CN102197131A - 通过代谢竞争除去污染性的非人唾液酸 - Google Patents

通过代谢竞争除去污染性的非人唾液酸 Download PDF

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Abstract

本发明提供了减少或除去细胞培养物或人受试者中的Neu5Gc的方法。所述方法包括用糖苷连接形式的或游离形式的人唾液酸N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)或其前体N-乙酰甘露糖胺(ManNAc)漫灌系统，其量足以在Neu5Gc首次进入细胞或从预先存在的细胞分子的分解再循环时代谢竞争过Neu5Gc。此外，甚至在某些能够产生Neu5Gc的动物细胞中，Neu5Ac的供给引起Neu5Gc表达的减少。

Description

通过代谢竞争除去污染性的非人唾液酸
关于联邦资助的研究的说明
根据国立卫生研究所授予的奖助金No.GM032373，美国政府在本发明中具有一定的权利。
与相关申请的交叉引用
根据35U.S.C.第119条，本申请要求临时申请序列No.61/095,414的优先权，所述临时申请递交于2008年9月9日，在此将其公开通过引用而并入。
技术领域
本申请在唾液酸化学、代谢和抗原性的领域中。更特别地，本申请涉及N-羟乙酰神经氨酸(Neu5Gc)(其为在人中是免疫原性的非人唾液酸)，用于实验室和人使用的无Neu5Gc哺乳动物产品的生产，和从人体中除去Neu5Gc。
背景
所有的细胞均被糖链的密集和复杂的阵列所覆盖。唾液酸(Sias)是典型地出现在这些链的最外部单元处的九碳糖家族。由于它们的末端位置，唾液酸对于许多外源的和内源的受体(例如流感病毒和内源蛋白的涎免凝集素(Siglec)家族)起到结合位点的作用。因此此类糖是预防和治疗感染的有用的药物靶点。它们还涉及各种生物的和病理的过程，例如神经元可塑性和的癌症转移。在许多这些情况中，唾液酸的精确结构和其所附着的残基发挥关键性的作用。
胞苷一磷酸-N-乙酰神经氨酸水解酶(CMAH)将唾液酸N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)转化为N-羟乙酰神经氨酸(Neu5Gc)。在非人哺乳动物中，Neu5Gc被许多内源性结合蛋白及病原性生物体(例如细菌和病毒)所识别。人类不能产生内源性的Neu5Gc，因为其CMAH基因中的进化失活突变。
此外，已知Neu5Gc在人中是免疫原性的。该免疫原性被认为对在接触了哺乳动物产品(例如源自非人哺乳动物或被暴露于非人哺乳动物的化妆品、食物、哺乳动物细胞和细胞产品、以及治疗剂)的人中所观察到的免疫应答起作用。已试图尝试使用RNAi抑制CMAH基因的表达而通过改变细胞系来减少所述细胞系中重组产生的人糖蛋白的Neu5Gc含量。(Chenu S.，等人，Biochim.Biophys.Acta.，1622(2)：133-144，2003)。
概述
非人唾液酸N-羟乙酰神经氨酸(Neu5Gc)通过以代谢的方式被分别掺入培养的细胞和人组织中而污染生物治疗产品和人体。在第一种情况中，污染来自培养基中源于动物的组分和/或所使用的动物细胞系；而在第二种情况中，污染来自从食物(例如红肉)中的膳食摄取。本公开的方法除去或减少人受试者、生物治疗剂或细胞系中Neu5Gc的量。所述方法包括以人唾液酸N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)，其衍生物、类似物或前体(例如，N-乙酰甘露糖胺(ManNAc))漫灌系统。所使用的Neu5Ac也可以单体的形式结合至其他分子，或以多聚体的形式(聚唾液酸)结合。在这些情况下，所结合的Neu5Ac将通过细胞过程被释放然后以类似于被结合的形式的方式起作用。Neu5Ac和Neu5Gc都为被CMP-Sia合成酶活化而竞争。因此，通过在Neu5Gc首次进入细胞时和/或从预先存在的细胞分子的分解再循环时代谢竞争过Neu5Gc，任何来源的过量的Neu5Ac提供了简单有效的减少或除去Neu5Gc负荷的方法。此外，本公开提供用于减少CMAH阳性动物细胞中的Neu5Gc产生的方法，包括用大丸的或浓度递增的Neu5Ac漫灌系统，其抑制内源性Neu5Gc的产生。
本公开提供的方法包括以足够的量、在足够的时期内、用有效量或递增量的N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)、其衍生物、类似物或前体培养细胞系以除去或大量地减少细胞或细胞系中的、或由所述细胞或细胞系产生的产品中的Neu5Gc。在一个实施方式中，所述细胞系包含用于治疗性蛋白生产的哺乳动物细胞系。在另一个实施方式中，所述细胞系包含hESC、诱导的干细胞、胚状体细胞或任何其他意在用于人中的治疗应用或用于生产治疗性产品的细胞。
本公开提供减少生物治疗产品中Neu5Gc的量的方法，包括：在包含Neu5Ac的培养基中，在用于生产生物治疗产品的条件下培养哺乳动物细胞培养物。
本公开还提供制备用于移植的、含有Neu5Gc的组织的方法，包括将所述组织暴露于缺少Neu5Gc且包含足量的N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)或其前体N-乙酰甘露糖胺(ManNAc)的培养基。
除去Neu5Gc的方法和组合物可用于人，因为Neu5Ac(其衍生物、或类似物、或前体)是可以散布到体内各区室并因此影响体内所有细胞的小分子。因此本公开提供治疗感染性疾病或癌症的方法，包括向受试者施用递增量的、结合或游离形式的N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)或其前体N-乙酰甘露糖胺(ManNAc)，直至Neu5Gc的水平降低或从受试者中被去除。例如，本公开表明暴露于饮用水中的1mM Neu5Ac超过6个月的小鼠未产生明显的毒性，表示所述过程对于在人中长时间的使用是安全的。
本公开还提供了相比于Neu5Gc的水平，具有升高的Neu5Ac或其前体的食物、饮料或细胞培养基产品。在一个实施方式中，所述食物、饮料或细胞培养基包含约0.1mM-20mM或更多的结合或游离形式的Neu5Ac。
本公开还提供了在含有Neu5Gc酶途径的动物中减少Neu5Gc产生的方法，所述方法包括对动物施用有效量的Neu5Ac，其衍生物、类似物或前体，其中所述有效量减少或除去所述动物中Neu5Gc的产生。
在上述所有用于动物用途(包括人用途)的方法中，Neu5Ac可以是膳食补充物的形式，可作为包含高水平Neu5Ac的天然膳食产品的一部分，可以是合成的Neu5Ac，可以是单体或多聚体形式的、结合的或未结合形式的Neu5Ac。关于培养方法，可将来自合成或其他生产方法的，结合、非结合形式的Neu5Ac加入培养基中。对于施用或膳食消耗而言，Neu5Ac可以是基本上纯化的形式。
本公开的一个或多个实施方式的细节如所附的附图和以下的描述中所示。从说明书和附图以及权利要求中，本公开的其他特征、目标和优势将是显然的。
附图简述
图1显示在两个细胞系中添加和未添加Neu5Ac时的Neu5Gc含量图。稳定转染的、表达重组可溶的涎免凝集素9-Fc或涎免凝集素13-Fc蛋白的CHO-KI细胞，在不存在或存在5mM Neu5Ac(Ac)时生长。CHOSig9细胞在含有10％FCS和80μM MTX的MEM alpha中生长至70％汇合。CHOSig13细胞在含有10％FCS和1.2mg/ml G418的MEM alpha中生长至70％汇合。首先以PBS冲洗所述细胞两次，然后加入含有2％低IgG FCS和5mM Neu5Ac的Optimem培养基三天，在第三天收集所述培养基(第3天)，加入含有Neu5Ac的新鲜培养基并在两天后(第5天)收集，再次加入含有Neu5Ac的新鲜培养基并在第7天收集。将各个收集的培养基离心以去除细胞碎片，调节至5mM Tris-HCl pH 8并以250μl的蛋白质-A琼脂糖、在4℃下孵育3天以结合嵌合蛋白。针对各时间点和细胞类型，用PBS清洗树脂，并用0.1M pH3的甘氨酸洗脱。在用1M Tris-HCl pH 8中和至pH7后，使用Millipore Ultrafree-15 30K截止装置浓缩被洗脱的蛋白质。使用Pierce BCA蛋白质测定试剂盒确定蛋白质的浓度。将经纯化的蛋白质的等份用2M醋酸在80℃下水解3小时以释放唾液酸，随后用DMB试剂进行衍生化。HPLC分析通过反相色谱法在C18柱上、在等度模式中以85％的水、8％的乙腈和7％的甲醇在0.9ml/min下进行，且检测了荧光。获得了各峰下的面积且确定了相对于Neu5Ac，各样品中Neu5Gc的百分比。结果显示附着于两种蛋白的Neu5Gc的量均通过Neu5Ac的加入而显著减少。这提供了减少在CHO细胞中生产的生物治疗产品中的Neu5Gc污染的方法。
图2A-E显示减少在积累了来自环境的Neu5Gc的人细胞中制备的生物治疗产品中的Neu5Gc污染的方法。(A-B)用游离的Neu5Ac饲养人293T细胞减少了糖缀合物中预先存在的Neu5Gc的含量。人293T细胞在DME+10％FCS中、在5mM Neu5Gc的存在下生长3天，以使细胞负载Neu5Gc。然后用PBS清洗所述细胞，将其分入两种相同的培养物中，一种加入了5mM Neu5Ac，而另一种没有。然后如图所示将细胞培养数天，收获细胞，用HPLC分析乙醇可溶的低分子量级分(A)和乙醇可沉淀的蛋白质(B)二者中Neu5Gc和Neu5Ac的含量。所显示的％Neu5Gc是相对于总的唾液酸，Neu5Gc的量。可见Neu5Ac在培养基中的存在显著地加快了Neu5Gc从细胞中除去的速度。(C-E)用游离的Neu5Ac饲养CHO细胞减少了具有内源性CMAH的动物细胞系的总细胞膜和分泌的糖蛋白中的Neu5Gc。稳定转染的表达重组可溶的IgG-Fc融合蛋白的CHO-KI细胞在不存在或存在5mM Neu5Ac(Ac)时生长。首先用PBS清洗细胞两次，然后加入含2％低IgG FCS和5mM Neu5Ac的Optimem培养基三天，在第三天收集所述培养基(第3天)，加入含Neu5Ac的新鲜培养基并在2天后(第5天)收集，再次加入含Neu5Ac的新鲜培养基并在第7天收集。将各个收集的培养基离心以去除细胞碎片，调节至5mM Tris-HCl pH 8。用蛋白质-A琼脂糖纯化融合蛋白。(C)将经纯化的蛋白质的等份用2M醋酸在80℃下水解3小时以释放唾液酸，随后用DMB试剂进行衍生化并使之经受HPLC分析。获得了各峰下的面积且确定了相对于Neu5Ac，各样品中Neu5Gc的百分比。可见Neu5Gc的含量相对于对照明显减少。(D)制备来自相同的CHO细胞的总细胞膜并用于DMB-HPLC分析。再次可见Neu5Gc的含量相对于对照明显减少。(E)通过SDSPAGE分离来自上述实验的CHO膜蛋白并将其转移到硝化纤维素膜上。通过用亲和纯化的多克隆鸡抗-Neu5Gc抗体孵育而检测Neu5Gc的表达。可见Neu5Gc-表达在蛋白质方面相对于对照明显减少。
图3显示来自喂食了含有大量糖苷连接的Neu5Ac的食物的4名人受试者的尿中Neu5Ac的含量。可见在紧接着摄食富含Neu5Ac的食物的时间段中尿的Neu5Ac含量显著增加。类似于细胞实验，预期此方法会以Neu5Ac漫灌人体。反复应用该方法将最终从人体中除去Neu5Gc。
发明详述
在本申请和所附的权利要求中所用的单数形式“a”、“an”和“the”包括复数指示物，除非语境清楚地表明另外的情况。因此，例如，引用“Neu5Gc”包括数种此类分子和引用“Neu5Ac”包括引用本领域技术人员所知的一种或多种Neu5Ac，等等。
此外，除非陈述了其他情况，使用“或”意味着“和/或”。类似地，“包含(comprise)”、“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“包括(include)”、“包括(includes)”和“包括(including)”可互换而不意在是限制性的。
此外将理解当各种实施方式的描述使用术语“包含”时，本领域技术人员将理解在一些特定的情况下，可使用语言“基本上由…组成”或“由…组成”来备选地描述实施方式。
除非另外限定，本申请中使用的所有技术和科学术语与本公开所属领域一般技术人员所通常理解的具有相同的含义。尽管与本申请中描述的方法和材料类似或等同的方法和材料可被用于实施所公开的方法和组合物，示例性的方法，设备和材料被描述于本申请中。
上面和贯穿全文所讨论的出版物仅为其在本申请递交日之前的公开而被提供。本申请中没有任何内容将被解释为承认发明人不能因为在先公开而有权先于此类公开。
唾液酸(Sia)是酸性九碳糖家族的通用名称，通常被发现作为脊椎动物细胞多糖包被上和分泌的糖蛋白上聚糖链的最外部的单元。它们在所有脊椎动物细胞上的位置和广泛存在允许其涉及下列过程，例如配体-受体相互作用，细胞-细胞识别，细胞-病原体结合，炎性过程，免疫应答和肿瘤转移。
已知自然中有多于50种唾液酸。大部分经由称为N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)的唾液酸的生物合成修饰而衍生。将单个氧原子加至Neu5Ac的N-乙酰基基团产生很常见的、称为N-羟乙酰神经氨酸(Neu5Gc)的变化。迄今研究的大部分灵长类细胞类型的表面由这两种主要的唾液酸占优势。
为了使唾液酸(Sia)分子附着至糖缀合物，必须通过转化为糖核苷酸衍生物胞苷一磷酸唾液酸(CMP-Sia)而先将所述唾液酸(Sia)活化。唾液酸在核中被转换为CMP-Sias，然后其从核中返回至细胞溶胶，以便被转运到高尔基体中。CMP-Sias作为高能量供体用于使Sias在到细胞表面的途中附着至新合成的糖缀合物。Neu5Ac到Neu5Gc的生物合成转化发生在所述糖核苷酸水平，其中CMP-Neu5Ac水解酶(CMAH)催化氧原子到CMP-Neu5Ac的转移，产生CMP-Neu5Gc。然后CMP-Neu5Gc可被转运到高尔基体中并以与CMP-Neu5Ac相同的方式被用来将Neu5Gc加至新合成的糖缀合物。这两种核苷酸糖似乎被高尔基CMP-Sia转运子和转运Sia残基到细胞表面和被分泌的糖缀合物的哺乳动物唾液酸转移酶可互换地使用。在溶酶体降解过程中从糖缀合物中释放的Neu5Ac或Neu5Gc分子还可以通过特定的转运子被输出回胞质区室中。在那里，所述分子可用于作为底物而用来转化为其各自的CMP-Sia形式。Neu5Gc可被“再循环”而用于在高尔基唾液酸化(sialation)反应中重复使用。
非人唾液酸N-羟乙酰神经氨酸(Neu5Gc)通过被代谢地掺入培养细胞和人组织中而污染生物治疗产品和人体。在前一种情况中，污染来自培养基中源于动物的组分和/或所使用的动物细胞系，在第二种情况中，污染来自膳食摄取。防止所述Neu5Gc掺入是非常困难的，因为对于培养基或膳食所需的处理程度是可观的。
Neu5Gc也许是非人哺乳动物细胞中最广泛地表达的唾液酸。尽管人类在产生Neu5Gc方面是遗传缺陷性的，少量的Neu5Gc存在于人细胞中。通过人志愿者研究，以及通过观察到游离的Neu5Gc通过未知机理被代谢地掺入培养的人细胞中，提示了膳食起源。研究显示Neu5Gc的掺入可能主要源于膳食来源(Tangvoranuntakul，P.等人Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)(2003)100：12045-12050)。
例如，来自例如牛肉、猪肉和羊肉来源的红肉特别富含Neu5Gc且可能是人膳食中Neu5Gc的主要来源。此外，奶制品含有Neu5Gc，虽然在比红肉低一些的水平上。
此外，由遗传工程哺乳动物细胞或异源或异种细胞(例如移植物)生产的生物治疗产品可包含Neu5Gc。Neu5Gc在培养于动物产品中用于人治疗剂的人细胞中的存在也是潜在的抗原性来源。更特别地，当人细胞被培养于来自动物的血清中时，其可摄取和掺入Neu5Gc，如果此类细胞被用于治疗(例如移植源于人胚胎干细胞的移植物)就潜在地引起免疫排斥。例如由经转化的哺乳动物细胞(例如CHO细胞)产生的生物治疗剂可直接地或通过培养物产生含有Neu5Gc的材料。从此类培养物中去除Neu5Gc是重要的。
已表明游离Neu5Gc的摄取发生在各种哺乳动物细胞和组织中，例如分泌细胞，癌细胞和血管。某些非网格蛋白介导的(即不依赖于受体的)胞吞途径的抑制剂减少Neu5Gc的积累。以人突变细胞进行的研究显示游离Neu5Gc的代谢性掺入需要溶酶体的唾液酸转运子。来自异源糖缀合物的糖苷连接的Neu5Gc的掺入(与暴露于膳食Neu5Gc的人肠上皮有关)需要转运子和可能用以释放游离Neu5Gc的溶酶体唾液酸酶。因此，外源的Neu5Gc经由胞饮/胞吞途径到达溶酶体，并以游离的形式被输出到胞质溶胶中，可用于活化作用和转移至糖缀合物。相反地，N-羟乙酰甘露糖胺(ManNGc)显然通过被动扩散低效地横过质膜并可用于在胞质溶胶中向Neu5Gc的转化。
大多数正常健康人具有一定量的循环的抗Neu5Gc抗体，可能因为下列事实：大多数人摄食源于含高水平Neu5Gc的非人哺乳动物的食物来源或其他材料。例如，可能以Neu5Gc接种受试者的材料包括异种(即非人)来源的生物材料(例如来自培养方法，如干细胞培养，生物反应器系统等)以及植入/移植材料。由于摄取和Neu5Gc在从暴露于含有Neu5Gc的产品的人细胞发育而来的任何组织的表面上的表达，此类材料可引起降低治疗成功的免疫应答。这一问题也可影响重组可溶性生物治疗产品。
尽管Neu5Gc是大多数哺乳动物细胞中主要的唾液酸，其长期被认为在健康人组织中是不存在的(Traving，C，等人，Cell.Mol.Life.Sci.54：1330-1349，1998)。的确，人在遗传上不能合成Neu5Gc，由于人CMAH基因中的外显子缺失/移码突变(Varki，A.，Yearb.Phys.Anthropol.44：54-69，2002；Chou，H.H.，等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：11751-11756，1998；和Irie，A.等人J.Biol.Chem.273：15866-15871，1998)。已估计此突变发生在类人系中-2.5至3百万年前(Chou，H.H.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99：11736-11741，2002)。
尽管不存在任何已知的在人中合成Neu5Gc的备选途径，各个小组已使用了抗体研究Neu5Gc在人肿瘤中、特别是在各种癌中的表达。(Hirabayashy，Y.等人，Jpn.J.Cancer Res.78：251-260，1987；Miyoshi，I.等人，Mol.Immunol.23：631-638，1986；Marquina，G.等人，Cancer Res.56：5165-5171，1996；Carr，A.等人，Hybridoma19：241-247，2000；Devine，P.L.，等人，Cancer Res.51：5826-5836，1991；Kawachi S.等人，Int.Arch.Allergy Appl.Immunol.85：381-383，1988；和Higashi，H.等人，Jpn.J.Cancer Res.79：952：956，1998)。近期的研究重新探索了这些发现，证实了Neu5Gc在人癌症中表达的先前报道并且将发现扩展至正常人组织，包括在正常人的上皮和内皮细胞中检测到少量的Neu5Gc。确定性的证实来自通过HPLC和质谱分析利用荧光衍生形式的Neu5Gc从所述组织中释放和纯化唾液酸(Tangvoranuntakal，P.，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100：12045-12050，2003)。已显示外源添加的游离Neu5Gc在体外被掺入所培养的人癌细胞中。此外，人志愿者中Neu5Gc的口服研究提供下述证据：在人组织中发现的Neu5Gc可源自膳食来源(Tangvoranuntakal，P.，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA100：12045-12050，2003)，特别是来自红肉和奶产品。
已将Neu5Gc与细胞增生性病症、癌症、组织排异和炎症相关联(“Neu5Gc关联性病症”)。因为Neu5Gc是非人动物产品膳食组分，组织移植物、生物治疗剂和基于细胞的疗法递送所述非人Neu5Gc产品到人体，在那里抗体可反应并引起炎症、组织排异等。
相应地，从人或人消耗的产品中去除或减少Neu5Gc可被用于减少免疫应答和疾病发展。本公开提供用于从人受试者中去除或减少、从动物或动物产品中去除或减少、从膳食消耗品中去除或减少、和从治疗剂中去除或减少所存在的Neu5Gc的方法。在一个实施方式中，所述方法可与减少动物或人对Neu5Gc的摄取的方法相结合。
本公开表明可通过用人唾液酸N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)、其衍生物、类似物或前体(例如ManNAc)漫灌系统而除去或大幅减少所掺入的Neu5Gc。所述方法可代谢地与之前掺入的Neu5Gc竞争或减少或除去包含CMAH基因的生物体或细胞中的Neu5Gc。本公开的方法可被用于当Neu5Gc首次进入细胞时或从预先存在的细胞分子的分解再循环时去除或减少Neu5Gc。所述方法可被用于任何哺乳动物系统或生物体包括人细胞和人。例如，已显示Neu5Ac在长期暴露后对小鼠是无毒性的，相应地这一方法可用于培养中的细胞和用于完整的哺乳动物体(例如人受试者)。
在一个实施方式中，本公开提供生产无Neu5Gc的生物治疗剂、细胞产品、细胞培养物及由此而得的产品的方法，包括用N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)，Neu5Ac前体N-乙酰甘露糖胺(ManNAc)或合适的Neu5Ac或ManNAc的衍生物漫灌(例如冲洗(flushing)/驱逐(chasing))细胞、培养物或受试者。Neu5Ac、ManNAc或其衍生物的量包含当Neu5Gc首次进入细胞时和/或从预先存在的细胞分子的分解中再循环时足以代谢地竞争过Neu5Gc的量。因此，本公开的方法和组合物可用于去除或减少受试者、细胞或动物中所存在的Neu5Gc，或可用于通过竞争性置换防止Neu5Gc的摄取或合成。
如本申请中所使用的，Neu5Ac组合物通常指含有N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)、Neu5Ac前体N-乙酰甘露糖胺(ManNAc)、或Neu5Ac或ManNac的衍生物的组合物。N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)、Neu5Ac前体N-乙酰甘露糖胺(ManNAc)、或Neu5Ac或ManNac的衍生物可源自天然来源或可通过标准化学方法被合成或可通过重组或酶促过程被生成。所使用的Neu5Ac也可以单体的形式结合至其他分子，或者以多聚体的形式(聚唾液酸)结合。在这些情况下，结合的Neu5Ac将通过细胞过程被释放且然后以类似于被结合的形式的方式起作用。
本公开表明可通过用N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)、其前体N-乙酰甘露糖胺(ManNAc)、或其衍生物，包括单体和多聚体形式的Neu5Ac漫灌细胞、培养物或受试者来去除或大幅减少所述细胞中的Neu5Gc。Neu5Ac、ManNAc或其衍生物的量包含当Neu5Gc首次进入细胞和/或从预先存在的细胞分子的分解中再循环时足以代谢地除去Neu5Gc的量。在一个实施方式中，所述方法被用于替换受试者的细胞中先前掺入的Neu5Gc。而在另一个实施方式中，所述方法被用于减少含有功能性CMAH基因的细胞或生物体中Neu5Gc的合成。
用Neu5Ac“漫灌”细胞或受试者意指提供在Neu5Ac方面高而含很少或不含可检测到的Neu5Gc(例如，至少99％-100％无Neu5Gc)的组合物。把所述过程认为是从细胞或生物体中冲洗或驱逐Neu5Gc可能是有帮助的。用于漫灌细胞或受试者的Neu5Ac的量是足以减少和除去Neu5Gc而对受试者或细胞无毒性的量。所述量将取决于生物体的大小、重量、类型，培养条件，受试者或细胞中Neu5Gc的量，细胞或生物体是否具有功能性CMAH基因或同源体等等而变化。使用本领域中的技术可容易地确定所述量。用于漫灌受试者系统或培养系统的Neu5Ac可以是天然存在的Neu5Ac(以游离形式或糖苷连接的形式)或纯合成的Neu5Ac或其组合。来自膳食制备物的Neu5Ac的来源是已知的，其包括例如燕窝汤。合成Neu5Ac或其衍生物的方法在本领域中已知。
在一个实施方式中，在产生所期望的产品的条件下生长和扩增或培养细胞培养物。培养条件可包括无Neu5Gc的培养基或包含N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)、N-乙酰甘露糖胺(ManNAc)或其衍生物或类似物的无Neu5Gc的培养基，所述N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)、N-乙酰甘露糖胺(ManNAc)或其衍生物或类似物的量足以除去细胞中预先存在的Neu5Gc或减少Neu5Gc的产生。例如，目前用于生产生物治疗产品的一些细胞(例如CHO细胞)已经含有和产生Neu5Gc和/或从培养基中获得Neu5Gc。在一些实施方式中，以有效量或递增量的Neu5Ac和/或其前体或衍生物或其类似物培养产生目的生物治疗产品的细胞系以从培养物中去除Neu5Gc。如图2E中所表明的，通过所述递增量的Neu5Ac、其衍生物、类似物或前体，CHO细胞膜糖蛋白中存在的Neu5Gc大大减少。类似地，纯化的由CHO细胞分泌的产品上Neu5Gc的量稳定地减少直至不可检测到(图1)。因此，本公开提供这样的方法和组合物，其通过将Neu5Ac加入培养基，可用于从已建立的动物细胞系中已产生的所存在的生物治疗产品中除去Neu5Gc。
此外，本公开的方法可有效地减少具有完整CMAH基因的生物体或源自所述生物体的细胞中的Neu5Gc的量。除不具有完整CMAH基因的人细胞中所运行的代谢竞争机制之外，所述方法引起具有完整CMAH基因的细胞中Neu5Gc的产生。
如本申请中所使用的，术语“培养基(medium)”或“培养基(media)”指任何用于生长和收获细胞的培养基和/或所述细胞所表达和/或分泌的产品。所述“培养基(medium)”或“培养基(media)”包括但不限于可支持或含有任何宿主细胞和细胞内容物的液体、固体、半固体或刚性支持，其中所述宿主细胞以举例的方式包括，细菌宿主细胞，酵母宿主细胞，昆虫宿主细胞，植物宿主细胞，真核宿主细胞，哺乳动物宿主细胞，CHO细胞，原核宿主细胞，大肠杆菌(E.coli)或假单胞菌宿主细胞。所述“培养基(medium)”或“培养基(media)”包括但不限于宿主细胞已生长于其中、多肽已被分泌于其中的培养基，包括增殖步骤之前或之后的培养基。所述“培养基(medium)”或“培养基(media)”还包括但不限于含有宿主细胞裂解物(例如，细胞内产生的多肽，及裂解或破坏宿主细胞以释放所述多肽)的缓冲液或试剂。
在一个实施方式中，细胞或细胞系在第一培养基中生长、被清洗然后生长在无Neu5Gc且含有Neu5Ac的第二培养基中。在另一个实施方式中，所述培养基包含Neu5Ac，所述Neu5Ac的浓度至少是所述培养基中Neu5Gc浓度的1倍、2倍、3倍或更高。
人胚胎干细胞(hESCs)可潜在地生成所有身体细胞类型，使其成为用于细胞和组织替换疗法的极佳候选者。典型地在鼠类饲养层上用源于动物的“血清替换物”培养hESCs。这两者都是非人唾液酸Neu5Gc的来源，很多人具有针对所述非人唾液酸Neu5Gc的循环抗体。在标准条件下，hESC和衍生的胚状体都代谢地掺入显著量的Neu5Gc(Martin，M.J.，Muotri，A.，Gage，F.，和Varki，A.，Human embryonic stem cells express an immunogenic non-human sialic acid.Nat Med.11：228-232，2005)。使用本公开的方法，通过在没有Neu5Gc或有检测不到的Neu5Gc、以及有效量的Neu5Ac(例如，足够的或递增的Neu5Ac浓度)以替换细胞中Neu5Gc的条件下培养hESC、诱导的干细胞或胚状体或由其衍生的细胞，可降低或除去Neu5Gc的水平。所述培养基将包含约0.1mM至20mM或更多的Neu5Ac。所述方法可包括在通过将培养基或其组分暴露于抗Neu5Gc抗体而已排除Neu5Gc的培养基中培养细胞或使用制备自或源自缺乏功能性CMAH多肽/基因的转基因生物体的血清或培养基。
本公开的各种组合物和方法中所用的血清或细胞可源自CMAH转基因动物。例如，干细胞培养中所用的饲养层细胞可源自CMAH敲除转基因动物。本公开的方法可与所述CMAH敲除细胞或血清制备物结合使用以进一步从培养系统中“冲洗”任何在分离、传代等过程中可能已被掺入的Neu5Gc。CMAH转基因动物可在CMAH基因中具有敲除或具有突变的CMAH基因。所述CMAH转基因动物产生无Neu5Gc的产品或相比于野生型动物具有减少的Neu5Gc负荷的产品。在另一个实施方式中，血清替换物现在可用于培养完全缺乏动物产品的细胞和组织。
可使用许多普通的细胞培养技术。典型的传代、无血清培养基、含血清培养基、低温保存及相关的技术是本领域公知的。培养的方法将取决于生物体和/或细胞类型及其生长要求。在多数情况下，hESCs被培养于动物饲养层上，最常见的是小鼠成纤维细胞。然而，由于在本申请的别处所讨论的原因，这些饲养层作为不希望的Neu5Gc的另外的来源，所述不希望的Neu5Gc然后可被掺入被培养的细胞中。相应地，在将为过于谨慎的尝试中，可能希望通过与使用人饲养层一起在培养基中使用人血清、以有效浓度的Neu5Ac培养所述细胞以替换或竞争过先前掺入的Neu5Gc或减少Neu5Gc的生产，以进一步去除任何Neu5Gc的来源。培养条件可包括约0.1mM至20mM或更多的Neu5Ac。
正如在本申请中所用的，术语“缺乏Neu5Gc”或“无Neu5Gc”意指Neu5Gc与总唾液酸的比率小于5％，并甚至小于1％或是检测不到的。例如，通过在亲和柱中利用抗Neu5Gc抗体可利用Neu5Gc的免疫原性，以去除产品中存在的任何Neu5Gc。备选地，各种人细胞、组织、胚状体、神经系细胞、癌细胞、皮肤细胞和器官(在此统称为“细胞”)可用Neu5Ac培养且保存在Neu5Ac-环境中足够长以使它们不含Neu5Gc。如以上文所讨论的，任何存在于培养物或储存培养基中的Neu5Gc可被掺入细胞中，因此除去Neu5Gc，且使用有效量的Neu5Ac可从所述细胞中除去Neu5Gc。
除hESCs外，其它在本公开范围内的细胞类型包括，例如，胰岛细胞、内皮、肝细胞、肾细胞、心脏细胞、成纤维细胞等。然而，最显著地，还未完全分化的祖细胞和多潜能细胞作为用于涉及细胞植入的治疗处理的潜在来源对科学研究有很大的用处。此外，本申请中所描述的方法可在避免传递抗Neu5Gc抗体或掺入另外的Neu5Gc的条件下被用于在移植前保存人器官。
本公开的方法可与其他防止Neu5Gc的掺入的试剂联合使用。在一个实施方式中，本公开表明了将本公开的方法应用于人细胞系或小鼠细胞系。用含有递增量的人唾液酸Neu5Ac的培养基“驱逐”或“冲洗”所述细胞。当向培养基中加入Neu5Ac时，细胞中Neu5Gc的水平降低得更快，在约5mM时所述效果达到峰值。因此，Neu5Ac可在约1mM至大于15mM的范围内被使用(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15mM或更多)。
目前用于生产生物治疗产品的细胞(例如CHO细胞)可能已经含有和产生Neu5Gc和/或从培养基中获得Neu5Gc。本公开的方法通过可被一般性地描述为Neu5Gc再循环或Neu5Gc生产中的代谢竞争的过程而从生物治疗产品中减少或去除Neu5Gc。所述方法可区别于竞争性“摄取”过程，在竞争性“摄取”过程中，Neu5Gc的摄取被Neu5Ac竞争性地取代了。然而，本公开的方法替换了先前掺入的Neu5Gc和/或Neu5Gc的合成(对于包含功能性的CMAH基因或同系物的细胞而言)。在一个实施方式中，细胞系已经在产生目的生物治疗产品，然后以递增量的人唾液酸Neu5Ac和其类似物或衍生物和/或其前体培养所述细胞系以去除或减少Neu5Gc。所述Neu5Ac、衍生物、类似物、或前体替换(代谢地竞争)先前被掺入细胞培养物中的Neu5Gc。随着时间，Neu5Gc被从培养物中替换或除去。典型地，与未接受任何Neu5Ac的相同培养物相比，所述过程以可检测的量减少了Neu5Gc。在某些情况下，所述减少可以是1、2、3、4、5倍或更多。
本公开的方法还提供了治疗人的Neu5Gc关联性病症的方法或防止此类病症发生的方法。所述方法包括以大丸剂、多次递送或稳定递增递送的方式向受试者配量施用(dosing)(通过膳食消耗或医疗干预)Neu5Ac。所述方法将Neu5Ac作为Neu5Gc的代谢竞争剂递送，其帮助从身体中去除Neu5Gc。典型地，可通过尿样品、组织样品、血液、血清或血浆取样监控Neu5Ac和Neu5Gc的量。
所述方法包括以有效减少Neu5Gc含量的量向受试者施用包含合成的或天然存在的游离或结合的Neu5Ac、Neu5Ac类似物、Neu5Ac衍生物、前体或它们的任意组合的组合物。合成Neu5Ac的方法是本领域中已知的。可通过酶促反应、通过重组生物体和通过标准化学反应获得Neu5Ac。某些食物和细菌多糖也含有大量的Neu5Ac。
在另一个实施方式中，在个体被置于Neu5Gc缺乏性膳食约三天后(以清理胃肠道和除去任何新的Neu5Gc来源)测试人尿的Neu5Gc含量。在这一阶段后，将24小时的尿收集物用于确定尿中Neu5Gc的基线水平(例如，从体内的各种细胞类型排出并最终在尿中)。进行所述测量或多个该测量之后，然后给予所述个体大剂量的或递增的更大剂量的Neu5Ac(例如，源自天然来源)。所述Neu5Ac处理的重复循环可最终引起身体Neu5Gc负荷的逐渐减少。
可通过任何途径(例如，静脉内的、口服的、腹膜内地等等)施用Neu5Ac。此外，本公开的方法可利用另外的膳食方法，包括但不限于，(i)无Neu5Gc食物的膳食，(ii)低量Neu5Gc食物的膳食，(iii)高Neu5Ac食物的膳食，或者(i)或(ii)与(iii)的任意组合。所述组合物和方法对从受试者中除去已掺入的Neu5Gc是有用的。换言之，所述组合物将所存在的Neu5Gc从细胞系统的实验对象中“冲洗”掉。尽管不希望被特定的理论所约束，当已经被掺入受试者或细胞系统的Neu5Gc被再循环时，本公开的方法和组合物所提供的过量Neu5Ac替换Neu5Gc。这和在最初接触时与Neu5Gc的掺入竞争的方法相反。然而，将认识到，除了去除先前掺入的Neu5Gc之外，所述方法可用于防止从膳食或细胞培养系统中摄取Neu5Gc。
为防止进一步从食物来源将Neu5Gc摄取到体内，含有Neu5Ac或ManNAc的片剂或饮料可与已知含有Neu5Gc的餐食或与包含减少的或无Neu5Gc的食物/饮料的餐食一同被提供。也可以使用某些已知富含唾液酸的食物。
在一个实施方式中，向呈现出Neu5Gc关联性病症的受试者或被怀疑患有Neu5Gc关联性病症的受试者施用Neu5Ac组合物，将所述受试者置于Neu5Ac膳食、向所述受试者施用Neu5Ac组合物并将其置于低或无Neu5Gc膳食、或将所述受试者置于Neu5Ac膳食和低或无Neu5Gc膳食。由于Neu5Gc在受试者中被代谢替换，将会有Neu5Gc含量的减少，例如在尿中。
以下实施例意在阐释而非限制本公开。虽然它们是典型的可能被使用的，其他本领域技术人员所知的程序可备选地被使用。
实施例
用中国仓鼠卵巢(CHO-Kl)细胞和分离自CMAH基因敲除小鼠的自发性肿瘤的上皮细胞进行实验。但是，由于非人细胞经常具有大量内源性的Neu5Gc，在人细胞中的结果更显著。
游离的Neu5Ac和Neu5Gc通过相同的途径被摄取和掺入。Neu5Ac和Neu5Gc可由细胞从外源性来源摄取并被掺入内源性糖缀合物中。Neu5Gc和Neu5Ac被基本上所有导致其最终被掺入糖缀合物中的步骤可互换地使用。
通过在Caco-2和人正常成纤维细胞中进行竞争实验，确定了Neu5Gc和Neu5Ac是经由相同的途径被摄取和掺入的。所述两个细胞系都给出了类似的结果。用3mM Neu5Gc、在培养基中缺少或存在(3mM或15mM)Neu5Ac时饲养3天。两种分子都使用相同的途径进入人细胞并可用于代谢掺入。所述途径中的各种酶和转运子在对Neu5Gc和Neu5Ac的利用方面当然可能有小的差异。
用游离的Neu5Ac饲养人细胞可加速总细胞膜和分泌的糖蛋白中预负载的Neu5Gc的除去。由于发生Neu5Gc从外源性来源的转运和摄取，本公开提供了用于减少所述摄取或从细胞或受试者中除去所存在的Neu5Gc的方法和组合物。如之前所述，在人细胞系中生产的生物治疗产品可被从培养基中所用的源自动物的材料中掺入的Neu5Gc污染。此外，让所有的生物制药都从目前用于生产的、已很好建立且经FDA批准的细胞系(如CHO，BHK，鼠骨髓瘤)进行转变，是非常困难的。
293-T人肾细胞在补充了10％FCS的DME上生长。使用PBS中的20mMEDTA使细胞从培养板上升起并允许其生长至50％汇合。此时，一式两份地向培养物中加入经缓冲的100mM Neu5Gc，最终的浓度为5mM，且令细胞在此经补充的培养基中生长3天。在这一Neu5Gc脉冲结束时，用PBS中的20mM EDTA使细胞再次升起、沉淀细胞、用PBS洗涤一次以去除任何过量的Neu5Gc，然后悬浮于30ml生长培养基中。向5个P-100培养皿的每一个中加入5ml此细胞悬浮液。通过沉淀所述细胞而立即收获所述细胞悬浮液的最后等份(时间“0”)，用PBS洗涤一次，随后将所述细胞悬浮于1ml PBS中并转移至1.5ml微量离心管中。再次沉淀所述细胞并将其冷冻直至收集了所有的时间点。向另外5个用于“Neu5Ac驱逐”的板的每一个中加入经缓冲的100mM Neu5Ac，将等量的培养基加入“负驱逐”样品中。在第1、2、3、4和5天，通过将细胞刮至培养基中、经沉淀而收集、用PBS洗涤一次、转移到1.5ml微量离心管中、沉淀并冷冻细胞粒状沉淀而收获细胞。在5天的驱逐结束时，在300μl冰冷的20mM KPO4 pH 7中、用Fisher超声波仪、使用3-20秒的猝发使所有收集的细胞沉淀均质化。通过加入700μl100％的冰冷乙醇(最终为70％乙醇)并在-20℃孵育过夜而沉淀糖缀合物结合的唾液酸。使样品在20000Xg下旋转15min，将上清液转移到干净的管中并在真空离心蒸发浓缩器上使其干燥。用超声处理将所沉淀的糖缀合物和经干燥的乙醇上清物各自悬浮于100μl 20mM KPO4pH 7中。通过用2M醋酸(最终)的酸水解和在80℃孵育3小时，从所述两级分中释放唾液酸。使样品通过Microcon-10过滤器并用DMB试剂使滤过物衍生化，用于通过HPLC分析唾液酸。
除了省略了Neu5Gc脉冲且在蛋白质-A琼脂糖珠上捕获所分泌的糖蛋白外，对于在培养基中稳定表达涎免凝集素-Fc蛋白的CHO细胞采用类似的方法。除了通过离心沉淀总细胞膜外，细胞也被类似地处理。通过酸水解、DMB衍生化和HPLC确定分泌的蛋白和细胞膜中唾液酸的含量。还用鸡抗Neu5Gc IgY、通过蛋白质印迹法研究细胞膜。
因为细胞中的Neu5Gc在溶酶体中“再循环”并被再用于新合成糖缀合物，本公开提供了减少所述再循环并因此从细胞中除去Neu5Gc的方法。本公开表明培养基中游离的Neu5Ac被细胞摄取并与预先存在的Neu5Gc竞争，防止后者的再循环。另外，过量的Neu5Ac将竞争掉Neu5Gc自培养基的任何进一步掺入。为了研究这一可能性，我们用Neu5Gc预负载人293T细胞，然后用存在或缺少5mM Neu5Ac的培养基进行驱逐。如图2A和2B所示，Neu5Ac在培养基中的存在确实引起乙醇可沉淀的(糖苷结合的)Neu5Gc从细胞以及从分泌的糖蛋白中更快的清除。因此，向培养基中加入Neu5Ac是除去或减少人细胞的Neu5Gc污染的简单且非毒性的方式。
大多数重组生物治疗糖蛋白目前在非人细胞中生产，其中最普遍的是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系。已知在CHO细胞中生产的生物治疗糖蛋白携带少量的Neu5Gc。因此，本公开表明了减少Neu5Gc在培养的CHO细胞中积累的方法。如图2C-E所示，对于膜糖蛋白和分泌的重组蛋白而言，这确实都是成功的。鉴于CHO细胞已经表达其自身的内源性Cmah酶，这些数据提示除竞争过再循环的Neu5Gc外，涉及了新的机制。不论那种机制可能是什么，本方法显示甚至在非人Cmah-阳性细胞系中也可实现重组糖蛋白的Neu5Gc含量的减少。
在商业上，可以所需的量获得纯化学合成的Neu5Ac。但是，研究可使用源自食物来源的Neu5Ac。
作为治疗人类的前序，用1mg/ml Neu5Ac在小鼠的饮用水中饲喂正常的WT小鼠18周。通过观察或全部血细胞计数和血液化学分析，这些小鼠不显示任何毒性迹象，最终的尸体剖检显示无组织学异常。
人志愿者从可食用的燕窝(EBN)(流行的中国美味，典型地作为汤被食用并常常被称为“东方的鱼子酱”)摄食结合的Neu5Ac。EBN源自栖息在越南、泰国、印度尼西亚和菲律宾海岸区域的白巢金丝燕(Aerodramus fuciphogus)的唾液。EBN是膳食Neu5Ac的理想来源因为它是含有非常高Neu5Ac含量(9％w/w)的天然食物产品。此外，它作为中国菜肴和传统医学的一部分已经超过1000年。对于制备用于摄食的结合的Neu5Ac，依照了典型的传统汤食谱，其中将燕窝在水中浸泡过夜然后在新鲜的水中煮沸并加入肉汤和/或糖调味。对于制备用于摄食的游离的Neu5Ac，如上制汤，加入醋以温和地酸化肉汤并促进Neu5Ac的释放。醋从食品商店购买。所述提取类似于制备甜的和酸的汤。每个个体摄食的游离或结合的Neu5Ac的量是1-3g，类似于EBN汤的典型份量(参见，例如，www.chinesefood-recipes.com)。
含有Neu5Ac的样品被直至10个正常人志愿者摄食，所述人志愿者已避免了含有Neu5Gc的产品3天并在所述研究的早晨仅食用了水果或蔬菜汁(无唾液酸)。避免固体食物是重要的因为充满的胃会显著延迟样品进入肠中和所测分子的摄取。摄食测试样品后，在下面6小时中受试者以约4ml/Kg/小时仅饮用水果或蔬菜汁。从摄食前24小时开始收集所有的尿并继续收集至摄食后48小时(3个集合x24小时＝共72小时)。在用盐水彻底清洗口腔且在一片石蜡膜上咀嚼1分钟后，在摄食后0、6和24和48小时收集唾液样品。在0、3、24小时时收集血液样品(约30ml或约2汤匙)，共约90ml或6汤匙。针对游离的和结合的Neu5Ac和Neu5Gc、以及N-乙酰甘露糖胺(ManNAc)和N-羟乙酰甘露糖胺(ManNGc)(这些唾液酸的直接降解产物)分析所有的样品。使样品等份通过具有3000道尔顿的分子量截止值的Microcon过滤器。对于结合的唾液酸，渗余物被酸水解然后再次通过类似的Microcon-3过滤器。然后用Dowex阴离子交换柱纯化游离的唾液酸，并将这些阴离子性的糖从将含有ManNAc和ManNGc的中性糖级分中分离。后者通过使用丙酮酸盐裂解酶、在加入过剩的丙酮酸钠以驱动反应的条件下被酶促转化回为唾液酸。用DMB(1，2-二氨基-4，5，亚甲基-二氧基苯)试剂使唾液酸衍生化，从而在高压液相色谱分离之后通过荧光检测它们。通过质谱直接分析目的峰，用于证实化学组成。为了定量的目的，使用了其他类似分子的内部标准，在分析前将其加入尿样品中。
在摄食前收集的尿提供了关于受试者尿的Neu5Ac和Neu5Gc排泄的基线水平的信息。在随后的24小时的收集中，由于对所摄食的食物材料的肠吸收，观察到了Neu5Ac排出的增加，在第3天的24小时收集中回归到基线。血液样品收集的目的主要是确保在血液和生化参数方面没有显著的变化。注意在中国人群中，这些将不是对于特殊情况下的食用而言非常不寻常的量。由于各受试者是其自己的对照，问题是在重复处理之后，尿的Neu5Gc排泄随着时间是否显著减少。没有在先的数据可能预测基于性别或种族，结果是否会有差异。因此起初的志愿参与者是研究者自己，代表来自欧洲，南印度和墨西哥的女性和男性(年龄范围31-56)。所有所述志愿参与者目前都有良好的健康没有主要的医疗问题。在研究前的72小时和在研究中的72小时避免所有非必要药物、含Neu5Gc的食物和任何不寻常的食物。
在一组实验中，四名人受试者摄食在可食用的燕窝汤中的结合的约3G Neu5Ac。所有受试者都有良好的健康且没有主要的医疗问题。如图3所示，尿收集(其是有意随机的，不计时的)显示在摄食后10-30小时期间，尿排泄中的Neu5Ac增加。更晚的时间点显示在第二天回归到基线。没有观察到不利的效果。在反复处理后，我们期待看到尿中基线Neu5Gc的量下降。
已描述了本发明的许多实施方式。然而，将会理解的是可以不偏离本发明的精神和范围而进行各种修饰。相应地，其他的实施方式在下述权利要求的范围内。

Claims (18)

1.一种方法，其包括：
用有效量或递增量的游离或糖苷结合的N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)、N-乙酰甘露糖胺(ManNAc)、或其类似物或衍生物培养包含Neu5Gc的细胞系，培养足够的时间段以去除或大幅减少细胞、细胞系或由所述细胞或细胞系产生的产品中存在的Neu5Gc。
2.权利要求1的方法，其中所述细胞系包括用于治疗性蛋白生产的哺乳动物细胞系。
3.权利要求1的方法，其中所述细胞系包括hESC、诱导的干细胞或胚状体细胞。
4.权利要求1的方法，其中所述用游离或糖苷结合的N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)、N-乙酰甘露糖胺(ManNAc)、或其类似物或衍生物的培养，在以含有Neu5Gc的培养基组分进行的起初培养之后进行。
5.减少生物治疗产品中Neu5Gc的量的方法，包括：
在用于生产生物治疗产品的条件下、在包含有效量或递增量的游离或糖苷结合的N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)、N-乙酰甘露糖胺(ManNAc)、或其类似物或衍生物的培养基中培养包含Neu5Gc的哺乳动物细胞系。
6.权利要求5的方法，其中所述细胞系包括用于治疗性蛋白生产的哺乳动物细胞系。
7.权利要求5的方法，其中所述细胞系包括hESC、诱导的干细胞或胚状体细胞。
8.权利要求5的方法，其中所述用游离或糖苷结合的N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)、N-乙酰甘露糖胺(ManNAc)、或其类似物或衍生物的培养，在以含有Neu5Gc的培养基组分进行的起初培养之后进行。
9.制备用于移植的组织的方法，包括：
使所述组织暴露于缺乏Neu5Gc、且包含有效量或递增量的游离或糖苷结合的N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)、N-乙酰甘露糖胺(ManNAc)、或其类似物或衍生物的培养基。
10.治疗炎性疾病或癌症的方法，包括：
向包含Neu5Gc的受试者施用有效量或递增量的游离或糖苷结合的N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)、N-乙酰甘露糖胺(ManNAc)、或其类似物或衍生物，直至Neu5Gc的水平降低或从受试者中被去除。
11.权利要求10的方法，其中所述疾病或癌症与Neu5Gc或抗Neu5Gc抗体相关联。
12.相比于Neu5Gc的水平，具有升高的游离或糖苷结合的N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)、N-乙酰甘露糖胺(ManNAc)、或其类似物或衍生物的食物、饮料或细胞培养基产品，用于治疗Neu5Gc关联性疾病或病症，或用于减少受试者体内Neu5Gc的含量。
13.权利要求12的食物、饮料或细胞培养基，其包含约0.1mM至20mM或更多的游离或糖苷结合的N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)、N-乙酰甘露糖胺(ManNAc)、或其类似物或衍生物。
14.治疗患有Neu5Gc关联性疾病或病症的受试者的方法，包括减少或除去Neu5Gc的膳食消耗和施用有效量或递增量的游离或糖苷结合的N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)、N-乙酰甘露糖胺(ManNAc)、或其类似物或衍生物，以从受试者中去除预先存在的Neu5Gc。
15.权利要求14的方法，其中所述游离或糖苷结合的N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)、N-乙酰甘露糖胺(ManNAc)、或其类似物或衍生物来自膳食来源。
16.权利要求14的方法，其中所述游离或糖苷结合的N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)、N-乙酰甘露糖胺(ManNAc)、或其类似物或衍生物来自合成的来源。
17.从生物治疗产品或用于生产生物治疗产品的细胞系中除去Neu5Gc的方法，包括在包含有效量或递增量的游离或糖苷结合的N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)、N-乙酰甘露糖胺(ManNAc)、或其类似物或衍生物的无Neu5Gc培养基中培养所述细胞，以从所述细胞系中去除先前掺入的Neu5Gc。
18.在包含Neu5Gc酶促途径的动物中减少Neu5Gc生产的方法，所述方法包括向所述动物施用有效量的Neu5Ac、衍生物、类似物、或前体，其中所述有效量减少或除去所述动物中Neu5Gc的产生。
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