Verfahren zur Herstellung eines hochaktiven blutgerinnungshemmenden Mittels.
Heparin, ein Polysaeeharid-Sehwefelsäure- ester, wird bekanntlich aus Lebern und Lun nen gewonnen. Für die Herstellung von Heparin sind versehiedene Verfahren bekanntgeworden. Den meisten Verfahren ist gemeinsam, dass in einer ersten Phase Rohware, das heisst sogenanntes Rohheparin, erhalten wird, aus dem nach versehiedenen Methoden Reinware, sogenanntes Reinheparin, gewonnen wird. Das Rohheparin ist ein Gemisch ver schiedener mehr oder weniger stark mit Schwefelsäure veresterter Mucoitinsäuren.
Für die Gewinnung des Rohheparins haben AI. H. Kuizenga und L. B. Spaulding (J. Biol.
Chem., Bd. 148 [1943], S. 641) beispielsweise folgende Vorschrift angegeben : Ochsenlungen werden bei Gegenwart von Ammonsulfat autolysiert und anschliessend mit Natronlauge extrahiert. Aus dem Extrakt wird durch Ansäuern mit Schwefelsäure eine Heparin-Eiweiss-Verbindung ausgefällt. Diese wird mit Natronlauge behandelt und aus der erhaltenen Lösung wird das Rohheparin (im folgenden Produkt C genannt) mit Aceton ausgefällt.
Aus 50 kg Frischlunge wurden so 102 g Roh- heparin mit einer Aktivität von 8, 3 I. E. lmg (= internationalen Einheiten) erhalten, entsprechend einer Ausbeute von 16 900 I. E. pro kg Lunge.
Die Reinigung dieses Rohheparins erfolgt beispielsweise durch Umfällen über das Benzidinsalz (F. Charles und A. R. Todd, Bioeh. J., Bd. 34 [1940], S. 112) oder über das Barium- salz in verdünnter Essigsäure (M. H. Kuizenga und L. B. Spaulding, l. c.). Bei der Reinigung über das Bariumsalz wurden beispielsweise aus 102 g Rohheparin à 8, 3 I. E. lmg 8, 83 g Bariumverbindung erhalten mit einer Aktivität von 85 I. E./mg, entsprechend einer Ausbeute von 88 /o, das heisst 15 000 I. E. pro kg Lunge.
Bei der Reinigung gehen in diesem Falle somit 12% der Aktivität des Rohheparins verloren. Bei der weiteren Reini- gung dieses Präparates durch fraktionierte Fällung mit Aeeton erhielten die gleichen Autoren ein Reinheparin à 125 I. E. lmg in einer Ausbeute von 65 /o, entsprechend 9750 I. E. pro kg Lunge. Insgesamt verliert man also beim Reinigungsprozess 40 /o der urspriinglieh vorhandenen Aktivität.
Wie J. E. Jorpes und S. Gardell (J. Biol.
Chem., Bd. 176 [1948], S. 267) ausführen, besteht das in Lungen und Lebern enthaltene Heparin aus mehr oder weniger sulfurierten Polysacchariden, den sogenannten Heparin mono-,-di-,-tri-und-tetra-sulfosäuren. Je mehr Sulfogruppen im Molekül enthalten sind, um so hoher ist die bintgerinnungshemmende Wirkung. Heparin-monosulfosäure hat beispielsweise nur eine Aktivität von 10 bis 20 I. E. ! mg. Oie wenig wirksamen Verbindungen werden bei der Reinigung abgetrennt, was zu dem oben erwähnten Aktivitätsverluste führt.
Das nach diesen Autoren abtrennbare Gemisch von Heparin-mono-und-disulfosäuren soll im folgenden Nebenprodukt B genannt werden.
Ein weiteres wenig aktives und verhält- nismässig schwefelarmes Nebenprodukt der Heparingewinnung erhält man durch Behan deln von Rohheparin mit Zinkehlorid oder Cadmiumchlorid in verdünntem Alkohol. Es soll im folgenden Nebenprodukt A genannt werden und ist nach dem in der deutsehen
Patentschrift Nr. 806994 beschriebenen Verfahren erhältlieh.
Wird die bei der Reinigung des Rohhepa- rins über das Benzidinsalz (Charles & Scott, Biochem. J. 30 [1936], Seite 1927) oder ber das Bariumsalz (Kuizenga & Spaulding l. c.) erhaltene llutterlauge mit 4 Volumteilen Aceton versetzt, so erhÏlt man einen Niedersehlag.
Diesen Niederschlag kann man in Wasser suspendieren, mit Sodalösung versetzen und ihn von der abgeschiedenen Benzidinbase bzw. vom gefällten Bariumcarbonat abfiltrieren. Die erhaltene Losung kann man auf pH = 6 stellen und die Mucoitinsäuren mittels Alkohol oder A. ceton fällen. Nach Abzentrifugieren und Trocknen erhÏlt man ein Produkt mit einem Titer von 0, 5 bis 1 I. E. /mg, das im folgenden Produkt D genannt werden soll.
Diese Verbindungen unterscheiden sich von hoehaktive. n Heparin hauptsächlieh dureh den niedrigeren Schwefelgehalt.
Es wurde nun gefunden, dass man durch Sulfurierung der genannten Produkte zu ge rinnungshemmenden Verbindungen gelangen kann, deren Aktivität derjenigen des reinen Heparins, das heisst der Heparin-trisulfosäure, entspricht.
Das Verfahren gemäss der Erfindung zur Herstellung eines hochaktiven blutgerinnungs- hemmenden Mittels ist dadurch gekennzeichnet, dass man ein aus tierischen Organen gewonnenes, wenig aktives Gemisch von Mucoi- tinsulfosäuren, in welchen pro Polysaccharid- molek l im Durchschnitt weniger als drei Schwefelsäureestergruppen vorhanden sind, bei Temperaturen zwischen 50 und 120¯ C f r kurze Zeit mit einem Sulfurierungsmittel behandelt, derart, dass ein als Mucoitinsulfo- sÏure praktiseh ausschliesslich die TrisulfosÏure enthaltendes Produkt entsteht.
Als Ausgangsmaterialien f r die Sulfu- rierung kommen in erster Linie in Frage :
A. Das mittels Zink-oder Cadmiumsalzen aus Losungen von Rohheparin in verdünntem Alkohol abtrennbare Nebenprodukt mit einem Schwefelgehalt von etwa 5 O/o und einem Titer von etwa 50 I. EJmg (Nebenprodukt A).
B. Die Heparinmonosulfosäure mit einem Sehwefelgehalt von etwa 6 %und einem Titer von etwa 15 bis 20 I. E./mg sowie die Heparindisulfosäure mit einem Schwefelgehalt von etwa 10 /o und einem Titer von etwa 50I. E./mg (Nebenprodukt B).
C. Das mit Alkohol oder Aceton fällbare sogenannte Rohheparin (Sehwefelgehalt um 8"/o ; Titer um 10 I. E./mg) (Produkt C).
D. Der aus den beim Reinigen von Rohheparin anfallenden Mutterlaugen gewonnene Anteil mit einem Sehwefelgehalt von etwa (i /o und einer Aktivität von etwa 0, 1 bis l I. E./mg (Produkt D).
Die genannten Produkte der Heparingewinnung können einzeln oder gesamthaft sulfuriert werden.
Die Sulfurierung kann in iiblicher Weise in Pyridin, a-Picolin usw. unter Verwendung von Chlorsulfonsäure als Snlfurierungsmittel erfolgen.
Bei der Isolierung der sulfurierten Verbindung aus dem Reaktionsgemisch bereitet die Eliminierung des überschüssigen Sulfurle- rungsmittels gewisse Schwierigkeiten. Gemäss den Angaben von P. Karrer (Helv. Chim.
Acta, Bd. 26 [1943], S. 1296) wird die Ent fernung der Schwefelsäure zum Beispiel durch Dialysieren erreicht. Es wurde nun gefunden, dass man die Eliminierung des übersehüssigen Sulfurierungsmittels auf einfache Weise dadurch erreiehen kann, dass die sulfurierten Verbindungen mittels Alkaloiden, wie Bruein, Narcotin usw., ans dem Snlfurierungsgemisch ausgefällt werden.
Es ist zwar bekannt, dass durch Sulfurie- rung anderer natürlieher oder künstlieher bochpolymerer Stoffe Verbindungen mit blutgerinnungshemmender Wirkung hergestellt werden können. Die blutgerinnungshemmende Wirkung synthetischer Polysaecharid-Sehwe- felsäureester wurde durch Bergström (Ztschr. physiol. Chem., Bd. 238 [1936], S. 163) entdeckt. Durch Sulfurierung von Zellulose, Stärke, Chitin, Pektin u. a. mittels Chlorsulfonsäure erhielt er Präparate, deren Wirksamkeit 5-bis 20mal kleiner war als diejenige des Heparins. Chargaff (J. Biol.
Chem., Bd. 115 [1936], S. 155) stellte fest, dass die Sktivität von Zelluloseschwefelsäureester und Polyvinylalkohol-Schwefelsäureester nur etwa lA derjenigen des Heparins beträgt. Aus- gehend von Zellulose erhielt P. Karrer (Helv.
Chim. Acta, Bd. 26 [1943], S. 1296) Produkte mit einem Sehwefelgehalt von 18 bis 20 /o und einem Titer von 25 I. E./mg, aus Chon droitinsehlvefelsäure solehe mit einem Titer von 17 I. E. lmg. Ihre Aktivität lag also ebenfalls wesentlich unter derjenigen des Heparins, das einen Titer von etwa 130 I. E./mg besitzt.
Auch Astrup (Acta Physiol. Scand., Bd. 8 ['1944], S. 215) kommt zum Ergebnis, dass Zellulose-trischwefelsäureester und Chitindisulfosäure wesentlich weniger aktiv sind als Heparin. Alle diese blutgerinnungshemmenden Mittel sind im Gegensatz zu den gemäss der vorliegenden Erfindung erhaltenen entweder nur sehr wenig aktiv oder wegen ihren toxischen Nebenwirkungen unbrauchbar.
Nach dem neuen Verfahren erhält man in bisher nicht erreiehter Ausbeute (50 000 I. E. und mehr aus 1 kg Lunge) blutgerinnungs- hemmende Stoffe, welche f r therapeutische Zwecke geeignet sind.
Beispiel 1 : 1 Gewichtsteil Nebenprodukt A wird mit einer 800 C warmen Lösung von 1 Raumteil Chlorsulfonsäure in 10 Raumteilen Pyridin verrührt. Man lässt etwa 10 Minuten stehen und giesst die überstehende Lösung ab. Der Rüekstand wird in 100 Teilen Wasser gelost und die Lösung durch Zusatz von Salzsäure auf PH = 3 gestellt. Man versetzt sofort unter Rühren mit 50 Raumteilen einer 10pro zentigen wässerigen Lösung von Narcotinchlor- hydrat, wobei das Narcotinsalz des Schwefelsäureesters in groben Flocken ausfällt.
Nun wird zentrifugiert und der Rüekstand dreimal mit je 10 Raumteilen einerwässerigen, 1 /oigen Narcotinchlorhydratlosung ausgewaschen. Man verrührt das Narcotinsalz mit 10 Teilen Wasser und versetzt mit 10 Raumteilen l0prozen- tiger Sodalosung. Die ausgeschiedene Narco- tinbase wird abgenutseht, das Filtrat mit Essigsäure auf pg = 6 gestellt und der Schwe- felsäureester mit dem doppelten Volumen llethanol ausgefällt. Nach dem Trocknen, mit Alkohol und.
¯ther erhält man 1, 1 Gewichtsteile eines Präparates, das bei einem Schwefelgehalt von 14, 5 /o einen Titer von 130 I. EJmg aufweist und somit dem internationalen Heparinstandard entspricht.
Beispiel 2 : 1 Gewichtsteil Nebenprodukt B wird portionenweise in eine 700 C warme Lösung von 2 Raumteilen Chlorsulfonsäure in 10 Raum- teilen a-Picolin eingetragen. Man rührt 4 Stunden bei 700 C und versetzt mit 100 Teilen Wasser. Die klare Lösung wird mit 4 Raumteilen konzentrierter Salzsäure auf PEX = 3 gestellt und unter Rühren mit 80 Raumteilen einer lOprozentigen wässerigen Lösung von Brucinchlorhydrat versetzt.
Das Brucinsalz des gebildeten Schwefelsäureesters wird abzentrifugiert und dreimal mit je 10 Raumteilen einer lprozentigen wässerigen Losung von Brucinehlorhydrat ausgewaschen.
Man zerlegt das Brucinsalz mit 20 Raum- teilen 5prozentiger Natronlauge und trennt von der ausgeschiedenen Brucinbase ab. Das Filtrat wird mit Essigsäure auf pH = 5 gestellt und der Schwefelsäureester mit dem doppelten Volumen Äthylalkohol ausgefällt.
Nach dem Trocknen mit Alkohol und Äther erhält man 1, ? Gewichtsteile eines Präparates s mit einem Titer von 120 I. E. lmg.
Beispiel 3 : 1 Gewichtsteil Produkt C wird portionenweise in eine 100 C warme Lösung von 2 Raumteilen Chlorsulfonsäure in 10 Raumteilen Pyridin eingetragen. Man lässt 15 Minuten stehen und versetzt mit 100 Teilen Was- ser. Die Losung wird mit konzentrierter Salzsäure auf PH = 3 gestellt und mit 80 Raum- teilen einer 10prozentigen wässerigen Lösung von Narcotinchlorhydrat versetzt. Man zentrifugiert, wäscht das Narcotinsalz dreimal mit je 10 Raumteilen einer lprozentigen wÏsserigen Losung von Nareotinchlorhydrat aus. Der Rüekstand wird mit 20 Raumteilen 5prozen- tiger Sodalosung zerlegt.
Man trennt von der ausgesehiedenen Narcotinbase ab, stellt das Filtrat mit Essigsäure auf pH = 5 und fÏllt den Sehwefelsäureester mit dem doppelten Volumen Methanol aus. Nach dem Trocknen mit Alkohol und Äther erhÏlt man 1 Gewiehtsteil eines Präparates mit einem Titer von 110 I. E./mg und einem Schwefelgehalt un 14, 2 %
Beispiel 4 : 1 Gewichtsteil Produkt D wird mit 2 Raum- teilen Chlorsulfonsäure in 10 Raumteilen Pyridin 5 Stunden bei 600 C ger hrt. Man versetzt mit 200 Teilen Wasser und stellt mit konzentrierter Salzsäure auf pH = 3, 5.
Das Sulfurierungsprodukt wird durch Zusatz von 80 Raumteilen einer 1Oprozentigen wässerigen Lösung von Narcotinchlorhydrat ausgefäilt.
Der Niedersehlag wird abgenutscht und dreimal mit je 10 Raumteilen einer lprozentigen Narcotinchlorhydratlosung ausgewaschen. Das Narcotinsalz wird mit 20 Raumteilen 5prozen- tiger Sodalosung verrührt und die ausgescnie- dene Nareotinbase abgetrennt. Das Sulfure- rungsprodukt wird aus dem Filtrat naeli Einstellen auf pli = 5 mittels 2 Raumteilen Al kohol ausgefällt. Nach dem Trocknen mit Al- kohol und Äther erhält man 1, 1 Gewichtsteile e eines Präparates mit einem Titer von 135 I. EJmg. Der Schwefelgehalt beträgt 13, 1 /o.
Process for the preparation of a highly active anticoagulant agent.
As is well known, heparin, a polysacid sulfuric acid ester, is obtained from livers and lunas. Various processes have become known for the production of heparin. Most of the processes have in common that in a first phase raw material, i.e. so-called raw heparin, is obtained, from which pure material, so-called pure heparin, is obtained by various methods. The raw heparin is a mixture of various mucoitic acids that are more or less strongly esterified with sulfuric acid.
For the extraction of the raw heparin, AI. H. Kuizenga and L. B. Spaulding (J. Biol.
Chem., Vol. 148 [1943], p. 641), for example, the following rule is given: Ox lungs are autolyzed in the presence of ammonium sulfate and then extracted with sodium hydroxide solution. A heparin-protein compound is precipitated from the extract by acidification with sulfuric acid. This is treated with sodium hydroxide solution and the crude heparin (hereinafter referred to as product C) is precipitated from the resulting solution with acetone.
102 g of crude heparin with an activity of 8.3 IU 1 mg (= international units) were thus obtained from 50 kg of fresh lung, corresponding to a yield of 16,900 IU per kg of lung.
This raw heparin is purified, for example, by reprecipitation using the benzidine salt (F. Charles and AR Todd, Bioeh. J., Vol. 34 [1940], p. 112) or using the barium salt in dilute acetic acid (MH Kuizenga and LB Spaulding , lc). When purifying with the barium salt, for example, from 102 g of raw heparin of 8.3 I.U. 1mg, 8.33 g of barium compound were obtained with an activity of 85 I.U./mg, corresponding to a yield of 88 / o, i.e. 15,000 I.U. per kg of lung.
In this case, 12% of the activity of the raw heparin is lost during cleaning. In the further purification of this preparation by fractional precipitation with acetone, the same authors obtained pure heparin of 125 IU 1 mg in a yield of 65%, corresponding to 9750 IU per kg of lung. Overall, you lose 40 / o of the activity that was originally present in the cleaning process.
As J. E. Jorpes and S. Gardell (J. Biol.
Chem., Vol. 176 [1948], p. 267), the heparin contained in the lungs and livers consists of more or less sulfurized polysaccharides, the so-called heparin mono-, di-, tri- and tetra-sulfonic acids. The more sulfo groups there are in the molecule, the greater the anti-coagulant effect. Heparin monosulfonic acid, for example, only has an activity of 10 to 20 I.U.! mg. The inactive compounds are separated off during purification, which leads to the above-mentioned loss of activity.
The mixture of heparin mono- and disulfonic acids which can be separated off according to these authors is to be named by-product B in the following.
Another less active and relatively low-sulfur by-product of heparin production is obtained by treating raw heparin with zinc chloride or cadmium chloride in dilute alcohol. It is to be called by-product A in the following and is after that in German
The method described in U.S. Patent No. 806994 is available.
If 4 parts by volume of acetone are added to the mother liquor obtained in the purification of the raw heparin via the benzidine salt (Charles & Scott, Biochem. J. 30 [1936], page 1927) or via the barium salt (Kuizenga & Spaulding lc) a downfall.
This precipitate can be suspended in water, mixed with soda solution and filtered off from the separated benzidine base or from the precipitated barium carbonate. The solution obtained can be adjusted to pH = 6 and the mucoitic acids precipitated using alcohol or A. cetone. After centrifugation and drying, a product with a titer of 0.5 to 1 I.U. / mg, which is to be called product D below, is obtained.
These compounds are different from highly active ones. n Heparin mainly due to the lower sulfur content.
It has now been found that by sulfurizing the products mentioned it is possible to obtain anticoagulant compounds whose activity corresponds to that of pure heparin, that is to say of heparin trisulfonic acid.
The method according to the invention for the production of a highly active anticoagulant agent is characterized in that a poorly active mixture of mucoitinsulfonic acids obtained from animal organs, in which there are on average less than three sulfuric acid ester groups per polysaccharide molecule, is added Treated at temperatures between 50 and 120¯ C for a short time with a sulphurizing agent in such a way that a mucoitin sulphonic acid practically exclusively contains trisulphonic acid.
The main starting materials for the sulphuration are:
A. The by-product which can be separated from solutions of crude heparin in dilute alcohol by means of zinc or cadmium salts and has a sulfur content of about 5% and a titer of about 50 I / O (by-product A).
B. Heparin monosulfonic acid with a sulfur content of about 6% and a titer of about 15 to 20 I.U./mg and heparin disulfonic acid with a sulfur content of about 10 / o and a titer of about 50I. E./mg (by-product B).
C. The so-called raw heparin which can be precipitated with alcohol or acetone (sulfur content around 8 "/ o; titer around 10 IU / mg) (product C).
D. The portion obtained from the mother liquors obtained when cleaning raw heparin with a sulfur content of about (i / o and an activity of about 0.1 to 1 I.U./mg (product D).
The heparin recovery products mentioned can be sulfurized individually or as a whole.
The sulphuration can be carried out in the usual way in pyridine, a-picoline etc. using chlorosulphonic acid as the sulphurizing agent.
When isolating the sulfurized compound from the reaction mixture, the elimination of the excess sulfurizing agent presents certain difficulties. According to the information provided by P. Karrer (Helv. Chim.
Acta, Vol. 26 [1943], p. 1296) the removal of sulfuric acid is achieved, for example, by dialysis. It has now been found that the excess sulphurizing agent can be eliminated in a simple manner by precipitating the sulphurized compounds from the sulphurizing mixture by means of alkaloids such as bruein, narcotine, etc.
It is known that the sulfurization of other natural or artificial polymeric substances can produce compounds with an anti-coagulant effect. The anticoagulant effect of synthetic polysaccharide sulfuric acid esters was discovered by Bergström (Ztschr. Physiol. Chem., Vol. 238 [1936], p. 163). By sulfurizing cellulose, starch, chitin, pectin, etc. a. by means of chlorosulfonic acid he obtained preparations whose effectiveness was 5 to 20 times less than that of heparin. Chargaff (J. Biol.
Chem., Vol. 115 [1936], p. 155) found that the activity of cellulose sulfuric acid ester and polyvinyl alcohol-sulfuric acid ester is only about 1A that of heparin. Starting from cellulose, P. Karrer (Helv.
Chim. Acta, Vol. 26 [1943], p. 1296) products with a sulfur content of 18 to 20 / o and a titer of 25 IU / mg, from chon droitinsehlvefelsäure solehe with a titer of 17 IU lmg. Their activity was therefore also significantly below that of heparin, which has a titer of about 130 I.U./mg.
Astrup (Acta Physiol. Scand., Vol. 8 ['1944], p. 215) comes to the conclusion that cellulose trisulfuric acid ester and chitin disulfonic acid are much less active than heparin. In contrast to those obtained according to the present invention, all of these anticoagulant agents are either only very slightly active or unusable because of their toxic side effects.
According to the new process, blood-coagulation-inhibiting substances which are suitable for therapeutic purposes are obtained in unprecedented yield (50,000 I.U. and more from 1 kg of lung).
Example 1: 1 part by weight of by-product A is stirred with a solution of 1 part by volume of chlorosulfonic acid in 10 parts by volume of pyridine at 800 ° C. It is left to stand for about 10 minutes and the supernatant solution is poured off. The residue is dissolved in 100 parts of water and the solution is adjusted to pH 3 by adding hydrochloric acid. 50 parts by volume of a 10 percent aqueous solution of narcotine chlorohydrate are added immediately with stirring, the narcotine salt of the sulfuric acid ester precipitating in coarse flakes.
It is now centrifuged and the residue is washed out three times with 10 parts by volume of an aqueous, 1 / o narcotine chlorohydrate solution. The narcotine salt is stirred with 10 parts of water and 10 parts by volume of 10 percent sodium carbonate solution are added. The precipitated narcotine base is removed, the filtrate is adjusted to pg = 6 with acetic acid and the sulfuric acid ester is precipitated with twice the volume of ethanol. After drying, with alcohol and.
This gives 1.1 parts by weight of a preparation which, with a sulfur content of 14.5 / o, has a titer of 130 I. EJmg and thus corresponds to the international heparin standard.
Example 2: 1 part by weight of by-product B is introduced in portions into a 700 ° C. solution of 2 parts by volume of chlorosulfonic acid in 10 parts by volume of α-picoline. The mixture is stirred for 4 hours at 700 ° C. and 100 parts of water are added. The clear solution is adjusted to PEX = 3 with 4 parts by volume of concentrated hydrochloric acid, and 80 parts by volume of a 10 percent aqueous solution of brucine chlorohydrate are added while stirring.
The brucine salt of the sulfuric acid ester formed is centrifuged off and washed three times with 10 parts by volume of a 1 percent aqueous solution of brucine chlorohydrate.
The brucine salt is broken down with 20 parts by volume of 5% sodium hydroxide solution and separated from the brucine base which has separated out. The filtrate is adjusted to pH = 5 with acetic acid and the sulfuric acid ester is precipitated with twice the volume of ethyl alcohol.
After drying with alcohol and ether, 1,? Parts by weight of a preparation with a titer of 120 I.U. 1mg.
Example 3: 1 part by weight of product C is introduced in portions into a 100 ° C. solution of 2 parts by volume of chlorosulfonic acid in 10 parts by volume of pyridine. The mixture is left to stand for 15 minutes and 100 parts of water are added. The solution is adjusted to pH 3 with concentrated hydrochloric acid and 80 parts by volume of a 10 percent aqueous solution of narcotine chlorohydrate are added. It is centrifuged and the narcotine salt is washed three times with 10 parts by volume of an 1% aqueous solution of nareotine chlorohydrate. The residue is broken down with 20 parts by volume of 5 percent soda solution.
The narcotine base is separated off, the filtrate is adjusted to pH = 5 with acetic acid and the sulfuric acid ester is precipitated with twice the volume of methanol. After drying with alcohol and ether, 1 part by weight of a preparation with a titer of 110 I.U./mg and a sulfur content of 14.2%
Example 4: 1 part by weight of product D is stirred with 2 parts by volume of chlorosulfonic acid in 10 parts by volume of pyridine at 600 ° C. for 5 hours. 200 parts of water are added and the pH is adjusted to 3.5 with concentrated hydrochloric acid.
The sulfurization product is precipitated by adding 80 parts by volume of a 10 percent aqueous solution of narcotine chlorohydrate.
The lower part is sucked off and washed three times with 10 parts by volume of a 1 percent narcotine chlorohydrate solution. The narcotine salt is mixed with 20 parts by volume of 5 percent soda solution and the narcotine base separated out. The sulphuration product is precipitated from the filtrate after adjusting to pli = 5 using 2 parts by volume of alcohol. After drying with alcohol and ether, 1.1 parts by weight of a preparation with a titer of 135 IU mg are obtained. The sulfur content is 13.1 / o.