CN101274956B - 从人血浆组分FIV沉淀中分离纯化α1-抗胰蛋白酶的方法 - Google Patents
从人血浆组分FIV沉淀中分离纯化α1-抗胰蛋白酶的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种人血浆组分FIV沉淀中分离纯化α1-抗胰蛋白酶的方法，其特征在于包括以下步骤：(A)血浆沉淀预处理；(B)阴离子凝胶层析；(C)凝胶过滤层析；(D)超滤脱盐浓缩；(E)巴氏病毒灭活；(F)冻干分装；(G)干热消毒。本发明是以人血白蛋白生产过程中产生的弃料FIV组分沉淀为原料，采用层析技术分离纯化一种蛋白酶抑制剂即α1-抗胰蛋白酶(α1-antitrypsin，α1-AT)，建立α1-AT浓缩制剂的生产工艺。本方法制备的产品纯度好、收率高，操作简单易行，同时占用设备少、劳动强度小、能耗低，以白蛋白生产的废弃物料作原料，生产成本低。
Description
技术领域
本发明涉及一种α1-抗胰蛋白酶的制备方法，尤其是从人血浆组分沉淀中分离纯化α1-抗胰蛋白酶的方法。
背景技术
α1-AT主要是由肝细胞合成的一种糖蛋白，分子量54KD，体内半衰期6d。α1-AT是人血浆中最丰富的一种丝氨酸蛋白酶抑制剂，能抑制多种丝氨酸内切肽酶，如抑制弹性蛋白酶、胰蛋白酶、纤溶酶、胶原酶、凝血酶和Hageman因子等的活性。α1-AT是血液中最主要的抗胰蛋白酶，占血清胰蛋白酶抑制活性的90％以上。α1-AT具有较强的血管通透性，在肺组织中浓度高，而且对弹性蛋白酶活性更专一，它的主要生理功能是抑制肺部弹性蛋白酶的活性，保护肺部不受弹性蛋白酶的酶解损伤。
人体血浆中α1-AT缺乏直接相关的疾病主要是肺和肝脏疾病。如阻塞性肺气肿、新生儿或成人呼吸窘迫综合征、肺部囊性纤维化、儿童肝硬化和新生儿肝炎等，病情严重导致患儿夭折。
对于α1-AT缺乏症的治疗主要是进行替代治疗和基因治疗。但由于基因疗法目前尚处于实验阶段，具有一定的局限性，因此α1-AT替代或补充治疗此类疾病是主要方法。我国目前尚无该产品的生产，市场需求主要依靠进口产品来满足。
国内外都开展了α1-AT的生产研究。Gadek等应用两步沉淀过程制备临床应用的α1-AT浓缩制剂，α1-AT仅占浓缩制剂蛋白总量的5％。Glaser等建立了独特的α1-AT制备工艺，采用二硫苏糖醇处理结合硫酸铵沉淀，DEAE-纤维素层析，从Cohn’s低温乙醇工艺的废弃组分FIV-1中提纯出纯度70％的α1-AT浓缩制剂。朱威等[9]从Cohn组分FIV中提纯α1-AT。将Cohn组分FIV抽提液经沉淀，超滤，离子交换及凝胶过滤后，提纯α1-AT，用巴氏法灭活病毒，并考察其效果。用免疫单扩散、双向交叉免疫电泳、SDS-PAGE及合成基质法检测α1-AT蛋白活性，用区带扫描法测其纯度达90％以上。
上述工艺主要采用沉淀法或沉淀结合层析法纯化α1-AT，产品纯度在70％-90％左右，纯度较低；本发明采用两步层析法纯化，设备仪器少，操作简单易行，产品纯度高，α1-AT电泳纯度达到98％。
发明内容
本发明的目的是为了弥补现有技术的不足，提供一种新的从人血浆组分FIV沉淀中分离纯化α1-抗胰蛋白酶的方法，以降低生产成本及提高纯度。
为了达到上述发明目的，本发明采用了以下技术方案：
一种从人血浆组分FIV沉淀中分离纯化α1-抗胰蛋白酶的方法，其特征在于包括以下步骤：
(A)血浆沉淀预处理：取FIV沉淀加溶解液稀释到蛋白含量2％～5％，pH8.0～8.5，离子强度0.09-0.12，温度控制在2～8℃搅拌过夜，按照0.5％～15％的比例(W/V)加入硅酸盐助剂在2-8℃搅拌1h，固液分离，取上清液，按照0.5％-15％的比例(W/V)再次加入硅酸盐助剂在2-8℃搅拌3h，固液分离，取上清液进样层析柱；
(B)阴离子凝胶层析：取凝胶，室温放置达到温度平衡后装柱，以缓冲液洗脱平衡，pH6.0～6.5，平衡量为柱体积的8～12倍，将上清液上样于平衡好的层析柱，用缓冲液洗脱，pH6.0～6.5，温度控制在2～8℃，洗柱8～10倍柱体积，于紫外光280nm波长下自动监测，记录层析图谱，选择性地收集以含有a1-AT为主要成分的组分；
(C)凝胶过滤层析：取凝胶，室温放置达到温度平衡后装柱，以缓冲液平衡，将层析后收集的a1-AT的组分调至pH 7.0-7.5，上样于平衡好的Sephacryl5-200柱，用相同的缓冲液洗脱，同时于紫外光280nm波长下自动监测，记录层析图谱，选择性地收集a 1-AT的组分；
(D)超滤脱盐浓缩；
(E)巴氏病毒灭活：将浓缩蛋白液加无热原注射用水稀释，加入保护剂，于60±0.5℃保温8～12小时，灭活血浆蛋白制品中的病毒；
(F)冻干分装：巴氏灭活的a 1-AT蛋白液经除菌过滤，转入冻干机真空冻干；
(G)干热消毒：分装的冻干粉针放置于保温库中保温，灭活病毒，转入成品库全检包装。
本发明是以人血白蛋白生产过程中产生的弃料FIV组分沉淀为原料，采用层析技术分离纯化一种蛋白酶抑制剂即α1-抗胰蛋白酶(α1-antitrypsin，α1-AT)，建立α1-AT浓缩制剂的生产工艺。本方法制备的产品纯度好、收率高，操作简单易行，同时占用设备少、劳动强度小、能耗低，以白蛋白生产的废弃物料作原料，生产成本低。
附图说明
图1为工艺流程图。
具体实施方式
本发明提供的技术方案是α1-AT浓缩制剂的生产工艺，工艺步骤如下：
(A)FIV沉淀预处理
取FIV沉淀加8～18mM的磷酸或30～35mM的醋酸盐缓冲液稀释到蛋白含量2％-5％，pH8.0-8.5，离子强度0.09-0.12，温度控制2-8℃搅拌过夜。按照0.5％-15％的比例(W/V)加入硅酸盐助剂，2-8℃搅拌1h，固液分离，分离温度控制在4℃，取上清液，按照0.5％-15％的比例(W/V)加入硅酸盐助剂，2-8℃搅拌3h，调节溶液pH5.5-6.5，固液分离，温度控制在4℃，取上清液进样层析柱。
硅酸盐助剂为硅藻土、珍珠岩，添加剂的用量为每100毫升溶解液添加0.5克-15克。
(B)离子交换层析
取出DEAF-Sepharose Fast Flow凝胶，室温放置达到温度平衡后装柱，以8～18mM的磷酸盐缓冲液、30～35mM的醋酸盐缓冲液或12～25mM的柠檬酸盐缓冲液洗脱平衡，pH6.0-6.5，平衡量为柱体积的8-12倍。将上清液上样于平衡好的层析柱，用8～18mM的磷酸盐缓冲液、30～35mM的醋酸盐缓冲液或12～25mM的柠檬酸盐缓冲液洗脱，pH6.0-6.5，流速控制在每小时2.0～4.5倍柱体积，温度控制在2-8℃，洗柱8-10倍柱体积。于紫外光280nm波长下自动监测，记录层析图谱，选择性地收集以含有a1-AT为主要成分的组分。
(C)凝胶过滤层析
取Sephacryl S-200凝胶，室温放置达到温度平衡后装柱，以8～18mM的磷酸盐缓冲液、30～35mM的醋酸盐缓冲液或12～25mM的柠檬酸盐缓冲液平衡，pH7.0～7.5，平衡量为柱体积的8～12倍。将层析后收集的a 1-AT的组分调至pH 7.0～7.5，上样于平衡好的SephacrylS-200柱，用相同的缓冲液洗脱，洗脱量为柱体积的8-12倍，流速控制在每小时1.5～3.5倍柱体积，洗脱温度控制在2～8℃。同时于紫外光280nm波长下自动监测，记录层析图谱，选择性地收集a 1-AT的组分。
(D)超滤脱盐浓缩
经层析纯化的a 1-AT溶液泵入超滤机，用无热原注射用水超滤脱盐，超滤膜截留分子量为100KD。
(E)巴氏消毒
将浓缩蛋白液加无热原注射用水稀释到蛋白含量1.5％-2.5％，pH6.4～6.8，加入甘氨酸和麦芽糖作为巴氏消毒的混合保护剂，甘氨酸含量控制在45-55mM，麦芽糖含量控制在25％～35％于60±0.5℃保温10小时，灭活血浆蛋白制品中的病毒。
(F)冻干分装
巴氏灭活的a 1-AT蛋白液过0.22μm微孔滤膜除菌过滤，转入冻干机真空冻干，含水量控制在3％以下，冻干粉按500mg蛋白/瓶分装，转入待检品库。
(G)干热消毒
分装的冻干粉针放置于80℃保温库中，保温60～72小时灭活病毒，转入成品库全检包装。
实施例1：
(1)FIV沉淀预处理
称取Cohn法组分沉淀FIV 3kg，加入15mM，pH8.0的磷酸氢二钠一磷酸二氢钠缓冲溶液50L，于2～8℃搅拌过夜，加入3kg硅藻土，在2～8℃搅拌1小时，高速离心分离，温度控制在4℃，滤液中加入珍珠岩1.5kg，2-8℃搅拌3h，以1M HCl调溶液pH6.2，高速离心分离，温度控制在4℃，取上清液为层析上柱液。
(2)DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析
取出DEAF-Sepharose Fast Flow凝胶，室温放置以达到温度平衡，取6L凝胶装柱，以15mM，pH6.0的磷酸钠缓冲液平衡洗柱，平衡液用量8倍柱体积。将上柱液10L上样于平衡好的DEAF-Sepharose Fast Flow柱(9.5×110cm)，用pH6.0，15mM的磷酸钠缓冲液洗柱，洗柱液用量8倍柱体积，流速2.2L/h，以pH6.0，20mM的柠檬酸一柠檬酸钠缓冲液洗脱，流速3.2L/h，洗脱温度控制在2-8℃。同时于紫外光280nm波长下自动监测，记录层析图谱，选择性收集含有a 1-AT为主要成分的组分。
(3)Sephacryl S-200凝胶过滤层析
取Sephacryl S-200凝胶5L，于室温放置2h达到温度平衡后装柱，以15mM，pH7.0的磷酸钠缓冲液平衡洗柱，平衡液用量10倍柱体积，以1M NaOH溶液将层析后收集的a 1-AT组分调至pH7.2，上样于平衡好的SephacrylS-200柱(7.5×90cm)，用相同的缓冲液以1.8L/h的流速洗脱，洗脱温度控制在2-8℃。同时于紫外光280nm波长下自动监测，记录层析图谱，选择性地收集a 1-AT的组分。
(4)超滤脱盐浓缩
经层析纯化的a 1-AT溶液泵入超滤机，用无热原注射用水550L超滤脱盐，超滤膜截留分子量为100KD，浓缩到蛋白含量12％。
(5)巴氏消毒
从超滤器中泵出蛋白浓缩液，加无热原注射用水稀释到蛋白含量2％，加入55mM甘氨酸和25％麦芽糖作为巴氏消毒的保护剂。蛋白溶液于60±0.5℃保温10小时，灭活血浆蛋白制品中的病毒。
(6)冻干分装
巴氏灭活的a 1-AT蛋白液真空冻干，含水量控制在3％以下，冻干粉按照500mg蛋白/瓶无菌分装，转入待检品库。
(7)干热消毒/全检包装
冻干品置80℃保温库放置60小时灭活制品病毒，转入成品库全检包装。成品检测结果如下表1：
表1
| 检测项目 | 方法 | 测定值 | 结论 |
| 蛋白含量 | 凯氏定氮法 | 2.08％ | 合格 |
| 纯度 | 电泳法 | 98.8％ | 合格 |
| 纯度 | HPLC法 | 96.4％ | 合格 |
| 分子量 | SDS-PAGE电泳 | 54.8KD | 合格 |
| 等电点 | 等电聚焦电泳 | PI4.58 | 合格 |
| 鉴别试验 | 免疫双扩散法 | 产品与抗人血清形成沉淀线，与阴性对照品不产生沉淀线 | 合格 |
| 活性 | 胰蛋白酶抑制法 | 720±30IU/mg | 合格 |
实施例2
(1)FIV沉淀预处理
称取Cohn法组分沉淀FIV 3kg，加入50L 30mM的醋酸钠缓冲溶液，于2～8℃搅拌过夜，加入3kg硅藻土，在2～8℃搅拌1小时，进样板框滤器加压过滤，温度控制在4℃，滤液中加入珍珠岩1.5kg，2-8℃搅拌3h，以1M HCl调溶液pH6.2，进样板框滤器加压过滤，温度控制在4℃，取上清液为层析上柱液。
(2)DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析
取出DEAF-Sepharose Fast Flow凝胶，室温放置以达到温度平衡，取6L凝胶装柱，以30mM，pH6.0的醋酸钠缓冲溶液平衡洗柱，平衡液用量12倍柱体积。将上柱液10L上样于平衡好的DEAE-Sepharose Fast Flow柱(9.5×110cm)，用30mM，pH6.0的醋酸钠缓冲溶液洗柱，洗柱液用量10倍柱体积，流速2.0L/h，以pH6.0，20mM的柠檬酸一柠檬酸钠缓冲液洗脱，流速4.5L/h，洗脱温度控制在2-8℃。同时于紫外光280nm波长下自动监测，记录层析图谱，选择性收集含有a 1-AT为主要成分的组分。
(3)Sephacryl S-200凝胶过滤层析
取Sephacryl S-200凝胶5L，于室温放置2h达到温度平衡后装柱，以30Mm，pH7.2的醋酸钠缓冲溶液平衡洗柱，平衡液用量10倍柱体积，以1MNaOH溶液将层析后收集的a 1-AT组分调至pH7.2，上样于平衡好的SephacrylS-200柱(7.5×90cm)，用相同的缓冲液以1.5L/h的流速洗脱，洗脱温度控制在2-8℃。同时于紫外光280nm波长下自动监测，记录层析图谱，选择性地收集a 1-AT的组分。
(4)超滤脱盐浓缩
经层析纯化的a 1-AT溶液泵入超滤机，用无热原注射用水550L超滤脱盐，超滤膜截留分子量为100KD，浓缩到蛋白含量12％。
(5)巴氏消毒
从超滤器中泵出蛋白浓缩液，加无热原注射用水稀释到蛋白含量2％，加入55mM甘氨酸和32％麦芽糖作为巴氏消毒的保护剂。蛋白溶液于60±0.5℃保温10小时，灭活血浆蛋白制品中的病毒。
(6)冻干分装
巴氏灭活的a 1-AT蛋白液真空冻干，含水量控制在3％以下，冻干粉按照500mg蛋白/瓶无菌分装，转入待检品库。
(7)干热消毒/全检包装
冻干品置80℃保温库放置72小时灭活制品病毒，转入成品库全检包装。
Claims (5)
1.一种从人血浆组分FIV沉淀中分离纯化α1-抗胰蛋白酶的方法，其特征在于包括以下步骤：
(A)血浆沉淀预处理：取FIV沉淀加溶解液稀释到蛋白含量2％～5％，pH8.0～8.5，离子强度0.09-0.12，温度控制在2～8℃搅拌过夜，按照0.5％～15％的比例(W/V)加入硅酸盐助剂在2-8℃搅拌1h，固液分离，取上清液，按照0.5％-15％的比例(W/V)再次加入硅酸盐助剂在2-8℃搅拌3h，固液分离，取上清液进样层析柱，其中溶解液为8～18mM的磷酸盐缓冲液或30～35mM的醋酸盐缓冲液；溶解液中添加的助剂为硅藻土或珍珠岩，添加量为每100毫升溶解液添加0.5克-15克；
(B)阴离子凝胶层析：取凝胶，室温放置达到温度平衡后装柱，以缓冲液洗脱平衡，pH6.0～6.5，平衡量为柱体积的8～12倍，将上清液上样于平衡好的层析柱，用缓冲液洗脱，pH6.0～6.5，温度控制在2～8℃，洗柱8～10倍柱体积，于紫外光280nm波长下自动监测，记录层析图谱，选择性地收集以含有a 1-AT即a 1-抗胰蛋白酶为主要成分的组分，其中离子交换层析填料为DEAF-SepharoseFast Flow凝胶，洗脱液为8～18mM的磷酸盐缓冲液或30～35mM的醋酸盐缓冲液或12～25mM的柠檬酸盐缓冲液，流速控制在2.0～4.5L/h；
(C)凝胶过滤层析：取凝胶，室温放置达到温度平衡后装柱，以缓冲液平衡，将层析后收集的a1-AT的组分调至pH 7.0-7.5，上样于平衡好的SephacrylS-200柱，用相同的缓冲液洗脱，同时于紫外光280nm波长下自动监测，记录层析图谱，选择性地收集a 1-AT的组分，其中凝胶过滤层析填料为SephacrylS-200凝胶，洗脱液为8～18mM的磷酸盐缓冲液或30～35mM的醋酸盐缓冲液或12～25mM的柠檬酸盐缓冲液，pH7.0-7.5，洗脱量为柱体积的8-12倍，流速控制在每小时1.5～3.5倍柱体积，洗脱温度控制在2-8℃；
(D)超滤脱盐浓缩；
(E)巴氏病毒灭活：将浓缩蛋白液加无热原注射用水稀释，加入保护剂，于60±0.5℃保温8～12小时，灭活血浆蛋白制品中的病毒，其中巴氏消毒的保护剂为甘氨酸和麦芽糖混合保护剂，甘氨酸含量控制在45-55mM，麦芽糖含量控制在25％-35％；
(F)冻干分装：巴氏灭活的a 1-AT蛋白液经除菌过滤，转入冻干机真空冻干；
(G)干热消毒：分装的冻干粉针放置于保温库中保温，灭活病毒，转入成品库全检包装，其中冻干制品的保温温度为80℃，保温时间为60～72小时。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤A中的固液分离采用高速离心分离或板框加压过滤，分离温度控制在4℃，固液分离后上清液调节到pH5.5-6.5。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤D是将经层析纯化的a 1-AT溶液泵入超滤机，用无热原注射用水超滤脱盐，超滤膜截留分子量为100KD。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤E稀释到蛋白含量控制在1.5％-2.5％，pH6.4-6.8。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤F中所述除菌过滤采用的除菌膜孔径0.22um，真空冻干含水量控制在3％以下。
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