CN104911189B - 一种人Annexin V基因优化序列及其制作方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明对人Annexin Ｖ基因的核苷酸序列进行了优化，然后利用全基因合成技术获得的人Annexin Ｖ的优化基因，并构建了人工合成的人Annexin V基因优化序列原核表达载体，将上述人Annexin V基因优化序列的原核表达载体转化进大肠杆菌进行高效诱导表达，将表达蛋白提取及纯化；对纯化的人Annexin V蛋白FITC标记在细胞凋亡检测试验中进行生物活性验证。该人工合成的人Annexin V基因优化序列在大肠杆菌中表达量达200mg/1L菌液，生物活性达到国际知名品牌同类产品相当效果；本发明中的人Annexin V基因优化序列生产人Annexin V蛋白的工艺简单，表达量高，纯度好，成本低，具有良好的生物功能，可用来生产细胞凋亡检测产品，大大降低对进口原料的需求，具有广阔的市场应用前景。

Description

一种人Annexin V基因优化序列及其制作方法和应用

技术领域

本发明属于生物工程领域，尤其涉及一种人Annexin V基因优化序列及其制作方法和应用。

背景技术

人膜联蛋白V(Annexin V)是钙离子依赖的磷脂结合蛋白--Annexin家庭成员之一。共有320个氨基酸，分子量约35.8 KDa，存在于大多数真核生物细胞内，在多种组织细胞(如心肌细胞、血管内皮、骨骼肌、肝细胞等)中都有表达。在Ca²⁺存在时，对酸性磷脂分子有很高的亲和力，在体内具有多种生理功能，在细胞中参与膜转运及膜表面一系列依赖于钙调蛋白的活动，包括胞吐作用中的膜融合、信号传导和钙离子通道的形成、抗凝、抗炎症反应、细胞分化和细胞骨架蛋白间的相互作用等。

目前Annexin V蛋白主要应用在细胞凋亡检测领域。细胞凋亡又称程序性细胞死亡，是由基因调控的细胞主动的有序性死亡方式，是生物体调节和维持机体相对平衡的重要方式，与多种疾病病理密切相关。细胞凋亡早期改变发生在细胞膜表面，这些细胞膜表面的改变之一是磷脂酰丝氨酸(phosphatidyl—serine，PS)从细胞膜内转移到细胞膜外，使PS暴露在细胞膜外表面。Annexin V高度特异性亲和PS，将Annexin V进行荧光素（FITC，Alexa Fluor 488，PE等）或生物素标记，可作为一敏感的探针检测暴露在细胞膜表面的PS，利用流式细胞仪或者荧光显微镜观察细胞凋亡现象。这是目前公认的灵敏、高效和特异的凋亡细胞的检测方法[Sgonc R，Gruber J．Aptoptosis detection：An OverviewExperimental[J]．Exp Gerontol，1998，33：525～533．]。

人Annexin V蛋白的应用广泛，但是天然来源的人Annexin V含量低，无法批量提供，商业上需要大量重组表达人Annexin V蛋白，但是人Annexin V在大肠杆菌中用普通方法诱导表达时经常以包涵体形式存在，可溶性蛋白产量较低，不符合实际应用的需求。根据最新研究报道，人Annexin V产量最高的重组表达方法是采用流加发酵的生产方式，在大肠杆菌中产率达到28.5mg/1L培养基[Marder L,S et al. BMC Biotechnology 2014，14-33]，但对生产设备和工艺要求较高，不容易扩大规模生产。而本专利发明人利用基因工程技术，对人Annexin V编码基因进行优化，在大肠杆菌表达系统中，用最简单的生产方法高效表达可溶性人Annexin V蛋白，一步法纯化，重组蛋白产率达200mg/1L培养基，这一方法可低成本，批量获得高纯度、有生物学功能的人Annexin V纯品，解决了一直以来人AnnexinV蛋白难重组表达的问题，大大降低凋亡检测试剂盒生产成本，具有很好的市场应用前景。

发明内容

为解决上述问题本发明提供了一种人Annexin V基因优化序列及其制作方法和应用。本发明解决了一直以来人Annexin V蛋白难重组表达的问题，大大降低凋亡检测试剂盒生产成本，具有很好的市场应用前景。为达到上述技术效果，本发明的技术方案是：

一种人Annexin V基因优化序列，人Annexin V基因优化序列的核苷酸序列为SEQID NO: 1。

一种人Annexin V基因优化序列的制作方法，包括如下步骤：

步骤一）在基因数据库中获取人Annexin V基因；

步骤二）基因优化：对人Annexin V基因的编码区进行大肠杆菌密码子偏爱性的基因优化得到优化序列；优化序列编码的氨基酸与人Annexin V基因编码形成的氨基酸序列一致；

步骤三）添加酶切位点：在优化序列的5′端添加一种内切酶的酶切位点，在优化序列的3′端添加另一种内切酶酶切位点，得到合成序列；

步骤四）基因合成：对得到的合成序列进行全基因合成。

进一步的改进，所述步骤三）中，优化序列的5′端添加NdeI酶切位点，优化序列的3′端添加XhoI酶切位点。

进一步的改进，所述步骤二）中的优化序列为SEQ ID NO: 1。

一种含有SEQ ID NO: 1序列的质粒。

进一步的改进，所述质粒为pET23a质粒 。

进一步的改进，SEQ ID NO: 1序列插入到pET23a质粒的NdeI酶切位点和XhoI酶切位点之间。

一种含有SEQ ID NO: 1序列的原核生物。

进一步的改进，所述原核生物为大肠杆菌。

一种上述人Annexin V基因优化序列的使用方法，SEQ ID NO: 1序列导入大肠杆菌中翻译为重组蛋白，所述重组蛋白用于检测细胞凋亡。

本发明的优点：

本发明通过基因优化，实现了人Annexin V基因在原核中高产量可溶性表达，一步纯化及FITC偶联标记，更验证了优化后的人Annexin V基因序列生产的人Annexin V-FITC完全可以替代进口试剂盒中的人Annexin V-FITC。尤其重要的是，本发明实现了1L培养基诱导菌体可一步法纯化出200mg 人Annexin V蛋白，所需设备和工艺简单，快速，容易大规模生产，极大降低了凋亡试剂盒的生产成本。

附图说明

图1人Annexin V重组蛋白诱导表达SDS-PAGE电泳图；

图2人Annexin V重组蛋白纯化SDS-PAGE电泳图；

图3A 本发明的人Annexin V-FITC检测紫外诱导处理30s的细胞凋亡的检测图；

图3B eBioscience 的人Annexin V-FITC检测紫外诱导处理30s的细胞凋亡的检测图；

图4A 本发明的人Annexin V-FITC检测紫外诱导处理60s的细胞凋亡的检测图；

图4B eBioscience 的人Annexin V-FITC检测紫外诱导处理60s的细胞凋亡的检测图；

图5A 本发明的人Annexin V-FITC检测紫外诱导处理90s的细胞凋亡的检测图；

图5B eBioscience 的人Annexin V-FITC检测紫外诱导处理90s的细胞凋亡的检测图。

具体实施方式

实施例1

一种人Annexin V基因的优化的方法：

登录GeneBank，查找编码人Annexin V成熟蛋白的基因序列（序列号为GenBank:AK312644.1），其核苷酸长度为963bp，由于人Annexin V为真核生物蛋白，后续研究需要在原核生物中进行表达，因此将上述人Annexin V基因的编码密码子与大肠杆菌偏好密码子进行比对，根据密码子的兼并性，在不改变氨基酸组成的排列顺序的基础上，对已知的编码人Annexin V基因序列进行改造，将大肠杆菌的某些稀有密码子替换为大肠杆菌偏爱密码子，以提高目的基因在大肠杆菌中的表达水平，并进行转基因验证，最后得到的人AnnexinV基因优化序列如SEQ ID NO: 1所示。

将人Annexin V基因优化序列5′端加上NdeI酶切位点，3′端加上XhoI酶切位点，送北京三博远志生物技术有限责任公司进行全基因合成，并连入原核表达载体pET23a(购自Novagen 公司)的NdeI酶切位点和XhoI酶切位点之间，得到重组的原核表达质粒pET23a-ANXV。

实施例2

2.1 表达菌株的获得

将实施例1中得到的原核表达质粒pET23a-ANXV通过热激法转入大肠杆菌BL21（DE3）(购自北京全式金生物技术有限公司)中，LB平板培养基中加入氨苄青霉素至100mg/L进行筛选，挑取单菌落进行测序鉴定。

2.2 人Annexin V基因优化序列在大肠杆菌中的诱导表达

挑取含有重组阳性质粒的单菌落，接种到含有浓度为100mg/L氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃，220rpm振荡培养过夜，按照1%的比例将过夜培养的菌液接种到含100mg/L氨苄青霉素的新鲜LB液体培养基中，37℃，220rpm振荡培养至菌液浓度OD₆₀₀约为0.6，取出2mL菌液作为未诱导对照，剩余菌体立即加入诱导物IPTG至工作浓度1mM，将未诱导菌体和诱导菌体继续培养4h；4℃，12000rpm，离心10min收集菌体。

2.3人Annexin V可溶性蛋白的提取和鉴定

将离心收集的菌体，PBS清洗两遍，加入LB培养基1/10体积的PBS，充分悬浮菌体，加入溶菌酶至工作浓度1mg/mL，PMSF至工作浓度1mM，混匀，室温孵育15min，混匀，于冰上超声破碎，功率200W，超声5s，间隔5s，10min，然后于4℃，12000rpm，离心30min，取含有可溶总蛋白的上清进行纯化。对未诱导菌体和诱导后菌体各样品进行SDS-PAGE分析，结果如图1所示：M为蛋白分子量标准；A1为未诱导菌体的总蛋白；A2为诱导菌体的总蛋白；A3为诱导菌体破碎后的表达上清；A4为诱导菌体破碎后的表达沉淀，A为人Annexin V基因优化序列的重组蛋白。人Annexin V基因优化序列的重组蛋白占菌体总蛋白的40%以上，且从图1可以看出绝大部分以可溶性蛋白形式存在，使得每1L培养基，可用一步法纯化出≥200mg的Annexin V蛋白。

采用Ni-NTA琼脂糖层析柱纯化人Annexin V重组蛋白，先用5倍柱床体积平衡缓冲液（20mM NaH₂PO₄，500mM NaCl，20mM咪唑，pH7.4）平衡层析柱，将上述可溶总蛋白以0.8mL/min的速度上柱，收集穿出液以备SDS-PAGE分析，当层析柱中所有穿出液流出介质后，加入洗脱缓冲液（20mM NaH₂PO₄，500mM NaCl，500mM咪唑，pH7.4）进行洗脱，分管收集，SDS-PAGE鉴定每管目的蛋白的纯度，收集纯度大于95%的组份。合并含有目的蛋白的各管，用PBS缓冲液，截止分子量为12-14KDa的透析袋进行过夜透析，收集透析后人Annexin V重组蛋白，用BCA法进行浓度测定，并进行SDS-PAGE电泳检测，电泳结果如图2所示：M为蛋白分子量标准；B1为纯化前总蛋白；B2为上柱穿出液；B3为纯化后的人Annexin V基因优化序列重组蛋白。

实施例3

人Annexin V FITC标记和细胞凋亡检测

3.1 人Annexin V FITC标记

取5mg 人Annexin V重组蛋白，用截止分子量为12-14KDa的透析袋进行过夜透析（缓冲液0.1M Na₂CO₃-NaHCO₃，pH9.5）透析，其间更换3次缓冲液；4℃，12000rpm，离心15min；取上清测定浓度。DMSO溶解FITC至终浓度5mg/mL；按照每毫克人Annexin V重组蛋白中加入9uL FITC的比例往蛋白中加入FITC，旋涡混匀器混匀后包上锡箔纸，旋转杂交炉中室温避光旋转反应2小时；5倍柱床体积去离子水平衡Sephadex G25层析柱；5倍柱床体积AnnexinV-FITC保存缓冲液（50mM Tris， 150mM NaCl， 0.05%NaN₃， pH8.0）平衡Sephadex G25层析柱；将偶联好的Annexin V-FITC上柱纯化以去除游离的FITC。收集第一个峰为Annexin V-FITC偶联物。

3.2细胞凋亡诱导及检测

将jurkat细胞（购自ATCC公司）传代于6孔细胞培养板中，培养至对数生长期，调整细胞密度约为10⁶/mL，3mL/孔。诱导凋亡组用紫外分别照射30s，60s，90s作为实验组，另一组细胞不照射紫外作为空白对照，37℃培养箱继续培养4h，1000rpm，离心10min收集细胞至离心管中，加入2mL PBS溶液洗涤细胞，1000rpm，离心10min收集细胞。对处理后的细胞分别使用上述自制人Annexin V-FITC和eBioscience 人Annexin V-FITC试剂盒，按照说明书进行人Annexin V-FITC/PI双染色，用BD Calibur流式细胞仪进行分析。

实验组的结果分别如图3A、图3B、图4A、图4B、图5A和图5B所示，本发明自制的人Annexin V-FITC在细胞凋亡检测试验中，取得了和eBioscience相同产品同样的效果，表明该人Annexin V蛋白具有很好的生物学功能，可用于细胞凋亡检测试剂盒的开发和应用。

本发明通过基因优化，实现了人Annexin V在原核中高产量可溶性表达，一步纯化及FITC偶联标记，更验证了自制的人Annexin V-FITC完全可以替代进口试剂盒中的人Annexin V-FITC。尤其重要的是，本发明实现了1L培养基诱导菌体可一步法纯化出200mg人Annexin V蛋白，所需设备和工艺简单，快速，容易大规模生产，极大降低了凋亡试剂盒的生产成本。

以上实例的说明只是用于帮助理解本发明的核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。

<110> 北京四正柏生物科技有限公司

<120> 一种人Annexin V基因优化序列及其制作方法和应用

<130> 2015

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 963

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atggcacagg ttctccgtgg caccgtgacc gacttccccg gatttgatga gcgtgctgat 60

gcagaaaccc ttcgtaaggc tatgaaaggc ttgggcaccg atgaggagag catcctgacc 120

ctgttgacct cccgtagcaa tgctcagcgc caggaaatct ctgcagcttt taagaccctg 180

tttggccgtg atcttctgga tgacctgaaa tcagaactta ccggaaaatt tgaaaaatta 240

attgtggctc tgatgaaacc gtctcgtctt tatgatgctt atgaactgaa acatgccttg 300

aagggagctg gaaccaatga aaaagtactg accgaaatta ttgcttcacg taccccggaa 360

gaactgcgtg ccatcaaaca agtttatgaa gaagaatatg gctcaagcct ggaagatgac 420

gtggtggggg acacctcagg gtactaccag cgtatgttgg tggttctcct tcaggctaac 480

cgtgacccgg atgctggaat tgatgaagct caagttgaac aagatgctca ggctttattt 540

caggctggag aacttaaatg ggggaccgat gaagaaaagt ttatcaccat ctttggaacc 600

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ggagctggga ccgatgatca taccctcatc cgtgtcatgg tttcccgtag cgagattgat 840

ctgtttaaca tccgtaagga gtttcgtaag aattttgcca cctctcttta ttccatgatt 900

aagggagata cctctgggga ctataagaaa gctcttctgc tgctctgcgg agaagatgac 960

taa 963

Claims (9)

1. 一种优化的人Annexin V基因，其特征在于，优化的人Annexin V基因的核苷酸序列为SEQ ID NO: 1。

2.一种优化的人Annexin V基因的制作方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一）在基因数据库中获取人Annexin V基因；

步骤二）基因优化：对人Annexin V基因的编码区进行大肠杆菌密码子偏爱性的基因优化得到优化序列；优化序列编码的氨基酸与人Annexin V基因编码形成的氨基酸序列一致；优化序列为SEQ ID NO: 1；

步骤三）添加酶切位点：在优化序列的5′端添加一种内切酶的酶切位点，在优化序列的3′端添加另一种内切酶酶切位点，得到合成序列；

步骤四）基因合成：对得到的合成序列进行全基因合成。

3.如权利要求2所述的优化的人Annexin V基因的制作方法，其特征在于，所述步骤三）中，优化序列的5′端添加NdeI酶切位点，优化序列的3′端添加XhoI酶切位点。

4.一种含有SEQ ID NO: 1序列的质粒。

5.如权利要求4所述的含有SEQ ID NO: 1序列的质粒，其特征在于，所述质粒的起始质粒为pET23a质粒。

6.如权利要求5所述的含有SEQ ID NO: 1序列的质粒，其特征在于，SEQ ID NO: 1序列插入到pET23a质粒的NdeI酶切位点和XhoI酶切位点之间。

7.一种含有SEQ ID NO: 1序列的原核生物。

8.如权利要求7所述的含有SEQ ID NO: 1序列的原核生物，其特征在于，所述原核生物为大肠杆菌。

9.一种如权利要求1所述的优化的人Annexin V基因的使用方法，其特征在于，SEQ IDNO: 1序列导入大肠杆菌中翻译为重组蛋白，所述重组蛋白用于检测细胞凋亡。