CN101501187A - 富含赘生干细胞的组合物及包含其的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明描述了根据OCT4转录因子的表达被富集的赘生干细胞群及其鉴别、分离和富集方法。所述OCT4－富集的赘生干细胞群进一步用于在动物中诱导和分析癌症。另外，本发明进一步提供了通过抑制OCT4而预防、消除或者抑制癌症、肿瘤生长和转移的方法。

Description

富含赘生干细胞的组合物及包含其的方法
发明背景
迄今为止，赘生性细胞的分析方法对于研究目的而言既不足够有效也不足够统一。通过各种分级分离程序分离自组织样品中的赘生干细胞(neoplastic stem cell)由混合类型的细胞组成。赘生干细胞的有效分离能提供探索癌细胞生物学和疾病的基本机制的手段。本领域非常需要特异性并有效地分离和增殖细胞亚群以提供大的赘生干细胞群以在体外和体内进行研究的方法。
赘生性细胞中干细胞标记的鉴别为多种临床和基础研究应用提供颇有价值的信息。从特定的肿瘤或转移瘤中鉴别和随后分离赘生干细胞(NSC)可例如用于诊断疾病和/或开发针对发展中的病症的合理治疗措施。在一些情况中，NSC的分离和/或富集可进一步用于探索生理学和分子机制的体外研究，在其它情况中，这些细胞可用于接种实验动物以进一步研究癌症的进展或治疗。
可以使用如FACS(图10)或抗生素选择测定法等技术淘选NSC，这些技术不能基于生物学活性和/或生理学功能区分细胞亚群。另外，所述测定不包括天然的非抗生素表达或处理的干细胞的回收。其它细胞鉴别及随后的分离和/或富集方法如凝胶电泳方法不能探查纯细胞群，受污染困扰和/或损害细胞存活性。
发明概述
在一个实施方案中，本发明涉及根据OCT4表达被富集的赘生干细胞群。
在另一个实施方案中，本发明提供了鉴别赘生干细胞的方法，包括如下步骤：(i)将赘生性细胞与和OCT4特异性相互作用的物质接触；及(ii)鉴别所述物质与之特异性相互作用的细胞。
在另一个实施方案中，本发明提供了分离赘生干细胞的方法，包括如下步骤：(i)将赘生性细胞与和OCT4特异性相互作用的物质接触；及(ii)分离所述物质与之特异性相互作用的细胞。
在另一个实施方案中，本发明提供了从赘生性细胞群中富集赘生干细胞的方法，包括如下步骤：(i)将包含多种癌细胞的混合细胞群与包含和Oct4启动子可操纵地连接的抗生素抗性基因的载体接触；及(ii)在存在抗生素的条件下培养所述混合细胞群。
在另一个实施方案中，本发明提供了诱导癌症的方法，包括将根据OCT4表达被富集的赘生干细胞群导入哺乳动物中。
在另一个实施方案中，本发明提供了体内分析癌症进展和/或发病机制的方法，包括如下步骤：(i)将OCT4hi赘生干细胞移植进动物中；及(ii)分析动物体内癌症进展和/或发病机制。
在另一个实施方案中，本发明提供了消除或抑制癌症的方法，包括如下步骤：将赘生性细胞与抑制OCT4在所述赘生性细胞中表达或功能的物质接触。
在另一个实施方案中，本发明提供了预防、消除或抑制肿瘤生长的方法，包括如下步骤：将赘生性细胞与抑制OCT4在肿瘤中表达或功能的物质接触。
在另一个实施方案中，本发明提供了预防、消除或抑制细胞转移的方法，包括如下步骤：将赘生性细胞与抑制OCT4在所述赘生性细胞中表达或功能的物质接触。
附图简述
本发明的主题在本说明书总结部分中特别指出并明确要求保护。然而，通过如下详细描述和附图可以对本发明的构成和实施方法以及本发明的目的、特征和优势有更好的理解。
图1示出了用多克隆抗OCT4抗体探查的实体肿瘤的系列切片和对照切片的光学显微镜图。图1A是软骨肉瘤的横切面；图1B是骨肉瘤的横切面；图1C是多形性胶质母细胞瘤(GBM)的横切面；图1D是用作阳性对照的人胎儿睾丸的横切面。箭头表示OCT4阳性细胞核。
图2A证实了探查OCT4、STAT3和Nanog mRNA表达的半定量RT-PCR的结果，其中β-微管蛋白和GFAP在代表性胶质母细胞瘤原代培养物(MT917、MT926、MT928、MT1231)和细胞系(LN18、LN229、LN428、U251)中作为归一化对照。图2B证实了OCT4、STAT3和Nanog蛋白质表达的Western印迹分析结果，其中β-微管蛋白和GFAP在细胞系(LN18、LN229、LN319、LN428、D247、U251、U373、T98G)中作为归一化对照。用抗-OCT4、抗-磷酸-STAT3和抗-Nanog探查印迹。
图3示出了在贴壁细胞培养物和漂浮的源于骨肉瘤的球体中探查OCT4和nanog基因表达的2-D定量PCR结果。基质附着的培养物示出OCT4和Nanog显著较低的表达(p<0.05)。肉球(sarcosphere)中的OCT4(X轴)与Nanog(Y轴)表达的相关性显著高于在基质附着的培养物中的相关性(p<0.05)。
图4举例说明了OCT4siRNA阻抑的源自瘤胶质母细胞瘤的细胞的克隆形成潜力。图4A证实Western印迹分析结果，其中转染细胞培养物中外源OCT4蛋白的阻抑通过用包含DNA序列TTGATCCTCGGACCTGGCTAA的特异性OCT4 siRNA处理而实现。图4B示出选择的胶质母细胞瘤细胞(MT317、LN-229、MT-917)的克隆形成频率。细胞用eGFP(绿色荧光蛋白)和OCT4 siRNA共转染。一式三份进行实验，条杆表示标准误差。
图5A是源自MCF-7R乳腺癌细胞系并在甲基纤维素中培养的悬浮的乳腺球(mammasphere)的光学显微镜图像(×200)。图5B是从甲基纤维素中转移出、附着于基质上并且针对OCT4(白色)和广谱细胞角蛋白(pancytokeratine)(灰色)表达进行免疫染色的乳腺球的荧光显微照片(×200)。
图6示出针对OCT4表达进行探查的经免疫组织化学染色的乳腺癌肿瘤的光学显微镜照片(×200)。黑点处表示OCT4阳性细胞核。图6A是导管癌肿瘤的横切面，图6B是乳腺癌转移至脑的肿瘤横切面。箭头表示OCT4阳性细胞核。
图7是在甲基纤维素中培养的第一次分裂后的OCT4-EGFP转染的胶质母细胞瘤细胞的荧光显微镜图像(×200)(图7A)。在几轮分裂后OCT-EGFP转染的细胞的胶质母细胞瘤漂浮神经球(neurosphere)(克隆)示于图7B。
图8是通过OCT4应答启动子表达EGFP的培养的乳腺癌细胞(A)、骨肉瘤(B)和胶质母细胞瘤多形细胞(C)的荧光显微镜图像(×200)。
图9是通过Nanog应答启动子表达EGFP的培养的胶质母细胞瘤细胞系Ln428(×200)(A)和骨肉瘤OS521(×100)(B)的荧光显微镜图像。
图10举例说明了培养的胶质母细胞瘤细胞系Ln428中表达OCT4的肿瘤细胞亚群的FACS流式分离图。M2门表示OCT4阳性细胞。图10A表示对混合的克隆OCT4细胞群的OCT4阳性细胞进行的初始FACS淘选。图10B表示对经过两代后(大约2周)进行FACS分析(B)以确定其纯度的分离的OCT4阳性细胞。发现这个细胞群对于OCT4蛋白表达是96.16％纯的。
图11是举例说明用OCT4-EGFR转染的OCT4阳性和OCT4阴性MDAMB231乳腺癌细胞的肿瘤形成潜力的图示。
图12是从任何肿瘤组织中获得OCT4富集的肿瘤干细胞以进行癌症相关研究包括药物开发研究的示意图。阶段A：细胞的制备：1)手术切除肿瘤，2)切碎并配制以产生单细胞悬浮液。阶段B：用OCT4应答启动子稳定标记肿瘤干细胞：1)以单细胞悬浮液形式的肿瘤干细胞培养物用于在合适条件下扩增和选择肿瘤干细胞，2)用包含在OCT4应答启动子(阶段C)控制下的EGFP基因的质粒转染。阶段C：产生高纯度肿瘤干细胞培养物：通过FACS进一步选择EGFP表达细胞并再次培养扩增，获得大量培养物。阶段D：D1，使用严格的细胞和分子生物学技术进一步研究肿瘤干细胞。D2，将肿瘤干细胞暴露于多种药物。阶段E：将分离的肿瘤干细胞接种于免疫缺陷小鼠以产生异种移植肿瘤模型，随后进行基本效力、安全性(或无毒性)和结果研究，产生最终药物表。
图13是源自MDA-MB-435黑素瘤细胞系的乳腺球培养物的显微镜图像(×200)，经生物学标记存在表达Oct-3/4的NSC。图13A是在甲基纤维素中培养的悬浮的源自肿瘤的球形体的光学显微镜照片。图13B是图13A示出的悬浮的源自肿瘤的球形体的荧光显微镜照片。图13C是在附着于基质后的肿瘤球形体的光学显微镜照片。图13D是图13C示出的附着的肿瘤球形体的荧光显微镜照片。
应意识到为了简便和明了地举例说明本发明，图中示出的元件非必需是按比例绘制的。例如，为了清晰起见，一些元件的尺度相对于其它元件而过大。再者，在认为合适的情况中，参考数字在图中可重复出现以表示相应或类似元件。
发明详述
在如下的详细描述中，阐述了许多特定细节以深入理解本发明。然而，本领域技术人员理解可以不利用这些特定细节实施本发明。换句话说，熟知的方法、程序和成分未被详细描述，以使得本发明不晦涩。
虽然本文举例说明和描述了本发明的某些特征，但是本领域技术人员可以对本发明进行一些修改、取代、改变和等价改变。因此，应理解所附权利要求书是用于覆盖在本发明真正精神范围内的这种修改和改变。
在一个实施方案中，本发明包含根据OCT4、Nanog、STAT3表达或其组合被富集的赘生干细胞(NSC)群。在另一个实施方案中，NSC代表包含赘生性细胞的群中的细胞亚群，其在较长的时间内能起始和维持癌症。在另一个实施方案中，NSC驱动肿瘤形成和生长(图11)。在另一个实施方案中，如本文所用术语“驱动”是指引导(guide)、控制(control)、指导(direct)、起始(initiate)、经历(go through)、渗透(penetrate)等其组合。
在另一个实施方案中，NSC包含如长寿命、自我更新和静止状态等性质。在另一个实施方案中，NSC包含增强的侵润能力。在另一个实施方案中，NSC是多能的、自我更新的且能从肉瘤中产生增殖性肉球、从脑瘤中产生神经球及从乳腺癌中产生乳腺球(图5)。在另一个实施方案中，NSC在体外培养1-100代期间能保持其自我更新潜力。在另一个实施方案中，NSC在体外培养1-90代期间能保持其自我更新潜力。在另一个实施方案中，NSC在体外培养20-60代期间能保持其自我更新潜力。在另一个实施方案中，NSC表达参与NSC的特异性功能和/或自我更新的基因，如OCT4、Nanog、STAT3或其组合。
在另一个实施方案中，本发明提供了实体肿瘤代表源自共同的生成细胞或NSC的细胞群。在另一个实施方案中，本发明提供了肿瘤代表源自共同的生成细胞或NSC的细胞群。在另一个实施方案中，本发明提供了NSC表型与正常干细胞表型在许多方面相似。在另一个实施方案中，本发明提供了NSC表型与正常于细胞表型完全不同，导致异常发育谱的不规则性。在另一个实施方案中，本发明提供了NSC表型与正常干细胞表型完全不同，导致与缺少关键增殖控制有关的不规则性。
在另一个实施方案中，本发明提供了NSC群包含真NSC或亲代NSC与源自NSC的祖先赘生性细胞的混合物。在另一个实施方案中，本发明提供了源自NSC的祖细胞在关键方面与亲代NSC不同。在另一个实施方案中，本发明提供了关键方面的不同包括高增殖动力学。在另一个实施方案中，本发明提供了NSC典型以相对于总癌细胞群非常低的百分比存在，其与环境的“不友善(hostility)”大致相关(即天然环境如原发乳腺组织位置中的乳腺NSC相对于位于转移的和/或外部位置如脑中的乳腺NSC)。
在另一个实施方案中，本发明提供了NSC包含大约0.001-1％的亲代原发癌细胞群。在另一个实施方案中，本发明提供了NSC包含大约0.005-1％的亲代原发癌细胞群。在另一个实施方案中，本发明提供了NSC包含大约0.01-0.1％的亲代原发癌细胞群。在另一个实施方案中，本发明提供了NSC包含大约0.05-0.1％的亲代原发癌细胞群。在另一个实施方案中，本发明提供了NSC包含大约0.005-0.01％的亲代原发癌细胞群。
在另一个实施方案中，本发明提供了NSC包含大约1-80％的永久癌细胞系亲代的细胞群。在另一个实施方案中，本发明提供了NSC包含大约1-10％的永久癌细胞系亲代的细胞群。在另一个实施方案中，本发明提供了NSC包含大约7-14％的永久癌细胞系亲代的细胞群。在另一个实施方案中，本发明提供了NSC包含大约15-25％的永久癌细胞系亲代的细胞群。在另一个实施方案中，本发明提供了NSC包含大约10-30％的永久癌细胞系亲代的细胞群。在另一个实施方案中，本发明提供了NSC包含大约30-50％的永久癌细胞系亲代的细胞群。在另一个实施方案中，本发明提供了NSC包含大约20-40％的永久癌细胞系亲代的细胞群。在另一个实施方案中，本发明提供了NSC包含大约50-80％的永久癌细胞系亲代的细胞群。在另一个实施方案中，本发明提供了NSC包含大约1-5％的永久癌细胞系亲代的细胞群。在另一个实施方案中，本发明提供了NSC包含大约5-10％的永久癌细胞系亲代的细胞群。在另一个实施方案中，本发明提供了NSC包含大约3-8％的永久癌细胞系亲代的细胞群。在另一个实施方案中，本发明提供了NSC包含大约7-10％的永久癌细胞系亲代的细胞群。
在另一个实施方案中，本发明提供了NSC包含大约1-100％的亲代转移癌细胞群细胞。在另一个实施方案中，本发明提供了NSC包含大约1-10％的亲代转移癌细胞群细胞。在另一个实施方案中，本发明提供了NSC包含大约10-30％的亲代转移癌细胞群细胞。在另一个实施方案中，本发明提供了NSC包含大约30-50％的亲代转移癌细胞群细胞。在另一个实施方案中，本发明提供了NSC包含大约50-75％的亲代转移癌细胞群细胞。在另一个实施方案中，本发明提供了NSC包含大约75-100％的亲代转移癌细胞群细胞。在另一个实施方案中，本发明提供了NSC包含大约30-80％的亲代转移癌细胞群细胞。在另一个实施方案中，本发明提供了NSC包含大约20-90％的亲代转移癌细胞群细胞。在另一个实施方案中，本发明提供了NSC包含大约10-100％的亲代转移癌细胞群细胞。在另一个实施方案中，本发明提供了NSC包含大约20-40％的亲代转移癌细胞群细胞。
在另一个实施方案中，本发明提供了大块癌细胞(BCC)包含来自原发实体肿瘤的大部分癌细胞群。在另一个实施方案中，本发明提供了BCC包含来自衍生自癌症的永久培养细胞系的大部分癌细胞群。在另一个实施方案中，本发明提供了BCC群缺乏干细胞特征。在另一个实施方案中，本发明提供了BCC群缺乏OCT-4表达。
在另一个实施方案中，本发明的方法提供了从癌组织活检样品和永久癌细胞系中分离NSC，其通过选择被预先处理并被生物标记以进行检测的NSC进行。在另一个实施方案中，本发明的方法提供了用DNA载体稳定转染NSC，所述DNA载体表达由Oct-4应答启动子调节的荧光或发光蛋白(图12)。在另一个实施方案中，本发明的方法提供了使用荧光生物标记的FACS淘选从总癌细胞群中分离NSC，由此获得高纯度培养物。在另一个实施方案中，本发明的方法提供了使用对表达由Oct4启动子驱动的GFP(绿色荧光蛋白)的那些细胞进行FACS淘选以从总癌细胞群中分离NSC，由此获得高纯度培养物(图9)。
在另一个实施方案中，本发明的Oct-4CDNA序列包含序列：tcccttcgcaagccctcatttcaccaggcccccggcttggggcgccttccttccccatggcgggacacctggcttcggatttcgccttctcgccccctccaggtggtggaggtgatgggccaggggggccggagccgggctgggttgatcctcggacctggctaagcttccaaggccctcctggagggccaggaatcgggccgggggttgggccaggctctgaggtgtgggggattcccccatgccccccgccgtatgagttctgtggggggatggcgtactgtgggccccaggttggagtggggctagtgccccaaggcggcttggagacctctcagcctgagggcgaagcaggagtcggggtggagagcaactccgatggggcctccccggagccctgcaccgtcacccctggtgccgtgaagctggagaaggagaagctggagcaaaacccggaggagtcccaggacatcaaagctctgcagaaagaactcgagcaatttgccaagctcctgaagcagaagaggatcaccctgggatatacacaggccgatgtggggctcaccctgggggttctatttgggaaggtattcagccaaacgaccatctgccgctttgaggctctgcagcttagcttcaagaacatgtgtaagctgcggcccttgctgcagaagtgggtggaggaagctgacaacaatgaaaatcttcaggagatatgcaaagcagaaaccctcgtgcaggcccgaaagagaaagcgaaccagtatcgagaaccgagtgagaggcaacctggagaatttgttcctgcagtgcccgaaacccacactgcagcagatcagccacatcgcccagcagcttgggctcgagaaggatgtggtccgagtgtggttctgtaaccggcgccagaagggcaagcgatcaagcagcgactatgcacaacgagaggattttgaggctgctgggtctcctttctcagggggaccagtgtcctttcctctggccccagggccccattttggtaccccaggctatgggagccctcacttcactgcactgtactcctcggtccctttccctgagggggaagcctttccccctgtctccgtcaccactctgggctctcccatgcattcaaactgaggtgcctgcccttctaggaatgggggacagggggaggggaggagctagggaaagaaaacctggagtttgtgccagggtttttgggattaagttcttcattcactaaggaaggaattgggaacacaaagggtgggggcaggggagtttggggcaactggttggagggaaggtgaagttcaatgatgctcttgattttaatcccacatcatgtatcacttttttcttaaataaagaagcctgggacacagtaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa(SEQ.ID NO：1)。在另一个实施方案中，本发明的Oct-4CDNA包含与SEQ.ID.NO：1同源的核酸序列。在另一个实施方案中，所述Oct-4CDNA序列是人(Homo sapiens)Oct-4CDNA序列。在另一个实施方案中，所述Oct-4CDNA序列来自非人物种。每种可能性均代表本发明的单独实施方案。
在另一个实施方案中，本发明的Oct-4CDNA序列包含序列：gtagtcctttgttacatgcatgagtcagtgaacagggaatgggtgaatgacatttgtgggtaggttatttctagaagttaggtgggcagcttggaaggcagaggcacttctacagactattccttggggccacacgtaggttcttgaatcccgaatggaaaggggagattgataactggtgtgtttatgttcttacaagtcttctgccttttaaaatccagtcccaggacatcaaagctctgcagaaagaactcgagcaatttgccaagctcctgaagcagaagaggatcaccctgggatatacacaggccgatgtggggctcaccctgggggttctatttgggaaggtattcagccaaacgaccatctgccgctttgaggctctgcagcttagcttcaagaacatgtgtaagctgcggcccttgctgcagaagtgggtggaggaagctgacaacaatgaaaatcttcaggagatatgcaaagcagaaaccctcgtgcaggcccgaaagagaaagcgaaccagtatcgagaaccgagtgagaggcaacctggagaatttgttcctgcagtgcccgaaacccacactgcagcagatcagccacatcgcccagcagcttgggctcgagaaggatgtggtccgagtgtggttctgtaaccggcgccagaagggcaagcgatcaagcagcgactatgcacaacgagaggattttgaggctgctgggtctcctttctcagggggaccagtgtcctttcctctggccccagggccccattttggtaccccaggctatgggagccctcacttcactgcactgtactcctcggtccctttccctgagggggaagcctttccccctgtctccgtcaccactctgggctctcccatgcattcaaactgaggtgcctgcccttctaggaatgggggacagggggaggggaggagctagggaaagaaaacctggagtttgtgccagggtttttgggattaagttcttcattcactaaggaaggaattgggaacacaaagggtgggggcaggggagtttggggcaactggttggagggaaggtgaagttcaatgatgctcttgattttaatcccacatcatgtatcacttttttcttaaataaagaagcctgggacacagtaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa(SEQ.ID NO：2)。在另一个实施方案中，本发明的Oct-4CDNA包含与SEQ.ID.NO：2同源的核酸序列。在另一个实施方案中，所述Oct-4CDNA序列是人Oct-4 CDNA序列。在另一个实施方案中，所述Oct-4CDNA序列来自非人物种。每种可能性均代表本发明的单独实施方案。
在另一个实施方案中，本发明的OCT-4蛋白的序列包含序列：MAGHLASDFAFSPPPGGGGDGPGGPEPGWVDPRTWLSFQGPPGGPGIGPGVGPGSEVWGIPPCPPPYEFCGGMAYCGPQVGVGLVPQGGLETSQPEGEAGVGVESNSDGASPEPCTVTPGAVKLEKEKLEQNPEESQDIKALQKELEQFAKLLKQKRITLGYTQADVGLTLGVLFGKVFSQTTICRFEALQLSFKNMCKLRPLLQKWVEEADNNENLQEICKAETLVQARKRKRTSIENRVRGNLENLFLQCPKPTLQQISHIAQQLGLEKDVVRVWFCNRRQKGKRSSSDYAQREDFEAAGSPFSGGPVSFPLAPGPHFGTPGYGSPHFTALYSSVPFPEGEAFPPVSVTTLGSPMHSN(SEQ.ID NO：3)。在另一个实施方案中，本发明的OCT-4蛋白包含与SEQ.ID.NO：3同源的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述OCT-4蛋白是人OCT-4蛋白。在另一个实施方案中，所述OCT-4蛋白来自非人物种。每种可能性均代表本发明的单独实施方案。
在另一个实施方案中，本发明的OCT-4蛋白的序列包含序列：MCKLRPLLQKWVEEADNNENLQEICKAETLVQARKRKRTSIENRVRGNLENLFLQCPKPTLQQISHIAQQLGLEKDVVRVWFCNRRQKGKRSSSDYAQREDFEAAGSPFSGGPVSFPLAPGPHFGTPGYGSPHFTALYSSVPFPEGEAFPPVSVTTLGSPMHSN(SEQ.IDNO：4)。在另一个实施方案中，本发明的OCT-4蛋白包含与SEQ.ID.NO：4同源的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述OCT-4蛋白是人OCT-4蛋白。在另一个实施方案中，所述OCT-4蛋白来自非人物种。每种可能性均代表本发明的单独实施方案。
在另一个实施方案中，本发明的Oct-4应答启动子序列包含cacccaggggcggggccagaggtcaaggctagagggtggg(SEQ.ID NO：5)。在另一个实施方案中，本发明的Oct-4应答启动子包含与SEQ.ID.NO：5同源的核酸序列。在另一个实施方案中，所述Oct-4应答启动子序列是鼠Oct-4应答启动子序列。在另一个实施方案中，所述Oct-4应答启动子序列来自人。在另一个实施方案中，所述Oct-4应答启动子序列来自非人物种。每种可能性均代表本发明的单独实施方案。
在另一个实施方案中，本发明的Oct-4 DNA序列与SEQ.ID NO：1-2任一序列至少60％同源。在另一个实施方案中，本发明的Oct-4 DNA序列与SEQ.ID NO：1-2任一序列至少70％同源。在另一个实施方案中，本发明的Oct-4 DNA序列与SEQ.ID NO：1-2任一序列至少80％同源。在另一个实施方案中，本发明的Oct-4 DNA序列与SEQ.ID NO：1-2任一序列至少90％同源。在另一个实施方案中，本发明的Oct-4 DNA序列与SEQ.ID NO：1-2任一序列至少95％同源。
在另一个实施方案中，本发明的Oct-4应答启动子DNA序列与SEQ.IDNO：5至少60％同源。在另一个实施方案中，本发明的Oct-4应答启动子DNA序列与SEQ.ID NO：5至少70％同源。在另一个实施方案中，本发明的Oct-4应答启动子DNA序列与SEQ.ID NO：5至少80％同源。在另一个实施方案中，本发明的Oct-4应答启动子DNA序列与SEQ.ID NO：5至少90％同源。在另一个实施方案中，本发明的Oct-4应答启动子DNA序列与SEQ.ID NO：5至少95％同源。
在另一个实施方案中，本发明的Oct-4蛋白序列与SEQ.ID NO：3-4任一序列至少60％同源。在另一个实施方案中，本发明的Oct-4蛋白序列与SEQ.ID NO：3-4任一序列至少70％同源。在另一个实施方案中，本发明的Oct-4蛋白序列与SEQ.ID NO：3-4任一序列至少80％同源。在另一个实施方案中，本发明的Oct-4蛋白序列与SEQ.ID NO：3-4任一序列至少90％同源。在另一个实施方案中，本发明的Oct-4蛋白序列与SEQ.ID NO：3-4任一序列至少95％同源。
在另一个实施方案中，本发明的方法提供了高纯的生物标记的NSC群。在另一个实施方案中，本发明的方法提供了通过利用高纯的生物标记的NSC群的荧光性质对其进行多方面研究(图7-9)。
在另一个实施方案中，本发明的方法提供了NSC可以传代至少5代而不丧失其NSC表型。在另一个实施方案中，本发明的方法提供了NSC可以传代至少8代而不丧失其NSC表型。在另一个实施方案中，本发明的方法提供了NSC可以传代至少10代而不丧失其NSC表型。在另一个实施方案中，本发明的方法提供了NSC可以传代至少15代而不丧失其NSC表型。在另一个实施方案中，本发明的方法提供了NSC可以传代至少20代而不丧失其NSC表型。在另一个实施方案中，本发明的方法提供了NSC可以传代至少25代而不丧失其NSC表型。在另一个实施方案中，本发明的方法提供了NSC可以传代至少30代而不丧失其NSC表型。在另一个实施方案中，本发明的方法提供了NSC可以传代至少35代而不丧失其NSC表型。在另一个实施方案中，本发明的方法提供了NSC可以传代至少40代而不丧失其NSC表型。在另一个实施方案中，本发明的方法提供了NSC可以传代至少45代而不丧失其NSC表型。在另一个实施方案中，本发明的方法提供了NSC可以传代至少50代而不丧失其NSC表型。
在另一个实施方案中，本发明的方法提供了NSC可以传代至少5代且保留Oct-4表达。在另一个实施方案中，本发明的方法提供了NSC可以传代至少10代且保留Oct-4表达。在另一个实施方案中，本发明的方法提供了NSC可以传代至少15代且保留Oct-4表达。在另一个实施方案中，本发明的方法提供了NSC可以传代至少20代且保留Oct-4表达。在另一个实施方案中，本发明的方法提供了NSC可以传代至少25代且保留Oct-4表达。在另一个实施方案中，本发明的方法提供了NSC可以传代至少30代且保留Oct-4表达。在另一个实施方案中，本发明的方法提供了NSC可以传代至少35代且保留Oct-4表达。在另一个实施方案中，本发明的方法提供了NSC可以传代至少40代且保留Oct-4表达。在另一个实施方案中，本发明的方法提供了NSC可以传代至少45代且保留Oct-4表达。在另一个实施方案中，本发明的方法提供了NSC可以传代至少50代且保留Oct-4表达。
在另一个实施方案中，本发明的方法提供了NSC群在延长的时间期间被扩增为大体积大量培养物而不丧失其希望的纯NSC表型。在另一个实施方案中，本发明的方法提供了NSC群在延长的时间期间被扩增为大体积大量培养物而不丧失其Oct-4表达。
在另一个实施方案中，针对干细胞标记富集NSC。在另一个实施方案中，所述干细胞标记是OCT4、Nanog、STAT3或其组合。在另一个实施方案中，所述干细胞标记是转录因子如OCT4。在另一个实施方案中，OCT4在NSC中差异表达。在另一个实施方案中，使用基于与表面抗原的亲和性的富集OCT4表达细胞的免疫学方法。在另一个实施方案中，通过基于免疫磁性的细胞分离技术富集NSC。在另一个实施方案中，通过基于与特异于表面抗原的抗体保温而电泳迁移率降低的电泳细胞分离技术富集NSC。在另一个实施方案中，通过与表面抗原特异性抗体保温而降低电泳迁移率是在非加帽(non-capping)条件下进行的。在另一个实施方案中，通过荧光激活细胞分选仪(FACS)、免疫磁性珠或者磁性激活细胞分选仪(MACS)进一步富集NSC。
在另一个实施方案中，混合的癌细胞群在非贴壁细胞培养条件下生长，其中NSC形成球形细胞簇(球体)，从中可以富集OCT4阳性NSC。在另一个实施方案中，源自游离漂浮球体的细胞与等价的贴壁细胞培养物相比表达更高水平的OCT4和Nanog mRNA，如图3示出。在另一个实施方案中，包含所述球体的细胞是游离漂浮的。在另一个实施方案中，在体外从乳腺癌样品富集NSC是使用非贴壁乳腺球细胞培养系统进行的。在另一个实施方案中，在体外从骨肉瘤细胞富集NSC是使用非贴壁肉球细胞培养系统进行的。在另一个实施方案中，在体外从脑瘤细胞富集NSC是使用非贴壁神经球细胞培养系统进行的。在另一个实施方案中，在体外从脑瘤细胞富集NSC是使用游离漂浮球体进行的。
在另一个实施方案中，富含NSC的癌细胞亚群至少60％是OCT4表达阳性的。在另一个实施方案中，富含NSC的癌细胞亚群至少70％是OCT4表达阳性的。在另一个实施方案中，富含NSC的癌细胞亚群至少80％是OCT4表达阳性的。在另一个实施方案中，富含NSC的癌细胞亚群至少80％是Nanog表达阳性的。在另一个实施方案中，富含NSC的癌细胞亚群至少80％是STAT3表达阳性的。在另一个实施方案中，富含NSC的癌细胞亚群至少80％是OCT4、STAT3、Nanog表达或其组合是阳性的。在另一个实施方案中，富含NSC的癌细胞亚群至少90％是OCT4表达阳性的。在另一个实施方案中，富含NSC的癌细胞亚群至少90％是Nanog表达阳性的。在另一个实施方案中，富含NSC的癌细胞亚群至少90％是STAT3表达阳性的。在另一个实施方案中，富含NSC的癌细胞亚群至少90％是OCT4、STAT3、Nanog表达或其组合是阳性的。在另一个实施方案中，富含NSC的癌细胞亚群至少95％是OCT4表达阳性的。在另一个实施方案中，富含NSC的癌细胞亚群至少95％是Nanog表达阳性的。在另一个实施方案中，富含NSC的癌细胞亚群至少95％是STAT3表达阳性的。在另一个实施方案中，富含NSC的癌细胞亚群至少95％是OCT4、STAT3、Nanog表达或其组合是阳性的。
在另一个实施方案中，本发明提供了通过FACS分析(图10)、原位杂交、免疫组织化学或其组合确定富含NSC的癌细胞亚群的水平，所述方法在材料与方法章节中描述。
在另一个实施方案中，所述富含NSC的细胞群的特征在于OCT4hi表达。在另一个实施方案中，OCT4hi表达是β-肌动蛋白表达的至少两倍。在另一个实施方案中，OCT4hi表达是β-肌动蛋白表达的至少四倍。在另一个实施方案中，富含NSC的细胞群的特征进一步在于Nanog、STAT3的高表达或其组合。
在另一个实施方案中，OCT4、Nanog或STAT3的表达水平通过mRNA转录水平确定。在另一个实施方案中，转录水平通过定量或半定量PCR或RT-PCR方法确定，所述方法如图2A所示及在材料与方法章节中描述。在另一个实施方案中，OCT4、Nanog或STAT3的表达水平通过蛋白质表达水平确定。在另一个实施方案中，蛋白质表达水平通过western印迹分析确定，所述分析方法如图2B所示及在材料与方法章节中描述。在另一个实施方案中，蛋白质表达水平通过使用报道基因间接确定。在另一个实施方案中，所述报道基因包括EGFP构建体。在另一个实施方案中，OCT4-EGFP转染的胶质母细胞瘤细胞培养物(图7和8)中OCT4表达水平如在材料与方法章节中描述确定。
在另一个实施方案中，NSC亚群是从“软”或“硬”肿瘤中富集。在另一个实施方案中，“硬”肿瘤包括除了白血病、淋巴瘤、黑素瘤和多发性骨髓瘤之外的所有肿瘤，除外的这些肿瘤在另一个实施方案中被分类为“软”肿瘤。在另一个实施方案中，NSC亚群从分离的转移瘤细胞中富集。在另一个实施方案中，NSC亚群从包含源自肿瘤细胞系的细胞的组织培养物中富集。
在另一个实施方案中，本发明包含一种组合物，其包含根据OCT4表达被富集的NSC群。在另一个实施方案中，本发明包含根据OCT4hi表达富集的NSC群。在另一个实施方案中，所述组合物进一步包含如本文所述的NSC可以被诱导增殖并产生NSC子代的那些合适环境。在另一个实施方案中，NSC子代被置于其中的所述“环境”是指影响NSC生长和发育的外部或外在的物理和/或化学条件的组合。在另一个实施方案中，所述环境可以是离体(ex vivo)或体内环境。在另一个实施方案中，循环系统(血液和淋巴系统)可以作为诱导NSC产生子代的体内环境。在另一个实施方案中，所述环境是离体环境，包括NSC置于培养箱中的细胞培养基中。
在另一个实施方案中，所述环境进一步包括包含DMEM/F12的细胞培养基。在另一个实施方案中，所述细胞培养基进一步包含终浓度低于3％、更优选低于1.5％的甲基纤维素。在另一个实施方案中，所述培养基补加了8-20％胎牛血清(FBS)、30-70％源自人原代包皮成纤维细胞的培养基或其组合。在另一个实施方案中，所述培养基进一步包含结合OCT4的筛选剂。在另一个实施方案中，所述培养基进一步包含与OCT4应答元件相互作用的筛选剂。
在另一个实施方案中，所述培养基进一步补加了5-50nM孕酮、5-500μM腐胺、2-100ng/ml重组EGF、20-40nM亚硒酸钠、10-40μg/ml运铁蛋白(transferring)、5-50μg/ml胰岛素、2-100ng/ml重组FGF2或其组合。在另一个实施方案中，所述培养基补加了8-20％胎牛血清(FBS)、30-70％源自人原代包皮成纤维细胞培养物的培养基或其组合。在另一个实施方案中，所述培养基包含核酸。在另一个实施方案中，所述培养基包含质粒DNA。在另一个实施方案中，所述质粒DNA包含OCT4应答启动子。在另一个实施方案中，所述OCT4应答启动子与报道基因连接(图8)。在另一个实施方案中，所述OCT4应答启动子与抗生素抗性基因连接。在另一个实施方案中，所述培养基包含siRNA。在另一个实施方案中，所述siRNA反义编码抗-OCT4、抗-Nanog、抗-STAT3或其组合。在另一个实施方案中，抗-OCT4siRNA通过抑制OCT4蛋白的从头产生(图4A)而抑制克隆形成(图4B)。
在另一个实施方案中，所述细胞铺板于超低附着平板中。在另一个实施方案中，所述细胞保持在36-42℃的温度的培养箱中。在另一个实施方案中，所述培养箱进一步保持4-8％CO2。在另一个实施方案中，所述培养箱保持90-100％湿度。在另一个实施方案中，细胞以1 x 102-1 x 106个细胞/cm2终密度铺板。
在另一个实施方案中，本发明的NSC源自细胞系。在另一个实施方案中，本发明的NSC源自原代细胞培养物。在另一个实施方案中，包含NSC的原代细胞培养物源自肿瘤或细胞转移瘤。在另一个实施方案中，本发明包含具有NSC的肿瘤和细胞转移瘤。在另一个实施方案中，肿瘤和细胞转移瘤源自但非限于：肾上腺皮质癌、直肠癌症、膀胱癌、脑癌、脑干神经胶质瘤、脑瘤、小脑星形细胞瘤、脑星形细胞瘤、室管膜瘤、髓母细胞瘤、幕上原发神经外胚层肿瘤、松果体瘤、下丘脑神经胶质瘤、乳腺癌、类癌瘤、癌、宫颈癌、结肠癌、子宫内膜癌、食管癌、肝外胆管癌、ewings肿瘤家族(pnet)、颅外生殖细胞瘤、眼癌、眼内黑色素瘤、胆囊癌、胃癌、生殖细胞肿瘤、性腺外妊娠滋养细胞肿瘤、头颈癌、下咽癌、胰岛细胞癌、喉癌、白血病、急性淋巴母细胞白血病、口腔癌、肝癌、肺癌、小细胞癌、淋巴瘤、AIDS-相关淋巴瘤，中枢神经系统(原发性)淋巴瘤、皮肤T-细胞淋巴瘤、霍奇金病、非霍奇金病，恶性间皮瘤、黑素瘤、merkel细胞癌、转移鳞状癌、多发性骨髓瘤、浆细胞赘生物、蕈样肉芽肿、骨髓增生异常综合征、骨髓增生病、鼻咽癌、神经细胞瘤、口咽癌、骨肉瘤、卵巢上皮癌、卵巢生殖细胞肿瘤、卵巢低度潜在恶性肿瘤、胰腺癌、外分泌性胰腺癌、胰岛细胞癌、鼻旁窦和鼻腔癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、嗜铬细胞瘤、垂体癌，浆细胞赘生物、前列腺癌、横纹肌肉瘤、直肠癌、肾细胞癌、唾液腺癌、sezary综合征、皮肤癌、皮肤T细胞淋巴瘤、皮肤癌、kaposi′s肉瘤、皮肤癌、黑素瘤、小肠癌、软组织肉瘤、软组织肉瘤、睾丸癌、胸腺瘤、恶性甲状腺癌、尿道癌、子宫癌、肉瘤、儿童异常癌(unusual cancer ofchildhood)、阴道癌、外阴癌、或肾母细胞瘤。
在另一个实施方案中，本发明提供了鉴别NSC的方法，包括将赘生性细胞与和OCT4特异性相互作用的物质接触，将所述物质应用于包含原代细胞培养物的细胞培养物或细胞系培养物中进行。在另一个实施方案中，NSC亚群在“软或硬”肿瘤中鉴别。在另一个实施方案中，“硬”肿瘤包括除了白血病、淋巴瘤、黑素瘤和多发性骨髓瘤之外的所有肿瘤，除外的这些肿瘤被分类为“软”肿瘤。在另一个实施方案中，NSC在转移瘤细胞中鉴别。
在另一个实施方案中，本发明提供了鉴别NSC的方法，包括将赘生性细胞与和OCT4特异性相互作用的物质接触，并鉴别与所述物质特异性相互作用的细胞，如本文所述。在另一个实施方案中，鉴别OCT4的物质与细胞膜相互作用。在另一个实施方案中，所述物质与编码OCT4的POU5F1基因或其片段相互作用。在另一个实施方案中，所述物质与编码OCT4的mRNA或其片段相互作用。在另一个实施方案中，所述物质与OCT4蛋白或其片段相互作用。在另一个实施方案中，所述物质与OCT4的特异翻译后形式相互作用，例如但非限于磷酸化的OCT4蛋白。
在另一个实施方案中，本发明提供了使用DNA探针鉴别NSC的方法，所述DNA探针与DNA-RNA异源双链体中OCT4mRNA特异性相互作用。在另一个实施方案中，鉴别NSC的方法利用RNA探针，所述RNA探针与RNA-RNA同源双链体中的OCT4mRNA特异性相互作用。在另一个实施方案中，鉴别NSC的方法利用肽核酸(PNA)探针，所述探针与PNA-RNA异源双链体中的OCT4mRNA特异性相互作用。在另一个实施方案中，所述核酸或PNA探针进一步包含可易于鉴别的标记。在另一个实施方案中，所述方法利用包含核酸的特异性探针，所述核酸使得可以选择性鉴别OCT4表达细胞。
在另一个实施方案中，本发明提供了鉴别包含与OCT4蛋白或其片段特异性相互作用的配体的NSC的方法。在另一个实施方案中，本发明提供了鉴别包含与OCT4蛋白或其片段特异性相互作用的配体的NSC的方法。在另一个实施方案中，利用单克隆或多克隆抗-OCT4抗体检测OCT4。
在另一个实施方案中，本发明提供了检测OCT4表达细胞的方法。在另一个实施方案中，所述检测方法是直接检测法，其中使用放射性标记，在另一个实施方案中包含放射性化合物如32P或125I。在另一个实施方案中，直接标记包含荧光标记、化学发光标记或金标记。在另一个实施方案中，所述检测方法是间接检测法，包含与本领域技术人员已知的免疫组织化学探针相似的核酸探针。在另一个实施方案中，探针可以用半抗原或生物素标记以携带在杂交位点产生可检测事件(例如化学发光、生色或荧光)的酶。在另一个实施方案中，在需要扩大检测信号的情况中，利用特异性鉴别初级抗体的二级标记抗体。在另一个实施方案中，所述方法利用包含使得可以选择性鉴别OCT4表达细胞的抗体的特异探针。
在另一个实施方案中，将表达OCT4的异质细胞群用包含控制可鉴别报道基因产物表达的OCT4应答启动子的质粒转染。在另一个实施方案中，所述可鉴别基因产物包含绿色荧光蛋白例如但非限于：GFP、Emerald、Azami Green或ZsGreen1；蓝色荧光蛋白例如但非限于：EBFP或Sapphire；蓝绿色荧光蛋白例如但非限于：Cerulean、ECFP、AmCyan1或Midoriishi-Cyan；黄色荧光蛋白例如但非限于：ZsYellow1、PhiYFP、Citrine或Venus；橙色荧光蛋白例如但非限于：Kusabira-Orange或mOrange；红色荧光蛋白例如但非限于：DsRed、HcRed、mPlum、mRaspberry、mTomato、mStrawberry或者绿色-红色荧光Dendra。在另一个实施方案中，所述可鉴别基因产物作为表达OCT4与不表达OCT4的细胞之间的可区别标记(图8)。
在另一个实施方案中，本发明提供了鉴别表达OCT4的NSC的方法，包括观测探查的NSC。在另一个实施方案中，表达OCT4的NSC的观测是通过将标记样品暴露于胶片进行。在另一个实施方案中，表达OCT4的NSC的观测可以用荧光显微镜进行。在另一个实施方案中，表达OCT4的NSC的观测可以用共焦显微镜进行。在另一个实施方案中，表达OCT4的NSC的观测可以用电子显微镜进行。在另一个实施方案中，光学显微镜用于观测表达OCT4的NSC，而在另一个实施方案中，通过肉眼即可检测到信号。在另一个实施方案中，上述观测方法的结果可以在CCD照相机上进一步记录和/或观测。
在另一个实施方案中，本发明提供了分离赘生干细胞的方法，包括将赘生性细胞与和OCT4特异性相互作用的物质接触的步骤。在另一个实施方案中，应用包含原代细胞培养物的细胞培养物或细胞系培养物。
在另一个实施方案中，本发明提供了细胞分开方法，包括细胞分离方法。在另一个实施方案中，在细胞分开方法之前利用组织解离技术。在另一个实施方案中，应用如释放酶(liberase)、胰蛋白酶、弹性蛋白酶、分散酶、胶原酶或其组合等酶以进行有效的组织解离。在另一个实施方案中，需要用移液管头进一步捣碎以破坏细胞聚集。
在另一个实施方案中，本发明提供了分离赘生干细胞的方法，包括将赘生性细胞与和OCT4特异性相互作用的物质接触，及分离与所述物质特异性相互作用的细胞，如所述。在另一个实施方案中，先前描述的鉴别赘生干细胞的方法、特别是将赘生性细胞与和OCT4蛋白或mRNA特异性相互作用的物质接触的步骤也用于分离NSC。
在另一个实施方案中，本发明提供了用质粒转染的异质细胞群，所述质粒包含控制可鉴别和/或可选择的基因产物表达的Oct4应答启动子(图8)。在另一个实施方案中，先前描述的包括使用各种可鉴别荧光蛋白序列鉴别赘生干细胞的方法也用于细胞分开方法中。在另一个实施方案中，所述可鉴别基因产物选择性用于分离OCT4表达细胞，产生一致的表达OCT4的NSC。
在另一个实施方案中，表达OCT4的NSC在层析柱中分离，其中附着于柱的特异于OCT4的抗体结合表达OCT4的NSC，从而将其分开。在另一个实施方案中，与磁性颗粒共价结合且与OCT4特异性相互作用的物质用于在磁场中保留表达OCT4的NSC。在另一个实施方案中，通过FACS淘选用包含荧光标记的抗体标记的表达OCT4的NSC用于从异质细胞群中分开NSC，如图10所示。在另一个实施方案中，本文所述分开方法产生分离的表达OCT4的细胞群。
在另一个实施方案中，本发明提供了富集表达OCT4的NSC的方法。在另一个实施方案中，针对原代细胞培养物富集表达OCT4的细胞。在另一个实施方案中，对其应用富集表达OCT4的NSC的方法的原代细胞培养物源自软肿瘤、硬肿瘤，或者转移瘤细胞群。在另一个实施方案中，表达OCT4的NSC亚群从包含源自细胞系的细胞的组织培养物中富集。
在另一个实施方案中，本发明提供了富集表达OCT4的NSC的方法，包括用质粒转染异质细胞群，所述质粒包含控制可选择的基因产物表达的Oct4应答启动子(图8)。在另一个实施方案中，所述可选择的基因编码抗生素抗性蛋白。在另一个实施方案中，所述细胞富集方法进一步包含选择剂。在另一个实施方案中，所述选择剂是抗生素，其选择性根除非OCT4表达细胞，产生富集的OCT4表达NSC细胞群。
在另一个实施方案中，本发明提供了诱导癌症的方法，包括将根据OCT4表达被富集的赘生干细胞群导入哺乳动物中。在另一个实施方案中，所述诱导癌症的方法包括导致癌症的促进细胞生长。在另一个实施方案中，诱导癌症的方法包括提供诱导癌症的转移瘤细胞。
在另一个实施方案中，分离自乳腺球、肉球或神经球的本发明NSC用作癌症诱导剂。在另一个实施方案中，用NSC接种动物。在另一个实施方案中，NSC经静脉内注射。在另一个实施方案中，将NSC注射进骨中。在另一个实施方案中，NSC经皮内、肌内或腹膜内注射进动物中。在另一个实施方案中，NSC被直接注射至模型动物的乳腺中。在另一个实施方案中，接种包括将NSC注射进模型动物的脂肪垫中。
在另一个实施方案中，本发明提供了诱导癌症的方法。在另一个实施方案中，所述诱导癌症的方法在免疫缺陷啮齿动物中进行。在另一个实施方案中，所述免疫缺陷啮齿动物是裸小鼠或大鼠。在另一个实施方案中，所述免疫缺陷啮齿动物是SCID小鼠。在另一个实施方案中，所述免疫缺陷啮齿动物是NIH-III小鼠。
在另一个实施方案中，本发明提供了诱导肿瘤或转移瘤的方法，包括将根据OCT4表达富集的赘生干细胞群导入哺乳动物中。在另一个实施方案中，诱导原位或异位肿瘤(图11)。在另一个实施方案中，转移通过淋巴系统、血流、扩散机体空间或者通过植入发生。
在另一个实施方案中，本发明提供了在体内分析癌症进展和/或发病机制的方法，包括将OCT4hi赘生干细胞移植至动物体内，分析动物体内的癌症进展和/或发病机制。在另一个实施方案中，癌症包括癌、肉瘤、淋巴瘤、白血病或骨髓瘤。
在另一个实施方案中，本发明的NSC通过用荧光蛋白转染OCT4hi赘生干细胞而标记。在另一个实施方案中，可鉴别的基因产物包含如上述的多种荧光蛋白。在另一个实施方案中，所述可鉴别的基因产物包含发光蛋白。在另一个实施方案中，所述发光蛋白是荧光素酶。在另一个实施方案中，同位素用于在动物模型中追踪移植的OCT4hi赘生干细胞。在另一个实施方案中，所述同位素包含32p、125I、124I、123I、14C、109Cd、51Cr、67Cu、179Ta、111In、18F或其组合。在另一个实施方案中，使用磁性标记进行细胞检测。
在另一个实施方案中，本发明的移植的标记的细胞用单光子发射计算体层摄影(SPECT)扫描仪、正电子发射断层扫描仪(PET)或者单光子发射计算体层摄影术追踪。在另一个实施方案中，在细胞是经磁性标记的情况中，使用MRI进行检测。在另一个实施方案中，使用背照式冷却电荷耦合器件(CCD)照相机进行发光检测。在另一个实施方案中，使用具有激发滤波片和发射滤波片的LED闪光灯检测荧光标记的细胞。在另一个实施方案中，使用具有大约490nm光纤灯的灯箱及置于该灯箱顶部的滤光片对较大的肿瘤成像。在另一个实施方案中，使用荧光解剖显微镜观测较小的肿瘤和转移瘤，所述显微镜具有光源和在大约490nm的激发滤波片。在另一个实施方案中，使用彩色CCD摄像机以及双光子激光仪对荧光蛋白表达进行超高分辨率体内成像。
在另一个实施方案中，本发明提供了在体内分析癌症进展和/或发病机制包括确定细胞转移的方法。在另一个实施方案中，细胞转移的分析包括确定细胞在与原发肿瘤不连续的部位的进展性生长情况。在另一个实施方案中，细胞转移部位的分析包括肿瘤传播的途径。在一些实施方案中，细胞可以通过血管系统、淋巴系统、机体内腔或其组合扩散。在另一个实施方案中，细胞转移分析根据细胞迁移、传播、渗出、增殖或其组合进行。
在另一个实施方案中，本发明提供了在体内分析癌症进展和/或发病机制的方法。在另一个实施方案中，在体内癌症进展和/或发病机制的分析包括确定肿瘤进展的程度。在另一个实施方案中，所述分析包括肿瘤的鉴别(图11)。在另一个实施方案中，肿瘤进展的分析对原始肿瘤或者“原发肿瘤”进行。在另一个实施方案中，所述分析依赖于本领域技术人员已知的癌症类型随着时间而进行(图11)。在另一个实施方案中，在体内进一步分析源自原发肿瘤的转移细胞的继发肿瘤。在另一个实施方案中，分析了继发肿瘤的大小和形状。在一些实施方案中，进行进一步的离体分析。在另一个实施方案中，如图1所示评估软骨肉瘤或骨肉瘤中OCT4表达细胞的频率。
在另一个实施方案中，术语评估、筛选、评价和分析可互换应用。
在另一个实施方案中，如本领域技术人员所已知，在特定时间点评估转移瘤或肿瘤的病理学样品。在另一个实施方案中，进一步应用定量或定性方法评价肿瘤阻抑基因、癌基因、凋亡基因、信号转导基因、受体、转录因子、配体或其组合，所述方法包括PCR、western-印迹、northern-印迹、southern-印迹、免疫组织化学或者原位杂交分析。
在另一个实施方案中，从病理学样品中分离肿瘤或转移瘤细胞以进行进一步分析。在另一个实施方案中，从病理学样品中分离肿瘤或转移瘤细胞并且培养生长。在另一个实施方案中，评价原发肿瘤细胞培养物的细胞增殖潜力。在另一个实施方案中，根据上述方法从包含肿瘤或转移瘤细胞的病理学样品中分离和/或富集OCT4阳性细胞。在另一个实施方案中，对分离自肿瘤的OCT4阳性细胞进一步分析。在一些实施方案中，对所述肿瘤或转移瘤原代细胞培养物进一步应用各种物质。在另一个实施方案中，所述物质是致癌物质。在另一个实施方案中，所述物质是促凋亡剂或者分化剂。
在另一个实施方案中，本发明提供了评价致癌物质对于原代细胞培养物的作用的方法。在另一个实施方案中，所述致癌物质包括但不限于International Agency for Research on Cancer(IARC)的目录1-3中列出的致癌物质。
在另一个实施方案中，本发明提供了评价治疗剂对于源自肿瘤或转移瘤的原代细胞培养物的作用的方法。在另一个实施方案中，针对源自肿瘤或转移瘤的原代细胞培养物离体筛选治疗剂。在另一个实施方案中，所述治疗剂包含干扰素、白细胞介素、集落刺激因子、烷化剂、亚硝基脲、抗代谢物、抗肿瘤抗生素、植物(长春花)碱、类固醇激素或其组合。在另一个实施方案中，所述治疗剂是化疗剂。在另一个实施方案中，所述化疗剂是非特异性的且因此在细胞周期任何阶段均可以杀死癌细胞。在另一个实施方案中，所述化疗剂是特异性的且因此在细胞周期特定阶段能杀死癌细胞。
在另一个实施方案中，本发明提供了源自临床肿瘤样品(无论是原发还是转移的)或者源自永久肿瘤细胞系的异质癌细胞群可以被操作以使得可以分离和增殖其各自的癌干细胞群。在另一个实施方案中，本发明提供了基于维持由Oct3/4转录因子的启动子驱动的荧光(或发光)蛋白表达的能力而鉴别、淘选和稳定维持NSC培养物亚组的方法。在另一个实施方案中，本发明提供了与SOX-2、Nanog和STAT3相一致的Oct3/4转录因子是胚胎发育包括自我更新过程中正常干细胞表型的调节物。
在另一个实施方案中，本发明提供了在癌症中，NSC不具有适当的增殖控制作用，使得自我更新过程未经核查而导致在增殖部位产生发育异常组织块。在另一个实施方案中，本发明的方法提供了由上述分子机制平行调节的生物标记的应用。在另一个实施方案中，这些调节的生物标记监测给定癌细胞的“干性(stemness)”。
在另一个实施方案中，本发明可以监测NSC群的相对生存力和“干性”。
在另一个实施方案中，本发明提供了NSC是造成转移至全身器官的原因。在另一个实施方案中，本发明提供了NSC是转移至全身器官所必需的。在另一个实施方案中，本发明提供了NSC是造成在治疗(即手术、放疗和化疗)后在原发部位再发癌症生长的原因。在另一个实施方案中，本发明的方法提供了可以鉴别靶向那些具有转移潜力的NSC的药物的平台。
在另一个实施方案中，本发明的方法使用小型化形式培养的细胞进行。在另一个实施方案中，本发明的小型化形式培养的细胞包括多孔平板。在另一个实施方案中，本发明的多孔平板包括96孔平板。在另一个实施方案中，本发明的多孔平板包括384孔平板(实施例2)。在另一个实施方案中，本发明的多孔平板包括1536孔平板。在另一个实施方案中，本发明的多孔平板包括2-5000孔平板。在另一个实施方案中，本发明的多孔平板包括20-3000孔平板。在另一个实施方案中，本发明的多孔平板包括96-2000孔平板。
在另一个实施方案中，本发明提供了评估光动力疗法(PDT)对于肿瘤原代细胞培养物的作用的方法。在另一个实施方案中，进一步评价了单独的放疗或射频切除术或者与任何其它形式治疗剂组合对于肿瘤原代细胞培养物的作用。在另一个实施方案中，分析了化疗栓塞对于肿瘤原代细胞培养物的作用。在另一个实施方案中，分析了局部高温对于肿瘤原代细胞培养物的作用。在一些实施方案中，多种物质和条件的体内作用是希望的。
在另一个实施方案中，本发明提供了将感兴趣的物质进一步在体内给予已经移植了表达OCT4的NSC的动物的方法。在另一个实施方案中，表达OCT4的NSC表达OCT4hi。在另一个实施方案中，物质的给予是根据本领域技术人员已知的程序进行。在另一个实施方案中，如本领域技术人员所已知，需要单次或多次给予一或多种物质。在另一个实施方案中，正如本领域技术人员所已知，所述一或多种物质是在几天至几周或者几个月至几年的时间内给予，根据癌症的进展和/或衰退情况而定。在另一个实施方案中，所述物质是致癌物质，在另一个实施方案中其是International Agencyfor Research on Cancer(IARC)的目录1-3中列出的致癌物质。在另一个实施方案中，所述物质是治疗剂。
在另一个实施方案中，本发明提供了研究治疗剂对于癌症进展的作用的手段(图12)。在另一个实施方案中，评估了治疗剂对于细胞转移潜力的作用。在另一个实施方案中，评估了治疗剂对于软肿瘤的作用。在另一个实施方案中，评估了治疗剂对于硬肿瘤的作用。在另一个实施方案中，评估了治疗剂对于原发和/或继发肿瘤生长的作用。
在另一个实施方案中，在体内给予移植了OCT4或OCT4hi赘生干细胞(图12)的动物的治疗剂包括：干扰素、白细胞介素、集落刺激因子、烷化剂、亚硝基脲、抗代谢物、抗肿瘤抗生素、植物(长春花)碱、类固醇激素或其组合。在另一个实施方案中，所述治疗剂是化疗剂。在另一个实施方案中，所述化疗剂是非特异性的且因此在细胞周期任何阶段均具有杀死癌细胞的潜力。在另一个实施方案中，所述化疗剂是特异性的，因此能在特定细胞周期阶段杀死癌细胞。
在另一个实施方案中，评估了PDT对于移植了OCT4hi赘生干细胞的动物的体内作用。在另一个实施方案中，进一步评价了单独的放疗或射频切除术或者组合任何其它形式的体内治疗剂的体内作用。在另一个实施方案中，评估了化学栓塞或者局部高温对于癌症进展和/或衰退的体内作用。
在另一个实施方案中，分析了生物学疗法对于移植了源自肿瘤或原代细胞培养物的OCT4hi赘生干细胞的动物的体内作用。在另一个实施方案中，生物学疗法包括免疫治疗。在另一个实施方案中，免疫治疗包括使用包含衍生自Nanog、STAT3、OCT4或其组合的免疫原性片段的疫苗，如本文所述。在另一个实施方案中，评价了非特异性免疫调节剂的作用。在另一个实施方案中，所述非特异性免疫调节剂是卡介苗(BCG)或左旋咪唑。
在另一个实施方案中，在移植了OCT4hi赘生干细胞的动物中在体内针对癌症进展或衰退筛选OCT4修饰剂(图12)。在另一个实施方案中，在体内筛选OCT4单克隆抗体。在另一个实施方案中，在体内筛选特异于OCT4蛋白的胞内抗体。在另一个实施方案中，如图4所示进一步在体内评估PNA、适体或者反义siRNA。
在另一个实施方案中，本发明提供了预防、治疗、消除或者抑制癌症、肿瘤生长、细胞转移或其组合的方法，包括将赘生性细胞与抑制OCT4表达或功能的物质接触的步骤。在另一个实施方案中，OCT4被瞬时抑制。在其它实施方案中，OCT4被组成型抑制。
在另一个实施方案中，本发明提供了抑制OCT4的方法，包括在DNA水平靶向OCT4表达并因此抑制或消除OCT4转录。在另一个实施方案中，在DNA水平抑制OCT4是通过DNA三链结构的形成而实现。在另一个实施方案中，所述三螺旋抑制复合物称作OCT4基因特异性寡核苷酸，并因此抑制OCT4转录。
在另一个实施方案中，本发明提供了抑制OCT4的方法，包括在RNA水平靶向OCT4表达并因此抑制OCT4表达。在另一个实施方案中，RNA是mRNA。在另一个实施方案中，基于反义的治疗用于抑制OCT4。在另一个实施方案中，设计与特异性OCT4 mRNA序列互补并因此抑制OCT4表达的合成寡核苷酸。
在另一个实施方案中，本发明提供了人工构建为与OCT4 mRNA序列杂交并因此抑制OCT4表达的肽核酸(PNA)。在另一个实施方案中，所述结合剂是特异性工程化的核酶，其切割OCT4 mRNA转录物，随之抑制OCT4表达。
在另一个实施方案中，抑制OCT4功能的方法包括靶向OCT4蛋白。在另一个实施方案中，OCT4功能的抑制通过抗体与OCT4蛋白的特异性结合并因此抑制或消除OCT4蛋白与OCT4应答DNA元件的结合而实现。在另一个实施方案中，在OCT4免疫治疗之后产生的胞内抗体或抗体抑制或消除OCT4功能。
在另一个实施方案中，本发明提供了特异于OCT4蛋白的胞内抗体。在另一个实施方案中，胞内抗体包含通过肽接头结合在一起的重链可变结构域与轻链可变结构域的单链，用于干扰OCT4蛋白与OCT4 DNA应答元件的结合。在另一个实施方案中，胞内抗体靶向细胞核，在此其抑制或消除OCT4蛋白与OCT4 DNA应答元件的结合。在另一个实施方案中，所述胞内抗体靶向OCT4蛋白上的OCT4蛋白DNA结合结构域，并因此抑制或消除OCT4蛋白与OCT4 DNA应答元件的结合。
在另一个实施方案中，本发明提供了包含OCT4肽的疫苗。在另一个实施方案中，所述OCT4肽增强OCT4特异性抗体。在另一个实施方案中，所述肽由全长OCT4基因组成。在另一个实施方案中，所述肽是OCT4的突变形式。在另一个实施方案中，使用4-18个氨基酸长度的OCT4肽。在另一个实施方案中，所述疫苗包含相同长度和序列的OCT4肽。在另一个实施方案中，所述疫苗包含长度和序列不同的OCT4肽的混合物。
在另一个实施方案中，使用寡核苷酸适体结合特异性OCT4蛋白序列，并因此抑制或消除OCT4蛋白结合OCT4 DNA应答元件。
在另一个实施方案中，本发明提供了突变的OCT4蛋白。在另一个实施方案中，所述突变的OCT4蛋白用于阻断下游OCT4应答基因的转录。在另一个实施方案中，所述突变的OCT4蛋白用于抑制或消除OCT4应答基因表达，野生型OCT4蛋白对于OCT4 DNA应答元件具有相似的亲和性。在另一个实施方案中，用于抑制或消除OCT4应答基因表达的突变的OCT4蛋白与野生型OCT4蛋白相比对于OCT4 DNA应答元件具有更高的亲和性。
材料和方法
组织中OCT4、STAT3或Nanog阳性细胞的免疫组织化学鉴别
如下所述对人和小鼠肿瘤活检组织进行OCT4、STAT3或Nanog免疫组织化学染色分析：将福尔马林固定的石蜡包埋组织切片(5μm)相继脱蜡、再水化及阻断内源过氧化物酶活性，随后在Trilogy unmasking溶液(CellMarque，Hot Springs AR)中在95℃进行25分钟抗原恢复。使用山羊ABCElite试剂盒(Vector Labs，Burlingame，CA)对载玻片进行生物素封闭、血清封闭和免疫染色。在室温应用1小时1:50稀释的OCT3/4、STAT3和Nanog的抗体(R&D Systems，Minneapolis，MN)。阳性染色用DAB(3，3’-二氨基联苯胺)检测，亮绿SF(淡黄)或者苏木精(Sigma，St.Louis，MO)用作复染。或者，收集原发乳腺癌病灶及脑和肺，通过低温恒温器切片。将组织在低温恒温器上切成16μm切片，分成轴面(乳腺和肺)和冠状面(脑)组。对一组进行苏木精-伊红(H&E)染色，另一组进行免疫组织化学染色。使用如下程序进行免疫组织化学。将冷冻的乳腺、肺和脑切片进行如下处理：(1)在于PBS中2％脱脂乳和0.3％Triton-X中保温1小时；(2)在室温在于3％驴血清和0.1％Triton-X中的OCT4、STAT3或Nanog抗体中保温过夜；(3)用PBS洗涤3次；(4)在室温于黑暗处与二级抗体保温4小时；(5)用PBS洗涤3次；及(6)通过分等级乙醇脱水，用二甲苯澄清，及用DPX封片剂(44581，FlukaBiochemika)覆盖盖玻片。使用Bio-Rad共焦显微镜观测免疫反应性并将图像收集在计算机上以进行后续分析。
OCT4、STAT3或Nanog阳性细胞培养物的免疫细胞化学鉴别
进行免疫组织化学染色以在人和小鼠的肿瘤活检组织原代培养物中鉴别OCT4、STAT3或Nanog阳性细胞，通过将样品在DMEM/F12培养基中用300U/ml的II型胶原酶(Gibco BRL Invitrogen Corporation，Grand Island，NY，USA)消化3-6小时切成小颗粒并通过70μm Cell Strainer(BectonDickinson Lab Ware，Franklin Lakes，NJ USA)过滤以制备单细胞悬浮液。细胞然后用PBS漂洗除去所有培养基，悬浮于培养基中并铺板。在细胞贴壁之后，应用含有新鲜的4％甲醛溶液和0.1％ Triton X-100的固定溶液。经生物素封闭、血清封闭而封闭细胞的内源过氧化物酶活性和使用山羊ABCElite试剂盒(Vector Labs，Burlingame，CA)免疫染色。在室温应用30分钟1:200稀释的OCT3/4、STAT3和Nanog的抗体(R&D Systems，Minneapolis，MN)。阳性染色用DAB(3，3’-二氨基联苯胺)检测，苏木精(Sigma，St.Louis，MO)用作复染。
OCT4-EGFP和Nanog-EGFP构建体
使用先前描述的策略和技术(Gerrard et al.，2005)对OCT4-EGFP和Nanog-EGFP构建体进行工程化。使用含有EGFP报道基因(pEGFP1，BDBiosciences)及在OCT4和Nanog启动子控制下的选择标记G418的质粒。人OCT4的启动子片段跨越OCT4基因的-3917碱基至+55碱基(hOCT4pr，人DNA序列中第67539至第71490)且含有驱动发育特异性EGFP表达的两个合适的调节元件。人Nanog的启动子片段跨越-132碱基至+300碱基(人染色体12的基因组DNA序列中第697969位至第701269位)。
用于产生生物标记的细胞的表达载体
使用人Oct-4应答启动子(Oct4hP，登记号为AP000509的人DNA序列的第67539至第71490位)构建Oct4hP-eGFP质粒，利用引物Oct4hP-F(5’-TTCCC ATG TCA AGT AAG TGG GGT GG-3’)和Oct4hP-R(5’-CGA GAAGGC AAA ATC TGA AGC CAG G-3’)、使用人基因组DNA(Promega G3041)作为模板通过聚合酶链反应扩增。将片段克隆进TOPO载体(Invitrogen)中，DNA序列的精确度通过双向DNA测序证实。然后通过插入在eGFP上游的HindIII和BamH1位点中(图12A)将Oct4hP克隆进表达载体pEGFP1(Clontech Cat#6086-1，Genbank Accession#U55761)中。
用于从胶质母细胞瘤、骨肉瘤和乳腺癌分离以及分析NSC的的神经球培养 系统的修饰
通过在半固体甲基纤维素(MC)中采用多效生长因子-EGF、FGF2和胰岛素抑制细胞的基质附着潜力来对由Weiss and Raynolds(1992)提出的神经球培养系统进行修饰。在这个实验中，NSC用如图7所示具有在人OCT4启动子控制下的EFGP和G418基因的EGFP报道质粒转染。
病变区(lesion)和病灶解剖
从其各自的组织部位切下病变区和病灶，使用具有GFP3滤波片(针对荧光能力)的Leica MZ16FA解剖显微镜和具有RGB滤波片的Q-成像Retiga EXi单色数码相机进行体外研究和分子分析。通过使用不同的测定法进一步研究这个肿瘤材料。
RNA分离与靶cDNA扩增
使用RNeasy Mini试剂盒分离总RNA并用RNAase-Free DNase Set(Qiagen Sciences，MD，USA)处理，用DNAase处理。使用SuperScript IIRNaseH+逆转录酶第一链合成系统(InVitrogen Life Technologies，Carlsbad，CA)通过用Oligo(dT)12-18(Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，CA)引发从1.5μg总RNA中合成cDNA。靶cDNA通过使用Platinum TaqDNA聚合酶(InVitrogen Life Technologies，Carlsbad，CA)和37次PCR循环进行扩增。人β微管蛋白III引物扩增了从Hbeta4基因的非翻译3′UTR区中转录的1356-1497bp产物，如Kavallaris et al.，1997所述。人OCT3/4(Accession#Z11898)、Nanog(NM 024865)、Stat3(NM 139276)、Gata-4(NM 002052)、Gata-6(NM 005257)、AFP(NM 001134)、Runx 1(NM 001754)的引物最初通过使用Oligo5.1程序产生。表1中示出了所有引物。
表1：用于基因表达分析的RT PCR引物
 
基因 正向引物 反向引物 产物长度(bp)
GATA4 GCCCAAGAACCTGAATAAATCTAAG AGACATCGCACTGACTGAGAACGTC 208
GATA6 TTCCCCCACAACACAACCTACAG GTAGAGCCCATCTTGACCCGAATAC 118
AFP GGTGTAGCGCTGCAAACGATG AATTTAAACTCCCAAAGCAGCACGA 210
STAT3 GGGTGGAGAAGGACATCAGCGGTAA GCCGACAATACTTTCCGAATGC 198
RUNX1 CTCAGGTTTGTCGGTCGAAGTGGAA CCGCAGCTGCTCCAGTTCAC 216
Nanog GCTGAGATGCCTCACACGGAG TCTGTTTCTTGACTGGGACCTTGTC 163
OCT3A/4 TGGAGAAGGAGAAGCTGGAGCAAAA GGCAGATGGTCGTTTGGCTGAATA 186
 
巢蛋白 CAGCTGGCGCACCTCAAGATG AGGGAAGTTGGGCTCAGGACTGG 209
β-III微管蛋白   CTGCTCGCAGCTGGAGTGAG CATAAATACTGCAGGAGGGC 141
GFAP GCTCGATCAACTCACCGCCAACA GACCTGACAGACGCTGCTGCCC 207
Western印迹分析
将细胞在冰上在裂解缓冲液中溶解至少1小时，所述缓冲液中含有50mM Tris-HCl、150mM NaCl、1mM EDTA、1％NP40、0.1％ SDS、1％脱氧胆酸钠、1mM钒酸钠和蛋白酶抑制剂：5μg/ml胃蛋白酶抑制剂、1mM苯甲磺酰氟、10μg/ml亮肽素、1mM NaF(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)。在离心(4℃，12000g，10分钟)之后，上清的蛋白质浓度通过BCAProtein Assay试剂盒(Pierce，Rockford，IL)使用Benchmark Microplate Reader(Bio Rad Laboratories，Hercules，CA USA)进行测量。将裂解物与Laemmli缓冲液(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)混合(1:1)。8-16％或10-20％Tris-HCl Ready Gels(Bio Rad Laboratories，Hercules，CA)的每条泳道上样15μg蛋白质并通过电泳分离。将具有转移的蛋白质的硝基纤维素膜(SigmaChemical Co.，St.Louis，MO)根据厂商推荐的方案封闭，与针对STAT3(R&D Systems)、磷酸-Tyr705 Stat3(Cell Signaling Technology，IL)、β-III微管蛋白(BAbCO，Berkeley，CA)、β-肌动蛋白(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)、α胎蛋白(Santa Cruz Biotech，CA)、OCT-3/4(Santa Cruz Biotech.，CA，Nanog from(R&D systems)的相应一级抗体在4℃振荡保温过夜，所述抗体在含有5％牛白蛋白(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)的Tris-缓冲盐水(TBS)和0.1％ Tween-20(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA USA)的溶液中稀释。在具有0.1％ Tween-20的TBS中洗涤后，将印迹与小鼠或兔IgG的二级过氧化物酶缀合的山羊抗体(Cell Signaling Technology，IL)或者山羊IgG的兔抗体(Jackson Immuno Research Laboratories，West Grove，PA)保温。免疫反应条带用ECL+Western印迹检测试剂(Amersham Biosciences，UK)检测60秒或更长时间并且曝光于X线胶片。
转染前和转染后细胞培养基
将细胞在补加了10％(体积/体积)胎牛血清(FBS)(HyClone，Logan，UtahUSAUSA)的DMEM/F12培养基中在37℃、7.0％CO2条件下培养。所有细胞均通过用Gibco Cell Porator脉冲仪电穿孔转染。细胞悬浮液中补加10μg质粒DNA，根据本领域技术人员已知的方案转染(图11C)。在电穿孔之后，将全部的悬浮液以60000个细胞/2ml/孔的密度铺板于具有0.8％MC的DMEM/F12中，所述培养基中补加了孕酮(20nM)、腐胺(100μM)、亚硒酸钠(30nM)、运铁蛋白(25μg/ml)、胰岛素(20μg/ml)(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO USA)和生长因子EGF(10ng/ml)及重组FGF2(10ng/ml)。
转染的EGFP-乳腺球克隆的选择
为了选择转染的EGFP-乳腺球克隆，在培养3天后加入G418(200mg/ml)。在具有G418的平板中，仅产生绿色EGFP-阳性克隆，收集进行进一步处理。产生的EGFP-阳性乳腺球用于建立具有稳定整合EGFP的EGFP-亚群。表达在Oct4启动子控制下的EGFP的绿色乳腺球生长为未附着的悬浮乳腺球(图7B)。在荧光显微镜下直接分离EGFP细胞(图11D)。
实施例1：
肿瘤中OCT4表达细胞的频率
为了更好地研究肿瘤中表达OCT4的细胞的频率，对源自如下肿瘤的系列切片进行免疫组织化学分析：骨肉瘤、胶质母细胞瘤和导管癌。图1所示结果表明OCT4阳性细胞核存在于骨肉瘤和胶质母细胞瘤中；另外，图6A-B所示结果表明OCT4阳性细胞核也分别存在于导管癌和乳腺癌转移至脑中。尽管在导管癌和乳腺癌转移中均观测到OCT4阳性细胞，但是与局限在导管癌的原发乳腺癌相比(图6A)，在乳腺癌转移至脑中出现更频繁的OCT4阳性细胞核(图6B)。肿瘤和转移瘤均包含OCT4阳性细胞，因此本发明所述的方法表明了这些OCT4-阳性细胞在癌症治疗中是有效靶位。
实施例2：
OCT4、Nanog和STAT3在胶质母细胞瘤临床样品和细胞系中一致表达
为了确定OCT4、Nanog和STAT3在胶质母细胞瘤临床样品及在细胞系LN18、LN229、LN428和U251中是否共表达，进行半定量RT-PCR分析及随后western印迹分析。图2A示出的结果表明OCT4、Nanog和STAT3的中等至高水平mRNA表达。所述蛋白质表达水平与如图2B示出的mRNA表达水平相关联，图2B中显现出OCT4、Nanog和STAT3的中等至高蛋白质表达水平。
实施例3：
在基质附着或未附着生长的肿瘤细胞中的OCT4表达
为了检验细胞-基质附着对于肿瘤细胞中OCT4表达的影响，使得骨肉瘤和乳腺肿瘤细胞分别作为肉球或乳腺球以基质附着或未附着形式生长。图3示出的结果表明hi OCT4和Nanog表达依赖于细胞附着，因此以肉球和乳腺球形式未附着生长的肿瘤细胞高水平表达OCT4和Nanog，与其在基质附着的肿瘤细胞中的抑制作用相反，在后者情况中Nanog和OCT4的表达相对较低。
实施例4：
OCT4在培养于神经球系统中的源自神经胶质瘤的肿瘤干细胞的克隆生成 中的作用
为了检测OCT4基因在模型培养系统中维持自我更新的功能作用，评价POU5F1/OCT4基因的siRNA沉默(图4)。为此，将源自三种代表性胶质母细胞瘤的肿瘤细胞(包括两个细胞系和分离自患者的肿瘤原代培养物)用EGFP和OCT4siRNA共转染，铺板于神经球培养系统中。在平行的对照实验中，细胞用EGFP和混杂的对照siRNA共转染。在铺板后第7天，用EGFP和siRNA转染的克隆开始显现(图4A)。当与对照相比时，由用OCT4-siRNA转染的细胞形成的具有可检测的EGFP的克隆的比例下降60％以上(图4B)。这些发现证实在处于神经球培养系统的生长抑制条件下的铺板的源自肿瘤的细胞中，siRNA对内源OCT4的下调导致源自肿瘤的含有EGFP的细胞的克隆形成显著降低。
实施例5：
用EGFP标记MDA MB231乳腺癌细胞系评价NSC参与原位肿瘤形成
通过NSC参与裸鼠中的原位肿瘤形成评价源自在Oct4启动子控制下稳定表达EGFP的乳腺癌细胞系MDA MB231的赘生干细胞的潜力。这个测定基于EGFP表达与内源OCT4基因表达相关联的假说。将用OCT4-EGFR构建体转染且经过FACS淘选的OCT4阳性和OCT4阴性MDAMB231乳腺癌细胞接种于12只裸鼠的脂肪垫中，所述裸鼠分成4组，每组3只动物：1组接种5000个OCT4阳性细胞/动物，2组接种50000个OCT4阳性细胞/动物，3组接种500000个OCT4阳性细胞/动物，4组接种500000个OCT4阴性细胞/动物。图11示出用OCT4阳性细胞接种的动物在接种后第37天开始显现肿瘤；然而用OCT4-阴性细胞接种的动物在第50天开始显现肿瘤。结果还表明分离的EGFP-阳性细胞表达OCT4、EGFP、CD44、AC133和ES细胞标记SSEA4，如表2所示。
表2：在MDA-MB231乳腺癌细胞和对照阳性干细胞中对干细胞标记的 FACS分析(结果以百分比表示)
实施例6
由Oct3/4启动子驱动的荧光生物标记对于癌症干细胞是强的且特异性的
乳腺球培养物源自MDA-MB-435黑素瘤细胞系，并针对表达Oct-3/4的癌症干细胞的存在进行生物标记。将MDA-MB-435细胞用Oct4hP-eGFP和CMV-mRFP稳定转染。然后通过FACS淘选表达GFP的细胞，产生高纯的癌症干细胞群以进行进一步分析。图13B示出的悬浮的源于肿瘤的球体的荧光显微照片证实由Oct3/4启动子驱动的荧光生物标记对于癌症干细胞是强的且特异性的。另外，(图13D)示出的附着的肿瘤球体的荧光显微照片呈现相似的现象。这些发现证实由Oct3/4启动子驱动的荧光对于被生物标记以在多种系统中作为治疗靶位进行研究的癌症干细胞是强的且特异性的。

Claims (33)

1.根据OCT4表达被富集的分离的赘生干细胞群。
2.权利要求1的细胞群，其中所述细胞群特征在于OCT4hi表达。
3.包含权利要求1的细胞群的组合物。
4.权利要求3的组合物，其进一步包含细胞培养基，大约50％的所述培养基衍生自人原代包皮成纤维细胞培养基培养物。
5.权利要求4的组合物，其中所述培养基包含最多直至大约15％的血清。
6.权利要求4的组合物，其中所述培养基被消耗了EGF、FGF2、胰岛素或者其组合。
7.鉴别赘生干细胞的方法，包括如下步骤：
(a)将赘生性细胞群与和OCT4特异性相互作用的物质接触；及
(b)鉴别与所述物质特异性相互作用的细胞；
从而鉴别赘生干细胞。
8.分离赘生干细胞的方法，包括如下步骤：
(a)将赘生性细胞群与和OCT4特异性相互作用的物质接触；及
(b)分离与所述物质特异性相互作用的细胞；
从而分离赘生干细胞。
9.权利要求7或8的方法，其中所述物质包含核酸。
10.权利要求7或8的方法，其中所述物质是OCT4抗体。
11.权利要求7或8的方法，其中所述鉴别进一步包括使用荧光显微镜或者荧光激活细胞分选仪(FACS)。
12.权利要求7或8的方法，其中所述赘生性细胞得自实体肿瘤。
13.权利要求7或8的方法，其中所述赘生性细胞是转移细胞。
14.对赘生干细胞富集赘生性细胞群的方法，包括如下步骤：
(a)将包含多种癌细胞的混合细胞群与载体接触，所述载体包含与Oct4启动子可操纵地连接的抗生素抗性基因；及
(b)在存在所述抗生素的条件下培养所述细胞；
从而对赘生干细胞富集赘生性细胞群。
15.权利要求14的方法，其中所述培养是在细胞培养基中进行，其中50％的所述培养基衍生自人包皮成纤维细胞的原代培养基。
16.权利要求14的方法，其中所述混合细胞群衍生自细胞系。
17.权利要求14的方法，其中所述混合细胞群是衍生自肿瘤的原代细胞培养物。
18.一种诱导癌症的方法，其包括如下步骤：
将根据OCT4表达被富集的赘生干细胞群导入哺乳动物中；从而诱导癌症。
19.权利要求18的方法，其中所述赘生干细胞群在体内诱发原位肿瘤。
20.权利要求18的方法，其中所述赘生干细胞群在体内诱发异位肿瘤。
21.权利要求18的方法，其中所述赘生干细胞在体内诱发转移。
22.一种体内分析癌症进展和/或发病机制的方法，包括如下步骤：
(a)将OCT4hi赘生干细胞移植进动物体内；及
(b)分析所述动物中的癌症进展和/或发病机制；
从而体内分析癌症进展和/或发病机制。
23.权利要求22的方法，进一步包括标记所述OCT4hi赘生干细胞的步骤。
24.权利要求22的方法，其中分析癌症进展包括确定细胞转移。
25.权利要求22的方法，其中分析癌症进展包括确定肿瘤进展。
26.权利要求22的方法，进一步包括给予感兴趣的物质的步骤。
27.权利要求26的方法，其中所述物质是治疗剂。
28.抑制赘生性细胞中OCT4表达的物质在制备治疗、消除或抑制癌症的药物组合物中的应用。
29.抑制赘生性细胞中OCT4功能的物质在制备治疗、消除或抑制癌症的药物组合物中的应用。
30.权利要求28或29的应用，其中所述癌症包括肿瘤生长。
31.权利要求28或29的应用，其中所述癌症包括细胞转移。
32.权利要求28或29的应用，其中所述物质包括核酸。
33.权利要求28或29的应用，其中所述物质是OCT4抗体。
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