CN104480200A - 测定癌症对表皮生长因子受体靶向性治疗反应性的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及测定癌症对表皮生长因子受体靶向性治疗反应性的方法。本发明涉及癌症对表皮生长因子受体(EGFR)治疗的反应性的方法。在优选的实施方案中,在erbB1基因的激酶结构域中的至少一个变异的存在赋予对酪氨酸激酶抑制剂gefitinib的敏感性。因而,对于这些突变的诊断测定将允许向那些最有可能对药物起反应的患者施用gefitinib、erlotinib和其它酪氨酸激酶抑制剂。

Description

测定癌症对表皮生长因子受体靶向性治疗反应性的方法
本申请是申请日为2005年3月31日,申请号为201210028631.5的、发明名称和本发明相同的发明专利申请的分案申请。
对相关申请的交叉参考
本申请在35U.S.C.119(e)之下要求递交于2004年3月31日的美国临时申请系列号:60/558,218,递交于2004年4月9日的美国临时申请系列号:60/561,095,递交于2004年4月27日的美国临时申请系列号:60/565,753,递交于2004年4月27日的美国临时申请系列号:60/565,985,递交于2004年5月25日的美国临时申请系列号:60/574,035,递交于2004年6月7日的美国临时申请系列号:60/577,916和递交于2004年7月29日的美国临时申请系列号:60/592,287的权益,在此将其内容全部并入作为参考。
政府支持
本发明由国立卫生研究院(NIH)奖助金号RO1 CA 092824,P50CA 090578,PO1 95281,和1K12CA87723-01支持,美国政府具有其某些权益。
技术领域和背景技术
上皮细胞癌症,例如,前列腺癌、乳癌、结肠癌、肺癌、胰癌、卵巢癌、脾癌、睾丸癌、胸腺癌等,是特征为上皮细胞异常、加速生长的疾病。这种加速的生长最初引发肿瘤形成。最后,还能够发生向不同器官位点的转移。尽管已经在各种癌症的诊断和治疗上取得了一些进展,但这些疾病仍然导致显著的死亡率。
肺癌是工业化国家中主要的癌症死亡原因。根据细胞在显微镜下如何显现,将在肺中开始的癌症分成两种主要类型,非小细胞肺癌和小细胞肺癌。非小细胞肺癌(鳞状细胞癌,腺癌,和大细胞癌)一般比小细胞肺癌更慢地传播到其它器官。大约75%的肺癌病例被分类为非小细胞肺癌(例如,腺癌),而其它25%为小细胞肺癌。非小细胞肺癌(NSCLC)是在美国、日本和西欧癌症死亡的主要原因。对于患有进行性疾病的患者来说,化疗在存活上提供了最适度的益处,但代价是显著的毒性,这强调了对治疗剂的需要,所述治疗剂特异性靶向脂导肿瘤生长的关键遗传损伤(Schiller JH等,N Engl JMed,346:92-98,2002)。
表皮生长因子受体(EGFR)是170千道尔顿(kDa)的膜结合蛋白,其表达于上皮细胞的表面上。EGFR是蛋白质酪氨酸激酶的生长因子受体家族的成员,所述激酶是一类细胞周期调控分子(W.J.Gullick等,1986,Cancer Res.,46:285-292)。EGFR当它的配体(EGF或TGF-α)结合细胞外结构域时被激活,导致受体细胞内酪氨酸激酶结构域的自体磷酸化(S.Cohen等,1980,J.Biol.Chem.,255:4834-4842;A.B.Schreiber等,1983,J.Biol.Chem.,258:846-853)。
EGFR是促进生长的癌基因,erbB或ErbB1的蛋白产物,但是该基因是一种家族的成员,即原癌基因的ERBB家族,其据信在许多人类癌症的发生和发展中发挥重要作用。特别地,已经在乳腺、膀胱、肺、头、颈和胃癌以及胶质母细胞瘤中观察到EGFR表达的提高。癌基因的ERBB家族编码四种,结构相关的跨膜受体,即,EGFR,HER-2/neu(erbB2),HER-3(erbB3)和HER-4(erbB4)。临床上,已经报道肿瘤中的ERBB癌基因扩增和/或受体过表达与疾病复发和患者不良预后,以及与治疗中的反应性有关(L.Harris等,1999,Int.J.Biol.Markers,14:8-15;和J.Mendelsohn和J.Baselga,2000,Oncogene,19:6550-6565)。
EGFR由三个主要结构域组成,即,细胞外结构域(ECD),其被糖基化并且包含配体结合性穴和两个半胱氨酸富集区;一个短的跨膜结构域,和一个具有固有酪氨酸激酶活性的细胞内结构域。所述跨膜区将配体结合结构域连接到细胞内结构域上。氨基酸和DNA序列分析,以及EGFR的非糖基化形式的研究表明EGFR的蛋白质主链具有132kDa的质量,具有1186个氨基酸残基氨基酸残基(A.L.Ullrich等,1984,Nature,307:418-425;J.Downward等,1984,Nature,307:521-527;C.R.Carlin等,1986,Mol.Cell.Biol.,6:257-264;和F.L.V.Mayes和M.D.Waterfield,1984,The EMBO J.,3:531-537)。
EGF或TGF-α与EGFR结合激活信号转导途径并导致细胞增殖。EGFR的二聚体化,构象变化以及内化作用作用来传递细胞同信号,导致细胞生长调控(G.Carpenter和S.Cohen,l979,Ann.Rev.Biochem.,48:193-216)。影响生长因子受体功能,或导致受体和/或配体过表达的遗传变化导致细胞增殖。此外,已经确定EGFR在细胞分化、细胞运动性增强,蛋白质分泌,新血管形成,入侵,转移和癌细胞对化疗剂和放射的耐受性中发挥作用。(M.-J.Oh等,2000,Clin.Cancer Res.,6:4760-4763)。
已经鉴定了多种EGFR的抑制剂,包括多种已经进行临床试验用于治疗各种癌症。近期的概述,见de Bono,J.S.和Rowinsky,E.K.(2002),″The ErbB receptor Family:A Therapeutic Target ForCancer″,Trends in Molecular Medicine,8,S 19-26。
在癌症的治疗中对于治疗性干预有希望的一组靶标包括HER-激酶axis的成员。它们在实体上皮肿瘤,例如,前列腺、肺和乳腺肿瘤中经常上调,并且在胶质母细胞瘤中也上调。表皮生长因子受体(EGFR)是HER-激酶axis的成员,并且已经是开发几种不同癌症疗法的靶标选择。EGFR酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKIs)是这些疗法之一,因为酪氨酸残基的可逆性磷酸化是EGFR途径激活所必需的。换句话说,EGFR-TKIs阻抑对促进和/或维持细胞信号途径负责的细胞表面受体,所述信号途径诱导肿瘤细胸生长和分裂。具体地,据信这些抑制剂干扰EGFR激酶结构域,称为HER-1。更有希望的EGFR-TKIs为三个系列的化合物:喹唑啉类、吡啶并嘧啶类和吡咯并嘧啶类。
在临床开发中两种更先进的化合物包括Gefitinib(由AstraZeneca UK Ltd.开发的化合物ZD1839;商品名IRESSA;下文为″IRESSA″)和Erlotinib(由Genentech,Inc.and OSIPharmaceuticals,Inc.开发的化合物OSI-774;商品名TARCEVA;下文为″TARCEVA″);二者都产生了令人鼓舞的临床结果。用IRESSA和TARCEVA进行常规的癌症治疗都包括每天口服不超过500mg的各自化合物。在2003年5月,当IRESSA被批准用于治疗晚期非小细胞肺癌患者时,它在这些产品中成为第一个进入美国市场的。
IRESSA是一种口服活性喹唑啉,其通过直接抑制EGFR分子上的酪氨酸激酶磷酸化而起作用。它竞争三磷酸腺苷(ATP)结合位点,导致HER-激酶axis的抑制。IRESSA反应的确切机制并不完全清楚,不过,研究提示EGFR的存在是其作用的必要条件。
在使用这些化合物中的显著限制是其受体在他们开始对治疗反应后可能会发展出对它们的治疗效果的耐受性,或者他们可能在任何可测量的程度上完全不对EGFR-TKIs反应。事实上,只有10-15%的晚期非小细胞肺癌患者对EGFR激酶抑制剂反应。因而,在靶向性治疗中对于那些最可能受益于这种治疗的个体来说更好地理解在对IRESSA和TARCEVA的敏感性之下的分子机制将是极其有益的。
本领域明显需要癌症的令人满意的治疗,特别是上皮细胞癌症如肺、卵巢、乳腺、脑、结肠和前列腺癌症,其并入了TKI治疗的益处并克服了由患者展现的无反应性。这种治疗能够对个体的健康具有戏剧性的影响,特别是癌症特别常见的老人。
发明内容
酪氨酸激酶抑制剂(TKI)疗法如gefitinib()在大多数爱上述癌症影响的个体中并不有效。本发明人令人吃惊地发现EGFR激酶结构域躯体变异的存在基本上提高了EGFR对TKI如IRESSA,TARCEVA的敏感性。例如小于30%的患有这种癌症的患者易受由目前TKIs进行的治疗的影响,而大于50%,更优选60,70,80,90%的具有EGFR激酶结构域突变的患者是易受影响的。此外,这些突变赋予EGFR提高的激酶活性。因而,具有这些突变的患者将可能对目前的酪氨酸激酶抑制剂(TKI)疗法,例如,gefitinib有反应。
因此,本发明提供一种确定在受癌症影响的人类患者中表皮生长因子受体(EGFR)靶向性治疗有效性的可能性的新方法。该方法包括相对于野生型erbB1基因检测所述患者的erbB1基因的激酶结构域中的至少一种核酸变异的存在或缺失。至少一种变异的存在表示EGFR靶向性治疗可能有效。优选地,所述核苷酸变异提高EGFR的激酶活性。随后可以用EGFR靶向性治疗来治疗所述患者。在本发明的一个实施方案中,所述EGFR靶向性治疗是酪氨酸激酶抑制剂。在优选的实施方案中,所述酪氨酸激酶抑制剂是苯氨基喹唑啉。所述苯氨基喹唑啉可以是合成的苯氨基喹唑啉。优选地,所述合成的苯氨基喹唑啉为gefitinib或erlotinib。在另一个实施方案中,所述EGFR靶向性治疗是不可逆的EGFR抑制剂,包括4-二甲基氨基-but-2-烯酸[4-(3-氯-4-氟-苯氨基)-3-氰基-7-乙氧基-喹啉-6-基]-酰胺(″EKB-569″,有时称作″EKI-569″,见例如WO/2005/018677和Torrance等,Nature Medicine,vol.6,No.9,Sept.2000,p.1024)和/或HKI-272或HKI-357(Wyeth;见Greenberger等,Proc.11th NCIEORTC-AACR Symposium on New Drugs in Cancer Therapy,Clinical Cancer Res.Vol.6Supplement,Nov.2000,ISSN 1078-0432;in Rabindran等,Cancer Res.64:3958-3965(2004);Holbro andHynes,Ann.Rev.Pharm.Tox.44:195-217(2004);Tsou等,j.Med.Chem.2005,48,1107-1131;and Tejpar等,J.Clin.Oncol.ASCOAnnual Meeting Proc.Vol.22,No.14S:3579(2004))。
在本发明的一个实施方案中,所述EGFR获自有或处于发生癌症危险中的患者的生物样品。EGFR(或erbB1基因)激酶结构域中的变异影响ATP结合口袋的构象结构。优选地,EGFR激酶结构域中的变异是框内删除或外显子18、19、20或21中的取代。
在一个实施方案中,所述框内删除在EGFR(erbBl)的外显子19中。优选地所述外显子19中的框内删除在删除处至少由密码子747,748,749,和750上的氨基酸亮氨酸、精氨酸、谷氨酸和丙氨酸组成。在一个实施方案中,所述框内删除包含核苷酸2235-2249并删除氨基酸746-750(序列谷氨酸,亮氨酸,精氨酸,谷氨酸和丙氨酸),见表2,表S2,图2B,图4A,图5,图6C,和图8C。在另一个实施方案中,所述框内删除包含核苷酸2236-2250并删除氨基酸氨基酸746-750,见表S2,图5,和图6C。或者,所述框内删除包含核苷酸2240-2251,见表2,图2C,图4A,图5,或核苷酸2240-2257,见表2,表S3A,图2A,图4A,图5,图6C,和图8E。或者,所述框内删除包含核苷酸2239-2247与在核苷酸2248上的半胱氨酸对鸟嘌呤的取代,见表S3A和图8D,或核苷酸2238-2255的删除和核苷酸2237上的胸腺嘧啶对腺嘌呤的取代,见表S3A和图8F,或核苷酸2254-2277的删除,见表S2(SEQ ID NO:437)。或者,所述删除包含核苷酸2239-2250delTTAAGAGAAGCA(SEQ ID NO:554);2251A>C,或2240-2250delTAAGAGAAGCA(SEQ ID NO:720),或2257-2271delCCGAAAGCCAACAAG(SEQ ID NO:721),如表S3B中所示。
在另一个实施方案中,所述取代在EGFR的外显子2中。所述外显子2中的取代包含至少一个氨基酸。在一个实施方案中,所述外显子2中的取代在核苷酸2573上包含一个鸟嘌呤对胸腺嘧啶的取代,见图4A和图5。这种取代导致氨基酸取代,其中野生型亮氨酸在氨基酸858上被精氨酸所替换,见图5,表2,表S2,表S3A,图2D,图6A,图8B,和SEQ ID NO:512。或者,所述外显子2中的取代在核苷酸2582上包含一个腺嘌呤对胸腺嘧啶的取代,见图4A和图5。这种取代导致了氨基酸取代,其中野生型亮氨酸在氨基酸861上被谷氨酰胺所替换,见图5(分别是SEQ ID NOS 740-762,以出现的顺序),表2(分别是SEQ ID NOS 730-739,以出现的顺序),图2E,表S3B(分别是SEQ ID NOS 554&720-729,以出现的顺序),和SEQ IDNO:512。
所述取代还可以在EGFR的外显子18中。在一个实施方案中,所述外显子18中的取代是在核苷酸2155上胸腺嘧啶对鸟嘌呤的取代,见图4A和图5。这种取代导致了氨基酸取代,其中野生型甘氨酸在密码子719上被半胱氨酸所取代,见图5,SEQ ID NO:512。在另一个实施方案中,所述外显子18中的取代是在核苷酸2155上腺嘌呤对鸟嘌呤的取代,导致氨基酸取代,其中野生型甘氨酸在密码子719上被丝氨酸所取代,见表S2,图6B,图8A,图5和SEQ ID NO:512。
在另一个实施方案中,所述取代是在如图5所示的核苷酸2316之后和核苷酸2317之前鸟嘌呤,鸟嘌呤和胸腺嘧啶(GGT)的插入(23162317ins GGT)。这也可以描述为缬氨酸(V)在氨基酸772上的插入(P772_H733insV)。其它的突变显示于表S3B中并包括,例如,在如图5所示的的核苷酸2309之后和核苷酸2310之前CAACCCGG的插入和在如图5所示的的核苷酸2311之后和核苷酸2312之前GCGTGGACA的插入。所述取代还可以在外显子20中并且在一个实施方案中为在核苷酸2334和2335上的AA对于GG的取代,见表S3B。
总之,在优选的实施方案中,erbB1基因的核酸变异是在如图5所示的核苷酸2155上胸腺嘧啶对鸟嘌呤或腺嘌呤对鸟嘌呤的取代,在如图5所示的核苷酸2235-2249,2240-2251,2240-2257,2236-2250,2254-2277,或2236-2244的删除,在如图5所示的核苷酸2316之后和在核苷酸2317之前核苷酸鸟嘌呤,鸟嘌呤,和胸腺嘧啶(GGT)的插入,以及在如图5所示的核苷酸2573上鸟嘌呤对胸腺嘧啶或在2582上腺嘌呤对胸腺嘧啶的取代。
通过扩增编码受体的核酸片段可以测定至少一个核酸变异的存在或缺失的检测。待扩增的片段为1000核苷酸长,优选地,500核苷酸长,最优选100核苷酸长或更小。待扩增的片段可以包括多种变异。
在另一个实施方案中,至少一个核酸变异的存在或缺失的检测提供了将包含变异位点的EGFR核酸与至少一种核酸探针接触。所述探针优选地与包括变异位点并且在变异位点包含互补核苷酸的核酸序列在选择性杂交条件下杂交。杂交可以用可检测的标记进行检测。
在又一个实施方案中,至少一个核酸变异的存在或缺失的检测包括对至少一个核酸序列进行测序并将获得的序列与已知的erbB1核酸序列比较。或者,至少一个核酸变异的存在或缺失包含至少一个核酸序列的质谱测定。
在优选的实施方案中,至少一个核酸变异的存在或缺失的检测包括进行聚合酶链式反应(PCR)。扩增包含假定变异的erbB1核酸序列并测定扩增的核酸的核苷酸序列。测定扩增的核酸的核苷酸序列包括对至少一个核酸片段进行测序。或者,通过利用任何能够根据其大小分离扩增产物的方法,包括自动的和手动的凝胶电泳等等可以分析扩增产物。
或者,至少一个核酸变异的存在或缺失的检测包括测定基因中多种变异的单倍型。
在另一个实施方案中,通过分析erbB1基因产物(蛋白质)t可以检测EGFR变异的存在或缺失。在这种实施方案中,使用特异性结合变异EGFR的探针。在优选的实施方案中,所述探针是优选结合到变异EGFR上的抗体。变异EGFR的存在预示着EGFR靶向性治疗有效的可能性。或者,所述探针可以是抗体片段,嵌合性抗体,人源化抗体或适体。
本发明进一步提供一种探针,其在选择性结合条件下特异性结合到在EGFR基因(erbB1)中包含至少一个核酸变异的核苷酸序列上。在一个实施方案中,所述变异是在erbB1的激酶结构域中的突变,其赋予ATP结合性口袋的结构变化。
本发明的探针可以包含大约500个核苷酸碱基的核苷酸序列,优选大约100个核苷酸碱基,最优选大约50个核苷酸碱基或大约25个核苷酸碱基或更小的长度。所述探针可以由DNA,RNA,或肽核酸(PNA)组成。另外,所述探针可以包含可检测的标记,如例如,荧光或酶学标记。
本发明另外提供一种在受癌症影响的患者中测定表皮生长因子受体(EGFR)靶向性治疗有效的可能性的新方法。所述方法包括测定来自患者的生物样品中的EGFR的激酶活性。与正常对照相比,在用EGFR配体刺激之后激酶活性的提高表明EGFR靶向性治疗很可能是有效的。
本发明进一步提供一种治疗具有或处于形成癌症的危险之中的患者的新方法。所述方法包括确定患者的EGFR的激酶结构域是否包含至少一种核酸变异。优选地,EGFR位于肿瘤或癌症的位点上并且所述核酸变异是躯体性的。这种变异的存在表示EGFR靶向性治疗将是有效的。如果所述变异存在,向患者施用酪氨酸激酶抑制剂。
如上,向经鉴定的患者施用的酪氨酸激酶抑制剂可以是苯氨基喹唑啉或不可逆的酪氨酸激酶抑制剂,如例如,EKB-569,HKI-272和/或HKI-357(Wyeth)。优选地,所述苯氨基喹唑啉是合成的的苯氨基喹唑啉并且最优选地所述合成的的苯氨基喹唑啉是gefitinib和erlotinib。
要通过本发明的方法治疗的癌症包括,例如,但不限于,胃肠癌、前列腺癌、卵巢癌、乳癌、头颈癌、肺癌、非小细胞肺癌、神经系统癌、肾癌、视网膜癌、皮肤癌、肝癌、胰癌、生殖-泌尿系统癌和膀胱癌。在优选的实施方案中,所述癌症是非小细胞肺癌。
还包括实施本发明的PCR方法的试剂盒。所述试剂盒包括至少一对设计来退火到基因边界核酸区上的简并引物对,所述基因编码EGFR激酶结构域的ATP结合口袋。此外,所述试剂盒包含实施PCR扩增所必需的产品和试剂,以及说明书。
在优选的实施方案中,包含在试剂盒中的引物对选自SEQ IDNO:505,SEQ ID NO:506,SEQ ID NO:507,和SEQ ID NO:508。在实施例中的表6和7中列出的引物也是优选的。
在又一个实施方案中,本发明公开了一种选择化合物的方法,所述化合物抑制变异表皮生长因子受体(EGFR)的催化性激酶活性。作为第一步,将变异EGFR与可能的化合物接触。随后检测所述变异EGFR得到的激酶活性并选择抑制变异EGFR的激酶活性的化合物。在一个实施方案中,所述变异EGFR包含在细胞中。
还可以使用所述方法选择变异EGFR的激酶活性的化合物,所述变异EGFR在激酶结构域中具有次发突变,其赋予对TKI,例如gefitinib或erlotinib的耐受性。
在一个实施方案中,对所述变异EGFR进行标记。在另一个实施方案中,将EGFR结合到固体支持物上。在优选的实施方案中,所述固体支持物是蛋白质芯片。
在本发明的又一个实施方案中,公开了一种抑制变异表皮生长因子受体(EGFR)的催化性激酶活性的药物组合物。抑制变异EGFR的催化剂激酶活性的化合物选自抗体、抗体片段、小分子、肽、蛋白质、反义核酸、核酶、PNA、siRNA、寡核苷酸适体,和肽适体。
还公开了一种治疗患有EGFR介导性疾病的患者的方法。按照该方法,对患者施用抑制变异表皮生长因子受体(EGFR)的催化性激酶活性的药物组合物。
在一个实施方案中,所述EGFR介导性疾病是癌症。在优选的实施方案中,所述癌症是上皮起源的。例如,所述癌症是胃肠癌、前列腺癌、卵巢癌、乳癌、头颈癌、肺癌、非小细胞肺癌、神经系统癌、肾癌、视网膜癌、皮肤癌、肝癌、胰癌、生殖-泌尿系统癌和膀胱癌。在优选的实施方案中,所述癌症是非小细胞肺癌。
在另一个实施方案中,公开了一种预测在erbB1基因的激酶结构域中获得次发突变(或选择突变)的方法。将表达erbB1的变异形式的细胞与有效的,然而是亚致死剂量的酪氨酸激酶抑制剂接触。选择抗酪氨酸激酶抑制剂生长阻滞作用的细胞并对erbB1核酸分析erbB1激酶结构域中其它突变的存在。在一个实施方案中,所述细胞是体外的。在另一个实施方案中,所述细胞获自转基因动物。在一个实施方案中,所述转基因动物是小鼠。在此小鼠模型中,待研究的细胞获自肿瘤活检组织。通过本发明选择的在erbB1激酶结构域中包含次发突变的细胞可以用在以上方法中以选择化合物,所述化合物抑制在激酶结构域中具有次发突变的变异EGFR的激酶活性。
在预测在erbB1基因的激酶结构域中获得次发突变的另一个实施方案中,首先将表达erbB1基因变异形式的细胞与效量的诱变剂接触。所述诱变剂是,例如,甲磺酸乙酯(EMS),N-乙基-N-亚硝基脲(ENU),N-甲基-N-亚硝基脲(MNU),phocarbaxine hydrochloride(Prc),甲磺酸甲酯(MeMS),苯丁酸氮芥(Chl),美法仑,porcarbazinehydrochloride,环磷酰胺(Cp),硫酸二乙酯(Et2SO4),丙烯酰胺单体(AA),三亚乙基密胺(TEM),氮芥,长春新碱,二甲基亚硝胺,N-甲基-N′-硝基-亚硝基胍(MNNG),7,12二甲基苯并(a)蒽(DMBA),环氧乙烷,六甲基磷酰胺,bisulfan,或ethylmethanesulforate(EtMs)。随后将细胞与有效的,但亚致死剂量的酪氨酸激酶抑制剂接触。选择抗酪氨酸激酶抑制剂生长阻滞作用的细胞并对erbB1核酸分析erbB1激酶结构域中其它突变的存在。
附图说明
图1A-1B显示在顽固性非小细胞肺癌(NSCLC)中Gefitinib反应的代表性图示。病例6的胸腔CT扫描(表1),显示(图1A)用gefitinib治疗前在右肺中的大的质量,(图1B)在开始Gefitinib治疗后的六周出现显著的改善。
图2显示Gefitinib反应性肿瘤中的EGFR突变。
图2A-2C显示肿瘤样本中EGFR基因的核苷酸序列,在激酶结构域内具有杂合的框内删除(双峰)(出现顺序分别为SEQ ID NOS643-644和690-699)。在有义和反义方向的追踪显示证明了删除的两人断裂点;野生型核苷酸序列以大写字母显示,而突变序列以小写字母显示。delL747-T751insS突变的5′断裂点的前面为T-C取代,其并不改变编码的氨基酸。
图2D和图2E显示杂合的错义突变(箭头),导致在酪氨酸激酶结构域内的氨基酸取代(SEQ ID NOS 701&703)。双峰代表杂合突变位点上的两个核苷酸。为了进行比较,还显示了相应的野生型序列(SEQ ID NOS 700&702)。
图2F是二聚EGFR分子被EGF配体结合的流程图。突出了细胞外结构域(包含两种受体配体[L]-结构域和furin-like结构域),跨膜区,和细胞质结构域(包含催化性激酶结构域)。指出了用途受体激活标记的自体磷酸化位点的酪氨酸1068(Y-1068)的位置,以及由EGFR自体磷酸化激活的下游效应剂(STAT3,MAP激酶(MAPK),和AKT)。显示了肿瘤相关突变的定位,都在酪氨酸激酶结构域中。
图3表明突变EGFR的增强的EGF依赖型激活和突变EGFR对Gefitinib提高的敏感性。
图3A显示野生型EGFR相比,在添加EGF到血清饥饿细胞中后delL747-P753insS和L858R突变体的配体诱导的激活时间过程。EGFR自体磷酸化被用作受体激活的标记,与Cos-7细胞中表达的EGFR总体水平(对照;右板)相比,使用用特异性识别EGFR的磷酸化酪氨酸1068残基的抗体的蛋白质印迹(左板)。在加入EGF(10ng/ml)的时间间隔上测量EGFR的自体磷酸化。
图3B是野生型和突变型受体磷酸化作用的EGF诱导的图示(见版A)。利用NIH图像软件对来自三个独立实验的放射自显影进行量化;将EGFR磷酸化作用的强度规格化为总体蛋白质表达,并显示为受体的百分比激活,带有标准偏差。
图3C显示由Gefitinib产生的EGFR激活的剂量依赖型抑制。通过表达野生型或突变型受体的Cos-7细胞的蛋白质印迹分析证明EGFR的酪氨酸1068的自体磷酸化,并用100ng/ml的EGF刺激30min。如所示对细胞不处理(U)或用提高浓度的Gefitinib预处理3hrs(左板)。表达的EGFR蛋白总量显示为对照(右板)。
图3D显示来自对图版3C所述的两种实验的结果的量化(NIH图像软件)。将磷酸化的EGFR浓度规格化为蛋白质表达水平并表示为受体的百分比激活。
图4显示了在EGFR的ATP-结合性口袋内关键位点上的突变的聚类。
图4A显示在多种NSCLC情况下(SEQ ID NOS 495-504(DNA)),EGFR基因的外显子19中重叠的框内删除和外显子21的错义突变的位置。对每种外显子显示部分核苷酸序列,通过虚线标记删除并突出和对错义突变下划线;显示野生型EGFR核苷酸和氨基酸序列(SEQID NOS 493&494(DNA)&509-510(氨基酸))。
图4B显示EGFR ATP裂口的立体结构,两翼是激酶结构域的氨基(N)和羧基(C)凸起部(源自PDB1M14的等同物,并利用Cn3D软件展示)。抑制剂Gefitinib,图示占据ATP裂口。显示了两种错义突变的定位,在激酶的激活性环内;三个框内删除都存在于另一个环内,在ATP裂口侧翼。
图4C显示EGFR激酶结构域的特写,显示与结合ATP或抑制剂相关的氨基酸残基。
具体地,4-苯氨基喹唑啉化合物如gefitinib通过占据ATP结合位点抑制催化,其中它们与甲硫氨酸793(M793)和半胱氨酸775(C775)残基形成氢键,而它们的苯胺环接近甲硫氨酸766(M766),赖氨酸(K745),和亮氨酸788(L788)残基。预测突变所靶向的环内的框内删除相对于抑制剂改变这些氨基酸的位置。显示突变的残基在酪氨酸激酶的激活环内。
图5显示erbB1基因的核苷酸和氨基酸序列。所述氨基酸被描述为本领域技术人员已知的单个字母。通过患者数目来突出激酶结构域中的核苷酸变异,见表2。如图5所示的包括核苷酸1到3633。SEQIDNO:512包括氨基酸1到1210。
图6A-6C:在EGFR和B-Raf激酶结构域内的选定区的序列比对。人NSCLC中EGFR突变的描绘。iEGFR(gb:X00588;)NSCLC肿瘤中的突变以灰色突出显示。在多种肿瘤类型(5)中的B-Raf(gb:M95712)突变以黑色突出显示。星号表示残基EGFR和B-Raf之间保守的残基。图6A描绘了激活环中的L858R突变(SEQ ID NOS477-479)。图6B描绘了P环中的G719S突变(SEQ ID NOS 480-482)。图6C描绘了EGFR外显子19中的删除突变(SEQ ID NOS 483-489)。
图7:EGFR激酶结构域的三维结构中的错义突变G719S和L858R和Del-1删除的位置。激活环以黄色显示,P环以蓝色显示并指出C端凸起和N端凸起。由突变或删除靶向的残基以红色突出显示。Del-1突变靶向密码子746-750的残基ELREA。突变定位在激酶内高度保守的区域中并发现于p环和激活环中,其包围着ATP并且也是gefitinib和erlotinib预测结合的区域。
图8A-8F.来自正常组织和来自肿瘤组织的EGFR DNA的代表性色谱。鉴定的突变的定位如下。图8A描绘了外显子18激酶结构域P环(SEQ ID NOS 704-705)。图8B描绘了外显子21激酶结构域A-环(SEQ ID NOS 706-707)。图8C描绘了外显子19激酶结构域Del-1(SEQ ID NOS 708-710)。图8D描绘了外显子19激酶结构域Del-3(SEQ ID NOS 711-713)。图8E描绘了外显子19激酶结构域Del-4(SEQ ID NOS 714-716)。图8F描绘了外显子19激酶结构域Del-5(SEQ ID NOS 717-719)。
图9:EGFR和BCR-ABL多肽的序列比对和赋予药物耐受性表型的残基的定位。将由GenBank编号NM005228中公开的核苷酸编码的EGFR多肽(SEQ ID NO:492)和由Gen Bank编号M14752中公开的核苷酸序列编码的BCR-ABL多肽(SEQ ID NO:491)进行比对并用阴影标注保守性残基。通过星号表示赋予对酪氨酸激酶抑制剂imatinib(STI571,Glivec/Gleevec)耐受性的BCR-ABL突变。
图10显示对于患有转移性NSCLC患者来说决定进行EGFR测试的过程。
图11EGFR外显子18-24的图(未给出比例尺)。箭头描述了鉴定突变的定位。星号表明在每个位置上具有突变的患者的数目。单相交图描绘了外显子19删除的重叠,以及具有每个删除的患者的数目(如图5所示的的核苷酸2233-2277和SEQ ID NO:512的残基745-749)。注意这些结果并没有包括目前所有的EGFR突变。
具体实施方式
本发明提供一种确定在受癌症影响的人类患者中表皮生长因子受体(EGFR)靶向性治疗有效的可能性的新方法。该方法包括检测所述患者的erbB1基因的激酶结构域中的至少一种核酸变异的存在或缺失。至少一种变异的存在表示EGFR靶向性治疗可能有效。优选地,所述核苷酸变异提高EGFR的激酶活性。随后可以用EGFR靶向性治疗来治疗所述患者。在本发明的一个实施方案中,所述EGFR靶向性治疗是酪氨酸激酶抑制剂。在优选的实施方案中,所述酪氨酸激酶抑制剂是苯氨基喹唑啉。所述苯氨基喹唑啉可以是合成的苯氨基喹唑啉。优选地,所述合成的苯氨基喹唑啉为gefitinib或erlotinib。
定义:
术语″ErbB1″,″表皮生长因子受体″,和″EGFR″在本文中相互交换使用并指如,例如,在Carpenter等Ann.Rev.Biochem.56:881-914(1987)中公开的天然序列EGFR,包括其变体(例如如在Humphrey等PNAS(USA)87:4207-4211(1990)中的删除突变EGFR)。ErbB1指编码EGFR蛋白产物的基因。
本文所用的术语″提高激酶活性的核苷酸变异″指基因的核苷酸序列中的变异(即突变),其导致提高的激酶活性。提高的激酶活性是在所述核酸中的变异的直接结果并且所述基因编码的蛋白质相关联。
本文所用的术语″药物″或″化合物″指施用给个体以治疗或预防或控制疾病或状况的化学实体或生物学产品,或化学实体或生物学产品的组合。优选地,但并非必需地,所述化学实体或生物学产品是低分子量化合物,但是也可以是较大的化合物,例如,核酸的寡聚体,氨基酸,或糖类,包括但不限于蛋白质,寡核苷酸,核酶,DNA酶,糖蛋白,siRNAs,脂蛋白,适体,及其改进和组合。
在本发明的背景中术语″基因型″指基因的特定等位形式,其可以用在特定位点存在于核酸序列中的特定核苷酸来定义。
术语″基因的变异形式″,″基因的形式″,或″等位基因″指基因在群体中的一种特定形式,所述特定形式与相同基因的其它形式在所述基因序列中的至少一个,经常是大于一个变异位点的序列上有所不同。在基因的不同等位基因之间差异的这些变异位点上的序列称作″基因序列变异″或″变异″或″变体″。本领域已知的其它等同术语包括突变和多态性,尽管突变经常用来指与有害表型相关联的等位基因。在本发明的优选方面,所述变异选自由本文变异表中所列出的变异。
在本发明的背景下,术语″探针″指能够可检测地区分结构不同的靶分子的分子。根据所用探针的类型和靶分子的类型,检测可以以多种不同方式实现。因而,例如,检测可以基因靶分子的活性水平的区别,但优选基于特异性结合的检测。这种特异性结合的例子包括抗体结合和核酸探针杂交。因而,例如,探针可以包括酶底物,抗体和抗体片段,优选核酸杂交探针。
如本文所用的,术语″有效″和″有效性″包括药学有效性和生理安全性。药学有效性指治疗在患者中导致所需的生物学作用的能力。生理安全性指在细胞,组织和/或生物水平上的毒性,或其它有害生理作用的水平(通常称为副作用),其是由治疗的施用而产生的。″有效性较小的″指治疗导致药学有效性的治疗上明显较低的水平和/或有害生理作用的治疗上较高的水平。
术语″引物″正如本文所用的,是指这样一种寡核苷酸:即,当这种寡核苷酸被置于催化合成与多核苷酸互补的引物延伸产物的条件下时,它能够用作沿互补链进行多核苷酸合成的起始点。这些条件包括在适当的缓冲液(″缓冲液″包括作为辅因子或影响pH、离子强度等的成份)中,和在适当的温度下存在四种不同的三磷酸核苷酸或核苷类似物以及一种或多种用于聚合的试剂例如DNA聚合酶和/或反转录酶。引物必须长得足以在用于聚合酶的试剂存在时引发延伸产物的合成。典型的引物含有长至少大约5个核苷酸的基本上与靶序列互补的序列,但是在某种程度上较长的引物是优选的。引物通常含有大约15-26个核苷酸,但也可以采用更长的引物。
引物总是含有基本上与靶序列,即引物可以与之退火的待扩增的特异性序列,互补的序列。除了与靶序列互补的序列之外,引物还可任选地包含其它序列。术语″启动子序列″定义了由RNA聚合酶特异性识别的核酸序列单链,所述RNA聚合酶结合到所识别的序列上并引发产生RNA转录本的转录过程。原则上,可以采用任何启动子序列,只要对于该启动子具有已知的可获得的能够识别起始序列的聚合酶即可。已知的有用启动子是那些被某些噬菌体聚合酶,如噬菌体T3、T7或SP6识别的启动子。
″微阵列″是在固体支持物表面上形成的具有优选不连续区域,每一区域具有限定的面积,的线性或二维阵列。由单个固体支持物的表面上待检测的靶多核苷酸的总数来确定微阵列上不连续区域的密度,优选的是至少大约50/cm2,更优选的是至少大约100/cm2,甚优选的是至少大约500/cm2,并且更甚优选的是至少大约1,000/cm2。正如本文所用的,DNA微阵列是置于芯片或其它表面上的用来扩增或克隆靶多核苷酸的寡核苷酸引物阵列。由于每个特定引物组在阵列中的位置是已知的,因此基于靶多核苷酸与微阵列中特定位置的结合,可以确定它们的特性。
术语″标记物″是指能够产生指示测定样品中存在靶多核苷酸的可检测信号的组合物。适宜的标记物包括放射性同位素、核苷酸发色团、酶、底物、荧光分子、化学发光部分、磁性颗粒、生物发光部分以及类似物质。于是,标记物是可以由分光的、光化学的、生物化学的、免疫化学的、电子的、光学的或化学的工具检测的任何组合物。
术语:″支持物″是指常规的支持物,如珠、颗粒、棒、纤维、过滤器、膜以及硅烷或硅酸盐支持物,如玻片。
术语″扩增″广义上是指产生扩增产物,所述扩增产物可包括例如其它靶分子,或者靶样分子或者与靶分子互补的分子,所述分子是由样品中靶分子的存在而产生的。在靶物是核酸的情形中,利用DNA或RNA聚合酶或转录酶可以酶促产生扩增产物。
如本文所用的,″生物学样品″指从个体中分离的组织或液体的样品,它包括但不限于,例如,血液、血浆、血清、肿瘤活检组织、尿液、粪便、痰、脊髓液、胸水、乳头吸取物、淋巴液、皮肤、呼吸道、肠道和泌尿生殖道的外分泌物、泪液、唾液、乳液、细胞(包括但不限于血细胞)、肿瘤、器官,也包括体外细胞培养组分的样品。在优选的实施方案中,样品来自切除术、支气管活检组织,或原发性或转移性肿瘤的核心针活检组织,或来自胸水的细胞团。此后,使用细针吸取样品。样品可以是石蜡包埋或冷冻的组织。
术语″抗体″意为一种免疫球蛋白,其能够结合抗原。如本文所用的抗体意为包括能够结合目标抗原或抗原片段的抗体片段,例如F(ab′)2,Fab′,Fab。优选地,所述抗体结合抗原抑制EGFR的变异形式的活性。
术语″人源化抗体″在本文用于描述完全的抗体分子,即由两条完全的轻链和两种完全的重链组成,以及只由抗体片段,例如Fab,Fab′,F(ab)2,和Fv组成,其中CDRs源自非人来源而剩余的Ig分子的部分或其部分源自人抗体,优选地产生自编码人抗体的核酸序列。
术语″人抗体″和″人源化抗体″在本文用来描述一种抗体,该抗体分子的所有部分都源自编码人抗体的核酸序列。这些人抗体是适于用在抗体疗法中,因为这些抗体将在人患者中引发小的或不引发免疫反应。
术语″嵌合性抗体″在本文中用于描述抗体分子以及抗体片段,如上面在术语″人源化抗体″的定义中所述。术语″嵌合性抗体″表达人源化抗体。嵌合性抗体具有源自第一种哺乳类物种的重链或轻链氨基酸序列的至少一部分以及源自第二种不同的哺乳类物种的重链或轻链氨基酸序列的另一部分。
优选地,所述可变区源自非人哺乳类物种并且恒定区源自人类物种。具体地,嵌合性抗体优选产自非人哺乳动物的编码可变区的9个核苷酸序列以及来自人的编码抗体恒定区的核苷酸序列。
表2是与本发明中所述方法相关的erbB1的激酶结构域中的DNA序列变异的部分列表。这些变化由本发明人在来自对gefitinib起反应的患有NSCLC的患者以及不接触gefitinib的患者的生物学样品的研究中鉴定。
利用任一种本领域公知的技术可以将核酸分子从特定的生物学样品中分离出来,所选的特定分离方法适于特定的生物学样品。例如冻融和碱裂解方法可以用于从固体物质中获得核酸分子;热和碱裂解方法可以用于从尿中获得核酸分子;而蛋白酶K提取可以用于从血液中获核酸(Rolff,A等PCR:Clinical Diagnostics and Research,Springer(1994)。
检测方法
可以用多种方式来测定在具有或处于形成癌症的危险之中的患者中的erbB1基因的激酶结构域中特定变异或多种变异的存在或缺失。这些测试通常利用收集自生物学样品的DNA或RNA样品来进行,所述生物学样品例如,活检组织、尿、粪便、唾液、血液、细胞、组织刮屑、乳腺抽吸物或其它细胞物质,并且能够通过多种方法进行,包括,但不限于,PCR,与等位基因特异性探针杂交,酶学突变检测,化学剪切错配,质谱分析或DNA测序,包括小型测序。在特定的实施方案中,与等位基因特异性探针杂交能够以两种形式进行:(1)等位基因特异性寡核苷酸结合到固相(玻璃、硅、尼龙膜)和溶液中标记的样品上,正如在许多DNA芯片应用中一样,或(2)在溶液中结合样品(经常是克隆的DNA或PCR扩增DNA)和标记的寡核苷酸(可以是等位基因特异性的或短的以便允许通过杂交进行测序)。诊断测试可以包括一组变异,经常在固体支持物上,其能够进行一个以上变异的同时测定。
在另一方面,测定erbB1基因中至少一种提高激酶活性的核酸变异的存在必需单倍型测试。测定单倍型的方法是本领域技术人员已知的,例如,在WO 00/04194中。
优选地,测定至少一种提高激酶活性的核酸变异的存在或缺失包括通过聚合酶链式反应(PCR)测定变异位点的序列。或者,测定提高激酶活性的核酸变异的存在或缺失可以包括链末端DNA测序或小型测序,寡核苷酸杂交或质谱分析。
本发明的方法可以用来预测在具有或处于形成癌症的危险之中的患者中EGFR靶向性治疗有效(或无效)的可能性。优选地,癌症包括上皮组织起源的癌症,包括,但不限于,胃肠癌、前列腺癌、卵巢癌、乳癌、头颈癌、肺癌、非小细胞肺癌、神经系统癌、肾癌、视网膜癌、皮肤癌、肝癌、胰癌、生殖-泌尿系统癌和膀胱癌。在优选的实施方案中,所述癌症是非小细胞肺癌。
本发明一般性地涉及erbB1基因的激酶结构域中的变异的鉴定,其是在具有或处于形成癌症的危险之中的患者中EGFR靶向性治疗有效的指征。此外,在EGFR的激酶结构域中特异性变异的鉴定,在效果上,能够用作诊断或预防测试。例如,在erbB1基因的激酶结构域中至少一个变异的存在表明患者将可能受益于用EGFR靶向化合物进行的治疗,如,例如,酪氨酸激酶抑制剂。
用于诊断性测试的方法是本领域公知的并公开于专利申请WO00/04194中,在此并入作为参考。在一种例示性的方法中,所述诊断性测试包括扩增跨越erbB1基因序列的激酶结构域中的一个或多个变异的DNA或RNA(一般在将RNA转变成cDNA后)片段。随后对这种扩增的片段进行测序和/或进行聚丙烯酰胺凝胶电泳以便鉴定扩增片段中的核酸变异。
PCR
在一个实施方案中,本发明提供一种通过PCR,或,备选地,在连接链式反应(LCR)中筛选erbB1基因的激酶结构域中变异的方法(见,例如,Landegran,等,1988.Science 241:1077-1080;和Nakazawa,等,1994.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:360-364),后者可以特别用于检测EGFR基因中的点突变(见,Abravaya,等,1995.Nucl.Acids Res.23:675-682)。该方法包括以下步骤:设计简并引物用于扩增靶序列,所述引物对应于基因的一种或多种保守性区域,利用获自测试生物学样品的DNA或cDNA作为模板用引物进行扩增反应,和分析PCR产物。测试生物学样品与对照样品的PCR产物的比较表明测试生物学样品中的变异。所述变化可以是核酸变异在测试生物学样品中的缺失或存在。
备选的扩增方法包括:自持序列复制(见,Guatelli,等,1990.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:1874-1878),转录扩增系统(见,Kwoh,等,1989.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:1173-1177);Qb复制酶(见,Lizardi,等,1988.BioTechnology 6:1197),或任何其它核酸扩增方法,然后利用本领域技术人员公知的技术对扩增的分子进行检测。这些检测方案对于核酸分子的检测特别有用,如果这些分子以极低数目存在的话。
利用蛋白质的氨基酸序列或erbB1基因的激酶结构域的核酸序列作为指导设计根据本发明的有用引物,所述序列例如SEQ ID NO:493,SEQ ID NO:494,SEQ ID NO:509,和SEQ ID NO:510。在基因的同源性区域设计引物,其中至少两个同源区域被可变序列的差异区分隔开,所述序列在长度或核酸序列上是可变的。
例如,相同的或高度同源的,优选具有至少大约6个,优选至少8-10个连接氨基酸的至少80%-85%,更加优选至少90-99%的同源性氨基酸序列。最优选地,所述氨基酸序列是100%相同的。基于密码子简并性和在已知基因家族成员之间给定位置上各种氨基酸的保持设计正向和反向引物。本文提到的同源性程度是基于利用标准序列比较软件进行的氨基酸序列分析,如使用默认设置的蛋白质-BLAST(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)。
下表3给出了简并密码子的用法和它们的标准符号:
优选地避免任何6倍的简并密码子如L,R和S,因为它们将引入高于6倍的简并性。对于L来说,TTR和CTN折衷成YTN(8倍简并性),对于R来说,CGN和AGR折衷成MGN(8倍简并性),最后S,TCN和AGY能够折衷成WSN(16倍简并性)。In all threecases on 6of these将会匹配靶序列。为了避免这种特异性的丧失,优选避免这些区域,或制成两群,每群都有备选的简并密码子,例如S在一个集合中包括TCN,而AGY在另一个集合中。
利用多种现有的计算机程序,包括,但不限于Oligo Analyzer3.0;Oligo Calculator;NetPrimer;Methprimer;Primer3;WebPrimer;PrimerFinder;Primer9;Oligo2002;Pride或GenomePride;Oligos;和Codehop可以设计引物。关于这些程序的详细信息可以获知,例如,www.molbiol.Net。
利用本领域技术人员已知的标记可以对引物进行标记。这些标记包括,但不限于放射性、荧光、染料和酶学标记。
利用能够根据其大小分离扩增产物的任何方法都可以进行扩增产物的分析,包括自动和手动的凝胶电泳,质谱分析等等。
或者,利用序列差异,使用SSCP,DGGE,TGGE,化学剪切或限制性片段多态性以及杂交到例如核酸阵列上可以分离扩增产物。
核酸分离、扩增和分析的方法对于本领域技术人员来说是常规的并且方案的例子可以见于,例如,Molecular Cloning:A LaboratoryManual(3-Volume Set)Ed.Joseph Sambrook,David W.Russel,andJoe Sambrook,Cold Spring Harbor Laboratory;3rd edition(January15,2001),ISBN:0879695773。用于PCR扩增的特别有用的方案来源是PCR(Basics:From Background to Bench)by M.J.McPherson,S.G.Mller,R.Beynon,C.Howe,Springer Verlag;1stedition(October 15,2000),ISBN:0387916008。
优选地,使用下列引物通过聚合酶链式反应(PCR)对人EGFR的外显子19和21进行扩增:外显子19有义引物,5′-GCAATATCAGCCTTAGGTGCGGCTC-3′(SEQ ID NO:505);外显子19反义引物,5′-CATAGAAAGTGAACATTTAGGATGTG-3′(SEQ ID NO:506);外显子21有义引物,5′-CTAACGTTCGCCAGCCATAAGTCC-3′(SEQ ID NO:507);和外显子21反义引物,5′-GCTGCGAGCTCACCCAGAATGTCTGG-3′(SEQ ID NO:508)。
在备选的实施方案中,通过限制性酶切模式的变化可以鉴定来自样品细胞的EGFR基因中的突变。例如用一种或多种限制性内切酶对样品和对照DNA进行分离、扩增(任选地)、消化,并通过凝胶电泳测定片段长度大小并进行比较。在样品和对照DNA之间的片段长度大小差异表明样品DNA中的突变。另外,使用序列特异性核酶(见,例如,美国专利号5,493,531)可以用来通过核酶剪切位点的形成或缺失来评估特异性突变的存在。
检测EGFR基因中突变的其它方法包括利用防护剪切剂来检测RNA/RNA或RNA/DNA杂合双螺旋中的错配碱基的方法。见,例如,Myers,等,1985.Science 230:1242。通常,本领域的″错配剪切″技术通过提供由包含野生型EGFR序列的RNA或DNA与获自组织样品的潜在突变RNA或DNA杂交(标记)形成的杂合双螺旋开始。用剪切双螺旋的单链区的试剂处理双链双螺旋,所述单链区如由于对照和样品链之间的碱基错配存在的区域。例如,RNA/DNA双螺旋可以用RNA酶进行处理而DNA/DNA杂合体用S1核酶处理以酶学消化错配区。在其它的实施方案中,DNA/DNA或RNA/DNA双螺旋都可以用羟胺或四氧化锇或用哌啶处理以便消化错配区。在消化错配我后,随后在变性聚丙烯酰胺凝胶上通过大小分离得到的物质以测定突变的位点。见,例如,Cotton,等,1988.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:4397;Saleeba,等,1992.Methods Enzymol.217:286-295。在一个实施方案中,可以将对照DNA或RNA进行标记用于检测。
在又一个实施方案中,错配剪切反应采用一种或多种蛋白质,其在检测和绘制获自细胞样品的EGFR cDNAs中的点突变终谱的限定系统中识别双链DNA中的错配碱基对(所谓的″DNA错配修复″酶)。例如大肠杆菌(E.coli)的mutY酶在G/A错配上剪切A而来自Hela细胞的胸腺嘧啶DNA糖基酶在G/T错配上剪切T。见,例如,Hsu,等,1994-Carcinogenesis 15:1657-1662。根据一种例示性的实施方案,将基于EGFR序列,例如,DEL-1到DEL-5,G719S,G857V,L883S或L858R EGFR序列,杂交到来自测试细胞的cDNA或其它DNA产物上。用DNA错配修复酶处理双螺旋,剪切产物,如果有的话,可以由电泳方法等进行检测。见,例如,美国专利号5,459,039。
在其它实施方案中,电泳迁移率的改变将被用于鉴定EGFR基因中的突变。例如,单链构象多态(SSCP)可以用来检测突变和野生型核酸之间电泳迁移率的差异。见,例如,Orita,等,1989.Proc.Natl.Acad.Sci.USA:86:2766;Cotton,1993.Mutat.Res.285:125-144;Hayashi,1992.Genet.Anal.Tech.Appl.9:73-79。将对样品的单链DNA片段和对照EGFR核酸进行变性并让它复性。单链核酸的二级结构随着序列的不同而变化,得到的电泳迁移率的变化使得即使是单一碱基变化的检测成为可能。可以用标记探针对DNA片段进行标记或检测。通过使用RNA(而不是DNA)可以提高测定的灵敏性,其中二级结构对于序列的变化更加敏感。在一个实施方案中,主题方法基于电泳迁移率的变化,利用杂合双螺旋分析分离双链的杂合双螺旋分子。见,例如,Keen,等,1991.Trends Genet.7:5。
在又一个实施方案中,利用变性梯度凝胶电泳(DGGE)测定包含梯度变性剂的聚丙烯酰胺凝胶中的突变或野生型片段的迁移。见,例如,Myers,等,1985.Nature 313:495。当DGGE用作分析方法时,将对DNA进行修饰以确保它不会完全变性,例如通过PCR加入大约40bp的高度熔解性富含GC的DNA的GC夹。在另一个实施方案中,使用温度梯度代替变性梯度以鉴定对照和样品DNA的迁移率的差异。见,例如,Rosenbaum and Reissner,1987.Biophys.Chem.265:12753。
用来检测点突变的其它技术的例子包括,但不限于,选择性寡核苷酸杂交,选择性扩增,或选择性引物延伸。例如,可以制备寡核苷酸引物,其中将已知的突变置于中央并且只有如果发现了完全的配对随后才在允许杂交的条件下杂交到靶DNA上。见,例如,Saiki,等,1986.Nature 324:163;Saiki,等,1989.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:6230。当寡核苷酸附于杂交膜上并与标记的靶DNA杂交时,这些等位基因特异性寡核苷酸被杂交到PCR扩增的靶DNA或多种不同的突变上。
或者,依赖于选择性PCR扩增的等位基因特异性扩增技术可以用在与本发明的关联中。用作特异性扩增引物的寡核苷酸可以在分子的中央(从而扩增依赖于差别杂交;见,例如,Gibbs,等,1989.Nucl.Acids Res.17:2437-2448)或在一个引物的最外3′端携带目标突变,所述3′端在合适的条件下,可以防止错配,或减少聚合酶延伸(见,例如,Prossner,1993.Tibtech.11:238)。此外希望在突变区导入新的限制性位点以创造基于剪切的检测。见,例如,Gasparini,等,1992.Mol.Cell Probes 6:1。预期在某些实施方案中还可以利用扩增用的Taq连接酶进行扩增。见,例如,Barany,1991.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:189。在这些情况下,只有在5′序列的3′端上有完全配对才会发生连接,使得通过观察扩增的存在或缺失而在特异性位点上检测已知突变的存在成为成能。
固体支持物和探针
在备选的实施方案中,检测至少一种核酸变异的存在或缺失包括将上面鉴定的对应于erbB1基因的所需区域的核酸序列与探针接触。所述探针能够辨别基因的特定形式或特定变异或多种变异的存在,例如,通过差异结合或杂交。因而,例示性的探针包括核酸杂交探针,肽核酸探针,包含核苷酸的探针,其还包含至少一种核苷酸类似物,和抗体,例如单克隆抗体,和本文讨论的其它探针。本领域技术人员熟悉具有特异性的探针的制备。本领域技术人员将会认识到可以调节多种变量以优化基因的两种变异形式之间的区别,包括盐浓度、温度、pH的变化以及添加影响GC对AT碱基对差异亲和性的各种化合物,如四甲基氯化铵.(见Current Protocols in Molecular Biology by F.M.Ausubel,R.Brent,R.E.Kingston,D.D.Moore,J.G.Seidman,K.Struhlarxd V.B.Chanda(Editors),John Wiley&Sons.)。
因而,在优选的实施方案中,检测至少一种变异的存在或缺失包括将包括至少一个变异位故作多情的核酸序列与探针接触,优选核酸探针,其中与和在变异位点上具有非互补碱基的核酸序列形式的杂交相比所述探针优选与在变异位点上包含互补碱基的核酸序列形式杂交,其中所述杂交在选择性杂交条件下进行。这种核酸杂交探针可以跨越两个或多个变异位点。除非另外指定,核酸探针可以包括一种或多种核酸类似物,探针或其它取代物或部分,只要碱基配对功能得以保留。
可以设计探针来结合到,例如,SEQ ID NO:495,SEQ ID NO:497,或SEQ ID NO:499的删除区两侧上的至少三个连续的核苷酸上。当在适当条件下杂交时,这种探针将结合到EGFR的变异形式上,但不会结合到野生型EGFR上。
这些杂交探针是本领域公知的,(见,例如,Sambrook等,Eds.,(most recent edition),Molecular Cloning:A Laboratory Manual,(third edition,2001),Vol.1-3,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.)。严格的杂交条件一般将包括小于大约1M的盐浓度,更通常地小于大约500mM和优选地小于大约200mM。杂交温度可以低至5℃,但一般大于22℃,更一般地大于大约℃,优选地大于大约37℃。较长的片段可能需要较高的杂交温度进行特异性杂交。其它因素可能影响杂交的严谨度,包括碱基组成和互补链的长度,有机溶剂的存在和碱基错配的程度;所用参数的组合比任何一个单独参数的绝对测量更重要。其它可以控制的杂交条件包括缓冲液类型和浓度,溶液pH,封闭剂(例如,重复序列,Cotl DNA,封闭性蛋白质溶液)的存在和浓度以减少背景结合,去污剂类型和浓度,提高多核苷酸的相对浓度的分子如聚合物,金属离子及其浓度,螯合剂及其浓度,和其它本领域已知或可发现的条件。可以使用公式预测完全互补序列对给定探针的优化熔解温度,但是在一组杂交条件下的探针的真实熔解浓度必须进行经验性确定。另外,必须相对于其精确互补体对探针进行测试以确定给定组条件下的精确熔解温度,如在Sambrook等,″Molecular Cloning,″3nd edition,Cold SpringHarbor Laboratory Press,2001中所述。利用与核苷酸相关联的支持物可以对给定的杂交溶液系统性改变杂交温度直到鉴定一个温度范围,其允许检测在所需严谨度水平上的结合,可以在只有靶多核苷酸与高度互补体杂交的高度严谨度水平上,也可以在与探针具有互补区的其它靶多核苷酸可检测地杂交的较低水平上,所述可检测地杂交是在由非特异性结合到非互补性靶多核苷酸或支持物上而提供的背景水平之上进行的。当杂交在给定的条件组之下由潜在的靶多核苷酸在支持物上进行时,随后在提高的严谨条件下洗涤支持物(一般为更低的盐浓度和/或提高的温度,但其它条件可以变化)直到背景结合降低到可以见到明显的阳性信号的点上。这可以利用Geiger计数器作进行性监测,其中探针进行放射性标记,使用荧光成像仪,或通过其它检测探针结合的手段。在这些操作过程中不让支持物干燥,或者探针可以进行可逆性结合甚至是结合到背景位置上。当探针产生有利的背景或假阳性时,采用封闭剂,或者使用探针的不同区域或不同探针直到可以将阳性信号与背景区分开。一旦发现条件在背景之上提供令人满意的信号,就将提供阳性信号的靶多核苷酸分离出来并进一步作特征鉴定。可以对分离的多核苷酸进行测序;必要时,通过本领域已知的技术获得全长克隆;并且可以利用合适的载体和宿主表达所述多核苷酸以确定鉴定的多核苷酸是否编码这样一种蛋白,其具有与衍生探针多核苷酸的蛋白具有相似活性。探针可以为10-50个核苷酸。不过,还可以采用更大的探针,例如,50-500个核苷酸或更大。
固相支持物
本发明的固相支持物可以是任何适于支持核苷酸杂合和合成的固体材料和结构。优选的,固相支持物至少含一个相当坚硬的表面,在此表面上可以固定寡核苷酸引物。该固相支持物可由以下材料构成,例如,玻璃,合成聚合物,塑料,硬无孔尼龙或陶瓷制品。其他适宜的固体支持物材料是本领域技术人员已知并且可以轻易获得的。固相支持物的尺寸可以是任意标准微阵列尺寸,对DNA微阵列技术是有用的,该尺寸可以适应用来进行本发明的反应的特定仪器。用来固定寡核苷酸的固相支持物的衍生方法和材料是本领域技术人员已知的,并在,例如,美国专利号5,919,523中描述,此发明的公开内容此处作为参考被引用。
固相支持物可以存在于包含液体容器中或是包含液体容器的一部分。例如,固相支持物可放置于一带边的小室中,其沿固相支持物的边生成一个封口,以便容纳在支持物上发生的聚合酶链反应(PCR)。在一特定实施例中,小室在矩形支持物的每一侧有壁,以确保PCR混合物保存于支持物上,也使得整个表面对于提供引物是用的。
可以使用任何可利用的方式将本发明的寡核苷酸或寡核苷酸引物粘附、固定、提供和/或应用在固相支持物的表面上以便在固相支持物的特定位置上定位、固定、提供和/或应用寡核苷酸。例如,可使用影印法(Affymetrix,Santa Clara,Calif)将寡核苷酸引物应用于芯片或固相支持物上的特定位置上,如在美国专利号US 5,919,523,5,837,832,5,831,070和5,770,722,以上专利在此处作为参考被引用。可以将寡核苷酸引物应用到Brown和Shalon,美国专利号5,807,522(1998)中描述的固体支持物上。此外,可以用机器人系统,如由Genetic MicroSystems(Woburn,Mass.),GeneMachines(San Carlos,Calif)或Cartesian Technologies(Irvine,Calif)制造的系统将引物应用到固相支持物上。
在本发明的一个方面,进行来自于一种生物样品的靶多核苷酸的固相扩增,其中多组寡核苷酸引物固定于一固体支持物上。在一优选的实施方案中,一组中的引物至少包括序列相同的第一组引物,它与靶多核苷酸的指定序列是互补的,能在适宜条件下与靶多核苷酸杂合,并适宜作为核酸合成(即,链延长或扩展)的起始引物。被选择的覆盖于参照序列的特定区域上的引物作为一个组固定于一固相支持物的非连续位置上。优选地,组与组之间的距离比用来检测扩增产物的方法的分辨率大。在一优选的实施方案中,固定引物形成微阵列或芯片,其可通过自动的方式来处理和检测。被固定的引物用于在适于核酸扩增方法的条件下进行靶多核苷酸的固相扩增。以此方式,在一种测定中可以测定erbB1基因的激酶结构域中的多种潜在变异的存在或缺失。
在测量生物学来源在erbB1基因的激酶结构域里是否具有至少一种提高激酶活性的变异中,一群分离自健康个体的靶多核苷酸可以用作对照。或者,可以将分离自相同个体的健康组织的靶多核苷酸用作上面的对照。
在微阵列上的原位型PCR反应可以基本上如在例如Embretson等,Nature 362:359-362(1993);Gosden等,BioTechniques 15(1):78-80(1993);Heniford等,Nuc.Acid Res.21(14):3159-3166(1993);Long等,Histochemistry 99:151-162(1993);Nuovo等,PCR Methods and Applications 2(4):305-312(1993);Patterson等,Science 260:976-979(1993)中所述的那样进行。
或者,可以通过固相技术测定erbB1基因的激酶结构域中的变异,而不会在支持物上进行PCR。多种寡核苷酸探针,每种都在erbB1的激酶结构域中含有不同的变异,以一式两份,一式三份或一式四份的形式,可以结合到固相支持物上。通过本领域已知的和上述的选择性杂交技术可以检测测试生物学样品中变异的存在或缺失。
质谱分析
在另一个实施方案中,利用质谱分析测定在erbB1基因的激酶结构域中提高激酶活性的核酸变异的存在或缺失。为了得到合适量的核酸分子用于进行质谱,扩增可能是必须的。可用于本发明的合适的扩增方法的实例包括:克隆(Sambrook等,《分子克隆:实验室手册》(Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)、聚合酶链反应(PCR)(C.R.Newton和A.Graham,《PCR》,BIOS Publishers,(1994)),连接酶链反应(LCR)(Wiedmann M等,(1994)《PCR方法应用》(PCR MethodsAppl.),卷3,57-64页;F.Barany,《美国国家科学院学报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),1991年88卷189-93页)、链置换扩增(SDA)(G.Terrance Walker等,《核酸研究)》(Nucleic AcidsRes.),1994年22卷2670-77页)和变更方法如RT-PCR(Higuchi等,《生物/技术》(Bio/Technology)1993年11卷1026-1030页)、等位基因特异扩增(ASA)和基于转录的方法。
为了方便质谱分析,含有待测序列的核酸分子可固定到固相支持物上。合适的固相支持物的实例包括球珠(如硅胶、可控多孔玻璃、磁珠、Sephadex/Sepharose,纤维素)、平台表面或嵌片(如玻璃纤维滤器、玻璃表面、金属表面(钢、金、银、铝、铜和硅)、毛细管、塑料(如聚乙烯、聚丙烯、聚酰胺、聚二氧乙二烯膜或微量滴定板));或者用包括球珠或平台表面相似材料做成的钉或梳子、或将球珠置入平台表面的凹点中如垫片(例如硅垫片)。
固定化可利用杂交法来完成,例如,基于已固定到固相支持物上的捕获核酸序列与也包含在含有待测核酸序列的核酸分子中的互补核酸序列之间的杂交。从而互补的核酸分子间的杂交不会被支持物妨碍,捕获核酸分子在固相支持物和捕获核酸序列间可含一至少5核苷酸长的间隔区。在激光脉冲影响下形成的二聚体可被断裂且解吸附可被激发。固相支持物结合的碱基序列可通过天然的寡聚核糖核酸或寡聚脱氧核糖核酸及其类似物(例如巯基修饰的磷酸二酯或磷酸三酯骨架)或使用寡核苷酸模拟物如PNA类似物(参见例如Nielsen等,Science,254,1497(1991))提供,它们可降低碱基序列对酶促降解的敏感性,因而提高固相支持物结合的捕获碱基序列的总体稳定性。
在质谱分析前,″修饰″核酸分子可能是有用的,例如可降低汽化所需的激光能量和/或将片段化作用降至最低程度。修饰优选适用于固定化的靶检测位点。修饰的一个实例是核酸分子中磷酸二酯骨架的修饰(例如阳离子交换),这可用于消除由于每核苷酸单位上结合的阳离子的不均一性导致的峰加宽现象。将核酸分子与烷基化试剂如烷基碘、碘乙酰胺、β-碘乙醇或2,3-环氧乙烷-1-丙醇接触,核酸分子的单硫磷酸二酯键可转换为磷酸三酯键。同样地,利用氯化三烷基硅可将磷酸二酯键转换为无电荷的衍生物。进一步的修饰包括掺入降低脱嘌呤(MS中的片段化作用)敏感性的核苷酸如N7-或N9-脱氮嘌呤核苷酸或RNA元件,或使用寡聚核苷酸三酯或掺入烷基化的硫代磷酸酯官能团或掺入寡聚核苷酸模拟物如PNA。
对于某些应用,同时检测位于一特异被捕获核酸片段(在阵列上的一个点上)上超过一个(突变的)位点或用不同固相支持物上寡聚核苷酸或寡聚核苷酸模拟物阵列排列来实行并行检测可能是有用的。″多路检测″可由几种不同的方法来获得。例如,通过使用相应的检测(探针)分子(如寡聚核苷酸或寡聚核苷酸模拟物),在一靶序列上的几个突变可被同时检测。然而,检测核苷酸D1、D2和D3的分子量差异必须足够大,同时检测(多路检测)才有可能。这种差异可通过序列本身(组成或长度)或在检测寡聚核苷酸中引入质量修饰官能团M1-M3来获得。
本发明中用到的优选的质谱检测方式是基质辅助激光解吸附离子化(MALDI),电喷雾(ES),离子回旋共振(ICR)和傅立叶变换。进行质谱分析的方法是本领域技术人员已知的并且在Methodsof Enzymology,Vol.193:″MassSpectrometry″(J.A.McCloskey,editor),1990,Academic Press,New York中进行了描述。
测序
在其它的优选实施方案中,测定至少一种提高激酶活性的核酸变异的存在或缺失包括对至少一和核酸序列进行测序。所述测序包括对包括至少一个变异位点,并且可能包括多个这种位点的erbB1的激酶结构域的一部分或多部分进行测序。优选地,所述部分为500个核苷酸或更少的长度,更加优选地为100个核苷酸或更少,最优选地为45个核苷酸或更少的长度。这种测序可以通过本领域技术人员所认知的各种方法进行,包括双脱氧终止法(例如,使用染色标记的双脱氧核苷酸),和使用质谱分析法。
免疫检测
在一个实施方案中,测定至少一种提高激酶活性的核酸变异的存在或缺失包括测定EGFR下游靶标的激活状态。
本发明的发明人比较了EGFR的主要下游靶标的磷酸化状态。例如,已经检查了EGF-诱导的通过Ras的Erk1和Erk2的激活,通过PLCγ/PI3K的Akt,以及通过JAK2的STAT3和STAT5的激活。通过Ras的Erk1和Erk2,通过PLCγ/PI3K的Akt,以及通过JAK2的STAT3和STAT5是介导EGFR的致癌作用的基本下游途径(R.N.Jorissen等,Exp.Cell Res.284,31(2003))。
本发明的发明人显示EGF诱导的Erk激活在表达野生型EGFR和两种活化性EGFR突变体的任一种之间无法区别。
相反地,Akt和STAT5的磷酸化作用在表达两种突变EGFR的任一种的细胞中基本上得以提高。。在表达突变EGFRs的细胞中类似地观察到STAT3的磷酸化作用。因而,在EGFR突变体内C末端酪氨酸残基的选择性EGF诱导的自体磷酸化与下游信号途径的选择性激活密切相关。
在本发明的一个实施方案中,EGFR突变的存在可以利用本领域公知的免疫学技术进行测定,例如,抗体技术如免疫组织化学,免疫细胞化学,FACS扫描,免疫印迹,放射性免疫测定,蛋白质印迹,免疫沉淀,酶联免疫吸附测定(ELISA),利用针对EGFR激活的下游靶标的抗体的衍生技术。这些靶标的例子包括,例如,磷酸化STAT3,磷酸化STAT5,和磷酸化Akt。利用磷特异性抗体,可以测定STAT3,STAT5,和Akt的激活状态。STAT3,STAT5,和Akt的激活可以用作活化性EGFR突变的诊断指标。
在本发明的一个实施方案中,激活的(磷酸化的)STAT5,STAT3,或Akt的存在显示EGFR靶向性治疗可能有效。
本发明提供了一种通过免疫组织化学或免疫细胞化学方法筛选测试样品中erbB1基因的激酶结构域中变异的方法。
例如,可以利用免疫组织化学(″IHC″)和免疫细胞化学(″ICC″)技术。IHC是免疫化学对组织切片的应用,而ICC是免疫化学是在细胞或组织标记进行过特定的细胞学制备如,例如基于液体的制备后对它们的应用。免疫化学是一族基于特异性抗体使用的利用,其中使用抗体特异性靶向细胞内部或细胞表面上的分子。抗体一般包含一种标记物,其在遇到靶分子后将进行生化反应,由此经历变化颜色。在一些情况下,可以将信号扩增并入特定的方案中,其中在应用特异性一抗后使用包括标记染色的二抗。
免疫组织化学测定是本领域技术人员已知的(例如,见Jalkanen,等,J.Cell.Biol.101:976-985(1985);Jalkanen,等,J.Cell.Biol.105:3087-3096(1987)。
多克隆或单克隆的抗体,可以购自多家商业供应商,或可以利用公知的方法进行生产,例如,如在Harlow等,Antibodies:ALaboratory Manual,2nd Ed;Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1988)中所述的那样。一般,可用于本发明的抗体的例子包括抗-磷-STAT3,抗-磷-STAT5,和抗-磷-Akt抗体。这些抗体可以购自,例如,Upstate Biotechnology(Lake Placid,NY),New England Biolabs(Beverly,MA),NeoMarkers(Fremont,CA)。
一般,对于免疫组织化学来说,组织切片获自患者并且通过合适的固定剂如乙醇、丙酮和多聚甲醛进行固定,抗体与所述固定剂反应。进行免疫组织化学的常规方法在Harlow和Lane(eds)(1988),在″Antibodies A Laboratory Manual″,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,New York;Ausbel et al(eds)(1987),在Current Protocols In Molecular Biology,John Wiley and Sons(NewYork,NY)中进行描述。适于这些检测测定的生物学样品包括,但不限于,细胞、活检组织、全血、血浆、血清、痰、脑脊液、乳腺抽吸物、胸水、尿等等。
对于直接的标记技术,使用标记的抗体。对于间接的标记技术,将样品进一步与标记的物质反应。
或者,可以利用免疫细胞化学。一般,细胞获自患者并且通过合适的固定剂如乙醇、丙酮和多聚甲醛进行固定,抗体与所述固定剂反应。人样品的免疫细胞学染色的方法是本领域技术人员已知的并且,例如,在Brauer等,2001(FASEB J,15,2689-2701),Smith-Swintosky等,1997中进行描述。
本发明的免疫学方法是有利的,因为它们只需要小量的生物学材料。这些方法可以在细胞水平上进行并且因而需要最少一个细胞。优选地,从具有或处于发生癌症危险中的患者中获得几个细胞并根据本发明的方法进行测定。
其它的诊断方法
用于检测突变型EGFR蛋白质的试剂是能够结合到突变型EGFR蛋白质上的抗体,优选地为具有可检测标记的抗体。抗体可以是多克隆的,或更优选地,是单克隆的。可以使用完整的抗体,或其片段(例如,Fab或F(ab)2)。关于探针或抗体,术语″标记的″意在包括通过将可检测的物质偶联(即,物理性连接)到探针或抗体上的探针或抗体的直接标记,以及通过与另一种直接标记的试剂的反应进行的探针或抗体的间接标记。间接标记的例子包括利用荧光标记的二抗检测一抗和用生物素标记DNA探针从而可以用荧光标记的链霉抗生物素对它进行检测。术语″生物学样品″意在包括分离自受试者的组织、细胞和生物液,以及存在于受试者体内的组织、细胞和液体。即,本发明的检测方法可以用于在体外以及体内检测生物学样品中的突变型EGFR mRNA,蛋白质,或基因组DNA。例如,检测突变型EGFR mRNA的体外技术包括RNA印迹杂交和原位杂交。检测突变型EGFR蛋白的体外技术包括酶联免疫吸附测定(ELISAs),蛋白质印迹,免疫沉淀,和免疫荧光。用于检测突变型EGFR基因组DNA的体外技术包括向受试者体内导入标记的抗突变型EGFR蛋白抗体。例如,所述抗体可以用放射性标记进行标记,其在受试者中的存在和定位可以通过标记的成像技术进行检测。
在一个实施方案中,所述生物学样品包含来自试验受试者的蛋白质分子。或者,所述生物学样品可以包含来自试验受试者的mRNA分子或来自试验受试者的基因组DNA分子。
在另一个实施方案中,所述方法进一步包括从对照受试者获得对照生物学样品,将对照样品一能够检测突变型EGFR mRNA,蛋白质,或基因组DNA的化合物或试剂接触,从而在生物学样品中检测突变型EGFR mRNA,蛋白质,或基因组DNA的存在,并将对照样品中的突变型EGFR mRNA,蛋白质,或基因组DNA的存在与测试样品中的突变型EGFR mRNA,蛋白质,或基因组DNA的存在相比较。
在不同的实施方案中,诊断测定是针对突变型EGFR活性。在具体的实施方案中,所述突变型EGFR活性是酪氨酸激酶活性。一种这样的诊断测定是检测至少一种EGFR底物的EGFR介导的磷酸化作用。可以对于,例如,各种突变型EGFR多肽,各种包含突变型EGFR的组织,来自怀疑具有至少一种突变型EGFR的癌组织的活检组织等等测定EGFR活性的水平。任选地可以进行在这些各种细胞、组织或其提取物中的EGFR活性水平的比较。在一个实施方案中,在癌组织中高水平的EGFR活性水平可以诊断可能易受用一种或多种酪氨酸激酶抑制剂进行治疗的影响的癌症。在相关的实施方案中,可以在治疗和未治疗的活检组织样品,细胞系,转基因动物,或任何这些的提取物之间测定EGFR活性水平抑制剂,以便与未治疗的对照相比来确定给定治疗对于突变型EGFR活性的影响。
治疗患者的方法
在一个实施方案中,本发明提供了一种通过测定erbB1基因的激酶结构域中至少一种提高激酶活性的核酸变异的存在或缺失来选择对于患有癌症或处于形成癌症的危险之中的患者的治疗的方法。在另一个实施方案中,所述变异是多种变异,其中多种可以包括来自一个、两个、三个或多个基因位点的变异。
在某些实施方案中,至少一个变异的存在是所述治疗将在患者中有效或有益(或更可能是有益)的指征。声明所述治疗将是有效的方法,即有益治疗效果的可能性比在erbB1基因的激酶结构域中不具有特定的提高激酶活性的核酸变异的适当存在的个人中更大。
所述治疗将包括施用酪氨酸激酶抑制剂。所述治疗可以包括治疗组织,包括,但不限于酪氨酸激酶抑制剂组合以其它酪氨酸激酶抑制剂,化疗,放疗等。
因而,与施用酪氨酸激酶抑制剂相关,″有效对抗″癌症的药物表明以临床上适当的方式给药导致对于患者的至少统计学上显著的部分的有益效果,如症况的改善,治愈,疾病负担的减轻,肿瘤质量或细胞数目的减小,生命的延长,生命质量的改善,或其它被熟悉治疗特定类型的疾病或状况的医生一般性认为是积极的效果。
在优选的实施方案中,所述化合物是苯氨基喹唑啉或合成的苯氨基喹唑啉。欧洲专利公开号0566226公开了具有抗表皮生长因子(EGF)受体酪氨酸激酶活性的苯氨基喹唑啉s。由欧洲专利公开号0520722和0566226还得知某些4-苯氨基喹唑啉衍生物可以用作受体酪氨酸激酶的抑制剂。由这些化合物显示的非常紧密的结构-活性关系提示明确定义的结合方式,其中喹唑啉环结合在腺嘌呤口袋中而anilino环结合在邻近的独特亲脂性口袋。已经对三种4-苯氨基喹唑啉类似物(两种可逆的和一种不可逆的抑制剂)作为抗癌药物在临床上进行了评估。Denny,Farmaco January-February 2001;56(1-2):51-6。或者,所述化合物是EKB-569,EGF受体激酶的抑制剂(Torrance等,Nature Medicine,vol.6,No.9,Sept.2000,p.1024)。在最优选的实施方案中,所述化合物是gefitinib()或erlotinib()。
包含本文所述的至少一种突变型EGFR的靶向癌细胞的治疗剂可以单独施用或组合以任何其它适合的抗癌治疗剂和/或本领域技术人员已知的治疗剂。在一个实施方案中,提供诸如癌症的病理的治疗,包括向其需要的受试者施用治疗上有效量的抑制EGFR激酶活性的化合物,如gefitinib,erlotinib,等,单独施用或组合以至少一种其它抗癌剂或疗法。通过使用靶向小分子药物或基于抗体的策略抑制活化的蛋白激酶已经作为有效的方法成为癌症疗法。见,例如,G.D.Demetri等,N.Engl.J.Med.347,472(2002);B.J.Druker等,N.Engl.J.Med.344,1038(2001);D.J.Slamon等,N.Engl.J.Med.344,783(2001)。
在一个实施方案中,所述抗癌剂是至少一种化疗剂。在相关的实施方案中,所述抗癌剂是至少一种放疗剂。在变异的实施方案中,所述抗癌疗法是抗血管生成疗法(例如,内皮他丁,血管他丁,TNP-470,Caplostatin(Stachi-Fainaro等,Cancer Cell 7(3),251(2005))。
所述治疗剂可以是相同或不同的,并且可以是,例如,治疗性放射性核素,药物,激素,激素拮抗剂,受体拮抗剂,酶或由另一种试剂活化的原酶,自分泌因子,细胞因子或任何合适的本领域技术人员已知的抗癌剂。在一个实施方案中,所述抗癌剂是Avastin,一种被证明在抗实体癌和血液恶性瘤的抗血管生成疗法中成功的VEGF抗体。见,例如,Ribatti等2003J Hematother Stem Cell Res.12(1),11-22。还可以在本发明的方法中使用毒素。可用于本发明的其它治疗剂包括抗T-DNA,抗-RNA,放射性标记的寡核苷酸,如反义寡核苷酸,抗-蛋白质和抗-染色质细胞毒性或抗微生物试剂。其它的治疗剂是本领域技术人员已知的,并且特别要求保护按照本发明的这些其它治疗剂的使用。
所述抗肿瘤剂可以是多种化疗剂中的一种,如烷化剂,抗代谢剂,激素制剂,抗生素,抗体,抗癌生物剂,gleevec,秋水仙碱,长春花生物碱,L-天冬酰胺酶,甲基苄肼,羟基脲,米托坦,亚硝基脲或氨甲酰咪唑。合适的药剂是那些促进微管蛋白去极化或抑制肿瘤细胞增殖的药剂。包括在本发明范围之内的化疗剂包括,但不限于,在Orange Book of Approved Drug Products With TherapeuticEquivalence Evaluations中列出的抗癌剂,由Food and DrugAdministration and the U.S.Department of Health and HumanServices汇编。化疗剂的非限制性例子包括,例如,卡铂和紫杉醇。靶向EGFR激酶活性的治疗剂也可以与放疗治疗一起施用。本领域已知的其它抗癌治疗剂包括在本发明的范围之内。
所述治疗剂可以是一种化疗剂。化疗剂是本领域已知的并且至少包括紫杉烷,氮芥,氮丙啶衍生物,烷基磺酸盐,亚硝基脲,三氮烯(triazenes),叶酸类似物,嘧啶类似物,嘌呤类似物,长春花生物碱,抗生素,酶,铂配位络合物,代用品尿素,甲基肼的衍生物,肾上腺皮质的抑制剂,或拮抗剂。更具体地,所述化疗剂可以是一种或多种选自类固醇孕酮,雌激素,抗雌激素和雄激素的非限制性组的药剂。还要更加具体地,所述化疗剂可以是阿扎立平,博来霉素,苔藓抑素-1,白消安,卡氮芥,苯丁酸氮芥,卡铂,顺铂,CPT-11,环磷酰胺,阿糖胞苷,氮烯唑胺,放线菌素,柔红霉素,地塞米松,二乙基己烯雌酚,阿霉素,乙炔雌二醇,依托泊甙,氟尿嘧啶,氟甲睾酮,吉西他滨,己酸羟孕酮,羟基脲,天冬酰胺酶,甲酰四氢叶酸,环己亚硝脲,氮芥,醋酸medroprogesterone,甲地孕酮,苯丙氨酸氮芥,6-巯基嘌呤,氨甲蝶呤,氨甲蝶呤,光神霉素,丝裂霉素,米托坦,紫杉醇,丁酸苯酯,强的松,甲基苄肼,司莫司汀链脲霉素,他莫昔芬,紫杉烷,红豆杉醇,丙酸睾酮,镇静剂,2-氨基嘌呤-6-硫醇,硫替派,尿嘧啶氮芥,长春碱,或长春新碱。还要求保护化疗剂的任何组合的使用。化疗剂的施用可以在施用靶向EGFR活性的治疗剂之前,之中或之后。
其它合适的治疗剂选自放射性同位素,硼addend,免疫调节剂,毒素,光敏剂或染料,癌症化疗药物,抗病毒药物,抗真菌药物,抗细菌药物,抗原生动物药物和化学致敏剂(见,美国专利号4,925,648和4932,412)。合适的化疗剂在REMINGTON′SPHARMACEUTICAL SCIENCES,19th Ed.(Mack Publishing Co.1995),和在Goodman and Gilman′s The Pharmacological Basis ofTherapeutics(Goodman等,Eds.Macmillan Publishing Co.,New-York,1980and 2001editions)中进行描述。其它合适的化疗剂,如实验性药物,是本领域技术人员已知的。另外合适的治疗性放射性同位素选自α-辐射源,β-辐射源,γ-辐射源,奥杰尔电子辐射源,发射α粒子的中子俘获剂和被电子捕获衰减的放射性同位素。优选地,所述放射性同位素选自225Ac,198Au,32P,125I131I,90Y,186Re,188Re,67Cu,177Lu,213Bi,10B,和211At。
当使用一种以上的治疗剂时,它们可以是相同或不同的。例如,所述治疗剂可以包含不同的放射性核素,或药物和放射性核素。在优选的实施方案中,靶向EGFR活性的治疗抑制突变型EGFR激酶活性。
在另一个实施方案中,将不同的同位素用作第一和第二治疗剂,作为其各自能量发射的结果所述不同的同位素在不同的距离上有效。可以使用这些药剂实现更有效的肿瘤治疗,并且可用于出现多个不同大小肿瘤的患者,如在正常临床情况一样。
很少有同位素可以用于处理极小的肿瘤沉积物和单细胞。在这些情况下,药物或毒素可能是更加有用的治疗剂。因此,在本发明的优选实施方案中,同位素可以组合以非同位素物类如药物,毒素和中子俘获剂一起使用。许多药物和毒素是已知的,其对细胞具有细胞毒性作用,并且能够用于与本发明的联系中。它们见于药物和毒素概略中,如Merck Index,Goodman and Gilman,等等,并且见于上面引用的参考文献中。
还可以将干扰细胞内蛋白质合成的药物用于本发明的方法中;这些药物是本领域技术人员已知的并且包括嘌呤霉素,放线菌酮,和RNA酶。
本发明的治疗方法可以用于癌症治疗。众所周知的是放射性同位素,药物和毒素可以缀合到由癌细胞产生或与之相关联的特异性结合到标记物的抗体或抗体片段上,这些抗体缀合物可以用来靶向放射性同位素,药物或毒素到肿瘤位点上以提高它们的治疗效力并使得副作用最小化。这些药剂和方法的例子在Wawrzynczaka-nd Thorpe(inIntroduction to the Cellular and Molecular Biology of Cancer,L.M.Franks and N.M.Teich,eds,Chapter 18,pp.378-410,OxfordUniversity Press.Oxford,1986),inImmunoconjugates:AntibodyConjugates in Radioimaging and Therapy of Cancer(C.W.Vogel,ed.,3-300,Oxford University Press,N.Y.,1987),在Dillman,R.O.(CRC Critical Reviews inOncology/Hematology 1:357,CRCPress,Inc.,1984),在Pastan等(Cell 47:641,1986).在Vitetta等(Science 238:1099-1104,1987)and in Brady等(Int.J.Rad.Oncol.Biol.Phys.13:1535-1544,1987)中进行了综述。在美国专利号4,331,647,4,348,376,4,361,544,4,468,457,4,444,744,4,460,459,4,460,561 4,624,846,4,818,709,4,046,722,4,671,958,4,046,784,5,332,567,5,443,953,5,541,297,5,601,825,5,635,603,5,637,288,5,677,427,5,686,578,5,698,178,5,789,554,5,922,302,6,187,287,和6,319,500等中公开了用于癌症的免疫缀合物的应用和其它形式的治疗的实施例。
此外,本发明的治疗方法可以组合以其它用来预防、减轻或逆转某些细胞毒性剂的副作用的化合物或技术来使用。这些组合的例子包括,例如,IL-1与用于快速清除的抗体一起施用,如在例如,美国专利号4,624,846中所述的。这种施用可以在施用组合以抗癌剂(例如,用放射性同位素,药物或毒素作为细胞毒性组分)的靶向EGFR活性的主要治疗剂之后3到72小时进行。这可以用于增强所述缀合物,药物或毒素从环境中清除并减轻或逆转由治疗剂引发的骨髓和其它造血组织毒性。
在本发明的另一方面,癌症治疗可以包括结合一种以上的tumoricidal剂,例如,药物和放射性同位素,或放射性同位素和Boron-10药剂用于中子激活疗法,或药物和生物学反应修饰剂,或融合分子缀合物和生物学反应修饰剂。可以将细胞因子并入这种治疗方案中以使得其每种组分的效力最大化。
类似地,当这些试剂并非只是指向肿瘤细胞时,与β或α发射源放射性同位素缀合的抗白血病和抗淋巴瘤抗体可以诱导骨髓和其它造血副作用。当肿瘤细胞在循环和在血液形成器官中时这被特别发现。优选同时和/或随后施用至少一种造血细胞因子(例如,生长因子,如集落刺激性因子,如G-CSF和GM-CSF)以减弱或改善造血组织副作用,同时增强抗癌效果。
本领域公知的是可以使用放射性核素治疗的各种方法用于治疗癌症和其它病理状况,如,例如在Harbert,″Nuclear MedicineTherapy″,New York,Thieme Medical Publishers,1087,PP.1-340中所述。熟习这些方法的临床医生将能够轻易地将本文所述的的细胞因子辅助治疗适用到这些方法中以减轻其任何造血组织副作用。类似地,例如,可以使用细胞毒性药物疗法,施用靶向EGFR活性的治疗剂,来治疗癌症或其它细胞增殖性疾病。这种治疗由与同位素或放射性标记的抗体进行的放射性同位素疗法相类似的理论指导。普通的熟练临床医生将能够在主要的抗癌治疗之前,之中和/或之后适用其它抗癌疗法。
试剂盒
所以本发明提供一种预测性的,诊断性的,和预后性的试剂盒,其包含简并引物以扩增erbB1基因的激酶结构域中的靶核酸和包括扩增方案和结果分析的说明书。或者所述试剂盒还包含缓冲液、酶,和溶器以进行扩增或扩增产物的分析。所述试剂盒还可以是一种筛选、诊断或预后试剂盒的组成部分,所述筛选、诊断或预后试剂盒包含其它的工具如DNA微阵列。优选地,所述试剂盒还提供一种或多种对照模板,如分离自组织样品中的核酸,和/或一系列代表erbB1基因的激酶结构域中的不同变异的样品。
在一个实施方案中,所述试剂盒提供两个或多个引物对,每对都能够扩增erbB1基因的不同区域(每个区域一种潜在的变异位点),由此提供一种试剂盒,用来在一个反应或几个并行反应中分析几种基因变异在生物学样品中的表达。
可以对试剂盒中的引物进行标记,例如进行荧光标记,以利于检测扩增产物和随后的核酸变异分析。
在一个实施方案中,在一次分析中可以检测一个以上的变异。所以组合试剂盒将由能够扩增erbB1基因的激酶结构域的不同片段的引物组成。所述引物可以进行差异性标记,例如利用不同的荧光标记,以便在变异之间有所区别。
包含在试剂盒内的引物可以包括下列引物:外显子19有义引物,5′-GCAATATCAGCCTTAGSTGCGGCTC-3S(SEQ ID NO:505);外显子19反义引物,5′-CATAGAA AGTGAACATTTAGGATGTG-3′(SEQ ID NO:506);外显子21有义引物,5′-CTAACGTTCGCCAGCCATAAGTCC-3′(SEQ ID NO:507)和外显子21反义引物,5′-GCTGCGAGCTCACCCAG AATGTCTGG-3′(SEQ ID NO:508)。
在优选的实施方案中,所述引物选自SEQ ID NOS 646-673(见表5和6)。这些引物在正向引物的5′端具有SEQ ID NO 645而在反向引物的5′端具有SEQ ID NO 674。
免疫检测试剂盒
在其它实施方案中,本发明提供了免疫试剂盒用于检测下游EGFR靶标(即STAT3,STAT5,和Akt)的激活水平。这些试剂盒将会一般性地包含一种或多种抗体,其对于STAT3,STAT5,或Akt的磷酸化形式具有免疫特异性。
在本发明中提供了一种试剂盒,其包含能够免疫特异性结合选自磷酸化Akt,STAT3,和STAT5蛋白的哺乳动物细胞中的磷酸化蛋白的抗体,以及使用所述抗体对哺乳动物细胞检测Akt,STAT3或STAT5途径激活的说明书。在优选的方法中,所述试剂盒包含不同的抗体,每种都能够免疫特异性结合选自磷酸化Akt,STAT3,和STAT5蛋白的哺乳动物细胞中的磷酸化蛋白。
所述试剂盒一般包含,a)可药用的载体;b)在合适的容器装置中的针对磷酸化STAT3,STAT5,或Akt的抗体;和c)免疫检测试剂。抗体(单克隆或多克隆的)可以商购并且也可以通过本领域技术人员已知的方法进行制备,例如,在Current Protocols inImmunology,John Wiley&Sons,Edited by:John E.Coligan,AdaM.Kruisbeek,David H.Margulies,Ethan M.Shevach,WarrenStrober,2001中。
在某些实施方案中,可以将抗原或抗体结合到固体支持物上,如柱基质或微量滴定板的孔。所述试剂盒的免疫检测试剂可以采取多种形式的任何一种,包括那些与给定抗体或抗原本身有关联,或联系的可检测标记。
合适的测定标记是本领域已知的并且包括酶标记,如葡萄糖氧化酶;放射性同位素,如碘(131I,125I,121I,121I),碳(14C),硫(35S),氚(3H),铟(115mIn,113mIn,112In,111In),和锝(99Tc,99mTc),铊(201Ti),镓(68Ga,67Ga),钯(103Pd),钼(99M0),氙(133Xe),氟(18F),153Sm,177Lu,159Gd,149Pm,140La,175yb,166Ho,90Y,47Sc,186Re,188Re,142Pr,105Rh,97Ru;发光标记如发光氨;和荧光标记,如荧光素和若丹明,以及生物素。
其它适用于本试剂盒中的免疫检测试剂包括两种组成试剂,其包含对一抗或抗原具有结合亲和性的二抗,以及对二抗具有结合亲和性的三抗,其中所述三抗连接到可检测的标记上。
许多例示性的标记是本领域已知的并且所有这些标记都可以用于与本发明的联系中。放射性标记,核磁旋转共振同位位,荧光标记以及能够在接触了适合的底物之后生成带色彩产物的酶标签是合适的例子。
所述试剂盒可以包含完全缀合形式的,或中间物形式的,或作为有待试剂盒使用者缀合的分离部分的抗体-标记缀合物。
所述试剂盒可以进一步包含适当等分的标记或未标记的抗原组合物,可以用于制备检测测定的标记曲线或用作阳性对照。
本发明的试剂盒,不论类型如何,一般将包含置入生物学试剂的一个或多个容器,并且,优选地,进行合适的等分。所述试剂盒的组分可以包装在液体培养基中或以冻干的形式包装。
本发明的免疫检测试剂盒可以另外包含许多其它癌症标记抗体或抗原的一种或多种,如果需要这样的话。因而这些试剂盒能够提供一组癌症标记,以便可以更好地用于测试多位患者。例如,这些其它标记可以包括,其它的肿瘤标记如PSA,SeLe(X),HCG,以及asp53,细胞周期蛋白DI,psi 6,酪氨酸酶,MAGE,BAGE,PAGE,MUC18,CEA,p27,[bgr]HCG或其它本领域技术人员已知的标记。
所述试剂的容器装置将一般性地包括至少一个可以置入抗体或抗原的小瓶,试管,烧瓶,瓶,或甚至是注射器或其它容器装置,优选地,进行适当地等分。在提供第二或第三结合配体或其它组分时,所述试剂盒还将一般性地包含可以置入这种配体或组分的第二,第三或其它额外的容器。
本发明的试剂盒一般还将包括密封用于商业出售的含有抗体,抗原的装置或任何其它试剂容器。这些容器可以包括保持所需小瓶的注射或吹铸的塑料容器。
本发明的方法还包括鉴定干扰EGFR变异形式的激酶活性的化合物。所述变异EGFR在其激酶结构域包含至少一种变异。这些化合物可以,例如,是酪氨酸激酶抑制剂。鉴定干扰受体激酶活性的化合物的方法一般是本领域技术人员已知的并且进一步在,例如,Dhanabal等,Cancer Res.59:189-197(1999);Xin等,J.Biol.Chem.274:9116-9121(1999);Sheu等,Anticancer Res.18:4435-4441;Ausprunk等,Dev.Biol.38:237-248(1974);Gimbrone等,J.Natl.Cancer Inst.52:413-427;Nicosia等,In vitro 18:538-549进行描述,在此将其并入作为参考。一般,利用本文公开的方法鉴定化合物,其干扰erbB1基因的激酶结构域中至少一种变异的提高的激酶活性特征。
固体支持物
在另一个实施方案中,本发明提供一种实施本发明的方法的试剂盒。在一个实施方案中,描述了一种在固体支持物上检测erbB1基因的激酶结构域中变异的试剂盒。所述试剂盒可以包括,例如在一次测定中检测多种变异的物质和试剂。所述试剂盒可以包括例如一种固体支持物,用于特定组靶多核苷酸的寡核苷酸引物,聚合酶链式反应试剂和组分,例如,用于DNA合成的酶,标记物质,和其它缓冲液和用于洗涤的试剂。所述试剂盒还可以包括使用试剂盒的说明书以便在固体支持物上扩增特异性靶标。在所述试剂盒包含一种制备好的固体支持物时,这种制备好的固体支持物的设计和构建如上所述,具有一组引物已经固定在所述固体支持物上,例如用来扩增特定组的靶多核苷酸。所述试剂盒还包括在固体支持物上进行PCR所必需的试剂,例如,当所述支持物能够利用原位型PCR机器进行PCR扩增时利用原位-型或固相型PCR方法。包括在试剂盒中的PCR试剂包括通常的PCR缓冲液,耐热聚合酶(例如Taq DNA聚合酶),核苷酸(例如dNTPs),和其它组分和标记性分子(例如如上所述进行直接或间接标记)。可以对试剂盒进行组配以支持PCR扩增方法的实施,其单独地,或与溶液相引物一起使用固定的引物。
或者,所述试剂盒可以包括一种固体支持物,其具有附着的对于任何EGFR变异数特异性的寡核苷酸,进一步在图4A-4C和图7和8中进行定义。可以在选择性杂交条件下将测试生物学样品应用到固体支持物上,用于测定erbB1基因的激酶结构域中变异的存在或缺失。
本发明的方法还包括干扰EGFR变异形式的激酶活性的化合物。所述变异EGFR在其激酶结构域中包含至少一个变异。不过,在备选的实施方案中,所述变异EGFR包含次发突变,其赋予对第一个TKI例如,gefitinib或erlotinib的耐受性。这些化合物可以是,例如,酪氨酸激酶抑制剂。鉴定干扰受体激酶活性的化合物的方法一般是本领域技术人员已知的并且进一步在,例如,Dhanabal等,Cancer Res.59:189-197(1999);Xin等,J.Biol.Chem.274:9116-9121(1999);Sheu等,Anticancer Res.18:4435-4441;Ausprunk等,Dev.Biol.38:237-248(1974);Gimbrone等,J.Natl.Cancer Inst.52:413-427;Nicosia等,In vitro 18:538-549进行描述,在此将其并入作为参考。一般,利用本文公开的方法鉴定化合物,其干扰erbB1基因的激酶结构域中至少一种变异的提高的激酶活性特征。这些已知的变异描述于图4,7,8和表2中。
一旦经鉴定,这些化合物就施用给需要EGFR靶向性治疗的患者,例如,患有癌症或处于形成癌症的危险中的患者。
给药途径可以是静脉内(I.V.),肌内(I.M.),皮下(S.C.),皮内(I.D.),腹膜内(I.P.),阴道内(I.T.),胸膜内,子宫内,直肠,阴道,局部,肿瘤内等等。本发明的化合物通过注射或通过逐渐输液进行给药或通过通过蠕动装置进行递送。
给药可以通过经粘膜或经皮方式。对于经粘膜或经皮给药来说,在制剂中使用适于透过屏障的渗透剂。这些渗透剂一般是本领域已知的,包括,例如,用于经粘膜给药的胆汁盐和梭链孢酸衍生物。此外,可以使用去污剂以利于透过。经粘膜给药可以通过例如,经鼻喷雾,或使用栓剂。对于口服给药,将本发明的化合物配制成常规的口服形式如胶囊,片剂和滋补剂。
对于局部给药,如一般为本领域已知的,将药物组合物(激酶活性的抑制剂)配制成药膏、帖膏、凝胶或乳膏。
例如通过单位剂量的注射,将本发明的治疗性组合物常规地进行静脉内给药。当关于本发明的治疗性组合物而使用时术语″单位剂量″指适合作为受试者单一剂量的物理上分离的单位,每一单位都包含经过计算的预定量的活性物质,以便产生与必需的稀释剂相关的所需治疗效果;即,载体,或媒介物。
以与剂型相容的方式,并以治疗上有效的量给药组合物。要给药的量和时间依赖于待治疗的受试者,受试者系统利用活性成分的能力,和所需治疗效果的程度。需要进行给药的活性成分的精确量依赖于医生的判断并且对于每个个体都是独特的。
本文描述了可用于本发明的方法的酪氨酸激酶抑制剂。可以使用任何含有活性成分的剂型或药物递送系统,其适于希望的用途,这一般是本领域技术人员已知的。对于口服,直肠或胃肠外(包括吸入,皮下,腹膜内,肌内和静脉内)给药合适的可药用载体是本领域技术人员已知的。在与该剂型的其它成分相容的意义上所述载体必须是可药物的并且对其受体无害。
如本文所用的,术语″可药用的″,″生理上可忍耐的″及其语法变体,当它们指组合物,载体,稀释剂和试剂时,可以相互交换使用并且代表该物质能够向哺乳动物施用而不会产生不利的生理作用。
适于胃肠外给药的剂型便利地包括活性化合物的无菌水性制品,其优选地与受体的血液等渗。因而,这些剂型可以便利地包含蒸馏水,蒸馏水或生理盐水中的5%葡萄糖。有用的剂型还包括含有所述化合物的浓缩溶液或固体,其在用适合的溶液稀释后给了适于以上胃肠外给药的溶液。
对于肠道给药,可将化合物掺入惰性载体使之成为不连续的单元,如胶囊、小袋、片剂或锭剂,每种都含有预订量的活性化合物;如粉剂或颗粒剂;或是在水性液体或非水性液体中的悬浮液或溶液,例如,糖浆、酏剂、乳剂或饮剂。适当的载体可以是淀粉或糖,并包括润滑剂、芳香剂、粘合剂和其它相同性质的材料。
片剂可采用压制或模具成型的方法制备,可选择的有一种或多种附加成分。压制的片剂可采用适当的机器,将自由流动形式的活性化合物,例如粉末或颗粒进行压制,其中所述的活性化合物中还可选择的有一种或多种附加成分,如粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂、表面活性剂或分散剂。压制的片剂可用适当的机器,将含有任何适当载体的活性化合物进行模具成型来制备。
糖浆或悬浮液可以通过将活性化合物加入糖如蔗糖的浓的水溶液中而制成,其中还可以加入任何附加成分。这些附加成分可包括芳香剂、能延缓糖结晶的试剂或能增加任何其它成分溶解度的试剂,例如多元醇,例如甘油或山梨醇。
用于直肠给药的制剂可以是带常规载体的栓剂,例如可可油或Witepsol S55(商标名Dynamite Nobel Chemical,Germany)可用作栓剂载体。
用于口服给药的剂型可以给出增强剂。可以口服的吸收增强剂包括表面活性剂如十二烷基硫酸钠,棕榈酰肉碱,聚乙二醇单十二醚,磷脂酰胆碱,环糊精及其衍生物;胆盐如去氧胆酸钠,牛磺胆酸钠,甘胆酸钠,和夫西地酸钠;螯合剂包括EDTA,柠檬酸和水杨酸盐;和脂肪酸(例如,油酸,月桂酸,acylcarnitines,甘油单酯和甘油二酯)。其它的口服吸收增强剂包括氯苄烷铵,苄索氯铵,CHAPS(3-(3-胆酰氨基丙基)-二甲基铵-1-丙磺酸盐),Big-CHAPS(N,N-二(3-D-葡糖酰氨基丙基)-胆酰胺),氯代丁醇,octoxynol-9,苯甲醇,苯酚,甲酚,和烷基醇。对于本发明来说一种特别优选的口服吸收增强剂是十二烷基硫酸钠。
另外,所述化合物可以脂质体和微球(或微粒)的形式给药。制备用于向患者施用的脂质体和微球的方法是本领域技术人员公知的,美国专利号4,789,734,特此将其内容并入作为参考,描述了使脂质体中的生物学材料成胶囊的方法。基本地,将所述材料溶解于水溶液,必要时,加入表面活性剂的同时可加入适当的磷脂和脂类,以及在需要时加入透析或超声处理的材料。关于已知方法的综述见G.Gregoriadis,第十四章,″Liposomes″,Drug Carries in Biology andMedicine,pp.287-341(Academic Press,1979)。
聚合物或蛋白质形成的微球是本领域熟练技术人员公知的,并可设计用来经过胃肠道直接进入血流。另外,可以把化合物掺入从数天至数月的一定时间范围内缓慢释放的微球、微球的组合体。例如,参见美国专利4,906,474、4,925,673、3,625,214和Jein,TIPS 19:155-157(1998),本文引用其内容作为参考。
在一个实施方案中,可以将本发明的酪氨酸激酶抑制剂配制成合适大小的脂质体或微球,以便在静脉给药后进入毛细血管层。当所述脂质体或微球进行局部缺血组织周围的毛细血管层时,可以将药剂局部给药到它们最有效的位点。用于靶向局部缺血组织的合适的脂脂体一般小于大约200纳米并且一般还是单层媒介物,如,例如,在授予Baldeschweiler的题为″Liposomal targeting of ischemic tissue″的美国专利号5,593,688,特此将其内容并入作为参考。
优选的微粒是由可生物降解的聚合物,如polyglycolide,聚交酯及其共聚物。本领域技术人员可以根据各位因素,包括所需的药物释放速率和所需的剂量轻易地确定适当的载体系统。
在一个实施方案中,通过导管直接向血管内给药所述剂型。所述给药可以,例如,通过导管中的孔来发生。在活性化合物具有相对长的半寿期(1天到一周或更长)的那些实施方案中,所述剂型可以包括在可以生物降解的聚合水凝胶中,如在授予Hubbell等的美国专利号5,410,016中所披露的那些。这些聚合的水凝胶可以递送到组织内腔内并且活性化合物可以随着时间作为聚合物降解物而释放。如果需要,所述聚合的水凝胶可以具有微粒或脂质体,其包括分散于其中的活性化合物,这提供了活性化合物的受控释放的另一种机制。
所述剂型可以便利地以单位剂量的形式给出并且可以通过药剂学领域公知的任何方法进行制备。所有的方法都包括使活性化合物与构成一种或多种助剂的载体相关联。通常,通过均一地和密切地将活性化合物与液体载体或精细分开的固体载体相关联,并且随后,如果必要的话,将产物成型为所需的单位剂量形式而制备所述剂型。
所述剂型可以进一步包括一种或多种任选的用在药物剂制剂领域中的助剂,例如,稀释剂,缓冲剂,调味剂,粘合剂,表面活性剂,增稠剂,滑润剂,悬浮剂,防腐剂(包括抗氧化剂)等等。
可以给出本发明的化合物用于向呼吸道给药,作为气味剂或气雾剂或喷雾器溶液,或作为进行喷洒的微细粉末,单独或组合以惰性载体如乳糖。在这种情况下活性化合物适当地具有小于50微米的直径,优选地小于10微米,更加优选地在2和5微米之间。
一般对于经鼻给药来说弱酸性pH是优选的。优选地本发明的组合物具有从大约3到5的pH,更加优选地从大约3.5到大约3.9,并且最优选地为3.7。通过加入适合的酸如盐酸调节pH。
包含活性成分溶于或分散于其中的药物组合物的制备是本领域公知的并且不需要基于剂型进行限定。一般将这些组合物作为液体溶液或悬浮液制备成可注射液,不过,还可以在使用之前制备适于溶液或悬浮液的固体形式。还可以将所述制品乳化。
可以将活性成分与可药用的和与所述活性成分相容的并且是适用于本文所述治疗方法的量的赋形剂混合。合适的赋形剂是,例如,水,生理盐水,葡萄糖,甘油,乙醇等及其组合。此外,如果需要,所述组合物可以包含小量的辅助物质如湿润剂或乳化剂,pH缓冲剂等等,其提高活性成分的效力。
本发明的激酶抑制剂可以在其中包括组分的可药用盐。可药用盐包括无机酸形成的酸加合盐(以多肽的三个游离氨基形成),如,例如,盐酸或磷酸,或有机酸诸如乙酸,酒石酸,苯乙醇酸等等。由游离羧基形成的盐还可以源自无机碱如,例如,氢氧化钠,钾,铵,钙或铁,以及有机碱如异丙胺,三甲基胺,2-乙基氨基乙醇,组氨酸,普鲁卡因等等。
生理上可以耐受的载体是本领域公知的。液体载体的例子是除了活性成分和水不包含其它物质的无菌水溶液,或包含缓冲液如生理pH值的磷酸钠,生理盐水或两者,如磷酸缓冲盐溶液。另外,水性载体可以包含一种以上的缓冲盐,以及诸如氯化钠和钾,葡萄糖,聚乙二醇和其它溶质的盐。
液体组合物还可以包含液相,除了水之外。这些其它的液相的例子为甘油,植物油如棉花籽油,和水-油乳浊液。
预测突变
在另一个实施方案中,本发明公开了一种在用酪氨酸激酶抑制剂处理之后预测erbB1基因中的变异的方法。一般知道对用酪氨酸激酶抑制剂进行治疗的反应一般后接对于该化合物或其它相似化合物的抗性。这种抗性据认为是通过获得药物靶标,例如,EGFR里的突变而发生的。预测(和选择)这些突变的允许更好地治疗选择和更少的复发。
在本发明的一个实施方案中由癌症患者中分离编码EGFR激酶结构域的DNA并进行测序,所述患者对gefitinib(或类似的EGFR靶向性治疗)有反应但随后又复发。预计这些患者中的复发涉及EGFR激酶结构域内获得次发突变。随后利用本文公开的方法鉴定靶向这些新定义的突变和抑制其激酶活性的化合物。这些化合物可以单独,或组合以其它已知的EGFR靶向性治疗进行使用,以治疗在EGFR激酶结构域中具有原发和次发(如上)突变的癌症患者。
在一个实施方案中,预测EGFR(erbB1基因)的激酶(催化性)结构域中的变异在体内进行。在这种方法中,将,细胞,例如成纤维细胞,用含有激酶结构域突变的cDNAs进行稳定转染,所述突变已经在人癌细胞系中进行了鉴定。例如,可以用具有诸如SEQ ID NO:495的突变的EGFR,或用任何数目的经鉴定或尚未经鉴定的激酶结构域突变的EGFRs转染所述细胞,所述SEQ ID NO:495进一步在图4A中描述。激酶结构域突变的EGFRs转染入细胞将导致细胞在培养物中异常增殖。稳定转染的方法是本领域技术人员已知的并且在Current Protocols in Molecular Biology by F.M.Ausubel,R.Brent,R.E.Kingston,D.D.Moore,J.G.Seidman,K.Struhl and V.B.Chanda(Editors),John Wiley&Sons.,2004中进一步定义,在此将其并入作为参考。随后给与细胞有效的,然而是亚致死的药物剂量,优选地为预测抑制细胞增殖的酪氨酸激酶抑制剂。在优选的实施方案中,所述药物是苯氨基喹唑啉,合成的苯氨基喹唑啉,gefitinib或erlotinib。将细胞在药物存在的情况下进行连续传代并选择存活的亚克隆。选择在许多代存活的细胞(即抗所述化合物)并分析erbB1基因中的变异。因而可以预测次发变异在体内用酪氨酸激酶抑制剂反复处理后发生。
或者,用来自人NSCLC细胞系,例如,NCI-1650和NCI-1975的抗gefitinib突变型cDNA转染细胞。每个细胞系都具有EGFR的激酶结构域的杂合突变,所以预测对gefitinib敏感。NCI-1650中的EGFR突变由外显子19内的2235-2249(delLE746-A750)位置上的15个核苷酸的框内删除组成,而NCI-1975具有外显子21内的错义突变,其在核苷酸2573(L858R)取代T为G。如本文所示,NCI-H1975中的L858R突变是激活性的并且赋予对gefitinib体外提高的敏感性。可以使用其它具有EGFR激酶结构域突变的其它癌细胞系。所述癌细胞系可以包括肺癌以及其它被发现具有这些突变的癌症。
可以用诱变剂处理细胞以便提高所述细胞获得次发突变的频率。诱变剂可以根据剂量方案,递送方式,生物或细胞在诱变剂施用时的的发育阶段以不同的频率诱导突变,所有这些参数都在现有技术中对于不同的诱变剂或诱变技术进行了公开。所述诱变剂可以是烷化剂,如甲磺酸乙酯(EMS),N-乙基-N-亚硝基脲(ENU)或N-甲基-N-亚硝基脲(MNU)。或者,所述诱变剂可以是,例如,phocarbaxinehydrochloride(Prc),甲磺酸甲酯(MeMS),苯丁酸氮芥(Chl),美法仑,porcarbazine hydrochloride,环磷酰胺(Cp),硫酸二乙酯(Et2SO4),丙烯酰胺单体(AA),triethylene melamin(TEM),氮芥,长春新碱,二甲基亚硝胺,N-甲基-N′-硝基-亚硝基胍(MNNG),7,12二甲基苯并蒽(DMBA),氧丙环,六甲基磷酰胺,bisulfan,和ethyl methanesulforate(EtMs)。用诱变剂处理细胞的方法在,例如,U.S.6,015,670中进行了描述,在此将其并入作为参考。在诱变后,能够将细胞(即用变异EGFR转染的或人癌细胞系衍生的)培养在添加了gefitinib的培养基中以选择抗性克隆的生长。单个克隆的继代培养接来下,例如,在相应对EGFR激酶结构域的基因组DNA的特异性PCR介导的扩增后,进行EGFR基因的核苷酸序列测定。
在另一个实施方案中,在逐渐提高浓度的gefitinib(或类似的酪氨酸激酶抑制剂)存在的情况下将细胞(具有EGFR变异)连续传代几周或几个月以便选择EGFR基因内突变的自发获得,其赋予对gefitinib的抗性。选定的细胞(其在相当高的gefitinib浓度下继续增殖)可以分离为集落,并且将如上所述对突变进行鉴定。因而可以预测这些变异在体内用酪氨酸激酶抑制剂反复处理后发生。见,例如,Scappini等,Cancer,April 1,2004,Vol.100,pg.1459,在此并入作为参考。
在又一个实施方案中,在将它导入稳定选择的细胞系中之前,可以将EGFR的变异形式在DNA修复缺陷型细菌菌株中进行扩增。这些细菌的复制将提高诱变的频率。或者,使用本领域技术人员已知的标准方法,可以利用″致错″PCR提高体外克隆的EGFR DNA的突变频率。
在另一个实施方案中,预测erbB1基因激酶结构域中的变异在体内进行。例如,将一种提高激酶活性的erbB1基因变异形式转染到动物体内,即,小鼠,生成癌症模型。随后用有效剂量的化合物治疗所述动物,优选苯氨基喹唑啉,合成的苯氨基喹唑啉,gefitinib或erlotinib。在反复接触化合物后,癌症最初被抑制。如在用这些化合物治疗的人中一样,动物体内的肿瘤细胞获得了突变,其使得它们耐受这种治疗。本发明的方法允许这些抗性肿瘤中的erbB1基因的分离和特征鉴定。特异性靶向这些新鉴定的变异的化合物可以用于治疗怀疑携带这种突变的erbB1基因的患者。这些患者包括,例如,最初对用酪氨酸激酶抑制剂的疗法有反应,但随后对相同或相似化合物无反应的患者。
产生动物模型的方法是本领域技术人员已知的并且进一步在例如,Ohashi等,Cell,65:305-317(1991);Adams etal.,Nature,325:223-228(1987);和Roman等,Cell,61:383-396(1990)中进行描述,将其并入本文作为参考。对于受精的卵母细胞来说,导入转基因的优选方法是通过微注射。见,例如,Leder等,美国专利号4,736,866和5,175,383,在此将其并入作为参考,而对于胚胎干(ES)细胞来说,优选的方法是电穿孔。不过,可以使用其它方法,包括病毒递送系统如反转录病毒感染,或脂质体融合。核酸的分离和特征鉴定在上面和在实施例中进行描述。
利用本发明的方法,可以在患者(诊断性的或预后性的)中筛选上面鉴定的erbB1基因中的提高激酶活性的变异。随后这种突变的存在或缺失可以用作确定个体对用EGFR靶向性化合物,如,例如,酪氨酸激酶抑制剂治疗敏感性的标准。
利用本领域已知的和本文讨论的技术,可以选择特异性靶向这些新定义的变异的化合物,不论是在体内或体外鉴定的。可以利用候选药物筛选测定法鉴定抑制EGFR变异形式的活性的生物活性候选药剂。特别有兴趣的是对于人细胞具有低毒性的药剂的筛选测定法。为此目的可以利用许多测定法,包括体外标记的蛋白质-蛋白质结合测定法,电泳迁移率转变测定法,酶活性测定法,蛋白质结合的免疫测定法等等。还可以使用纯化的突变型EGFR蛋白测定三维晶体结构,其可以用于对于分子间相互作用、运输剂功能等建立模型。这些化合物可以是,例如,酪氨酸激酶抑制剂,抗体,适体,siRNAs,和抑制EGFR激酶活性的载体。
在另一个实施方案中,可用于本发明的化合物是通过变异型EGFR干扰激酶信号发送的抗体,包括单克隆的,嵌合性人源化的,和重组的抗体及其片段,其特征是它们的抑制EGFR的激酶活性的能力并且其具有低毒性。
通过用在其激酶结构域中具有至少一个核酸变氨基的EGFR进行免疫在诸如兔或小鼠的动物体内轻易产生压制性抗体。经免疫的小鼠对于提供生产杂交瘤的B细胞源特别有用,所述杂交瘤又进行培养以生产大量的抗EGFR单克隆抗体。嵌合性抗体是免疫球蛋白分子,特征为来自不同动物物种的两个或多个片段或部分。一般,嵌合性抗体的可变区源自非人哺乳动物抗体,如鼠单克隆抗体,而免疫球蛋白恒定区来自人免疫球蛋白分子。优选地,如常规测定地,两个区域及其组合都具有低免疫原性。人源化抗体是由遗传工程技术生成的免疫球蛋白分子,其中鼠恒定区被人对应部分所替代,同时保留鼠抗原结合区。得到的小鼠-人嵌合性抗体在人体内应当具有减弱的免疫原性和增强的药物动力学。可用于本发明的方法中的高亲和性单克隆抗体及其嵌合性衍生物的优选例子,在欧洲专利申请EP 186,833;PCT专利申请WO 92/16553;和美国专利号6,090,923中进行描述。
现有的或如上所述新鉴定的化合物可以用于治疗携带原发或次发EGFR突变的患者。
在优选的实施方案中,所述化合物是在其激酶结构域中具有至少一个变异的EGFR的酪氨酸激酶活性抑制剂,特别是对与其它酪氨酸激酶相比″突变的″EGFRs具有选择作用的小分子抑制剂。EGFR的抑制剂包括,但不限于,酪氨酸激酶抑制剂如喹唑啉,如PID153035,4-(3-氯苯胺)喹唑啉,或CP-358,774,吡啶并嘧啶,嘧啶并嘧啶,吡唑并嘧啶,如CGP 59326,CGP 60261和CGP 62706,和吡唑并嘧啶,4-(苯氨基)-7H-吡咯[2,3-d]嘧啶(Traxler等,(1996)J.Med Chem 39:2285-2292),姜黄色素(diferuloylmethane)(Laxmin arayana,等,(1995),Carcinogen 16:1741-1745),4,5-二(4-对氟苯胺)酞酰亚胺(Buchdunger等(1995)Clin.CancerRes.1:813-821;Dinney等(1997)Clin.Cancer Res.3:161-168);包含tyrphostins的硝基噻吩部分(Brunton等(1996)Anti CancerDrug Design 11:265-295);蛋白激酶抑制剂ZD-1839(AstraZeneca);CP-358774(Pfizer,Inc.);PD-0183805(Warner-Lambert),EKB-569(Torrance等人,Nature Medicine,Vol.6,No.9,Sept.2000,p.1024),HKI-272和HKI-357(Wyeth);或如国际专利申请W099/09016(American Cyanamid);W098/43960(American Cyanamid);W097/38983(Warener Labert);W099/06378(WarnerLambert);W099/06396(Warner Lambert);W096/30347(Pfizer,Inc.);W096/33978(Zeneca);W096/33977(Zeneca);andW096/33980)Zeneca中所述的;全部都并入本文作为参考。
在另一个实施方案中,可以使用反义策略干扰变异EGFR的激酶活性。这种方法可以,例如,利用反义核酸或核酸,其通过用反义核酸掩饰特异性mRNA或用核酶剪切它来阻抑该mRNA的翻译。关于反义技术的一般性讨论,参见,例如,Antisense DNA and RNA,(ColdSpring Harbor Laboratory,D.Melton,ed.,1988)。
变异EGFR基因转录的可逆的短暂抑制是可以是有用的。这种抑制可能通过使用siRNAs而实现。RNA干扰(RNAi)技术通过使用小RNA分子如小干扰性RNAs(siRNAs)阻止基因的表达。这种技术又利用这样的事实,即RNAi是从植物到昆虫到哺乳动物的许多活体生物的大多数细胞中使基因沉默的天然生物学机制(McManus等,Nature Reviews Genetics,2002,3(10)p.737)。RNAi通过确保中间分子,基因的信使RNA被破坏而阻止基因产生功能性蛋白质。siRNAs能够以裸分子形式以及并入载体中,如下所述,进行使用。能够进一步利用适体特异性抑制变异EGFR基因转录,见,例如,美国专利6,699,843。可用于本发明的适体可以利用SELEX方法进行鉴定。SELEX法已经在,例如美国专利号5,707,796,5,763,177,6,011,577,5,580,737,5,567,588,和5,660,985中进行了描述。
″反义核酸″或″反义寡核苷酸″是单链核酸分子,其,在细胞质条件下与RNA或DNA分子中的互补碱基杂交后,抑制后者的作用。如果RNA是信使RNA转录本,则反义核酸是相反转录本或mRNA干扰性互补核酸。如本文所用的,″反义″广义地包括RNA-RNA相互作用,RNA-DNA相互作用,核酶,RNAi,适体和RNA酶H介导的阻滞。
核酶是具有以在某种程度上与DNA限制性内切酶类似的方式特异性剪切其它单链RNA分子的能力的RNA分子。核酶是由这样的观察结果发现的,即某些mRNAs具有剪切它们自身内含子的能力。通过修饰这些核核苷酸序列,研究者已经能够改造分子,其识别RNA分子中的特异性核苷酸序列并剪切它(Cech,1989,Science 245(4915)p.276)。因为它们是序列特异性的,只有具有特定序列的mRNAs失活。
反义核酸分子能够由重组基因编码用于在细胞中的表达(例如,美国专利号5,814,500;U.S.5,811,234),或者可以合成的制备它们(例如,美国专利号5,780,607)。
本发明进一步提供治疗癌症患者的方法。特别地,在EGFR的激酶结构域中具有至少一个核酸变异的患者。所述治疗方法包括在适当的时间窗口内对患者施用包含siRNA的组合物。所述siRNAs可以进行化学合成,利用体外转录生产,等。此外,可以用这样的方式对个别患者定制siRNA分子,即精确地对应于在他们的肿瘤中鉴定的突变。由于siRNA能够区分只有一个核苷酸不同的核苷酸序列,有可能设计出唯一性靶向EGFR基因的突变形式的siRNAs,所述突变形式单一核苷酸取代或几个核苷酸的小删除有关联-二者都如本文所述地进行了鉴定。SiRNAs已经在Brummelkamp等,Science 296;550-553,2002,Jaque等,Nature 418;435-438,2002,Elbashir S.M.等(2001)Nature,411:494-498,McCaffrey等(2002),Nature,418:38-39;Xia H.等(2002),Nat.Biotech.20:1006-1010,Novina等(2002),Nat.Med.8:681-686,和美国申请号20030198627中进行了描述。
这种治疗策略相对于使用抑制突变型受体和正常受体的药物如gefitinib的重要优点,是siRNA直接针对突变的EGFR,不会抑制野生型EGFR。这是有意义的,因为一般据信gefitinib治疗的″副作用″,其包括腹泻和皮炎,是需要EGFR功能的正常组织中EGFR抑制的结果。
通过任何几种现有的递送″媒介物″都可以潜在地实现siRNA向肿瘤的递送。这些包括病毒载体,如腺病毒,慢病毒,疱疹单纯病毒,牛痘病毒,和反转录病毒,以及化学介导的基因递送系统(例如,脂质体),或机械性DNA递送系统(DNA枪)。要表达用于这种siRNA-介导的基因表达的抑制的寡核苷酸长度为18和28个核苷酸之间。
在另一个实施方案中,所述化合物为对于人序列特异性的反义分子,所述人序列编码在其激酶结构域中具有至少一个变异的EGFR。给药的治疗剂可以是反义寡核苷酸,特别是合成的寡核苷酸;具有由天然核酸进行的化学修饰,或表达这些反义分子为RNA的核酸构建体。所述反义序列与靶向EGFR基因的mRNA互补,并且抑制靶向基因产物的表达(见例如Nyce等(1997)Nature 385:720)。反义分子通过减少可用于翻译的mRNA的量,通过RNA酶H或空间位阻来抑制基因表达。可以施用一种反义分子或反义分子的组合,其中组合可以包含多种来自靶基因的不同序列,或与几种不同基因互补的序列。
优选的靶基因是在其激酶结构域中具有至少一种核酸变异的EGFR。所述基因序列在本文中并入,如,例如,图5中。一般,反义序列将具动物宿主具有相同的物种来源。
通过在合适载体中的靶基因序列的全部或部分的表达可以产生反义分子,其中将所述载体导入并表达于靶向宿主细胞中。将对转录起始进行导向从而将反义链作为RNA分子进行生产。
反义RNA与内源有义链mRNA杂交,由此阻抑靶基因的表达。可以采用天然的转录起始区,或外源转录起始区。启动子可以通过体外重组方法,或作为序列同源性整合入染色体中的结果而得以导入。许多在肌细胞中具有活性的强启动子是本领域已知的,包括O-肌动蛋白启动子,SV40早期和晚期启动子,人cytornegalovirus启动子,反转录病毒LTRs,等。转录载体一般具有方便的限制性位点,位于启动子序列附近以提供核酸序列的插入。转录盒可以制备成包含转录起始区,靶基因或其片段,以及转录终止区。可以将转录盒导入多种载体中,例如质粒;逆转录病毒,例如慢病毒;腺病毒;等等,其中所述载体能够短暂地或稳定地保持在细胞中,通常持续至少大约一天的时间,更加通常持续至少大约几天的时间。
适体也是有用的。适体是一类新的有希望的治疗性寡核苷酸或肽并且在体外进行选择以高亲和性特异性结合到给定的靶标上,如例如配体受体。它们的结合特性可能是寡核苷酸形成由分子内核碱配对保持在一起的三维结构的能力的反映。适体是合成的DNA,RNA或肽序列,其可以是正常的和经修饰的(例如肽核酸(PNA)巯基磷酸化DNA等),其与靶蛋白,配体(脂,糖,代谢物等)相互作用。在另一个实施方案中,可以将对变异EGFR特异性的RNA适体作为治疗剂导入或表达于细胞中。
肽核酸(PNAs)是在某些方面与寡核苷酸及其类似物相似的化合物,并且因而可以模仿DNA和RNA。在PNA中,寡核苷酸的脱氧核糖骨架已被假肽骨架所替换(Nielsen等1991Science 254,1457-1500)。每个亚基或单体,都具有天然发生的或非天然发生的附于这种骨架上的核碱。一种这类骨架由通过酰胺键连接的N-(2-氨基乙基)甘氨酸构成。PNA与互补核酸通过Watson和Crick碱基配对和螺旋形成而杂交。所述假肽骨架提供良好的杂交特性(Egholm等Nature(1993)365,566-568),对酶降解的抗性(Demidov等Biochem.Pharmacol.(1994)48,1310-1313)和对多种化学修饰的接受性(Nielsen and Haaima Chemical Society Reviews(1997)73-78)。可以将对变异EGFR特异的PNAs作为治疗剂导入或表达于细胞中。PNAs已经在,例如,美国申请号20040063906中进行了描述。
要用靶向变异EGFR的化合物治疗的患者包括,例如,诊断在其EGFR中具有原发或次发突变的患者,一开始对用酪氨酸激酶抑制剂进行的治疗有反应,但随后对相同或相似化合物无反应的患者。或者,可以将靶向次发EGFR突变的化合物组合以靶向原发EGFR突变的化合物,例如,gefitinib给与癌症患者,作为组合治疗。通过组合靶向原发和次发EGFR突变的化合物,抗性的可能性将被减小。
其它赋予对目前已知的抗癌治疗剂包括但不限于EGFR酪氨酸激酶抑制剂gefitinib,erlotinib等等的抗性的EGFR突变,在本发明的范围内。预测抗性EGFR突变具有与在包含相关酪氨酸激酶结构域的蛋白质的激酶结构域中鉴定的突变类似的突变。介绍类似蛋白质中突变的论文包括本领域已知的关于BCR-ABL的那些。参见,例如,Bradford等Blood.2003Jul 1;102(1):276-83,Epub 2003Mar 06;Hachhaus等,Leukemia.2002Nov;16(11):2190-6;and Al-Ali等,Hematol J.2004;5(1):55-60。
抗已知EGFR酪氨酸激酶抑制剂的突变型EGFR包括任何一种或多种EGFR多肽,或编码它的核苷酸,在类似于c-ab1(BCR-ABL)残基的一个或多个位置上具有非野生型残基,所述c-abl(BCR-ABL)残基确定imatinib抗性表型。当在EGFR中突变时赋予药物抗性的残基特别包括那些来自激酶结构域的残基,包括但不限于,例如,P-loop和激活环,其中在EGFR多肽中的突变残基与c-able残基类似。预期的抗性EGFR突变在与至少下列位置类似的氨基酸位置上具有非野生型残基:BCR-ABL的Met 244,Leu 248,Gly 250,Gln 252,Tyr 253,Glu 255,Asp 276,Thr 315,Phe317,Met 351,Glu 355,Phe 359,His 396,Ser 417,和Phe 486,见,例如表S3C和图9。这些BCL-ABL残基分别对应于EGFR中的残基Lys 714,Leu 718,Ser 720,Ala 722,Phe 723,Thr 725,Ala 750,Thr 790,Leu 792,Met 825,Glu 829,Leu 833,His 870,Thr 892,Phe 961。见,例如,表S3C,图9。
预后测试
本发明的方法被用作癌症发展的预后指征。或者,利用所述方法检测已经存在但尚未诊断或处于不能检测阶段的癌症。利用本发明的方法对处于形成癌症的危险之中的患者筛选erbB1基因中提高激酶活性的核酸变异的存在。erbB1基因激酶结构域中变异的存在表明癌症的存在或即将出现。因而,erbB1基因激酶结构域中变异的存在提示患者将从EGFR靶向性治疗中获益。如本文所述,EGFR靶向性治疗优选是用酪氨酸激酶抑制剂进行的治疗。
在本发明优选的实施方案中,通过获得生物学样品对患者筛选erbB1基因激酶结构域中核酸变异的存在或缺失。所述样品可以是来自患者的任何样品,包括来自例如舌、口、颊、气管、支气和、肺等的组织或来自例如痰或肺吸出物的液体。获得这些生物学样本的方法是本领域技术人员公知的。
因而,本发明提供一种方法,用于鉴定与异常突变型EGFR表达或活性相关联的疾病或病症,其中从受试者获得测试样品并检测突变型EGFR蛋白或核酸(例如,mRNA,基因DNA),其中突变型EGFR蛋白或核酸的存在是对患有或处于形成与异常突变型EGFR表达或活性相关联的疾病或病症的危险之中的患者的诊断。如本文所用的,术语″测试样品″指获自目标受试者的生物学样品。例如,测试样品可以是生物液体(例如,血清),细胞样品,或组织,特别是活检组织样品。
另外,本文所述的预后测定可以用于确定受试者是否能够施用一种药剂(例如激活剂、拮抗剂、peptidomimetic、蛋白质、肽、核酸、小分子,或其它药物候选物)来治疗与异常突变型EGFR表达或活性相关联的疾病或病症。例如,这些方法可以用来确定受试者是否能够用一种药剂对病症进行有效治疗。因而,本发明提供用来确定受试者是否能够能够用一种药剂对与异常突变型EGFR表达或活性相关联的病症进行有效治疗的方法,其中获得一种测试样品并对突变型EGFR蛋白或核酸进行检测(例如,其中突变型EGFR蛋白或核酸的存在是对受试者的诊断,所述受试者能够给药一种药剂以治疗与突变型EGFR表达或活性相关联的病症)。
实施例
实施例1
肿瘤样本的核苷酸序列分析
从患有NSCLC的患者中收集来自初始诊断或手术操作的肿瘤样本,随后在IRB批准的方案下用Gefitinib治疗所述患者。从四个病例中得到冷冻的肿瘤样本,以及相匹配的正常组织,并对剩余的样本使用石蜡包埋材料。此外,由Massachusetts General Hospital肿瘤库获得25个未经选择的原发NSCLC病例(15支气管肺泡癌,7个腺癌,和3个大细胞肺癌),以及相匹配的正常组织。为了进行完整EGFR编码序列的突变分析,从样本中提取DNA,随后扩增所有28个外显子,对未克隆的PCR片段进行测序,并在有义和反义方向上进行electropherograms分析杂合突变的存在。通过多重独立的PCR扩增确认所有的序列变体。
在附录材料中提供引物序列和扩增条件。还在乳腺(15个病例),结肠(20个病例),肾(16个病例),和脑(4个病例)的原发肿瘤,以及一组呈现不同组织学的78个癌衍生的细胞系(下面列出)中寻找外显子19和21中的EGFR突变。。
突变型EGFR构建体的功能分析
利用定点诱变将L858R和delL747-P753insS突变导入全长EGFR编码序列中并插入到细胞巨化病毒来源的表达构建体(pUSE,Upstate)中。使用1μg的表达构建体转染Cos-7细胞(Lipofectamine2000,Invitrogen),18hrs后以5x104细胞/孔(12-孔板,Costar)重新接种于DMEM缺乏的胎牛血清中。16hrs的血清饥饿后,用10ng/ml的EGF(SIGMA)刺激细胞。为了证明Gefitinib抑制作用,在加入EGF(用100ng/ml的EGF刺激30min)3hrs之前将药物加入到培养基中。在100μL的Laemmli裂解缓冲液中制备细胞裂解物,随后在10%SDS-PAGE上解析蛋白质,转移到PVDF膜上,以及利用增强的化学发光试剂(Amersham)进行蛋白质印迹分析。利用针对磷酸酪氨酸Y-1068的抗体测量EGFR的自体磷酸化作用,并利用抗EGFR抗体(作用浓度1∶1000;Cell Signaling Technology)显示可比较的蛋白质表达。
突变分析
利用聚合酶链式反应扩增包含EGFR基因的28个外显子,使用分离自原发肿瘤组织或肿瘤衍生的细胞系的DNA。所用的引物对是:外显子1,
CAGATTTGGCTCGACCTGGACATAG(有义)(SEQ ID NO:513)和
CAGCTGATCTCAAGGAAACAGG(反义)(SEQ ID NO:514);外显子2,
GTATTATCAGTCACTAAAGCTCAC(有义)(SEQ ID NO:515)和
CACACTTCAAGTGGAATTCTGC(SEQ ID NO:516);外显子3,CTCGTG
TGCATTAGGGTTCAACTGG(有义)(SEQ ID NO:517)和
CCTTCTCCGAGGTGGAATTGAGTGAC(反义)(SEQ ID NO:518);外显子4,
GCTAATTGCGGGACTCTTGTTCGCAC(有义)(SEQ ID NO:519)和
TACATGCTTTTCTAGTGGTCAG(反义)(SEQ ID NO:520);外显子5,
GGTCTCAAGTGATTCTACAAACCAG(有义)(SEQ ID NO:521)和
CCTTCACCTACTGGTTCACATCTG(反义)(SEQ ID NO:522);外显子6,
CATGGTTTGACTTAGTTTGAATGTGG(有义)(SEQ ID NO:523)和
GGATACTAAAGATACTTTGTCACCAGG(反义)(SEQ ID NO:524);外显子7,GAACACTAGGCTGCAAAGACAGTAAC(有义)(SEQ ID NO:525)和
CCAAGCAAGGCAAACACATCCACC(反义)(SEQ ID NO:526);外显子8,
GGAGGATGGAGCCTTTCCATCAC(有义)(SEQ ID NO:527)和
GAAGAGGAAGATGTGTTCCTTTGG(反义)(SEQ ID NO:528);外显子9和10,
GAATGAAGGATGATGTGGCAGTGG(有义)(SEQ ID NO:529)和
CAAAACATCAGCCATTAACGG(反义)(SEQ ID NO:530);外显子11,
CCACTTACTGTTCATATAATACAGAG(有义)(SEQ ID NO:531)和
CATGTGAGATAGCATTTGGGAATGC(反义)(SEQ ID NO:532);外显子12,
CATGACCTACCATCATTGGAAAGCAG(有义)(SEQ ID NO:533)和
GTAATTTCACAGTTAGGAATC(有义)(SEQ ID NO:534);外显子13,GTCACCCAAGGTCATGGAGCACAGG(有义)(SEQ IDNO:535)和
CAGAATGCCTGTAAAGCTATAAC(反义)(SEQ ID NO:536);外显子14,GTCCTGGAGTCCCAACTCCTTGAC(有义)(SEQ IDNO:537)和
GGAAGTGGCTCTGATGGCCGTCCTG(反义)(SEQ ID NO:538);外显子15,
CCACTCACACACACTAAATATTTTAAG(有义)(SEQ ID NO:539)和
GACCAAAACACCTTAAGTAACTGACTC(反义)(SEQ ID NO:540);外显子16,
CCAATCCAACATCCAGACACATAG(有义)(SEQ ID NO:541)和
CCAGAGCCATAGAAACTTGATCAG(反义)(SEQ ID NO:542);外显子17,
GTATGGACTATGGCACTTCAATTGCATGG(有义)(SEQ IDNO:543)和
CCAGAGAACATGGCAACCAGCACAGGAC(反义)(SEQ ID NO:544);外显子18,
CAAATGAGCTGGCAAGTGCCGTGTC(有义)(SEQ ID NO:545)和
GAGTTTCCCAAACACTCAGTGAAAC(反义)(SEQ ID NO:546)或
CAAGTGCCGTGTCCTGGCACCCAAGC(有义)(SEQ ID NO:675)和
CCAAACACTCAGTGAAACAAAGAG(反义)(SEQ ID NO:676);外显子19,
GCAATATCAGCCTTAGGTGCGGCTC(有义)(SEQ ID NO:547)和
CATAGAAAGTGAACATTTAGGATGTG(反义)(SEQ ID NO:548);外显子20,
CCATGAGTACGTATTTTGAAACTC(有义)(SEQ ID NO:549)和
CATATCCCCATGGCAAACTCTTGC(反义)(SEQ ID NO:550);外显子21,
CTAACGTTCGCCAGCCATAAGTCC(有义)(SEQ ID NO:551)和
GCTGCGAGCTCACCCAGAATGTCTGG(反义)(SEQ ID NO:552);外显子22,
GACGGGTCCTGGGGTGATCTGGCTC(有义)(SEQ ID NO:553)和
CTCAGTACAATAGATAGACAGCAATG(反义)(SEQ ID NO:684);外显子23,
CAGGACTACAGAAATGTAGGTTTC(有义)(SEQ ID NO:555)和
GTGCCTGCCTTAAGTAATGTGATGAC(反义)(SEQ ID NO:556);外显子24,
GACTGGAAGTGTCGCATCACCAATG(有义)(SEQ ID NO:557)和
GGTTTAATAATGCGATCTGGGACAC(反义)(SEQ ID NO:558);外显子25,
GCAGCTATAATTTAGAGAACCAAGG(有义)(SEQ ID NO:559)和
GGTTAAAATTGACTTCATTTCCATG(反义)(SEQ ID NO:560);外显子26,CCTAGTTGCTCTAAAACTAACG(有义)(SEQ ID NO:561)和
CTGTGAGGCGTGACAGCCGTGCAG(反义)(SEQ ID NO:562);外显子27,
CAACCTACTAATCAGAACCAGCATC(有义)(SEQ ID NO:563)和
CCTTCACTGTGTCTGCAAATCTGC(反义)(SEQ ID NO:564);外显子28,
CCTGTCATAAGTCTCCTTGTTGAG(有义)(SEQ ID NO:565)和
CAGTCTGTGGGTCTAAGAGCTAATG(反义)(SEQ ID NO:566)。
退火温度是58℃(外显子1,3,4,7-10,12-25,27,和28),56℃(外显子2,5,6,和26),或52℃(外显子11)。
如下进行由保藏肿瘤组织提取的DNA的巢式PCR扩增。利用引物和上述条件对外显子2,5,6,7,11,12,14,16,18,19,20,21,23,24,25,26,和27进行初始PCR。随后,利用下列内部引物对在第二个PCR中扩增2μl的这种反应物:外显子2
CAGGAATGGGTGAGTCTCTGTGTG(有义)(SEQ ID NO:567)和
GTGGAATTCTGCCCAGGCCTTTC(反义)(SEQ ID NO:568);外显子5,
GATTCTACAAACCAGCCAGCCAAAC(有义)(SEQ ID NO:569)和
CCTACTGGTTCACATCTGACCCTG(反义)(SEQ ID NO:570);外显子6,
GTTTGAATGTGGTTTCGTTGGAAG(有义)(SEQ ID NO:571)和
CTTTGTCACCAGGCAGAGGGCAATATC(反义)(SEQ ID NO:572);外显子7,
GACAGTAACTTGGGCTTTCTGAC(有义)(SEQ ID NO:573)和
CATCCACCCAAAGACTCTCCAAG(反义)(SEQ ID NO:574);外显子11,
CTGTTCATATAATACAGAGTCCCTG(有义)(SEQ ID NO:575)和GAGAGATGCAGGAGCTCTGTGC(反义)(SEQ ID NO:576);外显子12,GCAGTTTGTAGTCAATCAAAGGTGG(有义)(SEQ IDNO:577)和
GTAATTTAAATGGGAATAGCCC(反义)(SEQ ID NO:578);外显子14,CAACTCCTTGACCATTACCTCAAG(有义)(SEQ IDNO:579)和GATGGCCGTCCTGCCCACACAGG(反义)(SEQ IDNO:580);外显子16,
GAGTAGTTTAGCATATATTGC(有义)(SEQ ID NO:581)和
GACAGTCAGAAATGCAGGAAAGC(反义)(SEQ ID NO:582);外显子18,
CAAGTGCCGTGTCCTGGCACCCAAGC(有义)(SEQ ID NO:583)和
CCAAACACTCAGTGAAACAAAGAG(反义)(SEQ ID NO:584)或GCACCCAAGCCCATGCCGTGGCTGC(有义)(SEQ ID NO:677)和
GAAACAAAGAGTAAAGTAGATGATGG(反义)(SEQ ID NO:678);外显子19,
CCTTAGGTGCGGCTCCACAGC(有义)(SEQ ID NO:585)和
CATTTAGGATGTGGAGATGAGC(反义)(SEQ ID NO:586);外显子20,
GAAACTCAAGATCGCATTCATGC(有义)(SEQ ID NO:587)和
GCAAACTCTTGCTATCCCAGGAG(反义)(SEQ ID NO:588);外显子21,
CAGCCATAAGTCCTCGACGTGG(有义)(SEQ ID NO:589)和
CATCCTCCCCTGCATGTGTTAAAC(反义)(SEQ ID NO:590);外显子23,
GTAGGTTTCTAAACATCAAGAAAC(有义)(SEQ ID NO:591)和
GTGATGACATTTCTCCAGGGATGC(反义)(SEQ ID NO:592);外显子24,
CATCACCAATGCCTTCTTTAAGC(有义)(SEQ ID NO:593)和
GCTGGAGGGTTTAATAATGCGATC(反义)(SEQ ID NO:594);外显子25,
GCAAACACACAGGCACCTGCTGGC(有义)(SEQ ID NO:595)和
CATTTCCATGTGAGTTTCACTAGATGG(反义)(SEQ ID NO:596);外显子26,
CACCTTCACAATATACCCTCCATG(有义)(SEQ ID NO:679)和
GACAGCCGTGCAGGGAAAAACC(反义)(SEQ ID NO:680);外显子27,
GAACCAGCATCTCAAGGAGATCTC(有义)(SEQ ID NO:681)和
GAGCACCTGGCTTGGACACTGGAG(反义)(SEQ ID NO:682)。
剩余外显子的巢式PCR扩增由利用下列引物的初始PCR组成。外显子1,
GACCGGACGACAGGCCACCTCGTC(有义)(SEQ ID NO:597)和
GAAGAACGAAACGTCCCGTTCCTCC(反义)(SEQ ID NO:598);外显子3,
GTTGAGCACTCGTGTGCATTAGG(有义)(SEQ ID NO:599)和
CTCAGTGCACGTGTACTGGGTA(反义)(SEQ ID NO:600);外显子4,
GTTCACTGGGCTAATTGCGGGACTCTTGTTCGCAC(有义)(SEQ ID NO:601)和
GGTAAATACATGCTTTTCTAGTGGTCAG(反义)(SEQ ID NO:602);外显子8,
GGAGGATGGAGCCTTTCCATCAC(有义)(SEQ ID NO:603)和
GAAGAGGAAGATGTGTTCCTTTGG(反义)(SEQ ID NO:604);外显子9,
GAATGAAGGATGATGTGGCAGTGG(有义)(SEQ ID NO:605)和
GTATGTGTGAAGGAGTCACTGAAAC(反义)(SEQ ID NO:606);外显子10,
GGTGAGTCACAGGTTCAGTTGC(有义)(SEQ ID NO:607)和
CAAAACATCAGCCATTAACGG(反义)(SEQ ID NO:608);外显子13,
GTAGCCAGCATGTCTGTGTCAC(有义)(SEQ ID NO:609)和
CAGAATGCCTGTAAAGCTATAAC(反义)(SEQ ID NO:610);外显子15,
CATTTGGCTTTCCCCACTCACAC(有义)(SEQ ID NO:611)和
GACCAAAACACCTTAAGTAACTGACTC(反义)(SEQ ID NO:612);外显子17,
GAAGCTACATAGTGTCTCACTTTCC(有义)(SEQ ID NO:613)和
CACAACTGCTAATGGCCCGTTCTCG(反义)(SEQ ID NO:614);外显子22,
GAGCAGCCCTGAACTCCGTCAGACTG(有义)(SEQ ID NO:683)和
CTCAGTACAATAGATAGACAGCAATG(反义)(SEQ ID NO:684);外显子28a
GCTCCTGCTCCCTGTCATAAGTC(有义)(SEQ ID NO:615)和
GAAGTCCTGCTGGTAGTCAGGGTTG(反义)(SEQ ID NO:616);外显子28b,
CTGCAGTGGGCAACCCCGAGTATC(有义)(SEQ ID NO:617)和
CAGTCTGTGGGTCTAAGAGCTAATG(反义)(SEQ ID NO:618)。
利用下列引物对进行第二次PCR扩增:外显子1,
GACAGGCCACCTCGTCGGCGTC(有义)(SEQ ID NO:619)和
CAGCTGATCTCAAGGAAACAGG(反义)(SEQ ID NO:620);外显子3,
CTCGTGTGCATTAGGGTTCAACTGG(有义)(SEQ ID NO:621)和
CCTTCTCCGAGGTGGAATTGAGTGAC(反义)(SEQ ID NO:622);外显子4,
GCTAATTGCGGGACTCTTGTTCGCAC(有义)(SEQ ID NO:623)和
TACATGCTTTTCTAGTGGTCAG(反义)(SEQ ID NO:624);外显子8,
CCTTTCCATCACCCCTCAAGAGG(有义)(SEQ ID NO:625)和
GATGTGTTCCTTTGGAGGTGGCATG(反义)(SEQ ID NO:626);外显子9,
GATGTGGCAGTGGCGGTTCCGGTG(有义)(SEQ ID NO:627)和
GGAGTCACTGAAACAAACAACAGG(反义)(SEQ ID NO:628);外显子10,
GGTTCAGTTGCTTGTATAAAG(有义)(SEQ ID NO:629)和
CCATTAACGGTAAAATTTCAGAAG(反义)(SEQ ID NO:630);外显子13,
CCAAGGTCATGGAGCACAGG(有义)(SEQ ID NO:631)和CTGTAAAGCTATAACAACAACCTGG(反义)(SEQ ID NO:632);外显子15,
CCACTCACACACACTAAATATTTTAAG(有义)(SEQ ID NO:633)和
GTAACTGACTCAAATACAAACCAC(反义)(SEQ ID NO:634);外显子17,
GAAGCTACATAGTGTCTCACTTTCC(有义)(SEQ ID NO:635)和
CACAACTGCTAATGGCCCGTTCTCG(反义)(SEQ ID NO:636);外显子22,
GACGGGTCCTGGGGTGATCTGGCTC(有义)(SEQ ID NO:685)和CTCAGTACAATAGATAGACAGCAATG(反义)(SEQ ID NO:686);外显子28a,CCTGTCATAAGTCTCCTTGTTGAG(有义)(SEQ ID NO:637)和
GGTAGTCAGGGTTGTCCAGG(反义)(SEQ ID NO:638);外显子28b,
CGAGTATCTCAACACTGTCCAGC(有义)(SEQ ID NO:639)和
CTAAGAGCTAATGCGGGCATGGCTG(反义)(SEQ ID NO:640)。
对于外显子1扩增的退火温度为54℃。对于初始和第二次扩增的退火温度都为58℃(外显子3,4,7-10,12-17,19-25,27,和28),56C(外显子2,5,6,和26),或52C(外显子11和18)。
在测序前利用核酸外切酶I(United States Biochemical,Cleveland,OH),和虾碱性磷酸酶(United States Biochemical,Cleveland,OH)纯化PCR扩增子。根据生产商的说明书利用ABIBigDye Terminator试剂盒v1.1(ABI,Foster City,CA)对纯化的DNA进行稀释和循环测序。在ABI3100遗传分析仪上将测序反应物进行电泳。利用Sequence Navigator软件结合Factura在有义和反义方向上分析electropherograms以标记杂合位置。在多重独立的PCR扩增和测序反应中确认所有的序列变体。
癌症来源的细胞系:
对一组14个肺癌来源的细胞系分析EGFR突变。这些源自肿瘤NSCLC(N=5),小细胞肺癌(N=6),腺癌(N=1),支气管癌(N=1),和未知的组织学(N=1)。具体的细胞系是:NCI-H460,NCI-522,HOP-92,NCIH841,NCIH734,NCIH2228,NCIH596,NCIH727,NCIH446,NCIH1781,NCIH209,NCIH510,NCIH82,NCIH865。此外,对64种癌症来源的细胞系筛选外显子19和21中的突变。这些代表下列组织学:乳腺癌(BT549,BT483,UACC893,HS467T,HS578T,MCF7,MCF7-ADR,MDA-MB-15,MDA-MB-175,MDA-MB-231,MDA-MB-415,MDA-MB-436,MDA-MB-453,MDA-MB-468,T47D),卵巢癌(ES-2,IGROV-1,MDAH2774,OV1063,OVCAR3,OVCAR4,OVCAR5,SKOV3,SW626),CNS癌(SF-295,SNB-19,U-251,CCF-STTG1,SW-1088,SW-1783,T98G,M059K,A172,SK-N-DZ,SK-N-MC),白血病(CCRF-CEM,K562,MOLT-4,RPMI8226,SR),前列腺癌(DU-145,PC-3),结肠癌(COLO-205,HCT-116,HCT-15,HT-29,SW-620),肾癌(786-O,ACHN,CAKI-1,SN-12C,UO-31),黑色素瘤(LOX-IMVI,M14,SKMEL2,UACC-62),骨肉瘤(SAOS-2),和头颈癌(011,O13,019,028,022,029,012)。所述头颈癌细胞系由Dr.JamesRocco,美国典型培养物保藏中心(Manassas,VA)获得。
基因组DNA由速冻肿瘤样本中分离。首先使用预冷和灭菌的研钵和研杵将肿瘤样本碾压成细粉。将肿瘤组织立即转移到由100mM氯化钠,10mM Tris pH 7.5,25mM EDTA(乙二胺四乙酸二钠)pH8.0,和0.5%(w/v)十二烷基磺酸钠,和100μg/ml新制蛋白酶K组成的DNA提取溶液中并于37℃温育过夜或于50℃3小时。随后利用标准的苯酚-氯仿法抽提DNA,乙醇沉淀,用70fi乙醇洗涤,风干并重悬于TE缓冲液中。利用分光光度计测定DNA浓度。利用下列引物对通过聚合酶链式反应扩增人EGFR的外显子19和21:外显子19有义引物,5′-GCAATATCAGCCTTAGGTGCGGCTC-3′(SEQID NO:505);外显子19反义引物,5′-CATAGAAAGTGAACATTTAGGATGTG-3′(SEQ ID NO:506);外显子21有义引物,5′-CTAACGTTCG CCAGCCATAAGTCC-3′(SEQ IDNO:507)外显子21反义引物,5′-GCTGCGAGCTCACCCAGAATGTCTGG-3′(SEQ ID NO:508)。对于每个样品,在由1X ExpandLong Template缓冲液1(Roche,Mannhein Germany),50μM测序级dATP(Amersham Biosciences,Cleveland OH),50μM测序级dCTP(Amersham Biosciences,Cleveland OH),50μM测序级dGTP(Amersham Biosciences,Cleveland OH),50μM测序级dTTP(Amersham Biosciences,Cleveland OH),0.211M有义引物,0.2,uM反义引物,已经与1/6体积的Taq Start抗体(1.1μg/l)(Clontech,Palo Alto,CA)一起在冰上预温5分钟的1.25单位Expand LongTemplate酶复合物(Taq DNA聚合酶/Tgo DNA聚合酶)(Roche,Mannhein Germany)和水至最终体积25μl组成的PCR反应中对20ng的基因组DNA进行扩增。每个系列的扩增都包括省略DNA模板的阴性对照。对两种外显子的PCR循环条件是95℃C 2min,接下来40个循环的95℃30s,58℃30s和72℃45sec;和最后72℃延伸10min,接下来于4℃置于MJ-Research PTC-200或PTC-225热循环仪(MJ-Research,Waltham MA)上。
通过0.8%琼脂糖凝胶电泳解析PCR产物以确保来自患才材料的扩增和阴性对照中无扩增。在测序之前通过将10μl每种PCR扩增子与0.5μl核酸外切酶I(10U/l)(United States Biochemical,Cleveland,OH),和1μl虾碱性磷酸酶(lU/μl)(United States Biochemical,Cleveland,OH)混合并于37℃温育20分钟,随后在热循环仪(MJ-Research,Waltham MA)上于80℃灭活15分钟而对PCR产物进行纯化。根据扩增子的强度将纯化的DNA稀释于水中,并根据生产商的说明书利用ABI BigDye Terminator kit v1.1(AppliedBiosystems,Foster City,CA)进行循环测序。利用下列循环条件在MJ-Research热循环仪上进行循环测序:外显子19有义引物,5′-GCAATATCAGCCTTAGGTGCGGCTC-3′(SEQ ID NO:505);外显子19反义引物,5′-CATAG AAAGTGAACATTTAGGATGTG-3′(SEQ ID NO:506);外显子21有义引物,5′-CTAACGTTCGCCAGCCATAAGTCC-3′(SEQ ID NO:507)或5′-CGTGGAGAGGCTCAGAGCCTGGCATG-3′(SEQ ID NO:687);外显子21反义引物,5′-GCTGCGAGCTCACCCAGAATGTCTGG-3′(SEQ ID NO:508)。将测序反应物在ABI3100遗传分析仪(AppliedBiosystems,Foster City,CA)上进行电泳。利用Factura and SequenceNavigator(Applied Biosystems,Foster City,CA)软件程序标记潜在的杂合位置并显示它们用于评估。在副峰的高度比主峰的30%高度更高或与之相等的位置上的核苷酸被标记为杂合的并且通过有义和反义阅读进行确认。对具有存在突变的序列指征的样品再次扩增并测序进行确证。
相对于外显子19和21的用于序列分析中的引物的位置
内含子引物以小写字母和下划线显示。
内含子序列以小写字母显示。
外显子序列以大写字母显示。
EGFR外显子19(5′-3′)(SEQ ID NO:641)
gcaatatcagccttaggtgcggctccacagccccagtgtccctcaccttcggggtgcatcgc
tggtaacatccacccagatcactgggcagcatgtggcaccatctcacaattgccagttaacg
tcttccttctctctctgtcatagGGACTCTGGATCCCAGAAGGTGAGAAAGTTAAATTCCC
GTCGCTATCAAGGAATTAAGAGAAGCAACATCTCCGAAAGCCAACAAGGAAATCCTCGATgt
gagtttctgctttgctgtgtgggggtccatggctctgaacctcaggcccaccttttctcatg
tctggcagctgctctgctctagaccctgctcatctccacatcctaaatgttcactttctatg
EGFR外显子21(5′-3′)(SEQ ID NO:642)或(SEQ ID NO:687)
ctaacgttcgccagccataagtcctcgacgtggagaggctcagagcctggcatgaacatgac
cctgaattcggatgcagagcttcttcccatgatgatctgtccctcacagcagggtcttctct
gtttcagGGCATGAACTACTTGGAGGACCGTCGCTTGGTGCACCGCGACCTGGCAGCCAGGA
ACGTACTGGTGAAAACACCGCAGCATGTCAAGATCACAGATTTTGGGCTGGCCAAACTGCTG
GGTGCGGAAGAGAAAGAATACCATGCAGAAGGAGGCAAAgtaaggaggtggctttaggtcag
ccagcattttcctgacaccagggaccaggctgccttcccactagctgtattgtttaacacat
gcaggggaggatgctctccagacattctgggtgagctcgcagc
结果
Gefitinib反应者的临床特征
自从2000年以来在Massachusetts General Hospital已经用单一药剂Gefitinib治疗患有晚期的,化疗难以控制的NSCLC的患者。在其于2003年5月被FDA批准之前,总共治疗了275位患者,作为compassionate use expanded access program的部分,并在批准日之后使用商业供应品。在此期间,25位患者被医生鉴定为具有明显的临床反应。明显的临床反应被定义为对于患有可测量疾病的患者来说使用RECIST标准的部分反应,或对于使用这些标准的不能量化肿瘤负担的患者来说,由两位医生评定出可评价的反应。表1显示了9个病例的临床特征,对于它们在作为最初诊断时获得肿瘤样本。对于其他的Gefitinib反应者,并未获得组织,最常见的是因为来自针抽吸物的诊断性样本对于细胞学来说是有限的。作为一组,所述9位患者实质性地由Gefitinib获益。从开始药物治疗的中值存活期超过18个月,而中值治疗期大于16个月。与先前报道相一致,Gefitinib反应者多为女性,无抽吸史,以及具有支气管肺泡组织学的肿瘤(11,12)。病例6是代表性的Gefitinib反应性人群。此患者是一位32岁的男子,无抽烟史,其出现多发性脑损害以及右肺中被诊断为支气管肺泡癌的疾病。用全脑放疗对他进行治疗,接着进行一系列的化疗方案,对此他的肿瘤没有反应(卡铂和吉西他滨;紫杉萜;长春瑞宾)。伴随着不断衰退的功能状态和进行性肺肿瘤负担,他开始用250mg每天的Gefitinib进行治疗。他的呼吸短促迅速得到改善并且开始治疗6周后的肺部CT揭示了在图1中所示的明显改善。
Gefitinib反应者中的EGFR突变
我们假定对Gefitinib具有显著反应的NSCLC病例可能具有EGFR的躯体性突变,表明在这些肿瘤中由这种生长因子信号途径发挥的基本作用。为了寻找这些突变,我们首先测试了EGFR细胞外结构域中的重排,这是神经胶质瘤的特征(15):没有检测到什么。所以我们利用各个外显子的PCR扩增对基因的完整编码区进行了测序。在8/9病例中观察到杂合突变,所有这些都集聚在EGFR的激酶结构域之内(表2和图2)。四个肿瘤具有框内删除,去除了氨基酸746-750(delE746-A750;病例1),747-750(delL747-T751insS;病例2),和747-752(delL747-P753insS;病例3病例4)。后两种删除与丝氨酸残基的插入相关联,所述插入缘自删除断裂点上新密码子的生成。引人注目地,这四种删除是重叠的,在外显子19内的四个氨基酸的删除(在密码子747-750上,亮氨酸,精氨酸,谷氨酸和丙氨酸)为全部病例为共有(见图4a)。另三种肿瘤具有外显子21内的氨基酸取代:在密码子858上的亮氨酸-精氨酸(L858R;病例5和6),在密码子861上的亮氨酸-谷氨酰胺(L861Q;病例7)。L861Q突变是特别令人感兴趣的,因为在小鼠egfr基因中的相同氨基酸对黑皮(dsk5)性状负责,与改变的EGFR信号相关(18)。在激酶结构域中的第四种错义突变导致外显子18内密码子719上的甘氨酸-半胱氨酸取代(G719C;病例8)。对于病例1,4,5和6获得匹配的正常组织,并只显示野生型序列,表明所述突变是在肿瘤形成过程中于躯体出现的。在不对Gefitinib反应的七个NSCLC病例中没有观察到突变(P=0.0007;2-侧Fisher′s精确测试)。
在NSCLC和其它癌症类型中特异性EGFR突变的流行
不像神经胶质瘤,其中影响EGFR细胞外结构域的重排已经被广泛研究(15),在NSCLC中的EGFR突变尚未进行定义。所以我们对与Gefitinib研究无关的25个原发病例的基因的完整编码区进行了测序,包括15个具有支气管肺泡组织学的病例,其已经在先前的临床试验中与Gefitinib反应性相关联(11,12)。在两例支气管肺泡癌中检测到杂合突变。两个病例都在激酶结构域具有与在Gefitinib反应者相同的框内删除,即delL747-P753insS和delE746-A750(表2)。给定EGFR突变的明显聚类后,我们对总共55个原发肿瘤和代表不同肿瘤类型的78个癌衍生细胞系的外显子19和21进行了测序(见补充材料)。没有检测到突变,提示这些只发生于一小组癌症中,其中EGFR信号可能在肿瘤发生中发挥重要作用。
EGF诱导的激活和突变型EGFR蛋白的Gefitinib抑制的增强
为了研究由这些突变编码的功能特性,将L747-S752insS删除和L858R错义突变体表达于培养的细胞中。野生型和突变型构建体瞬时转染入Cos-7细胞证明了等同的表达水平,表明突变并没有影响蛋白质稳定性。通过测量一般用作受体自体磷酸化作用标记的酪氨酸1068残基的磷酸化对EGFR激活进行量化(19)。在血清和相关生长因子不存在的情况下,野生型或突变型EGFR都未显示自体磷酸化(图3a)。不过,与野生型受体相比,加入EGF导致错义和删除EGFR突变体的受体激活的2-3倍的提高。而且,尽管正常EGFR激活并没有在15min后下调,与受体内化作用一致,两种突变型受体显示了高达3hrs的持续激活(图3a)。在加入EGF后用测量总体EGFR磷酸化的抗体获得类似的结果(未显示)。
由于7/8EGFR激酶突变位于ATP裂缝中,其被Gefitinib所靶向,我们测定了所述突变型蛋白是否对抑制剂具有变化的敏感性。在用变化浓度的Gefitinib预处理的细胞中测量了EGF诱导的受体自体磷酸化作用。引人注目地,两种突变型受体都展示了对由Gefitinib引发抑制的敏感性的提高。野生型EGFR具有0.1μM的IC50并且于2μM Gefitinib上显示自体磷酸化作用的完全抑制,而两种突变型蛋白具有0.015μM的IC50并且于0.2μM上显示自体磷酸化作用的消除(图3b)。这种药物敏感性的差异可以是临床相关的,因为药物动力学研究表明每日口服给药400-600mg的Gefitinib导致1.1-1.4μM的平均稳态低槽血浆浓度,而目前推荐的每日250mg的剂量导致0.4μM的低槽浓度(20)。
实施例2
在EGFR的激酶结构域内具有突变,并且因此对由Gefitinib处理造成的生长抑制敏感的肿瘤细胞,能够还在所述激酶结构域内经历″第二位点″突变,其赋予对Gefitinib的抗性但在它们展示相对于野生型EGFR的提高的EGFR信号的意义上仍然是″激活性的″。这些gefitinib抗性突变体由两种散发性人NSCLC细胞系,即NCI-1650和NCI-1975产生。每个细胞系都包含EGFR的激酶结构域的杂合突变,并且预计对gefitinib敏感。在NCI-1650中的EGFR突变由外显子19内位置2235-2249上的15个核苷酸的框内删除组成(delLE746-A750)而NCI-1975具有外显子内的错义突变,其在核酸2573上取代G为T(L858R)。本文显示NCI-H1975中的L858R突变为激活性的并且体外赋予对gefitinib的敏感性。
利用EMS(甲磺酸乙酯)进行随机化学诱变,随后在添加了gefitinib的培养基中培养以选择抗性克隆的长出之后,分离出源自NCI-1650和NCI-1975的gefitinib抗性细胞系。单个克隆的亚培养后,在对应于EGFR激酶结构域的基因组DNA的特异性PCR介导的扩增之后进行EGFR基因的核苷酸序列测定。
这一策略的一种变异形式包括在逐渐升高浓度的gefitinib存在时连续传代这两种细胞系持续几周的时间从而选择赋予对gefitinib抗性的EGFR基因内突变的自发获得。将选定的克隆(其在相对高gefitinib浓度下持续增殖)作为集落分离出来,并如上所述鉴定突变。
实施例3
为了确定受体酪氨酸激酶的突变是否在NSCLC中发挥重要作用,我们在一组119个原发NSCLC肿瘤中寻找基因变化,所述119个原发NSCLC肿瘤由来自Nagoya City University Hospital in Japan的58个样品和来自Brigham and Women′s Hospital in Boston,Massachusetts的61个样品组成。所述肿瘤包括70个肺腺癌和49个其它的NSCLC肿瘤,来自74位男性和45位女性患者,其都没有被记录用EGFR激酶抑制剂进行过治疗。
作为初始筛选,我们由来自一亚组58个NSCLC样品的基因组DNA扩增并测序了58个人受体酪氨酸激酶(*)(表S1)中的47个的编码激活环的外显子,所述亚组中包括41个肺腺癌。所述肿瘤的其中三个,全部是肺腺癌,显示不存在于来自相同患者肺组织DNA中的EGFR中的杂合错义突变(表S2;S0361,S0388,S0389)。在来自其它受体酪氨酸激酶基因的扩增子中没有检测到突变。全部三个肿瘤都具有相同的EGFR突变,预计在位置858上将亮氨酸(″L″)改变为精氨酸(″R″)(图6A;CTG→CGG;″L858R″),其中所有的编号都参照人EGFR。
我们接下来检查了全部119个NSCLC肿瘤集合的EGFR的外显子2到25。基因组DNA的外显子测序揭示在总共16个肿瘤中的错义和删除突变,全部都在激酶结构域外显子18到21中。此组中的全部序列改变都是在肿瘤DNA中杂合的;在每个病例中,配对的来自相同患者的正常肺组织显示野生型序列,这确证了突变在起源上是躯体性的。核苷酸和蛋白质序列改变的分布,以及与这些异常相关联的患者特征,总结于表S2中。
分别在两个和三个肿瘤中检测到取代突变G719S和L858R。″G719S″突变在位置719上将甘氨酸(G)改变为丝氨酸(S)(图6B)。这些突变分别位于三磷酸核苷酸结合结构域或P环的GXGXXG基序(SEQ ID NO:490)中和邻近激活环的高度保守性DFG基序中。见,例如,图7。突变的残基在所有蛋白激酶中几乎不变并且B-Raf蛋白丝氨酸-苏氨酸激酶中的类似残基(G463和L596)在结肠直肠、卵巢和肺癌中是躯体性突变的(41,53)(图6A,6B)。
我们还检测到聚集在EGFR激酶结构域内跨越密码子746-759的区域中的多个删除突变。十个肿瘤携带在核苷酸2235或2236处起始的消除EGFR密码子746-750的两个重叠性15个核苷酸删除的其中一个(Del-1;图6C和8C;表S2)。来自另一个肿瘤的EGFR DNA展示了杂合的24-核苷酸缺口,导致密码子752到759的删除(Del-2;图6C)。代表性的色谱图显示于图8A-8F中。
在EGFR激酶结构域活性形式的三维结构中取代突变和Del-1删除的位置显示于图7中。注意序列变化聚集在激酶活性位点周围,并且取代突变位于激活环和富含甘氨酸的P环中,其是已经对于许多蛋白激酶的自身调节重要的结构元件(52)。
鉴定了两个不同肿瘤类型中的两种其它EGFR突变。即,我们鉴定了急性髓细胞性白血病(AML)中的EGFR突变G857V和转移性肉瘤中的EGFR突变L883S。″G857V″突变在位置857上具有被缬氨酸(V)取代的甘氨酸(G),而″L883S″突变在位置883上具有被丝氨酸(S)取代的亮氨酸(L)。这些发现提示EGFR中的突变发生在几种肿瘤类型中,最重要的是,EGFR抑制剂将在具有这些突变的患者的治疗中有效。这延展了激酶抑制剂如,例如,酪氨酸激酶抑制剂gefitinib(市场上为IressaTM),erlotinib(市场上为TarcevaTM),等等在治疗除了NSCLC之外的肿瘤类型中的应用。
EGFR突变显示了令人震惊的与在日本和美国专利族中所述差别患者特征的一致性。如上所注,临床试验揭示了对酪氨酸激酶抑制剂gefitinib(IressaTM)反应的明显可变性,在日本患者中比在主要源于欧洲种群中见到更高的反应(27.5%vs.10.4%,在多机构II期试验中)(48);并且部分反应在美国于妇女,在吸烟者,和腺癌患者中更加常见(49-51)。我们显示EGFR突变在腺癌中(15/70或21%)比在其它NSCLCs中(1/49或2%)更常见;在女性中(9/45或20%)比在男性中(7/74或9%)更常见;在来自日本的患者中(15/58或26%,和14/41腺癌或32%)比在来自美国的患者中(1/61或2%,和1/29腺癌或或3%)更常见。在患有腺癌的日本妇女中观察到EGFR突变的最高部分(8/14或57%)。值得注意的是,与EGFR突变的存在相关的患者特征好像是与对gefitinib治疗的临床反应相一致的那些。
为了研究EGFR突变是否可能是gefitinib敏感性的决定因素,从反应的5位患者和进行过gefitinib治疗的4位患者获得预处理NSCLC样品,其中这些患者是从超过125位在Dana-Farber CancerInstitute于扩展接受程序或在gefitinib的统制批准后进行治疗的患者中鉴定出来的(49)。其中四位患者具有部分放射照像反应(在2个月的治疗后在CT扫描中50%肿瘤消退),而第五位患者在不到两个月内经历了明显的症状改善。所有患者都来自美国并是高加索人。
尽管激酶结构域(外显子18到24)的测序没有揭示出来自四位患者的肿瘤中的突变,其肿瘤在进行gefitinib治疗后发展,来自gefitinib反应性患者的所有五个肿瘤都具有EGFR激酶结构域突变。.卡方检验揭示在gefitinib反应者(5/5)和非反应者(0/4)之间EGFR突变频率的差异是统计学上显著的,p=0.0027,而在gefitinib反应者和未选择的美国NSCLC患者之间的差异(5/5vs.1/61)也是显著的,p<10-12(*)。先前在未选择肿瘤中观察到的EGFR L858R突变,在一个gefitinib敏感性肺腺癌中得以鉴定(图6A;表S3A,lR3T)。三个gefitinib敏感性肿瘤包含杂合的框内删除(图6C和表S3A和S3B,两例中的Del-3和一例中的Del-4)而一个包含纯合的框内删除(图6C和表S3A和S3B,Del-5)。这些删除的每一个都在EGFR的密码子746到753区域之内,其中删也在未选择的肿瘤中发现。这三种删除的每一个也都与氨基酸取代相关联(表S3A-S3C)。在所有取得匹配的正常组织的四个样品中,这些突变被确认为躯体性的。
实施例3A:引物设计
受体酪氨酸激酶的cDNA序列获自Gen Bank(列于S1中的编号),并利用BLAT比对与人基因组排列(https://genome.ucsc.edu)相比较以鉴定外显子/内含子边界。利用Primer3程序(https://frodo.wi.mit.edu/primer3/primer3~code.html)设计外部基因特异性引物对以便在每侧扩增外显子序列和至少250bp的侧翼内启子序列或邻近的外显子序列。随后使用得到的经预测的扩增子设计在外显子两侧并包含随附的M13正向或反向引物尾部的内部引物(一般距外显子/内含子边界大于50bp)。对这些巢式引物对测试合适的扩增子大小和来自对照DNA的高质量的序列。在一组来自Nagoya City UniversityMedical School的58个原发肺癌样品中对包含编码47个酪氨酸激酶的受体酪氨酸激酶激活环的外显子的扩增子进行扩增和测序。此外,还扩增了覆盖全长EGFR的扩增子。
实施例3B:对基因组DNA的PCR和测序方法
在384孔格式的巢式PCR装置中利用特异性引物扩增酪氨酸激酶外显子和侧翼内含子序列。每个PCR反应包含5ng的DNA,1XHotStar Buffer,0.8mM dNTPs,1mM MgC 12,0.2U HotStar Enzyme(Qiagen,Valencia,CA),和0.2μM正向和反向引物,于10μL反应体积中。PCR循环参数为:一个循环的95℃15min,35个循环的95℃20s,60℃30s和72℃1min,接下来是一个循环的72℃3min。
通过固相可逆固定化学纯化得到的PCR产物,随后用通用的M13引物进行双向染料-终止子荧光测序。利用ABI Prism3700DNA分析仪(Applied Biosystems,Foster City,CA)通过毛细管电泳对测序片段进行检测。由Agencourt Bioscience Corporation(Beverly,MA)进行PCR和测序。
实施例3B:序列分析和确证
通过序列Mutation Surveyor 2.03(SoftGenetics,State College,PA)对正向(F)和反向(R)色谱进行批次分析。将在一个或两个方向上发现的高质量序列变异评为候选突变。从原始样品中再次扩增具有候选突变的外显子并如上进行再次测序。
实施例3C:患者
肺肿瘤样本在Institutional Review Board批准的研究下获自在Nagoya City University Hospital和the Brigham and Womens′sHospital(分别为未选择的日本人肿瘤和gefitinib治疗的美国肿瘤)治疗的非小细胞肺癌患者并且获自the Brigham and Women′sHospital匿名肿瘤库(未选择的美国样品)。对于大多数样品有性别、年龄和组织学的信息。患者样品还获自在Dana-Farber CancerInstitute于开放标记临床试验中治疗的患者(13)。利用权威标准定义对gefitinib的反应(见,例如,A.B.Miller,B.Hoogstraten,M.Staquet,A.Winkler,1981Cancer 47,207-14)。对这些研究获得了IRB批准。
在gefitinib反应性患者中,有两位患者先前已经用至少一个周期的化疗进行过治疗,一位患者先前用放疗进行治疗,一位患者正在用化疗治疗,一位患者没有接受其它治疗。对于gefitinib不敏感的患者,治疗失败定义为与基线CT扫描相比在2个月的gefitinib治疗后在CT扫描中出现新的肿瘤病变或现有肿瘤病变的生长。
实施例3D:患者样品的cDNA测序
利用TrizolTM(Invitrogen,Carlsbad,CA)由组织样品分离总RNA并利用RN easyTM mini-elute cleanup试剂盒(Qiagen,Valencia,CA)纯化。根据生产商的推荐,用Superscript II反转录酶(Invitrogen Life technologies,Carlsbad,CA)从2μg总RNA中转录cDNA。将cDNA用作模板用于随后EGFR的PCR扩增。
PCR的组分为:20rnM Tris-HCl(pH 8.4),50mM KCl,1.5mMMgCl2,dATP,dCTP,dGTP,dTTP各自0.1mM,0.2μM的每种引物,和0.05单位/μl Taq聚合酶(TaqPlatinurn,GIBCO BRL,Gaithersburg,MD)。片段″a″的扩增需要向反应物中加入4%DMSO。引物序列列于表S4中。分别用18个碱基对的凸起M13正向和反向序列合成正向和反向引物。热循环条件为:94℃,4min;接下来为11个循环,于94℃变异步骤20″,于72℃延伸步骤20″,和降1℃/循环的20″退火步骤,从循环1的60℃到循环11的50℃;随后将循环11重复25次。于72℃6分钟温育随后置于4℃结束程序。
用水将一小份PCR反应物稀释1∶50。使用M13Forward Big DyePrimer试剂盒(Perkin-Elmer/Applied Biosystems,Foster City,CA),根据生产商的推荐,对稀释的PCR产物进行测序。在荧光测序仪上(来自Applied Biosystems的型号3100,Foster City,CA)对测序产物进行分离。通过仪器软件进行碱基识别并通过目视检查进行复查。利用Sequencher 4.1软件(Gene Codes Corp.)将每个序列与对应的正常序列比较。
实施例3E:表达突变型EGFR的肿瘤类型
在两种不同的肿瘤类型中发现了两种其它EGFR突变。在急性髓细胞性白血病(AML)中鉴定了于位置857(″G857V″)上取代甘氨酸(G)为缬氨酸(V)的EGFR突变。在转移性肉瘤中鉴定了于位置883(″L857S″)上用丝氨酸(S)取代亮氨酸(L)的EGFR突变。
实施例3F:细胞系
检测体外gefitinib对NSCLC细胞系的作用。一个细胞系,H3255,对于gefitinib特别敏感,IC50为40nM。其它的细胞系具有高得多的IC50s。例如,野生型细胞系H1666具有2μM的IC50,其比突变型细胞系高50倍。当对来自此细胞系的EGFR进行测序时,它包含L858R错义突变,而其它细胞系对EGFR为野生型。与EGFR野生型细胞相比需要浓度低得多的gefitinib抑制EGFR还有由EGFR引发的AKT和ERK磷酸化作用,野生型细胞需要至少100倍更高浓度的gefitinib达到相同的效果。这些发现提示突变型受体对于gefitinib的作用更加敏感。
另外这里注意,
实施例3G:组合疗法
分析来自在有或无erlotinib的卡铂/紫杉醇随机化试验上治疗的患有晚期NSCLC的患者的肿瘤样本。此试验的临床部分在两种治疗辅助中显示等同的存活。由1076位患者的228位中获得用于测序的肿瘤样本。这些患者的初步临床特征在基线人口统计学,反应速率,中值和总体存活率方案与该组并无区别。
对酪氨酸激酶结构域的外显子18-21进行测序,并对鉴定了29个突变,突变频率为百分之12.7。
作为一个整体具有EGFR突变的患者具有更好的存活,不论他们是否接受单独的化疗或组合以erlotinib。这些差异是统计学上显著的,p值小于0.001。这些发现提升了EGFR突变的可能性,除了作为对gefitinib和erlotinib的预测剂之外,还可以预测提高的存活。
(*)注意与报道的10.4%的gefitinib反应频率相比,在未选择的美国患者中EGFR突变的频率,61中的1个,似乎是低的。这一差异具有适度统计学显著性(卡方检验p=0.025)。因而这一结果仍可以归因于偶然性,可以归因于一部分没有EGFR突变的反应者,或可以归因于在此肿瘤收集中实验性地未能检测到EGFR突变。如果交gefitinib反应性美国患者中的EGFR突变频率(5/5)与gefitinib反应的预计频率(10.4%)相比,卡方检验的可能性再一次小于10-12。
实施例4
研究设计:
从2004年8月到2005年1月,参考EGFR激酶结构域测序,在Massachusetts General Hospital(MGH),Dana-Farber Cancer:Institute(DFCI),和Brigham and Women′s Hospital(BWH),我们进行了NSC LC患者的回顾性群体研究。这三个研究所包含Dana-Farber/Partners CancerCare(DF/PCC),一个学术性的联合临时癌症收容中心,其每年护理大约1,200肺癌患者。在2004年8月,在DF/PCC可以将EGFR激酶结构域测序用于临床应用。医生能够选择哪个患者进行测试,患者需要有足够和合适的肿瘤样品存在。基于通过MGH和BWH参考病理学家的组织学检查肿瘤细胞必须包含至少50%的样本,并且所述样品必须来自原发或转移肿瘤的解剖、bronchoscopic活检,或芯针活组织检查,或来自胸水的细胞团。在极少的病例中,细针抽吸样品经测定是足够的。样品可以是石蜡包埋的或冷冻的组织。由于EGFR突变在鳞状上皮细胞肿瘤中的低发性(62)有这种诊断的患者不符合条件进行测试。
我们利用保留在Laboratory for Molecular Medicine(LMM),of the Harvard Medical School/Partners HealthCare Center forGenetics and Genomics(CLIA#22D1005307)的EGFR病例记录鉴定了进行EGFR测试的患者,其是实施和解释全部测序的诊断测试机构。我们包括了所有进行EGFR测试的患者,其来自DF/PCC,在研究期间具有NSCLC的诊断。
由电子医疗记录系统收集患者年龄、性别,和种族。利用structured physician chart review记录抽烟状态,癌症病史,EGFR激酶结构域测序结果,和随后的EGFR-TKI治疗计划。具体地,抽烟状态和癌症病史获自医生和护理笔记。从前的抽烟者被定义为这样的患者,其在他们的肺癌诊断之前至少一年已经戒烟而从未抽烟者被定义为这样的患者,他们在其一生中曾经抽过少于100只香烟。在其诊断一年内戒烟的或在诊断时正在抽烟的抽烟者被分类为当前抽烟者。通过将每天抽的包数乘以抽烟年数计算出抽烟的包-年数。肿瘤组织学和EGFR激酶结构域测序结果获自病理报告。全部病理样本都在MGH或BWH进行集中检查并且利用世界卫生组织(WHO)分类系统将组织学进行分类(63)。随后的治疗计划获自医生笔记。
对于年龄、性别、肿瘤组织学,和EGFR突变状态有完整的数据。对于种族(12%),测试时的肿瘤阶段(4%),抽烟状态(6%),先前治疗(5%),和随后的EGFR-TKI治疗计划(11%)有缺少的数据。本研究由Institutional Review Board at DF/PCC批准。
EGFR基因测序:
切出冷冻的或福尔马林固定的,石蜡包埋的(FFPE)肿瘤组织的连续切片并放置在玻璃载玻片上。由病理学家鉴定出由至少50%存活肿瘤细胞组成的肿瘤组织区。用二甲苯和乙醇抽提FFPE样品以去除石蜡。FFPE和冷冻组织样品都用蛋白酶K过夜进行消化。利用标准方法从组织和外周血中提取基因组脱氧核糖核酸(DNA)。利用DNAGenotek-OrageneTM唾液试剂盒从唾液中提取基因组DNA。
在一组个别巢式聚合酶链式反应(PCR)中扩增EGFR的激酶结构域(外显子18-24和侧翼的内含子区)。用在巢式PCR扩增中的引物描述于表S1A和B和SEQ ID 1-424中,向引物的5′端添加通用序列(5′tgtaaaacgacggccagt)(SEQ ID NO.645)。通过染料-终止子测序法对PCR产物进行直接测序。在384孔板于15μl体积中进行PCR,所述15μl体积包含5ng基因组DNA,2mM MgCl2,0.75μlDMSO,1M Betaine,0.2mM dNTPs,20pmol引物,0.2μlAmpliTaq(Applied Biosystems),1X缓冲液(提供AmpliTaqGold)。热循环条件如下:95℃10分钟;95℃30秒,60℃30秒,72℃1分钟30个循环;和72℃10分钟。用磁珠(Agencourt)纯化PCR产物。
利用磁珠(Agencourt)纯化测序产物并在ABI 3730DNA分析仪(Applied Biosystems)上通过毛细管电泳进行分离。通过Mutation Surveyor(SofiGenetics,State College,PA)并由两位复查者手工进行序列分析。通过原始基因组DNA样品的3-5个PCR反应的分析确认不同义DNA序列变异体。对具有不同义DNA序列变异体的血液或唾液样品进行分析以研究序列变化是否是对肿瘤组织特有的。
统计学分析:
我们构建了逻辑回归模型以评估患者人口统计学和临床特征与EGFR突变状态之间的单变量关联。为了鉴定突变阳性状态的明显的预测物,我们构建了多变量的逻辑回归模型,工包括在先前研究中鉴定出的独立变量作为突变的预测物,具体为性别、种族、组织学,以及抽烟状态。六位患者由于作为PCR失败的结果缺少EGFR突变数据而被排除在这些分析之外。利用SAS统计学软件(版本8.02,SASInstitute,Cary,NC)进行全部分析。
结果:
患者特征:
在研究期间作为临床癌症的部分的进行躯体EGFR激酶结构域测序的患有NSCLC的100位患者中,平均年龄为60.7岁,63%为女性(表4)。大多数患者为白人(76%)或亚洲人(7%),并且在安排测试时患有转移性疾病(67%)。几乎所有对EGFR突变进行测试的患者(94%)都患有腺癌,具有细支气管肺泡癌(BAC)特征的腺癌,或纯BAC。大约三分之一的患者为从不抽烟者。在进行EGFR测试之间施用的疗法包括手术(50%),胸部放疗(22%),化疗(47%),和EGFR靶向性疗法(11%)。
鉴定的突变:
从进行测试到得到结果的平均时间长度为12个工作日。大多数提交的样本为石蜡包埋的(74%)。74个石蜡包埋样本中的6个(8%)未能进行PCR扩增,而所有26个冷冻的样品都成功地进行了扩增。在具有可说明结果的94位患者中,23位(24%)被发现在EGFR激酶结构域中具有至少一个突变,这些患者中的两位每人显示两个点突变,总共鉴定了25个突变(表5)。在具有突变的23位患者中,9位(39%)具有一个或多个点突变,12位(52%)在外显子19中具有框内重叠性删除而两位患者(9%)具有外显子20中的复制。点突变在外显子18和21中,并包括五个2573T>G(L858R),2126A>T(E709V),2155G>A(G719S),2156G>C(G719A),2327G>A(R776H),2543C>T(P848L),和2582T>A(L861Q)每种一个。所述点突变的其中一个(P848L)在肿瘤样本以及在获自口腔棉签的单核细胞中都被检测到。在外显子s 22,23,或24中没有检测到突变。
突变的预测物:
在我们的样品中,在EGFR突变状态和年龄(p=0.61),女性性别(p=0.92),亚洲种族(p=0.08),或医疗安排时的转移性疾病之间没有明显的关联。具有非腺癌肿瘤组织学的6位患者没有一闰被发现具有突变。在患有腺癌的患者中,具有BAC特征的腺癌和纯BAC,在BAC/BAC特征和EGFR突变状态之间没有关联(p=0.35)。
17位当前抽烟者中没有人被发现具有突变。从不抽烟者明显比从前的抽烟者更有可能具有EGFR突变(几率[OR]=3.08,95%置信敬意[CI]1.09-8.76)。与EGFR突变阴性患者相比(25.0包-年,p<0.001),在EGFR突变阳性患者中的抽烟平均包-年数要显著地更低(0.7包-年)。每另加一个抽烟包-年,具有突变的可能性有4%的降低(OR=0.96,95%CI 0.93-0.99)
在控制性别、种族,和肿瘤组织学后抽烟的包-年数仍然是突变状态的有意义的预测物(OR=0.96,95%CI 0.93-0.99)。
测试信息的随后使用:
EGFR突变阳性患者比EGFR突变阴性患者(11%,p<0.001)显著更有可能具有备案的计划以接受随后的EGFR-TKI治疗(86%)。临床医师证明EGFR的结果在38%病例中影响他们优选推荐的疗法。这些病例包括23位突变阳性患者中的14位(61%),对于他们推荐EGFR-TKI疗法比对测试为阴性的患者更早,而71位突变阴性患者中的24位(34%)不推荐EGFR-TKI疗法,或比对测试阳性患者推荐地更晚。
在患有转移性疾病的患者中(54%)比在具有局部或局部晚期疾病的患者中EGFR突变状态更有可能改变治疗选择的优先项(19%,p=0.003)。给定了这一发现,我们进一步分析了转移性患者中做出决定的过程(图10)。在其测试结果影响治疗推荐的患有转移性疾病的31位患者中,在化疗场所对五位突变阳性患者提供了一线EGFR-TKI治疗并对六位突变阳性患者提供了二线EGFR-TKI治疗。基于其阴性EGFR测试结果,二十位突变阴性患者被鼓励推迟EGFR-TKI治疗直到三线治疗或更后面。在其测试结果不影响治疗推荐的患有转移性疾病的26位患者中,两位突变阴性患者接受了一线EGFR-TKI治疗,尽管他们为阴性结果,九位患者包括四位突变阳性患者接受了二线或三线EGFR-TKI治疗,15患者包括两位突变阳性患者未接受EGFR-TKI的推荐。患有转移性疾病患者中的三位正在参加评估一线EGFR-TKI疗法的试验。患有转移性疾病患者中的九位以前曾经接受过或在EGFR测试时正在接受EGFR-TKIs。
讨论:
我们研究了第一批患有NSCLC的100位患者,进行躯体EGFR突变的筛选作为在我们研究所进行的临床癌症护理的部分并发现测试是可行的并且显著影响了NSCLC患者的治疗。具有EGFR突变的患者比无突变的患者显著得更有可能接受对EGFR-TKI疗法的推荐。在三分之一的病例中医生根据测试结果调整他们的治疗建议,并且在患有转移性疾病的患者中更有可能这样做。在我们的患者样品中,医生利用阳性EGFR测试结果帮助做出对一些患者在化疗上优选EGFR-TKIs的决定,特别是进行一线或二线治疗。不过,阴性EGFR测试结果并不阻止医生对选定的患者施用EGFR-TKIs。许多测试结果并不影响临床上做决定的患者患有早期的,切除性疾病或在测试时已经正在对转移性疾病接受EGFR-TKI。这是合理的,因为EGFR-TKIs作为辅助疗法的使用并未被了解并且在少量没有经鉴定的EGFR突变的患者中有对EGFR-TKI疗法的益处(65,66-70,71)。
我们的研究还提供这样的证据,即分子诊断可以提高鉴定有EGFR突变的患者的临床能力。许多肿瘤学家目前使用与EGRR突变相关联的临床特征和对EGFR-TKIs的反应以指导对患有NSCLC的患者做出决定的过程。事实上,我们的进行了EGFR测试的患者群证明了这些特征的增强的流行。例如,与一般性NSCLC人群中的45%相比,95%的相关患者有腺癌或或BAC肿瘤组织学(72)。尽管从不抽烟者占我们人群的29%,但在一般性NSCLC人群中从不抽烟者的发主率据报道为2-10%,并且在患NSCLC的女性中可以高达27%(73-75)。类似地,与新诊断的NSCLC患者中38-75%比率的当前抽烟者相比,我们的人群只包含17%当前抽烟者。因此我们的临床选择的人群具有24%的EGFR突变率,其基本上高于由我们的和其它的测试未选择的现有NSCLC肿瘤样品的美国研究组记录的比率(65-66,81)。不过重要的是注意尽管临床医生似乎试图选择具有EGFR突变的临床特征的患者进行测试,突变频率仍然只是24%,这强调了这样的事实,即分子诊断增多了可以用来做出临床决定的信息。
在对照为先前描述的突变状态的预测物后,在我们的患者中抽烟状态是EGFR突变状态最强的预测物,抽烟史增多与上有EGFR突变的可能性显著降低相关联。我们的结果与记录了抽烟状态在EGFR突变可能性中的重要性的其它安全系列相一致(66,69,70,81,82)。正因为在鳞状上皮细胞肿瘤中EGFR突变的极低流行性(62)已经将测试努力转向腺癌肿瘤,将未来的努力集中在具有低或无抽烟史的患者上可能是适当的。不,在无典型性临床特征的患者中的EGFR突变报告提出了针对严格测试限制的意见(83)。当检查其它被认为与突变相关联的临床特征时,我们发现亚洲种族和BAC肿瘤组织学具有非显著性的预测EGFR突变状态的趋势。在这些关联中缺少统计学意义可能是由于样品小。
所述测试是可行的并且适合临床癌症护理的时间限制。几乎所有提交进行分析的肿瘤都产生可说明的结果。没能进行PCR扩增的六个样本全部都是石蜡包埋的,而无冷冻的样本不能PCR扩增。当可以获得时,新鲜的冷冻组织是优选的EGFR突变测试底物。
到目前为止已经有接近2,500NSCLC个样品报道进行了部分的或全部EGFR序列分析。我们的患者显示与先前报道相似的突变,9-23个碱基对的重叠性外显子19删除和导致外显子18和21中单一氨基酸取代的点突变。我们发现的点突变中的其中五个已经在上面描述过(E709V,G719S,G719A,L858R,和L861Q)。我们发现的点突变中的其中一个引发密码子上的氨基酸取代,在该密码子上以前描述过不同的氨基酸取代(R776H)。E709V和R776H变异体每个都是和涉及密码子719的已知gefitinib致敏突变一起发现的。在外显子21中的P848L突变在肉体和口腔样品中都有发现,提示它可能是不确定意义的种系变异体。患者是患腺癌的从不抽烟的女性,她在进行EGFR突变测试之前,在进行gefitinib治疗后有15个月稳定的疾病。当发现P848L突变后,最近发现她患有进行性疾病并且开始了erlotinib疗法。此时没有关于对erlotinib反应的信息存在。
(2253~2276del)删除重叠了以前描述的外显子19删除。可以将我们患者中的删除分到两组中的一组:最小跨越密码子747-749的删除(氨基酸序列LRE),和跨越密码子752-759的删除(图11)。对至今报道的所有外显子19的分析提示可以从跨越密码子747-759的TK区删除许多氨基酸。似乎没有必需的常见密码子被删除;不过,我们检测到的所有删除都在位置745上保留赖氨酸残基。
我们的两种外显子20突变的其中之一是在患有复发腺癌的从不抽烟的女性中,其在进行了EGFR测试后用erlotinib进行治疗并且此时已经有了两个月的稳定疾病。另一个是患有转移性腺癌从前的抽烟者,其用EGFR-TKI进行治疗,但由于严重的皮疹而不能忍受它。在外显子20中的临床上相关的EGFR突变的鉴定强调了EGFR的TK区的全面测序的重要性。
总之,本研究证明了在NSCLC患者中对EGFR基因的TK区全面筛选躯体性突变作为临床癌症护理的部分的可行性和实用性。测试结果提供关于EGFR-TKI反应的临床预测物的有用信息。当前抽烟者不太可能具有突变,就像有高包-年数抽烟史的从前的抽烟者那样。
实施例5
EGFR基因测试非小细胞肺癌,标准操作方法。
临床适应证:
此测试指示患有非小细胞肺癌的个体。
分析原理
EGFR基因测序是检测EGFR激酶结构域中突变的遗传测试。首先从肿瘤活检组织中获得DNA。随后通过直接的双向基因测序测定EGFR的7个外显子(18,19,20,21,22,23,24)的DNA序列。随后将获得的序列与已知的EGFR序列相比较以鉴定DNA序列变化。如果在肿瘤组织中检测到DNA序列变化,将对原始的肿瘤样品重复该测试。如果所述变化以往未曾在gefitinib-或erlotinib-反应者中报道,还将用所述个体的血液样品进行该测试以研究突变是否是构成性的(因而可能是正常出现的多态性)或是在肿瘤组织中躯体性发生的。
样本要求
从肿瘤样品中需要最少100ng的DNA。
注意:可以从组织样品中提取极小量的DNA。这种DNA的浓度可以不进行精确量化。
质量控制:
所用的对照
在PCR反应中对每个外显子包括两个阴性对照(水)和一个阳性对照(人DNA)。阴性对照应当进行完整的操作以确保获得的序列不是污染的结果。将pGEM阳性对照和ABI阵列对照包括在测序步骤中。
对照制备和保存:
PCR的阳性对照是Clontech人DNA或来自匿名血液样品的人DNA并保存于4℃。PCR反应的阴性对照是保存在室温下的高纯分子生物学级别的水。将阳性对照和ABI阵列对照保存在-20℃下。
容限和如果个别对照失败要采取的步骤:
如果阳性PCR对照失败但阴性对照和样品通过,将PCR结果指定为通过并将进行测序。如果阴性对照显示DNA扩增的迹象,将用一份新的患者DNA重复整个反应。如果pGEM对照失败并且测试反应失败,将用第二份PCR产物重复进行测序。如果测序对照失败但测试反应通过,不需要对测序进行重复。注意:由于从石蜡包埋的组织样品中提取的DNA产量低,外部PCR反应经常不产生可见的产物。内部PCR反应应当产物可见产物。应当将在凝胶上检测的产物大小与预期大小相比(见下面)以确保获得了合适的PCR产物。如果内部PCR产物在凝胶上不可见,则应当重复外显子特异性的PCR失败反应
如果对个别样品的PCR扩增失败,应当加入增多两倍的DNA模板浓度进行新一轮PCR。如果PCR扩增再次失败,应当获得该患者的新DNA样品,如果有的话。如果样品是石蜡包埋的组织样品,应当刮擦额外的载玻片。如果有的话,应当刮擦比用来生成原始样品更多的载玻片,并且应当让蛋白酶K中的消化持续进行三晚。
装备和试剂(除非另外注明所有试剂都稳定一年)
PCR和测序(通常,PCR和测序装备和试剂是本领域技术人员已知的并且可以用于本文,也如上所注)。
引物:(见表下6和7)
表6:外部PCR引物:
表7:内部PCR引物:
预防措施
表8
制备PCR反应混合物进行外部PCR。
在PCR通风橱中对基因组DNA进行所有操作,而非干净通风橱。
1.在冰上融出Taq Gold和dNTP。
2.利用下表在试管(eppendorf或15mL试管)中制备主混合物。水,甜菜碱,10X缓冲液,MgC12,DMSO,Taq Gold和dNTP应当按所列顺序加入。非常重要的是加入每种试剂的同时通过轻轻上下抽吸混合试剂。
3.DNA应当在等分前加入到主混合物中。在制成大体积的主混合物后,对于每个患者或对照向分离的试管中分入96μl(足够进行8rxns)。以5ng/μl向96μl的主混合物中加入8μl的DNA。随后可以将13μl加入到板的各个孔中或用多通道移液器放在条状试管中并进行吸移。
4.对于反应的整个384孔板,制成进行大约415个反应的足够的主混合物。
5.离心主混合物的板以除去气泡。
6.如果使用一大组引物,让它们在分离的板中与正向引物和反向引物于96孔板中在一起将会有所帮助。
7.利用多通道移液器添加引物。确定通过轻轻上下吸取进行混合。
8.离心所述板以除去任何气泡。
9.利用下面的循环进行扩增。
注:在384孔板中进行PCR。
表9
试剂 每反应的体积(μL)
高压灭菌ddH2O 4.90
5M甜菜碱 3.00
10X缓冲液 1.50
氯化镁 1.50
DMSO 0.75
Taq 0.20
Dntp 0.15
PCR正向引物1(浓度20pmol/uL) 1.00
PCR反向引物2(浓度20pmol/uL) 1.00
DNA(浓度5ng/uL) 1.00
PCR反应总体积 15.00
表10:PCR扩增循环
注:在进行外部PCR后不必进行纯化。
制备用于内部PCR的PCR反应混合物
内部PCR装置与外部PCR几乎相同,除了稍许例外。
1.如对于外部PCR所述的那样在PCR通风橱中制成大体积的主混合物。
2.将MM等分到7只条状试管中并用多通道移液器吸取12μl入384孔板中。
3.正向和反向内部引物每样加12μl。临时封板。
4.从通风橱中移除,将板离心下来并进入PCR后装置区。
5.利用专用移液器将1μl外部PCR产物等分入每个反应中。
6.热封并再次离心。
7.如外部PCR一样运行相同的扩增循环。
在纯化前在1%凝胶上将PCR产物跑电泳。确定通过/失败的外显子进行重复PCR。
利用Ampure Magnetic Bead Clean-up纯化内部PCR
纯化
1.振荡Ampure磁珠的板直到没有珠沉积。
2.非常重要的是Ampure珠的温度是于室温。
3.在Biomek上使用384孔Ampure方案并将反应体积改变为12μl以容纳用于纯化的试剂。如果不做这,将产生错误。
4.在完成程序后,用20μl高压灭菌ddH2O每孔水合板。在加水时,确保通过轻轻地上下吸取来混合。
5.离心所述板以除去任何气泡。
6.将板置于磁体上以分离出所述珠。现在你应当能够取出1μl的DNA以进行测序反应。将其余的保存于-20℃以便将来使用。
测序方案
制备测序反应混合物
1.在暗室中于冰上融出BigDye 3.1。
2.利用下表在试管(eppendorf或15mL试管)中制备主混合物。水,缓冲液,DMSO,Taq Gold和BigDye 3.1应当按所列顺序加入。
3.非常重要的是加入每种试剂的同时通过轻轻上下抽吸混合试剂。
4.当使用通常引物进行测序时,此时还可以将所述引物加入到主混合物中。如果所述引物是特有的应当在主混合物放入384孔板中后个别地将它加入。
5.通常对于反应的整个384孔板,制成进行大约415个反应的足够的主混合物。
6.一旦制成主混合物就将所述混合物分入条状试管的8孔中。(不使用储存器来等分主混合物。那会浪费试剂)。
7.现在可以使用多通道移液器将主混合物等分入384孔板中。
8.离心主混合物的板以除去气泡。
9.使用多通道移液器加入等测序的PCR产物。确保通过上下抽吸混合试剂。
10.离心所述板以除去任何气泡。
11.利用下面的循环进行扩增。
表11
试剂 每反应的体积(μL)
高压灭菌ddH2O 4.38
5xABI缓冲液 3.65
DMSO 0.50
ABI BigDye 3.1 0.35
测序引物浓度 0.12
来自内部PCR反应的DNA 1.00
反应总体积 10.00
表12:进行测序的扩增循环
通过Cleanse Magnetic Bead Clean-up 1进行纯化
1.振荡Cleanse磁珠的板直到没有珠沉积。
2.在Biomek上使用Cleanse 384孔板程序纯化样品。
3.在完成程序后,将原始板保存于-20℃。具有纯化样品的新板可以用于ABI 3730上。
(注:如果PCR产物短于300bps你可能不得不在将样品放在3730上之前稀释它)
生成用于EGFR测试的突变检查模板并将它们收录于LMM/测序/序列-MS检查/EGFR上。
重复结果标准
通过对特异性外显子扩增和测序来重复所有的阳性结果,在所述外显子中由源自原始组织样品的第二份患者DNA检测出DNA序列变化。此外,由患者血液样品提取的DNA应当并行地进行操作以便与肿瘤组织比较,如果检测出的序列变化以往未曾在gefitinib-或erlotinib-反应者中检测过的话。
基于具体的技术问题,任何未产生清楚序列的外显子都将由提取、PCR或测序进行重复。
测定参数
测试的敏感性-在大约13%的患有NSCLC的个体中发现了躯体性EGFR激酶结构域突变(Paez JG等,2004)。此外,在gefitinib反应性的13/14(92.8%)患有NSCLC的个体中发现了躯体性EGFR激酶结构域突变(Paez JG等,2004,Lynch,等,2004)。测试技术敏感性的确证显示对于已知突变100%的敏感性并且在我们实验室测序平台的确证显示100%的敏感性(见下面的″技术的精确性″)。组合样品突变检测的敏感性已经测定为25%(即,当以细胞混合物的50%存在时,杂合突变可以被检测到)。我们发现高达20%的石蜡包埋的组织并不产生高质量的DNA。我们不能从这些样品中获得序列信息。
测试的特异性-迄今为止,已公布的文献表明在EGFR中具躯体性突变的个体没有不对gefitinib反应的(11/11)。由于双向测序的人为假象导致发现突变的机会近乎为0%(见下面的″技术的精确性″)。由此,测试的特异性大约为100%。
技术的精确性-DNA测序技术是分子诊断学中的黄金标准。本实验室使用具有98.5%的报道精确性的ABI 3730 DNA分析仪。将这结合双向测序,用Mutation Surveyor进行的自动色谱分析,以及假阳性的手动分析,我们达到了100%的准确率。这是基于对原初序列的100,000个碱基的分析基础之上的,见我们的质量保证方案手册。
注:我们并不假定这些结果保证此平台100%的精确性。已知测序误差可以发生,因此,我们报告我们的精确性为99.99%,其已经由大规模测序方案所发现(Hill等2000)。
测试的再现性-由于测试的精确性,当获得结果时,它们是可再现的,与测试的精确性等同(99.99%)。不过,偶而地,由于下面所列的因素(见方法的限制)或因为由于不清楚的技术原因导致的PCR或测序失败所述测试可以失败。在这些情况下,没有获得结果并且重复测定直到获得结果或者患者样本是不能接受的。每个测定步骤和样本的具体失败率可以在我们的质量保证方案手册的确认报告中发现。
结果的正常范围-利用Gen Bank编号:NT_033968.5(基因组序列)和NM_005228.3(mRNA序列)可以在线发现EGFR基因的正常序列。
方法的限制:
通过测序方法将检测不到跨越一个或多个外显子的大的删除,特别是如果以杂合现象存在时。通过本测定法将检测不到在EGFR基因激酶结构域外侧的突变。抑制剂可能存在于DNA样品中,阻止通过PCR进行扩增。降解的DNA可能不会产生可分析的数据并且可能需要重新提交样本。稀有序列变异或靶向性引物序列的二级结构能够影响PCR扩增,因此突变能够在一个等位基因的该区被错过。
实施例6
Gefitinib(Iressa)是一种靶向表皮生长因子受体(EGFR)的酪氨酸激酶抑制剂,并且诱导非小细胞肺癌(NSCLCs)中的显著临床反应,所述NSCLCs在EGFR激酶结构域内具有激活性的突变。我们报道这些突变型EGFRs选择性地激活Akt和STAT信号途径,其促进细胞存活,但对诱导增殖的Erk/MAPK信号没有影响。在siRNA介导的突变型EGFR的压低或用Akt和STAT信号的药学抑制剂处理后,表达突变型EGFRs的NSCLCs经历了广泛的凋亡,并且对由常规化疗药物诱导的凋亡具有相对抗性。因而,突变型EGFRs选择性地转导NSCLCs所依赖的存活信号;因此,通过Gefitinib抑制那些信号可以成为对抗临床反应的基础。
EGFR家族的受体酪氨酸激酶调控基本的细胞功能,包括增殖,存活,迁移和分化,并且似乎在实体肿瘤的病因学和进展中发挥中心作用(R.N.Jorissen等,Exp.Cell Res.284,31(2003),H.S.Earp,T.L.Dawson,X.Li,H.Yu,Breast Cancer Res.Treat.35,115(1995))。EGFR经常在乳腺,肺,结肠,卵巢,和脑肿瘤中过表达,促进诸如Gefitinib的特异性药学抑制剂的开发,其通过在催化结构域内结合ATP口袋而破坏EGFR激酶活性(A-E.Wakeling等,Cancer Res.62,5749(2002))。Gefitinib在大约10%的患有化疗顽固性NSCLC的患者中诱导显著的临床反应(J.Baselga等,J.Clin.Oncol.20,4292(2002),M.Fukuoka等,J.Clin.Oncol.21,2237(2003),G.Giaccone等,J Clin Oncol.22,777(2004),M.G.Kris等,TAMA 290,2149(2003))。事实上全部Gefitinib反应性肺癌都在EGFR激酶结构域内具有躯体型突变,而在非反应性病例中没有见到突变(T.J.Lynch等,N.Engl.J.Med.350,2129(2004),J.G.Paez等,Science 304,1497(2004))。这些杂合突变包括聚集在ATP结合口袋内的小的框内删除和错义取代。
利用突变型EGFRs的瞬时转染,我们之前显示了两种类型的突变都导致增强的EGF依赖型受体激活,如通过Y1068的自体磷酸化所测量的,所述Y1068是EGFR的突出的C末端磷酸化位点的其中之一(T.J.Lynch等,N.Engl.J.Med.350,2129(2004)。
为了能够研究由突变型EGFRs产生信号的定性差异,我们制成了表达野生型或突变型EGFRs的非转化小鼠乳腺表皮细胞(NMuMg)的稳定品系,并分析与不同下游效应剂相联系的多种酪氨酸残基的EGF介导的自体磷酸化(R.N.Jorissen等,Exp.Cell Res.284,31(2003))。制成表达野生型EGFR或在来自Gefitinib反应性患者的肿瘤中检测到的两种复发突变的其中一种的细胞系,所述两种突变为:错义突变L858R和18bp的框内删除,,delL747-P753insS。在野生型和两个突变型EGFRs之间于几个C末端位点上观察到显著不同的酪氨酸磷酸化模式。EGF诱导的Y1045和Y1173的磷酸化作用在在野生型和突变型EGFRs之间完全无法区分,而Y992和Y1068在两种突变体中都基本上得以提高。令人感兴趣的是,Y845在L858R错义突变体中高度磷酸化,但野生型或删除突变中并非如此,因此好像是在两种类型的EGFR突变之间区别中特有的。在野生型和突变型受体中见到的不同的EGF诱导的酪氨酸磷酸化模式在顺时转染的COS7细胞中是可重复的,确保针对潜在的细胞类型特异性效应。
因而,Gefitinib敏感性的突变型EGFRs转导与由野生型EGFR介导的信号在定性上不同的信号。这些区别可能直接缘自影响底物特异性的催化性口袋内的结构变化,或缘自与调节EGFR信号途径的附属蛋白的变化的相互作用。
建立用突变型EGFRs稳定转染的细胞系使得在共同的细胞背景下比较EGFR的主要下游靶标的磷酸化状态成为可能。EGF诱导的通过Ras的Erkl和Erk2的激活,通过PLCγ/PI3K的Akt的激活,以及通过JAK2的STAT3和STAT5的激活,是介导EGFR致癌作用的基本下游途径(R.N.Jorissen等,Exp.Cell Res.284,31(2003))。EGF-诱导的Erk激活在表达野生型EGFR或两种激活性EGFR突变体任一种的细胞中基本上不能区分。相反地,Akt和STAT5的磷酸化作用在表达任一种突变型EGFRs的细胞中基本上都得以提高。在表达突变型EGFRs的细胞中类似地观察到STAT3的增强的磷酸化作用。不变的由突变型EGFRs导致的Erk激活与缺少Y1173增强的磷酸化作用相一致,所述Y1173是导致Ras激活和随后Erk磷酸化的Shc和Grb-2接头的重要入坞位点(R.N.Jorissen等,Exp.Cell Res.284,31(2003))。在突变型EGFRs激活后增强的Akt和STAT磷酸化作用与Y992和Y1068磷酸化作用的增强相一致,二者之前都与Akt和STAT激活相联系(R.N.Jorissen等,Exp.Cell Res.284,31(2003))。因而,在突变型EGFRs内C末端酪氨酸残基的选择性EGF诱导自体磷酸化与下游信号途径的选择性激活非常好地相一致。
为了将这些观察结果延伸到EGFR突变好像驱动肿瘤形成的肺癌细胞中,我们研究了源自五个NSCL肿瘤的细胞系。NCI-H1975携带复发的错义突变L858R而NCI-H1650具有框内删除delE746-A750,而NCI-358,NCI-H1666,和NCI-H1734表达野生型EGFR。在转染的细胞中,EGF诱导的Y992和Y1068的自体磷酸化作用在具有内源EGFR突变的两个细胞系中得以明显提高,正如Akt和STAT5的磷酸化作用一样,但Erk并非如此。
EGFR的致癌活性反映了信号途径的激活,其促进细胞增殖和细胞存活(S.Grant,L.Qiao,P.Dent,Fro7zt.Biosc.7,d376(2002))。尽管这些途径显示重叠,Ras介导的Erk激酶的激活基本上赋予EGFR的增殖活性,而Akt和STAT的激活在很大程度上与抗凋亡功能有联系(S.Grant,L.Qiao,P.Dent,Front.Biosci.7,d376(2002),F.Chang等,Leukemia 17,1263(2003),F.Chang等,Leukemia17,590(2003),F.Chang等,Int.J.Oncol.22,469(2003),V.Calo等,J.Cell Physio.197,157(2003),T.J.Ahonen等,J.Biol.Chem.278,27287(2003))。两种具有EGFR突变的肺癌细胞在低血清浓度上显示对于EGF的增殖性反应,这在具有野生型受体的细胞中没有观察到。不过,它们的增殖率和细胞汇合密码在正常血清浓度下相当。
SiRNA
相反,凋亡途径在具有突变型EGFRs的肺癌细胞中明显不同:在这些细胞系中siRNA介导的突变型EGFR的特异性激活导致快速和大规模的凋亡。在96小时内大约90%的用L858R-特异性siRNA转染的NCI-H1975细胞死亡,如同用delE746-A750-特异性siRNA转染的NCI-H1650细胞一样。对于两种EGFR突变特异性的SiRNA对于表达其它突变的细胞没有作用,靶向野生型和突变型EGFR的siRNA对于只表达野生型受体的细胞的生存能力具有最小限度的影响,但是在表达EGFR突变体的细胞系中诱导快速的细胞死亡。在COS7细胞中通过免疫印迹确证siRNAs特异性靶向对应的EGFR等位基因的能力。因而,在具有这些突变的肺癌中突变型EGFRs的表达对于原凋亡信号的抑制似乎是必需的。只表达野生型受体的肺癌细胞并不展示对EGFR表达的类似依赖性的事实也可以说明过表达野生型EGFR的人肿瘤的相对Gefitinib不敏感性。
在具有突变型EGFRs的肺癌中Gefitinib的有效性可能反映了它对这些细胞严重依赖的关键抗凋亡途径的抑制,以及突变型受体的变化的生化特性。我们先前报道了突变型EGFRs比野生型受体对EGF依赖型自体磷酸化的Gefitinib抑制更加敏感(T.J.Lynch等,N.Engl.J.Med.350,2129(2004))。这种由突变型受体提高的药物敏感性对于Erk和STAT5激活也观察到。因而,尽管由突变型受体产生的EGF诱导的信号途径通过不同的自体磷酸化事件证明下游效应剂的选择性激活,但由Gefitinib产生的它们的增强的抑制是一致的,并且可能反映了药物结合到突变型ATP口袋的变化。
为了确定在EGFR介导的NSCLC存活中增强的Akt和STAT信号的相关性,我们用特异性药学抑制剂靶向这些途径。具有EGFR突变的肺癌细胞比具有野生型受体的细胞对Gefitinib更加敏感100倍。表达突变型EGFRs的细胞也比只表达野生型EGFR的细胞对于Akt或STAT信号的药物抑制更加敏感。尽管EGFR突变型肺癌细胞展示对Akt/STAT介导的抗凋亡信号的破坏的提高的敏感性,它们显示了对由常用化疗剂阿霉素和顺铂,以及原凋亡性Fas配体诱导的细胞死亡信号明显提高的抗性。
所以在具有突变型EGFR的细胞中增强的Akt/STAT信号可能提供额外的治疗靶标,同时提高了常规化疗可能对这些肿瘤较少有效的可能性。
″癌基因嗜好″已经被提出来解释癌细胞依赖的增殖性信号被抑制后它们的凋亡(I.B.Weinstein,Science 297,63(2002))。令人感兴趣的是,Imatinib(Gleevec)在表达BCR-ABL转位产物的慢性髓样白血病中并且在表达激活性c-Kit突变的胃肠粘膜肿瘤中有效地引发细胞死亡,二者都经常展示构成性STAT激活,其被药物有效地抑制(T.Kindler等,Leukemia 17,999(2003),G.P.Paner等,Anticancer Res.23,2253(2003))。类似地,在具有EGFR激酶突变的肺癌细胞中,Gefitinib-反应性可能大部分缘自其对由突变型受体转导的必需的抗凋亡信号的有效抑制。
材料和方法
免疫印迹
在冰冷的RIPA裂解溶液(1%Triton X-100,0.1%SDS,50mMTris-HCl,pH 7.4,150mM NaCl,1mM EDTA,1mM EGTA,10mMβ-甘油-磷酸酯,10mM NaF,1mM Na-orthovauadate,包含蛋白酶抑制剂)中制备来自培养细胞的裂解物。通过在离心管中于12,000xg 4℃离心10min去除碎片。将澄清的裂解物在凝胶加样缓冲液中煮沸并通过10%SDS-PAGE分离。将蛋白质电转移到硝酸纤维素膜上并用特异性抗体进行检测,随后与辣根过氧化物酶缀合的山羊二抗一起温育(Cell signaling(Beverly,MA;1∶2000)并用放大的化学化发进行显影(Du Pont NEN),随后进行放射自显影。磷-EGFR Y845,Y992,Y1045,Y1068,磷-STAT5(tyr694),磷-AKT(Ser473),磷-ERKl/2(Thr202/Tyr204),AKT,STAT5,和ERK1/2抗体获自New England Biolabs(Beverly,MA)。全部EGFR Ab-20抗体获自NeoMarkers(Fremont,CA).磷-EGFRY1173抗体来自UpstateBiotechnology(Lake Placid,NY)而全部磷酪氨酸抗体PY-20来自Transduction Laboratories(Lexington,KY。以1∶1000稀释使用所有抗体。
EGFR表达载体
利用标准方法将编码野生型,L858或del L747-P753insS突变的全长EGFR表达构建体亚克隆入质粒pUSEamp中。通过DNA序列分析确认所有构建体。
细胞系和转染
在2mM L-谷氨酰胺和50U/ml青霉/链霉素存在时将COS7细胞和NMuMg(正常小鼠乳腺表皮)细胞生长于具有10%胎牛血清的DMEM(Dulbecco′s modified Eagle′s media)中。NCI-H358,NCI-H1650,NCI-H1734,NCI-H1666,和NCI-H1975人肺癌细胞系获自美国典型培养物保藏中心并生长于具有10%胎牛血清,2mM L-谷氨酰胺,50U/青霉/链霉素和1mM丙酮酸钠的RPMI1640中。它们在文中分别以缩写的形式称为H358,H1650,H1734,H1666,和H1975。使用Lipofectamine 2000(Invitrogen;Carlsbad,CA)进行COS7细胞的瞬时转染。将质粒(1μg)转染入10cm皿上80%汇合的细胞中。12小时后,收集细胞并重新接种于不含血清的12孔板中。第二天,用30ng/ml的EGF刺激细胞。通过共转染EGFR表达构建体与可选择药物的pBABE puro,随后在3μg/ml的嘌呤霉素中进行选择来制备稳定的NMuMg细胞系。将抗药物细胞集合用于分析。通过免疫印迹确证在稳定转染细胞中的EGFR的表达。
SiRNA-介导的EGFR表达的″压低″
设计EGFRL858R的SiRNA来靶向核苷酸序列CACAGATTTTGGGCGGGCCAA(SEQ ID NO.:688),而GCTATCAAAACATCTCCGAAA(SEQ ID NO.:689)序列用于delE745-A750(Qiagen;Valencia,CA)。为了靶向EGFR的所有形式,从Dharmacon(Lafayette,CO)获得商业上制备的对应于人野生型EGFR的siRNA。用Lipofectamine2000(Invitrogen)按照生产商的说明书进行siRNAs的转染。在96小时后利用MTT测定法对细胞测定生活力。
凋亡测定
将10,000个细胞接种入96孔板的各个孔中。6小时后,更换培养基并在存在逐渐提高浓度的阿霉素(Sigma;St.Louis,MO),顺铂(Sigma),Fas-配体(人激活性的,克隆CH11;UpstateBiotechnology),Ly294002(Sigma),或AG490(Calbiochem;LaJolla,CA)的情况下维持细胞。96小时后,利用MTT测定法测定细胞的生活力。为了进行caspase免疫染色,将10,000个细胞接种到10mm盖玻片上。第二天将它们用siRNA转染(细节见在前的节段)。72小时后将细胞于室温固定于4%多聚甲醛中10min。随后将它们在0.5%Triton x-100中浸透5min并在5%正常山羊血清(NGS)中封闭1hr。随后将盖玻片在1∶100稀释的一抗(来自Cell Signaling的经剪切的caspase-3Asp 175 5A1)中于4℃过夜培养。第二天将盖玻片在PBS中洗涤三次并与1∶250稀释于5%正常山羊血清中的二抗(得克萨斯红缀合的山羊抗兔;来自Jackson Immunoresearch;WestGrove,PA)和0.5ug/ml的DA PI(4′,6-二脒-2-苯基吲哚)一起温育。在PBS中洗涤3次后将盖玻片装上来自Molecular Probes(Eugene,OR)的ProLong Gold抗衰减试剂。
细胞生活力测定
将10μl的5mg/ml MTT(Thiazolyl blue;Sigma)溶液加到96孔板的每个孔中。于37℃温育2小时后,除去培养基并通过向每孔加入100μl的酸性异丙醇(0.1N HCL)来溶解MTT。于570nm分光分度测定吸光度。
生长曲线
通过在96孔板的各孔中接种1000个细胞获得H-358,H-1650,H-1734,和H-1975细胞的生长曲线。将每个细胞系接种于8个独立的孔中。连接作业日后,将细胞固定在4%甲醛中并用0.1%(w/v)结晶紫溶液进行染色。随后将结晶紫溶于100μl的乙酸中,并利用板读取器于570nm测量吸光度以测定相对细胞数目。
突变鉴定
为了鉴定在EGFR内具有突变的偶发NSCLC细胞系,我们在一组15个NSCLC细胞系内对外显子19和21进行了测序,如上所述。基于它们从支气管肺泡组织学的来源而不管是否有抽烟史,(NCI-H358,NCI-H650,NCI-H1650),或从非抽烟者中发生的腺癌的来源(NCI-H1435,NCI-H1563,NCI-H1651,NCI-H1734,NCI-H1793,NCI-H1975,NCI-H2291,NCI-H2342,NCI-H2030,NCI-H1838,NCI-H2347,NCI-H2023)选择细胞系进行分析。已经报道NCI-H1666只具有野生型EGFR(见上面的实施例)。所有细胞系都可从美国典型培养物保藏中心获得。
将这里和整个说明书中引用的参考文献的全部内容并入本文作为参考。
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表1.九位患有非小细胞肺癌的患者的特征和对Gefitinib的反应
*具有支气管肺泡癌(BAC)任何要素的腺癌(Adeno)被列为BAC。如果患者在进入之前12个月内未抽任何香烟的话则抽烟状态被定义为从前(former),如果患者在其一生抽了不到100只香烟则定义为从不(never)。
总体存活从gefitinib治疗开始到死亡来测量。
§EGFR表示表皮生长因子受体基因。
在实体肿瘤中使用反应评估标准评估部分反应,由两位医生在患者中评估较大和较小的反应,所述患者不能用这些标准测量反应。
表2.在非小细胞肺癌患者的EGFR酪氨酸激酶结构域中的躯体性突变
*在未接触gefitinib的25位患者中(15位患有支气管肺泡癌,7位患有腺癌,3位患有大细胞癌)2位(患者A和B)具有支气管肺泡癌-具有EGFR突变。在代表不同组织学类型:非小细胞肺癌(6个样本),小细胞肺癌(6个样本),支气管肿瘤(1个样本),和一种未知类型(1个样本)的14个肺癌细胞系中没有发现突变。在EGFR内鉴定的多态性变体包括下列:在酪氨酸激酶结构域内,在核苷酸1562上A对G的取代,在核苷酸1887上A对T的取代,和未知功能意义的种系变体,在核苷酸2885上A对G的取代。
表4:在作为NSCLC护理的部分的测试EGFR突变的100位患者中的群体特征
特征 频率
平均年龄,年(标准偏差) 63
女性
种族 76
白人 7
亚洲人 5
其它 12
未知
测试时的状态 15
I 4
II 10
III 67
IV 4
未知
组织学 1
纯BAC 24
具有BAC特征的腺癌 69
腺癌 6
NSCLC,所有其它亚型
抽烟状态 17
当前 48
从前 29
从不 6
未知
当前和从前抽烟者所抽的平均量,包-年(标准偏差) 39.0(32.3)
从诊断到EGFR测试的平均时间,月(标准偏差) 18.7(78.4)
以往化疗治疗 47
以往EGFR靶向性治疗 11
BAC=支气管肺泡癌,EGFR=表皮生长因子受体
表S1A:选定的EGFR和受体酪氨酸激酶外显子的扩增引物(SEQ ID NOS:1-212)
表S1A:续
表S1B:选定的EGFR和受体酪氨酸激酶外显子的扩增引物(SEQID NOS:213-424)
表S1B:续
表S4:用于cDNA测序的引物
引物名称 SEQ ID NO 引物序列5′-3′
cDNA EGFR aF 447 TGTAAAACGACGGCCAGTCGCCCAGACCGGACGACA
cDNA EGFR aR 448 CAGGAAACAGCTATGACCAGGGCAATGAGGACATAACCA
cDNA EGFR bF 449 TGTAAAACGACGGCCAGTGGTGGTCCTTGGGAATTTGG
cDNA EGFR bR 450 CAGGAAACAGCTATGACCCCATCGACATGTTGCTGAGAAA
cDNA EGFR cF 451 TGTAAAACGACGGCCAGTGAAGGAGCTGCCCATGAGAA
cDNA EGFR cR 452 CAGGAAACAGCTATGACCCGTGGCTTCGTCTCGGAATT
cDNA EGFR dF 453 TGTAAAACGACGGCCAGTGAAACTGACCAAAATCATCTGT
cDNA EGFR dR 454 CAGGAAACAGCTATGACCTACCTATTCCGTTACACACTTT
cDNA EGFR cF 455 TGTAAAACGACGGCCAGTCCGTAATTATGTGGTGACAGAT
cDNA EGFR cR 456 CAGGAAACAGCTATGACCGCGTATGATTTCTAGGTTCTCA
cDNA EGFR fF 457 TGTAAAACGACGGCCAGTCTGAAAACCGTAAAGGAAATCAC
cDNA EGFR fR 458 CAGGAAACAGCTATGACCCCTGCCTCGGCTGACATTC
cDNA EGFR gF 459 TGTAAAACGACGGCCAGTTAAGCAACAGAGGTGAAAACAG
cDNA EGFR gR 460 CAGGAAACAGCTATGACCGGTGTTGTTTTCTCCCATGACT
cDNA EGFR hF 461 TGTAAAACGACGGCCAGTGGACCAGACAACTGTATCCA
cDNA EGFR hR 462 CAGGAAACAGCTATGACCTTCCTTCAAGATCCTCAAGAGA
cDNA EGFR iF 463 TGTAAAACGACGGCCAGTGATCGGCCTCTTCATGCGAA
cDNA EGFR iR 464 CAGGAAACAGCTATGACCACGGTGGAGGTGAGGCAGAT
cDNA EGFR iF 465 TGTAAAACGACGGCCAGTCGAAAGCCAACAAGGAAATCC
cDNA EGFR iR 466 CAGGAAACAGCTATGACCATTCCAATGCCATCCACTTGAT
cDNA EGFR kF 467 TGTAAAACGACGGCCAGTAACACCGCAGCATGTCAAGAT
cDNA EGFR kR 468 CAGGAAACAGCTATGACCCTCGGGCCATTTTGGAGAATT
cDNA EGFR lF 469 TGTAAAACGACGGCCAGTTCAGCCACCCATATGTACCAT
cDNA EGFR lR 470 CAGGAAACAGCTATGACCGCTTTGCAGCCCATTTCTATC
cDNA EGFR mF 471 TGTAAAACGACGGCCAGTACAGCAGGGCTTCTTCAGCA
cDNA EGFR mR 472 CAGGAAACAGCTATGACCTGACACAGGTGGGCTGGACA
cDNA EGFR nF 473 TGTAAAACGACGGCCAGTGAATCCTGTCTATCACAATCAG
cDNA EGFR nR 474 CAGGAAACAGCTATGACCGGTATCGAAAGAGTCTGGATTT
cDNA EGFR oF 475 TGTAAAACGACGGCCAGTGCTCCACAGCTGAAAATGCA
cDNA EGFR oR 476 CAGGAAACAGCTATGACCACGTTGCAAAACCAGTCTGTG

Claims (19)

1.一种试剂盒,其包含:
a.设计来退火到EGFR激酶结构域的外显子19或21内部的核酸区域上的至少一种探针;
b.进行退火反应所必需的产物和试剂;和
c.说明书,
其中所述探针在选择性结合条件下特异性结合到在erbB1基因中的外显子19或21中包含至少一个变异的核酸序列上,其中所述变异为导致EGFR基因的外显子19中的框内删除的突变,其由导致氨基酸改变的在密码子746-753内的删除组成,所述氨基酸改变包含至少SEQ ID NO.512中第747、748和749位的亮氨酸、精氨酸和谷氨酸的删除,或其中所述变异为导致氨基酸改变的外显子21内的取代,所述氨基酸改变由序列SEQ ID NO.512的858位以精氨酸取代亮氨酸(L858R)组成。
2.一种试剂盒,其包含:
a.设计来退火到EGFR激酶结构域的外显子19或21的边界或内部的核酸区域上的至少一对简并引物,其中所述引物对特异性扩增在EGFR基因中的外显子19或21中包含至少一个变异的核酸序列,其中所述变异为导致EGFR基因的外显子19中的框内删除的突变,其由导致氨基酸改变的在密码子746-753内的删除组成,所述氨基酸改变包含至少SEQ ID NO.512中第747、748和749位的亮氨酸、精氨酸和谷氨酸的删除,或其中所述变异为导致氨基酸改变的外显子21内的取代,所述氨基酸改变由序列SEQ ID NO.512的858位以精氨酸取代亮氨酸(L858R)组成;
b.进行PCR扩增所必需的产物和试剂;和
c.说明书。
3.一种试剂盒,其包含:
a.设计来检测EGFR激酶结构域的外显子19或21中的变异的至少一种核酸探针,其中所述核酸探针检测EGFR基因中的外显子19或21中的至少一个变异,其中所述变异为导致EGFR基因的外显子19中的框内删除的突变,其由导致氨基酸改变的在密码子746-753内的删除组成,所述氨基酸改变包含至少SEQ ID NO.512中第747、748和749位的亮氨酸、精氨酸和谷氨酸的删除,或其中所述变异为导致氨基酸改变的外显子21内的取代,所述氨基酸改变由序列SEQID NO.512的858位以精氨酸取代亮氨酸(L858R)组成,其中所述检测基于与核苷酸变异序列的特异性杂交;
b.进行退火反应所必需的产物和试剂;和
c.说明书。
4.一种试剂盒,其包含:
a.设计来退火到EGFR激酶结构域的外显子18的边界或内部的核酸区域上的至少一对简并引物,其中所述引物对特异性扩增在EGFR基因中的外显子18中包含至少一个变异的核酸序列,其中所述变异为导致氨基酸改变的外显子18内的取代,所述氨基酸改变由序列SEQ ID NO.512的719位以半胱氨酸取代甘氨酸(G719C)组成;
b.进行PCR扩增所必需的产物和试剂;和
c.说明书。
5.一种试剂盒,其包含:
a.设计来检测EGFR激酶结构域的外显子18中的变异的至少一种核酸探针,其中所述核酸探针检测EGFR基因中的外显子18中的至少一个变异,其中所述变异为导致氨基酸改变的外显子18内的取代,所述氨基酸改变由序列SEQ ID NO.512的719位以半胱氨酸取代甘氨酸(G719C)组成,其中所述检测基于与核苷酸变异序列的特异性杂交;
b.进行退火反应所必需的产物和试剂;和
c.说明书。
6.一种探针,其在选择性结合条件下特异性结合到在erbB1基因中的外显子19或21中包含至少一个变异的核酸序列上,其中所述变异为导致EGFR基因的外显子19中的框内删除的突变,其由导致氨基酸改变的在密码子746-753内的删除组成,所述氨基酸改变包含至少SEQ ID NO.512中第747、748和749位的亮氨酸、精氨酸和谷氨酸的删除,或其中所述变异为导致氨基酸改变的外显子21内的取代,所述氨基酸改变由序列SEQ ID NO.512的858位以精氨酸取代亮氨酸(L858R)组成。
7.权利要求6的探针,其中所述探针包含长度为500个核苷酸碱基或更少的核酸序列。
8.权利要求6的探针,其中所述探针包含肽核酸(PNA)。
9.权利要求6的探针,其进一步包含可检测标记。
10.一种核酸探针,其设计来检测EGFR基因中的外显子19或21中的变异,其中所述变异为导致EGFR基因的外显子19中的框内删除的突变,其由导致氨基酸改变的在密码子746-753内的删除组成,所述氨基酸改变包含至少SEQ ID NO.512中第747、748和749位的亮氨酸、精氨酸和谷氨酸的删除,或其中所述变异为导致氨基酸改变的外显子21内的取代,所述氨基酸改变由序列SEQ ID NO.512的858位以精氨酸取代亮氨酸(L858R)组成,其中所述检测基于与核苷酸变异序列的特异性杂交。
11.权利要求10的核酸探针,其中所述核酸探针包含长度为500个核苷酸碱基或更少的核酸序列。
12.权利要求10的核酸探针,其中所述核酸探针包含肽核酸(PNA)。
13.权利要求10的核酸探针,其进一步包含可检测标记。
14.一种核酸探针,其设计来检测EGFR基因中的外显子18中的变异,其中所述变异为导致氨基酸改变的外显子18内的取代,所述氨基酸改变由序列SEQ ID NO.512的719位以半胱氨酸取代甘氨酸(G719C)组成,其中所述检测基于与核苷酸变异序列的特异性杂交。
15.一种引物对,其设计来退火到EGFR激酶结构域的外显子19或21的边界或内部的核酸区域上,其中所述引物对特异性扩增在EGFR基因中的外显子19或21中包含至少一个变异的核酸序列,其中所述变异为导致EGFR基因的外显子19中的框内删除的突变,其由导致氨基酸改变的在密码子746-753内的删除组成,所述氨基酸改变包含至少SEQ ID NO.512中第747、748和749位的亮氨酸、精氨酸和谷氨酸的删除,或其中所述变异为导致氨基酸改变的外显子21内的取代,所述氨基酸改变由序列SEQ ID NO.512的858位以精氨酸取代亮氨酸(L858R)组成。
16.一种引物对,其设计来退火到EGFR激酶结构域的外显子18的边界或内部的核酸区域上,其中所述引物对特异性扩增在EGFR基因中的外显子18中的至少一个变异,其中所述变异为导致氨基酸改变的外显子18内的取代,所述氨基酸改变由序列SEQ ID NO.512的719位以半胱氨酸取代甘氨酸(G719C)组成。
17.一种具有SEQ ID NO:512氨基酸序列的分离的蛋白质,其中将选自氨基酸746-750、747-751和747-753的氨基酸删除。
18.一种具有SEQ ID NO:512氨基酸序列的分离的蛋白质,其包含在氨基酸858上用精氨酸取代亮氨酸。
19.一种具有SEQ ID NO:512氨基酸序列的分离的蛋白质,其包含在氨基酸719上用半胱氨酸取代甘氨酸。
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