CN102596236A - 抗原性Tau肽及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含优选连接至免疫原性载体的抗原性Tau肽的免疫原和组合物，其用于治疗Tau相关的神经学病症。本发明还涉及制备这些免疫原及组合物的方法以及其在医药中的用途。

Description

抗原性Tau肽及其用途
技术领域
本发明涉及包含连接至诸如病毒样颗粒(VLP)等免疫原性载体的抗原性tau肽(tau peptide)的免疫原、免疫原性组合物及药物组合物，其用于治疗tau相关的神经学病症或病状，例如阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease)及轻度认知损伤(Mild Cognitive Impairment)。本发明还涉及制备这些免疫原、免疫原性组合物及药物组合物的方法及其于医药中的用途。
背景技术
阿尔茨海默病也称为阿尔茨海默痴呆或AD，其是一种造成记忆丧失及严重精神衰退的进行性神经变性病症或病状。AD是最常见的痴呆形式，占所有痴呆的一半以上。据估计，全世界超过2600万人遭受AD影响，预计随着人口老龄化在2050年以前该数字会变成四倍(Brookmeyer等人，Alzheimer′s&Dementia 3：186-191(2007))。考虑到AD患者在诊断后平均存活8至10年且需要高水平的日常护理，除丧失生命及降低生活质量外，对社会造成的经济成本也非常巨大。在早期，抱怨自己略微记忆丧失及意识错乱的患者被鉴定为患有轻度认知损伤(MCI)，在一些情况下其会发展成典型的阿尔茨海默病症状，导致严重的智力及社会能力障碍。
通常，阿尔茨海默病(AD)的特征在于脑中神经炎斑(neuritic plaque)及神经原纤维缠结(neurofibrillary tangle)的聚积，导致神经元细胞死亡，随后进行性认知衰退。大多数当前可用的AD疗法集中于治疗症状，但不一定终止疾病进展。因此，显然需要新的途径以鉴别出能够保护神经元免受AD衰弱效应的疗法。
大多数目前用于治疗AD的治疗途径是基于广为接受的“淀粉样蛋白级联假说(amyloid cascade hypothesis)”。此观点将病理生理学作用归因于淀粉样蛋白-β(Aβ)，该淀粉样蛋白-β是单体至寡聚体形式的神经毒素(neurotoxin)及突触毒素(synaptotoxin)、同时以聚合物形式沉积于淀粉样蛋白斑(amyloid plaque)中，这是AD病理学的特征之一。抗一系列Aβ形式的单克隆抗体被认为是有效的，这是因为其使血脑平衡(brain-bloodequilibrium)向血液偏移，由此降低脑中的Aβ储量。
AD病理生理学的特征不仅在于Aβ沉积于老年斑中，且还包括神经原纤维缠结(NFT)的聚积。NFT是由成对螺旋纤维与高度磷酸化的tau蛋白连接在一起而形成的原纤维。Tau可在多于30个不同丝氨酸及苏氨酸残基(Hanger等人，J.Neurochem.71：2465-2476(1998))以及数个酪氨酸残基(Lebouvier等人，JAD 18：1-9(2009))处经多种激酶而短暂磷酸化。在AD中，激酶与磷酸酶活性明显不平衡，导致产生以NFT形式聚集和堆积的tau蛋白的高度磷酸化形式。
轻度认知损伤(MCI)最通常定义为具有可测量的记忆损伤，该记忆损伤超出了通常对衰老所的预期，但未显示其他痴呆或AD症状。MCI似乎代表着介于与正常衰老及早期痴呆有关的认知变化之间的过渡状态。当主要症状是记忆丧失时，此类型的MCI进一步细定义为遗忘型MCI。患有此亚型MCI的个体最可能以每年约10-15％的比率发展成AD(Grundman M等人，Arch Neurol.61，59-66，2004)。2005年公布的一项大规模研究作为第一个临床试验显示出在第一年试验期间对MCI患者进行治疗可延迟转变至AD(Petersen RC等人，NEJM 352，2379-2388，2005)，表明这些患者也代表了对于AD治疗干预的是可行的群体。
最近的研究报导，在病原性tau的缠结小鼠模型中接种抗磷酸化tau肽的疫苗可导致脑中聚积的tau减少并改善与缠结有关的行为缺陷(Asuni等人，J.Neurosci.27：9115-9129(2007))。尽管高度磷酸化的tau及NFT对认知丧失及AD进展的影响尚未完全了解，但最近的意见表明仅靶向淀粉样蛋白并不足以在整个病程期间看到改善，这使得靶向其他的或替代的靶标成为必须(Oddo等人，J.Biol.Chem.281：39413(2006))。有鉴于此，可能需要靶向tau蛋白的疾病构象的活性疫苗途径来产生对于AD及MCI有效的治疗疫苗。
此外，除AD及MCI外还有许多疾病也与tau病变(tau pathology或tauopathies)有关，其也可能得益于特异性靶向所涉及致病形式的tau疫苗。这些疾病包括例如额颞痴呆、帕金森病(Parkinson′s disease)、皮克病(Pick′sdisease)、进行性核上麻痹、和肌萎缩侧索硬化/帕金森病-痴呆综合症(参见，例如Spires-Jones等人，TINS 32：150-9(2009))。
发明概述
本发明提供包含至少一种抗原性tau肽的新的免疫原、免疫原性组合物和药物组合物，所述抗原性tau肽能够诱导免疫应答、特别是抗体应答，导致产生针对呈致病的高度磷酸化状态的自身抗原tau的抗体效价。此类免疫原、免疫原性组合物及药物组合物展现出多种期望的特性，例如能够诱导免疫应答、特别是抗体应答，对于与高度磷酸化tau有关的神经变性疾病(例如阿尔茨海默病及MCI)的诱导及发展具有治疗效果。
在一个方面，本发明提供包含至少一种连接至免疫原性载体的抗原性tau肽的免疫原，其中所述抗原性tau肽包含选自以下的磷酸-tau表位：pSer-396磷酸-tau表位、pThr-231/pSer-235磷酸-tau表位、pThr-231磷酸-tau表位、pSer-235磷酸-tau表位、pThr-212/pSer-214磷酸-tau表位、pSer-202/pThr-205磷酸-tau表位，以及表位。
在一个实施例中，所述磷酸-tau表位是pSer-396磷酸-tau表位。在又一实施例中，所述磷酸-tau表位是pThr-231/pSer-235磷酸-tau表位。在又一实施例中，所述磷酸-tau表位是pThr-231磷酸-tau表位，在又一实施例中，所述磷酸-tau表位是pSer-235磷酸-tau表位。在又一实施例中，所述磷酸-tau表位是pThr-212/pSer-214磷酸-tau表位。在又一实施例中，所述磷酸-tau表位是pSer-202/pThr-205磷酸-tau表位。在又一实施例中，所述磷酸-tau表位是pTyr18磷酸-tau表位。
在另一方面，本发明提供包含至少一种连接至免疫原性载体的抗原性tau肽的免疫原，其中所述抗原性tau肽包含选自SEQ ID NO：4、6-26、105及108-112的氨基酸序列。
在一个实施例中，所述抗原性tau肽通过式(G)nC表示的接头共价连接至所述免疫原性载体，其中所述接头位于所述肽的C端(肽-(G)nC)或N端(C(G)n-肽)，且其中n是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在又一实施例中，所述接头位于所述tau肽的N端，且其中n为1或2。在另一实施例中，所述接头位于所述tau肽的C端，且其中n为1或2。在又一实施例中，所述抗原性tau肽包含选自SEQ ID NO：4及6-13的氨基酸序列。在又一实施例中，所述抗原性tau肽由选自SEQ ID NO：4及6-13的氨基酸序列组成。在又一实施例中，所述抗原性tau肽由SEQ ID NO：11中所示的氨基酸序列组成。
在另一实施例中，所述抗原性tau肽包含选自SEQ ID NO：14-19的氨基酸序列。在又一实施例中，所述抗原性tau肽由选自SEQ ID NO：14-19的氨基酸序列组成。在又一实施例中，所述抗原性tau肽由SEQ ID NO：16中所示的氨基酸序列组成。
在另一实施例中，所述抗原性tau肽包含选自SEQ ID NO：20-24的氨基酸序列。在又一实施例中，所述抗原性tau肽由选自SEQ ID NO：20-24的氨基酸序列组成。在又一实施例中，所述抗原性tau肽由SEQ ID NO：21中所示的氨基酸序列组成。
在另一实施例中，所述抗原性tau肽包含选自SEQ ID NO：105及108-112的氨基酸序列。在又一实施例中，所述抗原性tau肽由选自SEQ IDNO：105及108-112的氨基酸序列组成。在又一实施例中，所述抗原性tau肽由SEQ ID NO：105中所示的氨基酸序列组成。
在一个方面，本发明提供任何本文所述的免疫原，其中所述免疫原性载体为血蓝蛋白(例如KLH)、血清白蛋白、球蛋白、提取自蛔虫属的蛋白质、或失活的细菌毒素。
在一个方面，本发明提供任何本文所述的免疫原，其中所述免疫原性载体选自由HBcAg VLP、HBsAg VLP及Qbeta VLP组成的组的病毒样颗粒。在一个实施例中，本发明提供包含至少两种本文所述免疫原的组合物。在又一实施例中，所述组合物包含至少三种本文所述的免疫原。
在一个实施例中，本发明提供包含至少两种本文所述免疫原的组合物，其中：a)第一种免疫原的抗原性tau肽由选自SEQ ID NO：4及6-13的氨基酸序列组成；且b)第二种免疫原的抗原性tau肽由选自SEQ ID NO：14-19的氨基酸序列组成。
在另一实施例中，本发明提供包含至少两种本文所述免疫原的组合物，其中：a)第一种免疫原的抗原性tau肽由选自SEQ ID NO：4及6-13的氨基酸序列组成；且b)第二种免疫原的抗原性tau肽由选自SEQ ID NO：20-24的氨基酸序列组成。
在另一实施例中，本发明提供包含至少两种本文所述免疫原的组合物，其中：a)第一种免疫原的抗原性tau肽由选自SEQ ID NO：14-19的氨基酸序列组成；且b)第二种免疫原的抗原性tau肽由选自SEQ ID NO：20-24的氨基酸序列组成。
在又一实施例中，本发明提供包含至少两种本文所述免疫原的组合物，其中：a)第一种免疫原的抗原性tau肽由选自SEQ ID NO：4及6-13的氨基酸序列组成；且b)第二种免疫原的抗原性tau肽选自SEQ ID NO：105及108-112。
在又一实施例中，本发明提供包含至少两种本文所述免疫原的组合物，其中：a)第一种免疫原的抗原性tau肽由选自SEQ ID NO：14-19的氨基酸序列组成；且b)第二种免疫原的抗原性tau肽选自SEQ ID NO：105及108-112。
在又一实施例中，本发明提供包含至少两种本文所述免疫原的组合物，其中：a)第一种免疫原的抗原性tau肽由选自SEQ ID NO：20-24的氨基酸序列组成；且b)第二种免疫原的抗原性tau肽选自SEQ ID NO：105及108-112。
在另一实施例中，本发明提供包含本文所述四种免疫原中的至少三种免疫原的组合物，其中：a)第一种免疫原的抗原性tau肽由选自SEQ ID NO：4及6-13的氨基酸序列组成；b)第二种免疫原的抗原性tau肽由选自SEQ IDNO：14-19的氨基酸序列组成；且c)第三种免疫原的抗原性tau肽由选自SEQ ID NO：20-24的氨基酸序列组成；d)第四免种疫原的抗原性tau肽选自SEQ ID NO：105及108-112。
在又一实施例中，本发明提供任何本文所述的组合物，其中所述抗原性tau肽中的每一种独立地通过式(G)nC所表示的接头共价连接至所述免疫原性载体，其中这些接头中的每一种独立地位于所述tau肽的C端(肽-(G)nC)或N端(C(G)n-肽)，且其中各个n独立地为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在又一实施例中，本发明提供任何本文所述的组合物，其中所述接头中的每一种位于该tau肽的N端且其中各n独立地为1或2。
在另一方面，本发明提供包含四种免疫原中的至少三种免疫原的组合物，其中：a)第一种免疫原包含至少一种连接至Qbeta VLP的抗原性tau肽，其中所述抗原性tau肽由SEQ ID NO：11组成，且其中所述肽通过式(G)nC所表示的接头共价连接至所述VLP，其中所述接头位于所述tau肽的C端(肽-(G)nC)或N端(C(G)n-肽)，且其中n是1或2；b)第二种免疫原包含至少一种连接至Qbeta VLP的抗原性tau肽，其中所述抗原性tau肽由SEQ IDNO：16组成，且其中所述肽通过式(G)nC表示的接头共价连接至所述VLP，其中所述接头位于所述tau肽的C端(肽-(G)nC)或N端(C(G)n-肽)，且其中n是1或2；且c)第三种免疫原包含至少一种连接至Qbeta VLP的抗原性tau肽，其中所述抗原性tau肽由SEQ ID NO：21组成，且其中所述肽经由式(G)nC表示的接头共价连接至所述VLP，其中所述接头位于所述tau肽的C端(肽-(G)nC)或N端(C(G)n-肽)，且其中n是1或2；d)第四种免疫原包含至少一种连接至Qbeta VLP的抗原性tau肽，其中所述抗原性tau肽由SEQ IDNO：105组成，且其中所述肽通过式(G)nC表示的接头共价连接至所述VLP，其中所述接头位于所述tau肽的C端(肽-(G)nC)或N端(C(G)n-肽)，且其中n为1或2。
在一个实施例中，第一、第二及第三免疫原的所述接头中的每一种位于所述抗原性tau肽中的每一种的N端，且其中对于所述接头中的每一种，n为2。
在另一方面，本发明提供包含任何本文所述免疫原或组合物的组合物，其进一步包含至少一种佐剂，所述佐剂选自明矾、含CpG寡核苷酸、及基于皂苷的佐剂。
在又一方面，本发明提供包含任何本文所述的免疫原或组合物、及药物可接受的赋形剂的药物组合物。在一个实施例中，至少一种佐剂是选自CpG 7909(SEQ ID NO：27)、CpG 10103(SEQ ID NO：28)及CpG 24555(SEQID NO：29)的含CpG寡核苷酸。
在又一方面，本发明提供包含任何本文所述免疫原或组合物、及药物可接受的赋形剂的药物组合物。
在另一方面，本发明提供一种免疫方法，其包括向哺乳动物施用任何本文所述的免疫原、组合物或药物组合物。例如，在一个方面，所述施用是通过使用医药有效剂量的任何本文所述免疫原、组合物或药物组合物来实施。
在另一方面，本发明提供治疗哺乳动物tau相关神经学病症的方法，其包括向所述哺乳动物施用治疗有效量的任何本文所述的免疫原、免疫原性组合物或药物组合物。
在一个方面，所述施用是通过使用医药有效剂量的任何本文所述免疫原、组合物或药物组合物来实施。
在另一方面，本发明提供治疗哺乳动物tau相关神经学病症的方法，其包括向所述哺乳动物施用：a)医药有效剂量的任何本文所述的免疫原、免疫原性组合物或药物组合物；及b)医药有效剂量的至少一种佐剂。在一个实施例中，所述至少一种佐剂选自明矾、含CpG寡核苷酸及基于皂苷的佐剂。在又一实施例中，所述至少一种佐剂是选自CpG 7909(SEQ ID NO：27)、CpG 10103(SEQ ID NO：28)、以及CpG 24555(SEQ ID NO：29)的含CpG寡核苷酸。
在又一实施例中，所述神经学病症时阿尔茨海默病。在另一实施例中，所述神经学病症被诊断为轻度认知损伤。在另一实施例中，所述神经学病症被诊断为遗忘型MCI。
在另一实施例中，本发明提供了任何本文所述的免疫原、组合物或药物组合物用于制造药物的用途。例如，在一个方面，所述药物可用于治疗哺乳动物tau相关的神经学病症。在一个实施例中，所述神经学病症位阿尔茨海默病。在另一实施例中，所述神经学病症被诊断为轻度认知损伤(MCI)。在另一实施例中，所述神经学病症被诊断为遗忘型MCI。
在又一方面，本发明提供应答任何本文所述免疫方法而产生的分离的抗体，其中所述抗体特异性结合高度磷酸化形式的人类tau。
在又一方面，本发明提供治疗哺乳动物tau相关神经学病症的方法，其包括向所述哺乳动物施用特异性结合高度磷酸化形式的人类tau的抗体，且其中所述抗体是应答任何本文所述免疫方法而产生。
在又一方面，本发明提供任何本文所述抗体用以制造用于治疗哺乳动物tau相关神经学病症的药物的用途。在一个实施例中，所述神经学病症为阿尔茨海默病。在另一实施例中，所述神经学病症被诊断为轻度认知损伤(MCI)。在另一实施例中，所述神经学病症被诊断为遗忘型MCI。
在又一方面中，本发明提供一种分离的肽，其由选自SEQ ID NO：4、6至26、31至76以及105至122的氨基酸序列组成或基本上由上述氨基酸序列所组成。在又一方面，本发明提供编码任何所述分离肽的分离核酸。在又一方面，本发明提供包含任何所述核酸的表达载体。在又一方面，本发明提供包含任何所述表达载体的宿主细胞。
附图简述
图1A及1B显示了如实施例5所述的经皮下免疫的Balb/c小鼠组的描述，以及效价和选择性结果。用300μg肽、100μg肽-KLH或100μg肽-VLP经皮下免疫Balb/c小鼠。在列出的情形中用50μL TiterMax Gold(AlexisBiochemicals)作为佐剂。在抗原特异性效价确定测定法(参见实施例13)中所测试的血清稀释度介于1∶30至1∶7,290范围内。
图2显示如实施例5所述的经免疫的Balb/c小鼠组的描述、以及效价结果。经皮下免疫Balb/c小鼠。在列出的情形中使用50μL TiterMax Gold作为佐剂。在抗原特异性效价确定测定法(参见实施例13)中所测试的血清稀释度介于1∶900至1∶1,968,300范围内。
图3显示如实施例6所进一步阐述的经皮下免疫的Balb/c小鼠的描述。使用100μg肽初免，并使用100μg肽-VLP加强免疫。在列出的情形中使用750μg明矾(Al(OH)3)作为佐剂。在抗原特异性效价确定测定法(参见实施例13)中测试的血清稀释度介于1∶800至1∶1,750,000范围内。ND意指未进行测定。
图4A、4B及4C显示如实施例7所述的经肌内免疫的TG4510++小鼠的结果。图4A显示组1至7的效价结果，而图4B显示组8至17的效价结果。图4C显示组1至6的选择性结果。CPG是CpG-24555。明矾是Al(OH)3。在抗原特异性效价确定测定法(参见实施例13)中测试的血清稀释度介于1∶5,000至1∶15,800,000范围内。ND意指未进行测定。
图5显示如实施例8所述的免疫小鼠的描述。通过肌内(IM)或皮下(SC)途径免疫Balb/c小鼠。在列出的情形中使用90μg肽-VLP。在列出的情形中使用1,595μg明矾(Al(OH)3)、20μg CpG-24555及12μg ABISCO-100。在抗原特异性效价确定测定法(参见实施例13)中测试的血清稀释度介于1∶5,000至1∶15,800,000范围内。标准曲线检测的下限为0.0025mg/mL。NA意指不适用。
图6显示如实施例11所述的经免疫小鼠的描述。经肌内免疫Balb/c小鼠。使用100μg肽-VLP。在列出的情形中使用252(750)μg明矾(Al(OH)3)。在抗原特异性效价确定测定法(参见实施例13)中测试的血清稀释度介于1∶500至1∶2,720,000范围内。ND意指未进行测定。
图7显示如实施例11所述的经免疫小鼠的描述。经肌内免疫Balb/c小鼠。使用750μg明矾(Al(OH)3)作为佐剂。在抗原特异性效价确定测定法(参见实施例13)中测试的血清稀释度介于1∶500至1∶15,800,000范围内。
图8显示如实施例12所述的经免疫小鼠的描述。经肌内免疫TG4510-/-(野生型同窝)小鼠。列出时，使用100μg各肽-VLP进行第0天的初免以及第14天的加强免疫。使用所列出的量的明矾(Al(OH)3)。采集“未治疗”组的血清。在抗原特异性效价确定测定法(参见实施例13)中测试的血清稀释度介于1∶5,000至1∶15,800,000范围内。
图9显示如实施例12所述的经免疫小鼠的描述。经肌内免疫TG4510-/-(野生型同窝)小鼠。使用100μg的各种肽-VLP进行第0天的初免以及第14天的加强免疫。不使用明矾或使用504μg明矾(Al(OH)3)。在第21天采集脾。显示如经干扰素-γT细胞ELIspot(参见实施例14)所测量的每5x105个脾细胞的斑点数量。获得一组3只脾的结果。肽HBV-1(SEQ IDNO：77)为不相关的肽。BSA为不相关的蛋白质。ND表示未进行测定。*表示相对于适当的不相关肽或蛋白质p小于0.05。
图10显示人类tau同种型2(Genbank登记号为NP_005901)的氨基酸序列(SEQ ID NO：30)。
发明详述
定义及一般技术
除非本文另有定义，否则结合本发明使用的科学及技术术语将具有那些本领域技术人员所通常了解的含义。通常，结合以下所使用的命名及关于以下的技术已为本领域所熟知且在本领域常用：本文所述的细胞及组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学及蛋白质与核酸化学、杂交、分析化学、合成有机化学、及医学与医药化学。
除非另有说明，否则本发明方法及技术通常按照本领域技术人员所熟知的常规方法并如本说明书全文中所引用及论述的各个概括以及更具体的参考文献中所述来实施。参见，例如，Sambrook J.&Russell D.MolecularCloning：A Laboratory Manual，第3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(2000)；Ausubel等人，Short Protocols in MolecularBiology：A Compendium of Methods from Current Protocols in MolecularBiology，Wiley，John&Sons公司(2002)；Harlow及Lane，Using Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，N.Y.(1998)；及Coligan等人，Short Protocols in Protein Science，Wiley，John&Sons公司(2003)。酶促反应及纯化技术是按照制造商说明书、按照本领域习用方法或如本文所述实施。
本文所用的术语“轻度认知损伤(MCI)”是指一种记忆及认知损伤等级，其通常特征在于临床痴呆评级(clinical dementia rating)(CDR)为0.5(参见，例如Hughes等人，Brit.J.Psychiat.140：566-572，1982)，且其另外特征在于记忆损伤，但其他认知领域的功能未出现损伤。记忆损伤优选使用诸如“段落测试(paragraph test)”等测试来测量。诊断为轻度认知损伤的患者通常呈现受损且延迟的回忆表现。轻度认知损伤通常与衰老有关，且通常发生于45周岁或更大年龄的患者。
本文所用的术语“痴呆”在其最广泛意义上是指一种精神病的病状，如美国精神病学学会(American Psychiatric Association)：Diagnostic andStatistical Manual of Mental Disorders，第4版，Washington，D.C.，1994(“DSM-IV”)中所定义。DSM-IV将“痴呆”定义为特征在于包括记忆损伤在内的多种认知缺陷，且按照推测的病因列出各种痴呆。DSM-IV阐述通常可接受的用于痴呆及相关精神损伤的诊断、分级及治疗的标准。
术语“Tau”或“tau蛋白”是指与神经细胞中微管的稳定化有关的tau蛋白及广泛的tau聚集体(例如，神经原纤维缠结)的组份。具体而言，本文所用的术语“tau蛋白”涵盖任何多肽，该多肽包含SEQ ID NO：30的人类tau、或经修饰或未经修饰的其他人类同种型、或来自任何其他动物的对应直向同源物(ortholog)，或者由上述所组成。本文所用的术语“tau蛋白”进一步涵盖转译后修饰，包括但不限于对如上文所定义tau蛋白的糖基化、乙酰化及磷酸化。
术语“Tau病变”是指tau相关的病症或病状，例如，阿尔茨海默病、进行性核上麻痹(PSP)、皮质基底节变性(CBD)、皮克病、与染色体17有关的额颞痴呆及帕金森病(FTDP-17)、帕金森病、中风、外伤性脑损伤、轻度认知损伤及诸如此类。
术语“抗原”与“免疫原”在本文中可互换使用，其是指由MHC分子呈递的能够与抗体、B细胞受体(BCR)或T细胞受体(TCR)结合的分子。本文所用的术语“抗原”及“免疫原”还涵盖T细胞表位。另外，抗原能够被免疫系统识别和/或能够诱导体液免疫应答和/或细胞免疫应答，导致B-淋巴细胞和/或T-淋巴细胞激活。然而，至少在某些情形下，这可能需要抗原含有或连接至T辅助细胞表位并提供抗原一种佐剂。抗原可具有一或多种表位(例如，B-表位及T-表位)。上文提及的特异性反应意在表明，抗原优选与其对应的抗体或TCR反应(通常以高度选择性方式)，且不与可能由其他抗原诱发的大量其他抗体或TCR反应。本文所用的抗原还可以为数种单一抗原的混合物。术语“抗原”及“免疫原”均涵盖(但不限于)多肽。
术语“抗原位点”与术语“抗原表位”在本文中可互换使用，其是指多肽的可被抗体或T细胞受体(在MHC分子的情况下)免疫特异性地结合的连续或不连续部分。免疫特异性结合排除非特异性结合，但不一定排除交叉反应性。抗原位点通常在该抗原位点所特有的空间构象中包含5至10个氨基酸。
就氨基酸残基而言，本文所用的术语“磷酸化”是指在原本通常存在羟基的残基侧链上存在磷酸酯基团。所述磷酸化通常以羟基的氢原子被磷酸酯基团(-PO3H2)取代的形式发生。本领域技术人员认识到，基于局部环境的pH，此磷酸酯基团可以不带电荷的中性基团(-PO3H2)、或带一个负电荷(-PO3H-)、或带两个负电荷(-PO3 2-)的形式存在。通常可被磷酸化的氨基酸残基包括丝氨酸、苏氨酸及酪氨酸侧链。在本发明全文中，磷酸化的氨基酸残基以粗体表示并标以下划线。
如本文所用，以单字母或三字母代码来表示提及的氨基酸残基(参见，例如Lehninger，Biochemistry，第2版，Worth Publishers，New York，1975，第72页)。
冠词“一”(a及an)在本文中用以指一个或一个以上(即指至少一个)的该冠词的语法对象。例如，“一元件”意指一个元件或一个以上的元件。此外，除非上下文另有需要，否则单数形式应包括复数，且复数形式应包括单数，除非本文另外明确说明。
术语“肽”或“多肽”是指氨基酸的聚合物且不考虑聚合物的长度；因此，蛋白质片段、寡肽及蛋白质均涵盖于肽或多肽的定义之内。此术语也未指定或排除多肽的表达后修饰，例如，术语多肽明确地涵盖包括糖基、乙酰基、磷酸酯基团、脂质基团及诸如此类的共价附着的多肽。此定义也包括含有一或多种氨基酸类似物(包括，例如，非天然存在的氨基酸、仅天然存在于不相关生物系统中的氨基酸、来自哺乳动物系统的经修饰氨基酸等)的多肽、具有经取代键以及本领域技术人员熟知的其他修饰(包括天然存在及非天然存在的)的多肽。
本文所用的术语“tau片段”涵盖包含本文所定义tau蛋白的至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个邻接氨基酸或由其组成的任何多肽。
本文所用的术语“pSer-396磷酸-tau表位”是指包含氨基酸序列K
Figure BDA0000141966330000121
P(即人类tau序列的Lys-395Ser-396Pro-397)的肽，其中丝氨酸残基经磷酸化，且其中序列编号是基于SEQ ID NO：30所提供的人类tau同种型2。pSer-396磷酸-tau表位的长度通常为约3个至约25个氨基酸。
本文所用的术语“pThr-231/pSer-235磷酸-tau表位”是指包含氨基酸序列
Figure BDA0000141966330000122
PPK
Figure BDA0000141966330000123
(SEQ ID NO：1)(即人类tau序列的Thr-231Pro-232Pro-233Lys-234Ser-235)的肽，其中苏氨酸及丝氨酸残基各自经磷酸化，且其中序列编号是基于SEQ ID NO：30提供的人类tau同种型2。这些表位的长度通常为约5个至约25个氨基酸。所述pThr-231/pSer-235磷酸-tau表位也可指该表位的包含磷酸化Thr-231残基但不包括磷酸化Ser-235残基或包含磷酸化Ser-235残基但不包括磷酸化Thr-231表位的形式。该表位的这些形式的长度通常为约3个至约20个氨基酸。
本文所用的术语“pThr-212/pSer-214磷酸-tau表位”是指包含氨基酸序列
Figure BDA0000141966330000124
P
Figure BDA0000141966330000125
(即人类tau序列的Thr-212Pro-213Ser-214)的肽，其中苏氨酸及丝氨酸残基各自经磷酸化，且其中序列编号是基于SEQ ID NO：30提供的人类tau同种型2。pThr-212/pSer-214磷酸-tau表位的长度通常为约3个至约25个氨基酸。
本文所用的术语“pSer-202/pThr-205磷酸-tau表位”是指包含氨基酸序列
Figure BDA0000141966330000126
PG(SEQ ID NO：3)(即人类tau序列的Ser-202Pro-203Gly-204Thr-205)的肽，其中丝氨酸及苏氨酸残基各自经磷酸化，且其中序列编号是基于SEQ ID NO：30提供的人类tau同种型2。pSer-202/pThr-205磷酸-tau表位的长度通常为约4个至约25个氨基酸。
本文所用的术语“纯化”及“分离”为同义词。例如，就多肽而言，术语“分离”或“纯化”根据起源或衍生源是指如下多肽：(1)不与在其天然状态下伴随其的天然结合组份相结合；(2)基本上不含来自相同物种的其他蛋白质；(3)由来自不同物种的细胞表达；或(4)在天然状态下不存在。因此，经化学合成或在不同于多肽天然起源的细胞的细胞系统中合成的多肽是与其天然结合组份“分离”的。还可使用本领域技术人员所熟知的蛋白质纯化技术通过分离使多肽基本上不含天然结合组份。当至少约60％至75％的试样呈现单一种类的多肽时，多肽为“基本上纯净”、“基本上均质”或“基本上纯化”。多肽可以为单体或聚合物。基本上纯净的多肽通常可占蛋白质试样的约50％、60％、70％、80％或90％w/w，更通常约95％，且优选地可为99％以上纯净。蛋白质纯度或均质性可由本领域熟知的多种方式来展现，例如进行蛋白质试样的聚丙烯酰胺凝胶电泳，随后在用本领域熟知染色剂染色凝胶后目测单个多肽条带。出于某些目的，可通过使用HPLC或本领域熟知的其他方式进行纯化来提供更高的分辨率。
本文所用的术语tau相关神经学病症意指tau(尤其tau的高度磷酸化形式)被认为起作用的任何疾病或其他病状。所述病症、疾病和/或病状通常与存在神经原纤维缠结(通常涉及tau的高度磷酸化形式)有关，且包括(但不限于)阿尔茨海默病、MCI、额颞痴呆、皮克病、进行性核上麻痹、皮质基底节变性、关岛型帕金森病-痴呆综合症及其他tau病变。
本文所用的术语“抗原性tau肽”涵盖所有tau衍生多肽，例如来自哺乳动物物种，例如来自人类，以及其呈现“抗原性tau肽生物活性”的变体、类似物、直向同源物、同源物及衍生物、及其片段。例如，术语“抗原性tau肽”是指包含选自SEQ ID NO：1至26、31至76、及105-122的氨基酸序列、由这些氨基酸序列组成或基本上由这些氨基酸序列组成的多肽、以及其呈现基本上相同生物活性的变体、同源物及衍生物。
本文所用的术语“抗原性tau肽生物活性”是指本发明抗原性tau肽在个体中诱导具有拮抗性质的自身tau抗体的能力，所述自身抗体能够降低高度磷酸化的致病形式的tau的含量，同时基本上不能够结合正常的非高度磷酸化、非致病形式的tau。此外，可对具有抗原性tau肽生物活性的抗原性tau肽进行设计以使施用至患者后tau特异性T细胞应答降低至最低程度。本领域技术人员应明了可使用何种技术来证实特定构建体是否在本发明范围内。这些技术包括(但不限于)本发明实施例部分中所述的技术以及以下技术。可对具有推定抗原性tau肽生物活性的肽进行分析以确定该肽的免疫原性(例如，确定由推定肽产生的抗血清是否结合高度磷酸化形式的tau，而基本上不结合非高度磷酸化、非致病形式的tau)。此外，可对具有推定抗原性tau肽生物活性的肽进行分析以确定该肽是否实质上诱导tau特异性T细胞介导的应答。
本文所用的术语“高度磷酸化”或“异常磷酸化”是指每个tau分子含有至少约7个(即约7个或更多个)磷酸酯基团的tau(参见，例如Kopke等人，J.Biol Chem 268：24374-84(1993))。高度磷酸化tau是发现于AD患者中的神经原纤维缠结(NFT)及成对螺旋纤维(PHF)的主要组份，且高度磷酸化是造成tau的正常生物活性丧失及自聚集的原因。一些tau残基通常仅在其致病的高度磷酸化形式(例如PHF及NFT)中被发现为磷酸化。这些残基包括Ser-202、Thr-205、Thr-212、Ser-214、Thr-231、Ser-235、Ser-396和/或Ser-404、Tyr-18。因此，在通常不参与tau与微管的结合的多个位点上、尤其在tau的微管结合区域两侧的脯氨酸富集区域中发现的位点上磷酸化且包含PHF及NFT的主要组份的tau蛋白也涵盖于术语高度磷酸化tau或异常磷酸化tau的范围内。
抗原性tau肽
人类tau蛋白是微管相关蛋白，其在中枢神经系统的神经元中相对富集，但在其他区域中并不常见。在脑组织中，作为tau基因的外显子2、3及10的可变剪接的结果，tau以六种不同同种型存在。对于本发明的所有tau肽，人类tau同种型2(SEQ ID NO：30)在本文中被用作氨基酸编号的参考。Tau通常与微管蛋白相互作用以稳定微管并促进微管蛋白组装成微管，以及提供蛋白质的轴突运输。Tau是由发育调控的磷蛋白，在成人脑中在正常状态下通常每个分子含有2个至3个磷酸酯基团。然而，tau可在多于30个不同残基处、主要在Ser/Thr-Pro基序处经不同激酶短暂磷酸化(Hanger等人，J.Neurochem.71：2465-2476(1998))。
本发明的抗原性tau肽通常具有较小大小，由此他们模拟了选自整个tau蛋白的区域，在其中发现了致病形式的tau中的表位。如先前所述，此类致病形式的tau通常特征在于tau蛋白内某些氨基酸处经磷酸化。因此，本发明的抗原性tau肽的长度通常小于100个氨基酸，例如小于75个氨基酸，例如小于50个氨基酸。本发明的抗原性tau肽的长度通常为约3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或约30个氨基酸。序列表中提供的本发明抗原性tau肽的具体实施例包括长度介于4个至31个氨基酸范围内的肽。本领域技术人员应明了，此类抗原肽通常具有游离N端，且可具有羧基化或酰胺化的C端。
本发明的抗原肽包含衍生自高度磷酸化或致病形式的人类tau的一部分的氨基酸序列。具体而言，此类抗原性tau肽通常包含特异性磷酸-tau表位，其在文献中可参考结合此类表位的抗体而提及(例如PHF1、TG3、AT8和/或AT100；参见，例如Hanger等人，J.Biol.Chem.282(32)：23645-23654(2007)；Pennanen等人，Biochem.Biophys.Res.Comm.337：1097-1101(2005)；Porzig等人，Biochem.Biophys.Res.Comm.358：644-649(2007))。
本发明已识别出人类tau蛋白的特异性抗原区，当单独或彼此组合使用时其可有利地用于引发针对致病形式的高度磷酸化tau的免疫应答。例如，pSer-396磷酸-tau表位通常为包括磷酸化丝氨酸残基Ser-396恶人类tau片段。此类片段的长度通常为约3个至约20个氨基酸(例如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个)，且在Ser-396的N端及C端侧包括至少一个来自天然人类tau序列的氨基酸。例如，pSer-396磷酸-tau表位通常包含如SEQ ID NO：30中所示人类tau序列的残基395、396及397(即Lys-395Ser-396Pro-397，其中Ser-396经磷酸化)。这些pSer-396表位还可进一步包含天然人类序列的磷酸化丝氨酸残基Ser-404。包含pSer-396磷酸-tau表位的tau肽的实例以SEQ ID NO：4及6-13提供。
此外，例如，pThr-231/pSer-235磷酸-tau表位通常是包括磷酸化苏氨酸残基Thr-231及磷酸化丝氨酸残基Ser-235二者的人类tau片段。或者，pThr-231/pSer-235磷酸-tau表位仅包括Thr-231或Ser-235之一。此类表位的长度通常为约3个至约20个氨基酸(例如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个)，且在Thr-231的N端侧包括至少一个来自天然人类tau序列的氨基酸(即Arg-230)和/或在Ser-235的C端侧包括至少一个氨基酸(即Pro-236)。包含pThr-231/pSer-235表位的tau肽的实例以SEQ ID NO：14-19提供。
此外，例如，pThr-212/pSer-214磷酸-tau表位通常为包括磷酸化苏氨酸残基Thr-212及磷酸化丝氨酸残基Ser-214的人类tau片段。此类表位的长度通常为约3个至约20个氨基酸(例如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个)，且在Thr-212的N端侧包括至少一个来自天然人类tau序列的氨基酸(即Arg-211)及在Ser-214的C端侧包括至少一个氨基酸(即Leu-215)。包含pThr-212/pSer-214表位的tau肽的实例以SEQ ID NO：20-24提供。
此外，例如，pSer-202/pThr-205磷酸-tau表位通常为包括磷酸化丝氨酸残基Ser-202及磷酸化苏氨酸残基Thr-205的人类tau片段。此类表位的长度通常为约6个至约20个氨基酸(例如6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个)，且在Ser-202的N端侧通常包括至少一个来自天然人类tau序列的氨基酸(即Gly-201)及在Thr-205的C端侧包括至少一个氨基酸(即Pro-206)。包含pSer-202/pThr-205表位的tau肽的实例以SEQ ID NO：25提供。
此外，例如，pTyr-18磷酸-tau表位通常为包括磷酸化酪氨酸残基Tyr-18的人类tau片段。此类表位的长度通常为约6个至约20个氨基酸(例如6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个)，且在Tyr-18的N端侧通常包括至少一个来自天然人类tau序列的氨基酸(即Thr-17)及在Tyr-18的C端侧包括至少一个氨基酸(即Gly-19)。包含pTyr-18表位的tau肽的实例以SEQ ID NO：112提供。
本发明的抗原性tau肽还可包括包含上文所述磷酸-tau表位的tau肽，包括少数氨基酸已经取代、添加或缺失但基本上仍保留相同免疫特性的肽。另外，此类衍生的抗原性tau肽可进一步经氨基酸修饰，尤其在N端及C端末端，以使抗原性tau肽在构象上受局限和/或使抗原性tau肽与免疫原性载体在实施适当化学处理后偶合。
本发明的抗原性tau肽还涵盖衍生自氨基酸已经缺失、插入或取代但其免疫特性基本上未减弱的tau的氨基酸序列的功能活性变体肽，即此类功能变体肽保留实质的抗原性tau肽生物活性。通常，此类功能变体肽与任何SEQ ID NO：1至26、31至76及105-122中所述的氨基酸序列具有氨基酸序列同源性，优选高度同源性。
在一个方面中，所述功能活性变体肽呈现与选自由SEQ ID NO：1至26、31至76及105-122组成的组的氨基酸序列至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的一致性。
多肽的氨基酸序列一致性可使用诸如Bestfit、FASTA或BLAST等公知的计算机程序以常规方式来确定(参见，例如Pearson，Methods Enzymol.183：63-98(1990)；Pearson，Methods Mol.Biol.132：185-219(2000)；Altschul等人，J.Mol.Biol.215：403-410(1990)；Altschul等人，Nucelic Acids Res.25：3389-3402(1997))。当使用Bestfit或任何其他序列比对程序来确定特定序列是否与参考氨基酸序列(例如)95％一致时，可设置参数以在参考氨基酸序列的全长范围内计算一致性百分比，且容许引入占参考序列中的全部氨基酸残基高达5％的同源性空位(gap)。此上文提及的确定多肽间一致性百分比的方法可适用于本文所公开的所有蛋白质、其片段或变体。
功能活性变体包含天然存在的功能活性变体，例如等位基因变体及种类变体(species variant)；以及可通过例如诱变技术或通过直接合成来制备的非天然存在的功能活性变体。
功能活性变体与SEQ ID NO：1至26及31至76中所示的任一种肽相差约例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸残基，但仍保留抗原tau生物活性。当此种比较需要进行比对时，可针对最大同源性对序列进行比对。变化位点可位于肽中的任何地方，只要生物活性与任何SEQ ID NO：1至26、31至76及105-122中所示的肽基本上类似即可。
关于如何实施表型沉默氨基酸取代的指导在Bowie等人，Science，247：1306-1310(1990)中有提供，该文献指出，主要有两种策略用于研究氨基酸序列对变化的耐受性。
第一种策略利用进化过程期间自然选择的氨基酸取代耐受性。通过比较不同物种中的氨基酸序列，可识别在各物种间保守的氨基酸位置。此类保守氨基酸对于蛋白质功能可能非常重要。相比之下，自然选择耐受的取代所处的氨基酸位置表示对于蛋白质功能并不重要的位置。因此，可对耐受氨基酸取代的位置进行修饰，同时仍保留经修饰肽的特定免疫原性活性。
第二种策略利用基因工程在克隆基因的特定位置上引入氨基酸变化以识别对于蛋白质功能极为重要的区域。例如，可利用定点诱变或丙氨酸扫描诱变(Cunningham等人，Science，244：1081-1085(1989))。随后可针对特定抗原tau生物活性对所得变体肽进行测试。
按照Bowie等人，所述两种策略揭示蛋白质对于氨基酸取代令人惊奇地耐受。作者进一步指出在蛋白质中的某些氨基酸位置上何种氨基酸变化可能是许可的。例如，最隐匿或最内部(在蛋白质的三级结构中)的氨基酸残基需要非极性侧链，然而很少表面或外部侧链特征通常是保守的。
向蛋白质的氨基酸中引入突变的方法已为本领域技术人员所熟知(参见，例如，Ausubel(编辑)，Current Protocols in Molecular Biology，John Wileyand Sons公司(1994)；T.Maniatis，E.F.Fritsch及J.Sambrook，MolecularCloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor laboratory，Cold SpringHarbor，N.Y.(1989))。
还可使用诸如“QuikChangeTM定点诱变试剂盒”(Stratagene)等市售试剂盒来引入突变。本领域技术人员能够通过替代不显著影响抗原性tau肽的功能的氨基酸来制备该抗原性tau肽的功能活性变体。保守氨基酸取代是可在本发明肽之一中实施的一种氨基酸取代。“保守氨基酸取代”为其中一氨基酸残基由另一具有有着相似化学特性(例如，电荷或疏水性)的侧链R基团的氨基酸残基所取代的取代。通常，保守氨基酸取代不会实质改变蛋白质的功能特性。在其中两个或更多个氨基酸序列因保守取代而彼此不同的情形下，可上调百分比序列一致性或相似度以校正取代的保守性质。用于进行此调整的方法已为本领域技术人员所熟知(参见例如，Pearson，Methods Mol.Biol.243：307-31(1994))。
具有有着相似化学特性侧链的各组氨基酸的实例包括：1)脂肪族侧链：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸及异亮氨酸；2)脂肪族羟基侧链：丝氨酸及苏氨酸；3)含酰胺侧链：天冬酰胺及谷氨酰胺；4)芳香族侧链：苯丙氨酸、酪氨酸及色氨酸；5)碱性侧链：赖氨酸、精氨酸及组氨酸；6)酸性侧链：天冬氨酸及谷氨酸；以及7)含硫侧链：半胱氨酸及甲硫氨酸。优选的保守氨基酸取代基团为：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸及天冬酰胺-谷氨酰胺。
或者，保守替代是Gonnet等人，Science 256：1443-45(1992)中公开的PAM250对数相似度矩阵中具有正值的任何改变。“中度保守”替代是在PAM250对数相似度矩阵中具有非负值的任何改变。
功能活性变体肽还可使用杂交技术进行分离。简言之，使用与编码目标肽、多肽或蛋白质(例如SEQ ID NO：1至26、31至76及105-122)的完整或部份核酸序列具有高度同源性的DNA来制备功能活性肽。因此，本发明的抗原性tau肽还包括与任何SEQ ID NO：1至26及31至76具同等功能且可由与编码任何SEQ ID NO：1至26、31至76及105-122的核酸杂交的核酸分子编码的肽、或其互补序列。本领域技术人员可使用容易获得的密码子列表很容易即可决定编码本文所公开肽的核酸序列。因此，本文中并未提供此类核酸序列。
编码功能活性变体的肽、多肽或蛋白质的核酸的杂交严格性例如为10％甲酰胺、5×SSPE、1×Denhart溶液及1×鲑鱼精子DNA(低度严格条件)。更优选条件为25％甲酰胺、5×SSPE、1×Denhart溶液及1×鲑鱼精子DNA(中度严格条件)，更优选的条件为50％甲酰胺、5×SSPE、1×Denhart溶液及1×鲑鱼精子DNA(高度严格条件)。然而，除上述甲酰胺浓度外，数种因素会影响杂交严格性，且本领域技术人员可适当地选择此类因素以实现类似的严格性。
编码功能活性变体的核酸分子还可使用编码目标肽、多肽或蛋白质的核酸分子DNA的一部分(例如任何SEQ ID NO：1至26、31至76及105-122中所示的肽)作为探针，通过基因扩增方法(例如PCR)分离。
肽/蛋白质的制备
本发明多肽可衍生自天然来源及自哺乳动物分离得到，所述哺乳动物(例如)为人类、灵长类动物、猫、狗、马、小鼠或大鼠。因此，本发明多肽可使用标准蛋白质纯化技术自细胞或组织来源分离得到。
或者，多肽可由化学方式合成或使用重组DNA技术制备。例如，本发明多肽(例如tau片段)可通过本领域技术人员所熟知的固相程序合成。可使用“T-boc”或“F-moc”程序来适当地合成。环肽可使用熟知的“F-moc”程序及聚酰胺树脂在全自动设备中通过固相方法来合成。或者，本领域技术人员应了解手动实施此过程所需要的实验室程序。固相合成的技术及程序阐述于Solid Phase Peptide Synthesis：A Practical Approach，E.Atherton及R.C.Sheppard，由IRL在Oxford University Press出版(1989)；以及Methods  in Molecular Biology，第35卷：肽合成方案(M.W.Pennington及B.M.Dunn编辑)，第7章，第91-171页，D.Andreau等人著。
或者，可使用本领域技术人员所熟知的技术将编码本发明多肽的多核苷酸引入至可在适宜的表达系统中表达的表达载体中，随后分离或纯化所表达的目标多肽。本领域可得到各种细菌、酵母、植物、哺乳动物及昆虫表达系统，且可使用任何所述的表达系统。任选地，可在无细胞翻译系统中翻译编码本发明多肽的多核苷酸。
本发明的抗原性tau肽还可包含由于存在多种基因、选择性转录事件、选择性RNA剪接事件及选择性翻译及翻译后事件而产生者。多肽可在以下系统中表达：获得的翻译后修饰与在天然细胞中表达多肽时所存在的基本上相同的系统，例如培养的细胞；或导致在天然细胞中表达时存在的翻译后修饰(例如糖基化或裂解)改变或删除的系统。
本发明多肽(例如抗原tau多肽)可以含有其他非tau或非tau衍生氨基酸序列的融合蛋白形式来制备，此类其他非tau或非tau衍生氨基酸序列例如为本文所述的氨基酸接头或信号序列或免疫原性载体、以及可用于蛋白质纯化的配体，例如谷胱甘肽-S-转移酶、组氨酸标签及葡萄球菌蛋白质A。融合蛋白中可存在不止一种本发明抗原tau多肽。例如，可将异源多肽融合至本发明多肽的N端或C端。本发明多肽还可以包含同源氨基酸序列(即，其他tau或tau衍生序列)的融合多肽形式来制备。
受局限的肽
本发明的抗原性tau肽可以是线性的或在构象上受局限的。如本文所用，就分子而言，术语“构象上受局限”意指随时间流逝分子(例如多肽)的三维结构基本上保持一种空间排列。构象上受局限的分子可具有改良特性，例如增强的亲和性、免疫原性、代谢稳定性、膜通透性或溶解性。另外，预期此类构象上受局限的分子会以与天然构象类似的构象提供抗原tau表位，由此诱导更易识别自身tau分子的抗-tau抗体。构象局限方法已为本领域技术人员所熟知，且包括(但不限于)桥连及环化。
现有技术中已知数种向线性肽或多肽链中引入构象局限的途径。例如，使肽中的两个邻近氨基酸桥连产生局部构象修饰，与规则肽的弹性相比，其弹性有限。形成此类桥键的一些可能方式包括纳入内酰胺及六氢吡嗪酮(参见，例如Giannis及Kolter，Angew.Chem.Int.Ed.，32：1244(1993))。
如本文所用，就肽而言，术语“环状”是指在两个非毗邻氨基酸或氨基酸类似物之间包括分子内键的结构。环化可通过共价或非共价键来实现。分子内键包括(但不限于)骨架与骨架、侧链与骨架、侧链与侧链、侧链与端基、及端部与端部之间的键。环化方法包括(但不限于)在非毗邻氨基酸或氨基酸类似物的侧链之间形成二硫键；在Lys与Asp/Glu残基侧链之间形成酰胺键；在丝氨酸残基与Asp/Glu残基之间形成酯键；形成内酰胺键，例如，在一种氨基酸或其类似物的侧链基团与氨基末端残基的N端胺之间；及形成赖氨酸正亮氨酸及二酪氨酸键。还可使用碳形式的二硫键，例如乙烯基或乙基键(J.Peptide Sc.14：898-902(2008))，以及使用经适当多取代的亲电试剂(例如二-、三-或四卤代烷烃)实施烷基化反应(PNAS，105(40)，15293-15298(2008)；ChemBioChem，6：821-824(2005))。还可使用经各种修饰的脯氨酸类似物来向肽中纳入构象局限(Zhang等人，J.Med Chem.，39：2738-2744(1996)；Pfeifer及Robinson，Chem.Comm.，1977-1978(1998))。可利用化学方式使本发明肽环化，以产生利用包括但不限于以下键环化的肽：内酰胺、腙、肟、噻唑啶、硫醚或锍键。
设计构象受局限肽的另一途径(阐述于美国专利公开第2004-0176283号中)是将较短的目标氨基酸序列附着至模板上以产生环状受限肽。此类环肽不仅通过其模板在结构上保持稳定，由此提供可模仿病毒及寄生虫上的构象表位的三维构象，而且与线性肽相比其对血清中的蛋白水解降解更具抗性。美国专利公开第2004-0176283号进一步揭示构象受局限交联肽的合成，其通过制备骨架偶合至适当定位的氨基酸以稳定肽的超二级结构的合成氨基酸来实施。交联可通过使经正交保护的(2S，3R)-3-胺基脯氨酸残基的一级氨基与谷氨酸盐的适当定位的侧链羧基进行酰胺偶合来实现。已遵循该途径来制备CS蛋白质的构象受局限的四肽重复，其中至少一个脯氨酸由(2S，3R)-3-胺基脯氨酸替代，而且为引入侧链羧基，已纳入谷氨酸盐作为丙氨酸的替代。
交联策略还包括应用Grubbs闭环置换反应来形成经设计以模拟α-螺旋构象的“U型钉(stapled)”肽(Angew.Int.Ed.Engl.37：3281(1998)；JACS122：5891(2000))；使用多官能化糖类；使用氨基羧乙基硫色氨酸(tryptathionine)键(Chemistry Eu.J.24：3404-3409(2008))；以及利用迭氮化物与炔烃的“点击(click)”反应，该两种物质可以侧链氨基酸残基纳入或位于肽序列的骨架中(Drug Disc.Today 8(24)：1128-1137(2003))。还从文献中了解到，金属离子可通过螯合与金属阳离子配位的特定残基(例如组氨酸)来稳定线性肽的受局限构象(Angew.Int.Ed.Engl.42：421(2003))。类似地，可利用使用非天然酸及氨官能团或多氨及多酸官能团官能化线性肽序列、随后激活及形成酰胺键来实现环状结构。
根据一个实施例，通过使抗原性tau肽的两个非毗邻氨基酸(例如N端及C端氨基酸)彼此分子内共价键合来使该抗原性tau肽构象受局限。根据另一实施例，通过使本发明抗原性tau肽共价结合至支架分子来使其构象受限。根据又一实施例，抗原性tau简单受局限，即在一端(C端或N端)或通过不位于任一端的另一氨基酸偶合至支架分子。根据再一实施例，抗原性tau肽双重受限，即C端及N端均偶合至支架分子。
支架(也称为“平台(platform)”)可以是能够通过共价键合来减少抗原性tau肽可呈现的构象数量的任何分子。构象受局限支架的实例包括蛋白质及肽，例如脂质运载蛋白相关分子，例如含有β-桶的硫氧还蛋白及硫氧还蛋白样蛋白质、核酸酶(例如RNaseA)、蛋白酶(例如胰蛋白酶)、蛋白酶抑制剂(例如水蛭抑制剂(eglin)C)、抗体或其结构刚性片段、萤光蛋白(例如GFP或YFP)、芋螺毒素(conotoxin)、纤维连接蛋白III型结构域的环区域、CTLA-4及病毒样颗粒(VLP)。
其他适宜平台分子包括碳水化合物，例如琼脂糖。平台可为线性分子或例如闭合形成环的环形分子。平台通常与抗原性tau肽异源。与线性肽相比此类连接至平台的构象受限肽据认为对蛋白水解降解更具抗性。
根据一个实施例，支架是如本发明中所定义的免疫原性载体，例如异源载体蛋白或VLP。在另一实施例中，抗原性tau肽简单受限至免疫原性载体上。在又一实施例中，抗原性tau肽双重受限至免疫原性载体上。以此方式，抗原性tau肽形成构象受局限的环结构，已证实其为细胞内识别分子的特别适宜的结构。
可对本发明的抗原性tau肽进行修饰以便于偶联至平台上，例如通过在一端或两端添加末端半胱氨酸和/或通过添加接头序列，例如双甘氨酸头或尾、以赖氨酸残基封端的接头、或本领域技术人员所熟知的可实施此功能的任何其他接头。还可利用生物正交化学(Bioorthogonal chemistry)(例如上文所述的点击反应)将完整的肽序列偶合至载体上，由此避免任何区域化学及化学选择性问题。已知刚性接头(例如阐述于Jones等人，(Angew.Chem.Int.Ed.2002，41：4241-4244)中的)可引发改善的免疫应答，而且也可使用。在又一实施例中，使抗原性tau肽附着至多价模板上，其本身偶合至载体上，由此增加抗原密度(见下文)。多价模板可为适当官能化的聚合物或寡聚物，例如(但不限于)寡聚谷氨酸盐或壳寡糖(oligochitosan)。
Figure BDA0000141966330000231
所述接头可位于肽的N端、或位于肽的C端、或位于肽的两端。所述接头的长度可为0至10个氨基酸，例如0至6个氨基酸。或者，可添加或取代一或多个氨基酸的D-立体异构体形式以产生有益的衍生物，例如以增强肽的稳定性。
下文提供使用各种接头的示例性偶联组合(所有均在本发明范围内且构成各个实施例)：
肽-GGGGGC(SEQ ID NO：79)-支架；肽-GGGGC(SEQ ID NO：80)-支架；肽-GGGC(SEQ ID NO：81)-支架；肽-GGC-支架；肽-GC-支架；肽-C-支架；肽-GGGGGK(SEQ ID NO：82)；肽-GGGGK(SEQ ID NO：83)
肽-GGGK(SEQ ID NO：84)；肽-GGK；肽-GK；肽-K；肽-GGGGSC(SEQ IDNO：85)；肽-GGGSC(SEQ ID NO：86)；肽-GGSC(SEQ ID NO：87)；肽-GSC；肽-SC；肽-GGGGC(SEQ ID NO：80)；肽-GGGC(SEQ ID NO：81)；肽-GGC；肽-GC；CSGGGG(SEQ ID NO：88)-肽；CSGGG(SEQ ID NO：89)-肽；CSGG(SEQ ID NO：90)-肽；CSG-肽；CS-肽；CGGGG(SEQ ID NO：91)-肽；CGGG(SEQ ID NO：92)-肽；CGG-肽；CG-肽
下文提供使用各种接头及双重受限肽的示例例性偶联组合，其中载体可为一致的载体单体或差异的载体单体。在下文实施例中，GC接头可由上文所示例的GK接头或GSC接头中的任一者或本领域技术人员所熟知的任何其他接头取代：
载体-CGGGGG(SEQ ID NO：93)-肽-GGGGGC(SEQ ID NO：79)-载体；载体-CGGGG(SEQ ID NO：91)-肽-GGGGC(SEQ ID NO：80)-载体；载体-CGGG(SEQ ID NO：92)-肽-GGGC(SEQ ID NO：81)-载体；载体-CG-肽-GC-载体；载体-C-肽-C-载体
在一个实施例中，将末端半胱氨酸残基(若先前未存在于抗原性tau肽的氨基酸序列中)添加至包含SEQ ID NO：1至26中所示序列中的任一者或由其组成的抗原性tau肽的一端或两端以产生构象受局限的肽。
在另一实施例中，将包含可变数量的甘氨酸残基及一个末端半胱氨酸残基的GC接头添加至包含SEQ ID NO：1至26中所示序列中的任一者或由其组成的抗原性tau肽的一端或两端以产生构象受局限的肽。优选地，GC接头包含1至10个甘氨酸残基，更优选地，包含1、2、3、4或5个甘氨酸残基。
在再一实施例中，将包含可变数量的甘氨酸残基及一个末端半胱氨酸残基的GC接头添加至包含SEQ ID NO：1至26中所示序列中的任一者或由其组成的抗原性tau肽的一端，并将末端半胱氨酸残基(若先前未存在于抗原性tau肽的另一端)添加至抗原性tau肽的另一端。优选地，GC接头包含1至10个甘氨酸残基，更优选地，包含1、2、3、4或5个甘氨酸残基。免疫原性载体
在本发明的一个实施例中，将本发明的抗原性tau肽或多肽连接至免疫原性载体分子以形成供疫苗接种方案用的免疫原。术语“免疫原性载体”在本文中包括以下物质：具有独立地在宿主动物中引发免疫原性应答的特性，且可连接(例如共价偶合)至肽、多肽或蛋白质，此连接是直接经由在肽、多肽或蛋白质的游离羧基、氨基或羟基与免疫原性载体物质的对应基团之间形成肽或酯键，或另一选择为通过经常用双功能连接基团或以融合蛋白形式键合。
本领域技术人员可容易地获知用于本发明免疫原中的载体类型。此类免疫原性载体的实例有：病毒样颗粒(VLP)；血清白蛋白，例如牛血清白蛋白(BSA)；球蛋白；甲状腺球蛋白；血红蛋白；血蓝蛋白(尤其钥孔血蓝蛋白(KLH))；提取自蛔虫的蛋白质；失活细菌毒素或类毒素，例如破伤风或白喉毒素(TT及DT)或CRM197；结核菌素的纯化蛋白质衍生物(PPD)；或来自流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)的蛋白质D(PCT公开第WO91/18926号)或其重组片段(例如，TT的片段C的结构域1、或DT的易位结构域、或包含流感嗜血菌蛋白质D的N端100个至110个氨基酸的1/3蛋白质D(GB 9717953.5))；聚赖氨酸；聚谷氨酸；赖氨酸-谷氨酸共聚物；含有赖氨酸或鸟氨酸的共聚物；脂质体载体等。
在一个实施例中，免疫原性载体为KLH。在另一实施例中，免疫原性载体为病毒样颗粒(VLP)，优选为重组病毒样颗粒。
本文所用的术语“病毒颗粒”是指病毒的形态形式。在一些病毒类型中，其包含由蛋白质衣壳包围的基因组；另一些病毒类型则具有其他结构，例如包膜、尾部等。
本文所用的术语“病毒样颗粒”(VLP)是指非复制性和/或非感染性病毒颗粒，或是指与病毒颗粒类似的非复制性和/或非感染性结构，例如病毒衣壳。本文所用的术语“非复制性”是指VLP所包含的基因组不能复制。本文所用的术语“非感染性”是指不能进入宿主细胞。在一个实施例中，由于病毒样颗粒缺少全部病毒基因组或基因组功能或其一部分而呈现非复制性和/或非感染性。例如，病毒样颗粒是病毒基因组已经以物理方式或以化学方式失活的病毒颗粒。此外，例如，病毒样颗粒缺少病毒基因组的全部复制性及感染性组件或其一部分。病毒样颗粒可含有不同于病毒基因组的核酸。病毒样颗粒的一个实例为病毒衣壳，例如相应病毒的病毒衣壳，例如噬菌体，例如RNA-噬菌体。术语“病毒衣壳”或“衣壳”是指由病毒蛋白亚基构成的大分子组装。例如，可有60、120、180、240、300、360及多于360个病毒蛋白亚基。此类亚基相互作用可形成具有内在重复组织结构的病毒衣壳或病毒衣壳样结构，其中该结构例如为球形或管形。
本文所用的术语“RNA噬菌体的病毒样颗粒”是指包含RNA噬菌体的外壳蛋白、其变体或片段、或基本上由其组成、或由其组成的病毒样颗粒。例如，RNA噬菌体的病毒样颗粒可能与非复制性和/或非感染性且至少缺少编码RNA噬菌体复制机构的基因的RNA噬菌体的结构类似，且也可缺少编码负责病毒附着至宿主或进入宿主的蛋白质的基因。然而，所述定义还应涵盖上述基因仍然存在但失活(且因此也导致产生RNA噬菌体的非复制性和/或非感染性病毒样颗粒)的RNA噬菌体的病毒样颗粒。在本发明中，术语“亚基”与“单体”在此上下文中可互换及等价使用。此外，在本发明中，术语“RNA-噬菌体(RNA-phage)”与术语“RNA-噬菌体(RNA-bacteriophage)”可互换使用。
本发明提供用于诱导和/或增强哺乳动物中针对磷酸化tau的免疫应答的组合物及方法。本发明组合物可包含与至少一种抗原性tau肽连接的病毒样颗粒(VLP)。例如，抗原性tau肽可连接至VLP以形成有序且重复的抗原-VLP阵列。例如，在一种情形下，至少20种、至少30种、至少60种、至少120种、至少180种、至少360种或至少540种本文所述肽连接至VLP。自RNA噬菌体外壳蛋白的180个亚基的自组装形成且任选含有宿主RNA的衣壳结构在本文中称为“RNA噬菌体外壳蛋白的VLP”。一具体实例为Qbeta外壳蛋白的VLP。在此特定情形下，Qbeta外壳蛋白的VLP可仅自Qbeta CP亚基(由Qbeta CP基因的表达而产生，所述Qbeta CP基因含有例如通过抑制来阻止较长A1蛋白质的任何表达的TAA终止密码子，参见Kozlovska，T.M.等人，Intervirology 39：9-15(1996))组装，或在衣壳组装中额外含有A1蛋白质亚基。通常，限制衣壳组装中Qbeta A1蛋白质相对于Qbeta CP的百分比以确保衣壳形成。
在本发明上下文中适宜作为免疫原性载体的VLP的实例包括(但不限于)以下衣壳蛋白：乙型肝炎病毒(Ulrich等人，Virus Res.50：141-182(1998))、麻疹病毒(Warnes等人，Gene 160：173-178(1995))、辛德毕斯病毒(Sindbis virus)、轮状病毒(美国专利第5,071,651号及第5,374,426号)、口蹄疫病毒(Twomey等人，Vaccine 13：1603-1610，(1995))、诺沃克病毒(Norwalkvirus)(Jiang，X.等人，Science 250：1580-1583(1990)；Matsui，S.M.等人，J Clin.Invest.87：1456-1461(1991))、反转录病毒GAG蛋白质(PCT公开案第WO96/30523号)、反转录转座子Ty蛋白质pl、乙型肝炎病毒的表面蛋白(PCT公开案第WO 92/11291号)、人类乳头瘤病毒(PCT公开案第WO 98/15631号)、人类多瘤病毒(Sasnauskas K.等人，Biol.Chem.380(3)：381-386(1999)；Sasnauskas K.等人，Generation of recombinant virus-like particles of differentpolyomaviruses in yeast，第3届国际研讨会“病毒样颗粒作为疫苗(Virus-likeparticles as vaccines)”，Berlin，9月26日-29日(2001))、RNA噬菌体、Ty、fr噬菌体(frphage)、GA-噬菌体、AP 205-噬菌体及特别是Qbeta-噬菌体。
本领域技术人员应容易地明了，要用作本发明免疫原性载体的VLP并不限于任何特定形式。颗粒可以化学方式或通过生物过程加以合成，其可为天然的或非天然的。例如，此类型的实例包括病毒样颗粒或其重组形式。在一更具体实施例中，VLP可包含已知形成VLP的任一病毒的重组多肽、或另一选择为由其组成。VLP可进一步包含此类多肽之一或多个片段以及此类多肽的变体、或另一选择为由其组成。多肽变体与其野生型对应物在氨基酸层面上可具有例如至少80％、85％、90％、95％、97％或99％的一致性。适用于本发明的变体VLP可衍生自任何生物体，只要其能够形成“病毒样颗粒”且可用作本发明所定义的“免疫原性载体”即可。
优选的本发明VLP包括HBV的衣壳蛋白或核心及表面抗原(分别为HBcAg及HBsAg)或其重组蛋白质或片段、及RNA-噬菌体的外壳蛋白或其重组蛋白质或片段，更优选地，Qbeta的外壳蛋白或其重组蛋白质或片段。在一个实施例中，与本发明抗原性tau肽组合使用的免疫原性载体为HBcAg蛋白质。本领域技术人员可容易地确定可用于本发明上下文中的HBcAg蛋白质的实例。实例包括(但不限于)阐述于以下文献中的HBV核心蛋白质：Yuan等人，J.Virol.73：10122-10128(1999)；及PCT公开第WO 00/198333号、第WO 00/177158号、第WO 00/214478号、第WO 00/32227号、第WO 01/85208号、第WO 02/056905号、第WO 03/024480号及第WO03/024481号。适用于本发明的HBcAg可衍生自任何生物体，只要其能够形成“病毒样颗粒”且可用作本发明所定义的“免疫原性载体”即可。
可用于本发明上下文中的特别感兴趣的HBcAg变体是其中一或多个天然存在的半胱氨酸残基已经缺失或取代的变体。本领域技术人员已熟知，游离半胱氨酸残基可参与诸多化学副反应，包括二硫化物交换、与例如注射或形成于与其他物质的组合疗法中的化学物质或代谢物反应、或暴露于UV光后直接氧化及与核苷酸反应。由此可产生毒性加合物，尤其考虑到HBcAg具有较强的结合核酸的趋势的事实。因此，此类毒性加合物会分布于诸多种物质中，其单独地可各自以低浓度存在，但合在一起即会达到毒性含量。有鉴于此，在疫苗组合物中使用已经修饰而移除天然存在的半胱氨酸残基的HBcAg的一个优点在于，当附着抗原或抗原决定簇时毒性物质可结合非人位点数量减少或完全消除。
另外，HBcAg的缺少乙型肝炎核心抗原前体蛋白的N端前导序列的经处理形式也可用于本发明上下文中，尤其当HBcAg是在不会发生处理作用的条件下产生时(例如于细菌系统中表达)。
本发明的其他HBcAg变体包括i)使用标准序列比较电脑算法与野生型HBcAg氨基酸序列之一或其子部分(subportion)至少80％、85％、90％、95％、97％或99％一致的多肽序列；ii)C端截短型突变体，包括至少1、5、10、15、20、25、30、34或35个氨基酸已经自C端移除的突变体；iii)N端截短型突变体，包括至少1、2、5、7、9、10、12、14、15或17个氨基酸已经自N端移除的突变体；iv)N端及C端均截短的突变体，包括至少1、2、5、7、9、10、12、14、15或17个氨基酸已经自N端移除且至少1、5、10、15、20、25、30、34或35个氨基酸已经自C端移除的HBcAg。
本发明范围内的另一些其他HBcAg变体蛋白质是经修饰以增强外来表位的免疫原性呈递的变体，其中4个精氨酸重复中之一或多个缺失，但仍保留C端半胱氨酸(参见例如PCT公开第WO 01/98333号)；及嵌合C端截短型HBcAg，例如阐述于PCT公开第WO 02/14478号、第WO 03/102165号及第WO 04/053091号中的内容。
在另一实施例中，与本发明抗原性tau肽组合使用的免疫原性载体是HBsAg蛋白质。本领域技术人员可容易地确定可用于本发明上下文中的HBsAg蛋白质。实例包括(但不限于)阐述于以下文献中的HBV表面蛋白：美国专利第5,792,463号、及PCT公开第WO 02/10416号及第WO 08/020331号。适用于本发明的HBsAg可源自任何生物体，只要其能够形成“病毒样颗粒”且可用作本发明所定义的“免疫原性载体”即可。
在又一实施例中，与本发明抗原性tau肽组合使用的免疫原性载体是Qbeta外壳蛋白。已发现，当Qbeta外壳蛋白表达于大肠杆菌(E.coli)中时，其自组装成衣壳(Kozlovska T.M.等人，GENE 137：133-137(1993))。所获得的衣壳或病毒样颗粒显示直径为25nm且T＝3准对称的二十面体噬菌体样衣壳结构。此外，已解析出噬菌体Qbeta的晶体结构。该衣壳含有180拷贝外壳蛋白，其以共价五聚体及六聚体通过二硫键连接(Golmohammadi，R.等人，Structure 4：5435554(1996))，使得Qbeta外壳蛋白的衣壳具有显著稳定性。Qbeta衣壳蛋白也显示对有机溶剂及变性剂不寻常的抗性。Qbeta外壳蛋白的衣壳的高度稳定性特别对于其在本发明上下文中于哺乳动物及人类的免疫及疫苗接种中的用途而言是一个有利的特征。
本领域技术人员可容易地确定可用于本发明上下文中的Qbeta外壳蛋白的实例。实例已详尽阐述于PCT公开第WO 02/056905号、第WO03/024480号、第WO 03/024481号中，且包括(但不限于)揭示于PIR数据库中的氨基酸序列，登记号为VCBPQbeta，称为Qbeta CP；登记号为AAA16663，称为Qbeta A1蛋白质；及其变体，包括N端甲硫氨酸已裂解的变体蛋白质；Qbeta A1的失去多达100个、150个或180个氨基酸的C端截短形式；通过缺失或取代而移除赖氨酸残基或通过取代或插入而添加赖氨酸残基的变体蛋白质(参见例如揭示于PCT公开第WO 03/024481号中的Qbeta-240、Qbeta-243、Qbeta-250、Qbeta-251及Qbeta-259)；及与本文所述的任何Qbeta核心蛋白质显示出至少80％、85％、90％、95％、97％或99％的一致性的变体。适用于本发明的变体Qbeta外壳蛋白可衍生自任何生物体，只要其能够形成“病毒样颗粒”且可用作本发明所定义的“免疫原性载体”即可。
键
本发明的抗原性tau肽可经由化学偶联或通过表达基因工程融合伴侣而偶合至免疫原性载体。偶合不一定需要直接偶合，而是可以通过接头序列来实施。更通常地，在抗原肽融合、偶联或以其他方式附着至免疫原性载体的情形下，通常将间隔区或接头序列添加至抗原肽的一端或两端。此类接头序列通常包含由蛋白酶体、核内体或细胞的其他囊泡室的蛋白酶识别的序列。
在一个实施例中，本发明肽以与免疫原性载体的融合蛋白形式表达。肽的融合可通过插入至免疫原性载体的基本序列中或通过融合至免疫原性载体的N端或C端来实现。在下文中，当提及肽与免疫原性载体的融合蛋白时，涵盖融合至亚基序列的任一端或将肽内部插入于载体序列中。如下文中所提及，融合可通过将抗原肽插入至载体序列中、通过使用抗原肽取代载体序列的一部分、或通过缺失、取代或插入的组合来实施。
当免疫原性载体是VLP时，嵌合的抗原肽-VLP亚基通常能够自组装成VLP。展示融合至其亚基的表位的VLP在本文中也称为嵌合VLP。例如，EP 0 421 635B阐述在病毒样颗粒中使用嵌合的嗜肝性DNA病毒(hepadnavirus)核心抗原颗粒来呈递外来肽序列。
侧翼氨基酸残基可添加至要融合至VLP亚基序列的任一端的抗原肽序列的任一端，或用于将该肽序列内部插入至VLP的亚基序列中。甘氨酸及丝氨酸残基是用于添加至要融合肽的侧翼序列中的特别有利的氨基酸。甘氨酸残基赋予额外弹性，这可以降低将外来序列融合至VLP亚基序列中的潜在不稳定效应。
在本发明的一具体实施例中，免疫原性载体是HBcAg VLP。已阐述抗原肽融合至HBcAg的N端的融合蛋白(Neyrinck，S.等人，Nature Med.5：11571163(1999))或插入于所谓的主要免疫显性区(MIR)中(Pumpens等人，Intervirology 44：98-114(2001)；PCT公开第WO 01/98333号)，且为本发明的具体实例。也已经阐述了天然存在的MIR缺失的HBcAg变体(Pumpens等人，Intervirology 44：98-114(2001))，且融合至N端或C端以及插入于与野生型HBcAg相比对应于缺失位点的MIR位置是本发明的其他实例。也已经阐述了融合至C端(Pumpens等人，Intervirology 44：98-114(2001))。本领域技术人员将容易地找到如何使用经典分子生物学技术来构建融合蛋白的指导。已阐述了编码HBcAg及HBcAg融合蛋白且可用于表达HBcAg及HBcAg融合蛋白的载体及质粒(Pumpens等人，Intervirology 44：98-114(2001)；Neyrinck，S.等人，Nature Med.5：1157-1163(1999))，且可用于实施本发明。使自组装及要插入于HBcAg MIR中的表位展示的效率最佳化的重要因素是所选择的插入位点，以及插入后MIR内要从HBcAg序列缺失的氨基酸的数量(欧洲专利第EP 0421635号；美国专利第6,231,864号)，或换言之要使用新表位取代的形成HBcAg的氨基酸的数量。例如，已阐述使用外来表位来取代HBcAg氨基酸76-80、79-81、79-80、75-85或80-81(Pumpens等人，Intervirology 44：98-114(2001)；欧洲专利第EP 0421635号；美国专利第6,231,864号；PCT专利公开第WO00/26385号)。HBcAg含有对于衣壳组装及能够结合核酸非必要的较长精氨酸尾部。包含或缺少此精氨酸尾部的HBcAg是本发明的两个实例。
在本发明的另一具体实施例中，免疫原性载体是RNA噬菌体的VLP，优选为Qbeta。在细菌以及特别是大肠杆菌中表达之后，RNA噬菌体的主要外壳蛋白自发组装成VLP。已阐述了抗原肽已经融合至截短形式Qbeta的A1蛋白质的C端或插入于A1蛋白质内部的融合蛋白构建体(Kozlovska等人，Intervirology，39：9-15(1996))。所述A1蛋白质是通过抑制UGA终止密码子而产生，且其具有329个氨基酸，或者若将N端甲硫氨酸的裂解考虑在内则具有328个氨基酸的长度。丙氨酸(由Qbeta CP基因编码的第二氨基酸)之前的N端甲硫氨酸的裂解通常发生于大肠杆菌中，且Qbeta外壳蛋白的N端即为此种情况。A1基因的该部分(UGA琥珀密码子的3′端)编码具有195个氨基酸长度的CP延伸部分。在CP延伸部分的位置72与73之间插入抗原肽获得本发明的其他实例(Kozlovska等人，Intervirology 39：9-15(1996))。将抗原肽融合于C端截短型Qbeta A1蛋白质的C端获得本发明的其他优选实例。例如，Kozlovska等人，Intervirology，39：9-15(1996)阐述了表位融合于位置19处经截短的Qbeta CP延伸部分的C端的Qbeta Al蛋白质融合物。
如Kozlovska等人，Intervirology，39：9-15(1996)所述，展示融合表位的颗粒的组装通常需要存在A1蛋白质-抗原融合物及野生型CP二者以形成镶嵌颗粒(mosaic particle)。然而，包含病毒样颗粒且由此特别是RNA噬菌体Qbeta外壳蛋白的VLP(其仅由与抗原肽融合的VLP亚基构成)的实施例也在本发明范围内。
镶嵌颗粒的产生可以多种方式实施。Kozlovska等人，Intervirology39：9-15(1996)阐述了三种方法，所有方法均可用于实施本发明。在第一种途径中，融合表位于VLP上的有效展示是由编码Qbeta A1蛋白质融合物的质粒在大肠杆菌菌株中的表达来介导的，该融合物在CP与CP延伸部分之间具有UGA终止密码子，所述大肠杆菌菌株含有编码克隆UGA抑制基因tRNA的质粒，这使得UGA密码子翻译至Trp(pISM3001质粒中(Smiley等人，Gene 134：33-40(1993))。在另一种途径中，将CP基因终止密码子修饰成UAA，且将表达A1蛋白质-抗原融合物的第二质粒共转化。第二质粒编码不同的抗生素抗性，且复制起始点与第一质粒一致。在第三种途径中，CP及A1蛋白质-抗原融合物以双顺反子方式编码，且可操作地连接至诸如Trp启动子等启动子，如Kozlovska等人，Intervirology，39：9-15(1996)的图1中所述。
适于融合抗原或抗原决定簇的其他VLP在PCT公开第WO 03/024481号中有阐述，且包括噬菌体fr、RNA噬菌体MS-2、乳头瘤病毒的衣壳蛋白、反转录转座子Ty、酵母以及反转录病毒样颗粒、HIV2 Gag、豇豆花叶病毒(Cowpea Mosaic Virus)、细小病毒VP2 VLP、HBsAg(美国专利第4,722,840号及欧洲专利第EP 0020416B1号)。适于实施本发明的嵌合VLP的实例也有Intervirology 39：1(1996)中所公开的那些。涵盖用于本发明的VLP的其他实例有：HPV-1、HPV-6、HPV-11、HPV-16、HPV-18、HPV-33、HPV-45、CRPV、CPOV、HIV GAG及烟草花叶病毒。其他实施例包括SV-40、多瘤病毒、腺病毒、单纯疱疹病毒、轮状病毒及诺沃克病毒的VLP。
对于构成本发明的一部分的任何重组表达肽或蛋白质(包括偶合或未偶合至免疫原性载体的本发明抗原性tau肽)，编码该肽或蛋白质的核酸也构成本发明的一方面，包含所述核酸的表达载体以及含有所述表达载体的宿主细胞(自发地或染色体插入)也是如此。通过将肽或蛋白质表达于上文宿主细胞中并从宿主细胞分离免疫原以重组产生肽或蛋白质的方法是本发明的又一方面。
在另一实施例中，使用本领域技术人员所熟知的技术将本发明肽化学偶合至免疫原性载体。可以如下方式实施偶联：经由单点偶联(例如N端或C端点)以容许肽自由移动或作为肽的两端均偶联至免疫原性载体蛋白质或支架结构(例如VLP)的锁定结构(locked down structure)。该偶联可通过本领域技术人员所熟知的偶联化学来实施，例如通过半胱氨酸残基、赖氨酸残基或通常已知作为偶联点的其他羧基部分，例如谷氨酸或天冬氨酸。因此，例如，对于直接共价偶合，可使用碳化二亚胺、戊二醛或(N-[y-马来酰亚胺基丁酰氧基]琥珀酰亚胺酯，使用诸如CDAP及SPDP等常见市售异型双功能接头(使用制造商说明书)。肽(尤其环肽)与蛋白质载体通过酰肼肽衍生物的偶联的实例在PCT公开第WO 03/092714号中有阐述。在偶合反应后，可借助透析方法、凝胶过滤方法、分级分离方法等容易地分离及纯化免疫原。以半胱氨酸残基封端的肽(优选地在环状区域外部有接头)可经由马来酰亚胺化学方便地偶联至载体蛋白。
当免疫原性载体是VLP时，可将数种具有相同氨基酸序列或不同氨基酸序列的抗原肽偶合至单一VLP分子，优选产生重复且有序的结构，以定向方式呈递数个抗原决定簇，如PCT公开第WO 00/32227号、第WO03/024481号、第WO 02/056905号及第WO 04/007538号中所述。
在本发明的一个方面，抗原肽经由化学交联、通常且优选地通过使用异型双功能交联剂结合至VLP。数种异型双功能交联剂已为本领域技术人员所熟知。在一些实施例中，异型双功能交联剂含有可与第一附着位点反应的官能团，即与VLP或VLP亚基的赖氨酸残基的侧链氨基反应的官能团；及可与优选第二附着位点反应的另一官能团，即融合至抗原肽且任选地可实施还原反应的半胱氨酸残基。该程序的第一个步骤(通常称为衍生化)是VLP与交联剂的反应。该反应的产物是激活的VLP，其也称为激活载体。在第二个步骤中，使用诸如凝胶过滤或透析等标准方法来移除未反应的交联剂。在第三个步骤中，使抗原肽与激活的VLP反应，且此步骤通常称为偶合步骤。在第四个步骤中，可任选地通过例如透析来移除未反应的抗原肽。数种异型双功能交联剂已为本领域技术人员所熟知。这些包括优选的交联剂SMPH(Pierce)、Sulfo-MBS、Sulfo-EMCS、Sulfo-GMBS、Sulfo-SIAB、Sulfo-SMPB、Sulfo-SMCC、SVSB、SIA及其他交联剂，此类其他交联剂可购自例如Pierce化学公司(Rockford，IL，USA)并且具有一个对氨基具有反应性的官能团及一个对半胱氨酸残基具有反应性的官能团。上文提及的交联剂全部导致形成硫醚键。
适于实施本发明的另一类交联剂的特征在于偶合后在抗原肽与VLP之间引入二硫键。属于此类的优选交联剂包括例如SPDP及Sulfo-LC-SPDP(Pierce)。VLP与交联剂的衍生化程度可能受诸如下述各种实验条件影响：各反应伴侣(partner)的浓度、一种试剂相比于另一种试剂是否过量、pH、温度及离子强度。偶合度，即每一VLP亚基的抗原肽的量可通过改变上文所述的实验条件加以调节以与疫苗要求相匹配。
使抗原肽结合至VLP的另一种方法是使VLP表面上的赖氨酸残基与抗原肽上的半胱氨酸残基连接。在一些实施例中，可能需要含有半胱氨酸残基作为第二附着位点或作为其一部分的氨基酸接头与用于偶合至VLP的抗原肽进行融合。通常，弹性氨基酸接头较有利。氨基酸接头的实例选自由以下所组成的组：(a)CGG；(b)N端γ1-接头；(c)N端γ3-接头；(d)Ig铰链区；(e)N端甘氨酸接头；(f)(G)kC(G)n，其中n＝0至12且k＝0至5；(g)N端甘氨酸-丝氨酸接头；(h)(G)kC(G)m(S)i(GGGGS)n，其中n＝0至3，k＝0至5，m＝0至10，i＝0至2；(i)GGC；(k)GGC-NH2；(l)C端γ1-接头；(m)C端γ3-接头；(n)C端甘氨酸接头；(o)(G)nC(G)k，其中n＝0至12且k＝0至5；(p)C端甘氨酸-丝氨酸接头；(q)(G)m(S)t(GGGGS)n(G)oC(G)k，其中n＝0至3，k＝0至5，m＝0至10，t＝0至2，且o＝0至8。氨基酸接头的其他实例为免疫球蛋白的铰链区、甘氨酸丝氨酸接头(GGGGS)n及甘氨酸接头(G)n，所有均进一步含有半胱氨酸残基作为第二附着位点并且任选进一步含有甘氨酸残基。此类氨基酸接头的通常优选实例为N端γ1：CGDKTHTSPP(SEQ ID NO：94)；C端γ1：DKTHTSPPCG(SEQ ID NO：95)；N端γ3：CGGPKPSTPPGSSGGAP(SEQ ID NO：96)；C端γ3：PKPSTPPGSSGGAPGGCG(SEQ ID NO：97)；N端甘氨酸接头：GCGGGG(SEQ ID NO：98)及C端甘氨酸接头：GGGGCG(SEQ ID NO：99)。
当疏水性抗原肽结合至VLP时，尤其适于实施本发明的其他氨基酸接头是用于N端接头的CGKKGG(SEQ ID NO：100)或CGDEGG(SEQ ID NO：101)；或用于C端接头的GGKKGC(SEQ ID NO：102)及GGEDGC(SEQ IDNO：103)。对于C端接头，末端半胱氨酸任选经C端酰胺化。
在本发明的一些实施例中，位于肽C端的GGCG(SEQ ID NO：104)、GGC或GGC-NH2(“NH2”代表酰胺化)接头或位于肽N端的CGG是优选的氨基酸接头。通常，将甘氨酸残基插入于较大氨基酸与要用作第二附着位点的半胱氨酸之间以避免偶合反应中较大氨基酸的潜在空间位阻。在本发明的又一实施例中，使氨基酸接头GGC-NH2融合至抗原肽的C端。
存在于抗原肽上的半胱氨酸残基优选呈还原态与激活VLP上的异型双功能交联剂反应，即应当可以得到游离半胱氨酸或半胱氨酸残基与游离巯基。在半胱氨酸残基以氧化形式而起结合位点作用的情形下，例如，若其形成二硫键，则优选使用例如DTT、TCEP或p-巯基乙醇还原该二硫键。低浓度的还原剂适合PCT公开第WO 02/05690号中所述的偶合，而较高浓度会抑制偶合反应，如本领域技术人员所了解的，在此情形下应在偶合之前通过例如透析、凝胶过滤或反相HPLC移除还原剂或降低其浓度。
通过使用异型双功能交联剂按照上文所述的方法使抗原肽与VLP结合使得抗原肽与VLP能够以定向方式偶合。使抗原肽与VLP结合的其他方法包括使用碳化二亚胺EDC及NHS使抗原肽交联至VLP的方法。
在其他方法中，使用同型双功能交联剂使抗原肽附着至VLP，该交联剂例如为戊二醛、DSGBM[PEO]4、BS3(Pierce化学公司，Rockford，IL，USA)或其他已知的带有对VLP的胺基团或羧基具有反应性的官能团的同型双功能交联剂。
使VLP与抗原肽结合的其他方法包括其中VLP经生物素化并且抗原肽以抗生蛋白链菌素-融合蛋白形式表达的方法，或其中抗原肽与VLP二者均经生物素化的方法，例如PCT公开第WO 00/23955号中所述。在此情形下，可首先使抗原肽结合至抗生蛋白链菌素或抗生物素蛋白上，这通过调节抗原肽与抗生蛋白链菌素的比率以使在随后步骤中添加的VLP仍然能够结合游离的结合位点来实施。或者，可将所有组份混合于“一罐(one pot)”反应中。可以使用可得到可溶形式的受体及配体且能够交联至VLP或抗原肽的其他配体-受体对作为结合剂来使抗原肽结合至VLP上。或者，可使配体或受体融合至抗原肽，并由此介导与分别化学结合或融合至受体或配体的VLP的结合。还可通过插入或取代来实施融合。
若空间上容许，可将一个或多个抗原分子附着至RNA噬菌体外壳蛋白的衣壳或VLP的一个亚基上，这优选通过RNA噬菌体的VLP的暴露的赖氨酸残基。因此，RNA噬菌体外壳蛋白的VLP且特别是其Qbeta外壳蛋白VLP的一个具体特征是每一亚基可能偶合数种抗原。这能够产生密集的抗原阵列。
在本发明的一个实施例中，至少一种抗原或抗原决定簇与病毒样颗粒的分别结合及附着是通过病毒样颗粒的至少一个第一附着位点与抗原肽的至少一个第二附着位点之间分别相互作用及缔合来实施。
Qbeta外壳蛋白的VLP或衣壳在其表面上展示界定数量的赖氨酸残基，其具有给定的拓扑结构，其中三个赖氨酸残基指向衣壳内部并与RNA相互作用，而四个其他赖氨酸残基暴露于衣壳外部。这些给定特性有利于抗原附着至颗粒外部而非赖氨酸残基与RNA相互作用的颗粒内部。其他RNA噬菌体外壳蛋白的VLP在其表面上还具有给定数目的赖氨酸残基并具有此类赖氨酸残基的给定的拓扑结构。
在本发明的又一实施例中，第一附着位点是赖氨酸残基和/或第二附着位点包含巯基或半胱氨酸残基。在本发明的又一实施例中，第一附着位点是赖氨酸残基且第二附着位点是半胱氨酸残基。在又一些实施例中，抗原或抗原决定簇通过半胱氨酸残基结合至RNA噬菌体外壳蛋白的VLP的赖氨酸残基，并且特别结合至Qbeta外壳蛋白的VLP。
衍生自RNA噬菌体的VLP的另一优点是其在细菌中的表达量很高，这能够以担负得起的成本制备大量材料。而且，使用VLP作为载体能够以可变的抗原密度分别形成稳健的抗原阵列及缀合物。具体而言，使用RNA噬菌体的VLP、以及由此而特别使用RNA噬菌体Qbeta外壳蛋白的VLP能够实现非常高的表位密度。
在一些实施例中，免疫原性组合物可包含免疫原性缀合物的混合物，即免疫原性载体缀合至一种或数种抗原性tau肽。因此，此类免疫原性组合物可由氨基酸序列不同的免疫原性载体构成。例如，可制备包含“野生型”VLP及其中一或多个氨基酸残基已改变(例如，缺失、插入或取代)的经修饰VLP蛋白质的疫苗组合物。或者，可使用相同的免疫原性载体，但使其偶合至具有不同氨基酸序列的抗原性tau肽。
因此，本发明还涉及产生免疫原的方法，其包括：i)提供本发明抗原性tau肽；ii)提供本发明免疫原性载体，优选为VLP；及iii)将所述抗原性tau肽与所述免疫原性载体组合。在一个实施例中，所述组合步骤通过化学交联、优选地通过异型双功能交联剂来实施。
包含抗原性tau肽的组合物
本发明还涉及组合物，特别是还称为“对象免疫原性组合物”的免疫原性组合物，其包含本发明抗原性tau肽及任选存在的至少一种佐剂，该抗原性tau肽优选连接至免疫原性载体，更优选连接至VLP，更优选连接至HBsAg、HBcAg或Qbeta VLP。此类免疫原性组合物(特别是调配成药物组合物时)被认为可用于预防、治疗或减轻tau相关病症，例如阿尔茨海默病。
免疫原性组合物
在一些实施例中，本发明的对象免疫原性组合物包含抗原性tau肽，所述抗原性tau肽包含选自SEQ ID NO：1至26、31至76及105至122的氨基酸序列。在一些实施例中，所述抗原性tau肽连接至免疫原性载体，优选连接至VLP，更优选连接至HBsAg、HBcAg或Qbeta VLP。
包含本发明抗原性tau肽的对象免疫原性组合物可以诸多方式如下文更详细阐述那样进行调配。
在一些实施例中，对象免疫原性组合物包含单一种类的抗原性tau肽，例如，免疫原性组合物包含一群抗原性tau肽，基本上全部抗原性tau肽都具有相同的氨基酸序列。在其他实施例中，对象免疫原性组合物包含两种或更多种不同的抗原性tau肽，例如，免疫原性组合物包含一群抗原性tau肽，该群体成员的氨基酸序列可能有所不同。
例如，在一些实施例中，对象免疫原性组合物包含第一抗原性tau肽，其优选连接至免疫原性载体，更优选连接至VLP，更优选连接至HBsAg、HBcAg或Qbeta VLP，且包含选自SEQ ID NO：1至26、31至76及105至122的第一氨基酸序列；及至少一种第二抗原性tau肽，优选连接至免疫原性载体，更优选连接至VLP，更优选连接至HBsAg、HBcAg或Qbeta VLP，且包含优选选自SEQ ID NO：1至26、31至76及105至122的第二氨基酸序列，其中第二氨基酸序列与第一氨基酸序列相差至少1、2、3、4、5、6至10、或15个氨基酸。
作为另一实施例，对象免疫原性组合物包含第一抗原性tau肽，其优选连接至免疫原性载体，更优选连接至VLP，更优选连接至HBsAg、HBcAg或Qbeta VLP，且包含选自SEQ ID NO：1至26、31至76及105至122的第一氨基酸序列；第二抗原性tau肽，其优选连接至免疫原性载体，更优选连接至VLP，更优选连接至HBsAg、HBcAg或Qbeta VLP，且包含优选选自SEQ ID NO：1至26、31至76及105至122的第二氨基酸序列，其中第二氨基酸序列与第一氨基酸序列相差至少1、2、3、4、5、6至10、或15个氨基酸；及至少一种第三抗原性tau肽，其优选连接至免疫原性载体，更优选连接至VLP，更优选连接至HBsAg、HBcAg或Qbeta VLP，且包含优选选自SEQ ID NO：1至26、31至76及105至122的第三氨基酸序列，其中第三氨基酸序列与第一及第二氨基酸序列均相差至少1、2、3、4、5、6至10、或15个氨基酸。
在其他实施例中，对象免疫原性组合物包含如上文所述的多聚抗原性tau肽。本文所用的术语“包含抗原性tau肽的免疫原性组合物”或“本发明的免疫原性组合物”或“对象免疫原性组合物”是指包含单一种类(多聚或未多聚)或多种偶合或未偶合至免疫原性载体的抗原性tau肽的免疫原性组合物。
佐剂
在一些实施例中，对象免疫原性组合物包含至少一种佐剂。适宜的包括适用于哺乳动物、优选适用于人类的佐剂。可用于人类的已知适宜佐剂的实例包括(但不限于)明矾、磷酸铝、氢氧化铝、MF59TM(4.3％w/v角鲨烯、0.5％w/v聚山梨酯80(Tween 80)、0.5％w/v山梨醇酐三油酸酯(Span 85))、含CpG核酸(其中胞嘧啶未甲基化)、QS21(皂苷佐剂)、MPL(单磷酰脂质A)、3DMPL(3-O-去酰基化MPL)、沉香(Aquilla)提取物、ISCOMS(参见，例如，
Figure BDA0000141966330000381
等人，J.Leukocyte Biol.64：713(1998)；PCT公开第WO90/03184号、第WO 96/11711号、第WO 00/48630号、第WO 98/36772号、第WO 00/41720号、第WO 06/134423号及第WO 07/026190号)、LT/CT突变体、聚(D，L-丙交酯-共-乙交酯)(PLG)微粒、Quil A、白细胞介素及诸如此类。对于包括但不限于动物实验在内的兽医应用，可以使用弗氏佐剂(Freund′s)、N-乙酰基-胞壁酰基-L-苏胺酰基-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰基-正-胞壁酰基-L-丙胺酰基-D-异谷氨酰胺(CGP 11637，称为正-MDP)、N-乙酰基胞壁酰基-L-丙胺酰基-D-异谷氨酰胺基-L-丙氨酸-2-(1′-2′-二棕榈酰基-sn-甘油-3-羟基磷酰基氧基)-乙胺(CGP 19835A，称为MTP-PE)、及RIBI(其含有三种提取自细菌的组份)、单磷酰脂质A、海藻糖二霉菌酸酯及存于2％角鲨烯/Tween 80乳液中的细胞壁支架(MPL+TDM+CWS)。
可增强组合物效力的其他示例性佐剂包括但不限于：(1)水包油乳液配制品(含有或不含有其他特定免疫刺激剂，例如胞壁酰肽(见下文)或细菌细胞壁组份)，例如(a)MF59TM(PCT公开第WO 90/14837号；第10章，Vaccinedesign：the subunit and adjuvant approach，Powell&Newman编辑，PlenumPress 1995)，其含有5％角鲨烯、0.5％Tween 80(聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯)及0.5％Span 85(山梨醇酐三油酸酯)(任选含有共价连接至二棕榈酰基磷脂酰基乙醇胺的胞壁酰三肽(MTP-PE))，使用微射流均质机调配成亚微米粒子，(b)SAF，其含有10％角鲨烯、0.4％Tween 80、5％普朗尼克封闭聚合物(pluronic-blocked polymer)L121及thr-MDP，微流化成亚微米乳液或实施涡旋以产生较大粒径乳液，及(c)RIBITM佐剂体系(RAS)(Ribi Immunochem，Hamilton，MT)，其含有2％角鲨烯、0.2％Tween 80及一或多种细菌细胞壁组份，例如单磷酰脂质A(MPL)、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)及细胞壁支架(CWS)，优选为MPL+CWS(DETOXTM)；(2)皂苷佐剂，例如QS21、STIMULONTM(Cambridge Bioscience，Worcester，MA)、
Figure BDA0000141966330000382
(Isconova，Sweden)或免疫刺激复合物基质(Iscomatrix)
Figure BDA0000141966330000383
(Commonwealth SerumLaboratories，Australia)，可使用此类物质或自其产生的颗粒，例如ISCOM(免疫刺激复合物)，ISCOMS可不含其他洗涤剂，例如PCT公开第WO 00/07621号；(3)完全弗氏佐剂(CFA)及不完全弗氏佐剂(IFA)；(4)细胞因子，例如白细胞介素(例如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12(PCT公开第WO99/44636号)等)、干扰素(例如γ干扰素)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、肿瘤坏死因子(TNF)等；(5)单磷酰脂质A(MPL)或3-O-去酰基化MPL(3dMPL)，例如英国专利第GB-2220221号及欧洲专利第EP-A-0689454号，当与肺炎球菌糖一起使用时任选于实质上不存在明矾下使用，例如PCT公开第WO 00/56358号；(6)3dMPL与例如QS21和/或水包油乳液的组合，例如EP-A-0835318、EP-A-0735898、EP-A-0761231；(7)包含CpG基序的寡核苷酸[Krieg，Vaccine(2000)19：618-622；Krieg，Curr Opin Mol Ther(2001)3：15-24；Roman等人，Nat.Med.(1997)3：849-854；Weiner等人，PNAS USA(1997)94：10833-10837；Davis等人，J.Immunol(1998)160：870-876；Chu等人，J.Exp.Med(1997)186：1623-1631；Lipford等人，Ear.J.Immunol.(1997)27：2340-2344；Moldoveami等人，Vaccine(1988)16：1216-1224；Krieg等人，Nature(1995)374：546-549；Klinman等人，PNAS USA(1996)93：2879-2883；Ballas等人，J.Immunol，(1996)157：1840-1845；Cowdery等人，J.Immunol(1996)156：4570-4575；Halpern等人，Cell Immunol.(1996)167：72-78；Yamamoto等人，Jpn.J.Cancer Res.，(1988)79：866-873；Stacey等人，J.Immunol.，(1996)157：2116-2122；Messina等人，J.Immunol，(1991)147：1759-1764；Yi等人，J.Immunol(1996)157：4918-4925；Yi等人，J.Immunol(1996)157：5394-5402；Yi等人，J.Immunol，(1998)160：4755-4761；及Yi等人，J.Immunol，(1998)160：5898-5906；PCT公开第WO 96/02555号、第WO 98/16247号、第WO 98/18810号、第WO 98/40100号、第WO98/55495号、第WO 98/37919号及第WO 98/52581号]，即含有至少一种CG二核苷酸，其中胞嘧啶未甲基化；(8)聚氧乙烯醚或聚氧乙烯酯，例如PCT公开第WO 99/52549号；(9)聚氧乙烯山梨醇酐酯表面活性剂与辛苯昔醇的组合(PCT公开第WO 01/21207号)或聚氧乙烯烷基醚或酯表面活性剂与至少一种其他非离子型表面活性剂(例如辛苯昔醇)的组合(PCT公开第WO 01/21152号)；(10)皂苷及免疫刺激性寡核苷酸(例如CpG寡核苷酸)(PCT公开第WO 00/62800号)；(11)免疫刺激剂及金属盐颗粒，例如PCT公开第WO 00/23105号；(12)皂苷及水包油乳液，例如PCT公开第WO 99/11241号；(13)皂苷(例如QS21)+3dMPL+IM2(任选+固醇)，例如PCT公开第WO98/57659号；(14)可作为免疫刺激剂增强组合物功效的其他物质，例如胞壁酰肽，包括N-乙酰基-胞壁酰基-L-苏胺酰基-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-25乙酰基-正胞壁酰基-L-丙胺酰基-D-异谷氨酰胺(正-MDP)、N-乙酰基胞壁酰基-L-丙胺酰基-D-异谷氨酰胺基-L-丙氨酸-2-(1′-2′-二棕榈酰基-sn-甘油-3-羟基磷酰基氧基)-乙胺(MTP-PE)；(15)Toll样受体(toll-like receptor)(TLR)的配体，天然或合成的(例如，如Kanzler等人，Nature Med.13：1552-1559(2007)中所述)，包括TLR3配体，例如聚肌苷酸胞苷酸(polyl：C)及类似化合物，例如Hiltonol及安普济Ampligen。
在一个实施例中，本发明的免疫原性组合物包含至少一种佐剂。在一特定实施例中，所述佐剂是免疫刺激性寡核苷酸，且优选为CpG寡核苷酸。在一个实施例中，CpG寡核苷酸具有核酸序列5′TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 3′(CpG 7909；SEQ ID NO：27)。在另一实施例中，CpG寡核苷酸具有核酸序列5′TCGTCGTTTTTCGGTGCTTTT 3′(CpG 24555；SEQ ID NO：29)。SEQ ID NO：29的免疫刺激性寡核苷酸核酸序列与先前报导的免疫刺激性寡核苷酸(CpG 10103)5′TCGTCGTTTTTCGGTCGTTTT 3′(SEQ ID NO：28)的不同之处在于最靠近3′的CG二核苷酸的颠倒。此两种免疫刺激性寡核苷酸的活性具有惊人的相似性，这是因为先前已报导CpG寡核苷酸的免疫刺激活性取决于CpG基序的数量、CG二核苷酸两侧的序列、CpG基序的位置及各CpG基序之间的间距(Ballas等人，1996，J.Immunol.；Hartmann等人，2000，J.Immunol.；Klinman等人，2003，Clin.Exp.Immunol.)。如根据先前揭示内容所预期的那样，移除免疫刺激性寡核苷酸CpG 24555中最靠近3′的CG二核苷酸不会对此免疫刺激性寡核苷酸增强抗原特异性免疫应答的能力造成负面影响。CpG 24555呈现与CpG 10103相比类似的且在一些情形下增强的免疫刺激活性。
免疫刺激性寡核苷酸可为双链或单链。通常，双链分子在活体内更稳定，而单链分子具有增强的免疫活性。因此，在本发明的一些方面中，核酸优选为单链；且在其他方面中，核酸优选为双链。
对于任何本文所揭示的CpG序列(例如CpG 24555、CpG 10103及CpG7909)，核苷酸间键中的任一者可为硫代磷酸酯或磷酸二酯键。
术语“核酸”与“寡核苷酸”在本文中可互换使用，其意指多个核苷酸(即包含连接至磷酸酯基团及可交换有机碱基的糖(例如核糖或去氧核糖)的分子，所述有机碱基为经取代嘧啶(例如胞嘧啶(C)、胸苷(T)或尿嘧啶(U))或经取代嘌呤(例如腺嘌呤(A)或鸟嘌呤(G))。本文所用的此类术语是指寡核糖核苷酸(即去除磷酸酯的多核苷酸)及任何其他含有机碱基的聚合物。核酸分子可得自现有核酸来源(例如基因组DNA或cDNA)，但优选为合成的核酸分子(例如通过核酸合成来产生)。
在一个实施例中，免疫刺激性寡核苷酸可相比于天然RNA及DNA涵盖各种化学修饰及取代，包括核苷间磷酸二酯桥、β-D-核糖(去氧核糖)单元和/或天然核苷碱基(腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶)。化学修饰的实例已为本领域技术人员所熟知，且阐述于(例如)Uhlmann E.等人，(1990)，Chem.Rev.90：543；“Protocols for Oligonucleotides and Analogs”，Synthesis and Properties&Synthesis and Analytical Techniques，S.Agrawal编辑，Humana Press，Totowa，USA 1993；Crooke，S.T.等人，(1996)Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.36：107-129；及Hunziker J.等人，(1995)，Mod.Synth.Methods 7：331-417中。本发明寡核苷酸可具有一或多种修饰，其中相比于由天然DNA或RNA组成的具有相同序列的寡核苷酸，各修饰位于特定的核苷间磷酸二酯桥和/或位于特定的β-D-(去氧)核糖单元和/或位于特定的天然核苷碱基位置。
例如，寡核苷酸可包含一或多种修饰。此类修饰可选自：a)用经修饰核苷间桥替代位于核苷3′和/或5′端的核苷间磷酸二酯桥，b)用去磷桥替代位于核苷3′和/或5′端的磷酸二酯桥，c)用另一单元替代糖磷酸酯骨架中的糖磷酸酯单元，d)用经修饰糖单元替代β-D-核糖单元，及e)替代天然核苷碱基。
核酸还包括经取代的嘌呤及嘧啶，例如C-5丙炔嘧啶及7-去氮-7-经取代嘌呤修饰碱基(Wagner等人，1996，Nat.Biotechnol.14：840-4)。嘌呤及嘧啶包括(但不限于)腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸苷、5-甲基胞嘧啶、2-氨基嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤、2，6-二氨基嘌呤、次黄嘌呤、及其他天然及非天然存在的核碱基、经取代及未经取代的芳香族部分。其他此类修饰已为本领域技术人员所熟知。
经修饰碱基是在化学上与通常在DNA及RNA中所发现天然存在碱基(例如T、C、G、A及U)不同的任何碱基，但其与此类天然存在碱基共享基本化学结构。经修饰核苷碱基可选自(例如)次黄嘌呤、尿嘧啶、二氢尿嘧啶、假尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-胺基尿嘧啶、5-(C1-C6)-烷基尿嘧啶、5-(C2-C6)-烯基尿嘧啶、5-(C2-C6)-炔基尿嘧啶、5-(羟基甲基)尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羟基胞嘧啶、5-(C1-C6)-烷基胞嘧啶、5-(C2-C6)-烯基胞嘧啶、5-(C2-C6)-炔基胞嘧啶、5-氯胞嘧啶、5-氟胞嘧啶、5-溴胞嘧啶、N2-二甲基鸟嘌呤、2，4-二胺基-嘌呤、8-氮杂嘌呤、经取代7-去氮嘌呤(优选7-去氮-7-经取代和/或7-去氮-8-经取代嘌呤)、5-羟基甲基胞嘧啶、N4-烷基胞嘧啶(例如N4-乙基胞嘧啶)、5-羟基去氧胞苷、5-羟基甲基去氧胞苷、N4-烷基去氧胞苷(例如N4-乙基去氧胞苷)、6-硫去氧鸟苷、及硝基吡咯的去氧核糖核苷、C5-丙炔基嘧啶、及二胺基嘌呤(例如2，6-二胺基嘌呤)、肌苷、5-甲基胞嘧啶、2-胺基嘌呤、2-胺基-6-氯嘌呤、次黄嘌呤或天然核苷碱基的其他修饰。此列表是用于示例而并不应理解为具有限制性。
在本发明的一些方面，本文所述免疫刺激性寡核苷酸的CpG二核苷酸优选未甲基化。未甲基化CpG基序是未甲基化胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸序列(即未甲基化5′胞嘧啶以及随后的3′鸟苷，且通过磷酸酯键来连接)。在其他方面，CpG基序经甲基化。甲基化CpG基序是甲基化胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸序列(即甲基化5′胞嘧啶以及随后的3′鸟苷，且通过磷酸酯键来连接)。
在本发明的一些方面，免疫刺激性寡核苷酸可含有经修饰的胞嘧啶。经修饰的胞嘧啶是胞嘧啶的天然存在或非天然存在的嘧啶碱基类似物，其可替代此碱基且不损害寡核苷酸的免疫刺激活性。经修饰胞嘧啶包括(但不限于)5-经取代胞嘧啶(例如5-甲基-胞嘧啶、5-氟-胞嘧啶、5-氯-胞嘧啶、5-溴-胞嘧啶、5-碘-胞嘧啶、5-羟基-胞嘧啶、5-羟基甲基-胞嘧啶、5-二氟甲基-胞嘧啶、及未经取代或经取代的5-炔基-胞嘧啶)、6-经取代胞嘧啶、N4-经取代胞嘧啶(例如N4-乙基-胞嘧啶)、5-氮杂-胞嘧啶、2-巯基-胞嘧啶、异胞嘧啶、假异胞嘧啶、具有稠环系统的胞嘧啶类似物(例如N，N′-丙烯胞嘧啶或吩恶嗪)、及尿嘧啶及其衍生物(例如5-氟-尿嘧啶、5-溴-尿嘧啶、5-溴乙烯基-尿嘧啶、4-硫-尿嘧啶、5-羟基-尿嘧啶、5-丙炔基-尿嘧啶)。一些优选胞嘧啶包括5-甲基-胞嘧啶、5-氟-胞嘧啶、5-羟基-胞嘧啶、5-羟基甲基-胞嘧啶、及N4-乙基-胞嘧啶。在本发明的另一实施例中，胞嘧啶碱基经通用碱基(例如3-硝基吡咯、P-碱基)、芳香族环系统(例如氟苯或二氟苯)或氢原子(d间隔区)取代。
在本发明的一些方面，免疫刺激性寡核苷酸可含有经修饰的鸟嘌呤。经修饰的鸟嘌呤是鸟嘌呤的天然存在或非天然存在的嘌呤碱基类似物，其可替代此碱基而不损害寡核苷酸的免疫刺激活性。经修饰鸟嘌呤包括(但不限于)7-去氮鸟嘌呤、7-去氮-7-经取代鸟嘌呤、次黄嘌呤、N2-经取代鸟嘌呤(例如N2-甲基-鸟嘌呤)、5-胺基-3-甲基-3H，6H-噻唑并[4，5-d]嘧啶-2，7-二酮、2，6-二胺基嘌呤、2-胺基嘌呤、嘌呤、吲哚、腺嘌呤、经取代腺嘌呤(例如N6-甲基-腺嘌呤、8-侧氧基-腺嘌呤)、8-经取代鸟嘌呤(例如8-羟基鸟嘌呤及8-溴鸟嘌呤)、及6-硫鸟嘌呤。在本发明的另一实施例中，鸟嘌呤碱基经通用碱基(例如4-甲基-吲哚、5-硝基-吲哚、及K-碱基)、芳香族环系统(例如苯并咪唑或二氯-苯并咪唑、1-甲基-1H-[1，2，4]三唑-3-甲酰胺)或氢原子(d间隔区)取代。
在某些方面，寡核苷酸可包括经修饰核苷酸间键。此类经修饰键可部分抵抗降解(例如经稳定)。“经稳定的核酸分子”意指核酸分子对活体内降解(例如经由外切或内切核酸酶)具有相对强的抗性。稳定性可随长度或二级结构而变化。长度为数万至数十万碱基的核酸对活体内降解的抗性相对较强。对于较短核酸而言，二级结构可稳定且增强其效应。茎环结构的形成可稳定核酸分子。例如，若核酸的3′端对上游区域具有自身互补性而使其可向后折叠并形成茎环结构，则该核酸可变得稳定且呈现更强活性。
对于活体内应用而言，核酸优选对降解(例如经由内切及外切核酸酶)具有相对强抗性。已证实，修饰核酸骨架可在活体内施用时增强核酸活性。诸如茎环等二级结构可稳定核酸以对抗降解。或者，核酸稳定可经由磷酸酯骨架修饰来实现。优选的经稳定核酸具有至少部分硫代磷酸酯修饰骨架。硫代磷酸酯可使用采用氨基磷酸酯或H-磷酸酯化学物质的自动化技术来合成。芳基-及烷基-磷酸酯可如(例如)美国专利第4,469,863号中所述来制备；且烷基磷酸三酯(其中带电氧部分如美国专利第5,023,243号及欧洲专利第092,574号中所述经烷基化)可通过自动化固相合成使用市售试剂来制备。已阐述制备其他DNA骨架修饰及取代的方法(Uhlmann，E.及Peyman，A.(1990)Chem.Rev.90：544；Goodchild，J.(1990)Bioconjugate Chem.1：165)。具有CpG基序的2′-O-甲基核酸也造成免疫激活，与乙氧基修饰的CpG核酸一样。事实上，尚未发现任何骨架修饰可完全消除CpG效应，但可通过用5-甲基C替代C来显著降低该效应。具有硫代磷酸酯键的构造提供最大活性且保护核酸免受细胞内外切及内切核酸酶降解。其他经修饰核酸包括磷酸二酯修饰核酸、磷酸二酯与硫代磷酸酯核酸的组合、甲基磷酸酯、甲基硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、p-乙氧基、及其组合。此类组合中每种及其对免疫细胞的特定影响就CpG核酸而言更详细地论述于PCT公开第WO96/02555号及第WO 98/18810号及美国专利第6,194,388号及第6,239,116号中。此类经修饰核酸由于增强的核酸酶抗性、提高的细胞摄取、通过的蛋白质结合和/或改变了的细胞内定位而被认为可显示更强的刺激活性。
对于体内施用，核酸可与某种分子结合，该分子可导致与靶细胞(例如树突细胞、B细胞、单核细胞及天然杀伤(NK)细胞)表面的较高亲和力结合和/或提高靶细胞的细胞摄取，从而形成“核酸递送复合物”。可使用本领域熟知的技术使核酸以离子方式或共价方式与适宜分子结合。可使用多种偶合或交联剂，例如蛋白质A、碳化二亚胺、及3-(2-吡啶基二硫)丙酸N-琥珀酰亚胺基酯(SPDP)。或者可使用常规技术将核酸囊封于脂质体或病毒体中。
其他经稳定核酸包括(但不限于)非离子型DNA类似物，例如烷基-及芳基-磷酸酯(其中带电磷酸酯氧经烷基或芳基替代)、磷酸二酯及烷基磷酸三酯(其中带电氧部分经烷基化)。在一端或两端含有二醇(例如四乙二醇或六乙二醇)的核酸也已表达可实质上抵抗核酸酶降解。在一些实施例中，本发明免疫刺激性寡核苷酸可包括至少一种亲脂性经取代核苷酸类似物和/或嘧啶-嘌呤二核苷酸。
寡核苷酸可具有一个或两个可及5′端。可产生具有两个可及5′端的经修饰寡核苷酸，其是通过(例如)经3′-3′键附着两个寡核苷酸以生成具有一个或两个可及5′端的寡核苷酸来实现。3′-3′键可为磷酸二酯、硫代磷酸酯或任何其他经修饰核苷间桥。实现此类键的方法为本领域技术人员所熟知。例如，此类键已阐述于以下文献中：Seliger，H.等人，Oligonucleotide analogswith terminal 3′-3′-and 5′-5′-internucleotidic linkages as antisense inhibitors ofviral gene expression，Nucleosides&Nucleotides(1991)，10(1-3)，469-77；及Jiang等人，Pseudo-cyclic oligonucleotides：in vitro and in vivo properties，Bioorganic&Medicinal Chemistry(1999)，7(12)，2727-2735。
此外，可使用诸如三-或四-乙二醇磷酸酯部分等其他间隔区来制备3′端核苷之间的键并非磷酸二酯、硫代磷酸酯或其他经修饰桥的3′-3′连接寡核苷酸(Durand，M.等人，Triple-helix formation by an oligonucleotidecontaining one(dA)12and two(dT)12sequences bridged by two hexaethyleneglycol chains，Biochemistry(1992)，31(38)，9197-204；美国专利第5,658,738号及美国专利第5,668,265号)。或者，非核苷酸接头可使用标准亚磷酰胺化学而从乙二醇、丙二醇或无碱基去氧核糖(d间隔区)单元获得(Fontanel，Marie Laurence等人，Nucleic Acids Research(1994)，22(11)，2022-7)。可一次或多次纳入非核苷酸接头，或可将其彼此组合，从而使得要连接的两个寡核苷酸的3′端之间可存在任何期望的距离。
可通过经修饰核苷间桥来替代位于核苷3′和/或5′端的核苷间磷酸二酯桥，其中经修饰核苷间桥选自(例如)硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、NR1R2-胺基磷酸酯、硼烷磷酸酯、α-羟基苄基磷酸酯、磷酸-(C1-C21)-O-烷基酯、磷酸-[(C6-C12)芳基-(C1-C21)-O-烷基]酯、(C1-C8)烷基磷酸酯和/或(C6-C12)芳基磷酸酯桥、(C7-C12)-α-羟基甲基-芳基(例如揭示于PCT公开第WO95/01363号中的)，其中(C6-C12)芳基、(C6-C20)芳基及(C6-C14)芳基任选经卤素、烷基、烷氧基、硝基、氰基取代且其中R1及R2彼此独立地为氢、(C1-C18)-烷基、(C6-C20)-芳基、(C6-C14)-芳基、(C1-C8)-烷基，优选为氢、(C1-C8)-烷基，优选为(C1-C4)-烷基和/或甲氧基乙基，或R1及R2与携带其的氮原子一起形成可另外含有选自O、S及N的群的另一杂原子的5元或6元杂环。
通过去磷桥来替代位于核苷3′和/或5′端的磷酸二酯桥(去磷桥阐述于(例如)以下文献中：Uhlmann E.及Peyman A.，“Methods in MolecularBiology”，第20卷，“Protocols for Oligonucleotides and Analogs”，S.Agrawal编辑，Humana Press，Totowa 1993，第16章，第355页以后)，其中去磷桥选自(例如)以下去磷桥：甲缩醛、3′-硫代甲缩醛、甲基羟胺、肟、亚甲基二甲基-亚肼基、二甲砜和/或甲硅烷基。
本发明的免疫刺激性寡核苷酸可任选具有嵌合骨架。嵌合骨架是包含不止一种类型的键的骨架。在一个实施例中，嵌合骨架可由下式表示：5′Y1N1ZN2Y2 3′。Y1及Y2是具有1至10个核苷酸的核酸分子。Y1及Y2各自包括至少一个经修饰核苷酸间键。由于嵌合寡核苷酸中至少2个核苷酸包括骨架修饰，因而此类核酸是一类“经稳定免疫刺激性核酸”的实例。
对于嵌合寡核苷酸而言，应认为Y1与Y2彼此独立。此意指在同一分子中，Y1及Y2可各自具有或不具有彼此不同的序列及彼此不同的骨架键。在一些实施例中，Y1和/或Y2具有3至8个核苷酸。N1及N2是具有0至5个核苷酸的核酸分子，只要N1ZN2总共具有至少6个核苷酸即可。N1ZN2的核苷酸具有磷酸二酯骨架且不包括具有经修饰骨架的核酸。Z是免疫刺激性核酸基序，其优选选自本文所述的那些。
式Y1N1ZN2Y2的中心核苷酸(N1ZN2)具有磷酸二酯核苷酸间键，且Y1及Y2具有至少一个经修饰核苷酸间键，但可能具有不止一个经修饰核苷酸间键，或甚至可具有所有经修饰核苷酸间键。在优选实施例中，Y1和/或Y2具有至少两个或2个至5个经修饰核苷酸间键，或Y1具有5个经修饰核苷酸间键且Y2具有2个经修饰核苷酸间键。在一些实施例中，经修饰核苷酸间键是硫代磷酸酯修饰键、二硫代磷酸酯键或p-乙氧基修饰键。
核酸也包括骨架糖共价附着至除2′位的羟基及5′位的磷酸酯基团以外的低分子量有机基团的核酸。因此，经修饰核酸可包括′-O-烷基化核糖基团。此外，经修饰核酸可包括诸如阿拉伯糖或2′-氟阿拉伯糖等糖来代替核糖。因此，各核酸可具有不同骨架组成，由此含有任何可能组合的连接在一起的聚合物单元，例如肽-核酸(其具有氨基酸骨架及核酸碱基)。在一些实施例中，各核酸具有相同骨架组成。
糖磷酸酯骨架(即，糖磷酸酯骨架由糖磷酸酯单元组成)的糖磷酸酯单元(即β-D-核糖与核苷间磷酸二酯桥一起形成糖磷酸酯单元)可由另一单元替代，其中所述另一单元适于例如构建“吗啉基-衍生物”寡聚物(如(例如)Stirchak E.P.等人，(1989)Nucleic Acid Res.17：6129-41中所述)，即，例如，由吗啉基-衍生物替代；或构建聚酰胺核酸(“PNA”；如(例如)NielsenP.E.等人，(1994)Bioconjug.Chem.5：3-7中所述)，例如，由PNA骨架单元、例如2-胺基乙基甘氨酸替代。寡核苷酸可具有其他碳水化合物骨架修饰及替代，例如具有磷酸酯基团的肽核酸(PHONA)、锁核酸(LNA)、及骨架区段具有烷基接头或胺基接头的寡核苷酸。烷基接头可具有支链或无支链，经取代或未经取代，且为手性纯或外消旋混合物。
β-核糖单元或β-D-2′去氧核糖单元可由经修饰糖单元来替代，其中所述经修饰糖单元选自(例如)β-D-核糖、α-D-2′-去氧核糖、L-2′-去氧核糖、2′-F-2′-去氧核糖、2′-F-阿拉伯糖、′-O-(C1-C6)烷基-核糖，优选′-O-(C1-C6)烷基-核糖是2′-O-甲基核糖、′-O-(C1-C6)烯基-核糖、2′-[O-(C1-C6)烷基-O-(C1-C6)烷基]-核糖、2′-NH2-2′-去氧核糖、β-D-木-呋喃糖、α-阿拉伯呋喃糖、2，4-二去氧-β-D-赤藓-己-吡喃糖、及碳环(例如Froehler J.(1992)Am.Chem.Soc.114：8320中所述)和/或开链糖类似物(例如Vandendriessche等人(1993)，Tetrahedron 49：7223中所述)和/或二环糖类似物(例如Tarkov M.等人(1993)，Helv.Chim.Acta.76：481中所述)。
在一些实施例中，糖是2′-O-甲基核糖，对于一个或两个通过磷酸二酯或磷酸二酯样核苷间键连接的核苷酸而言尤其如此。
本发明寡核苷酸可使用多种本领域熟知程序中的任一种来从头合成。例如，b-氰基乙基亚磷酰胺方法(Beaucage，S.L.及Caruthers，M.H.，(1981)Tet.Let.22：1589)；核苷H-磷酸酯方法(Garegg等人，(1986)Tet.Let.27：4051-4054；Froehler等人，(1986)Nucl.Acid Res.14：5399-5407；Garegg等人，(1986)27：4055-4058；Gaffney等人，(1988)Tet.Let.29：2619-2622)。此类化学方法可通过多种市售自动化核酸合成仪来实施。此类寡核苷酸称作合成寡核苷酸。或者，可在质粒中大规模制造富含T的核酸和/或TG二核苷酸(参见Sambrook T.等人，“Molecular Cloning：A Laboratory Manual”，Cold Spring Harbor Iaboratory Press，New York，1989)，并将其分离成较小部分或以完整形式施用。可从现有核酸序列(例如基因组DNA或cDNA)使用已知技术来制备核酸，例如采用限制性酶、外切核酸酶或内切核酸酶的那些技术。
诸如硫代磷酸酯等经修饰骨架可使用采用氨基磷酸酯或H-磷酸酯化学物质的自动化技术来合成。芳基-及烷基-磷酸酯可如(例如)美国专利第4,469,863号中所述来制备，且烷基磷酸三酯(其中带电氧部分是如美国专利第5,023,243号中所述来烷基化)可通过自动化固相合成使用市售试剂来制备。已阐述制备其他DNA骨架修饰及取代的方法(例如Uhlmann，E.及Peyman，A.，Chem.Rev.90：544，1990；Goodchild，J.，Bioconjugate Chem.1：165，1990)。
以此方式制备的核酸称为分离的核酸。“分离的核酸”通常是指与一起自细胞、自细胞核、自线粒体或自染色质分离的组份及任何其他可视作杂质的组份分开的核酸。
在一些实施例中，可按照本领域技术人员所熟知的方法(参见例如PCT公开案第WO 03/024480号)将含CpG寡核苷酸与免疫原性载体简单地混合。在本发明的其他实施例中，可将含CpG寡核苷酸封装于VLP内(参见例如PCT公开第WO 03/024481号)。
在本发明上下文中佐剂的实例包括明矾；含CpG寡核苷酸，例如CpG7909、CpG 10103及CpG 24555；及基于皂苷的佐剂，例如免疫刺激复合物基质，其可单独或组合使用。
因此，本发明提供包含抗原性tau肽及至少一种佐剂的免疫原性组合物，所述抗原性tau肽优选包含选自由SEQ ID NO：1至26、31至76及105至122组成的组的氨基酸序列。所述抗原性tau肽优选连接至免疫原性载体，优选连接至VLP，更优选连接至HBsAg、HBcAg或Qbeta VLP。在一个实施例中，所述佐剂是基于皂苷的佐剂，优选为免疫刺激复合物基质。在另一实施例中，所述佐剂是明矾。在又一实施例中，所述佐剂含CpG寡核苷酸。优选地，所述佐剂是CpG 7909或CpG 10103。更优选，所述佐剂是CpG 24555。
在又一实施例中，所述至少一种佐剂包含两种佐剂，其优选选自由下列组成的组：明矾、基于皂苷的佐剂及含CpG寡核苷酸。在一优选实施例中，此类佐剂是明矾及含CpG寡核苷酸，优选为CpG 7909，优选为CpG10103，更优选为CpG 24555。在另一优选实施例中，此类佐剂是基于皂苷的佐剂，优选为免疫刺激复合物基质；及含CpG寡核苷酸，优选为CpG7909，优选为CpG 10103，更优选为CpG 24555。在另一优选实施例中，此类佐剂是明矾及基于皂苷的佐剂，优选为免疫刺激复合物基质。
在又一实施例中，所述至少一种佐剂包含三种佐剂，其优选选自由下列组成的组：明矾；基于皂苷的佐剂，优选为免疫刺激复合物基质；及含CpG寡核苷酸，例如CpG 7909、CpG 10103及CpG 24555。
配制品
本发明还提供包含本发明抗原性tau肽或其免疫原性组合物的药物组合物，其是与一或多种药物可接受的赋形剂的配制品形式。术语“赋形剂”在本文中用以描述除活性成份以外的任何成份，活性成份即为最终偶合至免疫原性载体且任选与一或多种佐剂组合的本发明抗原性tau肽。对赋形剂的选择在很大程度上取决于(例如)以下因素：具体施用方式、赋形剂对溶解性及稳定性的影响、及剂型的性质。本文所用的“药物可接受的赋形剂”包括任何及所有生理上相容的溶剂、分散介质、涂布剂、抗细菌剂及抗真菌剂、等渗剂及吸收延迟剂、及诸如此类。药物可接受的赋形剂的一些实例有水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、右旋糖、甘油、乙醇及诸如此类、以及其组合。在许多情形下，优选将等渗剂，例如，糖、多元醇(例如，甘露醇、山梨醇)或氯化钠纳入组合物中。药物可接受的物质的其他实例有润湿剂或少量辅助物质，诸如润湿或乳化剂、防腐剂或缓冲剂，其可延长活性成份的存储寿命或增强其效力。
本发明的药物组合物及其制备方法易于为本领域技术人员所了解。此类组合物及其制备方法可参见(例如)Remington′s Pharmaceutical Sciences，第19版(Mack出版公司，1995)。药物组合物优选在GMP条件下制造。
本发明的药物组合物可以散装形式、作为单一单位剂量或作为多个单一单位剂量加以制备、包装或出售。本文所用的“单位剂量”是包含预定量活性成份的药物组合物的离散量。活性成份的量通常等于要施用个体的活性成份的剂量或此一剂量的适宜分数(例如，此一剂量的二分之一或三分之一)。
本发明的药物组合物通常适于非经肠施用。本文所用的药物组合物的“非经肠施用”包括特征在于个体组织的物理破裂及通过组织中的裂口施用药物组合物，由此通常直接施用至血流、肌肉或内脏器官中的任何施用途径。因此，非经肠施用包括(但不限于)通过注射组合物、通过经外科切口施用组合物、通过经穿透组织的非外科伤口施用组合物及诸如此类等方式施用药物组合物。具体而言，预期非经肠施用包括(但不限于)皮下、腹膜腔内、肌内、胸骨内、静脉内、动脉内、鞘内、心室内、尿道内、颅内、滑膜内注射或输注；及肾透析输注技术。优选实例包括静脉内、皮下、皮内及肌内途径。
适于非经肠施用的药物组合物的配制品通常包含活性成份与药物可接受的载剂(例如无菌水或无菌等渗盐水)的组合。此类配制品可以适于推注施用或持续施用的形式加以制备、包装或出售。可注射配制品可以存于例如含有防腐剂的安瓿或多剂量容器中的单位剂型加以制备、包装或出售。用于非经肠施用的配制品包括(但不限于)存于油性或水性媒剂中的悬浮液、溶液、乳液、糊剂及诸如此类。此类配制品可进一步包含一或多种其他成份，包括但不限于悬浮剂、稳定剂或分散剂。在用于非经肠施用的配制品的一个实施例中，活性成份是以干燥(即粉末或颗粒)形式提供以使用适宜媒剂(例如无菌无热原水)进行重构，随后非经肠施用重构的组合物。非经肠配制品还包括水性溶液，其可含有赋形剂(例如盐、碳水化合物)及缓冲剂(优选至3至9的pH)，但对于一些应用，可能更适合将其调配成无菌非水性溶液或调配成干燥形式从而和适宜的媒剂(例如无菌无热原水)结合使用。示例性非经肠施用形式包括存于无菌水性溶液(例如，水性丙二醇或右旋糖溶液)中的溶液或悬浮液。若需要，此类剂型可适当地进行缓冲。其他可用的可非经肠施用的配制品包括含有呈微晶形式或脂质体制剂形式的活性成份的配制品。用于非经肠施用的配制品可经调配而能够直接释放和/或改良释放。改良释放配制品包括延迟释放、持续释放、脉冲释放、受控释放、靶向释放及程序性释放。
例如，在一个方面，无菌可注射溶液可通过将所需量的抗原性tau肽(优选偶合至免疫原性载体，最终与一或多种佐剂组合)纳入于任选含有一种上文所列举成份或各成份组合的合适溶剂中随后进行无菌过滤来制备。通常，可通过将活性化合物纳入于含有基本分散介质及所需的选自上文所列举成份的其他成份的无菌媒剂中来制备分散液。对于使用无菌粉末来制备无菌可注射溶液来说，优选的制备方法是真空干燥及冷冻干燥，这可产生由活性成份及任何所需附加成份(来自其先前经无菌过滤的溶液)构成的粉末。可通过(例如)使用诸如卵磷脂等包衣、通过保持所需粒径(对于分散液来说)以及通过使用表面活性剂来保持溶液的适当流动性。可通过将可延迟吸收的试剂(例如，单硬脂酸盐及明胶)纳入组合物中来延长可注射组合物的吸收。
本发明的示例性非限制性药物组合物是呈无菌水性溶液形式的配制品，所述无菌水性溶液的pH介于约5.0至约6.5之间且包含约1mg/mL至约200mg/mL的本发明肽、约1毫摩尔至约100毫摩尔组氨酸缓冲剂、约0.01mg/mL至约10mg/mL聚山梨酯80、约100毫摩尔至约400毫摩尔海藻糖及约0.01毫摩尔至约1.0毫摩尔二水EDTA二钠。
本发明的抗原性tau肽还可以下列方式来施用：经鼻内或通过吸入，通常以干燥粉末形式(单独、作为混合物、或作为混合组份颗粒，例如，与适宜的药物可接受的赋形剂混合)自干燥粉末吸入器施用；作为气溶胶喷雾自加压容器、帮浦、喷射器、雾化器(优选是使用电流体动力学以生成细雾的雾化器)、或喷雾器施用(其中使用或不使用适宜推进剂)；或作为滴鼻剂。该加压容器、帮浦、喷射器、雾化器或喷雾器通常含有本发明组合物的溶液或悬浮液，本发明组合物包含(例如)适宜的分散剂、增溶剂或延长活性物质释放的试剂、及推进剂作为溶剂。
在干燥粉末或悬浮液配制品中使用之前，通常将药品微粉化至适于通过吸入递送的大小(通常小于5微米)。这可通过任一适宜粉碎方法来实现，例如螺旋喷射研磨、流化床喷射研磨、超临界流体处理以形成奈米粒子、高压均质化或喷雾干燥。
用于吸入器或吹入器中的胶囊、泡罩及药筒可经调配而含有本发明化合物、适宜粉末基质及性能改良剂的粉末混合物。
适用于使用电流体动力学以生成细雾的雾化器的溶液配制品每次喷射可含有适宜剂量的本发明的抗原性tau肽，且喷射体积可在例如1μl至100μl间变化。
可将适宜调味剂(例如薄荷醇及左薄荷醇)或甜味剂(例如糖精或糖精钠)添加至那些要用于吸入/鼻内施用的本发明配制品中。
用于吸入/鼻内施用的配制品可经调配而能够直接释放和/或改良释放。改良释放的配制品包括延迟释放、持续释放、脉冲释放、受控释放、靶向释放及程序性释放。
在干燥粉末吸入剂及气溶胶的情形中，剂量单位是借助递送计量量的阀来确定的。本发明的单位通常经过设置以施用计量剂量或“喷雾量(puff)”的本发明组合物。总的日剂量通常以单次剂量或更通常以分次剂量全天施用。
包含抗原性tau肽的药物组合物还可调配用于口服途径施用。口服施用可包括吞咽(以使化合物进入胃肠道)和/或口腔、舌或舌下施用(由此，该化合物可直接自口腔进入血流)。
适于口服施用的配制品包括固体、半固体及液体系统(例如，锭剂)；含有多颗粒或奈米颗粒、液体或粉末的软质或硬质胶囊；糖锭(包括填充有液体者)；咀嚼锭；凝胶剂；快速分散剂型；薄膜；阴道锭；喷雾剂；及口腔/粘膜粘着性贴片。
液体配制品包括悬浮液、溶液、糖浆剂及酏剂。此类配制品可作为软质或硬质胶囊(例如，由明胶或羟丙基甲基纤维素制成)内的填充剂使用，且通常包含载剂(例如，水、乙醇、聚乙二醇、丙二醇、甲基纤维素或适宜油)及一或多种乳化剂和/或悬浮剂。液体配制品还可通过(例如)对药袋中的固体实施重构来制得。
剂量
本发明组合物可用于治疗、减轻或预防个体的tau相关病症或症状，该个体具有患所述病症或症状的风险或患有该病症或症状，这通过实施免疫疗法刺激所述个体中的免疫应答来进行。免疫疗法可包含初始免疫及随后的额外(例如一次、两次、三次或更多次)加强免疫。
本发明抗原性tau肽或其组合物的“免疫有效量”是以单次剂量或作为一系列的一部分递送至哺乳动物个体以在该个体中有效诱导针对致病形式tau的免疫应答的量。所述量根据以下因素而有所变化：所治疗个体的健康及身体状况、所治疗个体的分类学群组、个体免疫系统引发体液和/或细胞免疫应答的能力、疫苗配制品及其他相关因素。预期所述量在相对较宽的范围内，且所述范围可通过合适试验来确定。
“医药有效剂量”或“治疗有效剂量”是治疗或预防、或减轻个体的一或多种tau相关病症或症状所需要的剂量。医药有效剂量可根据以下因素而定：施用的特定化合物、症状的严重程度、个体对副作用的感受性、疾病类型、所使用的组合物、施用途径、所治疗哺乳动物的类型、所考虑特定哺乳动物的身体特征，例如健康及身体状况、同时实施的药物治疗、个体免疫系统的能力、所期望的保护程度及本领域技术人员认识到的其他因素。出于预防目的，将典型疫苗中诱导免疫保护性应答而无明显不利副作用的量选择作为每一剂量中肽的量。初始疫苗接种后，个体可以适当的间隔来接受一次或多次加强免疫。
应了解，用于任何特定患者的特定剂量量应根据多种因素而定，所述因素包括所用具体化合物的活性、年龄、体重、总体健康状况、性别、饮食、施用时间、施用途径、排泄速率、药物组合及经受疗法的特定疾病的严重程度。
例如，本发明的抗原性tau肽(偶合至免疫原性载体)可以以下剂量施用至个体：每次约0.1μg至约200mg，例如，约0.1μg至约5μg、约5μg至约10μg、约10μg至约25μg、约25μg至约50μg、约50μg至约100μg、约100μg至约500μg、约500μg至约1mg、约1mg至约10mg、约10mg至约50mg、或约50mg至约200mg，且任选在例如1周、2周、3周、4周、2个月、3个月和/或1年后施用加强免疫。在一些实施例中，每一剂量的抗原性tau肽的量是基于单位体重来确定。例如，在一些实施例中，抗原肽是以下列量施用：每一剂量约0.5mg/kg至约100mg/kg，例如，约0.5mg/kg至约1mg/kg、约1mg/kg至约2mg/kg、约2mg/kg至约3mg/kg、约3mg/kg至约5mg/kg、约5mg/kg至约7mg/kg、约7mg/kg至约10mg/kg、约10mg/kg至约15mg/kg、约15mg/kg至约20mg/kg、约20mg/kg至约25mg/kg、约25mg/kg至约30mg/kg、约30mg/kg至约40mg/kg、约40mg/kg至约50mg/kg、约50mg/kg至约60mg/kg、约60mg/kg至约70mg/kg、约70mg/kg至约80mg/kg、约80mg/kg至约90mg/kg、或约90mg/kg至约100mg/kg、或大于约100mg/kg。
在一些实施例中，施用本发明抗原性tau肽的单一剂量。在其他实施例中，施用本发明抗原性tau肽的多次剂量。施用频率可根据以下多种因素中任一因素而有所变化：例如，症状的严重程度、所期望的免疫保护程度、组合物是用于预防还是治愈目的等。例如，在一些实施例中，本发明抗原性tau肽是以下列频率施用：一个月一次、一个月两次、一个月三次、每隔一周一次(qow)、一周一次(qw)、一周两次(biw)、一周三次(tiw)、一周四次、一周五次、一周六次、每隔一天一次(qod)、一天一次(qd)、一天两次(qid)或一天三次(tid)。当本发明组合物用于预防目的时，其通常以初免剂量(priming dose)及加强剂量来施用。预期加强剂量会适当地间隔开，或优选一年施用一次，或者在循环抗体的含量降低至期望含量以下时施用。加强剂量可由不存在最初免疫原性载体分子的抗原性tau肽组成。此类加强构建体可包含替代的免疫原性载体或可不含任何载体。所调配的此类加强组合物可含有或不含佐剂。
本发明抗原性tau肽的施用持续时间(例如，施用抗原性tau肽所经历的时间段)可根据多种因素中的任一因素而变化：例如，患者反应等。例如，抗原性tau肽可经以下时间段来施用：约1天至约1周、约2周至约4周、约1个月至约2个月、约2个月至约4个月、约4个月至约6个月、约6个月至约8个月、约8个月至约1年、约1年至约2年、或约2年至约4年、或更长时间。
用途及治疗方法
本发明还涵盖包含施用本发明抗原性tau肽的各种治疗方法。治疗方法包括在个体中诱导针对致病形式的自身tau的免疫应答的方法以及预防、减轻或治疗个体的tau相关病症或症状的方法。
在一个方面，本发明提供治疗、预防或减轻个体的tau相关病症或症状的方法，其包括向该个体施用治疗有效量的本发明抗原性tau肽或其免疫原性组合物或药物组合物。
在另一方面，本发明提供在个体中诱导针对致病形式的自身tau的免疫应答的方法，其包括向该个体施用治疗或免疫原性有效量的本发明抗原性tau肽或其免疫原性组合物或药物组合物。
“治疗(treat、treating及treatment)”是指减轻或消除生物学病症和/或至少一种其伴随症状的方法。本文所用的“减轻”疾病、病症或病状意指降低疾病、病症或病状的症状的严重程度和/或发生频率。此外，在本文中提及“治疗”包括提及治愈性、缓和性及预防性治疗。所述个体优选为人类，且可为任何年龄的男性或女性。
本发明的其他方面涉及本发明抗原性tau肽或其免疫原性组合物或药物组合物用作药剂，优选用于治疗tau相关病症。
在再一方面中，本发明提供本发明抗原性tau肽或其免疫原性组合物或药物组合物用以制造优选用于治疗tau相关病症的药剂的用途。
本发明将通过以下实施例进一步阐述，且不应将其视为进一步限制。本发明通篇所引用的所有图及所有参考文献、专利及公开的专利申请的全部内容明确地以引用方式并入本文中。
实施例
已经努力确保所用数字(例如量、温度等)的精确性，但应考虑到一些实验误差及偏差。除非另有说明，否则份数是重量份数，分子量是重量平均分子量，温度是以摄氏度计，而压力是大气压力或接近大气压力。如下文实施例中所使用的，下列缩写具有以下含义，且除非另有说明，其均可容易地自商业供应商购得：DMF：二甲基甲酰胺；TFA：三氟乙酸；TIPS：三异丙基甲硅烷基三氟甲磺酸盐；TCEP：叁(2-羧基乙基)膦；mcKLH：海水培养的钥孔血蓝蛋白；HBTU：六氟磷酸O-苯并三唑-N，N，N′N′-四甲基-脲鎓盐；EDTA：乙二胺四乙酸；DMSO：二甲基亚砜。
实施例1：Qbeta质粒构建
天然Qbeta外壳蛋白：通过DNA 2.0(DNA 2.0，Menlo Park，CA)来合成对应于Qbeta外壳蛋白核苷酸1304至1705(来自GenBank登记号AY099114)的编码序列。包括引入NcoI位点的5′修饰(CCatgg)及引入两个终止密码子及XhoI位点的3′修饰(gtaTTAATGACTCGAG-SEQ ID NO：78)。
密码子优化的Qbeta外壳蛋白：也使用Gene Designer针对表达对Qbeta外壳蛋白编码序列进行优化(Villalobos等人，BMC Bioinformatics 7：285(2006))。将相同的5′及3′修饰纳入至密码子优化的Qbeta外壳蛋白中。
利用常规的DNA亚克隆方法(包括限制酶切消化及连接反应)将天然及密码子优化的Qbeta外壳蛋白序列引入pET28表达载体中。
实施例2：合成Tau肽的制备
如下制备Tau肽(称为A-1至A-11；B-1至B-6；C-1至C-5；D-1；E-1及F1；以及此类肽的磷酸化形式-表示为A-1P、A-2P、A-3P等)，此类肽是如SEQ ID NO.31-76、105-107中所示及如下表5中所显示，表5中还显示以下所有实施例中所用的其对应名称。含有接头序列(CGG或GGC)的磷酸化或未磷酸化tau肽的合成是使用固相合成技术在Symphony肽合成仪(Protein Technologies公司)上进行。使用经过单保护的氨基酸Fmoc-Ser[PO(O-Bzl)OH]-OH、Fmoc-Thr[PO(O-Bzl)OH]-OH及Fmoc-Tyr[PO(O-Bzl)OH]-OH(EMD Chemicals公司)将磷酸丝氨酸、磷酸苏氨酸及磷酸酪氨酸纳入磷酸化形式的序列中。通过使含有第一氨基酸的NovaSyn TGA树脂(EMD Chemicals公司)与6.25倍过量的经Fmoc保护的第二氨基酸(1mmol)(使用1mmol HBTU激活1小时)混合来开始反应。对于每一氨基酸，偶合反应均重复一次。在存于DMF中的20％六氢吡啶中经2×5分钟移除Fmoc基团。通过将树脂与5mL含有2.5％TIPS及2.5％苯甲硫醚的TFA溶液在室温下一起培育3小时自树脂释放合成的肽。在过滤、二乙醚介导的沉淀及真空干燥后，回收粗肽。在配备有BEH 130制备型C18管柱的反相HPLC(Waters 2525 Binary Gradient Module)上对肽实施纯化。流动相由存于水中的0.1％TFA(作为缓冲液A)及存于乙腈中的0.1％TFA(作为缓冲液B)组成。将所收集的含有肽的流份组合并在真空中冻干。自典型注射100mg粗肽纯化得到约20mg肽，其中纯度高于95％。利用LC-MS验证所有纯化肽。
以类似方式合成及纯化其他tau肽(SEQ ID：108-122)。
实施例3：Qbeta-VLP：表达、纯化及与tau肽的偶联
Qbeta于大肠杆菌中的表达：将含有Qbeta cDNA的质粒pET28转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中。将单一菌落接种于5mL含有50μg/mL卡那霉素(kanamycin)的2×YT培养基中，在37℃下保持过夜。将过夜接种物稀释于500mL含有50μg/mL卡那霉素的TB培养基中，在37℃下于250rpm下生长至0.8OD600，并使用0.4mM IPTG(异丙基β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷)诱导过夜。通过在2500RCF下离心15分钟来收获细胞。将细胞沉淀物储存于-80℃下。
自大肠杆菌纯化Qbeta VLP：所有纯化步骤均在4℃下实施。将表达Qbeta的细胞沉淀物再悬浮于含有25mM Tris pH 8.0、150mM NaCl、5mMEDTA、0.1％Triton-100且补加有蛋白酶抑制剂混合液(Roche)的裂解缓冲液中。使再悬浮溶液通过微射流均质机(Microfluidics公司)，随后超速离心。通过添加硫酸铵至50％饱和、随后在15,000RCF下离心30分钟使蛋白质沉淀。将沉淀物再悬浮并于含有25mM Hepes pH 7.5、100mM NaCl、1mMEDTA的缓冲液中于4℃下透析过夜。离心所透析的溶液，并随后加载至在25mM HEPES pH 7.5、100mM NaCl、1mM EDTA中平衡的Capto Q管柱(GE)中。洗涤管柱并以存于含有25mM HEPES pH 7.5、1mM EDTA的缓冲液中的100mM NaCl至1M NaCl的梯度运行。使用SDS-PAGE鉴定Qbeta蛋白质。将含有Qbeta的流份在10mM磷酸钾pH 7.4、150mM KCl中透析过夜，并加载至羟基磷灰石管柱(II型，Bio-Rad公司)中。洗涤管柱，并使用自100％的含有10mM磷酸钾pH 7.5、150mM KCl的缓冲液至100％的含有500mM磷酸钾pH 7.5、0.5M KCl的缓冲液的梯度进行溶析。集中含有Qbeta的流份，透析，并加载至在25mM Tris-Cl pH 8.0、150mM NaCl、0.7M(NH4)2SO4中平衡的苯基管柱中。使用自100％的含有25mM Tris-ClpH 8.0、150mM NaCl、0.7M(NH4)2SO4的缓冲液至100％的含有25mMTris-Cl pH 8.0、50mM NaCl的缓冲液的梯度溶析蛋白质。集中含有纯净Qbeta的流份，并在PBS中于4℃下透析过夜。通过Bradford分析来测定蛋白质的浓度。
tau肽与Qbeta VLP的偶合：借助双功能交联剂SMPH(琥珀酰亚胺基-6-[β-马来酰亚胺基丙酰胺基]己酸酯)(Thermo Scientific)来介导tau肽与Qbeta-VLP的偶合(Freer等人，Virology 322(2)：360-369(2004))。将肽以10mg/mL溶解于含有5mM EDTA的PBS(Invitrogen)(pH 7.0)中，并通过与固定的TCEP二硫化物还原凝胶以等体积在室温下一起培育1小时来还原。通过在1000×g下离心2分钟来回收肽溶液。通过将存于PBS(Invitrogen)中的2mg/mL Qbeta-VLP蛋白质与存于DMSO中的7mM SMPH在室温下一起培育1小时来将前者激活。通过以1000×g经2分钟通过Zeba除盐离心柱(Desalt Spin column)(Thermo Scientific)来除去衍生化VLP中的盐分。将激活的VLP溶液与10倍摩尔过量的还原肽在室温下混合2至3小时。浓缩反应混合物，并在PBS或25mM组氨酸pH 7.4(含有50mM NaCl)中于4℃下透析过夜。利用Thermo Scientific的Coomassie Plus蛋白质分析来测定蛋白质的浓度。
实施例4：肽-KLH缀合物的制备
使含有CGG接头的tau肽A-1P(SEQ ID NO：31)偶联至mcKLH(ThermoScientific，目录号为77605)以评估其在小鼠中的免疫原性。借助双功能交联剂SMPH(琥珀酰亚胺基-6-[β-马来酰亚胺基丙酰胺基]己酸酯)(ThermoScientific)来介导偶联。以存于含有5mM EDTA的PBS pH 7.0中的10mg/mL的A-1P肽首先使用等体积的固定化TCEP二硫化物还原凝胶，通过在室温下搅动1小时进行处理。通过在1000×g下离心2分钟，回收肽溶液。由存于PBS中的10mg/mL KLH与200μL存于DMSO中的100mMSMPH在室温下一起培育1小时，将KLH激活。使反应混合物通过Zeba除盐离心管柱(Zeba Desalt Spin column，Thermo Scientific)。随后将所收集的衍生化KLH与还原A-1P在室温下混合2小时。将反应混合物在含有0.6MNaCl的PBS中于4℃下透析过夜。利用Thermo Scientific的Coomassie Plus蛋白质分析法测定蛋白质的浓度。
实施例5：针对免疫原性及B细胞记忆的肽免疫研究
进行实验，以测定示于表5的所选肽是否具有免疫原性并确定是否产生免疫记忆。在第0天使用肽或偶联至Qbeta VLP的肽，对每组3只Balb/c小鼠进行初免，并在第14天及第101天加强免疫，但是一些小鼠仅在第101天进行初免，如图1A、1B及2中所示。在第28、101、104、108及115天采集血清。在第94天采集所选小鼠的血清。利用抗原特异性效价测定分析(如实施例13中所述)分析免疫动物的抗体应答。
抗原特异性IgG效价结果概述于图1B中，其利用第28天的血清试样显示此类肽具有免疫原性。该研究显示，当使用TiterMax Gold(AlexisBiochemicals)作为佐剂进行免疫时，肽A-1、A-1P、B-1P及C-1P具有免疫原性。使用A-1P肽及TiterMax Gold或使用偶联至Qbeta-VLP的A-1P初免，随后在第14天使用A-1P-Qbeta-VLP加强免疫，产生的抗体效价大于A-1P TiterMax初免加强群组。使用偶联至KLH的A-1P(如实施例4中所述来制备)作为佐剂初免并在第14天加强免疫时，所产生的抗体效价也大于A-1P TiterMax初免加强群组。
还检测用于免疫的磷酸化肽(A-1P、B-1P、D-1P、C-1P)或未磷酸化肽(A-1)所引发抗体的选择性。其作法是比较用于免疫的每一种肽的磷酸化及未磷酸化形式的抗体效价(参见图1B)。计算特异性效价对非特异性效价的比值。在此实验中，针对A-1的抗体应答(群组1)对为动物免疫接种的肽的磷酸化状态具有选择性(小于0.1倍)，而针对C-1P的抗体(群组5)似乎具有选择性(C-1P/C-1效价比值大于7)。群组2(A-1P)不具有选择性。
显示A-1P B细胞记忆回忆应答的结果显示于图2中。将群组A(使用A-1P与TiterMax初免，使用A-1P-Qbeta-VLP加强免疫)及群组B(使用A-1P-Qbeta-VLP初免及加强免疫)与群组C进行比较，群组C在第101天使用偶联至Qbeta-VLP的A-1P初免。所有三个群组均具有IgM应答。于第101天加强免疫的两个群组中，在第104天检测到IgG，但对于在第101天初免的群组直至初免后第7天才检测到。第104天的效价大于第94天的效价。第7天及第14天的IgG效价也大于第101天初免群组(群组C)。在第108天及第115天群组A及B的IgG效价相同，而群组C的IgG效价直至第115天才达到峰值。此类数据表明长期抗体应答及B细胞记忆回忆。
实施例6：针对免疫原性的肽初免及肽-VLP加强免疫研究
实施实验以测定当使用以明矾(Al(OH)3；铝胶2％“85”，BrenntagBiosector)作为佐剂的肽初免、随后使用偶联至Qbeta-VLP的肽加强免疫来进行免疫时表5中的所选肽是否具有免疫原性。如图3中所示，在第0天使具有4只Balb/c小鼠的群组初免，并在第28天及第56天加强免疫。在第70天采集血清。利用抗原特异性效价测定分析(如实施例13中所述)对免疫动物的抗体应答进行研究。
结果概述于图3中。在群组1-6中，在所测试的最大稀释度(1：1,749,600)下检测到针对用于免疫的肽的IgG抗体，表明对免疫肽抗原具有稳健的抗体应答。在未经治疗群组(群组7)中未检测到抗体。通过使用肽D-1P及C-1P免疫而产生的抗体识别肽E-1P。肽D-1P及C-1P完全包含于E-1P中。
检测用于免疫的磷酸化肽(A-1P、B-1P、D-1P、C-1P、E-1P)或未磷酸化肽(A-1)所引发抗体的选择性。此通过测定磷酸化肽的未磷酸化形式与未磷酸化肽的磷酸化形式的抗体效价来实施(参见图3)。计算特异性效价对非特异性效价的比。在此实验中，针对D-1P(群组4)、C-1P(群组5)及E-1P(群组6)的抗体对磷酸化状态的肽(使用其对动物进行免疫)具有选择性(效价比大于10)。
实施例7：针对免疫原性的肽-VLP免疫研究
实施实验以测定当使用各种佐剂以Qbeta-VLP缀合物进行免疫时表5中的所选肽及肽组合是否具有免疫原性。如图4中所示，在第0天使具有4只TG4510+/+(转基因双阳性，参见Ramsden等人，J.Neuroscience25(46)：10637(2005))或TG4510-/-(野生型同窝对照)小鼠的群组初免，并在第56天及第28或29天加强免疫。在第63天采集血清。利用如实施例13中所述的抗原特异性IgG效价测定分析对免疫动物的抗体应答进行研究。第63天的试样结果概述于图4中。在每一群组中，以介于7.7E+04至1.58E+06范围内的平均效价检测到针对用于免疫的肽或肽组合的抗体(IgG)。使用三种肽-Qbeta-VLP缀合物以100μg或10μg的组合进行免疫各自引发的效价与单独使用100μg肽-Qbeta-VLP缀合物进行免疫所引发的效价类似。组合投药群组1及2的A-1P、B-1P及C-1P效价是相关单一投药群组(群组3、4及5)的效价的1.7至4.4倍。组合投药群组11及12的A-1P、B-1P及C-1P效价是相关单一投药群组(群组13、14及15)的效价的0.32至2.8倍。在使用佐剂(明矾、或CpG-24555(美国临时专利申请第61/121,022号，2008年12月9日申请)、或ABISCO-100(Isconova)与CpG-24555)或不使用佐剂时，检测到抗体。在未经治疗对照中未检测到针对肽的抗体。
在所选群组中检测用于免疫的磷酸化肽(A-1P、B-1P、D-1P、C-1P、E-1P)所引发抗体的选择性。此通过测定群组1-7中磷酸化肽的未磷酸化形式的抗体效价来实施(图4)。计算特异性效价对非特异性效价之比。在此实验中，在所有投药群组中，抗体对B-1P的选择性优于B-1(效价比大于10倍)。仅在群组6(不含有明矾的群组)中抗体对C-1P的选择性优于C-1。在群组2、3及6中，抗体对A-1P的选择性优于A-1，但在群组1(以明矾作为佐剂使用高剂量组合进行免疫)中并非如此。在未经治疗对照中未检测到针对未磷酸化肽的抗体。
实施例8：针对途径、佐剂及同种型的肽-VLP免疫研究
实施实验以比较使用不同佐剂及施用途径时所引发抗体的免疫原性及同种型。如图5中所示，在第0天使具有3只Balb/c小鼠的群组初免，并在第17天加强免疫。在第24天采集血清。利用抗原特异性效价测定分析(如实施例13中所述)对免疫动物的抗体应答进行研究。
将偶联至Qbeta-VLP的A-1P经由皮下或肌内注射递送至BALB/c。还经由肌内途径测试不同抗原组合。使用第27天试样的结果概述于图5中。皮下及肌内施用偶联至Qbeta-VLP且以明矾作为佐剂的A-1P均引发IgG抗体应答。肌内投药群组(70)比皮下投药群组(11)具有较大的A-1P对A-1效价比。这表明施用途径会影响应答的选择性。
如图5中所示，所用的所有佐剂组合皆引发IgG1及IgG2a抗体，其中含有明矾的群组的IgG1对IgG2a比(对于群组2及5，比分别为21及12)远远大于不包括明矾作为佐剂的群组3(0.17)及4(0.17)。此与已知的明矾使免疫应答偏向Th2型的效应一致(参见Lindblad，Immunol Cell Biol.82(5)：497-505(2004)；Marrack等人，Nature Rev.9：287-293(2009))。此类结果表明，可使用佐剂来改变此实施例中所用疫苗的抗体应答。在未经治疗对照中未检测到针对肽的抗体。
实施例9：针对接头分析的肽-VLP免疫
实施实验以测定免疫原性是否受表5中所选肽的接头(CGG或GGC)的位置影响。此处，使用接头位于肽的N端(即SEQ ID NO：31-A-1P)或C端(即SEQ ID NO：41-A-11P)的A-1P肽。如下表1中所示，在第0天使具有4只TG4510+/+小鼠的群组初免，并在第14天加强免疫。在第20天抽取小鼠血液。利用如实施例13中所述的抗原特异性效价测定分析对免疫动物的抗体应答进行研究。
基于显示于表1中的结果，至Qbeta-VLP的接头序列可置于tau特异性序列的N端(CGG)或C端(GGC)，且仍然引发磷酸化选择性IgG应答(效价比大于10倍，表1)。该实验中所用的肽(SEQ ID NO：31及41)具有相同序列，只是CGG接头位于SEQ ID NO：31的N端，而接头GGC位于SEQ IDNO：41的C端。二者在第20天试样中引发类似的IgG效价。如表1中所示，如通过磷酸化对未磷酸化IgG效价比为49及大于132所测定，由该两个肽序列引发的抗体具有选择性。在第56天未经治疗对照(图4中的群组7)中未检测到针对肽的抗体。
表1：经肌内使小鼠免疫。使用100μg肽-VLP及750μg明矾(Al(OH)3)。在抗原特异性效价测定分析(参见实施例13)中测试的血清稀释度介于1∶5,000至1∶15,800,000范围内。
Figure BDA0000141966330000611
实施例10：多克隆抗体与截短肽的结合
实施实验以测定表5中的所选肽是否含有存在于A-1P、B-1P或C-1P(引发针对其的抗体)中的免疫原性表位。如下表2中所示，自接种A-1P、B-1P或C-1P的小鼠采集血清。利用抗原特异性效价测定分析(如实施例13中所述)对免疫动物的抗体应答进行研究，其中对数据分析进行以下修正：为未经涂敷孔平均值的两倍的信号视为阳性，而低于未经涂敷孔平均值的两倍的信号视为阴性。
实施ELISA以测定来自使用A-1P、B-1P或C-1P肽的肽-VLP缀合物进行免疫的动物的抗体是否结合此类肽中的每一者的缩短形式。使用所测试tau肽中的每一者作为板抗原(plate antigen)，且对以1∶4×104及1∶4×105稀释的来自A-1P-、B-1P-或C-1P-VLP免疫小鼠的血清进行测试以测定其是否能够结合相关肽(参见表3)。先前显示此类血清含有抗原特异性抗体。血清是来自使用相关亲代肽(对于A-1P及衍生物为A-1P；对于B-1P及衍生物为B-1P；对于C-1P及C-1P/E-1P衍生物为C-1P)免疫的小鼠(参见表2)。每一抗血清以2种稀释度(1∶4×104及1∶4×105)使用。若检测到与肽的结合，则列为阳性结果。若自任一血清稀释物均未检测到信号，则列为阴性结果。除A-5P、A-10P及B-2P外，所有测试试样皆具有阳性信号，表明由全长(亲代)肽引发的抗体也结合大多数所测试的缩短衍生物。
表2：经肌内使小鼠免疫。在列出的情况下使用100μg肽、100μg肽-VLP及750μg明矾(Al(OH)3)。在抗原特异性效价测定分析(实施例13)中测试的每一血清的稀释度为1∶4×104及1∶4×105。
Figure BDA0000141966330000621
表3：“阳性”表示该孔的OD是背景(未经涂敷孔)OD平均值的至少两倍。“阴性”表示该孔的OD小于背景(未经涂敷孔)OD平均值的两倍。
  肽   血清A   血清B
  A-1P   阳性   阳性
  A-2P   阳性   阳性
  A-4P   阳性   阴性
  A-5P   阴性   阴性
  A-6P   阳性   阳性
  A-7P   阳性   阳性
  A-8P   阳性   阳性
  A-9P   阳性   阳性
  A-10P   阴性   阴性
  B-1P   阳性   阳性
  B-2P   阴性   阴性
  B-3P   阳性   阳性
  B-4P   阳性   阴性
  B-5P   阳性   阴性
  B-6P   阳性   阴性
  C-1P   阳性   阳性
  C-2P   阳性   阳性
  C-3P   阳性   阳性
  C-4P   阳性   阳性
  C-5P   阳性   阳性
实施例11：针对免疫原性及记忆的截短肽免疫研究
实施两项实验以测定当以Qbeta-VLP缀合物进行免疫时表5中的所选肽是否具有免疫原性。也利用此类研究之一来测定是否产生免疫记忆。为努力避免肽抗原与I类MHC及II类MHC T细胞配体的潜在结合，对A-1P、B-1P及C-1P“亲代”肽的缩短形式进行测试。选择7至11个氨基酸的肽长度，这是因为II类MHC分子通常结合具有13-17个氨基酸的肽，且I类MHC结合需要至少8个氨基酸的肽长度(Murphy等人，Janeway′sImmunobiology，Garland Science(2007))。因此，具有11个或较少氨基酸的肽不应诱导II类MHC限制性CD4T细胞应答，而具有7个氨基酸的肽不应诱导CD4T细胞应答，也不应诱导I类MHC限制性CD8T细胞应答。还对长度为7个氨基酸的肽F-1P进行测试。如图6中所示，在第0天使具有3或6只Balb/c小鼠的群组初免，并在第14天加强免疫。三个群组也在第108天加强免疫，且三个群组在第108天初免(参见图7)。在第21天、或第28天、或第111天、第115天及第122天或第21天、第105天、第111天、第115天及第122天采集血清。利用抗原特异性效价测定分析(如实施例13中所述)对免疫动物的抗体应答进行研究。
结果概述于图6中。除B-5P外，所有肽-Qbeta-VLP缀合物皆在所有ELISA测试小鼠中引发抗原特异性IgG抗体，对于B-5P，3只小鼠中仅有2只小鼠在1∶15,800的血清稀释度下具有可检测抗体。这些结果表明，具有CGG接头的具有7至11个氨基酸的tau肽具有免疫原性且能够引发对免疫原具有特异性的抗体。
检测用于免疫的磷酸化肽形式所引发抗体的选择性(参见图6)。大多数此类肽对磷酸化形式的肽的选择性优于未磷酸化形式(效价比大于10倍)。当以未磷酸化形式的免疫肽用作板抗原时，许多缩短的A-1P、B-1P及C-1P衍生物不产生可检测的ELISA信号。许多缩短的A-1P、B-1P及C-1P衍生物的选择性等于或大于亲代肽。已报导，在JN L3 Tau P301L过表达动物模型中，不具有CGG接头的肽A-2P的主动免疫会降低脑中的聚集Tau并减缓缠结相关性感觉运动损伤的进展(Asuni等人，J.Neurosci.27：9115(2007))。偶联至Qbeta-VLP的A-2P具有免疫原性。然而，在ELISA分析中，所引发抗体对磷酸化形式的肽(A-2P)相对于未磷酸化形式的肽(A-2)不具有选择性(A-2P/A-2效价比为1.7)。相比之下，此类抗体对A-1P的选择性优于A-1(A-1P/A-1效价比大于10.0)。使用A-2P及A-1P作为ELISA抗原时，效价相同。此表明，大多数非磷酸特异性抗体(non-phosphospecificantibody)的表位包括肽A-2P的12个氨基酸，此12个氨基酸并不包含于A-1P中。在此实验中，不使用明矾作为佐剂比使用明矾作为佐剂进行测试(分别为群组14及10)时，C-1P具有较高选择性。可使用佐剂(例如明矾)来改变对磷酸化与未磷酸化肽的选择性。在未经治疗对照中未检测到针对肽的抗体。此类结果表明，具有CGG接头的具有7至11个氨基酸的tau肽能够引发磷酸-肽选择性抗体。
测试A-1P、B-1P及C-1P的记忆回忆应答的结果显示于图7中。将在第0、14及108天初免及加强免疫的肽-Qbeta-VLP免疫小鼠第111天、第115天及第122天(距最后一次免疫分别为+3天、+7天及+14天)的IgG效价与那些在第108天初免的小鼠的IgG效价进行比较。群组1、2及3在第105天、最后一次加强免疫后84天具有较高IgG效价。与第108天初免群组(群组4、5及6)相比，此类群组在第111天与第115天期间也具有较大的IgG效价增加。此类数据表明长期抗体应答及记忆回忆。
实施例12：与明矾组合及不与明矾组合时针对免疫原性及T细胞应答的截短肽免疫研究
实施实验以测定当使用100μg Qbeta-VLP缀合物与0或504μg明矾(Al(OH)3)进行免疫时或当以肽-Qbeta-VLP缀合物与明矾的组合形式或以肽-Qbeta-VLP缀合物形式施用时衍生自A-1P、B-1P及C-1P的肽(表5)是否具有免疫原性。还分析脾中的T细胞应答。如图8中所示，在第0天使具有3只TG4510-/-野生型同窝小鼠的群组初免，并在第14天加强免疫。在第21天采集血清及脾。利用抗原特异性效价测定分析(如实施例13中所述)及IFN-γELISPOT分析(如实施例14中所述)对免疫动物的抗体应答进行研究。
抗原特异性IgG效价显示，当使用504μg明矾(Al(OH)3)或不使用明矾以Qbeta-VLP缀合物进行免疫时，所有测试肽皆具有免疫原性(参见图8)。使用A-8P、B-3P及C-2P与总共750μg明矾的组合以300μg肽-Qbeta-VLP缀合物进行免疫对所有3种肽皆产生选择性抗体应答。
通过ELISA来检测用于免疫的磷酸化肽与未磷酸化形式的肽所引发抗体的选择性(图8)。计算特异性效价对非特异性效价之比，其中较大比值表示较高选择性。不管在初免及加强免疫中是否包括明矾，也不管肽-Qbeta-VLP缀合物是单独抑或以组合形式进行免疫，所引发抗体对磷酸化形式的肽具有选择性。
利用IFN-γELISPOT分析来分析使用单一肽Qbeta-VLP免疫后脾中的T细胞应答(参见图9)。在第21天、最后一次肽Qbeta-VLP加强免疫后7天分析分泌对亲代tau肽(A-1P、B-1P、C-1P)及其对应截短形式具有特异性的IFN-γ的T细胞的频率。相对于无关肽对照(HBV-1)，在使用B-3P-Qbeta-VLP及C-2P-Qbeta-VLP于存在或不存在明矾下免疫后，未产生大量分泌对B-1P、B-1、B-3P、B-3、C-1P、C-1、C-2P或C-2具有特异性的IFN-γ的T细胞。在使用A-3P-Qbeta-VLP免疫后，诱导显著(p＜0.05)程度的A-3P特异性IFN-γT细胞应答。A-3P肽含有预测的小鼠I类MHC Kb结合表位(IVYKSPVV，参见Lundegaard等人，Bioinformatics 24：1397-1398(2008))，且该表位可能促成A-3P免疫动物中所观察到的T细胞应答。此表位还存在于A-1P、A-1、A-2P、A-2及A-3中。当将A-1P肽缩短成长度为7个氨基酸的肽(A-8P Qbeta-VLP)时，A-8P Qbeta-VLP免疫小鼠中的IFN-γ特异性T细胞应答降低至背景层面。
CD4T辅助细胞为产生同种型转换抗体应答及产生记忆B细胞所需要(参见Murphy等人，Janway′s Immunobiology，Garland Science，(2007))。因此，在使用截短型磷酸-tau肽Qbeta-VLP免疫后产生的IgG抗体应答对应于其各自肽表位的发现表明，CD4T辅助应答是针对疫苗而诱导。由于在使用截短肽缀合物免疫后未产生显著含量的tau-肽特异性T细胞，故测试对疫苗另一组份的T细胞应答。对VLP蛋白质的T细胞应答的分析显示，IFN-特异性T细胞是针对VLP表位而产生(4-15倍高于无关蛋白质对照(BSA，Sigma Aldrich A9418))。
实施例13：抗原特异性抗体效价测定
利用以下分析来测定如上文实施例5-12所述的免疫动物的抗体应答。
利用比色ELISA来测定具有可检测抗原特异性抗体(如通过阳性信号所代表)的最高血清稀释度。自血清试样制备连续稀释物并在分析中进行测试。在一些分析中，使用对磷酸-tau肽具有特异性的单克隆抗体作为阳性对照或标准物。使用来自未接种疫苗小鼠(BALB/c、TG4510+/+或Tg4510-/-)的血清作为阴性对照。将96孔高结合力聚苯乙烯板(CoStar 9018)用100μL稀释于0.1M碳酸钠pH 8.2(Sigma S7795)中的肽在4℃下涂敷18至21小时。除C-1P及C-1的浓度为3μg/mL外，所有其他肽的浓度均为0.3μg/mL。第二天，移除涂敷溶液，并在室温下使用含有0.05％Tween 20(Sigma P2287)及1％BSA(Sigma A9418)的PBS溶液(EMD OmniPure 6507)在使用Heildolph Titramax 1000以600rpm振荡下将此类板阻断1小时。移除阻断溶液，随后将试样添加至此类板中。
将小鼠血清及用作标准物的单克隆抗体利用0.5或1对数稀释于含有0.5％Tween 20的PBS(PBS-T)中进行连续稀释。对于每一试样，测试自1∶500、1∶5000或1∶15,800开始的6至8份血清试样稀释物。用作标准物及阳性对照的单克隆抗体系：针对A-1P的抗-Tau 396(Zymed 35-5300)；针对B-1P的AT-180(Thermo Pierce MN1040)；针对D-1P及E-1P的AT-8(ThermoPierce MN1020)；针对C-1P的AT-100(Thermo Pierce MN1060)。用于标准曲线的所用单克隆抗体的浓度是每孔50、15.8、5、1.58、0.5、0.158及0.05ng。
将试样及标准物以每孔100μL添加至板中，每孔一式两份。将此类板在室温下于600rpm振荡下培育1小时。随后使用PBS-T将此类板洗涤3次，并以100μL/孔添加以1∶3000稀释于PBS-T中的二级抗体(偶联HRPO的抗-小鼠IgG，Caltag#M30107)。使用不同二级抗体来检测IgG1(Caltag#M32107 1∶2000)、IgG2a(Caltag#M32307 1∶2000)及IgM(Caltag#315071∶3000)。使二级抗体在室温下于振荡下在此类板上结合1小时。将此类板再次使用PBS-T洗涤三次，并在最后一次洗涤后将此类板吸干。为显影，向每一孔中添加100μL TMB过氧化物酶EIA受质(Bio-Rad#172-1067)，并在室温下保持11分钟。向每一孔中添加100μL 1N硫酸以终止反应。在Molecular Devices Spectramax plus 384上在450nm下读取吸光度。通过取用PBS-T处理的所有孔的平均值并加上此类孔的标准偏差的3倍来计算各板的OD阈值。若不能计算得到标准偏差，则使用两倍于PBS-T OD的值作为阈值。自第一试样稀释物测定试样效价，其中450nm吸光度值大于所计算的阈值。对于一些分析，使用基于相关阳性对照单克隆抗体的稀释物的标准曲线来计算相对于标准曲线的效价浓度。当未检测到信号时，使用最低稀释值或所测试标准物来计算，而当最高稀释是阳性时，则使用最高稀释值或所测试标准物来计算。当N大于2时，计算平均效价，而当N是1或2时，则显示各值。通过将对于每一试样磷酸化肽的试样效价除以未磷酸化形式的相同肽的效价，随后取不同试样比值的平均值来测定选择性比值。大于10或小于0.1的值视为具有选择性。使用第一阳性稀释来测定选择性是最保守的方法。使用其他方法(例如阈值OD为1或1/2的最大OD)可能得到较大的选择性值。
实施例14：IFN-γELISPOT分析
使用IFN-γELISPOT试剂盒(BD Biosciences；551083)来测量使用肽-Qbeta-VLP免疫后的T细胞应答。对自A-8P、A-3P、B-3P、C-2P(在低剂量明矾存在下或无明矾)免疫小鼠以及未免疫小鼠采集的脾(N＝3)实施ELISPOT。给96孔ELISPOT板铺板5μg/mL捕获抗-小鼠IFN-γ抗体，并在4℃下保持过夜。洗涤涂敷抗体的板并使用含有10％胎牛血清(VWRA15-204)的RPMI 1640完全培养基(Invitrogen 11875-119)实施阻断。
随后将脾细胞以每孔500,000个脾细胞接种至涂敷有抗-IFN-γ抗体的板上，使用10μg/mL肽或蛋白质抗原在37℃且含有5％CO2的培育箱中刺激20至24小时。无关肽对照是肽HBV-1(SEQ ID NO：77)且使用牛血清白蛋白(Sigma Aldrich；A9418)作为Qbeta-VLP的无关蛋白质对照。使用以每孔55,555个及18,520个细胞接种的经佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(Phorbol 12-Myristate 13-Acetate)(0.5μg/mL PMA，Sigma Aldrich；P8139)及离子霉素(ionomycin)(0.5μg/mL，Sigma Aldrich；I0634)刺激的脾细胞作为阳性对照。培育20至24小时后，使用蒸馏水洗涤ELISPOT板两次，随后再使用洗涤缓冲液(1×PBS(Invitrogen 10010072)，含有0.05％Tween-20(SigmaP2287))洗涤三次。通过以下来检测IFN-γ细胞因子：将稀释于含有10％FBS的PBS中的2μg/mL生物素化抗-IFN-γ检测抗体在室温下培育2小时，随后与以1∶100稀释于PBS 10％FBS中的抗生蛋白链菌素HRP一起培育。使用洗涤缓冲液洗涤板4次且使用PBS洗涤板2次后，使用AEC发色团-受质(在室温下培育11分钟)来显现IFN-γ斑点。
扫描IFN-γ阳性斑点，捕获，并使用Cellular Technology ELISpot分析仪及5.0 Professional Immunospot软体计数，并取每孔计数的平均值。无关肽是肽抗原的阴性对照，而BSA是未偶联VLP的阴性对照。利用Student T检验时平均斑点值必须显著大于(p＜0.05)相关阴性对照才能视为阳性。
实施例15：佐剂配制品及免疫
如下制备本文所述特定实施例(例如实施例5-14)中所用的佐剂。将CpG-24555制备成存于水中的2mg/mL原液。所用明矾是含有10mg/mL铝的铝胶“85”(Brenntag Biosector)。将铝胶“85”与100μg肽或VLP偶联肽以1∶1的比率混合。通常，将高达25μL(对于肌内疫苗接种)或50μL(对于皮下疫苗接种)添加至含有100μg VLP的溶液中，并立即实施涡旋并置于冰上。以与肽溶液1∶1的比率添加TiterMax Gold(Alexis Biochemicals)。将50μL TiterMax Gold添加至用于100μL皮下剂量的50μL 2mg/mL肽溶液中，并使用Mixermill(SPEX Sample Prep)在4℃下乳化10分钟。将25μL(12μg)AbISCO-100(Isconova)添加至高达100μg VLP-肽溶液及5μL(10μg)CpG-24555中，实施涡旋并置于冰上。
按照普遍认可的方法实施本文所述特定实施例(例如实施例5-14)中所进行的免疫及动物操作。疫苗接种时，在尾巴根部经皮下注射高达100μL疫苗，或者将50μL疫苗注射至胫骨后肌及胫骨前肌的一或二者中。经由下颌下切缝或在结束时经由心脏穿刺采集血液。在驱血法及颈椎脱位后取出脾，并置于含有5％PBS及Penn/Strep(Invitrogen，目录号为15140-122)的冷的无菌HBBS(Invitrogen，目录号为14170)中。在70μm筛网(Falcon)上磨碎脾。在冰冷的HBBS中洗涤细胞，并使用ACK裂解缓冲液(Invitrogen)裂解红细胞。在Guava PCA 96(Guava Technologies公司)上计数脾细胞。
实施例16：优化pTau肽至Qbeta/VLP的偶联密度以获得期望免疫应答
实施实验以确定pTau肽表位至Qbeta/VLP的偶联密度(每一Qbeta单体亚基的肽数量)是否影响pTau特异性抗体应答。利用通过改变SMPH的摩尔过量与pTau肽过量产生的不同偶合条件来产生8种具有不同表位密度的pTau/VLP缀合物(表4)。在第0天及第14天(sc)使用100μg存于750μg明矾(Al(OH)3)中的不同密度缀合物中的每一者使具有5只雌性BalbC小鼠(8周龄)的群组免疫。在第26天采集血清。利用如实施例13中所述的抗原特异性效价测定分析对免疫动物的抗体应答进行研究。
基于显示于表4中第26天的效价结果，对于A-8P/QBeta，2.3的偶联密度与较高(3.6)密度偶联形式相比产生较高的效价免疫应答。对于不同的B-3P/Qbeta缀合物，效价类似且2.2及3.6偶联密度形式的效价最高。对于C-2P/Qbeta，2.2及3.5表位偶联密度产生类似效价，其略微高于4.3偶联密度形式。结果表明，表位偶联密度可以抗原特异性方式影响抗体应答，且通常，导致偶联密度为每一Qbeta单体2-3个pTau肽表位的偶合条件优选。
表4：在第0天及第14天使用10μg或100μg指定的不同偶合密度的存于750μg明矾(Al(OH)3)中的pTau-肽/Qbeta/VLP缀合物经皮下使小鼠免疫。在实施例13所述的抗原特异性效价测定分析中测试第26天的血清稀释物。显示效价结果。
Figure BDA0000141966330000691
表5：序列表概述
在下表中，且如本文先前所述，磷酸化的氨基酸以粗体表示且标以下划线。
Figure BDA0000141966330000692
Figure BDA0000141966330000701
Figure BDA0000141966330000711
Figure BDA0000141966330000721
权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.一种免疫原，其包含连接至免疫原性载体的抗原性tau肽，其中所述抗原性tau肽包含选自SEQ ID NO：4、6-26、105和108-112的氨基酸序列，并且其中所述抗原性tau肽通过式(G)nC所表示的接头共价连接至所述免疫原性载体，其中所述接头位于所述肽的C端(肽-(G)nC)或N端(C(G)n-肽)，并且其中n是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
2.权利要求1的免疫原，其中所述抗原性tau肽包含选自SEQ ID NO：4及6-13的氨基酸序列。
3.权利要求2的免疫原，其中所述抗原性tau肽由SEQ ID NO：11中所示的氨基酸序列组成。
4.权利要求1的免疫原，其中所述抗原性tau肽包含选自SEQ ID NO：14-19的氨基酸序列。
5.权利要求4的免疫原，其中所述抗原性tau肽由SEQ ID NO：16中所示的氨基酸序列组成。
6.权利要求1的免疫原，其中所述抗原性tau肽包含选自SEQ ID NO：20-24的氨基酸序列。
7.权利要求6的免疫原，其中所述抗原性tau肽由SEQ ID NO：21中所示的氨基酸序列组成。
8.权利要求1的免疫原，其中所述抗原性tau肽包含选自SEQ ID NO：105及108-112的氨基酸序列。
9.权利要求8的免疫原，其中所述抗原性tau肽由SEQ ID NO：105中所示的氨基酸序列组成。
10.权利要求1至9中任一项的免疫原，其中所述免疫原性载体是选自由HBcAg VLP、HBsAg VLP、和Qbeta VLP组成的组的病毒样颗粒。
11.一种组合物，其包含至少两种免疫原，每种所述免疫原包含连接至免疫原性载体的抗原性tau肽，其中：
a)第一种免疫原的抗原性tau肽由选自SEQ ID NO：4及6-13的氨基酸序列组成；且
b)第二种免疫原的抗原性tau肽由选自SEQ ID NO：14-19的氨基酸序列组成。
12.一种组合物，其包含至少两种免疫原，每种所述免疫原包含连接至免疫原性载体的抗原性tau肽，其中：
a)第一种免疫原的抗原性tau肽由选自SEQ ID NO：4及6-13的氨基酸序列组成；且
b)第二种免疫原的抗原性tau肽由选自SEQ ID NO：20-24的氨基酸序列组成。
13.一种组合物，其包含至少两种免疫原，每种所述免疫原包含连接至免疫原性载体的抗原性tau肽，其中：
a)第一种免疫原的抗原性tau肽由选自SEQ ID NO：14-19的氨基酸序列组成；且
b)第二种免疫原的抗原性tau肽由选自SEQ ID NO：20-24的氨基酸序列组成。
14.一种组合物，其包含至少两种免疫原，每种所述免疫原包含连接至免疫原性载体的抗原性tau肽，其中：
a)第一种免疫原的抗原性tau肽由选自SEQ ID NO：4及6-13的氨基酸序列组成；且
b)第二种免疫原的抗原性tau肽选自SEQ ID NO：105及108-112。
15.一种组合物，其包含至少两种免疫原，每种所述免疫原包含连接至免疫原性载体的抗原性tau肽，其中：
a)第一种免疫原的抗原性tau肽由选自SEQ ID NO：14-19的氨基酸序列组成；且
b)第二种免疫原的抗原性tau肽选自SEQ ID NO：105及108-112。
16.一种组合物，其包含至少两种免疫原，每种所述免疫原包含连接至免疫原性载体的抗原性tau肽，其中：
a)第一种免疫原的抗原性tau肽由选自SEQ ID NO：20-24的氨基酸序列组成；且
b)第二种免疫原的抗原性tau肽选自SEQ ID NO：105及108-112。
17.一种组合物，其包含选自由第一种免疫原、第二种免疫原、第三种免疫原、和第四种免疫原组成的组的至少三种免疫原，其中所述的第一种免疫原、第二种免疫原、第三种免疫原、和第四种免疫原中的每种均包含连接至免疫原性载体的抗原性tau肽，并且其中：
a)所述第一种免疫原的抗原性tau肽由选自SEQ ID NO：4及6-13的氨基酸序列组成；
b)所述第二种免疫原的抗原性tau肽由选自SEQ ID NO：14-19的氨基酸序列组成；且
c)所述第三种免疫原的抗原性tau肽由选自SEQ ID NO：20-24的氨基酸序列组成；
d)所述第四种免疫原的抗原性tau肽由选自SEQ ID NO：105及108-112的氨基酸序列组成。
18.一种药物组合物，其包含权利要求1至10中任一项的免疫原、或权利要求11至17中任一项的组合物、及药物可接受的赋形剂。

Claims (20)

1.一种免疫原，其包含至少一种连接至免疫原性载体的抗原性tau肽，其中所述抗原性tau肽包含选自以下的磷酸-tau表位：pSer-396磷酸-tau表位、pThr-231/pSer-235磷酸-tau表位、pThr-231磷酸-tau表位、pSer-235磷酸-tau表位、pThr-212/pSer-214磷酸-tau表位、pSer-202/pThr-205磷酸-tau表位、和pTyr 18磷酸-tau表位。
2.一种免疫原，其包含至少一种连接至免疫原性载体的抗原性tau肽，其中所述抗原性tau肽包含选自SEQ ID NO：4、6-26、105和108-112的氨基酸序列。
3.权利要求2的免疫原，其中所述抗原性tau肽通过式(G)nC所表示的接头共价连接至所述免疫原性载体，其中所述接头位于所述肽的C端(肽-(G)nC)或N端(C(G)n-肽)，并且其中n是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
4.权利要求3的免疫原，其中所述抗原性tau肽包含选自SEQ ID NO：4及6-13的氨基酸序列。
5.权利要求4的免疫原，其中所述抗原性tau肽由SEQ ID NO：11中所示的氨基酸序列组成。
6.权利要求3的免疫原，其中所述抗原性tau肽包含选自SEQ ID NO：14-19的氨基酸序列。
7.权利要求6的免疫原，其中所述抗原性tau肽由SEQ ID NO：16中所示的氨基酸序列组成。
8.权利要求3的免疫原，其中所述抗原性tau肽包含选自SEQ ID NO：20-24的氨基酸序列。
9.权利要求8的免疫原，其中所述抗原性tau肽由SEQ ID NO：21中所示的氨基酸序列组成。
10.权利要求3的免疫原，其中所述抗原性tau肽包含选自SEQ ID NO：105及108-112的氨基酸序列。
11.权利要求10的免疫原，其中所述抗原性tau肽由SEQ ID NO：105中所示的氨基酸序列组成。
12.权利要求1至11中任一项的免疫原，其中所述免疫原性载体是选自由HBcAg VLP、HBsAg VLP、和Qbeta VLP组成的组的病毒样颗粒。
13.一种组合物，其包含至少两种权利要求2的免疫原，其中：
a)第一种免疫原的抗原性tau肽由选自SEQ ID NO：4及6-13的氨基酸序列组成；且
b)第二种免疫原的抗原性tau肽由选自SEQ ID NO：14-19的氨基酸序列组成。
14.一种组合物，其包含至少两种权利要求2的免疫原，其中：
a)第一种免疫原的抗原性tau肽由选自SEQ ID NO：4及6-13的氨基酸序列组成；且
b)第二种免疫原的抗原性tau肽由选自SEQ ID NO：20-24的氨基酸序列组成。
15.一种组合物，其包含至少两种权利要求2的免疫原，其中：
a)第一种免疫原的抗原性tau肽由选自SEQ ID NO：14-19的氨基酸序列组成；且
b)第二种免疫原的抗原性tau肽由选自SEQ ID NO：20-24的氨基酸序列组成。
16.一种组合物，其包含至少两种权利要求2的免疫原，其中：
a)第一种免疫原的抗原性tau肽由选自SEQ ID NO：4及6-13的氨基酸序列组成；且
b)第二种免疫原的抗原性tau肽选自SEQ ID NO：105及108-112。
17.一种组合物，其包含至少两种权利要求2的免疫原，其中：
a)第一种免疫原的抗原性tau肽由选自SEQ ID NO：14-19的氨基酸序列组成；且
b)第二种免疫原的抗原性tau肽选自SEQ ID NO：105及108-112。
18.一种组合物，其包含至少两种权利要求2的免疫原，其中：
a)第一种免疫原的抗原性tau肽由选自SEQ ID NO：20-24的氨基酸序列组成；且
b)第二种免疫原的抗原性tau肽选自SEQ ID NO：105及108-112。
19.一种组合物，其包含权利要求2的四种免疫原中的至少三种免疫原，其中：
a)第一种免疫原的抗原性tau肽由选自SEQ ID NO：4及6-13的氨基酸序列组成；
b)第二种免疫原的抗原性tau肽由选自SEQ ID NO：14-19的氨基酸序列组成；且
c)第三种免疫原的抗原性tau肽由选自SEQ ID NO：20-24的氨基酸序列组成；
d)第四种免疫原的抗原性tau肽由选自SEQ ID NO：105及108-112的氨基酸序列组成。
20.一种药物组合物，其包含权利要求1至12中任一项的免疫原、或权利要求13至19中任一项的组合物、及药物可接受的赋形剂。
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