CN103842374A - 融合前的rsv f抗原 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含一个或多个氨基酸突变的融合前RSV F蛋白和多肽，所述氨基酸突变使融合前构象稳定或使融合后构象失稳。本发明还涉及诱导针对融合前RSV F的免疫应答的方法。

Description

融合前的RSV F抗原
相关申请
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序列表
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发明背景
呼吸道合胞病毒(RSV)是副粘病毒科(Paramyxoviridae)肺炎病毒属(Pneumovirus)中的包膜不分节负链RNA病毒。其为儿童出生后第一年中细支气管炎和肺炎的最主要原因。RSV还引起重复感染包括严重下呼吸道疾病，其可在任何年龄发作，特别是在老年人或心脏、肺或免疫系统受损的人中。
为了感染宿主细胞，副粘病毒(如RSV)与其它包膜病毒如流感病毒和HIV一样，需要使病毒膜与宿主细胞膜融合。对于RSV，保守融合蛋白(RSV F)通过偶联不可逆的蛋白重折叠和膜并置来融合病毒和细胞膜。在基于副粘病毒研究的现有模型中，所述RSV F蛋白最初折叠为“融合前”构象。进入细胞时，所述融合前构象经历重折叠和构象变化成为其“融合后”构象。
RSV F蛋白由mRNA翻译为约574个氨基酸的蛋白，称为F0。F0的翻译后加工包括通过内质网中的信号肽酶移除N端信号肽。转运高尔基体内的细胞蛋白酶(特别是弗林蛋白酶(furin))还在两个位置(109/110和136/137)切割F0。该切割导致短干扰序列移除，并产生彼此仍相关联的两种亚基，称为F1(约50kDa；C末端；约为残基137-574)和F2(约20kDa；N末端；约为残基1-109)。F1在其N端含疏水性融合肽和两个两性七肽重复区(HRA和HRB)。HRA靠近所述融合肽，而HRB靠近所述跨膜结构域。三个F1-F2异源二聚体在所述病毒表面上组装成F1-F2同源三聚体。
目前还未获得但需要针对RSV感染的疫苗。基于主要RSV中和抗原(F糖蛋白)的候选疫苗已失败，原因在于稳定性、纯度、再现性和效力方面的问题。相关副流感病毒F糖蛋白的晶体结构已揭示融合前与融合后状态之间有很大构象变化。所述重排的幅度提示，融合后F抗原不会有效引发中和抗体，推测中和抗体必须结合暴露在融合前构象上的表位。因此，在开发疫苗抵御RSV上的努力以集中于开发含有RSV F的融合前形式的亚单位疫苗(参见，例如，WO2010/149745、WO2010/149743、WO2009/079796)。对RSV F的融合前形式的这一关注已经由RSV F的现有模型确证。
融合前的F是“亚稳定”结构，容易重排成较低能量的融合后状态，其之后因暴露疏水融合肽而聚集(Begona Ruiz-Arguello,M.等，Virology298,317-326(2002)(142))。棒棒糖形的融合前F三聚体和拐杖形的融合后F三聚体之间的较大结构差异甚至在负染样品的电子显微镜分辨率之下都很明显，提示融合前和融合后F可能具有抗原性差异(Calder,L.J.等，Virology271,122-131(2000)(143))。为了预防病毒进入，推测F特异性中和抗体必须在所述病毒包膜与细胞膜融合之前结合所述病毒粒上的F融合前构象。然而，在生成可溶、稳定化的融合前F亚单位抗原上的努力仍未产生适合在人内测试的候选物。此外，对于莫维珠单抗-肽复合物和同源建模的分析指示，由莫维珠单抗和帕利珠单抗识别的优势中和表位可能被掩蔽在F三聚体中，需要至少一处局部解离使表面暴露来允许抗体结合(McLellan,J.S.等，Nat Struct Mol Biol17,248-250(2010))。需要改善的RSV F蛋白组合物和制备RSV F蛋白组合物的方法。
发明内容
本发明涉及融合前呼吸道合胞病毒(RSV)F多肽和融合前嵌合F多肽。
在一些方面，所述融合前呼吸道合胞病毒(RSV)F多肽包含至少两个引入的半胱氨酸残基，所述两个半胱氨酸残基彼此紧密接近，并形成使所述融合前RSVF多肽稳定的二硫键。在具体的实施方式中，HRB区包含一个引入的半胱氨酸残基，且DI和/或DII区包含一个引入的半胱氨酸残基，并且在所述HRB区中引入的半胱氨酸残基和所述D1或DII区中引入的半胱氨酸残基之间形成二硫键。在其它实施方式中，HRA区包含一个引入的半胱氨酸残基，且DIII区包含一个引入的半胱氨酸残基，并且在所述HRA区中引入的半胱氨酸残基和所述III区中引入的半胱氨酸之间形成二硫键。在其它实施方式中，HRA区包含至少两个引入的半胱氨酸残基，并且在所述HRA区中引入的半胱氨酸残基之间形成二硫键。
在其它方面，所述融合前呼吸道合胞病毒(RSV)F多肽包含融合后修饰，所述融合后修饰选自下组：使HRA螺旋缺失、使HRB螺旋缺失、引入点突变、添加糖基化位点及其组合，其中所述融合后修饰使所述融合后构象失稳。在一些实施方式中，所述失稳性融合后修饰是使HRB螺旋全部或部分缺失。若需要，所述失稳性融合后修饰还可包括使所述融合肽全部或部分缺失。在其它实施方式中，所述失稳性融合后修饰包括添加糖基化位点，例如选自下组的残基上的糖基化：173位、175位和184位。
在另一方面，本发明的融合前呼吸道合胞病毒(RSV)F蛋白包含三个RSV F单体，其中，所述单体中至少两个包含引入的半胱氨酸残基，所述引入的半胱氨酸残基彼此紧密接近并形成使所述融合前RSV F蛋白稳定的二硫键。在另一方面，本发明的嵌合融合前F蛋白包含来自RSV以外病毒(例如副流感病毒F多肽或偏肺病毒F多肽)的稳定化F蛋白，其含有一个或多个RSV F中和表位。合适的中和表位可选自能由莫维珠单抗、帕利珠单抗、mAb11、mAb151、mAb1129、mAb1153、mAb1200、mAb1214、mAb1237、mAb47F、mAb7C2、mAb B4、Fab19、mAb AK13A2、mAb7.936、mAb9.936、mAb19、mAb20、mAb101F及其组合识别的表位组。
本发明涉及用于诱导对象内抗呼吸道合胞病毒(RSV)免疫应答的方法，所述方法包括给予所述对象有效量的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含融合前RSV F蛋白或融合前嵌合F蛋白。优选地，所诱导的免疫应答的特点是使针对RSV的中和抗体和/或抵御RSV的保护性免疫。
在特定方面，本发明涉及诱导或提高对象内抗呼吸道合胞病毒(RSV)F蛋白中和抗体的方法，所述方法包括给予所述对象有效量的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含融合前RSV F蛋白或融合前嵌合F蛋白。
在特定方面，本发明涉及诱导或提高对象内抵御呼吸道合胞病毒(RSV)的保护性免疫的方法，所述方法包括给予所述对象有效量的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含融合前RSV F蛋白或融合前嵌合F蛋白。
在特定方面，本发明涉及包含融合前呼吸道合胞病毒(RSV)F蛋白或融合前嵌合F蛋白的免疫原性组合物。
本发明所用的融合前RSV F蛋白可以是全长或截短形式，例如缺乏胞浆域和跨膜域的可溶性胞外域。所述融合前RSV F蛋白，例如，全长或可溶性胞外域形式，可在109/110位和136/137位包含功能性弗林蛋白酶切割位点。在一些优选实施方式中，所述融合前RSV F蛋白(例如，全长或可溶性胞外域形式)包含天然发生的RSV F蛋白的对应部分(例如，胞外域)的氨基酸序列。在本发明的任何方面，所述融合前RSV F蛋白按需要随同佐剂或不随同佐剂给予，并且，必要时所述免疫原性组合物可包含佐剂。
附图简述
图1显示四种F蛋白基于结构的序列比对，二级分配(Secondary Assignment)和关键要素。RSV(SEQ ID NO:33)、新城疫病毒(NDV)(SEQ ID NO:34)、PIV3(SEQ ID NO:36)和PIV5(SEQ ID NO:35)的F的比对采用ClustalW2(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)生成，使用来自CCP4程序包的Lsqkab根据结构叠合来进行手动调整，并使用ESPript2.2版(https://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/)显示。RSV F的要素在所示序列上方表示；PIV3F的要素在所示序列下方表示。*CHO表示RSV F糖基化位点。指示二级结构元件，用与所示序列平行的箭头指示β折叠，圆圈指示α螺旋，"TT"指示转角，而卷圈指示310螺旋。指示二级结构符号的结构域位置(DI、DII、DIII)，但RSV螺旋α5和α6除外，它们被标记以指示它们形成莫维珠单抗的结合位点，还标记β20和β21以指示它们形成101F结合位点。圆圈内数字(RSV)或三角形内数字(PIV3)指示形成二硫键的残基，二硫键连接对中每个成员的数字相同。RSV F和PIV3F的弗林蛋白酶切割位点由标记了Fr的垂直箭头指示。在经弗林蛋白酶切割后释放自所述蛋白质的RSV F p27区域由黑色线条指示。标记RSV F和PIV3F的融合肽。所述融合肽中的箭头指示本研究中所用的融合肽缺失构建体中的F1片段的第一残基。在全部四种蛋白中相同的残基由阴影方框指示。用于研究中和结合位点的肽在空心方框中，而抗性突变(resistance mutation)由星号指示。
图2显示所述RSV F的融合后三聚体的电子显微镜和圆二色性分析。图2A中，所述RSV F蛋白的电子显微图显示视野中均一拐杖形表型，与融合后F蛋白的结构一致。图2B显示在观测到折叠RSV F蛋白的光谱最低值即210nm处观察到的融合后RSV F三聚体的CD解链曲线。CD吸收(y轴)对温度(x轴)作图。图2C显示20℃和95℃时的融合后RSV F三聚体的CD光谱。所述光谱的记录范围是320～190nm，且在两个温度下都显示已折叠蛋白特征性的螺旋最低值。
图3显示结晶RSV F蛋白的代表性电子密度。图3A是原始分子置换方案模型的侧视图，其包含框内的PIV3融合后头部和RSV F的六螺旋束，该图以采用
Figure BDA0000455572550000051
的相位延长和无相重组进行迭代真实空间NCS三倍平均化、直方图匹配和溶剂扁平化之后计算的初始电子密度图(1σ)显示。所述头部区域与所述电子密度不匹配。图3B是侧视图。RSV F的最终模型示于图4A所述的平均电子密度图。图3C显示图4A中所示RSV F蛋白结构的顶视图。图3D显示B的顶视图。图4B中描述模型和电子密度。图3E是所述最终模型的代表性平均电子密度(灰色)的特写的棍形表示图。图3F显示与图4E相同的视图，但是以1.5σ为等值线的最终2mFo-dFc电子密度图。图4显示RSV F的胞外域结构。4A是条形图。列出的残基数对应于各片段的N末端、弗林蛋白酶切割位点(箭头)和C末端。DI-III，结构域I-III；p27，切除的肽；FP，融合肽；HRA、B和C，七肽重复区A、B和C。
4B显示RSV F胞外域三聚体的一个亚基的带状表示图。结构域按4A所示标记并以阴影显示，聚糖以黑色显示。4C显示RSV F胞外域三聚体的表面表示图。一个亚基的结构域按4A所示标记并以阴影显示，其它两个亚基为白色和灰色。
图5显示RSV F和PIV3F的结构域I和II的叠合。图5A显示通过匹配共有β片层叠合的RSV和PIV3的结构域I的带状图解。图5B显示基于共有β链叠合的RSVF和PIV3F的结构域II的带状图解。标记RSV F的二级结构元件。
图6描述RSV和PIV3之间的比较。图6A是RSV F结构域III的带状图解。图6B显示PIV3结构域III的带状图解，其方向匹配图6A中所示方向。图6C显示基于结构域IIIβ片层叠合的RSV和PIV3结构域III螺旋束的特写(它们由不同阴影显示)。图6D显示基于RSV和PIV3F的六螺旋束叠合的其胞外域三聚体(以A和B阴影显示)。左侧图像显示与三次对称轴垂直的带状图解；右侧图像是从所述头部沿所述三次对称轴显示的表面表示图。
图7描述莫维珠单抗表位。图7A是RSV F融合后三聚体和肽-莫维珠单抗复合物(PDB编码3IXT)的莫维珠单抗结合螺旋，α5和α6的叠合。所述融合后三聚体结构和所述肽-莫维珠单抗复合物结构以不同阴影显示。由莫维珠单抗结合的RSV残基以棍形表示图显示。星号指示帕利珠单抗的逃逸突变。图7B显示模拟莫维珠单抗-RSV F融合后三聚体复合物的带状表示图。标记所述Fab的VH和VL结构域；来自所述RSV F结构和所述肽-莫维珠单抗结构的螺旋α5和α6以不同阴影显示；RSV F上的聚糖为黑色；而RSV F的剩余部分为白色。
图8说明RSV F的构象变化、抗原结构和帕利珠单抗结合。图8A是所述融合后结构的表面表示图。描述并标记抗原位点A和C。星号指示选自中和逃逸变体的残基或在中和抗体-肽复合物的确定结构中与抗体形成接触的残基。HRA和HRB的表面以阴影表示。图8B是融合前模型的表面表示图，注解同图A。图8C显示通过来自未免疫小鼠或用RSV F抗原免疫的小鼠的混合血清对帕利珠单抗结合融合后RSV F的抑制。将帕利珠单抗结合(无竞争血清时ELISA信号的百分数)按对竞争混合血清的稀释度作图。
图9显示融合后RSV F结构(A)和融合前RSV F模型(B)中的莫维珠单抗表位的暴露。图9A显示来自融合后结构的一个亚基的结构域III，该结构域以黑色和灰色加深显示，而RSV F的剩余部分为白色。融合前和融合后之间无显著变化的结构元件为黑色，而在从融合前构象转变为融合后构象时发生重折叠的HRA(用箭头标记)为浅灰色。还标记两个亚基上的莫维珠单抗表位。第三个莫维珠单抗表位存在于所述三聚体的表面，但从这个方向不容易看到。在一个示例上标记莫维珠单抗表位α5和α6螺旋。图9B显示按图A中阴影表示的融合前模型的结构域III。所述融合肽区域以阴影表示并用FP标记。使所述HRA区域分解成结构元件α1、α2、α3、β1和β2；对一个亚基标记并以阴影表示。在所述融合前与融合后结构中，所述莫维珠单抗表位的α5和α6螺旋都暴露于表面。然而，在所述融合前模型中，所述HRC环可能需要移动以适应抗体结合(由箭头指示)。
图10显示与所述融合后RSV F三聚体结合的中和抗体101F的模型。图10A显示在RSV F结构(β链20～β链21)的等价残基上叠加的101F Fab肽复合物结构(PDB编码3O4121)的肽(残基431-435)(SEQ ID NO:37)。图10B是与所述RSV F融合后三聚体结合的101F Fab模型的带状表示图。标记101F Fab VH和VL结构域；如A中所述标记RSV Fβ链20和β链21。RSV F的剩余部分为白色。图10B公开"IIKTF"为SEQ ID NO:37。
图11A-C显示可根据RSV F融合前的现有模型来鉴定在合适距离内以形成二硫键的残基。图11A(中图)，所述融合前RSV F模型以阴影/色彩显示标记的结构要素(HRB、HRA、DIII)。图11B(左图)是融合前模型中结构域III上的HRA包装的放大视图。成对的数字指示若都突变成半胱氨酸则可形成二硫键的相近残基。图11C(右图)是结构域I和III(白色)上的HRB茎部包装的放大视图。成对的数字指示若都突变成半胱氨酸则可形成二硫键的残基。氨基酸残基165和296，以及56和164彼此间的距离在所述融合前模型中就形成二硫键而言并不理想，但在所述模型被所述PIV5结构偏转时方向正确并且能形成二硫键，PIV5结构是构建所述模型的基础。
图12显示所述HRB缺失的RSV F构建体(RSV F delHRB HIS，SEQ ID NO:28)的负染电子显微照片。所述HRB缺失的RSV F构建体的电子显微镜照片证明所述RSV F蛋白形成玫瑰花结，可能是通过融合肽。通过所述融合肽形成的玫瑰花结是融合后RSV F的特点，而不是融合前F蛋白的预测表现(Ruiz-Arguello等，2004(142)和Connolly等,2006(144))。该结果显示，所述HRB缺失的RSV F构建体并不显著使所述蛋白质稳定在所需融合前构象。图13显示RSV F蛋白的结构，其中引入某些突变以抑制六螺旋束形成。示出所述RSV F融合后结构，其中，移去了所述HRB螺旋并用假设的随机卷圈(以线表示)替代。标记所述融合后RSV F的延长的HRA螺旋。数字代表供于引入糖基化位点或其它突变以干扰所述融合后结构的六螺旋束特征形成的潜在位点。所述HRA螺旋上干扰与HRB相互作用的突变将使所述融合后构象失稳，其进而将导致所述蛋白质保留在有利的融合前构象。
图14A和B是煮沸和还原条件下使用抗His标签抗体进行的细胞裂解物(14A，显示总表达)或培养基(14B，显示分泌蛋白)的蛋白质印迹。所述蛋白质印迹显示RSV F的表达，并且具有改造的半胱氨酸残基的蛋白质得以表达且包含链内二硫键。从F0到F1/F2的RSV F蛋白质切割并从所述细胞分泌证明RSV F蛋白的适当蛋白质折叠。指示未切割的F0和经切割的F1的迁移。凝胶泳道标记的关键词显示在所述印迹上方。(A)指示总蛋白表达的细胞裂解物的蛋白质印迹。各蛋白质构建体都由所述细胞良好表达。(B)分泌进入培养基的RSV F的蛋白质印迹。所述分泌的蛋白质主要是被切割(F1)并且分泌的量在蛋白质间有差异。该分析的结果指示，T58C与V164C、K168C与V296C以及M396C与F483C蛋白质构建体是最佳表达/分泌的蛋白质构建体。R049:RSV-F融合肽缺失R429SI432T K433T S436F截短体(SEQ ID NO:39)；R050:RSV-F HRA二硫化2I57CS190C截短体(SEQ ID NO:40)；R051:RSV-F HRA二硫化3T58C V164C截短体(SEQ ID NO:6)；R052:RSV-F HRA二硫化5K168C V296C截短体(SEQ IDNO:8)；R053:RSV-F融合肽缺失N262Y N268I K272M R429S I432T K433TS436F截短体(SEQ ID NO:41)；R054RSV-F HRA二硫化1V56C V164C截短体(SEQ ID NO:4)；R055RSV-F HRA二硫化4N165C V296C截短体(SEQ IDNO:7)；R056RSV-F HRB二硫化M396C F483C截短体(SEQ ID NO:9)。
图15A-C显示RSV F链间二硫键的SEC分析。使用融合后F玫瑰花结和融合肽缺失的RSV F三聚体来展开HPLC-SEC试验以区分玫瑰花结和三聚体。(图15A)融合肽稳定化的RSV F玫瑰花结的SEC迁移空穴体积(在Bio-Sil250SEC柱上的保留时间为5分钟)。抗-HIS-标签蛋白质印迹证实，所述蛋白质在空穴体积峰内。(图15B)融合肽缺失的RSV F三聚体迁移的SEC保留时间为大约6.5分钟。类似地，抗-HIS-标签的蛋白质印迹证实，所述蛋白质在渗入体积三聚体峰内。尽管该空隙峰比渗入体积峰大，但所述抗-HIS蛋白质显示所述两个峰内的RSV F量大致相等。(图15C)这些数据显示，所述RSV F T58C V164C构建体具有经切割的RSV F群，所述RSV F群是单分散三聚体而非玫瑰花结形式，指示所述蛋白质构建体的群是融合前形式。
图16A-C显示含工程改造的半胱氨酸的RSV F蛋白构建体的纯化和分析。图16A显示RSV F N165C/V296C构建体的纯化。就螯合纯化法的流通(FT)、冲洗(W)、洗脱(E)和树脂(R)对柱进行标记。不像含有引入二硫化突变且在昆虫细胞中表达的其它蛋白质构建体，N165C/V296C作为经切割物质分泌，与其在哺乳动物细胞中表达时的情况相似。图16B显示K168C/V296C和M396C/F483CRSV F蛋白构建体的凝胶迁移分析。所示标准的左侧是采用煮沸且有还原剂处理的两种构建体的运行结果。所示标准的右侧是煮沸但不采用还原剂处理(b/nr)或不煮沸且不用还原剂处理(nb/nr)的两种构建体的运行结果。蛋白质印迹显示所述蛋白质的大部分未经切割，但预料之外的是没有形成链间二硫键。未经煮沸的K168C/V296C迁移至三聚体条带，而未经煮沸的M396C/F483C作为单体条带运行。图16C显示采用还原且煮沸处理的K168C/V296C和M396C/F483C RSVF蛋白构建体的考马斯(coomasie)染色凝胶。大约50%的所述物质是经切割的。
图17(A)显示NDV F(融合前)的电子显微镜分析，预期融合前F的圆形头部，伴随少量玫瑰花结样的聚集体。图17(B)显示NDV融合前F形式杆样晶体。对分离的杆进行分析，并且记录约95%完整度至约3.7埃的数据集。图17(C)显示NDV融合前F形式的双金字塔形晶体(50×50×50μm大小)。
图18A-E显示对若干RSV F蛋白构建体的分析。图18A示出的RSV F缺失HRB(Del-HRB)的EM分析显示100%形成玫瑰花结。所述蛋白质在所述空隙/玫瑰花结保留峰中自SEC柱洗脱。图18(B)显示缺失HRB缺失FP(Del-HRB Del-FP)RSV F构建体的分析/纯化。所述蛋白质在空隙和三聚体保留峰中都有发现。图18C显示凝胶分析，其提示在所述空隙和三聚体峰中都存在部分切割的RSV F缺失HRB缺失FP(Del-HRB Del-FP)。图18D显示NDV F(融合前)的EM，其显示预计的融合前F的球形头部，带有少量的玫瑰花结样聚集体。图18E显示来自SEC三聚体峰的RSV F缺失HRB(Del-HRB)包含玫瑰花结样结构、融合后拐杖体和融合前头部样球形物质的不均匀混合物。
图19显示嵌合RSV F/NDV和RSV F/PIV5F蛋白构建体的SDS-PAGE分析。通过SDS-PAGE分析用六种构建体(1:RSV-F NDV HRB缺失融合肽截短体；2:RSV-F NDV HRB截短体；3:RSV-F NDV HRB2缺失融合肽截短体；4:RSV-FNDV HRB2截短体；5:RSV-F PIV5HRB缺失融合肽截短体；6:RSV-F PIV5HRB截短体)之一转染的细胞的上清液。所述构建体工程改造成包含或不含(缺失融合肽)融合肽。所述蛋白质按指示具有NDV HRB，含额外甘氨酸残基作为连接子的NDV HRB(HRB2)，或PIV5HRB。就各构建体而言，观察到经切割的F1蛋白与经加工的F蛋白一致。对各蛋白质进行一升表达。
发明详述
定义
如本文中所用，“融合前”RSV F蛋白是共有一般结构构造的RSV F蛋白，所述一般结构构造更类似于PIV5融合前结构而不是所述RSV F融合后结构。融合前RSV F蛋白包括以下特征：所述HRA区域堆靠于所述RSV F头部区域中的结构域III，和/或所述HRB区域在接近结构域I和II处形成三聚体卷曲螺旋的茎部，而不与所述HRA区域联合形成六螺旋束。
如本文中所用，RSV F蛋白的“融合后构象”是与所述RSV F融合后结构而非所述PIV5融合前结构共有更多一般结构构造的RSV F蛋白。融合后RSV F蛋白包括HRA-HRB六螺旋束。
如本文中所用，融合前RSV F中的HRA区域约为RSV F蛋白(SEQ ID NO:1和2)的残基137-239，并且包含所述融合肽、螺旋α1、螺旋α2、螺旋α3、螺旋α4、链β1和链β2。参见图9B。
如本文中所用，融合后RSV F中的HRA螺旋约由RSV F蛋白(SEQ ID NO:1和2)的残基155-226形成。
如本文中所用，所述融合肽由RSV F蛋白(SEQ ID NO:1和2)的残基137-154定义。如本文中所用，融合前RSV F HRA区域中的螺旋α1约由RSV F蛋白(SEQID NO:1和2)的残基145-157形成。
如本文中所用，融合前RSV F HRA区域中的螺旋α2约由RSV F蛋白(SEQ IDNO:1和2)的残基158-167形成。
如本文中所用，融合前RSV F HRA区域中的螺旋α3约由RSV F蛋白(SEQ IDNO:1和2)的残基168-176形成。
如本文中所用，融合前RSV F HRA区域中的螺旋α4约由RSV F蛋白(SEQ IDNO:1和2)的残基194-212形成。
如本文中所用，融合前RSV F HRA区域中的链β1约由RSV F蛋白(SEQ IDNO:1和2)的残基177-184形成。
如本文中所用，融合前RSV F HRA区域中的链β2约由RSV F蛋白(SEQ IDNO:1和2)的残基185-193形成。
如本文中所用，RSV F中的HRB区域大约是RSV F蛋白(SEQ ID NO:1和2)的残基461-515，并且包括所述HRB螺旋和所述HRB接头。
如本文中所用，RSV F中的HRB螺旋约由RSV F蛋白(SEQ ID NO:1和2)的残基485-515形成。
如本文中所用，RSV F中的HRB接头约由RSV F蛋白(SEQ ID NO:1和2)的残基461-484形成。
如本文中所用，结构域I(DI)约由RSV F蛋白(SEQ ID NO:1和2)的残基26-50和309-401形成。
如本文中所用，结构域II(DII)约由RSV F蛋白(SEQ ID NO:1和2)的残基400-460形成。
如本文中所用，结构域III(DIII)约由RSV F蛋白(SEQ ID NO:1和2)的残基51-98和206-308或残基51-308形成。
如本文所用，“纯化的”蛋白质或多肽是重组或合成生产，或由其天然宿主产生的蛋白质或多肽，其从所述重组或合成生产系统或天然宿主的其它组分中分离出，从而相对于组合物中存在的其它大分子组分，所述蛋白质的含量明显高于未加工制品中存在的量。纯化的蛋白质通常为至少约50%均质，且更优选至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或基本均质。
如本文所用，“基本不含脂质和脂蛋白”述及组合物、蛋白质和多肽时表示，在SDS PAGE凝胶上观察蛋白质和/或多肽(如RSV F多肽)的纯度并用UV280吸收或BCA分析检测总蛋白质含量，并用磷脂酶C试验(Wako,编号433-36201)测量脂质和脂蛋白含量时，在质量上至少约95%不含脂质和脂蛋白。
如本文中所用，“紧密接近”指举例不多于约不多于约不多于约不多于约
Figure BDA0000455572550000114
或不多于约
Figure BDA0000455572550000115
当两个或多个氨基酸残基紧密接近时，所述氨基酸残基的α碳之间的距离不多于约
Figure BDA0000455572550000116
不多于约
Figure BDA0000455572550000117
不多于约
Figure BDA0000455572550000118
不多于约
Figure BDA0000455572550000119
或不多于约
Figure BDA00004555725500001110
适用于本发明的RSV F蛋白的要素在本文中参照具体氨基酸描述，所述氨基酸通过来自A2株系的RSV F蛋白质序列(SEQ ID NO:1)中的氨基酸的位置来鉴别。RSV F蛋白可具有来自A2株系或任何其它所需株系的F蛋白的氨基酸序列。当使用非A2株系的株系源性F蛋白时，所述F蛋白的氨基酸参照所述A2株系F蛋白的编号来编号，必要时插入缺口。这可以通过使任何所需RSV F蛋白与所述A2株系F蛋白比对来完成。优选使用由Corpet,Nucleic Acids Research,1998,16(22):10881-10890公开的算法，使用默认参数(Blossum62符号对照表，缺口开放罚分：12，缺口延伸罚分：2)来进行序列比对。
如本文中描述并示例，测定了RSV F蛋白的融合后形式的
Figure BDA00004555725500001111
x射线晶体结构。通过将所述RSV F融合后x射线晶体结构与融合前和融合后副流感病毒F蛋白的已知结构做比较来生成RSV F蛋白的融合前形式的模型。所述RSV F的融合前形式的模型显示不同于之前的那些融合前RSV F模型的结构特征，并且允许基于结构合理设计稳定化的RSV F融合前形式。
因此，本发明涉及融合前呼吸道合胞病毒F(RSV F)多肽和/或蛋白质，以及包含融合前RSV F多肽和/或蛋白质的免疫原性组合物。本发明还涉及用于诱导免疫应答和/或通过保护性免疫来抵抗RSV的融合前RSV F多肽和/或蛋白质的方法和应用。本发明还涉及编码融合前RSV F多肽和/或蛋白质的核酸。
所述免疫原性组合物通常包含引发中和抗体的融合前RSV F多肽和/或蛋白质。例如，与帕利珠单抗、莫维珠单抗和101F结合相同表位的抗体。
融合前和融合后PIV F结构显示结构域的整体迁移和HRA与HRB的大幅重排。在所述融合前PIV5结构的结构域III中，HRA折叠成三个α螺旋和两个β链，而不是融合后的长HRA螺旋(Yin等，2006)。然而，当比较个体PIV F结构域的融合前和融合后构象时，非重排部分完好叠合。使融合后RSV F结构域在其融合前PIV5F对应物上叠合没有导致较大冲突，并且形成结构域间二硫键的所有半胱氨酸对都定位至彼此接近。因此，通过结合来源于融合后RSV F的x射线晶体结构和融合前PIV5F结构的信息获得的融合前RSV F模型显示出先前仅基于PIV5融合前结构的融合前RSV F同源模型(McLellan等NSMB2010(141))中未显现的特征。所述帕利珠单抗/莫维珠单抗表位的螺旋暴露在所述融合前RSV F三聚体模型的表面上，正如它们在融合后RSV F三聚体x射线晶体结构上一样(图9)。在我们的融合前RSV F模型中，连接β4和HRC(结构域III的部分)的环会阻碍帕利珠单抗或莫维珠单抗接触它们的表位。但是，所述环可能具备足够灵活性以采取其它构象来允许抗体结合(图9B)。
基于所述RSV F融合后x射线晶体结构和所述PIV5融合前结构(Yin等,2006(145))，本文公开的融合前模型显示所述融合后RSV F的延长的HRA螺旋(残基137-212)折叠成与所述PIV5融合前晶体结构相似的链和螺旋。RSV F的融合肽(残基137-154)形成卷曲和螺旋，所述卷曲和螺旋被堆积在所述RSV F融合前头部内。形成四个螺旋，螺旋a1约为残基145-157，螺旋a2约为残基158-167，螺旋a3约为残基168-176而螺旋a4约为残基194-212。形成两条链；链b1约为残基177-184，链b2约为残基185-193(图9)。
融合前构象
本发明包括融合前RSV F多肽和蛋白质，以及含有融合前RSV F多肽和蛋白质的免疫原性组合物。所述RSV F蛋白质和多肽可包含使所述融合前构象稳定或使所述融合后构象失稳的一种或多种氨基酸置换、缺失和/或添加，例如，以二硫键稳定化的融合前RSV F，或通过使所述融合后构象失稳来形成的融合前RSV F。
通过二硫键稳定化
可使用所述RSV F融合前模型作为指导来选择在所述融合前构象中彼此紧密接近，但在所述融合后构象中不再紧密接近的氨基酸残基。此类氨基酸可突变成半胱氨酸残基以允许形成二硫键来稳定所述融合前构象，例如，通过防止所述HRB螺旋与所述HRA螺旋结合，从而防止重折叠成所述融合后构象。
本发明的稳定化的融合前RSV F蛋白可包含在任何两个结构元件之间，或在一个结构元件和所述RSV F蛋白的剩余部分之间，或在三聚体的一个亚基的结构元件和所述相同三聚体的另一个亚基的结构元件之间的二硫键。通常选择一个结构元件中的第一氨基酸和另一不同结构元件中或者在不同单体上相同结构元件中，且在所述融合前模型中仍与第一氨基酸紧密接近的第二氨基酸来用半胱氨酸置换。所述残基(例如，所述α碳)之间的距离可以小于约小于约小于约
Figure BDA0000455572550000133
小于约
Figure BDA0000455572550000134
小于约
Figure BDA0000455572550000135
或小于约
Figure BDA0000455572550000136
所述第一氨基酸和所述第二氨基酸的半胱氨酸置换，以及它们之间的二硫键可以进行模拟。在一些实施方式中，所模拟二硫键的长度不与二硫键的理想认知长度(约
Figure BDA0000455572550000137
)准确匹配。优选地，预计在所述蛋白质中形成二硫键的模拟二硫键长度(硫核间距)为约
Figure BDA0000455572550000138
约
Figure BDA0000455572550000139
或约这取决于结构灵活性。
在一个实施方式中，可通过在第一结构元件引入至少一个半胱氨酸突变，且引入的位置紧密接近第二结构元件或RSV F头部区域剩余部分的至少一个其它半胱氨酸(天然的或引入的)来使融合前RSV F蛋白稳定在所述融合前构象。
在所述引入的半胱氨酸之间形成二硫键，所述二硫键防止形成融合后HRA-HRB六螺旋束。例如，可通过在所述HRA螺旋区域、HRB螺旋区域、所述融合肽、螺旋α1、螺旋α2、螺旋α3、螺旋α4、链β1、链β2、DI、DII或DIII中，并且与不同结构区域(例如，选自所述HRA螺旋区域、HRB螺旋区域、所述融合肽、螺旋α1、螺旋α2、螺旋α3、螺旋α4、链β1、链β2、DI、DII或DIII)中的至少一个其它半胱氨酸(天然的或引入的)紧密接近处引入至少一个半胱氨酸突变，由此形成一个或多个二硫桥以防止形成所述融合后HRA-HRB六螺旋束，来使融合前RSV F蛋白稳定在所述融合前构象。可将所述半胱氨酸引入所述HRB或所述HRB接头以产生半胱氨酸之间的二硫键。在一个实施方式中，可将一个或多个半胱氨酸引入所述HRB接头和螺旋区域(大约是残基452-515)以形成连接所述RSV F头部区域的部分的二硫键。在另一个实施方式中，可在所述HRB接头或螺旋和所述RSV F蛋白的剩余部分之间采用二硫键以使所述蛋白质稳定在所述融合前构象。在一个优选实施方式中，在所述HRB融合前茎部和所述头部“顶端”的DI或DII区域之间形成二硫桥(例如，M396C+F483C)。在一个优选实施方式中，所述融合前RSV F蛋白包含两个半胱氨酸突变，M396C和F483C，由此在所述HRB融合前茎部和所述DI区域之间包含二硫键。
在其它优选实施方式中，在所述HRA区域和DIII区域之间形成二硫桥。例如，所述RSV F蛋白可包含选自下组的氨基酸置换：V56C+V164C、I57C+S190C、T58C+V164C、N165C+V296C、K168C+V296C及其组合。在一个实施方式中，所述融合前RSV F蛋白在所述HRA区域中包含第一半胱氨酸突变，并在所述融合前HRA区域的融合肽、螺旋α1、螺旋α2、螺旋α3、螺旋α4、链β1、链β2，或DIII中包含第二半胱氨酸(天然的或引入的)。在该实施方式中，所述蛋白质在所述第一和第二半胱氨酸之间包含二硫键，所述二硫键防止形成所述融合后HRA-HRB六螺旋束。
在一个实施方式中，所述融合前RSV F蛋白在所述HRB螺旋区域中包含第一半胱氨酸突变，并在DI或DII中包含第二半胱氨酸(天然的或引入的)。在该实施方式中，所述蛋白质在所述第一和第二半胱氨酸之间包含二硫键，所述二硫键防止形成所述融合后HRA-HRB六螺旋束。
在一个实施方式中，所述融合前RSV F蛋白在所述融合肽中包含第一半胱氨酸，并在所述HRA区域、螺旋α1、螺旋α2、螺旋α3、螺旋α4、链β1、链β2或DIII中包含第二半胱氨酸(天然的或引入的)。在该实施方式中，所述蛋白质在所述第一和第二半胱氨酸之间包含二硫键，所述二硫键防止形成所述融合后HRA延长螺旋。
在一个实施方式中，所述融合前RSV F蛋白在所述螺旋α1中包含第一半胱氨酸，并在所述HRA区域、所述融合肽、螺旋α2、螺旋α3、螺旋α4、链β1、链β2或DIII中包含第二半胱氨酸(天然的或引入的)。在该实施方式中，所述蛋白质在所述第一和第二半胱氨酸之间包含二硫键，所述二硫键防止形成所述融合后HRA-HRB六螺旋束。
在一个实施方式中，所述融合前RSV F蛋白在所述螺旋α2中包含第一半胱氨酸，并在所述HRA区域、所述融合肽、螺旋α1、螺旋α3、螺旋α4、链β1、链β2或DIII中包含第二半胱氨酸(天然的或引入的)。在该实施方式中，所述蛋白质在所述第一和第二半胱氨酸之间包含二硫键，所述二硫键防止形成所述融合后HRA-HRB六螺旋束。
在一个实施方式中，所述融合前RSV F蛋白在所述螺旋α3中包含第一半胱氨酸，并在所述HRA区域、所述融合肽、螺旋α1、螺旋α2、螺旋α4、链β1、链β2或DIII中包含第二半胱氨酸(天然的或引入的)。在该实施方式中，所述蛋白质在所述第一和第二半胱氨酸之间包含二硫键，所述二硫键防止形成所述融合后HRA-HRB六螺旋束。
在一个实施方式中，所述融合前RSV F蛋白在所述螺旋α4中包含第一半胱氨酸，并在所述HRA区域、所述融合肽、螺旋α1、螺旋α2、螺旋α3、链β1、链β2或DIII中包含第二半胱氨酸(天然的或引入的)。在该实施方式中，所述蛋白质在所述第一和第二半胱氨酸之间包含二硫键，所述二硫键防止形成所述融合后HRA-HRB六螺旋束。
在一个实施方式中，所述融合前RSV F蛋白在所述链β1中包含第一半胱氨酸，并在所述HRA区域、所述融合肽、螺旋α1、螺旋α2、螺旋α3、螺旋α4、链β2或DIII中包含第二半胱氨酸(天然的或引入的)。在该实施方式中，所述蛋白质在所述第一和第二半胱氨酸之间包含二硫键，所述二硫键防止形成所述融合后HRA-HRB六螺旋束。
在一个实施方式中，所述融合前RSV F蛋白在所述链β2中包含第一半胱氨酸，并在所述HRA区域、所述融合肽、螺旋α1、螺旋α2、螺旋α3、螺旋α4、链β1、DI、DII或DIII中包含第二半胱氨酸(天然的或引入的)。在该实施方式中，所述蛋白质在所述第一和第二半胱氨酸之间包含二硫键，所述二硫键防止形成所述融合后HRA-HRB六螺旋束。
在一个实施方式中，所述融合前RSV F蛋白在所述DI区域中包含第一半胱氨酸突变，并在所述HRB螺旋区域中包含第二半胱氨酸(天然的或引入的)。在该实施方式中，所述蛋白质在所述第一和第二半胱氨酸之间包含二硫键，所述二硫键防止形成所述融合后HRA-HRB六螺旋束。
在一个实施方式中，所述融合前RSV F蛋白在所述DII区域中包含第一半胱氨酸突变，并在所述HRB螺旋区域中包含第二半胱氨酸(天然的或引入的)。在该实施方式中，所述蛋白质在所述第一和第二半胱氨酸之间包含二硫键，所述二硫键防止形成所述融合后HRA-HRB六螺旋束。
在一个实施方式中，所述融合前RSV F蛋白在所述DIII区域中包含第一半胱氨酸突变，并在所述HRA螺旋区域中包含第二半胱氨酸(天然的或引入的)。在该实施方式中，所述蛋白质在所述第一和第二半胱氨酸之间包含二硫键，所述二硫键防止形成所述融合后HRA-HRB六螺旋束。
在其它实施方式中，所述融合前RSV F蛋白在所述HRA螺旋区域、HRB螺旋区域、所述融合肽、螺旋α1、螺旋α2、螺旋α3、螺旋α4、链β1、链β2、DI、DII或DIII区域中包含第一引入的半胱氨酸，并在所述RSV F蛋白的任何其它区域中紧密接近所述引入的半胱氨酸处包含第二半胱氨酸(天然的或引入的)。在该实施方式中，所述蛋白质在所述第一和第二半胱氨酸之间包含二硫键，所述二硫键防止形成所述融合后HRA-HRB六螺旋束。
在一个特定实施方式中，所述融合前RSV F蛋白包含选自下组的两个半胱氨酸突变：V56C+V164C、I57C+S190C、T58C+V164C、N165C+V296C和K168C+V296C及其组合，从而在所述HRA区域和所述DIII区域之间包含二硫桥。在一个实施方式中，所述融合前RSV F蛋白包含两个半胱氨酸突变，V56C和V164C，从而在所述HRA区域和所述DIII区域之间包含二硫桥。在一个实施方式中，所述融合前RSV F蛋白包含两个半胱氨酸突变，I57C和S190C，从而在所述HRA区域和所述DIII区域之间包含二硫桥。
在一个实施方式中，所述融合前RSV F蛋白包含两个半胱氨酸突变，T58C和V164C，从而在所述HRA区域和所述DIII区域之间包含二硫桥。
在一个实施方式中，所述融合前RSV F蛋白包含两个半胱氨酸突变，N165C和T296C，从而在所述HRA区域和所述DIII区域之间包含二硫桥。
在一个实施方式中，所述融合前RSV F蛋白包含两个半胱氨酸突变，K168C和T296C，从而在所述HRA区域和所述DIII区域之间包含二硫桥。
在一个实施方式中，所述融合前RSV F蛋白包含两个半胱氨酸突变，M396C+F483C，从而在所述HRB区域和所述DII区域之间包含二硫桥。
本发明的RSV F融合前蛋白使所述融合前亚基稳定的突变而稳定在所述融合前构象，所述融合前亚基形成三聚体。
在一些实施方式中，本发明的RSV F融合前蛋白是RSV F单体的三聚体，并通过引入不同单体的半胱氨酸残基之间的一个或多个二硫键使融合前构象稳定。
RSV单体的示例性氨基酸序列如下示出(SEQ ID NO:4-9)，所述氨基酸序列包含引入的半胱氨酸残基来使所述融合前构象稳定。所示序列包含信号肽和HIS标签(GGSAGSGHHHHHH;SEQ ID NO:3)。本发明的融合前RSV F蛋白可包含如下示出的任何氨基酸序列，包含或不含所示信号肽和/或HIS标签。
>RSV F HRA二硫化1(V56C+V164C)(SEQ ID NO:4)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSCITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGECNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNGGSAGSGHHHHHH
>RSV F HRA二硫化2(I57C+S190C)(SEQ ID NO:5)
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>RSV F HRA二硫化3(T58C+V164C)(SEQ ID NO:6)
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>RSV F HRA二硫化4(N165C+V296C)(SEQ ID NO:7)
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>RSV F HRA二硫化5(K168C+V296C)(SEQ ID NO:8)
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>RSV F HRB二硫化(M396C+F483C)(SEQ ID NO:9)
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融合后RSV F的失稳
所示RSV F融合后结构的主要特征是所述茎部区域中的六螺旋束。在所述融合后构象中，所述三个HRA螺旋和所述三个HRB螺旋形成非常稳定的六螺旋束。产生本发明的稳定化融合前RSV F蛋白的选择性方案是，通过使所述融合后六螺旋束失稳和/或防止所述六螺旋束形成(例如，通过使HRB螺旋缺失，引入点突变，添加糖基化或其它修饰位点)来进行。
通过使所述HRA螺旋或所述HRB螺旋缺失可防止所述六螺旋束形成。
优选地，使所述HRB螺旋区域缺失或使所述区域突变以防止形成所述融合后构象。形成所述RSV F融合前构象的茎部的HRB区域紧密接近病毒包膜，并可能不包含重要的中和表位。使所述HRB螺旋(残基484和C末端)缺失可防止所述RSV F蛋白从所述融合前状态重折叠成所述融合后状态。
本发明的稳定化的融合前RSV F蛋白可包含所述HRB区域已缺失或突变的RSV胞外域序列，并优选剩余胞外域序列另包含其它突变或缺失。例如，所述RSV胞外域可包含一个或多个引入的半胱氨酸以产生二硫桥(所述二硫桥如本文所述使所述融合前结构稳定)、突变的或缺失的弗林蛋白酶切割位点、突变的或缺失的融合肽序列，或之前在WO2011/008974中描述的其它突变，所述文献通过引用全文纳入本文。所述RSV胞外域可以是天然发生的RSV F蛋白的胞外域，或者其可包含除所述HRA或HRB区域的缺失和/或突变以外的突变。
在一个实施方式中，所述稳定化的融合前RSV F蛋白包含天然发生的RSVF蛋白的胞外域，其中，所述HRB区域缺失并且存在一个或多个突变，所述突变防止在一个或两个所述弗林蛋白酶切割位点(即，SEQ ID NO:1和2的氨基酸109和136)的切割。
在一个实施方式中，所述稳定化的融合前RSV F蛋白包含天然发生的RSVF蛋白的胞外域，其中，所述HRB区域是缺失的且所述融合肽是突变的(SEQ IDNO:1或2的氨基酸137和153)。例如，此区域可完全或部分缺失。
在另一个实施方式中，所述稳定化的融合前RSV F蛋白包含野生型RSV胞外域，其中所述HRB区域和所述融合肽是完全或部分缺失的。
在另一个实施方式中，所述稳定化的融合前RSV F蛋白包含野生型RSV胞外域，其中，所述HRB区域是缺失的并且添加了寡聚化序列。存在寡聚序列时，优选三聚序列。本领域熟知合适的寡聚序列，包括例如：酵母GCN4亮氨酸拉链蛋白的卷曲螺旋、T4噬菌体次要纤维蛋白(fibritin)的三聚化序列（“折叠子(foldon)”）和流感HA的三聚体结构域。
在另一个实施方式中，所述稳定化的融合前RSV F蛋白包含野生型RSV胞外域，其中所述HRB区域是缺失的，且所述p27区域是突变的(SEQ ID NO:1或2的氨基酸110-136)，包括所述p27区域的完全或部分缺失。例如，所述p27区域(约为SEQ ID NO:1或2的氨基酸110-136)中的赖氨酸和/或精氨酸残基可被取代或缺失。在另一个实施方式中，所述稳定化的融合前RSV F蛋白包含野生型RSV胞外域，其中所述HRB区域是缺失的，并且添加提供蛋白酶切割位点的氨基酸序列。
通常，提供蛋白酶切割位置的氨基酸序列位于所述跨膜结构域氨基末端（SEQ ID NO:1或2的氨基酸525）的约60个氨基酸、约50个氨基酸、约40个氨基酸、约30个氨基酸、约20个氨基酸、约10个氨基酸内，或基本与之毗邻。
下文示出其中缺失所述融合肽和HRB以使所述融合前构象稳定的RSV F单体的示例性氨基酸序列(SEQ ID NO:10)。所示序列包含信号肽和HIS标签(GGSAGSGHHHHHH;SEQ ID NO:3)。本发明的融合前RSV F蛋白可包含如下示出的氨基酸序列，包含或不含所示信号肽和/或HIS标签。
>RSV F缺失HRB融合肽缺失HIS(SEQ ID NO:10)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSGGSAGSGHHHHHH
本发明的稳定化的融合前RSV F蛋白还可通过工程改造点突变或引入糖基化位点(例如，AsnXaaSer/Thr;SEQ ID NO:11)或其它修饰位点(例如，脂化、磷酸化)来阻碍所述HRA或HRB区域(分别大约是残基154-212和484-513)形成六螺旋束而形成。可将通过静电或位阻干扰六螺旋束形成的糖基化位点或其它翻译后修饰位点或点突变引入所述HRA或HRB螺旋区域。糖基化能干扰六螺旋束形成并防止所述RSV F构建体翻转成所述融合后构象。
本发明的稳定化的融合前RSV F蛋白可包含一个或多个突变，所述突变在所述HRA或HRB螺旋区域中形成一个或多个糖基化位点。所述RSV F蛋白可包含在所述HRA或HRB螺旋区域中引入糖基化位点的那些以外的突变或缺失。
在一个实施方式中，所述RSV F蛋白包含S173N和N175T突变，并且所述融合前RSV F蛋白在现有丝氨酸残基173上具有糖基化位点。
在另一个实施方式中，所述RSV F蛋白包含A177T突变，从而所述融合前RSV F蛋白在现有残基N175上具有糖基化位点。
在另一个实施方式中，所述RSV F蛋白包含G184N和S186T突变，并且所述融合前RSV F蛋白在现有残基G184上具有糖基化位点。
含相应RSV F表位的嵌合型融合前F结构
本发明还涉及嵌合型融合前F蛋白，其包含RSV F蛋白的中和表位。所述嵌合型融合前F蛋白通常包含源自不同病毒的稳定化的F蛋白，所述病毒例如副流感病毒(PIV1、PIV2、PIV3、PIV4、PIV5)、新城疫病毒(NDV)、仙台病毒(SeV)、亨德拉病毒、尼帕病毒(NiV)、人偏肺病毒或禽偏肺病毒，其中，暴露在所述蛋白质表面上的部分由对应的RSV F部分置换。优选地，所述部分包含RSV F的中和表位。
例如，可将稳定在所述融合前构象(例如，凭借经C末端与所述HRB区域融合的GCN三聚体结构域)的任何非RSV(例如，副流感病毒或偏肺病毒)F蛋白用作所述蛋白质(即，未经切割的NDV F-GCN融合蛋白质)的模板。例如，所述嵌合型F蛋白构建体中可使用由Yin等,2006(145)描述的PIV5融合前F蛋白的SV5，或者由Swanson等,2010(146)描述的NDV融合前F。然后，可使所述模板突变以引入已知的或可能的RSV F中和表位。因此，所述蛋白质的融合前F结构可显示RSV F的中和表位但无非中和表位。该构建体的明显优势在于，其不会引起非中和RSV F抗体。
本发明的融合前嵌合体蛋白可包含副流感病毒F蛋白，其稳定在经突变以引入RSV F中和表位的融合前构象。所述副流感病毒F蛋白可以是任何副流感病毒F蛋白，优选是由Yin等,2006(147)描述的PIV5融合前F蛋白的SV5，或由Swanson等,2010(146)描述的NDV融合前F。可通过突变引入的示例性中和表位包括表1中公开的表位。例如，可将形成由表1中所列抗体识别的表位的氨基酸引入稳定在融合前构象的非RSV F蛋白(例如，副流感病毒F蛋白或偏肺病毒F蛋白)的对应位置(例如，通过结构比较如基于结构的比对所鉴定)。例如，所述嵌合F蛋白可包含RSV F位点A表位或位点C表位。在特定的示例中，所述嵌合F蛋白包含一个或多个RSV F残基，所述RSV F残基选自位于RSV F262-276位的氨基酸残基。在另一个特定示例中，所述嵌合F蛋白包含一个或多个RSV F残基，所述RSV F残基选自RSV F429-447位的氨基酸残基。
表1RSV Fa的中和表位
Figure BDA0000455572550000231
a该表中不包括使用肽结合或肽抑制的研究结果。
b位点基于Beeler等,1989(156)的竞争与交叉中和分析。
c包括逃逸突变，前提是所述逃逸突变是抗体耐受性株系中的唯一突变。
dFab19和19是不相关的抗体。其相似名称属于巧合。
e帕利珠单抗
f包括允许完整加工、完整融合活性且单克隆抗体结合降至低于野生型15%的完整重组RSV F中的工程改造突变。g莫维珠单抗
h包括来自肽-Fab复合物结构中肽的残基，前提是其侧链或主链原子与所述抗体有明显联系。通过其它技术已确证了这些结构研究中观察到的所述肽-抗体相互作用的生物学显著性。
在一个实施方式中，本发明的嵌合F蛋白包含RSV F的HRA区域(残基137-212)以取代NDV-GCN融合前F的等同HRA残基。因此，表达的融合前F蛋白(NDV-GCN)在所述融合前F头部的顶端含有可能的中和表位位点(RSV F的HRA区域)，允许引起中和RSV F抗体。必要时，可添加额外的中和表位，例如所述莫维珠单抗表位或所述101F表位。
下文示出嵌合蛋白的示例性氨基酸序列(SEQ ID NO:13)，所述嵌合蛋白包含经突变以囊括RSV F HRA氨基酸序列的融合前NDV F。所示序列包含信号肽、GCN三聚化结构域和HIS标签。本发明的嵌合融合前F蛋白可包含下文示出的氨基酸序列，包含或不含所述信号肽和/或GCN三聚化结构域和/或HIS标签。
NDV RSV HRA融合前(下划线部分是RSV HRA，斜体部分是C-末端GCN三聚化结构域和HIS6(SEQ ID NO:12)亲和纯化标签)(SEQ ID NO:13)。
MGSRSSTRIPVPLMLTVRVMLALSCVCPTSALDGRPLAAAGIVVTGDKAVNIYTSSQTGSIIIKLLPNMPKDKEACAKAPLEAYNRTLTTLLTPLGDSIRRIQESVTTSGGGKQGRLIGAIIGFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKS ALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCIKITQQVGVELNLYLTELTTVFGPQITSPALTQLTIQALYNLAGGNMDYLLTKLGVGNNQLSSLISSGLITGNPILYDSQTQLLGIQVTLPSVGNLNNMRATYLETLSVSTTKGFASALVPKVVTQVGSVIEELDTSYCIETDLDLYCTRIVTFPMSPGIYSCLSGNTSACMYSKTEGALTTPYMTLKGSVIANCKMTTCRCADPPGIISQNYGEAVSLIDRQSCNILSLDGITLRLSGEFDATYQKNISIQDSQVIVTGNLDISTELGNVNNSISNALDKLEESNSKLDKVEDKIEEILSKIYHIENEIARIKKLIGEAGGPLVPRGSHHHHHH
RSV F糖蛋白
RSV的F糖蛋白通过病毒包膜和宿主细胞质膜之间的融合指导病毒穿入。其为I型单次跨膜整合蛋白，具有四个一般结构域：N末端ER-移位信号序列(SS)、胞外域(ED)、跨膜结构域(TM)和胞质尾部(CT)。CT包含单一棕榈酰化半胱氨酸残基。RSV分离物之间F蛋白的序列高度保守，但不断进化(7)。与大多数副粘病毒不同，RSV中的F蛋白可独立于其它病毒蛋白介导进入和多核体形成(其它副粘病毒中通常除F以外还需要HN)。
hRSV F的mRNA翻译为称作F0的574氨基酸前体蛋白，其在N末端包含信号肽序列，该序列在内质网中由信号肽酶移除。转运高尔基体中细胞蛋白酶（具体为弗林蛋白酶）在两个位置（氨基酸109/110和136/137）切割F0，移除短糖基化干扰序列并产生两个亚基，称为F1（约50kDa;C末端;残基137-574）和F2（约20kDa;N末端;残基1-109）（参见例如图4A）。F1在N端包含疏水性融合肽以及两个疏水性七肽重复区（HRA和HRB）。HRA靠近所述融合肽，HRB靠近所述跨膜结构域（参见例如图4A）。所述F1-F2异源二聚体在病毒粒子中组装为同源三聚体。
RSV以单一血清型存在，但具有两个抗原亚组：A和B。所述两组的F糖蛋白约90%相同。所述A亚组、所述B亚组或两组的组合或混合可用于本发明。所述A亚组的示例序列为SEQ ID NO:1（A2株系；GenBank GI:138251;Swiss ProtP03420），所述B亚组的示例序列为SEQ ID NO:2（18537株系；GI:138250;SwissProt P13843）。SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2均为574氨基酸序列。A2株系中的信号肽为氨基酸1-21，但18537株系中信号肽为1-22。两个序列中，所述TM结构域来自约氨基酸530-550，但或者报道为525-548。
SEQ ID NO:1
Figure BDA0000455572550000251
SEQ ID NO:2
Figure BDA0000455572550000252
Figure BDA0000455572550000261
本发明可使用任何所需的RSV F氨基酸序列，如氨基酸序列SEQ ID NO:1或2，或与SEQ ID NO:1或2有相同性的序列。通常其与SEQ ID NO:1或2有至少75%相同性，如与SEQ ID NO:1或2有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%相同性。所述序列可天然地存在于RSV中。
本发明使用全部或部分F蛋白胞外域时，其可包括：
(i)含SEQ ID NO:1的约氨基酸22-525的多肽。
(ii)含SEQ ID NO:2的约氨基酸23-525的多肽。
(iii)含与(i)或(ii)有至少75%相同性（如至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%相同性）的氨基酸序列的多肽。
(iv)含(i)、(ii)或(iii)的片段的多肽，其中所述片段含至少一种F蛋白表位。所述片段通常至少约100个氨基酸长度，如至少约150、至少约200、至少约250、至少约300、至少约350、至少约400、至少约450个氨基酸长度。
所述胞外域可为具有或没有所述信号肽的F0形式，或可包括彼此结合的两种分离的肽链（如F1亚基和F2亚基），例如所述亚基可通过二硫桥连接。因此，所述胞外域中可缺失约氨基酸101-约氨基酸161的全部或部分如氨基酸110-136。因此全部或部分所述胞外域可包括：
(v)第一肽链和与所述第一多肽链结合的第二肽链，其中所述第一肽链含与SEQ ID NO:1的约氨基酸22-约氨基酸101或SEQ ID NO:2的约氨基酸23-约氨基酸101有至少75%相同性（如至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%或甚至100%相同性）的氨基酸序列，且所述第二肽链含与SEQ ID NO:1的约氨基酸162-约525或SEQ ID NO:2的约氨基酸162–525有至少75%相同性（如至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%或甚至100%相同性）的氨基酸序列。
(vi)第一肽链和与所述第一多肽链结合的第二肽链，其中所述第一肽链含包括SEQ ID NO:1的约氨基酸22-约氨基酸101或SEQ ID NO:2的约氨基酸23-约氨基酸109的片段的氨基酸序列，且所述第二肽链含SEQ ID NO:1的约氨基酸162-约氨基酸525或SEQ ID NO:2的约氨基酸161-约氨基酸525的片段。所述片段其一或两者包括至少一个F蛋白表位。所述第一肽链中的片段通常为至少20个氨基酸长度，如至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80个氨基酸长度。所述第二肽链中的片段通常为至少100个氨基酸长度，如至少150、至少200、至少250、至少300、至少350、至少400、至少450个氨基酸长度。
(vii)通过弗林蛋白酶消化(i)、(ii)、(iii)或(iv)可获得的分子。
因此本发明所用的氨基酸序列可天然存在于RSV F蛋白中（如缺失约为SEQ ID NO:1或2的氨基酸522-574的TM和CT的可溶性RSV F蛋白），和/或其相对天然RSV序列可具有一种或多种（如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30种）单一氨基酸突变（插入、缺失或替换）。例如，已知突变F蛋白消除其弗林蛋白酶切割序列，从而阻止胞内加工。在某些实施方式中，所述RSV F蛋白缺失TM和CT（约为SEQ ID NO:1或2的氨基酸522-574）并相对天然RSV序列含有一种或多种（如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30种）单一氨基酸突变（插入、缺失或替换）。
弗林蛋白酶切割、胰蛋白酶切割和融合肽突变
必要时，融合后RSV F多肽或蛋白质可包含一个或多个突变，例如，防止在一个或两个所述弗林蛋白酶切割位点(即，SEQ ID NO:1和2的氨基酸109和136)切割的突变，防止切割或引入胰蛋白酶切割位点的突变，p27区域中的突变，和/或所述融合肽中的突变。此类突变可阻止所述可溶性多肽或蛋白的聚集并因此有助于纯化，如果所述RSV F蛋白在细胞表面表达如由病毒复制子表达（如α病毒复制子颗粒），或如果所述RSV F蛋白是病毒样颗粒的组分，所述突变可阻止细胞-细胞的融合。
合适的弗林蛋白酶切割突变的示例包括SEQ ID NO:1或2氨基酸残基106-109替换为RARK（SEQ ID NO:14）、RARQ（SEQ ID NO:15）、QAQN（SEQID NO:16）或IEGR（SEQ ID NO:17）。或者或此外，SEQ ID NO:1或2的氨基酸残基133-136可替换为RKKK(SEQ ID NO:18)、ΔΔΔR、QNQN(SEQ ID NO:19)、QQQR(SEQ ID NO:20)或IEGR(SEQ ID NO:17)。（Δ表示所述氨基酸残基缺失。）必要时，这些弗林蛋白酶切割突变可与本文所述其他突变如胰蛋白酶切割突变和融合肽突变相组合。
合适的胰蛋白酶切割突变示例包括SEQ ID NO:1或2的约101位-161位之间的任何赖氨酸或精氨酸残基的缺失，或任何所述赖氨酸或精氨酸残基被非赖氨酸或精氨酸的氨基酸替换。例如，所述p27区域（SEQ ID NO:1或2的约氨基酸110-136）中的赖氨酸和/或精氨酸残基可被替代或缺失，包括所述p27区域全部或部分的缺失。
必要时，可以任何联合方式联合本文所述的突变。例如，弗林蛋白酶突变可与所述融合肽区域的部分或全部缺失和/或与所述HRA或HRB螺旋区域的缺失联合。
在上述突变如弗林蛋白酶切割和融合肽突变以外，补充或者替换地，可溶性RSV F多肽或蛋白质，例如缺失跨膜区域和胞质尾部，或缺失HRA和HRB，或半胱氨酸突变的那些可包含一种或多种寡聚序列。存在寡聚序列时，优选三聚序列。本领域熟知合适的寡聚序列，包括例如：酵母GCN4亮氨酸拉链蛋白的卷曲螺旋、T4噬菌体次要纤维蛋白(fibritin)的三聚化序列（“折叠子(foldon)”）和流感HA的三聚体结构域。这些和其他合适的寡聚序列在本文中更详细地描述。
在具体实施方式中，所述RSV F多肽或蛋白的羧基末端序列起始于480位，其为
(GCN)PLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNDKIEEILSKIYHIENEIARIKKLIGE(SEQ ID NO:21)
(HA)PLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNEKFHQIEKEFSEVEGRIQDLEK(SEQ IDNO:22)
(理想化的螺旋)PLVFPSDEFDASISQINEKINQILAFIRKIDELLHNIN(SEQ ID NO:23)
(短折叠子)
PLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNGSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL(SEQID NO:24);或
(长折叠子)
PLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNNKNDDKGSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL(SEQ ID NO:25)
必要时，含有跨膜区域的RSV F多肽或蛋白质可包含添加的氨基酸序列来提供蛋白酶切割位点。这种类型的RSV F多肽或蛋白可通过在细胞表面表达而生成，并在用合适的蛋白酶从细胞表面切割后以可溶形式回收。提供蛋白酶切割位置的氨基酸序列通常位于所述跨膜结构域氨基末端（SEQ ID NO:1或2的氨基酸525）的约60个氨基酸、约50个氨基酸、约40个氨基酸、约30个氨基酸、约20个氨基酸、约10个氨基酸内，或基本与之毗邻。本领域熟知许多可被市售蛋白酶切割的合适氨基酸序列。例如，凝血酶切割序列LVPR(SEQ ID NO:26)、Xa因子切割序列IEGR(SEQ ID NO:17)，而肠激酶切割序列DDDDK(SEQ IDNO:27)。这些氨基酸序列可导入RSV F多肽。
按照本发明使用的免疫原性多肽通常经分离或纯化。因此，其不与通常天然存在（若适用）的分子结合。例如，本发明使用的F蛋白不采用RSV病毒粒的形式（尽管其可为人工病毒粒的形式，如病毒体或VLP）。
通常通过在重组宿主系统中表达来制备多肽。尽管可使用任何合适的方法，通常是通过编码所述胞外域的重组构建体在合适的重组宿主细胞中的表达来生产这些多肽如RSV胞外域。合适的重组宿主细胞包括例如，昆虫细胞（如埃及伊蚊(Aedes aegypti)、苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)、家蚕蛾(Bombyxmori)、果蝇(Drosophila melanogaster)、草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)和粉纹夜蛾(Trichoplusia ni）)、哺乳动物细胞（如人、非人灵长类、马、牛、羊、狗、猫和啮齿类（如仓鼠））、禽类细胞（如鸡、鸭、鹅）、细菌（如大肠杆菌(E.coli)、枯草杆菌(Bacillus subtilis)和链球菌属(Streptococcus spp.)）、酵母细胞（如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、白色念珠菌(Candida albicans)、麦芽糖假丝酵母(Candida maltosa)、多形汉森酵母(Hansenual polymorpha)、脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、季也蒙毕赤酵母(Pichia guillerimondii)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)和解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)）、四膜虫细胞（如嗜热四膜虫(Tetrahymena thermophila)）或其组合。本领域熟知许多合适的昆虫细胞和哺乳动物细胞。合适的昆虫细胞包括例如，Sf9细胞、Sf21细胞、Tn5细胞、Schneider S2细胞和High Five细胞（源自亲本粉纹夜蛾BTI-TN-5B1-4细胞系的克隆分离物（英杰公司(Invitrogen)））。合适的哺乳动物细胞包括例如，中华仓鼠卵巢(CHO)细胞、人胚胎肾细胞（HEK293细胞，通常由剪切的腺病毒5型DNA转化成）、NIH-3T3细胞、293-T细胞、Vero细胞、HeLa细胞、PERC.6细胞（ECACC保藏号96022940）、Hep G2细胞、MRC-5（ATCC CCL-171）、WI-38（ATCC CCL-75）、胎猕猴肺细胞细胞（ATCC CL-160）、Madin-Darby牛肾（“MDBK”）细胞、Madin-Darby狗肾(“MDCK”)细胞（如MDCK(NBL2)、ATCC CCL34；或MDCK33016、DSM ACC2219）、幼仓鼠肾(BHK)细胞如BHK21-F、HKCC细胞等。合适的禽类细胞包括例如，鸡胚胎干细胞（如
Figure BDA0000455572550000291
细胞）、鸡胚胎成纤维细胞、鸡胚胎生殖细胞、鸭细胞（如，例如在Vaccine27:4975-4982(2009)和WO2005/042728中描述的AGE1.CR和AGE1.CR.pIX细胞系（专业生物基因公司(ProBioGen)））、EB66细胞等。
合适的昆虫细胞表达系统如杆状病毒系统为本领域技术人员已知，描述于例如Summers和Smith,Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No.1555(1987)。杆状病毒/昆虫细胞表达系统的材料和方法可以药盒形式购自加利福尼亚州圣迭戈的英杰公司等。禽类细胞表达系统也为本领域技术人员已知，描述于例如美国专利号5,340,740;5,656,479;5,830,510;6,114,168;和6,500,668;欧洲专利号EP0787180B;欧洲专利申请号EP03291813.8;WO03/043415;和WO03/076601。相似地，细菌和哺乳动物细胞表达系统也为本领域已知，描述于例如Yeast Genetic Engineering（《酵母遗传工程》）(Barr等编著，1989)伦敦，巴特沃思公司（Butterworths）。
编码融合前RSV F蛋白的重组构建体可用常规方法制备在合适的载体中。昆虫或哺乳动物细胞中用于重组蛋白表达的许多合适载体为本领域熟知且常用。合适的载体可含许多组分，包括但不限于以下一种或多种：复制起点；可选的标记基因；一种或多种表达控制元件如转录控制元件（如启动子、增强子、终止子），和/或一种或多种翻译信号；和选择的宿主细胞（如哺乳动物起源的或来自异源哺乳动物或非哺乳动物物种）中用于靶向分泌途径的信号序列或前导序列。例如，为了在昆虫细胞中表达，使用合适的杆状病毒表达载体如pFastBac（英杰公司（Invitrogen））生产重组杆状病毒颗粒。所述杆状病毒颗粒经扩增，用于传染昆虫细胞以表达重组蛋白。为了在哺乳动物细胞中表达，使用会驱动所述构建体在所需哺乳动物宿主细胞（如中华仓鼠卵巢细胞）中表达的载体。
融合前RSV F蛋白多肽可用任何合适的方法纯化。例如，本领域已知通过免疫亲和层析纯化融合前RSV F多肽的方法。Ruiz-Arguello等,J.Gen.Virol.,85:3677-3687(2004)。本领域已熟知纯化所需蛋白的合适方法，包括沉淀和各种类型的色谱如疏水相互作用、离子交换、亲和、螯合和尺寸排阻。可用两种或更多这些或其它合适方法实现合适的纯化方案。必要时，所述融合前RSV F蛋白多肽可包括有助于纯化的“标记”，如表位标记或HIS标记。此类标记的多肽可通过螯合层析或亲和层析方便地从例如条件培养基中纯化。
所述融合前RSV F多肽也可通过在对象细胞中表达其编码核酸而原位生成。例如，通过表达本文所述的自复制RNA。
除了所述融合前RSV序列，多肽可包括额外序列。例如，多肽可包括有助于纯化的序列（如聚His序列）。相似地，为了表达的目的，F蛋白的天然前导肽可替换为不同的肽。例如，参考文献6使用蜂毒素前导肽取代该天然肽。
自复制RNA
本文所述的融合前RSV-F多肽可通过在对象细胞中表达编码该多肽的重组核酸来生产。能给予对象以引起融合前RSV-F多肽生产的优选核酸为自复制RNA分子。本发明的自复制RNA分子是基于RNA病毒的基因组RNA，但缺失编码一种或多种结构蛋白的基因。所述自复制RNA分子能经翻译生成所述RNA病毒的非结构蛋白和自复制RNA编码的异源蛋白。
所述自复制RNA通常含至少一种或多种选自下组的基因：病毒复制酶、病毒蛋白酶、病毒解旋酶和其他非结构性病毒蛋白，还含有5’-和3’-末端顺式激活复制序列和（如果需要）编码所需氨基酸序列（如蛋白质、抗原）的异源序列。引导所述异源序列表达的亚基因组启动子可包括在所述自复制RNA中。必要时，所述异源序列可与所述自复制RNA中的其他编码区域在框内融合和/或可在内部核糖体进入位点（IRES）的控制下。
本发明的自复制RNA分子可设计成所述自复制RNA分子不能诱导感染性病毒颗粒生成。这可通过例如省略所述自复制RNA中病毒颗粒生成所必需的一种或多种结构蛋白编码病毒基因来实现。例如，所述自复制RNA分子基于α病毒如辛德毕斯病毒（SIN）、西门利克森林病毒和委内瑞拉马脑炎病毒（VEE）时，可省略一种或多种编码病毒结构蛋白如衣壳或包膜糖蛋白的基因。必要时，本发明的自复制RNA分子可设计成诱导减毒或强毒的感染性病毒颗粒生成，或生成能进行单轮后续感染的病毒颗粒。
自复制RNA分子在甚至无任何蛋白下递送到脊椎动物细胞时，能通过其自身（或其自身的反义拷贝）转录导致生成多种子RNA。所述自复制RNA递送到细胞后能直接翻译，且该翻译提供RNA依赖性RNA聚合酶，所述酶然后从该递送RNA中生成转录本。因此所递送RNA引起多个子RNA生成。这些转录本相对所递送RNA为反义且可自身翻译以提供基因产物的原位表达，或可转录以进一步提供与该递送RNA同义的转录本，其经翻译提供编码的RSV F多肽的原位表达。
实现自复制的一种合适系统为使用基于α病毒的RNA复制子。这些+链复制子在递送到细胞后翻译以得到复制酶（或复制酶-逆转录酶）。这些复制酶翻译为自切割提供复制复合物的聚蛋白，所述复合物形成所述正链(+strand)递送RNA的基因组负链(－strand)拷贝。这些负链转录本自身可转录以进一步得到所述正链亲本RNA的拷贝也可得到编码所述RSV-F多肽的亚基因组转录本。所述亚基因组转录本的翻译从而引起所述感染细胞原位表达RSV-F多肽。合适的α病毒复制子可使用来自辛德毕斯病毒、西门利克森林病毒、东部马脑炎病毒、委内瑞拉马脑炎病毒等的复制酶。
因此，优选的自复制RNA分子编码(i)可从所述自复制RNA分子转录RNA的RNA依赖性RNA聚合酶和(ii)RSV-F多肽。所述聚合酶可为α病毒复制酶例如包括α病毒蛋白nsP4。
尽管除了所述非结构复制酶聚蛋白，天然α病毒基因组还编码结构病毒体蛋白，但本发明中基于α病毒的自复制RNA分子优选不编码α病毒结构蛋白。因此所述自复制RNA可引起细胞中基因组RNA拷贝的自我生成，但不引起含RNA的α病毒病毒体生成。不能生成这些病毒体说明不同于野生型α病毒，自复制RNA分子自身不能以感染形式永存。野生型病毒永存必需的α病毒结构蛋白在本发明的自复制RNA中缺失，且他们的位置被编码所需基因产物的基因占据，从而所述亚基因组转录本编码所需要的基因产物而不是所述结构α病毒病毒体蛋白。
因此，本发明有用的自复制RNA分子可具有两个开放阅读框。第一(5')开放阅读框编码复制酶；第二(3')开放阅读框编码RSV-F多肽。在一些实施方式中，所述RNA可具有额外的（下游）开放阅读框如编码其它需要的基因产物。自复制RNA分子可具有与所编码复制酶相容的5'序列。
在一个方面，所述自复制RNA分子源自或基于α病毒。在其它方面，所述自复制RNA分子源自或基于非α病毒的病毒，优选正链RNA病毒，更优选小RNA病毒、黄病毒、风疹病毒、瘟病毒、丙型肝炎病毒、萼状病毒或冠状病毒。合适的野生型α病毒序列熟知且可从序列保藏机构如马里兰州罗克维尔的美国典型培养物保藏中心（American Type Culture Collection）获得。合适α病毒的代表性示例包括奥拉病毒(ATCC VR-368)、贝巴鲁病毒(ATCC VR-600、ATCCVR-1240)、犰狳病毒(ATCC VR-922)、基孔肯雅病毒(ATCC VR-64、ATCCVR-1241)、东方马脑脊髓炎病毒（Eastern equine encephalomyelitis virus）(ATCCVR-65、ATCC VR-1242)、摩根堡病毒(ATCC VR-924)、格塔病毒(ATCCVR-369、ATCC VR-1243)、克泽拉格齐病毒(ATCC VR-927)、马亚罗（Mayaro）(ATCC VR-66)、马亚罗病毒(ATCC VR-1277)、米德尔堡病毒（Middleburg）(ATCC VR-370)、穆坎博病毒(ATCC VR-580、ATCC VR-1244)、恩杜姆病毒（Ndumu）(ATCC VR-371)、皮春纳病毒(ATCC VR-372、ATCC VR-1245)、罗斯河病毒(ATCC VR-373、ATCC VR-1246)、西门利克森林病毒(ATCC VR-67、ATCC VR-1247)、辛德比斯病毒(ATCC VR-68、ATCC VR-1248)、托纳特(ATCCVR-925)、特里尼蒂病毒(ATCC VR-469)、乌纳病毒(ATCC VR-374)、委内瑞拉马脑脊髓炎病毒(ATCC VR-69、ATCC VR-923、ATCC VR-1250ATCCVR-1249、ATCC VR-532)、西马脑脊髓炎病毒(ATCC VR-70、ATCC VR-1251、ATCC VR-622、ATCC VR-1252)、沃达罗河病毒(ATCC VR-926)和Y-62-33(ATCC VR-375)。
所述自复制RNA可与递送系统关联。所述自复制RNA可用或不用佐剂一起递送。
RNA递送系统
本发明的自复制RNA适于各种方式递送，例如裸RNA递送或与脂质、聚合物或其它促进进入细胞的化合物联用。可使用任何合适的技术将本发明的自复制RNA分子导入靶细胞或对象，所述技术例如通过直接注射、微注射、电穿孔、脂质转染、生物裂解（biolystics）等。所述自复制RNA分子还可通过受体介导的胞吞作用导入细胞。参见例如美国专利号6,090,619；Wu和Wu，J.Biol.Chem.，263:14621(1988)；和Curiel等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:8850(1991)。例如，美国专利号6,083,741公开了通过连接核酸与聚阳离子部分（如具有3-100个赖氨酸残基的聚L赖氨酸）来将外源核酸导入哺乳动物细胞，所述聚阳离子部分自身偶联整联蛋白受体结合部分（如具有序列Arg-Gly-Asp的环肽）。
本发明的自复制RNA分子可通过两亲物递送入细胞。参见例如，美国专利号6,071,890。核酸分子通常可形成具有阳离子两亲物的复合物。与该复合物接触的哺乳动物能容易地将其吸收。
所述自复制RNA可作为裸露RNA递送（如仅作为RNA水溶液），但为了增强进入细胞以及随后的细胞间效应，所述自复制RNA优选与递送系统如微粒或乳液递送系统组合给予。本领域技术人员熟知大量递送系统。所述递送系统包括例如基于脂质体的递送（Debs和Zhu(1993)WO93/24640；Mannino和Gould-Fogerite(1988)BioTechniques6(7):682-691；Rose美国专利号5,279,833；Brigham(1991)WO91/06309；和Felgner等(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA84:7413-7414），以及病毒载体的应用（如腺病毒（综述参见例如Berns等(1995)Ann.NY Acad.Sci.772:95-104；Ali等(1994)Gene Ther.1:367-384；和Haddada等(1995)Curr.Top.Microbiol.Immunol.199(Pt3):297-306）、乳头瘤病毒、逆转录病毒（参见例如Buchscher等(1992)J.Virol.66(5)2731-2739；Johann等(1992)J.Virol.66(5):1635-1640(1992)；Sommerfelt等,(1990)Virol.176:58-59；Wilson等(1989)J.Virol.63:2374-2378；Miller等,J.Virol.65:2220-2224(1991)；Wong-Staal等,PCT/US94/05700，和Rosenburg和Fauci(1993)，Fundamental Immunology（《基础免疫学》）,第三版Paul(编辑)纽约雷文出版社有限公司(Raven Press,Ltd.)和其参考文献，和Yu等,Gene Therapy（《基因治疗》）(1994)同上）、和腺相关病毒载体（AAV载体的综述参见West等(1987)Virology160:38-47；Carter等(1989)美国专利号4,797,368；Carter等WO93/24641(1993)；Kotin(1994)Human Gene Therapy（《人类基因治疗》）5:793-801；Muzyczka(1994)J.Clin.Invst.94:1351和Samulski(同上)；还参见Lebkowski,美国专利号5,173,414；Tratschin等(1985)Mol.Cell.Biol.5(11):3251-3260；Tratschin,等(1984)Mol.Cell.Biol.,4:2072-2081；Hermonat和Muzyczka(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6466-6470；McLaughlin等(1988)和Samulski等(1989)J.Virol.,63:03822-3828）等。
三种特别有用的递送系统是(i)脂质体(ii)非毒性和可生物降解聚合物微粒(iii)阳离子亚微米水包油乳液。
脂质体
各种两亲性脂质能在水环境下形成双层以包封含RNA的水核心形成脂质体。这些脂质可具有阴离子、阳离子或两性离子亲水头基。从阴离子磷脂形成脂质体可追溯到上世纪六十年代，而形成阳离子脂质体的脂质从上世纪九十年代已开始研究。一些磷脂为阴离子型而其他为两性离子型。合适类型的磷脂包括但不限于：磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油和表2所列的一些有用的磷脂。有用的阳离子脂质包括但不限于：二油酰-三甲胺丙烷(DOTAP)、1,2-二硬脂氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(DSDMA)、1,2-二油氧基-N,N二甲基-3-氨基丙烷(DODMA)、1,2-二亚油氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(DLinDMA)、1,2-二亚麻氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(DLenDMA)。两性离子脂质包括但不限于酰基两性离子脂质和醚基离子两性脂质。有用的两性离子脂质示例为DPPC、DOPC和十二烷基磷酸胆碱。所述脂质可为饱和或不饱和。
脂质体可由单一脂质或脂质混合物形成。混合物可包括(i)阴离子脂质混合物(ii)阳离子脂质混合物(iii)两性离子脂质混合物(iv)阴离子脂质和阳离子脂质混合物(v)阴离子脂质和两性离子脂质混合物(vi)两性离子脂质和阳离子脂质混合物或(vii)阴离子脂质、阳离子脂质和两性离子脂质混合物。相似地，混合物可包括饱和以及不饱和脂质。例如，混合物可包括DSPC（两性离子、饱和）、DlinDMA（阳离子、不饱和）和/或DMPG（阴离子、饱和)。使用脂质混合物时，并非所有混合物中的组成脂质都需要是两亲性，例如可将一种或多种两亲性脂质与胆固醇混合。
脂质的亲水部分可PEG化（即通过聚乙二醇共价连接修饰）。此修饰可增加稳定性并防止所述脂质体的非特异性吸收。例如，脂质可用如Heyes等.(2005)J Controlled Release107:276-287中公开的技术偶联PEG。
实施例中使用DSPC、DlinDMA、PEG-DMPG和胆固醇的混合物。本发明的单独方面为含DSPC、DlinDMA、PEG-DMG和胆固醇的脂质体。该脂质体优选包封RNA，如例如编码免疫原的自复制RNA。
脂质体通常分为3组：多层囊泡(MLV)；小单层囊泡(SUV)；和大单层囊泡(LUV)。MLV的各囊泡中具有多个双层，形成数个分开的水隔室。SUV和LUV具有包封水核心的单一双层；SUV通常直径≤50nm，LUV直径>50nm。本发明所用的脂质体理想上为直径范围50-220nm的LUV。对于含不同直径LUV群的组合物：(i)至少数量上有80%的直径应该在20-220nm的范围内，(ii)所述群体的平均直径（Zav，按照强度）理想上在40-200nm的范围内，和/或(iii)所述直径的多分散性指数应<0.2。
本领域熟知制备合适的脂质体的技术，例如参见Liposomes:Methods andProtocols（《脂质体：方法和实验方案》），卷一：Pharmaceutical Nanocarriers:Methods and Protocols（《药物纳米载体：方法和实验方案》）(Weissig编著).休马那(Humana)出版,2009.ISBN160327359X；Liposome Technology（《脂质体技术》），卷I、II和III(Gregoriadis编著).印富玛健康护理公司（InformaHealthcare）,2006；和Functional Polymer Colloids and Microparticles（《功能性聚合物胶质和微粒》），卷4（Microspheres,microcapsules&liposomes（微球、微囊和脂质体））.(Arshady和Guyot编著).辞塔斯图书公司（Citus Books）,2002。一种有用的方法涉及混合(i)所述脂质的乙醇溶液(ii)所述核酸的水溶液和(iii)缓冲液，随后混合、平衡、稀释和纯化（Heyes等.(2005)J Controlled Release107:276-87.）。
RNA优选包封在所述脂质体中，且因此所述脂质体形成围绕含RNA水性核心的外层。已发现所述包封可保护RNA免于RNA酶消化。所述脂质体可包括一些外部的RNA（如所述脂质体的表面），但至少包埋一半的RNA（理想上为全部）。
聚合微粒
许多聚合物可形成微粒以包埋或吸收RNA。使用基本非毒性聚合物意味着受体可安全的接受所述颗粒，而使用可生物降解聚合物意味着所述颗粒可在递送后代谢以避免长期留存。有用的聚合物还可进行灭菌，以辅助制备药物级别制剂。
合适的非毒性和可生物降解的聚合物包括但不限于：聚(α-羟酸)、聚羟基丁酸、聚内酯(包括聚己内酯)、聚二噁烷酮、聚戊内酯、聚原酸酯、聚酸酐、
聚氰基丙烯酸酯、酪氨酸衍生聚碳酸酯、聚乙烯基吡咯烷酮或聚酯酰胺和其组合。
在一些实施方式中，所述微颗粒从聚(α-羟酸)如聚(丙交酯)(“PLA”)、丙交酯和乙交酯的共聚物如聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯)(“PLG”)、和D,L-丙交酯和己内酯的共聚物形成。有用的PLG聚合物包括丙交酯/乙交酯摩尔比范围为例如20:80-80:20，如25:75、40:60、45:55、55:45、60:40、75:25的那些。有用的PLG聚合物包括分子量为例如5,000-200,000Da，如10,000-100,000、20,000-70,000、40,000-50,000的那些。
所述微粒理想地具有0.02μm-8μm范围的直径。对于含直径不同的微粒群的组合物，至少数量上80%组合物的直径应在0.03-7μm范围内。
本领域熟知制备合适的微粒的技术，例如参见Functional Polymer Colloids andMicroparticles（《功能性聚合物胶质和微粒》），卷4（Microspheres,microcapsules&liposomes（微球、微囊和脂质体））.(Arshady和Guyot编著).辞塔斯图书公司（Citus Books）,2002；Polymers in Drug Delivery（《药物递送中的聚合物》）.(Uchegbu和Schatzlein编著).CRC出版社,2006.(具体第7章)和Microparticulate Systems for the Delivery of Proteins and Vaccines（《递送蛋白和疫苗的微粒系统》）.(Cohen和Bernstein编著).CRC出版社,1996。为了有助于RNA的吸收，微粒可包括阳离子表面活性剂和/或脂质，如O’Hagan等(2001)JVirology75:9037-9043;和Singh等(2003)Pharmaceutical Research20:247-251中所公开。制作聚合微粒的替代方法是通过模塑和固化，如WO2009/132206中所公开。
本发明的微粒可具有40-100mV的ζ电势。
RNA可吸附到微粒上，并通过在所述微粒中纳入阳离子材料（如阳离子脂质）来促进所述吸附。
水包油阳离子乳液
已知水包油乳液能用于流感疫苗如FLUADTM产品中的MF59TM佐剂和PREPANDRIXTM产品中的AS03佐剂。按照本发明的RNA递送能利用水包油乳液，只要该乳液包括一种或多种阳离子分子。例如，阳离子脂质可包括在所述乳液中，以提供带负电RNA能结合的带正电液滴表面。
所述乳液包含一种或多种油。合适的油包括来自例如动物（如鱼）或植物来源的油。所述油理想上是可生物降解(可代谢)和生物相容的。植物油的来源包括坚果、种籽和谷物。最常见的花生油、大豆油、椰子油和橄榄油是坚果油的示例。可以使用例如获自霍霍巴豆的霍霍巴油。种籽油包括红花油、棉花籽油、葵花籽油、芝麻籽油等。在谷物油中，最常见的是玉米油，但也可以使用其它谷类的油，如小麦、燕麦、黑麦、稻、画眉草、黑小麦等。甘油和1,2-丙二醇的6-10碳脂肪酸酯虽然不是天然存在于种籽油中，但可从坚果和种籽油开始，通过水解、分离和酯化合适物质制备。来自哺乳动物乳汁的脂肪和油可代谢并因而可以使用。获得动物来源纯油所必需的分离、纯化、皂化和其它方法的过程为本领域熟知。
大多数鱼类含有容易回收的可代谢油。例如，鳕鱼肝油、鲨鱼肝油和诸如鲸蜡的鲸油是本文可使用的几种鱼油的示例。通过生化途径用5-碳异戊二烯单位合成许多支链油，其总称为萜类。也可采用鲨烯的饱和类似物鲨烷。包括鲨烯和鲨烷在内的鱼油易于从市售来源获得，或可以通过本领域已知的方法获得。
其它有用的油为生育酚，特别是和鲨烯联合。当乳液的油相包含生育酚时，可采用α、β、γ、δ、ε或ξ生育酚中的任何一种，但优选α-生育酚。D-α-生育酚和DL-α-生育酚都可采用。优选的α生育酚是DL-α生育酚。可使用包括鲨烯和生育酚（如DL-α-生育酚）的油组合。
乳液优选包含鲨烯，其是一种支链不饱和萜类鲨鱼肝油(C30H50；[(CH3)2C[=CHCH2CH2C(CH3)]2=CHCH2-]2；2,6,10,15,19,23-六甲基-2,6,10,14,18,22-二十四碳己烯；CAS RN7683-64-9)。
所述乳液中的油可包括油例如角鲨烯和至少一种其他油的组合。
所述乳液的水性组分可为淡水（如w.f.i.）或可包括其他组分如溶质。例如，其可包括盐以形成缓冲液，例如柠檬酸或磷酸盐如钠盐。常用缓冲液包括：磷酸盐缓冲剂；Tris缓冲剂；硼酸盐缓冲剂；琥珀酸盐缓冲剂；组氨酸缓冲剂；或柠檬酸盐缓冲剂。优选缓冲的水相，且所包含的缓冲剂一般在5-20mM范围内。
所述乳液也包含阳离子脂质。优选此脂质为表面活性剂从而其有助于所述乳液的形成和稳定。有用的阳离子脂质通常含生理条件下带正电的氮原子如叔胺或季胺。所述氮可在两亲性表面活性剂的亲水头部基团中。有用的阳离子脂质包括但不限于：1,2-二油酰氧基-3-(三甲胺)丙烷(DOTAP)、3'-[N-(N',N'-二甲基氨基乙烷)-氨甲酰基]胆固醇(DC胆固醇)、二甲基双十八烷基-铵(DDA如溴化物)、1,2-二肉豆蔻酰-3-三甲铵丙烷(DMTAP)、二棕榈酰(C16:0)三甲铵丙烷(DPTAP)、二硬脂酰三甲铵丙烷(DSTAP)。其它有用的阳离子脂质是：苯扎氯铵(BAK)、苄索氯铵、溴棕三甲铵（其含十四烷基三甲基溴化铵和可能少量的十二烷基三甲基溴化铵和十六烷基三甲基溴化铵）、十六烷基氯化吡啶
Figure BDA0000455572550000381
(CPC)、十六烷基三甲基氯化铵(CTAC)、N,N',N'-聚氧乙烯(10)-N-牛油-l,3-二氨基丙烷、十二烷基三甲基溴化铵、十六烷基三甲基溴化铵、混合的烷基-三甲基-溴化铵、苄基二甲基十二烷基氯化铵、苄基二甲基十六烷基-氯化铵、苄基三甲基甲醇铵、十六烷基二甲基乙基溴化铵、二甲基双十八烷基溴化铵(DDAB)、甲基氯化苄乙铵、氯化十烃季铵、甲基混合三烷基氯化铵、甲基三辛基氯化铵)、N,N-二甲基-N-[2(2-甲基-4-(l,l,3,3四甲基丁基)-苯氧基]-乙氧基)乙基]-苯甲烷-氯化铵(DEBDA)、二烷基二甲基铵盐、[l-(2,3-二油烯基氧基)-丙基]-N,N,N,三甲基氯化铵、1,2-二酰基-3-(三甲基铵)丙烷(酰基基团=二肉豆蔻酰、二棕榈酰、二硬脂酰、二油酰)、l,2-二酰基-3(二甲基铵)丙烷(酰基基团=二肉豆蔻酰、二棕榈酰、二硬脂酰、二油酰)、l,2-二油酰-3-(4'-三甲基-铵)丁酰-sn-甘油、1,2-二油酰-3-琥珀酰-sn-甘油胆碱酯、胆甾醇(4'-三甲基铵)丁酸酯)、N-烷基吡啶
Figure BDA0000455572550000382
盐(如溴化十六烷基吡啶
Figure BDA0000455572550000383
和氯化十六烷基吡啶
Figure BDA0000455572550000384
)、N-烷基哌叮
Figure BDA0000455572550000385
盐、二价阳离子bola型电解质(C12Me6;C12BU6)、二烷基甘油基磷酸胆碱、溶血卵磷脂、L-α二油酰磷脂酰乙醇胺、胆固醇半琥珀酸胆碱酯、脂聚胺，包括但不限于双十八烷基酰氨基甘氨酰精胺(DOGS)、二棕榈酰磷脂酰乙醇-酰氨基精胺(DPPES)、脂聚-L(或D)-赖氨酸(LPLL、LPDL)、聚(L(或D)-赖氨酸偶联N-戊二酰磷脂酰乙醇胺、具有侧接氨基基团的双十二烷基谷氨酸(C^GluPhCnN)、具有侧接氨基基团的双十四烷基谷氨酸酯(Cl4GIuCnN+)、胆固醇阳离子衍生物，包括但不限于胆固醇基-3β-氧琥珀酰氨基乙烯基三甲基铵盐、胆固醇基-3β-氧琥珀酰氨基乙烯基-二甲基铵、胆固醇基-3β-羧基酰氨基乙烯基三甲基铵盐、和胆固醇基-3β-羧基酰氨基乙烯基二甲基铵。其它有用的阳离子脂质描述于美国2008/0085870和美国2008/0057080，其通过引用纳入本文。
阳离子脂质优选可生物降解(可代谢)和生物相容的。
除了所述油和阳离子脂质，乳液可包括非离子型表面活性剂和/或两性离子表面活性剂。所述表面活性剂包括但不限于：聚氧乙烯去水山梨糖醇酯表面活性剂(通常称为吐温)，特别是聚山梨酯20和聚山梨酯80；以商品名DOWF AXTM出售的环氧乙烷(EO)、环氧丙烷(PO)和/或环氧丁烷(BO)的共聚物，如直链EP/PO嵌段共聚物；重复的乙氧基(氧-1,2-乙二基)数量不同的辛苯聚醇，特别感兴趣的是辛苯聚醇9(曲通(Triton)X-100，或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)；(辛基苯氧基)聚乙氧基乙醇(IGEPAL CA-630/NP-40)；磷脂如磷脂酰胆碱(卵磷脂)；衍生自十二烷醇、十六烷醇、十八烷醇和油醇的聚氧乙烯脂肪醚(称为苄泽表面活性剂)，如三乙二醇单月桂基醚(苄泽30)；聚氧乙烯-9-月桂醚以及去水山梨糖醇酯(通常称为司盘)，如去水山梨糖醇三油酸酯(司盘85)和去水山梨糖醇单月桂酸酯。乳液中包含的优选表面活性剂是聚山梨酯80(吐温80；聚氧乙烯去水山梨糖醇单油酸酯)、司盘85(去水山梨糖醇三油酸酯)、卵磷脂和曲通X100。
所述乳液中可包括这些表面活性剂的混合物，如吐温80/司盘85混合物或吐温80/曲通-X100混合物。聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯如聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯（吐温80）和辛苯聚醇如叔辛基苯氧基-聚乙氧基乙醇（曲通X-100）的组合也适用。另一种有用的组合包含月桂醇聚醚-9加聚氧乙烯去水山梨糖醇酯和/或辛苯聚醇。有用的混合物可包括HLB值为10-20的表面活性剂（如聚山梨酯80，HLB为15.0）和HLB值为1-10的表面活性剂（如去水山梨糖醇三油酸酯，HLB为1.8）。
最终乳液中油的含量（体积%）优选为2-20%，如5-15%、6-14%、7-13%、8-12%。约4-6%或约9-11%的鲨烯含量特别有用。
最终乳液中表面活性剂的含量（重量%）优选为0.001%-8%。例如：聚氧乙烯去水山梨糖醇酯（如聚山梨酯80）0.2-4%，具体为0.4-0.6%、0.45-0.55%、约0.5%或1.5-2%、1.8-2.2%、1.9-2.1%、约2%、或0.85-0.95%、或约1%；去水山梨糖醇酯（如去水山梨糖醇三油酸酯）0.02-2%，具体约0.5%或约1%；辛基-或壬基苯氧基聚氧乙醇（如曲通X-100）0.001-0.1%，具体为0.005-0.02%；聚氧乙烯醚（如月桂醇聚醚9）0.1-8%,优选0.1-10%且具体为0.1-1%或约0.5%。
油和表面活性剂的绝对含量和其比例可在较广范围内变化而仍能形成乳液。技术人员可容易地改变组分的相对比例以获得需要的乳液，但油和表面活性剂的重量比通常在4:1和5:1之间（油过量）。
确保乳液的免疫刺激活性（特别是在大型动物中）的重要参数是油滴尺寸（直径）。最有效的乳液液滴尺寸为亚微米范围。所述液滴的合适尺寸范围为50-750nm。最常用的平均液滴尺寸小于250nm如小于200nm、小于150nm。平均液滴尺寸常用80-180nm。理想地，至少80%（数量）的乳液油滴直径小于250nm，且优选至少90%。测量乳液中平均液滴尺寸和大小分布的仪器可市售获得。这些通常使用动态光散射和/或单粒子光学传感的技术如获自PSS公司（ParticleSizing Systems）（美国圣塔芭芭拉）的AccusizerTM和NicompTM系列仪器，或马文仪器公司（Malvern Instruments）（英国）的ZetasizerTM仪器，或堀场公司（Horiba）（日本京都）的粒径分布分析仪（Particle Size Distribution Analyzerinstruments）。
理想地，液滴大小分布（数量）仅有一个最大值而不是两个最大值，即围绕平均值（模式）分布有单一液滴群。优选乳液的多分散性<0.4如0.3、0.2或更小。
含亚微米液滴和窄尺寸分布的合适乳液可通过使用微流化获得。该技术以高压和高速推动输入组分流通过几何学固定的通道来降低油滴平均尺寸。这些流接触通道壁、室壁和彼此。所得的剪切力、冲击力和空化力使液滴尺寸变小。可重复微流化步骤直至得到的乳液含所需平均液滴尺寸和分布。
作为微流化的替代，加热法可用于引起相转化。这些方法还可提供紧密粒度分布的亚微米乳液。
优选的乳液可过滤灭菌，即其液滴可穿过220nm滤器。除了提供灭菌，这个过程还去除所述乳液中的任何大液滴。
在某些实施方式中，所述乳液中的所述阳离子脂质是DOTAP。所述阳离子水包油乳液可包含约0.5mg/ml-约25mg/ml DOTAP。例如，所述阳离子水包油乳液包含的DOTAP可为约0.5mg/ml-约25mg/ml、约0.6mg/ml-约25mg/ml、约0.7mg/ml-约25mg/ml、约0.8mg/ml-约25mg/ml、约0.9mg/ml-约25mg/ml、约1.0mg/ml-约25mg/ml、约1.1mg/ml-约25mg/ml、约1.2mg/ml-约25mg/ml、约1.3mg/ml-约25mg/ml、约1.4mg/ml-约25mg/ml、约1.5mg/ml-约25mg/ml、约1.6mg/ml-约25mg/ml、约1.7mg/ml-约25mg/ml、约0.5mg/ml-约24mg/ml、约0.5mg/ml-约22mg/ml、约0.5mg/ml-约20mg/m、约0.5mg/ml-约18mg/ml、约0.5mg/ml-约15mg/ml、约0.5mg/ml-约12mg/ml、约0.5mg/ml-约10mg/ml、约0.5mg/ml-约5mg/ml、约0.5mg/ml-约2mg/ml、约0.5mg/ml-约1.9mg/ml、约0.5mg/ml-约1.8mg/ml、约0.5mg/ml-约1.7mg/ml、约0.5mg/ml-约1.6mg/ml、约0.6mg/ml-约1.6mg/ml、约0.7mg/ml-约1.6mg/ml、约0.8mg/ml-约1.6mg/ml、约0.5mg/ml、约0.6mg/ml、约0.7mg/ml、约0.8mg/ml、约0.9mg/ml、约1.0mg/ml、约1.1mg/ml、约1.2mg/ml、约1.3mg/ml、约1.4mg/ml、约1.5mg/ml、约1.6mg/ml、约12mg/ml、约18mg/ml、约20mg/ml、约21.8mg/ml、约24mg/ml等。在一个示例性实施方式中，所述阳离子水包油乳液包含约0.8mg/ml-约1.6mg/mlDOTAP，如0.8mg/ml、1.2mg/ml、1.4mg/ml或1.6mg/ml。
在某些实施方式中，所述阳离子脂质是DC胆固醇。所述阳离子水包油乳液可包含约0.1mg/ml-约5mg/ml DC胆固醇。例如所述阳离子水包油乳液包含的DC胆固醇可为约0.1mg/ml-约5mg/ml、约0.2mg/ml-约5mg/ml、约0.3mg/ml-约5mg/ml、约0.4mg/ml-约5mg/ml、约0.5mg/ml-约5mg/ml、约0.62mg/ml-约5mg/ml、约1mg/ml-约5mg/ml、约1.5mg/ml-约5mg/ml、约2mg/ml-约5mg/ml、约2.46mg/ml-约5mg/ml、约3mg/ml-约5mg/ml、约3.5mg/ml-约5mg/ml、约4mg/ml-约5mg/ml、约4.5mg/ml-约5mg/ml、约0.1mg/ml-约4.92mg/ml、约0.1mg/ml-约4.5mg/ml、约0.1mg/ml-约4mg/ml、约0.1mg/ml-约3.5mg/ml、约0.1mg/ml-约3mg/ml、约0.1mg/ml-约2.46mg/ml、约0.1mg/ml-约2mg/ml、约0.1mg/ml-约1.5mg/ml、约0.1mg/ml-约1mg/ml、约0.1mg/ml-约0.62mg/ml、约0.15mg/ml、约0.3mg/ml、约0.6mg/ml、约0.62mg/ml、约0.9mg/ml、约1.2mg/ml、约2.46mg/ml、约4.92mg/ml等。在一个示例性实施方式中，所述阳离子水包油乳液包含约0.62mg/ml-约4.92mg/ml DC胆固醇，如2.46mg/ml。
在一些实施方式中，所述阳离子脂质是DDA。所述阳离子水包油乳液可包含约0.1mg/ml-约5mg/ml的DDA。例如，所述阳离子水包油乳液包含的DDA可为约0.1mg/ml-约5mg/ml、约0.1mg/ml-约4.5mg/ml、约0.1mg/ml-约4mg/ml、约0.1mg/ml-约3.5mg/ml、约0.1mg/ml-约3mg/ml、约0.1mg/ml-约2.5mg/ml、约0.1mg/ml-约2mg/ml、约0.1mg/ml-约1.5mg/ml、约0.1mg/ml-约1.45mg/ml、约0.2mg/ml-约5mg/ml、约0.3mg/ml-约5mg/ml、约0.4mg/ml-约5mg/ml、约0.5mg/ml-约5mg/ml、约0.6mg/ml-约5mg/ml、约0.73mg/ml-约5mg/ml、约0.8mg/ml-约5mg/ml、约0.9mg/ml-约5mg/ml、约1.0mg/ml-约5mg/ml、约1.2mg/ml-约5mg/ml、约1.45mg/ml-约5mg/ml、约2mg/ml-约5mg/ml、约2.5mg/ml-约5mg/ml、约3mg/ml-约5mg/ml、约3.5mg/ml-约5mg/ml、约4mg/ml-约5mg/ml、约4.5mg/ml-约5mg/ml、约1.2mg/ml、约1.45mg/ml等。或者，所述阳离子水包油乳液包含的DDA可为约20mg/ml、约21mg/ml、约21.5mg/ml、约21.6mg/ml、约25mg/ml。在一个示例性实施方式中，所述阳离子水包油乳液包含约0.73mg/ml-约1.45mg/ml DDA，如1.45mg/ml。
导管或类似设备可用于将本发明的自复制RNA分子以裸露RNA或与递送系统联合递送到靶器官或组织。合适的导管公开于例如美国专利号4,186,745；5,397,307；5,547,472；5,674,192和6,129,705，所有文献通过引用纳入本文。
本发明包括使用合适的递送系统如包埋或吸收有自复制RNA的脂质体、聚合微粒或亚微米乳液微粒来递送编码RSV-F多肽的自复制RNA分子，以例如单独或结合其他大分子激发免疫应答。本发明包括吸收和/或包埋有自复制RNA分子的脂质体、微粒和亚微米乳液及其组合。
如实施例中进一步证明，与脂质体和亚微米乳液微粒结合的自复制RNA分子可有效地递送到所述宿主细胞，且可引起针对所述自复制RNA编码的蛋白的免疫应答。
免疫原性组合物
本发明提供免疫原性组合物。所述免疫原性组合物可包括单一活性免疫原性剂或数种免疫原性剂。例如，所述免疫原性组合物可包含融合前RSV F多肽或融合前嵌合RSV F多肽的组合。所述免疫组合物可包括编码融合前RSV-F多肽的自复制RNA，且优选还包括合适的递送系统如脂质体、多聚微粒、水包油乳液及其组合。
本发明免疫原性组合物也可包含一种或多种免疫调节剂。一种或多种所述免疫调节剂优选包括一种或多种佐剂，例如两种、三种、四种或更多佐剂。佐剂可包括TH1佐剂和/或TH2佐剂，详述见下。
在另一个实施方式中，本发明的免疫原性组合物包含如下多肽，所述多肽显示存在于RSV F糖蛋白融合前构象中的表位。
在另一个实施方式中，本发明的免疫原性组合物包含基于两种不同融合前非RSV(F蛋白(例如，偏肺病毒、副流感病毒，例如PIV5、NDV)的一种或多种融合前嵌合蛋白，其中所述两种不同融合前非RSV都在所述蛋白质表面上具有突变的相同RSV F中和表位。
本发明的组合物优选适于给予哺乳动物对象如人，且包括一种或多种药学上可接受的载体和/或赋形剂包括佐剂。对这类组分的充分讨论参见参考文献29。组合物通常是水性形式。当所述组合物是免疫原性组合物时，会在给予哺乳动物如人时引发免疫应答。所述免疫原性组合物可用于制备用于免疫哺乳动物的疫苗制剂。
所述免疫原性组合物可包括单一活性免疫原性剂或数种免疫原性剂。例如，所述融合前RSV F蛋白可以是全长或胞外域多肽，并且可为单一形式（如未切割的单体、切割的单体、未切割的三聚体、切割的三聚体）或两种或更多形式（如未切割的单体和未切割的三聚体的混合物或未切割的单体和未切割的三聚体之间的动态平衡）。此外，所述组合物可包含融合前RSV F蛋白和一种或多种其它RSV蛋白（如G蛋白和/或M蛋白）和/或其可组合来自其它病原体的免疫原。
该组合物可含有防腐剂，如硫柳汞或2-苯氧乙醇。然而，疫苗优选应基本无(即小于5μg/ml)含汞物质，如不含硫柳汞。更优选无汞的免疫原性组合物。特别优选不含防腐剂的免疫原性组合物。
为了控制张度，优选包含生理盐如钠盐。优选氯化钠(NaCl)，其可以1-20mg/ml存在。可以存在其它盐，包括氯化钾、磷酸二氢钾、无水磷酸氢二钠、氯化镁、氯化钙等。
组合物的渗透压通常为200mOsm/kg-400mOsm/kg，优选为240-360mOsm/kg，更优选为290-310mOsm/kg。
组合物可含有一种或多种缓冲剂。常用缓冲剂包括：磷酸盐缓冲剂；Tris缓冲剂；硼酸盐缓冲剂；琥珀酸盐缓冲剂；组氨酸缓冲剂(具体是有氢氧化铝佐剂时)；或柠檬酸盐缓冲剂。包含的缓冲剂一般是5-20mM。组合物的pH通常为5.0-8.1，更常为6.0-8.0，例如6.5-7.5，或者7.0-7.8。因此，本发明方法可包括在包装前调节散装疫苗pH的步骤。
该组合物优选无菌。该组合物优选无热原，如每剂量含有<1EU(内毒素单位，标准量度)，优选每剂量<0.1EU。该组合物优选不含谷蛋白。人疫苗的给药剂量体积一般为约0.5ml，但可将一半剂量(即约0.25ml)给予儿童。
佐剂
本发明的组合物含RSV-F多肽或编码RSV-F多肽的核酸，其还可包含一种或多种佐剂，例如2种、3种、4种或更多佐剂，所述佐剂可用于提高接受所述组合物的患者体内引发的免疫应答（体液和/或细胞）。所述佐剂可包括TH1佐剂和/或TH2佐剂。可用于本发明组合物的佐剂包括但不限于：
含矿物质的组合物。本发明中适合用作佐剂的含有矿物质的组合物包括矿物盐，例如钙盐和铝盐(或其混合物)。本发明包括无机盐，例如氢氧化物(如羟基氧化物)、磷酸盐(如羟磷酸盐、正磷酸盐)、硫酸盐等，或不同无机化合物的混合物，这些化合物可采用任何合适的形式(如凝胶、晶体、无定形等)，优选具有吸附性。钙盐包括磷酸钙(如参考文献38公开的“CAP”颗粒)。铝盐包括氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝等，也可将含有矿物质的组合物制成金属盐的颗粒(39)。铝盐佐剂详述于下。
·油乳液组合物(详述见下)。适用作本发明佐剂的油乳液组合物包含鲨烯-水乳液，如MF59（5%角鲨烯、0.5%吐温80和0.5%司盘85，用微流化床配制成亚微米颗粒)。
·细胞因子诱导剂(详述见下)。适用于本发明的细胞因子诱导剂包括toll样受体7(TLR7)激动剂（如WO2009/111337中公开的苯并萘啶化合物。
·皂苷（参考文献74第22章）是在许多种类植物的树皮、叶、茎干、根甚至花中发现的甾醇糖苷和三萜糖苷的异质群体。已广泛研究了作为佐剂的来自皂树(Quillaia saponaria Molina)树皮的皂苷。皂苷也可购自丽花菝葜（Smilaxornata）（墨西哥菝葜）、满天星（Gypsophilla paniculata）（婚纱花）和肥皂草（Saponaria officianalis）（皂根）。皂苷佐剂制剂包括纯化制剂如QS21，以及脂质制剂如ISCOM。QS21以STIMULON(TM)出售。已采用HPLC和RP-HPLC纯化皂苷组合物。已使用这些技术鉴定了得到的具体纯化组分，包括QS7、QS17、QS18、QS21、QH-A、QH-B和QH-C。皂苷优选QS21。制备QS21的方法参见参考文献40。皂苷制剂也可以包含甾醇，如胆固醇(41)。皂苷和胆固醇的组合可用于形成称为免疫刺激复合物(ISCOM)的独特颗粒（参考文献74的第23章）。ISCOM通常还包含磷脂，如磷脂酰乙醇胺或磷脂酰胆碱。任意已知的皂苷均可用于ISCOM中。ISCOM优选包含QuilA、QHA和QHC中的一种或多种。参考文献41-43中进一步描述了ISCOM。任选地，所述ISCOM可以不含另外的去污剂(44)。关于开发基于皂苷的佐剂的综述可以参见参考文献45和46。
·脂肪佐剂（详见下）包括水包油乳液、源自肠细菌脂多糖的改良的天然脂质As、磷脂化合物（如合成磷脂二聚体，E6020）等。
细菌ADP-核糖基化毒素(如大肠杆菌不耐热肠毒素"LT"、霍乱毒素"CT"或百日咳毒素"PT")及其脱毒衍生物，如称为LT-K63和LT-R72的突变毒素(47)。参考文献48中描述了将脱毒的ADP-核糖基化毒素用作粘膜佐剂，参考文献49中描述了将其用作胃肠道外佐剂。
·生物粘附剂和粘膜粘附剂，如酯化透明质酸微球(50)或壳聚糖及其衍生物(51)。
由可生物降解和无毒材料(例如聚(α-羟酸)、聚羟基丁酸、聚正酯、聚酐、聚己酸内酯等)，优选丙交酯-乙交酯共聚物形成的微粒(即直径约100nm-150μm，更优选约200nm-30μm，最优选约500nm-10μm的颗粒)，任选处理以具有带负电表面(如用SDS处理)或带正电表面(例如用阳离子去污剂如CTAB处理)。
脂质体(参考文献74的第13和14章)。适合用作佐剂的脂质体制剂的例子见参考文献52-54所述。
·聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯制剂(55)。该类制剂还包括聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯表面活性剂和辛苯糖醇的组合(56)，以及聚氧乙烯烷基醚或酯表面活性剂和至少一种另外的非离子表面活性剂如辛苯糖醇的组合(57)。优选的聚氧乙烯醚选自下组：聚氧乙烯-9-月桂醚（月桂醇聚醚9）、聚氧乙烯-9-硬脂醚、聚氧乙烯-8-硬脂醚、聚氧乙烯-4-月桂醚、聚氧乙烯-35-月桂醚和聚氧乙烯-23-月桂醚。
胞壁酰肽，例如N-乙酰胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰-去甲胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(去甲MDP)、N-乙酰葡萄糖胺酰-N-乙酰胞壁酰-L-Al-D-异谷氨酸-L-Ala-二棕榈酰丙酰胺("DTP-DPP"或"TheramideTM")和N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺酰-L-丙氨酸-2-(1′-2′-二棕榈酰-sn-甘油-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(MTP-PE)。
由第一种革兰氏阴性菌制备的外膜蛋白蛋白质体制剂与衍生自第二种革兰氏阴性菌脂多糖制剂的组合，其中外膜蛋白蛋白质体和脂多糖制剂形成稳定的非共价佐剂复合物。这类复合物包括"IVX-908"，它是包括脑膜炎奈瑟球菌外膜和脂多糖的复合物。
聚氧鎗(polyoxidonium)聚合物(58,59)或其它N-氧化的聚乙烯-哌嗪衍生物。甲基肌苷5'-单磷酸酯("MIMP")(60)。多聚羟化吡咯双烷类化合物(61)，如下式化合物：
其中，R选自：氢，直链或支链、未取代或取代、饱和或不饱和的酰基、烷基(如环烷基)、烯基、炔基和芳基，或其药学上可接受的盐或衍生物。示例包括但不限于：木麻黄(casuarine)、木麻黄-6-α-D-吡喃葡萄糖、3-表-木麻黄、7-表-木麻黄、3,7-二表-木麻黄等。
CD1配体，如α-糖基神经酰胺(62-69)(如α-半乳糖基神经酰胺)、含植物鞘氨醇的α-糖基神经酰胺、OCH、KRN7000[(2S,3S,4R)-1-O-(α-D-吡喃半乳糖基)-2-(N-二十六烷酰氨基)-1,3,4-十八烷三醇、CRONY-101、3"-O-硫代-半乳糖基神经酰胺等等。
γ菊糖(70)或其衍生物，如阿尔加穆林(algammulin)。
病毒体和病毒样颗粒(VLP)。这些结构通常包含任选与磷脂组合或一起配制的一种或多种病毒蛋白质。其通常无病原性，非复制型，且通常不含任意天然病毒基因组。所述病毒蛋白可重组生成或分离自全病毒。这些适用于病毒体或VLP的病毒蛋白包括衍生自流感病毒（例如HA或NA）、乙肝病毒（例如核心蛋白或衣壳蛋白）、戊肝病毒、麻疹病毒、辛德比斯病毒、轮状病毒、口蹄疫病毒、逆转录病毒、诺沃克病毒、人乳头状瘤病毒、HIV、RNA-噬菌体、Qβ-噬菌体（如外壳蛋白）、GA-噬菌体、fr-噬菌体、AP205噬菌体和Ty（如反转录转座子Ty蛋白p1）的蛋白。
参考文献74和75中更详细地讨论了这些和其它佐剂活性物质。
组合物可包含2种、3种、4种或更多佐剂。例如，本发明的组合物可优选包括水包油乳剂和细胞因子诱导剂，或含矿物质的组合物和细胞因子诱导剂，或两种水包油乳液佐剂、或两种苯并萘啶化合物等。
组合物中的抗原和佐剂通常相混。
油乳液佐剂
适用作本发明佐剂的油乳液组合物包含鲨烯-水乳液，如MF59（5%鲨烯、0.5%吐温80和0.5%司盘85，用微流化床配制成亚微米颗粒)。也可以使用完全弗氏佐剂（CFA）和不完全弗氏佐剂（IFA）。
已知各种水包油乳液，它们通常包括至少一种油和至少一种表面活性剂，所述油和表面活性剂是可生物降解(可代谢)和生物相容的。乳液中的油滴直径通常小于5μm，甚至可具有亚微米直径，通过微流化床实现这种小尺寸以提供稳定乳液。优选尺寸小于220nm的液滴，因为其可进行过滤灭菌。
本发明可使用诸如来自动物(如鱼)或植物来源的油。植物油的来源包括坚果、种籽和谷物。最常见的花生油、大豆油、椰子油和橄榄油是坚果油的示例。可以使用例如获自霍霍巴豆的霍霍巴油。种籽油包括红花油、棉花籽油、葵花籽油、芝麻籽油等。在谷物油中，最常见的是玉米油，但也可以使用其它谷类的油，如小麦、燕麦、黑麦、稻、画眉草、黑小麦等。甘油和1,2-丙二醇的6-10碳脂肪酸酯虽然不是天然存在于种籽油中，但可从坚果和种籽油开始，通过水解、分离和酯化合适物质制备。来自哺乳动物乳汁的脂肪和油类是可代谢的，因此可以用于实施本发明。获得动物来源纯油所必需的分离、纯化、皂化和其它方法的过程为本领域熟知。大多数鱼类含有容易回收的可代谢油。例如，鳕鱼肝油、鲨鱼肝油和诸如鲸蜡的鲸油是本文可使用的几种鱼油的示例。通过生化途径用5-碳异戊二烯单位合成许多支链油，其总称为萜类。鲨鱼肝油含有称为鲨烯的支链不饱和萜类化合物，2,6,10,15,19,23-六甲基-2,6,10,14,18,22-二十四碳六烯，其为本文特别优选。鲨烯的饱和类似物角鲨烷也是优选的油。包括鲨烯和鲨烷在内的鱼油易于从市售来源获得，或可以通过本领域已知的方法获得。其它优选油是生育酚（见下）。可以使用油的混合物。
表面活性剂可以按其‘HLB’(亲水/亲脂平衡)分类。本发明优选的表面活性剂的HLB为至少10，优选至少15，更优选至少16。可以与本发明一起使用的表面活性剂包括但不限于：聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯表面活性剂（通常称为吐温），特别是聚山梨酯20和聚山梨酯80；以商品名DOWFAX(TM)出售的环氧乙烷（EO）、环氧丙烷（PO）和/或环氧丁烷（BO）的共聚物，如直链EP/PO嵌段共聚物；重复的乙氧基（氧-1,2-乙二基）数量不同的辛苯聚醇，特别感兴趣的是辛苯聚醇9（曲通（Triton）X-100，或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇）；（辛基苯氧基）聚乙氧基乙醇（IGEPAL CA-630/NP-40）；磷脂，如磷脂酰胆碱（卵磷脂）；壬酚乙醇酯，如TERGITOL(TM)NP系列；衍生自月桂醇、鲸蜡醇、硬脂醇和油醇的聚氧乙烯脂肪醚（称为苄泽（Brij）表面活性剂），如三甘醇单月桂基醚（苄泽30）；以及脱水山梨糖醇酯（通常称为司盘（SPAN）），如脱水山梨糖醇三油酸酯（司盘85）和脱水山梨糖醇单月桂酸酯。优选非离子型表面活性剂。乳液中包含的表面活性剂优选吐温80(TM)(聚氧乙烯去水山梨糖醇单油酸酯)、司盘85(去水山梨糖醇三油酸酯)、卵磷脂和曲通X-100。
可使用表面活性剂的混合物，如吐温80(TM)/司盘85混合物。聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯如聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯（吐温80(TM)）和辛苯聚醇如叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇（曲通X-100）的混合物也适用。另一种有用的组合包含月桂醇聚醚-9加聚氧乙烯去水山梨糖醇酯和/或辛苯聚醇。
优选的表面活性剂含量（重量%）为：聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯（如吐温80(TM)）0.01-1%，特别是约0.1%；辛基-或壬基苯氧基聚氧乙醇（如曲通X-100或曲通系列的其它去污剂）0.001-0.1%，特别是0.005-0.02%；聚氧乙烯醚（如月桂醇聚醚9）0.1-20%，优选0.1-10%，特别是0.1-1%或约0.5%。
本发明所用的具体水包油乳液佐剂包括但不限于：
鲨烯、吐温80(TM)和司盘85的亚微米乳液。所述乳液的体积组成可以是约5%鲨烯、约0.5%聚山梨酯80和约0.5%司盘85。以重量计，这些比例为4.3%鲨烯、0.5%聚山梨酯80和0.48%司盘85。这种佐剂称为‘MF59’(71-73)，参考文献74的第10章和参考文献75的第12章有更详细的描述。MF59乳液宜包含柠檬酸根离子，如10mM柠檬酸钠缓冲液。
鲨烯、生育酚和吐温80(TM)的乳液。所述乳液可包含磷酸盐缓冲盐水。其还可包含司盘85（例如1%）和/或卵磷脂。这些乳液可含有2-10%鲨烯、2-10%生育酚和0.3-3%吐温80(TM)，鲨烯:生育酚的重量比优选<1，因为这提供更稳定的乳液。鲨烯和吐温80(TM)的体积比可约为5:2。可通过下述方法制备一种此类乳液：将吐温80(TM)溶解于PBS得到2%溶液，然后将90ml该溶液与5gDL-α-生育酚和5ml鲨烯的混合物混合，然后微流体化该混合物。得到的乳液可含有亚微米油滴，如平均直径为100-250nm，优选约180nm。
鲨烯、生育酚和曲通去污剂(如曲通X-100)的乳液。该乳液也可包含3d-MPL(见下)。所述乳液可包含磷酸盐缓冲液。
含有聚山梨酯(如聚山梨酯80)、曲通去污剂(如曲通X-100)和生育酚(如琥珀酸α-生育酚)的乳液。该乳液可包含这三种组分，其质量比约为75:11:10(如750μg/ml聚山梨酯80、110μg/ml曲通X-100和100μg/ml琥珀酸α-生育酚)，这些浓度应包括抗原中这些组分的贡献。所述乳液还可包含鲨烯。该乳液也可包含3d-MPL(见下)。所述水相可包含磷酸盐缓冲液。
角鲨烷、聚山梨酯80和泊洛沙姆401(“普流罗尼克(TM)L121”)的乳液。所述乳液可用pH7.4的磷酸盐缓冲盐水配制。该乳液是一种有用的胞壁酰二肽递送载体，已与苏氨酰基-MDP一起用于“SAF-1”佐剂(0.05-1%Thr-MDP、5%角鲨烷、2.5%普流罗尼克(Pluronic)L121和0.2%聚山梨酸酯80)中(76)。也可不与Thr-MDP一起使用，例如用“AF”佐剂(77)(5%角鲨烷、1.25%普流罗尼克L121和0.2%聚山梨酸酯80)。优选微流体化。
含有角鲨烷、水性溶剂、聚氧乙烯烷基醚亲水性非离子型表面活性剂(如聚氧乙烯(12)十六十八醚)和疏水性非离子型表面活性剂(如去水山梨糖醇酯或二缩甘露醇酯，如去水山梨糖醇单油酸酯或‘司盘80’)的乳液。该乳液优选为热可逆的和/或其中至少90%油滴(以体积计)的尺寸小于200nm。该乳液也可含有一种或多种以下物质：糖醇；低温保护剂(例如，糖，如十二烷基麦芽苷和/或蔗糖)；和/或烷基多糖苷。这类乳液可冻干。
含有0.5-50%油、0.1-10%磷脂和0.05-5%非离子型表面活性剂的乳液。如参考文献78所述，优选的磷脂组分是磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、磷脂酸、鞘磷脂和心磷脂。优选亚微米液滴尺寸。
不可代谢油(如轻质矿物油)和至少一种表面活性剂(如卵磷脂、吐温80(TM)或司盘80)的亚微米水包油乳液。可包含添加剂，例如QuilA皂苷、胆固醇、皂苷-亲脂体偶联物(如通过葡糖醛酸的羧基将脂族胺加到脱酰基皂苷上而产生的GPI-0100，如参考文献79所述)、二甲基二-十八烷基溴化铵和/或N,N-二-十八烷基-N,N-双(2-羟乙基)丙二胺。
包含矿物油、非离子亲脂性乙氧基化脂肪醇和非离子亲水性表面活性剂(例如，乙氧基化脂肪醇和/或聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物)的乳液。
包含矿物油、非离子亲水性乙氧基化脂肪醇和非离子亲脂性表面活性剂(例如，乙氧基化脂肪醇和/或聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物)的乳液。
皂苷(如QuilA或QS21)和固醇(如胆固醇)结合成螺旋胶束的乳液(80)。
可以在递送时，将该乳液与抗原临时混合。因此，在包装或出售的疫苗中该佐剂和抗原可分开保存，使用时能配制成最终制剂。所述抗原通常是水性形式，从而最终通过混合两种液体制备疫苗。所述两种液体的混合体积比可变(例如5:1-1:5)，但通常约为1:1。
细胞因子诱导剂
包含在本发明组合物中的细胞因子诱导剂在给予患者时能够引发免疫应答，以释放细胞因子，包括干扰素和白介素。优选的药剂可引发以下一种或多种物质的释放：干扰素-γ；白介素-1；白介素-2；白介素-12；TNF-α；TNF-β；和GM-CSF。优选的药剂可诱发与Th1-型免疫应答有关的细胞因子的释放，例如干扰素γ、TNFα、白介素2。优选刺激干扰素γ和白介素2。
因此，接受本发明组合物的结果是，用RSV F蛋白刺激时，患者会具有以抗原特异性方式释放所需细胞因子的T细胞。例如，由其血液纯化的T细胞在体外接触F蛋白时会释放γ-干扰素。测定外周血单核细胞(PBMC)中这种应答的方法是本领域已知的，这些方法包括ELISA，ELISPOT，流式细胞术和实时PCR。例如，参考文献81报道了监测抗原特异性T细胞介导的针对破伤风类毒素的免疫应答，特别是γ干扰素应答的研究，发现ELISPOT是区别抗原特异性TT-诱导的应答与自发应答的灵敏度最高的方法，但流式细胞术检测胞内细胞因子是测定重刺激效果的最有效方法。
合适的细胞因子诱导剂包括但不限于：
免疫调节性寡核苷酸，如含有CpG基序(含有通过磷酸键连接于鸟嘌呤的未甲基化胞嘧啶的二核苷酸序列)的寡核苷酸、或双链RNA、或含有回文序列的寡核苷酸、或含有聚(dG)序列的寡核苷酸。
3-O-去酰基单磷酰脂质A（“3dMPL”，也称为“MPL(TM)”)(82-85)。
咪唑并喹啉化合物，如IMIQUIMOD(TM)("R-837")(86-87)、RESIQUIMOD(TM)("R-848")(88)和其类似物；及其盐(如盐酸盐)。有关免疫刺激性咪唑喹啉的其它细节可参见参考文献89-93。
苯并萘啶化合物，例如：(a)具有下式的化合物：
其中：
R4选自H、卤素、-C(O)OR7、-C(O)R7、-C(O)N(R11R12)、
-N(R11R12)、-N(R9)2、-NHN(R9)2、-SR7、-(CH2)nOR7、-(CH2)nR7、
-LR8、-LR10、-OLR8、-OLR10、C1-C6烷基、C1-C6杂烷基、
C1-C6卤代烷基、C2-C8烯烃,C2-C8炔烃、C1-C6烷氧基、
C1-C6卤代烷氧基、芳基、杂芳基、C3-C8环烷基，和
C3-C8杂环烷基，其中R4的所述C1-C6烷基、C1-C6杂烷基、C1-C6卤代烷基、C2-C8烯烃、C2-C8炔烃、C1-C6烷氧基、
C1-C6卤代烷氧基、芳基、杂芳基、C3-C8环烷基，和
C3-C8杂环烷基基团各自可任选地被1-3个取代基取代，所述取代基独立地选自卤素、–CN、-NO2、-R7、-OR8、-C(O)R8、-OC(O)R8、-C(O)OR8、-N(R9)2、-P(O)(OR8)2、-OP(O)(OR8)2、-P(O)(OR10)2、
-OP(O)(OR10)2、-C(O)N(R9)2、–S(O)2R8、–S(O)R8、–S(O)2N(R9)2和-NR9S(O)2R8；
每个L独立地选自键、-(O(CH2)m)t-、C1-C6烷基、
C2-C6亚烯基和C2-C6亚炔基，其中L的C1-C6烷基、
C2-C6亚烯基和C2-C6亚炔基各自任选地被1-4个取代基取代，所述取代基独立地选自卤素、-R8、-OR8、-N(R9)2、-P(O)(OR8)2、-OP(O)(OR8)2、-P(O)(OR10)2和-OP(O)(OR10)2；
R7选自H、C1-C6烷基、芳基、杂芳基、C3-C8环烷基、C1-C6杂烷基、C1-C6卤代烷基、C2-C8烯烃、C2-C8炔烃、C1-C6烷氧基、C1-C6卤代烷氧基和C3-C8杂环烷基，其中R7的C1-C6烷基、芳基、杂芳基、C3-C8环烷基、C1-C6杂烷基、C1-C6卤代烷基、C2-C8烯烃、C2-C8炔烃、C1-C6烷氧基、C1-C6卤代烷氧基和C3-C8杂环烷基基团各自可任选地被1-3个R13基团取代；
各R8独立地选自H、-CH(R10)2、C1-C8烷基、C2-C8烯烃、C2-C8炔烃、C1-C6卤代烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6杂烷基、C3-C8环烷基、C2-C8杂环烷基、C1-C6羟基烷基和C1-C6卤代烷氧基，其中R8的C1-C8烷基、C2-C8烯烃、C2-C8炔烃、C1-C6杂烷基、C1-C6卤代烷基、C1-C6烷氧基、C3-C8环烷基、C2-C8杂环烷基、C1-C6羟基烷基和C1-C6卤代烷氧基基团各自可任选地被1-3个取代基取代，所述取代基独立地选自–CN、R11、-OR11、-SR11、-C(O)R11、-OC(O)R11、-C(O)N(R9)2、-C(O)OR11、-NR9C(O)R11、-NR9R10、-NR11R12、-N(R9)2、-OR9、-OR10、-C(O)NR11R12、-C(O)NR11OH、–S(O)2R11、–S(O)R11、–S(O)2NR11R12、-NR11S(O)2R11、-P(O)(OR11)2和-OP(O)(OR11)2；
各R9独立地选自H、-C(O)R8、-C(O)OR8、-C(O)R10、-C(O)OR10、-S(O)2R10、-C1-C6烷基、C1-C6杂烷基和C3-C6环烷基，或者各R9独立地是C1-C6烷基，所述C1-C6烷基与它们连接的N一起形成C3-C8杂环烷基，其中所述C3-C8杂环烷基环可任选地包含额外的杂原子，所述杂原子选自N、O和S，并且其中R9的C1-C6烷基、C1-C6杂烷基、C3-C6环烷基或C3-C8杂环烷基基团各自可任选地被1-3个取代基取代，所述取代基独立地选自–CN、R11、-OR11、-SR11、-C(O)R11、-OC(O)R11、-C(O)OR11、-NR11R12、-C(O)NR11R12、-C(O)NR11OH、-S(O)2R11、-S(O)R11、-S(O)2NR11R12、-NR11S(O)2R11、-P(O)(OR11)2和-OP(O)(OR11)2；
各R10独立地选自芳基、C3-C8环烷基、C3-C8杂环烷基和杂芳基，其中所述芳基、C3-C8环烷基、C3-C8杂环烷基和杂芳基基团可任选地被1-3个取代基取代，所述取代基选自卤素、–R8、-OR8、–LR9、-LOR9、-N(R9)2、-NR9C(O)R8、-NR9CO2R8、-CO2R8、-C(O)R8和-C(O)N(R9)2；
R11和R12独立地选自H、C1-C6烷基、C1-C6杂烷基、C1-C6卤代烷基、芳基、杂芳基、C3-C8环烷基和C3-C8杂环烷基，其中R11和R12的C1-C6烷基、C1-C6杂烷基、C1-C6卤代烷基、芳基、杂芳基、C3-C8环烷基和C3-C8杂环烷基基团各自可任选地被1-3个取代基取代，所述取代基独立地选自卤素、–CN、R8、–OR8、-C(O)R8、-OC(O)R8、-C(O)OR8、-N(R9)2、-NR8C(O)R8、-NR8C(O)OR8、-C(O)N(R9)2、C3-C8杂环烷基、–S(O)2R8、–S(O)2N(R9)2、-NR9S(O)2R8、C1-C6卤代烷基和C1-C6卤代烷氧基；
或者R11和R12各自独立地是C1-C6烷基，并与它们连接的N原子一起形成可任选被取代的C3-C8杂环烷基环，所述C3-C8杂环烷基环可任选地包含额外的杂原子，所述杂原子选自N、O和S；
各R13独立地选自卤素、–CN、-LR9、-LOR9、-OLR9、-LR10、-LOR10、-OLR10、-LR8、-LOR8、-OLR8、-LSR8、-LSR10、-LC(O)R8、-OLC(O)R8、-LC(O)OR8、-LC(O)R10、-LOC(O)OR8、-LC(O)NR9R11、-LC(O)NR9R8、-LN(R9)2、-LNR9R8、-LNR9R10、-LC(O)N(R9)2、–LS(O)2R8、–LS(O)R8、-LC(O)NR8OH、-LNR9C(O)R8、-LNR9C(O)OR8、–LS(O)2N(R9)2、-OLS(O)2N(R9)2、-LNR9S(O)2R8、-LC(O)NR9LN(R9)2、-LP(O)(OR8)2、-LOP(O)(OR8)2、-LP(O)(OR10)2和-OLP(O)(OR10)2；
各RA独立地选自–R8、–R7、-OR7、-OR8、–R10、-OR10、-SR8、-NO2、-CN、-N(R9)2、-NR9C(O)R8、-NR9C(S)R8、-NR9C(O)N(R9)2、-NR9C(S)N(R9)2、-NR9CO2R8、-NR9NR9C(O)R8、-NR9NR9C(O)N(R9)2、-NR9NR9CO2R8、-C(O)C(O)R8、-C(O)CH2C(O)R8、-CO2R8、-(CH2)nCO2R8、-C(O)R8、-C(S)R8、-C(O)N(R9)2、-C(S)N(R9)2、-OC(O)N(R9)2、-OC(O)R8、-C(O)N(OR8)R8、-C(NOR8)R8、-S(O)2R8、-S(O)3R8、-SO2N(R9)2、-S(O)R8、-NR9SO2N(R9)2、-NR9SO2R8、-P(O)(OR8)2、-OP(O)(OR8)2、-P(O)(OR10)2、-OP(O)(OR10)2、-N(OR8)R8、-CH=CHCO2R8、-C(=NH)-N(R9)2和-(CH2)nNHC(O)R8；或者，环A上的两个毗邻的RA取代基形成5-6元环，所述5-6元环包含至多两个杂原子作为环成员；
每次出现时，n独立地是0、1、2、3、4、5、6、7或8；
各m独立地选自1、2、3、4、5和6，并且
t是1、2、3、4、5、6、7或8；
(b)具有下式的化合物：
其中：
R4选自H、卤素、-C(O)OR7、-C(O)R7、-C(O)N(R11R12)、-N(R11R12)、-N(R9)2、-NHN(R9)2、-SR7、-(CH2)nOR7、-(CH2)nR7、-LR8、-LR10、-OLR8、-OLR10、C1-C6烷基、C1-C6杂烷基、C1-C6卤代烷基、C2-C8烯烃、C2-C8炔烃、C1-C6烷氧基、C1-C6卤代烷氧基、芳基、杂芳基、C3-C8环烷基和C3-C8杂环烷基，其中R4的C1-C6烷基、C1-C6杂烷基、C1-C6卤代烷基、C2-C8烯烃、C2-C8炔烃、C1-C6烷氧基、C1-C6卤代烷氧基、芳基、杂芳基、C3-C8环烷基和C3-C8杂环烷基基团各自可任选地被1-3个取代基取代，所述取代基独立地选自卤素、–CN、-NO2、-R7、-OR8、-C(O)R8、-OC(O)R8、-C(O)OR8、-N(R9)2、-P(O)(OR8)2、-OP(O)(OR8)2、-P(O)(OR10)2、-OP(O)(OR10)2、-C(O)N(R9)2、–S(O)2R8、–S(O)R8、–S(O)2N(R9)2和-NR9S(O)2R8；
各L独立地选自键、-(O(CH2)m)t-、C1-C6烷基、C2-C6亚烯基和C2-C6亚炔基，其中L的C1-C6烷基、C2-C6亚烯基和C2-C6亚炔基各自可任选地被1-4个取代基取代，所述取代基独立地选自卤素、-R8、-OR8、-N(R9)2、-P(O)(OR8)2、-OP(O)(OR8)2、-P(O)(OR10)2和-OP(O)(OR10)2；
R7选自H、C1-C6烷基、芳基、杂芳基、C3-C8环烷基、C1-C6杂烷基、C1-C6卤代烷基、C2-C8烯烃、C2-C8炔烃、C1-C6烷氧基、C1-C6卤代烷氧基和C3-C8杂环烷基，其中R7的C1-C6烷基、芳基、杂芳基、C3-C8环烷基、C1-C6杂烷基、C1-C6卤代烷基、C2-C8烯烃、C2-C8炔烃、C1-C6烷氧基、C1-C6卤代烷氧基和C3-C8杂环烷基基团各自可任选地被1-3个R13基团取代；
各R8独立地选自H、-CH(R10)2、C1-C8烷基、C2-C8烯烃、C2-C8炔烃、C1-C6卤代烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6杂烷基、C3-C8环烷基、C2-C8杂环烷基、C1-C6羟基烷基和C1-C6卤代烷氧基，其中R8的C1-C8烷基、C2-C8烯烃、C2-C8炔烃、C1-C6杂烷基、C1-C6卤代烷基、C1-C6烷氧基、C3-C8环烷基、C2-C8杂环烷基、C1-C6羟基烷基和C1-C6卤代烷氧基基团各自可任选地被1-3个取代基取代，所述取代基选自–CN、R11、-OR11、-SR11、-C(O)R11、-OC(O)R11、-C(O)N(R9)2、-C(O)OR11、-NR9C(O)R11、-NR9R10、-NR11R12、-N(R9)2、-OR9、-OR10、-C(O)NR11R12、-C(O)NR11OH、–S(O)2R11、–S(O)R11、–S(O)2NR11R12、-NR11S(O)2R11、-P(O)(OR11)2和-OP(O)(OR11)2；
各R9独立地选自H、-C(O)R8、-C(O)OR8、-C(O)R10、-C(O)OR10、-S(O)2R10、-C1-C6烷基、C1-C6杂烷基和C3-C6环烷基，或者各R9独立地是C1-C6烷基，所述C1-C6烷基和它们连接的N一起形成C3-C8杂环烷基，其中所述C3-C8杂环烷基环可任选地包含额外杂原子，所述杂原子选自N、O和S，并且其中R9的C1-C6烷基、C1-C6杂烷基、C3-C6环烷基或C3-C8杂环烷基基团各自可任选地被1-3个取代基取代，所述取代基独立地选自–CN、R11、-OR11、-SR11、-C(O)R11、-OC(O)R11、-C(O)OR11、-NR11R12、-C(O)NR11R12、-C(O)NR11OH、-S(O)2R11、-S(O)R11、-S(O)2NR11R12、-NR11S(O)2R11、-P(O)(OR11)2和-OP(O)(OR11)2；
各R10独立地选自芳基、C3-C8环烷基、C3-C8杂环烷基和杂芳基，其中所述芳基、C3-C8环烷基、C3-C8杂环烷基和杂芳基基团可任选地被1-3个取代基取代，所述取代基选自卤素、–R8、-OR8、–LR9、-LOR9、-N(R9)2、-NR9C(O)R8、-NR9CO2R8、-CO2R8、-C(O)R8和-C(O)N(R9)2；
R11和R12独立地选自H、C1-C6烷基、C1-C6杂烷基、C1-C6卤代烷基、芳基、杂芳基、C3-C8环烷基和C3-C8杂环烷基，其中R11和R12的C1-C6烷基、C1-C6杂烷基、C1-C6卤代烷基、芳基、杂芳基、C3-C8环烷基和C3-C8杂环烷基基团各自可任选地被1-3个取代基取代，所述取代基独立地选自卤素、–CN、R8、–OR8、-C(O)R8、-OC(O)R8、-C(O)OR8、-N(R9)2、-NR8C(O)R8、-NR8C(O)OR8、-C(O)N(R9)2、C3-C8杂环烷基、–S(O)2R8、–S(O)2N(R9)2、-NR9S(O)2R8、C1-C6卤代烷基和C1-C6卤代烷氧基；
或者R11和R12各自独立地是C1-C6烷基，所述C1-C6烷基与它们连接的N原子一起形成可任选被取代的C3-C8杂环烷基环，所述C3-C8杂环烷基环可任选地包含额外的杂原子，所述杂原子选自N、O和S；
各R13独立地选自卤素、–CN、-LR9、-LOR9、-OLR9、-LR10、-LOR10、-OLR10、-LR8、-LOR8、-OLR8、-LSR8、-LSR10、-LC(O)R8、-OLC(O)R8、-LC(O)OR8、-LC(O)R10、-LOC(O)OR8、-LC(O)NR9R11、-LC(O)NR9R8、-LN(R9)2、-LNR9R8、-LNR9R10、-LC(O)N(R9)2、–LS(O)2R8、–LS(O)R8、-LC(O)NR8OH、-LNR9C(O)R8、-LNR9C(O)OR8、–LS(O)2N(R9)2、-OLS(O)2N(R9)2、-LNR9S(O)2R8、-LC(O)NR9LN(R9)2、-LP(O)(OR8)2、-LOP(O)(OR8)2、-LP(O)(OR10)2和-OLP(O)(OR10)2；
各RA独立地选自–R8、–R7、-OR7、-OR8、–R10、-OR10、-SR8、-NO2、-CN、-N(R9)2、-NR9C(O)R8、-NR9C(S)R8、-NR9C(O)N(R9)2、-NR9C(S)N(R9)2、-NR9CO2R8、-NR9NR9C(O)R8、-NR9NR9C(O)N(R9)2、-NR9NR9CO2R8、-C(O)C(O)R8、-C(O)CH2C(O)R8、-CO2R8、-(CH2)nCO2R8、-C(O)R8、-C(S)R8、-C(O)N(R9)2、-C(S)N(R9)2、-OC(O)N(R9)2、-OC(O)R8、-C(O)N(OR8)R8、-C(NOR8)R8、-S(O)2R8、-S(O)3R8、-SO2N(R9)2、-S(O)R8、-NR9SO2N(R9)2、-NR9SO2R8、-P(O)(OR8)2、-OP(O)(OR8)2、-P(O)(OR10)2、-OP(O)(OR10)2、-N(OR8)R8、-CH=CHCO2R8、-C(=NH)-N(R9)2和-(CH2)nNHC(O)R8；
每次出现时，n独立地是0、1、2、3、4、5、6、7或8；
各m独立地选自1、2、3、4、5和6，并且
t是1、2、3、4、5、6、7或8；
或者(c)任何(a)或(b)的药学上可接受的盐。
其它苯并萘啶化合物和制备苯并萘啶化合物的方法描述于WO2009/111337。苯并萘啶化合物或其盐可单独使用，或者与一种或多种其它化合物联用。例如，苯并萘啶化合物可与水包油乳液或含矿物质的组合物联用。在一个具体的实施方式中，苯并萘啶化合物与水包油乳液（如鲨烯-水乳液如MF59）或含矿物质的组合物（如无机盐如铝盐或钙盐）联用。
缩氨基硫脲化合物，如参考文献94所述的化合物。参考文献94中也描述了配制、制备和筛选活性化合物的方法。缩氨基硫脲在刺激人外周血单核细胞产生细胞因子如TNF-α方面特别有效。
色胺酮化合物，如参考文献95所述的化合物。参考文献95中也描述了配制、制备和筛选活性化合物的方法。缩氨基硫脲在刺激人外周血单核细胞产生细胞因子如TNF-α方面特别有效。
核苷类似物，如：(a)埃索他宾(Isatorabine)(ANA-245；7-硫杂-8-氧代鸟苷)：
及其前药；(b)ANA975；(c)ANA-025-1；(d)ANA380；(e)参考文献96-98所述的化合物；(f)具有下式的化合物：
其中：
R1和R2各自独立地是H、卤素、-NRaRb、-OH、C1-6烷氧基、取代的C1-6烷氧基、杂环基、取代的杂环基、C6-10芳基、取代的C6-10芳基、C1-6烷基或取代的C1-6烷基；
R3是不存在、H、C1-6烷基、取代的C1-6烷基、C6-10芳基、取代的C6-10芳基、杂环基或取代的杂环基；
R4和R5各自独立地是H、卤素、杂环基、取代的杂环基、-C(O)-Rd、C1-6烷基、取代的C1-6烷基，或者连接在一起形成5元环，如R4-5：
R4-5
所述连接通过所示的键实现
X1和X2各自独立地是N、C、O或S；
R8是H、卤素、-OH、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、-OH、-NRaRb、-(CH2)n-O-Rc、-O-(C1-6烷基)、-S(O)pRe或-C(O)-Rd；
R9是H、C1-6烷基、取代的C1-6烷基、杂环基、取代的杂环基或R9a，其中R9a是：
R9a
所述连接通过所示的键实现
R10和R11各自独立地是H、卤素、C1-6烷氧基、取代的C1-6烷氧基、-NRaRb或-OH；
Ra和Rb各自独立地是H、C1-6烷基、取代的C1-6烷基、-C(O)Rd、C6-10芳基；
各Rc独立地是H、磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、C1-6烷基或取代的C1-6烷基；
各Rd独立地是H、卤素、C1-6烷基、取代的C1-6烷基、C1-6烷氧基、取代的C1-6烷氧基、-NH2、-NH(C1-6烷基)、-NH(取代的C1-6烷基)、-N(C1-6烷基)2、-N(取代的C1-6烷基)2、C6-10芳基或杂环基；
各Re独立地是H、C1-6烷基、取代的C1-6烷基、C6-10芳基、取代的C6-10芳基、杂环基或取代的杂环基；
各Rf独立地是H、C1-6烷基、取代的C1-6烷基、-C(O)Rd、磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯；
各n独立地是0、1、2或3；
各p独立地是0、1或2；或者
或者(g)任何(a)-(f)的药学上可接受的盐，任何(a)-(f)的互变异构体，或者所述互变异构体的药学上可接受的盐。
洛索立宾(Loxoribine)(7-烯丙基-8-氧代鸟苷)(99)。
参考文献100所述化合物，包括：酰基哌嗪化合物、吲哚二酮化合物、四氢异喹啉(THIQ)化合物、苯并环二酮化合物、氨基氮杂乙烯基化合物、氨基苯并咪唑喹啉酮(ABIQ)化合物(101,102)，水合酞酰胺(hydrapthalamide)化合物、苯并苯基酮化合物、异　唑化合物、固醇化合物、喹唑啉酮(quinazilinone)化合物、吡咯化合物(103)、蒽醌化合物、喹喔啉化合物、三嗪化合物、吡唑嘧啶化合物和吲哚化合物(104)。
参考文献105所述化合物。
氨烷基氨基葡糖苷磷酸衍生物，如RC-529(106,107)。
磷腈，如例如参考文献108和109中所述的聚[二(羧基苯氧基)磷腈](poly[di(carboxylatophenoxy)phosphazene])(“PCPP”)。小分子免疫增强剂(SMIP)，例如：
N2-甲基-1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑[4,5-c]喹啉-2,4-二胺；
N2,N2-二甲基-1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑[4,5-c]喹啉-2,4-二胺；
N2-乙基-N2-甲基-1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑[4,5-c]喹啉-2,4-二胺；
N2-甲基-1-(2-甲基丙基)-N2-丙基-1H-咪唑[4,5-c]喹啉-2,4-二胺；
1-(2-甲基丙基)-N2-丙基-1H-咪唑[4,5-c]喹啉-2,4-二胺；
N2-丁基-1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑[4,5-c]喹啉-2,4-二胺；
N2-丁基-N2-甲基-1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑[4,5-c]喹啉-2,4-二胺；
N2-甲基-1-(2-甲基丙基)-N2-戊基-1H-咪唑[4,5-c]喹啉-2,4-二胺；
N2-甲基-1-(2-甲基丙基)-N2-丙-2-烯基-1H-咪唑[4,5-c]喹啉-2,4-二胺；
1-(2-甲基丙基)-2-[(苯基甲基)硫]-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-4-胺；
1-(2-甲基丙基)-2-(丙硫基)-1H-咪唑[4,5-c]喹啉-4-胺；
2-[[4-氨基-1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑[4,5-c]喹啉-2-基](甲基)氨基]乙醇；
2-[[4-氨基-1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑[4,5-c]喹啉-2-基](甲基)氨基]乙酸乙酯；
4-氨基-1-(2-甲基丙基)-1,3-二氢-2H-咪唑[4,5-c]喹啉-2-酮；
N2-丁基-1-(2-甲基丙基)-N4,N4-双(苯基甲基)-1H-咪唑[4,5-c]喹啉-2,4-二胺；
N2-丁基-N2-甲基-1-(2-甲基丙基)-N4,N4-双(苯基甲基)-1H-咪唑[4,5-c]喹啉-2,4-二胺；
N2-甲基-1-(2-甲基丙基)-N4,N4-双(苯基甲基)-1H-咪唑[4,5-c]喹啉-2,4-二胺；
N2,N2-二甲基-1-(2-甲基丙基)-N4,N4-双(苯基甲基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-2,4-二胺；
1-[4-氨基-2-[甲基(丙基)氨基]-1H-咪唑[4,5-c]喹啉-1-基]-2-甲基丙-2-醇；
1-[4-氨基-2-(丙基氨基)-1H-咪唑[4,5-c]喹啉-1-基]-2-甲基丙-2-醇；
N4,N4-二苄基-1-(2-甲氧基-2-甲基丙基)-N2-丙基-1H-咪唑[4,5-c]喹啉-2,4-二胺。
用于本发明的细胞因子诱导剂可以是Toll样受体(TLR)的调节剂和/或激动剂。例如，它们可以是人TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR7、TLR8和/或TLR9蛋白中一种或多种的激动剂。优选的试剂为TLR4（如源自肠细菌脂多糖的改良的天然脂质As、磷脂化合物如合成磷脂二聚体，E6020）、TLR7（如苯并萘啶、咪唑喹啉）和/或TLR9（CpG寡核苷酸）的激动剂。这些药剂可用于激活先天性免疫途径。
可以在本发明组合物生产过程的各个阶段加入细胞因子诱导剂。例如，它可位于抗原组合物内，然后将该混合物加入到水包油乳液中。或者，它可位于水包油乳液中，在这种情况下，可将试剂在乳化之前加入乳液组分，或者可以在乳化之后加入乳液中。类似地，试剂可以凝聚在乳液滴中。细胞因子诱导剂在最终组合物中的位置和分布将取决于其亲水/亲脂特性，例如该药剂可位于水相、油相和/或油水界面上。
该细胞因子诱导剂可偶联于另一种药剂，如抗原(如CRM197)。参考文献110中提供了有关小分子偶联技术的综述。作为替代，佐剂可与其它药剂非共价结合，例如通过疏水作用或离子相互作用。
优选的细胞因子诱导剂是(a)苯并萘啶（benzonapthridine）化合物；(b)免疫刺激性寡核苷酸和(c)3dMPL。
免疫刺激性寡核苷酸可包含核苷酸修饰/类似物如硫代磷酸修饰，可以是双链或（除RNA外）单链。参考文献111、112和113公开了可能的类似物取代，例如用2'-脱氧-7-脱氮鸟苷取代鸟苷。参考文献114-119中进一步讨论了CpG寡核苷酸的佐剂作用。CpG序列可能导向TLR9，例如基序GTCGTT或TTCGTT(120)。CpG序列可特异性诱导Th1免疫应答，例如CpG-A ODN(寡脱氧核苷酸)，或更特异地诱导B细胞应答，例如CpG-B ODN。参考文献121-123中讨论了CpG-A和CpG-B ODN。优选CpG为CpG-A ODN。优选构建CpG寡核苷酸从而5’末端可被受体识别。任选将两个CpG寡核苷酸序列的3’端相连接形成“免疫聚体”。参见例如，参考文献120和124-126。有用的CpG佐剂是CpG7909，也称为PROMUNE(TM)（科雷制药集团公司（Coley Pharmaceutical Group，Inc.））。
作为使用CpG序列的替代或补充，可使用TpG序列(127)。这些寡核苷酸可不含未甲基化的CpG基序。
免疫刺激性寡核苷酸可能富含嘧啶。例如，其可包含一个以上连续的胸腺嘧啶核苷酸（例如参考文献127公开的TTTT）且/或其核苷酸组成中可具有>25%的胸腺嘧啶（例如，>35%、>40%、>50%、>60%、>80%等）。例如，它可能含有一个以上连续的胞嘧啶核苷酸(例如，参考文献127所公开的CCCC)，和/或它的核苷酸组成中可能含有>25%胞嘧啶(例如>35%、>40%、>50%、>60%、>80%等)。这些寡核苷酸可不含未甲基化的CpG基序。
免疫刺激性寡核苷酸通常包含至少20个核苷酸。其可包含少于100个核苷酸。
3dMPL(也称为3脱-O-酰化单磷酰脂质A或3-O-脱酰化4'-单磷酰脂质A)是单磷酰脂质A的还原性末端葡糖胺的3位脱酰化的佐剂。3dMPL可由明尼苏达沙门菌(Salmonella minnesota)的无庚糖突变体制备，在化学上类似于脂质A，但缺少酸不稳定性磷酰基和碱不稳定性酰基。它能激活单核细胞/巨噬细胞谱系的细胞，并刺激释放几种细胞因子，包括IL-I、IL-12、TNF-α和GM-CSF（参见参考文献128）。参考文献129最先描述了3dMPL的制备。
3dMPL可以取酰基化不同的相关分子(如具有3、4、5或6个酰基链，它们的长度可以不同)的混合物的形式。两个葡糖胺(也称为2-脱氧-2-氨基-葡萄糖)单糖在其2-位(即2和2'位)碳上N-酰基化，3'位上也有O-酰基化。连接于C2的基团具有下式：-NH-CO-CH2-CR1R1'。连接于碳2'的基团具有下式：-NH-CO-CH2-CR2R2'。连接于C3'的基团具有下式：-O-CO-CH2-CR3R3'。代表性结构为：
基团R1、R2和R3各自独立地是-(CH2)n-CH3。n值优选为8-16，更优选为9-12，最优选为10。
基团R1'、R2'和R3'各自独立地是：(a)-H；(b)-OH；或(c)-O-CO-R4，其中R4是-H或-(CH2)m-CH3，其中m值优选为8-16，更优选为10、12或14。在2位上，m优选为14。在2'位上，m优选为10。在3'位上，m优选为12。因此基团R1'、R2'和R3'优选为来自十二烷酸、十四烷酸或十六烷酸的-O-酰基。
R1'、R2'和R3'均为-H时，3dMPL仅含有3条酰基链(2、2'和3'位上各有一条)。R1'、R2'和R3'中仅有两个是-H时，3dMPL可含有4条酰基链。R1'、R2'和R3'中仅有一个是-H时，3dMPL可含有5条酰基链。R1'、R2'和R3'中没有一个是-H时，3D-MPL可含有6条酰基链。本发明所用的3dMPL佐剂可以是含有3-6条酰基链的这些形式的混合物，但混合物中优选包含具有6条酰基链的3dMPL，具体说，保证6条酰基链的形式占3dMPL总重的至少10%，例如>20%、>30%、>40%、>50%或更多。发现具有6条酰基链的3dMPL是佐剂活性最高的形式。
因此，本发明组合物包含的3dMPL的最优选形式具有下式(IV)。
以混合物的形式使用3dMPL时，提到3dMPL在本发明组合物中的含量或浓度，是指混合物中的混合3dMPL物质。
在水性条件下，3dMPL可形成不同大小如直径<150nm或>500nm的胶束聚集体或颗粒。胶束聚集体或颗粒中的一种或两种可用于本发明，可通过常规试验选择较好的颗粒。本发明优选使用较小的颗粒（例如小到足以产生澄清的3dMPL水性悬液），因为其具有优良的活性(130)。优选颗粒的平均直径小于220nm，更优选小于200nm或小于150nm或小于120nm，甚至平均直径小于100nm。然而在大多数情况下，所述平均直径不小于50nm。这些颗粒足够小，适合过滤除菌。可用揭示平均粒径的常规动态光散射技术评价粒径。在称颗粒的直径为x nm时，颗粒通常分布在此平均值附近，但至少50数量%(例如>60%、>70%、>80%、>90%或更多)颗粒的直径在x+25%的范围内。
3dMPL宜与水包油乳液联用。基本上所有3dMPL均位于该乳液的水相中。
3dMPL可以单独使用，或者与一种或多种其它化合物联用。例如，已知将3dMP与以下物质联用：QS21皂苷(131)(包含在水包油乳液中(132))、免疫刺激性寡核苷酸、QS21和免疫刺激性寡核苷酸、磷酸铝(133)、氢氧化铝(134)或磷酸铝和氢氧化铝。
式(IV)
脂肪佐剂
本发明可使用的脂肪佐剂包括上述水包油乳液，还包括例如：
式I、II或III的磷脂化合物或其盐：
I          II          III
如参考文献135所述，例如‘ER803058’、‘ER803732’、‘ER804053’、ER804058’、‘ER804059’、‘ER804442’、‘ER804680’、‘ER804764’、ER803022或‘ER804057’，如：
ER804057
ER-803022。
ER804057还称为E6020。式I、II或III的磷脂化合物或其盐可单独使用，或者与一种或多种其它化合物联用。例如，式I、II或III的化合物可与水包油乳液或含矿物质的组合物联用。在具体的实施方式中，E6020与水包油乳液（如鲨烯-水乳液如MF59）或含矿物质的组合物（如无机盐如铝盐或钙盐）联用。
大肠杆菌(Escherichia coli)如OM-174的脂质A的衍生物(如参考文献136和137所述)。
阳离子脂质与(通常为中性)共脂质(co-lipid)，如氨基丙基-二甲基-肉豆蔻烯酰氧基-溴化丙铵-二植酰基磷脂酰-乙醇胺("VAXFECTIN(TM)")或氨基丙基-二甲基-双十二烷基氧基-溴化丙铵-二油酰基磷脂酰-乙醇胺("GAP-DLRIE:DOPE")的制剂。优选含有(+)-N-(3-氨基丙基)-N,N-二甲基-2,3-双(顺-9-四癸烯氧基)-1-丙铵盐的制剂(138)。
3-O-脱酰化单磷酰脂质A(见上)。
含有连接于含磷酸无环主链的脂质的化合物，如TLR4拮抗剂E5564(139,140)：
脂肽（即含一种或多种脂肪酸残基和两种或更多氨基酸残基的化合物），如基于甘油半胱氨酸的脂肽。该肽的特定例子包括具有下式的化合物
其中R1和R2各代表具有8-30，优选11-21个碳原子的饱和或不饱和，脂族或混合的脂族-脂环族烃基，其也任选地由氧功能团取代，R3代表氢或基团R1-CO-O-CH2-，其中R1与上述相同，且X代表肽键结合的氨基酸，其含游离、酯化或酰胺化的羧基或末端羧基基团为游离、酯化或酰胺化的2-10个氨基酸的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述氨基酸序列含D-氨基酸，例如D-谷氨酸(D-Glu)或D-γ-羧基-谷氨酸(D-Gla)。
细菌脂肽通常识别TLR2，不需要TLR6参与。（TLR协同操作以提供各种激发物的特异识别，TLR2和TLR6一起识别肽聚糖，而TLR2识别脂肽但不需要TLR6。）这些有时分类为天然脂肽和合成脂肽。合成脂肽往往表现相似，且主要被TLR2识别。
适合用作佐剂的脂肽包括具有下式的化合物：
其中*标记的手性中心和***标记的手性中心都处于R构型；
**标记的手性中心为R或S构型；
R1a和R1b各自独立为具有7-21个碳原子的脂族或脂环族-脂族烃基基团，任选由氧功能团取代，或者R1a和R1b之一但非全部是H；
R2是具有1-21个碳原子的脂族或脂环族烃基基团且任选由氧功能团取代；
n是0或1；
As代表–O-Kw-CO-或–NH-Kw-CO-，其中Kw是具有1-12碳原子的脂族烃基基团；
As1是D-或L-α-氨基酸；
Z1和Z2各自独立代表–OH或者氨基-(低级烷烃)-磺酸的D-或L-α-氨基酸N末端基团或选自D-和L-α氨基羧酸和氨基-低级烷基-磺酸的至多6个氨基酸的肽的N末端基团；和
Z3为H或–CO-Z4，其中Z4为–OH或者氨基-(低级烷烃)-磺酸的D-或L-α-氨基酸N末端基团或选自D-和L-α氨基羧酸和氨基-低级烷基-磺酸的至多6个氨基酸的肽的N末端基团；或从所述化合物的羧酸形成的酯或酰胺。合适的酰胺包含–NH2和NH（低级烷基），合适的酯包含C1-C4烷基酯。（本文所用的低级烷基或低级烷烃指C1-C6直连或支链烷基）。
所述化合物在US4,666,886中更详细描述。在一个具体实施方式中，所述脂肽具有式：
。
脂肽种类的另一示例称为LP40，且其是TLR2的激动剂。Akdis等,Eur.J.Immunology,33:2717-26(2003)。
这些涉及来自大肠杆菌的已知脂肽种类，称为胞壁质脂蛋白。这些蛋白的某些部分降解产物称为胞壁质脂肽，描述于Hantke等,Eur.J.Biochem.,34:284-296(1973)。这些包含连接N-乙酰胞壁酸的肽且因此涉及胞壁酰肽，描述于Baschang等,Tetrahedron,45(20):6331-6360(1989)。
铝盐佐剂
可采用称为“氢氧化铝”和“磷酸铝”的佐剂。这些名称是常规名称，但仅为方便使用，因为它们都不是所代表的实际化合物的准确描述（例如参见参考文献74的第9章）。本发明可采用通常用作佐剂的任何"氢氧化物"或"磷酸盐"佐剂。
称为"氢氧化铝"的佐剂一般是羟基氧化铝盐，其通常至少部分为晶体。羟基氧化铝以分子式AlO(OH)表示，其可通过红外(IR)光谱与其它铝化合物，例如氢氧化铝Al(OH)3的区别开，特别是在1070cm-1处存在吸收带和在3090-3100cm-1处存在强烈的肩峰（参考文献74的第9章）。衍射带半峰高处的宽度(WHH)反映了氢氧化铝佐剂的结晶程度，结晶不佳的颗粒因晶体尺寸较小而显示更强的谱线增宽。表面积随WHH的增加而增加，WHH值较大的佐剂显示吸附抗原的能力较强。氢氧化铝佐剂呈典型的纤维形态(例如，由电子透射显微照片所见)。氢氧化铝佐剂的pI通常约11，即在生理pH下佐剂本身具有表面正电荷。据报道，pH7.4时，氢氧化铝佐剂的吸附能力在每mg Al+++1.8-2.6mg蛋白质之间。
称为"磷酸铝"的佐剂一般是羟基磷酸铝，常常还含有少量硫酸盐(即羟基磷酸硫酸铝)。其可通过沉淀获得，沉淀期间的反应条件和浓度影响磷酸根取代所述盐中羟基的程度。羟基磷酸盐的PO4/Al摩尔比通常为0.3-1.2。羟基磷酸盐因存在羟基而有别于严格的AlPO4。例如，3164cm-1的IR光谱带(例如，当加热至200℃时)表明存在结构性羟基（参考文献74的第9章）。
磷酸铝佐剂的PO4/Al3+摩尔比通常为0.3-1.2，优选为0.8-1.2，更优选为0.95+0.1。磷酸铝通常是无定形的，尤其是羟基磷酸盐。典型的佐剂是PO4/Al摩尔比为0.84-0.92的无定形的羟基磷酸铝，包含0.6mg Al3+/ml。磷酸铝通常是颗粒(如在透射电子显微镜照片上观察到的片状形态)。任何抗原吸附后颗粒直径一般是0.5-20μm(如约5-10μm)。据报道，pH7.4时磷酸铝佐剂的吸附容量为0.7-1.5毫克蛋白质/毫克Al+++。
磷酸铝的零电点(PZC)与磷酸对羟基的取代程度逆相关，这种取代程度的变化可取决于通过沉淀制备盐的反应条件和反应物浓度。也通过改变溶液中游离磷酸根离子的浓度(更多磷酸根=更酸性PZC)或加入缓冲剂如组氨酸缓冲剂(使PZC碱性更强)来改变PZC。本发明所用的磷酸铝的PZC通常为4.0-7.0，更优选为5.0-6.5，例如约为5.7。
用于制备本发明组合物的铝盐悬浮液可含有缓冲剂(如磷酸盐或组氨酸或Tris缓冲剂)，但并不必需。该悬浮液优选无菌且无热原。悬浮液可含有游离的水性磷酸根离子，如存在浓度为1.0-20mM，优选5-15mM，更优选约10mM。该悬浮液也可含有氯化钠。
本发明可使用氢氧化铝和磷酸铝的混合物。在这种情况下，磷酸铝可多于氢氧化铝，例如重量比为至少2:1，例如，>5:1、>6:1、>7:1、>8:1、>9:1等。
给予患者的组合物中Al+++的浓度优选小于10mg/ml，例如<5mg/ml、<4mg/ml、<3mg/ml、<2mg/ml、<1mg/ml等。优选范围是0.3-1mg/ml。优选0.85mg/剂的最大值。
除包含一种或多种铝盐佐剂外，佐剂组分还可包含一种或多种其它佐剂或免疫刺激剂。其它这类组分包括但不限于：苯并萘啶化合物，3-O-脱酰化单磷酰脂质A佐剂('3d-MPL')；和/或水包油乳液。3dMPL也称为3脱-O-酰化单磷酰脂质A或3-O-脱酰化4'-单磷酰脂质A。该命名表明单磷酰脂质A的还原性末端葡糖胺的3位脱酰化。它是由明尼苏达沙门菌(S.minnesota)的无庚糖突变体制备，在化学上类似于脂质A，但缺少酸不稳定性磷酰基和碱不稳定性酰基。它能激活单核细胞/巨噬细胞谱系的细胞，并刺激释放数种细胞因子，包括IL-I、IL-12、TNF-α和GM-CSF。最初在参考文献129中描述了3d-MPL的制备，该产品由Corixa Corporation生产并以商品名MPL(TM)出售。其它详情可参见参考文献82-85。
使用氢氧化铝和/或磷酸铝佐剂是有益的，在儿童中特别如此，且抗原通常吸附于这些盐。也优选水包鲨烯乳液，特定在老年人中。有用的佐剂组合包括Th1和Th2佐剂的组合，如CpG和明矾或雷西莫特和明矾。可以使用磷酸铝和3dMPL的组合。其他可用的组合包括：明矾和苯并萘啶化合物或SMIP、水包鲨烯乳液（如MF59）和苯并萘啶化合物或SMIP，以及E6020和水包鲨烯乳液（如MF59）或明矾。
本发明组合物可引起细胞介导的免疫反应以及体液免疫反应。
通常认为两种T细胞类型CD4和CD8细胞是启动和/或增强细胞介导免疫和体液免疫所必需的。CD8T细胞可表达CD8共受体，通常称为细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。CD8T细胞能够识别MHC I型分子上展示的抗原或与之相互作用。
CD4T细胞可表达CD4共受体，并通常称为T辅助细胞。CD4T细胞能够识别结合MHC II型分子的抗原性肽。与MHC II型分子相互作用后，CD4细胞可分泌诸如细胞因子等因子。这些分泌的细胞因子可激活B细胞、细胞毒性T细胞、巨噬细胞和参与免疫反应的其它细胞。辅助T细胞或CD4+细胞可进一步分为两个功能不同的亚组：即细胞因子和效应功能不同的TH1表型和TH2表型。
活化的TH1细胞能增强细胞免疫(包括抗原特异性CTL生成增加)，因而对响应胞内感染具有特定价值。活化的TH1细胞可分泌IL-2、IFN-γ和TNF-β中的一种或多种。TH1免疫反应可通过激活巨噬细胞、NK(自然杀伤)细胞和CD8细胞毒性T细胞(CTL)导致局部炎症反应。通过用IL-12刺激B和T细胞的生长，TH1免疫反应也可用于放大免疫反应。TH1刺激的B细胞可分泌IgG2a。
活化的TH2细胞提高抗体生成，因此对响应胞外感染具有价值。活化的TH2细胞可分泌IL-4、IL-5、IL-6和IL-10中的一种或多种。TH2免疫反应可引起生成IgG1、IgE、IgA和记忆B细胞来用于未来的保护。
增强的免疫反应可包括增强的TH1免疫反应和TH2免疫反应中的一种或多种。
TH1免疫反应可包括以下一种或多种：CTL增加，与TH1免疫反应相关的一种或多种细胞因子（如IL-2、IFN-γ和TNF-β）增加，活化巨噬细胞增加，NK活性增加，或者IgG2a生成增加。增强的TH1免疫反应优选包括IgG2a生成增加。
可使用TH1佐剂引发TH1免疫反应。相对于不用佐剂的抗原免疫，TH1佐剂通常引起IgG2a生成水平增加。适用于本发明的TH1佐剂可包括例如，皂苷制剂、病毒体和病毒样颗粒、肠细菌脂多糖(LPS)的无毒衍生物、免疫刺激性寡核苷酸。免疫刺激性寡核苷酸，如含有CpG基序的寡核苷酸是本发明所用的优选TH1佐剂。
TH2免疫反应可包括以下一种或多种：与TH2免疫反应相关的一种或多种细胞因子（如IL-4，IL-5，IL-6和IL-10）增加，或者IgG1、IgE、IgA和记忆B细胞生成增加。增强的TH2免疫反应优选包括IgG1生成增加。
可使用TH2佐剂引发TH2免疫反应。相对于不用佐剂的抗原免疫，TH2佐剂通常引起IgG1生成水平增加。适用于本发明的TH2佐剂包括例如，含矿物质组合物、油乳剂和ADP-核糖基化毒素及其脱毒衍生物。含矿物质组合物如铝盐是本发明使用的优选TH2佐剂。
组合物可包括TH1佐剂和TH2佐剂的组合。这种组合物优选引起增强的TH1和增强的TH2反应，即IgG1和IgG2a的生成相对于不用佐剂的免疫均有增加。更优选地，相对于用单一佐剂的免疫(即，相对于只用TH1佐剂的免疫或只用TH2佐剂的免疫)，包含TH1和TH2佐剂组合的组合物引起TH1和/或TH2免疫应答增强。
所述免疫反应可以是TH1免疫反应和TH2免疫反应之一或两种。免疫反应优选提供增强的TH1反应和增强的TH2反应之一或两种。
增强的免疫反应可以是全身免疫反应和粘膜免疫反应之一或两种。该免疫反应优选提供增强的全身免疫反应和增强的粘膜免疫反应之一或两种。优选粘膜免疫反应为TH2免疫反应。粘膜免疫反应优选包括IgA生成增加。
治疗方法和给药
本发明组合物适合给予哺乳动物，且本发明提供了在哺乳动物中诱导免疫应答的方法，所述方法包括将本发明组合物（如免疫原性组合物）给予哺乳动物的步骤。所述组合物（如免疫原性组合物）可用于生成疫苗制剂以免疫哺乳动物。所述哺乳动物一般是人，且所述RSV F蛋白一般是人RSV F蛋白。然而，所述哺乳动物可为任何其他易于感染RSV的哺乳动物，如可感染牛RSV的牛。例如，所述免疫应答可在给予经纯化RSV F蛋白、α病毒颗粒或自复制RNA后产生。
本发明还提供两种或更多种融合前嵌合蛋白的应用，所述融合前嵌合蛋白基于两种或更多种不同的非RSV(例如，副流感病毒、偏肺病毒)F融合前蛋白(即，PIV5和NDV)，所述F融合前蛋白各自具有在所述蛋白质表面上突变的相同RSV F中和表位。因此，用一次嵌合型融合前F接种，并用第二种融合前F二次接种可引发若干抗体，一些针对RSV而一些针对所述模板蛋白质主链。所述二次接种可以仅偏性增强所述共有的RSV F中和表位。
本发明还提供本发明组合物用作药物，例如用于免疫患者抵御RSV感染。
本发明还提供上述多肽在生产引起患者免疫应答的药物中的应用。
这些方法和应用引起的免疫应答通常包括抗体应答，优选保护性抗体应答。评价RSV疫苗免疫后抗体应答的方法为本领域熟知。
本发明的组合物可以多种合适方式给予，如肌肉内注射（如入臂或腿中）、皮下注射、鼻内给药、口服给药、皮内给药、经皮给药、透皮给药等。给药的合适途径取决于所述哺乳动物的年龄、健康和其他特征。临床医生能基于这些和其他因素确定给药的合适途径。
免疫原性组合物和疫苗制剂可用于治疗儿童和成年人，包括孕妇。因此，对象可小于1岁、1-5岁、5-15岁、15-55岁或至少55岁。接受所述疫苗的优选对象为老年人（如>50岁、>60岁且优选>65岁）、年轻人（如<6岁，如4-6岁、<5岁）和孕妇。然而所述疫苗不仅适用于这些人群，还可用于更广泛的群体。
可通过单剂量方案或多剂量方案进行治疗。多剂量可用于初免方案和/或加强免疫方案。在多剂量方案中，可通过相同或不同的途径给予各剂量，如胃肠道外初次和粘膜加强、粘膜初次和胃肠道外加强等。对于首次免疫(immunologically 
Figure BDA0000455572550000671
)患者，给予超过一个剂量(一般是两个剂量)特别有效。一般以至少1周（例如约2周、约3周、约4周、约6周、约8周、约10周、约12周、约16周等）的间隔给予多个剂量。
用本发明组合物生产的疫苗制剂可与其它疫苗在基本相同的时间(例如在向医疗保健专业人员或疫苗接种中心的同一次医疗咨询或就诊期间)给予患者。
概述
术语“包含”涵盖“包括”以及“由…组成”和“主要由…组成”，例如，“包含”X的组合物可以仅由X组成或可以包括其它物质，例如X+Y。
术语“基本上”不排除“完全”，如“基本上不含”Y的组合物可完全不含Y。必要时，术语“基本上”可从本发明定义中省略。
与数值x相关的术语“约”表示例如，x±10%。
除非另有明确说明，包括混合两种或更多种组分的步骤的工艺不要求任何特定的混合顺序。因此，组分可以任何顺序混合。有三种组分时，可将两种组分相互合并，然后可将该组合与第三种组分混合等。
将动物（且具体是牛）材料用于培养细胞时，其应获自未患传染性海绵状脑病（TSE），具体是未患牛海绵状脑病（BSE）的来源。总之，优选在完全不含动物来源材料的情况下培养细胞。
将化合物作为组合物的一部分给予机体时，该化合物可另外由合适的前药替代。
当细胞基质用于重组或反向遗传学方法时，优选经批准用于人类疫苗生产的那些，例如Ph Eur（《欧洲药典》）总纲5.2.3所列的那些。
优选通过MPSRCH程序（牛津分子科技公司(Oxford Molecular)）中设置的Smith-Waterman同源性搜索算法，利用仿射缺口搜索测定多肽序列之间的相同性，其中参数为缺口开放罚分=12、缺口延伸罚分=1。
表2磷脂
DDPC 1,2-二癸酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱
DEPA 1,2-二芥酰-sn-甘油-3-磷酸酯
DEPC 1,2-芥酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱
DEPE 1,2-二芥酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺
DEPG 1,2-二芥酰-sn-甘油-3-[磷脂酰-外消旋-(1-甘油...)
DLOPC  1,2-亚麻酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱
DLPA 1,2-二月桂酰-sn-甘油-3-磷酸酯
DLPC 1,2-二月桂酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱
DLPE 1,2-二月桂酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺
DLPG 1,2-二月桂酰-sn-甘油-3-[磷脂酰-外消旋-(1-甘油...)
DLPS 1,2-二月桂酰-sn-甘油-3-磷脂酰丝氨酸DMG1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺
DMPA   1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸酯
DMPC   1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱
DMPE   1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺
DMPG   1,2-肉豆蔻酰-sn-甘油-3-[磷脂酰-外消旋-(1-甘油...)
DMPS   1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷脂酰丝氨酸
DOPA   1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸酯
DOPC 1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱
DOPE 1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺DOPG  1,2-二油酰-sn-甘油-3-[磷脂酰-外消旋-(1-甘油...)
DOPS 1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷脂酰丝氨酸
DPPA 1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸酯
DPPC 1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱
DPPE 1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺
DPPG 1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-[磷脂酰-外消旋-(1-甘油...)
DPPS 1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷脂酰丝氨酸
DPyPE   1,2-二植烷酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺
DSPA 1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸酯
DSPC 1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱
DSPE 1,2-二硬脂酰(Diostearpyl)-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺
DSPG 1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-[磷脂酰-外消旋-(1-甘油...)
DSPS 1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷脂酰丝氨酸
EPC   蛋-PC
HEPC 氢化蛋PC
HSPC 高纯度氢化大豆PC
HSPC 氢化大豆PC
LYSOPC MYRISTIC 1-肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱
LYSOPC PALMITIC 1-棕榈酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱
LYSOPC STEARIC  1-硬脂酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱
乳鞘磷脂MPPC  1-肉豆蔻酰,2-棕榈酰-sn-甘油3-磷脂酰胆碱
MSPC 1-肉豆蔻酰,2-硬酯酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱
PMPC 1-棕榈酰,2-肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱
POPC 1-棕榈酰,2-油酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱
POPE 1-棕榈酰,2-油酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺
POPG 1,2-二油酰-sn-甘油-3-[磷脂酰-外消旋-(1-甘油)...]
PSPC 1-棕榈酰,2-硬脂酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱
SMPC 1-硬脂酰,2-肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱
SOPC 1-硬脂酰,2-油酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱
SPPC 1-硬脂酰,2-棕榈酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱
实施例
1.融合后结构和融合前模型
融合后RSV F结构
通过使所述融合肽、跨膜区域和胞质结构域缺失来制备稳定、非聚集性可溶的RSV F亚基抗原(图1)。这种工程改造的F有效表达且易于纯化。负染样品的电子显微照片显示形成非聚集性、均匀拐杖形分子，与融合后F三聚体一致(图2A)。该工程改造的F三聚体稳定，且圆二色谱显示当温度最高至95℃时没有明显解链(图2B和2C)。
所述RSV F蛋白是结晶化的，并且通过分子取代和三倍非晶体学对称(NCS)平均化来测定其结构(表3和图3)。所述结构不包括所述p27片段(在所述两个弗林蛋白酶位点之间的肽，该肽在切割后丢失)、所述融合肽、所述跨膜区域和所述胞质结构域(图4)。
表3.晶体学数据
Figure BDA0000455572550000701
Figure BDA0000455572550000711
￥括号中的值指最高分辨率壳结构中的数据
Figure BDA0000455572550000712
重折光校正后的数据统计。
重折光校正后的数据的细化值。
融合后RSV F与其它融合后副流感融合蛋白的总体结构相同。所述蛋白质由三个紧密缠结的亚基组成，形成球状头部和细长的茎部。各亚基包含三个结构域，称为I、II和III(图4A-C)。结构域I和II在所述三聚头部的顶端，并且形成三角形冠状。结构域III形成所述头部的基底。长螺旋(HRA)从结构域III延伸并形成所述茎部中心内的三聚卷曲螺旋。所述HRB螺旋连接结构域II，并向下触及所述茎部的头远端，其在那里与所述HRA内卷曲螺旋形成六螺旋束的外卷圈(outer coil)。在全长F中，所述疏水性融合肽(HRA的N末端)和所述跨膜区域(HRB的C末端)会并列在所述茎部底端并插入靶细胞膜。
RSV的结构域I和II、副流感病毒3(PIV3)和副流感病毒5(PIV5)F蛋白是结构保守的(图5A和5B)。唯一显著的差异在于结构域I的唯一螺旋(RSV F的η3，和PIV3与PIV5F的α6)相对于它们的共同β片层的方向。相反，RSV F结构域III具有不能从基于副流感病毒的模型预测的特征(图6)。当RSV F结构域III和PIV3F结构域III的四链β片层重叠时，所述结构域螺旋区域中的关键差异是明显的。与在PIV3F中相比，螺旋HRA的扭结(kink)在RSV F中在更N末端位置处，导致头部相对茎部的旋转有约60°的差异(图6A、6B、6D)。流感血细胞凝集素就其头部相对于其茎部的方向而言也有不同，亚型之间的旋转差异在30°-50°。(Ha,Y.等,Embo Journal21,865-875(2002))。所述RSV F结构域III的螺旋束区域包含额外的螺旋(α6)，改变了所述成束螺旋相对于副流感F中那些的方向(图6A-C和图1)。RSV F螺旋α5和α6几乎是平行的，并且暴露在所述三聚体的表面上；所述PIV3螺旋束中的RSV Fα6螺旋等同物(α5，图6C)掩埋在所述三聚体的亚基间界面处。RSV F螺旋α5和α6形成相关中和抗体帕利珠单抗或莫维珠单抗所结合的表位。莫维珠单抗Fab和包括α5和α6的24残基RSV F肽之间复合体的结构已有报道(McLellan等，Nat Struct Mol Biol17,248-250(2010))。该结构与融合后RSVF结构之间的比较揭示α5-α6螺旋之间的近似匹配(图7A)。基于这些螺旋来叠合这两种结构模拟了莫维珠单抗和融合后RSV F的复合体(图7B)。该模型揭示没有阻碍莫维珠单抗(或帕利珠单抗)结合融合后RSV F的位阻。用表面等离振子共振证实了溶液中帕利珠单抗与融合后F胞外域的结合(KD of4.2x10-10M)。
融合前和融合后副流感F结构显示结构域的整体迁移和HRA与HRB的大幅重排。在所述融合前PIV5F结构(唯一有报道的融合前副流感病毒F结构)的结构域III中，HRA折叠成三个α-螺旋和两个β-链而不是所述融合后长HRA螺旋(Yin,H.S.等.Nature439,38-44(2006))。然而，当比较个体副流感病毒F蛋白结构域的融合前和融合后构象时，所述非重排部分完好叠合。使融合后RSV F结构域在其融合前PIV5F配对物上叠合没有导致较大冲突，并且定位了全部半胱氨酸对，所述半胱氨酸对接近形成结构域间的二硫键(图8B)。
所得的融合前RSV F模型显示出在基于PIV5融合前结构域结构模拟的融合前RSV F结构域(McLellan,J.S.等.Nat Struct Mol Biol17,248-250(2010))中未显现的特征。所述莫维珠表位的螺旋暴露在所述融合前RSV F三聚体的表面上，正如它们在融合后RSV F三聚体上一样(图9)。在现有的融合前RSV F模型中，连接β4和HRC(结构域III的部分)的环会阻碍帕利珠单抗或莫维珠单抗接触所述表位。然而，所述环可能具备足够灵活性以采取其它构象来允许抗体结合(图9B)。
通过多种技术比对了RSV F抗原结构(图1)。记录最完善的表位簇被称为A和C(Beeler,J.A.和van Wyke Coelingh,K.J Virol63,2941-2950(1989))，并且其它表位簇已经被提出。莫维珠单抗-肽结构确证了位点A的位置，尽管对所述位点在RSV F三聚体上的暴露仍有问题(McLellan,J.S.等.Structural basis ofrespiratory syncytial virus neutralization by motavizumab(通过莫维珠单抗中和呼吸道合胞病毒的结构基础).Nat Struct Mol Biol17,248-250(2010))；与所述101F中和抗体结合的RSV F肽(残基422-436)的晶体结构确证了位点C的位置(McLellan,J.S.等.J Virol84,12236-12244(2010))。RSV F的融合后结构和融合前RSV F模型表明位点A和C保持暴露并在两个构象中结构相似(图8A和8B)。叠合在RSV F融合前模型和融合后结构上的101F-肽复合物证实，101F不会与各构象中的F发生抵触(图10)。
附录中提供所述RSV F融合前模型的PDB文件，所述RSV F融合前模型基于所述RSV F融合后结构并且序列/结构域与所述PIV5融合前结构对齐。所述PDB文件包含所述融合前模型的原子坐标，并且可与合适的软件联用以供分子显像与分析(例如，Roger Sayle和E.James Milner-White."RasMol:Biomoleculargraphics for all(RasMol：万用生物分子图形)",Trends in Biochemical Sciences(TIBS),1995年9月,第20卷,第9号,第374页.)以显示所述模型。所述模型包括与所述融合肽链接的三个亚基，且HRA区域如在PIV5中一样折叠，明显与DIII接触。所述三个亚基的HRB区域三体化(trimerize)成所述融合前茎部，并且与D1和DII相关联。
2.通过HRB螺旋缺失使融合后六螺旋束失稳
设计HRB缺失的构建体以防止形成所述融合后构象。设计了两种构建体以落实该方案。所述第一种是缺乏HRB区域(RSV F残基1-483)的野生型胞外域，称作De1HRB：
下方所示序列包含信号肽和HIS标签(GGSAGSGHHHHHH;SEQ ID NO:3)。本发明的融合前RSV F蛋白可包含如下示出的氨基酸序列，包含或不含所示信号肽和/或HIS标签。
>RSV F缺失HRB HIS(SEQ ID NO:28)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSGGSAGSGHHHHHH
上述序列具有两个未改变的弗林蛋白酶切割位点，并且预计由细胞加工。此外，上述序列具有野生型融合肽序列。在先前的实验中，当基于RSV F胞外域的蛋白质被细胞切割且含有融合肽时，它们以RSV F玫瑰花结形式与细胞碎片形成可溶的聚集体。如果该构建体保持在所述融合前构象(归因于缺乏所述HRB螺旋，该HRB螺旋被认为是融合后构象所需)，那么所述融合肽应该掩埋在所述RSV F头部内，并且应不形成玫瑰花结聚集体。使该构建体表达，通过亲和纯化法纯化并通过EM分析评价(图12)。
通过其在SEC柱上空穴体积中的迁移，并且由EM显微照片清楚地看出，所述构建体形成的玫瑰花结与由融合后RSV F蛋白形成的玫瑰花结相似。这是令人吃惊的结果，因为已假设HRB是使HRA稳定在其伸长的螺旋形成所需(由于观察到HRA肽不形成三聚体)。因此，我们假设所述融合肽彼此结合或与细胞碎片结合使HRA螺旋稳定在其伸长的、融合后形式。
我们假设了所述缺失HRB(DelHRB)构建体的融合后样表型是归因于通过所述融合肽彼此结合或与细胞碎片结合而使HRA稳定在伸长的螺旋。为了测试该假设，我们生成了如下构建体(DelHRB融合肽缺失：下方)，该构建体与所述DelHRB相似，但具有与我们的融合后三聚体一致的融合肽缺失。我们将通过EM显微镜测试所述构建体的表型，以观察其是否形成与缺失HRB(DelHRB)玫瑰花结中观察到的融合后样表型相似的拐杖样结构，或者所述构建体是否形成融合前头部形状，该形状与文献报道的棒棒糖表型的球形相似。
下方所示序列包含信号肽和HIS标签(GGSAGSGHHHHHH;SEQ ID NO:3)。本发明的融合前RSV F蛋白可包含如下示出的氨基酸序列，包含或不含所示信号肽和/或HIS标签。
>RSV F缺失HRB(DelHRB)融合肽缺失HIS(SEQ ID NO:10)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSGGSAGSGHHHHHH
3.利用链内二硫键形成的融合前稳定化
采用基于RSV F融合后结构和PIV5融合前结构的RSV F模型来工程改造半胱氨酸突变，所述半胱氨酸突变意在形成使RSV F稳定在融合前构象的二硫键(图11)。使所述链内二硫键构建体表达，并从细胞分泌进入培养基，然后以不同程度从F0切割成F1/F2(图14)。发现RSV F T58C/V164C(在哺乳动物细胞内表达)表达为经切割的物质，该物质分泌进入培养基。所述物质通过螯合纯化法纯化，并通过玫瑰花结/三聚体HPLC-SEC法，使用Bio-Sil250SEC柱采用2×PBS作为流动相来进行评价(图15)。由于这是经切割的含融合肽的F，预计其会是融合后形式，并且会形成玫瑰花结，并且以与融合后RSV F玫瑰花结类似的形式在空穴体积中迁移(图15A)。如果容纳了融合肽的经切割F蛋白折叠成融合前形式，那么预计所述融合肽会掩埋在所述融合前头部区域内防止玫瑰花结形成。融合前三聚体应该在渗入体积内迁移，保留时间与缺乏所述融合肽的RSV F融合后三聚体相似(图15B)。使RSV F HRA二硫化T58C V164C在HPLC-SEC上跑动，而大部分物质在所述柱空穴体积内迁移，指示所述物质聚集或形成融合后F玫瑰花结。
较小部分的所述蛋白质在渗入体积中迁移，保留时间与F三聚体一致，表示有一些物质形成所需的稳定化的融合前F。
之后，将所述二硫化构建体克隆进入杆状病毒表达载体，并表达三种构建体(HRA二硫化N165C/V296C和K168C/V296C和HRB M396C/F483C)。K168C/V296C和M396C/F483C在哺乳动物细胞中表达时是经切割的，而主要以未切割物质由昆虫细胞分泌(如抗HIS蛋白质印迹所示)。两种构建体都在空穴部分中迁移，这与先前观察到的未切割物质以单体跑动的现象不符。所示蛋白质可能已凭借非正确二硫键形成而聚集。采用抗-HIS的蛋白质凝胶迁移分析(图16)指示，没有形成键内二硫键。从所述SEC的空穴部分获得的纯物质采用SDS-PAGE分析，并用考马斯(coomassie)染色，发现各蛋白质约有50%是经切割的(图16)。使第三种二硫化构建体表达，通过蛋白质印迹判断N165C/V296C主要以所需切割产物形式分泌(图16A)。
4.供于进一步开发RSV-NDV嵌合亚基的NDV F融合前结构
开发用于拯救RSV HRA融合前表位的方案，以生成NDV F融合前构建体并使HRA的所选残基突变成RSV F的那些。用RSV的HRA替代NDV的HRA的最初尝试生成了不被细胞表达/分泌的构建体。这表明所述蛋白质被错误折叠。需要对NDV F可供突变的残基(即，位于所述蛋白质表面的那些)进一步细化。一种新型构建体，采用GCN三聚化结构域(未切割)稳定化的NDV F，通过SEC分析显示以三聚体迁移。这是预料之中的，因为通过电子显微镜显示该构建体是融合前三聚体(Swanson等,2010)。
5.与NDV融合前构建体有关的含HRB和融合肽缺失的RSV F的EM分析
生成HRB缺失的、容纳所述融合肽的RSV F，并纯化所述蛋白质。所述构建体在SEC柱的空穴体积内的迁移与RSV F玫瑰花结一致。通过EM评价所述构建体，并显示形成与融合后RSV F相似的玫瑰花结(图18A)。生成HRB和融合肽缺失的RSV F蛋白(Del-HRB Del-FP)，使其表达并纯化。HRB和融合肽缺失的RSV F在SEC上部分以三聚体形式跑动(图18B)。凝胶分析显示RSV F缺失HRB(del-HRB)和缺失FP(Del-FP)都在聚集/玫瑰花结峰和三聚体峰(图18C)中迁移。就比较而言，空穴部分内的未切割的NDV融合前构建体物质非常少(图18C)。从三聚体体积收集RSV F缺失HRB缺失FP(Del-HRB Del-FP)并通过EM评价。
NDV融合前构建体的电子显微照片显示主要是融合前F所预期的球形头部(图18D)。所述物质似乎部分以玫瑰花结样的聚集体相结合，这应不被允许，因为所述构建体是未切割且融合前的构建体。所述结合的量可能归因于HIS标签聚集，并且可以解释为什么RSV缺失HRB缺失FP甚至在所述融合肽不存在时还包含一些聚集体/玫瑰花结。RSV F缺失HRB缺失FP的EM分析显示所述物质是异源的(图18E)。RSV F缺失HRB缺失FP形成与NDV F相似的玫瑰花结结构，以及融合后样的“拐杖”和融合前样的“球”。
R057缺失HRB缺失FP截短体6H(融合肽缺失)
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R105缺失HRB缺失FP+接头截短体6H(融合肽与接头缺失)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGGGSAGSGHHHHHH**(SEQ ID NO:38)
6.RSV F非天然HRB构建体
通过用NDV的HRB区域(包含或不含额外的甘氨酸接头：HRB2)或PIV5替代HRB区域来生成稳定的RSV融合前F。所述非天然HRB构建体的哺乳动物表达显示，所述构建体各自被良好表达并分泌(图19)。此外，观察到的条带迁移与经切割的F1物质一致，指示所述蛋白质被正确加工。所述构建体以包含或不含融合肽形式存在(如图19所示)。
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Claims (29)

1.一种融合前呼吸道合胞病毒(RSV)F多肽，所述融合前RSV F多肽包含至少两个引入的半胱氨酸残基，其特征在于，所述半胱氨酸彼此紧密接近并形成使所述融合前RSV F多肽稳定的二硫键。
2.如权利要求1所述的融合前RSV F多肽，其特征在于，所述半胱氨酸突变彼此间的距离不多于约
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。
3.如权利要求1或2所述的融合前RSV F多肽，其特征在于，HRB区域和DI和/或DII区域包含引入的半胱氨酸残基，并且在所述HRB区域中引入的半胱氨酸残基和所述DI或DII区域中引入的半胱氨酸残基之间形成二硫键。
4.如权利要求1或2所述的融合前RSV F多肽，其特征在于，HRA区域和DIII区域包含引入的半胱氨酸残基，并且在所述HRA区域和所述DIII区域中引入的半胱氨酸残基之间形成二硫键。
5.如权利要求1或2所述的融合前RSV F多肽，其特征在于，所述HRA区域包含至少两个引入的半胱氨酸残基，并且在所述HRA区域中引入的半胱氨酸残基之间形成二硫键。
6.一种包含融合后修饰的融合前呼吸道合胞病毒(RSV)F多肽，所述融合后修饰选自下组：使HRA螺旋缺失、使HRB螺旋缺失、引入点突变、添加糖基化位点及其组合，其中所述融合后修饰使融合后构象失稳。
7.如权利要求6所述的融合前RSV F多肽，其特征在于，所述失稳化的融合后修饰是使所述HRB螺旋缺失。
8.如权利要求7所述的融合前RSV F多肽，其特征在于，所述融合前RSV F多肽还包含融合肽的缺失。
9.如权利要求6所述的融合前RSV F多肽，其特征在于，所述失稳化的融合后修饰是添加糖基化位点。
10.如权利要求9所述的融合后RSV F多肽，其特征在于，所述糖基化位点在选自下组的残基上：173位、175位和184位。
11.一种包含三个RSV F单体的融合前呼吸道合胞病毒(RSV)F多肽，其特征在于，所述单体中至少有两个包含引入的半胱氨酸残基，所述引入的半胱氨酸残基彼此紧密接近并形成使所述融合前RSV F多肽稳定的二硫键。
12.如权利要求1～11中任一项所述的融合前RSV F多肽，其特征在于，所述融合前RSV F多肽是RSV F的可溶性胞外域或者RSV F的可溶性胞外域的三聚体。
13.一种包含稳定化的F蛋白的嵌合型融合前F蛋白，所述稳定化的F蛋白来自非RSV的病毒但包含一个或多个RSV F中和表位。
14.如权利要求13所述的嵌合型融合前F蛋白，其特征在于，所述稳定化的F蛋白来自副流感病毒F多肽或偏肺病毒F多肽。
15.如权利要求13所述的嵌合型融合前F蛋白，其特征在于，所述稳定化的F蛋白是PIV5融合前F多肽或NDV融合前F多肽。
16.如权利要求13～15中任一项所述的嵌合型融合前F蛋白，其特征在于，所述稳定化的F蛋白是可溶性胞外域。
17.如权利要求13～16中任一项所述的嵌合型融合前F蛋白，其特征在于，RSV F的所述中和表位来自RSV F的HRA区域。
18.如权利要求13～16中任一项所述的嵌合型融合前F蛋白，其特征在于，所述中和表位选自由如下物质识别的表位组成的组：莫维珠单抗、帕利珠单抗、mAb11、mAb151、mAb1129、mAb1153、mAb1200、mAb1214、mAb1237、mAb47F、mAb7C2、mAb B4、Fab19、mAb AK13A2、mAb7.936、mAb9.936、mAb19、mAb20、mAb101F及其组合。
19.如权利要求1～18中任一项所述的融合前RSV F多肽或嵌合型融合前F蛋白，其特征在于，其还包含异源的寡聚化结构域、表位或信号肽。
20.如权利要求19所述的融合前RSV F多肽或嵌合型融合前F蛋白，其特征在于，所述异源的寡聚化结构域是三聚化结构域。
21.如权利要求20所述的融合前RSV F多肽或嵌合型融合前F蛋白，其特征在于，所述三聚化结构域来自流感血凝素、SARS刺突、HIV gp41、NadA、经修饰的GCN4、GCN4或天冬氨酸转氨甲酰酶。
22.一种免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含如权利要求1～21中任一项所述的融合前RSV F多肽或嵌合型融合前F蛋白。
23.如权利要求22所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述组合物还包含佐剂。
24.如权利要求23所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述佐剂选自下组：铝盐、水包鲨烯乳液、苯并萘啶化合物、磷脂化合物、小分子免疫增强剂和任何上述物质的组合。
25.一种分离的核酸，所述核酸编码如权利要求1～21中任一项所述的融合前RSV F多肽或嵌合型融合前F蛋白。
26.如权利要求25所述的分离的核酸，其特征在于，所述核酸是自复制RNA分子。
27.一种包含如权利要求26所述的自复制RNA分子的免疫原性组合物。
28.如权利要求26所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述免疫原性组合物还包含RNA递送系统。
29.一种在对象中引起针对RSV F的免疫应答的方法，所述方法包括给予所述对象如权利要求22～24中任一项所述的免疫原性组合物。
29.一种在对象中引起针对RSV F的免疫应答的方法，所述方法包括给予所述对象如权利要求27或28所述的免疫原性组合物。
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