CN107227345A - 一种微生物样品dna保存液 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种生物样本保存液，尤其涉及一种微生物样品DNA保存液；本发明的微生物样品DNA保存液，其中在纯水中溶解有0.5～2mM/L的EDTA、饱和氯化钠(NaCl)、质量分数为2～5％的甲醇、质量分数为5‑15％的甘油、质量分数为5‑10％的脂肪醇聚氧乙烯醚、质量分数为1‑5％的十二烷基硫酸钠(SDS)以及混合的矿物油，并调节pH至6.0‑9.0；本发明的微生物样品DNA保存液，适用于常温下保存微生物样品、操作简单、适用性较好、可应用于大规模样品检测。

Description

一种微生物样品DNA保存液
技术领域
本发明涉及一种生物样本保存液，尤其涉及一种微生物样品DNA保存液。
背景技术
聚合酶链反应(PCR)是一种体外核酸扩增技术，在分子生物学和医学领域得到广泛应用。PCR检测技术的第一步是模板DNA的制备，即样本中DNA的提取，直接影响PCR反应的结果。随着PCR技术的发展，已经有许多提取基因组DNA的方法。但是要从现场的环境标本如土壤、灰尘和污水中，或是人体组织样本如粪便中，快速检测致病微生物，由于模板量少，再加上微生物脱离原有生存环境，往往导致原有微生物的丰度发生变化、DNA受损，使实验的敏感性大大降低，其中尤以肠道微生物的保存最为困难。
粪便离体后，其环境也发生了变化，例如无氧环境转变成有氧环境，其中提供微生物代谢的能量来源也进入只消耗而不补充的状态。与此同时，其中的部分细菌还保持了活性，继续代谢和生长，而由于环境的变化，不同细菌其增长与死亡的速率已经不同于排便前。因此，需要对粪便进行一些保存措施，尽量将其中微生物的构成稳定在刚刚离体时的状态，从而最好的代表大肠中的共生微生物。粪便采集之后，通过提取细菌的总DNA，扩增核糖体16S rRNA可变区，测序以及一系列生物信息学分析，可以了解粪便中的细菌构成，进一步研究其和人体健康疾病之间的关系。
现有技术中对于粪便微生物的保存，多采用低温冷冻的方法，例如中国专利公布号为CN102864138A的发明专利，公开了一种人类粪便DNA提取方法，即采用低温保存法，采集的粪便样本立即放于-20℃～-80℃，然而低温冷冻的方法需要大型设备配合使用，适用性较差，操作也较为复杂，不适于广泛的临床检测；常见的DNA保存液中，通常含有EDTA，虽然可以在常温下使用，然而这种DNA保存液并不适用于粪便微生物样品的DNA保存，具有使用局限性。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种适用于常温下保存微生物样品、操作简单、适用性较好、可应用于大规模样品检测的微生物样品DNA保存液。
本发明的微生物样品DNA保存液，其中在纯水中溶解有0.5～2mM/L的EDTA、饱和氯化钠(NaCl)、质量分数为2～5％的甲醇、质量分数为5-15％的甘油、质量分数为5-10％的脂肪醇聚氧乙烯醚、质量分数为1-5％的十二烷基硫酸钠(SDS)以及混合的矿物油，并调节pH至6.0-9.0。
进一步的，还包括质量分数为5-10％的二甲基亚砜(DMSO)。
具体的，所述二甲基亚砜(DMSO)的质量分数为8％。
进一步的，还包括质量分数为2-5％的乙醇。
具体的，所述乙醇的质量分数为3％。
具体的，所述微生物样品DNA保存液中溶解有1mM/L的EDTA。
具体的，所述甲醇的质量分数为4％。
具体的，所述甘油的质量分数为10％。
具体的，所述脂肪醇聚氧乙烯醚的质量分数为8％。
具体的，所述十二烷基硫酸钠(SDS)的质量分数为3％。
具体的，所述保存液调节pH至8.0。
应当说明的是，1)EDTA作为阳离子螯合剂，能使钙变成螯合物，从而能高效率地防止生物体反应或者酶反应；2)甲醇作为抗氧化剂，能预防羟基的产生游离；3)甘油，不仅具有由羟基(OH基)引起的防止氧化的效果，同时还具有作为防冻液在-20℃～4℃下稳定地保存微生物样品的作用，还有防止蛋白分解、抑制酶反应的效果；4)脂肪醇聚氧乙烯醚能加强表面活性，具有分散、渗透作用，进一步加入乙醇后，与其配合可增加其它成分在水中的分散能力，并减少甲醇等物质挥发逸出；5)乙醇和SDS作为变性剂，可以将微生物样品中的粘蛋白和球蛋白等有机物质进行变性处理，作为抑菌剂，可以防止微生物的丰度发生变化；6)二甲基亚砜是一种重要的渗透型细胞保护剂，DMSO能够快速穿透细胞膜进入细胞中，降低冰点、延缓冻存过程，同时提高细胞内离子浓度，减少细胞内冰晶的形成，从而减少细胞损伤，研究结果表明，培养液中DMSO浓度为10％时，细胞生长抑制率近100％，1‰浓度时抑制率为35％，即使是0.04‰的浓度，DMSO对细胞的生长也有不利的影响，可以避免微生物的丰度发生变化；7)矿物油又称石蜡油，是从原油分馏所得到的无色无味的混合物，它可以分成轻质矿物油及一般矿物油两种，而轻质矿物油的比重及黏稠度较低，其具有低致敏性及不错的封闭性，将微生物样品混入保存液后，矿物油浮于混合液上表面，可以有效阻隔空气，降低微生物的新陈代谢，对于厌氧性微生物还可以有效避免改变其生存环境，同时可以避免挥发性物质逸出。
借由上述方案，本发明至少具有以下优点：按照以上配方配制保存液，将采集的微生物样品，直接置于保存液中，无需冻存，即可达到稳定其中微生物构成的作用，也可适用于长途运输。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。
附图说明
图1是本发明志愿者4种处理方式下的肠道菌群香农多样性指数结果图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例一 样品来源及分组保存方式
由于粪便微生物样品的生物保存要求较高，本发明一较佳实施例采用人粪便微生物样品作为实验样品来进行如下实验。
S1、采集5位志愿者的粪便样本，每个志愿者的样品采集18份，分别做6种不同的处理，每种处理重复试验3次；
S2、不同处理方式
a、冻存一周(标号0)：采集至少0.2g粪便样品，液氮速冻后，-80℃下密封保存，保存一周后进行DNA提取，16S rRNA基因V3/V4可变区扩增，文库构建、测序等处理；
b、保存液保存一周(标号1-3)：采集至少0.2g粪便样品，使用本发明3种不同配方(成分如表1所示)室温下(25℃)密封，避光保存一周，然后进行DNA提取，16S rRNA基因V3/V4可变区扩增，文库构建、测序等处理；
c、保存液保存一周(标号4)：采集至少0.2g粪便样品，使用现有技术中常见的保存液配方(成分如表2所示)室温下(25℃)密封，避光保存一周，然后进行DNA提取，16S rRNA基因V3/V4可变区扩增，文库构建、测序等处理；
d、不做任何处理保存一周(标号5)：采集至少0.2g粪便样品，室温下(25℃)密封，避光保存一周，然后进行DNA提取，16S rRNA基因V3/V4可变区扩增，文库构建、测序等处理。
表1 本发明微生物样品DNA保存液配方
成分/标号 1 2 3
EDTA(mM/L) 2 1 0.5
NaCl 饱和 饱和 饱和
甲醇(％) 2 4 5
甘油(％) 5 10 15
脂肪醇聚氧乙烯醚(％) 5 8 10
SDS(％) 1 3 5
DMSO(％) 5 8 10
乙醇(％) 2 3 5
pH 9 8 6
表2 现有技术保存液成分表
乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na) 2％
异硫酸氰酸胍 0.47％
氯化钠(NaCl) 0.9％
pH 7.4
实施例二 粪便样本处理方法
本实施例提供一种对上述粪便样本的处理方法：
S1、对照组样品预处理：
固体粪便(对应样品标号为0和5)：
称取200mg固体粪便于2ml离心管中，加入800ul stool DNA Buffer A，充分震荡混匀5min左右，1800g离心1min；
从中取出50ul重悬液于干净的1.5ml离心管中，加入800ul Lysis-BindingBuffer旋涡震荡混匀，70℃裂解5min。离心5min后转移上清至干净的1.5ml离心管中。
S2、实验组样品预处理
粪便保存液(对应样品标号为1-4)：
取200ul半液体状态的粪便加入不超过10％(w/v)的stool DNA Buffer A进行稀释，充分震荡5min，从中取出50ul重悬液至干净的1.5ml离心管。
S3、DNA提取
a、加入混匀的磁珠20ul，旋涡震荡20s，室温静置4min，旋涡震荡20s，室温静置4min.
b、置于磁架上，静止20s，吸取上清。
c、加入500ulWash Buffer W1，旋涡震荡混匀磁珠20s。
d、置于磁架上，静置20s，弃上清。
e、重复步骤d一次，并尽量除去所有液体。
f、加入750ul Wash Buffer W2，旋涡震荡混匀磁珠20s。
g、置于磁架上，静置20s，弃上清。
h、重复步骤f-g一次，并尽量除去所有液体。
i、置于磁力架上开盖干燥7-8min，用枪吸弃所有的液体。
j、加入50ul Elution Buffer或ddH2O，旋涡震荡混匀磁珠15s。
k、65℃，7min(期间旋涡震荡一次，震荡10s)。旋涡震荡混匀磁珠15s。
l、置于磁力架上，静置2min，吸上清于收集管中。
S4、DNA测序
提取后的DNA送往测序公司进行建库测序，获得测序数据后进行后续生物信息分析，得到菌群结果。
实施例三 不同的保存方式样品菌群多样性比较
经过上述实验操作，获得了5位志愿者6种处理方式下的肠道菌群序列信息，通过生物信息学分析，计算菌群香农多样性指数，进行比较。各志愿者经检测后的香农指数如图1所示，统计后的结果如表3所示，表中香农多样性指数数值越高代表细菌的丰富程度越高，p value是标号0-4的样品与标号5的样品比对得到的差异性的可信度分析，结果表明，标号0-4的样品基本可以满足粪便微生物样品DNA的保存，然而与现有技术的保存液(标号4)相比，本发明的微生物样品保存液的处理效果更接近液氮速冻的处理方法，尤其是标号2配方的保存液。
表3 不同处理方式下香农指数结果
成分/标号 0 1 2 3 4 5
香农指数 9.5 7.5 9.4 8.5 6.3 3.2
P value ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.05 -
以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种微生物样品DNA保存液，其特征在于：其中在纯水中溶解有0.5～2mM/L的EDTA、饱和氯化钠、质量分数为2～5％的甲醇、质量分数为5-15％的甘油、质量分数为5-10％的脂肪醇聚氧乙烯醚、质量分数为1-5％的十二烷基硫酸钠以及混合的矿物油，并调节pH至6.0-9.0。
2.根据权利要求1所述的微生物样品DNA保存液，其特征在于：还包括质量分数为5-10％的二甲基亚砜。
3.根据权利要求2所述的微生物样品DNA保存液，其特征在于：所述二甲基亚砜的质量分数为8％。
4.根据权利要求1所述的微生物样品DNA保存液，其特征在于：还包括质量分数为2-5％的乙醇。
5.根据权利要求4所述的微生物样品DNA保存液，其特征在于：所述乙醇的质量分数为3％。
6.根据权利要求1所述的微生物样品DNA保存液，其特征在于：所述微生物样品DNA保存液中溶解有1mM/L的EDTA。
7.根据权利要求1所述的微生物样品DNA保存液，其特征在于：所述甲醇的质量分数为4％。
8.根据权利要求1所述的微生物样品DNA保存液，其特征在于：所述甘油的质量分数为10％。
9.根据权利要求1所述的微生物样品DNA保存液，其特征在于：所述脂肪醇聚氧乙烯醚的质量分数为8％。
10.根据权利要求1所述的微生物样品DNA保存液，其特征在于：所述十二烷基硫酸钠的质量分数为3％。
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