CN104937102A - 人类toll样受体抑制剂及其使用方法 - Google Patents

人类toll样受体抑制剂及其使用方法 Download PDF

Info

Publication number
CN104937102A
CN104937102A CN201380050891.5A CN201380050891A CN104937102A CN 104937102 A CN104937102 A CN 104937102A CN 201380050891 A CN201380050891 A CN 201380050891A CN 104937102 A CN104937102 A CN 104937102A
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
polynucleotide
tlr inhibitor
nucleotide
tlr8
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201380050891.5A
Other languages
English (en)
Inventor
C·圭杜奇
K·L·费伦
F·巴拉特
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Dynavax Technologies Corp
Original Assignee
Dynavax Technologies Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Dynavax Technologies Corp filed Critical Dynavax Technologies Corp
Publication of CN104937102A publication Critical patent/CN104937102A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/18—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for pancreatic disorders, e.g. pancreatic enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/04—Drugs for skeletal disorders for non-specific disorders of the connective tissue
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/117—Nucleic acids having immunomodulatory properties, e.g. containing CpG-motifs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/711—Natural deoxyribonucleic acids, i.e. containing only 2'-deoxyriboses attached to adenine, guanine, cytosine or thymine and having 3'-5' phosphodiester links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/7115—Nucleic acids or oligonucleotides having modified bases, i.e. other than adenine, guanine, cytosine, uracil or thymine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/712—Nucleic acids or oligonucleotides having modified sugars, i.e. other than ribose or 2'-deoxyribose
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/7125—Nucleic acids or oligonucleotides having modified internucleoside linkage, i.e. other than 3'-5' phosphodiesters
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/17—Immunomodulatory nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/33—Chemical structure of the base
    • C12N2310/331—Universal or degenerate base
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
    • C12N2310/344—Position-specific modifications, e.g. on every purine, at the 3'-end

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本发明提供了人类Toll样受体(TLR)-抑制剂，以及用于患有自体免疫疾病或炎性紊乱的个体的方法。本发明公开的TLR抑制剂为包含抑制基序的多核苷酸，其中所述的抑制基序用于TLR7,TLR8和TLR9中的一种或多种。

Description

人类TOLL样受体抑制剂及其使用方法
关于联邦政府资助研究的声明
本发明是在政府支持下在由美国国立卫生研究院(the National Institutes of Health)的国家过敏与传染病研究所(国家过敏和传染病研究所)授予的批准号No.1R43AI096641下完成的。政府具有本发明的某些权利。
相关申请的交叉引用
本申请要求2012年9月29日提交的美国临时申请No.61/707,887；2013年2月5日提交的美国临时申请No.61/761,214；以及2013年3月15日提交的美国应用申请No.13/842,861的权益，所有这些申请均以引用方式全文并入本文。
ASCII文本文件形式的序列表的提交
以下以ASCII文本文件提交的内容以引用方式全文并入本文：计算机可读形式(CRF)的序列表(文件名：377882005440SeqList.txt，记录日期为2013年9月27日，大小为36KB)。
技术领域
本申请涉及人类Toll样受体(TLR)抑制剂，以及在患有自体免疫疾病或炎症紊乱的个体中的使用方法。本发明公开的TLR抑制剂为包含抑制基序(用于TLR7、TLR8和TLR9中的一种或多种)的多核苷酸。
背景技术
Toll样受体(TLR)为I型跨膜蛋白质，其识别由细菌、病毒和真菌得到的多种病原体相关分子模式(PAMP)。按照这种方式，PAMP起到对抗入侵病原体的首要防御作用。由于细胞表达的差异以及下游信号传导途径的活化，人类TLR可以引发部分重叠的但却不同的生物应答(Akira et al.,Adv Immunol,78:1-56,2001)。TLR可表征为由富含亮氨酸重复序列(LRR)组成的胞外结构域和细胞质结构域，称为Toll/白细胞介素-1受体(TIR)结构域。包含LRR的胞外结构域负责识别PAMP，而需要细胞质结构域用于下游信号传递。研究显示LRR8涉及DNA和RNA识别，而LRR17涉及核酸结合(Smits et al.,Oncologist,13:859-875,2008)。
TLR位于识别细菌膜成分的质膜中，而检测核酸基配体的TLR主要位于内涵体间隔区中。感觉核酸的TLR包含TLR3、TLR7、TLR8和TLR9。TLR3识别双链RNA，TLR7和TLR8识别单链RNA，而TLR9识别细菌和病毒DNA，以及包含非甲基化CG二核苷酸的合成寡脱氧核苷酸(Akira and Hemmi,Immunol Lett,85:85-95,2003)。
TLR8与TLR7和TLR9属于相同的亚家族，并且与TLR7是高度同源的(Liu et al.,Mol Immunol,47:1083-90,2010)。即使如此，TLR8对RNA和合成小分子(具有与核酸有关的结构)的特异性与TLR7的特异性是不同的(Medzhitov et al.,Immunol Rev,173:-89-97,2000)。例如包含重复A/U基序的一些ssRNA合成序列能够特异性地活化TLR8，但是不能活化TLR7(Gorden et al.,J Immunol,174:1259-68,2005)。此外，在人类中，TLR8在单核细胞、巨噬细胞、髓系树突状细胞(mDC)和嗜中性粒细胞中高度表达，而血细胞中的TLR7主要在浆细胞样树突状细胞(pDC)、B细胞和嗜中性粒细胞中表达。由于细胞表达中的这种差异，RNA通过血液中的TLR7产生的引发导致主要产生I型干扰素(IFN)的应答，而通过TLR的活化诱导多种促炎细胞因子，例如TNF、IL-12、IL-6、IL-8和IL-1(Barrat et al.,J Exp Med,202:1131-9,2005；and Gorden et al.,J Immunol,174:1259-68,2005)。
TLR涉及多种自体免疫和炎症疾病，并且最清楚的实例为由TLR9和TLR7在系统性红斑狼疮的发病机理下所起的作用(Barrat and Coffman,Immunol Rev,223:271-283,2008)。此外，TLR8多态性与类风湿性关节炎 有关(Enevold et al.,J Rheumatol,37:905-10,2010)。尽管已经描述了多种TLR7、TLR8和TLR9抑制剂，但是其他的TLR抑制剂也是理想的。具体而言，需要具有抑制基序(用于TLR7、TLR8和TLR9中的一种或多种)的多核苷酸来精确地抑制受试对象(例如患有自体免疫疾病或炎症紊乱的患者)中的免疫应答。
此外，已经识别了多种多核苷酸，其抑制小鼠脾细胞的、R848诱导的细胞因子的分泌。但是，小鼠TLR8缺乏对ssRNA配体、RNA病毒或小分子(所有这些均显示会活化人类TLR8)产生应答的能力(Heil et al.,Science,303:1526-9,2004；Jurk et al.Nat Immunol,3:499,2002；Hemmi et al.,Nat.Immunol,3:196-200,2002；and Lund et al.,PNAS,101:5598-603,2004)。此外，通过比较氨基酸序列，发现小鼠和大鼠的TLR8缺乏人类中配体识别所必须的5种氨基酸序列(Liu et al.,Mol Immunol,47:1083-90,2010)。因此，具有用于人类TLR8的抑制基序的多核苷酸理想地用于人类受试对象中。
发明概述
本发明提供了人类Toll样受体(TLR)-抑制剂，以及在患有自体免疫疾病或炎症紊乱的个体中的使用方法。本方面公开的TLR抑制剂为包含抑制基序的多核苷酸，其中所述的抑制基序用于TLR7、TLR8和TLR中的一种或多种。应该理解的是使用“包含”词语来描述的本发明公开的方法和实施方案还包含“由多个方面和实施方案组成”和“基本上由多个方面和实施方案组成”。
本发明公开提供了多核苷酸，以及该多核苷酸在个体中在抑制TLR8依赖的免疫应答中的用途。其中所述的多核苷酸由下式的核苷酸序列组成：5’-NxX1X2X3X4X5X6-My-3’，其中N,X1,X2,X3,X4和M均为核苷酸或核苷酸类似物，x为0至50的整数，y为0或1，X5为G或I，X6为I或A，前提条件是所述的多核苷酸不包含SEQ ID NO:9(DV197)。在一些实施方案中，X3和X4独立地为A,C,G,T或I。在一些实施方案中，X1,X2,X3和X4独立地为A,C,G,T或I。在一些实施方案中，X3X4X5X6为GAGI, GAGA,GGGI,TTGA,IAII,GTGI,AAII,IAIA,AIIA,IIII,ICII,IGII,ITII,CAII,TAII,CCII,TTII和GGII中的一种。在一些实施方案中，X1X2X3X4X5X6为TTGAGI,TTGAGA,TTGGGI,CCTTGA,TTIAII,TTGTGI,TTAAII,TTIAIA,TTAIIA,AGIAII,TTIIII,TTICII,TTIGII,TTITII,TTCAII,TTTAII,TTCCII,TTTTII,TTGGII,IIIAII,CCIAII,GGIAII,AAIAII,CIIAIII和IIAIIA的一种。本发明公开进一步提供了在个体中用于抑制TLR8诱导的免疫应答的多核苷酸，其中所述的多核苷酸由下式所示的核苷酸序列组成：5’-NxX1X2X3X4X5X6-3’，其中N,X1,X2,X3和X4均为核苷酸或核苷酸类似物，X5为G或I，X6为I或A，x为0至50的整数，X6处于多核苷酸的3’末端，前提条件是当X5X6为GI或GA时，则X3和X4均为A,T或C。在一些实施方案中，X1和X2均为A,T,C,G或I。此外，本发明公开还提供了在个体中用于抑制TLR8依赖的免疫应答的多核苷酸，其中所述的多核苷酸由下式的核苷酸序列组成：5’-NxX1X2X3X4X5X6-3’，其中N为核苷酸或核苷酸类似物，X1和X2均为A,T,C,G和I，X3和X4均为A,T或C，X5为G或I，X6为I或A，x为0至50的整数，并且X6处于多核苷酸的3’末端。在一些实施方案中，所述的多核苷酸不包含SEQ ID NO:9(DV197)。在一些优选的实施方案中，所述的多核苷酸不包含CG二核苷酸。在一些实施方案中，多核苷酸不包含C类似物或G类似物(例如不包含7-脱氮鸟苷)。在一些实施方案中，多核苷酸不包含修饰的碱基。在一些实施方案中，多核苷酸不包含修饰的糖。在一些优选的实施方案中，多核苷酸并非为反义序列或RNAi分子。在一些实施方案中，所述的多核苷酸在距该多核苷酸5’末端的0,1,2,3,4,5,6,7,8,9或10个核苷酸内不包含TGC或UGC三核苷酸。在一些实施方案中，所述的多核苷酸在距该多核苷酸5’末端的0,1或2个核苷酸内不包含所述的三核苷酸。在其他的实施方案中，所述的多核苷酸在距该多核苷酸5’末端的0,1或2个核苷酸的位置处不包含TGC或UGC三核苷酸。在一些实施方案中，所述的多核苷酸不包含5’-GGGG-3’或5’-GIGG-3’。在一些实施方案中，所述的多核苷酸不包含5'-S1S2S3S4-3'，其中S1,S2,S3和S4均独立地为G、脱氮G或I(核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)。在其他实施方案中，所述的多核苷酸包含5’-GGGG-3’或5’-GIGG-3’(或包含5'- S1S2S3S4-3'，其中S1,S2,S3和S4独立地为G、脱氮G或I)。在一些实施方案中，所述的多核苷酸在距该多核苷酸5’末端的0,1或2个核苷酸的位置处包含TGC或UGC三核苷酸，并且包含5'-S1S2S3S4-3'或5’-GIGG-3’。在一些实施方案中，所述的多核苷酸在距该多核苷酸5’末端的0,1或2个核苷酸的位置处包含TGC或UGC三核苷酸，并且包含5'-S1S2S3S4-3'，其中S1,S2,S3和S4均独立地为G、脱氮G或I(核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)。在一些实施方案中，X5为G。在一些实施方案中，X5为I。在一些实施方案中，X6为I。在一些实施方案中，X6为A。在一些实施方案中，X5X6为GI。在一些实施方案中，X5X6为GA。在一些实施方案中，X5X6为II。在一些实施方案中，X5X6为IA。在一些实施方案中，X5并非为G；X5并非为I；或者X6并非为A。在一些实施方案中，X5X6并非为GI；X5X6并非为GA；X5X6并非为II；或者X5X6并非为IA。在一些实施方案中，所述的多核苷酸不包含5'-S1S2S3S4-3'，其中S1,S2,S3和S4独立地为G或者能够防止G-四链体形成和/或防止Hoogsteen碱基配对的分子。在这些实施方案的子集中，能够防止G-四链体形成和/或防止Hoogsteen碱基配对的分子为核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸，例如次黄苷,7-脱氮-鸟苷,7-脱氮-2'-脱氧黄苷,7-脱氮-8-氮杂-2'-脱氧鸟苷,2'-脱氧水粉蕈素,异脱氧鸟苷或8-氧代-2'-脱氧鸟苷。在一些实施方案中，X3X4X5X6为TTGA,IAII,AAII,IAIA,AIIA,IIII,ICII,IGII,ITII,CAII,TAII,CCII,TTII和GGII中的一种。在一些实施方案中，X1X2X3X4X5X6为CCTTGA,TTIAII,TTAAII,TTIAIA,TTAIIA,AGIAII,TTIIII,TTICII,TTIGII,TTITII,TTCAII,TTTAII,TTCCII,TTTTII,TTGGII,IIIAII,CCIAII,GGIAII,AAIAII,CIIAII和IIAIIA中的一种。在一些实施方案中，所述的多核苷酸包含SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:14,SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:16,SEQ ID NO:17,SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:24,SEQ ID NO:26,SEQ ID NO:30,SEQ ID NO:31,SEQ ID NO:32,SEQ ID NO:33,SEQ ID NO:34,SEQ ID NO:35,SEQ ID NO:36,SEQ ID NO:37,SEQ ID NO:38,SEQ ID NO:39,SEQ ID NO:40,SEQ ID NO:44,SEQ ID NO:48,SEQ ID NO:49,SEQ ID NO:50,SEQ ID NO:51,SEQ ID NO:52,SEQ ID NO:53,SEQ ID NO:56,SEQ ID NO:59,SEQ ID NO:60,SEQ ID NO:61,SEQ ID NO:62,SEQ ID NO:63,SEQ ID NO:64,SEQ ID NO:65,SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:67,SEQ ID NO:68,SEQ ID NO:69,SEQ ID NO:70,SEQ ID NO:71,SEQ ID NO:72,SEQ ID NO:73,SEQ ID NO:77,SEQ ID NO:78,SEQ ID NO:79,SEQ ID NO:80,SEQ ID NO:81,SEQ ID NO:84,SEQ ID NO:85,SEQ ID NO:86,SEQ ID NO:87,SEQ ID NO:88,SEQ ID NO:89,SEQ ID NO:90,SEQ ID NO:91,SEQ ID NO:92,SEQ ID NO:93,SEQ ID NO:94,SEQ ID NO:95,SEQ ID NO:96,SEQ ID NO:97,SEQ ID NO:98,SEQ ID NO:99,SEQ ID NO:100,SEQ ID NO:101,SEQ ID NO:102,SEQ ID NO:103,SEQ ID NO:104,SEQ ID NO:105,SEQ ID NO:106,SEQ ID NO:107,SEQ ID NO:108,SEQ ID NO:109,SEQ ID NO:110,SEQ ID NO:111,SEQ ID NO:112,SEQ ID NO:113,SEQ ID NO:114和SEQ ID NO:115中的一种，前提条件是所述的多核苷酸在该多核苷酸的3’末端具有选自GI,GA,II和IA中的二核苷酸。在一些优选的实施方案中，所述的多核苷酸包含SEQ ID NO:87,SEQ ID NO:88,SEQ ID NO:89,SEQ ID NO:90,SEQ ID NO:91,SEQ ID NO:92,SEQ ID NO:93,SEQ ID NO:94,SEQ ID NO:95,SEQ ID NO:96,SEQ ID NO:97,SEQ ID NO:98,SEQ ID NO:99,SEQ ID NO:100,SEQ ID NO:101,SEQ ID NO:102,SEQ ID NO:103,SEQ ID NO:104,SEQ ID NO:105and SEQ ID NO:106,SEQ ID NO:107,SEQ ID NO:108,SEQ ID NO:109,SEQ ID NO:110,SEQ ID NO:111,SEQ ID NO:112,SEQ ID NO:113,SEQ ID NO:114和SEQ ID NO:115中的一种，前提条件是所述的多核苷酸在该多核苷酸的3’末端具有选自GI,GA,II和IA中的二核苷酸。在一些实施方案中，多核苷酸包含SEQ ID NO:108。在一些实施方案中，多核苷酸包含SEQ ID NO:109。本发明公开进一步提供了在个体中用于抑制TLR8依赖的免疫应答的多核苷酸，其中所述的多核苷酸包含：(a)SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:14,SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:16,SEQ ID NO:17,SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:24,SEQ ID NO:26,SEQ ID NO:30,SEQ ID NO:31,SEQ ID NO:32,SEQ ID NO:33,SEQ ID NO:34,SEQ ID NO:35,SEQ ID NO:36,SEQ ID NO:37,SEQ ID NO:38,SEQ ID NO:39,SEQ ID NO:40,SEQ ID NO:44,SEQ ID NO:48,SEQ ID NO:49,SEQ ID NO:50,SEQ ID NO:51,SEQ ID NO:52,SEQ ID NO:53,SEQ ID NO:56,SEQ ID NO:59,SEQ ID NO:60,SEQ ID NO:61,SEQ ID NO:62,SEQ ID NO:63,SEQ ID NO:64,SEQ ID NO:65,SEQ ID  NO:66,SEQ ID NO:67,SEQ ID NO:68,SEQ ID NO:69,SEQ ID NO:70,SEQ ID NO:71,SEQ ID NO:72,SEQ ID NO:73,SEQ ID NO:77,SEQ ID NO:78,SEQ ID NO:79,SEQ ID NO:80,SEQ ID NO:81,SEQ ID NO:84,SEQ ID NO:85,SEQ ID NO:86,SEQ ID NO:87,SEQ ID NO:88,SEQ ID NO:89,SEQ ID NO:90,SEQ ID NO:91,SEQ ID NO:92,SEQ ID NO:93,SEQ ID NO:94,SEQ ID NO:95,SEQ ID NO:96,SEQ ID NO:97,SEQ ID NO:98,SEQ ID NO:99,SEQ ID NO:100,SEQ ID NO:101,SEQ ID NO:102,SEQ ID NO:103,SEQ ID NO:104,SEQ ID NO:105,SEQ ID NO:106,SEQ ID NO:107,SEQ ID NO:108,SEQ ID NO:109,SEQ ID NO:110,SEQ ID NO:111,SEQ ID NO:112,SEQ ID NO:113,SEQ ID NO:114和SEQ ID NO:115中的一种；前提条件是所述的多核苷酸在该多核苷酸的3’末端具有选自GI,GA,II和IA中的二核苷酸；或者(b)(a)的类似物，其中除了多核苷酸3’末端的二核苷酸以外的一个或两个主要的碱基被天然或非天然形成的修饰的主要碱基所替代，再次的前提条件是所述的多核苷酸在该多核苷酸的3’末端具有选自GI,GA,II和IA中的二核苷酸。在一些实施方案中，所述的多核苷酸包含(a)的类似物，其中除了所述的二核苷酸以外的一个主要的碱基被天然形成的修饰所替代。在一些实施方案中，所述的多核苷酸包含(a)的类似物，其中除了所述的二核苷酸以外的一个主要的碱基被非天然形成的修饰所替代。在一些优选的实施方案中，所述的多核苷酸的长度少于50,45,40,35,30,25或20个碱基或碱基对(核苷酸)。在一些实施方案中，所述的多核苷酸是单链的。在其他的实施方案中，所述的多核苷酸是双链的。在一些实施方案中，所述的多核苷酸为DNA；所述的多核苷酸为RNA；或者所述的多核苷酸为DNA/RNA杂交体。在一些实施方案中，所述的多核苷酸包含磷酸酯修饰的键。在一些实施方案中，所述的多核苷酸仅包含磷硫酰键。在一些实施方案中，Nx包含非核酸间隔子部分。换言之，在一些实施方案中，Nx的N通过非核酸间隔子部分与Nx的另一个N链接。在这些实施方案的子集中，非核酸间隔子部分包含六(乙二醇)。此外，还提供了药物组合物，其包含上文所述的多核苷酸和药物可接受的赋形剂。此外，本发明公开提供了在个体中抑制TLR8依赖的免疫应答的方法：将在个体中能够有效抑制TLR8依赖的免疫应答的量的药物组合物给药所述的个 体。在一些优选的实施方案中，所述的个体为人类。
此外，本发明公开提供了多核苷酸，以及该多核苷酸在个体中抑制TLR7依赖的免疫应答的用途，所述的多核苷酸由下式的核苷酸序列组成：5’-QzTICNx-3或5’-QzTTCNx-3，其中Q和N均为核苷酸或核苷酸类似物，x为3至50的整数，z为0,1或2，并且其中所述的多核苷酸不包含CG二核苷酸。此外，本发明公开还提供了由下式的核苷酸序列组成的多核苷酸：5’-QzTICNx-3或5’-QzTTCNx-3，其中Q和N均为核苷酸或核苷酸类似物，x为3至50的整数，z为0,1或2，并且其中所述的多核苷酸不包含CG二核苷酸。在一些实施方案中，所述的式为5’-QzTICNx-3。在其他的实施方案中，所述的式为5’-QzTTCNx-3。在一些实施方案中，所述的多核苷酸包含SEQ ID NO:108。在一些实施方案中，所述的多核苷酸包含SEQ ID NO:109。进一步提供了包含多核苷酸和药物可接受的赋形剂的药物组合物。此外，本发明公开提供了在个体中抑制TLR7依赖的免疫应答的方法，包含：将在个体中能够有效抑制TLR7依赖的免疫应答的量的药物组合物给药所述的个体。在一些优选的实施方案中，所述的个体为人类。
此外，本发明公开提供了多核苷酸，以及该多核苷酸在个体中在抑制TLR7依赖的和TLR8依赖的免疫应答中的用途，其中所述的多核苷酸由下式的核苷酸序列组成：5’-QzTGC-NxX1X2X3X4X5X6-My-3,5’-Qzugc-NxX1X2X3X4X5X6-My-3,5’-QzTIC-NxX1X2X3X4X5X6-My-3或5’-QzTTC-NxX1X2X3X4X5X6-My-3；其中Q,N,X1,X2,X3,X4和M均为核苷酸或核苷酸类似物，x为0至50的整数，y为0或1，z为0,1或2，X5为G或I，并且X6为I或A，大写字母表示DNA，小写字母表示2’-O-甲基RNA；并且其中所述的多核苷酸不包含CG二核苷酸。此外，本发明公开还提供了由下式核苷酸序列组成的多核苷酸：5’-QzTGC-NxX1X2X3X4X5X6-My-3,5’-Qzugc-NxX1X2X3X4X5X6-My-3,5’-QzTIC-NxX1X2X3X4X5X6-My-3或5’-QzTTC-NxX1X2X3X4X5X6-My-3，其中Q,N,X1,X2,X3,X4和M均为核苷酸或核苷酸类似物，x为0至50的整数，y为0或1，z为0,1或2，X5为G或I，并且X6为I或A，大写字母表示DNA，小写字母(除了下角中的x和y)表示2’-O-甲基RNA；并且其中所述的多核苷酸不包含CG二核苷酸。在一些实施方案中，所述的多核苷酸包含SEQ ID NO:108。在一些实施方 案中，所述的多核苷酸包含SEQ ID NO:109。进一步提供了包含多核苷酸和药物可接受的赋形剂的药物组合物。此外，本发明公开提供了在个体中抑制TLR7依赖的和TLR8依赖的免疫应答的方法，包含：将在个体中能够有效抑制TLR7依赖的和TLR8依赖的免疫应答的量的药物组合物给药所述的个体。在一些优选的实施方案中，所述的个体为人类。
此外，本发明公开提供了多核苷酸，以及该多核苷酸在个体中抑制TLR7依赖的、TLR8依赖的和TLR9依赖的免疫应答的用途，其中所述的多核苷酸由下式的核苷酸序列组成：
5’-QzTGC-Nx-S1S2S3S4-Pa-X1X2X3X4X5X6-My-3, 
5’-Qzugc-Nx-S1S2S3S4-Pa-X1X2X3X4X5X6-My-3, 
5’-QzTIC-Nx-S1S2S3S4-Pa-X1X2X3X4X5X6-My-3,或
5’-QzTTC-Nx-S1S2S3S4-Pa-X1X2X3X4X5X6-My-3，其中Q,N,P,X1,X2,X3,X4和M均为核苷酸或核苷酸类似物，a为0至20的整数，x为0至50的整数，y为0或1，z为0,1或2，S1,S2,S3和S4均为G或I，X5为G或I，并且X6为I或A，大写字母表示DNA，小写字母表示2’-O-甲基RNA；并且其中所述的多核苷酸不包含CG二核苷酸。此外，本发明公开还提供了由下式核苷酸序列组成的多核苷酸：
5’-QzTGC-Nx-S1S2S3S4-Pa-X1X2X3X4X5X6-My-3, 
5’-Qzugc-Nx-S1S2S3S4-Pa-X1X2X3X4X5X6-My-3, 
5’-QzTIC-Nx-S1S2S3S4-Pa-X1X2X3X4X5X6-My-3,或
5’-QzTTC-Nx-S1S2S3S4-Pa-X1X2X3X4X5X6-My-3，其中Q,N,P,X1,X2,X3,X4和M均为核苷酸或核苷酸类似物，a为0至20的整数，x为0至50的整数，y为0或1，z为0,1或2，S1,S2,S3和S4均为G或I，X5为G或I，并且X6为I或A，大写字母表示DNA，小写字母表示2’-O-甲基RNA；并且其中所述的多核苷酸不包含CG二核苷酸。进一步提供了包含多核苷酸和药物可接受的赋形剂的药物组合物。此外，本发明公开提供了在个体中抑制TLR7依赖的、TLR8依赖的和TLR9依赖的免疫应答的方法，包含：将在个体中能够有效抑制TLR7依赖的、TLR8依赖的和TLR9依赖的免疫应答的量的药物组合物给药所述的个体。在一些优选的实施方案中，所述的个体为人类。
此外，本发明公开通过了多核苷酸，以及该多核苷酸在个体中在抑制TLR8依赖的和TLR9依赖的免疫应答中的用途，其中所述的多核苷酸由下式的核苷酸序列组成：5’-Nx-S1S2S3S4-Pa-X1X2X3X4X5X6-My-3，其中N,P,X1,X2,X3,X4和M均为核苷酸或核苷酸类似物，a为0至20的整数，x为0至50的整数，y为0或1，S1,S2,S3和S4均为G或I，X5为G或I，并且X6为I或A；并且其中所述的多核苷酸不包含CG二核苷酸。此外，本发明公开还提供了由下式核苷酸序列组成的多核苷酸：5’-Nx-S1S2S3S4-Pa-X1X2X3X4X5X6-My-3，其中N,P,X1,X2,X3,X4和M均为核苷酸或核苷酸类似物，a为0至20的整数，x为0至50的整数，y为0或1，S1,S2,S3和S4均为G或I，X5为G或I，并且X6为I或A；并且其中所述的多核苷酸不包含CG二核苷酸。进一步提供了包含多核苷酸和药物可接受的赋形剂的药物组合物。此外，本发明公开提供了在个体中抑制TLR8依赖的和TLR9依赖的免疫应答的方法，包含：将在个体中能够有效抑制TLR8依赖的和TLR9依赖的免疫应答的量的药物组合物给药所述的个体。在一些优选的实施方案中，所述的个体为人类。
此外，本发明公开提供了在个体中抑制免疫应答的方法，包含：将在个体中能够有效抑制免疫应答的量的药物组合物给药所述的个体，其中所述的药物组合物包含之前段落的任意一段所述的多核苷酸。在一些实施方案中，免疫应答与自体免疫疾病有关。在一些实施方案中，抑制免疫应答减轻了自体免疫疾病的一种或多种症状。在一些优选的实施方案中，自体免疫疾病选自类风湿性关节炎,胰腺炎,混合结缔组织病,系统性红斑狼疮,抗磷脂综合征,肠易激综合症,I型糖尿病和Sjogren综合征。在一些实施方案中，自体免疫疾病为Sjogren综合征。在一些实施方案中，自体免疫疾病与包含RNA的免疫络合物有关(或者由与肽结合的RNA导致的炎症，例如阳离子肽)。在一些实施方案中，免疫应答与炎症紊乱有关。在一些实施方案中，抑制免疫应答减轻了炎症紊乱的一种或多种症状。在一些实施方案中，炎症紊乱与TLR8表达的升高(或者异常的TLR8信号传递)有关。在一些实施方案中，抑制免疫应答治疗了自体免疫疾病或炎症紊乱。在一些实施方案中，抑制免疫应答预防或延迟了自体免疫疾病或炎症紊乱的发展。在一些实施方案中，个体为人类。
此外，本发明公开提供了用于制备药剂的、之前段落的任意一段所述的多核苷酸，其中所述的药剂用于治疗或预防自体免疫疾病或炎症紊乱。在一些实施方案中，所述的药剂包含用于减轻自体免疫疾病的一种或多种症状的、有效量的多核苷酸。在一些优选的实施方案中，自体免疫疾病选自类风湿性关节炎,胰腺炎,混合结缔组织病,系统性红斑狼疮,抗磷脂综合征,肠易激综合症,I型糖尿病和Sjogren综合征。在一些实施方案中，自体免疫疾病为Sjogren综合征。在一些实施方案中，自体免疫疾病与包含RNA的免疫络合物有关(或者由与肽结合的RNA导致的炎症，例如阳离子肽)。在一些实施方案中，免疫应答与炎症紊乱有关。在一些实施方案中，所述的药剂包含用于减轻炎症紊乱的一种或多种症状的、有效量的多核苷酸。在一些实施方案中，炎症紊乱与TLR8表达的升高(或者异常的TLR8信号传递)有关。在一些实施方案中，所述的药剂治疗了自体免疫疾病或炎症紊乱。所述的药剂预防或延迟了自体免疫疾病或炎症紊乱的发展。在一些优选的实施方案中，患有自体免疫疾病或炎症紊乱的个体为人类。
附图简述
图1A和1B示出了在经过2MOI灭活流感病毒刺激的PDC中，由浓度为30nM的多核苷酸C954,DV197和DV134对TLR7介导的IFN-α的诱导所产生的抑制百分率。
图2A和2B示出了在使用150μg/mL ORN8L刺激的单核细胞中，由浓度为0.9,0.237和0.06μM的多核苷酸C954,DV197和DV134对TLR8介导的TNF-α和IL-1β的诱导所产生的抑制百分率。
图3A和3B示出了在使用150μg/mL ORN8L刺激的单核细胞中，由浓度为0.75至0.047μM的多核苷酸DV197和DVX10对TLR8介导的TNF-α和IL-1β的诱导所产生的抑制百分率。
图4示出了在注射有300mcg ORN8L的hTLR8Tg Clone 8小鼠中，TLR-8介导的IL-12的诱导，其中所述的ORN8L是单独静脉给予的，或者与皮下给予DV197(100mcg)组合的。
图5示出了在使用150μg/mL ORN8L刺激的单核细胞中，由浓度为0.75至0.047μM的多核苷酸DV197,DVX1,DVX2,DVX3和DVX4对TLR8介导的TNF-α的诱导所产生的抑制百分率。
图6示出了在使用150μg/mL ORN8L刺激的单核细胞中，由浓度为1.5至0.047μM的多核苷酸DV197,DVX6,DVX7,DVX8和DVX9对TLR8介导的TNF-α的诱导所产生的抑制百分率。
图7示出了在使用150μg/mL ORN8L刺激的单核细胞中，由浓度为0.75至0.047μM的多核苷酸DV197,DVX20,DVX21,DVX24,DVX25和DVX26对TLR8介导的TNF-α的诱导所产生的抑制百分率。
图8示出了在使用150μg/mL ORN8L刺激的单核细胞中，由浓度为0.75至0.047μM的多核苷酸DV197,DVX11,DVX12,DVX13,DVX14,DVX15和DVX16对TLR8介导的TNF-α的诱导所产生的抑制百分率。
图9示出了在经过2MOI灭活流感病毒刺激的PDC中，由浓度为0.125至0.015μM的多核苷酸C954,DVX89,DVX90,DVX91,DVX92和DVX93对TLR7介导的IFN-α的诱导所产生的抑制百分率。
图10示出了在经过2MOI灭活流感病毒刺激的PDC中，由浓度为1.0至0.05μM的多核苷酸C954,DVX35和DVX42对TLR7介导的IFN-α的诱导所产生的抑制百分率。
图11示出了在使用单独的2MOI灭活流感病毒或者与浓度为1至0.002μM的DVX81组合的刺激的PDC中，TLR7介导的IFN-α的诱导。
图12示出了在使用单独的1μM CpG-TLR9L 1018ISS(SEQ ID NO:4)或者与浓度为2.0至0.03μM的C954和DVX81组合的刺激的B细胞中，TLR9介导的IL-6的诱导.
图13示出了在使用单独的得自3名类风湿性关节炎(RA)患者的血浆或得自3名健康(H)个体的血浆、或者与浓度为1μM的DVX42或DV197组合的刺激的PBMC中，产生的平均IL-8。
图14示出了在使用单独的得自8名类风湿性关节炎(RA)患者的血浆、或者与浓度为1μM的DVX81组合的刺激的PBMC中，产生的平均IL-8。PBMC得自3名健康的人类受试对象。
图15示出了由纯化的人类单核细胞生产的G-CSF,IL-1β,IL-6,IP-10, TNFα和VEGF，其中所述的纯化的人类单核细胞是使用单独的得自类风湿性关节炎患者的15％滑液(SN)、或者与浓度为1μM的DV197组合的而刺激的。
图16示出了在单独地静脉注射给予220mcg ORN8L、或者与100mcg DVX81组合静脉给予的hTLR8Tg Clone 8小鼠中，在2个小时和过夜(O/N)后，TLR-9介导的IL-12的诱导。
图17、图18和图19示出了不同多核苷酸相对于C954对人类B细胞非特异性IL-6的产生的影响。
图20示出了不同多核苷酸相对于C954对大鼠脾细胞非特异性IL-6的产生的影响。
图21示出了在使用单独的2MOI灭活流感病毒(PR8)、或者与浓度为0.25或0.06μM多核苷酸DVX82,DVX98或DVX99组合的刺激的PDC中，TLR-7介导的IFN-α的诱导量。
图22示出了在使用单独的2MOI灭活流感病毒(PR8)、或者与浓度为0.5或0.015μM多核苷酸C954,DVX42,DVX102,DVX103,DVX98或DVX99组合的刺激的PDC中，TLR-7介导的IFN-α的诱导量。
图23示出了在使用2MOI灭活流感病毒刺激的PDC中，由浓度为1至0.002μM的多核苷酸DVX99,DVX103,DVX104和DVX105对TLR7介导的IFN-α的诱导所产生的抑制百分率。
图24示出了在单独地静脉给予250mcg ORN7L、或者与皮下给予C954,DVX82,DVX98或DVX99(100mcg)组合的129S2/SvPasCrl小鼠中，在注射后2个小时，TLR-7介导的IL-12的诱导。
图25示出了在单独地静脉给予250mcg ORN7L、或者与皮下给予DVX103,DVX104或DVX99(100mcg)组合的129S2/SvPasCrl小鼠中，在注射后6个小时，对TLR7-介导的IL-12的诱导的影响。
图26A示出了在给予生理盐水或者100mg/kg C954,DVX82,DVX98,DVX99,DVX102或DVX103后，在经过一定时间后小鼠体重增加/减少。图26B示出了在给予生理盐水或者100mg/kg C954,DVX82,DVX98,DVX99,DVX102或DVX103后，在经过一定时间后小鼠体重改变的百分率(相对于第1天的体重)。
图27A示出了在给予生理盐水或者85mg/kg C954,DVX103和DVX104后，在经过一定时间后大鼠体重的增加/减少。图27B示出了在给予生理盐水或者25mg/kg C954,DVX103或DVX104后，在经过一定时间后大鼠体重的增加/减少。
图28示出了在给予生理盐水或者90mg/kg C954或DV185后，在经过一定时间后大鼠历史体重的增加/减少。
图29示出了与野生型小鼠以及使用DVX82或DVX99(2.2mg/kg，每周2次，持续5周)治疗后的人类TLR8Tg Clone 8小鼠相比，在人类TLR8Tg Clone 8小鼠的胰腺中hTLR8,mIFN-γ,mTNF-α,mIL-18,mIL-12p40,mIL-1α,mMMP9和mIP-10的相对水平。
图30示出了与野生型(WT)小鼠相比，使用PBS,DVX82或DVX99治疗的人类TLR8Tg Clone 8小鼠的胰腺疾病得分。
图31示出了与野生型小鼠和在使用DVX103(1mg/kg或5mg/kg，每周1次，持续10周)治疗后的人类TLR8Tg Clone 8小鼠相比，在人类TLR8Tg Clone 8小鼠的胰腺中mIFN-γ,mIL-1α,mIL-23,mIL-1β,mLT-α,mIL1-RA,mMMP-1,mMMP-9,mMMP-7,mMMP-10,hTLR8,mCD4,mCD8和mCD11β的相对水平。
图32A和32B示出了抗LBPA在人类单核细胞中诱导了炎症细胞因子TNF-α和IL-6。
图33A和33B示出了使用单独的1μg/mL抗LBPA或与1μM DVX82组合的刺激的单核细胞中，TNF-α和IL-6的诱导。
图34A示出了mIL-1α,mIL-1β,mTNF-α,mIFN-γ,mMMP-7,mCD11β的相对水平，图34B示出了与野生型(WT)小鼠以及使用PBS或DVX103(1mg/kg，每周1次，持续15周)治疗后的TLR7.6小鼠相比，在过表达小鼠TLR7基因(TLR7.6)的肾脏中，mCD8和mCD4的相对水平。图34C示出了在野生型小鼠以及在使用PBS或DVX103(1mg/kg，每周1次，持续15周)治疗的TLR7.6小鼠中，脾脏树突状细胞(DC)的数量。
图35A示出了与野生型(WT)小鼠以及使用生理盐水或DVX105(1mg/kg或5mg/kg，每周1次，持续8周)治疗后的TLR7.6小鼠相比，在TLR7.6小鼠的肾脏中，mIL-1α,mIL-1β,mLT-β,mMIG和mF4/80的相对水 平。图35B示出了在野生型以及使用PBS或DVX105(1mg/kg或5mg/kg，每周1次，持续8周)治疗的TLR7.6小鼠中，脾脏树突状细胞(DC)的数量。
图36示出了在首次胶原蛋白注射后的一段时间，在使用PBS或DVX105治疗的野生型(WT)小鼠(C57BL/6)和TLR8转基因小鼠(TLR8TGCL8)的、胶原蛋白诱导的类风湿性关节炎(CIA)模型中的疾病得分。在第1,7,14,20,24,28,31,35,42,49和53天给予治疗(PBS或DVX105,1mg/kg皮下)。
图37示出了在使用单独的1018ISS(SEQ ID NO:4,1μM)或者与浓度为1μM至0.03μM的C954,DVX107,DVX108,DVX109或DVX103组合的刺激的B细胞中，TLR9介导的IL-6的诱导。
图38示出了在使用单独的得自5名Sjogren综合征(SJ)患者的血清或得自3名健康个体的血清、或者与浓度为1μM的DVX99组合的刺激的CD14+单核细胞所生产的平均hIL-1α,hIL-1β,hTNF-α,hGM-CSF和hG-CSF。所述的单核细胞得自健康的人类受试对象。所示的结果代表了3个试验。
发明详述
本发明提供了人类Toll样受体(TLR)-抑制剂，以及在个体中在抑制TLR7-,TLR8-和/或TLR9依赖的免疫应答中的使用方法。在一些实施方案中，所述的个体还原自体免疫疾病或炎症紊乱。本发明公开的TLR抑制基序为包含抑制剂的多核苷酸，其中所述的抑制基序用于TLR7,TLR8和TLR9中的一种或多种。在此将更详细地描述本发明公开的以下方面：一般技术；定义、组合物、方法和试剂盒。
I.一般技术
除非另作说明，本发明公开的实施使用了分子生物学(包含重组技术)、微生物学、细胞生物学、化学、生物化学和免疫学的传统技术，这些技术都在本领域的技术范围内。这些技术在文献中成分地说明，例如Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第二版(Sambrook et al.,1989)；Oligonucleotide Synthesis(Gait,ed.,1984)；Animal Cell Culture(Freshney,ed., 1987)；Handbook of ExperimentalImmunology(Weir&Blackwell,eds.)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(Miller&Calos,eds.,1987)；Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel et al.,eds.,1987)；PCR:The Polymerase Chain Reaction(Mullis et al.,eds.,1994)；Current Protocols in Immunology(Coligan et al.,eds.,1991)；TheImmunoassayHandbook(Wild,ed.,Stockton Press NY,1994)；Bioconjugate Techniques(Hermanson,ed.,Academic Press,1996)；以及Methods of Immunological Analysis(Masseyeff,Albert,and Staines,eds.,Weinheim:VCH Verlags gesellschaft mbH,1993)。
II.定义
术语“核酸”、“多核苷酸”和“寡核苷酸”可以交换使用，并且包含单链DNA(ssDNA)、双链DNA(dsDNA)、单链RNA(ssRNA)、双链RNA(dsRNA)、修饰多核苷酸、多核苷或者它们的组合。多核苷酸可以是线性、支化或环状构造的，或者多核苷酸可以包含1个或多个线性、支化和/或环状的节段。多核苷酸为通常通过硫酸二酯键连接的核苷的聚合物，但是还可以使用备选的键，例如磷硫酰键。核苷由与糖结合的嘌呤(腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)或它们的衍生物)或嘧啶(胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)、尿嘧啶(U)或它们的衍生物)碱基组成。DNA中4种核苷单元(或碱基)被称为脱氧腺苷,脱氧鸟苷,胸苷和脱氧胞苷。RNA中4种核苷单元(或碱基)被称为腺苷,鸟苷,尿苷和胞苷。核苷酸为核酸的磷酸酯。
术语“激动剂”使用其最广泛的意义，并且包含通过受体活化信号传递的任何分子。例如TLR8激动剂与TLR8受体结合，并且活化TLR8信号传递途径。
术语“拮抗剂”使用其最广泛的意义，并且包含阻断激动剂生物活性的任何分子。例如TLR8拮抗剂抑制TLR8信号传递途径。
如本文所用，术语“免疫抑制序列”和“IIS”是指能够抑制可测量的免疫应答的核酸序列(例如体外测量、体内测量和/或离体测量)。
如本文所用，术语“免疫刺激序列”和“ISS”是指能够刺激可测量的免疫应答的核酸序列(例如体外测量、体内测量和/或离体测量)。就本发明公开的目的而言，数据ISS是指包含非甲基化的CG二核苷酸的核酸序列。
在多核苷酸存在和缺乏下，通过测量与TLR激动剂接触的免疫细胞 (例如白细胞，例如淋巴细胞、单核细胞和树突状细胞)的应答来测量该多核苷酸对TLR依赖的免疫应答的影响。示例性方法在实施例3中描述。如本文所述，TLR抑制剂为在低于500nM的IC50(半数抑制浓度)下抑制TLR依赖的免疫应答的多核苷酸。IC50低于200nM的多核苷酸被认为是高活性的TLR抑制剂。IC50为201-500nM的多核苷酸被认为是中等活性的TLR抑制剂。IC50大于500nM的抑制剂被认为是基本无活性的(例如非TLR抑制剂)。
可测量的免疫应答的实例包含但不限于抗原特异性抗体的生产、细胞因子的分泌、淋巴细胞的活化和淋巴细胞的增殖。
如本文所用，术语“反义”和“反义序列”是指多核苷酸的非编码链，该多核苷酸具有与mRNA的编码链互补的序列。在优选的实施方案中，本发明公开的多核苷酸并非为反义序列或RNAi分子(miRNA和siRNA)。换言之，在优选的实施方案中，本发明公开的TLR抑制剂与使用该TLR抑制剂的哺乳动物受试对象的转录物(或基因)不具有显著的同源性(或互补性)。例如在人类受试对象中用于抑制TLR依赖的免疫应答的本发明公开的多核苷酸在其长度长度上与人类基因座的核酸序列具有低于80％的一致性例如20个碱基的人类TLR8抑制剂与人类转录物的20个碱基共有不超过16个碱基，其中所述的转录物包含但不限于tlr8 mRNA)。具体而言，TLR抑制剂与哺乳动物受试对象(例如人类、非人类的灵长动物、农场动物、狗、猫、兔子、大鼠、小鼠等)的核酸序列具有低于80％,75％,70％,65％,60％,55％,50％,45％,40％,35％,30％,25％或20％的一致性。
术语“microRNA”和“miRNA”是指一类转录后调节剂，其为与靶mRNA的互补序列结合的短(～22核苷酸)RNA序列形式，通常导致靶序列沉默。术语“小干扰RNA”、“短干扰RNA”和“siRNA”是指一类长度为20-25个碱基对的双链RNA分子，其使用互补的核苷酸序列干扰基因的表达。
应答或参数的“刺激”包含当与其他相同的状况(除了所关注的参数以外)，或者备选地与另一种状况相比时，引发和/或增强所述的应答或参数(例如与缺乏TLR激动剂的情况相比，在TLR激动剂存在下，增强TLR信号传递)。例如免疫应答的“刺激”是指应答增强，这可以由应答的引发和/ 或增强而产生。相似地，细胞因子(例如IL-1α,IL-1β,IL-6和/或TNF-α)产生的刺激或者细胞类型(例如CTL)的刺激是指细胞因子或细胞类型的量或水平增加。
应答或参数的“压制”或“抑制”包含当与其他相同的状况(除了所关注的参数以外)，或者备选地与另一种状况相比时，降低所述的应答或参数(例如与缺乏TLR拮抗剂存在TLR激动剂的情况相比，在TLR激动剂和TLR拮抗剂存在下，增强TLR信号传递)。
如本文所用，术语“细胞”理解为不仅是指具体的题述细胞，而且还指此类细胞的后代或潜在的后代。由于突变或环境影响而使得下一代可能发生某些修饰，所以所述的后代实际上与亲代细胞可能是不一致的，但是仍包含在本文所用的术语的范围内。
术语“个体”是指哺乳动物，包含人类。个体包含但不限于人类、牛科动物、马科动物、猫科动物、犬科动物、啮齿动物或灵长动物受试对象。
“转基因动物”为包含一种或多种细胞的动物，其中所述的细胞戴有通过在亚细胞水平下刻意的遗传操作(例如通过微注射或使用重组病毒感染)而直接或间接地取得的遗传信息。这种引入的DNA分子可以整合至染色体中，或者其可以为染色体外复制的DNA。
“与一种或多种其他的治疗剂组合”给药包含同时(同时发生)和以任何顺序连续给药。
“慢性”给药是指与急性方式相反，以连续的方式给药所述的试剂，从而在延长的时期内保持最初的治疗作用(活性)。“间断”给药是指这样的治疗，其并非是连接和/或连续实施而未中断的，而实际上是周期性的。
本文所公开的试剂的“有效量”为足以执行具体陈述的目的的量。关于所述的目的，“有效量”可以凭经验和以常规的方式测定。
术语“治疗有效量”是指有效“治疗”受试对象(例如哺乳动物，例如人类)的疾病或紊乱的试剂(例如TLR抑制剂)的量。在自体免疫疾病的情况下，治疗有效量的所述的试剂减轻了自体免疫疾病的迹象或症状的。例如关于类风湿性关节炎的治疗，治疗有效量的试剂(例如TLR抑制剂)减轻了患者类风湿性关节炎的迹象或症状，其还可以减慢骨和软骨的损伤速率。
术语疾病的“治疗”(分词形式)或“治疗”(名词形式)是指执行方案，其可以包含向个体(人类或其他动物)给药一种或多种药品，以努力减轻疾病的迹象或症状。因此，“治疗”(分词形式)或“治疗”(名词形式)无需完全减轻迹象或症状，无需治愈，并且特意地包含对个体仅具有边缘效应的方案。
如本文所用及如本领域公知的那样，“治疗”(名词形式)是指用于获得有益或所需结果的方法，包含临床结果。有益或所需的临床结果包含但不限于减轻或改善一种或多种症状，减弱疾病的程度，稳定(即不恶化)疾病的状态，防止疾病扩散，延迟或减慢疾病的进程，改善或缓和疾病的状态，以及缓解(部分的或全部的)，而无论是可检测的还是不可检测的。此外，“治疗”(名词形式)还可以指比若未接受治疗的预期生存延长的生存。
本文所述的“大约”一个值或参数包含(并描述为)定向于该值或参数本身的变化。例如关于“大约X”的描述包含“X”的描述。
如本文所用以及在所附的权利要求书中，单数形式“a”、“or”和“the”包含复数形式，除非内容中另外作出清楚的描述。
应该理解的是本文以“包含”来描述的方法和实施方案包含“由方面和实施方案组成”和/或“基本上由方面和实施方案组成”。
III.组合物
本文提供了包含抑制基序的多核苷酸，其中所述的抑制基序用于TLR7,TLR8和TLR9(TLR抑制剂)中的一种或多种。此外，还提供了用于本文所述的任一方法中的TLR抑制剂。本文所述的各免疫抑序列(IIS)包含至少一个抑制基序。包含抑制基序的TLR抑制剂可以为单链或双链DNA、以及单链或双链RNA或者DNA/RNA杂交体。TLR抑制剂包含一种或多种核糖核苷酸(包含核糖作为唯一的或主要的糖成分)和/或脱氧核糖核苷酸(包含脱氧核糖作为主要的糖成分)。引入到TLR抑制剂中的杂环碱基或核酸碱基可以为天然形成的主要嘌呤或嘧啶碱基(即尿嘧啶,胸腺嘧啶,胞嘧啶,腺嘌呤和鸟嘌呤)。在某些实施方案中，在多核苷酸的3’末端除了二核苷酸以外的一个或多个主要的碱基均被天然或非天然形成的修饰的主要碱基所替代。在某些实施方案中，一个或多个核苷酸包含修饰。在某些实施方案中，一个或多个核苷酸包含修饰的碱基。在某些实施方案中，一个 或多个核苷酸包含修饰的糖。在某些实施方案中，一个或多个核苷酸包含2’-脱氧次黄苷。在某些实施方案中，一个或多个核苷酸不包含C类似物或G类似物(例如不包含7-脱氮鸟苷)。在某些实施方案中，所述的多核苷酸包含修饰。在某些实施方案中，所述的多核苷酸包含修饰的碱基。在某些实施方案中，所述的多核苷酸包含修饰的糖。在某些实施方案中，所述的多核苷酸不包含修饰的糖。在某些实施方案中，所述的多核苷酸不包含C类似物或G类似物(例如不包含7-脱氮鸟苷)。在某些实施方案中，所述的多核苷酸不包含CG二核苷酸。在优选的实施方案中，包含IIS的本发明公开的多核苷酸并非为反义序列或RNAi分子(miRNA和siRNA)。
在本文所提供的任一方法或组合物的某些实施方案中，一个或多个核苷酸包含修饰。在某些实施方案中，所述的修饰为2’-糖修饰。在某些实施方案中，所述的2’-糖修饰为2'-O-甲基糖修饰或2’-O-甲氧基乙基糖修饰。在某些实施方案中，所述的多核苷酸由所有的2’-脱氧核糖多核苷酸组成。在某些实施方案中，所述的多核苷酸为2’-脱氧核糖多核苷酸和2’-糖修饰嵌合序列。在某些实施方案中，所述的多核苷酸为2’-脱氧核糖多核苷酸和2’-O-甲基糖核糖多核苷酸嵌合序列。在某些实施方案中，所述的多核苷酸为2’-脱氧核糖多核苷酸和2’-O-甲氧基乙基糖核糖多核苷酸嵌合序列。在某些实施方案中，所述的多核苷酸具有包含修饰的磷酸酯键的至少一个核苷酸。在某些实施方案中，所述的多核苷酸包含唯一的磷硫酰键。在某些实施方案中，所述的多核苷酸包含唯一的磷硫酰键和磷酸二酯键。在某些实施方案中，一个或多个核苷酸包含修饰的碱基。在某些实施方案中，一个或多个核苷酸包含修饰的糖。在某些实施方案中，一个或多个核苷酸包含2’-脱氧次黄苷。在某些实施方案中，一个或多个核苷酸不包含C类似物或G类似物(例如不包含7-脱氮鸟苷)。如本文所用，术语“核苷酸类似物”是指这样的化合物，其基本保留了与衍生该化合物的核苷酸的特性。例如7-dG为G类似物，而N4-乙基-dC为C类似物。另一方面，核苷酸或碱基修饰是指未保留核苷酸或碱基的特性的化合物。换言之，术语修饰涵盖了使用不同的天然或非天然形成的核苷酸或碱基取代核苷酸或碱基。例如术语修饰涵盖了A取代G。如清除传达的那样，应该理解的是对于本文所述的所有的式，可以独立地选择任何和所有的参数。例如在包含变量 x和y的式中，如果x＝0-2，则可以独立地选择y，而不管x值(或者式中任何其他可选择的参数)。
在一些实施方案中，所述的多核苷酸小于以下核苷酸(碱基或碱基对)长度的大约任意一种：100,95,90,85,80,75,70,65,60,55,50,45,40,35,30,29,28,27,26,25,24,23,22,21,20,19,18,17,16,15,14,13,12,11,10,9,8或7。在一些实施方案中，所述的多核苷酸大于以下核苷酸(碱基或碱基对)长度的大约任意一种：6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,35,40,45,50,55,60,65,70,75,80,85,90或95。换言之，所述的多核苷酸可以为任何尺寸范围，其具有100,95,90,85,80,75,70,65,60,55,50,45,40,35,30,29,28,27,26,25,24,23,22,21,20,19,18,17,16,15,14,13,12,11,10,9,8或7的上限以及6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,35,40,45,50,55,60,65,70,75,80,85,90或95的独立选择的下限，其中下限小于上限。
TLR7抑制剂
本发明通过了用于本文所述的任意一种方法(例如抑制或压制TLR7依赖的免疫应答)中的TLR7抑制剂。TLR7抑制剂为包含至少一个TLR7抑制基序的多核苷酸。
本发明公开的TLR7抑制剂为由下式核苷酸序列组成的多核苷酸：5’-QzTICNx-3或5’-QzTTCNx-3，其中Q和N均为核苷酸或核苷酸类似物，x为3至50的整数，z为0,1或2。本文提供了用于抑制TLR7依赖的免疫应答的多核苷酸，其中所述的多核苷酸由下式的核苷酸序列组成：5’-QzTICNx-3或5’-QzTTCNx-3，其中Q和N均为核苷酸或核苷酸类似物，x为3至50的整数，z为0,1或2。在一些实施方案中，多核苷酸由下式的核苷酸序列组成：5’-QzTICNx-3或5’-QzTTCNx-3，其中Q和N均为核苷酸或核苷酸类似物，x为3至50的整数，z为0,1或2，并且其中所述的多核苷酸不包含CG二核苷酸。这意味着z并非为3，Qz并非为TGC或ugc，QzTIC并非为TGCTIC或ugcTIC，而QzTTC并非为TGCTTC或ugcTTC，其中大写字母表示DNA，小写字母表示2’-O-甲基RNA。在一些实施方案中，所述的多核苷酸不包含CG二核苷酸。在一些实施方案中， 所述的多核苷酸不包含修饰的CG二核苷酸。在某些实施方案中，所述的多核苷酸不包含5’-GGGG-3’或5’-GIGG-3’。在某些实施方案中，所述的多核苷酸不包含5’-S1S2S3S4-3’，其中S1,S2,S3和S4均独立地为G或能够防止G-四链体形成和/或防止Hoogsteen碱基配对的分子。在另一个实施方案中，能够防止G-四链体形成和/或防止Hoogsteen碱基配对的分子为核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸，例如次黄苷,7-脱氮-鸟苷,7-脱氮-2'-脱氧黄苷,7-脱氮-8-氮杂-2'-脱氧鸟苷,2'-脱氧水粉蕈素,异脱氧鸟苷或8-氧代-2'-脱氧鸟苷。在一些实施方案中，所述的多核苷酸包含5’-GGGG-3’或5’-GIGG-3’。在一些实施方案中，所述的多核苷酸包含5’-S1S2S3S4-3’。在一些实施方案中，Nx包含非核酸间隔子部分。在另一个实施方案中，所述的非核酸间隔子部分包含六(乙二醇)。
如本文所述，x为3至50的整数。这意味着x为3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49或50。在一些实施方案中，x为3至45、3至40、3至35、3至30、3至25、3至20、3至15、3至10、或者3至5。在一些实施方案中，x大于2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39或40，但不大于50。在一些实施方案中，x小于51,50,49,48,47,46,45,44,43,42,41,40,39,38,37,36,35,34,33,32,31,30,29,28,27,26,25,24,23,22,21,20,19,18,17,16,15,14,13,12,1110,9,8,7,6,5或4，但不小于3。
如本文所述，z为0,1或2。在一些实施方案中，z为0(5’-TIC-3’或5’-TTC处于多核苷酸的5’末端)。在一些实施方案中，z为1。在一些实施方案中，z为2。
示例性TLR7抑制剂为包含选自以下序列的多核苷酸：
5’-TIC TGC TCC TTGAGI-3’(SEQ ID NO:36)；
5’-TTC TGC TCC TTGAGI-3’(SEQ ID NO:38)；
5’-TIC TIC TCC TTIAII-3’(SEQ ID NO:44)；
5’-TTC TTC TCC TTTATT-3’(SEQ ID NO:46)；
5’-TIC TCC TTGAGI-3’(SEQ ID NO:48)；
5’-TTC TCC TTGAGI-3’(SEQ ID NO:50)；
5’-TIC TCC TTIAAI-3’(SEQ ID NO:55)；
5’-TIC TCC TTIAIA-3’(SEQ ID NO:56)；
5’-TIC TCC TTIAAA-3’(SEQ ID NO:57)；
5’-TIC TCC TTI IAI-3’(SEQ ID NO:58)；
5’-TIC TCC TTAIIA-3’(SEQ ID NO:59)；
5’-TICAGI TTI AII-3’(SEQ ID NO:60)；
5’-TICAGIAGIAII-3’(SEQ ID NO:61)；
5’-TIC TIC TII TTIAII-3’(SEQ ID NO:62)；
5’-TIC TCC TTIAII-3’(SEQ ID NO:63)；
5’-TIC TCC TTI III-3’(SEQ ID NO:64)；
5’-TIC TCC TTI CII-3’(SEQ ID NO:65)；
5’-TIC TCC TTI GII-3’(SEQ ID NO:66)；
5’-TIC TCC TTI TII-3’(SEQ ID NO:67)；
5’-TIC TIC TCC TII TTI CII-3’(SEQ ID NO:85)；
5’-TIC TIC TCC AGI TTI CII-3’(SEQ ID NO:86)；
5’-TIC TIC TCC TCC TTI CII-3’(SEQ ID NO:87)；
5’-TIC TIC TTGAGI TTI CII-3’(SEQ ID NO:88)；
5’-TIC TIC TCC TCC TTI CIIAII-3’(SEQ ID NO:90)；
5’-TIC TCC TCC TTI CIIAII-3’(SEQ ID NO:91)；
5’-TIC TIC TCC TTI CII-3’(SEQ ID NO:95)；
5’-TTC TTC TCC TTI CII-3’(SEQ ID NO:97)；
5’-TIC TCC TCC TTI CIIAIIA-3’(SEQ ID NO:99)；
5’-TIC TIC TTGAGI TTI CIIAII-3’(SEQ ID NO:103)；
5’-TIC TTGAGI TTI CIIAII-3’(SEQ ID NO:104)；
5’-TIC TCC TTGAGIAII-3’(SEQ ID NO:108)；
5’-TIC TCC TCC TTGAGIAII-3’(SEQ ID NO:109)；
5’-TIC TTC TCC TTGAGIAII-3’(SEQ ID NO:110)；
5’-TIC TCC TCC TTG IIAII-3’(SEQ ID NO:111)；
5’-TIC TCC TCC TTG GGIAII-3’(SEQ ID NO:114)；和
5’-TIC TTC TCC TTG GGIAII-3’(SEQ ID NO:115)；
其中I＝2’-脱氧次黄苷并且大写字母表示DNA，前提条件是多核苷酸在该多核苷酸的5’末端具有选自TIC和TTC的三核苷酸。在一些实施方案中，所述的多核苷酸包含SEQ IDNO:108。在一些实施方案中，所述的多核苷酸包含SEQ IDNO:109。
在一些实施方案中，所述的多核苷酸包含：
(a)SEQ ID NO:36,SEQ ID NO:38,SEQ ID NO:44,SEQ ID NO:46,SEQ ID NO:48,SEQ ID NO:50,SEQ ID NO:55,SEQ ID NO:56,SEQ ID NO:57,SEQ ID NO:58,SEQ ID NO:59,SEQ ID NO:60,SEQ ID NO:61,SEQ ID NO:62,SEQ ID NO:63,SEQ ID NO:64,SEQ ID NO:65,SEQ ID NO:66,SEQ ID NO:67,SEQ ID NO:85,SEQ ID NO:86,SEQ ID NO:87,SEQ ID NO:88,SEQ ID NO:90,SEQ ID NO:91,SEQ ID NO:95,SEQ ID NO:97,SEQ ID NO:99,SEQ ID NO:103,SEQ ID NO:104,SEQ ID NO:108,SEQ ID NO:109,SEQ ID NO:110；SEQ ID NO:111,SEQ ID NO:114和SEQ ID NO:115中的一种，前提条件是所述的多核苷酸在该多核苷酸的5’末端具有选自TIC和TTC的三核苷酸；或者
(b)(a)的类似物，其中除了多核苷酸3’末端的二核苷酸以外的一个或两个主要的碱基被天然或非天然形成的修饰的主要碱基所替代，前提条件是所述的多核苷酸在该多核苷酸的5’末端具有选自TIC和TTC中的三核苷酸。在其他的实施方案中，所述的多核苷酸包含(a)的类似物，其中除了所述的二核苷酸以外的一个主要的碱基被天然形成的修饰所替代。在其他的实施方案中，所述的多核苷酸包含(a)的类似物，其中除了所述的二核苷酸以外的一个主要的碱基被非天然形成的修饰所替代。所述的多核苷酸包含(a)的类似物，其中除了所述的三核苷酸以外的一个主要的碱基被非天然形成的修饰所替代。在一些实施方案中，所述的多核苷酸的长度少于50,45,40,35,30,25或20个碱基或碱基对(核苷酸)。在一些实施方案中，所述的多核苷酸是单链的。在一些实施方案中，所述的多核苷酸是双链的。在一些实施方案中，所述的多核苷酸为单链DNA。在一些实施方案中， 所述的多核苷酸为双链DNA。在一些实施方案中，所述的多核苷酸为单链RNA。在一些实施方案中，所述的多核苷酸为双链RNA。在一些实施方案中，所述的多核苷酸包含磷酸酯修饰的键。在一些实施方案中，所述的多核苷酸仅包含磷硫酰键。在一些实施方案中，所述的多核苷酸包含一个或多个磷硫酰键。在一些实施方案中，所述的多核苷酸仅包含磷硫酰和磷酸二酯键。在一些实施方案中，Nx包含非核酸间隔子部分。或者换言之，在一些实施方案中，Nx的N通过非核酸间隔子部分与Nx的另一个N链接。在其他的实施方案中，非核酸间隔子部分包含六(乙二醇)。
TLR8抑制剂
本文提供了用于本文所述的任一方法中的TLR8抑制剂(例如抑制或压制TLR8依赖的免疫应答)。TLR8抑制剂为包含至少一个TLR8抑制基序的多核苷酸。
本发明公开的TLR8抑制剂为由下式的核苷酸序列组成的多核苷酸：5’-NxX1X2X3X4X5X6-My-3’，其中N,X1,X2,X3,X4和M均为核苷酸或核苷酸类似物，x为0至50的整数，y为0或1，X5为G或I，X6为I或A。换言之，My处于多核苷酸的3’末端。此外，提供了TLR8抑制剂，其中TLR8抑制剂为由下式的核苷酸组成的多核苷酸：5’-NxX1X2X3X4X5X6-3’，其中N,X1,X2,X3和X4均为核苷酸或核苷酸类似物，X5为G或I，X6为I或A，x为0至50的整数，并且X6处于多核苷酸的3’末端，前提条件是当X5X6为GI或GA时，则X3和X4均为A,T或C。此外，本文提供了TLR8抑制剂，其中TLR8抑制剂为由下式的核苷酸序列组成的多核苷酸：5’-NxX1X2X3X4X5X6-3’，其中N为核苷酸或核苷酸类似物，X1和X2均为A,T,C,G或I，X3和X4均为A,T或C，X5为G或I，X6为I或A，x为0至50的整数，并且X6处于多核苷酸的3’末端。本文提供了用于抑制TLR8依赖的免疫应答的多核苷酸，其中所述的多核苷酸由下式的核苷酸序列组成：5’-NxX1X2X3X4X5X6-My-3’，其中N,X1,X2,X3,X4,和M均为核苷酸或核苷酸类似物，x为0至50的整数，y为0或1，X5为G或I，并且X6为I或A。此外，本发明提供了用于抑制TLR8依赖的免疫应答的多核苷酸，其中所述的多核苷酸由下式的核苷酸序列组成：5’-NxX1X2X3X4X5X6-3’， 其中N,X1,X2,X3和X4均为核苷酸或核苷酸类似物，X5为G或I，X6为I或A，x为0至50的整数，并且X6处于多核苷酸的3’末端，前提条件是当X5X6为GI或GA时，则X3和X4均为A,T或C。此外，本文提供了用于抑制TLR8依赖的免疫应答的多核苷酸，其中所述的多核苷酸由下式的核苷酸序列组成：5’-NxX1X2X3X4X5X6-3’，其中N为核苷酸或核苷酸类似物，X1和X2均为A,T,C,G或I，X3和X4均为A,T或C，X5为G或I，X6为I或A，x为0至50的整数，并且X6处于多核苷酸的3’末端。在一些实施方案中，所述的多核苷酸不包含CG二核苷酸。在一些实施方案中，所述的多核苷酸不包含C类似物或G类似物(例如不包含7-脱氮鸟苷)。在一些实施方案中，所述的多核苷酸不包含修饰的碱基。在一些实施方案中，所述的多核苷酸不包含修饰的糖。在一些实施方案中，所述的多核苷酸在距该多核苷酸5’末端的0,1或2个核苷酸的位置处不包含TGC或ugc三核苷酸。在一些实施方案中，所述的多核苷酸在距该多核苷酸5’末端的0,1或2个核苷酸的位置处包含TGC或ugc三核苷酸。在一些实施方案中，所述的多核苷酸不包含5’-GGGG-3’或5’-GIGG-3’。在一些实施方案中，所述的多核苷酸不包含5'-S1S2S3S4-3'，其中S1,S2,S3和S4独立地为G或者能够防止G-四链体形成和/或防止Hoogsteen碱基配对的分子。在其他的实施方案中，能够防止G-四链体形成和/或防止Hoogsteen碱基配对的分子为核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸，例如次黄苷,7-脱氮-鸟苷,7-脱氮-2'-脱氧黄苷,7-脱氮-8-氮杂-2'-脱氧鸟苷,2'-脱氧水粉蕈素,异脱氧鸟苷或8-氧代-2'-脱氧鸟苷。在一些实施方案中，所述的多核苷酸不包含SEQ ID NO:9。在一些实施方案中，所述的多核苷酸包含5’-GGGG-3’或5’-GIGG-3’。在某些实施方案中，所述的多核苷酸包含5'-S1S2S3S4-3'，其中S1,S2,S3和S4独立地为G或者能够防止G-四链体形成和/或防止Hoogsteen碱基配对的分子。在其他的实施方案中，能够防止G-四链体形成和/或防止Hoogsteen碱基配对的分子为核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸，例如次黄苷,7-脱氮-鸟苷,7-脱氮-2'-脱氧黄苷,7-脱氮-8-氮杂-2'-脱氧鸟苷,2'-脱氧水粉蕈素,异脱氧鸟苷或8-氧代-2'-脱氧鸟苷。在一些实施方案中，所述的多核苷酸在距该多核苷酸5’末端的0,1或2个核苷酸的位置处不包含TGC或UGC三核苷酸，并且包含5’-GGGG-3’或5’-GIGG-3’。在一些实施方案中，所述的多 核苷酸在该多核苷酸的3-末端不包含GT,GU或GG二核苷酸。在一些实施方案中，所述的多核苷酸并非为反义序列或RNAi序列。在一些实施方案中，X3和X4均独立地为A,C,G,T或I。在一些实施方案中，X1,X2,X3和X4均独立地为A,C,G,T或I。在一些实施方案中，X5为G。在一些实施方案中，X5为I。在一些实施方案中，X6为I。在一些实施方案中，X5为A。在一些实施方案中，X5X6为GI。在一些实施方案中，X5X6为GA。在一些实施方案中，X5X6为II。在一些实施方案中，X5X6为IA。在一些实施方案中，X5并非为G。在一些实施方案中，X5并非为I。在一些实施方案中，X6并非为I。在一些实施方案中，X6并非为A。在一些实施方案中，X5X6并非为GI。在一些实施方案中，X5X6并非为GA。在一些实施方案中，X5X6并非为II。在一些实施方案中，X5X6并非为IA。在一些实施方案中，其中y为0。在一些实施方案中，X3X4X5X6为GAGI,GAGA,GGGI,TTGA,IAII,GTGI,AAII,IAIA,AIIA,IIII,ICII,IGII,ITII,CAII,TAII,CCII,TTII和GGII中的一种。在一些实施方案中，X3X4X5X6为TTGA,IAII,AAII,IAIA,AIIA,IIII,ICII,IGII,ITII,CAII,TAII,CCII,TTII和GGII中的一种。在一些实施方案中，X1X2X3X4X5X6为TTGAGI,TTGAGA,TTGGGI,CCTTGA,TTIAII,TTGTGI,TTAAII,TTIAIA,TTAIIA,AGIAII,TTIIII,TTICII,TTIGII,TTITII,TTCAII,TTTAII,TTCCII,TTTTII,TTGGII,IIIAII,CCIAII,GGIAII,AAIAII,CIIAII和IIAIIA中的一种。在一些实施方案中，X1X2X3X4X5X6为CCTTGA,TTIAII,TTAAII,TTIAIA,TTAIIA,AGIAII,TTIIII,TTICII,TTIGII,TTITII,TTCAII,TTTAII,TTCCII,TTTTII,TTGGII,IIIAII,CCIAII,GGIAII,AAIAII,CIIAII和IIAIIA中的一种。
如本文所述，x为0至50的整数。这意味着x为0,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49或50。在一些实施方案中，x为3至45、3至40、3至35、3至30、3至25、3至20、3至15、3至10、或者3至5。在一些实施方案中，x大于2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39或40，但不大于50。在一些实施方案中，x小于51,50,49,48,47,46,45,44,43,42,41,40,39,38,37,36,35,34, 33,32,31,30,29,28,27,26,25,24,23,22,21,20,19,18,17,16,15,14,13,12,1110,9,8,7,6,5,4,3,2，但不小于1。在一些实施方案中，x为0。
如本文所述，y为0或1。在一些实施方案中，y为0(X5X6处于多核苷酸的3’末端)。在一些实施方案中，y为1。
在示例性实施方案中，所述的多核苷酸包含SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:14,SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:16,SEQ ID NO:17,SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:24,SEQ ID NO:26,SEQ ID NO:30,SEQ ID NO:31,SEQ ID NO:32,SEQ ID NO:33,SEQ ID NO:34,SEQ ID NO:35,SEQ ID NO:36,SEQ ID NO:37,SEQ ID NO:38,SEQ ID NO:39,SEQ ID NO:40,SEQ ID NO:44,SEQ ID NO:48,SEQ ID NO:49,SEQ ID NO:50,SEQ ID NO:51,SEQ ID NO:52,SEQ ID NO:53,SEQ ID NO:56,SEQ ID NO:59,SEQ ID NO:60,SEQ ID NO:61,SEQ ID NO:62,SEQ ID NO:63,SEQ ID NO:64,SEQ ID NO:65,SEQ ID NO:66,SEQ ID NO:67,SEQ ID NO:68,SEQ ID NO:69,SEQ ID NO:70,SEQ ID NO:71,SEQ ID NO:72,SEQ ID NO:73,SEQ ID NO:77,SEQ ID NO:78,SEQ ID NO:79,SEQ ID NO:80,SEQ ID NO:81,SEQ ID NO:84,SEQ ID NO:85,SEQ ID NO:86,SEQ ID NO:87,SEQ ID NO:88,SEQ ID NO:89,SEQ ID NO:90,SEQ ID NO:91,SEQ ID NO:92,SEQ ID NO:93,SEQ ID NO:94,SEQ ID NO:95,SEQ ID NO:96,SEQ ID NO:97,SEQ ID NO:98,SEQ ID NO:99,SEQ ID NO:100,SEQ ID NO:101,SEQ ID NO:102,SEQ ID NO:103,SEQ ID NO:104,SEQ ID NO:105,SEQ ID NO:106,SEQ ID NO:107,SEQ ID NO:108,SEQ ID NO:109,SEQ ID NO:110,SEQ ID NO:111,SEQ ID NO:112,SEQ ID NO:113,SEQ ID NO:114和SEQ ID NO:115中的一种，前提条件是GI,GA,II或IA为距多核苷酸3’末端的0或1个核苷酸。在一些实施方案中，所述的多核苷酸包含SEQ ID NO:87,SEQ ID NO:88,SEQ ID NO:89,SEQ ID NO:90,SEQ ID NO:91,SEQ ID NO:92,SEQ ID NO:93,SEQ ID NO:94,SEQ ID NO:95,SEQ ID NO:96,SEQ ID NO:97,SEQ ID NO:98,SEQ ID NO:99,SEQ ID NO:100,SEQ ID NO:101,SEQ ID NO:102,SEQ ID NO:103,SEQ ID NO:104,SEQ ID NO:105,SEQ ID NO:106,SEQ ID NO:107,SEQ ID NO:108,SEQ ID NO:109,SEQ ID NO:110,SEQ ID NO:111,SEQ ID NO:112,SEQ ID NO:113,SEQ ID NO:114和SEQ ID NO:115中的一 种，前提条件是GI,GA,II或IA为距多核苷酸3’末端的0或1个核苷酸。在一些实施方案中，所述的多核苷酸包含SEQ ID NO:108。在一些实施方案中，所述的多核苷酸包含SEQ ID NO:109。
在一些实施方案中，所述的多核苷酸包含：
(a)SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:14,SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:16,SEQ ID NO:17,SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:24,SEQ ID NO:26,SEQ ID NO:30,SEQ ID NO:31,SEQ ID NO:32,SEQ ID NO:33,SEQ ID NO:34,SEQ ID NO:35,SEQ ID NO:36,SEQ ID NO:37,SEQ ID NO:38,SEQ ID NO:39,SEQ ID NO:40,SEQ ID NO:44,SEQ ID NO:48,SEQ ID NO:49,SEQ ID NO:50,SEQ ID NO:51,SEQ ID NO:52,SEQ ID NO:53,SEQ ID NO:56,SEQ ID NO:59,SEQ ID NO:60,SEQ ID NO:61,SEQ ID NO:62,SEQ ID NO:63,SEQ ID NO:64,SEQ ID NO:65,SEQ ID NO:66,SEQ ID NO:67,SEQ ID NO:68,SEQ ID NO:69,SEQ ID NO:70,SEQ ID NO:71,SEQ ID NO:72,SEQ ID NO:73,SEQ ID NO:77,SEQ ID NO:78,SEQ ID NO:79,SEQ ID NO:80,SEQ ID NO:81,SEQ ID NO:84,SEQ ID NO:85,SEQ ID NO:86,SEQ ID NO:87,SEQ ID NO:88,SEQ ID NO:89,SEQ ID NO:90,SEQ ID NO:91,SEQ ID NO:92,SEQ ID NO:93,SEQ ID NO:94,SEQ ID NO:95,SEQ ID NO:96,SEQ ID NO:97,SEQ ID NO:98,SEQ ID NO:99,SEQ ID NO:100,SEQ ID NO:101,SEQ ID NO:102,SEQ ID NO:103,SEQ ID NO:104,SEQ ID NO:105,SEQ ID NO:106,SEQ ID NO:107,SEQ ID NO:108,SEQ ID NO:109,SEQ ID NO:110,SEQ ID NO:111,SEQ ID NO:112,SEQ ID NO:113,SEQ ID NO:114和SEQ ID NO:115中的一种，前提条件是所述的多核苷酸在距该多核苷酸3’末端的0或1个核苷酸处具有选自GI,GA,II,IA中的二核苷酸；或者
(b)(a)的类似物，其中除了多核苷酸3’末端的二核苷酸以外的一个或两个主要的碱基被天然或非天然形成的修饰的主要碱基所替代，前提条件是所述的多核苷酸在距该多核苷酸3’末端的0或1个核苷酸处具有选自GI,GA,II,IA中的二核苷酸。在其他的实施方案中，所述 的多核苷酸包含(a)的类似物，其中除了所述的二核苷酸以外的一个主要的碱基被天然形成的修饰所替代。在其他的实施方案中，所述的多核苷酸包含(a)的类似物，其中除了所述的二核苷酸以外的一个主要的碱基被非天然形成的修饰所替代。在一些实施方案中，所述的多核苷酸的长度少于50,45,40,35,30,25或20个碱基或碱基对(核苷酸)。在一些实施方案中，所述的多核苷酸是单链的。在一些实施方案中，所述的多核苷酸是双链的。在一些实施方案中，所述的多核苷酸为单链DNA。在一些实施方案中，所述的多核苷酸为双链DNA。在一些实施方案中，所述的多核苷酸为单链RNA。在一些实施方案中，所述的多核苷酸为双链RNA。在一些实施方案中，所述的多核苷酸包含磷酸酯修饰的键。在一些实施方案中，所述的多核苷酸仅包含磷硫酰键。在一些实施方案中，所述的多核苷酸包含一个或多个磷硫酰键。在一些实施方案中，所述的多核苷酸仅包含磷硫酰和磷酸二酯键。在一些实施方案中，Nx包含非核酸间隔子部分。在其他的实施方案中，非核酸间隔子部分包含六(乙二醇)。
TLR7/8组合抑制剂 
本文提供了用于本文所述的任一方法(例如抑制或压制TLR7依赖的和TLR8依赖的免疫应答)中的包含TLR7抑制基序和TLR8抑制基序的多核苷酸(下文中为“TLR7/8组合抑制剂”)。
本文提供了TLR7/8组合抑制剂，其中所述的TLR7/8组合抑制剂为由下式的核苷酸序列组成的多核苷酸：5’-QzTGC-NxX1X2X3X4X5X6-My-3,5’-Qzugc-NxX1X2X3X4X5X6-My-3,5’-QzTIC-NxX1X2X3X4X5X6-My-3或5’-QzTTC-NxX1X2X3X4X5X6-My-3，其中Q,N,X1,X2,X3,X4和M均为核苷酸或核苷酸类似物，x为0至50的整数，y为0或1，z为0,1或2，X5为G或I，并且X6为I或A，大写字母表示DNA，小写字母表示2’-O-甲基RNA，并且其中所述的多核苷酸不包含CG二核苷酸。本文提供了用于抑制LTR7依赖的和TLR8依赖的免疫应答的多核苷酸，其中所述的多核苷酸由下式的核苷酸序列组成：5’-QzTGC-NxX1X2X3X4X5X6-My-3,5’-Qzugc-NxX1X2X3X4X5X6-My-3,5’-QzTIC-NxX1X2X3X4X5X6-My-3或5’-QzTTC-NxX1X2X3X4X5X6-My-3，其中Q,N,X1,X2,X3,X4和M均为核苷酸 或核苷酸类似物，x为0至50的整数，y为0或1，z为0,1或2，X5为G或I，并且X6为I或A，大写字母表示DNA，小写字母表示2’-O-甲基RNA，并且其中所述的多核苷酸不包含CG二核苷酸。在一些实施方案中，所述的多核苷酸不包含修饰的CG二核苷酸。在一些实施方案中，多核苷酸由下式的核苷酸序列组成：5’-QzTGC-NxX1X2X3X4X5X6-My-3,5’-Qzugc-NxX1X2X3X4X5X6-My-3,5’-QzTIC-NxX1X2X3X4X5X6-My-3或5’-QzTTC-NxX1X2X3X4X5X6-My-3，其中Q,N,X1,X2,X3,X4和M均为核苷酸或核苷酸类似物，x为0至50的整数，y为0或1，z为0,1或2，X5为G或I，并且X6为I或A，大写字母表示DNA，小写字母表示2’-O-甲基RNA。在一些实施方案中，其中所述的多核苷酸不包含CG二核苷酸。
如本文所述，x为0至50的整数。这意味着x为0,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49或50。在一些实施方案中，x为3至45、3至40、3至35、3至30、3至25、3至20、3至15、3至10、或者3至5。在一些实施方案中，x大于0,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39或40，但不大于50。在一些实施方案中，x小于51,50,49,48,47,46,45,44,43,42,41,40,39,38,37,36,35,34,33,32,31,30,29,28,27,26,25,24,23,22,21,20,19,18,17,16,15,14,13,12,1110,9,8,7,6,5,4,3,2，但不小于1。在一些实施方案中，x为0。
如本文所述，y为0或1。在一些实施方案中，y为0(X5X6为处于多核苷酸的3’末端的核苷酸序列)。在一些实施方案中，y为1。
如本文所述，z为0,1或2。在一些实施方案中，z为0(例如5’-TIC-3’或5’-TTC为处于多核苷酸的5’末端的核苷酸序列)。在一些实施方案中，z为1。在一些实施方案中，z为2。
示例性TLR7/8组合抑制剂(其具有TLR7和TLR8，但不具有TLR9抑制基序)为由以下序列中的一个序列组成的多核苷酸：
5’-ugcTGCTCCTTGAGA-3’(SEQ ID NO:10)；
5’-ugCTGCTCCTTGAGI-3’(SEQ ID NO:15)；
5’-uGCTGCTCCTTGAGI-3’(SEQ ID NO:16)；
5’-TGCTGCTCCTTGAGI-3’(SEQ ID NO:17)；
5’-ugcugcTCCTTGAGI-3’(SEQ ID NO:18)；
5’-ugcTGCTCCTTGAGIT-3’(SEQ ID NO:20)；
5’-ugcTGCTCCTTGA-3’(SEQ ID NO:24)；
5’-ugcTICTCCTTIAII-3’(SEQ ID NO:26)；
5’-TGCTGCTGGTTGTGI-3’(SEQ ID NO:30)；
5’-ugcugcuccuugagI-3’(SEQ ID NO:34)；
5’-TGCTCCTTGAGI-3’(SEQ ID NO:35)；
5’-TICTGCTCCTTGAGI-3’(SEQ ID NO:36)；
5’-TTCTGCTCCTTGAGI-3’(SEQ ID NO:38)；
5’-TGCTICTCCTTIAII-3’(SEQ ID NO:40)；
5’-TICTICTCCTTIAII-3’(SEQ ID NO:44)；
5’-TICTCCTTGAGI-3’(SEQ ID NO:48)；
5’-TTCTCCTTGAGI-3’(SEQ ID NO:50)；
5’-TICTCCTTIAIA-3’(SEQ ID NO:56)；
5’-TICTCCTTAIIA-3’(SEQ ID NO:59)；
5’-TICAGITTIAII-3’(SEQ ID NO:60)；
5’-TICAGIAGIAII-3’(SEQ ID NO:61)；
5’-TICTICTIITTIAII-3’(SEQ ID NO:62)；
5’-TICTCCTTIAII-3’(SEQ ID NO:63)；
5’-TICTCCTTICII-3’(SEQ ID NO:65)；
5’-TICTCCTTITII-3’(SEQ ID NO:67)；
5’-TICTICTCCTIITTICII-3’(SEQ ID NO:85)；
5’-TICTICTCCAGITTICII-3’(SEQ ID NO:86)；
5’-TICTICTCCTCCTTICII-3’(SEQ ID NO:87)；
5’-TICTICTTGAGITTICII-3’(SEQ ID NO:88)；
5’-TICTICTCCTCCTTICIIAII-3’(SEQ ID NO:90)；
5’-TICTCCTCCTTICIIAII-3’(SEQ ID NO:91)；
5’-TGCTCCTCCTTICIIAII-3’(SEQ ID NO:92)；
5’-TGCTTGTCCTCCTTICII-3’(SEQ ID NO:93)；
5’-TGCTGCTCCTTICII-3’(SEQ ID NO:94)；
5’-TICTICTCCTTICII-3’(SEQ ID NO:95)；
5’-TTCTTCTCCTTICII-3’(SEQ ID NO:97)；
5’-TICTCCTCCTTICIIAIIA-3’(SEQ ID NO:99)；
5’-TGCTCCTGGAGGTTICII-3’(SEQ ID NO:100)；
5’-TGCTCCTGGAGGTTICIIAII-3’(SEQ ID NO:101)；
5’-TGCTCCTGGATTICIIAII-3’(SEQ ID NO:102)；
5’-TICTICTTGAGITTICIIAII-3’(SEQ ID NO:103)；
5’-TICTTGAGITTICIIAII-3’(SEQ ID NO:104)；
5’-TGCTICTTGAGITTICIIAII-3’(SEQ ID NO:105)；
5’-TGCTTGAGITTICIIAII-3’(SEQ ID NO:106)；
5’-TICTCCTTGAGIAII-3’(SEQ ID NO:108)；
5’-TICTCCTCCTTGAGIAII-3’(SEQ ID NO:109)；
5’-TICTTCTCCTTGAGIAII-3’(SEQ ID NO:110)；和
5’-TICTCCTCCTTGIIAII-3’(SEQ ID NO:111)；
其中I＝2’-脱氧次黄苷，大写字母表示DNA，小写字母表示2’-O-甲基RNA。在一些实施方案中，所述的多核苷酸包含SEQ ID NO:108。在一些实施方案中，所述的多核苷酸包含SEQ ID NO:109。
TLR8/9组合抑制剂 
此外，本文提供了用于本文所述的任一方法(例如抑制或压制TLR8依赖的和TLR9依赖的免疫应答)中的包含TLR8抑制基序和TLR9抑制基序的多核苷酸(下文中为“TLR8/9组合抑制剂”)。
本文提供了TLR8/9组合抑制剂，其中所述的TLR8/9组合抑制剂为由下式的核苷酸序列组成的多核苷酸：5’-Nx-S1S2S3S4-Pa-X1X2X3X4X5X6-My-3，其中N,P,X1,X2,X3,X4和M均为核苷酸或核苷酸类似物，a为0至20的整数，x为0至50的整数，y为0或1，S1,S2,S3和S4均为G或I，X5为G或I，并且X6为I或A，并且其中所述的多核苷酸不包含CG二核苷酸。此外，本文提供了用于抑制TLR8依赖的和TLR9依赖的免疫应答的多核苷酸，其中所述的多核苷酸由下式的 核苷酸序列组成：5’-Nx-S1S2S3S4-Pa-X1X2X3X4X5X6-My-3，其中N,P,X1,X2,X3,X4和M均为核苷酸或核苷酸类似物，a为0至20的整数，x为0至50的整数，y为0或1，S1,S2,S3和S4均为G或I，X5为G或I，并且X6为I或A，并且其中所述的多核苷酸不包含CG二核苷酸。在一些实施方案中，多核苷酸由下式的核苷酸序列组成：5’-Nx-S1S2S3S4-Pa-X1X2X3X4X5X6-My-3，其中N,P,X1,X2,X3,X4和M均为核苷酸或核苷酸类似物，a为0至20的整数，x为0至50的整数，y为0或1，S1,S2,S3和S4均为G或I，X5为G或I，并且X6为I或A。在一些实施方案中，其中所述的多核苷酸不包含CG二核苷酸。
如本文所述，a为0至20的整数。这意味着a为0,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19或20。在一些实施方案中，a大于0,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18或19，但不大于20。在一些实施方案中，a小于21,20,19,18,17,16,15,14,13,12,1110,9,8,7,6,5,4,3,2，但不小于1。在一些实施方案中，a为0。
如本文所述，x为0至50的整数。这意味着x为0,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49或50。在一些实施方案中，x为3至45、3至40、3至35、3至30、3至25、3至20、3至15、3至10、或者3至5。在一些实施方案中，x大于0,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39或40，但不大于50。在一些实施方案中，x小于51,50,49,48,47,46,45,44,43,42,41,40,39,38,37,36,35,34,33,32,31,30,29,28,27,26,25,24,23,22,21,20,19,18,17,16,15,14,13,12,1110,9,8,7,6,5,4,3,2，但不小于1。在一些实施方案中，x为0。
在一些实施方案中，y为0或1。在一些实施方案中，y为0(X5X6为处于多核苷酸的3’末端的核苷酸序列)。在一些实施方案中，y为1。
示例性TLR8/9组合抑制剂(其具有TLR8和TLR9，但不具有TLR7抑制基序)为由以下序列中的一个序列组成的多核苷酸：
5’-TAC TCC TTG GII-3’(SEQ ID NO:81)；以及
5’-TCC TGGAGG GGT TIAII-3’(SEQ ID NO:112)；
其中I＝2’-脱氧次黄苷，并且大写字母表示DNA。
TLR7/8/9组合抑制剂 
本文提供了用于本文所述的任一方法(例如抑制或压制TLR7依赖的、TLR8依赖的和TLR9依赖的免疫应答)中的包含TLR7抑制基序、TLR8抑制基序和TLR9抑制基序的多核苷酸(下文中为“TLR7/8/9组合抑制剂”)。
本文提供了TLR7/8/9组合抑制剂，其中TLR7/8/9组合抑制剂由下式的核苷酸序列组成的多核苷酸：
5’-QzTGC-Nx-S1S2S3S4-Pa-X1X2X3X4X5X6-My-3, 
5’-Qzugc-Nx-S1S2S3S4-Pa-X1X2X3X4X5X6-My-3, 
5’-QzTIC-Nx-S1S2S3S4-Pa-X1X2X3X4X5X6-My-3,或
5’-QzTTC-Nx-S1S2S3S4-Pa-X1X2X3X4X5X6-My-3，其中Q,N,P,X1,X2,X3,X4和M均为核苷酸或核苷酸类似物，a为0至20的整数，x为0至50的整数，y为0或1，z为0,1或2，S1,S2,S3和S4均为G或I，X5为G或I，并且X6为I或A，大写字母表示DNA，小写字母表达2’-O-甲基RNA，并且其中所述的多核苷酸不包含CG二核苷酸。此外，本文提供了用于抑制TLR7依赖的、TLR8依赖的和TLR9依赖的免疫应答的多核苷酸，其中所述的多核苷酸由下式的核苷酸序列组成：
5’-QzTGC-Nx-S1S2S3S4-Pa-X1X2X3X4X5X6-My-3, 
5’-Qzugc-Nx-S1S2S3S4-Pa-X1X2X3X4X5X6-My-3, 
5’-QzTIC-Nx-S1S2S3S4-Pa-X1X2X3X4X5X6-My-3,或
5’-QzTTC-Nx-S1S2S3S4-Pa-X1X2X3X4X5X6-My-3，其中Q,N,P,X1,X2,X3,X4和M均为核苷酸或核苷酸类似物，a为0至20的整数，x为0至50的整数，y为0或1，z为0,1或2，S1,S2,S3和S4均为G或I，X5为G或I，并且X6为I或A，大写字母表示DNA，小写字母表达2’-O-甲基RNA，并且其中所述的多核苷酸不包含CG二核苷酸。在一些实施方案中，多核苷酸由下式的核苷酸序列组成：
5’-QzTGC-Nx-S1S2S3S4-Pa-X1X2X3X4X5X6-My-3, 
5’-Qzugc-Nx-S1S2S3S4-Pa-X1X2X3X4X5X6-My-3, 
5’-QzTIC-Nx-S1S2S3S4-Pa-X1X2X3X4X5X6-My-3,或
5’-QzTTC-Nx-S1S2S3S4-Pa-X1X2X3X4X5X6-My-3，其中Q,N,P,X1,X2,X3,X4和M均为核苷酸或核苷酸类似物，a为0至20的整数，x为0至50的整数，y为0或1，z为0,1或2，S1,S2,S3和S4均为G或I，X5为G或I，并且X6为I或A，大写字母表示DNA，小写字母表示2’-O-甲基RNA。在一些实施方案中，其中所述的多核苷酸不包含CG二核苷酸。
如本文所述，a为0至20的整数。这意味着a为0,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19或20。在一些实施方案中，a大于0,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18或19，但不大于20。在一些实施方案中，a小于21,20,19,18,17,16,15,14,13,12,1110,9,8,7,6,5,4,3,2，但不小于1。在一些实施方案中，a为0。
如本文所述，x为0至50的整数。这意味着x为0,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49或50。在一些实施方案中，x为3至45、3至40、3至35、3至30、3至25、3至20、3至15、3至10、或者3至5。在一些实施方案中，x大于0,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39或40，但不大于50。在一些实施方案中，x小于51,50,49,48,47,46,45,44,43,42,41,40,39,38,37,36,35,34,33,32,31,30,29,28,27,26,25,24,23,22,21,20,19,18,17,16,15,14,13,12,1110,9,8,7,6,5,4,3,2，但不小于1。在一些实施方案中，x为0。
在一些实施方案中，y为0或1。在一些实施方案中，y为0(X5X6为处于多核苷酸的3’末端的核苷酸序列)。在一些实施方案中，y为1。
在一些实施方案中，z为0,1或2。在一些实施方案中，z为0(例如5’-TGC-3’,5’-ugc-3’,5’-TIC-3’或5’-TTC-3’为处于多核苷酸的5’末端的核苷酸序列)。在一些实施方案中，z为1。在一些实施方案中，z为2。
示例性TLR7/8/9组合抑制剂(其具有TLR7、TLR8和TLR9抑制基序)为由以下序列中的一个序列组成的多核苷酸：
5’-ugc TGC TCC TTG GGI-3’(SEQ ID NO:14)；
5’-TIC TCC TTI III-3’(SEQ ID NO:64)；
5’-TIC TCC TTI GII-3’(SEQ ID NO:66)；
5’-TGC TCC TGGAGG GGT TIAII-3’(SEQ ID NO:113)；
5’-TIC TCC TCC TTG GGIAII-3’(SEQ ID NO:114)；和
5’-TIC TTC TCC TTG GGIAII-3’(SEQ ID NO:115)；
其中I＝2’-脱氧次黄苷，并且大写字母表示DNA。
多核苷酸的修饰
本发明公开进一步提供了本文所述的包含至少一种修饰的核苷酸的TLR抑制剂(例如包含抑制基序的免疫抑制性多核苷酸，其中所述的抑制基序用于TLR7、TIR8和TLR9中的一种或多种)。至少一种核苷酸的修饰而言为修饰的碱基、修饰的糖和/或修饰的磷酸酯。在一些实施方案中，至少一种核苷酸的修饰可以为天然形成的修饰。在一些实施方案中，至少一种核苷酸的修饰可以为合成的修饰。在一些实施方案中，所述的修饰可以在多核苷酸组装之前或之后赋予的。在一些实施方案中，所述的修饰的核苷酸包含一种或多种形式的核苷。如本文所述，“修饰的核苷酸”或“修饰的核苷”涵盖核苷或核苷酸“类似物”。术语“核苷酸类似物”是指这样的化合物，其基本保留了衍生出上述核苷酸类似物的核苷酸的特性。例如7-dG为G类似物，而N4-乙基-dC为C类似物。如本文所用，“修饰的核苷酸”或“修饰的核苷”还涵盖了可以不保留核苷酸或碱基的特性的化合物。换言之，术语修饰涵盖了使用不同的天然或非天然形成的核苷酸或碱基取代的核苷酸或碱基。例如术语修饰行了A取代G。
在一些实施方案中，多核苷酸的一个或多个核苷酸包含至少一种修饰(例如核苷酸包含修饰)。在一些实施方案中，多核苷酸的一个或多个核苷酸包含修饰(例如序列Nx包含修饰)。在一些实施方案中，所述的一种或多种修饰为与被修饰的各核苷酸相同的修饰。在一些实施方案中，多核苷酸的每个核苷酸都是被修饰的，并且修饰为2'-O-甲基糖修饰(例如核苷酸N由修饰组成，并且修饰为2'-O-甲基糖修饰)。在一些实施方案中，至少一种修饰包含核苷酸的多于一种不同类型的修饰。
在一些实施方案中，至少一种核苷酸的修饰包含修饰的碱基。碱基修饰的实例包含但不限于将吸电子部分加入到多核苷酸胞嘧啶的C5和/或C6中。优选的是，吸电子部分为卤素，例如5-溴胞嘧啶、5-氯胞嘧啶、5-氟 胞嘧啶、5-碘胞嘧啶。在一些实施方案中，碱基修饰包含但不限于将吸电子部分加入到免疫抑制性多核苷酸尿嘧啶的C5和/或C6中。优选的是，吸电子部分为卤素。此类修饰的尿嘧啶可以包含但不限于5-溴胞嘧啶、5-氯胞嘧啶、5-氟胞嘧啶、5-碘胞嘧啶。在一些实施方案中，碱基修饰包含将一个或多个巯基加入到碱基中，包含但不限于6-硫代-鸟嘌呤,4-硫代-胸腺嘧啶和4-硫代-尿嘧啶。在一些实施方案中，碱基修饰包含但不限于N4-乙基胞嘧啶,7-脱氮鸟嘌呤和5-羟基胞嘧啶。例如参见Kandimalla et al.(2001)Bioorg.Med.Chem.9:807-813。在一些实施方案中，IIS可以包含2’-脱氧尿苷和/或2-氨基-2’-脱氧腺苷。在一些实施方案中，修饰的碱基包含甲基化修饰。在一些实施方案中，甲基化修饰包含5’-甲基-胞嘧啶修饰。在一些实施方案中，TLR抑制剂包含多种碱基修饰。在一些实施方案中，所述的碱基修饰是相同的。在一些实施方案中，所述的碱基修饰是不同的。在一些实施方案中，TLR抑制剂包含大约1种、大约2种、大约3种、大约4种、大约5种碱基修饰的任意一种。此外，在修饰的TLR抑制剂的制备中，还可进行多种碱基修饰，并且与任何磷酸酯修饰和/或糖修饰组合。
在一些实施方案中，至少一种核苷酸的修饰包含修饰的磷酸酯。在一些实施方案中，修饰的磷酸酯为磷酸二酯键修饰。例如磷酸酯修饰可以包含但不限于甲基膦酸酯、磷硫酰、磷酰胺、磷酰胺(桥接或非桥接)、磷酸三酯和二硫代磷酸酯，并且可以用于任何组合中。在一些实施方案中，修饰的磷酸酯为3’末端核苷酸内硫酸二酯键修饰。例如3’末端核苷酸内硫酸二酯键修饰包含但不限于烷基或芳基磷酸三酯、烷基或芳基膦酸酯、羟基膦酸酯、氢磷酸酯、磷硒酸酯键修饰。在一些实施方案中，3’末端核苷酸内磷酸二酯键修饰为磷酰胺修饰。在一些实施方案中，修饰的磷酸酯包含但不限于其中磷酸酯被P(O)S(“硫代”),P(S)S(“二硫代”),(O)NR2(“酰胺”),P(O)R,P(R)OR’,CO或CH2(“甲缩醛”)替代的实施方案，其中R或R’均独立地为H，或者为取代的或非取代的烷基(1-20C)，其可任选地包含醚(-O-)键、芳基、烯基、环烷基、环烯基或芳烷基。
在一些实施方案中，TLR抑制剂可以包含至少一种核苷酸，其包含至少一个磷硫酰骨架键。在一些实施方案中，TLR抑制剂的多核苷酸仅包含磷硫酰骨架。在一些实施方案中，TLR抑制剂的多核苷酸包含一个或多个 磷硫酰骨架。在一些实施方案中，TLR抑制剂的多核苷酸仅包含磷酸二酯骨架。在一些实施方案中，TLR抑制剂在磷酸酯骨架中可以包含磷酸酯键的组合，其包含但不限于磷酸二酯和磷硫酰键的组合。
TLR抑制剂可以包含磷酸酯修饰的多核苷酸，其中一些磷酸酯修饰的多核苷酸可以稳定该多核苷酸。因此，一些实施方案包含稳定的免疫抑制性多核苷酸。在一些实施方案中，TLR抑制剂包含多种磷酸酯修饰。在一些实施方案中，磷酸酯修饰是相同的。在一些实施方案中，磷酸酯修饰是不同的。在一些实施方案中，TLR抑制剂包含大约1种、大约2种、大约3种、大约4种、大约5种不同磷酸酯修饰的任意一种。此外，在修饰的TLR抑制剂的制备中，还可进行多种磷酸酯修饰，并且与任何碱基修饰和/或糖修饰组合。
在一些实施方案中，至少一种核苷酸的修饰包含修饰的糖。在本发明公开中使用的TLR抑制剂可以包含一种或多种修饰的糖或糖类似物。因此，加入到核糖和脱氧核糖中的糖部分可以为戊糖、脱氧戊糖、己糖、脱氧己糖、葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、来苏糖和糖“类似物”的环戊基。所述的糖可以为吡喃糖基或呋喃糖基形式。在TLR抑制剂中，所述的糖部分优选为核糖、脱氧核糖、阿拉伯糖或2’-O-烷基核糖的呋喃糖苷。在一些实施方案中，所述的糖可以以α或β端基异构体构造与各杂环碱基连接。在一些实施方案中，所述的糖是通过替代通常存在的羟基来修饰的。所述的糖中通常存在的羟基可以被例如但不限于膦酸酯基或磷酸酯基替代。5’和3’末端羟基可以额外地被磷酸化或者被胺或1至20个碳原子的有机封端基团部分取代的。在一些实施方案中，修饰的糖为2’糖修饰，包含但不限于2’-烷氧基-RNA类似物,2’-氨基-RNA类似物,2’-氟-DNA,以及2’-烷氧基-或氨基-RNA/DNA嵌合体。在一些实施方案中，修饰的糖包含但不限于2’-O-甲基-,2’-O-烯丙基,或2’-叠氮-糖修饰。在一些实施方案中，2’-修饰的糖为2’-O-甲基糖修饰。在一些实施方案中，2’-修饰的糖为2’-O-甲氧基乙基糖修饰。例如IIS中的糖修饰包含但不限于2’-O-甲基-尿苷,2’-O-甲基-胸苷,2’-O-甲基-腺嘌呤,2’-O-甲基-鸟嘌呤,或2’-O-甲基-胞苷。在一些实施方案中，糖修饰的核苷酸包含一种或多种糖修饰的核苷。这些糖或糖类似物、以及各“糖苷”(其中此类糖或类似物与杂环碱基(核酸碱基)本身连 接)的制备是已知的，并且在本文不必描述，除了该制备可以属于任何具体的实施例。在一些实施方案中，TLR抑制剂包含多种糖修饰。在一些实施方案中，糖修饰是相同的。在一些实施方案中，糖修饰是不同的。在一些实施方案中，TLR抑制剂包含大约1种、大约2种、大约3种、大约4种、大约5种不同糖修饰的任意一种。此外，在修饰的TLR抑制剂的制备中，还可进行多种糖修饰，并且与任何碱基修饰和/或磷酸酯修饰组合。
本文所述的修饰的多核苷酸的任意一种都可以包含在多核苷酸序列中任何地方的修饰。在一些实施方案中，所述的修饰为处于或接近多核苷酸序列5’末端的核苷酸的修饰。在一些实施方案中，在多核苷酸序列的5’末端，1,2,3,4,5,6,7,8,9或10个核苷酸中的大约任意一种的核苷酸被修饰。在一些实施方案中，在多核苷酸序列的5’末端，1,2,3,4,5,6,7,8,9或10个核苷酸中的至少大约任意一种的核苷酸被修饰。在一些实施方案中，所述的修饰为处于或接近多核苷酸序列3’末端的核苷酸的修饰。在一些实施方案中，在多核苷酸序列的3’末端，1,2,3,4,5,6,7,8,9或10个核苷酸中的大约任意一种的核苷酸被修饰。在一些实施方案中，在多核苷酸序列的3’末端，1,2,3,4,5,6,7,8,9或10个核苷酸中的至少大约任意一种的核苷酸被修饰。在一些实施方案中，处于或接近多核苷酸序列5’末端的核苷酸以及处于或接近多核苷酸序列3’末端的核苷酸被修饰。在一些实施方案中，在多核苷酸序列的5’末端以及在多核苷酸序列的3’末端，1,2,3,4,5,6,7,8,9或10个核苷酸中的大约任意一种的核苷酸被修饰。在一些实施方案中，在多核苷酸序列的5’末端以及在多核苷酸序列的3’末端，1,2,3,4,5,6,7,8,9或10个核苷酸中的至少大约任意一种的核苷酸被修饰。
有效抑制TLR7和/或TLR9的多核苷酸的其他实例在例如PCT/US2005/030494,PCT/US2008/012220和PCT/US2011/040788中可以找到，这些文献中的序列以引用方式全文并入本文。
在任意一种TLR抑制剂的以下实施方案中，修饰的TLR抑制剂的尿苷(U)核苷可以被胸苷(T)核苷取代。在一些实施方案中，TLR抑制剂的所有尿苷(U)核苷可以被胸苷(T)核苷取代。在任意一种TLR抑制剂的一些实施方案中，修饰的TLR抑制剂的胸苷(T)核苷可以被尿苷(U)核苷取代。在一些实施方案中，TLR抑制剂的所有胸苷(T)核苷可以被尿苷(U)核苷取代。 在一些实施方案中，修饰的TLR抑制剂可以包含尿苷(U)核苷和胸苷(T)核苷。
本发明公开进一步提供了本文所述的TLR抑制剂，其具有免疫抑制活性，并且包含用于本文所述的方法中的用于TLR7,TLR8和TLR9中的一种或多种的抑制基序。本文提供的TLR抑制剂包含一个或多个核酸部分以及一个或多个非核酸间隔子部分。符合多种结构式的化合物被考虑用作TLR抑制剂，包含在下式I-VII中所述的核心结构。式I-III显示用于“线性TLR抑制剂”的核心序列。式IV-VI显示用于“支化的TLR抑制剂”的核心序列。式VII显示用于“单一间隔子TLR抑制剂”的核心结构。
在本文提供的各式中，“N”表示核酸部分(沿着5’-3’或者3’-5’的方向取向)，“Sp”表示非核酸间隔子部分。破折号(“-”)表示核酸部分与非核酸间隔子部分之间的共价键。双破折号(“--”)表示非核酸间隔部分与至少2个核酸部分之间的共价键。三破折号(“---”)表示非核酸间隔子部分与多个(即至少3个)核酸部分之间的共价键。下标用于表示不同定位的核酸和非核酸间隔子部分。但是，用于区分不同的核酸部分的下标的使用无意于表示这些部分必须具有不同的结构或序列。相似地，用于区分不同的间隔子部分的下角的使用无意于表示这些部分必须具有不同的结构。例如在下文的式II中，命名为N1和N2的核酸部分可以具有相同或不同的序列，并且命名为S1和S2的间隔子部分可以具有相同或不同的结构。此外，应该考虑的是其他化学部分(例如磷酸酯,单核苷酸,其他的核酸部分,烷基,氨基,巯基或二硫基,连接基团和/或间隔子部分)可以在核心结构的末端共价键合。
线性TLR抑制剂具有以下结构，其中核心结构中的非核酸间隔子部分与至多2个核酸部分共价键合。
示例性线性TLR抑制剂符合下式：
N1-Sp1-N2                (I) 
N1-Sp1-N2-Sp2-N3         (II) 
N1-Sp1-N2-Sp2-[Nv-Spv]A  (III) 
其中A为1至大约100的整数，[Nv-Spv]表示与非核酸间隔子部分缀合的 核酸部分的A个额外的重复。下标“V”表示在“[Nv-Spv]”的各个重复中，N和Sp是独立选择的。“A”有时为1至大约10，有时为1至3，有时确切地为1,2,3,4或5。在一些实施方案中，A为由1,2,3,4或5的下限、至10,20,50或100的独立选择的上限之间所定义的范围的整数(例如3至10)。
示例性线性TLR抑制剂包含： 
N1-HEG-N2-OH          (Ia) 
N1-HEG-N1-PO4         (Ib) 
N1-HEG-N2-HEG         (Ic) 
HEG-N1-HEG-N1-HEG     (Id) 
N1-HEG-N2-HEG-N1      (Ie) 
N1-HEG-N2-(HEG)4-N3   (If) 
(N1)2-甘油-N1-HEG-N1  (Ig) 
PO4-N1-HEG-N2         (Ih) 
N1-(HEG)15-T          (Ii) 
N1-HEG-T-HEG-T        (Ik) 
N1-HEG-N2-TEG-N3      (IIa) 
其中HEG是指六(乙二醇)。TEG是指四(乙二醇)。在其中不包含-[Nv-Spv]A的实例中，N1和N2、以及Sp1和Sp2是独立选择的。在任意一种TLR抑制剂的一些实施方案中，TLR抑制剂为2’-脱氧核糖多核苷酸序列。在任意一种RLT抑制剂的一些实施方案中，TLR抑制剂为2’脱氧核糖多核苷酸和/或2’-O-Me糖多核苷酸嵌合序列。在一些实施方案中，TLR抑制剂具有至少一个包含修饰的磷酸酯键的核苷酸。在一些实施方案中，TLR抑制剂仅包含磷硫酰键。在一些实施方案中，多核苷酸的一个或多个核苷酸包含修饰。在一些实施方案中，所述的修饰包含至少一种磷硫酰骨架修饰。在一些实施方案中，多核苷酸仅包含磷硫酰键。在一些优选的实施方案中，所述的修饰包含2’-糖修饰。在这些实施方案的子集中，2’-糖修饰包含2'-O-甲基糖修饰或2’-O-甲氧基乙基糖修饰。支化的TLR抑制剂包含与至少3个(3)核酸部分共价键合的多价间隔子部分(mSp)。
根据下式来描述示例性支化的TLR抑制剂：
[Nv]A---mSp             (IV) 
[Spv-Nv]A---mSp         (V) 
(Sp1-N1)-mSp--(Nv-Spv)A  (VI) 
其中mSp为与数量为“A”的独立选择的核酸部分Nv、Spv-Nv(其包含与核酸部分共价键合的间隔子部分)共价键合的多价间隔子。“[Spv-Nv]”或“[Nv-Spv]”的末端重复可以仅包含Nv。对于式IV和V而言，A为至少3。在式IV和V的多个实施方案中，A为3至100的整数(包含端值)，但是A可以为大约3,5,10,50或100的下限、至大约5,7,10,50,100,150,200,250或500的独立选择的上限之间所定义的范围内的整数，或者备选地，A可以大于500。对于式VI而言，A为至少2，即2,5,10,50或100的下限、至5,10,50,100,150,200,250,500,或大于500的独立选择的上限之间所定义的范围内的整数。
示例性支化的TLR抑制剂包含： 
(N1)2-甘油-N1            (IVa) 
(N2-HEG)2-甘油-N1        (IVb) 
(N1-HEG-N2)2-甘油-N1     (IVc) 
[(N1)2-甘油-N1]2-甘油-N1 (IVd)
(N1-HEG)2-甘油-HEG-N2    (IVe) 
(N1-HEG)2-甘油-N1-TEG-N1 (VIa) 
其中HEG是指六(乙二醇)。TEG是指四(乙二醇)。在任意一种TLR抑制剂的一些实施方案中，TLR抑制剂为2’-脱氧核糖多核苷酸序列。在任意一种RLT抑制剂的一些实施方案中，TLR抑制剂为2’脱氧核糖多核苷酸和/或2’-O-Me糖多核苷酸嵌合序列。在一些实施方案中，TLR抑制剂具有至少一个包含修饰的磷酸酯键的核苷酸。在一些实施方案中，TLR抑制剂仅包含磷硫酰键。优选的支化的TLR抑制剂包含(5’-N1-3’-HEG)2-甘油-HEG-5’-N1-3’和(5’-N1-3’-HEG)2-甘油-HEG-5’-N1’。
单一的间隔子TLR抑制剂包含以下结构，其中单一的核酸部分与单一的间隔子部分共价缀合，即：
N1-Sp1              (VII) 
在优选的变体中，S1具有多聚体结构，所述的多聚体包含通常通过酯键(例如磷酸二酯或磷硫酰酯)连接的更小的单元(例如HEG,TEG,甘油,1’2’-二脱氧核糖,C2烷基-C12烷基亚单元等)，例如下文所述。例如参见下文中的式VIIa。所述的多聚体可以为异聚的或均聚的。在一个变体中，间隔子为通过酯键(例如磷酸二酯或磷硫酰酯)连接的单体单元(例如HEG,TEG,甘油,1’2’-二脱氧核糖,C2烷基至C12烷基连接体等)的异聚体。例如参见下文中的式VIIb。
示例性单一的间隔子TLR抑制剂包含： 
N1-(HEG)15                 (VIIa) 
N1-HEG-丙基-HEG-丙基-HEG  (VIIb)
其中HEG是指六(乙二醇)。在任意一种TLR抑制剂的一些实施方案中，TLR抑制剂为2’-脱氧核糖多核苷酸序列。在任意一种RLT抑制剂的一些实施方案中，TLR抑制剂为2’脱氧核糖多核苷酸和/或2’-O-Me糖多核苷酸嵌合序列。在一些实施方案中，TLR抑制剂具有至少一个包含修饰的磷酸酯键的核苷酸。在一些实施方案中，TLR抑制剂仅包含磷硫酰键。
在某些实施方案中，TLR抑制剂的末端结构是共价连接的(例如核酸部分-与-核酸部分；间隔子部分-与-间隔子部分；或者核酸部分-与-间隔子部分)，从而得到环状构造。
用于本文提供的免疫抑制组合物的TLR抑制剂包含至少一个核酸部分。如本文所用，术语“核酸部分”是指核苷酸单体(即单核苷酸)或聚合物(即包含至少2个相邻的核苷酸)。如本文所用，核苷酸包含：(1)与糖连接的嘌呤或嘧啶碱基，其中所述的糖处于与磷酸酯基的酯键中；或者(2)类似物，其中碱基和/或糖和/或磷酸酯被类似物所替代，例如下文所述。在包含多于1个核酸部分的TLR抑制剂中，核酸部分可以是相同的或不同的。
在TLR抑制剂(掺入到免疫抑制组合物中)中使用的核酸部分可以包含本文公开的任意一种抑制基序，并且可以额外地为6个碱基对或更少的碱基对的序列。应该考虑的是在包含多个核酸部分的TLR抑制剂中，核酸部 分可以是相同的或不同的长度。在其中TLR抑制剂包含多于1个核酸部分的一些实施方案中，仅所需的一个部分包含抑制基序。应该考虑的是在包含多个核酸部分的TLR抑制剂中，核酸部分可以是相同的或不同的。因此，在多个实施方案中，被引入到免疫抑制组合物中的TLR抑制剂包含：(a)具有相同序列的核酸部分；(b)多于1个的重复的核酸部分；或者(c)2个或多个不同的核酸部分。此外，单一的核酸部分可以包含多于1个抑制基序，其可以是相邻的、重叠的或者在合适部分中通过其他的核苷酸碱基分开的。
TLR抑制剂包含与核酸部分共价键合的一个或多个非核酸间隔子部分。例如非核酸间隔子部分在本文中有时简称为“间隔子”或“间隔子部分”。间隔子的分子量通常为大约50至大约50000，通常为大约75至大约5000，最通常为大约75至大约500，在多个实施方案中，所述的间隔子与1个、2个、3个或多于3个核酸的部分共价键合。多种试剂适用于连接核酸部分。例如在科学文献中被称为“非核酸连接体”、“非核苷酸连接体”或“化合价平台(valency platform)分子”的多种化合物在IRC中可以用作间隔子。在某些实施方案中，间隔子包含多价连接的亚单元，并且可以具有均聚的或异聚的结构。应该理解的是单核苷酸和多核苷酸不包含在非核酸间隔子的定义中，不包含单核苷酸和多核苷酸，则核酸部分和相邻的非核酸间隔子部分之间的排除不具有差异。
在某些实施方案中，间隔子可以包含一个或多个脱碱基核苷酸(即缺乏核苷酸碱基，但是具有糖和磷酸酯部分)。示例性的脱碱基核苷酸包含1’2’-二脱氧核糖,1’-脱氧核糖,1’-脱氧阿拉伯糖和它们的聚合物。
其他合适的间隔子包含可任选地取代的烷基、可任选地取代的聚乙二醇、可任选地取代的聚胺、可任选地取代的多元醇、可任选地取代的聚酰胺、可任选地取代的聚醚、可任选地取代的聚亚胺、可任选地取代的聚磷酸二酯(例如聚(1-磷酸-3-丙醇))等。可任选的取代基包含醇,烷氧基(例如甲氧基,乙氧基和丙氧基),直链或支链烷基(例如C1-C12烷基),胺,氨基烷基(例如氨基C1-C12烷基),亚磷酰胺,磷酸酯,硫代磷酸酯,酰肼,肼,卤素,(例如F,Cl,Br或I),酰胺,烷基酰胺(例如酰胺C1-C12烷基),羧酸,羧酸酯,羧酸酐,羧酸卤化物,磺酰基卤化物,酰亚胺酯,异氰酸酯,异硫氰 酸酯,卤甲酸酯,碳二亚胺加成物,醛,酮,氢硫基,卤代乙酰基,烷基卤化物,烷基磺酸酯,其中R1R2为–C(＝O)CH＝CHC(＝O)(马来酰亚胺)的NR1R2,硫醚,氰基,糖(例如甘露糖,半乳糖和葡萄糖),α,β-不饱和羰基,烷基汞,α,β-不饱和砜。
合适的间隔子可以包含多环分子，例如包含苯基或环己基环的那些。所述的间隔子可以为：聚醚，例如多聚磷酸丙二醇,聚乙二醇,聚丙二醇；双功能多环分子，例如双功能并环戊二烯,茚,萘,甘菊环,庚搭烯,联苯撑,不对称引达省,对称引达省,苊烯,芴,非那烯,菲,蒽,荧蒽,acephenathrylene,醋蒽烯,三亚苯,嵌二苯,稠二萘,萘并萘,噻蒽,异苯并呋喃,色烯,呫吨,吩恶噻，它们可以是被取代的或被修饰的；或者聚醚与多环分子的组合。多环分子可以是取代的，或者是被C1-C5烷基,C6烷基,烯基,羟基烷基,卤素或卤代烷基多取代的。含氮的稠杂环分子(例如吲嗪)通常不是合适的间隔子。此外，间隔子还可以为多元醇，例如甘油或季戊四醇。在一个变体中，所述的间隔子包含1-磷酸丙烷)3-磷酸酯或1-磷酸丙烷)4-磷酸酯(也称为四磷酸丙二醇和五磷酸丙二醇)。在一个变体中，所述的间隔子包含衍生的2,2’-二乙酸乙二胺(EDDA)。
用于TLR抑制剂中的非核酸间隔子的特异性实例包含由Cload et al.(1991)J.Am.Chem.Soc.113:6324；Richardson et al.(1991)J.Am.Chem.Soc.113:5109；Ma et al.(1993)Nucleic Acids Res.21:2585；Ma et al.(1993)Biochemistry 32:1751；McCurdy et al.(1991)Nucleosides&Nucleotides10:287；Jaschke et al.(1993)Tetrahedron Lett.34:301；Ono et al.(1991)Biochemistry 30:9914；和国际公开No.WO 89/02439中所述的“连接体”。
其他合适的间隔子包含由Salunkhe et al.(1992)J.Am.Chem.Soc.114:8768；Nelson et al.(1996)Biochemistry 35:5339-5344；Bartley et al.(1997)Biochemistry 36:14502-511；Dagneaux et al.(1996)Nucleic Acids Res.24:4506-12；Durand et al.(1990)Nucleic Acids Res.18:6353-59；Reynolds et al.(1996)NucleicAcidsRes.24:760-65；Hendry et al.(1994)Biochem.Biophys.Acta 1219:405-12；Altmann et al.(1995)Nucleic Acids Res.23:4827-35中所述的连接体。而且，其他合适的间隔体在欧洲专利No.EP0313219B1和美国专利No.6,117,657中有所描述。
示例性的非核酸间隔子包含寡-乙二醇(例如三乙二醇,四乙二醇,六乙二醇间隔子，以及包含至多大约10个、大约20个、大约40个、大约50个、大约100个或大约200个乙二醇单元的其他聚合物)，烷基间隔子(例如丙基、丁基、己基和其他C2-C12烷基间隔子，例如通常为C2-C10烷基，最通常的是C2-C6烷基)，脱碱基核苷酸间隔子，由甘油、季戊四醇或1,3,5-三羟基环己烷衍生的对称或不对称的间隔子(例如本文所述的对称的二倍体和三倍体间隔子部分)。此外，间隔子还可以包含上述化合物的异聚的或均聚的寡聚体和聚合物(例如通过酰胺、酯、醚、硫醚、二硫化物、磷酸二酯、磷硫酰、磷酰胺、磷酸三酯、二硫代磷酸酯、甲基膦酸酯或其他键)。
合适的间隔子部分可以有助于TLR抑制剂的电荷和/或疏水性，有助于TLR抑制剂的有利的药代动力学性质(例如改善的稳定性、在血液中更长的停留时间)，和/或使得TLR抑制剂靶向特定的细胞或器官。可以选择或修饰间隔子部分，从而剪裁TLR抑制剂，以达到理想的药代动力学性质或用于理想的给药模式的适应性(例如口服给药)。读者应该理解的是，为了方便，间隔子(或间隔子化合物)通常被称为衍生该间隔子成分的化合物的化学品(例如六乙二醇)，并且理解的是TLR抑制剂实际包含化合物与相邻核酸部分或其他间隔子部分成分的缀合物。
在包含多于1个间隔子部分的TLR抑制剂中，所述的间隔子可以是相同的或不同的。因此，在一个变体中，TLR抑制剂中所有的非核酸间隔子部分都具有相同的结构。在一个变体中，TLR抑制剂包含具有至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个或者更多不同的结构的非核酸间隔子部分。
在一些所考虑的实施方案中，TLR抑制剂的间隔子部分被定义为排除了某些结构。因此，在一些实施方案中，间隔子并非为脱碱基核苷酸或脱碱基核苷酸的聚合物。在一些实施方案中，间隔子并非为寡(乙二醇)(例如HEG、TEG等)或者聚(乙二醇)。在一些实施方案中，间隔子并非为C3烷基间隔子。在一些实施方案中，间隔子并非为多肽。因此，在一些实施方案中，免疫原分子(例如蛋白质或多肽)不适合作为间隔子部分的成分。但是，如下文中所讨论的那样，应该理解的是在某些实施方案中，TLR抑制剂为“似蛋白质的TLR抑制剂”(即包含间隔子部分，其包含多肽)。但是 在一些实施方案中，间隔子部分并非为似蛋白质的和/或并非为抗原(即如果间隔子是由TLR抑制剂分离得到的，则并非为抗原)。
通常，合适的间隔子部分不能使TLR抑制剂(合适的间隔子为该抑制剂的成分)不溶于水性溶液中(例如PBS,pH 7.0)。因此，间隔子的定义排除了微载体或纳米载体。此外，具有低溶解度的间隔子部分(例如十二烷基间隔子，当其作为二醇前体1,12-二羟基十二烷来测量时，溶解度<5mg/ml)不是优选的，这是因为其可以降低IRC的亲水性和活性。优选的是，间隔子部分在作为二醇前体来测量时，具有大于5mg/ml的溶解度(例如≥20mg/ml,≥50mg/ml或≥100mg/ml)。
TLR抑制剂的电荷可以由磷酸酯、硫代磷酸酯或核酸部分中的其他基团、以及非核酸间隔子部分的基团贡献。在一些实施方案中，非核酸间隔子部分携带有净电荷(例如当在pH7下测量时，带有净的正电荷或净的负电荷)。在一个有用的变体中，TLR抑制剂具有净的负电荷。在一些实施方案中，通过衍生化本文所述的间隔子亚单元来增加其电荷，从而增加TLR抑制剂中的间隔子部分的负电荷。例如甘油可以与2个核酸部分共价键合，并且剩余的醇可以与活化的亚磷酰胺反应，然后氧化或硫化从而分别形成磷酸酯或硫代硫酸酯。在某些实施方案中，由TLR抑制剂中非核酸间隔子部分贡献的负电荷(即当间隔子多于1个时，电荷的总和)高于由TLR抑制剂的核酸部分贡献的负电荷。可以根据分子式来计算电荷，或者通过试验(例如通过毛细管电泳)来测定电荷(Li,ed.,1992,Capillary electrophoresis,Principles,Practice and Application Elsevier Science Publishers,Amsterdam,The Netherlands,pp202-206)。
如上文说明的那样，合适的间隔子可以为较小的非核酸(例如非核苷酸)化合物(例如本文所述的那些)的聚合物，其中所述的化合物本身可用作间隔子，包含通常被称为非核苷酸“连接体”的化合物。此类聚合物(即“多单元间隔子”)可以为异聚的或均聚的，并且通常包含通过酯键(例如磷酸二酯或磷硫酰酯)连接的单体单元(例如HEG、TEG、甘油、1’2’-二脱氧核糖等)。因此，在一个变体中，所述的间隔子包含非核苷酸单元(例如2至大约100个单元，备选地2至大约50个，例如2至大约5个，备选地例如大约5至大约50个，例如大约5至大约20个)的聚合(例如异聚的)结构。
在某些实施方案中，间隔子部分为多价非核酸间隔子部分(即“多价间隔子”)。如本文所述，包含多价间隔子的TLR抑制剂包含与3个(3)或多个核酸部分共价键合的间隔子。在本领域中，多价间隔子有时称为“平台分子”。多价间隔子可以为聚合的或非聚合的。合适的分子的实例包含甘油或取代的甘油(例如2-羟基甲基甘油,乙酰丙基-甘油)；四氨基苯,七氨基倍他环糊精,1,3,5-三羟基环己烷,季戊四醇和季戊四醇的衍生物,四氨基季戊四醇,1,4,8,11-四氮环十四烷(Cyclam),1,4,7,10-四氮环十二烷(Cyclen),聚乙烯亚胺,1,3-二氨基-2-丙醇及取代的衍生物,丙氧基甲基]乙基化合物(例如“三倍体”),聚乙二醇衍生物(例如所谓的“Star PEG”和“bPEG”)(例如参见Gnanou et al.(1988)Makromol.Chem.189:2885；Rein et al.(1993)Acta Polymer 44:225；美国专利No.5,171,264),和树突状聚合物。
树突状聚合物是本领域已知的，并且为化学定义的球状分子，其通常通过多功能单体逐步或反复反应来制备，从而得到支化结构(例如参见Tomalia et al.(1990)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.29:138-75)。已知多种树突状聚合物，例如胺封端的聚酰胺、聚乙烯亚胺和聚丙烯亚胺树突状聚合物。可以使用的示例性的树突状聚合物包含“稠密的星团”型聚合物或“星射”型聚合物，例如在美国专利No.4,587,329；5,338,532和6,177,414中所述的那些，包含所谓的“聚酰胺-胺("PAMAM")树突状聚合物”。此外，适于使用的其他多聚体间隔子分子包含化学定义的非聚合的化合价平台分子，例如在美国专利No.5,552,391，以及PCT申请公开WO 00/75105,WO 96/40197,WO 97/46251,WO 95/07073和WO 00/34231中所公开的那些。可以使用许多其他合适的多价间隔子，并且这些间隔子是本领域的那些技术人员已知的。
核酸分子与平台分子的缀合可以以多种方式来实施，通常涉及一种或多种交联剂、以及核酸部分和平台分子上的官能团。使用标准的合成化学技术将交联基团加入到平台中。可以使用标准的合成技术将交联基团加入到核酸部分中。
具有多种化合价的多价间隔子是有用的，并且在多个实施方案中，TLR抑制剂的多价间隔子与大约3个至大约400个核酸部分键合，通常为3至100个核酸部分键合，有时为3-50个核酸分子，往往为3-10个，并且有时 多于400个核酸部分。在多个实施方案中，多价间隔子与多于10个、多于25个、多于50个、或者多于500个核酸部分(其可以是相同的或不同的)缀合。应该理解的是在其中TLR抑制剂包含多价间隔子的某些实施方案中，本文提供了具有稍微不同的分子结构的TLR抑制剂群体。例如当使用树突状聚合物作为高价多价间隔子来制备TLR抑制剂时，会产生少量分子的异源混合物，即包含加入到各树突状聚合物分子中的不同数量(处于或者大部分处可测定的范围内)的核酸部分。
衍生从而允许与核酸部分连接的多糖可以被用作TLR抑制剂中的间隔子。合适的多糖包含天然形成的多糖(例如右旋糖苷)和合成多糖(例如 )。例如氨基乙基羧甲基-(AECM-)可以通过Inman(1975)J.Imm.114:704-709的方法来制备。然后可以使AECM- 与异双功能交联剂(例如6-马来酰亚胺己酸酰基N-羟基琥珀酰亚胺酯)反应，然后与巯基衍生的核酸部分缀合(参见Lee et al.(1980)Mol.Imm.17:749-56)。其他多糖可以以相似的方式修饰。
使用常规方法制备TLR抑制剂恰好在任一技术人员的能力范围内(在本说明书以及本领域的知识的指导下)。用于制备核酸部分(例如寡核苷酸和修饰的寡核苷酸)的技术是已知的。可以使用以下技术来合成核酸部分，所述的技术包含但不限于酶法、化学方法以及酶法和化学方法的组合。可以通过将合适的核苷亚磷酰胺与正在加长的寡核苷酸的5’-羟基依次偶联、然后将中间体亚磷酸三酯氧化成磷酸三酯来化学合成包含磷酸二酯键的DNA或RNA，其中所述的正在加长的寡核苷酸在3’末端与固体支撑体连接。用于DNA合成的有用的固体支撑体包含Controlled Pore Glass(Applied Biosystems,Foster City,CA)、聚苯乙烯珠(Primer Support,Amersham Pharmacia,Piscataway,NJ)和TentGel(Rapp Polymere GmbH,Tubingen,Germany)。一旦所需的寡核苷酸序列被合成，便将其由支撑体上移除，将磷酸三酯脱保护从而形式磷酸二酯，并使用氨水或其他的碱使核苷碱基脱保护。
例如通常通过反复重复以下步骤来合成包含磷酸二酯键的DNA、RNA或DNA/RNA杂交体多核苷酸(核酸部分)：a)由3’-固体支撑体-键合的核苷或核酸的5’-羟基上除去保护基团；b)使活化的核苷亚磷酰胺与5’-羟基 偶联；c)将亚磷酸三酯氧化形成磷酸三酯；以及d)将未反应的5’-羟基帽封。按照上文所述制备包含磷硫酰键的DNA或RNA，不同之处在于使用硫化步骤替代氧化步骤。一旦所需的寡核苷酸序列被合成，便将该寡核苷酸由支撑体上移除，将磷酸三酯基脱保护从而形式磷酸二酯，并使用氨水或其他的碱使核苷碱基脱保护。例如参见Beaucage(1993)“Oligodeoxyribonucleotide Synthesis”in PROTOCOLS FOR OLIGONUCLEOTIDES AND ANALOGS,SYNTHESIS AND PROPERTIES(Agrawal,ed.)Humana Press,Totowa,NJ；Warner et al.(1984)DNA 3:401；Tang et al.(2000)Org.Process Res.Dev.4:194-198；Wyrzykiewica et al.(1994)Bioorg.&Med.Chem.Lett.4:1519-1522；Radhakrishna et al.(1989)J.Org.Chem.55:4693-4699.以及美国专利No.4,458,066。自动化地合成特定序列的核酸部分的可编程机器是广泛可用的。其实例包含the Expedite 8909自动化DNA合成仪(Perseptive Biosystem,Framington MA)；ABI 394(Applied Biosystems,Inc.,Foster City,CA)；以及OligoPilot II(Amersham Pharmacia Biotech,Piscataway,NJ)。
例如可以使用包含酸不稳定的5’-保护基和3’-亚磷酰胺的、碱基保护的核苷(单体)沿着3’至5’的方向来组装多核苷酸。此类单体的实例包含5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)保护的核苷-3’-O-(N,N-二异丙基氨基)2-氰基乙基亚磷酰胺，其中保护的核苷的实例包含但不限于N6-苯甲酰腺苷,N4-苯甲酰胞苷,N2-异丁酰基鸟苷,胸苷和尿苷。在这种情况下，使用的固体支撑体包含3’-连接的保护的核苷。备选地，可以使用包含酸不稳定的3’-保护基和5’-亚磷酰胺的、碱基保护的核苷沿着5’至3’的方向来组装多核苷酸。此类单体的实例包含3’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)保护的核苷-5’-O-(N,N-二异丙基氨基)2-氰基乙基亚磷酰胺，其中保护的核苷的实例包含但不限于N6-苯甲酰腺苷,N4-苯甲酰胞苷,N2-异丁酰基鸟苷,胸苷和尿苷(GlenResearch,Sterling,VA)。在这种情况下，使用的固体支撑体包含5’-连接的保护的核苷。环状核酸成分可以分离得到，通过重组方法合成或者化学合成。可以使用在文献中所述的任何方法来实施化学合成。例如参见Gao et al.(1995)Nucleic Acids Res.23:2025-2029and Wang et al.(1994)Nucleic Acids Res.22:2326-2333。
可以使用常规的方法加入非核酸间隔子部分。用于加入特定间隔子部 分的方法是本领域已知的，并且例如在上文所述的参考文献中有所描述。
例如参见Durand et al.(1990)Nucleic Acids Res.18:6353-6359。间隔子部分和核酸部分之间的共价键可以为多种类型中的任意一种，包含磷酸二酯,磷硫酰,酰胺,酯,醚,硫醚,二硫化物,磷酰胺,磷酸三酯,二硫代磷酸酯,甲基膦酸酯和其他键。通常方便的是使用用于合成核酸部分的相同的亚硫酰胺型化学法使间隔子部分(多个)与核酸部分(多个)结合。例如本文所述的IRC可以使用亚磷酰胺化学法(例如参见Beaucage,1993,supra；Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry,supra)使用自动化DNA合成仪(例如Expedite 8909；Perseptive Biosystems,Framington,MA)而方便地合成。但是，任一技术人员都将理解的是通过自动化DNA合成仪实施的相同的(或相当的)合成步骤还可以人工实施(如果需要)。在这种合成中，通常间隔子(或用于多聚间隔子的间隔子亚单元)的一个末端被4,4’-二甲氧基三苯甲基保护，而另一个末端包含亚磷酰胺基。
具有必需的保护基和反应基团的多种间隔子是市售可得的，例如：
这些以及很多种其他保护的间隔子部分前体(例如包含DMT和亚磷酰胺基保护基)可以是购买得到的，或者可以使用用于制备本文所述的IRC中的常规方法来合成。根据制造商的操作指南为仪器编程，从而以所需的顺序加入核苷酸单体和间隔子。
尽管使用亚磷酰胺化学法制备某些TLR抑制剂是方便的，但是应该理解的是本文所述的TLR抑制剂不限于通过任何特定的合成或制备方法制备的化合物。
在一个变体中，制备具有多价间隔子的TLR抑制剂，其中所述的多价间隔子与多于1种类型的核酸部分缀合。例如已经描述了包含2个马来酰亚胺基(其可以与包含巯基的多核苷酸反应)和2个活化的酯基(其可以与包含氨基的核酸反应)的平台(例如参见PCT申请公开WO 95/07073)。这2个活化的基团可以独立地彼此反应。这将得到包含总计4个核酸部分(每个序列2个核酸部分)的TLR抑制剂。
此外，还可以使用上文所述的对称支化间隔子、以及常规的亚磷酰胺化学法(例如使用人工或自动化方法)来制备具有多价间隔子(包含2个不同的核酸序列)的TLR抑制剂。对称支化间隔子包含亚磷酰胺基和2个保护基，这2个保护基是相同的，并且被同时除去。在一种方法中，例如合成第一核酸，并使其与对称支化间隔子偶联，由间隔子上除去保护基。然后在所述的间隔子上合成(使用各步骤中合成单一核酸部分使用的试剂的量 的2倍)2个额外的核酸(其为相同序列的核酸)。
可以使用相似的方法将3个不同的核酸部分(下文称为核酸I,II和III)连接至多价平台(例如不对称支化间隔子)上。这可以使用自动化DNA合成仪来最方便地实施。在一个变体中，不对称支化间隔子包含亚磷酰胺基和可以独立除去的2个正交保护基。首先合成核酸I，然后使不对称支化间隔子与核酸I偶联，接着在选择性除去一个保护基之后加入核酸II。将核酸II脱保护，帽封，然后除去间隔子上的其他保护基。最后合成核酸III。
在一些实施方案中，合成核酸部分(多个)，并使用标准的合成化学技术加入反应性连接基团(例如氨基、羧酸酯、巯基、二硫化物等)。反应性连接基团(认为其形成了所得间隔子部分的一部分)与其他的非核酸化合物缀合，从而形成间隔子部分。使用用于核酸合成的标准的方法，使用文献中所述的或市售可得的多种试剂将连接基团加入至核酸中。其实例包含含有保护的氨基、羧基、巯基或二硫基和亚磷酰胺基的试剂。一旦通过活化的亚磷酰胺基将这些化合物引入至核酸中并脱保护，它们便可提供具有氨基、羧酸酯或巯基反应性的核酸。
长度可变的亲水性连接体可用于例如连接核酸部分和平台分子。已知多种合适的连接体。合适的连接体包含但不限于乙二醇的线性寡聚体或聚合物。此类连接体包含具有下式的连接体：R1S(CH2CH2O)nCH2CH2O(CH2)mCO2R2，其中n＝0-200,m＝1或2,R1＝H或诸如三苯甲基之类的保护基,R2＝H、烷基或芳基(例如4-硝基苯酯)。这些连接体可用于将包含巯基反应性基团(例如卤代乙酰基、马来酰胺等)的分子(通过硫醚)与包含氨基的第二分子(通过酰胺键)连接起来。连接的顺序可以改变，例如可以在形成酰胺键之前后之后形成硫醚键。其他可用的连接体包含Sulfo-SMCC(磺基琥珀酰亚胺基4-[N-马来酰亚胺甲基]-环己烷-1-羧酸酯)Pierce Chemical Co.产品22322；Sulfo-EMCS(N-[ε-马来酰亚胺己酰氧基磺基琥珀酰亚胺基)Pierce Chemical Co.产品22307；Sulfo-GMBS(N-[γ-马来酰亚胺丁酰氧基]磺基琥珀酰亚胺基)Pierce Chemical Co.产品22324(Pierce Chemical Co.,Rockford,IL)，以及通式马来酰亚胺-R-C(O)NHS酯的相似化合物(其中R＝烷基,环烷基,乙二醇的聚合物等)。
用于共价连接核酸部分和多价间隔子的特别有用的方法在上文所述 的参考文献中有所描述。
在某些实施方案中，多肽可用作多价间隔子部分，许多核酸部分可以直接地或通过中间体与所述的多价间隔子部分共价缀合，从而形成“似蛋白质的TLR抑制剂”。所述的多肽可以为载体(例如)。通常似蛋白质的载体包含至少1个、通常为几个或许多个核酸部分，其长度通常为2至7、更通常为4至7个核苷酸，备选地其长度为2至6、2至5、4至6、或者4至5个核苷酸，和/或与包含TLR抑制基序的更长的多核苷酸(例如长度为至少8个核苷酸)相比，具有较差的分离的免疫调节活性。就本发明公开的观点来看，制备似蛋白质的TLR抑制剂的方法对于技术人员而言是显而易见的。例如核酸可以通过本领域已知的方法与多肽间隔子部分共价缀合，其中所述的方法包含核酸部分的3’或5’末端(或者在核酸部分中在中间位置处在合适的修饰碱基处)与具有合适的反应性基团(例如N-羟基琥珀酰亚胺酯，其可以直接与胞嘧啶残基的N4氨基反应)的多肽之间的键。另一个实例，多肽可以通过已经引入核酸部分中的肽、巯基或羧基与核酸部分的游离5’末端连接。备选地，如本文所述，多肽可以与间隔子部分缀合。此外，在一个末端包含保护的胺、巯基或羧基的连接基团，以及亚磷酰胺可以与多核苷酸的羟基共价连接，并且随后脱保护，官能度可以用于将TLR抑制剂与肽共价连接。
多核苷酸的分离和合成
此外，本文还提供了制备本文所述的包含抑制基序的多核苷酸的方法，其中所述的抑制基序用于TLR7,TLR8和TLR9中的一种或多种。在一些实施方案中，所述的多核苷酸包含修饰的TLR抑制基序序列。在一些实施方案中，所述的多核苷酸包含未修饰的TLR抑制基序序列。所述的方法可以为本文所述的那些方法中的任意一种。例如所述的方法可以合成TLR抑制剂(例如使用固相合成)，并且进一步包含任意的纯化步骤(多个)。纯化方法是本领域已知的。
此外，还提供了用于分离和合成免疫抑制性多核苷酸的方法，其中所述的多核苷酸包含用于TLR7,TLR8和TLR9中的一种或多种的抑制基序(TLR抑制剂)。在一些实施方案中，所述的TLR抑制剂为修饰的TLR抑制剂。在一些实施方案中，所述的TLR抑制剂为未修饰的TLR抑制剂。
用于制备多核苷酸和修饰多核苷酸的技术是本领域已知的。天然形成的DNA或RNA(其包含磷酸二酯键)通常通过将合适的核苷亚磷酰胺与正在加长的寡核苷酸的5’-羟基依次偶联、然后将中间体亚磷酸三酯氧化成磷酸三酯而合成的，其中所述的正在加长的寡核苷酸在3’末端与固体支撑体连接。一旦所需的多核苷酸序列被合成，便将其由支撑体上移除，将磷酸三酯脱保护从而形式磷酸二酯，并使用氨水或其他的碱使核苷碱基脱保护。例如参见Beaucage(1993)“Oligodeoxyribonucleotide Synthesis”in Protocols for Oligonucleotides and Analogs,Synthesis and Properties(Agrawal,ed.)Humana Press,Totowa,NJ；Warner et al.(1984)DNA 3:401和美国专利No.4,458,066。
包含修饰的磷酸酯键或非磷酸酯键的多核苷酸的合成也是本领域已知的。综述参见Matteucci(1997)“OligonucleotideAnalogs:an Overview”in Oligonucleotides as Therapeutic Agents,(D.J.Chadwick and G.Cardew,ed.)John Wiley and Sons,New York,NY。可以与多核苷酸中的糖或糖类似物部分连接的磷衍生物(或修饰的磷酸酯基)可以为单磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、烷基膦酸酯、磷硫酰、二硫代膦酸酯、磷酰胺等。上述磷酸酯类似物的制备以及将它们引入到核苷酸、修饰的核苷酸和寡核苷酸本身中也是已知的，在此无须详细描述。Peyrottes et al.(1996)Nucleic Acids Res.24:1841-1848；Chaturvedi et al.(1996)Nucleic Acids Res.24:2318-2323；和Schultz et al.(1996)Nucleic Acids Res.24:2966-2973。例如磷硫酰寡核苷酸的合成类似于上文所述的天然形成的寡核苷酸的合成，不同之处在于氧化步骤被硫化步骤替代(Zon(1993)“Oligonucleoside Phosphorothioates”in Protocols for Oligonucleotides and Analogs,Synthesis and Properties(Agrawal,ed.)Humana Press,pp.165-190)。相似地，还描述了其他磷酸酯类似物的合成，例如磷酸三酯(Miller et al.(1971)JACS 93:6657-6665),非桥接磷酰胺(Jager et al.(1988)Biochem.27:7247-7246),N3’至P5’亚磷酰胺(Nelson et al.(1997)JOC 62:7278-7287)和二硫代磷酸酯(美国专利No.5,453,496)。此外，还可以使用其他非磷基的修饰寡核苷酸(Stirchak et al.(1989)Nucleic AcidsRes.17:6129-6141)。
本领域的那些技术人员将意识到包含多种杂环碱基和多种糖部分(和 糖类似物)的大量“合成”非天然核苷在本领域中是可利用的，并且只要满足本发明公开的其他标准，TLR抑制剂除了可以包含天然形成核酸的主要的5个碱基部分以外，还可以包含一个或多个杂环碱基。但是优选的是，TLR抑制剂中的杂环碱基包含但不限于尿嘧啶-5-基,巯基丙氨酸-5-基,腺嘌呤-7-基,腺嘌呤-8-基,鸟嘌呤-7-基,鸟嘌呤-8-基,4-氨基吡咯并[2.3-d]嘧啶-5-基,2-氨基-4-氧吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基,2-氨基-4-氧吡咯并[2.3-d]嘧啶-3-基，其中所述的嘌呤通过9-位置与TLR抑制剂的糖部分连接，所述的嘧啶通过1-位置与TLR抑制剂的糖部分连接，所述的吡咯并嘧啶通过7-位置与TLR抑制剂的糖部分连接，以及所述的吡唑并嘧啶通过1-位置与TLR抑制剂的糖部分连接。
例如已经在美国专利No.4,910,300,4,948,882和5,093,232中描述了碱基修饰的核苷的制备，以及使用碱基修饰的核苷作为前体合成修饰的寡核苷酸。这些碱基修饰的核苷经过设计使得它们可以通过化学合成而被引入至寡核苷酸的末端或内部位置中。此类碱基修饰的核苷(存在于寡核苷酸的末端或内部位置中)可以起到用于连接多肽的位点的作用。此外还描述了在它们的糖部分的修饰的核苷(包含但不限于美国专利No.4,849,513,5,015,733,5,118,800,5,118,802)，并且这些核苷可以相似地使用。
TLR抑制剂络合物 
TLR抑制剂可以直接给药个体，或者它们可以以组合物或络合物的形式给药，从而增强TLR抑制剂向细胞的传递和/或细胞的吸收。此外，组合物或络合物还可以用于增强2种或多种不同的TLR抑制剂向细胞的共传递。在一些实施方案中，可以使TLR抑制剂的混合物络合物，从而传递至少一种TLR抑制剂。
这种传递组合物或络合物包含但不限于囊封络合物和胶体分散系统，如本文所述和本领域已知的那样。这种传递组合物的实例包含水包油乳液、胶囊和脂质体。此外，传递组合物或络合物还包含与连接体分子连接的TLR抑制剂、平台分子、纳米颗粒或微颗粒，如本文所述。这种键包含共价键和非共价键。
在一些实施方案中，TLR抑制剂以多种方式与连接体分子缀合物，包含共价相互作用和/或非共价相互作用。
各部分之间的连接可以在TLR抑制剂的3’或5’末端形成，或者在TLR抑制剂中在内部位置处在合适的修饰碱基处形成。如果连接体为肽并且包含合适的反应性基团(例如N-羟基琥珀酰亚胺酯)，其可以直接与胞嘧啶残基的N4氨基反应。根据TLR抑制剂中胞嘧啶残基的数量和位置，可以在一个或多个残基处取得特定的偶联。
备选地，修饰的寡核苷(例如本领域已知的那些)可以被引入到TLR抑制剂的末端或内部位置处。这些寡核苷可以包含封闭的官能团，当封闭的官能团去封闭时，其可以与存在或附着在所关注的连接体上的多种官能团反应。
在连接体为肽的情况下，缀合物的这部分可以通过固体支撑体化学法与TLR抑制剂的3’末端连接。例如TLR抑制剂部分可以加入到在支撑体上预合成的肽部分中。Haralambidis et al.(1990a)Nucleic Acids Res.18:493-499；and Haralambidis et al.(1990b)Nucleic Acids Res.18:501-505。备选地，可以合成TLR抑制剂，是的其通过由3’末端伸出的可切割连接体与固体支撑体连接。在由支撑体上化学切割TLR抑制剂时，将末端巯基留在寡核苷酸的3’末端处(Zuckermann et al.(1987)Nucleic Acids Res.15:5305-5321；and Corey et al.(1987)Science 238:1401-1403)，或者将末端氨基留在寡核苷酸的3’末端处(Nelson et al.(1989)Nucleic Acids Res.17:1781-1794)。如在Benoit et al.(1987)Neuromethods 6:43-72中所述，可以使氨基修饰的TLR抑制剂与肽的氨基缀合。如在Sinah et al.(1991)Oligonucleotide  Analogues:A Practical Approach,IRL Press中所述，可以使巯基修饰的TLR抑制剂与肽的羧基缀合。此外，已经描述了携带附加马来酰亚胺的寡核苷酸与肽的半胱氨酸残基的巯基侧链偶联。Tung et al.(1991)Bioconjug.Chem.2:464-465。
缀合物的肽连接体部分可以通过胺、巯基或羧基与TLR抑制剂的5’末端连接，其中所述的胺、巯基或羧基已经在寡核苷酸的合成过程中引入其中。优选的是，在寡核苷酸固定于固体支撑体上的同时，使在一个末端包含保护的胺、巯基或羧基并且在另一末端包含亚磷酰胺的连接基团与5’羟基共价连接。Agrawal et al.(1986)Nucleic Acids Res.14:6227-6245；Connolly(1985)Nucleic Acids Res.13:4485-4502；Kremsky et al.(1987) Nucleic Acids Res.15:2891-2909；Connolly(1987)Nucleic Acids Res.15:3131-3139；Bischoff et al.(1987)Anal.Biochem.164:336-344；Blanks et al.(1988)Nucleic Acids Res.16:10283-10299；以及美国专利No.4,849,513,5,015,733,5,118,800和5,118,802。在脱保护后，胺、巯基和羧基可以用于使寡核苷酸与肽共价连接。Benoit et al.(1987)；和Sinah et al.(1991)。
此外，还可以通过非共价相互作用来形成TLR抑制剂缀合物，例如离子键、疏水相互作用、氢键和/或范德华引力。
非共价连接的缀合物可以包含非共价相互作用，例如生物素-链霉亲和素络合物。生物素基团可以连接在例如TLR抑制剂的修饰的碱基上。Roget et al.(1989)Nucleic Acids Res.17:7643-7651。将链霉亲和素部分引入至肽部分中允许链霉亲和素缀合的肽与生物素化的寡核苷酸形成非共价键合的络合物。
此外，可以通过使用包含带电残基(其可以与寡核苷酸相互作用)的连接体部分通过与TLR抑制剂有关的离子相互作用而形成非共价结合。例如在通常带负电荷的TLR抑制剂与肽连接体的带正电荷的氨基酸残基(例如聚赖氨酸、聚精氨酸和聚组氨酸残基)之间可以形成非共价缀合。
可以使用标准的方法来形成TLR抑制剂与脂质的键。这些方法包含但不限于寡核苷酸-磷脂缀合物的合成(Yanagawa et al.(1988)Nucleic Acids Symp.Ser.19:189-192)，寡核苷酸-脂肪酸缀合物的形成(Grabarek et al.(1990)Anal.Biochem.185:131-135；and Staros et al.(1986)Anal.Biochem.156:220-222)，以及寡核苷酸-固醇缀合物的形成。Boujrad et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5728-5731。
可以使用标准的已知的方法来形成寡核苷酸与寡糖的键。这些方法包含但不限于寡核苷酸-寡糖的合成，其中寡糖为免疫球蛋白的部分。O’Shannessy et al.(1985)J.Applied Biochem.7:347-355。
可以以多种方式形成环状TLR抑制剂与肽连接体的键。在使用重组或化学方法合成环状TLR抑制剂的情况下，修饰的核酸是合适的。Ruth(1991)in Oligonucleotides and Analogues:A Practical Approach,IRL Press。然后，可以使用标准的连接技术连接环状TLR抑制剂和所述的肽。Goodchild(1990)Bioconjug.Chem.1:165。在使用重组或化学方法分离或合 成环状TLR抑制剂的情况下，可以通过化学活化或光活化已经引入至肽中的反应性基团(例如卡宾、自由基)来形成键。
用于将肽和其他分子与寡核苷酸连接的其他方法可以在美国专利No.5,391,723；Kessler(1992)“Nonradioactive labeling methods for nucleic acids”in Kricka(ed.)Nonisotopic DNA Probe Techniques,Academic Press；and Geoghegan et al.(1992)Bioconjug.Chem.3:138-146中找到。
TLR抑制剂可以以多种方式近似结合(proximately associated)。在一些实施方案中，TLR抑制剂通过囊封近似结合。在其他的实施方案中，TLR抑制剂通过与平台分子形成的键而近似结合。“平台分子”(也称为“平台”)为包含多个位点的分子，其中所述的位点允许连接TLR抑制剂。在其他的实施方案中，TLR抑制剂通过吸附在表面(优选为载体颗粒)上而近似结合。
在一些实施方案中，本文所述的方法使用了与TLR抑制剂有关的囊封剂。优选的是，包含TLR抑制剂和囊封剂的组合物为辅助的水包油乳液、微颗粒和/或脂质体的形式。更优选的是，囊封TLR抑制剂的辅助的水包油乳液、微颗粒和/或脂质体为大约0.04μm至大约100μm尺寸的颗粒形式，优选为以下范围的任意一种：大约0.1μm至大约20μm、大约0.15μm至大约10μm、大约0.05μm至大约1.00μm、大约0.05μm至大约0.5μm。
胶体分散系统可以有效地囊封包含TLR抑制剂的组合物，其中所述的胶体分散系统例如有微球体、珠、大分子络合物、纳米胶囊和脂质基系统，例如水包油乳液、胶囊、混合胶囊以及脂质体。
所述的囊封组合物进一步包含多种成分的任意一种。这些成分包含但不限于明矾、脂质、磷脂、聚乙二醇和其他聚合物，例如多肽、糖肽和多糖。
适用于囊封多种成分的多肽包含本领域已知的任意一种，并且包含但不限于脂肪酸结合蛋白。修饰的多肽包含多种修饰的任意一种，包含但不限于糖基化、磷酸化、十四烷基化、硫酸化和羟基化。如本文所用，合适的多肽为可以保护包含TLR抑制剂的组合物保持其免疫抑制活性的多肽。结合蛋白的实例包含但不限于白蛋白，例如牛血清白蛋白(BSA)和豌豆白蛋白。
其他合适的聚合物可以为药物领域中已知的任意一种，并且包含但不 限于天然形成的聚合物，例如右旋糖苷、羟基乙基淀粉、多糖和合成聚合物。天然形成的聚合物的实例包含蛋白质、糖肽、多糖、右旋糖苷和脂质。其他的聚合物可以为合成的聚合物。适于使用的合成聚合物的实例包含但不限于：烷基乙二醇化合物(PAG)，例如PEG；聚氧乙烯醇(POP)，例如聚氧乙烯甘油(POG)；聚三亚甲基二醇(PTG)聚丙二醇(PPG)；聚羟基乙基甲基丙烯酸酯；聚乙烯醇(PVA)；聚丙烯酸；聚乙基唑啉；聚丙烯醛基酰胺；聚乙烯吡咯烷酮(PVP)；聚氨基酸；聚氨酯和聚磷腈。此外，合成的聚合物可以是2种或多种不同合成单体的线性的或支化的，取代的或非取代的、均聚的，共聚物或嵌段共聚物。
用于囊封组合物的PGE可购自化学品供应商，或者使用本领域的那些技术人员已知的技术来合成。
可任选的胶体分散系统为脂质体。如本文所用，“脂质体”或“脂质囊泡”为由至少一个以及可能多于一个的双层脂质膜限定的小囊泡。脂质体可以由磷脂、糖脂、脂质、类固醇(例如胆固醇)、相关分子或它们的组合通过本领域已知的任何技术而人工制得，其中所述的技术包含但不限于超声处理、挤出或由脂质-洗涤剂络合物中除去洗涤剂。此外，脂质体还可以可任选地包含其他成分，例如组织靶向成分。应该理解的是“脂质膜”或“脂质双层”无需专门由脂质组成，而且可以额外地包含任何合适的其他成分，包含但不限于胆固醇和其他类固醇、脂质可溶的化学品、任何长度的蛋白质和其他两性分子，前提条件是膜的一般结构为将疏水核心夹在中间的2个亲水表面层。对于膜结构的一般讨论，参见TheEncyclopedia of Molecular Biology by J.Kendrew(1994)。对于合适的脂质，例如参见Lasic(1993)“Liposomes:fromPhysics to Applications”Elsevier,Amsterdam。
用于制备包含TLR抑制剂组合物的脂质体的工艺是本领域已知的。可以通过本领域已知的任何合适的技术来制备脂质囊泡。其方法包含但不限于微囊封、微流化、LLC方法、乙醇注射、氟利昂注射、“发泡”方法、洗涤剂透析、水化作用、超声处理和逆向蒸发。综述于Watwe et al.(1995)Curr.Sci.68:715-724中。为了提供具有更理想的特性的囊泡，可以将多种技术结合起来。
本文提供了脂质双层的用途，例如包含组织或细胞靶向成分的脂质 体。当将此类靶向成分给药完整的动物、器官或细胞培养物时，其增强了在某些组织或细胞位点(优选于其他组织或细胞位点)处的累积。靶向成分通常可由脂质体的外部得到，并因此优选地结合于外表面或插入到外面的脂质双层中。靶向成分尤其可以为与上文所述分子的任意一种连接的肽、较大肽的区域、特异性针对细胞表面或标志物的抗体或其抗原结合片段、核酸、碳水化合物、络合的碳水化合物的区域、特殊的脂质或小分子，例如药品、激素或半抗原。对细胞型特异性的细胞表面标志物具有特异性的抗体是本领域已知的，并且可以通过本领域已知的方法容易地制备。
脂质体可以靶向治疗性治疗定向针对的任何细胞类型，例如可以调节和/或参与免疫应答的细胞类型。此类靶细胞和器官包含但不限于APC，例如巨噬细胞、树突状细胞和淋巴细胞；淋巴结构，例如淋巴结和脾；以及非淋巴结构，特别是其中发现树突状细胞的那些。
本文提供的脂质体组合物可以额外包含表面活性剂。表面活性剂可以为阳离子、阴离子、两性分子或非离子的。优选的一类表面活性剂为阴离子表面活性剂；特别优选的是水溶性的那些表面活性剂。
在其中TLR抑制剂通过与平台分子连接而近似结合的一些实施方案中，所述的平台可以为似蛋白质的或非似蛋白质的(即有机的)。似蛋白质的平台的实例包含但不限于白蛋白、丙种球蛋白、免疫球蛋白(IgG)和卵白蛋白。Borel et al.(1990)Immunol.Methods 126:159-168；Dumas et al.(1995)Arch.Dematol.Res.287:123-128；Borel et al.(1995)Int.Arch.Allergy Immunol.107:264-267；Borel et al.(1996)Ann.N.Y.Acad.Sci.778:80-87。平台是多价的(即包含多于1个的结合或连接位点)，从而适应多于1个的TLR抑制剂的结合。因此，平台可以包含2个或更多、3个或更多、4个或更多、5个或更多、6个或更多、7个或更多、8个或更多、9个或更多、10个或更多的结合或连接位点。聚合的平台的其他实例为右旋糖苷,聚丙烯醛基酰胺,羧甲基纤维素,聚乙烯醇和聚D-谷氨酸/D-赖氨酸。
在一些实施方案中，所述的平台为聚合物平台。在一些实施方案中，所述的聚合物为右旋糖苷,聚丙烯醛基酰胺,羧甲基纤维素,聚乙烯醇或聚D-谷氨酸/D-赖氨酸。在一些实施方案中，所述的聚合的平台为在一些实施方案中，聚合的平台为400。在一 些实施方案中，聚合的平台为70。在一些实施方案中，聚合的平台为PM 70(聚(蔗糖-co-表氯醇))。在一些实施方案中，聚合的平台为PM 400。在一些实施方案中，大约1至大约200个、大约1至大约150个、大约1至大约125个、大约1至大约100个、大约1至大约75个、大约1至大约50个、或者大约1至大约25个TLR抑制剂的任意一种与聚合的平台连接。
使用平台分子的原理是本领域公知的。通常，平台包含或者衍生成包含用于TLR抑制剂的合适的结合位点。此外或者备选地，TLR抑制剂衍生成提供了合适的连接基团。例如单一的平台为双功能连接体(即具有2个结合位点)，例如肽。其他实例将在下文中描述。
平台分子可以是生物稳定的，即它们表现出通常为几小时至几天、至几个月的体内延长的半衰期，从而赋予治疗效力，并且优选地由定义组合物的合成单链组成。它们的分子量范围通常为大约200至大约1000000，优选为以下范围的任意一种：大约200至大约500000；大约200至大约200000；大约200至大约50000(或者更少，例如30000)。化合物平台分子的实例为聚合物(或者由聚合物组成)，例如聚乙二醇(PEG；分子量优选为大约200至大约8000),聚D-赖氨酸,聚乙烯醇,聚乙烯吡咯烷酮,D-谷氨酸和D-赖氨酸(比例为3:2)。可以使用的其他分子为白蛋白和IgG。
适合使用的其他平台分子为美国专利No.5,552,391中公开的化学定义的非聚合的化合价平台分子。适合使用的其他均质的化学定义的化合价平台分子为衍生的2,2'-二乙酸乙二胺(EDDA)和三乙二醇(TEG)。
其他合适的化合价平台分子包含但不限于四氨基苯,七氨基倍他环糊精,四氨基季戊四醇,1,4,8,11-四氮环十四烷(Cyclam)和1,4,7,10-四氮环十二烷(Cyclen)。
通常，这些平台是通过标准的化学合成技术而制备的。PEG必须是衍生的，并且被制备成多价的，这是使用标准的技术来完成的。适用于缀合物合成的一些物质(例如PEG、白蛋白和IgG)是市售可得的。
TLR抑制剂与平台分子的缀合可以以多种方式来实施，通常涉及一种或多种交联剂、以及核酸部分和平台分子上的官能团。平台和TLR抑制剂必须具有合适的交联基团。使用标准的合成化学技术将交联基团加入至平 台中。可以标准的固相合成技术或重组技术将交联基团加入至多肽平台和TLR抑制剂中。重组方法可以需要翻译后修饰，以便连接连机体，并且此类方法是本领域已知的。
作为实例，多肽包含氨基酸侧链部分，该部分包含起到偶联多肽与平台作用的官能团，例如氨基、羧基或氢硫基。如果多肽尚未包含这些基团，则可以将具有此类官能团的残基加入至多肽中。此类残基可以通过固相合成技术或重组技术引入，这两种方法都是肽合成领域中公知的。当所述的多肽具有碳水化合物侧链(多个)(或者如果平台为碳水化合物)时，可以通过传统的化学法将官能氨基、氢硫基和/或醛基引入至其中。例如可以在硼氢化氰钠存在下通过氧化的糖与乙二胺反应来引入伯氨基，可以通过巯基乙胺二氢氯化物反应、然后使用标准的二硫化物还原剂还原来引入氢硫基，同时可以在高碘酸盐氧化后生成醛基。按照相似的方式，如果平台分子尚未具有合适的官能团，则还可以使其衍生成包含官能团。
长度可变的亲水性连接体可用于连接TLR抑制剂与平台分子。合适的连接体包含乙二醇的线性寡聚体或聚合物。此类连机体包含具有下式的连接体：R1S(CH2CH2O)nCH2CH2O(CH2)mCO2R2，其中n＝0-200,m＝1或2,R1＝H或诸如三苯甲基之类的保护基,R2＝H、烷基或芳基(例如4-硝基苯酯)。这些连接体可用于将包含巯基反应性基团(例如卤代乙酰基、马来酰胺等)的分子(通过硫醚)与包含氨基的第二分子(通过酰胺键)连接起来。关于连接的顺序，这些连接体是可变通的，即可以首先或最后形成硫醚。
在其中通过吸附到表面上而近似结合TLR抑制剂的实施方案中，所述的表面可以为使用无机核心或有机核心制成的载体颗粒(例如纳米颗粒)的形式。此类纳米颗粒的实例包含但不限于纳米晶体颗粒，通过烷基氰基丙烯酸酯的聚合而制备的纳米颗粒，以及通过亚甲基丙二酸酯的聚合而制备的纳米颗粒。TLR抑制剂可以吸附的其他表面包含但不限于活性碳颗粒和蛋白质-陶瓷纳米盘。本文提供了载体颗粒的其他实例。
使多核苷酸和多肽吸附在为了将被吸附的分子传递至细胞的表面上是本领域公知的。例如参见Douglas et al.(1987)Crit.Rev.Ther.Drug.Carrier Syst.3:233-261；Hagiwara et al.(1987)In Vivo 1:241-252；Bousquet et al.(1999)Pharm.Res.16:141-147；and Kossovsky et al.,美国专利No. 5,460,831。优选的是，包含吸附表面的材料是可生物降解的。TLR抑制剂吸附在表面上可以通过非共价相互作用来实现，包含离子和/或疏水相互作用。
通常，诸如纳米颗粒之类的载体的特征(例如表面电荷、粒径和分子量)取决于聚合工艺过程中的聚合条件、单体浓度和稳定剂的存在(Douglas et al.,1987)。例如可以使用表面涂料来改性载体颗粒的表面，从而允许或增强TLR抑制剂的吸附。可以使用其他物质进一步涂敷具有吸附的TLR抑制剂的载体颗粒。一旦加入的此类其他物质被给予受试对象，其便可以例如延长颗粒的半衰期，和/或可以使所述的颗粒靶向特定的细胞类型或组织，如本文所述。
已经描述了可以吸附TLR抑制剂的纳米晶体表面(例如参见美国专利No.5,460,831)。使用表面能量改性层来涂敷纳米晶体核心颗粒(直径为1μm或更低)，其中所述的表面能量改性层会促进多肽、多核苷酸和/或其他药物试剂的吸附。另一种吸附表面为通过烷基氰基丙烯酸酯的聚合而制备的纳米颗粒。烷基氰基丙烯酸酯可以在酸化的水性介质中通过阴离子聚合工艺来聚合。根据聚合条件，小颗粒的尺寸范围往往为20至3000nm，并且可以形成了具有特定的表面特征和特定的表面电荷的纳米颗粒(Douglas et al.,1987)。例如在疏水性阳离子(例如四苯基氯化膦)或季铵盐(例如溴化十六烷基三甲铵)存在下，寡核苷酸可以吸附到聚异丁基和聚异己基氰基丙烯酸酯纳米颗粒上。寡核苷酸吸附在这些纳米颗粒上显示是通过在核酸链上带负电荷的磷酸酯基与疏水性阳离子之间形成离子对来介导的。例如参见Lambert et al.(1998)Biochimie 80:969-976,Chavany et al.(1994)Pharm.Res.11:1370-1378；Chavany et al.(1992)Pharm.Res.9:441-449。另一种吸附表面为通过亚甲基丙二酸酯的聚合而制备的纳米颗粒。
TLR抑制剂可以以微载体(MC)络合物的形式给药。因此，本文提供了包含TLR抑制剂/MC络合物的组合物。TLR抑制剂/MC络合物包含结合于微载体表面上的TLR抑制剂(即TLR抑制剂并未囊封于MC中)，并且优选的是包含结合于各微载体上的多个TLR抑制剂分子。在某些实施方案中，不同TLR抑制剂的混合物可以与微载体络合，使得微载体结合于多于1个TLR抑制剂物质。TLR抑制剂与MC之间的结合可以是共价的或非共 价的。如本领域任一技术人员所理解的那样，TLR抑制剂可以被修饰或衍生，并且微载体的组成可以选择和/或修改，从而适应用于TLR抑制剂/MC络合物形成所需的理想的结合类型。
可用的微载体小于大约150,120或100μm的尺寸，更通常的是小于大约50-60μm的尺寸，优选的是小于大约10μm尺寸，并且不溶于纯水中。使用的微载体优选为可生物降解的，但是不可生物降解的微载体是可接受的。微载体通常为固相，例如“珠”或其他颗粒，但是液相微载体(例如包含可生物降解的聚合物或油的水包油乳液)也可以考虑。可接受用作微载体的多种可生物降解的和不可生物降解的材料是本领域已知的。
用于本文所述的组合物或方法的微载体通常具有小于大约10μm的尺寸(例如平均直径小于大约10μm，或者至少大约97％的颗粒通过10μm筛网过滤器)，并且包含纳米载体(及小于大约1μm尺寸的载体)。优选的是选择尺寸上限为大约9,7,5,2,1μm或者900,800,700,600,500,400,300,250,200,100nm且独立地选择的下限为大约4,2,1μm或者大约800,600,500,400,300,250,200,150,100,50,25,10nm的微载体，其中下限小于上限。在一些实施方案中，微载体的尺寸为大约1.0-1.5μm,大约1.0-2.0μm或大约0.9-1.6μm。在某些优选的实施方案中，微载体的尺寸为大约10nm至大约5μm，或者大约25nm至大约4.5μm,大约1μm,大约1.2μm,大约1.4μm,大约1.5μm,大约1.6μm,大约1.8μm,大约2.0μm,大约2.5μm或大约4.5μm。当微载体为纳米载体时，优选的实施方案包含大约25至大约300nm、50至大约200nm、大约50nm或大约200nm的纳米载体。
固相可生物降解的微载体可以由可生物降解的聚合物制造，其中所述的聚合物包含但不限于：可生物降解的聚酯，例如聚(乳酸)、聚(乙醇酸)和它们的共聚物(包含嵌段共聚物)，以及聚(乳酸)和聚(乙二醇)的嵌段共聚物；聚原酸酯，例如基于3,9-二亚乙基-2,4,8,10-四氧杂螺[5.5]十一烷(DETOSU)的聚合物；聚酐，例如基于相对亲水性单体(例如癸二酸)的聚(酐)聚合物；聚酐酰亚胺，例如基于癸二酸衍生的引入了氨基酸(例如甘氨酸或丙氨酸)的聚酐聚合物(即通过氨基末端的氮通过酰亚胺键与癸二酸连接)；聚酐酯；聚磷腈，特别是包含水解敏感性酯基(其可以通过生成羧酸基来催化聚合物骨架的降解)的聚(磷腈)(Schacht et al.,(1996)Biotechnol. Bioeng.1996:102)；以及聚酰胺，例如聚(乳酸-co-赖氨酸)。
适用于制造微载体的多种不可生物降解的材料也是已知的，包含但不限于聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、二氧化硅、陶瓷、聚丙烯醛基酰胺、右旋糖苷、羟磷灰石、胶乳、金、以及铁磁的或顺磁的材料。某些实施方案排除了金、胶乳和/或磁珠。在某些实施方案中，微载体可以由第一材料制成，该第一材料(例如磁性材料)被第二材料(例如聚苯乙烯)囊封。
使用本领域已知的技术来制备固相微球体。例如它们可以通过乳液-溶剂提取/蒸发技术来制备。通常，在这种技术中，将诸如聚酐、聚(烷基-氰基丙烯酸酯)和聚(羟基酯)(例如聚(乳酸),聚(乙醇酸),聚(D,L-乳酸-co-乙醇酸)和聚(己内酯))之类的可生物降解的聚合物溶解于合适的有机溶剂(例如二氯甲烷)中，从而构成乳液分散相(DP)。DP是通过高速均化至过量的连续水相(CP)中而乳化的，其中所述的连续的水相包含溶解的表面活性剂，例如聚乙烯醇(PVA)或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。CP中的表面活性剂将确保形成离散的且尺寸合适的乳滴。然后，将有机溶解提取至CP中，随后通过升高系统温度来蒸发。接着通过离心或过滤分离固体微颗粒，并通过例如冻干或施加真空来干燥，然后储存在4℃下。
可以测定干燥微球体的物理化学特征，例如平均尺寸、尺寸分布和表面电荷。例如通过动态光散射技术来测定尺寸特征，并通过测量zeta电位来测定表面电荷。
液相微载体包含脂质体、胶囊、油滴和其他脂质或油基颗粒，其中引入了可生物降解的聚合物或油。在某些实施方案中，可生物降解的聚合物为表面活性剂。在其他实施方案中，由于液相微载体包含可生物降解的油(例如鲨烯或植物油)，所以其是可生物降解的。一种优选的液相微载体为处于水包油乳液中的油滴。优选的是，用作微载体的水包油乳液包含可生物降解的取代物，例如鲨烯。
可以使用本领域已知的任何共价交联技术来连接共价键合的TLR抑制剂/MC络合物。通常，TLR抑制剂部分可通过以下过程修饰：引入其他的部分(例如游离胺、羧基或氢硫基)，或者引入修饰(例如磷硫酰)的核苷酸间接，从而提供TLR抑制剂部分可以连接微载体的位点。TLR抑制剂与络合物的MC部分之间的连接可以在TLR抑制剂的3’或5’末端，或者在 TLR抑制剂中在内部的位置处在合适的修饰碱基处进行。通常还可以改性微球体，从而引入这样的部分，通过该部分可以形成共价连接，但是通常还可以使用存在于微载体上的官能团。在允许形成共价络合物的条件(例如在交联剂存在下，或者通过使用活化的微载体，该微载体包含与TLR抑制剂形成共价键的活化部分)下通过将TLR抑制剂与微载体温育来形成TLR抑制剂/MC。
多种交联技术是本领域已知的，并且包含与氨基、羧基和氢硫基反应的交联剂。对于本领域的任一技术人员显而易见的是，交联剂和交联方案的选择取决于TLR抑制剂和微载体的构造、以及TLR抑制剂/MC络合物的理想的最终构造。交联剂可以为同源双功能的或异源双功能的。当使用同源双功能交联剂时，交联剂利用在TLR抑制剂和MC上相同的部分(例如醛交联剂用于共价连接TLR抑制剂和MC，其中TLR抑制剂和MC都包含一个或多个游离的胺)。异源双功能交联剂例如在TLR抑制剂和MC上不同的部分(例如马来酰亚胺-N-羟基琥珀酰亚胺酯可以用于共价连接TLR抑制剂上游离的氢硫基和MC上的游离的胺)，并且优选的是减少微载体内部键的形成。在多数情况下，优选的是通过微载体上的第一交联部分与TLR抑制剂上第二交联部分交联，其中第二交联部分不存在于微载体上。生产TLR抑制剂/MC络合物的一种优选的方法为以下过程：通过与异源双功能交联剂温育来“活化”微载体，然后通过在适于反应的条件下温育TLR抑制剂和活化的MC，从而形成TLR抑制剂/MC络合物。叫连接可以在反应性部分之间引入“间隔子”臂，或者交联剂中的2个反应性部分可以是直接交联的。
在一个优选的变体中，TLR抑制剂部分包含用于交联微载体的至少一个游离的氢硫基(例如由5’-巯基修饰的碱基或连机体提供)，而微载体包含游离的胺基。与这2个基团反应的异源双功能交联剂(例如包含马来酰亚胺基和NHS-酯的交联剂，例如琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯)用于活化MC，然后与TLR抑制剂共价交联，从而形成TLR抑制剂/MC络合物。
非共价TLR抑制剂/MC络合物可以通过任何非共价结合或相互作用来连接，包含离子(静电)键、疏水相互作用、氢键、范德华引力或2种或 多种不同相互作用的组合(在结合对将连接TLR抑制剂和MC时，通常为这种情况)。
优选的非共价TLR抑制剂/MC络合物通常是通过疏水或静电(离子)相互作用、或者它们的组合来络合的(例如通过TLR抑制剂与与结合对使用的MC结合的多核苷酸之间的碱基配对)。由于多核苷酸骨架的亲水性本性，依赖于疏水相互作用来形成络合物的TLR抑制剂/MC络合物通常需要对络合物的TLR抑制剂部分进行修饰，从而引入高度疏水的部分。优选的是，疏水部分是生物相容性的，非免疫原性的，并且在需要所述的组合物的个体中是天然形成的(例如在哺乳动物中发现的那些，特别是在人类中发现的那些)。优选的疏水部分的实例包含脂质、类固醇、固醇(例如胆固醇)和萜烯。用于连接疏水部分与TLR抑制剂的方法当然取决于TLR抑制剂的构造和疏水部分的特性。可以在TLR抑制剂中在任何方便的位点加入疏水部分，优选的是5’或3’末端；在将胆固醇部分加入至TLR抑制剂中的情况下，优选的是使用常规的化学反应将胆固醇部分加入至TLR抑制剂的5’末端(例如参见Godard et al.(1995)Eur.J.Biochem.232:404-410)。优选的是，用于TLR抑制剂/MC络合物(通过疏水结合而连接)的微载体是由疏水材料制得的，例如油滴或疏水聚合物，但是还可以使用经修饰引入了疏水部分的疏水材料。当微载体为包含腔的脂质体或其他液相微载体并且需要TLR抑制剂与MC的外表面结合时，在制备MC后通过混合TLR抑制剂和MC来形成TLR抑制剂/MC络合物，从而避免在MC制备工艺过程中囊封TLR抑制剂。
通过静电结合而结合的非共价TLR抑制剂/MC络合物通常利用了多核苷酸骨架的高负电荷。因此，用于非共价结合的TLR抑制剂/MC络合物的微载体在生理Ph(例如大约pH6.8-7.4)下通常带正电荷的(阳离子)。微载体可以固有地具有正电荷，但是由通常不具有正电荷的化合物制成的微载体可以衍生或以其他方式改性成正电荷的(阳离子)。例如用于制备微载体的聚合物可以衍生成加入了正电荷基团，例如伯胺。备选地，在制造过程中在微载体的配方中可以引入带正电荷的化合物(例如在制造聚(乳酸)/聚(乙醇酸)共聚物的过程中可以使用带正电荷的表面活性剂，从而在所得的微载体颗粒中赋予正电荷)。
例如为了制备阳离子微球体、阳离子脂质或聚合物，例如将1,2-二油酰基-1,2,3-三甲胺丙烷(DOTAP),溴化十六烷基三甲铵(CTAB)或聚赖氨酸加入至DP或CP中(根据它们在这些相中的溶解性)。
可以通过多核苷酸与颗粒优选地在水性预混物中温育，通过吸附在阳离子微球体上来形成TLR抑制剂/MC络合物。此类温育可以在任何理想的条件下实施，包含环境温度(室温)(例如大约20℃)或者在冷冻(例如4℃)下。由于阳离子微球体和多核苷酸相对快速地结合，所述的温育可以为任何方便的时间，例如5、10、15分钟或更多，包含过夜和更长的温育。例如通过使多核苷酸与颗粒在4℃下过夜水性温育而是TLR抑制剂可以吸附在阳离子微球体上。但是由于阳离子微球体与多核苷酸自发结合，所以可以通过简单地共给予多核苷酸和MC来形成TLR抑制剂/MC络合物。可以在多核苷酸结合之前和结合之后针对尺寸和表面电荷来表征微球体。可以在例如人类外周血单核细胞(PBMC)和小鼠脾细胞检验中，针对合适的对照，就活性来评价所选的批次。此外，还可以在合适的动物模型中评价配制物。
可以使用常规的方法来生产通过核苷酸碱基配对而连接的非共价TLR抑制剂/MC络合物。通常，使用包含结合的(优选为共价结合的)多核苷酸(“捕获的多核苷酸”)的微载体来生产碱基配对的TLR抑制剂/MC络合物，其中所述的多核苷酸与TLR抑制剂是至少部分互补的。TLR抑制剂与捕获的核苷酸的互补节段优选为至少6,8,10或15个临近的碱基对，更优选的是至少20个临近的碱基对。捕获的核苷酸可以通过本领域已知的任何方法与MC结合，并且优选的是在5’或3’末端与TLR抑制剂共价结合。
在其他的实施方案中，结合对可以用于在TLR抑制剂/MC络合物中连接TLR抑制剂和MC。结合对可以是受体和配体，抗体和抗原(或抗原决定簇)，以高亲和性(例如Kd小于大约10-8)结合的任何其他的结合对。一种优选的结合对类型为生物素和链霉亲和素，或者生物素和抗生物素蛋白，其形成了极紧密的络合物。当使用结合对来介导TLR抑制剂/MC络合物的结合时，TLR抑制剂通常使用结合对的一者通过共价键来衍生，而MC使用结合对的另一者来衍生。2种衍生的化合物的混合物使得TLR抑制剂/MC络合物形成。
药物配制物 
此外，还提供了包含本文所述的TLR抑制剂的药物配制物。可以将包含TLR抑制剂的药物配制物以有效量的组合物给予个体，从而得到特定的结果。药物配制物可以常规地包含药物可接受浓度的盐、缓冲剂、防腐剂、相容性载体、佐剂和可任选的其他治疗组分。在一些方面中，药物配制物包含至少一种TLR抑制剂。
药物配制物包含例如用于注射或吸入的水性或生理盐水溶液，或者可以被微囊封、encochleated、涂敷在微小金颗粒上、包含在脂质体中、形成喷雾、形成气溶胶、用于植入皮肤中的小丸或者干燥在锋利的物(其被刮擦在皮肤中)上。此外，药物配制物还包含具有延迟释放的活性化合物的小颗粒、粉末、片剂、涂敷的片剂、(微)囊、栓剂、糖浆、乳液、悬浮液、乳霜、滴剂或制备物，例如在这些制备物中，通常使用赋形剂和添加剂、和/或辅助物质，例如崩解剂、粘结剂、涂敷试剂、膨胀剂、润滑剂、风味剂、甜味剂或增溶剂，如上文所述。所述的药物配制物适用于多种药品传递系统。关于药品传递的示例性方法的简述，参见Langer,Science249:1527-33(1990)，该文献以引用方式并入本文。
在一些实施方案中，包含TLR抑制剂的药物配制物进一步包含药物可接受的载体、赋形剂或稳定剂。药物可接受的载体、赋形剂或稳定剂如本文所述，并且是本领域公知的(例如参见Remington:The Science and Practice of Pharmacy,20th edition,Mack Publishing,2000)。药物可接受的载体、赋形剂或稳定剂的实例包含但不限于：缓冲剂，例如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，例如抗坏血酸；低分子量多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、凝胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰氨、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包含葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，例如EDTA；糖醇，例如甘露醇或山梨醇；盐形成抗衡离子，例如钠；和/或非离子表面活性剂，例如聚乙二醇(PEG)和在一些实施方案中，药物可接受的载体为柠檬酸盐。
在一些实施方案中，包含TLR抑制剂的药物配制物适用于肠胃外给药。水、Ringer溶液、磷酸盐缓冲的生理盐水和等渗氯化钠溶液为可接受 的媒介物和溶剂。此外，无菌固定油常用作溶解或悬浮介质。就此目的而言，可以使用任何温和的固定的矿物或非矿物油，包含合成的甘油单酯或甘油二酯。此外，诸如油酸之类的脂肪酸在注射剂的制备中具有用途。在一些实施方案中，包含TLR抑制剂的药物配制物适用于皮下、肌肉内、腹膜内或静脉内传递。
在一些实施方案中，包含TLR抑制剂的药物配制物为限时释放的、延时释放的或持续释放的药物配制物。持续释放的药物配制物包含聚合物基系统，例如聚(丙交酯-乙交酯),共聚草酸酯,聚己内酯,聚酯酰胺,聚原酸酯,多羟基丁酸以及聚酐。包含之前所述的聚合的药品的微囊在例如美国专利No.5,075,109中有所描述。非聚合物药物配制物可以包含：脂质，包含固醇(例如胆固醇)、胆固醇酯和脂肪酸或中性脂肪(例如甘油单酯、甘油二酯和甘油三酯)；水凝胶释放稀土；硅橡胶系统；肽基系统；蜡涂料；使用常规粘结剂和赋形剂的压制片；部分融合的移植物等。
包含TLR抑制剂的药物配制物可以适用于局部应用，包含但不限于生理学可接受的软膏、乳霜、冲洗液、乳液、洗剂、溶液、糊剂和凝胶。
在一些实施方案中，包含TLR抑制剂的药物配制物为配制用于经皮给药的药物配制物。经皮给药是通过施加例如乳霜、冲洗液或凝胶而完成的。在一些实施方案中，药物配制物为配制用于胃肠途径给药的药物配制物。在一些实施方案中，用于胃肠途径的药物配制物包含用于消化的药物可接受的粉末、药丸或液体以及用于直肠给药的栓剂。在一些实施方案中，药物配制物为配制用于鼻咽和肺部给药的药物配制物。提供了适用于鼻咽和肺部给药的药物配制物，其包含但不限于用于形成气溶胶的液体悬浮液、以及用于干燥粉末吸入传递系统的粉末形式。
IV.使用方法
本文提供了用于抑制个体中免疫应答的方法，其包含向所述的个体给药有效量的TLR7、TLR8和/或TLR9的抑制剂(例如TLR抑制剂)。本发明公开的TLR抑制剂为包含抑制基序的多核苷酸，其中所述的抑制基序用于一种或多种人类的TLR7、TLR8和TLR9。在一些变体中，所述的TLR抑制剂抑制了TLR7依赖的免疫应答。在一些变体中，所述的TLR抑制剂抑制了TLR8依赖的免疫应答。在一些变体中，所述的TLR抑制剂抑制了 TLR7依赖的和TLR8依赖的免疫应答。在一些变体中，所述的TLR抑制剂抑制了TLR8依赖的和TLR9依赖的免疫应答。在一些变体中，所述的TLR抑制剂抑制了TLR7依赖的、TLR8依赖的和TLR9依赖的免疫应答。除非另作说明，术语TLR抑制剂是指本文所公开的任意一种TLR抑制剂。在一些优选的实施方案中，所述的个体为人类患者。
免疫调节的方法由本发明公开提供，并且包含压制和/或抑制免疫应答(包含但不限于免疫应答)的那些。此外，本发明公开还提供了用于减轻与不需要的免疫活化有关的症状(包含但不限于与自体免疫有关的症状)的方法。根据本文所述的额方法的免疫压制和/或抑制可以在个体上实施，所述的个体包含遭受紊乱的那些，所述的紊乱与不需要的免疫应答的活化有关。此外，本发明公开还提供了用于抑制TLR7、TLR8和/或TLR9诱导的应答(例如体外或体内)的方法。在一些变体中，使所述的细胞与有效抑制细胞(其有助于免疫应答)应答的量的TLR抑制剂接触。
TLR7、TLR8和/或TLR9的抑制可以用于治疗和/或预防多种响应于细胞因子的疾病或紊乱。可以使用TLR7、TLR8和/或TLR9作为治疗的状况包含但不限于自体免疫疾病和炎症紊乱。本文提供了治疗或预防个体疾病或紊乱的方法，其包含向个体给药有效量的TLR7、TLR8和/或TLR9的抑制剂。此外，提供了用于减轻与疾病或紊乱有关的症状的方法，其包含向患有所述的疾病或紊乱的个体给药有效量的TLR7、TLR8和/或TLR9的抑制剂。此外，本文还提供了用于预防或延迟疾病或紊乱的发展的方法，其包含向患有所述的疾病或紊乱的个体给药有效量的TLR7、TLR8和/或TLR9的抑制剂。在一些实施方案中，所述的TLR抑制剂选自SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:14,SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:16,SEQ ID NO:17,SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:24,SEQ ID NO:26,SEQ ID NO:30,SEQ ID NO:31,SEQ ID NO:32,SEQ ID NO:33,SEQ ID NO:34,SEQ ID NO:35,SEQ ID NO:36,SEQ ID NO:37,SEQ ID NO:38,SEQ ID NO:39,SEQ ID NO:40,SEQ ID NO:44,SEQ ID NO:46,SEQ ID NO:48,SEQ ID NO:49,SEQ ID NO:50,SEQ ID NO:51,SEQ ID NO:52,SEQ ID NO:53,SEQ ID NO:55,SEQ ID NO:56,SEQ ID NO:57,SEQ ID NO:58,SEQ ID NO:59,SEQ ID NO:60,SEQ ID NO:61,SEQ ID NO:62,SEQ ID NO:63,SEQ ID NO:64,SEQ ID NO:65,SEQ  ID NO:66,SEQ ID NO:67,SEQ ID NO:68,SEQ ID NO:69,SEQ ID NO:70,SEQ ID NO:71,SEQ ID NO:72,SEQ ID NO:73,SEQ ID NO:77,SEQ ID NO:78,SEQ ID NO:79,SEQ ID NO:80,SEQ ID NO:81,SEQ ID NO:84,SEQ ID NO:85,SEQ ID NO:86,SEQ ID NO:87,SEQ ID NO:88,SEQ ID NO:89,SEQ ID NO:90,SEQ ID NO:91,SEQ ID NO:92,SEQ ID NO:93,SEQ ID NO:94,SEQ ID NO:95,SEQ ID NO:96,SEQ ID NO:97,SEQ ID NO:98,SEQ ID NO:99,SEQ ID NO:100,SEQ ID NO:101,SEQ ID NO:102,SEQ ID NO:103,SEQ ID NO:104,SEQ ID NO:105,SEQ ID NO:106,SEQ ID NO:107,SEQ ID NO:108,SEQ ID NO:109,SEQ ID NO:110,SEQ ID NO:111,SEQ ID NO:112,SEQ ID NO:113,SEQ ID NO:114和SEQ ID NO:115。在一些实施方案中，所述的TLR抑制剂为包含SEQ ID NO:109的多核苷酸。
本文提供了用于抑制个体中的免疫应答的方法，该方法包含向所述的个体给药有效抑制该个体的免疫应答的量的、本文所公开的至少一种TLR抑制剂。在一些变体中，所述的免疫应答与自体免疫疾病有关。在其他的方面中，其中抑制免疫应答会减轻自体免疫疾病的一种或多种症状。在其他的方面中，其中抑制免疫应答可治疗自体免疫疾病。在其他的方面中，其中抑制免疫应答会预防或延迟自体免疫疾病的发展。在一些变体中，TLR抑制剂抑制的TLR7依赖的免疫应答。在一些变体中，TLR抑制剂抑制了TLR8依赖的免疫应答。在一些变体中，TLR抑制剂抑制了TLR7依赖的和TLR8依赖的免疫应答。在一些变体中，TLR抑制剂抑制了TLR8依赖的和TLR9依赖的免疫应答。在一些变体中，TLR抑制剂抑制了TLR7依赖的、TLR8依赖的和TLR9依赖的免疫应答。在一些方面中，以有效抑制个体免疫应答的量给药至少一种TLR抑制剂。
此外，本文还提供了用于治疗或预防个体的自体免疫疾病的方法，其包含向个体给药有效量的TLR7,TLR8和/或TLR9抑制剂。在一些方面中，自体免疫疾病表征为关节疼痛、抗核抗体阳性、面颊疹或盘状疹。在一些实施方案中，自体免疫疾病与皮肤、肌肉组织和/或结缔组织有关。在一些实施方案中，自体免疫疾病在个体中并非通过皮肤、肌肉组织和/或结缔组织来证明的。在一些实施方案中，自体免疫疾病是系统性的。自体免疫疾病包含但不限于类风湿性关节炎(RA),自体免疫胰腺炎(AIP),系统性红斑 狼疮(SLE),I型糖尿病,多发性硬化(MS),抗磷脂综合征(APS),硬化性胆管炎,全身性关节炎,肠易激综合症(IBD),硬皮病,Sjogren病,白癜风,多肌炎,寻常性天疱疮,落叶状天疱疮,炎性肠病(包含Crohn病和溃疡性结肠炎),自体免疫肝炎,垂体机能减退,移植物抗宿主疾病(GvHD),自体免疫皮肤病,葡萄膜炎,恶性贫血和甲状旁腺功能减退。此外，自体免疫疾病还可以包含但不限于多血管炎重叠综合征,Kawasaki病,肉状瘤病,血管球性肾炎和寒冷病。这些状况是医药领域公知的，并且在例如Harrison’s Principles of Internal Medicine,14th ed.,Fauci et al.,eds.,New York:McGraw-Hill,1998中有所描述。在一些方面中，自体免疫疾病选自关节炎,胰腺炎,混合性结缔组织病(MCTD),狼疮,抗磷脂综合征(APS),全身性关节炎和过敏性大肠综合征。在其他方面中，自体免疫疾病选自系统性红斑狼疮(SLE),类风湿性关节炎,自体免疫皮肤病和多发性硬化。在其他方面中，自体免疫疾病选自胰腺炎,血管球性肾炎,肾盂炎,硬化性胆管炎和I型糖尿病。在一些方面中，自体免疫疾病为类风湿性关节炎。在一些方面中，自体免疫疾病为自体免疫胰腺炎(AIP)。在一些方面中，自体免疫疾病为血管球性肾炎。在一些方面中，自体免疫疾病为肾盂炎。在一些方面中，自体免疫疾病为硬化性胆管炎。在一些方面中，自体免疫紊乱为银屑病。在一些方面中，自体免疫疾病为类风湿性疾病或紊乱。在一些方面中，类风湿性疾病或紊乱为类风湿性关节炎。在一些方面中，所述的疾病为糖尿病和/或糖尿病相关疾病或紊乱。在一些方面中，其中自体免疫疾病与含RNA的免疫络合物有关。在一些方面中，自体免疫疾病为Sjogren病。
本文提供了用于抑制个体的免疫应答的方法，该方法包含向所述的个体给药有效抑制个体的免疫应答的量的、本文所公开的至少一种TLR抑制剂。在一些变体中，免疫应答与炎症紊乱有关。如本文所用，术语“炎症紊乱”涵盖了自体免疫疾病以及不具有已知的自体免疫成分的炎症状况(例如动脉粥样硬化,哮喘等)。在其他的方面中，抑制免疫应答会减轻炎症紊乱的一种或多种症状。在其他的方面中，抑制免疫应答可治疗炎症紊乱。在其他的方面中，抑制免疫应答会预防或延迟炎症紊乱的发展。在一些方面中，炎症紊乱选自非类风湿性关节炎,肾纤维化和肝纤维化。在一些方面中，炎症紊乱为界面皮炎。在一些其他的方面中，界面皮炎选自扁平苔 藓,苔癣样疹,扁平苔藓样角化病,线状苔藓,慢性苔藓样角化病,多形红斑,固定性药疹,苔癣样糠疹,光毒性皮炎,辐射性皮炎,病毒疹,皮肌炎,继发性梅毒,硬化萎缩性苔藓,蕈样肉芽肿,大疱性类天疱疮,金黄色苔藓,汗孔角化病,慢性萎缩性肢端皮炎和消退型黑素瘤。在一些方面中，炎症状况为皮肤紊乱，例如特应性皮炎(湿疹)。在一些方面中，炎症紊乱为无菌炎症状况，例如。药品诱导的肝脏和/或胰腺炎。在一些其他的方面中，炎症疾病为炎性肝脏紊乱。在一些其他的方面中，炎性疾病为炎性胰腺紊乱。
本文提供了抑制个体免疫应答的方法，该方面包含向所述的个体给药有效抑制个体免疫应答的量的、本文所公开的至少一种TLR抑制剂。在一些变体中，免疫应答与慢性病原体刺激有关。在一些变体中，免疫应答与HIV感染有关。在其他的方面中，其中抑制免疫应答会减轻病毒疾病或紊乱(由HIV感染所导致)的一种或多种症状。在其他的方面中，其中抑制免疫应答可治疗由HIV感染所导致的病毒疾病或紊乱。在其他的方面中，其中抑制免疫应答会预防或延迟由HIV感染所导致的病毒疾病或紊乱的发展。本文提供的其他变体涉及个体的免疫抑制疗法，其中所述的个体曾经暴露于或被HIV感染。对曾经暴露于或被HIV感染的个体给药TLR抑制剂导致由HIV诱导的细胞因子的生产被压制。在一些方面中，在暴露于或被HIV感染的个体中，给药有效压制HIV诱导的细胞因子的生产的量的、至少一种TLR抑制剂。
本文提供了用于抑制个体中TLR7-、TLR8-和/或TLR-9依赖的免疫应答的方法，该方法包含向所述的个体给药有效抑制该个体的免疫应答的量的TLR抑制剂。在一些变体中，免疫应答与自体免疫疾病有关。在一些方面中，自体免疫疾病为类风湿性关节炎。在一些方面中，TLR抑制剂可有效地压制类风湿性关节炎的一种或多种症状。在一些方面中，自体免疫疾病为多发性硬化。在一些方面中，TLR抑制剂可有效地压制多发性硬化的一种或多种症状。在一些方面中，自体免疫疾病为狼疮。在一些方面中，TLR抑制剂可有效地压制狼疮的一种或多种症状。在一些方面中，自体免疫疾病为胰腺炎。在一些方面中，TLR抑制剂可有效地压制胰腺炎的一种或多种症状。在一些方面中，自体免疫疾病为糖尿病。在一些方面中，TLR 抑制剂可有效地压制糖尿病的一种或多种症状。在一些方面中，所述的疾病为Sjogren病。在一些方面中，TLR抑制剂可有效地压制Sjogren病的一种或多种症状。在一些变体中，免疫应答与炎性紊乱有关。在一些方面中，TLR抑制剂可有效地压制炎性紊乱的一种或多种症状。在一些变体中，免疫应答与慢性病原体刺激有关。在一些方面中，TLR抑制剂可有效地压制慢性病原体刺激的一种或多种症状。在一些变体中，免疫应答与由HIV感染导致的病毒疾病有关。在一些方面中，TLR抑制剂可有效地压制由HIV感染导致的病毒疾病的一种或多种症状。在任意一种变体中，TLR抑制剂为包含抑制基序的多核苷酸，其中所述的抑制基序用于TLR7,TLR8和TLR9中的一种或多种。
本文的方法提供了预防性治疗和/或治疗性治疗。如本文所用，预防性治疗是指在观察到症状和/或疑似暴露于所述状况的病因(例如病原体或致癌物)之前开始的治疗。通常，预防性治疗可以降低：(a)接受治疗的个体发展出状况的可能性，和/或(b)在受试对象发展出状况的情况下，症状的持续时间和/或严重性。如本文所用，治疗性治疗是指在观察到症状和/或疑似暴露于所述状况的病因之后开始的治疗。通常，治疗性治疗可以降低与所得状况有关的症状的严重性和/或持续时间。
如本文证明的那样，包含抑制基序(用于TLR7,TLR8和/或TLR9中的一种或多种)的特定TLR抑制剂抑制了TLR7依赖的细胞应答、TLR8依赖的细胞应答和/或TLR9依赖的细胞应答。在一些实施方案中，某些TLR抑制剂不会抑制TLR4依赖的细胞应答。在一些实施方案中，某些TLR抑制剂不会抑制TLR1依赖的、TLR2依赖的、TLR3依赖的、TLR4依赖的、TLR5依赖的、TLR6依赖的、TLR10依赖的、TLR11依赖的、TLR12依赖的和/或TLR13依赖的细胞应答。在一些实施方案中，如本文所述，包含抑制基序(用于TLR7,TLR8和/或TLR9中的一种或多种)的TLR抑制剂抑制了和/或压制了可测量的免疫应答，这可以体外、体内和/或离体测定。
如本文所述，具有新定义的TLR7抑制基序的一些TLR抑制剂可特别有效地压制TLR7依赖的细胞应答。此类TLR抑制剂包含但不限于SEQ ID NO:36,38,44,46,48,50,55-67,85-88,90,91,95,97,99,103,104,108-111,114和115。
如本文所述，具有新定义的TLR8抑制基序的一些TLR抑制剂可特别有效地压制TLR8依赖的细胞应答。此类TLR抑制剂包含但不限于SEQ ID NO:10,14-18,20,24,26,30-40,44,48-53,56,59-73,77-81和84-115。
如本文所述，一些TLR抑制剂可特别有效地压制TLR7依赖的和TLR8依赖的细胞应答。此类TLR抑制剂包含但不限于SEQ ID NO:10,15-18,20,24,26,30,34-36,38,40,44,48,50,56,59-63,65,67,85-88,90-95,97,99-106和108-111。
如本文所述，一些TLR抑制剂可特别有效地压制TLR8依赖的和TLR9依赖的细胞应答。此类TLR抑制剂包含但不限于SEQ ID NO:81和112。
如本文所述，一些TLR抑制剂可特别有效地压制TLR7依赖的、TLR8依赖的和TLR9依赖的细胞应答。此类TLR抑制剂包含但不限于SEQ ID NO:14,64,66和113-115。
在涉及向个体给药TLR抑制剂的任意一种方法(例如抑制免疫应答，治疗和预防自体免疫疾病或炎性紊乱等的方法)的一些实施方案中，TLR抑制剂具有治疗可接受的安全图谱。TLR抑制剂可以具有例如治疗可接受的历史图谱，包含可接受的低的肝脏、肾脏、胰腺或其他器官的毒性(如果有的话)。有时，多核苷酸与对某些器官(例如肝脏、肾脏和胰腺)的毒性有关。在一些实施方案中，TLR抑制剂具有意想不到的且有利的安全图谱。在一些实施方案中，安全图谱包含毒性、历史图谱和/或坏疽(例如肝脏、肾脏和/或心脏)的评价。在一些实施方案中，TLR抑制剂具有治疗可接受的水平的毒性。在一些实施方案中，与另一种TLR抑制剂(例如参照TLR抑制剂，例如SEQ ID NO:7的C954)相比，所述的TLR抑制剂具有水平降低的毒性。在一些实施方案中，与治疗的个体的初始体重相比，TLR抑制剂诱导了体重发生治疗可接受的减少。在一些实施方案中，TLR抑制剂诱导全体重减少小于5％,7.5％,10％,12.5或15％。在一些实施方案中，TLR抑制剂具有治疗可接受的历史图谱。在一些实施方案中，例如与参照TLR抑制剂(例如SEQ ID NO:7的C954)相比，所述的TLR抑制剂具有较好的(例如较低的严重性得分)历史图谱。在一些实施方案中，在评价例如肝脏、肾脏和/或心脏时，TLR抑制剂具有较好的(例如较低的严重性得分)历史图谱。在一些实施方案中，TLR抑制剂具有治疗可接受的坏疽得分。在一些实施 方案中，例如与参照TLR抑制剂(例如SEQ ID NO:7的C954)相比，所述的TLR抑制剂具有减少的坏疽和/或较好的(例如较低)坏疽得分。在一些实施方案中，平均坏疽得分小于或等于大约3。在一些实施方案中，平均坏疽得分小于或等于大约2.0。在一些实施方案中，平均坏疽得分小于或等于大约1。在一些实施方案中，平均坏疽得分小于或等于大约0。在一些实施方案中，例如与参照TLR抑制剂(例如SEQ ID NO:7的C954)相比，TLR抑制剂具有减少的肾脏和/或干细胞坏疽、和/或较好的肾脏和/或干细胞坏疽得分。
在涉及向个体给药TLR抑制剂的任意一种方法(例如抑制免疫应答，治疗和预防自体免疫疾病或炎性紊乱等的方法)的一些实施方案中，TLR抑制剂具有治疗可接受的药代动力学(PK)或药品代谢动力学(DMPK)。在任意一种方法的一些实施方案中，TLR抑制剂具有与另一种TLR抑制剂(例如参照TLR抑制剂，例如SEQ ID NO:7的C954)相似的PK谱图或PK。在一些实施方案中，在小鼠或大鼠中测定治疗可接受的安全谱图。在一些实施方案中，在大鼠中测定治疗可接受的安全图谱。
在涉及向个体给药TLR抑制剂的任意一种方法(例如抑制免疫应答，治疗和预防自体免疫疾病或炎性紊乱等的方法)的一些实施方案中，TLR抑制剂诱导了治疗可接受的水平的B细胞活化。在一些实施方案中，与阳性对照多核苷酸(例如免疫刺激序列，也称为ISS，包含非甲基化的CG二核苷酸)相比，TLR抑制剂诱导了低水平的B细胞活化。在一些实施方案中，TLR抑制剂诱导了低水平的B细胞的活化，其与另一种TLR抑制剂相当或者不明显高于另一种TLR抑制剂(例如参照TLR抑制剂，例如SEQ ID NO:7的C954)，已知所述的另一种TLR抑制剂具有较低的B细胞活化。在一些实施方案中，TLR抑制剂诱导B细胞活化的水平达到另一种TLR抑制剂(例如SEQ ID NO:7的C954)的不到大约1倍、1.5倍、2倍、2.5倍或3倍，已知所述的另一种TLR抑制剂具有较低的B细胞活化。在一些实施方案中，TLR抑制剂诱导B细胞活化的水平达到明显低于阳性对照多核苷酸(例如ISS)。在一些实施方案中，TLR抑制剂体外诱导B细胞活化的水平达到阳性对照多核苷酸(例如ISS)的不到大约5％,10％,15％,20％或25％。在一些实施方案中，TLR抑制剂的B细胞活化对阳性对照多核苷酸 (例如ISS)归一化。在一些实施方案中，比较多种TLR抑制剂的归一化结果。在一些实施方案中，TLR抑制剂诱导B细胞活化的水平达到明显低于第二TLR抑制剂(例如SEQ ID NO:116的DV185)。在一些实施方案中，TLR抑制剂在细胞培养物检验中不会诱导B细胞活化的水平达到明显高于单独的介质或参照TLR抑制剂(例如SEQ ID NO:7的C954)，已知TLR抑制剂具有较低的B细胞活化。在一些实施方案中，TLR抑制剂在细胞培养物检验中诱导B细胞活化的水平达到第二TLR抑制剂(例如SEQ ID NO:7的C954)的明显不到大约1倍、1.5倍、2倍、2.5倍或3倍，已知所述的另一种TLR抑制剂具有较低的B细胞活化。在一些实施方案中，TLR抑制剂在细胞培养物检验中诱导B细胞活化的水平达到明显低于阳性对照多核苷酸(例如ISS)。在一些实施方案中，TLR抑制剂例如在大约4000nM至大约15nM的范围内显示浓度依赖的B细胞活化。在一些实施方案中，TLR抑制剂例如在大约1000nM至大约15nM的范围内显示很少至无的B细胞活化。
TLR抑制剂的给药以及免疫应答的评估
如同使用所有的用于抑制免疫应答的组合物，可以根据个体、将要治疗的状况以及对于本领域的任一技术人员显而易见的其他因素来改变特定TLR抑制剂配制物的有效量和给药方法。
在一些方面中，TLR抑制剂的剂量足以压制对TLR7,TLR8和/或TLR9激动剂的应答，压制TLR7依赖的免疫应答，压制TLR8依赖的免疫应答，压制TLR7依赖的和TLR8依赖的免疫应答，压制TLR8依赖的和TLR9依赖的免疫应答，压制TLR7依赖的、TLR8依赖的和TLR9依赖的免疫应答，减轻自体免疫疾病的一种或多种症状，减轻慢性炎性疾病的症状，减少响应于HIV的细胞因子的生产，和/或治疗和/或预防由TLR7,TLR8和/或TLR9介导的疾病或紊乱的一种或多种症状。在一些实施方案中，以有效抑制个体免疫应答的量来给药至少一种TLR抑制剂。
合适的剂量范围为可以对免疫应答提供所需的调节的范围(例如压制TLR7,TLR8和/或TLR9激动剂或者压制响应于TLR7,TLR8和/或TLR9激动剂的IFN或其他细胞因子的生产)。通常，通过给予个体的TLR抑制剂的量来测定剂量。包含TLR抑制剂的组合的有用的剂量范围可以为例如 以下的任意一种：0.1至10mg/kg,0.5至10mg/kg,1至10mg/kg,0.1至20mg/kg,0.1至20mg/kg,或者1至20mg/kg。给予各个体的绝对量取决于药理学性质，例如生物利用度、清除率和给药途径。
就个体的治疗而言，根据试剂的活性、给药方式、给药目的(即预防性的或治疗性的)、紊乱的本性和严重性、个体的年龄和体重，需要不同的剂量。剂量通常由医生或其他健康护理专业人士根据本领域已知的多种参数来选择，例如症状的严重性、个体的历史等。在一些实施方案中，在本文所述的方法中可以使用有效量的TLR抑制剂。
给定剂量的给药可以通过以个体剂量单位的形式单一给药或者以多个较小的剂量单位的方式来进行。此外，还考虑在特定地间隔几天、几周或几个月下重复和多次给药多个剂量。
可以根据个体患者、所需的结果和/或紊乱的类型、疾病的阶段和本领域的任一技术人员显而易见的其他因素来改变特定TLR抑制剂配制物的有效量和给药方法。用于特定用途的给药途径(多种)对于本领域的任一技术人员而言是显而易见的。给药途径包含但不限于局部、皮肤、经皮、经粘膜、表皮、肠胃外、胃肠道以及鼻咽和肺部(包含经支气管和经肺泡)。合适的剂量范围为提供足够的包含TLR抑制剂的配制物从而使组织浓度为大约1-50μM(其可通过血液水平来测量)的范围。给予各患者的绝对量取决于药理学性质，例如生物利用度、清除率和给药途径。
包含本文所述的TLR抑制剂的任意一种药物配制物可以通过系统(例如肠胃外)或局部(例如局部或损伤区注射)给药来给予。在一些实施方案中，药物配制物为局部的、肠胃外的、口服的、阴道内的、子宫内的、鼻内的或通过吸入给药。如本文所述，其中不需要的免疫活化正在发生或可能将要发生的组织是TLR抑制剂的优选靶物。因此，对淋巴结、脾脏、骨髓、血液以及暴露于病毒的组织给药TLR抑制剂是优选的给药位点。
在一些实施方案中，包含TLR抑制剂的药物配制物是肠胃外给药的。肠胃外给药途径包含但不限于经皮、经粘膜、鼻咽、肺部和直接注射。通过注射的肠胃外给药可以通过任何肠胃外注射途径，包含但不限于：静脉内(IV)，包含团注和输注(例如快速或缓慢的)；腹膜内(IP)；肌肉内(IM)；皮下(SC)和皮内(ID)途径。经皮和经粘膜给药可以通过例如包含载体(例如 二甲基亚砜,DMSO)、通过施加电脉冲(例如离子电渗疗法)或它们的组合来实施。多种装置可用于可以使用的经皮给药。适用于肠胃外给药的TLR抑制剂配制物通常是在USP水或注射用水中配制的，并且可以进一步包含pH缓冲剂、盐膨胀剂、防腐剂和其他药物可接受的赋形剂。用于肠胃外注射的免疫抑制性多核苷酸可以在药物可接受的无菌等渗溶液(例如用于注射的生理盐水和磷酸盐缓冲生理盐水)中配制。
经皮给药是通过施加能够使TLR抑制剂渗透皮肤病进入血流中的乳霜、冲洗液、凝胶等来实施的。适用于经皮给药的组合物包含但不限于可以直接施加在皮肤上或者被引入到保护性载体(例如经皮装置，所谓的贴剂)中的药物可接受的悬浮液、油、乳霜和软膏。合适的乳霜、软膏等的实例可以在例如Physician’s Desk Reference中找到。经皮传送还可以例如使用市售可得的贴剂(在几天或更长的时间内，所述的贴剂将它们的产品连续地传递通过破损的皮肤)，通过离子电渗疗法来实施。使用这种方法允许药物组合物在相对更高的浓度下以受控的方式传送，允许输注组合药品，并允许同时使用吸收促进剂。经皮和经粘膜途径给药可以是连续的或脉冲式的。
胃肠道途径给药包含但不限于消化和直肠途径，并且可以包含使用例如用于消化的药物可接受的粉末、药丸或液体，以及用于直肠给药的栓剂。
鼻咽和肺部给药是通过吸入来实施的，并且包含诸如鼻内、经支气管和经肺泡途径。提供了适用于吸入给药的TLR抑制剂的配制物，包含但不限于用于形成气溶胶的液体悬浮液，以及用于干燥粉末吸入传递系统的粉末形式。适用于吸入给药TLR抑制剂配制物的装置包含但不限于喷雾器、蒸馏器、雾化器和干燥粉末吸入传递装置。传递至呼吸粘膜的其他方法包含传递液体配制物，例如滴鼻液。通过吸入给药优选的是以分离的剂量(例如通过计量剂量的吸乳器)来实施的，但是与输注相似的传递可以通过使用雾化器来实施。
如本文所述，其中不需要的免疫活化正在发生或者可能将要发生的组织为TLR抑制剂的合适的靶物。因此，对淋巴结、脾脏、骨髓、血液以及暴露于病毒的组织给药TLR抑制剂是优选的给药位点。
如本领域公知的那样，用于本文所述的给药途径的溶液或悬浮液可以 包含以下成分的任意一种或多种：无菌稀释剂，例如注射用水、生理盐水溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗细菌试剂，例如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，例如乙二胺四乙酸；缓冲剂，例如醋酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；以及用于调节渗透压的试剂，例如氯化钠或右旋葡萄糖。可以使用酸或碱来调节pH，例如盐酸或氢氧化钠。可以将肠胃外制备物密封于安瓿瓶、一次性注射器或者由玻璃或塑料制成的多剂量小瓶中。
如本领域公知的那样，适用于注射用途的药物组合物包含无菌水溶液(在水溶性的情况下)，或者用于无菌注射溶液或分散液的临时制备物的分散液和无菌粉末。就静脉内给药而言，合适的载体包含生理盐水、抑菌水、Cremophor ELTM(BASF,Parsippany,NJ)或磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)。在所有情况下，所述的组合物必须是无菌的，并且应该流动至达到容易注射能力的程度。其在制造和储存条件下应该是稳定的，并且必须防止微生物有机体(例如细菌和真菌)污染作用下保存。所述的载体可以为包含例如水、乙醇、多羟基化合物(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)和它们的合适的混合物的溶剂或分散介质。可以例如通过使用涂料(例如卵磷脂)，通过在分散情况下保持所需的粒径以及使用表面活性剂来保持合适的流动性。防止微生物有机体的作用可以通过多种抗细菌和抗真菌试剂(例如对羟苯甲酸酯,氯丁醇,苯酚,抗坏血酸,硫汞撒等)来实施。可以优选的是在组合物中包含等渗试剂，例如糖，多元醇(例如甘露醇、山梨醇)以及氯化钠。延长可注射组合物的吸收可以通过在组合物中包含延迟吸收的试剂(例如单硬脂酸铝和凝胶)来达到。
如本领域公知的那样，无菌注射溶液可以通过将所需量的活性化合物(多种)引入至合适的溶剂(根据需要，其具有一种上文列举的组分或多种组分的组合)中、然后通过过滤除菌来制备。通常，分散液是通过将活性化合物引入至无菌媒介物中来制备，其中所述的无菌媒介物包含基本的分散介质以及由上文列举的那些得到的所需的其他组分。在用于制备无菌注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，其产生了活性组分的粉末加上由之前无菌过滤的溶液得到的任何其他所需的组分。
在本文所述的任意一种方法中，可以给药足以抑制免疫应答的量的TLR抑制剂。如本文所述，免疫应答可以是体液水平的和/或细胞水平的，并且可以使用本领域和本文所述的标准的技术来测量。在一些方面中，本文提供了用于压制、减轻和/或抑制TLR7,TLR8和/或TLR9依赖的细胞刺激(例如在表达TLR的细胞中的TLR信号传递)的方法。在一些方面中，给药有效抑制个体的免疫应答的量的至少一种TLR抑制剂。
如本文所证明的那样，一些TLR抑制剂压制了TLR7依赖的、TLR8依赖的和/或TLR9依赖的免疫应答。在一些实施方案中，通过了用于抑制个体中TLR7依赖的、TLR8依赖的和/或TLR9免疫应答的方法，其包含给药足以压制个体中TLR7依赖的、TLR8依赖的和/或TLR9细胞因子生产的量的、本文所述的TLR抑制剂。在一些实施方案中，TLR7依赖的、TLR8依赖的和/或TLR9免疫应答是固有的免疫应答。在一些实施方案中，TLR7依赖的、TLR8依赖的和/或TLR9免疫应答是适用性的免疫应答。
在一些实施方案中，本文所述的组合物抑制了单核细胞、巨噬细胞、髓系树突状细胞、调节T细胞、B细胞和嗜中性粒细胞的应答。在一些实施方案中，由本文所述的组合物所抑制的免疫应答包含抑制所述细胞的细胞因子(例如IL-1β和/或TNF)的生产，抑制细胞成熟和/或抑制细胞增殖。在一些实施方案中，本文所述的组合物抑制了TLR7依赖的、TLR8依赖的和/或TLR9依赖的细胞应答。
上文提及的组合物和给药方法是描述但不限于给药本文所述的TLR抑制剂的配制物的方法。生产各种组合物和装置的方法在本领域的任一技术人员的能力范围内，因此在此不再详细描述。
组合治疗
本发明公开的TLR抑制剂可以与一种或多种其他的治疗剂组合给药。如本文所述，TLR抑制剂可以与生理可接受的载体组合。本文所述的方法可以与其他治疗组合实施，其中所述的其他治疗构成了用于所述的紊乱的护理标准，例如给药抗炎试剂。
在一些实施方案中，TLR抑制剂与皮质类固醇组合给药。在一些实施方案中，皮质类固醇为糖皮质类固醇。在一些实施方案中，皮质类固醇为盐皮质激素。皮质类固醇包含但不限于：肾上腺酮及其衍生物、前药、异 构体和类似物；可的松及其衍生物、前药、异构体和类似物(即Cortone)；醛固酮及其衍生物、前药、异构体和类似物；地塞米松及其衍生物、前药、异构体和类似物(即Decadron)；泼尼松及其衍生物、前药、异构体和类似物(即Prelone)；氟氢可的松及其衍生物、前药、异构体和类似物(即 )；氢化可的松及其衍生物、前药、异构体和类似物(即考的索或Cortef)；羟基可的松及其衍生物、前药、异构体和类似物；倍他米松及其衍生物、前药、异构体和类似物(即Celestone)；布地缩松及其衍生物、前药、异构体和类似物(即EntocortEC)；甲基泼尼松龙及其衍生物、前药、异构体和类似物(即Medrol)；泼尼松龙及其衍生物、前药、异构体和类似物(即Deltasone,Crtan,Meticorten,Orasone或Sterapred)；去炎松及其衍生物、前药、异构体和类似物(即Kenacort或Kenalog)等。在一些实施方案中，皮质类固醇为氟氢可的松或其衍生物、前药、异构体和类似物。在一些实施方案中，皮质类固醇为氟氢可的松。在一些实施方案中，皮质类固醇为羟基可的松或其衍生物、前药、异构体或类似物。在一些实施方案中，皮质类固醇为羟基可的松。
在一些实施方案中，以每天0.001mg至1mg,0.5mg至1mg,1mg至2mg,2mg至20mg,20mg至40mg,40至80mg,80至120mg,120mg至200mg,200mg至500mg,或500mg至1000mg中的大约任意一种给药皮质类固醇。在一些实施方案中，以每天0.1mg/kg至0.5mg/kg,0.5mg/kg至1mg/kg,1mg/kg至2mg/kg,2mg/kg至5mg/kg,5mg/kg至10mg/kg,10mg/kg至15mg/kg,15mg/kg至20mg/kg,20mg/kg至25mg/kg,25mg/kg至35mg/kg,或35mg/kg至50mg/kg的大约任意一种给药皮质类固醇。
在一些实施方案中，在组合治疗中使用的TLR抑制剂(以传递的TLR抑制剂的量给药)可以为例如0.1至10mg/kg,0.5至10mg/kg,1至10mg/kg,0.1至20mg/kg,0.1至20mg/kg,或1至20mg/kg的大约任意一种。
在一些实施方案中，TLR抑制剂与一种或多种其他的治疗剂同时给药，其中所述的治疗剂包含但不限于皮质类固醇(同时给药)。在一些实施方案中，TLR抑制剂与其他的治疗剂依次给药，其中所述的治疗剂包含但不限于皮质类固醇(依次给药)。在一些实施方案中，依次给药包含在1分钟、5分钟、30分钟、1小时、5小时、24小时、48小时或1周的大约任 意一种时间内之后给药TLR抑制剂或其他治疗剂。在一些实施方案中，TLR抑制剂通过与其他治疗剂相同的给药途径给药。在一些实施方案中，TLR抑制剂通过与其他的治疗剂不同的给药途径给药。在一些实施方案中，其他的治疗剂以肠胃外(例如中央静脉导管、动脉内、静脉内、肌肉内、腹膜内、皮内或皮下注射)、口服、胃肠道、局部、鼻咽和肺部(例如吸入或鼻内)给药。在一些实施方案中，其他治疗剂为皮质类固醇。
在一些实施方案中，与单独给药TLR抑制剂或其他的治疗剂时给药的有效量相比，TLR抑制剂与一种或多种其他治疗剂的组合会降低达到相同结果所给药的TLR抑制剂和/或一种或多种其他的治疗剂的有效量(包含但不限于给药的剂量体积、剂量浓度和/或总的药品剂量)。在一些实施方案中，与单独给药皮质类固醇相比，TLR抑制剂与皮质类固醇的组合会降低给药的皮质类固醇的有效量。在一些实施方案中，与单独给药的其他治疗剂相比，TLR抑制剂与其他的治疗剂的组合会降低治疗剂的给药频率。在一些实施方案中，与单独给药其他的治疗剂相比，TLR抑制剂与其他治疗剂的组合会降低总的治疗持续时间。在一些实施方案中，TLR抑制剂与其他的治疗剂的组合会降低与单独给药其他的治疗剂有关的副作用。在一些实施方案中，其他的治疗剂为皮质类固醇。在一些实施方案中，皮质类固醇为氟氢可的松或其衍生物、前药、异构体或类似物。在一些实施方案中，皮质类固醇为氟氢可的松。在一些实施方案中，与单独的有效量的TLR抑制剂或其他的治疗剂相比，有效量的TLR抑制剂与其他的治疗剂的组合是更有效的。
此外，TLR抑制剂还可以用作疫苗佐剂，以用于与调控体液和/或细胞介导的免疫应答的任何材料联合使用，其中所述的材料例如为：活病毒、细菌或寄生虫免疫原；灭活的病毒、肿瘤衍生的、原生动物、有机体衍生的、真菌或细菌的免疫原，类毒素，毒素；自体抗原；多糖；蛋白质；糖蛋白；肽；细胞疫苗；DNA疫苗；重组蛋白质；糖蛋白；肽等。在一些方面中，组合治疗包含但不限于TLR抑制剂与疫苗的组合用于治疗自体免疫疾病或炎性紊乱。在一些方面中，组合治疗包含但不限于TLR抑制剂与疫苗的组合用于治疗传染病。
在一些实施方案中，组合治疗包含但不限于TLR抑制剂和皮质类固醇 的组合用于治疗自体免疫疾病或炎性紊乱。在一些实施方案中，自体免疫疾病选自但不限于类风湿性关节炎,系统性红斑狼疮,自体免疫皮肤病,多发性硬化,胰腺炎,血管球性肾炎,肾盂炎,硬化性胆管炎和I型糖尿病。在一些实施方案中，自体免疫疾病为Sjogren病。
V.试剂盒、小瓶和单位剂型
此外，本文还提供了包含TLR抑制剂的试剂盒以及用于抑制TLR7-,TLR8-和/或TLR9依赖的免疫应答的方法中的说明书。
所述的试剂盒可以包含：装有TLR抑制剂(或包含TLR抑制剂的配制物)的一个或多个容器；以及一套说明书，其通常是书面说明书，但是具有说明书的电子储存介质(例如磁盘或光盘)也是可以接收的，所述的说明书涉及TLR抑制剂或配制物用于预期治疗的用途和剂量(例如压制对TLR7,TLR8和/或TLR9激动剂的应答，压制TLR7依赖的,TLR8依赖的和/或TLR9依赖的免疫应答，减轻自体免疫疾病的一种或多种症状，减轻慢性炎性疾病的的症状，减少响应于病毒的细胞因子的生产，和/或治疗和/或预防由TLR7,TLR8和/或TLR9介导的疾病或紊乱的一种或多种症状)。试剂盒中含有的说明书通常包含关于用于预期治疗的剂量、定量给药时间表和给药途径的信息。用于TLR抑制剂(或者包含TLR抑制剂的配制物)的容器可以是单位剂量、整体剂量(例如多剂量包装)或亚单位剂量。所述的试剂盒可以进一步包含装有佐剂的容器。
试剂盒的容器可以包含至少一个小瓶、试管、烧瓶、瓶、注射器或其他容器，其中可以放置成分，并且优选的是适量等分的。在试剂盒中具有多于1种成分的情况下，所述的试剂盒可以包含第二、第三或其他额外的容器，这些容器中可以分开放置其他的成分。但是，多种成分的多种组合可以包含在小瓶中。此外，试剂盒通常还以紧密限制的方式包含用于装有所述容器的部件以用于市场上出售。此类容器可以包含喷射成型或吹气成型的塑料容器，其中容纳有所需的小瓶。
当试剂盒的成分在一种和/或多种液体溶液中提供时，液体溶液为水性溶液，并且无菌的水洗溶液是特别优选的。此外，试剂盒的成分还可以以干燥粉末(多种)的形式提供。当试剂和/或成分以干燥粉末的形式提供时，可以通过加入合适的溶剂来再构建粉末。可以预见的是所述的溶解还可以 在另一个容器手段中提供。
试剂盒的TLR抑制剂配制物成分可以包装在任何方便合适的包装中。例如如果TLR抑制剂为冻干配制物，则通常使用具有回弹瓶塞的小瓶，这样可以通过将流体注射通过回弹瓶塞来再构建TLR抑制剂。具有非回弹且可移动的封闭(例如密封的玻璃)的安瓿或回弹瓶塞最方便地用于注射形式的TLR抑制剂。此外，当试剂盒与TLR抑制剂的液体配制物一起提供时，可以使用预充满的注射。所述的试剂盒在合适的包装中在用于局部配制物的软膏中可以包含TLR抑制剂。此外，还考虑了与特定的装置组合使用的包装，其中所述的装置例如为吸乳入器、鼻腔给药装置(例如喷雾器)、经皮给药装置或灌注装置(例如小型泵)。
试剂盒可以包含用于使用试剂盒成分以及使用未装在试剂盒中的任何其他试剂的说明书。说明书可以包含可以实施的实施方案。
此外，提供了包含本文所述的任意一种TLR抑制剂或配制物的小瓶(例如密封的小瓶)。在一些实施方案中，包含TLR抑制剂的小瓶与包含治疗剂的小瓶组合使用。一些实施方案中，其中试剂盒中提供所述的小瓶。
此外，提供了用于治疗和/或预防由TLR7,TLR8和/或TLR9介导的疾病或紊乱的剂型，该剂型包含本文所述的任意一种TLR抑制剂或配制物。在一些实施方案中，包含TLR抑制剂的单位剂型与治疗剂的单位剂型组合使用。在一些实施方案中，其中试剂盒中提供所述的剂型。
实施例
缩写：APS(抗磷脂综合征)；CT(阈值循环)；CTRL(对照)；DNA(脱氧核糖核酸)；ELISA(酶联免疫吸附测定)；FACS(荧光活化细胞分类计)；hTLR8Tg(人类TOLL样受体8转基因)；IC50(半数抑制浓度)；IIS(免疫抑制序列)；KO(敲除)；mcg或μg(微克)；MCTD(混合性结缔组织病)；MDC(髓系树突状细胞)；MOI(复合感染)；PBMC(外周血单核细胞)；PDC(浆细胞样树突状细胞)；PN(多核苷酸)；RA(类风湿性关节炎)；RNA(核糖核酸)；SF(滑液)；slanDC(6-磺基LacNAc树突状细胞)；TLR(TOLL样受体)；和WT(野生型)。
实施例1-TLR8的表达
在人类细胞亚群中分析TLR8的表达。根据制造商的说明书，通过磁珠手段(Miltenyi Biotech)来纯化浆细胞样树突状细胞(pDC),单核细胞,髓系树突状细胞(mDC),CD4+T细胞,CD8+T细胞和嗜中性粒细胞。根据制造商的说明书，使用micr RNA KIT(Qiagen)纯化RNA。使用SuperScript First-Strand Synthesis System(Invitrogen)由RNA生成cDNA。使用下式：相对CT＝1.8(AvgCTUbi–CTGene)*100,000(其中Avg CT Ubi为管家基因3个重复运行的平均CT，Avg CT Gene为所关注基因2个重复运行的平均CT，以及100,000为任意选择的因子，使所有的值都大于1)，将各基因的阈值循环(CT)值对管家基因Ubiquitin归一化。GENBANK编号No.NM_138636.4的人类TLR8编码序列设定为SEQ ID NO:1：
ATGGAAAACATGTTCCTTCAGTCGTCAATGCTGACCTGCATTTTCCTGCTAATATCTGGTTCCTGTGAGT 
TATGCGCCGAAGAAAATTTTTCTAGAAGCTATCCTTGTGATGAGAAAAAGCAAAATGACTCAGTTATTGC 
AGAGTGCAGCAATCGTCGACTACAGGAAGTTCCCCAAACGGTGGGCAAATATGTGACAGAACTAGACCTG 
TCTGATAATTTCATCACACACATAACGAATGAATCATTTCAAGGGCTGCAAAATCTCACTAAAATAAATC 
TAAACCACAACCCCAATGTACAGCACCAGAACGGAAATCCCGGTATACAATCAAATGGCTTGAATATCAC 
AGACGGGGCATTCCTCAACCTAAAAAACCTAAGGGAGTTACTGCTTGAAGACAACCAGTTACCCCAAATA 
CCCTCTGGTTTGCCAGAGTCTTTGACAGAACTTAGTCTAATTCAAAACAATATATACAACATAACTAAAG 
AGGGCATTTCAAGACTTATAAACTTGAAAAATCTCTATTTGGCCTGGAACTGCTATTTTAACAAAGTTTG 
CGAGAAAACTAACATAGAAGATGGAGTATTTGAAACGCTGACAAATTTGGAGTTGCTATCACTATCTTTC 
AATTCTCTTTCACACGTGCCACCCAAACTGCCAAGCTCCCTACGCAAACTTTTTCTGAGCAACACCCAGA 
TCAAATACATTAGTGAAGAAGATTTCAAGGGATTGATAAATTTAACATTACTAGATTTAAGCGGGAACTG 
TCCGAGGTGCTTCAATGCCCCATTTCCATGCGTGCCTTGTGATGGTGGTGCTTCAATTAATATAGATCGT 
TTTGCTTTTCAAAACTTGACCCAACTTCGATACCTAAACCTCTCTAGCACTTCCCTCAGGAAGATTAATG 
CTGCCTGGTTTAAAAATATGCCTCATCTGAAGGTGCTGGATCTTGAATTCAACTATTTAGTGGGAGAAAT 
AGCCTCTGGGGCATTTTTAACGATGCTGCCCCGCTTAGAAATACTTGACTTGTCTTTTAACTATATAAAG 
GGGAGTTATCCACAGCATATTAATATTTCCAGAAACTTCTCTAAACTTTTGTCTCTACGGGCATTGCATT 
TAAGAGGTTATGTGTTCCAGGAACTCAGAGAAGATGATTTCCAGCCCCTGATGCAGCTTCCAAACTTATC 
GACTATCAACTTGGGTATTAATTTTATTAAGCAAATCGATTTCAAACTTTTCCAAAATTTCTCCAATCTG 
GAAATTATTTACTTGTCAGAAAACAGAATATCACCGTTGGTAAAAGATACCCGGCAGAGTTATGCAAATA 
GTTCCTCTTTTCAACGTCATATCCGGAAACGACGCTCAACAGATTTTGAGTTTGACCCACATTCGAACTT 
TTATCATTTCACCCGTCCTTTAATAAAGCCACAATGTGCTGCTTATGGAAAAGCCTTAGATTTAAGCCTC 
AACAGTATTTTCTTCATTGGGCCAAACCAATTTGAAAATCTTCCTGACATTGCCTGTTTAAATCTGTCTG 
CAAATAGCAATGCTCAAGTGTTAAGTGGAACTGAATTTTCAGCCATTCCTCATGTCAAATATTTGGATTT 
GACAAACAATAGACTAGACTTTGATAATGCTAGTGCTCTTACTGAATTGTCCGACTTGGAAGTTCTAGAT 
CTCAGCTATAATTCACACTATTTCAGAATAGCAGGCGTAACACATCATCTAGAATTTATTCAAAATTTCA 
CAAATCTAAAAGTTTTAAACTTGAGCCACAACAACATTTATACTTTAACAGATAAGTATAACCTGGAAAG 
CAAGTCCCTGGTAGAATTAGTTTTCAGTGGCAATCGCCTTGACATTTTGTGGAATGATGATGACAACAGG 
TATATCTCCATTTTCAAAGGTCTCAAGAATCTGACACGTCTGGATTTATCCCTTAATAGGCTGAAGCACA 
TCCCAAATGAAGCATTCCTTAATTTGCCAGCGAGTCTCACTGAACTACATATAAATGATAATATGTTAAA 
GTTTTTTAACTGGACATTACTCCAGCAGTTTCCTCGTCTCGAGTTGCTTGACTTACGTGGAAACAAACTA 
CTCTTTTTAACTGATAGCCTATCTGACTTTACATCTTCCCTTCGGACACTGCTGCTGAGTCATAACAGGA 
TTTCCCACCTACCCTCTGGCTTTCTTTCTGAAGTCAGTAGTCTGAAGCACCTCGATTTAAGTTCCAATCT 
GCTAAAAACAATCAACAAATCCGCACTTGAAACTAAGACCACCACCAAATTATCTATGTTGGAACTACAC 
GGAAACCCCTTTGAATGCACCTGTGACATTGGAGATTTCCGAAGATGGATGGATGAACATCTGAATGTCA 
AAATTCCCAGACTGGTAGATGTCATTTGTGCCAGTCCTGGGGATCAAAGAGGGAAGAGTATTGTGAGTCT 
GGAGCTAACAACTTGTGTTTCAGATGTCACTGCAGTGATATTATTTTTCTTCACGTTCTTTATCACCACC 
ATGGTTATGTTGGCTGCCCTGGCTCACCATTTGTTTTACTGGGATGTTTGGTTTATATATAATGTGTGTT 
TAGCTAAGGTAAAAGGCTACAGGTCTCTTTCCACATCCCAAACTTTCTATGATGCTTACATTTCTTATGA 
CACCAAAGATGCCTCTGTTACTGACTGGGTGATAAATGAGCTGCGCTACCACCTTGAAGAGAGCCGAGAC 
AAAAACGTTCTCCTTTGTCTAGAGGAGAGGGATTGGGATCCGGGATTGGCCATCATCGACAACCTCATGC 
AGAGCATCAACCAAAGCAAGAAAACAGTATTTGTTTTAACCAAAAAATATGCAAAAAGCTGGAACTTTAA 
AACAGCTTTTTACTTGGCTTTGCAGAGGCTAATGGATGAGAACATGGATGTGATTATATTTATCCTGCTG 
GAGCCAGTGTTACAGCATTCTCAGTATTTGAGGCTACGGCAGCGGATCTGTAAGAGCTCCATCCTCCAGT 
GGCCTGACAACCCGAAGGCAGAAGGCTTGTTTTGGCAAACTCTGAGAAATGTGGTCTTGACTGAAAATGA 
TTCACGGTATAACAATATGTATGTCGATTCCATTAAGCAATACTAA
嗜中性粒细胞显示TLR8的表达水平最高，其后为单核细胞,mDC和CD4+T细胞(例如嗜中性粒细胞>>单核细胞>mDC>CD4+T细胞)。在pDC和CD8+T细胞中为检测到明显的TLR8的表达。
实施例2-在人类和小鼠细胞中使用了RNA多核苷酸(PN)的TLR7和TLR8的活性
之前描述了PN基TLR7配体稳定的免疫调节RNA(5’-URCURCUUCUR-/甘油/-RUCUUCRUCRU-5’，其中R＝7-脱氮鸟苷，在下文中“TLR7激动剂”列为SEQ ID NO:2-/甘油/-SEQ ID NO:117)和PN基TLR8配体稳定的免疫调节RNA(5’-M2UGCUGCUUGUG-/甘油/-GUGUUCGUCGUM2-5’，其中M2＝C6连接体，在下文中ORN8L或“TLR8激动剂”列为SEQ ID NO:3-/甘油/-SEQ ID NO:118)(Lan et al.,PNAS,104:13750-13755,2007)。通过测量人类外周血单核细胞(PBMC)和人类单核细胞中IL-6和TNF-α的生产来评价TLR7和TLR8刺激性RNAPN的作用。使用20μg/mL,100μg/mL或200μg/mL TLR8激动剂或TLR7激动剂来刺激由人类健康供者得到的大约5x105PBMC或2x105个单核细胞。24小时后，通过标准的ELISA过程，针对炎性细胞因子IL-6和TNF-α来评估上清液。TLR7和TLR8激动剂在PBMC中刺激了IL-6和TNF-α的生产，并且在单核细胞中的刺激作用较小。
此外，通过测量IL-6,TNF-α和IFN-α的生产，在人类pDC(其为TLR8阴性)中评价TLR7和TLR8刺激性RNAPN的作用。单独使用100μg/mL TLR8激动剂或TLR7激动剂(Lan et al.,PNAS,104:13750-13755,2007)、或者介质来刺激由人类健康供者得到的大约1x105个pDC。24小时后，通过标准的ELISA过程，针对炎性细胞因子IL-6,TNF-α和IFN-α来评估上清液。TLR7激动剂通过人类pDC刺激了IL-6,TNF-α和IFN-α的生产，但是TLR8激动剂不能。因此，TLR8激动剂对于TLR8是特异性的。
通过测量IL-12和TNF-α的生产，在小鼠细胞中进一步评价TLR7和TLR8刺激性RNAPN的作用。小鼠脾细胞和PBMC是由129S2/SvPasCrl野生型小鼠(Charles River Laboratories,Wilmington,MA)和TLR7KO小鼠制备得到的。使用100μg/mL TLR8激动剂或TLR7激动剂来刺激大约5x105个细胞。使用标准的技术，通过ELISA来测量IL-12和TNF-α。TLR7激动剂通过小鼠脾细胞和PBMC刺激了IL-12和TNF-α的生产，但是TLR8激动剂不能。
实施例3-TLR7、TLR8和TLR9特异性抑制的筛选检验
使用以下TLR7、TLR8和TLR9特异性筛选检验来评价测试多核苷酸(PN)的抑制活性。由最少3名供者得到的平均结果报告为细胞因子水平或抑制％。按以下计算抑制百分率：[1-(Ri/Ro)]x 100％，其中Ri＝用于测试PN+刺激剂的细胞因子水平，以及Ro＝仅刺激剂的细胞因子水平。
对于具有足够滴定点(在3个数量级上，最小通常为10)的检验，使用GraphPad Prizm 5软件来计算IC50值(半数抑制浓度)。由于这些检验使用了原代细胞，所以在对用于刺激的激动剂和TLR抑制剂的响应中，供者间存在一些变化。因此，在使用不同供者的检验之间进行定性比较的同时，仅针对使用相同一组供者测试的PN进行定量比较。
在人类浆细胞样树突状细胞(PDC)中TLR7特异性抑制的筛选检验
使用流感病毒毒株PR/8(ATCC)刺激的人类PDC通过生产IFN-α而应答。该应答取决于TLR7信号传递，并且与TLR8和TLR9无关。
使用由Melteni Biotec(编号No.130-090-532)得到的阳性选择试剂盒，根据制造商的说明书来分离人类PDC。在37℃下，在单独的完全培养基或者在测试PN存在下，使用热灭活的流感在复合感染(MOI)为2下对原代人 类PDC(3-5x 104细胞/孔)刺激18-24小时。测试多核苷酸的浓度范围为0.002μM至1μM，但是并非所有的浓度都用于所有的试验中。在18-24小时下，收集上清液，并通过ELISA测量IFN-α的生产。
在人类单核细胞中TLR8特异性抑制的筛选检验
使用TLR8特异性激动剂ORN8L刺激的人类单核细胞通过生产TNF-α,IL-1β和IL-6而应答。该应答取决于TLR8信号传递，并且与TLR7和TLR9无关。
使用由Stem Cell(编号No.14068)得到的阴性去除试剂盒，根据制造商的说明书来分离人类单核细胞。在37℃下，在单独的完全培养基或者在测试PN存在下，使用150μg/mL ORN8L对原代人类单核细胞(5x 105细胞/孔)刺激16-18小时。测试多核苷酸的浓度范围为0.002μM至1μM，但是并非所有的浓度都用于所有的试验中。在16-18小时下，收集上清液，并通过ELISA测量TNF-α,IL-1β和IL-6的水平。通过测量TNF-α,IL-1β和IL-6的水平而测定的PN的抑制应答显示相同的趋势，因此各试验未测量所有的细胞因子。
在人类B细胞和人类PDC中TLR9特异性抑制的筛选检验
在人类B细胞和/或人类PDC中进行TLR9特异性抑制的筛选检验。使用包含CpG的免疫刺激序列(ISS)刺激的人类B细胞通过生产IL-6而应答。该应答取决于TLR9信号传递，并且与TLR7和TLR8无关。使用包含CpG的免疫刺激序列(ISS)刺激的人类PDC通过生产IFN-α而应答。该应答取决于TLR9信号传递，并且与TLR7和TLR8无关。
使用由Miltenyi Biotec(编号No.130-050-301)得到的阳性选择试剂盒，根据制造商的说明书来分离人类B细胞。在37℃下，在单独的完全培养基或者在测试PN存在下，使用1μM TLR9L CpG-ISS 1018(5’-TGACTG TGA ACG TTC GAGATGA-3’列为SEQ ID NO:4)对原代人类B细胞(2x 105细胞/孔)刺激40-48小时。测试多核苷酸的浓度范围为0.03μM至2μM，但是并非所有的浓度都用于所有的试验中。在40-48小时下，收集上清液，并通过ELISA测量IL-6的生产。
使用由Melteni Biotec(编号No.130-090-532)得到的阳性选择试剂盒，根据制造商的说明书来分离人类PDC。在37℃下，在单独的完全培养基或 者在测试PN存在下，使用0.5μM TLR9L CpG-ISS C274(5’-TCG TCGAAC GTT CGA GAT GAT-3’列为SEQ ID NO:5)对原代人类PDC(3-5x 104细胞/孔)刺激18-24小时。测试多核苷酸的浓度范围为0.002μM至1μM，但是并非所有的浓度都用于所有的试验中。在18-24小时下，收集上清液，并通过ELISA测量IFN-α的生产。
实施例4-多核苷酸(PN)序列
表4-1示出了在本发明公开全文中所涉及的PN的序列。大写字母表示2’-脱氧核糖核苷酸(DNA)，小写字母表示2’-O-甲基核糖核苷酸(2’-OMe-RNA)。除非另作说明，核苷酸内的键均为磷硫酰。由TriLink Biotechnologies(San Diego,CA)，使用标准的固相DNA合成过程来合成PN。“I”表示2’-脱氧次黄苷。
表4-1.多核苷酸序列
SEQIDNO 产品NO 序列
6 C869 5’-TCC TGG AGG GGT TGT-3’
7 C954 5’-TGC TCC TGG AGG GGT TGT-3’
8 DV134 5’-ugc TGC TCC TTG AGG GGT Tgu uug u-3’
9 DV197 5’-ugc TGC TCC TTG AGI-3’
10 DVX1 5’-ugc TGC TCC TTG AGA-3’
11 DVX2 5’-ugc TGC TCC TTG AGT-3’
12 DVX3 5’-ugc TGC TCC TTG AGG-3’
13 DVX4 5’-ugc TGC TCC TTG AGC-3’
14 DVX5 5’-ugc TGC TCC TTG GGI-3’
15 DVX6 5’-ugC TGC TCC TTG AGI-3’
16 DVX7 5’-uGC TGC TCC TTG AGI-3’
17 DVX8 5’-TGC TGC TCC TTG AGI-3’
18 DVX9 5’-ugc ugc TCC TTG AGI-3’
19 DVX10 5’-ugc TGC TGC TGC TGC-3’
20 DVX11 5’-ugc TGC TCC TTG AGI T-3’
21 DVX12 5’-ugc TGC TCC TTG AGI TT-3’
22 DVX13 5’-ugc TGC TCC TTG AGI TTT-3’
23 DVX14 5’-ugc TGC TCC TTG AG-3’
24 DVX15 5’-ugc TGC TCC TTG A-3’
25 DVX16 5’-ugc TGC TCC TTG -3’
26 DVX17 5’-ugc TIC TCC TTI AII-3’
27 DVX18 5’-ugc TGC TCC TTG AGu-3’
28 DVX19 5’-ugc TGC TCC TTG agu-3’
29 DVX20 5’-UGC UGC UUG UG-3’
30 DVX21 5’-TGC TGC TGG TTG TGI-3’
 
SEQIDNO 产品NO 序列
31 DVX22 5’-ucc TGC TCC TTG AGI-3’
32 DVX23 5’-uuu TGC TCC TTG AGI-3’
33 DVX24 5’-uuu uuu TCC TTG AGI-3’
34 DVX25 5’-ugc ugc ucc uug agI-3’
35 DVX26 5’-TGC TCC TTG AGI-3’
36 DVX27 5’-TIC TGC TCC TTG AGI-3’
37 DVX28 5’-TAC TGC TCC TTG AGI-3’
38 DVX29 5’-TTC TGC TCC TTG AGI-3’
39 DVX30 5’-TCC TGC TCC TTG AGI-3’
40 DVX31 5’-TGC TIC TCC TTI AII-3’
41 DVX32 5’-TGC TAC TCC TTA AAA-3’
42 DVX33 5’-TGC TTC TCC TTT ATT-3’
43 DVX34 5’-TGC TCC TCC TTC ACC-3’
44 DVX35 5’-TIC TIC TCC TTI AII-3’
45 DVX36 5’-TAC TAC TCC TTA AAA-3’
46 DVX37 5’-TTC TTC TCC TTT ATT-3’
47 DVX38 5’-TCC TCC TCC TTC ACC-3’
48 DVX39 5’-TIC TCC TTG AGI-3’
49 DVX40 5’-TAC TCC TTG AGI-3’
50 DVX41 5’-TTC TCC TTG AGI-3’
51 DVX42 5’-TCC TCC TTG AGI-3’
52 DVX43 5’-TAC TCC TTI AII-3’
53 DVX44 5’-TAC TCC TTA AII-3’
54 DVX45 5’-TAC TCC TTA AAI-3’
55 DVX46 5’-TIC TCC TTI AAI-3’
56 DVX47 5’-TIC TCC TTI AIA-3’
57 DVX48 5’-TIC TCC TTI AAA-3’
58 DVX49 5’-TIC TCC TTI IAI-3’
59 DVX50 5’-TIC TCC TTA IIA-3’
60 DVX51 5’-TIC AGI TTI AII-3’
61 DVX52 5’-TIC AGI AGI AII-3’
62 DVX53 5’-TIC TIC TII TTI AII-3’
63 DVX55 5’-TIC TCC TTI AII-3’
64 DVX56 5’-TIC TCC TTI III-3’
65 DVX57 5’-TIC TCC TTI CII-3’
66 DVX58 5’-TIC TCC TTI GII-3’
67 DVX59 5’-TIC TCC TTI TII-3’
68 DVX60 5’-TCC TTI AII-3’
69 DVX61 5’-TTI AII-3’
70 DVX64 5’-TAC TCC III AII-3’
71 DVX65 5’-TAC TCC CCI AII-3’
72 DVX66 5’-TAC TCC GGI AII-3’
 
SEQIDNO 产品NO 序列
73 DVX67 5’-TAC TCC AAI AII-3’
74 DVX68 5’-TAC TCC TTI AIG-3’
75 DVX69 5’-TAC TCC TTI AIT-3’
76 DVX70 5’-TAC TCC TTI AIC-3’
77 DVX71 5’-TAC TCC TTC AII-3’
78 DVX72 5’-TAC TCC TTT AII-3’
79 DVX73 5’-TAC TCC TTC CII-3’
80 DVX74 5’-TAC TCC TTT TII-3’
81 DVX75 5’-TAC TCC TTG GII-3’
82 DVX76 5’-TAC TCC TTI ACI-3’
83 DVX77 5’-TAC TCC TTI ATI-3’
84 DVX78 5’-CCC CCC TTI AII-3’
85 DVX79 5’-TIC TIC TCC TII TTI CII-3’
86 DVX80 5’-TIC TIC TCC AGI TTI CII-3’
87 DVX81 5’-TIC TIC TCC TCC TTI CII-3’
88 DVX82 5’-TIC TIC TTG AGI TTI CII-3’
89 DVX83 5’-TCC TIC TCC AGI TTI CII-3’
90 DVX85 5’-TIC TIC TCC TCC TTI CIIAII-3’
91 DVX86 5’-TIC TCC TCC TTI CII AII-3’
92 DVX87 5’-TGC TCC TCC TTI CII AII-3’
93 DVX88 5’-TGC TTG TCC TCC TTI CII-3’
94 DVX89 5’-TGC TGC TCC TTI CII-3’
95 DVX90 5’-TIC TIC TCC TTI CII-3’
96 DVX91 5’-TAC TAC TCC TTI CII-3’
97 DVX92 5’-TTC TTC TCC TTI CII-3’
98 DVX93 5’-TCC TCC TCC TTI CII-3’
99 DVX94 5’-TIC TCC TCC TTI CII AIIA-3’
100 DVX95 5’-TGC TCC TGG AGG TTI CII-3’
101 DVX96 5’-TGC TCC TGG AGG TTI CIIAII-3’
102 DVX97 5’-TGC TCC TGG ATT ICI IAII-3’
103 DVX98 5’-TIC TIC TTG AGI TTI CIIAII-3’
104 DVX99 5’-TIC TTG AGI TTI CII AII-3’
105 DVX100 5’-TGC TIC TTG AGI TTI CIIAII-3’
106 DVX101 5’-TGC TTG AGI TTI CII AII-3’
107 DVX102 5’-TCC TCC TTG AGI AII-3’
108 DVX103 5’-TIC TCC TTG AGI AII-3’
109 DVX104 5’-TIC TCC TCC TTG AGI AII-3’
110 DVX105 5’-TIC TTC TCC TTG AGI AII-3’
111 DVX106 5’-TIC TCC TCC TTG IIA II-3’
112 DVX107 5’-TCC TGG AGG GGT TIA II-3’
113 DVX108 5’-TGC TCC TGG AGG GGT TIAII-3’
114 DVX109 5’-TIC TCC TCC TTG GGI AII-3’
 
SEQIDNO 产品NO 序列
115 DVX110 5’-TIC TTC TCC TTG GGI AII-3’
116 DV185 5’-ugc TGC TCC TTG AGI GGT TGT TTG T-3’
实施例5-TLR7抑制剂不能一定抑制TLR8
在实施例3所述的TLR7和TLR8特异性抑制检验中测试已知的TLR7抑制剂。如所预计的那样，浓度为30nM的C954,DV197和DV134均显示良好地抑制了PDC中TLR7介导的IFN-α的生产，其中所述的PDC是使用灭活流感病毒以MOI为2而刺激的(图1A和1B)。但是，在使用ORN8L刺激的单核细胞中，仅DV197显示良好地抑制了TLR8介导的TNF-α和IL-1β的生产(图2A和2B)。之前，5’-TGC和5’-ugc被报告为TLR7/8抑制基序(例如参见美国公开No.2007/0238678和美国公开No.2011/0003885)。此外，3’-GT和3’-gu(其中G为鸟嘌呤或7-脱氮鸟苷)之前被报告为TLR8抑制基序(例如参见美国公开No.2005/0239733)。因此，出人意料的得知在本发明公开的研发过程中，这些推定的TLR8基序不足以用于TLR的8抑制。具体而言，DV197(但非C954,DV134和DVX10)在PN的3’末端包含3’-GI。因此，如本文所证明的那样，3’-GT和3’-gu不足以用于TLR8的抑制。此外，尽管DV197,C954,DV134和DVX10都包含5’-TGC或5’-ugc，但是仅DV197为有效的TLR8抑制剂(图3A和3B)。因此，如本文所证明的那样，5’-TGC或5’-ugc不足以用于TLR8的抑制。
实施例6-在人类TLR8转基因小鼠中，DV197体内抑制TLR8的活化
按照之前所述(国际申请No.PCT/US2012/031307)形成人类TLR8转基因小鼠。Clone 8的嵌合小鼠(其具有1-2个拷贝的整合至基因组中的hTLR8)能够繁殖并传代种系传递。因此，TLR8Tg Clone 8小鼠用于进一步研究。
使用单独的300mcg ORN8L(TLR8激动剂)或与DV197(100mcg)(其通过皮下给药)组合静脉注射TLR8Tg Clone 8小鼠。在6小时后，释放小鼠血液，并通过ELISA测量IL-12。如图4所示，DV197能够体内抑制TLR8的活化。
实施例7-3’-核苷酸的特性对于TLR8抑制活性是重要的
在如实施例3所述的TLR8特异性抑制检验中测试在3’末端包含A,T,G或C替代I的DV197类似物(分别为DVX1,DVX2,DVX3和DVX4)。如图5所示，3’-核苷酸对于TLR8抑制活性是重要的，并且3’-I或3’-A是 最具活性的。此外，DVX5(与DV197相似，DVX5在3’末端包含GGGI替代GAGI)还保留了TLR8抑制活性(在0.75μM下，达到～90％抑制)。
实施例8-DNA和嵌合2’-O-甲基RNA/DNA PN具有TLR8抑制活性
在实施例3所述的TLR8特异性抑制检验中，测试在5’末端包含不同量的2’-O-甲基RNA修饰的DV197类似物(DVX6,DVX7,DVX8,DVX9,DVX24,DVX25和DVX26)。如图6和图7所示，仅包含DNA核苷酸的DVX8和DVX26显示对于TLR8抑制活性，2’-O-甲基RNA不是必需的。此外，嵌合2’-O-甲基RNA/DNAPN具有TLR8抑制活性，但是完全修饰成2’-O-甲基RNA(如在DVX25中)会降低TLR8抑制活性。
实施例9-3’末端的加入和删除对TLR8抑制活性的影响
在实施例3所述的TLR8特异性抑制检验中，测试具有1,2或3个胸苷(T)核苷酸加入至3’末端(分别为DVX11,DVX12和DVX13)或者在3’末端具有1,2或3个核苷酸(DVX14,DVX15和DVX16)删除的DV197类似物。如图8所示，可以将1个(1)核苷酸加入至3’末端，并且TLR8抑制活性较少地损失。此外，删除系列证明对于TLR8抑制活性而言，3’-A优于3’-G(图8)。这些结果证明3’末端对于TLR8抑制活性是重要的。
实施例10-TLR8抑制基序的定义
对其他的PN进行设计以定义TLR抑制基序和多核苷酸的最小长度，以及识别最佳的TLR8抑制序列。在实施例3所述的TLR8特异性抑制检验中测试新的PN。结果概括于表10-1中。
表10-1.多核苷酸的TLR8抑制活性
在DV197或DVX8序列中使用I替代G使得PN具有相似的或增加的TLR8抑制活性。另一方面，在DVX8序列中具有A,C或T替代的PN是无活性的(图10和表10-1，试验A)。
包含5’-TIC,5’-TAC,5’-TTC或5’-TCC替代5’-TGC的DVX26类似物均显示相似的TLR8抑制活性，证明5’-TGC对于TLR8抑制不是必需的。这些结果还证明PN的5’末端对于TLR8抑制活性是不重要的(表10-1，试验B)。
此外，表10-1的试验C至G评价了3’末端的4个核苷酸对于TLR8抑制活性的重要性。这些结果结合在本发明公开的研发过程中形成的之前的观察显示在3’末端具有II,IA,GI或GA的PN具有良好的TLR8抑制活性。
表10-1的试验H至J评价了中部核苷酸对于TLR8抑制活性的重要性，同时在PN的3’末端保持II。在这些试验中测试的所有PN都具有TLR8抑制活性。
表10-1的试验K评价了PN保持TLR8抑制活性的最小长度。DVX61为在3’末端包含II的6-mer，其显示良好的TLR8抑制活性。
表10-1的试验L,N和O评价了在3’末端包含II的多种18-mer至21-mer的TLR8抑制活性。在本试验中测试的所有PN都具有良好的TLR8抑制活性。但是，观察到一些差异，表明PN中的其他核苷酸可以对TLR8抑制活性具有影响。此外，设计DVX86,DVX96,DVX97,DVX98,DVX99,DVX100和DVX101，使得PN在体内被3’-核酸外切酶降解时，TLR8抑制基序可以再生。例如这些PN的每一种在3’末端都具有序列5’-IIAII-3’。3’-核酸外切酶的依次降解会在PN的3’末端得到以下序列：5’-IIAI-3’,5’-IIA-3’和5’-II-3’。其中，除了5’-IIAI-3’以外的所有序列均为TLR8抑制基序。预计PN的TLR8抑制的半衰期比仅包含单一TLR8抑制基序的PN的半衰期更长，其中对PN进行设计，以便在3’-核酸外切酶的体内降解过程中使TLR8抑制基序再生。
表10-1的试验P和Q评价了包含TLR8抑制基序的其他多核苷酸的TLR8抑制活性。DVX102,DVX103,DVX104,DVX105,DVX106,DVX107,DVX108和DVX109均显示良好的TLR8抑制活性。
实施例11-仅具有TLR7抑制活性、仅具有LTR8抑制活性或具有TLR7/TLR8抑制活性的多核苷酸
如在本发明公开研发过程中测定的那样，TLR7和TLR8抑制基序是不同的。因此，PN可以通过包含或排除独特的基序而设计成仅具有TLR7、仅具有TLR8或TLR7/8抑制活性。为了证明这一点，在实施例3所述的TLR7特异性的和TLR8特异性的抑制检验中测试仅包含TLR7、仅包含TLR8或者TLR7和TLR8基序的PN。
如实施例5所述，包含TLR7但不包含TLR8抑制基序的C954和DV134仅具有TLR7抑制活性。表10-1和图9的试验M显示DVX89,DVX90和DVX92具有TLR7和TLR8抑制活性，而DVX91和DVX93仅具有TLR8抑制活性。相似地，表10-1和图1-的试验A和B显示DVX35具有TLR7和TLR8抑制活性，而DVX42仅具有TLR8抑制活性。由于DVX89,DVX90,DVX91,DVX92,DVX93,DVX35和DVX42都包含TLR8抑制基序(3’末端的II或GI)，所以预计TLR8抑制活性得以保留。相反，发现5’-TIC和5’-TTC为TLR7抑制基序。由于之前的工作描述了5’-TGC作为TLR7抑制基序，但是未描述5’-TIC或5’-TTC作为TLR7抑制基序，所以后来的观察是令人吃惊的。与使用非特异性TLR7/8激动剂R848刺激的小鼠脾细胞相反，在本发明公开的研发过程中部分通过使用选择性TLR7激动剂(流感病毒)刺激的人类PBMC，可以作出2种新的TLR7抑制基序的描述。这突出了测试TLR8抑制剂在表达人类TLR8的细胞中的重要性。
此外，包含TLR7和TLR8抑制基序(例如DV197和DVX81等)的其他PN还显示具有TLR7/8抑制活性(图1A,1B,2A,2B,11,21,22和23；以及表10-1试验L,N,O和P)。在TLR7抑制检验中，DVX81的IC50为12nM，在TLR8特异性抑制检验中，DVX81的IC50分别为26nM(TNFα)和58nM(IL-1β)。其他示例性TLR7/8抑制剂为：5’-TIC TCC TTG AGI AII-3’(DVX103；SEQ ID NO:108)；5’-TIC TCC TCC TTG AGI AII-3’(DVX104,SEQ ID NO:109)；5’-TIC TTC TCC TTG AGI AII-3’(DVX105,SEQ ID NO:110)；和5’-TIC TCC TCC TTG IIA II-3’(DVX106,SEQ IDNO:111)，如表10-1的试验P和图23中所示。
其他示例性仅LTR8抑制剂为：5’-TCC TCC TTGAGIAII-3’(DVX102；SEQ ID NO:107)，如表10-1的试验P和图22中所示。
如实施例3所述，在TLR9特异性抑制检验中，使用B细胞，通过评价DVX81来证明TLR7/8抑制活性的选择性。包含TLR7和TLR8抑制基序的C954用作阳性对照。如图12所示，DVX81不抑制TLR9。
实施例12-具有TLR8/9或者TLR7/8/9抑制活性的多核苷酸
由于TLR7,TLR8和TLR9抑制基序是不同的，所以还可以通过包含 或排除独特的基序来将PN设计成具有TLR8/9或TLR7/8/9抑制活性。为了证明这一点，在实施例3所述的TLR8特异性和TLR9特异性的抑制检验中测试包含TLR8和TLR9的PN。此外，还在实施例3所述的TLR7特异性、TLR8特异性以及TLR9特异性抑制检验中测试包含TLR7,TLR8和TLR9基序的PN。示例性TLR8/9抑制剂为：5’-TAC TCC TTG GII-3’(SEQ ID NO:81)；和5’-TCC TGGAGG GGT TIA II-3(SEQ ID NO:112)。示例性TLR8/9抑制剂为：5’-TAC TCC TTG GII-3’(SEQ ID NO:81)；和5’-TCC TGGAGG GGT TIA II-3(SEQ ID NO:112)。示例性TLR7/8/9抑制剂为：5’-ugc TGC TCC TTG GGI-3’(SEQ ID NO:14)；5’-TIC TCC TTI GII-3’(SEQ IDNO:66)；5’-TGC TCC TGGAGG GGT TIAII-3’(SEQ ID NO:113)；5’-TIC TCC TCC TTG GGIAII-3’(SEQ ID NO:114)；和5’-TIC TTC TCC TTG GGI AII-3’(SEQ IDNO:115)。
DVX107(SEQ ID NO:112)被设计为TLR8/9抑制剂，而DVX108(SEQ IDNO:113)被设计为TLR7/8/9抑制剂。在实施例3所述的LTR8特异性和TLR9特异性抑制检验中测试PN。表10-1的试验Q的结果显示所述的2种PN均抑制TLR8。图37中的结果显示DVX107和DVX108还抑制TLR9。此外，DVX108包含5’-TGC基序，已知其抑制TLR7(参见实施例11)。
实施例13-使用RA患者血浆刺激健康PBMC是TLR7/8依赖性的
在浓度为1毫摩尔的TLR抑制剂缺乏或存在下，将由3名健康供者得到的大约7x105PBMC个细胞与200μL培养基温育，其中所述的培养基具有由3名类风湿性关节炎(RA)患者得到的30μL血浆或者由3名正常个体得到的血浆。在16-18hr后，通过ELISA针对IL-8浓度来评价上清液。所测试的抑制剂为DV197(TLR7/8抑制剂)和DVX42(仅TLR8抑制剂)。
如图13所示，由RA患者得到的血浆刺激了IL-8，而由正常个体得到的血浆未刺激IL-8。由RA患者血浆产生的IL-8的刺激被DV197和DVX42所抑制。包含TLR7和TLR8抑制基序的DV197比DVX42抑制IL-8分泌的程度更高。这些结果证明使用RA患者血浆刺激健康PBMC是TLR7和TLR8依赖性的。
如上文所述实施第二个研究，不同之处在由8名单个的RA患者得到的血浆用于刺激，并将DVX81(TLR7/8抑制剂)用作抑制剂。结果取平均 值，并使用Wilcoxon配对t检验看来测定p值。如图14所示，双重TLR7/8抑制剂DVX81抑制了RA血浆刺激的IL-8的分泌(由PBMC分泌)。健康患者的血浆不刺激IL-8(数据未示出)。
实施例14-使用由RA患者得到的SF刺激人类单核细胞是TLR7/8依赖性的
使用阴性选择试剂盒(Stem Cell,编号No.14068)，根据制造商的说明书由白细胞层分离未触碰的CD14+单核细胞。纯度通常超过98％。在由类风湿性关节炎(RA)患者得到的单独的15％滑液(SF)存在下或者与DV197(1μM)组合，在完全培养基(RPMI,10％FBS)中温育大约3x105个细胞。所述的滑液得自ProteoGenex(Culver City,CA)。在14-16小时后，通过Milliplex(Millipore)检验上清液的细胞因子水平。数据单独表示为滑液的细胞因子水平的百分率，并且各细胞因子的平均水平在SF柱上方表示。数据为在至少3名独立的健康单核细胞供者上测试的7种滑液的累积。使用Wilcoxon配对符号秩检验测定p值。
如图15所示，由RA患者得到的SF刺激了G-CSF,IL-1β,IL-6,IP-10,TNF-α和VEGF的生产，并且SF刺激的细胞因子的生产可以被TLR7/8抑制剂DV197抑制。
实施例15-在人类TLR8转基因小鼠中，DVX81体内抑制了TLR8活化
在hTLR8Tg Clone 8小鼠中，体内评价DVX81的活性。向hTLR8Tg Clone 8小鼠单独静脉注射220mcg ORN8L，或者与DVX81(100mcg)组合(也是静脉内给予)。在2小时或过夜(O/N)后，通过ELISA测量TLR8介导的IL-12诱导的影响。如图16所示，DVX81能够体内抑制TLR8活化。
实施例16-在多核苷酸存在下培养人类B细胞
通过针对IL-6的检验来测定多核苷酸对非特异性人类B细胞活性的影响。磷硫酰修饰的寡脱氧核苷酸由于磷硫酰键而在体外诱导了一些人类B细胞的应答，但是在灵长动物中在体内未显示B细胞活化的证据。
就人类B细胞检验而言，使用磁珠(CD19阳性)，由得自健康供者的血细胞纯化B细胞。将细胞再次悬浮于新鲜的培养基(RPMI 1640，具有10％胎牛血清,50单位/mL青霉素,50μg/mL链霉素和2mM谷氨酰胺)中。然后，将细胞与0.015μM至4.0μM所示的多核苷酸温育。48小时后，收集上清液，并通过免疫测试来测量IL-6。所测试的多核苷酸为C954,DV185, DVX81,DVX82,DVX98,DVX99,DVX42,DVX102和DVX103。已知C954会刺激低水平的IL-6，并且已知DV185会刺激高水平的IL-6。由各多核苷酸诱导的IL-6的量除以由C954诱导的IL-6的量，从而测定相对C954而言IL-6诱导的数量级。
图17、图18和图19显示不同的多核苷酸诱导人类B细胞产生一定范围的IL-6应答。如所预计的那样，DV185比C954明显诱导更多的IL-6。惊人的是，尽管DVX82与DVX81具有相同的TLR7/8基序、核苷酸内磷硫酰键和一定数量的核苷酸，但是DVX82比DVX81诱导了明显更少的IL-6。DVX82,DVX98,DVX99,DVX42,DVX102和DVX103诱导人类B细胞产生低水平的IL-6。仅最低程度地活化人类B细胞的多核苷酸优选地包含在用于抑制TLR7,TLR8和/或TLR9介导的应答的组合物中以及包含在用于治疗或预防自体免疫疾病或炎性紊乱的药剂中。
实施例17-在多核苷酸存在下培养的大鼠脾细胞
收获由8-9周龄的雌性Sprague Dawley大鼠得到的脾细胞，并迫使消化的片段通过金属筛来进行机械分散。通过离心使分散的脾细胞形成团，然后再次悬浮于新鲜的培养基(RPMI 1640，具有10％胎牛血清,加上50单位/mL青霉素,50μg/mL链霉素和2mM谷氨酰胺以及0.05mMβ-巯基乙醇)中。然后，将细胞与0.06μM至4.0μM的各种多核苷酸温育。48小时后，收集上清液，并通过免疫测试来测量IL-6。所测试的多核苷酸为C954,DV185,DVX81和DVX82。已知C954会刺激低水平的IL-6，并且已知DV185会刺激高水平的IL-6。由各多核苷酸诱导的IL-6的量除以由C954诱导的IL-6的量，从而测定相对C954而言IL-6诱导的数量级。
图20显示不同的多核苷酸诱导大鼠脾细胞产生一定范围的IL-6应答。使用大鼠脾细胞获得的结果与使用人类B细胞获得的结合相一致。仅最低程度地活化大鼠脾细胞的多核苷酸优选地包含在用于抑制TLR7,TLR8和/或TLR9介导的应答的组合物中以及包含在用于治疗或预防自体免疫疾病或炎性紊乱的药剂中。
实施例18-在小鼠中，具有TLR7抑制基序的多核苷酸体内抑制了TLR7介导的免疫应答
向29S2/SvPasCrl小鼠单独地静脉注射250mcg ORN7配体(TLR7激动 剂)，或者与C954,DVX82,DVX98或DVX99(100mcg)组合(皮下给予)。2小时后，释放小鼠血液，并通过ELISA测量IL-12。如图24所示，C954,DVX82,DVX98和DVX99能够体内抑制TLR7介导的IL-12诱导。
类似地，向129S2/SvPasCrl小鼠单独地静脉注射250mcg ORN7配体(TLR7激动剂)，或者与DVX103,DVX104或DVX99(100mcg)组合(皮下给予)。6小时后，释放小鼠血液，并通过ELISA测量IL-12。如图25所示，DVX103,DVX104和DVX99能够体内抑制TLR7介导的IL-12诱导。
实施例19-具有TLR抑制基序的多核苷酸未显示脱靶效应
测试多核苷酸DVX36(无TLR7,TLR8或TLR9基序),DVX98(TLR7/8基序),DVX102(TLR8基序),DVX103(TLR7/8基序)和C954(TLR7/9基序)的脱靶效应。使用方法，由健康供者的总的血细胞分离人类PBMC。将细胞再次悬浮于新鲜的培养基(RPMI 1640，具有10％胎牛血清,50单位/mL青霉素,50μg/mL链霉素和2mM谷氨酰胺)中。
为了测试所述的多核苷酸对TLR4信号传递的影响，单独使用5μg/ml脂多糖(LPS)，或者与1μM或4μM所关注的多核苷酸组合来刺激人类PBMC。24小时后，收集上清液，并通过免疫测试来测量IL-6。DVX36,DVX98,DVX102,DVX103和C954未抑制TLR4介导的IL-6的生产(由LPS刺激的)。
为了测试所述的多核苷酸对TLR2/1信号传递的影响，单独使用0.1μg/ml PAM3CSK4(合成的三酰化的脂蛋白)，或者与1μM或4μM所关注的多核苷酸组合来刺激人类PBMC。24小时后，收集上清液，并通过免疫测试来测量IL-6。DVX36,DVX98,DVX102,DVX103和C954未抑制TLR2/1介导的IL-6的生产(由PAM3CSK4刺激的)。
为了测试所述的多核苷酸对TLR5信号传递的影响，单独使用1μg/ml鞭毛蛋白，或者与1μM或4μM所关注的多核苷酸组合来刺激人类PBMC。24小时后，收集上清液，并通过免疫测试来测量IL-6。DVX36,DVX98,DVX102,DVX103和C954未抑制TLR5介导的IL-6的生产(由鞭毛蛋白刺激的)。
为了测试所述的多核苷酸对视黄酸诱导的基因1(RIG-I)的影响，单独使用1至100倍稀释的Sendai病毒(SeV)，或者与1μM或4μM所关注的 多核苷酸组合来刺激3x105个单核细胞。24小时后，收集上清液，并通过免疫测试来测量IFN-α。DVX36,DVX98,DVX102,DVX103和C954未抑制RIG-I介导的IFN-α的生产(由SeV刺激的)。
实施例20-向小鼠给药高剂量的多核苷酸
每周2次向BALB/c小鼠皮下给药高剂量(100mg/kg)的多核苷酸(C954,DVX82,DVX98,DVX99,DVX102和DVX103)，或者对照(生理盐水)，并持续2周(n＝6/组)。在第2、5、9和12天给药多核苷酸。如图26A和26B所示，给药前(第0天)和之后将小鼠称重。在研究结束时收获器官，并测定器官的重量。此外，对C954-,DVX99和DVX103治疗的小鼠进行肾脏的组织学评价。
使用DVX102,DVX103或C954治疗的小鼠未显示出体重变化或者体重稍微增加，而使用DVX82,DVX98或DVX99治疗的小鼠在研究过程中显示体重明显减少(图26)。使用C954,DVX102或DVX103治疗的小鼠显示正常，而使用DVX82,DVX98或DVX99治疗的小鼠在研究结束时显示稍微邋遢的，并且使用DVX98治疗的小鼠显示最差的影响。所有组中的小鼠的器官重量均为增加。但是，使用DVX82,DVX98或DVX99治疗的小鼠的肝脏和肾脏比正常小鼠发白。对于C954-,DVX99和DVX103治疗的小鼠，在表20-1中显示第15天与第1天相比肾小管改变的严重性得分以及重量改变的百分率的概括。记录所有检测动物的肾脏改变，并通过肾小管(主要位于囊下区域)改变来表征，其中所述的肾小管改变由以下组成：胞质空泡变性；在肾小管腔中非结晶的嗜酸性粒细胞物质的存在；受影响的细胞的核轻微膨大伴有轻微的着色改变。在接受生理盐水的小鼠中，肾小管改变最小(1.0)，而在所有其他的组中，肾小管改变轻微增加。
表20-1.多核苷酸治疗的小鼠的肾小管和体重改变的概括
实施例21-向大鼠给药高剂量的多核苷酸
在第0,4,7和11天，向8-9周龄的雌性Sprague Dawley大鼠(n＝5/组)皮下给药剂量为85mg/kg或25mg/kg的多核苷酸(C954,DVX103或DVX104)，或者对照(生理盐水)。如图27A和27B所示，在第0天给药前和之后将大鼠称重。在研究结束时收获器官，并测定器官的重量。此外，进行肝脏、肾脏和心脏的组织性评价。
在使用25mg/kg C954,DVX103和DVX104，85mg/kg C954或生理盐水治疗的大鼠中观察到体重增加。使用85mg/kg DVX103或DV104治疗的大鼠显示体重未发生整体改变。这与在使用90mg/kg DV185治疗的大鼠中观察到的体重明显减轻相反(图28)。在使用25mg/kg或85mg/kg C954,DVX103或DVX104治疗的小鼠中，肝脏、肾脏、脾或心脏的器官重量不具有明显的差异。
表21-1中示出了肝脏、肾脏和心脏的组织性评价的概括。器官的组织病理学证明肾脏为靶器官。在大多数组中，对中度的肾小管改变评分。最高剂量的C954组织学显示中度的改变(严重性得分为2)。
表21-1.在多核苷酸治疗的大鼠中组织学检查发现的概括
()＝平均严重性得分；0＝无改变；1＝最小；2＝轻微；3＝中度；4＝严重
实施例22-在人类TLR8转基因小鼠的胰腺中，TLR7/8抑制剂降低炎症基因的表达
实施例6中所述的人类TLR8Tg Clone 8小鼠发展成胰腺炎，部分如胰腺中高水平表达的炎症基因所述。在尸体检查时分离胰腺，并使用Qiagen Midi Rneasy提取试剂盒，根据制造商的说明书来分离RNA。使用SuperScriptFirst-Strand Synthesis System(Invitrogen)由RNA生成cDNA，并使用TAQMAN检验来评价基因表达的水平。图29示出了在由人类TLR8Tg Clone 8小鼠得到的胰腺中，hTLR8,mIFN-γ,mTNF-α,mIL-18,mIL-12p40,mIL-1α,mMMP9和mIP-10水平的(CT)比野生型小鼠增加。
每周2次向70-80天大的人类TLR8Tg Clone 8小鼠注射2.2mg/kg DVX82,DVX99或PBS，并持续5周。如图29所示，DVX82和DVX99均能够降低人类TLR8Tg Clone 8小鼠胰腺中过表达的炎症基因的水平。此外，使用DVX82或DVX99治疗的人类TLR8Tg Clone 8小鼠的胰腺显示疾病得分相对于使用PBS治疗的小鼠而言有所降低(图30)。
在第二个试验中，每周1次向60-67天大的人类TLR8Tg Clone 8小鼠注射1mg/kg或5mg/kg DVX103，或者生理盐水，并持续10周。图31示出了与使用DVX103治疗后的野生型小鼠和人类TLR8Tg Clone 8小鼠相 比，在人类TLR8Tg Clone 8小鼠胰腺中mIFN-γ,mIL-1α,mIL-23,mIL-1β,mLT-α,mIL1-RA,mMMP-1,mMMP-9,mMMP-7,mMMP-10,hTLR8,mCD4,mCD8和mCD11β的相对水平。如图31所示，DVX103能够降低在人类TLR8Tg Clone 8小鼠的胰腺中表达的炎症基因的水平。
实施例23-TLR7/8抑制剂降低了人类单核细胞中由抗LBPA诱导的炎性细胞因子
抗磷脂综合征(APS)表征为抗磷脂抗体，其包含定向对抗磷脂相关蛋白质的抗体，例如心磷脂、β2-糖蛋白-1和内涵体脂质lysobisphosphatidic acid(LBPA)。使用0.1μg/mL,0.5μg/mL,1μg/mL或5μg/mL市售可得的抗LBPA抗体(Clone 6C4；Echelon)来刺激原代人类单核细胞(Kobayashi et al,Nature,392:193-197,1998)。6小时或过夜(ON)后，收集上清液，并通过ELISA测量TNF-α和IL-6的水平。图32A和32B示出抗LBPA诱导了人类单核细胞生产炎性细胞因子TNF-α和IL-6。
在第二个试验中，单独使用1μg/mL Clone 6C4抗LBPA抗体，或者与1毫摩尔DVX82(示例性TLR7/8抑制剂)组合来刺激原代人类单核细胞。在过夜温育后，收集上清液，并通过ELISA测量TNF-α和IL-6的水平。这些结果显示抗LBPA刺激至少部分是TLR7/8依赖性的。
实施例24-使用由患有混合性结缔组织病的患者得到的血清来刺激健康的PBMC
患有混合性结缔组织病(MCTD)的患者具有高水平的U1-RNP自身抗体，其为PDC中TLR7和单核细胞中TLR8的有效活化剂(Kattah et al.,Immunol Rev,233:126–145,2010；and Vollmer et al.,J Exp Med,202:1575-1585,2005)。
在TLR抑制剂缺乏或存在下，将由健康供者得到的大约7x105PBMC细胞或3x105单核细胞在200μL培养基中温育，其中所述的培养基具有由患有MCTD的患者得到的30μL血清或由正常个体得到的血清。通过ELISA针对IFN-α,TNF-α,IL-6,IL-1β和/或IL-8浓度(多个)来评价上清液。预计由MCTD患者得到的血清会刺激细胞因子的生产，而由正常个体得到的血清则不会。此外，预计MCTD血清诱导的细胞因子的生产将被TLR7和/或TLR8抑制剂抑制。
实施例25-使用由患有Sjogren综合征的患者得到的血浆或血清来刺激健康的PBMC
Sjogren综合征为慢性自体免疫疾病，其可表征为外分泌腺内程序性单核细胞浸润。口(口腔干燥)和眼(角膜结膜炎)的干燥是影响这些患者的主要器官相关性临床特征。Sjogren综合征可表征为存在RNP自身抗体，例如抗Ro/SSA和抗La/SSB。Sjogren综合征与PDC的TLR7活化以及通过浸润PDC而产生的I型IFN的增加明显相关(et al.,Arthritis Rheum 2005,52:1185–95,2005；and Gottenberg et al.,Proc NatlAcad Sci USA,103:2770–5,2006)。此外，抗Ro/SSA和抗La/SSB自身抗体还活化TLR8。事实上，TLR8在这些患者的唾液腺中还是过表达的。
在TLR抑制剂缺乏或存在下，将由健康供者得到的大约7x105PBMC细胞或3x105单核细胞在200μL培养基中温育，其中所述的培养基具有由患有Sjogren综合征的患者得到的血浆或血清，或者由正常个体得到的血浆或血清。通过ELISA针对IFN-α,TNF-α,IL-6,IL-1β和/或IL-8浓度(多个)来评价上清液。预计由Sjogren综合征患者得到的血浆或血清会刺激细胞因子的生产，而由正常个体得到的血浆或血清则不会。此外，预计Sjogren综合征相关的细胞因子的生产将被TLR7和/或TLR8抑制剂抑制。
实施例26-测定TLR抑制剂对TLR8介导的唾液腺炎症以及胰腺、肾脏和关节疾病的影响
人类TLR8Tg Clone 12小鼠表达高水平的人类TLR8，并发展成自发性严重的唾液腺炎症，以及胰腺、肾脏和关节疾病。人类TLR8Tg Clone 8表达低水平的人类TLR8，并且还发展成自发性胰腺和唾液腺炎症，但是其他器官没有被显著的影响。使用明确的治疗时间表向人类TLR8Tg Clone 12或Clone 8注射多个剂量的TLR7和/或TLR8和/或TLR9抑制剂，或PBS。使用TAQMAN来测定唾液腺、肾脏和/或关节中的炎症基因的水平。可以监测的基因包含IL-1β,IL-6,IL-10,TNF-α,IL1α,IL12p40,mTLR9,MAC1,TLR7,人类TLR8,IP-10,MMP9,IFN-g,MMP3,IL1-RAIL-23,Lta,MIP3a,MIP3B,MIG,MMP8,MMP10CD4,CD8,CCR2,CCR6,MPO,NOS2,MMP12,TLR2,MMP1和MMP7。预计TLR抑制剂治疗的hTLR8Tg Clone 12或Clone 8小鼠显示在靶器官中炎症基因的水平比在PBS治疗的 hTLR8Tg Clone 12或Clone 8小鼠中发现的水平降低。此外，预计由人类hTLR8Tg Clone 12或Clone 8小鼠(使用TLR抑制剂治疗)得到的靶器官的组织病理学显示疾病得分比仅使用PBS治疗的那些疾病得分降低。
实施例27-使用TLR7,TLR8和/或TLR7/8抑制剂抑制TLR7/8介导的对6-SulphoLacNAc树突状细胞的刺激
6-Sulpho LacNAc树突状细胞(slanDC)在人类血液中构成了主要的树突状细胞(DC)，并且是高度促炎的，其可表征为生产TNF-α,IL-23,IL-6,IL-1α和I-1β的能力(Schakel et al.,Immunity,25:767,2006)。在红肿的组织中，SlanDC会快速补充(Hansel et al.,JAllergy Clin Immun,127:787,2011)。SlanDC会浸润寻常性银屑病,特应性皮炎(AD),皮肤型狼疮和风湿性关节炎的血管翳组织患者的真皮。
SlanDC共表达TLR7和TLR8，而在人类CD1c+DC中其他类型的骨髓DC仅表达TLR8(Hansel et al.,Autoimmunity,40:1-8,2013)。SlanDC通过LL37-RNA络合物，通过TLR7和TLR8活化，其中所述的LL37-RNA络合物大部分存在于银屑病和皮肤型狼疮的皮肤中，并产生高水平的促炎细胞因子，例如TNF-α,IL-23和IL-6(Hansel,supra)。认为这些LL37-RNA络合物是皮肤型疾病(例如银屑病和皮肤型狼疮)的发病机理的核心(Ganguly et al.,J Exp Med,206:1983,2009；and Gilliet et al.,Nat Rev Immun,8:594,2008)。
使用单独的LL37-RNA络合物，或者在TLR7,TLR8和/或TLR7/TLR8抑制剂存在下来刺激由健康供者纯化得到的SlanDC。通过ELISA，针对TNF-α,IL-23和/或IL-6浓度(多个)来评价上清液。预计TLR7和TLR8单功能抑制剂会降低对LL37-RNA络合物的应答，而双功能TLR7/8抑制剂将比单一的组合更有效地降低应答。
实施例28-在皮肤致敏(tape stripped)的小鼠中，测定TLR8对炎性应答的贡献
小鼠的皮肤致敏会激发炎性应答，该炎性应答取决于TLR7和TLR9(Guiducci et al.,J Exp Med,207:2931-2942,2010)。为了测定人类TLR8在皮肤炎症中的贡献，在小鼠经皮肤致敏后即刻，使用TLR7,TLR8和/或TLR9单功能抑制剂、和/或TLR7/9和/或TLR7/8双功能抑制剂、和/或 TLR7/8/9三功能抑制剂皮下治疗hTLR8Tg Clone 8小鼠。将一组小鼠留作对照。在皮肤致敏后的24小时，对皮肤活组织检查取样，并通过TAQMAN分析来评价I型IFN调节的基因和炎症基因的基因表达。使用不同的TLR抑制剂，通过比较结果来测定炎症应答对TLR8的贡献。预计这种免疫应答至少部分是TLR8介导的，并且给药TLR8抑制剂会使得I型IFN调节的和炎症基因的表达降低。
实施例29-在TLR7.6小鼠的肾脏中，TLR7/8抑制剂会降低炎症基因的表达
之前已经描述了过表达小鼠TLR7基因(TLR7.6)的小鼠(Deane et.al.,Immunity,27:801-810,2007)。TLR7.6小鼠发展成自身抗体介导的血管球性肾炎，其可表征为炎性细胞浸润增加和生产炎性细胞因子。此外，TLR7.6小鼠发展成脾肿大以及骨髓细胞膨胀增加。
每周1次向2-3个月大的TLR7.6小鼠注射1mg/kg DVX103或PBS，并持续15周。通过TAQMAN检验来测定肾脏中炎症基因的表达。图34A和图34B显示与使用DVX103治疗后的野生型小鼠和TLR7.6小鼠相比，在TLR7.6小鼠的肾脏中mIL-1α,mIL-1β,mTNF-α,mIFN-γ,mMMP-7,mCD11bβ,mCD8和mCD4的相对水平。DVX103能够降低TLR7.6小鼠肾脏中表达的炎症基因的水平(参加图34A)。
在试验结束时，由小鼠收获脾脏。在机械破碎后，通过细胞计数来测定脾细胞的总数。使用用于标记CD11c细胞的抗体，通过流式细胞仪来测定树突状细胞(DC)的数量。图34C显示使用DVX103治疗TLR7.6小鼠在TLR7.6小鼠中归一化骨髓细胞的膨胀。
在第二个试验中，每周1次向5-6个月龄的TLR7.6小鼠注射1mg/kg或5mg/kgDVX105、或者生理盐水，并持续8周。通过TAQMAN检验来测定肾脏中炎症基因的表达。图35A显示与使用DVX105治疗后的野生型小鼠和TLR7.6小鼠相比，在TLR7.6小鼠肾脏中mIL-1α,mIL-1β,mLT-β,mMIG和mF4/80的相对水平。DVX105能够降低在TLR7.6小鼠的肾脏中表达的炎症基因的水平(参见图35A)。
在试验结束时，由小鼠收获脾脏。在机械破碎后，通过细胞计数来测定脾细胞的总数。使用分别用于标记CD11c和LY6G的抗体，通过流式细胞仪来测定树突状细胞(DC)和嗜中性粒细胞的数量。图35B显示使用 DVX105治疗TLR7.6小鼠在TLR7.6小鼠中归一化骨髓细胞的膨胀。
实施例30-在大鼠中，高剂量和低剂量的抑制性多核苷酸的活性
每周1次向Sprague Dawley大鼠皮下给药高剂量(hi＝40mg/kg)和低剂量(lo＝10mg/kg)的多核苷酸(C954,DVX103,DVX104和DVX105)，并持续8周(n＝5/组)。如表30-1所示，在给药前(第0天)以及此后将大鼠称重。在研究结束时收获器官并测定器官的重量。此外，进行肝脏和肾脏的组织学评价。在本研究中包含C954作为组织学对照，并且代表具有良好的毒理学图谱的多核苷酸。
使用C954,DVX103,DVX104或DVX105治疗的大鼠显示体重相似的增加。所有组的动物的器官重量是相似的。反应肝脏和肾脏改变的严重性得分的概括示于表30-1。器官的组织性检查证明肾脏为靶器官。肝脏的髓外造血作用在大鼠中是平常的。由于在所有的组(包含PBS治疗组)中都观察到上述情况，所以不认为是显著的多核苷酸相关性的发现。在肝脏中未观察到其他明显的改变。在肾脏中，在所有的组中都发现轻微的肾小管改变。在这种慢性环境下测试的所有多核苷酸均显示在高剂量(40mg/kg，严重性得分为大约2)下，在肾脏中具有轻微的改变，而在低剂量(10mg/kg)下观察到最小的改变。
表30-1.组织学发现的概括
()＝平均严重性得分；0＝无改变；1＝最小；2＝轻微；3＝中度；4＝严重。数据显示为每组中5只动物中的#只动物。
实施例31-在胶原蛋白诱导的类风湿性关节炎模型中，TLR7/8抑制剂会降低疾病得分
根据公开的免疫时间表和方案来免疫野生型(C57BL/6)和TLR8转基因小鼠(WO 2012/135549中所述的TLR8TGCL8)(Campbell,Eur J Immunol 30:1568-1575,2000)。在胶原蛋白免疫的第0天，使用如下的弗氏完全佐剂(得自Chondrex的CFA，其包含5mg/mL结核分枝杆菌(Mycobacterium  tuberculosis)H37Ra)来乳化胶原蛋白(得自Chondrex的小鸡II型胶原蛋白；2mg/mL)：
(i)将1体积的CFA与等体积的胶原蛋白溶液混合；
(ii)连续混合，直至得到稳定的硬性乳液；
(iii)为了确定所需的乳液的稳定性，将1滴乳液加入至装满水的烧杯中(如果乳液在水中保持固态，则认为其是稳定的)；以及
(iv)在尾部皮下注射100μl。
在第21天给药第二次注射。针对肢体的红色和肿胀来评估动物，并且各小鼠的累积得分为四肢的每肢所获得的得分的总和。临床得分指导原则如下：0-正常；1-轻微，但是踝部或腕部有明确的红色和肿胀，或者明显的红色和肿胀限于单个的足趾，而与受影响的足趾的数量无关；2-中度，踝部或腕部有红色和肿胀；3-严重，整个爪子由红色和肿胀，包含足趾；以及4-最大程度的发炎的肢体，并且涉及多个关节以及分配的临床得分。
在第1,7,14,20,24,28,31,35,42,49和53天，使用PBS或TLR7/8抑制剂DVX105(1mg/kg皮下)治疗hTLR8TgCL8小鼠。如图36所示，hTLR8TgCL8小鼠中的疾病得分比野生型(WT)小鼠的得分极大地恶化。使用DVX105治疗hTLR8TgCL8小鼠降低了疾病得分。该研究证明hTLR8在关节炎的恶化中起到一定作用，并且TLR7/8抑制剂经少了表达hTLR8的受试对象的关节炎。
实施例33-使用得自Sjogren综合征患者的血清刺激人类单核细胞是TLR7/8依赖性的
使用阴性选择试剂盒(Stem Cell,编号No.14068)，根据制造商的说明书由白细胞层分离CD14+单核细胞。纯度通常超过98％。在由健康受试对象(n＝3)或患有活性疾病的Sjogren综合征患者(n＝5)得到的7.5％血清存在下，将大约3x105个细胞与单独的完全培养基(RPMI,10％FBS)或者与TLR7/8抑制剂DVX99(1μM)组合温育。由Sjogren综合征患者得到的血清得自Newcastle University(UK)。在14-16小时后，通过Milliplex(Millipore)针对细胞因子的水平检验上清液。如图38所示，由Sjogren综合征患者得到的血清刺激了IL-1α,IL-1β,TNF-α,GM-CSF和G-CSF的生产，并且该细胞因子的生产可以被TLR7/8抑制剂DVX99抑制。

Claims (49)

1.一种用于抑制个体的TLR8依赖的免疫应答的多核苷酸，其中所述的多核苷酸由下式的核苷酸序列组成：5’-NxX1X2X3X4X5X6-3’，其中N,X1,X2,X3和X4的每一种均为核苷酸或核苷酸类似物，X5为G或I，X6为I或A，x为0至50的整数，以及X6处于所述的多核苷酸的3’末端，前提条件是当X5X6为GI或GA时，则X3和X4的每一种均为A、T或C。
2.根据权利要求1所述的用于使用的多核苷酸，其中所述的多核苷酸不包含CG二核苷酸。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的用于使用的多核苷酸，其中所述的多核苷酸并非为反义序列或RNAi分子。
4.根据权利要求1-3的任意一项所述的用于使用的多核苷酸，其中所述的多核苷酸在位于该多核苷酸的5’末端的0,1或2核苷酸处不包含TGC或UGC三核苷酸。
5.根据权利要求1-3的任意一项所述的用于使用的多核苷酸，其中所述的多核苷酸在位于该多核苷酸的5’末端的0,1或2核苷酸处包含TGC或UGC三核苷酸。
6.根据权利要求1-5的任意一项所述的用于使用的多核苷酸，其中所述的多核苷酸不包含5’-GGGG-3’或5’-GIGG-3’。
7.根据权利要求1-5的任意一项所述的用于使用的多核苷酸，其中所述的多核苷酸包含5’-GGGG-3’或5’-GIGG-3’。
8.根据权利要求1-3的任意一项所述的用于使用的多核苷酸，其中所述的多核苷酸在位于该多核苷酸的5’末端的0,1或2核苷酸处包含TGC或UGC三核苷酸，并且包含5’-GGGG-3’或5’-GIGG-3’。
9.根据权利要求1-8的任意一项所述的用于使用的多核苷酸，其中X5为G。
10.根据权利要求1-8的任意一项所述的用于使用的多核苷酸，其中X5为I。
11.根据权利要求1-8的任意一项所述的用于使用的多核苷酸，其中X6为I。
12.根据权利要求1-8的任意一项所述的用于使用的多核苷酸，其中X6为A。
13.根据权利要求1-8的任意一项所述的用于使用的多核苷酸，其中X5X6为GI。
14.根据权利要求1-8的任意一项所述的用于使用的多核苷酸，其中X5X6为GA。
15.根据权利要求1-8的任意一项所述的用于使用的多核苷酸，其中X5X6为II。
16.根据权利要求1-8的任意一项所述的用于使用的多核苷酸，其中X5X6为IA。
17.根据权利要求1-3的任意一项所述的用于使用的多核苷酸，其中所述的多核苷酸包含以下的一种：SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:14,SEQ IDNO:15,SEQ ID NO:16,SEQ ID NO:17,SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:24,SEQ ID NO:26,SEQ ID NO:30,SEQ ID NO:31,SEQ ID NO:32,SEQ IDNO:33,SEQ ID NO:34,SEQ ID NO:35,SEQ ID NO:36,SEQ ID NO:37,SEQ ID NO:38,SEQ ID NO:39,SEQ ID NO:40,SEQ ID NO:44,SEQ IDNO:48,SEQ ID NO:49,SEQ ID NO:50,SEQ ID NO:51,SEQ ID NO:52,SEQ ID NO:53,SEQ ID NO:56,SEQ ID NO:59,SEQ ID NO:60,SEQ IDNO:61,SEQ ID NO:62,SEQ ID NO:63,SEQ ID NO:64,SEQ ID NO:65,SEQ ID NO:66,SEQ ID NO:67,SEQ ID NO:68,SEQ ID NO:69,SEQ IDNO:70,SEQ ID NO:71,SEQ ID NO:72,SEQ ID NO:73,SEQ ID NO:77,SEQ ID NO:78,SEQ ID NO:79,SEQ ID NO:80,SEQ ID NO:81,SEQ IDNO:84,SEQ ID NO:85,SEQ ID NO:86,SEQ ID NO:87,SEQ ID NO:88,SEQ ID NO:89,SEQ ID NO:90,SEQ ID NO:91,SEQ ID NO:92,SEQ IDNO:93,SEQ ID NO:94,SEQ ID NO:95,SEQ ID NO:96,SEQ ID NO:97,SEQ ID NO:98,SEQ ID NO:99,SEQ ID NO:100,SEQ ID NO:101,SEQ IDNO:102,SEQ ID NO:103,SEQ ID NO:104,SEQ ID NO:105,SEQ IDNO:106,SEQ ID NO:107,SEQ ID NO:108,SEQ ID NO:109,SEQ IDNO:110,SEQ ID NO:111,SEQ ID NO:112,SEQ ID NO:113,SEQ IDNO:114和SEQ ID NO:115。
18.根据权利要求1-3的任意一项所述的用于使用的多核苷酸，其中所述的多核苷酸包含以下的一种：SEQ ID NO:87,SEQ ID NO:88,SEQ IDNO:89,SEQ ID NO:90,SEQ ID NO:91,SEQ ID NO:92,SEQ ID NO:93,SEQ ID NO:94,SEQ ID NO:95,SEQ ID NO:96,SEQ ID NO:97,SEQ IDNO:98,SEQ ID NO:99,SEQ ID NO:100,SEQ ID NO:101,SEQ ID NO:102,SEQ ID NO:103,SEQ ID NO:104,SEQ ID NO:105,SEQ ID NO:106,SEQID NO:107,SEQ ID NO:108,SEQ ID NO:109,SEQ ID NO:110,SEQ IDNO:111,SEQ ID NO:112,SEQ ID NO:113,SEQ ID NO:114和SEQ IDNO:115。
19.一种用于抑制个体的TLR8依赖的免疫应答的多核苷酸，其中所述的多核苷酸包含：
(a)以下的一种：SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:14,SEQ ID NO:15,SEQID NO:16,SEQ ID NO:17,SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:24,SEQ ID NO:26,SEQ ID NO:30,SEQ ID NO:31,SEQ ID NO:32,SEQ ID NO:33,SEQ IDNO:34,SEQ ID NO:35,SEQ ID NO:36,SEQ ID NO:37,SEQ ID NO:38,SEQ ID NO:39,SEQ ID NO:40,SEQ ID NO:44,SEQ ID NO:48,SEQ IDNO:49,SEQ ID NO:50,SEQ ID NO:51,SEQ ID NO:52,SEQ ID NO:53,SEQ ID NO:56,SEQ ID NO:59,SEQ ID NO:60,SEQ ID NO:61,SEQ IDNO:62,SEQ ID NO:63,SEQ ID NO:64,SEQ ID NO:65,SEQ ID NO:66,SEQ ID NO:67,SEQ ID NO:68,SEQ ID NO:69,SEQ ID NO:70,SEQ IDNO:71,SEQ ID NO:72,SEQ ID NO:73,SEQ ID NO:77,SEQ ID NO:78,SEQ ID NO:79,SEQ ID NO:80,SEQ ID NO:81,SEQ ID NO:84,SEQ IDNO:85,SEQ ID NO:86,SEQ ID NO:87,SEQ ID NO:88,SEQ ID NO:89,SEQ ID NO:90,SEQ ID NO:91,SEQ ID NO:92,SEQ ID NO:93,SEQ IDNO:94,SEQ ID NO:95,SEQ ID NO:96,SEQ ID NO:97,SEQ ID NO:98,SEQ ID NO:99,SEQ ID NO:100,SEQ ID NO:101,SEQ ID NO:102,SEQ IDNO:103,SEQ ID NO:104,SEQ ID NO:105,SEQ ID NO:106,SEQ IDNO:107,SEQ ID NO:108,SEQ ID NO:109,SEQ ID NO:110,SEQ IDNO:111,SEQ ID NO:112,SEQ ID NO:113,SEQ ID NO:114和SEQ IDNO:115，前提条件是所述的多核苷酸在该多核苷酸的3’末端具有选自GI,GA,II和IA中的二核苷酸；或
(b)(a)的类似物，其中除了所述的多核苷酸3’末端的二核苷酸以外的一个或两个主要的碱基被天然或非天然形成的修饰的主要碱基所替代。
20.根据权利要求19所述的用于使用的多核苷酸，其中所述的多核苷酸包含(a)的类似物，其中除了所述的二核苷酸以外的一个主要的碱基被天然形成的修饰所替代。
21.根据权利要求19所述的用于使用的多核苷酸，其中所述的多核苷酸包含(a)的类似物，其中除了所述的二核苷酸以外的一个主要的碱基被非天然形成的修饰所替代。
22.根据权利要求19所述的用于使用的多核苷酸，其中所述的多核苷酸包含以下的一种：SEQ ID NO:87,SEQ ID NO:88,SEQ ID NO:89,SEQID NO:90,SEQ ID NO:91,SEQ ID NO:92,SEQ ID NO:93,SEQ ID NO:94,SEQ ID NO:95,SEQ ID NO:96,SEQ ID NO:97,SEQ ID NO:98,SEQ IDNO:99,SEQ ID NO:100,SEQ ID NO:101,SEQ ID NO:102,SEQ ID NO:103,SEQ ID NO:104,SEQ ID NO:105,SEQ ID NO:106,SEQ ID NO:107,SEQID NO:108,SEQ ID NO:109,SEQ ID NO:110,SEQ ID NO:111,SEQ IDNO:112,SEQ ID NO:113,SEQ ID NO:114和SEQ ID NO:115。
23.根据权利要求1-22的任意一项所述的用于使用的多核苷酸，其中所述的多核苷酸的长度少于40,35,30,25或20个碱基或碱基对。
24.根据权利要求1-23的任意一项所述的用于使用的多核苷酸，其中所述的多核苷酸包含磷酸酯改性的键，或者仅包含磷硫酰键。
25.一种由下式的核苷酸序列组成的多核苷酸：5’-NxX1X2X3X4X5X6-3’，其中N,X1,X2,X3和X4的每一种均为核苷酸或核苷酸类似物，X5为G或I，X6为I或A，x为0至50的整数，以及X6处于所述的多核苷酸的3’末端，前提条件是当X5X6为GI或GA时，则X3和X4的每一种均为A、T或C。
26.一种包含权利要求25所述的多核苷酸和药物可接受的赋形剂的药物组合物。
27.一种抑制个体的TLR8依赖的免疫应答的方法，该方法包含：向所述的个体给药有效抑制该个体的TLR8依赖的免疫应答的量的、权利要求26所述的药物组合物。
28.一种由下式的核苷酸序列组成的多核苷酸：5’-QzTICNx-3或5’-QzTTCNx-3，其中Q和N的每一种均为核苷酸或核苷酸类似物，x为3至50的整数，z为0，并且其中所述的多核苷酸不包含CG二核苷酸。
29.一种包含权利要求28所述的多核苷酸和药物可接受的赋形剂的药物组合物。
30.一种抑制个体的TLR7依赖的免疫应答的方法，该方法包含：向所述的个体给药有效抑制该个体的TLR7依赖的免疫应答的量的、权利要求29所述的药物组合物。
31.一种由下式的核苷酸序列组成的多核苷酸：5’-QzTGC-NxX1X2X3X4X5X6-My-3,5’-Qzugc-NxX1X2X3X4X5X6-My-3,5’-QzTIC-NxX1X2X3X4X5X6-My-3,或5’-QzTTC-NxX1X2X3X4X5X6-My-3，其中Q,N,X1,X2,X3,X4和M的每一种均为核苷酸或核苷酸类似物，x为0至50的整数，y为0，z为0，X5为G或I，X6为I或A，大写字母表示DNA，小写字母表示2’-O-甲基RNA，并且其中所述的多核苷酸不包含CG二核苷酸。
32.一种包含权利要求31所述的多核苷酸和药物可接受的赋形剂的药物组合物。
33.一种抑制个体的TLR7依赖的和TLR8依赖的免疫应答的方法，该方法包含：向所述的个体给药有效抑制该个体的TLR7依赖的和TLR8依赖的免疫应答的量的、权利要求32所述的药物组合物。
34.一种由下式的核苷酸序列组成的多核苷酸：
5’-QzTGC-Nx-S1S2S3S4-Pa-X1X2X3X4X5X6-My-3,
5’-Qzugc-Nx-S1S2S3S4-Pa-X1X2X3X4X5X6-My-3,
5’-QzTIC-Nx-S1S2S3S4-Pa-X1X2X3X4X5X6-My-3,或
5’-QzTTC-Nx-S1S2S3S4-Pa-X1X2X3X4X5X6-My-3，其中Q,N,P,X1,X2,X3,X4和M的每一种均为核苷酸或核苷酸类似物，a为0至20的整数，x为0至50的整数，y为0，z为0，S1,S2,S3和S4的每一种为G或I，X5为G或I，X6为I或A，大写字母表示DNA，小写字母表示2’-O-甲基RNA，并且其中所述的多核苷酸不包含CG二核苷酸。
35.一种包含权利要求34所述的多核苷酸和药物可接受的赋形剂的药物组合物。
36.一种抑制个体的TLR7依赖的、TLR8依赖的和TLR9依赖的免疫应答的方法，该方法包含：向所述的个体给药有效抑制该个体的TLR7依赖的、TLR8依赖的和TLR9依赖的免疫应答的量的、权利要求35所述的药物组合物。
37.一种由下式的核苷酸序列组成的多核苷酸：5’-Nx-S1S2S3S4-Pa-X1X2X3X4X5X6-My-3，其中N,P,X1,X2,X3,X4和M的每一种均为核苷酸或核苷酸类似物，a为0至20的整数，x为0至50的整数，y为0，S1,S2,S3和S4的每一种为G或I，X5为G或I，X6为I或A，并且其中所述的多核苷酸不包含CG二核苷酸。
38.一种包含权利要求37所述的多核苷酸和药物可接受的赋形剂的药物组合物。
39.一种抑制个体的TLR8依赖的和TLR9依赖的免疫应答的方法，该方法包含：向所述的个体给药有效抑制该个体的TLR8依赖的和TLR9依赖的免疫应答的量的、权利要求38所述的药物组合物。
40.一种抑制个体的免疫应答的方法，该方法包含：向所述的个体给药有效抑制该个体的免疫应答的量的、权利要求26,29,32,35和38的任意一项所述的药物组合物。
41.权利要求40所述的方法，其中所述的免疫应答与自体免疫疾病有关。
42.权利要求41所述的方法，其中抑制所述的免疫应答减轻了所述的自体免疫疾病的一种或多种症状。
43.权利要求41或权利要求42所述的方法，其中所述的自体免疫疾病选自类风湿性关节炎,胰腺炎,混合结缔组织病,系统性红斑狼疮,抗磷脂综合征,肠易激综合症,I型糖尿病,和Sjogren病。
44.权利要求41或权利要求42所述的方法，其中所述的自体免疫疾病为Sjogren病。
45.权利要求41或权利要求42所述的方法，其中所述的自体免疫疾病与包含RNA的免疫络合物有关。
46.权利要求40所述的方法，其中所述的免疫应答与炎性紊乱有关。
47.权利要求46所述的方法，其中抑制所述的免疫应答减轻了所述的炎性紊乱的一种或多种症状。
48.权利要求46所述的方法，其中所述的炎性紊乱与TLR8表达的升高有关。
49.权利要求27,28,30,31,33,34,36,37,39,40,41,42,43,44,45,46,47或48的任意一项所述的方法，其中所述的个体为人类。
CN201380050891.5A 2012-09-29 2013-09-27 人类toll样受体抑制剂及其使用方法 Pending CN104937102A (zh)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261707887P 2012-09-29 2012-09-29
US61/707,887 2012-09-29
US201361761214P 2013-02-05 2013-02-05
US61/761,214 2013-02-05
US13/842,861 US9228184B2 (en) 2012-09-29 2013-03-15 Human toll-like receptor inhibitors and methods of use thereof
US13/842,861 2013-03-15
PCT/US2013/062479 WO2014052931A1 (en) 2012-09-29 2013-09-27 Human toll-like receptor inhibitors and methods of use thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN104937102A true CN104937102A (zh) 2015-09-23

Family

ID=50385792

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201380050891.5A Pending CN104937102A (zh) 2012-09-29 2013-09-27 人类toll样受体抑制剂及其使用方法

Country Status (8)

Country Link
US (1) US9228184B2 (zh)
EP (1) EP2900823B1 (zh)
JP (1) JP6395266B2 (zh)
CN (1) CN104937102A (zh)
AU (1) AU2013202255B2 (zh)
CA (1) CA2886755A1 (zh)
HK (1) HK1213290A1 (zh)
WO (1) WO2014052931A1 (zh)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8158768B2 (en) * 2002-12-23 2012-04-17 Dynavax Technologies Corporation Immunostimulatory sequence oligonucleotides and methods of using the same
US9868955B2 (en) 2012-09-29 2018-01-16 Dynavax Technologies Corporation Human toll-like receptor inhibitors and methods of use thereof
TW201630606A (zh) * 2015-01-21 2016-09-01 諾華公司 包含局部藥物之蓋崙（ｇａｌｅｎｉｃ）調配物
WO2016141236A1 (en) * 2015-03-03 2016-09-09 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compositions for modulating mecp2 expression
WO2017136399A1 (en) * 2016-02-02 2017-08-10 Idera Pharmaceuticals, Inc. POTENTIATION OF mmRNA THERAPEUTICS
WO2018044350A1 (en) * 2016-09-02 2018-03-08 Arrowhead Pharmaceuticals, Inc Targeting ligands
WO2018089695A1 (en) 2016-11-11 2018-05-17 Dynavax Technologies Corporation Toll-like receptor antagonist compounds and methods of use
CN111417401A (zh) * 2017-06-30 2020-07-14 皇家墨尔本理工大学 一种治疗方法
KR20220047319A (ko) 2019-08-14 2022-04-15 큐어백 아게 감소된 면역자극 특성을 갖는 rna 조합물 및 조성물
CA3161668A1 (en) 2019-12-20 2021-06-24 Nammi Therapeutics, Inc. Formulated and/or co-formulated liposome compositions containing toll-like receptor ("tlr") agonist prodrugs useful in the treatment of cancer and methods thereof

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006028742A2 (en) * 2004-09-01 2006-03-16 Dynavax Technologies Corporation Methods and conpositions for inhibition of innate immune responses and autoimmunity
WO2006066003A2 (en) * 2004-12-17 2006-06-22 Dynavax Technologies Corporation Methods and compositions for induction or promotion of immune tolerance
WO2009055076A2 (en) * 2007-10-26 2009-04-30 Dynavax Technologies Corporation Methods and compositions for inhibition of immune responses and autoimmunity
WO2011159958A2 (en) * 2010-06-16 2011-12-22 Dynavax Technologies Corporation Methods of treatment using tlr7 and/or tlr9 inhibitors

Family Cites Families (49)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4458066A (en) 1980-02-29 1984-07-03 University Patents, Inc. Process for preparing polynucleotides
US4948882A (en) 1983-02-22 1990-08-14 Syngene, Inc. Single-stranded labelled oligonucleotides, reactive monomers and methods of synthesis
US4849513A (en) 1983-12-20 1989-07-18 California Institute Of Technology Deoxyribonucleoside phosphoramidites in which an aliphatic amino group is attached to the sugar ring and their use for the preparation of oligonucleotides containing aliphatic amino groups
US5118802A (en) 1983-12-20 1992-06-02 California Institute Of Technology DNA-reporter conjugates linked via the 2' or 5'-primary amino group of the 5'-terminal nucleoside
US5118800A (en) 1983-12-20 1992-06-02 California Institute Of Technology Oligonucleotides possessing a primary amino group in the terminal nucleotide
US5015733A (en) 1983-12-20 1991-05-14 California Institute Of Technology Nucleosides possessing blocked aliphatic amino groups
US4587329A (en) 1984-08-17 1986-05-06 The Dow Chemical Company Dense star polymers having two dimensional molecular diameter
US5093232A (en) 1985-12-11 1992-03-03 Chiron Corporation Nucleic acid probes
US4910300A (en) 1985-12-11 1990-03-20 Chiron Corporation Method for making nucleic acid probes
US6312679B1 (en) 1986-08-18 2001-11-06 The Dow Chemical Company Dense star polymer conjugates as dyes
US5338532A (en) 1986-08-18 1994-08-16 The Dow Chemical Company Starburst conjugates
US5075109A (en) 1986-10-24 1991-12-24 Southern Research Institute Method of potentiating an immune response
PT88550A (pt) 1987-09-21 1989-07-31 Ml Tecnology Ventures Lp Processo para a preparacao de reagentes de ligacao nao nucleotidicos para sondas nucleotidicas
US5278302A (en) 1988-05-26 1994-01-11 University Patents, Inc. Polynucleotide phosphorodithioates
US5391723A (en) 1989-05-31 1995-02-21 Neorx Corporation Oligonucleotide conjugates
US5552391A (en) 1990-01-16 1996-09-03 La Jolla Pharmaceutical Company Chemically-defined non-polymeric valency platform molecules and conjugates thereof
US5171264A (en) 1990-02-28 1992-12-15 Massachusetts Institute Of Technology Immobilized polyethylene oxide star molecules for bioapplications
US5460831A (en) 1990-06-22 1995-10-24 The Regents Of The University Of California Targeted transfection nanoparticles
CA2169645A1 (en) 1993-09-02 1995-03-09 Nassim Usman Non-nucleotide containing enzymatic nucleic acid
US5874409A (en) 1995-06-07 1999-02-23 La Jolla Pharmaceutical Company APL immunoreactive peptides, conjugates thereof and methods of treatment for APL antibody-mediated pathologies
EP0954531A1 (en) 1996-06-06 1999-11-10 Lajolla Pharmaceutical Company aPL IMMUNOREACTIVE PEPTIDES, CONJUGATES THEREOF AND METHODS OF TREATMENT FOR aPL ANTIBODY-MEDIATED PATHOLOGIES
DK1003850T3 (da) 1997-06-06 2009-09-07 Univ California Inhibitorer af DNA-immunstimulatorisk sekvensaktivitet
US6458953B1 (en) 1998-12-09 2002-10-01 La Jolla Pharmaceutical Company Valency platform molecules comprising carbamate linkages
KR20020022691A (ko) 1999-06-08 2002-03-27 와이즈먼 앤드루 아미노옥시기를 포함하는 원자가 플랫폼 분자
WO2003014316A2 (en) * 2001-08-07 2003-02-20 Dynavax Technologies Corporation Immunomodulatory compositions, formulations, and methods for use thereof
CA2480775C (en) 2002-04-04 2016-05-31 Coley Pharmaceutical Gmbh Immunostimulatory g,u-containing oligoribonucleotides
ES2350576T3 (es) * 2002-11-21 2011-01-25 Bayhill Therapeutics, Inc. Métodos y composiciones de ácidos nucleicos inmunomoduladores para prevenir y tratar enfermedades.
EP1592302A4 (en) 2003-02-13 2007-04-25 3M Innovative Properties Co METHODS AND COMPOSITIONS ASSOCIATED WITH IMMUNE RESPONSE MODIFIER COMPOUNDS AND TOLL-LIKE RECEPTOR 8
JP2006519020A (ja) 2003-02-27 2006-08-24 スリーエム イノベイティブ プロパティズ カンパニー Ｔｌｒ介在生物活性の選択的調節
EP1635846A4 (en) 2003-06-20 2009-01-28 Coley Pharm Gmbh SMALL MOLECULAR TLR (TOLL-LIKE RECEPTOR) ANTAGONISTS
US20050239733A1 (en) 2003-10-31 2005-10-27 Coley Pharmaceutical Gmbh Sequence requirements for inhibitory oligonucleotides
US20050226878A1 (en) 2003-12-02 2005-10-13 3M Innovative Properties Company Therapeutic combinations and methods including IRM compounds
AU2005230938A1 (en) 2004-02-19 2005-10-20 Coley Pharmaceutical Gmbh Immunostimulatory viral RNA oligonucleotides
EP1819226A4 (en) 2004-12-08 2010-12-29 3M Innovative Properties Co COMBINATIONS AND METHODS OF IMMUNOSTIMULATION
CA2598831A1 (en) 2005-02-22 2006-08-31 The Regents Of The University Of California Methods of treating gastrointestinal inflammation
US7498409B2 (en) 2005-03-24 2009-03-03 Schering Corporation Screening assay for TLR7, TLR8 and TLR9 agonists and antagonists
TWI404537B (zh) 2005-08-19 2013-08-11 Array Biopharma Inc 作為類鐸受體（ｔｏｌｌ-ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）調節劑之８-經取代苯并氮雜呯
TWI382019B (zh) 2005-08-19 2013-01-11 Array Biopharma Inc 作為類鐸受體（ｔｏｌｌ-ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）調節劑之胺基二氮雜呯
US8076068B2 (en) 2005-09-14 2011-12-13 Gunther Hartmann Method for determining immunostimulatory activity of RNA oligonucleotides
JP2009511034A (ja) 2005-10-12 2009-03-19 キャンサー・リサーチ・テクノロジー・リミテッド 免疫異常を治療するための方法および組成物
EP2883957A1 (en) 2005-11-25 2015-06-17 Zoetis Belgium S.A. Immunostimmulatory oligoribonucleotides
US8106173B2 (en) * 2006-04-07 2012-01-31 Idera Pharmaceuticals, Inc. Stabilized immune modulatory RNA (SIMRA) compounds for TLR7 and TLR8
WO2007143582A2 (en) 2006-06-05 2007-12-13 Baylor College Of Medicine Reversal of the suppressive function of specific t cells via toll-like receptor 8 signaling
AU2007284036A1 (en) 2006-08-16 2008-02-21 Protiva Biotherapeutics, Inc. Nucleic acid modulation of Toll-like receptor-mediated immune stimulation
CN101795715A (zh) 2007-07-09 2010-08-04 艾德拉药物股份有限公司 稳定化免疫调控性rna(simra)化合物
WO2009154610A1 (en) 2008-06-17 2009-12-23 Idera Pharmaceuticals, Inc. Immune regulatory oligonucleotide (iro) compounds to modulate toll-like receptor based immune response
US20100047188A1 (en) 2008-08-04 2010-02-25 Idera Pharmaceuticals, Inc. Modulation of toll-like receptor 8 expression by antisense oligonucleotides
WO2011159328A1 (en) 2010-06-16 2011-12-22 Dynavax Technologies Corporation Methods of treatment using tlr7 and/or tlr9 inhibitors
US9063123B2 (en) 2011-03-29 2015-06-23 Dynavax Technologies Corporation Transgenic mice expressing human toll-like receptor 8

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006028742A2 (en) * 2004-09-01 2006-03-16 Dynavax Technologies Corporation Methods and conpositions for inhibition of innate immune responses and autoimmunity
WO2006066003A2 (en) * 2004-12-17 2006-06-22 Dynavax Technologies Corporation Methods and compositions for induction or promotion of immune tolerance
WO2009055076A2 (en) * 2007-10-26 2009-04-30 Dynavax Technologies Corporation Methods and compositions for inhibition of immune responses and autoimmunity
WO2011159958A2 (en) * 2010-06-16 2011-12-22 Dynavax Technologies Corporation Methods of treatment using tlr7 and/or tlr9 inhibitors

Also Published As

Publication number Publication date
EP2900823A1 (en) 2015-08-05
AU2013202255A1 (en) 2014-04-17
US9228184B2 (en) 2016-01-05
JP6395266B2 (ja) 2018-09-26
HK1213290A1 (zh) 2016-06-30
CA2886755A1 (en) 2014-04-03
EP2900823B1 (en) 2017-11-08
AU2013202255B2 (en) 2016-07-14
WO2014052931A1 (en) 2014-04-03
US20140094504A1 (en) 2014-04-03
JP2015532097A (ja) 2015-11-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104937102A (zh) 人类toll样受体抑制剂及其使用方法
CN101052643B (zh) 抑制先天免疫应答和自身免疫的方法和组合物
US9476053B2 (en) Methods and compositions for inhibition of immune responses and autoimmunity
US8940310B2 (en) Methods of treatment using TLR7 and/or TLR9 inhibitors
US9868955B2 (en) Human toll-like receptor inhibitors and methods of use thereof
EP1836218A2 (en) Methods and compositions for induction or promotion of immune tolerance
JP2013531989A (ja) Ｔｌｒ７および／またはｔｌｒ９阻害剤を用いる治療の方法
JP2013532976A (ja) Ｔｏｌｌ様レセプター３の新規アゴニストおよびその使用方法
AU2013203855A1 (en) Human toll-like receptor inhibitors and methods of use thereof

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20150923

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication