CN106456694B - 与循环肿瘤细胞相关的方法和测定法 - Google Patents

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Abstract

本文描述的技术涉及例如通过检测一些循环肿瘤细胞(CTC)标记基因的表达方面的改变来对CTC进行检测的方法。还可靶向CTC标记基因的异常表达(例如CTCs表达指征方面的改变)，从而治疗癌症。

Description

与循环肿瘤细胞相关的方法和测定法
相关申请的交叉引用
根据35U.S.C.§119(e)，本申请要求2013年12月20日递交的美国临时申请No.61/918,816和2014年2月10日递交的美国临时申请No.61/937,883的权益，以引用的方式将其内容整体并入本文。
政府支持
本发明是在由国立卫生研究院授予的基金号2R01CA129933的联邦基金的支持下完成。美国政府对本发明享有一定的权利。
技术领域
本文所述的技术涉及癌症的诊断和治疗。
背景技术
循环肿瘤细胞(CTCs)从原发肿瘤脱落进入血流，介导癌症向远端器官的扩散(转移)。因此，血流中存在的循环肿瘤细胞(CTCs)最终导致癌症扩散至远端器官。然而，CTCs极为罕见，估计每毫升血液的一百亿正常血细胞中有1到10个肿瘤细胞。就这一点而言，循环肿瘤细胞的分离和分子分析产生了明显的技术挑战(Pantel等，Nat Rev Cancer 2008 8：329-340；Yu等，J Cell Biol 2011 192：373-382)。
发明内容
如本文所述，本发明人识别了大量基因，该基因的表达为CTCs所特有的。具体而言，这些基因的表达区别了CTCs与原发肿瘤细胞。因此，本文提供了与CTCs的检测相关的方法和测定法(assays)，包括诊断和预后的方法和测定法。进而，本文提供了靶向这些CTCs标记(例如用来抑制转移)来对癌症进行的治疗。
在一个方面，本文所述的为检测样本中的循环肿瘤细胞(CTCs)的方法，所述方法包括：测量所述样本中的PC-CTC标记基因表达产物的水平；以及，如果检测到的所述标记基因表达产物的水平高于参比水平，则确定存在PC-CTCs。在一些实施方式中，所述CTCs为胰腺癌CTCs。在一些实施方式中，所述方法进一步包括从所述样本中分离所述CTCs的第一步骤。在一些实施方式中，所述表达产物为核酸。在一些实施方式中，利用选自于由如下所组成的组中的方法对所述表达产物的水平进行确定：RT-PCR；定量RT-PCR；Northern印迹；基于微阵列的表达分析；下一代测序以及RNA原位杂交。在一些实施方式中，所述表达产物为多肽。在一些实施方式中，利用选自于由如下所组成的组中的方法对所述表达产物的水平进行确定：Western印迹；免疫沉淀；酶联免疫吸附测定法(ELISA)；放射性免疫测定法(RIA)；夹心测定法；荧光原位杂交(FISH)；免疫组织学染色；放射性免疫分析测定法；免疫荧光测定法；质谱法；FACS以及免疫电泳测定法。在一些实施方式中，所述CTC标记基因选自表7或表8。在一些实施方式中，所述CTC标记基因选自于由如下所组成的组：ABI3BP；ADAMTS5；ADAMTSL1；ANG；ARSA；C1RL；C3；C4A；C4B；CCDC80；CD109；CHI3L1；CLEC3B；CMTM3；CMTM7；COL14A1；COL1A2；COL3A1；COL4A6；CSF1；DAG1；DCN；DMKN；FBLN1；FGF1；FMOD；GPC3；GPC4；HMGB1；IFNAR2；IGFBP5；IL16；LAMA4；LTBP4；MFAP1A；NID2；OGN；PDAP1；PF4；PLAT；PODN；PRELP；RSPO1；SERPING1；SLURP1；SOD3；SPARC；SPOCK2；SPON2；SULF1；SULF2；TGFB2；TGM2；THBD；THBS1；THSD4；TIMP2；TNXB；TPT1；TWSG1和WNT4。在一些实施方式中，所述CTC标记基因选自于由如下所组成的组：ALDH1A1；ALDH1A2；IGFBP5；KLF4；DCN；SPARC；WNT；TGFB2；VEGF；COL1A2；COL3A1和TIMP2。在一些实施方式中，所述CTC标记基因选自于由如下所组成的组：ALDH1A2；IGFBP5；KLF4；DCN和SPARC。
在一个方面，本文所述的为对受试者中的癌症进行治疗的方法，所述方法包括：向受试者给予治疗有效量的CTC标记基因靶向治疗剂(therapy)。在一些实施方式中，所述癌症为胰腺癌。在一些实施方式中，所述CTC标记基因靶向治疗剂包括CTC标记基因的抑制剂。在一些实施方式中，所述抑制剂为抗体试剂。在一些实施方式中，所述抑制剂为抑制性核酸试剂。在一些实施方式中，所述CTC标记基因靶向治疗剂包括CTC标记基因结合抗体试剂和化疗剂。在一些实施方式中，所述受试者为被确定具有升高水平的存在于血液和/或癌间质中的CTC标记基因和/或升高水平的CTCs的受试者。
在一个方面，本文所述的为确定受试者是否有可能对CTC标记基因靶向治疗剂的治疗作出响应的方法，所述方法包括：对存在于血液和/或癌间质中的CTC标记基因表达产物的水平进行测量；以及如果与参比水平相比，所述表达产物的水平升高，则确定受试者有可能对所述治疗作出响应。在一些实施方式中，所述方法进一步包括从所述样本中分离所述CTCs的第一步骤。在一些实施方式中，所述癌症为胰腺癌。在一些实施方式中，所述表达产物为核酸。在一些实施方式中，利用选自于由如下所组成的组中的方法对所述表达产物的水平进行确定：RT-PCR；定量RT-PCR；Northern印迹；基于微阵列的表达分析；下一代测序以及RNA原位杂交。在一些实施方式中，所述表达产物为多肽。在一些实施方式中，利用选自于由如下所组成的组中的方法对所述表达产物的水平进行确定：Western印迹；免疫沉淀；酶联免疫吸附测定法(ELISA)；放射性免疫测定法(RIA)；夹心测定法；荧光原位杂交(FISH)；免疫组织学染色；放射性免疫分析测定法；免疫荧光测定法；质谱法；FACS以及免疫电泳测定法。在一些实施方式中，所述PC-CTC标记基因选自表7或表8。在一些实施方式中，所述CTC标记基因选自于由如下所组成的组：ABI3BP；ADAMTS5；ADAMTSL1；ANG；ARSA；C1RL；C3；C4A；C4B；CCDC80；CD109；CHI3L1；CLEC3B；CMTM3；CMTM7；COL14A1；COL1A2；COL3A1；COL4A6；CSF1；DAG1；DCN；DMKN；FBLN1；FGF1；FMOD；GPC3；GPC4；HMGB1；IFNAR2；IGFBP5；IL16；LAMA4；LTBP4；MFAP1A；NID2；OGN；PDAP1；PF4；PLAT；PODN；PRELP；RSPO1；SERPING1；SLURP1；SOD3；SPARC；SPOCK2；SPON2；SULF1；SULF2；TGFB2；TGM2；THBD；THBS1；THSD4；TIMP2；TNXB；TPT1；TWSG1和WNT4。在一些实施方式中，所述CTC标记基因选自于由如下所组成的组：ALDH1A1；ALDH1A2；IGFBP5；KLF4；DCN；SPARC；WNT；TGFB2；VEGF；COL1A2；COL3A1和TIMP2。在一些实施方式中，所述CTC标记基因选自于由如下所组成的组：ALDH1A2；IGFBP5；KLF4；DCN和SPARC。
在一个方面，本文所述的为监测对受试者进行的治疗的方法，所述方法包括：向有需要的受试者给予癌症治疗剂；对存在于血液和/或癌间质中的CTC标记基因表达产物的水平进行测量；以及如果与参比水平相比，CTC标记基因表达产物的水平降低，则确定受试者作出响应，而如果与参比水平相比，CTC标记基因表达产物未降低，则确定受试者不对所述治疗作出响应。在一些实施方式中，所述癌症为胰腺癌。在一些实施方式中，所述参比水平为给予步骤之前的患者中的所述基因表达产物的水平。在一些实施方式中，所述方法进一步包括从所述样本中分离所述CTCs的第一步骤。在一些实施方式中，所述表达产物为核酸。在一些实施方式中，利用选自于由如下所组成的组中的方法对所述表达产物的水平进行确定：RT-PCR；定量RT-PCR；Northern印迹；基于微阵列的表达分析；下一代测序以及RNA原位杂交。在一些实施方式中，所述表达产物为多肽。在一些实施方式中，利用选自于由如下所组成的组中的方法对所述表达产物的水平进行确定：Western印迹；免疫沉淀；酶联免疫吸附测定法(ELISA)；放射性免疫测定法(RIA)；夹心测定法；荧光原位杂交(FISH)；免疫组织学染色；放射性免疫分析测定法；免疫荧光测定法；质谱法；FACS以及免疫电泳测定法。在一些实施方式中，所述PC-CTC标记基因选自表7或表8。在一些实施方式中，所述CTC标记基因选自于由如下所组成的组：ABI3BP；ADAMTS5；ADAMTSL1；ANG；ARSA；C1RL；C3；C4A；C4B；CCDC80；CD109；CHI3L1；CLEC3B；CMTM3；CMTM7；COL14A1；COL1A2；COL3A1；COL4A6；CSF1；DAG1；DCN；DMKN；FBLN1；FGF1；FMOD；GPC3；GPC4；HMGB1；IFNAR2；IGFBP5；IL16；LAMA4；LTBP4；MFAP1A；NID2；OGN；PDAP1；PF4；PLAT；PODN；PRELP；RSPO1；SERPING1；SLURP1；SOD3；SPARC；SPOCK2；SPON2；SULF1；SULF2；TGFB2；TGM2；THBD；THBS1；THSD4；TIMP2；TNXB；TPT1；TWSG1和WNT4。在一些实施方式中，所述CTC标记基因选自于由如下所组成的组：ALDH1A1；ALDH1A2；IGFBP5；KLF4；DCN；SPARC；WNT；TGFB2；VEGF；COL1A2；COL3A1和TIMP2。在一些实施方式中，所述CTC标记基因选自于由如下所组成的组：ALDH1A2；IGFBP5；KLF4；DCN和SPARC。
附图说明
图1A-图1C展示了CTCs的分离和表征。图1A描绘了CTC-iChip负IFD系统的示意图。图1B描绘了正常小鼠和癌症小鼠模型之间的小鼠WBC耗竭(depletion)的一致性的图。WBC耗竭以log10示出。图1C描绘了借助免疫荧光染色(CK+/CD45-/DAPI+)从正常小鼠和KPC小鼠计算的CTC的图表。
图2描绘了单细胞样本的主成分分析的示意图。
图3A-3B展示了上皮、间充质和干细胞基因在CTC-c细胞vs肿瘤中的差异化表达。描绘了在CTC-c细胞vs肿瘤中下调(图3A)和上调(图3B)的基因的箱形图。条＝中位值，箱形线＝四分位数，标度以log10(rpm)计。
图4A-图4C展示了CTC-iChip表征。图4A描绘了偏转的WBC的百分数(y轴)作为每WBC的抗-CD45珠的数量(x轴)的函数的图表。图4B描绘了加入正常的小鼠血液中的小鼠PDAC细胞系NB508的回收的图(示出4个独立实验)。图4C描绘了来自使用NB508细胞系的同基因型(syngeneic)正位PDAC肿瘤的所捕获的CTCs/mL血液的图。
图5A描绘了KPC小鼠的基因型和表征的表。图5B描绘了细胞系(NB508、MEF)、CTCs、WBC和来自匹配的原发肿瘤的经稀释的块状RNA(bulk RNA)的总的特有的比对(alignment)，以及具有经比对的读数的百分比(％)的单细胞测序的质量度量学的图表。图5C描绘了使用单细胞原发肿瘤(TuGMP3)、癌细胞系(NB508)和全部的CTCs(簇1、3、4、5和9)之间的以及各簇(右侧)的平均的簇内相关系数的单细胞异质性的图表。圆圈＝平均值，范围＝95％CI。
图6描绘了与块状原发肿瘤(bulk primary tumors)和单细胞原发肿瘤相比，CTC-c中富集的ECM蛋白基因的箱形图。条＝中位数，箱形线-四分位数，标度以log10(rpm)计。
图7描绘了来自3个患者的人胰腺CTCs表达谱热图。利用上皮基因定义CTCs，并示出富集的胞外蛋白。以log10标度示出表达。
图8描绘了人胰腺癌细胞系中的SPARC表达的定量RT-PCR的图表。
图9描绘了侵袭测定法。观察到具有针对SPARC的shRNA(ShF1和ShF3)的PDAC2和PDAC3细胞系侵袭穿过基底胶(Matrigel)减少。shNT＝非靶标shRNA。
图10描绘了通过非靶标shRNA(NT)和SPARC shRNA(SHF1)的体内荧光素酶成像而具有可检测转移的小鼠的数量的图表。
图11描绘了确定CTC异质性的过程的示意图。
图12A-图12C展示了在原发肿瘤的上皮和间质组分中发现的CTC富集的基因。描绘的是Aldh1a2干细胞(图12A)和CTC高度富集的基因Klf4(图12B)和Igfbp5基因(图12C)的表达箱形图。条＝中位数，箱形线＝四分位数，标度以log10(rpm)计。
图13展示了跨过不同的上皮癌的人和小鼠CTCs表达高水平的ECM蛋白基因。描绘了在人PDAC CTC、乳腺(br)CTC和前列腺(pr)CTC等中高度表达的ecm基因的表达箱形图。条，中位数；箱形线，四分位数；标度以log10(rpm)计。经holm校正的p值<0.05(*)、0.01(**)、0.001(***)。
图14A-图14E展示了人PDAC中的SPARC的表达增强了侵袭和转移。图14A描绘了通过MTT确定的PDAC3细胞系增殖的图表。图14B描绘了每43个视野中计数的PDAC3shNT vsshSPARC中的肿瘤球的图表(误差棒表示SD)。图14C描绘了通过每203个视野的核的数目定量的shSPARC和shNT细胞系的侵袭的图。p值<0.01(**)、0.001(***)、0.0001(****)。误差棒表示SD。图14D描绘了尾静脉接种PDAC3细胞系3周后通过体内荧光素酶成像而可检测的肺转移的百分数的图。示出Fisher精确检验的p值。图14E描绘了具有来自PDAC3细胞系的正位(orthotopic)胰腺肿瘤的小鼠中的归一化的转移负荷的图表。误差棒表示SD(*p<0.05)。
图15描绘了胰腺CTCs在转移级联中的作用的简要模型。示出了胰腺CTCs的异质性子类，并关注最显著的典型CTC群体，所述典型CTC群体被富集用于上皮(角蛋白)和间质(Sparc)基因的共表达。
图16A描绘了借助qRT-PCR的PDAC2shRNA细胞系的图表。平均值随着最大和最小RQ(误差棒)示出。图16B描绘了shNT和shSPARC稳定品系之间的借助MTT测定法的在PDAC2细胞系方面类似的增殖率的图表。图16C描绘了shNT和shSPARC细胞系之间在2周时形成的肿瘤球侵袭测定(误差棒＝STD)类似的图表。在4×放大视野下进行定量(误差棒＝SD)。通过在48小时时的侵袭测定法确定经由shSPARC_1和3降低的迁移行为(图16D)。
具体实施方式
如本文所述，本发明人发现循环肿瘤细胞(CTCs)的特征在于一些基因(即，CTC标记基因)的表达。这些CTC标记基因的发现使得能够有用于对CTC水平(例如，来自受试者的样本中的CTC水平)进行测量和/或检测的方法和测定法。这些方法和测定法可提供在CTC水平的测量方面改进的速度和精确度。进而，由于这些标记基因的表达将CTCs与其它细胞相区别(例如，其它循环细胞和/或正常肿瘤细胞)，治疗剂可通过结合至和/或抑制这些标记基因表达产物来降低CTCs的转移潜力和/或水平，从而被靶向针对CTCs。
本文所使用的“循环肿瘤细胞”或“CTC”是指从肿瘤脱落并在血液中(即在循环中)存在的肿瘤细胞。可用于从血液的其它成分中识别和/或分离CTCs的细胞标记(例如标记基因)在下文中加以描述。在一些实施方式中，CTC可为胰腺癌CTC。
在一个方面，本文所述的为检测样本中的循环肿瘤细胞(CTCs)的方法，所述方法包括：测量样本中的CTC标记基因的表达产物水平；以及如果检测到的所述标记基因表达产物的水平高于参比水平，则确定存在CTCs。
如本文所述，本发明人发现，在CTCs中大量基因被差异化地调控(例如，与非循环肿瘤细胞相比)。因此，本文提供的方法和测定法涉及CTC水平的测定。升高的CTC水平可表明不良预后，例如升高的转移风险。因此，本文所提供的是涉及患有癌症的受试者的治疗、预后和风险评价的方法和测定法。在一些实施方式中，方法和测定法涉及对受试者的生物样本中的基因产物(例如蛋白和/或基因转录物如mRNA)的表达水平进行确定和/或测量。在一些实施方式中，测定法和方法涉及确定受试者的生物样本中的至少两种基因的基因产物的表达水平(即，选自如本文所述的表7、表8和/或表14的至少2种基因、至少3种基因、至少4种基因、至少5种基因、至少6种基因、至少7种基因、至少8种基因、至少9种基因、至少10种基因…至少15种基因…至少25种基因…至少30种基因或更多基因，或任意数量的基因)。
在一些实施方式中，所述标记基因选自于由如下所组成的组：ABI3BP；ADAMTS5；ADAMTSL1；ANG；ARSA；C1RL；C3；C4A；C4B；CCDC80；CD109；CHI3L1；CLEC3B；CMTM3；CMTM7；COL14A1；COL1A2；COL3A1；COL4A6；CSF1；DAG1；DCN；DMKN；FBLN1；FGF1；FMOD；GPC3；GPC4；HMGB1；IFNAR2；IGFBP5；IL16；LAMA4；LTBP4；MFAP1A；NID2；OGN；PDAP1；PF4；PLAT；PODN；PRELP；RSPO1；SERPING1；SLURP1；SOD3；SPARC；SPOCK2；SPON2；SULF1；SULF2；TGFB2；TGM2；THBD；THBS1；THSD4；TIMP2；TNXB；TPT1；TWSG1和WNT4。在一些实施方式中，本文所述的测定法、方法和系统涉及确定受试者的生物样本中的至少两种基因的基因产物的表达水平，例如至少2种基因、或至少3种基因、或至少4种基因、或例如如下的全部基因：ABI3BP；ADAMTS5；ADAMTSL1；ANG；ARSA；C1RL；C3；C4A；C4B；CCDC80；CD109；CHI3L1；CLEC3B；CMTM3；CMTM7；COL14A1；COL1A2；COL3A1；COL4A6；CSF1；DAG1；DCN；DMKN；FBLN1；FGF1；FMOD；GPC3；GPC4；HMGB1；IFNAR2；IGFBP5；IL16；LAMA4；LTBP4；MFAP1A；NID2；OGN；PDAP1；PF4；PLAT；PODN；PRELP；RSPO1；SERPING1；SLURP1；SOD3；SPARC；SPOCK2；SPON2；SULF1；SULF2；TGFB2；TGM2；THBD；THBS1；THSD4；TIMP2；TNXB；TPT1；TWSG1和WNT4。
在一些实施方式中，所述标记基因选自于由如下所组成的组：ALDH1A1；ALDH1A2；IGFBP5；KLF4；DCN；SPARC；WNT；TGFB2；VEGF；COL1A2；COL3A1和TIMP2。在一些实施方式中，本文所述的测定法、方法和系统涉及确定受试者的生物样本中的至少两种基因的基因产物的表达水平，例如至少2种基因、或至少3种基因、或至少4种基因、或例如如下的全部基因：ALDH1A1；ALDH1A2；IGFBP5；KLF4；DCN；SPARC；WNT；TGFB2；VEGF；COL1A2；COL3A1和TIMP2。
在一些实施方式中，所述标记基因选自于由如下所组成的组：ALDH1A2；IGFBP5；KLF4；DCN和SPARC。在一些实施方式中，本文所述的测定法、方法和系统涉及确定受试者的生物样本中的至少两种基因的基因产物的表达水平，例如至少2种基因、或至少3种基因、或至少4种基因、或例如如下的全部基因：ALDH1A2；IGFBP5；KLF4；DCN和SPARC。
在一些实施方式中，所述标记基因选自于由如下所组成的组：ALDH1A2；IGFBP5；KLF4和DCN。在一些实施方式中，本文所述的测定法、方法和系统涉及确定受试者的生物样本中的至少两种基因的基因产物的表达水平，例如至少2种基因、或至少3种基因、或例如如下的全部基因：ALDH1A2；IGFBP5；KLF4和DCN。
在一些实施方式中，所述标记基因选自于由如下所组成的组：TPT1；HMGB1；SPON2；SPARC和ARSA。在一些实施方式中，本文所述的测定法、方法和系统涉及确定受试者的生物样本中的至种两个基因的基因产物的表达水平，例如至少2种基因、或至少3种基因、或至少4种基因、或例如如下的全部基因：TPT1；HMGB1；SPON 2；SPARC和ARSA。
在一些实施方式中，所述标记基因选自于由如下所组成的组：IL6ST；ARSA；TIMP2；CD55；SULF2；ITGA6；SDC4；CDON和SV2A。在一些实施方式中，本文所述的测定法、方法和系统涉及确定受试者的生物样本中的至少两种基因的基因产物的表达水平，例如至少2种基因、或至少3种基因、或至少4种基因、或至少5种基因、或至少6种基因、或至少7种基因、或至少8种基因、或例如如下的全部基因：IL6ST；ARSA；TIMP2；CD55；SULF2；ITGA6；SDC4；CDON和SV2A。在一些实施方式中，如本文所述，例如由于细胞表面蛋白的RNA水平低于多肽水平，对选自于由如下所组成的组中的标记基因的多肽表达产物的水平进行确定：IL6ST；ARSA；TIMP2；CD55；SULF2；ITGA6；SDC4；CDON和SV2A。
表7：示例性的小鼠标记基因
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表8：示例性的人类标记基因
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表7和表8中列出的基因名称为惯用名称。表7或表8中列出的各基因的NCBI基因ID号可通过使用惯用名称作为查询物检索NCBI“基因”数据库(可在万维网https:// www.ncbi.nlm.nih.gov/上得到)并选择首个返回的智人(Homo sapiens)基因(对于表8中的基因)或小鼠(Mus musculus)基因(对于表7中的基因)而获得。可使用UCSC基因组浏览器(可在万维网https://genome.ucsc.edu上得到)的基因分选器功能获得其它基因。可易于识别小鼠基因的人类同源物，例如在NCBI数据库或通过查询数据库(例如BLAST)识别的同源物。在一些实施方式中，标记基因选自表7、表8或表14中列出的基因。
在CTC中，表7、表8或表14中列出的标记基因可被上调，例如，对于表7、表8或表14中列出的标记基因而言，如果与标记基因表达的参比水平相比，在细胞或样本中测得的标记基因表达较高，则所述细胞被识别为CTC和/或样品被识别为包含CTCs。优选地，一度关注的是统计学上显著的改变。然而，即便组中的少数基因并未与正常的不同，如果组的整体改变表现为显著的改变、优选统计学上显著的改变，则样本可被识别为包含CTCs。在本文考虑之列的是两种以上的所指出的标记的全部可能组合。
表7、表8或表14中的标记基因的基因表达产物水平比起所述标记基因的参比水平更高，比起参比量更高至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约80％、至少约100％、至少约200％、至少约300％、至少约500％或至少约1000％或更多，则指示存在CTC。
在一些实施方式中，参比可为在不为CTCs的细胞群体或细胞中的标记基因产物的表达水平，例如非循环肿瘤细胞和/或不为癌细胞的循环细胞中的平均水平。在一些实施方式中，参比也可为对照样本、对照个体的汇集样本中的标记基因产物的表达水平，或者具有相同基础的数值或数值范围。
在一些实施方式中，本文所述的方法和测定法包括：(a)将基因表达产物转化为可检测的基因靶标；(b)测量所述可检测的基因靶标的量；以及(c)将可检测的基因靶标的量与参比的量进行对比，如果所述可检测基因靶标的量与所述参比水平的量具有统计学上显著的差别，则确定CTCs的存在和/或水平。在一些实施方式中，如果所述可检测基因靶标的量与所述参比水平的量相比不存在统计学上显著的差别，所述样本被识别为不包含CTCs。
本文中所使用的术语“转化”(transforming或transformation)是指将对象或物质(例如，生物样本、核酸或蛋白)转变为另一物质。该转化可以是物理的、生物的或化学的。示例性的物理转化包括但不限于：生物样本的预处理，例如，通过差速离心从全血转化为血清。生物/化学转化可以涉及反应中的至少一种酶和/或化学试剂。例如，DNA样本可以通过一种或多种限制性酶消化成为片段、或可以用连接酶将外源性分子连接至片段化的DNA样本。在一些实施方式中，DNA样本可以通过例如聚合酶链式反应(PCR)进行酶促复制。
用于测量与本文所述的标记基因相关的基因表达产物的方法是本领域技术人员所公知的。此类用于测量基因表达产物(例如蛋白水平)的方法包括ELISA(酶联免疫吸附测定法)、western印迹、FACS、放射性免疫测定法(RIA)；夹心测定法；荧光原位杂交(FISH)；免疫组织学染色；免疫电泳；使用检测试剂(例如抗体或蛋白结合试剂)的免疫荧光以及免疫沉淀。或者，可以通过向受试者中引入经标记的抗肽抗体和其它类型的检测试剂来测定受试者中的肽。例如，抗体可用放射性标记物标记，受试者中的放射性标记物的存在和位置通过标准的成像技术检测。
例如，用于本文所述的标记基因的多肽表达产物的抗体是可商购得到的并可用于本发明的目的以测量蛋白表达水平，例如抗IGFBP5(Cat.No.4255；Abcam；Cambridge，MA)。或者，由于用于本文所述的标记基因的氨基酸序列已知并在NCBI网站上公开可得，本领域技术人员可以针对用于本发明目的的感兴趣的这些蛋白产生它们特有的抗体。本文所述的标记基因的氨基酸序列对于不同的物种(例如人、小鼠和大鼠)分配有NCBI登记号。
在一些实施方式中，可以使用免疫组织化学(“IHC”)和免疫细胞化学(“ICC”)技术。IHC是将免疫化学应用于组织切片；而ICC是将免疫化学应用于经过特定的细胞学制剂(例如基于液体的制剂)处理之后的细胞或组织印记。免疫化学是基于抗体的使用的技术家族，其中，抗体被用于特异性靶向胞内分子或细胞表面的分子。抗体通常包含标记物，标记物将进行生化反应，从而在遇到靶向分子时经历颜色改变。在一些实例中，信号放大可以被整合到特定的方案中，其中，在使用特异性的一抗之后使用包含标记物染色或标记物信号的二抗。
在一些实施方式中，所述测定法可以是Western印迹分析。或者，可以通过二维凝胶电泳系统将蛋白分离。二维凝胶电泳在本领域中是公知的，通常涉及沿第一维度的等电聚焦以及随后的沿第二维度的SDS-PAGE电泳。这些方法也需要相当大量的细胞材料。2DSDS-PAGE凝胶的分析可以通过确定凝胶上的蛋白斑的强度进行、或可采用免疫测定进行。在其它实施方式中，可以借助质谱分析蛋白样本。
免疫学测试可以与本文所述的方法和测定法一起使用，并且所述免疫学测试包括例如使用下述技术的竞争性和非竞争性检测系统，例如：Western印迹、放射性免疫测定法(RIA)、ELISA(酶联免疫吸附测定法)、“夹心”免疫测定法、免疫沉淀测定法、免疫扩散测定法、凝集测定法如乳胶凝集、补体结合测定法、免疫放射测定法、荧光免疫测定法如FIA(荧光偶联免疫测定法)、化学发光免疫测定法(CLIA)、电化学发光免疫测定法(ECLIA)、计数免疫测定法(CIA)、侧流测试或侧流免疫测定法(LFIA)、磁性免疫测定法(MIA)和蛋白A免疫测定法。只要能够得到合适的抗体试剂，在本领域中已知用于实施此类测定法的方法。在一些实施方式中，免疫测定法可以是定量免疫测定法或半定量免疫测定法。
免疫测定法是生化测试，利用抗体或抗体与其抗原的相互作用来测量生物样本(通常是流体样本例如血清)中的物质的浓度。该测定法利用抗体与其抗原的高度特异性结合。对于本文所述的方法和测定法，在免疫测定法中发生靶多肽与本文所述的各自的蛋白或蛋白片段、分离的肽或融合蛋白的特异性结合，从而形成靶蛋白/肽复合物。然后，通过本领域已知的各种方法测定复合物。免疫测定法还经常涉及检测抗体的使用。
酶联免疫吸附测定法也称为ELISA、酶免疫测定法或EIA，是主要在免疫学中用来检测样本中的抗体或抗原的存在的生化技术。ELISA已在医学和植物病理学中用作诊断工具，并在各种行业中用于质量控制检查。
在一个实施方式中，还可进行涉及对于特定的期望抗原(即，本文所述的标记基因多肽)而言特异性的至少一种抗体的ELISA。将已知量的样本和/或抗原固定在固体支持物(通常是聚苯乙烯微滴定板)上。固定化可以是非特异性的(例如，通过吸附至表面)或特异性的(例如，其中利用固定在表面上的另一抗体来捕获抗原或一抗)。当抗原被固定后，加入检测抗体，与抗原形成复合物。检测抗体可与酶共价连接、或者检测抗体自身可以通过由生物缀合连接到酶的二抗来检测。在各步骤之间，滴定板通常用温和的洗涤剂溶液洗涤，以移除非特定结合的任何蛋白或抗体。在最后的洗涤步骤之后，通过添加酶底物以产生可见的信号对滴定板进行显影，表明样本中的抗原的量。老法ELISA(Older ELISAs)利用发色底物，然而较新的测定法采用具有更高灵敏度的荧光底物。
在另一实施方式中，使用竞争性ELISA。将针对靶多肽或其片段的纯化的抗体包被在多孔板的固相上，即缀合至固体表面。还需要不缀合于任何固体支持物上的第二批纯化抗体。这些非缀合的纯化抗体被标记用于测定目的，例如，用辣根过氧化物酶标记以产生可检测的信号。将来自受试者的样本(例如肿瘤、血液、血清或尿液)与已知量的期望抗原(例如含有靶多肽的已知体积或浓度的样本)以及辣根过氧化物酶标记的抗体混合，然后将混合物加入到经包被的孔中以形成竞争性结合。孵育后，如果样本中的多肽水平高，将形成经标记的抗体试剂-抗原的复合物。这一复合物在溶液中是游离的，可被洗涤掉。洗涤孔将会移除复合物。然后将孔用TMB(3,3′,5,5′-四甲基联苯胺)显色底物孵育，用于定位孔中的辣根过氧化物酶缀合的抗体。如果样本中的靶多肽水平高，将不存在颜色变化或几乎不存在颜色变化。如果样本中几乎没有靶多肽存在或没有靶多肽存在，形成不同的复合物，固体支持物的复合物结合抗体试剂-靶多肽。这一复合物被固定在板上，且在洗涤步骤中不会被洗涤掉。随后用TMB孵育将会产生一些颜色变化。此类竞争性ELISA测试是特异性的、敏感的、可再现的和易于操作的。
本领域的技术人员公知的是，存在其它的不同形式的ELISA。本领域中已知的ELISA标准技术在“Methods in Immunodiagnosis”，第2版，Rose和Bigazzi编，John Wiley&Sons，1980；以及Oellerich，M.，1984，J.Clin.Chem.Clin.Biochem.22:895-904中描述。由此以引用的方式将这些参考文献整体并入本文。
在一个实施方式中，可以通过侧流免疫测定法测试(LFIA)对样本中的多肽的水平进行检测，所述侧流免疫测定法测试也被称为免疫层析测定法或条带测试。LFIA是旨在检测流体样本中的抗原(例如多肽)的存在(或不存在)的简单的装置。目前有许多LFIA测试被用于医疗诊断，其目的在于家庭测试、即时检验或实验室应用。LFIA测试是免疫测定法的一种形式，其中，测试样本借助毛细作用流经固体底物。在将样本施加至测试条带之后，样本遇见结合至微粒的有色试剂(通常包含对于测试靶抗原而言特异性的抗体)，该有色试剂与样本混合并且转移至用另一抗体或抗原预处理的底物相遇线或区带。根据存在于样本中的靶多肽的水平，有色试剂可以被捕获，并在测试线或区带处结合。LFIA本质上是适合于沿单轴操作以适应测试条带形式或浸量条带(dipstick)形式的免疫检测。条带测试是极其多用途的，并且可以由本领域技术人员很容易地进行修饰以用于测定来自流体样本(如尿液、血液、水)和/或均质化肿瘤样本等的大范围的抗原。条带测试也被称为浸量条带测试，其名称来自于将测试条带“浸渍”入待测试的流体样本的字面作用。LFIA条带测试很容易使用，需要最少的培训，并可以容易地被包括作为待用于现场实地的即时检验(point-of-caretest，POCT)诊断的组分。LFIA测试可作为竞争性或夹心测定法进行操作。夹心LFIA类似于夹心ELISA。样本首先接触用针对靶抗原产生的抗体标记的有色颗粒。测试线还将含有针对相同靶点的抗体，虽然它可以结合至抗原上的不同表位。在阳性样本中，测试线将显示为有色带。在一些实施方式中，侧流免疫测定法可以是双抗体夹心测定法、竞争性测定法、定量测定法或它们的变型。竞争性LFIA类似于竞争性ELISA。样本首先接触用靶抗原或类似物标记的有色颗粒。测试线包含针对靶点/其类似物的抗体。样本中的未标记的抗原将会阻断抗体上的结合位点，防止吸收有色颗粒。在阴性样本中，测试线将显示为有色带。存在大量侧流技术的变型。也可以利用多个捕获区以创建多元测试。
“浸量条带”或LFIA测试条带和其它固体支持物的使用已在本领域中大量抗原生物标记物的免疫测定法的上下文中描述。美国专利号4,943,522、6,485,982、6,187,598、5,770,460、5,622,871、6,565,808；美国专利申请系列号10/278,676、美国专利申请系列号09/579,673和美国专利申请系列号10/717,082(以引用的方式将其整体并入本文)是此类侧流测试装置的非限制性实例。描述使用“浸量条带”技术以通过免疫化学测定法检测可溶性抗原的专利的实例包括但不限于美国专利号4,444,880、4,305,924和4,135,884，以引用的方式将其整体并入本文。这三项专利的设备和方法大体上描述了：在测定条带上的成分-抗原复合物之前，将第一成分固定至“浸量条带”上的固体表面，所述“浸量条带”暴露至含有可溶性抗原的溶液，所述可溶性抗原结合固定在“浸量条带”上的成分。对于对这一“浸量条带”技术进行修饰用于利用本文所述的抗体试剂测定多肽的教导是在本领域技术人员的技术范围之内。
其它技术可用于检测样本中的多肽的水平。此类技术中的一种是斑点印迹法，所述斑点印迹法为Western印迹的改编版(Towbin等，Proc.Nat.Acad.Sci.76:4350(1979))。在Western印迹中，多肽或其片段可用洗涤剂和加热进行解离，并在被转移到固体支持物(如硝酸纤维素膜或PVDF膜)之前在SDS-PAGE凝胶上进行分离。用对靶多肽或其片段具有特异性的抗体试剂孵育该膜。然后，将膜进行洗涤，以移除未结合的蛋白和具有非特异性结合的蛋白。然后，可检测的经标记的酶联二抗或检测抗体可被用于检测和评价所测试的样本中的多肽的量。来自可检测标签的信号强度对应于所存在的酶的量，并因此对应于多肽的量。可以例如通过光密度法对所述水平进行量化。
流式细胞术是用于分析和分选悬浮在流体流中的细胞(或其它小颗粒)的公知技术。该技术使得能够对流经光学、电子或磁检测装置的单细胞的物理和/或化学特征同时进行分析。用于FACS时，流式细胞仪由流动池组成，所述流动池运输流体流中的细胞，使其单行通过激发经荧光标记的检测标记物(例如抗体试剂)的光源，并测量细胞的荧光特征。随后，将流体流喷射穿过喷嘴和充电环(charging ring)，在压力下将流体破碎为液滴。对流动池装置和流体流进行校准，使得单个细胞或细胞结合组之间存在相对大的间距，从而使得任何液滴包含多于一个单细胞或细胞结合组的概率小。充电环基于液滴中包含的细胞的荧光特征对液滴充电。随后通过静电充电偏转系统(electrostatically-chargeddeflection system)将带电液滴偏转，所述静电充电偏转系统基于液滴的电荷(与细胞的荧光强度相关)将液滴转移至多个容器中。FACS系统(例如FACSARIATM流式细胞仪(BDBiosciences)和FLOWJOTM7.6.4版本(TreeStar))能够检测并记录总细胞数以及展示出一种或多种荧光特征的细胞的数量，例如被一种或多种对于CTC标记基因而言特异性的抗体试剂结合的细胞的总数。
在一些实施方式中，可替代性地通过确定与本文所述的标记基因相关的基因的信使RNA(mRNA)的表达水平来确定本文所述的基因表达产物。此类分子可以从生物样本(如肿瘤活检物)中分离、衍生或扩增。mRNA表达的检测对于本领域技术人员是已知的，并且包括例如但不限于：PCR程序、RT-PCR、定量PCR或RT-PCR、Northern印迹分析、差异基因表达、RNA保护测定法、微阵列分析、杂交方法、下一代测序等。下一代测序技术的非限制性的实例可以包括：Ion Torrent、Illumina、SOLiD、454；大规模平行签名测序固相、可逆性染色-终止子测序；以及DNA纳米球测序。
通常，PCR程序描述了基因扩增的方法，所述方法包括：(i)引物与核酸样本或文库内的特定基因或序列进行序列特异性杂交；(ii)后续扩增，涉及使用耐热DNA聚合酶进行的退火、延伸和变性的多个循环；以及(iii)筛查对于具有正确大小的带而言的PCR产物。所使用的引物是寡核苷酸，所述寡核苷酸具有足够的长度和适当的序列以提供聚合作用的起始，即各引物是专门设计为互补于待扩增的基因组基因座的链。在替代的实施方式中，本文所述的基因表达产物的mRNA水平可以通过逆转录(RT)PCR以及通过定量RT-PCR(QRT-PCR)或实时PCR方法加以确定。RT-PCR和QRT-PCR的方法在本领域中是公知的。本文所述的标记基因的核酸序列对于不同的物种(例如人、小鼠和大鼠)分配有NCBI登记号。因此，本领域技术人员可以基于已知序列设计合适的引物以确定相应基因的mRNA水平。
可以使用本领域所公知的大量程序中的任何一个从特定的生物学样本中分离核酸和核糖核酸(RNA)分子，所选择的特定的分离程序适合于特定的生物学样本。例如，冻融和碱裂解程序可以用于从固体材料中获得核酸分子；加热和碱裂解程序可用于从尿中获得核酸分子；以及蛋白酶K提取可以用来从血液中获得核酸(Roiff，A等，PCR:ClinicalDiagnostics and Research，Springer(1994))。
通常，PCR程序描述了基因扩增的方法，所述方法包括：(i)引物与核酸样本或文库内的特定基因进行序列特异性杂交；(ii)后续扩增，涉及使用DNA聚合酶进行的退火、延伸和变性的多个循环；以及(iii)筛查对于具有正确大小的带而言的PCR产物。所使用的引物是寡核苷酸，所述寡核苷酸具有足够的长度和适当的序列以提供聚合作用的起始，即各引物是专门设计为互补于待扩增的核酸分子的各条链。
在另一实施方式中，本文所述的基因表达产物的mRNA水平可以通过逆转录(RT)PCR、以及通过定量RT-PCR(QRT-PCR)或实时PCR方法加以确定。RT-PCR和QRT-PCR的方法在本领域中是公知的。
在一些实施方式中，本文所述的一种或多种试剂(例如，抗体试剂和/或核酸探针)可包括可检测的标记物和/或包括产生可检测信号的能力(例如，通过催化反应将化合物转化为可检测的产物)。可检测标记物可以包括例如：吸光染料、荧光染料或放射性标记物。可检测标记物、检测可检测标记物的方法以及将可检测标记物纳入试剂(例如，抗体和核酸探针)中的方法在本领域中是公知的。
在一些实施方式中，可检测标记物可以包括可通过如下测定的标记物：光谱手段；光化学手段；生物化学手段；免疫化学手段；电磁手段；放射化学手段；或化学手段，例如荧光手段、化学荧光手段、或化学发光手段、或任何其它适当的手段。本文所述的方法中使用的可检测标记物可以是一级标记物(其中，标记物包含可被直接测定的部分或产生可被直接测定部分的部分)或二级标记物(其中，可检测标记物结合至另一部分以产生可测定的信号，例如，如同在免疫标记中使用二抗和三抗一样常见)。可检测标记物可通过共价或非共价的手段连接至试剂。或者，可检测标记物可以例如通过直接标记如下分子而得以偶联，该分子通过配体-受体结合对布置(ligand-receptor binding pair arrangement)或其它的此类特异性识别分子来实现与试剂结合。可检测标记物可以包括但不限于：放射性同位素、生物发光化合物、发色团、抗体、化学发光化合物、荧光化合物、金属螯合物和酶。
在其它实施方式中，将检测试剂用荧光化合物进行标记。当荧光标记的抗体暴露至具有适当波长的光时，由于荧光，荧光标记抗体的存在可以被检测。在一些实施方式中，可测定的标记物可以是荧光染料分子或荧光团，包括但不限于：荧光素、藻红蛋白、藻蓝蛋白、邻苯二醛、荧光胺、Cy3TM、Cy5TM、别藻蓝蛋白(allophycocyanine)、德克萨斯红、peridenin叶绿素、青色素、串联缀合物如藻红蛋白-Cy5TM、绿色荧光蛋白、罗丹明、异硫氰酸荧光素(FITC)和Oregon GreenTM、罗丹明及衍生物(例如，德克萨斯红和四罗丹明异硫氰酸酯(tetrarhodimine isothiocynate，TRITC))、生物素、藻红蛋白、AMCA、CyDyesTM、6-羧基荧光素(6-carboxyfhiorescein；通常缩写为FAM和F)、6-羧基-2’,4’,7’,4,7-六氯荧光素(6-carboxy-2’,4’,7’,4,7-hexachlorofiuorescein，HEX)、6-羧基-4’,5’-二氯-2’,7’-二甲氧基荧光素(JOE或J)、N,N,N’,N’-四甲基-6羧基罗丹明(TAMRA或T)、6-羧基-X-罗丹明(ROX或R)、5-羧基罗丹明-6G(R6G5或G5)、6-羧基罗丹明-6G(R6G6或G6)和罗丹明110；青色素染料，例如Cy3、Cy5和Cy7染料；香豆素，例如伞形酮；苯甲亚胺染料，例如Hoechst 33258；菲啶染料，例如德克萨斯红；乙锭染料；吖啶染料；咔唑染料；吩噁嗪染料；卟啉染料；聚甲炔染料，例如青色素染料如Cy3、Cy5等；BODIPY染料和喹啉染料。在一些实施方式中，可测定标记物可以是放射性标记物，包括但不限于：3H、125I、35S、14C、32P和33P。在一些实施方式中，可检测标记物可以是酶，包括但不限于：辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶。酶标记物可以产生例如化学发光信号、有色信号或荧光信号。考虑用于可检测地标记物抗体试剂的酶包括但不限于：苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、δ-V-类固醇异构酶、酵母醇脱氢酶、α-磷酸甘油脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、过氧化氢酶、葡萄糖-VI-磷酸脱氢酶、葡萄糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶。在一些实施方式中，可检测标记物是化学发光标记物，包括但不限于：光泽精、鲁米诺、荧光素、异鲁米诺、theromatic吖啶酯、咪唑、吖啶盐和草酸酯。在一些实施方式中，可测定标记物可以是光谱比色标记物，包括但不限于：胶体金或者有色玻璃或塑料(例如，聚苯乙烯、聚丙烯和乳胶)珠。
在一些实施方式中，检测试剂还可用可检测标签(例如c-Myc、HA、VSV-G、HSV、FLAG、V5、HIS或生物素)进行标记。还可使用其它的检测系统，例如，生物素-链霉亲和素系统。在这一系统中，与感兴趣的生物标记具有免疫反应性(即，特异性)的抗体是生物素化的。结合至生物标记的生物素化抗体的量使用链霉亲和素-过氧化物酶缀合物和显色底物加以确定。此类链霉亲和素过氧化物酶检测试剂盒是可商购得到的，例如，来自DAKO，Carpinteria，CA。试剂还可以使用荧光发射金属(例如152Eu或镧系的其它金属)进行可检测地标记。可以使用金属螯合基团将此类金属连接至试剂，所述金属螯合基团如二乙烯三胺五乙酸(DTPA)或乙二胺四乙酸(EDTA)。
在本文所述的任何方面的一些实施方式中，可以同时确定(例如，多重检测)或平行确定多于一个基因的表达产物的水平。在一些实施方式中，确定不超过200个其它基因的表达产物的水平。在一些实施方式中，确定不超过100个其它基因的表达产物的水平。在一些实施方式中，确定不超过20个其它基因的表达产物的水平。在一些实施方式中，确定不超过10个其它基因的表达产物的水平。
本文所使用的术语“样本”或“测试样本”是指从生物有机体获取或分离的样本，例如来自受试者的肿瘤样本。示例性的生物样本包括但不限于：生物流体样本、血清、血浆、尿液、唾液、肿瘤样本、肿瘤活检物和/或组织样本等。该术语还包括上述样本的混合物。术语“测试样本”还包括未处理或经预处理的(或经预加工的)生物学样本。在一些实施方式中，测试样本可以包括来自受试者的细胞。在一些实施方式中，测试样本可以是肿瘤细胞测试样本，例如样本可以包括癌细胞、来自肿瘤的细胞和/或肿瘤活检物。在一些实施方式中，测试样本可以是血液样本。
测试样本可通过从受试者中移除细胞样本而获得，但也可以通过使用先前分离的细胞(例如，在之前的时间点分离以及由同一人或另一人分离)来完成。此外，测试样本可以是新鲜采集或以前采集的样本。
在一些实施方式中，测试样本可以是未经处理的测试样本。本文所使用的短语“未经处理的测试样本”是指如下测试样本，所述测试样本除了稀释和/或悬浮在溶液中外没有任何预先的样本前处理。用于处理测试样本的示例性的方法包括但不限于：离心、过滤、超声、匀浆、加热、冷冻、融解以及它们的组合。在一些实施方式中，测试样本可以是冷冻的测试样本，例如冷冻的组织。在采用本文所述的方法、测定法和系统之前，可将冷冻的样本融解。融解后，冷冻的样本可被离心，然后用于本文所述的方法、测定法和系统。在一些实施方式中，测试样本是澄清的测试样本，例如，通过离心和采集包含澄清的测试样本的上清液。在一些实施方式中，测试样本可以是预加工的测试样本，例如，选自于由如下所组成的组中的处理所产生的上清液或滤液：离心、过滤、融解、纯化以及它们的任意组合。在一些实施方式中，测试样本可以用化学和/或生物试剂处理。化学和/或生物试剂可用于在处理过程中保护和/或保持样本的稳定性，所述样本包括其中的生物分子(例如，核酸和蛋白)。一种示例性的试剂是蛋白酶抑制剂，通常用于在加工过程中保护或保持蛋白的稳定性。本领域技术人员熟知适合对用于确定本文所述的表达产物的水平所需要的生物学样本进行预加工的方法和过程。
在一些实施方式中，本文所述的方法、测定法和系统可以进一步包括从受试者获得测试样本的步骤。在一些实施方式中，受试者可以是人类受试者。
在一些实施方式中，本文所述的方法和测定法可进一步包括如下步骤：在测量本文所述的一个或多个标记基因的表达产物的水平之前，从样本中分离CTCs或潜在的CTCs。作为非限制性实例，可通过基于流体动力学的大小的分离和/或存在于血液样本中的其它细胞类型的免疫耗竭(immunodepletetion)，从例如血液样本中分离CTCs。本文实施例中描述的CTC-iChip结合了这两种方式来分离CTCs。
具有高水平或至少可检测水平的CTCs的受试者更可能得益于特异性地靶向CTCs的治疗剂的治疗。由此，本文提供了确定受试者是否有可能对CTC标记基因靶向治疗剂的治疗作出响应的方法，所述方法包括：对存在于血液和/或癌间质中的CTC标记基因表达产物的水平进行测量；以及如果与参比水平相比，所述表达产物的水平升高，则确定受试者有可能对所述治疗作出响应。CTC标记基因靶向治疗剂在下文中讨论。
在给予治疗剂后的CTCs的水平降低可为受试者状况改善(例如，癌症的大小、生长和/或转移潜力降低)的指征。由此，本文提供了监测对受试者进行的治疗的方法，所述方法包括：向有需要的受试者给予癌症治疗剂；对存在于血液和/或癌间质中的CTC标记基因表达产物的水平进行测量；以及如果与参比水平相比，CTC标记基因表达产物的水平降低，则确定受试者作出响应；如果与参比水平相比，CTC标记基因表达产物未降低，则确定受试者不对所述治疗作出响应。在一些实施方式中，所述治疗剂为化学治疗剂、外科手术治疗剂(surgical therapy)和/或放射治疗剂。在一些实施方式中，所述治疗剂为CTC标记基因靶向治疗剂。在一些实施方式中，所述参比水平为在给予步骤之前的患者中的基因表达产物的水平。
本文所述的CTC标记基因可被直接靶向和/或用于物理靶向化疗剂，从而降低CTCs的水平和/或致病活性(例如转移活性)。由此，本文所述的为对受试者中的癌症进行治疗的方法，所述方法包括向受试者给予治疗有效量的CTC标记基因靶向治疗剂。在一些实施方式中，所述受试者为被确定具有升高水平的存在于血液和/或癌间质中的CTC标记基因和/或升高水平的CTCs的受试者。
在一些实施方式中，CTC标记基因靶向治疗剂可包括CTC标记基因的抑制剂，例如CTC标记基因靶向治疗剂可抑制CTC标记基因的水平和/或活性。本文使用的术语“抑制剂”指的是能够将所靶向的表达产物(例如编码靶标的mRNA或靶多肽)的表达和/或活性降低例如至少10％以上(例如10％以上、50％以上、70％以上、80％以上、90％以上、95％以上或98％以上)的试剂。可通过例如测量CTC标记基因的活性和/或表达产物的水平，对CTC标记基因的抑制剂的效力(例如其降低CTC标记基因的水平和/或活性的能力)加以确定。用于测量给定的mRNA和/或多肽的水平的方法为本领域技术人员所知晓，例如可利用RT-PCR用引物确定RNA水平，可利用Western印迹用抗体确定多肽水平。可通过例如使用本领域所知晓和本文其它部分描述的方法对CTCs的存活率和/或水平进行测量，来确定例如CTC标记基因的活性。在一些实施方式中，CTC标记基因的抑制剂可为抑制性核酸、适体、抗体试剂、抗体或小分子。
在一些实施方式中，CTC标记基因的抑制剂可为抗体试剂。无论是衍生自天然产生抗体的任何物种，还是通过重组DNA技术创建，无论是否分离自血清、B细胞、杂交瘤、转染瘤、酵母或细菌，本文使用的“抗体”是指IgG、IgM、IgA、IgD或IgE分子或者它们的抗原特异性抗体片段(包括但不限于Fab、F(ab’)2，Fv、二硫键连接的Fv、scFv、单域抗体、封闭构象多特异性抗体、二硫键连接的scfv、双特异抗体)。
本文所述的“抗原”是通过抗体试剂上的结合位点结合的分子。一般，抗原通过抗体配体结合并能够引发体内的抗体应答。抗原可以是多肽、蛋白、核酸或其它分子或者它们的部分。术语“抗原决定簇”是指通过抗原结合分子、特别是通过所述分子的抗原结合位点识别的抗原上的表位。
本文所使用的术语“抗体试剂”是指多肽，所述多肽包含至少一个免疫球蛋白可变结构域或免疫球蛋白可变结构域序列，并特异性地结合给定的抗原。抗体试剂可包括抗体或含有抗体的抗原结合结构域的多肽。在一些实施方式中，抗体试剂可包括单克隆抗体或含有单克隆抗体的抗原结合结构域的多肽。例如，抗体可包含重(H)链可变区(本文中缩写为VH)以及轻(L)链可变区(本文中缩写为VL)。在另一实例中，抗体包含两个重(H)链可变区和两个轻(L)链可变区。术语“抗体试剂”涵盖了抗体的抗原结合片段(例如单链抗体、Fab片段和sFab片段、F(ab’)2、Fd片段、Fv片段、scFv和结构域抗体(dAb)片段(参见例如de Wildt等，Eur J.Immunol.1996；26(3):629-39；以引用的方式将其整体并入本文))以及完整抗体。抗体可具有IgA、IgG、IgE、IgD、IgM(以及它们的亚型和它们的组合)的结构特点。抗体可来自于任何来源，包括小鼠抗体、兔抗体、猪抗体、大鼠抗体和灵长类动物(人和非人灵长类动物)抗体、以及灵长类动物化抗体。抗体还包括midibodies、人源化抗体、嵌合抗体等。
VH区和VL区可进一步细分为高变区(称为“互补决定区”(“CDR”))和穿插的更为保守的区域(称为“框架区”(“FR”))。框架区和CDR的范围已被精确定义(参见Kabat，E.A.等，(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，U.S.Department ofHealth and Human Services，NIH Publication No.91-3242；以及Chothia，C.等(1987)J.Mol.Biol.196:901-917；以引用的方式将其整体并入本文)。各VH和VL通常由三个CDR和四个FR组成，从氨基末端到羧基末端按照以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
术语“抗原结合片段”或者“抗原结合结构域”在本文中可互换使用，用于指全长抗体的一个或多个片段，所述片段保留了特异性地结合至感兴趣的靶标的能力。术语全长抗体的“抗原结合片段”所涵盖的结合片段的实例包括：(i)Fab片段，由VL结构域、VH结构域、CL结构域和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab’)2片段，包含在铰链区通过二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)Fd片段，由VH结构域和CH1结构域组成；(iv)Fv片段，由抗体单臂的VL结构域和VH结构域组成；(v)dAb片段(Ward等，(1989)Nature 341：544-546；以引用的方式将其整体并入本文)，由VH结构域或VL结构域组成；以及(vi)保留了特异性的抗原结合功能的分离的互补决定区(CDR)。本文所使用的术语“特异性结合”是指两个分子、化合物、细胞和/或颗粒之间的化学相互作用，其中，与第一实体结合至非靶标的第三实体相比，第一实体以更高的特异性和亲和力与第二靶实体结合。在一些实施方式中，特异性结合可以指与第一实体对第三非靶标实体的亲和力相比，第一实体对第二靶标实体的亲和力为至少10倍、至少50倍、至少100倍、至少500倍、至少1000倍或者更高。
此外，如本文所述，用于人的治疗的重组人源化抗体可以进一步被优化，以降低潜在的免疫原性，同时保持功能活性。在这方面，功能活性是指多肽能够显示与本文所述的该多肽的重组抗体或抗体试剂相关的一种或多种已知的功能活性。此类功能活性包括例如结合至给定的CRC标记基因的能力。
在一些实施方式中，CTC标记基因的抑制剂可为抑制性核酸试剂。在一些实施方式中，抑制性核酸为抑制性RNA(iRNA)。双链RNA分子(dsRNA)已显示出以称为RNA干扰(RNAi)的高度保守的调控机制阻断基因表达。本文所述的抑制核酸可以包括具有长度为30个或更少的核苷酸(即，长度为15-30个核苷酸、长度通常为19-24个核苷酸)的区域的RNA链(反义链)，该区域实质上与靶向mRNA转录物的至少一部分互补。使用这些iRNA使得可以靶向降解mRNA转录物，引起靶标的表达和/或活性降低。
本文所使用的术语“iRNA”是指含有本文所定义的术语RNA、并通过RNA诱导的沉默复合物(RISC)通路来介导RNA转录物的靶向切割的试剂。在一个实施方式中，本文所述的iRNA引起靶mRNA的表达和/或活性的抑制。在一些实施方式中，与不存在iRNA的细胞中发现的靶mRNA水平相比，用抑制剂(例如iRNA)接触细胞造成细胞中的靶mRNA水平降低至少约5％、约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％、约99％、上至并包括100％。
在一些实施方式中，iRNA可以是dsRNA。dsRNA包括两条RNA链，两条RNA链充分互补，以在使用dsRNA的情况下杂交形成双链结构。dsRNA的一条链(反义链)包括互补区域，该区域与靶序列大体上互补、且通常完全互补。靶序列可以衍生自在靶标的表达过程中形成的mRNA的序列。另一条链(正义链)包含互补于反义链的区域，从而使得当在适当的条件下结合时，两条链杂交并形成双链结构。通常，双链结构的长度介于15至30个碱基对之间，包括端值；长度更通常在18至25个碱基对之间，包括端值；长度更通常在19至24个碱基对之间，包括端值；并且长度最通常在19至21个碱基对之间，包括端值。类似地，与靶序列互补的区域的长度介于15至30个核苷酸之间，包括端值；长度更通常在18至25个核苷酸之间，包括端值；长度更通常在19至24个核苷酸之间，包括端值；并且长度最通常在19至21个核苷酸之间，包括端值。在一些实施方式中，dsRNA的长度介于15至20个核苷酸之间，包括端值；在其它实施方式中，dsRNA的长度介于25和30个核苷酸之间，包括端值。正如普通技术人员会认识到的，靶向用于切割的RNA的靶向区域最通常是较大的RNA分子(通常是mRNA分子)的一部分。相关地，mRNA靶标的“部分”是具有足以成为RNAi引导的切割(RNAi-directedcleavage)(即，通过RISC通路切割)的底物的长度的mRNA靶标的连续序列。在一些情况下，具有短至9个碱基对的双链的dsRNA可以介导RNAi引导的RNA切割。最常见的靶标是至少15个核苷酸的长度、优选15-30个核苷酸的长度。
在又一实施方式中，iRNA(例如dsRNA)的RNA为化学修饰的，以增强稳定性或其它有益的特性。可以通过本领域完善建立的方法修饰和/或合成作为本发明特征的核酸，例如描述于“Current protocols in nucleic acid chemistry”，Beaucage，S.L.等(编)，JohnWiley&Sons，Inc.，New York，NY，USA中的方法，以引用的方式由此将其并入本文。修饰包括：例如(a)末端修饰，例如5’端修饰(磷酸化、缀合、反向连接等)、3’端修饰(缀合、DNA核苷酸、反向连接等)；(b)碱基修饰，例如，用稳定碱基、不稳定碱基、或与扩大库中的伴侣配对的碱基进行的置换；移除碱基(脱碱基核苷酸)或缀合碱基；(c)糖修饰(例如，在2’位或4’位)或糖置换；以及(d)骨架修饰，包括磷酸二酯连接的修饰或置换。用于本文所述的实施方式中的RNA化合物的具体实例包括但不限于含有经修饰的骨架或无天然核苷间连接的RNA。其中，具有经修饰的骨架的RNA包括在骨架中不具有磷原子的RNA。为了本申请文件的目的，如本领域有时所引用的，在核苷间的骨架中不具有磷原子的经修饰的RNA也可以被认为是寡核苷酸。在特定的实施方式中，经修饰的RNA将会在其核苷间的骨架中具有磷原子。
经修饰的RNA骨架可以包括例如：具有正常的3’-5’连接的boranophosphates、磷硫酰、手性磷硫酰、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其它烷基膦酸酯(包括3’-亚烷基膦酸酯和手性膦酸酯)、亚磷酸酯、氨基磷酸酯(包括3’-氨基磷酸氨基酯和氨基烷基氨基磷酸酯)、硫羰氨基磷酸酯(thionophosphoramidates)、硫羰烷基膦酸酯(thionoalkylphosphonates)和硫羰烷基磷酸三酯；它们的2’-5’连接的类似物；以及具有反极性的物质(其中，相邻的核苷单元对以3’-5’至5’-3’或2’-5’至5’-2’连接)。各种盐、混合盐和游离酸形式也包括在内。教导制备上述含磷连接的代表性的美国专利包括但不限于：美国专利号3,687,808、4,469,863、4,476,301、5,023,243、5,177,195、5,188,897、5,264,423、5,276,019、5,278,302、5,286,717、5,321,131、5,399,676、5,405,939、5,453,496、5,455,233、5,466,677、5,476,925、5,519,126、5,536,821、5,541,316、5,550,111、5,563,253、5,571,799、5,587,361、5,625,050、6,028,188、6,124,445、6,160,109、6,169,170、6,172,209、6,239,265、6,277,603、6,326,199、6,346,614、6,444,423、6,531,590、6,534,639、6,608,035、6,683,167、6,835,826、6,858,715、6,867,289、6,867,294、6,878,805、7,015,315、7,041,816、7,273,933、7,321,029、7,834,171、7,919,612、7,960,360、7,989,603、8,309,707、6,524,681和美国专利RE39464，以引用的方式将其各自并入本文。
在骨架中不包含磷原子的经修饰的RNA骨架具有通过如下形成的骨架：短链烷基或环烷基核苷间连接、混合的杂原子和烷基或环烷基核苷间连接、或者一个或多个短链杂原子或杂环核苷间连接。这些骨架包括：具有吗啉代连接(部分上由核苷的糖部分形成)的骨架；硅氧烷骨架；硫化物骨架、亚砜骨架或砜骨架；formacetyl骨架和thioformacetyl骨架；methylene formacetyl骨架和methylene thioformacetyl骨架；含烯烃骨架；氨基磺酸酯骨架；亚甲基亚氨基骨架和亚甲基肼基骨架；磺酸酯骨架和磺胺骨架；酰胺骨架；以及其它的具有混合的N、O、S和CH2组成部分的骨架。教导制备上述寡核苷酸的代表性的美国专利包括但不限于：美国专利号5,034,506、5,166,315、5,185,444、5,214,134、5,216,141、5,235,033、5,64,562、5,264,564、5,405,938、5,434,257、5,466,677、5,470,967、5,489,677、5,541,307、5,561,225、5,596,086、5,602,240、5,608,046、5,610,289、5,618,704、5,623,070、5,663,312、5,633,360、5,677,437和5,677,439，以引用的方式将其各自并入本文。
适于或考虑用于iRNA中的其它RNA模拟物中，核苷酸单元的糖和核苷间连接(即骨架)用新的基团所取代。碱基单元被保留用于与适当的核酸靶化合物杂交。一种此类寡聚化合物(已显示具有良好的杂交性质的RNA模拟物)被称为肽核酸(PNA)。在PNA化合物中，RNA的糖骨架被含酰胺骨架(特别是氨基乙基甘氨酸骨架)取代。核碱基保留并且直接或间接地结合至骨架的酰胺部分的氮杂氮原子。教导制备PNA化合物的代表性的美国专利包括但不限于：美国专利号5,539,082、5,714,331和5,719,262，以引用的方式将其各自并入本文。PNA化合物的进一步教导可例如Nielsen等，Science，1991，254，1497-1500。
本发明中的一些特色的实施方式包括：具有磷硫酰骨架的RNA和具有杂原子骨架的寡核苷酸，特别是上述引用的美国专利号5,489,677中的--CH2--NH--CH2--、--CH2--N(CH3)--O--CH2--[称为亚甲基(甲基亚氨基)骨架或MMI骨架]、--CH2--O--N(CH3)--CH2--、--CH2--N(CH3)--N(CH3)--CH2--和--N(CH3)--CH2--CH2--[其中，天然磷酸二酯骨架表示为--O--P--O--CH2--]；以及上述引用的美国专利号5,602,240中的酰胺骨架。在一些实施方式中，本文的特色的RNA具有上面上述引用的美国专利号5,034,506的吗啉代骨架结构。
经修饰的RNA还可以包含一个或多个取代的糖部分。本文的特色的iRNA(例如dsRNA)在2’位置可以包含如下中的一种：OH；F；O-烷基、S-烷基或N-烷基；O-烯基、S-烯基或N-烯基；O-炔基、S-炔基或N-炔基；或者O-烷基-O-烷基，其中，烷基、烯基和炔基可以是取代或未取代的C1-C10烷基或C2-C10烯基或C2-C10炔基。示例性的适当的修饰包括：O[(CH2)nO]mCH3、O(CH2)nOCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2和O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2，其中，n和m分别为从1至约10。在其它实施方式中，dsRNA在2’位置包含如下中的一种：C1-C10低级烷基；取代的低级烷基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基；SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2；杂环烷基、杂环烷芳基、氨基烷氨基、多烷基氨基、取代的甲硅烷基、RNA切割基团、报告子基团、嵌入剂、改善iRNA的药代动力学性质的基团、或改善iRNA的药效动力学性质的基团、以及具有类似性质的其它取代基。在一些实施方式中，所述修饰包括2’-甲氧基乙氧基(2’-O--CH2CH2OCH3，也称为2’-O-(2-甲氧基乙基)或2’-MOE)(Martin等，Helv.Chim.Acta，1995，78:486-504)，即烷氧基-烷氧基基团。另一示例性的修饰是如下文的实施例所述的2’-二甲基氨基氧基乙氧基，即O(CH2)2ON(CH3)2基团，又称为2’-DMAOE；以及如下文的实施例所述的2’-二甲基氨基乙氧基乙氧基(在本领域也称为2’-O-二甲基氨基乙氧基乙基或2’-DMAEOE)，即2’-O--CH2--O--CH2--N(CH2)2。
其它修饰包括2’-甲氧基(2’-OCH3)、2’-氨基丙氧基(2’-OCH2CH2CH2NH2)和2’-氟(2’-F)。类似的修饰也可以在iRNA的RNA上的其它位置进行，特别是2’-5’连接的dsRNA中或3’末端核苷酸上的糖的3’位、以及5’末端核苷酸的5’位置。iRNA也可以具有糖模拟物，例如取代戊呋喃糖的环丁基部分。教导制备此类经修饰的糖结构的代表性的美国专利包括但不限于：美国专利号4,981,957、5,118,800、5,319,080、5,359,044、5,393,878、5,446,137、5,466,786、5,514,785、5,519,134、5,567,811、5,576,427、5,591,722、5,597,909、5,610,300、5,627,053、5,639,873、5,646,265、5,658,873、5,670,633、5,700,920、8,084,600、8,124,745和8,377,644，并以引用的方式将其各自并入本文。
iRNA还可包括核碱基(在本领域通常仅仅称作“碱基”)修饰或置换。本文所使用的“未修饰的”或“天然的”核碱基包括：嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)；以及嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。经修饰的核碱基包括其它合成和天然的核碱基，例如：5-甲基胞嘧啶(5-me-C)；5-羟甲基胞嘧啶；黄嘌呤；次黄嘌呤；2-氨基腺嘌呤；腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基衍生物和其它烷基衍生物；腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基衍生物和其它烷基衍生物；2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶；5-卤素尿嘧啶和5-卤素胞嘧啶；5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶；6-偶氮尿嘧啶、6-偶氮胞嘧啶和6-偶氮胸腺嘧啶；5-尿嘧啶(假尿嘧啶)；4-硫尿嘧啶；8-卤素、8-氨基、8-硫醇、8-硫代烷基、8-羟基和其它的8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤；5-卤素(特别是5-溴)、5-三氟甲基和其它的5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶；7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤；8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤；7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤以及3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。进一步的核碱基包括：在美国专利号3,687,808公开的碱基；在Modified Nucleosides in Biochemistry，Biotechnology and Medicine，Herdewijn，P.编，Wiley-VCH，2008中公开的碱基；在The Concise Encyclopedia Of Polymer ScienceAnd Engineering，858-859页，Kroschwitz，J.L编，John Wiley&Sons，1990中公开的碱基；通过Englisch等，Angewandte Chemie，International Edition，1991，30，613公开的碱基；以及通过Sanghvi，Y S.，dsRNA Research and Applications，第15章，289-302页，Crooke，S.T.和Lebleu，B.编，CRC Press，1993公开的碱基。这些核碱基中的一些对于增高本发明中的特色的寡聚化合物的结合亲和力是特别有用的。这些核碱基包括：5-取代的嘧啶；6-氮杂嘧啶；以及N-2、N-6和O-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。已表明5-甲基胞嘧啶置换增高了核酸双链稳定性0.6-1.2℃(Sanghvi，Y.S.，Crooke，S.T.和Lebleu，B.编，dsRNA Research and Applications，CRC Press，BocaRaton，1993，276-278页)，并且是示例性的碱基置换，甚至更特别是当与2'-O-甲氧乙基糖修饰组合时。
教导制备一些上述经修饰的核碱基以及其它经修饰的核碱基的代表性的美国专利包括但不限于上面提到的美国专利号3,687,808，及美国专利号4,845,205、5,130,30、5,134,066、5,175,273、5,367,066、5,432,272、5,457,187、5,459,255、5,484,908、5,502,177、5,525,711、5,552,540、5,587,469、5,594,121、5,596,091、5,614,617、5,681,941、6,015,886、6,147,200、6,166,197、6,222,025、6,235,887、6,380,368、6,528,640、6,639,062、6,617,438、7,045,610、7,427,672和7,495,088，以引用的方式将其各自并入本文；以及美国专利号5,750,692，以引用的方式将其也并入本文。
iRNA的RNA也可以被修饰成包含一个或多个锁核酸(LNA)。锁核酸是具有经修饰的核糖部分的核苷酸，其中，所述核糖部分包含连接2’位和4’位碳原子的另外的桥。这一结构有效地将核糖“锁定”在3’-内向结构构象中。已经表明，将锁核酸添加至siRNA增加了血清中的siRNA的稳定性，并降低了脱靶效应(Elmen，J.等，(2005)Nucleic Acids Research 33(1):439-447；Mook，OR.等，(2007)Mol Canc Ther 6(3):833-843；Grunweller，A.等，(2003)Nucleic Acids Research 31(12):3185-3193)。教导制备锁核酸核苷酸的代表性的美国专利包括但不限于如下：美国专利号6,268,490、6,670,461、6,794,499、6,998,484、7,053,207、7,084,125和7,399,845，以引用的方式将其各自整体并入本文。
本发明中的特色的iRNA的RNA的另一修饰涉及将一个或多个配体、部分或缀合物在化学上连接至RNA，所述配体、部分或缀合物增强了iRNA的细胞摄取、活性、细胞分布或药代动力学性质。此类部分包括但不限于：脂质部分如胆固醇部分(Letsinger等，Proc.Natl.Acid.Sci.USA，1989，86:6553-6556)；胆酸(Manoharan等，Biorg.Med.Chem.Let.，1994，4:1053-1060)；硫醚，例如beryl-S-三苯甲基硫醇(Manoharan等，Ann.N.Y.Acad.Sci.，1992，660:306-309；Manoharan等，Biorg.Med.Chem.Let.，1993，3:2765-2770)；硫代胆固醇(Oberhauser等，Nucl.Acids Res.，1992，20:533-538)；脂肪链，例如十二烷二醇或十一烷基残基(Saison-Behmoaras等，EMBO J，1991，10:1111-1118；Kabanov等，FEBS Lett.，1990，259:327-330；Svinarchuk等，Biochimie，1993，75:49-54)；磷脂，例如二-十六烷基-消旋-甘油或三乙基铵1,2-二-O-十六烷基-消旋-甘油-3-磷酸酯(Manoharan等，Tetrahedron Lett.，1995，36:3651-3654；Shea等，Nucl.Acids Res.，1990，18:3777-3783)；聚胺或聚乙二醇链(Manoharan等，Nucleosides&Nucleotides，1995，14:969-973)，或金刚烷乙酸(Manoharan等，Tetrahedron Lett.，1995，36:3651-3654)；棕榈酰部分(Mishra等，Biochim.Biophys.Acta，1995，1264:229-237)；或十八胺或己基氨基-羰基氧基胆固醇部分(Crooke等，J.Pharmacol.Exp.Ther.，1996，277:923-937)。
在一些实施方式中，CTC标记基因靶向治疗剂可包括结合至CTC标记基因表达产物的试剂以及作为化疗剂的试剂。在一些实施方式中，CTC标记基因靶向治疗剂包括CTC标记基因结合抗体试剂和化疗剂。CTC标记基因结合抗体试剂可为结合例如CTC标记基因多肽的抗体试剂。结合抗体试剂可为抑制剂或其本身不表现出抑制效果的试剂。通过结合至CTC标记基因，从而结合CTC，使得化疗剂在肿瘤间质和/或循环的CTC细胞处浓缩并局部化，增强效力并减少副作用。
在一些实施方式中，CTC标记基因靶向治疗剂包括CTC标记基因结合抗体试剂，所述CTC标记基因结合抗体试剂结合选自表14的标记基因。在一些实施方式中，CTC标记基因靶向治疗剂包括CTC标记基因结合抗体试剂，所述CTC标记基因结合抗体试剂结合选自于由IL6ST、SULF2和SV2A所组成的组中的标记基因。
本文所使用的术语“化疗剂”是指在治疗特征为异常的细胞生长的疾病中具有治疗有效性的任何化学试剂或生物试剂。此类疾病包括肿瘤、赘生物、癌症以及特征为增生性生长的疾病。这些试剂的作用可在于抑制癌细胞持续增殖所依赖的细胞活性。在所有的实施方式的一些方面中，化疗剂是细胞周期抑制剂或细胞分裂抑制剂。在本发明的方法中有用的化疗剂的类别包括：烷化剂/生物碱剂、抗代谢物、激素或激素类似物、以及各种各样的抗肿瘤药物。这些试剂中的大多数直接或间接地对癌细胞具有毒性。在一个实施方式中，化疗剂是放射性分子。本领域技术人员可以容易地识别有用的化疗剂(例如参见Slapak和Kufe，Principles of Cancer Therapy，Harrison’s Principles of Internal Medicine中的第86章，第14版；Perry等，Chemotherapy，Abeloff，Clinical Oncology中的第17章，第2版，2000，Churchill Livingstone，Inc；Baltzer L，Berkery R(编)：Oncology PocketGuide to Chemotherapy，第2版，St.Louis，Mosby-Year Book，1995；Fischer D S，Knobf MF，Durivage H J(编)：The Cancer Chemotherapy Handbook第4版，St.Louis，Mosby-YearBook，1993)。在一些实施方式中，化疗剂可以是细胞毒性化疗剂。本文所使用的术语“细胞毒性试剂”是指抑制或防止细胞的功能和/或引起细胞的破坏的物质。该术语旨在包含放射性同位素(例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32和Lu的放射性同位素)；化疗剂；以及毒素，例如小分子毒素，或细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素；包括它们的片段和/或变体。
化疗剂的非限制性实例可以包括吉西他滨、顺铂(cisplastin)、紫杉醇、卡铂(carboplatin)、硼替佐米、AMG479、伏立诺他(vorinostat)、利妥昔单抗、替莫唑胺、雷帕霉素、ABT-737、PI-103；烷化剂，例如噻替哌(thiotepa)和
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环磷酰胺；烷基磺酸酯，例如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶，例如苯并多巴(benzodopa)、卡波醌、美妥替哌(meturedopa)和uredopa；乙撑亚胺和甲基蜜胺(methylamelamines)，包括六甲蜜胺、三乙撑蜜胺、三乙撑磷酰胺、三乙撑硫代磷酰胺和三羟甲基蜜胺；多聚乙酰(特别是布拉它辛(bullatacin)和布拉它辛酮(bullatacinone))；喜树碱(包括合成类似物拓扑替康(topotecan))；苔藓虫素(bryostatin)；callystatin；CC-1065(包括其阿多来新、卡折来新和比折来新合成类似物)；隐藻素(cryptophycins)(特别是隐藻素1和隐藻素8)；多拉司他汀；倍癌霉素(duocarmycin)(包括合成类似物KW-2189和CB1-TM1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；水鬼蕉碱(pancratistatin)；sarcodictyin；海绵毒素(spongistatin)；氮芥，例如苯丁酸氮芥、萘氮芥、胆磷酰胺(cholophosphamide)、雌氮芥、异环磷酰胺、二氯甲基二乙胺(mechlorethamine)、氮氧芥盐酸盐、美法仑、新氮芥、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼松龙苯芥、氯乙环磷酰胺、尿嘧啶氮芥；亚硝基脲(nitrosureas)，例如卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀和雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素，例如烯二炔抗生素(例如卡奇霉素，特别是卡奇霉素γlI和卡奇霉素ωIl(参见例如Agnew，Chem.Intl.Ed.Engl.，33:183-186(1994))；dynemicin，包括dynemicin A；双膦酸盐，例如氯膦酸盐；埃斯培拉霉素(esperamicin)；以及新制癌菌素发色团和相关的色素蛋白烯二炔抗生素发色团)、aclacinomysins、放线菌素、安曲霉素、重氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C、carabicin、洋红霉素(caminomycin)、嗜癌素、色霉素(chromomycinis)、放线菌素D、柔红霉素、地托比星、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、
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阿霉素(包括吗啉代阿霉素、氰基吗啉代阿霉素、2-吡咯啉并阿霉素和去氧阿霉素)、表柔比星、依索比星、去甲氧基柔红霉素、麻西罗霉素、丝裂霉素例如丝裂霉素C、霉酚酸、诺加霉素、橄榄霉素、培洛霉素、泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑菌素、链脲佐菌素、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星；抗代谢物，例如氨甲蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，例如二甲叶酸、氨甲蝶呤、蝶罗呤、曲美沙特；嘌呤类似物，例如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，例如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷；雄激素，例如卡普睾酮、丙酸甲雄烷酮、环硫雄醇、美雄烷、睾内酯；抗肾上腺，例如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦；叶酸补充剂，例如亚叶酸(frolinic acid)；乙酰葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；恩尿嘧啶；安吖啶；bestrabucil；比生群；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defofamine)；地美可辛；地吖醌；elformithine；依利醋铵；埃博霉素；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明(lonidainine)；美登木素(maytansinoids)，例如美登素(maytansine)和安丝菌素；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇(mopidanmol)；二胺硝吖啶(nitraerine)；喷司他丁；蛋氨氮芥；吡柔比星；洛索蒽醌；鬼臼酸乙肼；甲基苄肼；
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多糖复合物(JHS Natural Products，Eugene，Oreg.)；雷佐生；根霉素；西佐喃(sizofuran)；螺旋锗；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌；2,2’,2”-三氯三乙胺；单端孢霉烯(特别是T-2毒素、疣孢菌素A(verracurin A)、杆孢菌素A和蛇行菌素)；氨基甲酸酯；长春地辛；达卡巴嗪；甘露醇氮芥；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；gacytosine；阿糖胞苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；噻替哌；紫杉烷(taxoids)，例如
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紫杉醇(Bristol-Myers Squibb Oncology，Princeton，N.J.)、
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Cremophor-free、紫杉醇的白蛋白工程化纳米颗粒制剂(American PharmaceuticalPartners，Schaumberg，I11.)和
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doxetaxel(Rhone-Poulenc Rorer，Antony，法国)；苯丁酸氮芥(chloranbucil)；
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吉西他滨；6-硫代鸟嘌呤；巯基嘌呤；氨甲蝶呤；铂类似物，例如顺铂、奥沙利铂和卡铂；长春碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱；NAVELBINETM长春瑞滨；盐酸米托蒽醌；替尼泊苷；依达曲沙；道诺霉素；氨基蝶呤；希罗达；伊班膦酸盐；伊立替康(Camptosar，CPT-11)(包括伊立替康与5-FU和甲酰四氢叶酸的治疗方案)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类视黄醇，例如视黄酸；卡培他滨；考布他汀；甲酰四氢叶酸(LV)；奥沙利铂，包括奥沙利铂治疗方案(FOLFOX)；拉帕替尼(TykerbTM)；减少细胞增殖的PKC-α、Raf、H-Ras、EGFR(例如，厄洛替尼
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)和VEGF-A的抑制剂，以及任何上述物质的药学上可接受的盐、酸或者衍生物。
在一些实施方式中，结合抗体试剂和化疗剂可彼此直接缀合和/或结合，例如抗体-药物缀合物。在一些实施方式中，结合可为非共价的，例如通过氢键、静电或范德华相互作用，然而，结合也可为共价的。“缀合”意味着至少两个分子的共价连接。在一些实施方式中，组合物可为抗体-药物缀合物。
在一些实施方式中，结合抗体试剂可结合至和/或缀合至多个化疗分子。在一些实施方式中，给定化疗分子与结合抗体试剂分子的比例可为约1:1至约1,000:1，例如单个抗体结合试剂分子可例如连接、缀合于约1至约1,000个单独的化疗分子。
在一些实施方式中，结合抗体试剂和化疗剂可存在于支架材料中。适用于治疗组合物中的支架材料为本领域所知晓，可包括但不限于纳米颗粒、基质、水凝胶、生物材料、生物相容和/或生物可降解的支架材料。本文使用的术语“纳米颗粒”指的是约10-9或十亿分之一米量级的颗粒。术语“纳米颗粒”包括纳米球、纳米棒、纳米壳以及纳米棱柱；并且这些纳米颗粒可以是纳米网络的一部分。
术语“纳米颗粒”还涵盖了具有纳米颗粒尺寸的脂质体和脂质颗粒。本文使用的术语“基质”指的是包含本文所述的组合物组分(例如结合试剂、激酶抑制剂和/或EGFR抑制剂)的3维结构。基质结构的非限制性实例包括泡沫、水凝胶、静电纺丝纤维、凝胶、纤维垫、海绵、3维支架、无纺布垫、编织材料(woven materials)、针织材料(knit materials)、纤维束、纤维和其它材料形式(参见例如Rockwood等，Nature Protocols 2011 6：1612-1631以及US专利公开2011/0167602；2011/0009960；2012/0296352和U.S.专利号8,172,901，各自以引用的方式将其整体并入本文)。本领域技术人员可依赖于组合物的期望应用对基质的结构进行选择，例如静电纺丝基质可具有比泡沫更大的表面积。
在一些实施方式中，支架是水凝胶。本文使用的术语“水凝胶”指的是在水中不可溶、但能够吸收并保持大量的水从而形成稳定、通常柔软和柔韧的结构的三维聚合物结构。在一些实施方式中，水可渗透入聚合物网络的聚合物链之间，随后引起水凝胶的溶胀和形成。一般而言，水凝胶为超强吸收性的。水凝胶具有用于生物医疗应用的多种期望性质。例如，它们可制成无毒并与组织相容，并且它们对于水、离子和小分子是高度透过的。水凝胶为超强吸收性的(它们可含有超过99％的水)，并可由天然(例如丝)或合成的聚合物(例如PEG)组成。
本文使用的“生物材料”指的是生物相容且生物可降解的材料。本文使用的术语“生物相容”指的是对细胞无毒的物质。在一些实施方式中，如果在体外将物质加入至细胞造成小于或等于约20％的细胞死亡，则认为该物质是“生物相容”的。在一些实施方式中，如果在体内将物质加入至细胞而不引发体内的炎症和/或其它副作用，则认为该物质是“生物相容”的。本文使用的术语“生物可降解”指的是在生理条件下被降解的物质。在一些实施方式中，生物可降解物质为被细胞器(cellular machinery)分解的物质。在一些实施方式中，生物可降解物质为被化学过程分解的物质。
在一些实施方式中，本文所述的方法涉及用CTC标记基因靶向治疗剂对患有或诊断为患有癌症的受试者进行治疗。在一些实施方式中，所述癌症为胰腺癌。可通过医师使用现有的癌症诊断方法识别患有癌症的受试者。表征这些状况以及辅助诊断的癌症(例如胰腺癌)的症状和/或并发症为本领域所熟知的，包括但不限于上腹部疼痛、胃灼热、恶心、呕吐、腹泻、萎靡不振、黄疸、肺栓塞、Trousseau综合征和糖尿病。可有助于例如胰腺癌的诊断的测试包括但不限于：肝功能测试、CA19-9测试、CT和超声内镜。胰腺癌的家族史或暴露至胰腺癌的危险因素(例如吸烟或饮酒)也可帮助确定受试者是否有可能患癌症、或者帮助对癌症进行诊断。
本文所述的组合物和方法可给予至患有或诊断为患有癌症(例如胰腺癌)的受试者。在一些实施方式中，本文所述的方法包括将本文所述的有效量的组合物(例如CTC标记基因靶向治疗剂)给予至受试者，以缓解癌症的症状。本文所使用的“缓解癌症的症状”是改善与癌症有关的任何状况或症状。与同等的未经处理的对照相比，此类降低是通过任何标准技术测量降低至少5％、10％、20％、40％、50％、60％、80％、90％、95％、99％或更多。本领域技术人员已知用于将本文所述的组合物给予至受试者的多种手段。此类方法可以包括但不限于：口服给予、胃肠外给予、静脉内给予、肌内给予、皮下给予、经皮给予、气道(气溶胶)给予、肺部给予、皮肤给予、局部给予、注射给予或瘤內给予。给予可以是局部的或全身性的。
本文所使用的术语“有效量”是指缓解疾病或紊乱的至少一种或多种症状所需的CTC标记基因靶向治疗剂的量，并涉及足以提供期望效果的药物组合物的量。因此，术语“治疗有效量”是指当给予至典型受试者时，足以提供特定的抗癌效果的CTC标记基因靶向治疗剂的量。在各种背景下，本文所使用的有效量也包括足以推迟疾病症状进展的量、足以改变疾病症状进程(例如但不限于延缓疾病症状的进展)的量、或足以逆转疾病症状的量。因此，指定确切的“有效量”通常是不实际的。然而，对于任何给定的情况，适当的“有效量”可以由本领域普通技术人员仅使用常规实验来确定。
有效量、毒性和治疗效果可以通过细胞培养物或实验动物中的标准药学程序来确定，例如用于确定LD50(使群体50％致死的剂量)和ED50(在群体50％中治疗有效的剂量)的药学程序。剂量可以根据所采用的剂型和所利用的给予途径而变化。毒性作用和治疗效果之间的剂量比是治疗指数，并可表示为比例LD50/ED50。表现出大的治疗指数的组合物和方法是优选的。治疗有效剂量可以从细胞培养物检测初步估算。另外，剂量可在动物模型中制定以达到循环血浆浓度范围，所述循环血浆浓度范围包括在细胞培养物中或在合适的动物模型中确定的IC50(即，达到症状的半数最大抑制的CTC标记基因靶向治疗剂的浓度)。血浆中的水平可以通过例如高效液相色谱法进行测量。任何特定剂量的影响可以通过合适的生物测定法进行监测，例如用于其中包括CTC水平的测定法。所述剂量可以由医师来确定并在必要时进行调整，以适合所观察到的治疗效果。
在一些实施方式中，本文描述的技术涉及包含本文所述的CTC标记基因靶向治疗剂以及任选的药学上可接受的载体的药物组合物。药学上可接受的载体和稀释剂包括盐水、水性缓冲溶液、溶剂和/或分散媒介。本领域公知此类载体和稀释剂的使用。可作为药学上可接受的载体的一些非限制性实例包括：(1)糖，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3)纤维素及其衍生物，例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、乙基纤维素、微晶纤维素和醋酸纤维素；(4)黄蓍胶粉；(5)麦芽；(6)明胶；(7)润滑剂，例如硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠和滑石；(8)赋形剂，例如可可脂和栓蜡；(9)油，例如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；(10)二醇，例如丙二醇；(11)多元醇，例如甘油、山梨糖醇、甘露醇和聚乙二醇(PEG)；(12)酯，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，例如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)海藻酸；(16)无热原水；(17)等渗盐水；(18)林格氏溶液；(19)乙醇；(20)pH缓冲溶液；(21)聚酯、聚碳酸酯和/或聚酸酐；(22)填充剂，例如多肽和氨基酸；(23)血清成分，例如血清白蛋白、HDL和LDL；(24)C2-C12醇，例如乙醇；以及(25)用于药物制剂中的其它无毒相容物质。润湿剂、着色剂、脱模剂、包衣剂、甜味剂、调味剂、芳香剂、防腐剂和抗氧化剂也可以存在于制剂中。术语例如“赋形剂”、“载体”、“药学上可接受的载体”等在本文中可互换使用。在一些实施方式中，载体抑制活性试剂(例如本文所述的CTC标记基因靶向治疗剂)的降解。
在一些实施方式中，包含如本文所述的CTC标记基因靶向治疗剂的药物组合物可以是胃肠外剂型。由于胃肠外剂型的给予通常绕开患者对污染物的天然防御，胃肠外剂型优选是无菌的或能够在给予患者之前灭菌。胃肠外剂型的实例包括但不限于：准备用于注射的溶液剂、待溶解或悬浮于用于注射的药学上可接受的载体中的干燥产品、准备用于注射的混悬剂、以及乳液。此外，可制备控释的胃肠外剂型用来给予患者，包括但不限于
Figure BDA0001084465270000841
型剂型和剂量倾泻(dose-dumping)。
本文中公开的可以用来提供CTC标记基因靶向治疗剂的胃肠外剂型的合适的载体对本领域技术人员来说是公知的。实例包括但不限于：无菌水；USP注射用水；盐水溶液；葡萄糖溶液；水性载体，例如但不限于氯化钠注射液、林格氏注射液、右旋糖注射液、右旋糖和氯化钠注射液、以及乳酸林格氏注射液；与水混溶的载体，例如但不限于乙醇、聚乙二醇和丙二醇；以及非水性载体，例如但不限于玉米油、棉籽油、花生油、芝麻油、油酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯和苯甲酸苄酯。改变或修饰本文所公开的CTC标记基因靶向治疗剂的药学上可接受的盐的溶解度的化合物也可以纳入本公开内容的胃肠外剂型中，包括常规和控释的胃肠外剂型。
包含CTC标记基因靶向治疗剂的药物组合物也可以配制成适合于口服给予，例如作为离散剂型，例如但不限于片剂(包括但不限于刻痕片剂或包衣片剂)、丸剂、囊片剂、胶囊剂、咀嚼片剂、粉包剂(powder packets)、扁囊剂、含片、晶片、气溶胶喷雾剂；或液体剂，例如但不限于糖浆剂、酏剂、在水性液体中的溶液剂或混悬剂、非水性液体、水包油乳液或油包水乳液。此类组合物含有所公开的化合物的预定量的药学上可接受的盐，并可以使用本领域技术人员所熟知的药物学方法制备。通常参见，Remington:The Science andPractice of Pharmacy，第21版，Lippincott，Williams和Wilkins，Philadelphia，PA(2005)。
常规剂型通常提供药物从制剂中的快速或立即释放。根据药物的药理学和药代动力学，使用常规剂型可使得患者的血液和其它组织中的药物浓度的大幅波动。这些波动可能影响许多参数，例如剂量频率、起效时间、疗效的持续时间、治疗性血液水平的维持、毒性、副作用等。有利的是，控释制剂可用于控制药物的起效时间、作用持续时间、治疗窗内的血浆水平以及峰值血液水平。特别是，控释或缓释(extended-release)剂型或制剂可用于确保实现药物的最大效果，同时使潜在的副作用和安全隐患最小化，副作用和安全隐患可能在药物的不足量给药(即，低于最低治疗水平)以及超过药物的毒性水平时出现。在一些实施方式中，CTC标记基因靶向治疗剂能够以持续释放(sustained release)制剂给予。
控释药物产品具有改进药物治疗高于通过它们的非控释对应物所实现的共同目标。理想的是，在医学治疗中使用优化设计的控释制剂的特征在于，使用最少的药物物质在最短时间内治愈或控制病情。控释制剂的优点包括：1)延长药物活性；2)降低剂量频率；3)提高患者依从性；4)使用较少的药物总量；5)减少局部或全身性副作用；6)使药物累积最小化；7)减少血液水平的波动；8)改善治疗功效；9)减少药物活性的增强作用或损失；以及10)改善疾病或病情的控制速度(Kim，Cherng-ju，Controlled Release Dosage Form Design，2(Technomic Publishing，Lancaster，Pa.:2000))。
大多数控释制剂被设计为最初释放一定量的药物(有效成分)，以立即产生期望的治疗效果，并逐步且持续地释放另外量的药物以在一段长的时间内维持这一水平的治疗或预防作用。为了在体内维持药物的这一恒定水平，药物必须从剂型中以一定速度释放以取代药物从体内代谢和排出的量。活性成分的控释可以受到多种条件的刺激，包括但不限于：pH、离子强度、渗透压、温度、酶、水以及其它的生理状况或化合物。
各种已知的控释或缓释剂型、制剂和装置可适于用于本公开所述的盐和组合物。实例包括但不限于在以如下中描述的实例：美国专利号3,845,770、3,916,899、3,536,809、3,598,123、4,008,719、5,674,533、5,059,595、5,591,767、5,120,548、5,073,543、5,639,476、5,354,556、5,733,566以及6,365,185B1；以引用的方式将其各自并入本文。这些剂型可用于使用例如羟丙基甲基纤维素、其它聚合物基质、凝胶、可透膜、渗透系统(如
Figure BDA0001084465270000861
(Alza Corporation，Mountain View，Calif.USA))或它们的组合提供一种或多种活性成分的缓慢释放或控释，从而提供期望的不同比例的释放曲线。
本文所述的方法可以进一步包括向受试者给予第二试剂和/或治疗，例如作为组合治疗的一部分。第二试剂和/或治疗的非限制性实例可以包括如上文所述的放射治疗剂、外科手术治疗剂和/或化学治疗剂。
在一些实施方式中，包含本文所述的CTC标记基因靶向治疗剂的组合物的有效剂量可以一次给予患者。在一些实施方式中，包含CTC标记基因靶向治疗剂的组合物的有效剂量可以重复给予患者。对于全身给药，可以给予患者治疗量的包含CTC标记基因靶向治疗剂的组合物，例如0.1mg/kg、0.5mg/kg、1.0mg/kg、2.0mg/kg、2.5mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、40mg/kg、50mg/kg、或更多。
在一些实施方式中，在初始治疗方案之后，可以在不太频繁的基础上给予治疗。例如，在每两周治疗进行三个月后，治疗可每月重复一次至六个月或一年或更长时间。根据本文所述的方法的治疗可以降低标记的水平或状况的症状，例如CTC水平降低至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％，至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％或更多。
本文所述的组合物的剂量可以由临床医师确定并在必要时进行调整，以适应观察到的治疗效果。至于治疗持续时间和治疗的频率，一般由熟练的临床医师监测受试者以确定何时治疗提供治疗效果，并确定是否增加或减少剂量、增加或降低给予频率、不继续治疗、恢复治疗或对治疗方案作出其它改变。给药计划可以每周至每天变化，这取决于许多临床因素，例如受试者对CTC标记基因靶向治疗剂的敏感性。活性作用的期望的剂量或量可一次给予或分成亚剂量，例如2-4个亚剂量并在一段时间内(例如，以一天内的适当时间间隔或其它适当的计划)给予。在一些实施方式中，给予可以是长期的，例如在数周或数月的时间段内每天一次或多次给药和/或治疗。给药和/或治疗计划的实例是在1周、2周、3周、4周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月或6个月或更长的时间段内，每天给予、每天两次、每天三次或每天四次或更多次给予。含有CTC标记基因靶向治疗剂的组合物可以在一段时间内给予，例如在5分钟、10分钟、15分钟、20分钟或25分钟内。
根据本文所述的方法的CTC标记基因靶向治疗剂的给予剂量范围取决于：例如CTC标记基因靶向治疗剂的形式、其效力，以及期望降低的本文所述的状况的症状、标记或指标的程度，例如对CTC水平而言期望的降低百分比。剂量不应大到以至于造成不利的副作用。通常，剂量会随患者的年龄、状况和性别而变化，并可由本领域的技术人员确定。在任何并发症的情况下，剂量也可由医师个体进行调整。
CTC标记基因靶向治疗剂在例如治疗本文所述的状况方面的效力、或者引起如本文所述的应答(如降低CTC水平)的效力可以由熟练的临床医师确定。然而，如同在本文中所使用的术语，如果本文所述的状况的一种或多种指征或症状以有益的方式改变、其它临床上接受的症状改善或甚至缓解、或诱发了期望的应答(例如，根据本文所述的方法在治疗后改变至少10％)，则治疗被认为是“有效的治疗”。效力可例如通过测量根据本文所述的方法处理的标记、指标、症状和/或状况的发生率或者适当测量任何其它可测量的参数(例如肿瘤大小和/或生长)进行评估。效力还可通过住院治疗或需要医学干预(即，疾病的进展停止)评估个体不再恶化而测量。测量这些指标的方法对于本领域技术人员来说是已知的和/或在本文得以描述。治疗包括个体或动物(一些非限制性实例包括人或动物)中的疾病的任何治疗，并包括：(1)抑制疾病，例如防止症状(例如疼痛或炎症)的恶化；或(2)缓解疾病的严重程度，例如引起症状的复原。当该术语在本文中加以定义时，疾病治疗的有效量是指在向有需要的患者给予时，足以对疾病产生有效治疗的量。试剂的效力可以通过评估状况或期望的应答的物理指标(例如CTC水平)确定。通过测量此类参数的任一者或参数的任何组合来监测给予和/或治疗的效力完全在本领域技术人员的能力范围内。可以在本文所述的状况的动物模型中评估效力，例如小鼠模型中的癌症(例如胰腺癌)的治疗。当使用实验动物模型时，当观察到标记(例如CTC水平改变)中的统计学上显著的变化时，治疗的效力被证实。
为了方便起见，在说明书、实施例和附加的权利要求书中使用的一些术语和短语的含义在如下提供。除非另有说明或从上下文中暗示得到，下列术语和短语包含下面所提供的含义。提供这些定义以帮助描述特定的实施方式，而并不打算限制所要求保护的发明，因为本发明的范围仅通过权利要求书加以限定。除非另有定义，本文所使用的所有技术术语和科学术语具有与本发明所属技术领域中的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。如果在本领域中的术语的使用与本文所提供的定义之间存在明显的差异，则以本说明书中提供的定义为准。
为了方便起见，本文在说明书、实施例和附加的权利要求书中使用的一些术语汇集在此处。
本文所使用的术语“减少”、“降低的”、“降低”或“抑制”都是指降低统计学上显著的量。在一些实施方式中，“下降”、“降低”、“减少”或“抑制”通常是指与参照水平(例如，缺少给定的治疗)相比减少至少10％，并且可以包括例如减少至少约10％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％、或更多。如本文所使用的“降低”或“抑制”并未涵盖与参照水平相比的完全抑制或降低。“完全抑制”是与参照水平相比的100％的抑制。减少可以优选下降至在没有给定的紊乱的个体的正常范围内接受的水平。
本文所使用的术语“增加的/增高的”、“增加/增高”、“增强”或“激活/活化”都是指增加统计学上显著的量。在一些实施方式中，术语“增加的/增高的”、“增加/增高”、“增强”或“激活/活化”可意味着与参照水平相比增加至少10％，例如增加至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％或上至并包括100％的增加、或与参照水平相比的10-100％之间的任意增加、或者至少约2倍、或至少约3倍、或至少约4倍、或至少约5倍或至少约10倍的增加、或与参照水平相比的2倍至10倍之间的任意增加或更多。在标记或症状的语境下，“增加/增高”是以此类水平的统计学上的显著增加/增高。
本文所使用的“受试者”是指人或动物。通常动物是脊椎动物，例如灵长类动物、啮齿类动物、家养动物或狩猎动物。灵长类动物包括黑猩猩、食蟹猴、蜘蛛猴、以及猕猴例如恒河猴。啮齿类动物包括小鼠、大鼠、旱獭、雪貂、兔和仓鼠。家养动物和狩猎动物包括奶牛；马；猪；鹿；野牛；水牛；猫科动物，例如家猫；犬科动物，例如狗、狐狸、狼；鸟类，例如鸡、鸸鹋、鸵鸟；以及鱼类，例如鳟鱼、鲶鱼和鲑鱼。在一些实施方式中，受试者是哺乳动物，例如灵长类动物，例如人。术语“个体”、“患者”和“受试者”在本文中可互换使用。
优选地，受试者是哺乳动物。所述哺乳动物可以是人、非人灵长类动物、小鼠、大鼠、狗、猫、马或奶牛，但不限于这些实例。除了人之外的哺乳动物可以有利地用作代表癌症动物模型的受试者。受试者可以是雄性或雌性。
受试者可以是先前已被诊断或确认为患有或具有需要治疗的状况(例如癌症)或者具有与此类状况相关的一种或多种并发症的受试者，并且可选地已经接受对癌症的治疗或对与癌症相关的一种或多种并发症的治疗。或者，受试者也可以是先前没有被诊断为具有癌症或与癌症相关的一种或多种并发症的受试者。例如，受试者可以是显示出癌症的一个或多个风险因素或者显示出与癌症相关的一种或多种并发症的一个或多个风险因素的受试者、或未显示风险因素的受试者。
“需要”治疗特定状况的“受试者”可以是具有下述状况的受试者：诊断为具有该状况或诊断为具有发展出该状况的风险。
本文所使用的术语“癌症”或“肿瘤”是指干扰机体器官和系统的正常功能的不受控的细胞生长。患有癌症或肿瘤的受试者是在受试者体内存在客观上可测量的癌细胞的受试者。这一定义中包括的是良性癌症和恶性癌症、以及休眠肿瘤或微转移。从它们的起始位置迁移并播撒于要害器官的癌症可通过受影响器官的功能退化而最终导致受试者死亡。
术语“试剂”通常是指通常不存在或者不以向细胞、组织或受试者给予的水平存在的任何实体。试剂可以从如下组中选择，所述组包括但不限于：多核苷酸；多肽；小分子；以及抗体或其抗原结合片段。多核苷酸可以是RNA或DNA，并且可以是单链或双链的，并且可以从如下组中选择，所述组包括例如：编码多肽的核酸和核酸类似物。多肽可以是但不限于：天然存在的多肽、突变的多肽或保留了感兴趣的功能的多肽片段。试剂的进一步实例包括但不限于：核酸适体、肽-核酸(PNA)、锁核酸(LNA)、有机小分子或无机小分子；糖；寡糖；多糖；生物大分子、拟肽；核酸类似物和核酸衍生物；从生物材料如细菌、植物、真菌或者哺乳动物细胞或组织、以及天然存在的成分或合成的成分产生的提取物。试剂可以施用至培养基，在其中它接触细胞并诱导其效果。或者，试剂可以是胞内的作为如下的结果：将编码试剂的核酸序列导入细胞中，以及试剂的转录引起胞内的核酸和/或蛋白的环境刺激的产生。在一些实施方式中，试剂是任何化学的实体或部分，包括但不限于合成和天然存在的非蛋白实体。在一些实施方式中，试剂是具有所选择的化学部分的小分子，例如选自包含大环内酯、来普霉素和它们的相关的天然产物或类似物在内的未取代或取代的烷基部分、芳基部分或杂环基部分。试剂可以已知具有期望活性和/或特性、或可以从不同的化合物的库中选择。本文所使用的术语“小分子”可以指“天然产物样”的化合物，然而，术语“小分子”并不限于“天然产物样”化合物。相反，一般小分子的特征在于它含有数个碳-碳键，并具有大于约50道尔顿但小于约5000道尔顿(5kD)的分子量。优选小分子具有小于3kD、更优选小于2kD、最优选小于1kD的分子量。在一些情况下，优选小分子具有等于或小于700道尔顿的分子质量。
适体是特异性地结合至各种分子靶标的短的合成的单链寡核苷酸，所述分子靶标例如小分子、蛋白、核酸、以及甚至细胞和组织。这些小核酸分子可以形成二级结构和三级结构，能够特异性地结合蛋白或其它细胞靶标，并且实质上是抗体的化学等价物。适体是高度特异性的，尺寸相当小，并且非免疫原性。适体通常通过称为SELEX(指数富集的配体系统进化)的生物淘筛方法(Ellington等，Nature.1990，346(6287):818-822；Tuerk等，Science.1990，249(4968):505-510；Ni等，Curr Med Chem.2011，18(27):4206-14；以引用的方式将其整体并入本文)进行选择。本领域公知产生对于任何给定靶标而言的适体的方法。在癌症和HIV的小鼠模型中使用例如适体-siRNA嵌合体和适体靶向纳米颗粒疗法的临床前研究非常成功(Ni等，Curr Med Chem.2011，18(27):4206-14)。
本文所使用的术语“蛋白”和“多肽”在本文中互换使用，以指定一连串的氨基酸残基，所述氨基酸残基通过在相邻残基的α-氨基基团和羧基基团之间的肽键相互连接。无论其大小或功能，术语“蛋白”和“多肽”是指氨基酸的聚合物，所述氨基酸包括经修饰的氨基酸(例如，磷酸化、糖化、糖基化等)和氨基酸类似物。“蛋白”和“多肽”通常用来指比较大的多肽，而术语“肽”通常用于指小的多肽，但是在本领域中这些术语的用法重叠。当指基因产物及其片段时，术语“蛋白”和“多肽”在本文中互换使用。因此，示例性的多肽或蛋白包括基因产物、天然存在的蛋白、同源物、直系同源物、旁系同源物、片段和上述物质的其它等同物、变型、片段和类似物。
本文所使用的术语“核酸”或“核酸序列”是指并入核糖核酸、脱氧核糖核酸或它们的类似物的单元的任何分子，优选聚合分子。核酸可以是单链或双链的。单链核酸可为变性的双链DNA的一条核酸链。或者，单链核酸可为并非衍生自任何双链DNA的单链核酸。在一个方面，核酸可以是DNA。在另一方面，核酸可以是RNA。合适的核酸分子是DNA、包括基因组DNA或cDNA。其它合适的核酸分子是RNA、包括mRNA。
本文所使用的术语“治疗(treat/treatment/treating)”或“减轻”是指治疗剂治疗，其中，目的是逆转、缓解、减轻、抑制、减缓或停止与疾病或紊乱(例如癌症)相关的状况的进展或严重程度。术语“治疗”包括降低或缓解与癌症相关的状况、疾病或紊乱的至少一种不利影响或症状。如果一种或多种症状或临床标记减少，则治疗通常是“有效”的。或者，如果疾病的进展减弱或停止，则治疗是“有效”的。也就是说，“治疗”不仅包括症状或标记的改善，还包括与未进行治疗时所预期的情况相比症状的进展或恶化中止或至少减缓。有益或期望的临床结果(无论可测定或不可测定)包括但不限于：缓解一种或多种症状、减小疾病程度、稳定疾病状态(即，不恶化)、延迟或减缓疾病进展、减轻或减缓疾病状态、缓和(部分或全部)、和/或减少死亡率。术语“治疗”疾病还包括提供疾病的症状或副作用的舒解(包括姑息治疗)。
本文所使用的术语“药物组合物”是指与药学上可接受的载体(例如在制药工业中常用的载体)组合的活性试剂。本文采用的短语“药学上可接受的”是指下述化合物、材料、组合物和/或剂型：在合理的医学判断范围内，适于与人类和动物的组织接触而无过度的毒性、刺激、过敏反应或其它问题或并发症，与合理的收益/风险比相匹配。
本文所使用的术语“给予”是指通过一定的方法或途径向受试者中放置本文所公开的化合物，使得至少将试剂部分递送至期望部位。含有本文所公开的化合物的药物组合物可以通过任何适当的途径给予，从而在受试者中产生有效的治疗。
术语“统计上显著”或“显著地”是指统计显著性，并且通常是指2个标准差(2SD)或更大的差异。
除了在操作实施例中或另有指示以外，本文所使用的表示成分的量或反应条件的所有数字均应理解为在所有情况下均由术语“约”加以修饰。术语“约”在与百分比连接使用时可以表示±1％。
本文所使用的术语“包含”或“包括”是指对于方法或组合物而言必不可少的组成、方法及其各自的成分，对于包含未指定的要素(无论是必要的要素或是非必要的要素)而言也是开放性的。
术语“由……组成”是指本文所述的组合物、方法及其各自的成分，排除了任何在实施方式的描述中未列举的要素。
本文所使用的术语“基本上由……组成”是指对于给定的实施方式而言所需的要素。该术语允许存在实质上不会影响实施方式的基本和新颖的或功能性的特性的要素。
除非上下文另有明确指示，单数术语“一/该/所述(a/an/the)”包括复数的指示对象。类似地，除非上下文另有明确指示，词语“或”意在包括“和”。尽管与本文描述的相似或相当的方法和材料可用于本公开的实践或试验中，在下文中对合适的方法和材料进行了描述。缩写“例如(e.g.)”源自拉丁文的例如(exempli gratia)，并且在本文中用于表示非限制性的实例。因此，缩写“e.g.”与术语“例如(for example)”同义。
细胞生物学和分子生物学中的常用术语的定义可以在下述文献中找到：“TheMerck Manual of Diagnosis and Therapy”，第19版，Merck Research Laboratories出版，2006(ISBN 0-911910-19-0)；Robert S.Porter等(编)，The Encyclopedia ofMolecular Biology，Blackwell Science Ltd.出版，1994(ISBN 0-632-02182-9)；Benjamin Lewin，Genes X，Jones&Bartlett Publishing出版，2009(ISBN-10：0763766321)；Kendrew等(编)，Molecular Biology and Biotechnology:a ComprehensiveDesk Reference，VCH Publishers，Inc.出版，1995(ISBN 1-56081-569-8)；以及CurrentProtocols in Protein Sciences 2009，Wiley Intersciences，Coligan等编。
除非另有说明，本发明采用在以下文献中描述的标准程序来实施，例如：Sambrook等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第4版)，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N.Y.，USA(2012)；Davis等，Basic Methods in MolecularBiology，Elsevier Science Publishing Inc.，New York,USA(1995)；或Methods inEnzymology:Guide to Molecular Cloning Techniques 152卷，S.L.Berger和A.R.Kimmel编，Academic Press Inc.，San Diego，USA(1987)；Current Protocols in ProteinScience(CPPS)(John E.Coligan等编，John Wiley and Sons，Inc.)；Current Protocolsin Cell Biology(CPCB)(Juan S.Bonifacino等编，John Wiley and Sons，Inc.)；以及Culture of Animal Cells:A Manual of Basic Technique，R.Ian Freshney著，Wiley-Liss出版，第5版(2005)；Animal Cell Culture Methods(Methods in Cell Biology，57卷，Jennie P.Mather和David Barnes编，Academic Press，第1版，1998)，以引用的方式将其整体并入本文。
本文在对本发明各个方面的描述中对其它术语进行定义。
出于描述和公开的目的，将本申请全文中引用的所有专利和其它出版物(包括文字出版物、发行的专利、公开的专利申请和同时待审的专利申请)以引用的方式明确地并入本文，例如，在此类出版物中描述的可与本文描述的技术关联使用的方法学。这些出版物仅由于它们的公开早于本申请的申请日而提供。在这一方面，不应当视作承认了本发明人没有权利借助于先前的发明或因为任何其它原因而将此类公开内容提前。所有关于这些文件的日期的声明或关于这些文件的内容的表述是基于申请人可获得的信息，并不构成关于这些文件的日期或内容的正确性的任何承认。
对本公开的实施方式的描述并非旨在进行穷举或将本公开限制为所公开的明确的形式。尽管本文中出于说明性目的描述了本公开的具体实施方式和实施例，然而正如相关领域的技术人员将了解的，可在本公开的范围内进行各种等同修改。例如，当在给定的顺序中给出了方法步骤或功能时，替代的实施方式能够以不同的顺序执行功能、或可以实质上同时执行功能。本文所提供的本公开的教导可以施用至其它适当的程序或方法。本文所述的各种实施方式可以组合以提供进一步的实施方式。如果需要的话，可对本公开的方面进行修改，以采用上述参考文献和应用的组合、功能和构思，从而提供本公开的进一步的实施方式。此外，由于生物功能对等性的考虑，可以在种类或数量上对蛋白结构进行不影响生物或化学作用的一些改变。根据详细的说明书的启示，可以对本公开作出这些改变和其它改变。所有这些修饰都旨在包含于所附的权利要求的范围之内。
可将任何上述实施方式中的特定要素与其它实施方式中的要素组合或置换。此外，尽管在这些实施方式的上下文中已经描述了与本公开的一些实施方式相关的优点，然而其它实施方式也可以表现出此类优点，并且，并非所有的实施方式都必须表现出这样的优点才能落入本公开的范围之内。
本文所描述的技术通过以下实施例进行进一步说明，而不应被解释为进行了进一步的限定。
本文所述的技术的一些实施方式可以根据下列编号段落的任何一段进行定义：
1.一种检测样本中的循环肿瘤细胞(CTCs)的方法，所述方法包括：
测量所述样本中的PC-CTC标记基因表达产物的水平；以及
如果检测到的所述标记基因表达产物的水平高于参比水平，则确定存在PC-CTCs。
2.如段落1所述的方法，其中，所述CTCs为胰腺癌CTCs。
3.如段落1-2中任一段所述的方法，其中，所述方法进一步包括从所述样本中分离所述CTCs的第一步骤。
4.如段落1-3中任一段所述的方法，其中，所述表达产物为核酸。
5.如段落4所述的方法，其中，利用选自于由如下所组成的组中的方法对所述表达产物的水平进行确定：RT-PCR；定量RT-PCR；Northern印迹；基于微阵列的表达分析；下一代测序以及RNA原位杂交。
6.如段落1-3中任一段所述的方法，其中，所述表达产物为多肽。
7.如段落6所述的方法，其中，利用选自于由如下所组成的组中的方法对所述表达产物的水平进行确定：Western印迹；免疫沉淀；酶联免疫吸附测定法(ELISA)；放射性免疫测定法(RIA)；夹心测定法；荧光原位杂交(FISH)；免疫组织学染色；放射性免疫分析测定法；免疫荧光测定法；质谱法；FACS以及免疫电泳测定法。
8.如段落1-7中任一段所述的方法，其中，所述CTC标记基因选自表7、表8或表14。
9.如段落1-8中任一段所述的方法，其中，所述CTC标记基因选自于由如下所组成的组：ABI3BP；ADAMTS5；ADAMTSL1；ANG；ARSA；C1RL；C3；C4A；C4B；CCDC80；CD109；CHI3L1；CLEC3B；CMTM3；CMTM7；COL14A1；COL1A2；COL3A1；COL4A6；CSF1；DAG1；DCN；DMKN；FBLN1；FGF1；FMOD；GPC3；GPC4；HMGB1；IFNAR2；IGFBP5；IL16；LAMA4；LTBP4；MFAP1A；NID2；OGN；PDAP1；PF4；PLAT；PODN；PRELP；RSPO1；SERPING1；SLURP1；SOD3；SPARC；SPOCK2；SPON2；SULF1；SULF2；TGFB2；TGM2；THBD；THBS1；THSD4；TIMP2；TNXB；TPT1；TWSG1和WNT4。
10.如段落1-8中任一段所述的方法，其中，所述CTC标记基因选自于由如下所组成的组：ALDH1A1；ALDH1A2；IGFBP5；KLF4；DCN；SPARC；WNT；TGFB2；VEGF；COL1A2；COL3A1和TIMP2。
11.如段落1-9中任一段所述的方法，其中，所述CTC标记基因选自于由如下所组成的组：ALDH1A2；IGFBP5；KLF4；DCN和SPARC。
12.如段落1-9中任一段所述的方法，其中，所述CTC标记基因选自于由如下所组成的组：ALDH1A2；IGFBP5；KLF4和DCN。
13.如段落1-9中任一段所述的方法，其中，所述CTC标记基因选自于由如下所组成的组：TPT1；HMGB1；SPON 2；SPARC和ARSA。
14.如段落1-9中任一段所述的方法，其中，所述CTC标记基因选自于由如下所组成的组：IL6ST；ARSA；TIMP2；CD55；SULF2；ITGA6；SDC4；CDON和SV2A。
15.一种对受试者中的癌症进行治疗的方法，所述方法包括：向所述受试者给予治疗有效量的CTC标记基因靶向治疗剂。
16.如段落15所述的方法，其中，所述癌症为胰腺癌。
17.如段落15-16中任一段所述的方法，其中，所述CTC标记基因靶向治疗剂包括CTC标记基因的抑制剂。
18.如段落17所述的方法，其中，所述抑制剂为抗体试剂。
19.如段落17所述的方法，其中，所述抑制剂为抑制性核酸试剂。
20.如段落15-19中任一段所述的方法，其中，所述CTC标记基因靶向治疗剂包括CTC标记基因结合抗体试剂和化疗剂。
21.如段落15-20中任一段所述的方法，其中，所述受试者为被确定具有升高水平的存在于血液和/或癌间质中的CTC标记基因和/或升高水平的CTCs的受试者。
22.如段落15-21中任一段所述的方法，其中，所述CTC标记基因靶向治疗剂包括CTC标记基因结合抗体试剂，所述CTC标记基因结合抗体试剂结合选自于由如下所组成的组中的标记基因：IL6ST、SULF2和SV2A。
23.一种确定受试者是否有可能对CTC标记基因靶向治疗剂的治疗作出响应的方法，所述方法包括：
对存在于血液和/或癌间质中的CTC标记基因表达产物的水平进行测量；以及
如果与参比水平相比，所述表达产物的水平升高，则确定受试者有可能对所述治疗作出响应。
24.如段落23所述的方法，其中，所述方法进一步包括从所述样本中分离所述CTCs的第一步骤。
25.如段落23-24中任一段所述的方法，其中，所述癌症为胰腺癌。
26.如段落23-25中任一段所述的方法，其中，所述表达产物为核酸。
27.如段落26所述的方法，其中，利用选自于由如下所组成的组中的方法对所述表达产物的水平进行确定：RT-PCR；定量RT-PCR；Northern印迹；基于微阵列的表达分析；下一代测序以及RNA原位杂交。
28.如段落23-26中任一段所述的方法，其中，所述表达产物为多肽。
29.如段落28所述的方法，其中，利用选自于由如下所组成的组中的方法对所述表达产物的水平进行确定：Western印迹；免疫沉淀；酶联免疫吸附测定法(ELISA)；放射性免疫测定法(RIA)；夹心测定法；荧光原位杂交(FISH)；免疫组织学染色；放射性免疫分析测定法；免疫荧光测定法；质谱法；FACS以及免疫电泳测定法。
30.如段落23-29中任一段所述的方法，其中，所述PC-CTC标记基因选自表7、表8或表14。
31.如段落23-30中任一段所述的方法，其中，所述CTC标记基因选自于由如下所组成的组：ABI3BP；ADAMTS5；ADAMTSL1；ANG；ARSA；C1RL；C3；C4A；C4B；CCDC80；CD109；CHI3L1；CLEC3B；CMTM3；CMTM7；COL14A1；COL1A2；COL3A1；COL4A6；CSF1；DAG1；DCN；DMKN；FBLN1；FGF1；FMOD；GPC3；GPC4；HMGB1；IFNAR2；IGFBP5；IL16；LAMA4；LTBP4；MFAP1A；NID2；OGN；PDAP1；PF4；PLAT；PODN；PRELP；RSPO1；SERPING1；SLURP1；SOD3；SPARC；SPOCK2；SPON2；SULF1；SULF2；TGFB2；TGM2；THBD；THBS1；THSD4；TIMP2；TNXB；TPT1；TWSG1和WNT4。
32.如段落23-31中任一段所述的方法，其中，所述CTC标记基因选自于由如下所组成的组：ALDH1A1；ALDH1A2；IGFBP5；KLF4；DCN；SPARC；WNT；TGFB2；VEGF；COL1A2；COL3A1和TIMP2。
33.如段落23-31中任一段所述的方法，其中，所述CTC标记基因选自于由如下所组成的组：ALDH1A2；IGFBP5；KLF4；DCN和SPARC。
34.如段落23-31中任一段所述的方法，其中，所述CTC标记基因选自于由如下所组成的组：ALDH1A2；IGFBP5；KLF4和DCN。
35.如段落23-31中任一段所述的方法，其中，所述CTC标记基因选自于由如下所组成的组：TPT1；HMGB1；SPON 2；SPARC和ARSA。
36.如段落23-31中任一段所述的方法，其中，所述CTC标记基因选自于由如下所组成的组：IL6ST；ARSA；TIMP2；CD55；SULF2；ITGA6；SDC4；CDON和SV2A。
37.一种监测对受试者进行的治疗的方法，所述方法包括：
向有需要的受试者给予癌症治疗剂；
对存在于血液和/或癌间质中的CTC标记基因表达产物的水平进行测量；以及
如果与参比水平相比，CTC标记基因表达产物的水平降低，则确定受试者作出响应，而如果与参比水平相比，CTC标记基因表达产物未降低，则确定受试者不对所述治疗作出响应。
38.如段落37所述的方法，其中，所述癌症为胰腺癌。
39.如段落37-38中任一段所述的方法，其中，所述参比水平为给予步骤之前的患者中的所述基因表达产物的水平。
40.如段落37-39中任一段所述的方法，其中，所述方法进一步包括从所述样本中分离所述CTCs的第一步骤。
41.如段落37-40中任一段所述的方法，其中，所述表达产物为核酸。
42.如段落41所述的方法，其中，利用选自于由如下所组成的组中的方法对所述表达产物的水平进行确定：RT-PCR；定量RT-PCR；Northern印迹；基于微阵列的表达分析；下一代测序以及RNA原位杂交。
43.如段落37-40中任一段所述的方法，其中，所述表达产物为多肽。
44.如段落43所述的方法，其中，利用选自于由如下所组成的组中的方法对所述表达产物的水平进行确定：Western印迹；免疫沉淀；酶联免疫吸附测定法(ELISA)；放射性免疫测定法(RIA)；夹心测定法；荧光原位杂交(FISH)；免疫组织学染色；放射性免疫分析测定法；免疫荧光测定法；质谱法；FACS以及免疫电泳测定法。
45.如段落37-44中任一段所述的方法，其中，所述PC-CTC标记基因选自表7、表8或表14。
46.如段落37-45中任一段所述的方法，其中，所述CTC标记基因选自于由如下所组成的组：ABI3BP；ADAMTS5；ADAMTSL1；ANG；ARSA；C1RL；C3；C4A；C4B；CCDC80；CD109；CHI3L1；CLEC3B；CMTM3；CMTM7；COL14A1；COL1A2；COL3A1；COL4A6；CSF1；DAG1；DCN；DMKN；FBLN1；FGF1；FMOD；GPC3；GPC4；HMGB1；IFNAR2；IGFBP5；IL16；LAMA4；LTBP4；MFAP1A；NID2；OGN；PDAP1；PF4；PLAT；PODN；PRELP；RSPO1；SERPING1；SLURP1；SOD3；SPARC；SPOCK2；SPON2；SULF1；SULF2；TGFB2；TGM2；THBD；THBS1；THSD4；TIMP2；TNXB；TPT1；TWSG1和WNT4。
47.如段落37-46中任一段所述的方法，其中，所述CTC标记基因选自于由如下所组成的组：ALDH1A1；ALDH1A2；IGFBP5；KLF4；DCN；SPARC；WNT；TGFB2；VEGF；COL1A2；COL3A1和TIMP2。
48.如段落37-46中任一段所述的方法，其中，所述CTC标记基因选自于由如下所组成的组：ALDH1A2；IGFBP5；KLF4；DCN和SPARC。
49.如段落37-46中任一段所述的方法，其中，所述CTC标记基因选自于由如下所组成的组：ALDH1A2；IGFBP5；KLF4和DCN。
50.如段落37-46中任一段所述的方法，其中，所述CTC标记基因选自于由如下所组成的组：TPT1；HMGB1；SPON 2；SPARC和ARSA。
51.如段落37-46中任一段所述的方法，其中，所述CTC标记基因选自于由如下所组成的组：IL6ST；ARSA；TIMP2；CD55；SULF2；ITGA6；SDC4；CDON和SV2A。
实施例
实施例1：小鼠胰腺循环肿瘤细胞的单细胞RNA测序表明其表达ECM蛋白
循环肿瘤细胞(CTCs)从原发肿瘤脱落进入血流中，介导癌症血源性扩散至远端器官。利用胰腺癌小鼠模型，将微流体装置施用至不依赖于肿瘤表位而分离CTCs，并使CTCs进行单细胞RNA测序。CTC成簇为多个子类，与原发肿瘤和癌细胞系不同。尽管增殖指征通常较低，然而CTCs富集MAPK以及WNT、TGF-β、神经营养因子、Toll样受体和B细胞受体信号转导通路。CTCs高度富集干细胞相关基因Aldh1a2的表达。Igfbp5和Klf4的实质上普遍的表达与定位至上皮/间质边界的原发肿瘤细胞的子类相关，与CTCs中的上皮和间充质标记的同时存在相一致。间质衍生的胞外基质蛋白(包括Dcn和Sprc)的非常高的CTC表达表明微环境促进转移并识别出预料不到的治疗靶标。
引言
胰腺导管腺癌(PDAC)是美国第四大癌症死亡诱因，具有6％的五年总存活率(Society，2013)。该癌症的高死亡率源于肿瘤细胞快速传播导致的广泛转移。甚至在早期PDAC中，局部的组织和淋巴侵袭也是明显的，存在于血流中的循环肿瘤细胞(CTCs)最终导致癌症扩散至远端器官。CTCs极为罕见，估计1毫升血液的一百亿正常血细胞中有1到10个肿瘤细胞。就这一点而言，其分离和分子分析具有明显的技术挑战(Pantel等，2008；Yu等，2011)。鉴于其在血源性转移中的作用，CTC群体可能富集用于转移前体，并且对其分析可识别潜在的治疗靶标，且为胰腺癌的早期检测提供机会。
遗传学上工程化的小鼠胰腺癌模型为该疾病的进展提供了重要理解。特别地，遗传学上工程化的LSL-KrasG12D、Trp53flox/flox或+和Pdx1-Cre(KPC)小鼠模型囊括了从肿瘤发生前的胰腺内上皮瘤样(Pan1N)病变到侵袭性癌的组织学进展(Bardeesy等，2006)。最近的研究表明，在该模型中上皮-至-间充质转化(EMT)发生在早期，可能增强了肿瘤的侵袭性(Rhim等，2012)。在小鼠胰腺CTCs的初始分子表征中，进行CTC富集群体的RNA测序，从而识别出作为复发事件的非典型WNT信号转导的活化，有可能有助于循环上皮细胞的抗失巢凋亡(Yu等，2012)。在该研究中，结合匹配的白细胞RNA读数的数字减影(digitalsubtraction)，利用单分子RNA测序完成对纯化的CTC群体的分析，从而推导出CTC富集的表达指征。然而，此类部分纯化的细胞群体的转录组学分析受限于最大差异化表达的基因的覆盖深度，并且块状CTC群体的此类研究并不能解决此类知之甚少的细胞群体的异质性程度。
为了获得单细胞水平的CTCs的深度RNA测序谱，使用新型惯性聚集增强装置(inertial focusing-enhanced device)CTC-iChip，该装置使得能够对正常血细胞进行高效负性耗竭，在溶液中留下未附着的CTCs，从而在该处能够将CTCs作为单细胞进行选择和分析(Ozkumur等，2013)。通过避免肿瘤表位特异性捕获(例如靶向上皮标记EpCAM)，CTC-iChip在分离同时具有上皮和间充质特征的癌细胞方面是无偏的。进而，从活的、不带标签的CTCs纯化高质量的RNA特别适用于详细的转录组学分析。最后，使用胰腺癌小鼠模型使得能够对原发肿瘤和CTCs进行同步研究，而不同动物间的共享的驱动突变促进了对CTC特异的异质性的识别。本文所述的为单细胞水平的CTCs的全面转录组学分析，表明CTC群体内的不同的细胞子类、CTCs中富集的信号转导通路并识别出独特的CTC标记和诊断靶标。
结果
小鼠胰腺CTCs的分离。本文所述的实验中使用被直接施用于全血试样以分离CTCs的整合的微流体细胞分离平台CTC-iChip(Ozkumur等，2013)。CTC-iChip将基于初始的流体力学大小的全部有核细胞(白细胞(WBC)和CTCs)与血红细胞、血小板和血浆的分离结合随后的单个流线内的有核细胞惯性聚集，以实现高效的线内(in-line)磁分选。虽然肿瘤表位是高度可变的，但是WBC细胞表面标记已被完善建立；向这一高通量微流体细胞分离装置施用磁性缀合的抗WBC抗体能够由此排除绝大多数的WBC，以暴露出少量的不带标签的CTCs(图1A)。CTC-iChip被改造用于鼠科造血细胞的耗竭，并施加至KPC胰腺癌小鼠模型。该PDAC模型生成显著数量的CTCs(Rhim等，2012；Yu等，2012)。每WBC使用100个抗CD45珠对全血进行标记，实现在正常小鼠、荷载正位肿瘤的小鼠和遗传学上工程化的KPC小鼠中>103的耗竭(图1B和图4A-图4C)。
利用加入至小鼠全血的带有GFP标签的NB508小鼠胰腺癌细胞，并使其通过CTC-iChip处理，以平均值的95％(±3％std)测量CTC的回收(图4A-图4C)。NB508细胞为之前从相同的Kras/Trp53-驱动的KPC小鼠模型生成的胰腺瘤中产生(Bardeesy等，2006)。作为比较，对于相同细胞，使用基于小鼠CTCs的抗EpCAM捕获物的替代的微流体平台仅能实现的35％的回收(Yu等，2012)。在所测试的全部三只小鼠中，对衍生自带有GFP标签的NB508细胞胰腺接种的正位肿瘤施用CTC-iChip，产生>1000CTCs/mL(图4A-图4C)。最后，用遗传学上工程化的KPC模型对CTC-iChip进行测试，随后对分离的细胞进行上皮标记广谱细胞角蛋白(CK)vs.白细胞标记CD45的双重免疫荧光染色，显示出中位数为118CTCs/mL(平均429CTCs/mL，范围0-1649)(图1C)。从7只健康对照小鼠中未分理出CK阳性细胞。在微流体装置中不能偏转的大部分CD45阳性细胞在其表面保留了一些免疫磁珠。因此，在CTC-iChip产物中易于将CTCs与WBCs进行区分，使得能够在不需要对上皮特异性细胞表面表位(例如EpCAM)进行染色的条件下进行单细胞操作。
单CTC RNA测序。五只荷瘤的KPC小鼠产生总共168个单个CTCs，使其经受改造的初始cDNA扩增和文库方案(Tang等，2010)，并对RNA质量(Gapdh，Actb)、胰腺标记(Krt8、Krt18、Krt19、Pdx1)的存在和WBC标记(Cd45/Ptprc)的缺乏进行筛选(图5A-图5C)。其中，75个(45％)具有足够进行进一步扩增和文库构建从而实施下一代测序的质量。值得注意的是，候选CTCs的大部分(55％)表现出形态完好，然而具有降解的RNA。这些细胞可能代表血流中丧失活力的肿瘤细胞。鉴于对来自小鼠模型的血液样本的快速处理，微流体装置中的最小的剪切条件，以及经同样处理的对照细胞的保留的RNA质量，细胞不太可能在体外纯化过程中经历此类损伤。为与胰腺CTCs进行比较，还对来自对照小鼠的12个WBCs、来自小鼠NB508胰腺癌细胞系的16个单细胞以及12个小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)进行单细胞RNA测序。来自NB508和MEF培养物的超过90％的单细胞满足测序质量的标准，突出显示了在相同条件下具有受损的RNA模板的CTCs的高频率。为了比较CTC谱与CTC分离时收集的匹配的亲代肿瘤的谱，将来自各原发肿瘤的块状RNA(bulk RNA)稀释至1或10细胞当量(10pg或100pgRNA)，并经受相同的扩增和RNA测序方案(n＝34；来自4个匹配肿瘤的至少8个重复)。
单细胞RNA测序表现对于全部的经分析的样本而言是可比的，具有平均440-850万的读数，其中平均46％-61％被特有地与基因组比对(图5A-图5C)。使用UCSC已知基因转录组参考对基因组比对的读数进行注释和计数，并以每百万读数(RPM)进行归一化。随后通过非监督分级聚类分析经归一化的读数(数据未示出)。来自MEFs、NB508胰腺癌细胞系和正常的WBCs的单细胞转录组紧密地成簇，支持了RNA测序策略的分析可靠性。识别出候选CTCs的五个不同的簇，全部与匹配的原发肿瘤序列以及癌症衍生的细胞系不同。主成分分析表明这些不同的组的组间关系和成簇(图2)。
KPC小鼠模型中的PDAC的一致的遗传驱动物使得能够对衍生自个体小鼠和不同小鼠间的CTCs中的细胞异质性进行定量测量。通过计算簇内相关系数来评估各CTC簇内的单细胞异质性，其中，较低的相关系数反应出较高的异质性(图5A-图5C)。正如所期望的，与从NC508癌细胞系衍生的单细胞(平均0.86，95％CI，0.80-0.91，p值1.2×10-15)相比，CTC簇显示出相当高的异质性(平均0.42，95％CI，0.36-0.47)。为了评估原发PDAC内的细胞的异质性，将条件性Tomato/EGFP(mT/mG)表达标记(Muzumdar等，2007)与KPC小鼠杂交，从而生成带有品系标签的小鼠肿瘤(KPC-mT/mG)，可将其用于从污染的间质细胞中分离出单个EGFP阳性的原发肿瘤细胞。将原发肿瘤(TuGMP3)分解为单细胞悬液，并使20个EGFP阳性细胞接受RNA测序。单个原发肿瘤细胞被很好地成簇于之前分析的块状肿瘤物质内(数据未示出)，并具有类似于CTCs的异质性得分(平均0.38，95％CI，0.28-0.47)(p值0.49)。
总之，本文所述的为对无阳性筛选偏倚分离的小鼠胰腺CTCs、亲代肿瘤、所建立的基因型匹配的癌细胞系、MEFs和WBCs进行单细胞RNA测序。CTCs与原发肿瘤(块状肿瘤和分离的单细胞均是)以及肿瘤衍生的细胞系分别成簇，CTCs和原发肿瘤细胞之间具有可相比程度的的细胞间异质性。
胰腺CTCs子类的界定。为了对候选CTCs进行识别和分类，向全部的成簇的样本施加已知的上皮、造血和内皮标记的基因集合。如所期望的，上皮标记(Krt7、Krt8、Krt18、Krt19、Epcam、Egfr、Cdh1)在原发胰腺肿瘤和癌细胞系NB508中高表达，在非上皮的MEFs和正常的WBCs中几乎不存在(数据未示出)。与此相比，造血标记(Ptprc/Cd45、Csf3r/Cd114、Cd14、Fcgr3/Cd16、Itga2b/Cd41、Itgb3/Cd61)存在于正常的WBCs中，而在NB508和MEFs中不存在。在块状原发肿瘤样品中可检测到造血标记的一些表达，这与白细胞浸润的不同程度相一致。基于特征性标记的表达(Cdh5/Cd144、Vwf、Thbd/Cd141、Pecam1/Cd31、Mcam/Cd146、Sele/E-选择蛋白、Cd34)以及上皮和造血标记的不存在，未识别出特异性的内皮细胞簇。
使用上皮、造血和内皮标记对通过来自荷瘤的小鼠CD45耗竭分离的单细胞进行研究，显示五个主要的候选CTC群体(簇1、簇3、簇4、簇5和簇9，数据未示出)。簇3、簇4和簇5全部为更大群体的一部分，显示出上皮标记的强力表达，这与“典型”CTCs(标示为CTC-c)相一致。这些细胞的一个子类表达Cd34(其为内皮祖细胞标记，也见于包括MEFs在内的间充质细胞(数据未示出)和间质细胞中(Krause等，1994))，然而不存在其它特征性的内皮系标记。簇1和簇9更复杂，前者值得注意的是血小板标记CD41(Itga2b)和CD61(Itgb3)的富集(因此标示为CTC-plt)；而后者具有突出的细胞增殖指征(CTC-pro)。
为了更好地界定各候选CTC簇的特征，使用包括秩生成(rank product，RP)方法在内的非参数的差异化基因表达分析，所述秩生成(RP)方法适应于绝对转录物水平的改变和代表细胞至细胞间的转录组方面的差异(Breitling等，2004)。设定非常严格的参数(FDR≤0.01)，原发肿瘤vs.WBCs中的对照比较识别出肿瘤中相对过表达的927个基因和WBCs中高表达的293个基因(包括所期望的上皮肿瘤标记角蛋白7、角蛋白8、角蛋白18和角蛋白19相对于白细胞特异性CD45的差异表达(数据未示出))。“典型”的CTC-c簇与WBCs的比较也显示出CTCs中的细胞角蛋白18、细胞角蛋白19以及WBCs中的CD45的富集，确证了RP方法对单细胞群体间相对差异化表达的基因的识别。
作为最丰富的CTC簇，CTC-c包含满足上皮肿瘤细胞建立标准的75个细胞中的41个(55％)(相较于CTC-plt：32％；CTC-pro：13％)。值得注意的是，仅具有多发性大规模转移的小鼠(MP7)具有处于该类别内的大量的CTCs。与匹配的原发肿瘤相比，CTC-c细胞具有表达升高的878个转录物以及表达降低的774个基因(表2)。CTC-c富集的基因的基因本体(GO)分析(表3)表明富集与如下相关的指征：细胞与环境信号相互作用(GO:0045785—细胞粘附的正向调节；GO:0048584—刺激应答的正向调节)、细胞形态和结构(GO:0030036—肌动蛋白细胞骨架组建；GO:0060429—上皮细胞发育)以及转录状态(GO:0045449—转录的调节；GO:0051276—染色体组建)。为了评估CTC-c细胞中通过外部刺激激活的信号转导通路的贡献，利用KEGG数据库对富集的基因进行注释(表1)。类似地，京都基因与基因组百科全书(KyotoEncyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路分析显示出在黏着斑(让步比[OR]2.7，q值6.7 3 10.4)和肌动蛋白细胞骨架的调节(OR 2.4，q值0.005)方面富集。尤其是，在所注释的KEGG信号通路中，促分裂素原激活的蛋白激酶(MAPK)通路最为富集。最有代表性的是MAPK通路(OR 2.2，q值0.006)；MAPK信号转导已在KrasG12D驱动的原发肿瘤中被激活。然而，虽然与CTCs相比，MSigDB Kras依赖性指征在原发肿瘤中富集，CTCs具有增高的Braf、Mras和Rras2表达，表明CTCs中的进一步激活MAPK的替代通路。这一发现与使用基于微阵列的方法识别出MAPK通路在胰腺CTCs中最高度富集的另一研究一致(Sergeant等，2012)。
CTC富集的基因也具有完善建立的涉及转移的信号转导通路的代表，包括TGF-β(Ikushima和Miyazono，2010；Siegel和Massague，2003)、WNT(Anastas和Moon，2013；Clevers和Nusse，2012；Katoh和Katoh，2007)以及VEGF(Carmeliet和Jain，2011；Folkman，1995)。在该胰腺癌CTCs的同期组群中，与原发肿瘤相比，在CTCs中Wnt4和Tgfb2最高度富集，暗示了自分泌信号转导参与这些主要的通路。除这些完善限定的转移的贡献因素外，CTC表达分析还表明出乎预料的信号转导通路的激活，包括神经营养因子、toll样受体和B细胞受体通路。已经报道了在胰腺癌中的神经营养因子通路活化(特别是与增高的神经周围侵袭相关)(Miknyoczki等，1996；Miknyoczki等，1999；Ohta等，1997；Wang等，2009；Zhang等，2005)。Toll样受体和B细胞受体通路在CTC读数中具有较小的代表性，然而它们表明了免疫调控信号转导组分的异常活化。最后，CTC衍生的培养物的建立对于这些活化的信号转导通路的功能显著性测试而言是需要的。
虽然CTC-c簇中的单细胞满足肿瘤细胞的特征标准，对非典型CTC簇(CTC-plt和CTC-pro)的特性的界定需要额外的分析。与CTC-c相比，CTC-plt簇内的单细胞在伤口愈合和止血指征以及MSigDB血小板和巨核细胞表达谱方面具有高的富集(表4)。这表明这些细胞为循环的巨核细胞/巨血小板或者为覆盖有粘附的血小板的CTCs。肿瘤细胞特异性品系标签支持了对作为肿瘤起源的CTC-plt细胞的识别。使来自两只KPC-mT/mG小鼠的18个带有EGFP品系标签的单个CTC接受单细胞RNA测序：使用非监督分级聚类，将来自两只小鼠的总共9个CTCs(7/7CTCs来自小鼠GMP1，2/11来自小鼠GMP2)囊括于CTC-plt中(数据未示出)。因此，CTC-plt簇包含表现出强的血小板标记的CTCs，该血小板标记最有可能衍生自通过所粘附的血小板编码的转录物。有意思的是，甚至在全部的经注释的血小板转录物的数字移除(digital removal)后，CTC-plt细胞维持了其与CTC-c的明确的间隔(数据未示出)。如同最近的体外模型实验所表明的，由此可能的是丰富的血小板的粘附可调控内在的CTC表达谱(Labelle等，2011)。
CTC-pro簇与NB508胰腺癌细胞系和MEFs二者最为相似，当与CTC-c进行比较时，CTC-pro富集细胞增殖标记Mki67。多个品系有可能有助于该复杂分群：来自肿瘤限制的带有EGFP品系标签的KPC小鼠的CTCs与CTC-pro成簇(数据未示出)，值得注意的是在MSigDB中注释的细胞周期指征和Mki67的丰富表达(Whitfield等，2002)(数据未示出)。在CTC-pro簇内的一个单细胞衍生自胰腺癌细胞系NB508，而另一(MP3-2)具有典型CTCs的高的角蛋白/高的E-钙粘蛋白表达特征(数据未示出)。然而，通过其抗原加工和递呈基因的表达所识别的另一子类包含免疫和树突细胞(GO:0019886-经由II类MHC的外源肽抗原的抗原加工和递呈；表5)。总之，CTC-pro簇看起来代表一群高度增殖的细胞，其子类为肿瘤衍生。
总之，单个胰腺CTCs的无偏分离和RNA测序评估表明这些CTCs中超过一半无活力，其RNA处于降解的不同阶段。在剩余的有活力的CTCs中，通过非监督聚类区分了三个主要类群：典型子类(CTC-c)，占55％；第二血小板粘附类群(CTC-plt；32％)以及第三由增殖指征标记的异质簇(CTC-pro；13％)。鉴于其最清楚地限定的肿瘤衍生的特征，我们选择CTC-c簇进行转移相关通路的详细分析。
胰腺CTCs共表达上皮、间充质和干细胞标记。已通过KPC小鼠模型中的品系跟踪研究，支持了胰腺癌中的EMT与早期转移的关联(Rhim等，2012)。本发明人最近报道了人乳腺癌CTCs中的单个CTC内的上皮和间充质标记的分布，反映出肿瘤组织学以及对不同疗法的应答或耐受性(Yu等，2013)。为了直接测试小鼠胰腺CTCs中的EMT，使用经建立的上皮(E)和间充质(M)标记(Kalluri和Weinberg，2009)来评估CTC-c簇内的各细胞(数据未示出)。与原发肿瘤相比，CTC-c细胞展示出上皮标记E-钙粘蛋白(Cdh1)和Muc1的清楚的丧失；而间充质转录物为混合的，一些显示出增高的表达(Cdh11、Vim)，而其它具有降低的水平(S100a4、Itga5、Sdc1)(图3A和图3B)。尤其是，甚至在CTCs中上调的间充质基因显示出单细胞间的高度的异质性表达(数据未示出)。与此相比地，上皮标记的丧失(包括E-钙粘蛋白(Cdh1))在全部典型CTCs中几乎是普遍存在的。
还认为CTCs在转移前体方面富集，能够起始转移性肿瘤的沉积(deposit)。正如在识别这些细胞中所建立的干细胞标记的关联性所表明的，此类前体细胞和假定的癌干细胞间的关系不确定。在单细胞RNA测序读数中对推测的胰腺癌干细胞基因(Rasheed和Matsui，2012；Rasheed等，2010)进行评估(图3B)。在测试的全部候选标记(Aldh1a1、Aldh1a2、Prom1/Cd133、Cd44、Met、EpCAM)中，仅Aldh1a1和Aldh1a2在CTCs中富集。典型的CTCs主要表达Aldh1a2同工型，而CTC-plt细胞富集Aldh1a1，但这些同工型也在一些单个CTCs中共表达。MEFs、NB508胰腺癌细胞和正常的WBCs也表达Aldh1a1，然而不表达Aldh1a2(数据未示出)。在单个CTCs中，Aldh1同工型的表达和间充质基因Cdh11或Vim的富集之间没有关联，表明这两个生物标记并不具内在关联性。
鉴于将Aldh1a2识别为CTCs表达的潜在的干细胞样标记，利用RNA原位杂交(RNA-ISH)测试其在匹配的原发肿瘤内的表达。肿瘤内的表达模式为异质性的：表达Aldh1a2的细胞主要位于肿瘤的“间质”或非上皮(即，角蛋白少)区室内(数据未示出)。这些非上皮细胞(其在胰腺癌中特别丰富)的起源可能是混合的。人胰腺癌中的组织学评估和阴性KRAS突变分析(Biankin等，2012；Ogino等，2005)均表明这些细胞中的大部分代表反应性成纤维细胞或间质，而非是肿瘤起源。然而，最近的KPC小鼠品系跟踪显示出，这些被假定为间质的细胞的小部分事实上为肿瘤衍生的，并推定发生EMT从而表现为成纤维细胞(Rhim等，2012)。有意思的是，具有最多转移和最高数量的Aldh1a2阳性CTCs(MP7)的小鼠也具有最高水平的Aldh1a2的原发肿瘤。在该情形下，Aldh1a2阳性细胞广泛地存在于间质区室内，并包含了上皮(角蛋白高)组分的小的亚群体(数据未示出)。因此，角蛋白高、表达干细胞相关基因Aldh1a2的典型CTCs在原发肿瘤中的表达限于间质(角蛋白低)区室，且仅为上皮细胞的小的亚群体。
典型CTCs共享间质富集的基因的表达。除了CTCs的明显多样性外，认为共享转录物可能提供关于其在原发肿瘤内的细胞起源、其侵袭并在血流内存活的机制以及CTC特异性治疗靶标的最终识别的进一步理解。选择严格的标准来识别最高度富集的CTC转录物(RP得分<300)，所述CTC转录物在≥90％的全部典型CTCs中以极高水平表达(>100RPM)。三个基因满足这些标准：核心蛋白聚糖(Dcn)，在多种不同癌症的肿瘤间质中表达的胞外基质蛋白聚糖(Adany等，1990；Bostrom等，2013；Henke等，2012；Hunzelmann等，1995；Iozzo和Cohen，1994；Mu等，2013；Nash等，2002)；胰岛素样生长因子结合蛋白5(Igfbp5)，人PDAC中表达的胞外生长因子结合蛋白，据报道同时具有增殖性质和抗增殖性质(Johnson等，2006；Johnson和Haun，2009)；以及Kruppel样因子4(Klf4)，干细胞(iPS)重编程关键因子之一(Takahashi和Yamanaka，2006)，胰腺癌的发展牵涉该因子(Brembeck和Rustgi，2000；Prasad等，2005；Wei等，2010)。借助RNA-ISH，Dcn在肿瘤的间质要素中广泛表达(图6)。引人注目的是，Igfbp5和Klf4均集中且主要地在沿肿瘤的上皮区室边缘的表现为间质的细胞内表达(数据未示出)。EGFP品系限制的原发肿瘤的RNA-ISH证实，上皮/间质界面处的Igfbp5阳性细胞为肿瘤起源的(数据未示出)。除了该过渡区外，对该带有EGFP标签的肿瘤中的Klf4的分析也发现其在上皮管(epithelial ducts)的子类中表达(数据未示出)。值得注意的是，虽然Igfbp5和Klf4仅在原发肿瘤细胞的小的子类中表达，在全部的典型CTCs的85％中Igfbp5和Klf4高度共表达。与CTCs中的明显的混合的上皮/间充质标记一起，这些观察提出了如下可能性：许多CTCs衍生自上皮/间质界面处可由Igfbp5和Klf4表达界定的灶点(foci)。
除了三个最高表达的转录物外，值得注意的是，CTCs高水平表达牵涉间质细胞基质的基因。对全部的CTC富集的基因的基因本体分析(表3)识别了60个胞外蛋白(GO:0044421，OR 1.7，q值6.4×10-3)，发现其中32个为蛋白质性质的胞外基质(ECM)(GO:0005578，OR 2.4，q值4.8×10-3)。最近的研究强调了反应性间质对胰腺癌的发病机制和转移的重要性(Feig等，2012；Neesse等，2013；Neesse等，2011；Olive等，2009；Provenzano等，2012)，然而，循环的肿瘤细胞内的这些间质相关ECM基因的表达是出乎预料的。为了识别小鼠胰腺肿瘤模型中的主要的间质富集的基因，我们对块状肿瘤样本(代表混合有反应性间质细胞的肿瘤细胞)与从原发肿瘤(TuGMP3)纯化的带有EGFP标签的单细胞进行了RP差异化表达分析。相比于单个原发肿瘤细胞，在块状肿瘤中总共富集了51个蛋白质性质的ECM基因(GO:0005578，OR 4.8，q值3.4×10-18)。其中，6个基因(Ccdc80、Col1a2、Col3a1、Dcn、Sparc、Timp2)与之前识别的CTC富集的基因集合共享(数据未示出)。如上所指出的，识别出在CTCs中最高度富集的是核心蛋白聚糖(Dcn)(中位数10,686rpm)，其在98％的CTCs中高水平表达(>100rpm)。第二高度丰富的基因是Sparc(中位数3,913rpm)，其在88％的CTCs中高表达。这两个基因在88％的典型CTCs中以高水平共表达。对原发肿瘤的Dcn(图6)和Sparc(数据未示出)进行的RNA-ISH均证实，这些基因的表达遍布反应性间质，而不存在于原发肿瘤的上皮角蛋白富集区。
间质衍生ECM基因的表达为全部的典型CTCs的共有特征，虽然其Kras/p53遗传驱动物相同，在这些基因中有明显的小鼠特异性偏倚。这些小鼠特异性成簇在非监督分析中明显(p值＜2.2×10-16)。例如，用来自小鼠MP6的单个CTCs代表的亚簇3占比过高，而对于小鼠MP7，亚簇4富集；且对于小鼠MP2，亚簇5富集。通过RP分析，在小鼠MP2和MP7的CTCs之间的差异化表达的68个转录物中，基因本体表明11个胞外蛋白的显著富集(GO:0044421，OR3.8，q值0.06)，其中7个见于蛋白质性质的ECM中(GO:0005578，OR 6.3，q值0.05)(数据未示出)。总之，这些数据显示出，小鼠胰腺癌模型衍生的大部分CTCs以高水平表达ECM基因的集合，并通常见于原发肿瘤的间质、而非上皮区室中。这可反映出在上皮/间质界面处的许多CTCs的起源，与特有的限制性标记(例如Igfbp5和Klf4)的表达一致。遗传学上匹配的各小鼠肿瘤生成具有共享和特有的ECM基因表达模式的CTCs这一事实表明了肿瘤特异性侵袭通路，该肿瘤特异性侵袭通路被置于CTCs的本质特征之上。通过CTCs表达的胞外蛋白的高水平为靶向这些转移前体提供了出乎预料的机会。
人胰腺CTCs表达ECM蛋白SPARC。为了确定ECM蛋白表达与人类疾病的关联性，从转移性PDAC患者的血液中分离CTCs，并使其接受单细胞RNA测序。对来自3个患者的7个胰腺CTCs的分析显示出，大部分表达界定了其上皮起源的角蛋白，并且在小鼠CTCs中富集的60个胞外蛋白基因中的总共13个在至少一个的人胰腺CTC中以高水平表达(>100rpm)(图7)。人SPARC是在全部的人胰腺CTC中以高水平发现的唯一的基因。对人前列腺和乳腺CTCs的分析也显示出包括SPARC在内的胞外蛋白的显著表达，强调了这些靶标为转移性上皮癌细胞中所普遍共享(数据未示出)。小鼠和人PDAC中的Sparc/SPARC的RNA-ISH发现Sparc/SPARC表达主要局限在肿瘤的间质区室(数据未示出)。SPARC的表达见于196/198(99％)的人原发PDAC肿瘤和36％的阳性肿瘤中，该阳性肿瘤在上皮肿瘤细胞中(虽然为总体信号的少数)具有一些可检测的SPARC。SPARC作为胞外蛋白的存在使得能够进行靶向SPARC的抗体针对性疗法。总之，这些数据表明在小鼠胰腺CTCs中的发现也可在人类疾病中找到，并同时提供了新的生物标记和治疗靶标。
讨论
本文所述的为使用单细胞RNA测序进行的CTC组成和多样性的详细分析。总之，在93个单一的小鼠胰腺CTCs中获得高质量的转录组，并与来自匹配的原发肿瘤的20个单细胞、块状肿瘤制备物以及来自从相同小鼠胰腺肿瘤模型建立的永生化细胞系的16个细胞进行比较。使用密切匹配人PDAC的小鼠模型，使得能够对同时分离的原发肿瘤试样与CTCs进行比较。鉴于KPC小鼠模型中共享的Kras/Trp53遗传驱动物，还能够检查个体小鼠内和不同动物之间的CTC异质性。最后，CTC-iChip技术的使用使得能够不管其细胞表面表位而选择不带标签的CTCs，从而避免了与肿瘤标记特异性细胞纯化相关的任何偏倚。总之，这些观察结果包括如下：1.CTCs成簇为多个子类，包括主要的“典型CTC”组，以及通过血小板衍生标记或增殖指征标记的其它组；2.虽然单个小鼠肿瘤可产生纳入这些簇中的各簇的CTCs，尽管它们共享遗传驱动物，衍生自个体小鼠的CTCs具有独特的模式；3.通过实质上全部的典型CTCs所共享的共同标记包括上皮以及间充质标记、Aldh1a2干细胞标记以及识别定位于原发肿瘤的上皮/间质边界处的灶点的两个高度表达的转录物(Igfbp5和Klf4)；以及4.几乎全部的典型CTCs共享的最高度富集的CTC特异性转录物编码与肿瘤间质区室相关的胞外基质蛋白。
与之前的部分纯化的块状CTC群体的RNA测序相比，本文报告的单细胞分析提供了肿瘤细胞特异性读数的明显更深的深度。就这一点而言，对来自小鼠胰腺癌模型的典型CTCs的详细分析是史无前例的。本文展示了胰腺癌CTCs一致地丧失了上皮标记E-钙粘蛋白(Cdh1)(上皮-至-间充质转化的关键特征)的表达。然而，细胞不会丧失其它上皮标记(例如细胞角蛋白)的表达，且典型EMT间充质标记(例如波形蛋白)也没有一致性的增加。就这一点而言，大多数典型CTCs表现出在双表型状态的停滞。虽然其表达细胞角蛋白(存在于原发肿瘤的上皮成分中)，CTCs中的大部分其它高表达的标记为与原发肿瘤的非上皮或“间质”成分所共享。这些间质基因中在典型CTCs中表达的为Aldh1a2(推定的胰腺癌干细胞标记)(Rasheed和Matsui，2012；Rasheed等，2010)。转移前体中的Aldh1a2是否为具有细胞可塑性的功能显著标记仍有待确定。
与共享的典型CTCs的上皮和间充质状态相关的令人兴奋的观察结果是，它们的实质上一致(>85％)的Igfbp5和Klf4的高水平共表达，这两个基因仅在原发肿瘤内的上皮/间质界面处的细胞的小的亚群体中表达。这提出了有趣的可能性：肿瘤内的这一关键定位产生不成比例部分的有活力的CTCs。实际上，活跃地经历EMT的肿瘤细胞有可能在上皮-间质部分富集，有助于肿瘤间质与肿瘤衍生和非恶性的反应性细胞类型的混合品系。特别值得注意的是，胚胎发育和胰腺恶性肿瘤中的IGF信号转导和Klf4转录调节二者的潜在作用使得其在肿瘤以及CTCs中产生独特的表达模式。
最后，来自该单一CTC RNA测序研究的最为出乎预料的发现是绝大多数典型CTCs上的ECM蛋白的极高水平的丰度。尤其是，对匹配的原发和转移性的乳腺肿瘤的现有评估识别了作为转移中的ECM分子富集的最普遍的基因表达差异，包括一些18％差异化表达的基因(Weigelt等，2005)。虽然这被解释为反映了转移位点的局部环境的差异，本发明的数据表明ECM蛋白被CTCs自身高度表达。类比于经典的“种子相较于土壤”的争辩(Fidler，2003)，CTCs可能实际上是携带一些其自身土壤的种子。
CTCs的详细的分子分析的最终目的是理解CTCs的产生过程和其治疗脆弱性。就这一点而言，衍生自目前的单一CTC RNA测序分析的重要观察结果是胞外蛋白(主要具有在ECM中发现的蛋白)出乎预料的表达。CTCs中丰度最高且普遍共享的两个ECM蛋白是Dcn和Sparc，二者均为建立的肿瘤间质基因。尤其是，表达间质的Sparc看起来结合白蛋白缀合的包含化疗剂的纳米颗粒(白蛋白结合型紫杉醇(nab-paclitaxel))，使得能够提高在人PDAC中的细胞毒性和效力(Neuzillet等，2013；Von Hoff等，2011；Yardley，2013)。实际上，作为改进化疗剂递送和从其支持性微环境中剥离肿瘤细胞的手段，已针对靶向胰腺癌间质做出大量努力(Neesse等，2011；Olive等，2009；Provenzano等，2012；Rasheed等，2012)。这些基因产物也被CTCs表达的发现表明抗体导向的治疗不仅可用于针对原发肿瘤间质，也可靶向转移入血液中的肿瘤细胞。
如本文所述，目前的CTC分析从将其匹配至已知的肿瘤界定标记延伸至对其特有性质进行研究，所述特有性质区分CTC与大部分原发肿瘤以及能够成为CTC在血流中存活并产生远端转移的能力的基础。对人癌转移的细胞处理的此类深刻理解对于预防原发肿瘤扩散至远端器官的终极目标而言是关键的。
实验程序
小鼠和细胞系。在这些实验中使用的患有胰腺癌的小鼠为如之前所述的(Bardeesy等，2006)表达Pdx1、LSL-KrasG12D以及Trp53lox/+或Trp53lox/lox驱动的Cre。通过将mT/mG小鼠(Jackson Laboratory-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato，-EGFP)Luo/J)饲养成为用于KPC小鼠生成的繁殖对，生成带有EGFP胰腺品系标签的KPC小鼠。从JacksonLaboratory购买正常的FVB小鼠。全部的小鼠照料和规程按照MGH SRAC批准的方案进行。
CTC富集技术的改造。鉴于期望无偏的富集系统，对于该应用选择之前展示的负性耗竭(negative depletion)技术(Ozkumur等，2013)。除了将大鼠抗小鼠CD45抗体(BAM114，R&D Systems，USA)缀合至MyOne珠外，全部处理方案与之前认定的相同。
单细胞显微操作、扩增和测序。在全血抗CD45负性耗竭之后，将含有富集细胞的产物收集在35mm陪替氏培养皿中，并使用Nikon Eclipse TiTM倒置荧光显微镜查看。基于完整的细胞形态学和缺乏抗CD45磁珠标记来识别感兴趣的细胞。在Eppendorf
Figure BDA0001084465270001131
NK2显微操作器上，对这些靶细胞分别用10μm转移枪头进行显微操作，并排出至含有RNA保护性裂解缓冲液的PCR管中，并立即在液氮中进行速冻。利用改良的方案对单细胞进行扩增(Tang等，2010)，并在ABI 5500XLTM系统上测序。
RNA原位杂交(RNA-ISH)。根据Affymetrix QuantiGene ViewRNA ISH Tissue-2Plex AssayTM实施RNA-ISH。
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表1：KEGG定义的信号转导通路中的CTC富集基因的注释。*表明基因见于多个通路基因集合中。
Figure BDA0001084465270001191
表2：通过秩生成显著表达的基因(FDR<0.01)
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表3：利用BP_FAT和CC_FAT数据集，CTC-c富集基因中的最显著的基因本体条目
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表4：CTC-c vs CTC-plt中富集的最显著的基因集合
Figure BDA0001084465270001421
表5：CTC-c vs CTC-pro中富集的最显著的基因集合
q值<0.01
Figure BDA0001084465270001422
实施例2：补充方法
小鼠和细胞系。在这些实验中使用的患有胰腺癌的小鼠为如之前所述的(Bardeesy等，2006)表达Pdx1、LSL-KrasG12D以及Trp53lox/+或Trp53lox/lox驱动的Cre(否则称为KPC)。通过将mT/mG小鼠(从Jackson Laboratory购得-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato，-EGFP)Luo/J)饲养成为用于KPC小鼠生成的繁殖对，生成带有EGFP胰腺品系标签的KPC小鼠。从Jackson Laboratory购买正常的FVB小鼠。全部的小鼠照料和规程按照MGHSRAC批准的方案进行。
对于心脏穿刺术，给予动物异氟烷镇静剂，胸腔壁用乙醇消毒，在胸廓之上制造皮肤切口以暴露胸腔并消除正常皮肤的上皮细胞污染。将23号针用于抽取约1mL血液进入装有100μL PBS-10mM EDTA pH7.4(Gibco)的1mL注射器中。通过加入浓缩的500mM EDTA的药丸剂或者用10mM EDTA进行1:1稀释，将血EDTA浓度升高至5mM，随后按照动物方案指导对动物进行安乐死。
将先前从该内源性模型中发展的原发肿瘤生成的小鼠胰腺细胞系NB508(Pdx1-Cre/KrasG12D/Trp53lox/+)通过慢病毒进行GFP转染(NB508-GFP)。该细胞系用于加入细胞(spiked cell experiments)实验和正位肿瘤形成。
使用RPMI-1640培养基+10％FBS+1％Pen/Strep(Gibco/Invitrogen)将NB508-GFP细胞系维持在标准培养条件下。
对于正位实验，将NB508-GFP细胞正位注射入健康同系(FVB背景)小鼠的胰腺。简单来说，用异氟烷将小鼠麻醉，用
Figure BDA0001084465270001431
脱毛产品处理左腹壁，并用70％乙醇灭菌。在左侧腹壁上部制造小切口，并使胰腺松动。将处于0.1mL总体积的PBS中的约100万个NB508-GFP细胞注入胰腺。通过无菌手术钉封闭腹膜和腹壁。使得肿瘤生长2周，此时，通过心脏穿刺术获得血液用于CTC-iChip处理。
CTC富集技术的改造。鉴于期望无偏的富集系统，对于该应用选择负性耗竭技术。除了将大鼠抗小鼠CD45抗体(BAM114，R&D Systems，USA)缀合至MyOne珠外，全部处理方案与之前认定的相同。
通过将约1000个表达GFP的NB508细胞加入至1mL健康小鼠血液中并进行处理以确定回收效率，进行加入细胞实验以对系统进行验证。使用正位模型以验证回收效率，以及从荷瘤小鼠初步确定期望的耗竭效率。在这些实验中，对富集的样本评价在产物中观察到的GFP+细胞的数量。
从内源性模型分离的CTCs的免疫染色。利用一抗-二抗方式将分离的CTCs旋涂在载玻片上并进行免疫染色。一抗为兔抗广谱细胞角蛋白(1:50，Abcam ab9377)和山羊抗小鼠CD45(1:500，R&D systems AF114)。将带有免疫荧光标签的二抗用于信号放大。二抗为驴抗兔Alexa Fluor 594(1:500，Invitrogen A-21207)和驴抗山羊Alexa Fluor 488(1:500，Invitrogen A-11055)。随后用DAPI对核进行复染，用PBS对玻片进行漂洗，盖上盖玻片并在4℃下储存。使用BioViewTMLtd.自动成像系统(Billerica，MA)以及自动正置荧光显微镜(Eclipse 90iTM，Nikon，Melville，NY)在10×放大倍数下成像。对潜在的CTCs进行打分需要CK阳性染色而无需CD45染色，随后手动检查。使用来自非荷瘤小鼠的试样建立阈值和基线信号。
单细胞显微操作。在全血抗CD45负性耗竭之后，将含有富集细胞的产物收集在35mm陪替氏培养皿中，并使用Nikon EclipseTMTi倒置荧光显微镜查看。基于完整的细胞形态学和缺乏抗CD45磁珠标记识别感兴趣的细胞。在Eppendorf
Figure BDA0001084465270001441
NK 2显微操作器上，对这些靶细胞分别用10μm转移枪头进行显微操作，并排出至含有RNA保护性裂解缓冲液(10×PCR缓冲液II、25mM MgCl2、10％NP40、0.1M DTT、SUPERase-In、Rnase抑制剂、0.5μMUP1引物、10mM dNTP以及无核酸酶的水)的PCR管中，并立即在液氮中进行速冻。
单细胞扩增和测序。如前描述(Tang等，2010)用如下指出的微调的方案进行单细胞扩增和测序。将来自抽提的单个循环肿瘤细胞的RNA样本在冰上融解，并在70℃下孵育90秒。为了生成cDNA，将样本用逆转录预混液(每1×体积0.33μL SuperScript IIITM逆转录酶、0.05μl RNase抑制剂和0.07μl T4基因32蛋白)进行处理，并在热循环仪上于50℃下孵育30分钟并于70℃下孵育15分钟。为移除游离的引物，将1.0μl EXOSAP混合物添加至各样本，在37℃下孵育30分钟，并在80℃下灭活25分钟。接下来，通过如下将3’-poly-A尾添加至各样本中的cDNA：在预混液中(每1×体积4.26μl H2O、0.6μl 10×PCR缓冲液II、0.36μl25mM MgCl2、0.18μl 100mM dATP、0.3μl末端转移酶和0.3μl RNase H)于37℃下孵育15分钟，并在70℃下灭活10分钟。第二条链cDNA通过如下合成：将各样本分为4份，并在预混液中(每1×体积13.654μl H2O、2.2μl 10×高保真PCR缓冲液、1.76μl 2.5mM的各dNTP、0.066μl100μM的UP2引物、0.88μl 50mM MgSO4和0.44μl Platinum Taq DNA聚合酶)于95℃下孵育3分钟、于50℃下孵育2分钟并于72℃下孵育10分钟。
用预混液(每1×体积6.7μl H2O、4.1μl 10×高保真PCR缓冲液、1.64μl 50mMMgSO4、4.1μl 2.5mM的各dNTP、0.82μl 100μM的AUP1引物、0.82μl 100μM的AUP2引物和0.82μl Platinum Taq DNA聚合酶)进行PCR扩增(95℃下3分钟；95℃下30秒、67℃下1分钟、72℃下6分6秒的20次循环)。将各样本的4个反应物合并，并使用QIAGEN PCR纯化试剂盒(Cat.No28106)进行纯化，以50μl EB缓冲液洗脱。通过使用qPCR测试基因Gapdh、ActB、Ptprc(CD45)、Krt8、Krt18、Krt19和Pdx1来选择样本。每个样本又分为4份，并用预混物(每1×体积59.1μl H2O、9μl 10×高保真PCR缓冲液、3.6μl 50mM MgSO4、13.5μl 2.5mM的各dNTP、0.9μl 100μM的AUP1引物、0.9μl 100μM的AUP2引物和1.8μl Platinum Taq DNA聚合酶)进行第二轮PCR扩增(98℃下3分钟、67℃下1分钟和72℃下6分6秒的9个循环)。将样本合并并使用Agencourt AMPure XP珠纯化，并以40μl 1×低TE缓冲液洗脱。
测序文库构建。为了使用Covaris S2TM系统剪切DNA，向各样本中添加1×低TE缓冲液和1.2μl剪切缓冲液。剪切程序的条件包括：6个循环、5℃水浴温度、15℃水浴温度限制、10％占空循环、强度为5、100个循环/爆发、以及60秒。然后，用预混液(每1×体积14μl H2O、40μl 5×反应缓冲液、8μl 10mM dNTP、8μl末端修整酶1和10μl末端修整酶2)将样本于室温下末端修整30分钟。用0.5×体积的Agencourt AMPure XPTM珠移除大于500bp的DNA片段。将上清液转移至分离管。为了按大小选择200-500bp DNA产物，加入0.3×体积的珠，并用70％EtOH洗涤样本2次。将产物以36μl低TE缓冲液进行洗脱。通过用预混液(每1×体积5μl A-Tailing Enzyme I、10μl 5×反应缓冲液和1μl 10mM dATP)处理，将dA尾添加至各按大小选择的DNA，在68℃下孵育30分钟，并冷却至室温。为了标记和区分用于测序的各DNA样本，使用5500SOLiD Fragment Library Enzyme ModuleTM(4464413)将条形码接头(5500SOLiD4464405)连接至DNA。在条形编码之后，使用Agencourt AMPure XPTM珠将样本纯化两次，并以22μl低TE缓冲液进行洗脱。在一轮PCR扩增(95℃下5分钟；95℃下15秒、62℃下15秒和70℃下1分钟的12次循环；以及70℃下5分钟)之后，用AMPure XP珠纯化文库。最后，为了对连接的DNA进行量化，使用SOLiD Library TaqMan Quantitation KitTM进行qPCR。完成的条形编码文库再用模板珠制剂进行乳液PCR，并在ABI 5500XLTM上进行测序。
RNA原位杂交(RNA-ISH)。将石蜡包埋的组织块进行新鲜切片并冷冻于-80℃下。从冷藏箱中移出后，在60℃下将玻片烘烤1h，并在室温(RT)下于10％甲醛中固定1h。使用Histo-ClearTM移除石蜡，并根据Affymetrix QuantiGene ViewRNA ISH Tissue-2PlexAssayTM实施RNA-ISHTM。在RT下于5％甲醛中进行固定之前，将组织切片在缓冲溶液中于95℃下预处理10min并用蛋白酶消化10min，使组织切片透化。应用靶探针装置并通过在40℃下孵育2h与组织杂交。以1:50的稀释度使用1型探针，所述1型探针包括Aldh1a2(VB1-14197)、Dcn(VB1-14962)、Klf4(VB1-14988)、Igfbp5(VB1-14987)和Sparc(VB1-14196)。6型探针包括1:50的EGFP(VF6-13336)和各自为1:100的合并的Krt8(VB6-11060)和Krt18(VB6-11059)。通过PreAmplifier和Amplifer QT混合物对靶探针装置的连续杂交，对信号进行放大。通过将6型标记探针施用于Fast Blue底物并将1型标记探针施用于Fast Red底物，检测靶mRNA分子。在RT下用Gill’s苏木精对组织复染10s。DAPI(Invitrogen，D3571；3.0μg/ml)染色进行1min。将利用Nikon 90i的荧光显微术用于对靶mRNA进行可视化。在Cy3通道中检测1型探针，在Cy5通道中检测6型探针。使用NIS-ElementsTM软件生成合并的图像。
确定每百万读数(rpm)。用小鼠基因组版本mm9以及来自genome.ucsc.edu由mm9已知基因列表定义的转录组的no-novel-juncs参数集合，利用tophatTM2.0.4版(Trapnell等，2009)和bowtielTM0.12.7版对有色区域读数进行比对。舍弃无比对或比对至基因组多个位置的读数。如果可能的话，利用来自genome.ucsc.edu的mm9列表knownToLocusLink将经比对的各读数映射至其外显子已被该读数比对了的基因。各基因读数的计数是映射至该基因的读数的数目。这一计数除以映射至任何基因的读出的总数目并乘以一百万，从而形成每百万读数(rpm)计数。由于注意到比对中存在3’偏倚，所以使用了rpm而不是rpkm。
非监督分级聚类和主成分分析。向rpm矩阵添加1和rpm矩阵的最小正值之中的最小值，以剔除0。随后对结果进行log10转换，生成称为log10(rpm)的矩阵。保留具有最高2000标准偏差的log10(rpm)矩阵的行(对应于基因)，弃去其它的行。随后对结果进行中位数平滑处理。用凝聚分级聚类对结果进行聚类，其平均连接具有的距离度量相当于1减去Pearson相关系数。计算log10(rpm)矩阵的主成分，绘出样本坐标相对于前三个主成分的图。
细胞异质性测量。对于样本簇的采集，将统计量M定义为簇中全部样本对的平均值的簇间的平均值，该簇具有对应于所述样本对的rpm矩阵的两列之间的相关系数的atanh。将“平均簇内相关系数”定义为tanh(M)。对样本进行刀切法(Jackknife)估计，以评估统计量s的标准偏差。将95％CI定义为tanh(M±sφ-1(0.975))，其中φ为标准正态分布的累积分布函数。为了计算零假设(所述零假设为簇的统计量M分布的平均值与所采集的簇的统计量M分布的平均值相同)的p值，我们令p＝2(1-φ(|M1-M2|/√(s2 1+s2 2)))。值得注意的是，针对相同数据实施自举法来替代刀切法并获得类似的结果(数据未示出)。
利用秩生成的监督的差异化基因表达。为了找到两组样本间的差异化表达的基因，用如上定义的log10(rpm)矩阵开始进行分析。移除对应于不在样本集合中的样本的列。随后移除其第90百分位的值小于log10(10)的移除的行。使用Bioconductor(Gentleman等，2004)RankProdTM软件包(2.28.0版本)的RP函数获得上调和下调的差异化表达的FDR估值。如果其FDR估值小于0.01，认为基因为差异化表达，然而如果有任何如下情况则弃去：该基因同时上调和下调差异化表达。
基因集合富集。在四组基因集合的集中考量富集：(1)全部的KEGGTM，如DAVIDTM6.7(Huang da等，2009)中发现的；(2)如DAVIDTM6.7中发现的使用GO_BP的基因本体(GO)；以及(3)如DAVID 6.7中发现的GO_CC。将超几何检验用于所述集的各基因集合，对发现的差异化表达的基因集合检验在基因集合的集中的富集。使用Benjamini-Hochberg方法将各集获得的p值转换为FDR估计(Benjamini和Hochberg，1995)。
全部的注释的血小板转录物的数字移除。将log10(rpm)矩阵中书真表达与具有如下名称的基因集合中的任何基因的表达的相关系数绝对值大于0.6的446个基因从log10(rpm)矩阵(如上定义)中移除：处于MSigDB v3.1中的GNATENKO_PLATELET_SIGNATURE和TENEDINI_MEGAKARYOCYTE_MARKERS。随后如上所述实施成簇。
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实施例3
小鼠胰腺CTCs的比较分析显示出60种胞外蛋白的富集(表6)。在人胰腺循环肿瘤细胞中进行这些特定生物标记和治疗靶标的评估，示出人胰腺CTCs中的最为丰富的靶标(图7)。这些胞外蛋白不仅代表潜在的生物标记，而且鉴于其作为肿瘤细胞外表面上的蛋白的性质，它们为治疗靶标。可例如通过基于抗体的治疗剂(例如，如在如下的情况中：用于HER2的曲妥珠单抗、用于EGFR的西妥普单抗以及用于VEGF的贝伐单抗)靶向表6的胞外蛋白，以治疗癌症。
表6：胰腺CTC富集的胞外蛋白的列表
Figure BDA0001084465270001491
Figure BDA0001084465270001501
Figure BDA0001084465270001511
将这些CTC富集的基因扩展至人胰腺、乳腺和前列腺单细胞CTC数据，识别出如表9所示的5个候选基因。
表9：借助RNA-seq的具有高表达的人单个CTCs的百分数
Figure BDA0001084465270001512
关注于胰腺癌，选择SPARC作为初始基因进行评估。小鼠和人原发肿瘤中的SPARCRNA-ISH(数据未示出)表明了间质细胞中的显著表达，为肿瘤提供了基本的微环境信号。本领域的大量努力关注为了治疗效力的目的靶向PDAC间质[1-4]，使得SPARC作为CTC治疗靶标以及间质导向的靶标。总共196/198(99％)的人胰腺肿瘤为SPARC阳性，且36％具有明显的上皮肿瘤细胞表达。
人胰腺癌细胞系的评估识别出5个细胞系中的3个具有升高的SPARC表达，这与增高的迁移行为相关(与转移行为相关联的替代的体外测定法)(图8)。
针对具有最高的SPARC表达的两个细胞系(PDAC2和PDAC3)，使用短的发夹RNA干扰(shRNA)对人胰腺癌中的SPARC的功能进行评估。实施多重体外测定法，包括增殖、迁移、侵袭、刮擦(scratch)和软琼脂。阻抑SPARC表达的最深远的影响是针对迁移行为(图9和数据未示出)，表明SPARC不仅存在于多个CTCs中，并且当在细胞系模型中被抑制时具有功能性结果。
鉴于这些数据，使用PDAC-3进行体内尾静脉接种，以确定SPARC敲减是否影响转移。尾静脉接种后2周的最初数据表明，当SPARC被shRNA抑制时，转移潜能降低，与83％的对照小鼠发生转移相比，具有抗SPARC的shRNA的细胞系中40％转移(图10)。
表面蛋白靶标
表9中识别的大部分靶标为分泌因子，将注释为细胞表面蛋白的基因的分析总结于表14中。
表14：具有高表达的表面蛋白基因的人单个CTCs的百分数
Figure BDA0001084465270001521
在本文考虑之列的是，鉴于这些基因将被整合入CTCs的质膜中，这些基因是靶标。一般而言，细胞表面标记的RNA表达趋向于低于细胞的实际蛋白水平。
在本文考虑之列的是用于治疗效用的针对IL6ST、SULF2和SV2A的抗体。
1.IL6ST——IL6、LIF、CNTF和制瘤素M的信号转导子
a.对于STAT3激活的下游是重要的。
b.已经开发针对IL6受体和IL6的抗体用于人类疾病(包括癌症)。
2.SULF2——通过移除6-O-硫酸基团来修饰硫酸肝素的硫酸酯酶
a.在癌症的进展和转移中富集的表达。
b.已经开发针对硫酸酯酶活性的药物，并在肝癌模型中测试其活性。
3.SV2Ａ——神经内分泌细胞中升高的突触囊泡糖蛋白
a.神经内分泌细胞的标记，其在人胰腺癌的上皮间质边界处出现。
b.癌症中的神经内分泌分化共同特征，并且预示着更严重的疾病。
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实施例4
循环肿瘤细胞(CTCs)从原发肿瘤脱落进入血流中，介导癌症血源性扩散至远端器官。为了界定其构成，对小鼠胰腺癌模型中的CTCs与匹配的原发肿瘤的全基因组水平表达谱进行比较，利用非表位依赖型微流体捕获来分离单个CTCs，随后进行单细胞RNA测序。CTC与原发肿瘤和肿瘤衍生细胞系分开成簇，显示出低的增殖指征、Aldhla2的富集、上皮和间充质标记的双表型表达以及Igfbp5(在上皮-间质界面处富集的基因转录物)的表达。小鼠以及人胰腺CTCs表现出间质衍生的胞外基质(ECM)蛋白(包括SPARC)的极高的表达，其在癌细胞中的敲减阻抑了细胞迁移和侵袭。CTCs异常表达间质ECM基因表明其有助于癌症扩散至远端器官的微环境信号。
典型CTCs主要表达Aldh1a2同工型，而Aldhla1在多种细胞类型中表达(数据未示出)。在单个CTCs内，Aldh1同工型的表达与间充质基因(Cdh11、Vim)的富集或上皮基因(Cdh1、Mucl)的丧失均无关，表明在CTCs中干细胞和EMT标记并不存在固有的关联。利用RNA原位杂交(RNA-ISH)对原发胰腺肿瘤进行Aldh1a2分析识别了表达该干细胞标记的罕见的上皮肿瘤细胞，然而大部分的表达存在于癌症相关的间质细胞内(图12A)，这与人PDAC中的ALDH蛋白的免疫组化相一致(Rasheed等，2010)。
除了CTCs的明显多样性外，对共享的转录物检索可提供关于其在原发肿瘤内的细胞起源、其侵系并在血流中存活的机制的进一步理解以及最终识别CTC特异性治疗靶标。选择严格的标准来识别最高度富集的CTC-c转录物(RP得分<300)，所述CTC-c转录物在R90％的全部典型CTCs中以极高水平表达(>100rpm)。三个基因满足如下这些标准：Kruppel样因子4(Klf4)，干细胞(iPS)重编程关键因子之一(Takahashi和Yamanaka，2006)；胰岛素样生长因子结合蛋白5(Igfbp5)，一种胞外生长因子结合蛋白；以及核心蛋白聚糖(Dcn)。利用RNA-ISH在原发肿瘤试样中识别这三个高度富集的CTC基因的潜在的共定位。与Aldh1a2相比，Klf4在原发肿瘤的上皮组分中表达(图12B)。Igfbp5特别令人感兴趣之处在于，其表达集中于肿瘤的上皮-间质界面处(图12C)。在本文考虑之列的是，如单个CTCs的RNA-seq所表明的，这一位置区域富集经历EMT的癌细胞，有助于混合的上皮/间质转录程序。
除了高度表达Dcn外，CTCs一致地具有高水平的多个ECM基因转录物。全部的CTC富集的基因的GO分析(表3)识别了32个蛋白质性质的ECM基因(GO:0005578，OR 2.4，q值4.8 310.3)。这些基因通常在反应性间质细胞中而非上皮癌细胞中表达；并且虽然最近的研究强调了间质在支持胰腺癌的发病机制和转移方面的重要性(Feig等，2012；Neesse等，2011，2013；Olive等，2009；Provenzano等，2012)，循环的肿瘤细胞内的这些间质相关ECM基因的表达也是出乎预料的。使用RP差异化表达分析，将CTCs与纯化的带有EGFP标签的原发肿瘤单细胞(TuGMP3)及块状肿瘤样本(肿瘤细胞与反应性间质细胞相混合)进行比较。六个蛋白质性质的ECM基因被CTCs和基质组分高度表达，而并不被原发肿瘤内的上皮细胞表达：Dcn、Sparc、Ccdc80、Col1a2、Col3a1和Timp2(数据未示出)。Dcn和Sparc二者的RNA-ISH分析证实了在小鼠原发肿瘤的间质要素中的广泛表达，而在上皮-间质边界的少数区域处这些转录物与角蛋白表达细胞共定位(数据未示出)。
SPARC为ECM蛋白基因。198个原发的人PDAC的RNA-ISH分析表明了在99％的情形下的SPARC转录物的丰富的间质细胞表达，以及上至三分之一的肿瘤具有罕见的表达该ECM基因产物的上皮细胞(数据未示出)。与这些观察结果一致的是，带有EGFP标签的单个原发肿瘤细胞的RNA-seq(数据未示出)识别出在20个细胞中仅有1个细胞(5％)具有高水平(>100rpm)的Sparc和Krt19的共表达。
概括来说，ECM基因的丰富表达是全部的富角蛋白的典型CTCs的共同特征。这与原发肿瘤成鲜明的对比，在原发肿瘤中这些基因产物被支持性间质细胞、而不是被上皮癌细胞所分泌。然而，在原发肿瘤的上皮-间质界面处的罕见的细胞看起来同时表达角蛋白和ECM基因，这与在CTCs自身中观察到的模式一致。
为了证实在血流中循环的人癌细胞的蛋白质性质的ECM基因的表达，从患有胰腺癌(n＝7)、乳腺癌(n＝29)和前列腺癌(n＝77)的患者分离单个CTCs，并使其接受单细胞RNA-seq。六个ECM蛋白基因在人CTCs中高度表达(在>15％的全部CTC样本中>100rpm)(图13；表13)。尤其是，三个基因(SPARC、MGP、SPON2)为ECM糖蛋白，其被定义为核心基质体(matrisome)的一部分(Naba等，2012)。核心基质体蛋白SPARC在胰腺CTCs中特别富集，在100％的胰腺CTCs(相比于31％的乳腺CTCs和9％的前列腺CTCs)中以高水平表达(>100rpm)。人上皮CTCs之间的ECM蛋白基因表达方面的显著差异表明微环境的组织特异性以及ECM蛋白信号转导方面的可能的冗余性。总之，人CTCs中的ECM基因家族成员的一致性表达表明其上调有助于从原发肿瘤产生CTCs、或者有助于在其循环进入血流时从微环境信号剥离的癌细胞的存活。
为了界定胰腺癌细胞中的SPARC表达的功能性结果，对一组来自患者的低传代PDAC细胞系的表达进行筛选。识别出了两个具有相对高的SPARC表达的人PDAC细胞系(PDAC2和PDAC3)，使得能够对小的发夹RNA(shRNA)介导的敲减的结果进行测试(图8、图9、图16A-图16D)。利用两个独立的shRNA构建体进行的PDAC2和PDAC3细胞系中的内源性的SPARC表达的阻抑不会影响2D培养物的增殖或非贴壁依赖性的肿瘤球的形成(图14A-图14B、图16A-图16D)。然而，通过两种shRNA进行的SPARC的敲减显著降低了创伤刮擦测定法中的胰腺癌细胞迁移以及如体外Boyden测定法所测量的侵袭性质(数据未示出)。
与表达非靶标的发夹(shNT)对照的细胞相比，利用两种shRNA构建体进行的SPARC阻抑型PDAC3细胞的尾静脉注射产生显著更少的肺转移(图14D)。如通过荧光素酶成像和原发肿瘤大小归一化所测量的，对于SPARC阻抑型PDAC3细胞，从正位胰腺异种移植物生成的转移也显著减少(图14E)。因此，胰腺癌细胞的SPARC表达看起来选择性地增强其侵袭和迁移性质，增强了转移恶性。SPARC表达的高水平在实质上全部的胰腺CTCs中是明显的，因此提出其明显有助于胰腺癌转移扩散的可能性。
讨论
本文所述的为使用单细胞RNA-seq对胰腺癌中的CTC组成和多样性进行的详细分析。在93个单个小鼠胰腺CTCs中获得高质量的转录组，并与来自匹配的原发肿瘤和来自从相同的小鼠胰腺肿瘤模型建立的永生化细胞系的块状和单细胞制备物进行比较。KPC小鼠模型的使用使得能够将同时分离的原发肿瘤试样和CTCs进行比较，并允许测量共享相同的Kras/Trp53遗传驱动物的多个小鼠间的CTC异质性。来自这些细胞的大量的分离的CTCs和高质量的分离的RNA反映出CTC-iChip技术的应用，其有效地耗竭了正常的血液成分，富集CTC不带标签的并使得单细胞操作成为可能。最后，不管其细胞表面表位，CTC的纯化避免了与基于共同的上皮标记(例如EpCAM)表达的纯化有关的任何偏倚。
总之，本文的观察结果包括如下：(1)CTC表达谱聚类为三类，包括主要的“典型CTC”组以及通过血小板衍生标记或增殖指征界定的其它组。(2)实质上全部的典型CTCs共享的共同特征包括上皮和间充质标记、干细胞相关基因Aldh1a2以及三个高表达的转录物Klf4、Igfbp5和Dcn的表达。Igfbp5表达细胞在原发肿瘤内的上皮-间质边界处的特异性定位可指明显著有助于CTC生成的区域。(3)被几乎全部的典型CTCs共享的最高度富集的CTC特异性转录物编码胞外基质蛋白，例如Sparc。(4)在小鼠和人胰腺CTCs中均观察到CTCs中的该ECM基因产物的异常表达(其通常在肿瘤间质区室中丰富)，并且该基因的敲减减弱了重构体系中的癌细胞迁移和侵袭(图15)。与部分纯化的块状CTC群体的RNA-seq(需要白细胞衍生的读数的数字减影)(Yu等，2012，2013)相比，本文报告的单细胞分析提供了显著更为深入的肿瘤细胞特异性转录物读数，并且使得能够对CTC异质性进行测量。
在本文考虑之列的是，除了起始突变外，可用体细胞获得性遗传和表观遗传改变对衍生自不同肿瘤的CTCs进行区分。多个小鼠肿瘤有助于三个独特的CTCs簇中的每一个。虽然其具有非典型的表达模式，通过其包含带有品系标签的肿瘤细胞，证实了将血小板相关和增殖的CTC子类识别为肿瘤衍生的。通过典型的CTC簇所表现出的更加特征性的表达模式使得能够与原发肿瘤细胞进行详细比较，从而提供对CTCs起源和性质的进一步的深刻理解。
小鼠胰腺的典型CTCs一律丧失上皮标记E-钙粘蛋白(Cdh1)的表达，其为上皮-至-间充质转化的关键特征。然而，细胞不丧失其它上皮标记(例如细胞角蛋白)的表达，也不存在典型的间充质标记(例如波形蛋白)的一致的增高。就这一点而言，大部分典型CTCs表现出停滞在双表型状态。虽然其表达存在于原发肿瘤的上皮组分中的细胞角蛋白，CTCs中的大部分的其它高度表达的标记与原发肿瘤的间质组分共享。在这些间质基因中为Aldh1a2(Rasheed和Matsui，2012；Rasheed等，2010)。与典型CTCs的共享的上皮和间充质状态相关的令人兴奋的观察结果是其实质上普遍(93％)表达Igfbp5，Igfbp5在原发肿瘤内的上皮/间质界面处的小部分的细胞中特有表达。这提出了如下可能：该原发肿瘤中的关键定位产生了不成比例部分的有活力的CTCs。
来自单CTC RNA-seq研究的最出乎预料的观察结果是绝大多数典型CTCs中的ECM转录物的高丰度。表达这些ECM基因产物的单细胞中的胰腺癌富集的细胞角蛋白(Krt7和Krt19)的共表达排除了其代表循环的肿瘤衍生的成纤维细胞的可能性。
与一些胰腺癌细胞中的SPARC的异常表达相一致的是，患者衍生的肿瘤细胞系的一个子类也共表达SPARC和上皮细胞角蛋白。在SPARC敲减后通过这些胰腺细胞系表现出的细胞迁移和转移潜能的降低表明了SPARC有助于CTC介导的转移。在本文考虑之列的是，Sparc表达有助于转移，然而在一些实施方式中ECM蛋白表达的内在的冗余可缓和该效应。
已针对靶向胰腺癌间质作为改进化疗剂递送和从其支持性微环境中剥离肿瘤细胞的手段做出大量努力(Neesse等，2011；Olive等，2009；Provenzano等，2012；Rasheed等，2012)。本文描述的发现(例如这些基因产物也被CTC本身表达)表明显著水平的细胞可塑性。就CTCs的侵袭性质部分地由此类ECM蛋白的表达介导而言，也提出了靶向血液中的癌细胞的可能。
表13：人CTC ECM基因表达
Figure BDA0001084465270001601
Figure BDA0001084465270001611
Figure BDA0001084465270001621
Figure BDA0001084465270001631
Figure BDA0001084465270001641
Figure BDA0001084465270001651
Figure BDA0001084465270001661
表10：CTC-c vs CTC-pro中富集的最显著的基因集合
q值<0.01
Figure BDA0001084465270001671
表11：CTC-c vs CTC-plt中富集的最显著的基因集合
q值<0.01
Figure BDA0001084465270001681
表12：借助秩生成显著表达的基因(FDR<0.01)
Figure BDA0001084465270001691
Figure BDA0001084465270001701
Figure BDA0001084465270001711
Figure BDA0001084465270001721
Figure BDA0001084465270001731
Figure BDA0001084465270001741
Figure BDA0001084465270001751
Figure BDA0001084465270001761
Figure BDA0001084465270001771
Figure BDA0001084465270001781
Figure BDA0001084465270001791
Figure BDA0001084465270001801
Figure BDA0001084465270001811
Figure BDA0001084465270001821
Figure BDA0001084465270001831
Figure BDA0001084465270001841
Figure BDA0001084465270001851
Figure BDA0001084465270001861
Figure BDA0001084465270001871
Figure BDA0001084465270001881
Figure BDA0001084465270001891
Figure BDA0001084465270001901
Figure BDA0001084465270001911
Figure BDA0001084465270001921
Figure BDA0001084465270001931
Figure BDA0001084465270001941
Figure BDA0001084465270001951
表12和表13中列出的基因名称为惯用名称。表12或表13中列出的各基因的NCBI基因ID号可通过使用惯用名称作为查询物检索NCBI“基因”数据库(可在万维网https:// www.ncbi.nlm.nih.gov/上得到)并选择首个返回的智人(Homo sapiens)基因而获得。可使用UCSC基因组浏览器(可在万维网https://genome.ucsc.edu上得到)的基因分选器功能获得其它基因。在一些实施方式中，标记基因选自表13和/或表12中列出的基因。
在一些实施方式中，所述标记基因选自在表13中的至少一类CTC中被表明上调的标记基因，例如标记基因1-142。在一些实施方式中，所述标记基因选自在表12中的至少一类CTC中被表明上调的标记基因，例如标有“CTC-c vs.原发肿瘤富集的基因”或“CTC-cvs.WBC”列中列出的标记基因。
在CTC中，表13或表12中列出的标记基因可被上调，例如，对于表13和/或表12中列出的标记基因而言，如果与标记基因表达的参比水平相比，在细胞或样本中测得的该标记基因表达较高，则所述细胞被识别为CTC和/或样品被识别为包含CTCs。优选地，一度关注的是统计学上显著的改变。然而，即便组中的少数基因并未与正常的不同，如果组的整体改变表现为显著的改变、优选统计学上显著的改变，则样本可被识别为包含CTCs。在本文考虑之列的是两种以上的所指出的标记的全部可能组合。

Claims (36)

1.作为CTC-c标记基因的胰岛素样生长因子结合蛋白5(IGFBP5)和核心蛋白聚糖(DCN)在制备用于检测样本中的循环肿瘤细胞CTC-c的试剂中的用途，其中，所述试剂用于：
测量所述样本中的CTC-c标记基因表达产物的水平，以及
如果检测到的所述标记基因表达产物的水平高于参比水平，则确定存在CTC-c；
其中，所述CTC-c为胰腺癌CTC-c。
2.如权利要求1所述的用途，其中，所述表达产物为核酸。
3.如权利要求2所述的用途，其中，利用选自于由如下所组成的组中的方法，将所述试剂用于对所述表达产物的水平进行确定：RT-PCR；Northern印迹；基于微阵列的表达分析；下一代测序以及RNA原位杂交。
4.如权利要求3所述的用途，其中，利用定量RT-PCR，将所述试剂用于对所述表达产物的水平进行确定。
5.如权利要求1所述的用途，其中，所述表达产物为多肽。
6.如权利要求5所述的用途，其中，利用选自于由如下所组成的组中的方法，将所述试剂用于对所述表达产物的水平进行确定：Western印迹；免疫沉淀；酶联免疫吸附测定法；放射性免疫测定法；夹心测定法；荧光原位杂交；免疫组织学染色；免疫荧光测定法；质谱法；FACS以及免疫电泳测定法。
7.如权利要求1所述的用途，其中，所述试剂进一步包含选自于由如下所组成的组中的一种或多种额外的CTC标记基因：ABI3BP；ADAMTS5；ADAMTSL1；ANG；ARSA；C1RL；C3；C4A；C4B；CCDC80；CD109；CHI3L1；CLEC3B；CMTM3；CMTM7；COL14A1；COL1A2；COL3A1；COL4A6；CSF1；DAG1；DMKN；FBLN1；FGF1；FMOD；GPC3；GPC4；HMGB1；IFNAR2；IL16；LAMA4；LTBP4；MFAP1A；NID2；OGN；PDAP1；PF4；PLAT；PODN；PRELP；RSPO1；SERPING1；SLURP1；SOD3；SPARC；SPOCK2；SPON2；SULF1；SULF2；TGFB2；TGM2；THBD；THBS1；THSD4；TIMP2；TNXB；TPT1；TWSG1和WNT4。
8.如权利要求7所述的用途，其中，所述试剂进一步包含选自于由如下所组成的组中的一种或多种额外的CTC标记基因：ALDH1A1；ALDH1A2；KLF4；SPARC；WNT；TGFB2；VEGF；COL1A2；COL3A1和TIMP2。
9.如权利要求7所述的用途，其中，所述试剂进一步包含选自于由如下所组成的组中的一种或多种额外的CTC标记基因：ALDH1A2；KLF4和SPARC。
10.如权利要求7所述的用途，其中，所述试剂进一步包含选自于由如下所组成的组中的一种或多种额外的CTC标记基因：ALDH1A2和KLF4。
11.如权利要求7所述的用途，其中，所述试剂进一步包含选自于由如下所组成的组中的一种或多种额外的CTC标记基因：TPT1；HMGB1；SPON 2；SPARC和ARSA。
12.如权利要求7所述的用途，其中，所述试剂进一步包含选自于由如下所组成的组中的一种或多种额外的CTC标记基因：IL6ST；ARSA；TIMP2；CD55；SULF2；ITGA6；SDC4；CDON和SV2A。
13.作为CTC-c标记基因的胰岛素样生长因子结合蛋白5(IGFBP5)和核心蛋白聚糖(DCN)在制备用于确定受试者是否有可能对CTC-c标记基因靶向治疗剂的治疗作出响应的试剂中的用途，其中，所述试剂用于：
对存在于血液和/或胰腺癌间质中的CTC-c标记基因表达产物的水平进行测量，以及
如果与参比水平相比，所述表达产物的水平升高，则确定受试者有可能对所述治疗作出响应；
其中，所述CTC-c为胰腺癌CTC-c。
14.如权利要求13所述的用途，其中，所述表达产物为核酸。
15.如权利要求14所述的用途，其中，利用选自于由如下所组成的组中的方法，将所述试剂用于对所述表达产物的水平进行确定：RT-PCR；Northern印迹；基于微阵列的表达分析；下一代测序以及RNA原位杂交。
16.如权利要求15所述的用途，其中，利用定量RT-PCR，将所述试剂用于对所述表达产物的水平进行确定。
17.如权利要求13所述的用途，其中，所述表达产物为多肽。
18.如权利要求17所述的用途，其中，利用选自于由如下所组成的组中的方法，将所述试剂用于对所述表达产物的水平进行确定：Western印迹；免疫沉淀；酶联免疫吸附测定法；放射性免疫测定法；夹心测定法；荧光原位杂交；免疫组织学染色；免疫荧光测定法；质谱法；FACS以及免疫电泳测定法。
19.如权利要求13所述的用途，其中，所述试剂进一步包含选自于由如下所组成的组中的一种或多种额外的CTC标记基因：ABI3BP；ADAMTS5；ADAMTSL1；ANG；ARSA；C1RL；C3；C4A；C4B；CCDC80；CD109；CHI3L1；CLEC3B；CMTM3；CMTM7；COL14A1；COL1A2；COL3A1；COL4A6；CSF1；DAG1；DMKN；FBLN1；FGF1；FMOD；GPC3；GPC4；HMGB1；IFNAR2；IL16；LAMA4；LTBP4；MFAP1A；NID2；OGN；PDAP1；PF4；PLAT；PODN；PRELP；RSPO1；SERPING1；SLURP1；SOD3；SPARC；SPOCK2；SPON2；SULF1；SULF2；TGFB2；TGM2；THBD；THBS1；THSD4；TIMP2；TNXB；TPT1；TWSG1和WNT4。
20.如权利要求19所述的用途，其中，所述试剂进一步包含选自于由如下所组成的组中的一种或多种额外的CTC标记基因：ALDH1A1；ALDH1A2；KLF4；SPARC；WNT；TGFB2；VEGF；COL1A2；COL3A1和TIMP2。
21.如权利要求19所述的用途，其中，所述试剂进一步包含选自于由如下所组成的组中的一种或多种额外的CTC标记基因：ALDH1A2；KLF4和SPARC。
22.如权利要求19所述的用途，其中，所述试剂进一步包含选自于由如下所组成的组中的一种或多种额外的CTC标记基因：ALDH1A2和KLF4。
23.如权利要求19所述的用途，其中，所述试剂进一步包含CTC标记基因选自于由如下所组成的组中的一种或多种额外的CTC标记基因：TPT1；HMGB1；SPON 2；SPARC和ARSA。
24.如权利要求19所述的用途，其中，所述试剂进一步包含选自于由如下所组成的组中的一种或多种额外的CTC标记基因：IL6ST；ARSA；TIMP2；CD55；SULF2；ITGA6；SDC4；CDON和SV2A。
25.作为CTC-c标记基因的胰岛素样生长因子结合蛋白5(IGFBP5)和核心蛋白聚糖(DCN)在制备用于监测对受试者进行的治疗的试剂中的用途，其中，所述试剂用于：
在向有需要的受试者给予癌症治疗剂之后，对存在于血液和/或胰腺癌间质中的CTC-c标记基因表达产物的水平进行测量，以及
如果与参比水平相比，CTC-c标记基因表达产物的水平降低，则确定受试者作出响应，而如果与参比水平相比，CTC-c标记基因表达产物未降低，则确定受试者不对所述治疗作出响应；
其中，所述CTC-c为胰腺癌CTC-c。
26.如权利要求25所述的用途，其中，所述表达产物为核酸。
27.如权利要求26所述的用途，其中，利用选自于由如下所组成的组中的方法，将所述试剂用于对所述表达产物的水平进行确定：RT-PCR；Northern印迹；基于微阵列的表达分析；下一代测序以及RNA原位杂交。
28.如权利要求27所述的用途，其中，利用定量RT-PCR，将所述试剂用于对所述表达产物的水平进行确定。
29.如权利要求25所述的用途，其中，所述表达产物为多肽。
30.如权利要求29所述的用途，其中，利用选自于由如下所组成的组中的方法，将所述试剂用于对所述表达产物的水平进行确定：Western印迹；免疫沉淀；酶联免疫吸附测定法；放射性免疫测定法；夹心测定法；荧光原位杂交；免疫组织学染色；免疫荧光测定法；质谱法；FACS以及免疫电泳测定法。
31.如权利要求25所述的用途，其中，所述试剂进一步包含选自于由如下所组成的组中的一种或多种额外的CTC标记基因：ABI3BP；ADAMTS5；ADAMTSL1；ANG；ARSA；C1RL；C3；C4A；C4B；CCDC80；CD109；CHI3L1；CLEC3B；CMTM3；CMTM7；COL14A1；COL1A2；COL3A1；COL4A6；CSF1；DAG1；DMKN；FBLN1；FGF1；FMOD；GPC3；GPC4；HMGB1；IFNAR2；IL16；LAMA4；LTBP4；MFAP1A；NID2；OGN；PDAP1；PF4；PLAT；PODN；PRELP；RSPO1；SERPING1；SLURP1；SOD3；SPARC；SPOCK2；SPON2；SULF1；SULF2；TGFB2；TGM2；THBD；THBS1；THSD4；TIMP2；TNXB；TPT1；TWSG1和WNT4。
32.如权利要求31所述的用途，其中，所述试剂进一步包含选自于由如下所组成的组中的一种或多种额外的CTC标记基因：ALDH1A1；ALDH1A2；KLF4；SPARC；WNT；TGFB2；VEGF；COL1A2；COL3A1和TIMP2。
33.如权利要求31所述的用途，其中，所述试剂进一步包含选自于由如下所组成的组中的一种或多种额外的CTC标记基因：ALDH1A2；KLF4和SPARC。
34.如权利要求31所述的用途，其中，所述试剂进一步包含选自于由如下所组成的组中的一种或多种额外的CTC标记基因：ALDH1A2和KLF4。
35.如权利要求31所述的用途，其中，所述试剂进一步包含选自于由如下所组成的组中的一种或多种额外的CTC标记基因：TPT1；HMGB1；SPON 2；SPARC和ARSA。
36.如权利要求31所述的用途，其中，所述试剂进一步包含选自于由如下所组成的组中的一种或多种额外的CTC标记基因：IL6ST；ARSA；TIMP2；CD55；SULF2；ITGA6；SDC4；CDON和SV2A。
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