CN105779444B - 一种提高芽孢杆菌蛋白表达量的串联启动子 - Google Patents
一种提高芽孢杆菌蛋白表达量的串联启动子 Download PDFInfo
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Abstract
本发明的目的是提供一种提高芽孢杆菌蛋白表达量的串联启动子。采用本发明提供的P43‑PHpaII‑PSPO‑I串联启动子构建的QC6菌株，其碱性蛋白酶表达量显著高于采用单一启动子P43、PHpaII和PSPO‑I构建的QC1、QC2和QC3菌株，甚至比该三株菌的表达量之和还要高70％左右。采用本发明提供的P43‑PHpaII‑PSPO‑I‑PcryIIIA串联启动子构建的QC7菌株，其碱性蛋白酶的表达量显著高于采用P43‑PHpaII‑PSPO‑I串联启动子构建的QC6菌株和采用单一启动子PcryIIIA构建的QC4菌株，甚至比该两株菌的表达量之和还高50％左右。上述串联启动子均产生了意料不到的技术效果，能大幅度提升芽孢杆菌的蛋白表达量。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种可显著提高芽孢杆菌蛋白表达量的串联启动子及其应用。
背景技术
芽孢杆菌是一个优良的蛋白质表达宿主，它有安全性高(Generally Regarded asSafe,GRAS)，生长周期短，发酵成本低，分泌能力强，无明显的密码子偏好性等显著优点，广泛应用于淀粉酶、蛋白酶、普鲁兰酶、果胶酶等酶制剂的工业化生产。
为了降低酶制剂产品的生产成本，提高经济效益，工业用芽孢杆菌表达系统的一个重要要求是蛋白质表达量要高。而提高芽孢杆菌表达水平的一个重要手段是提高目的基因的mRNA水平，常用的方法是采用携带目的基因的高拷贝质粒表达载体，该方法最大的缺点是工业化生产过程中高拷贝质粒表达载体存在丢失现象。为了解决质粒菌株稳定性不好的问题，可以将含有与目的基因可操作连接的单个启动子的表达盒及一个可扩增的筛选标记基因(如抗生素抗性标记基因)整合到芽孢杆菌染色体上，然后通过筛选压力(如抗生素)扩增染色体上的表达盒及筛选标记基因，在染色体上产生多拷贝的表达盒。该方法也存在一些缺点，如通过扩增由单个启动子驱动的基因不可能获得饱和水平的mRNA。而且，染色体上串联多拷贝的表达盒可能不稳定。此外，筛选标记基因很难去除。而另外一个获得饱和mRNA水平的方法是筛选特定启动子。但由于用于芽孢杆菌启动子的数量多，且不同启动子的效果无法预测，所以筛选难度也较大。
发明内容
本发明的目的是提供一种提高芽孢杆菌蛋白表达量的串联启动子，是使用来源于芽孢杆菌的启动子P43、PHpaII和PSPO-I，可显著提高芽孢杆菌对外源蛋白的表达量，从而弥补现有技术的不足。
本发明一方面提供一种串联启动子，包含有启动子P43、PHpaII和PSPO-I；
其中，所述启动子P43的核苷酸序列为SEQ ID NO：2；
所述启动子PHpaII的核苷酸序列为SEQ ID NO：3；
所述启动子PSPO-I的核苷酸序列为SEQ ID NO：4；
上述的启动子，是由启动子P43、PHpaII和PSPO-I依次连接而成的，其核苷酸序列为SEQ ID NO：7；
为了获得更好的效果，上述的串联启动子，还包含启动子PcryIIIA。
所述启动子PcryIIIA的核苷酸序列为SEQ ID NO：5。
所述的串联启动子，由启动子P43、PHpaII、PSPO-I和PcryIIIA依次连接而成，其核苷酸序列为SEQ ID NO：8。
本发明还提供了一种重组质粒，包含上述串联启动子。
本发明还提供了一种宿主菌，包含上述重组质粒。
所述宿主菌为芽孢杆菌。
所述宿主菌优选枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。
所述宿主菌在生产蛋白酶中的应用。
采用本发明提供的P43-PHpaII-PSPO-I串联启动子构建的QC6菌株，其碱性蛋白酶表达量显著高于采用单一启动子P43、PHpaII和PSPO-I构建的QC1、QC2和QC3菌株，甚至比该三株菌的表达量之和还要高70％左右，产生了意料不到的技术效果，能大幅度提升芽孢杆菌的蛋白表达量。采用本发明提供的P43-PHpaII-PSPO-I-PcryIIIA串联启动子构建的QC7菌株，其碱性蛋白酶的表达量显著高于采用P43-PHpaII-PSPO-I串联启动子构建的QC6菌株和采用单一启动子PcryIIIA构建的QC4菌株，甚至比该两株菌的表达量之和还高50％左右，从而说明P43、PHpaII、PSPO-I和PcryIIIA这四个启动子的串联组合产生了意料不到的技术效果，能大幅度提升芽孢杆菌的蛋白表达量。
附图说明
图1为pDG1662质粒图谱；
图2为pQSXG-1质粒图谱；
图3为pQSXG-2质粒图谱；
图4为pQSXG-3质粒图谱；
图5为pQSXG-4质粒图谱；
图6为pQSXG-5质粒图谱；
图7为pQSXG-6质粒图谱；
图8为pQSXG-7质粒图谱；
图9为pQSXG-8质粒图谱；
图10为pQSXG-9质粒图谱；
图11为采用不同启动子的整合表达菌株发酵酶活水平。
具体实施方式
申请人通过对现有启动子进行大量筛选和串联组合后发现有些单一启动子对芽孢杆菌的蛋白表达有明显的促进作用，而有些单一启动子则没有显著效果；两个或多个启动子的串联组合对芽孢杆菌蛋白表达量的影响也无法预测，有些启动子串联后对芽孢杆菌的蛋白表达有明显的促进作用，其促进效果甚至远远高于其所包含的单一启动子的效果之和，而有些启动子串联后的促进效果却不如其包含的单一启动子的效果；而且，)串联启动子中各单一启动子的串联顺序对其效果有很大的影响，各启动子只有采用特定的顺序进行串联才能发挥最好的效果，反之，其效果较差。
经过长期的研究，申请人筛选到两种可应用于芽孢杆菌的串联启动子P43-PHpaII-PSPO-I和P43-PHpaII-PSPO-I-PcryIIIA，这两种串联启动子对芽孢杆菌的蛋白表达有明显的促进作用，采用该串联启动子构建的芽孢杆菌，其碱性蛋白酶表达量远高于分别采用其包含的单一启动子构建的芽孢杆菌的表达量之和，取得了意料不到的技术效果，从而促成本发明。
下面结合实例对本发明的方法做进一步说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常可按常规条件，如J.萨姆布鲁克(Sambrook)等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件运行。本领域相关的技术人员可以借助实施例更好地理解和掌握本发明。但是，实现本发明的方法不应限于本发明实施例所记载的具体方法步骤。
实施例1采用P43启动子构建的整合表达菌株Bacillus subtilis QC1
引物1：CGTACGGGATCCGCTGTTTGCGTTTTTGCCGTG(BamHI)
引物2：ATTTTCCCCAACGGTTTCTTCATTATCACTTTATATTATAAACA
引物3：TGTTTATAATATAAAGTGATAATGAAGAAACCGTTGGGGAAAAT
引物4：GTTTTATTTGATGCCTGGCAGTTAGCGTGTTGCCGCTTCTGC
引物5：GCAGAAGCGGCAACACGCTAACTGCCAGGCATCAAATAAAAC
引物6：CGTACGAAGCTTGAGTTTGTAGAAACGCAAAAAG(HindIII)
以合成的含SEQ ID NO:2序列的质粒为模板，利用引物1、引物2扩增P43启动子。利用引物3、引物4扩增碱性蛋白酶基因aprE(SEQ ID NO:1)。以大肠杆菌DH5α(Escherichiacoli DH5α)基因组为模板，利用引物5、引物6扩增rrnB terminators。PCR反应体系为：5×Phusion HF Buffer 10μL，2.5mMdNTP4μL，10μM Forward Primer2.5μL，10μM ReversePrimer2.5μL，模板DNA0.5μL，NEB Phusion DNA Polymerase0.5μL，ddH2O补至50μL。PCR扩增条件为98℃2min；98℃10s，54℃20s，72℃1min，30个循环；72℃5min。
利用E.Z.N.A.Gel Extraction Kit回收P43启动子、aprE及rrnB terminatorsPCR扩增产物，通过融合PCR获得融合片段P43/aprE/rrnB terminators。融合PCR过程如下：第一轮，PCR反应体系中各加入200ng的P43、aprE、rrnB terminators片段，不加引物，PCR扩增10个循环，PCR扩增条件为98℃2min；98℃10s，54℃20s，72℃4min，10个循环；72℃5min。第二轮，取10μL第一轮PCR产物作为模板，利用引物1、引物6PCR扩增30个循环，PCR扩增条件为98℃2min；98℃10s，54℃20s，72℃2min，30个循环；72℃5min。利用E.Z.N.A.GelExtraction Kit回收约1.5kb的PCR产物，得到P43/aprE/rrnB terminators融合片段。
将P43/aprE/rrnB terminators片段与pDG1662质粒(图1)同时进行BamHI、HindIII双酶切，利用E.Z.N.A.Gel Extraction Kit分别纯化回收1.5kb及7.0kb大小的条带，然后将两个回收产物用T4DNA Ligase连接，将连接产物普通感受态方法转化Bacillussubtilis1A751宿主菌(该菌株中的碱性蛋白酶基因(aprE)和中性蛋白酶基因(nprE)已被敲除，本身基本不产蛋白酶，该菌株是由美国弗吉尼亚理工大学张晓舟博士赠送)，转化具体过程如下：将新鲜活化的Bacillus subtilis1A751由LB(胰蛋白胨1％，酵母粉0.5％，NaCl1％)平板接种到5ml GMⅠ(GM I配制方法为：1×最低盐溶液95.6ml，20％葡萄糖2.5ml，5％水解酪蛋白0.4ml，10％酵母粉汁1ml；其中1×最低盐溶液的配制方法为：K2HPO414g/L，KH2PO46g/L，(NH4)2SO42g/L，柠檬酸三钠1g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，在蒸馏水中依次溶解)溶液，在30℃、125rpm振荡培养过夜。第二天取2ml转接到18ml GMⅠ中，37℃、250rpm培养3.5h。再取10ml上一步骤的培养液转接到90ml GMⅡ(GM II配制方法为：1×最低盐溶液96.98mL，20％葡萄糖2.5mL，5％水解酪蛋白0.08mL，10％酵母粉汁0.04mL，1MMgCl20.25mL，1M CaCl20.05mL)中，37℃、125rpm培养90min后，5000g、10min离心收集菌体。用10mL原培养液上清液轻轻悬浮菌体，悬浮后的菌体即为感受态细胞。然后在0.5mL感受态中加入适量DNA于37℃、200rpm振荡培养30min后涂布含5μg/mL氯霉素的LB平板，再在37℃培养过夜，次日检查和验证转化子。得到的阳性转化子，测序验证正确后，将获得的质粒命名为pQSXG-1(图2)。
使用KpnI酶切pQSXG-1质粒，进行线性化处理，回收8.5kb大小的条带，普通感受态方法转化Bacillus subtilis 1A751，涂布含5μg/mL氯霉素的LB平板。pQSXG-1线性化片段进入Bacillus subtilis 1A751后，会在amyE位点发生双交换整合，P43/aprE/rrnBterminators表达盒及cat抗性基因整合到基因组上。转化子的验证过程如下：挑取转化子平行点种LB(Cm5μg/mL)平板及LB(Cm5μg/mL+Spc100μg/mL)平板，发生双交换的阳性转化子为CmRSpcS。阳性转化子点种1％脱脂奶粉平板37℃过夜培养后可以观察到显著的透明圈。提取阳性转化子的基因组，利用引物1、引物6可以扩增出含有P43/aprE/rrnB terminators、大小约1.5kb的片段，该片段测序正确。获得的阳性转化子命名为Bacillus subtilis QC1。
实施例2采用PHpaII启动子构建的整合表达菌株Bacillus subtilis QC2
引物7：TATAATTTACTTGGAAGTGGTTGCCATGAAGAAACCGTTGGGGAAAATTG
引物8：GAAAAAAGAAACAAAAAAACCTGCCGGATCCGATCAGACCAGTTTTTAAT
引物9：ATTAAAAACTGGTCTGATCGGATCCGGCAGGTTTTTTTGTTTCTTTTTTC
引物10：CAATTTTCCCCAACGGTTTCTTCATGGCAACCACTTCCAAGTAAATTATA
以合成的含SEQ ID NO:3序列的质粒为模板，利用引物9、引物10扩增PHpaII启动子。以pQSXG-1为模板，利用引物7、引物8扩增质粒骨架。利用E.Z.N.A.Gel Extraction Kit分别纯化回收0.15 kb及8.4 kb大小的条带，进行多轮融合PCR，PCR反应体系为：5×Phusion HF Buffer 10μL，2.5mMdNTP4μL，pQSXG-1质粒骨架及PHpaII启动子各约200ng，NEB Phusion DNA Polymerase1μL，补水至50μL。PCR扩增条件为98℃2min；98℃10s，72℃3min，20个循环；98℃10s，72℃6min，15个循环；72℃5min。
将PCR产物进行KpnI酶切，胶回收8.5kb大小的条带，即得到线性化pQSXG-2(图3)片段。
按照实施例1的方法，将线性化pQSXG-2片段转化Bacillus subtilis1A751，筛选amyE位点双交换整合PHpaII/aprE/rrnB terminators表达盒的整合表达菌株，命名为Bacillus subtilis QC2。
实施例3采用PSPO-I启动子构建的整合表达菌株Bacillus subtilis QC3
引物11：CTACAAGGTGTGGTATAATGTGTGGATGAAGAAACCGTTGGGGAAAATTG
引物12：TGTAGAACAAAACATCTTTCCGCTCGGATCCGATCAGACCAGTTTTTAAT
引物13：ATTAAAAACTGGTCTGATCGGATCCGAGCGGAAAGATGTTTTGTTCTACA
引物14：CAATTTTCCCCAACGGTTTCTTCATCCACACATTATACCACACCTTGTAG
以合成的含SEQ ID NO:4序列的质粒为模板，利用引物13、引物14扩增PSPO-I启动子。以pQSXG-1为模板，利用引物11、引物12扩增质粒骨架。利用E.Z.N.A.Gel ExtractionKit分别纯化回收0.1kb及8.4kb大小的条带，进行多轮融合PCR，PCR反应条件同实施例2。
将PCR产物进行KpnI酶切，胶回收8.5kb大小的条带，即得到线性化pQSXG-3(图4)片段。
按照实施例1的方法，将线性化pQSXG-3片段转化Bacillus subtilis1A751，筛选amyE位点双交换整合PSPO-I/aprE/rrnB terminators表达盒的整合表达菌株，命名为Bacillus subtilis QC3。
实施例4采用PcryIIIA启动子构建的整合表达菌株Bacillus subtilis QC4
引物15：ACACCAATTAAAGGAGGAATTCAAAATGAAGAAACCGTTGGGGAAAATTG
引物16：AGCGATAATTCACATGAACAAGTTCGGATCCGATCAGACCAGTTTTTAAT
引物17：ATTAAAAACTGGTCTGATCGGATCCGAACTTGTTCATGTGAATTATCGCT
引物18：CAATTTTCCCCAACGGTTTCTTCATTTTGAATTCCTCCTTTAATTGGTGT
以合成的含SEQ ID NO:5序列的质粒为模板，利用引物17、引物18扩增PcryIIIA启动子。以pQSXG-1为模板，利用引物15、引物16扩增质粒骨架。利用E.Z.N.A.Gel ExtractionKit分别纯化回收0.37kb及8.4kb大小的条带，进行多轮融合PCR，PCR反应条件同实施例2。
将PCR产物进行KpnI酶切，胶回收8.7kb大小的条带，即得到线性化pQSXG-4(图5)片段。
按照实施例1的方法，将线性化pQSXG-4片段转化Bacillus subtilis1A751，筛选amyE位点双交换整合PcryIIIA/aprE/rrnB terminators表达盒的整合表达菌株，命名为Bacillus subtilis QC4。
实施例5采用P43-PHpaII串联启动子构建的整合表达菌株Bacillus subtilisQC5
引物19：AAATCACGGCAAAAACGCAAACAGCGGATCCGATCAGACCAGTTTTTAAT
引物20：ATTAAAAACTGGTCTGATCGGATCCGCTGTTTGCGTTTTTGCCGTGATTT
以合成的含SEQ ID NO:6序列的质粒为模板，利用引物20、引物10扩增P43-PHpaII串联启动子。以pQSXG-1为模板，利用引物7、引物19扩增质粒骨架。利用E.Z.N.A.GelExtraction Kit分别纯化回收0.3kb及8.4kb大小的条带，进行多轮融合PCR，PCR反应条件同实施例2。
将PCR产物进行KpnI酶切，胶回收8.7kb大小的条带，即得到线性化pQSXG-5(图6)片段。
按照实施例1的方法，将线性化pQSXG-5片段转化Bacillus subtilis1A751，筛选amyE位点双交换整合P43-PHpaII/aprE/rrnB terminators表达盒的整合表达菌株，命名为Bacillus subtilis QC5。
实施例6采用P43-PHpaII-PSPO-I串联启动子构建的整合表达菌株Bacillussubtilis QC6
以合成的含SEQ ID NO:7序列的质粒为模板，利用引物20、引物14扩增P43-PHpaII-PSPO-I串联启动子。以pQSXG-1为模板，利用引物11、引物19扩增质粒骨架。利用E.Z.N.A.Gel Extraction Kit分别纯化回收0.4kb及8.4kb大小的条带，进行多轮融合PCR，PCR反应条件同实施例2。
将PCR产物进行KpnI酶切，胶回收8.8kb大小的条带，即得到线性化pQSXG-6(图7)片段。
按照实施例1的方法，将线性化pQSXG-6片段转化Bacillus subtilis1A751，筛选amyE位点双交换整合P43-PHpaII-PSPO-I/aprE/rrnB terminators表达盒的整合表达菌株，命名为Bacillus subtilis QC6。
实施例7采用P43-PHpaII-PSPO-I-PcryIIIA串联启动子构建的整合表达菌株Bacillus subtilis QC7
以合成的含SEQ ID NO:8序列的质粒为模板，利用引物20、引物18扩增P43-PHpaII-PSPO-I-PcryIIIA串联启动子。以pQSXG-1为模板，利用引物15、引物19扩增质粒骨架。利用E.Z.N.A.Gel Extraction Kit分别纯化回收0.77kb及8.4kb大小的条带，进行多轮融合PCR，PCR反应条件同实施例2。
将PCR产物进行KpnI酶切，胶回收9.1kb大小的条带，即得到线性化pQSXG-7(图8)片段。
按照实施例1的方法，将线性化pQSXG-7片段转化Bacillus subtilis1A751，筛选amyE位点双交换整合P43-PHpaII-PSPO-I-PcryIIIA/aprE/rrnB terminators表达盒的整合表达菌株，命名为Bacillus subtilis QC7。
实施例8采用P43-PHpaII-PcryIIIA-PSPO-I串联启动子构建的整合表达菌株Bacillus subtilis QC8
以合成的含SEQ ID NO:9序列的质粒为模板，利用引物20、引物14扩增P43-PHpaII-PcryIIIA-PSPO-1串联启动子。以pQSXG-1为模板，利用引物11、引物19扩增质粒骨架。利用E.Z.N.A.Gel Extraction Kit分别纯化回收0.77kb及8.4kb大小的条带，进行多轮融合PCR，PCR反应条件同实施例2。
将PCR产物进行KpnI酶切，胶回收9.1kb大小的条带，即得到线性化pQSXG-8(图9)片段。
按照实施例1的方法，将线性化pQSXG-8片段转化Bacillus subtilis1A751，筛选amyE位点双交换整合P43-PHpaII-PcryIIIA-PSPO-1/aprE/rrnB terminators表达盒的整合表达菌株，命名为Bacillus subtilis QC8。
实施例9采用P43-PHpaII-PSPO-I-PamyQ串联启动子构建的整合表达菌株Bacillus subtilis QC9
引物21：ATAATATAATTTGTATAAGAAAATGATGAAGAAACCGTTGGGGAAAATTG
引物22：CAATTTTCCCCAACGGTTTCTTCATCATTTTCTTATACAAATTATATTAT
以合成的含SEQ ID NO:10序列的质粒为模板，利用引物20、引物22扩增P43-PHpaII-PSPO-I-PamyQ串联启动子。以pQSXG-1为模板，利用引物21、引物19扩增质粒骨架。利用E.Z.N.A.Gel Extraction Kit分别纯化回收0.5kb及8.4kb大小的条带，进行多轮融合PCR，PCR反应条件同实施例2。
将PCR产物进行KpnI酶切，胶回收8.9kb大小的条带，即得到线性化pQSXG-9(图10)片段。
按照实施例1的方法，将线性化pQSXG-9片段转化Bacillus subtilis1A751，筛选amyE位点双交换整合P43-PHpaII-PSPO-I-PamyQ/aprE/rrnB terminators表达盒的整合表达菌株，命名为Bacillus subtilis QC9。
实施例10采用不同启动子的整合表达菌株摇瓶发酵
实施例1-9所述采用不同启动子的整合表达菌株的信息见表1。
表1采用不同启动子的整合表达菌株
将构建的上述整合表达菌株在相同条件下进行摇瓶发酵，具体方法如下：
从含5μg/ml氯霉素的LB平板上挑取上述菌株的单菌落分别接种于50mL种子培养基(酵母浸粉0.5％，胰蛋白胨0.5％，葡萄糖1％，K2HPO41.8％，氯霉素5μg/mL)中，34℃、210rpm振荡培养8h。然后分别取2.5mL发酵液接种到50mL发酵培养基(酵母粉1～2％，豆饼粉2～5％，麦芽糊精5～10％，柠檬酸钠0.1～0.5％，CaCl20.1～0.5％，MgSO40.1～0.5％，K2HPO40.5～2％)中，34℃、250rpm振荡培养72h；离心取上清液；采用中华人民共和国国家标准蛋白酶制剂测定方法(GB/T25327-2009)分别测定上述菌株发酵上清液的碱性蛋白酶酶活，结果见图11。
如图11所示，QC1、QC2和QC3菌株分别采用单一启动子P43、PHpaII和PSPO-I，其碱性蛋白酶的表达量均较高，而QC4菌株采用单一启动子PcryIIIA，其碱性蛋白酶表达量很低，不足QC1、QC2和QC3菌株表达量的40％。从而说明单一启动子对芽孢杆菌蛋白表达量的影响因启动子的不同而有显著差异。
QC5菌株采用P43-PHpaII串联启动子，其碱性蛋白酶的表达量与采用单一启动子P43和PHpaII构建的QC1和QC2菌株基本相当，甚至于比QC1菌株的表达量还低10％，从而说明启动子P43和PHpaII的串联对于芽孢杆菌的蛋白表达没有明显的促进作用，也进一步说明了启动子的串联组合对芽孢杆菌蛋白表达的影响是无法预测的。
QC6菌株采用P43-PHpaII-PSPO-I串联启动子，其碱性蛋白酶表达量显著高于采用单一启动子P43、PHpaII和PSPO-I构建的QC1、QC2和QC3菌株，甚至比该三株菌的表达量之和还要高70％左右。P43、PHpaII和PSPO-I这三个启动子的串联组合产生了意料不到的技术效果，能大幅度提升芽孢杆菌的蛋白表达量。
QC7菌株采用P43-PHpaII-PSPO-I-PcryIIIA串联启动子，其碱性蛋白酶的表达量显著高于采用P43-PHpaII-PSPO-I串联启动子构建的QC6菌株和采用单一启动子PcryIIIA构建的QC4菌株，甚至比该两株菌的表达量之和还高50％左右。P43、PHpaII、PSPO-I和PcryIIIA这四个启动子的串联组合产生了意料不到的技术效果，能大幅度提升芽孢杆菌的蛋白表达量。
QC8菌株虽然也采用P43、PHpaII、PSPO-I和PcryIIIA这四个启动子进行串联，但单个启动子的排列顺序与QC7菌株略有不同，其串联后的启动子为P43-PHpaII-PcryIIIA-PSPO-I。但QC8菌株的碱性蛋白酶表达量仅为QC7菌株的20％，从而说明串联启动子中各单一启动子的串联顺序对其效果有很大的影响，各启动子只有采用特定的顺序进行串联才能发挥最好的效果，反之，其效果较差。
QC9菌株采用P43-PHpaII-PSPO-I-PamyQ串联启动子，与QC7菌株相比，其区别在于第四个启动子的选择，但其碱性蛋白酶的表达量不仅远远低于QC7菌株，甚至于比采用P43-PHpaII-PSPO-I三个启动子的串联组合构建的QC6菌株还要低30％。从而说明，串联启动子的效果与其启动子的数量不成正比，关键在于启动子的选择，串联启动子中任何一个单一启动子的变化均有可能导致其整体效果的大幅度改变，其影响不可预测。
综上，本发明的串联启动子P43-PHpaII-PSPO-I和P43-PHpaII-PSPO-I-PcryIIIA，这两种串联启动子对芽孢杆菌的蛋白表达有明显的促进作用。
Claims (10)
1.一种串联启动子，其特征在于，所述的串联启动子是由启动子P43、PHpaII和PSPO-I依次连接而成的。
2.如权利要求1所述的串联启动子，其特征在于，所述的启动子P43的核苷酸序列为SEQID NO：2。
3.如权利要求1所述的串联启动子，其特征在于，所述的启动子PHpaII的核苷酸序列为SEQ ID NO：3。
4.如权利要求1所述的串联启动子，其特征在于，所述的启动子PSPO-I的核苷酸序列为SEQ ID NO：4。
5.一种串联启动子，其特征在于，所述的串联启动子是由启动子P43、PHpaII、PSPO-I和PcryIIIA依次连接而成。
6.如权利要求5所述的串联启动子，其特征在于，所述的启动子PcryIIIA的核苷酸序列为SEQ ID NO：5。
7.权利要求1或5所述的串联启动子在制备用于转化芽孢杆菌的质粒中的应用。
8.一种重组质粒，其特征在于，所述的重组质粒的启动子为权利要求1或5所述的串联启动子。
9.一种重组菌株，其特征在于，所述的重组菌株为转化/转染有权利要求8所述的重组质粒的宿主菌。
10.如权利要求9所述的重组菌株，其特征在于，所述的宿主菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。
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