CH628813A5

CH628813A5 - Process for obtaining immunoglobulin

Info

Publication number: CH628813A5
Application number: CH428777A
Authority: CH
Inventors: Joergen Frederik Hansen
Original assignee: Nordisk Insulinlab
Priority date: 1976-04-06
Filing date: 1977-04-05
Publication date: 1982-03-31
Also published as: NO146763C; JPS52122620A; DE2713817A1; NL7703572A; FI771071A; GB1551865A; FI61191C; DD129451A5; DK139056B; FR2347379A1; CA1072444A; IL51782A0; IL51782A; NO146763B; BE852995A; AR211890A1; AU511474B2; FR2347379B1; DK139056C; DK162876A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Gewinnen von intravenös verabreichbarem Immunglobulin durch fraktioniertes Ausfallen von Blutplasma, Serum oder einer Fraktion desselben mit einem polykondensierten Di- oder Polyol. The invention relates to a method for obtaining intravenously administrable immunoglobulin by fractionally precipitating blood plasma, serum or a fraction thereof with a polycondensed diol or polyol.

Immunglobuline, hierunter Gammaglobuline, sind therapeutisch wichtig, da sie zur Herstellung immunisierender Präparate verwendbar sind. Immunoglobulins, including gamma globulins, are therapeutically important because they can be used to prepare immunizing preparations.

Immunglobulin findet sich in Blutplasma tierischen Ursprungs, aus dem es durch verschiedene Ausfällungs- und Reinigungsprozesse gewonnen werden kann. So kann beispielsweise Gammaglobulin in Form konzentrierter Lösungen mit Hilfe einer von Cohn et al., vgl. J. Clin. Invest. Immunoglobulin is found in blood plasma of animal origin, from which it can be obtained through various precipitation and purification processes. For example, gamma globulin in the form of concentrated solutions with the help of one of Cohn et al., Cf. J. Clin. Invest.

Chem. Soc. 68,479-75 (1946) entwickelten Methode gewonnen werden. Nach Cohn erhält man eine Fraktion II, d.h. ein 16,5%iges Konzentrat, das intramuskulär injizierbar ist. Chem. Soc. 68,479-75 (1946) developed method. According to Cohn, fraction II is obtained, i.e. a 16.5% concentrate that is injectable intramuscularly.

Bei dem erwähnten bekannten Verfahren entstehen Molekülaggregate von Gammaglobulin, so dass die Präparate zur intravenösen Verabreichung ungeeignet sind. Die Methode von Cohn umfasst ein Ausfällen mit Alkohol, der wasserverdrängend wirkt und zu einer irreversiblen Denaturierung führen kann, so dass das Globulin antikomplementär wirkt. Man hat versucht, dies mit Hilfe von besonderen Separationsprozessen und/oder durch chemische Modifikation des Gammaglobulins zu vermeiden. In the known method mentioned, molecular aggregates of gamma globulin are formed, so that the preparations are unsuitable for intravenous administration. Cohn's method involves precipitation with alcohol, which displaces water and can lead to irreversible denaturation, making the globulin anti-complementary. Attempts have been made to avoid this with the aid of special separation processes and / or by chemical modification of the gamma globulin.

Es ist ein verbesserter Fraktionierprozess bekannt, bei dem das Gammaglobulin mit Polyäthylenglykol (PEG) als Fällungsmittel aus dem Blutplasma ausgefallt wird, vgl. die USA Patentschrift 3 415 804. Durch diese Massnahme wird zwar die unerwünschte Denaturierung vermieden, die Reinheit des ausgefällten Erzeugnisses ist dabei jedoch unbefriedigend. An improved fractionation process is known in which the gamma globulin with polyethylene glycol (PEG) as a precipitant is precipitated from the blood plasma, cf. U.S. Patent 3,415,804. Although this measure avoids undesired denaturation, the purity of the precipitated product is unsatisfactory.

Gemäss der dänischen Patentanmeldung 6355/73 ist dieser Fällungsvorgang dadurch verbesserbar, dass statt Polyäthylenglykol ein Blockcopolymer von Äthylenoxid und Polyoxypropylenpolymer der in der Anmeldung ausführlicher angegebenen Art verwendet und bestimmte Fällungsbedingungen eingehalten werden. Dadurch kann bei der Gewinnung von Gammaglobulin die Ausbeute verbessert werden. Die ausgefällten Produkte weisen jedoch nicht immer eine zufriedenstellende Reinheit und genügend niedrige antikomplementäre Aktivität auf. According to the Danish patent application 6355/73, this precipitation process can be improved in that instead of polyethylene glycol, a block copolymer of ethylene oxide and polyoxypropylene polymer of the type specified in more detail in the application is used and certain precipitation conditions are observed. This can improve the yield in the production of gamma globulin. However, the precipitated products are not always of satisfactory purity and sufficiently low anti-complementary activity.

Die vorliegende Erfindung fusst auf der Beobachtung, dass das fraktionierte Ausfällen von Immunglobulinen, auch Gammaglobuline genannt, mit Hilfe von Polyäthylenglykol oder einem anderen polykondensierten Di- oder Polyol wesentlich spezifischer erfolgen kann, falls das Ausfällen in Gegenwart einer Mono- oder Polyalkansäure mit 4-12 Kohlenstoffatomen erfolgt, indem u.a. Fibrinogen und Lipoproteine entfernt werden. Die spezifische Wirkung der The present invention is based on the observation that the fractional precipitation of immunoglobulins, also called gamma globulins, with the aid of polyethylene glycol or another polycondensed di- or polyol can be carried out much more specifically if the precipitation occurs in the presence of a mono- or polyalkanoic acid with 4-12 Carbon atoms takes place by, among other things Fibrinogen and lipoproteins are removed. The specific effect of

Mono- oder Polyalkansäuren beim fraktionierten Ausfällen beruht offenbar darauf, dass mit dem Fibrinogen, den Lipoproteinen und anderen Begleitstoffen Salze oder salzartige Additionsprodukte gebildet werden, welche unter den gegebenen Bedingungen - im Gegensatz zu den Immunglobulinen - unlöslich sind und somit leicht abgetrennt werden können. Beim erfindungsgemässen Verfahren erhält man mit einfachen Mitteln überraschend reines Immunglobulin mit grosser Ausbeute, die der mit den besten der vorgenannten bekannten Methoden erreichbaren Ausbeute völlig entspricht. Mono- or polyalkanoic acids in fractional precipitates apparently rely on the fact that salts or salt-like addition products are formed with the fibrinogen, the lipoproteins and other accompanying substances, which, in contrast to the immunoglobulins, are insoluble under the given conditions and can therefore be easily separated. In the process according to the invention, surprisingly pure immunoglobulin is obtained in a simple manner with a large yield, which corresponds entirely to the yield obtainable with the best of the known methods mentioned above.

Das erfindungsgemässe Verfahren ist in Verbindung mit einem beliebigen polykondensierten Di- oder Polyglykol wie Polyäthylenglykol (PEG) mit verschiedenem Molekulargewicht, beispielsweise 2000-12 000, vorzugsweise 4000-6000, oder Polypropylenglykol durchführbar. Auch Copolymere von Äthylenoxid mit Propylenoxid oder Polyäthern sind verwendbar. The process according to the invention can be carried out in conjunction with any polycondensed di- or polyglycol such as polyethylene glycol (PEG) with different molecular weights, for example 2000-12000, preferably 4000-6000, or polypropylene glycol. Copolymers of ethylene oxide with propylene oxide or polyethers can also be used.

Als Mono- oder Polyalkansäure kann eine beliebige Alkan säure mit 4-12 Kohlenstoffatomen benutzt werden. Es wird eine Alkansäure mit 6-9 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise Caprylsäure bevorzugt. Andere geeignete Alkansäuren sind beispielsweise die Capronsäure und die Nonan-säure. Auch verzweigte Alkansäuren sind verwendbar. Werden höhere Alkansäuren mit beispielsweise 9-12 Kohlenstoffatomen benutzt, können zweckmässig eine oder mehrere zusätzliche Carboxylgruppen vorhanden sein, wodurch die Wasserlöslichkeit erhöht wird. Die gleiche Wirkung ist mit Alkansäuren mit anderen Substituenten, beispielsweise mit einer oder mehreren Hydroxylgruppen oder Aminogruppen, erzielbar. Any alkane acid with 4-12 carbon atoms can be used as the mono- or polyalkanoic acid. An alkanoic acid with 6-9 carbon atoms, preferably caprylic acid, is preferred. Other suitable alkanoic acids are, for example, caproic acid and nonanoic acid. Branched alkanoic acids can also be used. If higher alkanoic acids with, for example, 9-12 carbon atoms are used, one or more additional carboxyl groups can expediently be present, as a result of which the water solubility is increased. The same effect can be achieved with alkanoic acids with other substituents, for example with one or more hydroxyl groups or amino groups.

Der immunglobulinhaltigen Lösung werden zweckmässig 1-8 Gew.-% Polyäthylenglykol oder eines anderen polykondensierten Diols oder Polyols sowie 0,1-5 Gew.-% Caprylsäure oder einer anderen Alkansäure mit 4-12 Koh-lenstoffatomen beigemischt, indem das Ausfallen mit der Alkansäure erfindungsgemäss zweckmässig bei einem pH-Wert 3-7, vorzugsweise 4,5-5,5 erfolgt. The immunoglobulin-containing solution is expediently admixed with 1-8% by weight of polyethylene glycol or another polycondensed diol or polyol and 0.1-5% by weight of caprylic acid or another alkanoic acid with 4-12 carbon atoms by precipitating with the alkanoic acid expediently according to the invention at a pH of 3-7, preferably 4.5-5.5.

Das erfindungsgemässe Verfahren wird nachstehend anhand einiger Beispiele veranschaulicht. The method according to the invention is illustrated below with the aid of a few examples.

Beispiel 1 example 1

415ml humanes Blutplasma mit einem Gehalt von 10 g Immunglobulin per Liter Plasma wird auf einen pH-Wert von 5,0 eingestellt. Es wird PEG 3000 bis zu einer Konzentration von 6% zugesetzt. Die Lösung wird 45 Minuten abgestellt. Der hauptsächlich aus Fibrinogen bestehende Niederschlag wird abzentrifugiert, und die Flüssigkeitsphase wird auf pH 7,0 eingestellt. Nach dem Zusatz von weiterem PEG 3000 bis zu einer Konzentration von 12% wird 45 Minuten abgestellt. Das Gemisch wird zentrifugiert, und die Albumin und a- und ß-Globulin enthaltende flüssige Phase wird entfernt. Zur Erzielung einer Proteinkonzentration von etwa 4% wird der Rückstand bestehend aus unreinem Immunglobulin in einer 0,9%igen Natriumchloridlösung wieder gelöst. Die Lösung wird auf einem Seitz Ek-Filter bis zur Klarheit filtriert. Der gebildeten Lösung werden 5 g Caprylsäure und 30 g PEG 3000 per Liter Lösung zugesetzt, und es wird auf einen pH-Wert von 4,9 eingestellt. Nach zweistündigem Stehenlassen bei 20 °C wird das Gemisch zentrifugiert. Die flüssige Phase wird zur Erzielung einer klaren Lösung filtriert. Diese Lösung wird auf pH = 7,0 eingestellt, und es wird PEG 3000 bis zu einer Konzentration von 12% zugesetzt. Dabei fällt reines Immunglobulin aus, das durch Zentrifugieren und Trocknen gewonnen wird. Die Produktionsausbeute beträgt 60%. Die mit DISC PAGE (mit 5% Polyacrylamid) bestimmte Reinheit zeigt im wesentlichen nur zwei Bänder, die jeweils IgG und IgM entsprechen. Die 415 ml of human blood plasma with a content of 10 g of immunoglobulin per liter of plasma is adjusted to a pH of 5.0. PEG 3000 is added up to a concentration of 6%. The solution is turned off for 45 minutes. The precipitate consisting mainly of fibrinogen is centrifuged off and the liquid phase is adjusted to pH 7.0. After the addition of further PEG 3000 up to a concentration of 12%, it is switched off for 45 minutes. The mixture is centrifuged and the liquid phase containing albumin and α- and β-globulin is removed. To achieve a protein concentration of about 4%, the residue consisting of impure immunoglobulin is redissolved in a 0.9% sodium chloride solution. The solution is filtered on a Seitz Ek filter until clarity. 5 g of caprylic acid and 30 g of PEG 3000 per liter of solution are added to the solution formed, and the pH is adjusted to 4.9. After standing at 20 ° C for two hours, the mixture is centrifuged. The liquid phase is filtered to obtain a clear solution. This solution is adjusted to pH = 7.0 and PEG 3000 is added to a concentration of 12%. Pure immunoglobulin precipitates, which is obtained by centrifuging and drying. The production yield is 60%. The purity determined with DISC PAGE (with 5% polyacrylamide) essentially shows only two bands, each corresponding to IgG and IgM. The

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

3 3rd

Analyse wurde durch Auftragen von 500 [ig Produkt durchgeführt. Analysis was carried out by applying 500 µg of product.

Bei der Immunelektrophorese nach Grabar und Williams unter Verwendung von Kaninchenantikörpern gegen totales humanes Serumprotein sind im wesentlichen nur drei Bögen 5 vorhanden, die jeweils IgG, IgM und IgA entsprechen. In Grabar and Williams immunoelectrophoresis using rabbit antibodies to total human serum protein, there are essentially only three sheets 5, each corresponding to IgG, IgM and IgA.

Aus dem gereinigten Erzeugnis ist gewünschtenfalls durch dessen Lösen in 0,9% Salzwasser bis zu einer Proteinkonzentration von etwa 5% ein intravenös injizierbares Präparat herstellbar, das sich durch eine sehr niedrige antikom- 10 piementäre Aktivität auszeichnet und daher zur intravenösen Verabreichung besonders gut geeignet ist. If desired, an intravenously injectable preparation can be produced from the purified product by dissolving it in 0.9% salt water up to a protein concentration of about 5%, which is characterized by a very low anti-complementary activity and is therefore particularly suitable for intravenous administration .

Beispiel 2 Example 2

Das Verfahren gemäss Beispiel 1, wobei jedoch statt des 15 humanen Blutplasmas Schweineplasma verwendet wird. The method according to Example 1, but using pig plasma instead of the human blood plasma.

Beispiel 3 Example 3

Das Verfahren gemäss Beispiel 1, wobei jedoch statt des humanen Blutplasmas Blutserum verwendet wird. 20 The method according to Example 1, but using blood serum instead of the human blood plasma. 20th

628 813 628 813

Beispiel 4 Example 4

100 Liter Plasma oder Serum werden mit 100 Liter einer Lösung von 600 g/Liter PEG 3000 gemischt. Der pH-Wert wird auf 6,5 eingestellt. Der Niederschlag wird abzentrifu-giert und in 100 Liter destilliertem Wasser mit einem Zusatz von 0,015M NaCl wieder gelöst. Es werden 40 g PEG 3000 per Liter und 5 g Caprylsäure per Liter zugesetzt. Der pH-Wert wird auf 5,0 eingestellt. 45 Minuten abstellen. Der Niederschlag wird abzentrifugiert. Dem Zentrifugat werden weitere 40 g PEG 3000 per Liter zugesetzt. Der pH-Wert wird auf 7,5 eingestellt. Der Bodensatz wird abzentrifugiert und in destilliertem Wasser mit 0,002M NaCl wieder gelöst. Die Lösung wird klarfiltriert (beispielsweise mit dem Seitz® Ek-Filter). Die Proteinkonzentration muss 50-100 g/1 entsprechen. Es werden 20 g DEAE-Sephades-A25® per 100 g Protein zugesetzt. Nach einstündigem Hinstellen unter Umrühren wird das DEAE-Sephadex abfiltriert. Die Behandlung mit DEAE-Sephadex wird wiederholt. Nach dem Sterilfiltrieren erhält man ein antikomplementärfreies Immunglobulin G Präparat zur intravenösen Verabreichung. 100 liters of plasma or serum are mixed with 100 liters of a solution of 600 g / liter PEG 3000. The pH is adjusted to 6.5. The precipitate is centrifuged off and redissolved in 100 liters of distilled water with the addition of 0.015M NaCl. 40 g of PEG 3000 per liter and 5 g of caprylic acid per liter are added. The pH is adjusted to 5.0. Turn off for 45 minutes. The precipitate is centrifuged off. A further 40 g of PEG 3000 per liter are added to the centrifugate. The pH is adjusted to 7.5. The sediment is centrifuged off and redissolved in distilled water with 0.002M NaCl. The solution is filtered clearly (for example with the Seitz® Ek filter). The protein concentration must correspond to 50-100 g / 1. 20 g of DEAE-Sephades-A25® are added per 100 g of protein. After stirring for one hour, the DEAE-Sephadex is filtered off. Treatment with DEAE-Sephadex is repeated. After sterile filtration, an anti-complementary immunoglobulin G preparation for intravenous administration is obtained.

Claims

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1. A method for obtaining immunoglobulin by fractional precipitation of blood plasma, serum or a fraction thereof with a polycondensed di- or polyol, characterized in that the precipitation is carried out in the presence of a mono- or polyalkanoic acid having 4 to 12 carbon atoms.

2. The method according to claim 1, characterized in that the mono- or polyalkanoic acid is an alkanoic acid having 6 to 9 carbon atoms, preferably caprylic acid.

2nd

PATENT CLAIMS

3. The method according to claim 1 or 2, characterized in that the precipitation with the alkanoic acid is carried out at a pH of 3 to 7, preferably from 4.5 to 5.5.