CN101117635B - Ptd、hif的odd与肿瘤抑制基因的融合表达及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供蛋白转导域(PTD)、缺氧诱导因子(HIF)的氧依赖性蛋白降解结构域(ODD)和人肿瘤抑制基因的融合体，其表达产物为一个重组融合蛋白。该重组融合蛋白可以抑制肿瘤细胞的生长，在正常细胞中快速代谢，在肿瘤细胞中代谢缓慢，发挥抗肿瘤作用。本发明还提供所述重组融合蛋白的生产方法。

Description

PTD、HIF的ODD与肿瘤抑制基因的融合表达及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程和药学领域，具体涉及利用基因工程技术表达人类肿瘤抑制基因p53与转导肽和氧依赖性蛋白降解结构域的融合蛋白。 

背景技术

作为肿瘤抑制基因，p53参与负调节细胞生长，诱导细胞凋亡。p53以四聚体的形式参与凋亡、细胞周期抑制、DNA损伤与修复及衰老等过程。P53蛋白通过诱导编码三个跨膜蛋白Fas、DR5和PERP，形成死亡诱导信号复合物激活caspases，导致凋亡发生，形成外部凋亡信号途径。内部凋亡信号途径与线粒体去极化和释放细胞色素c有关，主要由Bcl-2家族蛋白完成。Bcl-2家族包括Bcl-2、Bax、Noxa、PUMA、Bid等，它控制着线粒体细胞色素C的释放。 

由于p53在机体的生长、发育、分化中的重要作用，p53失活将严重影响细胞基因组的稳定，而基因突变是p53失活的最重要机制，人类恶性肿瘤中至少50％发生了p53基因改变，如：肺癌，食管癌，胃癌，肝癌，结直肠癌，乳腺癌，卵巢癌等，据统计约80％为错义突变，6％为无义突变，10％为缺失和插入，细胞不能合成正确的p53蛋白，丧失原有的生物学功能。绝大多数的p53误义突变位于其DNA结合域，可导致p53丧失与DNA结合的能力，并且对常规治疗产生抵抗作用。此外，突变的p53蛋白(mutant type p53，mt p53)还可能获得新的功能，如能与Daxx结合抑制Fas诱导的凋亡途径；与醌氧化还原酶1牢固结合，从而抑制泛素化非依赖的降解作用。 

p53基因突变的研究为p53基因治疗提供了基础，以p53功能为基础的肿瘤药物研究成为多年来的研究热点。例如：应用腺病毒载体 进行p53基因治疗，在动物实验和临床研究中都取得了肯定性的抗肿瘤药效。但是使用载体的安全性、基因表达水平的调控及其对病人毒性作用等问题还没有完全解决。导入wt p53蛋白是在肿瘤细胞中重建p53功能最直接的手段。 

p53蛋白均可进行原核表达制备，外源性补充野生型p53蛋白或其活性调节分子，可直接发挥它们的肿瘤抑制作用。此方法避免了基因治疗的载体安全性问题，剂量可调，也同样能达到体内表达p53基因的抗肿瘤，增加放、化疗效果的目的。然而，p53发挥作用的部位在细胞内，如何将p53转导进入肿瘤细胞，以及如何避免其对正常细胞的毒性，相对延长它们在肿瘤细胞内的半衰期成为p53靶向性发挥其抗肿瘤作用的关键。 

蛋白转导域(protein transduction domin，PTD)是近年来发现的一种能高效穿过生物膜的结构域，称为转导肽。1988年Green和Frankel首次报道了HIV-1的反式激活蛋白TAT能够跨膜导入细胞内部，进一步发现其aa47-57作为PTD在蛋白转导过程中发挥主要作用。已经发现的PTD主要来源于病毒蛋白，如VP22和TAT等，被广泛地应用于多种生物分子的转运，如抗原肽，肽核酸，反义寡核苷酸，全长蛋白，甚至纳米粒和脂质体。 

转导肽可以有效地将多种生物分子转导进入靶细胞却是不容争议的事实。原核表达的蛋白质多为变性蛋白，可以大量制备、易于纯化和储存，而且变性的蛋白分子所具有的松散、不固定空间结构反而有利于蛋白转导肽将其转导进入细胞。已有结果显示转导肽TAT转导变性蛋白的效率要明显高于活性蛋白，且非活性蛋白进入细胞以后可以通过细胞内的纠错机制而复性。 

利用PTD的跨膜转导特点，将原核表达PTD-P53融合蛋白转导进入肿瘤细胞，增强或重建的P53功能即可发挥调节细胞周期、诱导肿瘤细胞凋亡的作用。我们在细胞实验中也证实了PTD与P53融合蛋白可诱发肿瘤细胞凋亡。然而，PTD转运蛋白高效进入细胞的同时，缺乏进入细胞的选择性，P53在杀伤肿瘤细胞的同时，也可能对正常细 胞造成伤害。 

实体瘤细胞恶性增殖与血液供应失衡的一个重要病理特征是缺氧，临床上已有许多证据表明，在缺氧环境下肿瘤细胞发生一系列适应性变化，同时使放射线的间接杀伤作用减弱，使之对放疗、化疗耐受，而且使肿瘤更具有侵袭性，容易发生远处转移。缺氧诱导因子1(hypoxia inducible factor 1，HIF-1)是细胞适应缺氧的重要转录因子，参与缺氧时相应靶基因的调控。可被HIF-1转录激活的靶基因均含有一个低氧反应元件(hypoxia reactive element，HRE)及Cis作用调节序列，在人类肿瘤中可以发现这些基因产物大大增加。HIF-1在其中的功能可分为以下几种：①促进糖酵解；②促进血管生成；③与瘤细胞增殖有关。 

HIF-1属于bHLH PAS蛋白族，由HIF-1α和HIF-1β各两个亚单位组成的杂四聚体蛋白，两个亚单位的分子量分别为120ku和91-94ku。HIF-1α对氧的依赖性较强，当周围环境的氧浓度下降时，HIF-1α表达增加。不缺氧时HIF-1α蛋白容易降解，其半衰期小于5分钟，而缺氧可以增加HIF-1α蛋白的稳定性，HIF-1α蛋白的降解阻止。亚单位HIF-1β对氧的依赖性较弱，在HIF-1中也必不可少，因为只有在两个亚单位聚合并且发生适应性变化后，与其要调节的下游因子或酶(如VEGF、P53和EPO)的HRE结合，才能发挥调节作用。 

在研究HIF-1的降解调控时发现，HIF-1α的氧依赖性蛋白降解结构域(oxygen-dependent degradation domain，ODD)是HIF-1α稳定的重要元件，非缺氧状态时，HIF-1多聚羟化酶(HIF-1prolyhydroxylase，HIF PH)羟化ODD核心脯氨酸(Pro 564)，使得pVHL(von Hippel-Lindau tumor suppressor gene product)与HIF-1α亚基结合，进而多聚遍在蛋白化HIF-1α，最终使其被蛋白酶降解，而在缺氧条件下，由于缺少氧原子(必需来自氧分子)使HIF PH失活，以上的反应过程被阻断。 

HIF-1α的ODD含有203个氨基酸残基，Harada等发现ODD的aa548-603可以发挥对其融合蛋白的降解调控作用，其中aa557-574 含调节融合蛋白降解所必需的最小核心成分，可使TAT-ODD-Gal在移植了人胰癌CF/PAC-1的裸鼠瘤体内的Gal活性明显增高，而正常组织内几乎检测不到Gal的活性，说明ODD发挥了氧诱导作用，加速了外来蛋白在正常组织内的降解，其融合蛋白在发挥抗肿瘤作用的同时，可最大限度地减少对正常组织的伤害。 

肿瘤靶向治疗是抗癌药物研究中的重要内容，本发明从肿瘤细胞的特点入手，在TAT和p53融合蛋白中引入ODD，加速融合蛋白在正常细胞内的降解，相对延长其在肿瘤细胞内的半衰期达到P53蛋白靶向抗肿瘤的目的。 

发明内容

本发明旨在将具有潜在治疗作用的基因与可以转导蛋白进入细胞的蛋白转导域、加速融合蛋白在正常组织中代谢的氧依赖性蛋白降解结构域进行有机的融合，通过原核表达载体表达融合蛋白，经过蛋白的纯化和复性，提供一种可以进入肿瘤细胞，在正常组织中快速代谢，而在缺氧的实体瘤组织中诱导细胞凋亡的融合蛋白，达到预防或/和治疗肿瘤的目的。 

为实现上述目的，本发明提供一种蛋白转导域、氧依赖性蛋白降解结构域和人肿瘤抑制基因的融合体。所述人肿瘤抑制基因可以是具有对肿瘤抑制作用的基因中的任一种，其最优选基因为p53基因。在优选的实施方案中，该融合体定义为PTD-ODD-p53，其序列为： 

ATGTACGGCCGTAAAAAGAGACGCCAACGTAGACGTATGAACCCATTTTCTACTCAGGACACAGATTTAGACTTGGAGATGTTAGCTCCCTATATCCCAATGGATGATGACTTCCAGTTACGTTCCTTCGATCAGTTGTCACCATTAGAAAGCAGTTCCGCAAGCCCTGAAAGCGCAAGTCCTCAAAGCACAGTTACAGTATTCCAGATGGAGGAGCCGCAGTCAGATCCTAGCGTCGAGCCCCCTCTGAGTCAGGAAACATTTTCAGACCTATGGAAACTACTTCCTGAAAACAACGTTCTGTCCCCCTTGCCGTCCCAAGCAATGGATGATTTGATGCTGTCCCCGGACGATATTGAACAATGGTTCACTGAAGACCCAGGTCCAGATGAAGCTCCCAGAATGCCAGAGGCTGCTCCCCGCGTGGCCCCTGCACCAGCAGCTCCTACACCGGCGGCCCCTGCACCA GCCCCCTCCTGGCCCCTGTCATCTTCTGTCCCTTCCCAGAAAACCTACCAGGGCAGCTACGGTTTCCGTCTGGGCTTCTTGCATTCTGGGACAGCCAAGTCTGTGACTTGCACGTACTCCCCTGCCCTCAACAAGATGTTTTGCCAACTGGCCAAGACCTGCCCTGTGCAGCTGTGGGTTGATTCCACACCCCCGCCCGGCACCCGCGTCCGCGCCATGGCCATCTACAAGCAGTCACAGCACATGACGGAGGTTGTGAGGCGCTGCCCCCACCATGAGCGCTGCTCAGATAGCGATGGTCTGGCCCCTCCTCAGCATCTTATCCGAGTGGAAGGAAATTTGCGTGTGGAGTATTTGGATGACAGAAACACTTTTCGACATAGTGTGGTGGTGCCCTATGAGCCGCCTGAGGTTGGCTCTGACTGTACCACCATCCACTACAACTACATGTGTAACAGTTCCTGCATGGGCGGCATGAACCGGAGGCCCATCCTCACCATCATCACACTGGAAGACTCCAGTGGTAATCTACTGGGACGGAACAGCTTTGAGGTGCGTGTTTGTGCCTGTCCTGGGAGAGACCGGCGCACAGAGGAAGAGAATCTCCGCAAGAAAGGGGAGCCTCACCACGAGCTGCCCCCAGGGAGCACTAAGCGAGCACTGCCCAACAACACCAGCTCCTCTCCCCAGCCAAAGAAGAAACCACTGGATGGAGAATATTTCACCCTTCAGATCCGTGGGCGTGAGCGCTTCGAGATGTTCCGAGAGCTGAATGAGGCCTTGGAACTCAAGGATGCCCAGGCTGGGAAGGAGCCAGGGGGGAGCAGGGCTCACTCCAGCCACCTGAAGTCCAAAAAGGGTCAGTCTACCTCCCGCCATAAAAAACTCATGTTCAAGACAGAAGGGCCTGACTCAGACTAA(SEQ ID NO：1)，其中：残基1-36为HIV-1的反式激活蛋白的47-57位肽(TAT)；残基37-207为缺氧诱导因子序列；残基208-1386为p53基因序列；残基1387-1389为终止密码子序列。 

上述融合体编码的融合蛋白为： 

MYGRKKRRQRRRMNPFSTQDTDLDLEMLAPYIPMDDDFQLRSFDQLSPLESSSASPESASPQSTVTVFQMEEPQSDPSVEPPLSQETFSDLWKLLPENNVLSPLPSQAMDDLMLSPDDIEQWFTEDPGPDEAPRMPEAAPRVAPAPAAPTPAAPAPAPSWPLSSSVPSQKTYQGSYGFRLGFLHSGTAKSVTCTYSPALNKMFCQLAKTCPVQLWVDSTPPPGTRVRAMAIYKQSQHMTEVVRRCPHHERCSDSDGLAPPQHLIRVEGNLRVEYLDDRNTFRHSVVVPYEPPEVGSDCTTIHYNYMCNSSCMGGMNRRPILTIITLEDSSGNLLGRNSFEVRVCACPGRDRRTEEENLRKKGEPHHELPPGSTKRALPNNTSSSPQPKKKPLDGEYFTLQIRGRERFEMFRELNEALELKDAQAGKEPGGSRAHSSHLKSKKGQSTSRHKKLMFKTEGPDSD(SEQ IDNO：2)，其中：残基1-12为HIV-1的反式激活蛋白的47-57位肽(TAT)； 残基13-69为缺氧诱导因子依赖性蛋白降解结构域序列；残基70-462为p53蛋白序列。 

本发明还将所述融合体插入表达载体中。该表达载体是将由DNA克隆技术构建的原核表达载体与上述融合蛋白基因表达盒相结合，构建成一个能在原核细胞中扩增、繁殖，表达的肿瘤抑制蛋白的融合序列。 

该表达载体可以是原核表达载体的任一种，其优选载体为pET28a。在一个优选实施方案中，本发明的融合体插入载体后得到pET-PTD-ODD-P53。 

本发明还涉及所述融合蛋白的表达、纯化及复性方法，包括：将编码所述融合蛋白和His标签的质粒，如pET质粒，转化宿主菌BL21(DE3)，培养在25℃～42℃，取出活化菌液，以5％～20％的比例在新鲜培养基中培养至OD600值为0.5～2.0，加入浓度为0.4～1mM的诱导剂IPTG，诱导时间为3～24h，收集诱导表达的菌体，PBS洗净，用pH8.5～11.5的10mmol/L Tris缓冲液重悬菌体，振荡混匀，置冰上超声10～15min破菌，然后回收包涵体。用6-10M尿素溶解，用镍柱或层析柱纯化包涵体。采用连续梯度法复性目的蛋白。 

还在另一方面，本发明提供了所述融合蛋白用于制备治疗实体瘤的药物中的用途。本发明特别涉及含有所述融合蛋白的药物组合物，为选自适于静脉注射、动脉注射、瘤内注射、肌肉注射、皮下注射、器官注射和胸腔、腹腔内注射的剂型。 

附图说明

图1：pET-PTD-ODD-P53构建示意图； 

图2：pET-PTD-ODD-P53经EcoR I和Sal I双酶切鉴定，其中 

标签1，pET-P53；2，pET-PTD-P53；3，pET-PTD-ODD-P53 

M，DNA Marker分别为500，1000，2000，3500，5500，7000bp； 

图3：pET-PTD-ODD-P53表达结果，其中标签1，含pET28a菌；2，，标准蛋白分子量； 

图4：PTD-ODD-P53 Western结果，其中TOP为PTD-ODD-P53，TP为PTD-P53。 

实施例 

本发明将通过下列实施例得到更清楚的说明。这些实施例只是说明性的，不应当理解成限制本发明的范围。 

实施例1 制备p53基因 

取人胎总RNA 1μg，按cDNA synthesis system操作指南依次加入反应成分。反应总体积20μl，42℃反应15min后，95℃灭活5min，作为PCR模板。以P7：GAGAATTCATGGAGGAGCCGCAGTC(SEQ ID NO：3)；P4：CCGTCGACTTAGTCTGAGTCAGGC(SEQ ID NO：4)为引物，PCR人全长p53基因。 

分别取载体pET28a和p53 PCR片段，用EcoR I和Sal I进行双酶切，37℃ 3h再用凝胶回收试剂盒回收。pET载体片段与p53片段以1∶3的比例混合，加3U的T4连接酶，16℃反应16h，将反应产物转化于感受态大肠杆菌DH5a中，挑取转化成功的菌落，提质粒PCR鉴定。阳性克隆命名为pET-p53。将pET-p53质粒转化于感受态大肠杆菌BL21中。 

实施例2 制备PTD-ODD-P53基因 

以实施例1中p53 PCR片段为模板，以P8：GAGAATTCATGTACGGCCGTAAAAAGAGACGCCAACGTAGACGTGCTATGGAGGAGCC(SEQ ID NO：5)；P4为引物进行PCR，经1％电泳后凝胶回收片段(PTD-P53)。 

用EcoR I和Sal I双酶切片段PTD-P53，37℃ 3h后用凝胶回收试剂盒回收。EcoR I和Sal I双酶切的pET载体片段与PTD-P53片段以1∶3的比例混合，加T4连接酶，16℃反应16h，将反应产物转化于感受态大肠杆菌DH5a中，挑取转化成功的菌落，提质粒PCR鉴定。阳性克隆命名为pET-PTD-P53。将pET-PTD-P53质粒转化于感受态大肠杆菌BL21中。 

采用重叠延伸法构建PTD-ODD-P53基因 

将P1：GAGAATTCATGTACGGCCGTAAAAAGAGACGCCAACGTAGACG(SEQ IDNO：6)；P2：TCATCATCCATTGGGATATAGGGAGCTAACATCTCCAAGTCTAAAGCACGTCTACGTTGGCG(SEQ ID NO：7)等量混合，加入PCR反应体系，反应30次，经2％电泳后凝胶回收片段(P1+P2)。 

以实施例1中p53 PCR片段为模板，以P3：TCCCAATGGATGATGACTTCCAGTTAGCTATGGAGGAGCCGCAGTC(SEQ ID NO：8)；P4为引物进行PCR，经1％电泳后凝胶回收片段(P3+p53)。 

将片段(P1+P2)与片段(P3+p53)等量混合，以P1、P4为引物进行PCR，经1％电泳后凝胶回收片段(PTD-ODD-P53)。 

用EcoR I和Sal I双酶切片段PTD-ODD-P53，37℃3h后用凝胶回收试剂盒回收。EcoR I和Sal I双酶切的pET载体片段与PTD-ODD-P53片段以1∶3的比例混合，加T4连接酶，16℃反应16h，将反应产物转化于感受态大肠杆菌DH5a中，挑取转化成功的菌落，提质粒PCR鉴定(图1、图2)。阳性克隆命名为pET-PTD-ODD-P53，其中PTD-ODD-P53的序列如SEQ ID NO：1所示。将pET-PTD-ODD-P53质粒转化于感受态大肠杆菌BL21中。 

实施例3.制备PTD-ODD-P53融合蛋白 

1.PTD-ODD-P53的表达 

分别挑取转化pET-PTD-ODD-P53的阳性菌落置LB培养液中(含卡拉霉素60g/ml)活化，再按5-20％接种于2YT培养液中，培养至OD600为0.5～2.0时，加入0.4～1mM IPTG诱导表达(图3)。收集诱导表达3～24h的菌体，PBS洗净。 

2.PTD-ODD-P53的Western鉴定 

经诱导表达获得的融合蛋白经聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析表明：沉淀中有目的蛋白，其分子量与理论值相符。经Western印迹，用P53单克隆抗体鉴定分析为PTD-ODD-P53(图4)。测序表明其具有SEQID NO：2的氨基酸序列。 

3.包涵体洗涤 

用磷酸缓冲液(pH 7.6)重悬，超声破菌，4℃ 10000rpm离心，沉淀部分用0.5-4M尿素，100mmol/L NaCl，20mmol/L Tris-HCl(pH8.0)洗涤4℃过夜。 

4.包涵体溶解及复性 

以10000转/分离心15分钟，收集沉淀，用6-10mol/L尿素(溶于20mmol/L三羟甲基胺基甲烷缓冲液pH 8.0-12.0)溶解，缓慢加入等体积复性液(含20mmol/L Tris，1mmol/L EDTA，0.1mmol/LGSH；0.01mol/L GSSG)，12000转/分离心15分钟，取上清装入8000-12000透析袋，置4-12℃中采用连续梯度透析法透析至复性液，用生理盐水透析3次。 

实施例4.PTD-ODD-P53活性测定 

1)PTD-ODD-P53过细胞膜试验 

将实施例3获得的PTD-ODD-P53融合蛋白加入SW480中，2h后以抗P53单克隆抗体为一抗做免疫组织化学检测，对照组分别用PTD-P53、P53加入SW480中，结果表明，PTD-ODD-P53、PTD-P53能进入细胞内，并以细胞核中分布为主。 

还研究了常氧条件下PTD-ODD-P53对细胞的影响，乏氧条件下PTD-ODD-P53对细胞的影响，以及PTD-ODD-P53对荷瘤动物的影响。 

发明效果 

利用基因工程、蛋白质纯化等手段，制备出具有穿膜活性、在缺氧环境中稳定及其他生物学活性的多重活性肽，并指导制备出具有药用价值的生物载体药物，PTD-ODD-P53在体外缺氧环境可以抑制肿瘤细胞生长，在体内可以抑制移植瘤在小鼠体内的生长，延长小鼠的存活时间。用于人类多种实体瘤的治疗，具有重要的医学研究及临床使用价值。 

                      序列表 

Claims (8)

1.一种基因融合体，其由蛋白转导域、缺氧诱导因子HIF-1的氧依赖性蛋白降解结构域、人肿瘤抑制基因组成，其如SEQ ID NO：1的序列所示。

2.由权利要求1的基因融合体编码的融合蛋白。

3.权利要求2的融合蛋白，其如SEQ ID NO：2的序列所示。

4.一种基因构建体，其含有权利要求1的基因融合体，以及表达载体。

5.权利要求4的基因构建体，其中所述表达载体为原核表达载体。

6.权利要求4的基因构建体，其中所述表达载体为pET28a。

7.权利要求4、5或6的基因构建体，其中基因融合体的上游为真核细胞启动子、原核细胞启动子或病毒启动子。

8.一种药物组合物，含有权利要求2或3的融合蛋白。

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