CN103830205B - 一种可溶解凝血酶纳米颗粒及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医药领域，公开了一种可溶解凝血酶纳米颗粒及其制备方法和应用。该可溶解凝血酶纳米颗粒具有核壳结构，核为凝血酶，壳为由水溶性直链淀粉-聚赖氨酸的阳离子交联形成的纳米粒子。该核壳结构有利于保持凝血酶的生物活性，在室温下稳定保存，具有缓释功能，药物作用时间长，进入体内不容易被降解，经济安全。本发明优选纳米粒子的粒径为150～250nm，可更好地保持凝血酶的生物活性，进一步提高纳米凝血酶的稳定性及缓释功能。而为了更好地提高纳米凝血酶的稳定性及缓释功能，纳米凝血酶的包封率优选为50～75%。

Description

一种可溶解凝血酶纳米颗粒及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种可溶解凝血酶纳米颗粒及其制备方法和应用。

背景技术

凝血酶（thrombin）是一种专一性很强的丝氨酸蛋白水解酶，它能水解血纤维蛋白原的肽键，产生不溶性的血纤维蛋白，使血液变成凝胶而发生凝固，使血液快速凝固、填塞出血点而达到止血的目的。由于其止血快，无副作用等优点，广泛应用于创伤和临床手术创面以及消化道粘膜等部位的出血与渗血，止血效果好，疗效确切。然而，普通凝血酶是一种蛋白酶类试剂，容易受光线、温度、湿度，特别是微生物的污染因素影响而导致生物活性下降甚至丧失。在常温下，凝血酶的水溶液在保存24天后就完全失活。稳定性较差，使其应用受到了一定限制。

利用丰富的可降解高分子纳米材料固化包裹凝血酶，制备凝血酶纳米颗粒，可大大减少光线、温度、湿度等对凝血酶的影响，从而提高凝血酶的稳定性。目前开发出一些包载凝血酶药物，但有的包载凝血酶的载体需溶于有机溶剂中来制备包载凝血酶，有的包载凝血酶的载体溶液呈酸性，有的包载凝血酶需在高温下制备，而有机溶剂、酸性溶液、高温对凝血酶的活性均有较大影响，从而降低制得的包载凝血酶的药效。

因此，目前很有必要开发一种对所包载的凝血酶的活性无较大影响，稳定性好、安全高效、使用范围广泛的凝血酶新剂型。

发明内容

为了克服现有技术中包载凝血酶药物的药效低、溶解度低、毒性大的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种可溶解凝血酶纳米颗粒的制备方法；

本发明的另一目的在于提供上述制备方法得到的可溶解凝血酶纳米颗粒；

本发明的再一目的在于提供上述可溶解凝血酶纳米颗粒的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种可溶解凝血酶纳米颗粒的制备方法，包括以下操作步骤：

（1）通过点击化学合成直链淀粉-聚赖氨酸纳米颗粒；

（2）将直链淀粉-聚赖氨酸纳米颗粒加入到乙酸水溶液中，搅拌至完全溶解，形成直链淀粉-聚赖氨酸乙酸水溶液；

（3）将凝血酶加入至pH6.0～8.0缓冲液中，搅拌溶解，形成凝血酶缓冲溶液；

（4）将凝血酶缓冲溶液加入到直链淀粉-聚赖氨酸乙酸水溶液中，加入交联剂至质量浓度为0.01～0.10%，升温至30～50℃，以100～800转/分钟的速度搅拌20～60分钟，将其倾倒入至液体石蜡中，搅拌，再加入分散剂至质量浓度为1～10%，以300～1500转/分钟的速度高速搅拌2～8小时进行乳化，得到乳化液；

（5）向步骤（4）所得乳化液中加入交联剂至交联剂质量浓度为0.5～5.0%，搅拌20～60分钟，使其分散均匀，置于30～50℃水浴中进行交联8～12小时，将产物冷却至室温，取出，进行过滤；

（6）过滤物用丙酮洗涤，使得丙酮表面无漂浮油斑，即得凝胶状半透明纳米微粒；再以乙醇洗涤脱水，即得固态纳米微球；

（7）将固态纳米微球在10～40℃温度下真空干燥，得到可溶解凝血酶纳米颗粒。

步骤（1）所述直链淀粉-聚赖氨酸纳米颗粒分子量在200-300kDa之间；所述直链淀粉-聚赖氨酸纳米颗粒按照以下制备步骤得到：

（1）通过酰胺化反应合成第一代树枝状聚赖氨酸：将1.73g L-2,6-二叔丁氧羰基赖氨酸和5.5mmol丙炔胺共溶在20mL无水DMF中，在通氮气下搅拌10min，接着冷却至0℃，再加入2.18g苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐和0.74g1-羟基苯并三氮唑，继续在室温下搅拌16h，反应结束后，加入200mL乙酸乙酯，用饱和NaHCO₃溶液、0.1mol/L的NaHSO₄、饱和NaHCO₃溶液和卤水依次冲洗，之后通过旋转蒸发干燥，将获得的粗制产物通过柱层析法纯化（硅胶，氯仿-甲醇=5:1），然后旋转蒸发可获得质量分数90%的第一代树枝状聚赖氨酸；

（2）合成第二代树枝状聚赖氨酸：在室温下，称取0.96g第一代树枝状聚赖氨酸溶解在15mL三氟乙酸-二氯甲烷混合溶液中，反应2h后，真空去除溶剂；加入30mL无水DMF，随后加入4mL三乙胺和1.75gL-2,6-二叔丁氧羰基赖氨酸，再加入2.48g苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐和0.86g1-羟基苯并三氮唑，在室温下搅拌24h，反应结束后，加入250mL乙酸乙酯，用饱和NaHCO₃溶液、0.1mol/L的NaHSO₄、饱和NaHCO₃溶液和卤水依次冲洗，之后通过旋转蒸发干燥，将获得的粗制产物通过柱层析法纯化，然后旋转蒸发可获得质量分数63%的第二代树枝状聚赖氨酸；

（3）合成第三代树枝状聚赖氨酸：称取1.12g第二代树枝状聚赖氨酸，加入20mL三氟乙酸-二氯甲烷混合溶液中，在室温下静置2h后去除L-2,6-二叔丁氧羰基，将获得的固体加入40mL无水DMF，随后加入6mL三乙胺和2.08gL-2,6-二叔丁氧羰基赖氨酸，在通氮气下搅拌10min，接着冷却至0℃；反应结束后，通过旋转蒸发干燥，将获得的粗制产物通过柱层析法纯化，然后旋转蒸发可获得质量分数60%的第三代树枝状聚赖氨酸；

（4）称取0.515g第三代树枝状聚赖氨酸，加入15mL三氟乙酸-二氯甲烷混合溶液中，在室温下静置2h后去除残留的L-2,6-二叔丁氧羰基；将溶剂蒸发后，加入0.05g直链淀粉和10mL二甲基亚砜进行溶解；在通氮气下，加入18mgCuSO₄·5H₂O和65mg抗坏血酸钠，并将混合溶液加热至40℃恒温48h，反应结束后，将产物在蒸馏水中透析3d，冻干后可获得质量分数65%的直链淀粉-聚赖氨酸纳米颗粒。

步骤（2）～（4）所述三氟乙酸/二氯甲烷混合溶液中三氟乙酸和二氯甲烷的体积比为1:1。

步骤（2）所述乙酸水溶液的质量浓度为0.5～2.5%；所述直链淀粉-聚赖氨酸乙酸水溶液中直链淀粉-聚赖氨酸的质量浓度为0.5～8%。

步骤（3）所述凝血酶是人凝血酶、猪凝血酶、牛凝血酶或羊凝血酶；步骤（3）所述凝血酶缓冲溶液中的凝血酶和步骤（2）所述直链淀粉-聚赖氨酸乙酸水溶液中直链淀粉-聚赖氨酸的质量比为4：0.5～2。

步骤（4）所述将凝血酶缓冲溶液加入到直链淀粉-聚赖氨酸乙酸水溶液中的同时要以100～800转/分钟的速度进行搅拌。

步骤（4）和（5）所述交联剂为聚乙二醇、海藻酸钠或戊二醛；步骤（5）所述分散剂是司盘80、吐温80或泊洛沙姆。

步骤（4）所述丙酮洗涤的次数为2～5次。步骤（6）所述乙醇洗涤是以体积百分比为70%的乙醇、体积百分比为80%的乙醇、体积百分比为90%的乙醇及无水乙醇依次脱水。

一种由权利要求1所述的制备方法制备得到的可溶解凝血酶纳米颗粒，该可溶解凝血酶纳米颗粒的粒径为200～350nm，其包封率为50～75%。该可溶解凝血酶纳米颗粒具有核壳结构，核为凝血酶，壳为由水溶性直链淀粉-聚赖氨酸的阳离子交联形成的纳米粒子。该核壳结构有利于保持凝血酶的生物活性，在室温下稳定保存，具有缓释功能，药物作用时间长，进入体内不容易被降解，经济安全。本发明优选纳米粒子的粒径为150～250nm，可更好地保持凝血酶的生物活性，进一步提高纳米凝血酶的稳定性及缓释功能。而为了更好地提高纳米凝血酶的稳定性及缓释功能，纳米凝血酶的包封率优选为50～75%。

上述的可溶解凝血酶纳米颗粒可作为止血药物或止血喷剂的作用。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及有益效果：

本发明可溶解凝血酶纳米颗粒，由于采用核壳结构，核为凝血酶，壳为直链淀粉-聚赖氨酸的阳离子交联形成的纳米粒子，即将凝血酶包载在由直链淀粉-聚赖氨酸的阳离子交联形成的纳米粒子中，水溶性直链淀粉-聚赖氨酸的阳离子是通过分子间或分子内交联反应而形成纳米粒子，是一种静电作用，不涉及热交联过程中的高温及化学交联过程中的共价键形成，对所包载的凝血酶的活性无较大影响；直链淀粉-聚赖氨酸是水溶性的，且为无毒性，安全高效，稳定性好，对所包载的凝血酶的活性也无较大影响。因此，本发明提供的纳米凝血酶保持了凝血酶的生物活性。

本发明可溶解凝血酶纳米颗粒，由于凝血酶被包载在水溶性直链淀粉-聚赖氨酸的阳离子交联成的纳米粒子中，因此可在室温下稳定保存；凝血酶的活性比较稳定；具有缓释功能，适于静脉注射；药物作用时间长，生物利用度高；进入体内不容易被降解，降低了用药剂量；直链淀粉-聚赖氨酸可在体内降解为氨基酸和葡萄糖，无毒性且生物兼容性好，使本发明提供的纳米凝血酶安全；通过对纳米粒子表面修饰可制备靶向药物制剂，本发明提供的纳米凝血酶具有良好的药物开发潜力，具有较高的医用价值和广阔的应用前景。

附图说明

图1是直链淀粉-聚赖氨酸纳米颗粒分子结构图。

图2是直链淀粉-聚赖氨酸纳米颗粒的红外谱图分析图。

图3是本发明可溶解凝血酶纳米颗粒的扫描电镜图。

图4是本发明可溶解凝血酶纳米颗粒的活性变化曲线图。

图5是25℃下各时间点凝血酶活性的保留率。

图6是0℃下各时间点凝血酶活性的保留率。

图7是-20℃下各时间点凝血酶活性的保留率。

图8是纳米凝血酶在纤维蛋白原溶液中反应结果，其中a为纳米凝血酶溶液，b为纤维蛋白原凝固物形成，c为纤维蛋白原凝固物沉积。

图9是不同浓度纳米凝血酶对血液的凝血效果，其中a为不同浓度梯度的凝血酶纳米颗粒，b为加入2ml新鲜血液，c为不同浓度梯度的纳米凝血酶的血液凝固过程，d为血液凝固效果。

图10是纳米凝血酶对肝出血的止血效果，其中a为正常大鼠肝脏解剖，b为大鼠肝脏出血模型，c为纳米凝血酶对肝脏出血模型的止血效果。

图11是纳米凝血酶对血管出血的止血作用，其中a为大鼠右髂动脉的解剖，b为大鼠右髂动脉的出血模型，c为大鼠右髂动脉的出血模型的止血效果。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

直链淀粉-聚赖氨酸纳米颗粒的制备：

（1）通过酰胺化反应合成第一代树枝状聚赖氨酸：1.73g L-2,6-二叔丁氧羰基赖氨酸（5mmol）和350μL丙炔胺（5.5mmol）共溶在20mL无水N,N二甲基甲酰胺（DMF）溶液中，在通氮气下搅拌10min，接着冷却至0℃，向溶液中加入2.18g（5.5mmol）苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐（HBTU）和0.74g（5.5mmol）1-羟基苯并三氮唑（HOBT），继续在室温下搅拌16h，反应结束后，加入200mL乙酸乙酯（EtOAc），用饱和NaHCO₃溶液、0.1mol/L的NaHSO₄、饱和NaHCO₃溶液和卤水依次冲洗，之后通过旋转蒸发干燥，将获得的粗制产物通过柱层析法纯化（硅胶，氯仿-甲醇=5:1），然后旋转蒸发可获得90%的第一代树枝状聚赖氨酸。

（2）合成第二代树枝状聚赖氨酸：首先用三氟乙酸（TFA）切割第一代树枝状聚赖氨酸；在室温下，称取0.96g（2.5mmol）第一代树枝状聚赖氨酸溶解在15mL三氟乙酸-二氯甲烷（v/v=1:1）混合溶液中，反应2h后，真空去除溶剂，加入30mL无水DMF，随后加入4mL三乙胺和1.75g（5.1mmol）L-2,6-二叔丁氧羰基赖氨酸，接着，加入2.48g（6.2mmol）HBTU和0.86g（6.2mmol）HOBt，在室温下搅拌24h，反应结束后，加入250mL乙酸乙酯，用饱和NaHCO₃溶液、0.1mol/L的NaHSO₄、饱和NaHCO₃溶液和卤水依次冲洗，之后通过旋转蒸发干燥，将获得的粗制产物通过柱层析法纯化（硅胶，氯仿-甲醇=10:1），然后旋转蒸发可获得质量分数63%的第二代树枝状聚赖氨酸。

（3）合成第三代树枝状聚赖氨酸：称取1.12g（1.30mmol）第二代树枝状聚赖氨酸，加入20mL三氟乙酸-二氯甲烷（v/v=1:1），在室温下静置2h后去除L-2,6-二叔丁氧羰基，将获得的固体加入40mL无水DMF，随后加入6mL三乙胺和2.08g（5.5mmol）L-2,6-二叔丁氧羰基赖氨酸，在通氮气下搅拌10min，接着冷却至0℃；反应结束后，之后通过旋转蒸发干燥，将获得的粗制产物通过柱层析法纯化（硅胶，氯仿-甲醇=15:1），然后旋转蒸发可获得质量分数60%的第三代树枝状聚赖氨酸；

（4）制备可溶解凝血酶纳米颗粒：将0.515g（0.29mmol）第三代树枝状聚赖氨酸，加入15mL三氟乙酸-二氯甲烷（v/v=1:1），在室温下静置2h后去除残留的L-2,6-二叔丁氧羰基；将溶剂蒸发后，加入0.05g直链淀粉（Amy-N₃，购买于美国sigma公司）和10mL二甲基亚砜，溶解后可获得清亮的溶液；接着，在通氮气下，称取18mg CuSO₄·5H₂O和65mg抗坏血酸钠加入溶液，并将混合溶液加热至40℃恒温48h，反应结束后，将产物在蒸馏水中透析3d（MWCO=14000），冻干后可获得质量分数65%的树可溶解凝血酶纳米颗粒（Amy-g-PLLD），其合成过程如图1所示。根据红外谱图分析，聚赖氨酸已经连接上直链淀粉，如图2所示。

实施例2

取实施例1所得直链淀粉-聚赖氨酸纳米颗粒20mg，置入三颈烧瓶中，加入质量百分数2%的乙酸水溶液500ml，搅拌使其完全溶解；另称取凝血酶（购于美国sigma公司）3000u，加磷酸盐缓冲液（pH7.4）100ml，搅拌溶解，形成凝血酶缓冲溶液；在室温下以100～800转/分钟的速度搅拌，将凝血酶缓冲溶液滴加到上述直链淀粉-聚赖氨酸乙酸水溶液中，滴加时间为30min，升温至40℃，滴加质量分数0.1%戊二醛溶液30ml，以200转/分钟的速度连续搅拌30min，停止搅拌，将其倾倒入至500ml液体石蜡中，搅拌25min，加入50ml的吐温80，以500转/分钟的速度高速搅拌4小时进行乳化；取乳化液再加入质量分数25%的戊二醛溶液100ml，搅拌30min使其分散均匀，置于40℃水浴锅中进行交联自组装8h，将产物冷却至室温，取出，进行过滤，得产物用丙酮洗涤3次，每次300ml，即得凝胶状半透明纳米微粒；后再依次以体积分数70%乙醇、体积分数80%乙醇、体积分数90%乙醇及无水酒精各200ml洗涤脱水，即得固态纳米微球；将制得固态纳米微球置于真空干燥器中30℃真空干燥，得可溶解凝血酶纳米颗粒，测定制得的可溶解凝血酶纳米颗粒的包封率为75.81%，平均粒径为250nm。将制得的可溶解凝血酶纳米颗粒进行扫描电镜下观察，电镜照片如图3所示。

实施例3

取实施例1所得直链淀粉-聚赖氨酸纳米颗粒40mg，置入三颈烧瓶中，加入质量分数2%的乙酸水溶液1500ml，搅拌使其完全溶解；另称取凝血酶（购于美国sigma公司）6000u，加磷酸盐缓冲液（pH7.4）150ml，搅拌溶解，形成凝血酶缓冲溶液；在室温下以100～800转/分钟的速度搅拌，将凝血酶缓冲溶液滴加到上述直链淀粉-聚赖氨酸乙酸水溶液中，滴加时间为40min，升温至40℃，滴加质量分数0.1%戊二醛溶液40ml，以300转/分钟的速度连续搅拌40min，停止搅拌，将其倾倒入至500ml液体石蜡中，搅拌35min，加入100ml的吐温80，以500转/分钟的速度高速搅拌4小时进行乳化；取乳化液再加入质量分数25%的戊二醛溶液150ml，搅拌40min使其分散均匀，置于40℃水浴锅中进行交联自组装10h，将产物冷却至室温，取出，进行过滤，得产物用丙酮洗涤3次，每次300ml，即得凝胶状半透明纳米微粒；后再依次以体积分数70%的乙醇、体积分数80%的乙醇、体积分数90%的乙醇及无水酒精各200ml洗涤脱水，即得固态纳米微球；将制得固态纳米微球置于真空干燥器中30℃真空干燥，得可溶解凝血酶纳米颗粒，测定制得的可溶解凝血酶纳米颗粒的包封率为65.26%，平均粒径为220nm。

实施例4

取实施例1所得直链淀粉-聚赖氨酸纳米颗粒30mg，置入三颈烧瓶中，加入质量分数2%的乙酸水溶液1000ml，搅拌使其完全溶解；另称取凝血酶（购于美国sigma公司）5000u，加磷酸盐缓冲液（pH7.4）150ml，搅拌溶解，形成凝血酶缓冲溶液；在室温下以100～800转/分钟的速度搅拌，将凝血酶缓冲溶液滴加到上述直链淀粉-聚赖氨酸乙酸水溶液中，滴加时间为40min，升温至50℃，滴加质量分数0.5%海藻酸钠30ml，以250转/分钟的速度连续搅拌30min，停止搅拌，将其倾倒入至500ml液体石蜡中，搅拌25min，加入150g的泊洛沙姆，以800转/分钟的速度高速搅拌3小时进行乳化；取乳化液再加入质量分数15%的海澡酸钠溶液250ml，搅拌50min使其分散均匀，置于50℃水浴锅中进行交联自组装12h，将产物冷却至室温，一取出，进行过滤，得产物用丙酮洗涤3次，每次400ml，即得凝胶状半透明纳米微粒;后再依次以体积分数70%的乙醇、体积分数80%的乙醇、体积分数90%的乙醇及无水酒精各250ml洗涤脱水，即得固态纳米微球；将制得固态纳米微球置于真空干燥器中30℃真空干燥，得可溶解凝血酶纳米颗粒，测定制得的可溶解凝血酶纳米颗粒的包封率为55.12%，平均粒径为200nm。

纳米凝血酶活性稳定性分析:

（1）分别将实施例2-4中制备的可溶解凝血酶纳米颗粒用去离子水溶解，以凝血酶的浓度计，分别配制成50U/mL的可溶解凝血酶纳米颗粒水溶液，同时配制凝血酶浓度相同的自由凝血酶水溶液，均在110rpm/37℃的保存条件下保存，在不同时间点测定残存酶诱导PRP中血小板聚集的能力，如图4所示（图中为实施例1的可溶解凝血酶纳米颗粒和自由凝血酶的活性变化曲线，实施例3和4的可溶解凝血酶纳米颗粒的活性变化曲线图与实施例1的活性变化曲线相似），可溶解凝血酶纳米颗粒活性变化类似于药物释放曲线，在5h时左右发生药物突释，在72h时左右，酶活性达到最大，之后开始缓慢下降，而自由酶则是一个活性衰减的过程。

从上述实施例可以看出，本发明提供的可溶解凝血酶纳米颗粒，保持了凝血酶的生物活性，活性稳定，具有缓释功能，药物作用时间长。

（2）温度稳定性实验:

分别将实施例2-4中制备的可溶解凝血酶纳米颗粒和普通凝血酶置于适宜的洁净培养皿中密封，分别在25℃、0℃和-20℃下放置，分别于0天、5天、10天、15天、20天、25天、30天、35天、40天、45天、50天、55天和60天取样，参考中国药典中凝血酶活性测定方法检测检测凝血酶活性。如图5、图6及图7所示，在25℃、0℃和-20℃条件下两组材料的活性均呈现随时间延长逐渐下降的趋势；其中在25℃条件下，普通凝血酶活性下降最为显著，在60天时活性保留率下降至40%，而纳米凝血酶活性在60天时活性保留率下降至60%；在0℃和-20℃条件下，纳米凝血酶活性下降均比普通凝血酶活性下降缓慢，两组比较P<0.05，P纳米凝血酶组在60天内的活性保留率高于普通凝血酶组。

（3）酸碱稳定性实验:

分别将实施例2-4中制备的可溶解凝血酶纳米颗粒和普通凝血酶置于适宜的洁净培养皿中，以不同PH值的磷酸盐缓冲液均匀滴加浸润并密封，使湿润条件下的材料pH值分别处于6.5-6.8，7.0-7.4，以及7.6-8.0范围中，于第3和第5天取样，参考上述凝血酶活性测定方法进行检测。如在保存期间材料变干燥，则先以去离子水浸润后测定pH值，之后根据结果重新以磷酸盐缓冲液调节pH值至原设定范围。结果表1及表2所示：两组材料的活性保留率均有降低；在接近中性的pH值7.0-7.4范围内，两组材料5天活性保留率分别为74.8%（普通凝血酶组）及84.9%（纳米凝血酶组）；在相同时间点，弱酸（pH值6.5-6.8）及弱碱（pH值7.6-8.0）环境下两组材料的活性保留率均低于中性环境（pH值7.0-7.4），弱酸性环境下对材料活性的影响更大，5天活性保留率两组材料均低于70%；相同条件下的纳米凝血酶组材料活性保留率高于普通凝血酶组。

（4）光照稳定性实验:

分别将实施例2-4中制备的可溶解凝血酶纳米颗粒和普通凝血酶置于适宜的洁净培养皿中，适宜的洁净培养皿中密封，放在YB-II型澄明度检测仪中，于照度为4500lx±500lx的条件下放置10天，于第5和第10天取样，参考上述凝血酶活性测定方法进行检测。结果如表3所示：两组材料在光照条件下的活性保留率均有降低，5天普通凝血酶的活性保留率分别为72.2%，纳米凝血酶的活性保留率分别为80.6%；10天普通凝血酶的活性保留率分别为67.5%，纳米凝血酶的活性保留率分别为74.9%；相同条件下的纳米凝血酶组材料活性保留率高于普通凝血酶组。

表1 普通凝血酶对酸碱稳定性

表2 凝血酶纳米颗粒对酸碱稳定性

表3 凝血酶纳米颗粒对光照的稳定性

纳米凝血酶止血效果分析:

（1）实验室检测方法：

取1.5×15cm试管，加入质量浓度3%的纤维蛋白原生理盐水溶液5ml，取约含有5U凝血酶的纳米颗粒材料置于试管中，观察形成凝固物的情况。5min内有凝固物形成，认为有效止血。如图8所示，纳米凝血酶置于纤维蛋白原溶液中，5min时可见显著纤维蛋白凝固物沉积。图9为纳米凝血酶不同浓度梯度对血液的止血效果，图中显示，随着纳米凝血酶浓度逐渐升高，止血效果逐渐增强。

（2）动物实验评估止血效果：

①大鼠肝血管出血模型的止血实验：

健康雄性SD大鼠，体重300--350g，室温23-25℃下单笼饲养，自由进食、进水，12小时光照/黑暗。大鼠及标准大鼠饲料均由中山大学实验动物中心提供。大鼠以10%水合氯醛（0.3ml/100g）腹腔内注射麻醉，仰卧位固定，消毒，取腹部正中切口长约5cm，逐层剪开皮肤、肌肉及腹膜，进腹。暴露肝脏。将肝脏右叶充分暴露后在其正中以尖刀划取1×1cm的正方形边界，深约0.5cm。以组织剪将边界内肝组织去除，并以组织镊刮除创面，使肝脏创面出现明显渗血。将预先准备好的双层折叠止血材料（3×3cm，5U/cm²）置于创面，充分覆盖并贴附肝组织，以干棉球于材料外侧创面上方适当压迫并计时，记录渗血完全停止时间。对照组采用明胶海绵及普通干纱球行同样操作。每种材料平行测定10次，评估止血效果。如图10所示，纳米凝血酶对肝脏渗血模型有很好的止血作用。

②大鼠髂动脉出血模型止血实验：

以前述方法麻醉、进腹，将大鼠肠管推向右侧腹腔，以盐水棉签钝性分离腹主动脉前方后腹膜及动脉周围脂肪组织，显露腹主动脉。沿腹主动脉下端向下钝性分离右侧髂总动脉，游离约1cm。丝线标记远、近端并预备结扎。提起游离段，将预先准备好纳米凝血酶。以5ml注射器针头穿刺右髂总动脉游离段的中点，动脉血搏动性喷出后立即以预置的受试材料覆盖穿刺点，保证材料良好贴附于髂总动脉外壁，5min后移除受试材料并记录有无活动性出血。如图11所示，纳米凝血酶对血管渗血模型有很好的止血作用。

本发明提供的可溶解凝血酶纳米颗粒，保持了凝血酶的生物活性；在室温下稳定保存；活性稳定；具有缓释功能，适于静脉注射；药物作用时间长，生物利用度高；进入体内不容易被降解，降低了用药剂量；直链淀粉-聚赖氨酸材料无毒、生物兼容性好，使本发明提供的可溶解凝血酶纳米颗粒经济安全；通过对纳米粒子表面修饰可制备靶向药物制剂，本发明提供的纳米凝血酶具有良好的药物开发潜力，可广泛应用于外科领域，如普通外科、骨科、心胸外科、神经外科、妇产科等的组织止血、组织封口和组织粘合，具有广阔的应用前景。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种可溶解凝血酶纳米颗粒的制备方法，其特征在于包括以下操作步骤：

(1)通过点击化学合成直链淀粉-聚赖氨酸纳米颗粒；

(2)将直链淀粉-聚赖氨酸纳米颗粒加入到乙酸水溶液中，搅拌至完全溶解，形成直链淀粉-聚赖氨酸乙酸水溶液；

(3)将凝血酶加入至pH6.0～8.0缓冲液中，搅拌溶解，形成凝血酶缓冲溶液；

(4)将凝血酶缓冲溶液加入到直链淀粉-聚赖氨酸乙酸水溶液中，加入交联剂至质量浓度为0.01～0.10％，升温至30～50℃，以100～800转/分钟的速度搅拌20～60分钟，将其倾倒入至液体石蜡中，搅拌，再加入分散剂至质量浓度为1～10％，以300～1500转/分钟的速度高速搅拌2～8小时进行乳化，得到乳化液；

(5)向步骤(4)所得乳化液中加入交联剂至交联剂质量浓度为0.5～5.0％，搅拌20～60分钟，使其分散均匀，置于30～50℃水浴中进行交联8～12小时，将产物冷却至室温，取出，进行过滤；

(6)过滤物用丙酮洗涤，使得丙酮表面无漂浮油斑，即得凝胶状半透明纳米微粒；再以乙醇洗涤脱水，即得固态纳米微球；

(7)将固态纳米微球在10～40℃温度下真空干燥，得到可溶解凝血酶纳米颗粒。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)所述直链淀粉-聚赖氨酸纳米颗粒分子量在200-300kDa之间；所述直链淀粉-聚赖氨酸纳米颗粒按照以下制备步骤得到：

(1)通过酰胺化反应合成第一代树枝状聚赖氨酸：将1.73g L-2,6-二叔丁氧羰基赖氨酸和5.5mmol丙炔胺共溶在20mL无水DMF中，在通氮气下搅拌10min，接着冷却至0℃，再加入2.18g苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐和0.74g1-羟基苯并三氮唑，继续在室温下搅拌16h，反应结束后，加入200mL乙酸乙酯，用饱和NaHCO₃溶液、0.1mol/L的NaHSO₄、饱和NaHCO₃溶液和卤水依次冲洗，之后通过旋转蒸发干燥，将获得的粗制产物通过柱层析法纯化，然后旋转蒸发可获得质量分数90％的第一代树枝状聚赖氨酸；

(2)合成第二代树枝状聚赖氨酸：在室温下，称取0.96g第一代树枝状聚赖氨酸溶解在15mL三氟乙酸-二氯甲烷混合溶液中，反应2h后，真空去除溶剂；加入30mL无水DMF，随后加入4mL三乙胺和1.75gL-2,6-二叔丁氧羰基赖氨酸，再加入2.48g苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐和0.86g1-羟基苯并三氮唑，在室温下搅拌24h，反应结束后，加入250mL乙酸乙酯，用饱和NaHCO₃溶液、0.1mol/L的NaHSO₄、饱和NaHCO₃溶液和卤水依次冲洗，之后通过旋转蒸发干燥，将获得的粗制产物通过柱层析法纯化，然后旋转蒸发可获得质量分数63％的第二代树枝状聚赖氨酸；

(3)合成第三代树枝状聚赖氨酸：称取1.12g第二代树枝状聚赖氨酸，加入20mL三氟乙酸-二氯甲烷混合溶液中，在室温下静置2h后去除L-2,6-二叔丁氧羰基，将获得的固体加入40mL无水DMF，随后加入6mL三乙胺和2.08gL-2,6-二叔丁氧羰基赖氨酸，在通氮气下搅拌10min，接着冷却至0℃；反应结束后，通过旋转蒸发干燥，将获得的粗制产物通过柱层析法纯化，然后旋转蒸发可获得质量分数60％的第三代树枝状聚赖氨酸；

(4)称取0.515g第三代树枝状聚赖氨酸，加入15mL三氟乙酸-二氯甲烷混合溶液中，在室温下静置2h后去除残留的L-2,6-二叔丁氧羰基；将溶剂蒸发后，加入0.05g直链淀粉和10mL二甲基亚砜进行溶解；在通氮气下，加入18mgCuSO₄·5H₂O和65mg抗坏血酸钠，并将混合溶液加热至40℃恒温48h，反应结束后，将产物在蒸馏水中透析3d，冻干后可获得质量分数65％的直链淀粉-聚赖氨酸纳米颗粒。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)～(4)所述三氟乙酸-二氯甲烷混合溶液中三氟乙酸和二氯甲烷的体积比为1:1。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)所述乙酸水溶液的质量浓度为0.5～2.5％；所述直链淀粉-聚赖氨酸乙酸水溶液中直链淀粉-聚赖氨酸的质量浓度为0.5～8％。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(3)所述凝血酶是人凝血酶、猪凝血酶、牛凝血酶或羊凝血酶；步骤(3)所述凝血酶缓冲溶液中的凝血酶和步骤(2)所述直链淀粉-聚赖氨酸乙酸水溶液中直链淀粉-聚赖氨酸的质量比为4：0.5～2。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(4)所述将凝血酶缓冲溶液加入到直链淀粉-聚赖氨酸乙酸水溶液中的同时要以100～800转/分钟的速度进行搅拌。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(4)和(5)所述交联剂为聚乙二醇、海藻酸钠或戊二醛；步骤(4)所述分散剂是司盘80、吐温80或泊洛沙姆。

8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(6)所述丙酮洗涤的次数为2～5次；步骤(6)所述乙醇洗涤是以体积百分比为70％的乙醇、体积百分比为80％的乙醇、体积百分比为90％的乙醇及无水乙醇依次脱水。

9.一种根据权利要求1～8任一项所述的方法制备的可溶解凝血酶纳米颗粒，其特征在于：该可溶解凝血酶纳米颗粒的粒径为200～350nm，其包封率为50～75％。

10.根据权利要求9所述的可溶解凝血酶纳米颗粒在制备止血药物或止血喷剂中的应用。