CN101143894A - 高效抑制血管生成多肽及其物理化学修饰方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物工程制药技术领域或蛋白质多肽类药物领域，具体涉及高效血管生成抑制剂及其生产方法与应用。本发明设计了具有整合素亲和性的高效血管生成抑制剂RGD－ED，该抑制剂含有血管生成抑制多肽异亮氨酸－缬氨酸－精氨酸－精氨酸－丙氨酸－天冬氨酸－精氨酸－丙氨酸－丙氨酸－缬氨酸－脯氨酸，在其一端或两端分别连接含有精氨酸－甘氨酸－天冬氨酸序列的多肽。本发明的RGD－ED可以合成。本发明还通过基因工程方法在大肠杆菌中或其它真核细胞中表达了其中一种RGD－ED，进行包涵体蛋白分离、溶解和复性、离子交换层析分离纯化得到RGD－ED。对本发明中的所有多肽序列进行聚乙二醇(PEG)修饰，肝素修饰，右旋糖苷修饰，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)修饰，聚乙二醇－聚氨基酸共聚物修饰，棕榈酸(palmitic acid)修饰，多聚唾液酸(colominic acid)修饰，脂质体修饰，其中包括脂质体(REV)、干脂质体(DRV)以及多室脂质体(Mvl)。本发明的合成多肽序列、基因工程产物和修饰产物在体内外实验中都能够显著提高现有血管生成抑制剂抑制内皮细胞生长、抑制新生血管生成和抗肿瘤效果，能够作为实体瘤、类风湿性关节炎治疗药物。

Description

高效抑制血管生成多肽及其物理化学修饰方法和应用
一.技术领域：本发明属于生物工程制药技术领域或蛋白质多肽类药物领域。
二.背景技术
肿瘤血管生成抑制剂是近年来在肿瘤治疗中引起重视的一类药物，这方面的研究已经取得一些进展，可望在今后成为一类新的有希望的肿瘤治疗药物。肿瘤新生血管形成的概念是Algureza在1947年提出的，他指出增长的肿瘤的一个重要特征是能够从宿主引发新的毛细血管内皮细胞形成。1971年，Folkman提出假设，认为肿瘤生长和转移依赖于新生血管生成，并认为实体瘤早期可分泌肿瘤血管生成因子，刺激宿主毛细血管增生。新生血管不仅可以提供肿瘤所需要的营养和氧气，排除代谢产物，而且是远处转移的途径(Folkman，J.，J.Natl.CancerInst.1990；82：4-6)。因此，阻断新生血管形成可能成为阻止肿瘤生长和转移的手段，从而激发了对促血管生成分子和抗血管生成分子的广泛研究。在这些血管生成抑制剂中，尤其以血管抑素(angiostatin)和内皮抑素(endostatin)最引人注目，两者均已在美国进入临床试验，尽管这些血管抑制剂呈现出非常诱人的前景，但其缺陷也非常明显：迄今为止的血管生成药物，如内皮抑素、血管抑素等作用靶点不明确，它们对血管的专一性和选择性还不够好，效果有限，导致实验中用量很高，在小鼠动物模型实验时，血管抑素用量达数百毫克/公斤体重，内皮抑素达到数十毫克/公斤体重，当这些血管生成抑制剂在人体内使用时，使用剂量至少要达到几克/人的剂量。这样大的药物使用剂量势必增加日后该类药物毒副作用发生的可能性，造成该类药物质量控制难度加大、生产规模和生产成本增大、药物价格居高。
因此，一个好的抗血管生成药物应该有对新生血管的标记分子具有选择性，这样才能达到对新生血管的导向性作用，从整体上提高药物对血管生成的抑制作用：做到只使用很低剂量的药物，就能达到高效的抑制血管生成效果。
整合素是由α亚基和β亚基组成的跨膜蛋白异二聚体，研究表明，肿瘤细胞表面的整合素是肿瘤转移发生的关键所在，它们通过连接胞内细胞骨架蛋白和细胞外基质分子的相互作用控制细胞的迁移、分化和增殖(Schoenwaelder SM等，Curr Opin CellBiol，1999；274-286)。20多种整合素中大多数都识别含RGD(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)序列的细胞外基质配基(Dennis MS等，Proc Natl AcadSci1990；87：2471-2475)，含有RGD序列的多肽具有整合素拮抗剂作用，能减少细胞表面黏附分子的表达，调节细胞内信号转导，在肿瘤治疗中具有广阔的应用前景。
物理化学修饰是一个使多肽或蛋白质在治疗或生物技术方面的效力得以提高的重要过程。当修饰物以适当的方式连接在蛋白质或多肽上或对蛋白质多肽进行修饰时，它能改变许多的特征，而主要的生物活性功能，如酶活性或特异结合位点，可以保留下来。物理化学修饰通过如下几种途径改善药物的性能，首先，修饰物连接在蛋白质或多肽的表面上，提高了它的分子大小，并且它还能携带大量的水分子，一种修饰物-蛋白质因而增大了5～10倍；其次，物理化学修饰使得以前不溶的蛋白质不仅容易溶解，而且具有高度移动性；此外，对蛋白质多肽进行修饰可以减少肾脏对药物的滤过作用，降低它的致热原性，还可以减少蛋白酶对其的消解，通过保护分子免受人体免疫系统的攻击来改善了它的输送；同时，因为它逃避了人体防御机构，因而在作用部位停留的时间就长得多，并使局部药物浓度增高。如目前在国外上市的PEG-多肽(或PEG-蛋白质)产品已有多个品种，像世界头号生物技术公司Amgen公司开发的新药SD/01，就是用PEG修饰的粒细胞集落刺激因子G-CSF，是Amgen公司的早期产品G-CSF的长效型。而G-CSF的99年销售额是12.2亿美元，2000年是12.6亿美元，这就可以看出修饰蛋白质多肽类产品的市场十分巨大。
三.发明内容
目前发现，有的编码血管生成抑制剂的小肽具有抑制血管生成和抗肿瘤效果，本研究是将抑制血管生成的小肽两端加上不同的含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸的序列，构建了一种对整合素具有结合作用和亲和性的血管生成抑制剂。
本发明需要解决的问题是提供一种与整合素有亲和性或结合能力的高效血管生成抑制剂，本发明的高效血管生成抑制剂可以合成。本发明还应用PCR扩增得到目的基因，克隆于原核表达载体或真核表达载体，用基因工程手段获得产物。本发明还应用多种修饰方法对血管生成抑制多肽进行修饰，包括聚乙二醇修饰，肝素修饰，右旋糖苷修饰，聚乙烯吡咯烷酮修饰，聚乙二醇-聚氨基酸共聚物修饰，棕榈酸修饰，多聚唾液酸修饰，脂质体修饰，获得了多种修饰产物。本发明技术方案为：
(1)在血管生成抑制多肽
Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro的一端或另外一端分别连接含有Arg-Gly-Asp或Arg-Gly-Asp-Gly-Gly-Gly-Gly的序列，即多肽序列Arg-Gly-Asp-Gly-Gly-Gly-Gly-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro，Arg-Gly-Asp-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro，Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp，Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Arg-Gly-Asp序列。
(2)在高效抑制血管生成多肽Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro的一端或另外一端连接含有
Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly或Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys的多肽，即序列Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro，
Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro，
Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys，
Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys。
(3)本发明的多肽序列及其编码此多肽序列的碱基序列可以直接进行合成。
(4)合成含有Arg-Gly-Asp整合素结合序列肽段的血管生成抑制剂基因序列，以此序列为模板，设计上下游引物，在引物序列的5’端和3’端加上适合克隆的酶切位点，PCR扩增，获得RGD-ED基因。将基因克隆于载体中，筛选阳性克隆，核苷酸序列分析鉴定。
(5)RGD-ED基因与原核表达载体重组，形成表达质粒，转化大肠杆菌，IPTG诱导表达RGD-ED，表达产物以包涵体形式存在。
(6)进行包涵体蛋白分离、溶解和复性，并进行离子交换层析分离纯化RGD-ED蛋白产物，收集穿过液，冻干。
(7)对本发明中的所有RGD-ED基因与真核表达载体重组，形成表达质粒，转化真核细胞，诱导表达RGD-ED，表达产物进行分离纯化。
(8)对本发明中的所有多肽序列进行聚乙二醇(PEG)修饰，采用的PEG分子量范围为具有线性(相对分子量5000～30000Dα)或支化(相对分子量力40000～60000Dα)，其中包括：(1)PEG-乙烯基磺酸(PEG-Vinylsulphone)；(2)PEG-碘乙酰胺(PEG-lodoacetamide)；
(3)PEG-马来酰胺(PEG-Maleimide)；(4)PEG-正吡啶二硫化物(PEG-Orthopyridyldisulfide)；(5)SC-mPEG(单甲氧基聚乙二醇甲酰琥珀酰亚胺)或者SS-PEG(琥珀酰胺类)或者PEG-异氰酸酯(PEG-lsocyanate)；(6)单甲氧基聚乙二醇丙醛(mPEG-ALD)。
(9)对本发明中的所有多肽序列进行肝素修饰。
(10)对本发明中的所有多肽序列进行右旋糖苷修饰。
(11)对本发明中的所有多肽序列进行聚乙烯吡咯烷酮(PVP)修饰。
(12)对本发明中的所有多肽序列进行聚乙二醇-聚氨基酸共聚物修饰。
(13)对本发明中的所有多肽序列进行棕榈酸(palmitic acid)修饰。
(14)对本发明中的所有多肽序列进行多聚唾液酸(colominic acid)修饰。
(15)对本发明中的所有多肽序列进行脂质体修饰，其中包括脂质体(REV)、干脂质体(DRV)以及多室脂质体(Mvl)。
(16)进行内皮细胞增殖实验和鸡胚尿囊绒膜(CAM)分析、小鼠体内抗肿瘤实验。
发现本发明产物在体内外实验中都能够大幅度改善和提高现有血管生成抑制剂抑制内皮细胞生长和抗肿瘤效果，并且用量小，降低了成本，说明本发明设计的高效血管生成抑制剂科学、合理、可行有效，能够作为肿瘤治疗药物。
本发明的有益效果是：
本发明所述高效抑制血管生成多肽及其物理化学修饰产物可制备成治疗人类新生血管生成有关疾病即实体瘤的药物。
所得产物与同类产品比较，具有高效、特异性抑制内皮细胞增殖和抗肿瘤效果，并且用量小，相应减少了药物治疗的副作用。
本发明还对多肽进行了多种修饰，这些修饰使本发明中的多肽延长了半衰期(T1/2)、增强了稳定性、降低免疫原性和抗原性、改变了分子结构从而改进了药物动力学和药效学的性质，提高了作用部位的血药浓度。同时，比未修饰的多肽表现出更好的耐受性，增加了今后的临床应用范围和疗效。
四.附图说明：
图1HPLC纯化RGD-ED分析结果
图2鸡胚尿囊绒膜(CAM)分析RGD-ED抑制新生血管生成：A，空白对照B，C，D分别为0.05μg，0.1μg和0.2μg给药组
图3RGD-ED体内抑制肿瘤效果
图4聚乙二醇(PEG)和脂质体修饰多肽体内抑制肿瘤效果：1，2，3分别为修饰前RGD-ED，脂质体修饰后和聚乙二醇修饰后的RGD-ED体内抑制人肝癌的作用效果
五.具体实施方式：
1.RGD-ED基因的克隆及其原核表达载体的构建
合成编码RGD-ED多肽序列的碱基，作为模板；合成上游引物和下游引物，其中上游引物加入了NdeI酶切位点；下游引物含有Arg-Gly-Asp序列和XhoI位点。进行PCR扩增，扩增产物经过琼脂糖凝胶电泳回收、纯化后，进行NdeI和XhoI酶切，克隆到原核表达载体pw，PCR筛选阳性克隆，核苷酸序列分析证实序列发生了设计的突变。
合成的引物1：5’GGAATTCCATATG ATCGTGCGCCGTGCCGACCGC3’
合成的引物2：5’CCGCTCGAGGCAGAAGCAGTCACCACGGCA3’
其中，引物1编码了NdeI位点和Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro的部分序列，引物2编码XhoI位点和含有Arg-Gly-Asp序列的基因。
为了比较本发明所设计的血管生成抑制剂RGD-ED的实际效果，本实例中我们同时委托公司合成了不含Arg-Gly-Asp序列的多肽Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro(ED)。
3.重组菌的诱导表达
将表达质粒转化大肠杆菌，重组菌经过1mMIPTG诱导表达3小时后，收获细胞并超声破菌，离心分离上清和沉淀，15％SDS-PAGE电泳分析，将考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE扫描(UVP White/Ultraviolet transilluminator)，分析表达结果。
4.包涵体的分离、溶解与复性
超声破菌，离心分离，将包涵体沉淀用0.1Mtris和脱氧胆酸钠洗涤，沉淀溶解于月桂基肌氨酸钠(SLS)中，4℃，10000rpm离心5min，上清液4℃透析，透析液为buffer A(10mM Tris-HCl，0.1mM氧化型谷胱甘肽和1mM还原型谷胱甘肽，pH7.4)，6-8h换液一次，共换液3次，最后透析一次，透析液为buffer B(10mM Tris-HCl，pH7.4)，样品直接进行SP-Sepharose Fast Flow(AmershamPharmacia Biotech)层析。柱床平衡洗涤均用buffer B，用0.6M NaCl，Tris-HCl，pH7.4和1M NaCl，Tris-HCl，pH7.4分步洗脱，将洗脱液混合，buffer B透析后冻干浓缩。层析结果如图1所示。
5.内皮细胞增殖分析
培养BCE细胞和NIH3T3细胞，方法：培养液DMEM含10％灭活小牛血清(BCS)，1％抗生素及3ng/ml bFGF。细胞增殖分析方法如下：PBS洗涤细胞，胰蛋白酶消化，加入培养液悬浮细胞并离心收集细胞，调整细胞浓度至25,000cells/ml。将细胞移入6孔板(0.5ml/well)，培养24h.，更换培养基为1mlDMEM，5％BCS，1％抗生素，1ng/ml bFGF，每孔加入不同剂量的样品，进一步培养48h，胰蛋白酶消化细胞，重悬于PBS，用70％冰冷乙醇固定30min，7-AAD染色，用流式细胞仪进行分析。
结果显示：重组RGD-ED能够特异性抑制内皮细胞-BCE细胞的增殖，而对非内皮细胞-NIH3T3则没有抑制作用。抑制BCE增殖的ED50大约为0.1μg/ml，而没有RGD序列的多肽ED50大约为0.8μg/ml，内皮抑素的ED50大约为0.5μg/ml。以上实验说明本发明所设计的高效血管生成抑制剂确实显著提高了现有的血管生成的生物活性。
6.鸡胚尿囊绒膜(CAM)分析
为了检测体内抗血管生成活性，进行CAM分析。所有实验在超净台中进行无菌操作，将消毒的6天的鸡胚在37℃、90％湿度下进行培养。两天后，每个鸡蛋顶端打孔，将试剂滴到灭菌的Whatman滤纸，放入CAMs上血管密集区，培养48小时后，观察鸡胚和CAMs并拍照。
如图2所示，为了评价RGD-ED体内抗新生血管生成活性，采用了不同剂量的RGD-ED来进行CAM实验，其中0.05μg，0.1μg和0.2μg的RGD-ED都能够显著抑制新生血管和血管生成，0.5μgRGD-ED能够完全抑制血管生成并导致鸡胚死亡。RGD-ED具有潜在的抑制血管生成的作用。
7、多肽的PEG修饰
7.1N端氨基酰化修饰
重量百分数大约为1-20％的多肽，优选大约1-12％，与大约20％-95％的聚乙二醇SC-mPEG(单甲氧基聚乙二醇甲酰琥珀酰亚胺，平均分子量为5000)或者SS-PEG(琥珀酰胺类)或者PEG-异氰酸酯(PEG-lsocyanate)溶液或者单甲氧基聚乙二醇丙醛(mPEG-ALD)溶液混合，优选大约50-93％的上述修饰物，充分混匀，在4℃-40℃，优选25℃-37℃摇床中震荡反应30min以上.通过通过离子交换层析分离N端被修饰的产物。
7.2羧基端修饰
重量百分数大约为1-20％的多肽，优选大约1-12％，与大约20％-95％的mPEG-NH2(平均分子量为5000)，少量DCCI(二环己基碳二亚胺)溶液混合，优选大约50-93％的上述修饰物，充分混匀，在4℃-40℃，优选22℃-37℃摇床中震荡反应30min以上.优选90min，羧基可与mPEG-NH2中的氨基结合，形成酰胺键，RP-HPLC分离得到N端被修饰的产物。
7.3巯基端修饰
重量百分数大约为1-20％的多肽，优选大约1-10％，与大约20％-95％的mPEG-MAL(mPEG-马来酰亚胺，平均分子量为5000)溶液混合，优选大约70-94％的上述修饰物，充分混匀，在4℃-40℃，优选20℃-37℃摇床中震荡反应30min以上.优选60min，通过离子交换分离得到N端被修饰的产物。
8、其它修饰方法
其它修饰方法均参照PEG修饰，其中最优修饰效果为PEG修饰和脂质体修饰(见图4)
7.动物体内抗肿瘤实验
将培养的B16F10黑色素瘤细胞用0.05％的胰蛋白酶消化，1000rpm离心5min，重悬于PBS，在C57BL/6小鼠(6-8周)小鼠体侧皮下接种5×105细胞0.1ml。当肿瘤平均体积达到200mm3-300mm3随机将小鼠分组，每组7只，其中一组接受RGD-ED治疗，一组用不含RGD的ED治疗，以上两组剂量均为5mg/kg/d，对照注射PBS。治疗采用在接种肿瘤对侧皮下注射方法。每天用游标卡尺测量肿瘤大小，计算肿瘤体积，采用公式：肿瘤体积＝长×宽2×0.52，治疗效果用给定时间内的肿瘤抑制率表示：(1-T/C)×100％，T＝治疗组肿瘤体积，C＝对照组肿瘤体积。
如图3所示，结果表明，在第9天时，RGD-ED的肿瘤抑制率为58％，而没有RGD序列的多肽ED的肿瘤抑制率为28％。以上实验说明本发明所设计的高效血管生成抑制剂能够显著抑制小鼠体内的肿瘤生长。
将培养的人肝癌SGC7901用0.05％的胰蛋白酶消化，1000rpm离心5min，重悬于PBS，在6-8周裸小鼠体侧皮下接种5×105细胞0.1ml。当肿瘤平均体积达到100mm3-200mm3，随机将小鼠分组，每组7只，其中一组接受RGD-ED治疗，一组用脂质体修饰的RGD-ED治疗，一组用聚乙二醇修饰的RGD-ED治疗，以上三组剂量均为3mg/kg/d，对照注射PBS。治疗采用在接种肿瘤对侧皮下注射方法。每天用游标卡尺测量肿瘤大小，计算肿瘤体积，采用公式：肿瘤体积＝长×宽2×0.52，治疗效果用给定时间内的肿瘤抑制率表示：(1-T/C)×100％，T＝治疗组肿瘤体积，C＝对照组肿瘤体积。
如图4所示，结果表明，在第10天时，RGD-ED的肿瘤抑制率为68％，而脂质体修饰的RGD-ED的肿瘤抑制率为72％，聚乙二醇修饰的RGD-ED的肿瘤抑制率为78％，以上实验说明本发明所设计的修饰方法获得的修饰产物能够显著抑制小鼠体内的肿瘤生长。
高效抑制血管生成多肽序列表
<110>申请人姓名：中国药科大学
<120>发明名称：高效抑制血管生成多肽及其制备方法和应用
<160>序列表中序列的个数：8
<210>序列相对应的序列标识符：1
<211>序列长度：25个氨基酸
<212>序列的类型：PRT
<213>生物体：人工序列
<400>序列标识符：
Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly-Ile-Val-Arg-Arg-Ala
         3           6           9            12         15           18
-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro
      21           24
<210>序列相对应的序列标识符：2
<211>序列长度：21个氨基酸
<212>序列的类型：蛋白质
<213>生物体：人工序列
<400>序列标识符：
Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Ile-Val-Arg-Arg-Ala
         3           6           9           12         15
-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro
          18
<210>序列相对应的序列标识符：3
<211>序列长度：18个氨基酸
<212>序列的类型：蛋白质
<213>生物体：人工序列
<400>序列标识符：
Arg-Gly-Asp-Gly-Gly-Gly-Gly-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro
         3            6          9           12           15         18
<210>序列相对应的序列标识符：4
<211>序列长度：14个氨基酸
<212>序列的类型：蛋白质
<213>生物体：人工序列
<400>序列标识符：
Arg-Gly-Asp-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro
         3           6           9          12
<210>序列相对应的序列标识符：5
<211>序列长度：25个氨基酸
<212>序列的类型：蛋白质
<213>生物体：人工序列
<400>序列标识符：
Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-
         3           6        9              12          15
Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys
         18          21          24
<210>序列相对应的序列标识符：6
<211>序列长度：21个氨基酸
<212>序列的类型：蛋白质
<213>生物体：人工序列
<400>序列标识符：
Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-
         3           6           9           12          15          18
Phe-Cys
     21
<210>序列相对应的序列标识符：7
<211>序列长度：18个氨基酸
<212>序列的类型：蛋白质
<213>生物体：人工序列
<400>序列标识符：
Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp
         3           6            9          12          15          18
<210>序列相对应的序列标识符：8
<211>序列长度：14个氨基酸
<212>序列的类型：蛋白质
<213>生物体：人工序列
<400>序列标识符：
Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Arg-Gly-Asp
         3            6           9          12

Claims (8)

1.一种具有整合素、肝素亲和性和结合能力的高效抑制血管生成的多肽，其特征在于在血管生成抑制多肽Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro的一端或另外一端连接对整合素家族具有亲和性和结合能力的多肽。
2.根据权利要求1所述高效抑制血管生成多肽，其特征在于所述对整合素家族具有亲和性和结合能力的多肽为Arg-Gly-Asp、Arg-Gly-Asp-Gly-Gly-Gly-Gly、Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly或Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys。
3.根据权利要求2所描述高效抑制血管生成多肽的生产方法，其特征在于：构建编码含有Arg-Gly-Asp、Arg-Gly-Asp-Gly-Gly-Gly-Gly、Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly或Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys序列的Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro多肽的基因序列，进行基因工程表达，分离纯化重组蛋白质。
4.根据权利要求2所述的高效抑制血管生成多肽的生产方法，其特征在于：采用多肽合成方法合成含有Arg-Gly-Asp、Arg-Gly-Asp-Gly-Gly-Gly-Gly、Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly或Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys序列的Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro多肽。
5.根据权利要求1或2所述的血管生成抑制多肽的物理化学修饰方法，其特征在于：重量百分数为1-20％的多肽，优选1-12％，与20％-95％的聚乙二醇或肝素或右旋糖苷或聚乙烯吡咯烷酮或聚乙二醇-聚氨基酸共聚物或棕榈酸或多聚唾液酸或脂质体溶液混合，优选50-93％的上述修饰物，充分混匀，在4℃-40℃，优选25℃-37℃摇床中震荡反应30min以上，分离被修饰的产物。
6.根据权利要求5方法所述的修饰产物，其特征是：采用聚乙二醇修饰，肝素修饰，右旋糖苷修饰，聚乙烯吡咯烷酮修饰，聚乙二醇-聚氨基酸共聚物修饰，棕榈酸修饰，多聚唾液酸修饰，脂质体修饰。
7.根据权利要求1或2所述高校血管生成抑制多肽在治疗人类新生血管生成有关疾病-实体瘤的药物中的应用。
8.根据权利要求6所述血管生成抑制多肽修饰产物在治疗人类新生血管生成有关疾病-实体瘤的药物中的应用。
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