CN101899082B - 三萜皂苷类化合物、用途及制备方法 - Google Patents

Abstract

三萜皂苷类化合物、用途及制备方法，本发明涉及涉及从豆科植物含羞草亚科榼藤属榼藤子中分离得到的化合物Phaseoloideside D、Phaseoloideside E及其医药用途和制备方法。体外抗肿瘤试验表明，化合物Phaseoloideside D和Phaseoloideside E对SHG-44(人神经胶质瘤细胞)、SW480(结肠癌细胞)、HepG-2(肝癌细胞)、Ec-109(食管癌细胞)、MCF-7(人乳腺癌细胞)有较强的抑制作用，可为研制新的抗肿瘤药物提供先导化合物，对开发利用中国的民族药用资源具有重要价值。

Description

三萜皂苷类化合物、用途及制备方法

技术领域

本发明涉及三萜皂苷类化合物、用途及制备方法，具体涉及从豆科植物含羞草亚科榼藤属榼藤子中分离得到的化合物Phaseoloideside D、Phaseoloideside E及其医药用途和制备方法。

背景技术

榼藤子(Entada phaseoloides(Linn.)Merr.)，属豆科含羞草亚科榼藤属，常绿木质大藤本，茎扭旋，枝无毛；二回羽状复叶，长10-25cm，通常有羽片2对，顶生一对羽片变为卷须；小叶2-4对，革质，长椭圆形，长3-8.5cm，宽1.5-4cm，先端钝，微凹，基部略偏斜，无毛。主要分布于我国福建、广西、云南等地，其主要含有榼藤酰胺类、三萜皂苷类成分，具有治疗胃病、痔疮、便秘等的功效。

以下文献报道的榼藤子同属植物中所含有的三萜皂苷类成分具有一定的抗肿瘤活性：Laurence KN，Luciano B，Remy BT et al.Rheediinosides A and B，two antiproliferativeand antioxidant triterpene saponins from Entada rheedii.Phytochemistry.2010，71：254-261；Giuseppina C，Fabrizio D P，Paolo De C，et al.Antiproliferative TriterpeneSaponins from Entada africana J.Nat.Prod.2006，69，1323-1329.；Azefack L T，TomofumiM，Mirjolet，J F.Pursaethosides A-E，Triterpene Saponins from Entada pursaetha.J.Nat.Prod.2005，68，1185-1190。

榼藤子中含有的总皂苷物对小鼠S180实体瘤也有明显的抑制作用，能明显延长艾氏腹水瘤小鼠生存时间(榼藤子水溶性提取物对小鼠移植瘤S180的抑制作用，许腾等，中国药师，2006，9(5)：397-399)；榼藤子水溶性提取物对人类慢性髓性白血病细胞株(K562)、人类淋巴瘤细胞株(U937)和人早幼粒白血病细胞株(HL60)也有较强的抑制作用(榼藤子水溶性提取物的体外抗肿瘤作用，许腾等，华西药学杂志，2005，20(6)：487-489)。

梅之南、熊慧等人(《榼藤子含硫酰胺类化学成分的研究》，《药学学报》2010，45(5)：624-626)公开了利用正反相硅胶柱色谱、制备HPLC分离纯化榼藤子种仁的化学成分，从70％乙醇提取物的正丁醇萃取部位分离得到4个含硫酰胺类化合物，分别为entadamide A-β-D-glucopyranosyl-(1→3)-β-D-glucopyranoside(1)、entadamide A(2)、entadamide A-β-Dglucopyranoside(3)和clinacoside C(4)。张勇等人(《榼藤子种仁化学成分研究》，《中国药学杂志》2008年7月第43卷第14期)公开了通过Sephadex LH-20等分离纯化，通过理化常数测定和现代波谱学技术进行结构鉴定后，分离得到8个化合物，分别为2，5-二羟基苯乙酸乙酯、2，5-二羟基苯乙酸甲酯、5-羟基-苯并呋喃-2酮、榼藤酰胺A、硬脂酸甲酯、β-谷甾醇、胡萝卜苷和豆甾醇。中国专利CN 101486650A公开了一种从豆科榼藤属植物榼藤中制备2，5-二羟基苯乙酸乙酯、2，5-二羟基苯乙酸甲酯、2，5-二羟基苯乙酸正丁酯的方法，以及这些化合物在制备抗HIV药物中的应用。

然而，目前还没有研究人员报道有关榼藤子中所含的皂苷类化合物Phaseoloideside D和Phaseoloideside E。

发明内容

本发明的目的之一是提供从豆科植物含羞草亚科榼藤属榼藤子中分离得到的化合物Phaseoloideside D、Phaseoloideside E。

发明人从生长于中国云南西双版纳地区的榼藤子种仁中提取分离到的两种新的皂苷类化合物，分别命名为Phaseoloideside D：

3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-[β-D-xylopyranosyl-(1→3)-α-L-arabinopyranosyl-(1→6)]-2-acetylamino-2-deoxy-β-D-glucopyranosylentagenic acid28-O-β-D-apiofuranosyl-(1→5)-O-β-D-apiofuranosyl-(1→2)-2-acetyl-2-deoxy-O-β-D-glucopyranoside；

和Phaseoloideside E：

3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-[β-D-xylopyranosyl-(1→3)-α-L-arabinopyranosyl-(1→6)]-2-acetylamino-2-deoxy-β-D-glucopyranosylentagenic acid28-O-β-D-apiofuranosyl-(1→3)-O-β-D-xylopyranosyl-(1→2)-2-acetyl-2-deoxy-O-β-D-glucopyranoside。

其化学结构如下：

本发明的目的之二是公开Phaseoloideside D或Phaseoloideside E在制备抗肿瘤药物中的应用。

发明人通过体外实验证实，Phaseoloideside D对SHG-44(人神经胶质瘤细胞)、SW480(结肠癌细胞)、HepG-2(肝癌细胞)、Ec-109(食管癌细胞)、MCF-7(人乳腺癌细胞)显示出明显的抑制作用，Phaseoloideside E对癌细胞株SHG-44、SW480、HepG-2显示出明显的抑制作用。可见，本发明的三萜皂苷类化合物Phaseoloideside D和Phaseoloideside E具有明显的抑制肿瘤的效果。

本发明的目的之三是提供榼藤子中提取分离Phaseoloideside D、Phaseoloideside E的方法。

发明人通过大量试验摸索后，获得了两种高效的提取分离Phaseoloideside D、Phaseoloideside E的方法。

第一种制备化合物Phaseoloideside D、Phaseoloideside E的方法的步骤如下：

(1)制备总皂苷提取物：将榼藤子种仁干品烘干粉碎，用60～70％的乙醇室温浸提3～7次，每次24h，浓缩提取液得浸膏；用体积比为9∶1的甲醇-水溶液溶解浸膏，用等体积的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取后，将正丁醇萃取物，通过硅胶柱层析，用二氯甲烷-甲醇溶液梯度洗脱进行分离，收集洗脱液，减压回收溶剂，得总皂苷提取物；

(2)分离：将上述含总皂苷提取物应用硅胶柱层析，以乙酸乙酯：甲醇为洗脱剂梯度洗脱，收集含三萜皂苷的流份，再经ODS柱层析，以甲醇：水为洗脱剂进行梯度洗脱，收集所述化合物的流份，再经硅胶柱层析，以氯仿：甲醇为洗脱剂进行梯度洗脱，收集所述化合物的流份，再经半制备高效液相色谱法分离，以乙腈∶水的体积比2.8∶7.2的流动相进行洗脱，收集含Phaseoloideside D、Phaseoloideside E的流分，回收溶剂即得所述化合物纯品Phaseoloideside D和Phaseoloideside E。经多种现代光谱分析，特别是综合应用多种先进的二位核磁共振波谱的解析，确定了Phaseoloideside D和Phaseoloideside E的化学结构和立体构型。

第二种制备化合物Phaseoloideside D、Phaseoloideside E的方法的步骤如下：

(1)将榼藤子种仁干品烘干粉碎，用60-70％的乙醇室温浸提3-7次，每次24h，浓缩提取液，然后用石油醚脱脂，将脱脂的浸膏经正丁醇萃取、乙醇复溶，真空干燥后，再溶于甲醇-水溶液，通过大孔树脂，用乙醇-水溶液梯度洗脱，收集洗脱液，减压回收乙醇，得总皂苷提取物；

(2)分离：将上述含总皂苷提取物应用硅胶柱层析，以乙酸乙酯-乙醇-水为洗脱剂梯度洗脱，收集含三萜皂苷的流份，再经ODS柱层析，以甲醇：水为洗脱剂进行梯度洗脱，收集含所述化合物的流份，再经半制备高效液相色谱法分离，以乙腈∶水的体积比2.8∶7.2的流动相进行洗脱，收集含Phaseoloideside D、Phaseoloideside E的流分，回收溶剂即得所述化合物纯品Phaseoloideside D和Phaseoloideside E。经多种现代光谱分析，特别是综合应用多种先进的二位核磁共振波谱的解析，确定了Phaseoloideside D和Phaseoloideside E的化学结构和立体构型。

本发明公开的化合物可以作为抗肿瘤药物的先导化合物，为研制新的抗肿瘤药物提供了一种新的思路，对开发利用中国的民族药用植物资源具有重要意义。

具体实施方式

以下通过优选实施例进一步描述本发明，然而本发明范围不仅仅限于下列实施例。凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。

实施例1三萜皂苷类化合物Phaseoloideside D和Phaseoloideside E的制备

1、提取分离与纯化方法

将干燥榼藤子药材去壳得榼藤子仁，晒干，粉碎称重8000克，再用4倍量70％的乙醇室温浸泡提取3次，每次24h，将浸取液减压浓缩，得半透明浸膏518g。用体积比为9∶1的甲醇-水混合溶剂溶解浸膏，用等体积的石油醚反复萃取，至石油醚层基本无色，将浸膏溶于水中，用等体积的乙酸乙酯反复萃取至乙酸乙酯层基本无色，再用等体积的正丁醇反复萃取至正丁醇层基本无色，合并正丁醇层并减压浓缩得半透明流动浸膏129g。并将正丁醇部位作为主要分离部分，进行硅胶柱层析，选用二氯甲烷-甲醇进行梯度洗脱，收集含皂苷的洗脱液，减压回收溶剂，得含总皂苷提取物38.15克。将含总皂苷进行硅胶柱层析，以乙酸乙酯：甲醇为洗脱剂洗脱，收集含三萜皂苷的洗脱液，减压回收溶剂得三萜皂苷18.59克。将该三萜皂苷进行ODS柱层析，以甲醇：水为洗脱剂进行梯度洗脱，收集含化合物Phaseoloideside D及Phaseoloideside E的流份，再经硅胶柱层析，以氯仿：甲醇为洗脱剂进行梯度洗脱，收集化合物Phaseoloideside D及Phaseoloideside E的流份，最后经半制备高效液相色谱法分离，以乙腈∶水的体积比2.8∶7.2的流动相进行洗脱，即得Phaseoloideside D纯品0.3克，Phaseoloideside E纯品0.35克。

2、化合物结构鉴定

Phaseoloideside D为白色无定形粉末，Lieberman-Burchard反应和Molish反应均为阳性经测定，分子式C₇₂H₁₁₅NO₃₇，[α]_D ²⁰-41(c 0.63，MeOH)，FAB-MS m/z 1586[M-1]^-，1453[M-132-1]^-，1423[M-162-1]^-，1321[M-132-132-1]^-，1117[M-162-132-132-42-1]^-；HR ESI-MS给出准分子离子峰m/z 1608.7082[M+Na]⁺(Calc Mass 1608.7040)。

Phaseoloideside D的结构式如下：

Phaseoloideside D的¹H-NMR，¹³C-NMR及HMBC数据如表1。

表1 Phaseoloideside D的¹H-NMR，¹³C-NMR及HMBC数据(in C₅D₅N，δppm)

Phaseoloideside E为白色无定形粉末，Lieberman-Burchard反应和Molish反应均为阳性经测定，分子式C₇₂H₁₁₅NO₃₇，[α]_D ²⁰-41(c 0.63，MeOH)，FAB-MS m/z 1586[M-1]^-，1453[M-132-1]^-，1423[M-162-1]^-，1321[M-132-132-1]^-，1117[M-162-132-132-42-1]^-；HR ESI-MS给出准分子离子峰m/z 1608.7019[M+Na]⁺(Calc Mass 1608.7040)。

Phaseoloideside E的结构式如下：

Phaseoloideside E的¹H-NMR，¹³C-NMR及HMBC数据如表2。

表2 Phaseoloideside E的¹H-NMR，¹³C-NMR及HMBC数据(in C₅D₅N，δppm)

实施例2三萜皂苷类化合物Phaseoloideside D和Phaseoloideside E的制备

将榼藤子种仁晒干，粉碎称重10000克，用5倍量的70％乙醇室温浸提7次，每次24h，浓缩提取液，进而用石油醚脱脂，将脱脂的浸膏经正丁醇萃取后，用可溶于乙醇的水层成分，经真空干燥后(干重345克)，再溶于体积比为9∶1的甲醇-水溶液，通过大孔树脂，用水和乙醇梯度洗脱，收集50％乙醇洗脱液，减压回收乙醇，得总皂苷提取物61.61克。总皂苷提取物应用硅胶柱层析，以乙酸乙酯∶甲醇∶水为洗脱剂梯度洗脱，收集含该三萜皂苷的流份，经ODS柱层析，以甲醇∶水为洗脱剂进行梯度洗脱，收集含化合物Phaseoloideside D及Phaseoloideside E的流份，再经半制备高效液相色谱法分离，以乙腈∶水的体积比2.8∶7.2的流动相进行洗脱，即得Phaseoloideside D纯品约0.5克，Phaseoloideside E纯品约0.55克。

实施例3Phaseoloideside D和Phaseoloideside E对肿瘤细胞的影响

试验所用细胞株为国际通用的肿瘤细胞株，即：SHG-44(人神经胶质瘤细胞)、SW480(结肠癌细胞)、HepG-2(肝癌细胞)、Ec-109(食管癌细胞)、MCF-7(人乳腺癌细胞)。

Phaseoloideside D及Phaseoloideside E对体外培养的癌细胞细胞分化诱导作用——MTT法：其原理是活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在492nm波长处测定其光吸收值，可求出抗癌药物作用的癌细胞数量变化，一次求出细胞的存活率，由IC50判断细胞对抗癌药的敏感程度。根据细胞生长速率，将处于生长对数期的肿瘤细胞以100μl/孔接种于96孔板，贴壁生长24h，吸去上清液后加入100μl/孔。每个浓度设6个复孔，并设未加药液的培养基对照及无细胞调零孔。肿瘤细胞在37℃、5％CO₂培养箱中培养24小时，然后每孔加入10μl MTT，培养箱中继续培养4h，取出，吸去上清液，加入DMSO 150μl/孔，酶标仪492nm波长下测0D值，实验结果见表3：

表3 Phaseoloideside D对肿瘤细胞的抑制作用IC50(μM)

IC50：表示本发明化合物的半数有效抑制浓度

上述实验结果表明，Phaseoloideside D对SHG-44、SW480、HepG-2、Ec-109、MCF-7显示明显的抑制作用，Phaseoloideside E对SHG-44、SW480、HepG-2显示明显的抑制作用。可见，本发明的三萜皂苷类化合物Phaseoloideside D和Phaseoloideside E具有明显的抑制肿瘤的效果。

Claims (6)

1.三萜皂苷类化合物，结构式如下：

2.三萜皂苷类化合物，结构式如下：

3.权利要求1所述的化合物在制备抗肿瘤药物中的应用，所述的肿瘤为人神经胶质瘤、结肠癌、肝癌、食管癌、乳腺癌。

4.权利要求2所述的化合物在制备抗肿瘤药物中的应用，所述的肿瘤为人神经胶质瘤、结肠癌、肝癌。

5.权利要求1或2所述化合物的制备方法，包括如下步骤：

(1)将榼藤子种仁干品烘干粉碎，用60-70％的乙醇室温浸提3-7次，每次24h，浓缩提取液得浸膏；用体积比为9∶1的甲醇-水溶液溶解浸膏，用等体积的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取后，将正丁醇萃取物通过硅胶柱层析，用二氯甲烷-甲醇溶液梯度洗脱，收集洗脱液，减压回收溶剂，得总皂苷提取物；

(2)将所述总皂苷提取物应用硅胶柱层析，以乙酸乙酯-甲醇溶液为洗脱剂洗脱，收集含三萜皂苷的流份，再经ODS柱层析，以甲醇-水为洗脱剂进行梯度洗脱，收集含所述化合物的流份，再经硅胶柱层析，以氯仿-甲醇溶液为洗脱剂进行梯度洗脱，收集所述化合物的流份，再经半制备高效液相色谱法分离，以乙腈∶水的体积比2.8∶7.2的流动相进行洗脱后得所述化合物。

6.权利要求1或2所述化合物的制备方法，包括如下步骤：

(1)将榼藤子种仁干品烘干粉碎，用60-70％的乙醇室温浸提3-7次，每次24h，浓缩提取液，然后用石油醚脱脂，将脱脂的浸膏经正丁醇萃取、乙醇复溶，真空干燥后，再溶于甲醇-水溶液，通过大孔树脂，用乙醇-水溶液梯度洗脱，收集洗脱液，减压回收乙醇，得总皂苷提取物；

(2)将上述总皂苷提取物应用硅胶柱层析，以乙酸乙酯-乙醇-水为洗脱剂梯度洗脱，收集含三萜皂苷的流份，再经ODS柱层析，以甲醇∶水为洗脱剂进行梯度洗脱，收集含所述化合物的流份，经半制备高效液相色谱法分离，以乙腈∶水的体积比2.8∶7.2的流动相进行洗脱后得所述化合物。