrob,et al.(2005)J Neurochem 95(4):1201-1214)递送至脑中，以及能够进入和离开脑的惊人的优点，和除了排泄器官以外在其他器官中不累积。事实上，脑中pepH3的百分比相当于极少的已知“高性能”BBB转运因子肽。例如其他标记的肽(例如TAT、渗透素、synB1等)的脑吸收百分比仅为0.2-0.9％ID/g组织(Sarko,et al.,MolPharm(2010)7(6):2224-2231)。选择pepH3用于与示例性抗BAP42寡聚体sdAb关联，如上文所述。
实施例3-抗非纤维状BAP42 sdAb和BBB特异性递送肽的构建体
通过将目的递送肽与对BAP42寡聚体特异性的所选sdAb缀合来制备构建体，从而提供具有升高的生理利用性的用于治疗阿尔茨海默病和相关紊乱的治疗剂。所述的过程涉及以下5个阶段：(a)测试克隆具有测试sdAb的递送肽；(b)测定它们的表达；然后(c)制备抗体-肽构建体；(d)测定它们阻止BAP42聚集的能力；以及随后(e)分析它们的体内分布和BBB通过。
a.具有测试sdAb的所选递送肽的测试克隆
实施测试克隆以选择在稳定性(例如在表达时具有良好的表达水平和溶解性)和良好的活性(例如促进BBB特异性通过并具有更低的毒性)方面有前途的融合构建体。具体而言，实施pepH1、pepH2、pepH3和pepM’的测试克隆，其中每一种肽都与不相关的抗体融合以模拟最终的抗体-肽构建体。
PepH2用作用于迁移的阴性对照。所用的不相关的抗体为非常稳定并有助于模拟最终的抗体-肽产物的sdAb。以多种方式进行缀合，包括双特异性抗体在N-末端、C-末端或两者与递送肽进行缀合。PepH1、pepH2、pepH3或pepM’(“pepDEN”)与测试sdAb的N-或C-末端连接，使用连接体，并且包含组氨酸标签、HA和Sfil位点。
b.测试抗体-肽构建体的表达
通过PCR扩增抗体-肽构建体，然后纯化，接着插入至表达载体中，即表达载体T7和pET21，并通过测序证明嵌合体。然后，使用嵌合体转化细菌细胞，具体而言为细菌菌株BL21。在BL21中的转化产生多个集落。通过PCR“筛选”的集落鉴定为目的克隆。使用IPTG或自诱导介质表达目的鉴定的克隆。
考马斯凝胶的结果证明与其他的肽构建体相比，sdAb-pepH以更高的水平并且作为更加可溶的产物表达，并且显示从构建体特别高的表达，其中所述的肽处于sdAb的C-末端。
这些结果以及从生物分布和稳定性/表达分析得到的结果证明，pepH3作为递送肽的用途，例如用于将抗寡聚体BAP42 sdAb递送至脑。接着，pepH3与本发明的抗寡聚体BAP42sdAb缀合，如下文所述。
c.抗体-肽构建体的制备
克隆不同的抗体分子和抗体-肽构建体，如下表13中所概括。
表13
Figure BDA0001400017140000931
表13显示其他的构建体与显示BBB迁移能力的pepH3一起使用。作为用于BBB迁移的阳性对照，克隆FC5抗体；作为用于结合BAP的阳性对照，克隆针对BAP的抗体(“Abx”)；以及作为阴性对照，还克隆不相关的抗体(“PMP6A6”)。FC5为文献中所述的sdAb，其是通过针对人类脑的上皮细胞的噬菌体展示而研发的，并且可以结合BBB上的受体，具体而言为糖基化的管腔BEC蛋白质(Cdc50A)(参见Muruganandam,et al.(2002)FASEB J,16(2):240-241；and Abulrob,et al.(2005)J Neurochem 95(4):1201-1214)。Abx为针对BAP多肽的纳米抗体(参见Lauwereys等人的美国专利U.S.20080107601)。PMP6A6也为纳米抗体，其为与血清白蛋白结合的抗体(参见Dombrecht等人的美国专利U.S.2014/0228546)。
根据抗体的基因，将最终的构建体克隆至pET21a、pET28a或pT7载体中。克隆后，对这些构建体测序，并表达用于进一步的表征。
d.抗体-肽构建体在阻止BAP42聚集中的作用
一旦生产并纯化所述的构建体，还可以测量该构建体的免疫特异性，并证明与不具有融合肽的相应的sdAb的免疫特异性相似。
还针对抗寡聚体抑制BAP42的聚集的能力测试这些寡聚体。使用硫磺素T(ThT)进行所述的测定，如上文所述，所述的硫磺素T(ThT)识别富含β-片的结构，其特征为纤维状BAP42，这样可以评估sdAb抑制聚集的能力。具体而言，所抑制的聚集体越多，则ThT发出的信号越小。测试2种比例，即，1:5(1个sdAb分子用于每5个BAP42分子)和1:20(1个sdAb分子用于每20个BAP42分子)。结果示于图29A-29B中。
图29A-29B显示，具有和不具有融合肽的本发明的sdAb实际上都抑制纤维化；而对BAP42不具有特异性的抗体(例如FC5和其他不相关的单一轻链可变结构域抗体VL18和VL218)不抑制纤维化，或者甚至可以促进纤维化。
e.抗体-肽构建体的生物分布和BBB通过
在生物分布测定中使用不同的抗体-肽构建体，并且将结果与各自DEN2C肽(pepH1、pepH2、pepH3和pepM’，化学合成的)的生物分布相比。所选的抗体分子(sdAb)是显示与BAP42强结合的以及高效地抑制BAP寡聚体体外聚集的那些。在表达和纯化后，sdAb和sdAb-肽构建体与锝(99Tc)缀合，并且如之前所述进行生物分布测定。结果示于下表14-16中。
表14-16示出不同抗BAP42sdAb及其与不同肽(“pepH3”)的构建体的生物分布。表14示出“#2”和“#2-pepH3”的嵌合体的生物分布结果；表15示出“#20”和“#20-pepH3”的生物分布结果；而表16示出“#27in”和“#27in-pepH3”的生物分布结果。
表14
Figure BDA0001400017140000951
表15
Figure BDA0001400017140000952
Figure BDA0001400017140000961
表16
Figure BDA0001400017140000962
结果显示示例性构建体的惊人的改善的生物分布谱。例如表14显示将“#2”sdAb与递送肽连接增加其在2分钟内在脑中的存在为大约3倍，并且仅减慢在1小时后从脑中的洗出为大约2倍。即，大约3倍在2分钟内达到脑中，而仅大约二分之一在1小时后保留。甚至更惊人的是，表16示出将“#27in”sdAb与递送肽连接增加其在2分钟内在脑中的存在为大约6倍，并且仅减慢在1小时后将由脑中的洗出为大约2倍。即，大约6倍在2分钟内达到脑中，而仅大约二分之一在1小时后保留。所选的抗体在阿尔茨海默病的转基因动物模型中用于初步研究，用于证实体内的效力，如以下实施例所述。
实施例4-候选化合物的临床前效力
使用所选的抗BAP42 sdAb在5xFAD转基因小鼠中实施体内测试，其中所述的抗BAP42 sdAb与所选的BBB特异性递送肽缀合和未缀合。使用体内成像，并观察对动物脑中β-淀粉样斑块的作用来评估结果。具体而言，使用以下3种配制物注射动物，鉴定如下：
·化合物“A”，其对应于包含“sdAb#2”的配制物；
·化合物“B”，其对应于包含“sdAb#2-pep”的配制物；以及
·化合物“C”，其对应于包含活性试剂的媒介物。
每次施用使用375μg活性试剂，每周一、周三和周五(3x每周)通过向测试动物ip注射施用各种化合物。处死动物后，实施免疫组织化学和成像。具体而言，处死动物，并将脑的海马体和皮质区切片并使用Thiazin Red(其为表明斑块存在的化合物)进行染色。结果示于图30A-30B、表17和图31A-31D中。
图30A-30B显示由使用上文鉴定的候选物“A”、“B”和“C”处理的5xFAD转基因小鼠得到的结果，在海马体(图30A)和皮质区(图30B)使用Thiazin Red染色之后。将测量对用作对照的化合物C(100％)归一化。与对照相比，化合物A和B有效地显示斑块数量，并且对于化合物B(对应于抗体-肽构建体“sdAb#2-pep”)特别如此。表17提供了通过Thiazin Red鉴定的斑块的绝对和相对数量。图31A-31D进一步证明这些结果，表明海马区上的归一化的斑块负载(图31A)和斑块/mm(图31B)；以及皮质区上的归一化的斑块负载(图31C)和斑块/mm(图31D)。
表17
Figure BDA0001400017140000971
在本实施例中使用的其他的抗体分子和抗体-肽构建体概括于下表18、表19和表20中。
表18
Figure BDA0001400017140000972
Figure BDA0001400017140000981
表19
Figure BDA0001400017140000982
Figure BDA0001400017140000991
Figure BDA0001400017140001001
表20
Figure BDA0001400017140001002
实施例5-候选化合物作为预测AD的生物标志物的诊断用途
以下实施例证明在体外(a)和体内(b)诊断中，本发明的抗BAP42sdAb(与BBB特异性递送肽缀合的和未缀合的)的用途。
a.使用AD患者的脑脊液对AD的体外诊断
为了诊断AD，根据伦理学程序，从处于不同阶段的阿尔茨海默病的患者收集脑脊液样品。具体而言，CSF样品得自在the Hospital Santa Maria,Lisbon中的患有认知诉求、记忆问题、适当鉴定为痴呆的患者。患者经过用于评价病史的标准的方案，以及神经学检查、试验室测试和脑成像(CT扫描或MRI扫描)，还使用痴呆评价的里斯本组(BLAD)进行神经电生理学评价。患者纳入MCI(轻度认知障碍)组中是基于the European Consortium onAlzheimer's disease(EADC)和the American Psychiatric Association(DSM-IV-TR,2000)的标准。
还收集对照样品。根据the Department of Neurology of the Hospital deSanta Maria的标准的过程进行样品收集。该研究经过the Ethics Committee of theHospital de Santa Maria批准，并且患者提供他们的知情同意书。
收集来自至少86名患者的CSF样品，其中患者为62.2±9.0岁(45名男性，43名女性；41名被诊断患有MCI；45名被诊断患有痴呆，其中大部分与阿尔茨海默病有关)。
将收集的样品暴露于本发明的抗BAP42sdAb(sdAb)，或者本发明的sdAb与BBB特异性递送肽(sdAb-pep)的构建体，具体而言上文表13中提供的构建体。具体而言，sdAb和/或sdAb-pep固定化在CM5芯片上；不同的CSF样品与该芯片接触，并且使用BIAcore检测结合情况。当连接时，所登记的信号鉴定作为AD的生物标志物的相应sdAb或sdAb-pep，以及定量存在的BAP42寡聚体/单体的量。识别并免疫特异性结合这些不同的CSF样品中的BAP42寡聚体的某些sdAb和sdAb-pep还显示在认知和阿尔茨海默病的阶段之间的相关性，从而提供用于AD特定阶段的生物标志物，特别是在早期的临床诊断中，鉴定阿尔茨海默病的早期阶段和/或与轻度认知障碍有关的阶段。
b.使用标记的sdAb及其与BBB特异性肽的构建体的体内成像
使用99Tc/67Ga标记所选的sdAb和sdAb-pep用于成像。对于此，选择体外识别BAP42并且可以转运BBB、同时不显示所形成的β-淀粉样斑块解聚的sdAb/sdAbs-pep。为了成像，选择结合BAP42寡聚体的sdAb，从而提供表明寡聚体在脑中存在但是不一定导致解聚的图像。此类sdAb/sdAbs-pep通过对AD的“老年斑”特征成像而提供体内诊断的生物标志物。
具体而言，如上文所述，使用99Tc标记sdAb#2-pep。使用标记的构建体注射2只健康的小鼠，并在注射后2分钟或60分钟处死，并且对动物实施SPECT(单光子发射计算机断层摄像)。结果示于图32A-32B中。
如图32A所示，在2分钟后，在脑和诸如膀胱和肾之类的器官中检测信号。如图32B所示，在60分钟后，不再观察到来自脑的信号，但持续观察到在肾的信号。这些结果证明sdAb构建体事实上达到动物的脑中，并且此后从脑中除去。在鼠尾中检测到的信号(对应于注射后60分钟的图像)是正常的，并且代表为所用的老年小鼠的注射位点。
所有的参考文献(包括本发明引用的专利申请和公开)均以引用方式全文并入本文，并且对于所有目的而言，如同每一份单独的公开或专利或专利申请为了所有的目的，特意地并单独地表明以引用方式全文并入本文。在不脱离本发明的精神和范围的条件下可以对本发明进行许多修改和改变，这对于本领域技术人员而言是显而易见的。本发明所述的具体的实施方案仅通过实例的方式提供，并且本发明不仅限于所附的权利要求书的条款以及该权利要求书施用权利的等价物的全部范围。
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Claims (40)

1.一种抗体分子，所述分子对至少一种寡聚体形式的β-淀粉样肽42(BAP42)和/或单体BAP42具有免疫特异性，
其中所述的分子对纤维状BAP42不具有免疫特异性，
其中所述分子穿越血脑屏障并且包含选自SEQ ID NO:1-6、8-11、13-17、19和21的至少一个氨基酸序列，
其中所述分子为单一结构域抗体。
2.权利要求1所述的抗体分子，其中所述单一结构域为兔轻链可变结构域(VL)，
其中所述分子是人源化的，
其中所述人源化分子包含所述抗体分子的一个或多个CDR以及人类抗体结构域的一个或多个构架区。
3.权利要求1或2所述的抗体分子，其中所述分子是稳定的，
所述稳定性定义为可以使转化的大肠杆菌的400-600个集落在37℃并且在2.48mM氯霉素存在下在24小时内生长，这是由于使用1个集落形成单位的载体的转化并且通过所述的转化的大肠杆菌表达融合体，其中所述载体编码与氯霉素乙酰基转运酶融合的所述抗体分子。
4.权利要求1或2所述的抗体分子，其中所述分子体外阻止BAP42纤维化达到至少50％。
5.权利要求1或2所述的抗体分子，其进一步包含与其融合的肽，所述肽包含由SEQ IDNO:127组成的多肽的疏水性片段，从而得到抗体-肽构建体，该构建体比不具有所述融合肽的所述抗体分子，显示更高的穿越血脑屏障的能力。
6.权利要求5所述的抗体分子，其中所述抗体-肽构建体比不具有所述融合肽的所述抗体分子，显示至少3倍以上的穿越血脑屏障的能力。
7.权利要求5所述的抗体分子，其中所述肽通过肽连接体与所述抗体分子融合。
8.权利要求5所述的抗体分子，其中所述肽与所述抗体分子的C-末端的下游融合。
9.权利要求5所述的抗体分子，其中所述肽缺乏对血脑屏障的内皮细胞的毒性，
所述缺乏毒性定义为在与至多100μM所述未融合的肽温育24小时后，所述内皮细胞的活力的降低不超过20％。
10.权利要求5所述的抗体分子，其中所述肽的至少30％在使用0.1-1mM所述未融合的肽注射小鼠的2分钟内，到达所述的小鼠的脑中。
11.权利要求10所述的抗体分子，其中到达所述小鼠的脑中的所述肽的至少90％在使用0.1-1mM未融合的肽注射小鼠的60分钟内，从其中清除。
12.权利要求5所述的抗体分子，其中所述的肽由选自SEQ ID NO:22-25的一个氨基酸序列组成。
13.权利要求5所述的抗体分子，其中所述抗体-肽构建体由选自SEQ ID NO:28-111的一个氨基酸序列组成。
14.一种药物组合物，其包含权利要求1-13的任意一项所述的抗体分子和药物可接受的载体。
15.权利要求14所述的药物组合物，其进一步包含选自美金刚、多奈哌齐、加兰他敏、利凡斯的明和他克林的至少一种其他的试剂。
16.一种制备权利要求14所述的药物组合物的方法，其包括：
提供权利要求1-13的任意一项所述的抗体分子；以及
与药物可接受的载体混合，
其中所述抗体分子是人源化的。
17.权利要求16所述的方法，其中所述药物组合物配制用于静脉内注射、鞘内注射或鼻内施用。
18.有效量的权利要求14或15所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于在有需要的受试对象中治疗、延迟、减慢、预防或减少阿尔茨海默病、相关紊乱或其症状的发生率。
19.根据权利要求18所述的用途，其中所述的症状选自短期记忆丧失、方向障碍、痴呆、认知障碍、轻度认知障碍、情绪波动、缺乏动力、缺乏自理、说话困难和解决问题困难。
20.根据权利要求18所述的用途，其中所述的相关紊乱为选自侧索硬化(ALS)、帕金森病、亨廷顿病、海绵状脑病和CNS紊乱的至少一种。
21.根据权利要求18所述的用途，其中所述的受试对象处于阿尔茨海默病的早期阶段或者与轻度认知障碍有关的阶段。
22.根据权利要求1-13的任意一项所述的抗体在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测受试对象中倾向于聚集的肽的方法，所述的方法包括：
在允许免疫特异性结合的条件下将权利要求1-13的任意一项所述的抗体分子与得自所述受试对象的测试样品接触，其中所述样品包含脑脊液或血清；以及
检测所述免疫特异性结合；
其中所述倾向于聚集的肽选自BAP42、α-突触核蛋白的肽、胰岛淀粉样多肽的肽、亨廷顿肽和阮病毒蛋白质的肽。
23.权利要求22所述的用途，其中所述方法进一步包括提供对阿尔茨海默病或相关紊乱的诊断，其中所述免疫特异性结合大于使用对照样品得到的免疫特异性结合，其中所述的对照样品得自未患有或者不倾向于患有阿尔茨海默病或相关紊乱的受试对象，
其中所检测的免疫特异性结合表明阿尔茨海默病的早期阶段或与轻度认知障碍有关的阶段。
24.权利要求23所述的用途，其中所述方法进一步包括以下步骤：
向所述诊断的受试对象施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包含权利要求1-13的任意一项所述的抗体分子，
其中所述抗体分子与在所述接触步骤中使用的抗体分子相同。
25.权利要求22或23所述的用途，其中当所述抗体分子与所述测试样品接触时，将所述的抗体分子固定化在芯片上。
26.权利要求22或23所述的用途，其中所述方法进一步包括：
在不同的时间点使用得自所述受试对象的第二测试样本重复所述的接触和检测步骤；以及
比较在所述的不同的时间点的免疫特异性结合的量；
由此监测在所述受试对象中的所述倾向于聚集的肽。
27.一种包含大量的权利要求1-13的任意一项所述的抗体分子的试剂盒，
所述大量为在与得自阿尔茨海默病或相关紊乱的第一受试对象的样品接触时，提供用于检测免疫特异性结合的足量的所述抗体分子，
其中所述样品包括脑脊液。
28.权利要求27所述的试剂盒，其中所述大量的抗体分子被固定化在芯片上。
29.权利要求27或28所述的试剂盒，其中所检测的免疫特异性结合表明阿尔茨海默病的早期阶段或与轻度认知障碍有关的阶段。
30.权利要求27或28所述的试剂盒，其进一步包含权利要求1-13的任意一项所述的至少第二大量的第二抗体分子，
其中当与得自第二受试对象的样品接触时，所述的第二抗体分子显示免疫特异性结合，所述的第二受试对象与所述的第一受试对象相比，处于所述的疾病或紊乱的不同阶段，
其中所述第一受试对象为阿尔茨海默病的早期阶段，第二受试对象为阿尔茨海默病的晚期阶段。
31.根据权利要求1-13的任意一项所述的抗体在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于对受试对象的脑中的倾向于聚集的肽成像的方法，所述的方法包括：
向所述受试对象施用与标记结合的权利要求1-13的任意一项所述的抗体分子；以及
获得所述的受试对象的脑的图像，所述的图像表明所述倾向于聚集的肽，
其中所述倾向于聚集的肽选自BAP42、α-突触核蛋白的肽、胰岛淀粉样多肽的肽、亨廷顿肽和阮病毒的肽，
其中所述抗体分子是人源化的，
其中所述人源化抗体分子包含所述抗体分子的一个或多个CDR以及人类抗体结构域的一个或多个构架区。
32.权利要求31所述的用途，其中所述抗体分子为在体外免疫特异性结合BAP42、转运体外血脑屏障模型并且不解聚所述的BAP42的斑块的抗体分子。
33.权利要求31或32所述的用途，其进一步包括提供对阿尔茨海默病或相关紊乱的诊断，其中所述的图像表明所述倾向于聚集的肽比在未患有或未倾向于患有阿尔茨海默病或相关紊乱的受试对象中形成的更多。
34.权利要求33所述的用途，所述方法进一步包括以下步骤：
向所述诊断的受试对象施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包含权利要求1-13的任意一项所述的抗体分子，
其中所述抗体分子与在所述的成像步骤中使用的抗体分子相同。
35.权利要求31或32所述的用途，其中所述标记选自放射活性部分、荧光部分、荧光猝灭部分、顺磁部分、可检测的蛋白质、编码可检测的蛋白质的基因和染料。
36.权利要求31或32所述的用途，其中所述方法进一步包括在不同的时间点使用所述受试对象重复所述施用和成像步骤；以及
比较在所述不同的时间点的免疫特异性结合的量；
由此监测在所述受试对象中的所述倾向于聚集的肽。
37.一种包含与标记结合的权利要求1-13的任意一项所述的抗体分子的试剂盒，
其中所述标记选自放射活性部分、荧光部分、荧光猝灭部分、顺磁部分、可检测的蛋白质、编码可检测的蛋白质的基因和染料，
其中所述标记与所述抗体分子共价连接。
38.权利要求37所述的试剂盒，其中所述抗体分子以提供图像的足够量存在，其中所述图像表明当施用给所述的受试对象时，在所述受试对象脑中的倾向于聚集的肽，
其中所述倾向于聚集的肽选自BAP42、α-突触核蛋白的肽、胰岛淀粉样多肽的肽、亨廷顿肽和阮病毒蛋白质的肽。
39.权利要求37或38所述的试剂盒，其中所述抗体分子免疫特异性地结合BAP42寡聚体，其为阿尔茨海默病的早期阶段或与轻度认知障碍有关的阶段的特征。
40.权利要求37或38所述的试剂盒，其进一步包含与第二标记的结合的权利要求1-13的任意一项所述的第二抗体分子，
其中所述第二抗体免疫特异性地结合BAP42寡聚体，其为与轻度认知障碍有关的阶段相比晚期阶段的阿尔茨海默病的特征。
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Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2017354743A1 (en) * 2016-11-07 2019-06-06 DegenRx B.V Novel amyloid beta oligomer specific binding molecule
MA54070A (fr) * 2018-10-29 2021-09-08 Biogen Ma Inc Variants fc5 humanisés et stabilisés pour l'amélioration du transport à travers la barrière hémato-encéphalique
US12115212B2 (en) * 2019-01-18 2024-10-15 L & J Bio Co., Ltd. Methods of decreasing amyloid beta (Aβ) plaque deposition and hyperphosphorylated tau plaque deposition in Alzheimer's disease using a cystatin C fusion protein
TW202300517A (zh) 2021-03-12 2023-01-01 美商美國禮來大藥廠 抗類澱粉β抗體及其用途
WO2022251048A1 (en) 2021-05-24 2022-12-01 Eli Lilly And Company Anti-amyloid beta antibodies and uses thereof
WO2022270396A1 (ja) * 2021-06-21 2022-12-29 株式会社Epsilon Molecular Engineering ダブルスクリーニング方法
WO2023281445A1 (en) * 2021-07-07 2023-01-12 Technophage, Investigação E Desenvolvimento Em Biotecnologia, S.A. Highly specific rabbit single -domain antibodies for drug delivery in immunotherapy applications
CN116212049B (zh) * 2022-12-19 2023-11-24 江南大学 一种基于小胶质细胞炎性衰老调节的手性纳米材料在制备治疗阿尔茨海默症的药物中的应用

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005105998A1 (ja) * 2004-04-27 2005-11-10 Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute ヒト抗アミロイドβペプチド抗体およびその抗体フラグメント
WO2008136694A1 (en) * 2007-05-04 2008-11-13 Technophage, Investigação E Desenvolvimento Em Biotecnologia, Sa Engineered rabbit antibody variable domains and uses thereof
WO2010119704A1 (en) * 2009-04-17 2010-10-21 Immunas Pharma, Inc. Antibodies that specifically bind to a beta oligomers and use thereof
WO2012120035A1 (en) * 2011-03-08 2012-09-13 Alzinova Ab Anti oligomer antibodies and uses thereof
WO2013167681A1 (en) * 2012-05-10 2013-11-14 Georg-August-Universität Göttingen CONFORMATIONAL-SPECIFIC ANTIBODIES AGAINST Αβ OLIGOMERS
WO2014060444A1 (en) * 2012-10-15 2014-04-24 Medimmune Limited Antibodies to amyloid beta

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US5807715A (en) 1984-08-27 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and transformed mammalian lymphocyte cells for producing functional antigen-binding protein including chimeric immunoglobulin
AU694745B2 (en) 1993-09-10 1998-07-30 Trustees Of Columbia University In The City Of New York, The Uses of green fluorescent protein
US6311415B1 (en) 1998-09-14 2001-11-06 Lind Shoe Company Bowling shoe with replaceable tip
CA2360219A1 (en) * 2000-10-27 2002-04-27 Mount Sinai Hospital Method for detecting alzheimer's disease
ATE422671T1 (de) * 2002-07-30 2009-02-15 David Gladstone Inst Verfahren zur diagnose von morbus alzheimer
JP2006508072A (ja) * 2002-10-01 2006-03-09 ノースウエスタン ユニバーシティ アミロイドベータ由来拡散性リガンド（ＡＤＤＬｓ）、ＡＤＤＬ代替物、ＡＤＤＬ結合性分子、およびそれらの使用
EP1814917A2 (en) 2004-10-13 2007-08-08 Ablynx N.V. Single domain camelide anti-amyloid beta antibodies and polypeptides comprising the same for the treatment and diagnosis of degenerative neural diseases such as alzheimer's disease
CN101076543A (zh) * 2004-10-13 2007-11-21 阿布林克斯公司 用于治疗和诊断变性神经疾病如阿尔茨海默症的单结构域骆驼抗淀粉样蛋白β的抗体以及包含它的多肽
WO2007064917A2 (en) * 2005-11-30 2007-06-07 Abbott Laboratories Methods of preparation of recombinant forms of human beta-amyloid protein and uses of these proteins
US8399627B2 (en) * 2007-12-31 2013-03-19 Bayer Pharma AG Antibodies to TNFα
WO2011016238A1 (en) * 2009-08-06 2011-02-10 Immunas Pharma, Inc. Antibodies that specifically bind to a beta oligomers and use thereof
EP2723771B1 (en) 2011-06-23 2019-09-11 Ablynx NV Serum albumin binding proteins
EP2758422A1 (en) 2011-09-23 2014-07-30 Technophage, Investigação E Desenvolvimento Em Biotecnologia, SA Modified albumin-binding domains and uses thereof to improve pharmacokinetics
HUE039033T2 (hu) 2012-01-10 2018-12-28 Biogen Ma Inc Terápiás molekulák transzportjának fokozása a vér-agy gáton keresztül
EP2928919A2 (en) * 2012-12-04 2015-10-14 AbbVie Inc. Blood-brain barrier (bbb) penetrating dual specific binding proteins

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005105998A1 (ja) * 2004-04-27 2005-11-10 Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute ヒト抗アミロイドβペプチド抗体およびその抗体フラグメント
WO2008136694A1 (en) * 2007-05-04 2008-11-13 Technophage, Investigação E Desenvolvimento Em Biotecnologia, Sa Engineered rabbit antibody variable domains and uses thereof
WO2010119704A1 (en) * 2009-04-17 2010-10-21 Immunas Pharma, Inc. Antibodies that specifically bind to a beta oligomers and use thereof
WO2012120035A1 (en) * 2011-03-08 2012-09-13 Alzinova Ab Anti oligomer antibodies and uses thereof
WO2013167681A1 (en) * 2012-05-10 2013-11-14 Georg-August-Universität Göttingen CONFORMATIONAL-SPECIFIC ANTIBODIES AGAINST Αβ OLIGOMERS
WO2014060444A1 (en) * 2012-10-15 2014-04-24 Medimmune Limited Antibodies to amyloid beta

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Active immunotherapy facilitates Aβ plaque removal following through microglial activation without obvious T cells infiltrating the CNS;Sha S 等;《Journal of Neuroimmunology》;20141231;全文 *
Common Structure of Soluble Amyloid Oligomers Implies Common Mechanism of Pathogenesis;Kayed R ET等;《Science》;20030418;图1 *
Inhibiting toxic aggregation of amyloidogenic proteins: A therapeutic strategy for protein misfolding diseases;Cheng B 等;《Biochimica Et Biophysica Acta》;20131231;全文 *
Kristoffer Brännström等.A Generic Method for Design of Oligomer-Specific Antibodies.《PLOS ONE》.2014, *
Molecular basis for passive immunotherapy of Alzheimer"s disease;Gardberg A S等;《Molecular basis for passive immunotherapy of Alzheimer"s disease》;20071231;全文 *
Rabbit single domain antibodies specific to protein C expressed in prokaryotes;Suter M等;《Immunology Letters》;19921231;全文 *
Targeting the proper amyloid-beta neuronal toxins: a path forward for Alzheimer’s disease immunotherapeutics;William F Goure等;《Alzheimer"s Research & Therapy》;20140709;表2 *

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