CN103501808A

CN103501808A - 用于针对肺炎链球菌免疫的组合物

Info

Publication number: CN103501808A
Application number: CN201180066348.5A
Authority: CN
Inventors: M.皮基切罗; M.奥赫斯-奥诺勒姆赫姆亨
Original assignee: Sanofi Pasteur SA
Current assignee: Sanofi Pasteur Ltd; Sanofi Pasteur SA
Priority date: 2010-12-03
Filing date: 2011-12-02
Publication date: 2014-01-08
Also published as: RU2589256C2; ZA201304517B; RU2013130297A; US20190071471A1; CA2819758A1; BR112013013702A2; US9944680B2; US20150017209A1; EP2646049A1; MX2013006255A; JP6046632B2; JP6178477B2; WO2012075428A1; JP2013544848A; AU2011336366B2; IL226690B; EP2646049B1; AU2011336366A1; KR20140009281A; JP2016210806A

Abstract

本公开涉及在有风险的受试者中预防或治疗急性中耳炎复发的方法，包括向所述受试者至少一次施用治疗有效量的组合物。所施用的组合物包含至少一种免疫原性多肽，所述免疫原性多肽选自肺炎链球菌PhtD、PhtE、PcpA、LytB和去毒的肺炎球菌溶血素。

Description

用于针对肺炎链球菌免疫的组合物

相关申请

本申请要求2010年12月3日提交的美国系列号61/419,635和2011年7月22日提交的美国系列号61/510,620的优先权，并且每一个的内容通过引用整体并入本文。

技术领域

本公开涉及免疫学领域，并且具体而言，涉及针对肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)免疫的方法。

背景

中耳炎是儿童中的常见病。术语“中耳炎”包括许多临床病症包括鼓膜炎、渗出性中耳炎(OME)、慢性化脓性中耳炎和急性中耳炎(AOM)(24)。急性中耳炎(AOM)是与上呼吸道症状、疼痛、发热和耳液溢有关的症状性疾病。其是世界范围的最普遍的传染病，导致在大多数国家中儿童的过量的抗生素消耗，和在发展中国家中耳聋和其它并发症的相当大的负担(1-3)。

AOM相当地普遍并且约60-70%的儿童在他们生命的前3年期间经历至少一次AOM的发作(4，5)。儿童的一个亚群经历复发性中耳炎。那些在6个月内经历3次或更多次AOM发作，或在一年内经历4次感染的儿童被认为是易患耳炎的，并且代表儿童总人群的10-30%(4，5)。

一种或多种耳病原体(otopathogen)的鼻咽(NP)群集是AOM发展的必要的先前事件。肺炎链球菌(Spn)、不可分型流感嗜血杆菌(non-typeable Haemophilus influenzae(NTHi))和粘膜炎莫拉氏菌(Moraxella Catarrhalis)是导致AOM的最普遍的耳病原体，并且这三种中，Spn占优势(6)。NTHi群集频率和AOM的频率之间直接的关系已被注意到(J. Infect Dis 170:862-866)。

复发性AOM目前用渐增强度的不同的抗生素治疗，这基于下列假设：复发性感染由渐增抗生素抗性的细菌导致。当复发以6个月内3次或12月内4次的频率发生时，则经常进行鼓膜造孔插管手术(tymnpanostomy tube surgery)，同时进行或不进行腺样体切除术和/或扁桃体切除术。

关于预防措施，目前，有两种可获得的肺炎球菌疫苗类型。第一种包括来自23种肺炎链球菌类型的荚膜多糖，其一起代表导致肺炎球菌感染的菌株的约90%的荚膜类型。但是此疫苗，在幼儿中不是非常有免疫原性(Fedson, 和 Musher 2004, “Pneumococcal Polysaccharide Vaccine”, pp. 529-588; In Vaccines. S.A. Plotikin 和 W.A. Orenstein(编), W.B. Saunders 和 Co., Philadelphia, PA; Shapiro 等, N. Engl. J. Med. 325:1453-1460(1991))，因为在年龄2岁之前他们对多糖抗原不产生良好的免疫应答。此疫苗不被推荐用于中耳炎的预防。

缀合物疫苗代表第二种可获得的肺炎球菌疫苗类型。这些疫苗，其包括缀合到蛋白载体的血清型特异性的荚膜多糖抗原，引发血清型特异性的保护。目前可获得的是7价和13价缀合物疫苗：7价包括7种多糖抗原(衍生自血清型4、6B、9V、14、18C、19F和23F的荚膜)并且13价缀合物包括13种多糖抗原(衍生自血清型1、3、5、6A、7F和19A，加上7价覆盖的那些血清型的荚膜)。也已经开发了9价和11价缀合物疫苗，并且除了7价中那些之外每个还包括血清型特异性多糖(即，9价中血清型1和5和11价中3和7F型)。

然而缀合物疫苗有局限。例如，由于这些疫苗引发血清型特异性的保护，为了保护免于额外的肺炎链球菌血清型包括在发展中世界主导的那些，必须包括额外的血清型特异性的多糖，其增加了制造的困难(Di Fabio 等, Pediatr. Infect. Dis. J. 20:959-967(2001); Mulholland, Trop. Med. Int. Health 10:497-500(2005))。7价缀合物疫苗的使用也已导致未被疫苗中包括的多糖覆盖的荚膜类型的菌株的群集和疾病增加(Bogaert 等, Lancet Infect. Dis. 4:144-154(2004); Eskola等, N. Engl. J. Med. 344-403-409(2001); Mbelle等, J. Infect. Dis. 180:1171-1176(1999))。对于肺炎球菌性中耳炎，可获得的缀合物疫苗在保护免于疾病中也不起作用，因为它们不针对侵入性疾病。另外，接种后AOM复发仍然是可能的；例如，特别倾向于AOM的复发性发作的儿童亚群，尽管免疫缀合物，仍经历许多复发并继续变得易患耳炎。

因此，对于在预防或治疗复发的肺炎球菌性AOM中使用的组合物和预防或治疗复发的肺炎球菌性AOM的方法仍然有需求。

发明概述

描述了在有风险的受试者中用于预防或治疗肺炎链球菌感染造成的AOM复发的方法。有风险的受试者包括例如，具有AOM的复发性发作(例如，易患耳炎)的婴儿和儿童，和已经具有AOM治疗失败的那些婴儿和儿童。例如，提供了在有发展肺炎球菌性AOM复发的风险的受试者中预防或治疗肺炎链球菌感染造成的急性中耳炎复发的方法，所述方法包括向所述受试者施用至少一次治疗有效量的组合物，所述组合物包含至少一种分离的和纯化的免疫原性多肽，或其免疫原性片段，所述免疫原性多肽选自肺炎链球菌PhtD、PhtE、PcpA、LytB和去毒的肺炎球菌溶血素。在某些实施方案中，受试者可以先前已经经历了至少一次急性中耳炎发作。在一些实施方案中，受试者可以在6个月的时期内已经经历了3次或更多次急性中耳炎发作或在12个月的时期内已经经历了4次或更多次急性中耳炎发作。在一些实施方案中，受试者可以具有急性中耳炎。

还描述了用于这些方法，预防或治疗AOM复发的组合物。所述组合物包含至少一种选自PhtD、PhtE、PcpA、LytB和去毒的肺炎球菌溶血素的肺炎链球菌的免疫原性多肽，或其免疫原性片段。

本文公开的主题内容提供几个优点。例如本文所述方法可以用于引发或增强抗原特异性CD4+ T细胞的产生。

根据下文详细的描述、附图和权利要求，其它特征和优点将是显而易见的。

附图简述

可以根据下文描述参照附图进一步理解本公开。

图1 是显示在不易患耳炎和易患耳炎儿童的循环中针对各种肺炎球菌抗原、针对6种肺炎球菌抗原产生各种细胞因子(a)IFN-γ、(b)IL-4、(c)IL-2 &(d)IL-17a的CD45RALow记忆性CD4+ T细胞亚群的百分比频率的图形表示。条形图代表抗原刺激后CD69+ CD4+ T细胞的平均百分比值。误差条代表SEM，采用Mann Whitney检验计算P值。^*P <0.05；^**P <0.005。

图2 是显示在不易患耳炎儿童和易患耳炎儿童的两个同龄组的血清样品中对5种肺炎球菌蛋白抗原(PhtD、LytB、PcpA、PhtE和Ply)的IgG应答的比较的图形表示。^*P <0.05；^**P <0.005；^***P <0.0005。Y轴代表几何平均滴度，并且误差条是95％置信区间上限。

图3 是显示针对SEB的CD4+ T细胞应答的图形表示。来自不易患耳炎儿童和易患耳炎儿童的PBMC样品用SEB刺激，并且观察CD45RALow CD4+ T细胞群中的细胞因子产生。

图4 是显示在35名易患耳炎儿童、25名AOMTF儿童和34名不易患耳炎儿童中在他们AOM急性随访时儿童血清样品中IgG抗体的比较的图形表示。注：针对5种蛋白的所有抗体浓度是以终点滴度表示的。显示线以指示在两组间观察的显著性差异。^***指 p 值 <0.0001，^**指 p 值 <0.001，并且^*指 p 值 < 0.05。

图5 是显示在不易患耳炎儿童和易患耳炎儿童中随年龄(6-24个月)针对5种肺炎链球菌蛋白的IgG抗体水平的比较的图形表示。在6、9、12、15、18和24个月时间点包括的血清数目对于不易患耳炎儿童分别为107、88、65、61、55和44，对易患耳炎儿童分别为10、10、9、10、10和4。在比较IgG血清抗体随时间相对上升时，在不易患耳炎儿童中对于除了LytB(p<0.07)的所有5种蛋白发现显著性差异，而在易患耳炎儿童中差异不显著(对于蛋白PhtD，p= 0.40，对于LytB，p = 0.39，对于PcpA，p = 0.11，对于PhtE，p = 0.09并且对于Ply，p = 0.42)。

图6 是由小图A、B和C组成的图形表示：图6A显示抗原特异性记忆性B细胞的百分比频率；图6B显示在不易患耳炎儿童和易患耳炎儿童的血清样品中针对5种肺炎球菌抗原的IgG应答的比较(Y轴代表几何平均滴度并且误差条是95％置信区间上限)；图6C显示循环的PhtD特异性记忆性B细胞百分比(x轴)和血清PhtD特异性IgG浓度(y轴)之间的相关性。

发明详述

描述了用于在有风险的受试者(例如，儿童)中预防和/或治疗肺炎链球菌感染造成的急性中耳炎复发的方法。还描述了用于这些方法，预防和/或治疗急性中耳炎复发的组合物。组合物包含至少一种选自PhtD、PhtE、PcpA、LytB和去毒的肺炎球菌溶血素的肺炎链球菌的免疫原性多肽，或其免疫原性片段。这些方法和组合物在下文进一步描述。

所提供的预防和治疗方法包括向有发展肺炎球菌性AOM复发(即，症状性肺炎链球菌感染导致AOM复发)的风险的受试者施用治疗有效量的组合物(例如，药物组合物)至少一次，所述组合物包含至少一种分离的和纯化的选自PhtD、PhtE、PcpA、LytB和去毒的肺炎球菌溶血素的肺炎链球菌的免疫原性多肽，或其免疫原性片段。

有风险的受试者群体包括，例如在他们的生命期已经具有至少1、2、3、4或更多次AOM发作的婴儿和儿童；易患耳炎的婴儿和儿童(即，已经在6个月内有3次或更多次AOM发作或在一年内有4次或更多次AOM发作)；和具有或已具有AOM治疗失败的婴儿和儿童(即，具有在至少48小时的适当的抗生素治疗后已经未能实现细菌根除和/或症状消除的AOM的那些婴儿和儿童；或完成抗生素疗程的14天内AOM体征和症状重现的婴儿和儿童)。有风险的受试者群体还包括例如，婴儿和儿童：对于复发性AOM有遗传倾向(Casselbrant ML 等 JAMA 1999; 282:2125-2130)；参加户外日托；参加家庭日托；具有一个或多个抽烟的父母/护理者；使用奶嘴；配方而非母乳喂养；和在生命的前6个月已经历AOM感染(Bentdal等 Int. J. Ped. Otorhinolaryngol. 2007; 71:1251-1259)。随儿童长大，由于咽鼓管中的解剖学变化，他们变得较少易患AOM。通常情况下，易患耳炎儿童在年龄3至5岁左右“长大而丧失(outgrow)”他们的倾向(40，48-51)。在某些实施方案中，受试者具有肺炎球菌性AOM或有发生肺炎球菌性AOM的风险。

如本文实施例中所讨论，易患耳炎儿童(即有风险的受试者群体)相比不易患耳炎儿童显示对Spn抗原(例如，PhtD、PhtE、PcpA、LytB、Ply)的免疫低应答性。例如，与不易患耳炎儿童相比，易患耳炎儿童具有肺炎球菌抗原特异性功能性记忆性CD4+ T细胞(例如对PhtD、PhtE、PcpA、LytB或Ply特异性的功能性记忆性CD4+ T细胞)缺乏或减少和减少的针对肺炎球菌抗原(例如，对PhtD、PhtE、PcpA、LytB、Ply)的血清IgG水平。然而这些儿童在总功能性记忆性T细胞或引发针对接种的抗原的B细胞介导的抗体应答方面是没有缺陷的。具有AOM治疗失败(AOMTF)的儿童免疫学行为与易患耳炎儿童类似。有风险的受试者是那些针对Spn抗原例如，如PhtD、PhtE、PcpA、LytB和/或Ply显示这种免疫低应答性的受试者。

如本文所用，在受试者中预防AOM的复发意指向受试者施用治疗有效量的本文所述组合物以保护受试者免于发展肺炎球菌急性中耳炎的复发。

如本文所用，治疗AOM的复发(或易患耳炎的受试者或具有复发性AOM的受试者)意指向患肺炎链球菌导致的AOM或已经暴露于肺炎链球菌和先前患AOM的受试者施用治疗有效量的本文所述的组合物，其中目的是治疗、治愈、缓解、减轻、改变、矫正、改善、改进或影响状况(例如，AOM)或疾病(即AOM)的症状。

治疗有效量指对于给定的状况和施用方案提供治疗效果的量。治疗有效量可以由普通熟练的医务工作人员基于患者特征(年龄、体重、性别、状况、并发症其它疾病等)确定。治疗有效量将进一步受组合物的施用途径影响。

在某些实例中，组合物的施用引发或增强抗原特异性CD4+ T细胞的产生。引发或增强其产生的抗原特异性CD4+ T细胞可以是那些产生例如细胞因子IFN-γ、IL-4、IL-2和/或IL-17a的细胞。例如，在一个实施方案中，组合物的施用引发或增强产生IFN-γ的抗原特异性CD4+ T细胞的产生。如本文所用，“引发或增强抗原特异性CD4+ T细胞的产生”意指抗原特异性CD4+ T细胞的量或百分比(%)增加。细胞的量可以增加超过在组合物临施用前存在的细胞量，例如增加25%、30%、35%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%、150%、200%、300%、400%或更多。

在一个实施方案中，组合物的施用引发或增强抗原特异性抗体(例如，IgG)的产生。通过引发或增强抗体产生，抗原特异性总IgG的总浓度(滴度)相对临施用前存在的浓度(滴度)增加。终点稀释滴度可以增加超过在组合物临施用前存在的滴度，例如增加25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%、150%、200%或更多。在一个实施方案中，抗原特异性IgG滴度相对组合物临施用前存在的滴度增加例如2、3或4倍。

还公开的是在有风险的受试者(例如，儿童)中减少急性中耳炎复发风险的方法，包括向受试者施用包含一种或多种公开的免疫原性多肽的组合物。这种复发的风险可以通过本文所述的方法减少。

在具体实施方案中，提供了在有风险的受试者(即，已经具有至少一次或多次AOM的复发性发作的受试者)中预防或治疗易患耳炎状况的方法。

本公开还提供了在有风险的受试者中通过施用本文所述的组合物引发免疫应答的方法。这可以通过向受试者施用组合物的药学可接受的制剂以影响至少一种免疫原性多肽对受试者免疫系统的暴露来实现。

本公开还提供一种或多种免疫原性肺炎链球菌多肽在组合物例如，如疫苗组合物中的用途。该组合物在向受试者(例如哺乳动物)施用后，诱导或增强针对组合物中包括的免疫原性多肽(即抗原)的免疫应答。此应答可以包括抗体的产生(例如，通过B细胞的刺激)或基于T细胞的应答(例如，溶细胞应答)。这些应答可以是或可以不是保护性的或中和性的。保护性的或中和性的免疫应答是一种应答，其对对应于抗原(例如，抗原衍生自其中)的感染性生物体是不利的并对受试者是有益的(例如，通过减少或预防感染)。如本文所用，保护性的或中和性的抗体可以对相应的野生型肺炎链球菌多肽是有反应性的，并当在受试者(例如哺乳动物)中测试时，可以减少或抑制相应的肺炎链球菌生物体或相应的野生型肺炎链球菌多肽的致死率。向受试者施用后造成保护性的或中和性的免疫应答的免疫组合物可以被认为是疫苗。本文所述组合物可用于在有风险的受试者中预防或治疗AOM复发的方法，如上文定义，所述受试者有被肺炎链球菌感染和发展AOM复发的风险。组合物还可用于预防或治疗复发性AOM的方法。

本文所述组合物，可以通过适当的途径施用，例如，如经皮(例如，肌内、静脉内、腹膜内或皮下)、经真皮、粘膜(例如鼻内)或局部的途径，其量和方案由本领域技术人员确定为适当的。例如，每个剂量可以施用100ng-500μg、1-240μg、10-100pg、5-50μg或10-25 μg的免疫原性多肽。出于预防或治疗的目的，疫苗可以施用一次或多次。例如，疫苗可以施用例如1、2、3或4次。在一个实例中，一次或多次施用可以作为所谓的“引发-增强(prime-boost)”方案的部分发生。当施用多剂量时，剂量可以彼此分开，例如，一周、一个月或几个月。

本文所述免疫原性多肽具有免疫原性活性。术语“免疫原性活性”指多肽在受试者(例如，哺乳动物)中引发免疫应答的能力。对多肽的免疫应答是在动物中发展针对多肽的细胞和/或抗体介导的免疫应答。通常，免疫应答包括但不限于下列效果的一种或多种：产生针对多肽的一个或多个表位的抗体、B细胞、辅助性T细胞、抑制性T细胞和/或细胞毒性T细胞。术语“表位”指抗原上的部位，特异性B细胞和/或T细胞对其应答从而产生抗体。免疫原性活性可以是保护性的。术语“保护性免疫原性活性”指多肽在受试者中引发免疫应答以预防或抑制肺炎链球菌感染(例如，抑制造成AOM复发的肺炎链球菌感染)的能力。

在某些实施方案中，可以配制包含2、3、4或更多种免疫原性多肽的多成分组合物以保护免于肺炎链球菌感染导致的AOM的复发。该组合物的一个优选实施方案包含PhtD和PcpA的免疫原性多肽。进一步优选的组合物包含PhtD、PcpA和去毒的肺炎球菌溶血素的免疫原性多肽。用于如本文所述用途的某些优选的多成分组合物在WO2011/075823(2010年12月20日提交，并且名称为免疫原性组合物)中描述。

多成分组合物的成分优选地是相容的，并且以适当的比例组合以避免抗原性干扰和以优化任何可能的协同作用。例如每种成分的量可以在每剂量约5 µg到约500 µg、每剂量5 µg到约10 µg、每剂量25 µg到约50 µg或每剂量50 µg到约100 µg的范围内。最优选地，范围可以是每剂量每抗原性成分约10µg到50µg。

免疫原性多肽

编码免疫原性多肽的核酸可以分离自，例如，但不限于，野生型或突变体肺炎链球菌细胞或可替代地，可直接获自携带可应用的DNA基因序列(例如，pcpA或phtD)的肺炎链球菌菌株的DNA，通过使用聚合酶链式反应(PCR)，或通过使用本领域技术人员认可的可替代的标准技术。所使用的可能的菌株包括例如肺炎链球菌菌株TIGR4和14453。在优选的实施方案中，多肽重组地衍生自肺炎链球菌菌株14453。

本文所述的多肽可以使用标准的分子生物学技术和表达系统生产(参见例如，Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第三版，Sambrook等, Cold Spring Harbor Press, 2001)。例如，可以分离编码免疫原性多肽的基因片段，并且编码免疫原性多肽的多核苷酸可以克隆到任何可商购获得的表达载体(例如，如，pBR322，和pUC载体(New England Biolabs, Inc., Ipswich, MA))，或表达/纯化载体(例如，如，GST融合载体(Pfizer, Inc., Piscataway, N.J.)中，并然后在合适的原核、病毒或真核宿主中表达。然后纯化可以通过常规方法，或者在商业化的表达/纯化系统的情况下，根据制造商的说明书而实现。

可替代地，本文所述的免疫原性多肽，包括变体，可以通过化学合成获得，使用商品化的自动程序，例如，如完全的固相合成，部分固相方法，片段缩合或溶液合成。

免疫原性PcpA多肽包含全长PcpA氨基酸序列(在存在或不存在信号序列的情况下)，其片段，和其变体。适合用于本文所述组合物的PcpA多肽包括，例如GenBank登录号CAB04758、YP817353、AAK76194、NP359536、ZP01835022和ZP01833419的那些多肽，和本文和下文实施例中所述那些多肽，等。在一个实施方案中，PcpA具有 SEQ ID NO:1或2所示氨基酸序列。

肺炎链球菌14453基因组中全长PcpA的氨基酸序列是SEQ ID NO. 1。优选的PcpA多肽可以包含与SEQ ID NO: 1、2或3具有50%或更多的同一性(例如，60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.5%或更多)的氨基酸序列。优选的多肽可以包含例如SEQ ID NO: 1、2或3的至少8、9、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多的连续氨基酸的片段。优选的片段包含来自SEQ ID NO: 1、2或3的表位。其它优选的片段从SEQ ID NO: 1或2的N末端缺失一个或多个氨基酸(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)和/或从SEQ ID NO: 1或2的C末端缺失一个或多个氨基酸，而保留SEQ ID NO: 1或2的至少一个表位。进一步优选的片段从SEQ ID NO: 1或2的N末端缺失信号序列。优选的PcpA多肽是SEQ ID NO: 3。

SEQ ID NO: 1(PcpA，Spn菌株14453)

SEQ ID NO:2(PcpA)

SEQ ID NO:3(PcpA构建体)

PcpA的免疫原性多肽任选地缺失在天然存在的成熟PcpA蛋白中典型地存在的胆碱结合结构域锚定序列。成熟PcpA蛋白的胆碱结合锚定的天然存在的序列在WO 2008/022302中公开为SEQ ID NO:52。更具体地，免疫原性多肽包含天然存在的PcpA的N末端区域，与天然存在的PcpA具有一个或多个氨基酸取代和约60到约99%序列同一性或在例如80、85、90和95%同一性之间的任何同一性。在存在或不存在一个或多个连续氨基酸取代的情况下和存在或不存在信号序列的情况下，N末端区域可以包含SEQ ID NO: 1或2(或WO2008/022302的SEQ ID NO: 1、2、3、4、41或45)的氨基酸序列。N末端区域可以包含与SEQ ID NO: 1、2或3(描述在本文的序列表中)或WO2008/02230的SEQ ID NO:1、2、3、4或41具有约60到99%序列同一性(或80到99%同一性之间任何同一性)的氨基酸序列。

SEQ ID NO: 1、2或3的免疫原性片段可以包含，例如，SEQ ID NO: 1、2或3的5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190和191个氨基酸残基或5和191之间的任意数目的氨基酸残基。在WO 2008/022302中公开了PcpA的免疫原性片段的实例。

本文所述免疫原性多肽的变体可以包含一个或多个连续的氨基酸取代。免疫原性的PcpA多肽的变体包括与SEQ ID NO: 1、2或3或其任何片段具有约50到约99%序列同一性(或50和99%同一性之间的任何同一性)的氨基酸序列。使用本领域熟知的方法根据其免疫原性能力选择变体。

适合用于本文所述组合物的免疫原性PhtX多肽包括例如，全长PhtD或PhtE氨基酸序列(在存在和不存在信号序列的情况下)、其免疫原性片段、其变体和其融合蛋白。适合用于本文所述组合物的PhtD多肽包括，例如，Genbank登录号AAK06760、YP816370和NP35851的那些，等。肺炎链球菌14453基因组中全长PhtD的氨基酸序列是SEQ ID NO.4并且来自TIGR4菌株的氨基酸序列是SEQ ID NO: 5。PhtD(衍生自肺炎链球菌14453基因组)优选的多肽是SEQ ID NO: 6。适合用于本文所述组合物的PhtE多肽包括，例如，Genbank登录号AAK06761、YP816371和NP358502的那些，等。肺炎链球菌14453基因组中全长PhtE的氨基酸序列是SEQ ID NO. 7。PhtE(衍生自肺炎链球菌14453基因组)优选的多肽是SEQ ID NO: 8。

SEQ ID NO:4(PhtD Spn菌株14453)

SEQ ID NO:5(PhtD Spn菌株TIGR4)

SEQ ID NO:6(衍生自Spn菌株14453的PhtD构建体)

SEQ ID NO:7(PhtE)

SEQ ID NO:8(衍生自Spn菌株14453的PhtE构建体)

免疫原性PhtX(例如，PhtD或PhtE)多肽可以包括附着信号序列的全长蛋白，信号肽(例如，N端约20个氨基酸)移除的成熟全长蛋白，PhtX的变体(天然存在或另外的，例如合成地衍生的)和PhtX的免疫原性片段(例如，包含在天然存在的成熟PhtX蛋白中存在的至少15或20个连续氨基酸的片段)。PhtX多肽的免疫原性片段和变体能够引发特异性针对相应的全长成熟氨基酸序列的免疫应答。在PCT公开WO 2009/012588中公开了PhtD的免疫原性片段的实例。

所用的优选的PhtD多肽可以包含与SEQ ID NO: 4、5或6具有50%或更多的同一性(例如，60、65、70、75、80、85、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.5%或更多)的氨基酸序列。所用的优选的多肽可以包含SEQ ID NO: 4、5或6的至少8、9、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多的连续氨基酸的片段。优选的片段包含来自SEQ ID NO: 4、5或6的表位。其它优选的片段从SEQ ID NO: 4，5或6的N末端缺失一个或多个氨基酸(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)和/或从SEQ ID NO: 4、5或6的C末端缺失一个或多个氨基酸，而保留SEQ ID NO: 4、5或6的至少一个表位。进一步优选的片段从SEQ ID NO: 4或5的N末端缺失信号序列。优选的PhtD多肽是SEQ ID NO: 6。

所用的优选的PhtE多肽可以包含与SEQ ID NO: 7、或SEQ ID NO: 8具有50%或更多的同一性(例如，60、65、70、75、80、85、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.5%或更多)的氨基酸序列。所用的优选的多肽可以包含SEQ ID NO: 7或8的至少8、9、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多的连续氨基酸的片段。优选的片段包含来自SEQ ID NO: 7或SEQ ID NO: 8的表位。其它优选的片段从SEQ ID NO: 7或8的N末端缺失一个或多个氨基酸(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)和/或从SEQ ID NO: 7或8的C末端缺失一个或多个氨基酸，而保留SEQ ID NO: 7或8的至少一个表位。进一步优选的片段从SEQ ID NO: 7的N末端缺失信号序列。优选的PhtE多肽是SEQ ID NO: 8。

免疫原性LytB多肽包括附着信号序列的全长蛋白，信号肽移除的成熟全长蛋白，LytB的变体(天然存在或另外的，例如合成地衍生的)和LytB的免疫原性片段(例如，包含在天然存在的成熟LytB蛋白中存在的至少15或20个连续氨基酸的片段)。本文所述的免疫原性LytB多肽的免疫原性变体和片段能够引发特异性针对相应的全长成熟氨基酸序列的免疫应答。适合用于本文所述组合物的LytB多肽包括，例如，Genbank登录号CAA09078、YP816335、ABJ55408、AAK19156、NP358461和AAK75086的那些，等。

所用的优选的LytB多肽可以包含与SEQ ID NO: 9、10或11具有50%或更多的同一性(例如，60、65、70、75、80、85、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.5%或更多)的氨基酸序列。所用的优选的多肽可以包含SEQ ID NO: 9、10或11的至少，例如，8、9、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多的连续氨基酸的片段。优选的片段包含来自SEQ ID NO: 9、10或11的表位。其它优选的片段从SEQ ID NO: 9、10或11的N末端缺失一个或多个氨基酸(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)和/或从SEQ ID NO: 9或10的C末端缺失一个或多个氨基酸，而保留SEQ ID NO: 9或10的至少一个表位。进一步优选的片段从SEQ ID NO: 10的N末端缺失信号序列。优选的LytB多肽是SEQ ID NO: 11。

SEQ ID NO:9(LytB)

SEQ ID NO:10(LytB)

SEQ ID NO: 11(衍生自Spn菌株14453的LytB构建体；缺失信号序列和胆碱结合区域；载体衍生的序列加下划线)

肺炎球菌溶血素(Ply)是溶细胞活化的毒素，牵涉于肺炎球菌发病的多个步骤，包括纤毛摆动的抑制和上皮细胞间紧密连接的破坏(Hirst 等，Clinical and Experimental Immunology(2004))。几种肺炎球菌溶血素是已知的并且(在去毒后)将适合用于本文所述的组合物，包括例如，Genbank登录号Q04IN8、P0C2J9、Q7ZAK5、和ABO21381，等。在一个实施方案中，Ply具有 SEQ ID NO:12所示氨基酸序列。

免疫原性肺炎球菌溶血素多肽可以包括附着信号序列的全长蛋白，信号肽移除的成熟全长蛋白，肺炎球菌溶血素的变体(天然存在或另外的，例如合成地衍生的)和肺炎球菌溶血素的免疫原性片段(例如，包含在天然存在的成熟肺炎球菌溶血素蛋白中存在的至少15或20个连续氨基酸的片段)。免疫原性的肺炎球菌溶血素多肽的免疫原性变体和片段能够引发特异性针对相应的全长成熟氨基酸序列的免疫应答。免疫原性的肺炎球菌溶血素多肽典型地是去毒的，即，它们缺失毒性或具有相比肺炎链球菌产生和释放的成熟的野生型肺炎球菌溶血素蛋白减少的毒性。免疫原性肺炎球菌溶血素多肽可以是，例如化学(例如，使用甲醛处理)或基因(例如，以突变的形式重组产生)去毒的。免疫原性的去毒的肺炎球菌溶血素的优选的实例公开于PCT公开号WO 2010/071986。在一个实施方案中，免疫原性的去毒的肺炎球菌溶血素具有 SEQ ID NO:13所示氨基酸序列。

优选的肺炎球菌溶血素多肽可以包含与SEQ ID NO: 12、或与SEQ ID NO: 13具有50%或更多的同一性(例如，60、65、70、75、80、85、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.5%或更多)的氨基酸序列。优选的多肽可以包含SEQ ID NO: 12或13的至少8、9、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多的连续氨基酸的片段。优选的片段可以包含来自SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 13的表位。其它优选的片段从SEQ ID NO: 12或13的N末端缺失一个或多个氨基酸(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)和/或从SEQ ID NO: 12或13的C末端缺失一个或多个氨基酸，而保留SEQ ID NO: 12或13的至少一个表位。进一步优选的片段从SEQ ID NO: 12的N末端缺失信号序列。优选的免疫原性的和去毒的肺炎球菌溶血素多肽是SEQ ID NO: 13。

SEQ ID NO: 12(PLY)

SEQ ID NO:13(衍生自Spn菌株14453的PlyD1构建体)

使用本领域熟知的方法根据其免疫原性能力选择本文所述的免疫原性多肽的变体。这些变体可以包含氨基酸修饰。例如，氨基酸序列修饰包括取代、插入或缺失性变化。取代、缺失、插入或其任何组合可以在单一变体中组合，只要变体是免疫原性多肽。插入包括氨基和/或羧基端融合，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。插入通常将是比氨基或羧基末端融合的插入更小的插入，例如，约一到四个残基。缺失的特征在于一个或多个氨基酸残基从蛋白序列的移除。典型地，不超过约2到6个残基在蛋白分子内的任一部位缺失。这些变体通常通过在编码蛋白的DNA中部位特异性诱变核苷酸而制备，从而产生编码变体的DNA，并且之后在重组细胞培养物中表达该DNA。在具有已知序列的DNA中预先确定的部位进行取代突变的技术是熟知的并且包括，但不限于，M13引物诱变和PCR诱变。氨基酸取代典型地是单一残基，但是可以在一些不同位置同时发生。取代的变体是那些其中至少一个残基被移除并且不同的残基插入其位置的变体。这些取代通常根据下表制备，并且称为保守取代。其它的对于本领域技术人员是熟知的。

如本文所用，氨基酸取代可以是保守的或非保守的。保守氨基酸取代可以涉及天然氨基酸残基用非天然残基的取代，使得对该位置的氨基酸残基的大小、极性、电荷、疏水性或亲水性很少或没有影响，并且具体而言，没有造成免疫原性的降低。合适的保守氨基酸取代显示在下文的表1中。

表 1

技术人员将能够使用熟知的技术确定本文提供的多肽和/或片段的合适的变体。

类似物可以在氨基酸序列中和/或由于非序列修饰而不同于天然存在的肺炎链球菌多肽。非序列修饰包括乙酰化、甲基化、磷酸化、羧化或糖基化的变化。多肽的“修饰”可以包括在一个或多个组成的氨基酸化学或酶学衍生的多肽(或其类似物，例如，如，其片段)。这些修饰可以包括，例如，侧链修饰，骨架修饰，和N和C末端修饰，例如，如，乙酰化、羟基化、甲基化、酰胺化和碳水化合物或脂质部分的附着，辅因子，等，及其组合。本文所述的修饰的多肽可以保持未修饰的多肽的生物学活性或可以显示减少或增加的生物学活性。

两种多肽的结构相似性可以通过比对两种多肽(例如，候选多肽和，例如，SEQ ID NO: 2的多肽)的残基来确定，以优化沿其序列长度的相同氨基酸的数目；在进行比对时允许任一或两个序列中的缺口以优化相同氨基酸的数目，虽然每个序列中的氨基酸必须仍然保持其适当的顺序。候选多肽是与参考多肽比较的多肽。候选多肽可以从，例如微生物分离，或可以使用重组技术产生，或化学或酶学合成。

氨基酸序列的成对的比较分析，可以使用综合的算法进行，例如，Needleman-Wunsch。或者，多肽可以使用局部比对算法进行比较，例如，如Tatiana等(FEMS Microbiol. Lett, 174 247-250(1999)所述，和国家生物技术信息中心(NCBI)网站上可用的BLAST 2搜索算法的Blasp程序。对所有BLAST2搜索参数可以使用默认值，包括矩阵= BLOSUM62；开放缺口罚分=11，延伸缺口罚分=1，缺口x衰减= 50，预期10，字长=3，和打开过滤器(filter on)。Smith和Waterman算法是另一个可以使用的局部比对工具(1988)。

在两个氨基酸序列的比较中，结构相似性可以通过百分比“同一性”提及或可以通过百分比“相似性”提及。“同一性”指相同氨基酸的存在。“相似性”指相同氨基酸的存在和保守取代的存在。对于本文所述多肽中氨基酸的保守取代可以选自显示于表1的氨基酸所属类别的其它成员。

组合物

组合物(例如，疫苗组合物)可以在存在或不存在佐剂的情况下施用。佐剂通常是可以增强抗原免疫原性的物质。佐剂可以在获得性和先天免疫(例如，toll样受体)中发挥作用，并且可以以各种方式发挥功能，不是其中所有的方式都被理解。

很多物质，无论天然还是合成的，已经显示作为佐剂发挥功能。例如，佐剂可以包括，但不限于，矿物盐、鲨烯混合物、胞壁酰肽、皂苷衍生物、分枝杆菌细胞壁制剂、某些乳液、单磷酰脂质A、分枝菌酸衍生物、非离子型嵌段共聚物表面活性剂、Quil A、霍乱毒素B亚单位、聚磷腈和衍生物、免疫刺激复合物(ISCOM)、细胞因子佐剂、MF59佐剂、脂质佐剂、粘膜佐剂、某些细菌外毒素和其它成分、某些寡核苷酸、PLG、及其它。这些佐剂可以用于本文所述的组合物和方法。

在某些实施方案中，组合物在存在佐剂的情况下施用，所述佐剂包括水包油型乳液，所述水包油型乳液包含至少鲨烯，含水溶剂，聚氧乙烯烷基醚亲水性非离子型表面活性剂，疏水性非离子型表面活性剂，其中所述水包油乳液通过相转变温度处理获得，并且其中根据油滴的体积，90％的群体具有小于200nm，和任选地小于150nm的大小。该佐剂在WO2007006939(包含热可逆性乳液的疫苗组合物)中描述，其整体并入本文。除了或替代所述的鲨烯水包油乳液，组合物还可以包括产品E6020(具有CAS号287180-63-6)。产品E6020在US2007/0082875中描述(其通过引用整体并入本文)。

在某些实施方案中，组合物包含单独或与佐剂组合在一起的TLR激动剂(例如，TLR4激动剂)。例如，佐剂可以包含TLR4激动剂(例如，TLA4)、鲨烯、含水溶剂，属于聚氧乙烯烷基醚化学基团的非离子型亲水性表面活性剂，非离子型疏水性表面活性剂并且其是热可逆的。这些佐剂的实例在WO2007080308(热可逆的水包油乳液)中描述，其整体并入本文。在一个实施方案中，组合物采用CpG和铝盐佐剂(例如，Alum)的组合进行佐剂化。

铝盐佐剂(或化合物)属于本文所述的实践中使用的佐剂。所用的铝盐佐剂的实例包括氢氧化铝(例如，结晶铝羟基氧化物(aluminum oxyhydroxide)AlO(OH))，和氢氧化铝Al(OH)₃。氢氧化铝是包含Al³⁺离子和羟基基团(-OH)的铝化合物。还可以使用氢氧化铝和其它铝化合物(例如，羟基磷酸盐或羟基硫酸盐)的混合物，其中所获得的混合物是包含羟基基团的铝化合物。在具体的实施方案中，铝佐剂是铝羟基氧化物(例如，Alhydrogel^®)。本领域熟知，具有铝盐佐剂的组合物不应暴露于极端温度，即低于冰点(0℃)或极端高温(例如，≥ 70℃)，因为该暴露可以不利地影响所吸附抗原和佐剂两者的稳定性和免疫原性。

在具体的实施方案中，铝化合物(例如，氢氧化铝佐剂)用磷酸盐处理。

在优选的实施方案中，磷酸盐以盐的形式加入氢氧化铝佐剂。优选地，磷酸盐离子由包含二钠一钠磷酸盐的缓冲溶液提供。

在优选的实践中，如本文所示例的，铝化合物(例如，铝羟基氧化物)用磷酸盐处理(例如，通过WO2011/075822(2010年12月20日提交，名称为免疫原性组合物和相关方法)中所述的工艺)。在此工艺中，铝羟基氧化物的含水悬液(约20mg/mL)与磷酸盐缓冲溶液(例如，约400mol/L)混合。优选的最终磷酸盐浓度是约2mM到20mM。混合物然后用缓冲液(例如，Tris-HCl、含盐的Tris-HCl、HEPES)稀释以制备铝羟基氧化物和磷酸盐(PO4)的悬液。优选地，缓冲液是pH约7.4的10mM Tris-HCl和150mM NaCl。悬液然后在室温下混合约24小时。优选地在最终悬液中元素铝的浓度是在约0.28mg/mL到1.68mg/mL的范围内。更优选地，元素铝的浓度是约0.56mg/mL。

免疫原性多肽(例如，PcpA，PhtD)可以随后单独或组合吸附到处理的氢氧化铝上。

组合物可以优选地以液体形式，但是它们可以是冻干的(如根据标准方法)或泡沫干燥的(如WO2009012601, 抗原-佐剂组合物和方法中所述)。根据一个实施方案的组合物是以液体形式。接种剂量可以配制在0.5和1.0ml之间的体积中。液体制剂可以以任何适合于施用的形式，包括例如溶液或悬液。因此，组合物可以包括液体介质(例如，盐水或水)，其可以是缓冲的。

制剂(和组合物)的pH可以优选地在约6.4和约8.4之间。更优选地，pH是约7.4。示例性的组合物的pH范围是5-10，例如5-9、5-8、5.5-9、6-7.5或6.5-7。可以通过缓冲液的使用来保持pH。

免疫原性组合物的药物制剂还可以任选地包括一种或多种赋形剂(例如，稀释剂、增稠剂、缓冲剂、防腐剂、表面活性剂、佐剂、去垢剂和/或免疫刺激剂)，其是本领域熟知的。合适的赋形剂将是与抗原和与佐剂相容的，如本领域已知的。稀释剂的实例包括黏合剂、崩解剂，或分散剂例如淀粉、纤维素衍生物、苯酚、聚乙二醇、丙二醇或甘油。药物制剂还可以包括一种或多种活性成分例如抗菌剂、抗炎剂和麻醉剂。去垢剂的实例包括吐温(聚山梨醇酯)例如吐温80。用于包括在组合物中的合适的赋形剂是本领域已知的。

在佐剂化的免疫的一个实施方案中，例如，免疫原性多肽和/或其片段可以是共价偶联到细菌多糖上以形成多肽缀合物。该缀合物可以用作免疫原以引发针对缀合到多肽和/或其片段的细菌多糖的T细胞依赖性的免疫原性应答。

免疫原性组合物可以以试剂盒形式提出，包含免疫原性组合物和佐剂或重构溶液，包含一种或多种药学可接受的稀释剂以促进组合物的重构，用于使用普通或其它装置对哺乳动物施用。该试剂盒将任选地包括用于组合物的液体形式的施用的装置(例如，皮下注射器，微针阵列)和/或使用说明书。

实施例

上文的公开通常描述此主题内容的某些实施方案。通过参照下列具体实施例可以获得更全面的理解。描述这些实施例仅用于阐释的目的，并且不意图限制本公开的范围。考虑形式的变化和等价物的取代，因为情况可以暗示或提出手段(expedient)。虽然本文已使用具体术语，这些术语意指描述性的意思，并且不是出于限制的目的。

在本公开和这些实施例中所用的但没有明确描述的分子遗传学、蛋白生物化学和免疫学的方法在科学文献中有充分的报道，并且都在本领域技术人员的能力之内。

免疫应答

CD4+ T细胞认为在针对细胞外病原体，例如，如肺炎链球菌中是最重要的。用MHC II类分子相关的负载抗原的抗原呈递细胞(APC)刺激后，幼稚的CD4+ T细胞可以分化成功能不同的T-辅助细胞(Th)-亚群。定型为不同的Th亚群取决于在宽松的环境中与APC的复杂的相互作用，包括抗原性类型和负载、共刺激分子和细胞因子信号传递(7-9)。例如，特征在于白介素(IL)-2、干扰素-γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子-β(TNF-β)产生的Th1细胞对于根除细胞内病原体是最重要的。清除细胞外病原体必需的Th2细胞表达IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13和IL-25。最近发现的Th17细胞分泌IL-17、IL-21和IL-22(10)。

记忆性T细胞应答或者在效应物应答(线性模型或不对称分裂)期间产生，或者是病原体清除后仍然感染和存在的效应物克隆型的大贮存物(cache)的残余(11)。具有其快速的回忆应答和高细胞因子产生的免疫记忆代表高度有效的机制，以确保快速保护免于流行的感染，并充当在入口进入点例如呼吸道粘膜处针对再次遇到病原体的主要防御(12，13)。强力的记忆性T细胞和B细胞应答在自然感染的发生以及接种后产生，并且记忆性淋巴细胞移居在淋巴样和非淋巴样部位(14-16)。一旦产生，记忆性T细胞可以在一定时期内在血液循环中检测到(15;17;18)。当前针对Spn产生免疫力的概念已经从小鼠中的研究发展出来，确定了CD4+ Th(辅助细胞)记忆性亚群(Th-1、Th-2和Th-17)的主要作用(19-21)。在动物模型中，CD4+ T细胞免疫在保护对抗耳病原体中发挥重要作用并且还可以赋予抗体非依赖的免疫(20，22，23)。但是，在经历AOM的人中没有数据支持T辅助细胞记忆性亚群的保护性作用。

抗原特异性CD4+ T细胞在适应性免疫应答中的主要作用是一方面在抗体产生中为B细胞提供帮助，并且另一方面作为它们自身的免疫功能效应物(7，9，23，27)。并且，在Th细胞提供的恒定的细胞因子环境中，以及在对抗原性刺激的应答中，特异性B细胞经历克隆扩增、类型转换和体细胞超突变，导致选择具有更高亲和力的抗体(28，29)。扩增的B细胞分化为浆细胞，所述浆细胞以高比率分泌抗体并在小生境(niche)如骨髓中持续，而一些分化成记忆性B细胞(29，30)。记忆性B细胞可以针对抗原性再刺激快速应答并可以有助于在来自CD4+ T细胞的持续帮助下持续很长时间保持浆细胞库和从而血清抗体水平(31)。

实施例 1

为了在儿童中评价易患耳炎状况，使用肺炎球菌蛋白抗原，对不易患耳炎和易患耳炎儿童同龄组的外周血中的Spn特异性的功能记忆性CD4+ Th细胞亚群进行计数。还在这些同龄组的儿童的血清中测量针对同样抗原的B细胞IgG应答。

受试者是来自由US NIH资助的5年前瞻性纵向AOM研究的参加者(26)。在6个月内有三次AOM发作或一年内有4次发作的儿童被认为是易患耳炎的，而其它具有更少发作的儿童被置于不易患耳炎组。入组儿童来自纽约州罗切斯特郊区中产阶级社会人口人群。无先前AOM的6个月年龄的健康儿童入组并在6、9、12、15、18、24和30个月的年龄获得七次血清、鼻咽(NP)和口咽(OP)培养物，并且两个同龄组均有不同年龄的2岁以下的儿童。在AOM发作期间通过鼓膜穿刺获得中耳液。肺炎链球菌和流感嗜血杆菌的NP/OP群集的评价通过培养的NP和OP表面和中耳液体的微生物学测试常规获得。分离来自收集的血液的PBMC并冷冻在液氮中直至使用。此研究中使用的样品从易患耳炎儿童在他们AOM随访时和从不易患耳炎组在群集或AOM随访期间取得。儿童已经根据可应用的日程表用可获得的缀合物疫苗的年龄适当的剂量针对肺炎链球菌进行免疫。

抗原

所用的肺炎球菌蛋白抗原是PhtD(SEQ ID NO:6)、PhtE(SEQ ID NO:8)、LytB(SEQ ID NO:11)、PcpA(SEQ ID NO:3)和PlyD1(SEQ ID NO:13)、肺炎球菌溶血素去毒的衍生物。作为对照，还使用PspA。每个蛋白克隆自肺炎链球菌血清型6B菌株，并在大肠杆菌中重组表达为可溶蛋白，并然后用离子交换层析的组合纯化。如通过SDS-PAGE和RP-HPLC测定的，纯化后蛋白各具有≥ 90%纯度。

通过不存在可检测的细胞毒性，使用台盼蓝染色和/或碘化丙啶染色后流式细胞分析(数据未显示)来确定用于刺激的最佳剂量。

T 细胞刺激

来自Spn在NP群集或AOM感染的易患耳炎或不易患耳炎的儿童的PBMC用六种肺炎球菌抗原刺激，而NTHi在NP群集或AOM感染的儿童用三种NTHi抗原刺激。刺激之前，冷冻的PBMC在37℃水浴快速融化，然后缓慢加入完全培养基(补充10%的FBS、2mM L-谷氨酰胺、0.1 mM丙酮酸钠、非必需氨基酸、100U/mL青霉素，100μg/mL链霉素的RPMI1640)。然后将细胞清洗并在24孔板中在完全培养基中静置过夜。使用修改自先前报道的标准化的方案刺激PBMC(35，36)。简而言之，细胞计数，并放置在96孔平底培养板中，并用1μg/ml的各种蛋白抗原或用1μg/ml的葡萄球菌肠毒素B(SEB)刺激。向细胞培养基中加入1μg/ml浓度的抗CD28和抗CD49d的抗体(分别是克隆L293和L25；BD Biosciences)，以提供共刺激和增强抗原特异性应答的检测。抗CD28和CD49d抗体已被广泛用于共刺激而不影响背景水平(18，37)。然后将细胞在存在5％CO2的条件下在37℃下孵育2小时进行抗原处理。2小时后，加入高尔基体转运抑制剂(BD Biosciences)以将细胞因子保存在细胞内，并且然后继续孵育额外的4小时。

细胞因子概况分析

使用多参数流式细胞术方法以检测在研究同龄组中AOM或NP群集后循环中针对Spn蛋白的特异性CD4 + T细胞应答。使用细胞内细胞因子染色测定(ICCS)以评价抗原特异性CD4 + T细胞亚群(Th-1、Th-2和Th-17)。刺激后，将细胞转移到96孔V型底板，并用FACS缓冲液(含5％FBS的PBS)清洗一次，并用针对各种细胞表面标志物的抗体染色。所使用的抗体是抗CD4 APC Alexafluor 750(克隆RPA T4，eBiosciences)，PE-德克萨斯红抗CD45RA(克隆MEM56，Invitrogen)，抗CCR7 PerCP/Cy5.5缀合物(克隆TG8/CCR7，Biolegend)。然后将细胞用固定和透化溶液(BD Biosciences)透化20分钟，并用1×透化缓冲液(BD Biosciences)清洗三次。使用各种细胞因子特异性抗体的混合物以染色作为刺激的结果在细胞内捕获的细胞因子。所使用的抗体是PE-Cy7缀合的抗IFN-γ(克隆B27，BD Biosciences)，太平洋蓝缀合的抗IL17A(克隆BL168，Biolegend)，Alexa fluor 700 抗IL-2(克隆MQ1-17H12，Biolegend)，PE缀合的抗IL-4(克隆8D4-8，BD Biosciences)，AF488缀合的TNF-α，抗CD3 Qdot 605(克隆UCHT1，Invitrogen)，和PE-Cy5 抗CD69(克隆FN50，BD biosciences)。细胞内染色后，细胞进一步用1x透化缓冲液清洗3次，最后一次清洗用FACS缓冲液，然后将它们悬浮到FACS管中。使用配备用于检测12个荧光参数的定制的BD LSR II流式细胞仪对每个样品收集2-5×10⁵事件，并使用FLOW JO(Tree Star)软件分析数据。为了排除细胞碎片和团块，细胞首先基于它们的正向和侧向散射特性进行门控，然后对CD4 + T细胞，随后是CD45RALow，并且然后对CD69+细胞因子阳性细胞进行顺序门控。可替代地，细胞还对TNF-α相比于其它细胞因子进行门控用于确认。低频的应答细胞通过额外的回门控进行确认。如先前报道，为帮助检测抗原特异性细胞，抗CD28/CD49d抗体结合多参数染色用于帮助避免不相干的背景(37)。整个测定进行标准化并与多重珠阵列(CBA BD Biosciences)比较以检测细胞因子概况。

体液应答

为了测量样品中的IgG抗体水平，如前面所述进行ELISA(26，38)。简而言之，96孔板(Nunc-Immulon)用在包被缓冲液(碳酸氢盐(pH9.4)中的0.25μg/ml的个别抗原(100μl/孔)包被，并在4℃孵育过夜。清洗后，将板在37℃用3％的脱脂乳封闭1小时(每孔200μl)。清洗5次后，以1:100的起始稀释度(含3％脱脂乳的PBS中)向孔中加入100μl血清，并2倍系列稀释。将混合物在室温下孵育1小时，然后加入缀合到辣根过氧化物酶的亲和纯化的山羊抗人IgG抗体(Bethyl Laboratories, Inc, Montgomery, TX)作为二抗。反应产物用TMB微孔过氧化物酶底物系统(KPL, Gaithersburg, MD)显色，通过加入1.0摩尔的磷酸停止并由自动ELISA读数器使用450nm滤光片读取。为了提供抗体浓度的定量结果，通过与内部参考血清(具有高抗原特异性抗体水平的人血清合并物)进行比较确定未知样品中存在的特异性抗体的水平。参考血清中的IgG水平使用人IgG ELISA定量试剂盒(BETHYL Laboratories)进行定量测量。四参数逻辑对数函数用于形成参考和样品曲线。此ELISA根据ICH指导原则充分验证。

所有数据使用Graph Pad Prism软件进行统计学分析。数据的双尾P值使用Mann Whitney检验进行计算。

结果：

易患耳炎组中的儿童与不易患耳炎的儿童年龄类似。两研究组中性别分布、日托护理情况、家庭中被动香烟烟雾暴露、8岁以下兄弟姐妹的人数和母乳喂养是相似的。

在不易患耳炎和易患耳炎的儿童间通过用特异性抗原刺激他们的PBMC，比较各种Spn抗原特异性记忆性Th细胞亚群的循环频率。对此，通过门控最近活化的CD69+ T细胞计算产生IFN-γ、IL-4、IL-2或IL-17的CD45RALow记忆性CD4+ T细胞的百分比。抗原特异性应答通过未刺激或用非特异性抗原(匙孔血蓝蛋白)刺激的对照PBMC进行均一化。

图1，其描述结果的总结，展示在不易患耳炎儿童(n=15)中AOM(n=6)或Spn在NP群集(n =9)后针对用于刺激的所有Spn抗原的各种CD45RALow记忆性CD4+ T细胞亚群可检测的频率。形成鲜明对比的是，易患耳炎儿童(n=13)在AOM(n =10)和NP群集(n=3)后，明显缺乏循环的Spn特异性的记忆性CD4+ T细胞。具体而言，针对LytB、PhtE和Ply的产生IFN-γ的记忆性CD4+ T细胞完全缺失，而对PhtD、PcpA和PspA应答产生的IFN-γ的水平显著更低(P<0.02)(图1a)。在易患耳炎儿童中观察到针对PhtD和LytB的产生IL-4的记忆性CD4+ T细胞的显著下降(P<0.02)(图1b)。在易患耳炎儿童中对PhtD(P<0.05)、PcpA(P<0.005)、PhtE(P<0.05)、Ply(P <0.005)和PspA(0.02)的IL-2应答显著更低(图1c)并且在易患耳炎儿童中发现对PhtD、PcpA和PhtE(P <0.05)应答的IL-17a产生细胞显著减少(图1d)。

由于缺失抗原特异性记忆性Th细胞可以导致受损的抗原特异性B细胞应答(9)，所以在不易患耳炎和易患耳炎儿童中对抗原特异性IgG滴度进行了评价。在各组中针对肺炎球菌抗原的血清IgG水平显示在图2中。如预期的，随记忆性T细胞频率增加，不易患耳炎组中相比易患耳炎组针对PhtD、LytB、PhtE、Ply的IgG滴度显著更高(分别为P<0.05；0.0005；0.0005；0.005)(图2)。针对PcpA抗原的IgG滴度也有增加，但差异不显著(图3)。

由于幼儿中的免疫系统在T-和B-细胞应答方面没有完全成熟(39，40)，所以测试了B细胞和T细胞介导的应答，以评价在易患耳炎儿童中受损的记忆性T细胞应答是否是由于内在T或B细胞缺陷。PBMC用SEB刺激，后者是不依赖APC参与而刺激T细胞应答的抗原(41)。图3显示产生IFN-γ、IL-4、IL-2或IL-17α的记忆性CD4+ T细胞百分比在易患耳炎和不易患耳炎的儿童中是相同的。鉴于所有儿童都已经接受DTaP疫苗，确定针对疫苗抗原白喉、破伤风和百日咳的IgG滴度，以评价是否易患耳炎的儿童具有普遍的免疫缺陷。针对白喉类毒素、破伤风类毒素、百日咳毒素、丝状血凝素或百日咳杆菌粘附素的IgG抗体浓度在组间没有发现显著性差异(数据未显示)。

总之，这些数据表明，Spn易患耳炎儿童相比非易患耳炎儿童具有肺炎球菌抗原特异性功能记忆性CD4+ T细胞缺乏或减少。这种效应与针对所研究抗原的IgG应答减少相关。如数据所示，易患耳炎儿童不能产生对Spn的抗原特异性CD45RALow功能性Th记忆应答并且引起针对Spn蛋白抗原的抗体应答减少。然而这些儿童在总功能性记忆性T细胞或引发针对接种的抗原的B细胞介导的抗体应答(例如，IgG)方面是没有缺陷的。

尽管事实是CD4+ Th细胞协助抵抗Spn和NTHi引起的感染，但是并无任何先前的报告证明在儿童中特异性CD4 + Th细胞与Spn或NTHi-介导的AOM相关的直接作用。显然，儿童中CD4+ T细胞产生的不足将导致随后B细胞介导的抗体应答减少。免疫记忆的缺少从而可以导致对复发的耳部感染的反复易感性。在此，我们首次证明，易患耳炎儿童具有在AOM和/或NP群集之后在血液循环的Th细胞中耳病原体(例如，肺炎链球菌)特异性记忆的缺乏/减少。相反，不易患耳炎的儿童在AOM和/或耳病原体在NP群集后产生记忆性抗原特异性CD4 + T细胞。

似乎易患耳炎的儿童的确发展了短时的B细胞应答，因为在这些儿童中AOM和/或肺炎链球菌在NP群集后一些抗体是可检测的。但是，在不存在T细胞记忆的情况下，抗体水平减弱后，儿童很快就变得对额外AOM感染易感。因此，在易患耳炎的儿童中重要的免疫缺陷似乎是在T细胞记忆的产生中。由于易患耳炎的儿童对不需要APC加工的抗原(SEB)类似地应答，并且对以DTaP疫苗形式抗原的肠胃外注射也类似地应答，所以其可以是易患耳炎的儿童中的问题，甚至免疫学更上游地在于鼻粘膜中存在的APC对Spn和NTHi抗原的实际加工和呈递中。

先前的工作已经证明Spn和NTHi抗原在儿童和成人中CD4+ T细胞增殖应答(5-7天)中的作用(42，43)。一项先前的研究评价了从易患耳炎儿童的腺样体和扁桃体收集的细胞的CD4+ T细胞增殖，并发现没有对NTHI蛋白P6应答的增殖(44)。此性质的研究评价抗原特异性T细胞增殖，但无法告知抗原特异性记忆性CD4+ T细胞的发生。

虽然CD4+Th-2细胞促进帮助从宿主消除细菌病原体的大部分的抗体应答，但是最近在小鼠模型中的研究已显示产生IL-17a的CD4+ T细胞(Th-17细胞)介导对Spn NP群集的抗体非依赖性的免疫(20)。在此，第一次在人类中，在不易患耳炎的儿童的循环中检测到了相比易患耳炎的儿童增加的产生Spn特异性IL-17a的记忆性Th细胞的频率。因此，产生Spn特异性IL-17a的记忆性Th细胞可以保护免于易患耳炎状况。

AOM(中耳粘膜，中耳液)期间，在感染部位的细胞表型分析表明存在丢失归巢受体L-选择素的CD45ROHigh/CD45RALow记忆性CD4+ T细胞的大迁移(45)。其它研究表明在AOM期间中耳液中主要是记忆性CD4+ T细胞的积累(45-47)。局部二级淋巴器官，例如腺样体是在上呼吸道感染如细菌群集期间T细胞致敏的主要部位。一旦负载抗原的APC迁移到局部淋巴样器官(腺样体)，则发生淋巴细胞(参照CD4+ T细胞)的分化。进入血液循环后CD4+ T细胞最终迁移到中耳粘膜(在AOM的情况下)和/或上呼吸道(NP群集期间)。

不被理论所束缚，延迟的免疫成熟可能是易患耳炎儿童中功能性T细胞缺乏的原因(48)。随着儿童年龄的增长，由于在咽鼓管中解剖学上的变化，他们变得不易患AOM，并且随着年龄增长，发生免疫系统成熟。强力的T细胞记忆应答典型地在3-5岁左右发展(40，48-51)，并且通常易患耳炎的儿童在此年龄时间框架期间“长大而丧失”他们的倾向。

在人中，记忆性CD4+ T细胞可以在抵抗AOM中发挥关键作用。因此，Spn特异性的CD4+ T细胞记忆，如果产生，将在复发的AOM发生率的预防中是有用的。

实施例 2

在本研究中，在三组6-36个月大的患AOM的儿童中比较针对PhtD、PhtE、LytB、PcpA和Ply的血清IgG抗体的发展：1)易患耳炎组，其包括在6个月内有3次或更多次AOM发作或12个月期间内4次或更多次发作的儿童；2)AOM治疗失败(AOMTF)组，其包括至少48小时的适当的抗生素治疗(70，71)后未能实现细菌根除和/或症状消除的儿童和完成抗生素疗程的14天之内AOM体征和症状回复的儿童；3)不易患耳炎组，其包括只有一次或两次AOM发作的儿童。

收集和分析的样品在实施例1中引用的前瞻性研究中获得。没有先前的AOM的健康儿童在6个月年龄时入组，并且前瞻性的随访直至30个月年龄。在研究期间在年龄6、9、12、15、18、24和30个月时获得7次血清、NP和口咽(OP)培养物。但是，从分析中排除30个月时间点的样品，因为达到30个月随访的受试者太少。在研究期间，每当儿童经历AOM，获得血清、NP和OP培养物以及通过鼓膜穿刺的中耳液(MEF)。恢复期样品在三周后采集。这些儿童的大部分没有发展AOM(约70%)并且包括在组3中(不易患耳炎儿童)。一些儿童继续符合易患耳炎的定义(约5%)并且包括在组1中，或者具有AOMTF(约5%)并且包括在组2中用于分析。为了增加易患耳炎和AOMTF同龄组的容量，每当额外的儿童符合6到36个月大的年龄时间跨度内的那些定义，将他们入组。在AOM事件的时间，急性地收集血清、NP、OP和MEF样品；并且在三周后收集恢复期样品。

为了保证AOM的诊断，儿童由验证的耳镜检查儿科医生使用美国儿科科学院AOM诊断指南进行检查。进行鼓膜穿刺以确认MEF中耳病原体的存在。MEF、NP和OP样品接种到胰胨豆胨培养液，含5％绵羊血液的胰胨豆胨琼脂平板，和巧克力琼脂平板上。根据CLSI标准培养程序分离细菌。

ELISA测定：此研究中也使用了实施例1中使用的肺炎链球菌蛋白PhtD、LytB、PcpA、PhtE和PlyD1。通过ELISA使用纯化的重组蛋白确定蛋白特异性抗体滴度。96孔 Nunc-Immulon 4板用在碳酸氢盐包被缓冲液(pH9.4)中的0.5μg/ml的个别蛋白(100μl/孔)包被，并在4℃孵育过夜。清洗后，将板在37℃用3％的脱脂乳封闭1小时(每孔200μl)。清洗5次后，以1:100的起始稀释度(含3％脱脂乳的PBS中)向孔中加入100μl血清，并2倍系列稀释。将混合物在室温下孵育1小时，然后加入缀合到辣根过氧化物酶的亲和纯化的山羊抗人IgG抗体(Bethyl Laboratories, Inc, Montgomery, TX)作为二抗。反应产物用TMB微孔过氧化物酶底物系统(KPL, Gaithersburg, MD)显色，通过加入1.0摩尔的磷酸停止并且板在450nm用Spectra max酶标仪(Molecular Devices, Sunnyvale, Calif.)使用Softmax终点稀释方案进行分析。

在GraphPad Prism 5上进行统计学分析。使用非配对t检验比较三组间的差异用于进行IgG抗体分析。应用配对t检验比较急性期相比于恢复期血清样品。使用单因素方差分析(ANOVA)评价随时间推移的抗体升高。P值< 0.05被认为有显著性。

在 AOM 时三组儿童中针对 PhtD 、 LytB 、 PcpA 、 PhtE 和 Ply 的特异性 IgG 抗体滴度

在急性AOM时在35个易患耳炎儿童、25个具有AOMTF的儿童和34个具有他们第一次或第二次AOM的作为不易患耳炎组的儿童中测量针对Spn的PhtD、LytB、PcpA、PhtE和Ply蛋白的IgG抗体滴度(图4)。

在易患耳炎儿童中针对PhtD蛋白的IgG滴度相比不易患耳炎儿童显著更低(P <0.05)。在AOMTF儿童中针对PhtD的IgG抗体水平相比不易患耳炎儿童也更低，但差异没有达到显著性。在易患耳炎儿童和AOMTF儿童中针对LytB的IgG滴度相比不易患耳炎儿童显著更低(对于两个比较P <0.001)。在易患耳炎儿童和AOMTF儿童中针对PcpA蛋白的IgG的GMT相比不易患耳炎儿童几乎低3倍，但是在3组儿童间由于抗体水平的大范围变化，差异不是统计学显著的。在易患耳炎儿童和AOMTF儿童中针对PhtE蛋白的IgG滴度相比不易患耳炎儿童显著更低(P <0.001)。在易患耳炎儿童(p=0.006)和AOMTF儿童(p=0.02)中针对PlyD1蛋白的IgG滴度相比不易患耳炎儿童显著更低。

三组儿童中针对肺炎链球菌 PhtD 、 LytB 、 PcpA 、 PhtE 和 Ply 的急性和恢复期的 AOM 抗体水平

22个易患耳炎儿童、13个AOMTF儿童和20个不易患耳炎儿童具有在他们的急性期(AOM时)和恢复期(3周后)获得的配对血清样品。在所有三组儿童中，急性期相比于恢复期中针对5种蛋白中的4种的IgG抗体水平显示没有显著的抗体升高(例外是在AOMTF儿童中的PhtE蛋白，其中发现了显著性差异，P=0.04)(表1)。但是急性期和恢复期血清中的抗体水平的大范围个体变化是显著的，所有3组中一些儿童显示对一种或多种抗原的抗体的两倍升高(表2)。

不易患耳炎儿童和易患耳炎儿童随年龄的抗体水平

图5显示在年龄6-24个月的前瞻性随访的不易患耳炎儿童和易患耳炎儿童中常规的非AOM随访时针对PhtD、LytB、PcpA、PhtE和Ply的IgG抗体水平。显示的数据是来自150个不易患耳炎儿童和10个易患耳炎儿童。在不易患耳炎儿童中，对于除LytB(P= 0.075)的所有蛋白，IgG抗体水平随时间显著上升(P <0.001)。相比之下，易患耳炎儿童对于任何5种蛋白IgG抗体水平随时间均未达到显著性变化(对于PhtD蛋白，P= 0.40；对于LytB，P= 0.39；对于PcpA，P=0.11；对于PhtE，p=0.09；对于Ply，P=0.42)。

这些数据显示，易患耳炎儿童和具有AOMTF的儿童与不易患耳炎儿童相比，在AOM发作时具有显著更低的针对Spn蛋白的抗体水平，表明先前暴露于Spn没有引起适应性免疫应答或引起不那么强力的适应性免疫应答，如在血清抗体水平中反映的。该发现表明，免疫学上，易患耳炎儿童和AOMTF儿童是类似的，但他们相比不易患耳炎儿童的应答是不同的。此外，针对所研究的5种Spn抗原的血清抗体的量的增加在易患耳炎儿童中比不易患耳炎儿童中显著更慢。在易患耳炎儿童中被NP群集自然暴露后更慢的抗体获得与在易患耳炎儿童中耳病原体暴露后受损的免疫应答的观察是一致的。这些数据还显示易患耳炎儿童和具有AOMTF的儿童在他们对AOM的血清抗体应答方面与不易患耳炎儿童没有不同。似乎在任何三组中对于大部分儿童，AOM不是免疫事件，至少在至多达3岁大的年龄范围内(如此处所研究的)。

所观察的针对Spn的抗原特异性免疫应答确认并延伸了对于易患耳炎儿童的其它的观察，与一些更早的报告矛盾并提供很多新的数据。Freijd等(72)描述了在年龄30个月的15个易患耳炎儿童中相比年龄匹配的对照儿童和成人针对血清型3、6A和23的血清抗Spn多糖抗体。他们发现在易患耳炎的儿童中针对血清型6A和23的抗体显著更低。Prellner等(73)测量了15个易患耳炎儿童中针对血清型6A、19和23的血清抗Spn多糖抗体并发现60%的儿童无可检测的抗体。即使在年龄6岁，针对6A多糖的抗体水平在易患耳炎儿童中也低于不易患耳炎儿童。Hotomi等(74)评价了36个易患耳炎儿童(平均年龄18个月大)和20个不易患耳炎儿童对NTHi OMP P6和Spn多糖(使用23价Spn疫苗作为抗原)的血清抗体应答。55%的易患耳炎儿童具有更低的针对P6的抗体应答，并且48%具有更低的针对Spn多糖的应答。Yamanaka和Faden在他们1993年的研究中(75，76)和Bernstein等(77)发现在易患耳炎儿童中对另一种耳病原体NTHi的减少的血清和/或粘膜抗体水平。据我们所知，这是在易患耳炎儿童和AOMTF儿童中针对Spn蛋白的血清抗体应答的首次报告。

关于与AOM相关的在易患耳炎儿童中抗PhtD、LytB、PcpA、PhtE和Ply抗体应答的这些观察支持对易患耳炎状态的一般持有的解释：当经由自然NP途径发生暴露时，这些儿童在针对Spn和其它耳病原体的抗体应答方面具有特定的免疫学缺陷。

如实施例1中所提到的，易患耳炎儿童在针对Spn和NTHi抗原应答的功能性T辅助细胞和T记忆性细胞中具有缺陷(未发表的结果)(82)。这些儿童中对肠胃外接种白喉、破伤风和百日咳的抗体应答没有减少，并且这些发现与Prellner等(83)和Wiertsma等(84)的观察是一致的，其还发现易患耳炎儿童对麻疹及其它儿科疫苗接种达到正常的血清抗体应答。因此，自然暴露于耳病原体时而不是肠胃外接种时在易患耳炎儿童中发生免疫功能异常。观察到在易患耳炎儿童中发生的针对Spn缀合物疫苗的足够的免疫应答支持此结论(85，86)。

比较针对所研究的Spn蛋白的急性和恢复期的抗体水平，在易患耳炎、AOMTF或不易患耳炎儿童中总体GMT没有显示显著上升。这主要由于在个体儿童免疫应答中的巨大变化。的确，一些儿童确实显示更高的恢复期滴度，而另一些显示更低的滴度并且一些保持相同。最可能这些结果是由于在AOM感染继发前Spn的NP运输的长度的差异。具有更长运输的那些可以在AOM发作前实现抗体应答的高峰，并且他们可以在急性到恢复期血清中显示稳定或渐降的抗体水平。其它儿童可以在AOM发作之前具有短暂时间的NP运输，并且他们显示逐渐上升的急性到恢复期抗体水平。这些结果表明，当蛋白通过无症状的群集或AOM感染以自然的方式呈递给儿童宿主时，不同的抗原引起不同的抗体应答概况，可能反映了它们在幼儿中不同的抗原性。当评价针对NTHi蛋白的抗体应答时做出了类似的观察，并且其它组也已观察到在AOM事件周围这种急性到恢复期抗体水平的变化(87-89)。Soininen等在329个在他们生命的前2年期间随访的儿童的同龄组中研究了NP群集和AOM相关的针对Spn多糖类型1、6B、11A、14、19F和23F的抗体的自然发展(90)。抗体温和上升，但随时间是显著的；血清型11A和14在更年轻的年龄是更有免疫原性的。他们发现NP群集或AOM后抗体水平是相等的。但是在涉及同样儿童的后来的研究中，Soininen等描述了发现，表明在AOM后抗体升高>2倍相对少见，变化是由于儿童的年龄和Spn的血清型导致的(89)。

在相应的研究中提到了，在健康儿童中针对此处研究的同样的5种Spn蛋白和针对三种NTHi蛋白(蛋白D、P6和OMP26)的抗体随时间的逐渐获得(69,87)。在此研究中，易患耳炎儿童不能展示针对所有5种Spn蛋白的抗体的上升或具有显著更慢的年龄相关的针对所有5种Spn蛋白的抗体的上升。

总之，这些结果提供了进一步的关于易患耳炎儿童的免疫应答的信息。在易患耳炎儿童中观察到了针对Spn抗原的免疫低反应性。具有AOMTF的儿童也显示与易患耳炎儿童类似的免疫学行为。通过肠胃外途径施用包含至少一种或多种PhtD、PhtE、PcpA、LytB和去毒的肺炎球菌溶血素(例如，PlyD1)的疫苗组合物(任选地具有佐剂)，可用于减轻自然暴露于肺炎链球菌后注意到的免疫低应答性。

实施例 3

评价和比较了获自实施例1中引用的研究的一些易患耳炎儿童和不易患耳炎儿童的血清样品中Spn抗原特异性记忆性B细胞的循环频率。从约387个儿童的总研究人群中，此处研究了22个儿童：10个易患耳炎儿童鉴定用于本研究(基于足够的PBMC样品的可获得性)；并且随机选择具有1或2次AOM和与易患耳炎儿童年龄类似的12个不易患耳炎儿童作为对照。儿童的临床特征在表3中描述。

抗原特异性(PhtD、PhtE、LytB、PcpA、Ply)和总IgG分泌细胞通过(内部标准化的)ELISPOT测定进行定量，其中记忆性B细胞在体外进行刺激以分化成抗体分泌细胞(ASC)。简而言之，一百万融化的PBMC置于24孔板的每孔中，孔中含有1ml单独的完全培养基或含有1μg/ml美洲商陆有丝分裂原的完全培养基。细胞在37℃保持3天用于分化，用完全培养基清洗，计数并分布到抗原包被(10μg/ml)过夜的96孔ELISPOT板(Millipore)。在分化细胞的流式细胞术评价的帮助下对血浆细胞分化进行优化(数据未显示)。对于总IgG分泌细胞的检测，孔用在PBS中的10μg/ml的单克隆抗人IgG(MT91/145; Mabtech)预包被。作为阴性对照的孔不进行处理或用同样量的牛血清白蛋白(BSA)包被。板用RPMI1640中的10%FBS在37℃封闭30分钟。刺激的PBMC进行计数，并且5x10⁵个细胞悬浮在200μl新鲜完全RPMI培养基中，然后将它们分布到对照和抗原包被的孔。板然后在5%CO₂培养箱中在37℃孵育过夜并然后用PBS清洗至少5次。然后100 μl的1μg/ml的生物素化的抗人IgG抗体(MT78/145; Mabtech)加入孔中并孵育1小时。清洗后，链霉抗生物素蛋白-碱性磷酸酶缀合物(1：1000)加入孔中并在37℃孵育1小时。板然后用PBS清洗5次，然后用底物(BCIP/NBT; Mabtech)使其显色。因为抗原特异性ASC的低频率，显色的斑点在解剖显微镜的帮助下人工计数。抗原特异性数据表示为抗原特异性记忆性B细胞的百分比，并如下按每一百万PBMC计算：%Ag-特异性MBC=(抗原特异性斑点数目/总Ig斑点数目)x100。

在这两组儿童的血清中的抗原特异性IgG滴度通过ELISA测量，所述ELISA与实施例1中描述的基本上相似进行，尽管板用0.5μg/ml的抗原包被，并且缀合辣根过氧化物酶的亲和纯化的山羊抗人IgG、IgM或IgA抗体(Bethyl Laboratories, Inc., Montgomery, TX)作为二抗。

所有数据使用Graph Pad Prism软件进行统计学分析。数据的双尾P值使用Mann Whitney检验计算。

结果的总结在图6(A、B、C)中描述。来自易患耳炎儿童和不易患耳炎儿童的样品中存在的针对5种Spn抗原(PhtD、PhtE、LytB、PcpA、Ply)特异性的记忆性B细胞的百分比显示在图6A中。与不易患耳炎组截然相反的是，易患耳炎儿童在AOM或NP群集后循环的Spn特异性记忆性B细胞显著减少(图6A)。具体而言，观察到针对抗原PhtD、PhtE和PlyD1的产生抗原特异性IgG的记忆性B细胞的显著更低的百分比(P<0.02)。易患耳炎儿童也显示总体更低的特异性针对LytB的记忆性B细胞的百分比，尽管差异不是统计学显著的(p=0.1)。在来自易患耳炎组和不易患耳炎组的样品中PcpA特异性记忆性B细胞的百分比没有发现统计学显著的差异(图6A)。类似地，两组中存在的IgG分泌细胞的总数没有不同(数据没有显示)。

在各组中针对Spn抗原的血清IgG水平显示在图6B中。如与来自易患耳炎组中儿童的血清所比较的，针对PhtD、PcpA和PhtE的IgG滴度在来自非耳炎组儿童的血清中显著更高(P< 0.05)。Ply水平更低并且在组间没有统计学显著方式的不同(图6B)。在两个同龄组中测试的所有抗原中LytB抗体滴度最低(图6B)。

在此研究中，注意到在AOM和/或NP群集后易患耳炎儿童的血液中循环的记忆性B细胞的减少的百分比(图6A)。抗原与幼稚B细胞相遇后，抗原特异性记忆性B细胞和抗体分泌细胞在二级淋巴样结构中产生，所述二级淋巴样结构通过血液运送到骨髓、脾、或靶组织，例如呼吸道(16)。由于血清抗体水平由记忆性B细胞保持(31)，通过分析产生的抗原特异性记忆性B细胞的百分比，为在易患耳炎儿童中更低的抗体水平提供了更明确的免疫学解释。为确认记忆性B细胞的更低频率与血清抗体水平的相关性，测量了Spn特异性抗体滴度，并发现在易患耳炎儿童中显著更低(图6B)，这与实施例1中描述的使用来自AOM或NP群集后不易患耳炎儿童(n =15)和易患耳炎儿童(n=13)的不同同龄组的血清样品的研究中获得的结果类似。总体而言，此处注意到的在不易患耳炎儿童中更高的Spn抗原特异性滴度结果的趋势与实施例1中评价的同龄组中所看到的一致，尽管组间对于抗原特异性应答的统计学显著性差异的确切结果在一些情况下是不同的。例如，此处评价的一小组儿童在Ply特异性抗体滴度上没有显示任何差异。虽然细菌群集和/或AOM后针对具体蛋白抗原的抗体应答和B细胞产生在个体儿童中可以有所不同，但是预期接种的变化程度更小。

如实施例1所示，易患耳炎儿童具有次优的肺炎球菌抗原特异性记忆性CD4+ T细胞应答(96)。来自此研究的发现确认了那些来自前面实施例的发现(即，易患耳炎儿童可以发展一些抗体应答)，因为在AOM和耳病原体NP群集后，这些儿童中抗体和记忆性B细胞是可检测的(图6A-B)。然而，在不存在抗原特异性记忆性B细胞产生和/或记忆性CD4+ T细胞产生的情况下，抗体水平下降并且易患耳炎儿童不能保持足够的血清抗体水平并变得易受重复AOM感染。

肺炎球菌多糖缀合物接种在增强保护性的抗多糖抗体水平中是有帮助的(86)；然而血清型变化限制了菌株特异性抗多糖抗体的保护性效力(95)。并且，尽管事实是易患耳炎儿童可以诱导针对缀合物疫苗的血清型特异性抗体，但是重复感染在这些脆弱组中是普遍的(86)，表明血清型中和免疫是短暂和不完全的。

有趣的是，循环的PhtD特异性记忆性B细胞的百分比与血清PhtD水平相关(图6C)。观察到针对PcpA和PlyD1的抗原特异性B细胞百分比和血清抗体水平的差异(图6A-B)。

总之，关于此处评价的抗原，易患耳炎儿童具有显著更低的记忆性B细胞产生，其可以分化成抗体分泌细胞。该发现的临床相关性是清楚的。抗原特异性记忆性B细胞作为用于保持血清抗体的储存器发挥作用，其在再次相遇抗原后可以增殖成ASC，导致血清抗体水平的增加。我们发现易患耳炎儿童不缺乏总IgG分泌细胞。并且，我们的流式细胞术结果显示，对多克隆刺激应答，易患耳炎儿童在记忆性B细胞(CD19+ IgD-)到抗体分泌浆细胞(CD27+CD38+CD138+)的转化中不具有机制功能异常(数据未显示)。

这些数据显示AOM或NP群集后在不易患耳炎儿童和易患耳炎儿童中均看到Spn抗原特异性应答。虽然在易患耳炎儿童中看到减少的应答，但是在这些儿童中自然感染或群集后看到了应答，这支持包含如早先所述(例如，实施例2)的PhtD、PhtE、PcpA、LytB和去毒的肺炎球菌溶血素(例如，PlyD1)中至少一种或多种的疫苗组合物的施用，以减轻自然暴露于肺炎链球菌后注意到的免疫低应答性。

虽然已描述了实例方法、蛋白、组合物和其它特征，申请人的意图不在于限制或以任何形式限制本发明、公开或申请的范围。修饰、替换和变化将对本领域技术人员是显而易见的。因此，本公开不限于本文所述和显示的具体细节、代表性装置和实例。与本文一同提交了序列表，并且考虑作为本公开的一部分。

所有上文引用的参考文献的内容通过引用并入本文。本文中的单数形式，如“一个(种)”和“该”的使用，不排除相应复数形式的指示，除非上下文有相反的指示。因此，例如，如果权利要求指示使用“一个(种)”X或Y，其还可以解释为覆盖使用超过一个(种)X或Y，除非另有说明。对于说明书或权利要求中使用的术语(或)的程度(例如，A或B)，其意指“A或B或两者”。在本发明指示“仅A或B但不是两者”的情况下，则将采用术语“仅A或B但不是两者”。因此，术语“或”在本文中的使用是包容性的，而不是排除性的。

其它实施方案在下文权利要求内。

表 2^*

*22个易患耳炎儿童、13个AOMTF儿童和20个不易患耳炎儿童在他们的急性期相比于恢复期的血清样品中IgG抗体的几何平均滴度的比较。发现显著性差异(p值<0.05)：a：易患耳炎相比于不易患耳炎；b：AOMTF相比于不易患耳炎；c：急性期血清相对恢复期血清。

表 3

研究受试者的特征

序列表

<110> Sanofi Pasteur Limited

<120> 用于针对肺炎链球菌免疫的组合物

<130> APL-10-14-PR

<150>

<151> 2010-12-05

<160> 13

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 641

<212> PRT

<213> 肺炎链球菌

<400> 1

Met Lys Lys Thr Thr Ile Leu Ser Leu Thr Thr Ala Ala Val Ile Leu

1 5 10 15

Ala Ala Tyr Val Pro Asn Glu Pro Ile Leu Ala Asp Thr Pro Ser Ser

20 25 30

Glu Val Ile Lys Glu Thr Lys Val Gly Ser Ile Ile Gln Gln Asn Asn

35 40 45

Ile Lys Tyr Lys Val Leu Thr Val Glu Gly Asn Ile Arg Thr Val Gln

50 55 60

Val Gly Asn Gly Val Thr Pro Val Glu Phe Glu Ala Gly Gln Asp Gly

65 70 75 80

Lys Pro Phe Thr Ile Pro Thr Lys Ile Thr Val Gly Asp Lys Val Phe

85 90 95

Thr Val Thr Glu Val Ala Ser Gln Ala Phe Ser Tyr Tyr Pro Asp Glu

100 105 110

Thr Gly Arg Ile Val Tyr Tyr Pro Ser Ser Ile Thr Ile Pro Ser Ser

115 120 125

Ile Lys Lys Ile Gln Lys Lys Gly Phe His Gly Ser Lys Ala Lys Thr

130 135 140

Ile Ile Phe Asp Lys Gly Ser Gln Leu Glu Lys Ile Glu Asp Arg Ala

145 150 155 160

Phe Asp Phe Ser Glu Leu Glu Glu Ile Glu Leu Pro Ala Ser Leu Glu

165 170 175

Tyr Ile Gly Thr Ser Ala Phe Ser Phe Ser Gln Lys Leu Lys Lys Leu

180 185 190

Thr Phe Ser Ser Ser Ser Lys Leu Glu Leu Ile Ser His Glu Ala Phe

195 200 205

Ala Asn Leu Ser Asn Leu Glu Lys Leu Thr Leu Pro Lys Ser Val Lys

210 215 220

Thr Leu Gly Ser Asn Leu Phe Arg Leu Thr Thr Ser Leu Lys His Val

225 230 235 240

Asp Val Glu Glu Gly Asn Glu Ser Phe Ala Ser Val Asp Gly Val Leu

245 250 255

Phe Ser Lys Asp Lys Thr Gln Leu Ile Tyr Tyr Pro Ser Gln Lys Asn

260 265 270

Asp Glu Ser Tyr Lys Thr Pro Lys Glu Thr Lys Glu Leu Ala Ser Tyr

275 280 285

Ser Phe Asn Lys Asn Ser Tyr Leu Lys Lys Leu Glu Leu Asn Glu Gly

290 295 300

Leu Glu Lys Ile Gly Thr Phe Ala Phe Ala Asp Ala Ile Lys Leu Glu

305 310 315 320

Glu Ile Ser Leu Pro Asn Ser Leu Glu Thr Ile Glu Arg Leu Ala Phe

325 330 335

Tyr Gly Asn Leu Glu Leu Lys Glu Leu Ile Leu Pro Asp Asn Val Lys

340 345 350

Asn Phe Gly Lys His Val Met Asn Gly Leu Pro Lys Leu Lys Ser Leu

355 360 365

Thr Ile Gly Asn Asn Ile Asn Ser Leu Pro Ser Phe Phe Leu Ser Gly

370 375 380

Val Leu Asp Ser Leu Lys Glu Ile His Ile Lys Asn Lys Ser Thr Glu

385 390 395 400

Phe Ser Val Lys Lys Asp Thr Phe Ala Ile Pro Glu Thr Val Lys Phe

405 410 415

Tyr Val Thr Ser Glu His Ile Lys Asp Val Leu Lys Ser Asn Leu Ser

420 425 430

Thr Ser Asn Asp Ile Ile Val Glu Lys Val Asp Asn Ile Lys Gln Glu

435 440 445

Thr Asp Val Ala Lys Pro Lys Lys Asn Ser Asn Gln Gly Val Val Gly

450 455 460

Trp Val Lys Asp Lys Gly Leu Trp Tyr Tyr Leu Asn Glu Ser Gly Ser

465 470 475 480

Met Ala Thr Gly Trp Val Lys Asp Lys Gly Leu Trp Tyr Tyr Leu Asn

485 490 495

Glu Ser Gly Ser Met Ala Thr Gly Trp Val Lys Asp Lys Gly Leu Trp

500 505 510

Tyr Tyr Leu Asn Glu Ser Gly Ser Met Ala Thr Gly Trp Val Lys Asp

515 520 525

Lys Gly Leu Trp Tyr Tyr Leu Asn Glu Ser Gly Ser Met Ala Thr Gly

530 535 540

Trp Val Lys Asp Lys Gly Leu Trp Tyr Tyr Leu Asn Glu Ser Gly Ser

545 550 555 560

Met Ala Thr Gly Trp Val Lys Asp Lys Gly Leu Trp Tyr Tyr Leu Asn

565 570 575

Glu Ser Gly Ser Met Ala Thr Gly Trp Val Lys Asp Lys Gly Leu Trp

580 585 590

Tyr Tyr Leu Asn Glu Ser Gly Ser Met Ala Thr Gly Trp Phe Thr Val

595 600 605

Ser Gly Lys Trp Tyr Tyr Thr Tyr Asn Ser Gly Asp Leu Leu Val Asn

610 615 620

Thr Thr Thr Pro Asp Gly Tyr Arg Val Asn Ala Asn Gly Glu Trp Val

625 630 635 640

Gly

<210> 2

<211> 708

<212> PRT

<213> 肺炎链球菌

<400> 2

Met Lys Lys Thr Thr Ile Leu Ser Leu Thr Thr Ala Ala Val Ile Leu

1 5 10 15

Ala Ala Tyr Val Pro Asn Glu Pro Ile Leu Ala Ala Tyr Val Pro Asn

20 25 30

Glu Pro Ile Leu Ala Asp Thr Pro Ser Ser Glu Val Ile Lys Glu Thr

35 40 45

Lys Val Gly Ser Ile Ile Gln Gln Asn Asn Ile Lys Tyr Lys Val Leu

50 55 60

Thr Val Glu Gly Asn Ile Gly Thr Val Gln Val Gly Asn Gly Val Thr

65 70 75 80

Pro Val Glu Phe Glu Ala Gly Gln Asp Gly Lys Pro Phe Thr Ile Pro

85 90 95

Thr Lys Ile Thr Val Gly Asp Lys Val Phe Thr Val Thr Glu Val Ala

100 105 110

Ser Gln Ala Phe Ser Tyr Tyr Pro Asp Glu Thr Gly Arg Ile Val Tyr

115 120 125

Tyr Pro Ser Ser Ile Thr Ile Pro Ser Ser Ile Lys Lys Ile Gln Lys

130 135 140

Lys Gly Phe His Gly Ser Lys Ala Lys Thr Ile Ile Phe Asp Lys Gly

145 150 155 160

Ser Gln Leu Glu Lys Ile Glu Asp Arg Ala Phe Asp Phe Ser Glu Leu

165 170 175

Glu Glu Ile Glu Leu Pro Ala Ser Leu Glu Tyr Ile Gly Thr Ser Ala

180 185 190

Phe Ser Phe Ser Gln Lys Leu Lys Lys Leu Thr Phe Ser Ser Ser Ser

195 200 205

Lys Leu Glu Leu Ile Ser His Glu Ala Phe Ala Asn Leu Ser Asn Leu

210 215 220

Glu Lys Leu Thr Leu Pro Lys Ser Val Lys Thr Leu Gly Ser Asn Leu

225 230 235 240

Phe Arg Leu Thr Thr Ser Leu Asn Met Leu Met Leu Arg Gly Met Ile

245 250 255

Val Ala Ser Val Asp Gly Val Ser Phe Gln Ser Lys Thr Gln Leu Ile

260 265 270

Tyr Tyr Pro Ser Gln Lys Asn Asp Glu Ser Tyr Lys Thr Pro Lys Glu

275 280 285

Thr Lys Glu Leu Ala Ser Tyr Ser Phe Asn Lys Asn Ser Tyr Leu Lys

290 295 300

Lys Leu Glu Leu Asn Glu Gly Leu Gln Lys Ile Gly Thr Phe Ala Phe

305 310 315 320

Ala Asp Ala Thr Lys Leu Glu Glu Ile Ser Leu Pro Asn Ser Leu Glu

325 330 335

Thr Ile Glu Arg Leu Ala Phe Tyr Gly Asn Leu Glu Leu Lys Glu Leu

340 345 350

Ile Leu Pro Asp Asn Val Lys Asn Phe Gly Lys His Val Met Asn Gly

355 360 365

Leu Pro Lys Phe Leu Thr Leu Ser Gly Asn Asn Ile Asn Ser Leu Pro

370 375 380

Ser Phe Phe Leu Ser Gly Val Leu Asp Ser Leu Lys Glu Ile His Ile

385 390 395 400

Lys Asn Lys Ser Thr Glu Phe Ser Val Lys Lys Asp Thr Phe Ala Ile

405 410 415

Pro Glu Thr Val Lys Phe Tyr Val Thr Ser Glu His Ile Lys Asp Val

420 425 430

Leu Lys Ser Asn Leu Ser Thr Ser Asn Asp Ile Ile Val Glu Lys Val

435 440 445

Asp Asn Ile Lys Gln Glu Thr Asp Val Ala Lys Pro Lys Lys Asn Ser

450 455 460

Asn Gln Gly Val Val Gly Trp Val Lys Asp Lys Gly Leu Trp Tyr Tyr

465 470 475 480

Leu Asn Glu Ser Gly Ser Met Ala Thr Gly Trp Val Lys Asp Lys Gly

485 490 495

Leu Trp Tyr Tyr Leu Asn Glu Ser Gly Ser Met Ala Thr Gly Trp Val

500 505 510

Lys Asp Lys Gly Leu Trp Tyr Tyr Leu Asn Glu Ser Gly Ser Met Ala

515 520 525

Thr Gly Trp Val Lys Asp Lys Gly Leu Trp Tyr Tyr Leu Asn Glu Ser

530 535 540

Gly Ser Met Ala Thr Gly Trp Val Lys Asp Lys Gly Leu Trp Tyr Tyr

545 550 555 560

Leu Asn Glu Ser Gly Ser Met Ala Thr Gly Trp Val Lys Asp Lys Gly

565 570 575

Leu Trp Tyr Tyr Leu Asn Glu Ser Gly Ser Met Ala Thr Gly Trp Val

580 585 590

Lys Asp Lys Gly Leu Trp Tyr Tyr Leu Asn Glu Ser Gly Ser Met Ala

595 600 605

Thr Gly Trp Val Lys Asp Lys Gly Leu Trp Tyr Tyr Leu Asn Glu Ser

610 615 620

Gly Ser Met Ala Thr Gly Trp Val Lys Asp Lys Gly Leu Trp Tyr Tyr

625 630 635 640

Leu Asn Glu Ser Gly Ser Met Ala Thr Gly Trp Val Lys Asp Lys Gly

645 650 655

Leu Trp Tyr Tyr Leu Asn Glu Ser Gly Ser Met Ala Thr Gly Trp Val

660 665 670

Lys Asp Lys Gly Leu Trp Tyr Tyr Leu Asn Glu Ser Gly Ser Met Ala

675 680 685

Thr Gly Trp Phe Lys Val Ser Gly Lys Trp Tyr Tyr Thr Tyr Asn Ser

690 695 700

Gly Asp Phe Ile

705

<210> 3

<211> 445

<212> PRT

<213> 肺炎链球菌

<400> 3

Met Ala Asp Thr Pro Ser Ser Glu Val Ile Lys Glu Thr Lys Val Gly

1 5 10 15

Ser Ile Ile Gln Gln Asn Asn Ile Lys Tyr Lys Val Leu Thr Val Glu

20 25 30

Gly Asn Ile Gly Thr Val Gln Val Gly Asn Gly Val Thr Pro Val Glu

35 40 45

Phe Glu Ala Gly Gln Asp Gly Lys Pro Phe Thr Ile Pro Thr Lys Ile

50 55 60

Thr Val Gly Asp Lys Val Phe Thr Val Thr Glu Val Ala Ser Gln Ala

65 70 75 80

Phe Ser Tyr Tyr Pro Asp Glu Thr Gly Arg Ile Val Tyr Tyr Pro Ser

85 90 95

Ser Ile Thr Ile Pro Ser Ser Ile Lys Lys Ile Gln Lys Lys Gly Phe

100 105 110

His Gly Ser Lys Ala Lys Thr Ile Ile Phe Asp Lys Gly Ser Gln Leu

115 120 125

Glu Lys Ile Glu Asp Arg Ala Phe Asp Phe Ser Glu Leu Glu Glu Ile

130 135 140

Glu Leu Pro Ala Ser Leu Glu Tyr Ile Gly Thr Ser Ala Phe Ser Phe

145 150 155 160

Ser Gln Lys Leu Lys Lys Leu Thr Phe Ser Ser Ser Ser Lys Leu Glu

165 170 175

Leu Ile Ser His Glu Ala Phe Ala Asn Leu Ser Asn Leu Glu Lys Leu

180 185 190

Thr Leu Pro Lys Ser Val Lys Thr Leu Gly Ser Asn Leu Phe Arg Leu

195 200 205

Thr Thr Ser Leu Lys His Val Asp Val Glu Glu Gly Asn Glu Ser Phe

210 215 220

Ala Ser Val Asp Gly Val Leu Phe Ser Lys Asp Lys Thr Gln Leu Ile

225 230 235 240

Tyr Tyr Pro Ser Gln Lys Asn Asp Glu Ser Tyr Lys Thr Pro Lys Glu

245 250 255

Thr Lys Glu Leu Ala Ser Tyr Ser Phe Asn Lys Asn Ser Tyr Leu Lys

260 265 270

Lys Leu Glu Leu Asn Glu Gly Leu Glu Lys Ile Gly Thr Phe Ala Phe

275 280 285

Ala Asp Ala Ile Lys Leu Glu Glu Ile Ser Leu Pro Asn Ser Leu Glu

290 295 300

Thr Ile Glu Arg Leu Ala Phe Tyr Gly Asn Leu Glu Leu Lys Glu Leu

305 310 315 320

Ile Leu Pro Asp Asn Val Lys Asn Phe Gly Lys His Val Met Asn Gly

325 330 335

Leu Pro Lys Leu Lys Ser Leu Thr Ile Gly Asn Asn Ile Asn Ser Leu

340 345 350

Pro Ser Phe Phe Leu Ser Gly Val Leu Asp Ser Leu Lys Glu Ile His

355 360 365

Ile Lys Asn Lys Ser Thr Glu Phe Ser Val Lys Lys Asp Thr Phe Ala

370 375 380

Ile Pro Glu Thr Val Lys Phe Tyr Val Thr Ser Glu His Ile Lys Asp

385 390 395 400

Val Leu Lys Ser Asn Leu Ser Thr Ser Asn Asp Ile Ile Val Glu Lys

405 410 415

Val Asp Asn Ile Lys Gln Glu Thr Asp Val Ala Lys Pro Lys Lys Asn

420 425 430

Ser Asn Gln Gly Val Val Gly Trp Val Lys Asp Lys Gly

435 440 445

<210> 4

<211> 838

<212> PRT

<213> 肺炎链球菌

<400> 4

Met Lys Ile Asn Lys Lys Tyr Leu Ala Gly Ser Val Ala Val Leu Ala

1 5 10 15

Leu Ser Val Cys Ser Tyr Glu Leu Gly Arg His Gln Ala Gly Gln Val

20 25 30

Lys Lys Glu Ser Asn Arg Val Ser Tyr Ile Asp Gly Asp Gln Ala Gly

35 40 45

Gln Lys Ala Glu Asn Leu Thr Pro Asp Glu Val Ser Lys Arg Glu Gly

50 55 60

Ile Asn Ala Glu Gln Ile Val Ile Lys Ile Thr Asp Gln Gly Tyr Val

65 70 75 80

Thr Ser His Gly Asp His Tyr His Tyr Tyr Asn Gly Lys Val Pro Tyr

85 90 95

Asp Ala Ile Ile Ser Glu Glu Leu Leu Met Lys Asp Pro Asn Tyr Gln

100 105 110

Leu Lys Asp Ser Asp Ile Val Asn Glu Ile Lys Gly Gly Tyr Val Ile

115 120 125

Lys Val Asp Gly Lys Tyr Tyr Val Tyr Leu Lys Asp Ala Ala His Ala

130 135 140

Asp Asn Ile Arg Thr Lys Glu Glu Ile Lys Arg Gln Lys Gln Glu His

145 150 155 160

Ser His Asn His Asn Ser Arg Ala Asp Asn Ala Val Ala Ala Ala Arg

165 170 175

Ala Gln Gly Arg Tyr Thr Thr Asp Asp Gly Tyr Ile Phe Asn Ala Ser

180 185 190

Asp Ile Ile Glu Asp Thr Gly Asp Ala Tyr Ile Val Pro His Gly Asp

195 200 205

His Tyr His Tyr Ile Pro Lys Asn Glu Leu Ser Ala Ser Glu Leu Ala

210 215 220

Ala Ala Glu Ala Tyr Trp Asn Gly Lys Gln Gly Ser Arg Pro Ser Ser

225 230 235 240

Ser Ser Ser Tyr Asn Ala Asn Pro Val Gln Pro Arg Leu Ser Glu Asn

245 250 255

His Asn Leu Thr Val Thr Pro Thr Tyr His Gln Asn Gln Gly Glu Asn

260 265 270

Ile Ser Ser Leu Leu Arg Glu Leu Tyr Ala Lys Pro Leu Ser Glu Arg

275 280 285

His Val Glu Ser Asp Gly Leu Ile Phe Asp Pro Ala Gln Ile Thr Ser

290 295 300

Arg Thr Ala Arg Gly Val Ala Val Pro His Gly Asn His Tyr His Phe

305 310 315 320

Ile Pro Tyr Glu Gln Met Ser Glu Leu Glu Lys Arg Ile Ala Arg Ile

325 330 335

Ile Pro Leu Arg Tyr Arg Ser Asn His Trp Val Pro Asp Ser Arg Pro

340 345 350

Glu Gln Pro Ser Pro Gln Ser Thr Pro Glu Pro Ser Pro Ser Leu Gln

355 360 365

Pro Ala Pro Asn Pro Gln Pro Ala Pro Ser Asn Pro Ile Asp Glu Lys

370 375 380

Leu Val Lys Glu Ala Val Arg Lys Val Gly Asp Gly Tyr Val Phe Glu

385 390 395 400

Glu Asn Gly Val Ser Arg Tyr Ile Pro Ala Lys Asp Leu Ser Ala Glu

405 410 415

Thr Ala Ala Gly Ile Asp Ser Lys Leu Ala Lys Gln Glu Ser Leu Ser

420 425 430

His Lys Leu Gly Ala Lys Lys Thr Asp Leu Pro Ser Ser Asp Arg Glu

435 440 445

Phe Tyr Asn Lys Ala Tyr Asp Leu Leu Ala Arg Ile His Gln Asp Leu

450 455 460

Leu Asp Asn Lys Gly Arg Gln Val Asp Phe Glu Val Leu Asp Asn Leu

465 470 475 480

Leu Glu Arg Leu Lys Asp Val Ser Ser Asp Lys Val Lys Leu Val Asp

485 490 495

Asp Ile Leu Ala Phe Leu Ala Pro Ile Arg His Pro Glu Arg Leu Gly

500 505 510

Lys Pro Asn Ala Gln Ile Thr Tyr Thr Asp Asp Glu Ile Gln Val Ala

515 520 525

Lys Leu Ala Gly Lys Tyr Thr Thr Glu Asp Gly Tyr Ile Phe Asp Pro

530 535 540

Arg Asp Ile Thr Ser Asp Glu Gly Asp Ala Tyr Val Thr Pro His Met

545 550 555 560

Thr His Ser His Trp Ile Lys Lys Asp Ser Leu Ser Glu Ala Glu Arg

565 570 575

Ala Ala Ala Gln Ala Tyr Ala Lys Glu Lys Gly Leu Thr Pro Pro Ser

580 585 590

Thr Asp His Gln Asp Ser Gly Asn Thr Glu Ala Lys Gly Ala Glu Ala

595 600 605

Ile Tyr Asn Arg Val Lys Ala Ala Lys Lys Val Pro Leu Asp Arg Met

610 615 620

Pro Tyr Asn Leu Gln Tyr Thr Val Glu Val Lys Asn Gly Ser Leu Ile

625 630 635 640

Ile Pro His Tyr Asp His Tyr His Asn Ile Lys Phe Glu Trp Phe Asp

645 650 655

Glu Gly Leu Tyr Glu Ala Pro Lys Gly Tyr

660 665

Claims

1.在有发展肺炎球菌性急性中耳炎复发风险的受试者中预防或治疗肺炎链球菌感染导致的急性中耳炎复发的方法，包括向所述受试者施用至少一次治疗有效量的组合物，所述组合物包含至少一种分离的和纯化的免疫原性多肽或其免疫原性片段，所述免疫原性多肽选自肺炎链球菌PhtD、PhtE、PcpA、LytB和去毒的肺炎球菌溶血素。

2.权利要求1的方法，其中所述受试者先前已经经历至少一次急性中耳炎的发作。

3.权利要求2的方法，其中所述受试者在6个月期间内已经经历了3次或更多次急性中耳炎发作或在12个月期间内已经经历了4次或更多次急性中耳炎发作。

4.权利要求1的方法，其中所述受试者发展急性中耳炎或有发展急性中耳炎的风险。

5.权利要求4的方法，其中所述受试者患有急性中耳炎。

6.权利要求1的方法，其中所述组合物的施用引发或增强抗原特异性CD4+ T细胞的产生。

7.权利要求6的方法，其中所述组合物的施用引发或增强产生IFN-γ、IL-4、IL-2和/或IL-17a的抗原特异性CD4+ T细胞的产生。

8.权利要求7的方法，其中产生IFN-γ、IL-4、IL-2和/或IL-17a的抗原特异性CD4+ T细胞的百分比相对于所述组合物临施用前存在的百分比增加。

9.权利要求1的方法，其中施用刺激IFN-γ、IL-2、IL-4和/或IL-17a细胞因子的产生。

10.权利要求1的方法，其中所述组合物进一步包含佐剂。

11.组合物，包含至少一种分离的和基本上纯化的免疫原性多肽，所述免疫原性多肽选自肺炎链球菌PhtD、PhtE、PcpA、LytB和去毒的肺炎球菌溶血素，其用于在受试者中预防或治疗肺炎链球菌感染导致的急性中耳炎的复发。

12.权利要求11的组合物，其中所述受试者先前已经经历至少一次急性中耳炎的发作。

13.权利要求11的组合物，其中所述受试者在6个月期间内已经经历了3次或更多次急性中耳炎发作或在12个月期间内已经经历了4次或更多次急性中耳炎发作。

14.权利要求11的组合物，其中所述受试者发展急性中耳炎或有发展急性中耳炎的风险。

15.权利要求14的组合物，其中所述受试者患有急性中耳炎。

16.权利要求11的组合物，其中所述组合物的施用引发抗原特异性CD4+ T细胞的产生。

17.权利要求16的组合物，其中所述组合物的施用引发产生IFN-γ、IL-4、IL-2和/或IL-17a的抗原特异性CD4+ T细胞的产生。

18.权利要求16的组合物，其中组合物的施用相对于缺少至少一种分离的和纯化的免疫原性多肽的组合物的施用使产生IFN-γ、IL-4、IL-2和/或IL-17a的抗原特异性CD4+ T细胞的百分比增加。

19.权利要求11的组合物，其中施用刺激IFN-γ、IL-2、IL-4和/或IL-17a细胞因子的产生。

20.权利要求11的组合物，其中组合物进一步包含佐剂。

21.权利要求1的方法，其中所述组合物包含至少两种分离的和纯化的免疫原性多肽或其免疫原性片段，所述免疫原性多肽选自肺炎链球菌PhtD、PhtE、PcpA、LytB和去毒的肺炎球菌溶血素。

22.权利要求1的方法，其中所述组合物包含至少三种分离的和纯化的免疫原性多肽或其免疫原性片段，所述免疫原性多肽选自肺炎链球菌PhtD、PhtE、PcpA、LytB和去毒的肺炎球菌溶血素。

23.权利要求1的方法，其中所述组合物包含至少四种分离的和纯化的免疫原性多肽或其免疫原性片段，所述免疫原性多肽选自肺炎链球菌PhtD、PhtE、PcpA、LytB和去毒的肺炎球菌溶血素。

24.权利要求1的方法，其中所述组合物包含至少五种分离的和纯化的免疫原性多肽或其免疫原性片段，所述免疫原性多肽选自肺炎链球菌PhtD、PhtE、PcpA、LytB和去毒的肺炎球菌溶血素。

25.权利要求1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、21、22、23和24中任一项的方法，其中所述去毒的肺炎球菌溶血素是在野生型序列65、293和428位置包含氨基酸取代的突变体肺炎球菌溶血素蛋白。

26.权利要求25的方法，其中所述三个氨基酸取代包含T₆₅→C、G₂₉₃→C和C₄₂₈→A。

27.权利要求11的组合物，其中所述组合物包含至少两种分离的和纯化的免疫原性多肽或其免疫原性片段，所述免疫原性多肽选自肺炎链球菌PhtD、PhtE、PcpA、LytB和去毒的肺炎球菌溶血素。

28.权利要求11的组合物，其中所述组合物包含至少三种分离的和纯化的免疫原性多肽或其免疫原性片段，所述免疫原性多肽选自肺炎链球菌PhtD、PhtE、PcpA、LytB和去毒的肺炎球菌溶血素。

29.权利要求11的组合物，其中所述组合物包含至少四种分离的和纯化的免疫原性多肽或其免疫原性片段，所述免疫原性多肽选自肺炎链球菌PhtD、PhtE、PcpA、LytB和去毒的肺炎球菌溶血素。

30.权利要求11的组合物，其中所述组合物包含至少五种分离的和纯化的免疫原性多肽或其免疫原性片段，所述免疫原性多肽选自肺炎链球菌PhtD、PhtE、PcpA、LytB和去毒的肺炎球菌溶血素。

31.权利要求11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、27、28、29和30中任一项的组合物，其中所述去毒的肺炎球菌溶血素是在野生型序列65、293和428位置包含氨基酸取代的突变体肺炎球菌溶血素蛋白。

32.权利要求31的组合物，其中所述三个氨基酸取代包含T₆₅→C、G₂₉₃→C和C₄₂₈→A。

33.权利要求11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、27、28、29、30、31和32中任一项的组合物，其中所述组合物是疫苗。

34.权利要求1的方法，其中所述受试者已经经历肺炎链球菌感染导致的急性中耳炎发作并在至少48小时的适当的抗生素治疗后无法实现细菌根除和/或症状的消除。

35.权利要求1的方法，其中所述受试者已经经历肺炎链球菌感染导致的急性中耳炎(AOM)发作并在完成对AOM的抗生素疗程的14天内，AOM症状回复。

36.权利要求10的组合物，其中所述受试者已经经历肺炎链球菌感染导致的急性中耳炎发作并在至少48小时的适当的抗生素治疗后无法实现细菌根除和/或症状的消除。

37.权利要求10的组合物，其中所述受试者已经经历肺炎链球菌感染导致的急性中耳炎(AOM)发作并在完成对AOM的抗生素疗程的14天内，AOM症状回复。

38.在有发展肺炎球菌性AOM复发的风险的受试者中减少肺炎链球菌感染导致的急性中耳炎(AOM)复发的风险的方法，包括向所述受试者施用治疗有效量的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含至少一种分离的和基本上纯化的免疫原性多肽或其免疫原性片段，所述免疫原性多肽选自肺炎链球菌PhtD、PhtE、PcpA、LytB和去毒的肺炎球菌溶血素。