CN101407780B - 利用定点突变改变辅酶特异性和立体选择性制备(r)-苯基乙二醇的方法 - Google Patents
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Abstract
利用定点突变改变辅酶特异性和立体选择性制备(R)-苯基乙二醇的方法，属于生物催化不对称转化技术领域。本发明提供了一株重组大肠杆菌BL21/pETSCR6768，保藏编号CCTCC NO：M208079；及其不对称转化制备(R)-苯基乙二醇的方法。本发明将(S)-专一性羰基还原酶的第67位的Ser和68位的His均突变为Asp，构建重组质粒pETSCR6768，转化入大肠杆菌获得重组菌株E.coliBL21/pETSCR6768。该重组菌株使(S)-专一性羰基还原酶的辅酶特异性由NADPH改变为NADH；另一方面改变了产物的空间选择性，由(S)-苯基乙二醇改变为(R)-苯基乙二醇；为高效、低成本制备(R)-苯基乙二醇提供了有效途径，从分子和蛋白水平上认识功能性酶蛋白的立体选择性具有重要的意义。
Description
技术领域
利用定点突变改变辅酶特异性和立体选择性制备(R)-苯基乙二醇的方法，本发明涉及利用蛋白质工程技术改造酶蛋白结构中关键位点的氨基酸，通过基因工程手段构建重组菌株，高效制备(R)-苯基乙二醇的方法及其应用，属于生物催化不对称转化技术领域。
背景技术
手性化合物在药物、农业、工业和生活中的重要作用越来越受到人们的重视，由于两种对映体在药理、毒理及功能作用等各方面均有所不同，因此，制备光学纯的手性模块化合物具有重要的意义。
苯基乙二醇的化学结构为：
光学纯(R)-苯基乙二醇不仅是液晶材料中不可缺少的重要手性添加剂，而且已成为制备具有光学活性的医药、农药和功能材料的重要中间体，开展苯基乙二醇拆分方法的研究极有意义。在拆分外消旋化合物常见方法(化学拆分法，色谱拆分法，液体膜拆分法或手性固体膜拆分的膜拆分法和生物法)中，生物法反应条件温和，产物单一，立体选择性、区域选择性和化学选择性较高，并能完成一些化学合成难以进行的反应等。
生物法转化制备光学纯的(R)-苯基乙二醇，通常采用微生物全细胞或酶作为催化剂，主要包括Bakers’酵母不对称还原2-羟基苯乙酮法，利用环氧化物水解酶催化水解外消旋苯乙烯氧化物法，或者利用萘双氧化酶(NDO)选择性氧化苯乙烯法等，上述方法都有产品光学纯度较低，底物浓度不够高，或反应过程需要消耗昂贵的NADPH作为辅酶来优化反应条件等缺点。本实验室已经利用重组菌株催化不对称转化制备(S)-苯基乙二醇，在此基础上，采用蛋白质工程技术改造蛋白结构中关键位点的氨基酸来改变辅酶特异性和产物空间选择性。被改造之前原来的羰基还原酶SCR，辅酶的依赖性为NADPH，催化还原2-羟基苯乙酮的反应产物为(S)-苯基乙二醇。经过对SCR中的两个氨基酸进行定点改造后，其辅酶的依赖性由原来的NADPH改变为NADH，而且以2-羟基苯乙酮为底物时，产物由原来的(S)-苯基乙二醇改变为(R)-苯基乙二醇。
发明内容
(1)要解决的技术问题
本发明的目的是提供一种蛋白质工程技术改造酶的催化功能，利用重组菌株(菌种保藏号：CCTCC M 208079)不对称转化制备(R)-苯基乙二醇的方法。本发明目的在于根据已经解析出来的蛋白结构，利用定点突变技术，基因工程法构建重组菌，改变该酶的辅酶特异性和产物空间选择性。该重组菌不对称还原2-羟基苯乙酮制备光学活性(R)-苯基乙二醇，产物光学纯度为100％。对羰基还原酶SCR进行定点突变后，开发了该酶的新催化功能，获得立体选择性完全不同的产物，进而探索立体选择性氧化还原酶选择底物特异性的分子催化机理。
(2)技术方案
1、一株不对称转化制备(R)-苯基乙二醇的重组菌，其分类命名为大肠杆菌BL21/pETSCR6768(Escherichia coli BL21/pETSCR6768)，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO：M208079。
2、利用定点突变后构建的重组菌CCTCC NO：M208079不对称转化制备(R)-苯基乙二醇的方法，以2-羟基苯乙酮为底物，进行不对称转化反应：在1mL0.1mol/L pH4.5～6.5的醋酸缓冲液，或1mL0.1mol/L pH6.0～7.0的磷酸缓冲液，或1mL0.1mol/L pH8.0～9.0的Tris-HCl缓冲液中，重组菌细胞或重组纯蛋白，2-羟基苯乙酮底物浓度为5g/L，反应温度30℃；
采用重组菌全细胞生物转化：重组菌细胞浓度为0.1～0.2g/mL，反应时间为48h，反应前不需要加入辅酶，产物为(R)-苯基乙二醇；
或采用重组菌的蛋白细胞破碎后经纯化后的重组蛋白生物转化：重组蛋白浓度为1～2μg/mL，反应时间为8h，反应前加5mmol/L辅酶NADH，产物为(R)-苯基乙二醇。
3、所述重组菌的培养
LB培养基以g/L计：胰蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl10，pH7.0；固体培养基添加琼脂粉1.5％；
培养条件：挑取重组菌株CCTCC NO：M208079的单菌落接种于3mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37℃，200rpm振荡培养过夜，取1mL培养液转接于50mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37℃，200rpm振荡培养至OD600为0.6后，培养物中加入诱导物异丙基-B-D-硫代半乳糖苷1mmol/L，诱导培养温度30℃，诱导培养过夜，10,000rpm离心10min，用生理盐水洗涤两次，收集得到重组菌全细胞。
4、所述重组蛋白的纯化
菌体破碎：将收集的重组菌全细胞用MCAC-0缓冲液重悬，超声破碎：工作时间4s，间歇时间6s，共20min；破碎液16,000rpm离心40min；弃沉淀，取上清进行后续的蛋白纯化工作；
蛋白纯化：先将上清挂Pharmacia公司的Ni柱两遍，用MCAC-50缓冲液洗脱杂蛋白，用MCAC-200缓冲液洗脱目的蛋白；再用Pharmacia公司的Hitrap柱蛋白脱盐，利用Pharmacia公司的
蛋白纯化系统将蛋白溶液换为无盐的缓冲液；接着用Pharmacia公司的Resource Q阴离子交换柱，1×1cm，进行蛋白纯化；最后用Pharmacia公司的Superdex200，HiLoad26/60，进行蛋白纯化；经SDS-PAGE检测目的蛋白纯度达到90％以上。
5、所述重组突变菌株CCTCC NO：M208079的构建方法，将突变基因片断scr6768插入载体pET21c构建重组质粒pETSCR6768，重组质粒转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞，通过含有100μg/mL氨苄青霉素的LB平板筛选，获得目的重组菌株E.coli BL21/pETSCR6768。
6、所述的重组质粒pETSCR6768的构建：利用限制性内切酶BamHI和XhoI对目的基因片断scr6768和载体pET21c分别进行双酶切处理，处理后DNA片断通过粘性末端连接，获得带有目的基因片断的重组质粒pETSCR6768。
7、所述的突变基因片断scr6768的获得：以含有(S)-专一性羰基还原酶的重组质粒pETCPADH作为PCR扩增反应模板，利用含有BamHI限制性酶切位点的引物1，含有XhoI限制性酶切位点的引物2，中间两段引物3和引物4，
引物1：5’-ATC GGATCC GATGGGCGAAATCGAATCTTATTG-3’，
引物2：5’-TGACTCTCGAGTGGACACGTGTATCCACCGTC-3’，
引物3：5’-CCATTTGGTACAACGATGATCCAGC-3’，
引物4：5’-CTCATCAGCTGGATCATCGTTGTAC-3’，
通过SOE-PCR反应扩增，获得scr6768基因，其全长为837bp；
上游cDNA片段及下游cDNA片段的获得：以重组质粒pETCPADH为模板，分别以引物1和4，引物2和3进行PCR反应，PCR反应体系：ddH2O37μL，10×Reaction Buffer5μL，25mmol/L dNTP0.5μL，50pmol/μL的引物1和4或引物2和3各引物1μL，重组质粒pETCPADH1μL，5U/μLTaq DNA polymerase0.5μL；PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃1min，57℃1min，72℃1min，进行30个循环；72℃延伸10min；获得上游cDNA片段及下游cDNA片段；利用3S Spin Agarose Gel DNA Purification Kit(上海申能博彩生物科技有限公司)纯化DNA片断。
将上、下游cDNA片段经退火重叠连接，两端单链于72℃用Taq DNAPolymerase延伸10min补成双链，作下一次的PCR模板，PCR反应条件：94℃3min；94℃1min，55℃1min，72℃1min，30个循环；72℃10min，即获得scr6768基因，该基因编码将(S)-专一性羰基还原酶蛋白序列中的第67位的Ser和第68位His均突变为Asp，scr6768基因全长为837bp。利用3S Spin AgaroseGel DNA Purification Kit(上海申能博彩生物科技有限公司)纯化DNA片断。
DNA溶液中加入1/10体积的乙酸钠溶液(3mol/L，pH5.2)和2倍体积无水乙醇，-20℃沉淀1h。12,000rpm于4℃离心30min。加入75％乙醇500μL洗涤，12,000rpm于4℃离心30min，无菌操作台吹干后溶于适量TE缓冲液中，立即使用或-20℃保存。
操作如下
一、含有(S)-专一性羰基还原酶的重组质粒pETCPADH的获得
本试验室前期已经成功构建了重组菌E.coli/pETCPADH，(APPLIED ANDENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY，June2007，p.3759—3764)利用质粒提取试剂盒Mini-Plasmid Rapid Isolation Kit(北京博大泰克生物基因技术有限公司)提取质粒pETCPADH。
二、突变基因scr6768全长的获得
合成两端引物1：5′-ATCGGATCCGATGGGCGAAATCGAATCTTATTG-3′(BamH I)，引物2：5′-TGACTCTCGAGTGGACACGTGTATCCACCGTC-3′(XhoI)。引物1含有BamH I，引物2含有Xho I限制性酶切位点。
合成中间引物3：F5’-CTCATCAGCTGG ATCATCGTTGTAC-3’，
引物4：R5’-CCATTTGGTACAACGATGAT CCAGC-3’。采用SOE-PCR的方法，将突变位点引入：
上游cDNA片段及下游cDNA片段的获得：
以重组质粒pETCPADH为模板，分别以引物1和4，引物2和3进行PCR反应，PCR反应体系：ddH2O37μL，10×Reaction Buffer5μL，dNTP(25mmol/L)0.5μL，引物1和4、或引物2和3(50pmol/μL)各引物1μL，重组质粒pETCPADH1μL，Taq DNA polymerase(5U/μL)0.5μL。PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃1min，57℃1min，72℃1min，进行30个循环；72℃延伸10min。分别获得上游cDNA片段及下游cDNA片段。利用3S Spin Agarose Gel DNAPurification Kit(上海申能博彩生物科技有限公司)纯化DNA片断。
scr6768全长基因的获得：
模板的获得：将上、下游cDNA片段经退火重叠连接，两端单链于72℃用Taq DNA Polymerase延伸10min补成双链，作下一次的PCR模板。
PCR反应条件：94℃3min；94℃1min、55℃1min、72℃1min，30个循环；72℃10min进行反应，即获得scr6768全长基因，基因全长为837bp。利用3S Spin Agarose Gel DNA Purification Kit(上海申能博彩生物科技有限公司)纯化DNA片断。
DNA溶液中加入1/10体积的乙酸钠溶液(3mol/L，pH5.2)和2倍体积无水乙醇，-20℃沉淀1h。12,000rpm于4℃离心30min。加入75％乙醇500μL洗涤，12,000rpm于4℃离心30min，无菌操作台吹干后溶于适量TE缓冲液中，立即使用或-20℃保存。
三、含突变基因scr6768重组大肠杆菌的构建
目的基因及质粒pET21c的酶切
利用质粒提取试剂盒Mini-Plasmid Rapid Isolation Kit(北京博大泰克生物基因技术有限公司)提取质粒pET21c。
分别按照水、缓冲液、基因scr6768和酶的顺序，及水、缓冲液、质粒pET21c和酶的顺序加到Eppendorf管中，盖好管盖，振荡使液体充分混匀，置于离心机内离心2s使液体集中于管底，37℃水浴3h，在管中加入1/10的Loading Buffer或将管置于65℃保温10min，终止酶切反应。酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析并切胶回收目的片段，浓缩。
反应体系组成：10×H Buffer4μL，DNA10μL，BamH I2μL，XhoI2μL，ddH2O将体系补足40μL。
目的基因与质粒pET21c的连接
将目的基因与质粒pET21c连接，反应体系组成如下：质粒pET21c0.8μL，目的基因4.2μL，Ligation Solution5μL。混合连接液，将其置于16℃培养箱中连接12-16h。
重组质粒转化大肠杆菌
在每管的100μLE.coli BL21(DE3)感受态细胞悬液中加入10μL连接产物，轻轻混匀，冰浴中静置30min。转入42℃水浴中，热击90s。快速转移至冰浴中，冷却2min。每管中加入700μLLB液体培养基，37℃100rpm摇床温育培养1h。培养后菌液3,000rpm离心2min，弃上清600μL，剩余菌液混匀后涂布到含有100μg/mL氨苄青霉素的LB平板上，37℃倒置培养过夜。
诱导表达培养
LB培养基：胰蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，NaCl1％，pH7.0。需要时使用前加入氨苄青霉素(100μg/mL)，固体培养基添加1.5％琼脂粉。
挑取阳性克隆单菌落接种于10mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37℃，200rpm振荡培养过夜。取10mL培养液转接于1L含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37℃，200rpm振荡培养至OD600约为0.6。向培养物中加入诱导物异丙基-B-D-硫代半乳糖苷至终浓度1mmol/L，在培养温度30℃下进行诱导培养10h。
四、重组蛋白的纯化
MCAC-0的缓冲液：20mmol/L Tris/HCl，500mmol/L NaCl，10％(V/V)甘油，pH8.0。
MCAC-1000的缓冲液：在MCAC-0的缓冲液的基础上增加1mol/L的咪唑，pH8.0。
MCAC-50的缓冲液：在MCAC-0的缓冲液的基础上增加50mmol/L的咪唑，pH8.0。
收集菌体，5000rpm30min，用MCAC-0缓冲液重悬，超声破碎共20min，工作时间4s，间歇时间6s。于16,000rpm离心40min。弃沉淀，取上清进行蛋白纯化工作。
蛋白纯化：分为四个步骤：
第一步将上清挂Ni柱(His-Trap Kit，Pharmacia)两次，用MCAC-50的缓冲液洗脱杂蛋白，用MCAC-200的缓冲液洗脱含有目的蛋白的溶液。
第二步用Hitrap(Pharmacia)柱蛋白脱盐，缓冲液A：20mmol/L Tris/HCl，500mmol/L NaCl，pH8.0。缓冲液B：20mmol/L Tris/HCl，pH8.0。利用
蛋白纯化系统(Pharmacia，Uppsala，Sweden)，将蛋白溶液由A缓冲液换为B缓冲液。
第三步用Resource Q阴离子交换柱(1×1cm，Pharmacia)进行蛋白纯化。缓冲液A：20mmol/L Tris/HCl，pH8.0。缓冲液B：20mmol/L Tris/HCl，1mol/LNaCl，pH8.0。利用
蛋白纯化系统(Pharmacia，Uppsala，Sweden)，收集含有目的蛋白的溶液。
第四步用Superdex200(HiLoad26/60，Pharmacia)进行蛋白纯化。缓冲液：20mmol/L Tris/HCl，150mmol/L NaCl，pH8.0。利用蛋白纯化系统(Pharmacia，Uppsala，Sweden)，最终收集目的蛋白。
经过以上四个步骤的纯化工作，蛋白液经SDS-PAGE检测为单一条带，纯度可达90％以上。
五、重组菌株催化不对称转化制备(R)-苯基乙二醇
利用重组大肠杆菌催化不对称还原反应。
LB培养基：胰蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，NaCl1％，pH7.0。需要时使用前加入氨苄青霉素(100μg/mL)，固体培养基添加1.5％琼脂粉。
挑取阳性克隆单菌落接种于3mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37℃，200rpm振荡培养过夜。取1mL培养液转接于50mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，于30℃，200rpm振荡培养10h。
培养后的重组菌10,000rpm离心10min，用生理盐水洗涤三次后收集。在以下体系中进行检测：1mL0.1mol/L醋酸缓冲液(pH4.5～6.5)，1mL0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.0～8.0)或Tris-HCl缓冲液(pH8.0～9.0)中，加入5g/L底物2-羟基苯乙酮，0.1～0.2g/mL重组大肠杆菌湿菌体，混匀后在30℃恒温摇床上振荡反应48h。
反应结束后，将反应混合物离心除去菌体，上清液加入2倍体积乙酸乙酯萃取，有机相用于分析。产物通过手性固定相高效液相色谱(Agillent HP1100)进行分析，条件为Chiralcel OB-H柱(4.6mm×25cm；Daicel Chemical Ind.，Ltd.，Japan)，流动相为正己烷/异丙醇(9/1，V/V)，流速0.5mL/min，检测波长为215nm。产物的光学纯度通过对映过量值来衡量。
产物(R)-苯基乙二醇对映过量值的计算：对映过量值(e.e.％)＝[(CR-CS)/(CR+CS)]×100％
产物(R)-苯基乙二醇产率的计算：产率(％)＝CR/CO×100％
式中CR为反应后(R)-对映体的浓度，CS为反应后(S)-对映体的浓度，CO为反应前底物2-羟基苯乙酮的浓度。
以全细胞为催化剂，不对称生物转化反应后，产物均为(R)-苯基乙二醇。六、用重组纯蛋白催化不对称转化制备(R)-苯基乙二醇
反应体系：1mL0.1mol/L醋酸缓冲液(pH4.5～6.5)，1mL0.1mol/L磷酸缓冲液(pH6.0～8.0)或1mL0.1mol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.0～9.0)中，分别加入5g/L底物2-羟基苯乙酮和5mmol/L NADH或者NADPH，适量的纯蛋白，混匀后在30℃恒温摇床上振荡反应8h。
反应结束后，将反应混合物离心，上清液加入2倍体积乙酸乙酯萃取，有机相用于分析。产物通过手性固定相高效液相色谱(Agillent HP1100)进行分析，条件为Chiralcel OB-H柱(4.6mm×25cm；Daicel Chemical Ind.，Ltd.，Japan)，流动相为正己烷/异丙醇(9/1，V/V)，流速0.5mL/min，检测波长为215nm。产物的光学纯度通过对映过量值来衡量。
产物(R)-苯基乙二醇对映过量值的计算：对映过量值(e.e.％)＝[(CR-CS)/(CR+CS)]×100％
产物(R)-苯基乙二醇产率的计算：产率(％)＝CR/CO×100％
式中CR为反应后(R)-对映体的浓度，CS为反应后(S)-对映体的浓度，CO为反应前底物2-羟基苯乙酮的浓度。
用NADH或者NADPH作辅酶进行转化后均得到产物(R)-苯基乙二醇。
(3)有益效果
成功改造(S)-专一性羰基还原酶(编码基因scr的GenBank登记号DQ675534)的第67位丝氨酸和68位的组氨酸为天冬氨酸，其编码基因全长837bp，编码279个氨基酸。
将改造后的基因scr6768插入表达载体pET21c中，转化入相应表达宿主E.coli BL21(DE3)中，成功构建带有目的基因的重组菌株E.coli BL21(DE3)/pETSCR6768。
通过优化反应条件，在pH6.0的醋酸缓冲液中，利用0.2g/mL重组细胞对5g/L底物2-羟基苯乙酮催化转化48h，最终产物(R)-苯基乙二醇的光学纯度为100％e.e.，产率为92.6％。
通过优化反应条件，在pH6.0的醋酸缓冲液中，利用约2μg的重组纯蛋白对5g/L底物2-羟基苯乙酮催化转化8h，最终产物(R)-苯基乙二醇的光学纯度为100％e.e，产率为96.4％。这些工作不仅为(R)-苯基乙二醇的获得提供了有效途径，而且有助于从蛋白质结构水平上认识功能性酶蛋白的立体选择性，对于今后手性转化用生物催化剂的开发具有较为重要的意义。
生物材料样品保藏
重组菌Escherichia coli BL21/pETSCR6768，保藏日期：2008年5月29日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号：CCTCC NO：M208079。
具体实施方式
实施例1
重组菌E.coli/pETCPADH的培养：重组菌E.coli/pETCPADH已在[Appliedand Environmental Microbiology200773(11)：3759-3764]上公开。采用LB培养基，其组成成分为：胰蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，NaCl1％，pH7.0。培养时加入氨苄青霉素(100μg/mL)。固体培养基添加1.5％琼脂粉。挑取阳性克隆单菌落接种于3mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37℃，200rpm振荡培养过夜。次日取1mL培养液转接于50mL含有100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37℃，200rpm振荡培养约12h，至OD600为0.6。
实施例2
重组菌E.coli/pETCPADH中pETCPADH质粒的获得：将菌体培养液5,000rpm离心10min，收集菌体，利用质粒提取试剂盒Mini-Plasmid Rapid Isolation Kit(北京博大泰克生物基因技术有限公司)提取质粒pETCPADH。
实施例3
以含有(S)-专一性羰基还原酶的重组质粒pETCPADH作为PCR扩增反应模板，利用含有BamHI限制性酶切位点的引物1，含有XhoI限制性酶切位点的引物2，中间两段引物3和引物4，
引物1：5’-ATC GGATCC GATGGGCGAAATCGAATCTTATTG-3’，
引物2：5’-TGACTCTCGAGTGGACACGTGTATCCACCGTC-3’，
引物3：5’-CCATTTGGTACAACGATGATCCAGC-3’，
引物4：5’-CTCATCAGCTGGATCATCGTTGTAC-3’，
通过SOE-PCR反应扩增，获得scr6768基因，其全长为837bp；
上游cDNA片段及下游cDNA片段的获得：以重组质粒pETCPADH为模板，分别以引物1和4，及引物2和3进行PCR反应，PCR反应体系：ddH2O37μL，10×Reaction Buffer5μL，25mmol/L dNTP0.5μL，50pmol/μL的引物1和4、或引物2和3各引物1μL，重组质粒pETCPADH1μL，5U/μLTaq DNApolymerase0.5μL；PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃1min，57℃1min，72℃1min，进行30个循环；72℃延伸10min；获得上游cDNA片段及下游cDNA片段；
将上、下游cDNA片段经退火重叠连接，两端单链于72℃用Taq DNAPolymerase延伸10min补成双链，作下一次的PCR模板，PCR反应条件：94℃3min；94℃1min、55℃1min、72℃1min，30个循环；72℃10min，即获得scr6768基因，该基因编码将(S)-专一性羰基还原酶蛋白序列中的第67位的Ser和第68位His均突变为Asp。
实施例4
利用限制性内切酶BamHI和XhoI对目的基因片断scr6768和载体pET21c分别进行双酶切处理，处理后DNA片断通过粘性末端连接，获得带有目的基因片断的重组质粒pETSCR6768。重组质粒pETSCR6768转化大肠杆菌E.coliBL21(DE3)感受态细胞，通过含有100μg/mL氨苄青霉素的LB平板筛选，获得目的重组菌株E.coli BL21/pETSCR6768。该重组大肠杆菌送中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号：CCTCC NO：M208079。
实施例5
诱导表达：LB培养基组成同实施例1。挑取阳性克隆单菌落接种于3mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37℃，200rpm振荡培养过夜。保藏甘油菌两支(每支含有1mL菌液，10％的甘油)，同时取1mL培养液转接于50mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37℃，200rpm振荡培养至OD600约为0.6。向培养物中加入诱导物异丙基-B-D-硫代半乳糖苷1mmol/L，在培养温度30℃下进行诱导培养突变菌E.coli BL21/pETSCR6768。收集菌体，溶解于MCAC-0缓冲液中，超声破碎20min，工作时间4s，间歇时间6s。将破碎后的菌体破碎液16,000rpm离心40min。分别取上清和沉淀，SDS-PAGE检测蛋白表达。
实施例6
诱导表达培养：LB培养基组成同实施例1。用实施例1中所保藏的甘油菌以1％接种量种于10mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37℃，200rpm振荡培养过夜。取10mL培养液转接于1000mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37℃，200rpm振荡培养至OD600约为0.6。向培养物中加入诱导物异丙基-B-D-硫代半乳糖苷1mmol/L，在培养温度30℃下进行诱导培养。将培养后的重组菌10,000rpm离心10min，一部分菌体用生理盐水洗涤两至三次后收集进行生物转化试验，另一部分菌体溶解于MCAC-0溶液中，进行蛋白纯化试验。
实施例7
用实施例6中所获得的菌体进行生物转化试验。在1mL0.1mol/L醋酸缓冲液(pH6.0)中，分别加入5g/L底物2-羟基苯乙酮，0.1g/mL重组大肠杆菌CCTCCNO：M208079湿菌体，混匀后在30℃恒温摇床上振荡反应48h。反应后混合物离心，取上清液萃取，产物(R)-苯基乙二醇的光学纯度为98.5％e.e.，产率为89.1％。
实施例8
用实施例6中所获得的菌体进行生物转化试验。在1mL0.1mol/L醋酸缓冲液(pH6.0)中，分别加入5g/L底物2-羟基苯乙酮，0.2g/mL重组大肠杆菌CCTCCNO：M208079湿菌体，混匀后在30℃恒温摇床上振荡反应48h。反应后混合物离心，取上清液萃取，产物(R)-苯基乙二醇的光学纯度为100％e.e.，产率为92.6％。
实施例9
用实施例6中所获得的菌体进行生物转化试验。在1mL0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.0)中，分别加入5g/L底物2-羟基苯乙酮，0.1g/mL重组大肠杆菌CCTCCNO：M208079湿菌体，混匀后在30℃恒温摇床上振荡反应48h。反应后混合物离心，取上清液萃取，产物(R)-苯基乙二醇的光学纯度为84.5％e.e.，产率为75.2％。
实施例10
用实施例6中所获得的菌体进行生物转化试验。在1mL0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.0)中，分别加入5g/L底物2-羟基苯乙酮，0.2g/mL重组大肠杆菌CCTCCNO：M208079湿菌体，混匀后在30℃恒温摇床上振荡反应48h。反应后混合物离心，取上清液萃取，产物(R)-苯基乙二醇的光学纯度86.8％e.e.，产率77.4％。
实施例11
用实施例6中所获得的菌体进行生物转化试验。在1mL0.1mol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.0)中，分别加入5g/L底物2-羟基苯乙酮，0.1g/mL重组大肠杆菌CCTCC NO：M208079湿菌体，混匀后在30℃恒温摇床上振荡反应48h。反应后混合物离心，取上清液萃取，产物(R)-苯基乙二醇的光学纯度为67.7％e.e.，产率为51.8％。
实施例12
用实施例6中所获得的菌体进行生物转化试验。在1mL0.1mol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.0)中，分别加入5g/L底物2-羟基苯乙酮，0.2g/mL重组大肠杆菌CCTCC NO：M208079湿菌体，混匀后在30℃恒温摇床上振荡反应48h。反应后混合物离心，取上清液萃取，产物(R)-苯基乙二醇的光学纯度为70.1％e.e.，产率为56.4％。
实施例13
用实施例6中所获得的菌体重悬于MCAC-0缓冲液中，超声破碎共20min，工作时间4s，间歇时间6s。于16,000rpm离心40min，取上清用蛋白纯化系统进行蛋白纯化工作。该工作将菌体上清穿过Ni柱两次，用MCAC-50缓冲液洗脱杂蛋白，用MCAC-200缓冲液洗脱含有目的蛋白的溶液并浓缩；用Hitrap(Pharmacia)柱蛋白脱盐，缓冲液A：20mmol/L Tris/HCl，500mmol/L NaCl，pH8.0。缓冲液B：20mmol/L Tris/HCl，pH8.0。将蛋白溶液由A缓冲液换为B缓冲液。用Resource Q柱进行蛋白纯化工作，洗脱并收集目的蛋白溶液；用Superdex200进行最后的纯化工作，目的蛋白在14mL左右的位置出峰，为重组纯蛋白溶液，测重组纯蛋白含量。经过上述纯化步骤后，目的蛋白均一性非常好，SDS-PAGE显示为一条蛋白条带。
实施例14
用实施例13中所获得的纯蛋白进行生物转化实验。在1mL0.1mol/L醋酸缓冲液(pH6.0)中，分别加入5g/L底物2-羟基苯乙酮，2μg重组纯蛋白，混匀后在30℃恒温摇床上振荡反应8h。反应后混合物离心，取上清液萃取，产物为(R)-苯基乙二醇的光学纯度为100％e.e.，产率为96.4％。
实施例15
用实施例13中所获得的纯蛋白进行生物转化实验。在1mL0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.0)中，分别加入5g/L底物2-羟基苯乙酮，2μg干基计重组纯蛋白，加5mmol/L辅酶NADH，混匀后在30℃恒温摇床上振荡反应8h。反应后混合物离心，取上清液萃取，产物(R)-苯基乙二醇的光学纯度为90.6％e.e.，产率为82.0％。
实施例16
用实施例13中所获得的纯蛋白进行生物转化实验。在1mL0.1mol/LTris-HCl缓冲液(pH8.0)中，加入5g/L底物2-羟基苯乙酮，2μg干基计重组纯蛋白，加5mmol/L辅酶NADH，混匀后在30℃恒温摇床上振荡反应8h。反应后混合物离心，取上清液萃取，产物(R)-苯基乙二醇的光学纯度为88.5％e.e.，产率为71.3％。
Claims (7)
1.一株不对称转化制备(R)-苯基乙二醇的重组菌，其分类命名为大肠杆菌BL21/pETSCR6768(Escherichia coli BL21/pETSCR6768)，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO：M208079。
2.利用定点突变后构建的重组菌CCTCC NO：M208079不对称转化制备(R)-苯基乙二醇的方法，其特征是以2-羟基苯乙酮为底物，进行不对称转化反应：在1mL 0.1mol/L pH 4.5～6.5的醋酸缓冲液，或1mL 0.1mol/L pH 6.0～7.0的磷酸缓冲液，或1mL 0.1mol/L pH 8.0～9.0的Tris-HCl缓冲液中，2-羟基苯乙酮底物浓度为5g/L，反应温度30℃；
采用重组菌全细胞生物转化：重组菌细胞浓度为0.1～0.2g/mL，反应时间为48h，反应前不需要加入辅酶，产物为(R)-苯基乙二醇；
或采用重组菌的蛋白细胞破碎后经纯化后的重组蛋白生物转化：重组蛋白浓度为1～2μg/mL，反应时间为8h，反应前加5mmol/L辅酶NADH，产物为(R)-苯基乙二醇。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征是重组菌的培养方法为：
LB培养基以g/L计：胰蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10，pH 7.0；固体培养基添加琼脂粉1.5％；
培养条件：挑取重组菌株CCTCC NO：M208079的单菌落接种于3mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37℃，200rpm振荡培养过夜，取1mL培养液转接于50mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37℃，200rpm振荡培养至OD600为0.6后，培养物中加入诱导物异丙基-B-D-硫代半乳糖苷1mmol/L，诱导培养温度30℃，诱导培养过夜，10,000rpm离心10min，用生理盐水洗涤两次，收集得到重组菌全细胞。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征是重组蛋白的纯化方法为：
菌体收集：将收集的重组菌全细胞用MCAC-0缓冲液重悬，超声破碎：工作时间4s，间歇时间6s，共20min；破碎液16,000rpm离心40min；弃沉淀，取上清进行后续的蛋白纯化工作；
蛋白纯化：先将上清挂Pharmacia公司的Ni柱两遍，用MCAC-50缓冲液洗脱杂蛋白，用MCAC-200缓冲液洗脱目的蛋白；再用Pharmacia公司的Hitrap柱蛋白脱盐，利用Pharmacia公司的
蛋白纯化系统将蛋白溶液换为无盐的缓冲液；接着用Pharmacia公司的Resource Q阴离子交换柱，1×1cm，进行蛋白纯化；最后用Pharmacia公司的Superdex 200，HiLoad 26/60，进行蛋白纯化；经SDS-PAGE检测目的蛋白纯度达到90％以上。
5.权利要求1所述重组菌的构建方法，其特征是将突变基因片断scr6768插入载体pET21c构建重组质粒pETSCR6768，重组质粒转化大肠杆菌E.coliBL21(DE3)感受态细胞，通过含有100μg/mL氨苄青霉素的LB平板筛选，获得目的重组菌株E.coli BL21/pETSCR6768。
6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征是重组质粒pETSCR6768的构建：利用限制性内切酶BamHI和XhoI对目的基因片断scr6768和载体pET21c分别进行双酶切处理，处理后DNA片断通过粘性末端连接，获得带有目的基因片断的重组质粒pETSCR6768。
7.根据权利要求5所述的构建方法，其特征是突变基因片断scr6768的获得：以含有(S)-专一性羰基还原酶的重组质粒pETCPADH作为PCR扩增反应模板，利用含有BamHI限制性酶切位点的引物1，含有XhoI限制性酶切位点的引物2，中间两段引物3和引物4，
引物1：5’-ATC GGATCC GATGGGCGAAATCGAATCTTATTG-3’，
引物2：5’-TGACTCTCGAGTGGACACGTGTATCCACCGTC-3’，
引物3：5’-CCATTTGGTACAACGATGATCCAGC-3’，
引物4：5’-CTCATCAGCTGGATCATCGTTGTAC-3’，
通过SOE-PCR反应扩增，获得scr6768基因，其全长为837bp；
上游cDNA片段及下游cDNA片段的获得：以重组质粒pETCPADH为模板，分别以引物1和4，引物2和3进行PCR反应，PCR反应体系：ddH2O 37μL，10×Reaction Buffer 5μL，25mmol/L dNTP 0.5μL，50pmol/μL的引物1和4，或引物2和3各引物1μL，重组质粒pETCPADH 1μL，5U/μL Taq DNA polymerase0.5μL；
PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃ 1min，57℃ 1min，72℃ 1min，进行30个循环；72℃延伸10min；获得上游cDNA片段及下游cDNA片段；
将上、下游cDNA片段经退火重叠连接，两端单链于72℃用Taq DNAPolymerase延伸10min补成双链，作下一次的PCR模板，PCR反应条件：94℃3min；94℃ 1min，55℃ 1min，72℃ 1min，30个循环；72℃ 10min，即获得scr6768基因，该基因编码将(S)-专一性羰基还原酶蛋白序列中的第67位的Ser和第68位His均突变为Asp。
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