CN107287273A - 表达Tim-3的外周血NK细胞在制备自然流产生物标记物中的用途 - Google Patents
表达Tim-3的外周血NK细胞在制备自然流产生物标记物中的用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于生物技术领域，涉及表达Tim‑3的外周血NK细胞在制备自然流产生物标记物中的用途。本发明所述的NK细胞具有耐受表型与低细胞杀伤毒性，经试验证明所述的表达Tim‑3的外周血NK细胞在正常妊娠外周血的高表达，而自然流产患者这种细胞数量下降、功能紊乱；拮抗NK细胞的Tim‑3导致妊娠失败，过继转输该NK细胞亚群可挽救免疫性自然流产模型以及NK敲除所致的妊娠失败；所述的表达Tim‑3的外周血NK细胞可用于制备自然流产生物标记物，进一步作为临床不明原因自然流产的新型预测与防治靶点。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域。涉及预测与防治自然流产的生物标记物，具体涉及表达Tim-3的外周血NK细胞在制备自然流产生物标记物中的用途。该自然流产的生物标记物可用于作为早期妊娠失败的预测与防治靶点。
背景技术
现有技术公开了有关妊娠结局的预测方法主要是根据孕妇的外周血HCG-β与孕酮水平，但实践中大量的证据表明孕妇外周血P水平与妊娠结局关系并不完全一致；尽管HCG-β能比较真实的反应孕妇的妊娠预后，但越来越多的临床资料表明：一旦孕妇外周血HCG下降(除了HCG-β生理性下降)，胚胎已无法挽救；另外，部分孕妇尽管持续分泌大量的HCG-β与P，但胚胎仍停止发育(或是空胚囊)；显然HCG-β与P作为检测妊娠结局的指标存在诸多的缺陷，临床实践迫切需要一个反映早孕期妊娠状态的早期预测与防治的生物指标。
研究公开了，胚胎表达父系抗原，因而可视为一种半同种移植物，作为这种半同种移植物的胚胎能够在母体内存活直至分娩实际是反应了母体对胚胎的免疫耐受。一旦这种母-胎免疫耐受被打破，将会导致妊娠失败或自然流产与妊娠并发症。自然流产是严重危害人类生殖健康的常见疾患之一，其发生率呈现逐年上升的趋势。据统计资料表明，目前，自然流产发生率高达15～40％，即便是在辅助生育技术飞速发展的今天，仍不能克服因母-胎免疫调节紊乱造成的妊娠失败，遗憾的是临床实践中仍缺乏对之有效的早期诊断与防治策略。自然流产的发生多归因于遗传、感染、内分泌、生殖道畸形等等，但临床仍有50％以上的流产尤其是反复自然流产病因不明，其中，母-胎免疫调节失衡被认为是重要原因之一；有研究显示，免疫细胞是母-胎免疫耐受的执行者与效应者，其中NK细胞在母-胎耐受中发挥至关重要的调节作用；本申请的前期研究发现，蜕膜NK细胞对母-胎耐受的建立和维持至关重要，妊娠期蜕膜NK细胞通过细胞表面分子与细胞内各种因子的作用，维持母-胎耐受与正常妊娠的进行，然而由于妊娠期蜕膜组织不易获取，用于临床诊断与防治靶点几无可能。因此，临床实践中迫切需要一个简单可靠的方法对早期自然流产的免疫学状态进行客观的评估，并能对之进行干预以达到防治自然流产挽救妊娠胚胎的目的。
基于现有技术的现状，本申请的发明人拟提供一种预测与防治自然流产的生物标记物，尤其是表达Tim-3的外周血NK细胞在用于制备自然流产生物标记物中的用途。该自然流产的生物标记物可用于作为早期妊娠失败的预测与防治靶点。
发明内容
本发明的目地是克服现有技术存在的缺陷，提供一种预测与防治自然流产的生物标记物，具体涉及表达Tim-3的外周血NK细胞在用于制备自然流产生物标记物中的用途。该自然流产的生物标记物可用于作为早期妊娠失败的预测与防治靶点。
本发明中，进行了不同妊娠状态外周血Tim-3+NK细胞百分率比较实验与差异分析，分析Tim-3在不同妊娠状态外周血NK细胞的表达特征及其调节情况；结果显示，Tim-3在NK细胞表达水平在不同孕期有明显差异，妊娠早期外周血NK细胞Tim-3表达明显上调，妊娠中期降至未孕期水平；妊娠早期，妊娠相关激素(主要是孕酮)与Th2型细胞因子(IL-4)参与外周NK细胞的Tim-3表达上调；
本发明中，进行了Galectin-9/Tim-3信号介导早孕外周NK细胞免疫耐受试验，结果显示：与Tim3-NK细胞相比，Tim-3+NK细胞产生较高水平的Th2型细胞因子和较低水平的Th1型细胞因子，并呈现出较弱的杀伤活性，这些表型特征将更有利于维持妊娠外周免疫的耐受状态；，NK细胞上的Tim-3受体与Galectin-9相互作用，通过活化Akt、JNK信号通路，促进转录因子Id-2、Blimp1、Gata-3的表达，进而诱导外周NK细胞向免疫耐受表型分化；Tim-3/Gal-9信号参与NK细胞优势产生Th2型细胞因子；
本发明中，进行了早孕外周NK细胞Galectin-9/Tim-3信号异常致NK功能障碍与妊娠失败的试验，结果表明，外周NK细胞Tim-3表达的降低及外周Gal-9产生水平的下调破坏外周NK细胞通过分泌细胞因子和维持较低的杀伤活性而发挥的免疫耐受作用，进而导致自然流产；
进一步，本发明进行了干扰Gal-9/Tim-3信号通路对妊娠结局的影响试验以及过继转输Tim-3+NK细胞挽救妊娠失败实验，结果显示，Tim-3在正常妊娠过程中通过调节外周NK细胞的功能起保护作用，如果Tim-3所介导的信号通路被破坏，会影响外周NK细胞的功能甚至分化发育，从而影响妊娠的正常进行和胚胎的发育，尤其Galectin-9/Tim-3信号通路异常会引起早孕外周血NK细胞功能紊乱致不良妊娠结局；经过IL-4和孕酮刺激的Tim-3+NK细胞有效缓解流产模型高胚胎吸收率；过继转输Tim-3+NK细胞降低NK细胞缺陷小鼠的胚胎吸收率，过继转输Tim-3-NK细胞不影响妊娠结局。
本发明经试验证明了一种耐受性NK亚群在正常妊娠外周血的高表达，而自然流产患者这种细胞数量下降、功能紊乱；拮抗NK细胞的Tim-3导致妊娠失败，过继转输该NK细胞亚群可挽救免疫性自然流产模型以及NK敲除所致的妊娠失败；所述的表达Tim-3的外周血NK细胞可用于制备自然流产生物标记物，进一步作为临床不明原因自然流产的新型预测与防治靶点。
本项发明的优点在于：
提供了表达Tim-3的外周血NK细胞可用于制备自然流产生物标记物，进一步作为临床不明原因自然流产的新型预测与防治靶点；
所述的Tim-3+NK细胞在妇女外周血存在，其表型与功能在早孕外周与蜕膜局部高度一致，只需抽取少许外周血，通过流式细胞分析即可监测孕妇的子宫局部与全身的免疫耐受状态；不仅如此，针对这群细胞，通过体外刺激(如IL-4、P)后过继转输该亚群细胞可用于直接防治反复自然流产患者的再次妊娠失败。
附图说明
图1：显示人早孕外周血不同免疫细胞亚群Tim-3的表达情况以及Tim-3+NK细胞在不同孕期的比例，其中Tim-3+NK细胞在早孕期比例明显高于非孕与中孕期。
图2，显示IL-4/STAT6信号与妊娠相关的孕激素上调外周血Tim3+NK细胞比例，
其中，Th2型细胞因子IL-4通过活化STAT6信号上调Tim-3表达，STAT6抑制剂与Th1型细胞因子抑制IL-4的这种调节作用，经典的保胎剂孕酮亦促进pNK细胞表达Tim-3。
图3，显示人早孕外周血Tim-3+NK细胞呈现免疫耐受表型，
其中，芯片分析结果显示Tim-3+NK细胞和Tim-3-NK细胞是有差异基因表达的两群NK细胞亚群，Tim-3+NK细胞中865个基因上调表达，100个基因下调表达，并且上调表达的基因多与Th2型免疫应答及免疫耐受有关；FCM分析人早孕外周血Tim-3+与Tim-3-的NK细胞，发现与Tim-3-NK细胞相比，Tim-3+NK细胞产生更高水平IL-4、IL-10与TGF-β，更低水平的TNF-α与Perforin；其对滋养细胞的杀伤活性亦明显下降。
图4：Galectin-9/Tim-3信号通过活化JNK与AKT信号调控外周NK细胞呈现耐受表型，其中显示，Tim-3的天然配体Gal-9刺激pNK细胞，qPCR与western blot显示Gal-9刺激后活化与NK细胞发育分化以及细胞毒性相关的转录因子水平，上调IL-4/IL-10、下调TNF-1/Perforin与细胞毒性。
图5：自然流产患者外周血NK细胞Tim-3/Gal-9表达异常，伴有NK细胞功能紊乱，其中，图5.1显示自然流产患者外周血NK细胞Tim-3表达下降、外周血Gal-9水平低下，伴随Tim-3+NK细胞抗炎细胞因子基因启动子和增强子区域的染色质可接近性显著降低，促炎细胞因子生成降低，导致Th2/Th1型细胞因子紊乱、细胞杀伤毒性增强；图5.2显示早孕小鼠外周血与脾脏NK细胞Gal-9/Tim-3表达高于中孕期；自然流产小鼠组低于正常妊娠小鼠；自然流产小鼠外周血与脾脏Tim-3+NK细胞产生Th2/Th1型细胞因子紊乱。
图6：阻断TIM-3信号损伤NK细胞功能导致妊娠失败，其中，
图示正常妊娠与自然流产模型小鼠的胚胎吸收与发育以及NK细胞的功能，阻断Tim-3信号降低正常妊娠与自然流产小鼠的窝崽数、增加其胚胎吸收、抑制胚胎生长；这种作用在自然流产组更显著，外源性给予Gal-9不影响正常妊娠的窝崽数、胚胎大小与吸收率与NK细胞功能，但显著抑制自然流产小鼠的胚胎吸收，并且改善NK细胞的功能。
图7：过继转输正常妊娠脾脏Tim-3+NK细胞缓解胚胎丢失，
其中，A为实验流程图，B，C，D，E显示过继转输正常妊娠脾脏Tim-3+NK细胞缓解自然流产模型胚胎吸收，而过继转输自然流产小鼠Tim-3-NK则无改善作用；将自然流产小鼠NK细胞经IL-4、P处理后的Tim-3+NK过继转输给自然流产小鼠后，胚胎吸收率显著下降；NK细胞缺陷小鼠妊娠模型，其胚胎吸收率显著升高，过继转输正常Tim-3+NK而不是Tim-3-NK细胞，显著降低NK缺陷鼠的胚胎吸收率。
图8为表达Tim-3的外周血NK细胞作为自然流产生物标记物用于早期妊娠失败的预测与防治靶点实验流程总图。
具体实施方式
实施例1：不同妊娠状态外周血Tim-3+NK细胞百分率比较与差异分析/分析Tim-3在不同妊娠状态外周血NK细胞的表达特征及其调节
1)分析Tim-3在不同妊娠状态外周血NK细胞的表达特征
首先分离正常非孕、早孕、中孕期妇女外周血，Ficoll分离淋巴细胞，FCM分析Tim-3在CD4+T细胞、CD8+T细胞、NK细胞、NKT细胞、DC细胞和单核细胞的表达(如图1A所示)，结果显示，NK细胞、DC细胞和单核细胞高表达Tim-3(分别为80％、80％、90％)，Tim-3在NK细胞表达水平在不同孕期有明显差异，图1B，C所示，妊娠早期外周血NK细胞Tim-3表达明显上调，妊娠中期降至未孕期水平。
2)Tim-3在人早孕外周血NK细胞的表达调节
由于早孕期外周血与母-胎界面呈现Th2优势，妊娠相关激素如E、P、hCG亦升高，本发明进一步探讨NK细胞Tim-3表达上调的可能因素，用磁珠将未孕妇女外周NK细胞分离纯化后，单独或联合添加重组人IL-4(100ng/ml)和IFN-γ(35ng/ml)培养48h，收集细胞，用流式细胞术检测NK细胞Tim-3的表达情况；图2显示Th2型细胞因子IL-4处理NK细胞后显著上调Tim-3表达，这种作用被IFN-γ所削弱；为了进一步探讨IL-4/IFN-γ调控NK细胞Tim-3表达的作用机制，本实验首先用流式细胞术检测上述方法处理后NK细胞中STAT6(IL-4作用的下游信号分子)的磷酸化水平，结果显示，IL-4处理的NK细胞组，其STAT6的磷酸化水平确实明显提高，而联合应用IFN-γ与IL-4抑制IL-4诱导的STAT6磷酸化水平(图2C，D)。Western Blot检测得到一致的结果如图2E所示)，STAT6的特异性阻断剂A77-1726可以抑制IL-4对Tim-3的上调作用(如图2F所示)，Th2型细胞因子IL-4通过活化其下游分子STAT6进一步促进NK细胞Tim-3的表达，而Th1型细胞因子IFN-γ可以拮抗这一作用；
妊娠早期，不仅外周血中的Th2/Th1型细胞因子格局发生改变，母体的激素水平也发生明显的变化，因此，本实验进一步观察妊娠相关激素是否也会影响外周NK细胞Tim-3的表达，用不同浓度梯度的雌、孕激素、hCG-β刺激纯化的未孕女性外周NK细胞，流式细胞术检测NK细胞Tim-3的表达情况，如图2G所示，孕激素以浓度依赖的方式对NK细胞Tim-3的表达进行调控，较低浓度的孕激素促进NK细胞Tim-3的表达，更高浓度时，这种上调作用就消失甚至抑制NK细胞Tim-3的表达，而雌激素与hCG-β对NK细胞Tim-3的表达无显著影响；
结果表明，妊娠早期，妊娠相关激素(主要是孕酮)与Th2型细胞因子(IL-4)参与外周NK细胞的Tim-3表达上调。
实施例2：Galectin-9/Tim-3信号介导早孕外周NK细胞免疫耐受实验
1)外周血Tim-3+NK与Tim3-NK细胞的表型比较
为了探讨Tim-3在NK细胞上的表达是否与NK细胞功能相关，将分离得到的外周单个核细胞进一步用磁珠分选出Tim-3+NK与Tim3-NK细胞，鉴定分选纯度为92％，满足实验要求，提取总RNA后进行全基因组芯片分析；如图3A、B所示，Tim-3+和Tim-3-NK细胞是有差异基因表达的两群NK细胞亚群，Tim-3+NK细胞中865个基因上调表达，100个基因下调表达，并且上调表达的基因多与Th2型免疫应答及免疫耐受有关；本实验用PMA、离子霉素及BFA刺激4至6小时后上进一步用流式检测Th2型、Th1型细胞因子的蛋白表达水平，如图3C，D所示，Th2型细胞因子IL-4、IL-10、TGF-β在Tim-3+pNK细胞的表达水平明显高于Tim-3-pNK细胞而Th1型细胞因子TNF-α在两群细胞的表达水平则相反；IFN-γ在Tim-3+NK与Tim3-NK细胞的表达几无差异(如图3E，F所示)；
进一步比较Tim-3+NK与Tim3-NK细胞的杀伤活性，将纯化的这两群细胞分别与靶细胞HTR-8(绒毛外细胞滋养细胞系)接触培养，用 Non-RadioactiveCytotoxicity Assay试剂盒检测细胞杀伤活性，如图3I所示，Tim-3+NK与Tim3-NK细胞的杀伤活性均随着效靶比的下降而降低，但Tim-3+NK细胞的杀伤活性始终低于Tim3-NK细胞；流式细胞术分析Tim-3+NK与Tim3-NK细胞产生穿孔素perforin的水平，结果显示perforin在Tim-3+NK细胞的表达水平明显低于Tim-3-NK细胞(如图3G，H)；实验些结果显示：与Tim3-NK细胞相比，Tim-3+NK细胞产生较高水平的Th2型细胞因子和较低水平的Th1型细胞因子，并呈现出较弱的杀伤活性，这些表型特征将更有利于维持妊娠外周免疫的耐受状态。
2)Tim-3天然配体Gal-9对外周血NK细胞分化发育与功能相关转录因子的表达调节
用Tim-3的天然配体Galectin-9处理外周NK细胞能明显促进与NK细胞分化发育及功能相关的转录因子Id-2、Blimp1、Gata-3在mRNA水平的表达，而调控NK细胞杀伤活性的转录因子Eomes的表达则明显下调，进一步分析发现，Gal-9通过活化Akt、JNK两条信号通路，促进NK细胞产生Th2型细胞因子，抑制其Th1型细胞因子生成，并且有效降低NK细胞杀伤活性；因此，NK细胞上的Tim-3受体与Galectin-9相互作用，通过活化Akt、JNK信号通路，促进转录因子Id-2、Blimpl、Gata-3的表达，进而诱导外周NK细胞向免疫耐受表型分化。
3)，Gal-9/Tim-3信号对外周血NK细胞的细胞因子分泌格局和杀伤活性的影响
研究提示Tim-3通过与其配体Gal-9结合可能参加NK细胞的表型与功能调节，因此，进一步在外周NK细胞的培养体系中加入了rhGal-9或anti-Tim-3中和性抗体，处理48小时后，rhGal-9处理组IL-4、IL-10产生水平明显升高，而TNF-α产生水平则明显降低；单独用anti-Tim-3中和性抗体处理组细胞因子的产生水平在处理前后无明显变化，但是rhGal-9和anti-Tim-3联合处理组IL-4、IL-10产生水平明显低于rhGal-9处理组，TNF-α产生水平则相反；实验结果提示Tim-3/Gal-9信号参与NK细胞优势产生Th2型细胞因子(如图4C所示)；
此外，rhGal-9处理后的外周血NK细胞杀伤活性显著下降，这一作用被anti-Tim-3中和性抗体部分恢复，而单独用anti-Tim-3中和性抗体则无明显作用；同样，用流式细胞术检测rhGal-9或anti-Tim-3中和性抗体处理后的NK细胞穿孔素perforin的产生水平也发生了上述改变(如图4D，E所示)。
4)Gal-9/Tim-3相互作用通过活化JNK、Akt信号调节外周血NK细胞功能实验
为了进一步解析Tim-3/Gal-9调节外周血NK细胞的信号转导机制，本实验用rhGal-9分别刺激纯化的外周血NK细胞10分钟、30分钟、60分钟，Western Blot检测外周血NK细胞信号通路相关分子的表达情况，如图4F所示，与NK细胞单独培养相比，rhGal-9刺激后，Akt、JNK和Erk的磷酸化水平显著升高而NK-κB的磷酸化水平在刺激前后没有明显变化，提示Tim-3/Gal-9很有可能通过活化Akt、JNK和Erk这三条信号通路来调控外周NK细胞的功能；
为了明确上述可能的信号通路，将Akt、JNK和Erk三条信号通路的特异性抑制剂加入Gal-9处理NK细胞的培养体系中，然后用流式细胞术检测NK细胞细胞因子和穿孔素的产生水平，如图4G所示，用JNK或AKT的特异性阻断剂可以抑制Gal-9对NK细胞的调节作用，而Erk的特异性阻断剂则没有明显作用；结果表明，Gal-9是通过活化JNK、Akt两条信号通路进一步改变NK细胞的生物学功能，而不是Erk。
实施例3：早孕外周NK细胞Galectin-9/Tim-3信号异常致NK功能障碍与妊娠失败实验
1)自然流产患者外周NK细胞Tim-3表达水平下降Gal-9产生水平降低，NK细胞细
胞因子分泌水平紊乱，杀伤活性增强
为研究外周NK细胞数量与功能的异常与自然流产的发生密切相关，进一步证实正常妊娠和自然流产患者的外周血NK细胞Tim-3的表达是否有差异，血液中Gal-9的含量是否有改变，NK细胞的功能是否也相应变化？本实验采集了早期正常妊娠和不明原因自然流产患者的外周血，用流式细胞术针对以上问题进行了检测和分析，结果发现，尽管Tim-3+NK细胞在外周免疫活性细胞中所占的比例没有发生明显升降，但是Tim-3在NK细胞表达的荧光密度在流产患者外周血中显著降低(如图5.1A所示)，进一步系统比较正常妊娠和反复自然流产患者外周Tim-3+NK细胞的差异，利用ATAC-seq技术检测和分析正常妊娠和反复自然流产患者外周Tim-3+NK细胞和Tim-3-NK细胞的染色质可接近性，主要成分分析结果显示，病人Tim-3+NK细胞和Tim-3-NK细胞与正常人NK细胞可以很好的区分开(如图5.1D所示)，聚类分析的结果与主要成分分析结果是一致的，提示Tim-3+NK细胞是与妊娠结局密切相关的功能细胞；进一步对流产患者和正常妊娠女性外周Tim-3+NK细胞进行比较和分析，发现流产患者Tim-3+NK细胞中有260个基因位点的染色质可接近性下降，360个基因位点的染色质可接近性升高(如图5.1E所示)，结合已知的人CD56+NK细胞的ChIP-seq结果分析，染色质可接近性降低的基因位点主要是增强子，而染色质可接近性升高的基因位点主要的是启动子，其中，TGF-β1的3’端的染色质可接近性降低最显著，与此同时，TGF-β1的启动子区域的染色质可接近性也明显降低，提示TGF-β1 3’端区域可能发挥着增强子的作用，与TGF-β1启动子协同调控TGF-β1的表达(如图5.1F所示)，IL-10的染色质可接近性也有同样的改变(如图5.1G所示)；
进一步检测NK细胞产生Th2、Th1型细胞因子和反应其杀伤活性的穿孔素perforin发现，由Tim-3+pNK细胞产生的Th2型细胞因子(L-4，IL-10及TGF-β1)在流产患者外周血明显下降，相反地，Th1型细胞因子(TNF-α、IFN-γ)则明显升高，Tim-3-pNK细胞产生的细胞因子水平在两种样本中并无明显的差异(如图5.1H，I所示)；同样地，Tim-3+pNK细胞而不是Tim-3-pNK细胞产生的穿孔素perforin在流产患者外周血中明显上调(如图5.1J所示)，提示流产患者外周NK细胞杀伤活性明显增强，而这主要是因为Tim-3+pNK细胞毒性的升高；
如图5.1B所示，流产患者外周血Gal-9分泌水平由正常情况下的1.84ng/ml下降到0.965ng/ml，另外，包括NK细胞自身在内的各外周免疫活性细胞(CD4+、CD8+T cells，CD14+单核细胞和CD11c+树突状细胞)产生Gal-9的水平也均有明显的下调(如图5.1C所示)；上述结果说明外周NK细胞Tim-3表达的降低及外周Gal-9产生水平的下调可能破坏了外周NK细胞通过分泌细胞因子和维持较低的杀伤活性而发挥的免疫耐受作用，进而导致自然流产。
实施例4：干扰Gal-9/Tim-3信号通路对妊娠结局的影响实验
基于已经验证了Gal-9/Tim-3在妊娠早期外周血中异常表达可能与自然流产有关，为了进一步解析这一对分子介导的信号通路对妊娠结局的影响及分子机制，本实验对正常和流产小鼠模型的Gal-9/Tim-3信号进行人为干预；首先建立正常和流产小鼠模型，比较早孕和中孕期小鼠外周(包括外周血和脾脏)NK细胞Tim-3的表达，结果显示，正常妊娠小鼠的早孕期外周NK细胞Tim-3表达高于中孕期，与人是一致的，也就是说Tim-3+NK细胞在妊娠早期富集；图5.1A的结果显示流产患者外周NK细胞Gal-9/Tim-3差异表达伴随NK细胞功能紊乱，本实验分析比较了Tim-3与Gal-9在正常妊娠模型和自然流产模型早孕期外周NK细胞上的表达，如图5.2A，B所示，相对于正常妊娠小鼠，自然流产小鼠NK细胞在外周血和脾脏中表达Tim-3和Gal-9的水平均明显下降，不仅如此，自然流产模型Tim-3+pNK产生Th2型细胞因子(IL-4，IL-10及TGF-β)的水平降低，而产生Th1型细胞因子的水平(TNF-α)则升高；流式细胞术分析颗粒酶A(GranzymeA，反映NK细胞的杀伤活性)也发现在自然流产模型外周Tim-3+NK细胞中的表达明显高于正常妊娠模型Tim-3+NK；分析脾脏中的上述指标，与外周血的结果是一致的；(图5.2C，D)显示了不管是在外周血还是，在脾脏，Tim-3-NK分泌细胞因子的功能和杀伤活性在正常妊娠和自热流产模型中几乎没有差异，结果表明Gal-9/Tim-3与妊娠外周NK细胞正常功能的发挥密切相关；
为了明确Tim-3/Gal-9在妊娠中的作用，本实验用重组的外源性的Gal-9和RM3-23(Tim-3信号通路的阻断剂)来干预妊娠小鼠体内Gal-9/Tim-3信号通路，正常妊娠模型和自然流产模型在用RMT3-23阻断Tim-3信号通路后，两组的胚胎吸收率均明显上升，正常妊娠模型由5％左右的胚胎吸收率增加至17％，而自然流产模型原本就较高的胚胎吸收率由约27％增加至约46％(图6A，D)；相应的，正常妊娠模型存活下来的胎仔数由10只降到6只，自然流产模型则由干预前的7只降到4只(如图6A，C所示)；尽管正常妊娠模型和自然流产模型的胚胎吸收率有明显的差异，但是存活的胚胎大小并无差异；然而，用RMT3-23注射小鼠后，两种模型的小鼠胚胎体积均明显小于未注射组，推测Tim-3信号的阻断不仅会影响胚胎吸收率，对胚胎的生长发育也有显著的抑制作用(如图6B，E所示)；为了证明Tim-3信号的阻断是否会对NK细胞的功能产生影响，本实验用流式细胞术检测分析了上述处理组小鼠的外周血和脾脏NK细胞，结果显示，注射了RMT3-23的小鼠其外周血中的NK细胞数量急剧降低，由处理前的5-10％降到1-2％，甚至达到删除水平，但是脾脏中的NK细胞数量并没有发生改变；进一步分析脾脏NK细胞的功能，发现正常妊娠小鼠脾脏NK细胞IL-4、IL-10、TGF-β的产生水平在阻断Tim-3信号后显著下降，TNF-α则显著上升，INF-上在阻断前后无明显差异；Tim-3信号阻断对正常妊娠脾脏NK细胞的作用在自然流产模型中体现得更加显著(如图6F所示)；对脾脏NK细胞颗粒酶A(Granzyme A)的检测发现，流产模型在Tim-3阻断后产生更高水平的Granzyme A，提示NK细胞的杀伤活性增强，而Tim-3阻断没有增强正常妊娠组NK细胞的杀伤活性，反而呈现出一定水平的降低，实验数据提示，Tim-3在正常妊娠过程中通过调节外周NK细胞的功能起保护作用，如果Tim-3所介导的信号通路被破坏，会影响外周NK细胞的功能甚至分化发育，从而影响妊娠的正常进行和胚胎的发育；
本实验给孕鼠注射外源性重组Gal-9，以期是否会对妊娠结局有所改善，结果显示，给予外源性Gal-9确实能在一定程度上改善妊娠结局：对于自然妊娠模型，能降低胚胎吸收率，增加存活的胎仔数，但对Tim-3阻断的自然流产模型和正常妊娠模型的妊娠结局无明显的改善作用；检测脾脏NK细胞的功能发现，注射Gal-9的自然流产模型的NK细胞IL-4、TGF-β的产生水平上升，INF-γ下降，GranzymeA也下降，而IL-10、TNF-α没有明显改变；预先用RMT3-23阻断Tim-3的正常妊娠模型和自然流产模型，给予Gal-9后NK细胞的细胞因子产生水平和杀伤活性均没有显著变化；上述实验数据说明，Gal-9是通过与其受体Tim-3结合并相互作用来调节外周NK细胞的功能从而维持正常妊娠顺利进行，如果Tim-3的信号通路被阻断，则Gal-9无法与Tim-3正常结合发挥调节作用(如图6所示)；
因此，Galectin-9/Tim-3信号通路异常会引起早孕外周血NK细胞功能紊乱致不良妊娠结局。
实施例5：过继转输Tim-3+NK细胞挽救妊娠失败实验
从正常妊娠小鼠的脾脏中流式分选出Tim-3+NK，Tim-3-NK和总NK细胞，分别将上述三种细胞重悬于200uLPBS中，经尾静脉注射过继转输给怀孕第4.5天的流产小鼠；用同样的方法从流产小鼠的脾脏中得到Tim-3+NK，Tim-3-NK和总NK细胞，Tim-3+NK，Tim-3-NK和其中一部分NK细胞用同样的方法过继转输给流产小鼠，另一部分NK细胞分别用IL-4和孕酮体外刺激，48小时后，再次流式分选Tim-3+NK，Tim-3-NK细胞，按照上述方法过继转输给流产小鼠，孕14.5天处死流产小鼠，观察胚胎吸收情况(如图7A所示)，结果显示，正常妊娠小鼠Tim-3+NK降低流产模型胚胎吸收率，而流产小鼠Tim-3+NK无显著作用，但是经过IL-4和孕酮刺激的Tim-3+NK细胞有效缓解流产模型高胚胎吸收率(图7D所示)；
建立NK细胞缺陷小鼠(Nfil3-/-)的早孕模型，于孕4.5天按上述方法过继转输正常妊娠Nfil3+/+小鼠脾脏的Tim-3+NK与Tim-3-NK细胞，于孕14.5天处死Nfil3-/-孕鼠，观察胚胎着床数与胚胎吸收率，结果显示过继转输Tim-3+NK细胞降低NK细胞缺陷小鼠的胚胎吸收率，过继转输Tim-3-NK细胞不影响妊娠结局(如图7E，F所示)。
Claims (8)
1.表达Tim-3的外周血NK细胞在制备自然流产生物标记物中的用途；所述的NK细胞具有免疫耐受表型和低细胞杀伤活性。
2.按权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的NK细胞优势表达IL-4、IL-10与TGF-β，低表达TNF-α；低细胞杀伤活性与Perforin表达率。
3.按权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的NK细胞在自然流产患者与小鼠模型中的细胞数量明显低于正常妊娠。
4.按权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的NK细胞在自然流产患者Tim-3+NK细胞TGF-β与IL-10启动子和增强子的染色质接近性降低。
5.按权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的NK细胞在自然流产患者与小鼠模型中的Tim-3+NK细胞表达IL-4与TGF-β下降，表达TNF-α上升；细胞杀伤活性与Perforin表达增高。
6.按权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的NK细胞拮抗Tim-3信号，影响NK细胞发育与免疫耐受表型，正常妊娠失败。
7.按权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的NK细胞过继转输Tim-3+NK细胞，挽救濒临死亡的胚胎。
8.表达Tim-3的外周血NK细胞作为自然流产的生物标记物在制备预测早期妊娠失败以及防治靶点中的用途。
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Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| JINTANG SUN等: "Tim-3 Is Upregulated in NK Cells during Early Pregnancy and Inhibits NK Cytotoxicity toward Trophoblast in Galectin-9 Dependent Pathway", 《PLOS ONE》 * |
| YAN-HONG LI等: "The Galectin-9/Tim-3 pathway is involved in the regulation of NK cell function at the maternal–fetal interface in early pregnancy", 《CELLULAR & MOLECULAR IMMUNOLOGY》 * |
| 张铭等: "Tim-3分子表达异常与原因不明复发性流产的关系", 《中国优生与遗传杂志》 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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