BRPI0707824A2

BRPI0707824A2 - proteÍna de ligaÇço a antÍgeno, e, mÉtodos de neutralizaÇço da ativaÇço de um receptor de tirosina quinase, de inibiÇço de angiogÊnese, de reduÇço de crescimento de tumor e de produÇço de uma proteÍna de ligaÇço a antÍgeno

Info

Publication number: BRPI0707824A2
Application number: BRPI0707824-2A
Authority: BR
Inventors: Zhenping Zhu
Original assignee: Imclone Systems Inc
Priority date: 2006-02-15
Filing date: 2007-02-15
Publication date: 2011-05-10
Also published as: AU2007215013A1; EA200870265A1; JP2009526857A; KR20080106245A; CN101432015A; NO20083785L; CA2638794A1; MX2008010561A; WO2007095338A2; EP1986684A2; WO2007095338A3

Abstract

PROTEINA DE LIGAÇçO A ANTÍGENO, E, METODOS DE NEUTRALIZAÇçO DA ATIVAÇçO DE UM RECEPTOR DE TIROSINA QUINASE, DE INIBIÇçO DE ANGIOGÊNESE, DE REDUÇçO DE CRESCIMENTO DE TUMOR E DE PRODUÇçO DE UMA PROTEÍNA DE LIGAÇçO A ANTÍGENO A invenção é dirigida a novos anticorpos que compreende sítios de ligação de domínio único. Os anticorpos podem ser bivalentes ou multivalentes, e podem ser biespecificos. A invenção é ainda dirigida a anticorpos monoespecíficos e biespecificos, que ligam a mPDGFR<244>. Os anticorpos podem ser administrados sozinhos ou em combinação com drogas antiangiogénicas ou antineoplásícas.

Description

"PROTEÍNA DE LIGAÇÃO A ANTÍGENO, E, MÉTODOS DENEUTRALIZAÇÃO DA ATIVAÇÃO DE UM RECEPTOR DE TIROSINAQUINASE, DE INIBIÇÃO DE ANGIOGÊNESE, DE REDUÇÃO DECRESCIMENTO DE TUMOR E DE PRODUÇÃO DE UMA PROTEÍNADE LIGAÇÃO A ANTÍGENO"

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

Este pedido reivindica prioridade para pedido US 60/773.994,depositado em 15 de fevereiro de 2006, que é aqui incorporado por referênciaem sua totalidade.

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção é dirigida a novos anticorpos, quecompreendem sítios de ligação a domínio único. Os anticorpos podem serbivalentes ou multivalentes, e podem ser específicos ou multiespecíficos.Também são descritos anticorpos biespecíficos e multiespecíficos que ligam aproteínas de receptor de superfície. Quando administrados a um indivíduosozinhos ou em combinação com fármacos angiogênicas ou antineoplásicas,os anticorpos podem ser usados para inibir o crescimento de tumores bemcomo inibir as doenças hiperproliferativas.

ANTECEDENTES

Anticorpos biespecíficos (BsAb) são moléculas baseadas emimunoglobulina (Ig) que ligam a dois epítopos diferentes nos mesmos ou emantígenos distintos. Tanto os estudos de laboratório como clínicos recentesdemonstram que BsAb pode ter aplicações significativas em terapia decâncer, por exemplo marcando no alvo as células de tumor com agentescitotóxicos como células efetoras, radionuclídeos, fármacos e toxinas (Weineret al., 1997, Câncer Immunol. Immunother. 45: 190-2; van Spriel et al., 2000,Immunol. Today 21: 391-7; Segai et al., 2000, J. Immunol. Methods 248: Ι-ό), ou marcando simultaneamente dois alvos de tumor diferentes (ouepítopos) a fim de melhorar as atividades biológicas de terapêuticos deanticorpos individuais (Lu et ai., 1999, J. Immunol. Methods 230: 159-71; Luet al., 2001, Câncer Res. 61: 7002-8; Lu et al., 2002, J. Immunol. Methods267: 213-26). Um obstáculo principal no desenvolvimento de agentesterapêuticos com base em BsAb é a dificuldade em produzir os materiais comqualidade e quantidade suficientes para estudos clínicos via métodostradicionais, incluindo hibridoma híbrido e conjugação química (Carter et al.,1995, J. Hemotherapy 4: 463-70). A co-expressão de dois conjuntosdiferentes de cadeias leves e pesadas de IgG pode resultar em uma variedadede pares de cadeias leves e pesadas, somente um dos quais é o heterodímerobiespecífico funcional desejado (Suresh et al., 1986, Methods Enzymol. 121:210-28). Por outro lado, a reticulação química de dois IgGs ou seusfragmentos é com freqüência ineficiente e pode levar à perda de atividade doanticorpo (Zhu et al., 1994, Câncer Lett. 86: 127-34). Em ambos os métodos,a purificação de BsAb de espécies não naturais, como homodímeros eheterodímeros com pares errados de cadeias leves e pesadas de Ig nãocognatas produzidos pelo hibridoma híbrido, e agregados multiméricosresultantes de conjugação química, é com freqüência difícil e o rendimento égeralmente baixo (Cao et al., 1998, Bioconj. Chem. 9: 635-44).

Para melhorar a eficiência, vários métodos recombinantesforam desenvolvidos para a produção de BsAb, tanto como fragmentos deanticorpos (Carter et al., 1995; Pluckthun et al., 1997, Immunotechnology 3:83-105; Todorovska et al., 2001, J. Immunol. Methods 248: 47-66) comoformatos de IgG de comprimento completo (Carter, 2001, J. Immunol.Methods 248: 7-15). Por exemplo, a produção de BsAb de tipo de IgG decomprimento completo, homogênea, é obtida pela assim chamada engenhariade "nós-em-furos" para a heterodimerização eficiente do domínio Ch3(Ridgway et al., 1996, Protein Eng. 9: 617-21; Merchant et al., 1998, Nat.Biotech. 16: 677-81) e fusionando dois Fv de cadeia única (scFv) deespecificidades diferentes em qualquer um dos términos N ou C de umamolécula de IgG de comprimento completo (Zhuang et al., 2000, Protein Eng.13: 361-7; Coloma e Morrison, 1997, Nat. Biotechnol. 15: 159-63). Os BsAbstambém são construídos fusionando geneticamente Fv de cadeia única (scFv)ou fragmentos Fab com ou sem o uso de ligadores flexíveis (Mallender et al.,1994, J. Biol. Chem. 269: 199-206; Mack et al., 1995. Proc. Natl. Acad. Sei.USA. 92: 7021-5; Zapata et al., 1995, Protein Eng. 8: 1057-62), via umdispositivo de dimerização como zipper de leucina (Kostelny et al., 1992, J.Immunol. 148: 1547-53; de Kruifet al., 1996, J. Biol.. Chem. 271: 7630-4), edomínios CL/CHI de Ig (Muller et al., 1998, FEBS Lett. 422: 259-64); pordiacorpo (Holliger et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 90: 6444-8; Zhuet al., 1996, Bio/Technology (NY) 14: 192-6); fusão Fab-scFv (Lu et al.,2002; Schoonjans et al., 2000, J. Immunol. 165: 7050-7); e formatos de mini-anticorpos (Pack et al., 1992, Biochemistry 31: 1579-84; Pack et al., 1993,Bio/Technology 11; 1271-7). Na maioria dos casos, estas abordagensrecombinantes resultam na produção de moléculas de anticorpos biespecíficosdivalentes que são monovalentes em cada um dos antígenos alvo. Além disso,os exemplos de anticorpos biespecíficos de tipo de a IgG compreendendodomínios Fc funcionais são limitados.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A invenção provê novos anticorpos biespecíficos quecompreendem sítios de ligação a antígeno de domínio variável único (sVD).Os anticorpos da invenção também podem incluir sítios de ligação a antígenoque compreendem sítios de ligação a anticorpos Fvs além de sítios de ligaçãoa antígenos VD.

Anticorpos da invenção podem ser específicos para qualquerantígeno. Em uma forma de realização, um anticorpo da invenção liga-se aum antígeno de superfície de célula, que pode ser um receptor tirosina quinase(incluindo, mas não limitado a PDGFR, VEGFRl, VEGFR2, EGFR). Emuma outra forma de realização, um anticorpo da invenção liga um ligando deum receptor de superfície de célula. Em uma forma de realização preferida,um anticorpo da invenção tem atividade de neutralização de receptor. Ainvenção ainda provê composições farmacêuticas dos anticorpos.

A presente invenção provê métodos para a inibição da ativaçãode um ou mais receptores tirosina quinases. O crescimento de tumor em ummamífero pode ser tratado ou inibido administrando-se ao mamífero umaquantidade eficaz de um anticorpo presente. Os anticorpos presentes podemser co-administrados com anticorpos que se ligam a outro antígeno desuperfície de célula (incluindo, por exemplo, RTKs) ou citoquinas (incluindo,por exemplo, ligandos de RTK). Em determinadas formas de realização, osmétodos também compreendem a administração ao mamífero de um agenteantineoplásico ou tratamento, incluindo, por exemplo, um agentequimioterapêutico e/ou radiação. Em uma outra forma de realização, ainvenção provê um método para o tratamento de uma doençahiperproliferativa não câncer, por exemplo, psoríase, em um mamífero.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

A figura 1 é um diagrama esquemático mostrando exemplos deproteínas de ligação a antígeno biespecíficas baseadas em anticorpo dedomínio único da invenção. O domínio único (designado VH2 no desenho)pode ser incorporado por fusão aos término N ou término C de outrosdomínios de anticorpos.

A figura 2 mostra a expressão e purificação de Fabsespecíficos de mPDGFRa. Os Fabs foram expressados em células HB2151hospedeiras de E. coli, purificados por cromatografia de afinidade eanalisados por SDS-PAGE. A) Fabs específicos de mPDGFRa "padrão"tendo cadeias pesadas (Vh-ChI) e leves (Vl-Cl) de peso molecular similar. B)Fragmentos de Fab 1F2 e 1F9 faltando domínios Vl e um controle de Fabpadrão na presença ou ausência de DTT. Os marcadores de peso molecularsão expressos em kilodaltons.A figura 3 mostra testes de ligação e de bloqueio de Fabspurificados. A) ELISA de ligação quantitativo de Fabs purificados emPDGFRa de murino. Várias quantidades de Fabs foram primeiro incubadasem uma placa de 96 cavidades pré-revestida com proteína de fusãomPDGFRa-Fc seguido por incubação com um conjugado de anticorpo - HRPanti-anti-humano- κ de coelho. Anticorpo - HRP ligado à placa foiquantificado pela adição de substrato de peroxidase, e a absorbância foi lida aA450 nm. B) Inibição da ligação de mPDGFRa a PDGF-AA imobilizado porFabs purificados. Várias quantidades de Fabs foram incubadas com umaquantidade fixa de mPDGFRa /Fc em solução. As misturas foram incubadasem placas de 96 cavidades revestidas com PDGF-AA seguido pelo conjugadoanticorpo-HRP anti-humano-Fc. mPDGFRa ligado foi então quantificadopela adição de substrato de peroxidase, e a absorbância foi lida a A450 nm. Osdados mostrados representam a média ± desvio padrão de amostras emduplicata.

A figura 4 descreve estruturas de Fabs monovalentes ebivalentes da invenção.

A figura 5 mostra a expressão e purificação de Fabsespecíficos de mPDGFRa bivalentes. Os Fabs foram expressados em célulasHB2151 hospedeiras de E. Coli, purificadas por cromatografia de afinidade, eanalisadas por SDS-PAGE. Fab 1F2-2H bivalente é comparado com um Fabpadrão (5C5) em condições não redutoras. Os marcadores de peso molecularsão expressos em kilodaltons.

A figura 6 mostra testes de ligação e de bloqueio de anticorpospurificados. A) Teste de ligação quantitativo de anticorpos Fab IF2monovalentes e bivalentes anti- mPDGFRa purificados. Várias quantidadesde anticorpos foram incubadas em uma placa de 96 cavidades pré-revestidacom mPDGFRa/Fc, seguido por incubação com um conjugado anticorpo-HRP anti-humano-κ. O Anticorpo - HRP ligado à placa foi então quantificadopela adição de substrato de peroxidase, e a absorbância foi lida a 450 nm. B)Inibição da ligação de mPDGFRa a PDGF-AA imobilizado pelos anticorposFabs purificados. Várias quantidades de anticorpos foram incubadas com umaquantidade fixa de mPDGFRa/Fc e as misturas foram transferidas para placaspré-revestidas com PDGF-AA. Após lavagem, as placas foram entãoincubadas com um conjugado anticorpo-HRP anti-humano-Fc. mPDGFRaligado foi quantificado pela adição de substrato de peroxidase, e a absorbânciafoi lida a A450 nm. Os dados mostrados representam a média ± desvio padrãode amostras em duplicata. 2B4 é um anticorpo dirigido contra VEGFR2 decamundongo (Flkl).

A figura 7 provê uma representação esquemática de IgGs decomprimento completo com base em IF2. O Vh de IF2 é expressado comouma proteína de fusão em CL e/ou CH, provendo anticorpos tetravalentes(painel A; MW ~ 150.000) ou bivalentes (painéis B e C: MW ~ 125.000).

A figura 8 mostra a expressão e purificação de anticorpos anti-mPDGFRa. No painel à direita, os anticorpos foram tratados com DTT antesde eletroforese.

A figura 9 mostra testes de ligação e de bloqueio de ligandospara anticorpos purificados. A) ligação quantitativa, anticorpos anti-mPDGFRa purificados. Várias quantidades de anticorpos foram incubadasem uma placa de 96 cavidades pré-revestida com mPDGFRa/Fc, seguido porincubação com um conjugado anticorpo-HRP anti-humano-κ. O anticorpoHRP ligado à placa foi quantificado pela adição de substrato de peroxidase, ea absorbância foi lida a A450 nm. B) Inibição da ligação de mPDGFRa aPDGF-AA imobilizado pelos anticorpos purificados. Várias quantidades deanticorpos foram incubadas com uma quantidade fixa de mPDGFRa/Fc etransferidas para placas pré-revestidas com PDGF-AA. As placas foramlavadas e incubadas com um conjugado anticorpo-HRP anti-humano-Fc.mPDGFRa ligado foi então quantificado pela adição de substrato deperoxidase, e a absorbância foi lida a Ã450 nm. Os dados representam amédia ± desvio padrão de amostras em duplicata. 2B4 é um anticorpo dirigidocontra VEGFR2 de camundongo (Flkl).

A figura 10 provê uma representação esquemática deanticorpos biespecíficos tetravalentes com base em IF2 selecionados queligam mPDGFRa e flk-1. A) Anticorpo de tipo IgG designado IF2/scFv2B4.Vh de IF2 é expressado como uma fusão a CL, e 2B4 é expressado como umafusão de scFv a CH. Β) O anticorpo de tipo IgG designado IF2-2B4. Vh de IF2é expressado como uma fusão ao término amino de Vl de 2B4.

A figura 11 mostra a expressão e purificação de anticorposbiespecíficos com base em IF2. Os anticorpos foram expressados em célulasde mamífero, purificados por cromatografia de afinidade, e analisados porSDS-PAGE. Os anticorpos foram tratados com/sem (±) DTT antes deeletroforese. Os marcadores de peso molecular são expressos em kilodaltons.

A figura 12 mostra os testes de ligação quantitativos deanticorpos biespecíficos anti- mPDGFRa χ anti-Flk-1. A) Várias quantidadesde anticorpos foram primeiro incubadas em uma placa de 96 cavidades pré-revestida com mPDGFRa/Fc, seguido por incubação com um conjugadoanticorpo-HRP anti-humano-κ. B) Várias quantidades de anticorpos foramprimeiro incubadas em uma placa de 96 cavidades pré-revestidas com Flk-1/Fc, seguido por incubação com um conjugado anticorpo-HRP anti-humano-k. Os dados mostrados representam a média ± desvio padrão de amostras emduplicata.

A figura 13 mostra testes de bloqueio de anticorposbiespecíficos anti- mPDGFRa χ anti-Flk-1. A) Inibição da ligação demPDGFRa a PDGF-AA imobilizado pelos anticorpos biespecíficospurificados. B) Inibição da ligação de Flk-I a VEGF165 imobilizado pelosanticorpos biespecíficos purificados. Em ambos os testes, várias quantidadesde anticorpos foram incubadas com uma quantidade fixa de receptor(mPDGFRa/Fc ou Flk-1) em solução e transferidas para placas pré-revestidascom ligando (PDGF-AA ou VEGF165). As placas foram então incubadascom um conjugado anticorpo-HRP anti-humano-Fc. mPDGFRa ligado foientão quantificado pela adição de substrato de peroxidase, e a absorbância foilida a A450 nm. Os dados mostrados representam a média ± desvio padrão deamostras em duplicata.

A figura 14 mostra inibição da fosforilação de receptorestimulada por PDGF e VEGF pelo IF2-2B4IgG biespecífico. Células eEnd.lforam primeiro incubadas com vários anticorpos a 37 0C durante 30 min,seguido por estímulo com VEGF ou PDGF a 37 0C durante 15 min. Após Iisede células, os receptores foram imunoprecipitados a partir do sobrenadante delisado de células por incubação com um anticorpo anti- mPDGFRa ou umanti-mVEGFR2, seguido por pérolas de ProA/G Sepharose . As proteínas dereceptor precipitadas foram resolvidas em um gel Nupage Bis-Tri 4-12% etransferidas para uma membrana de difluoreto de polivinilideno. Fosfo-mVEGFR2 e fosfo- mPDGFRa foram detectados no blot usando umconjugado anticorpo - HRP anti-fosfo-tirosina. As proteínas de receptor totaiscarregadas no gel foram testadas com anticorpos em mPDGFRa oumVEGFR2.

A figura 15 mostra as seqüências de aminoácidos dosdomínios Vh e Vl de várias proteínas de Fab identificadas. Fabs IEl0, 1A11,3B2, 1C10, 3G7, 1F9 e IF2 foram identificados em uma triagem para o fagoFab que liga a PDGFRa de murino. Fab 2B4 foi identificado em uma triagempara fago de Fab que liga a VEGFR2 de murino; mutação com deslocamentode armação; * códon de parada resultante de mutação com deslocamento dearmação; deleção em armação.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A invenção provê novos anticorpos que compreendem sítiosde ligação a antígeno de domínio variável único (sVD). A invenção tambémprovê proteínas de ligação a antígeno que compreendem tanto os sítios deligação a antígeno de domínio único, como os sítios de ligação a antígeno detipo Fv de dois domínios.

Sítios de ligação a antígeno de domínio único são similares adomínios variáveis de imunoglobulina (por exemplo, Vh ou Vl), mas sãocapazes de ligação específica a antígeno na ausência de um segundo domíniode ligação a antígeno (por exemplo, uma contraparte Vl ou Vh). Os domíniosúnicos podem de fato ser incapazes de associação estável com a contrapartede domínios de ligação. No entanto, anticorpos de domínio único podem ligarantígeno com afinidades e avidez similares às de anticorpos que incluemambos os domínios Vl e VH. Além disso, como anticorpos naturais,anticorpos de domínio único podem bloquear as interações receptor-ligando.Conseqüentemente, os anticorpos da invenção que compreendem sítios dedomínio único são usados para os mesmos fins como anticorpos obtidos, porexemplo, a partir de hibridomas, camundongos transgênicos expressandoanticorpos humanos, e bibliotecas de exibição de fagos de domínios deligação Fab ou scFv.

Os anticorpos da invenção são de tipo imunoglobulina emvários aspectos. 1) Os anticorpos da invenção que são de tipo IgG sãoheterotetrâmeros, consistindo de duas dentre cada uma das duas cadeias depolipeptídeos dissimilares. 2) As cadeias de polipeptídeos dissimilaresassociam-se e podem ser covalentemente ligadas, por exemplo, por ligaçõesdissulfeto do mesmo modo que as regiões constantes de cadeias leve e pesadade imunoglobulinas de ocorrência natural, padrão. 3) Uma das cadeias depolipeptídeos é capaz de auto-associação estável no modo das cadeias pesadasde imunoglobulina de ocorrência natural. Por exemplo, uma das cadeias depolipeptídeos pode incluir um ou mais domínios correspondentes a CH2, CH3ou Ch4 de uma imunoglobulina de ocorrência natural. Em uma forma derealização preferida, um anticorpo da invenção compreende a estrutura dedomínio constante de uma IgG de ocorrência natural.

Uma vantagem enorme de uma estrutura de tipo deimunoglobulina é que as cadeias de anticorpos formam pares naturalmentequando da expressão. Diferente de muitos anticorpos tetraméricos da técnicaanterior, nenhuma outra manipulação é necessária para obter uma preparaçãode anticorpos homogêneos.

As proteínas de ligação a antígeno da invenção compreendemsítios de ligação a antígeno que são domínios variáveis únicos (sVDs). Emcertas formas de realização da invenção, um sítio de ligação sVD substitui umdomínio variável de um anticorpo de tipo IgG, e um scFv substitui o outrodomínio variável. Exemplos destas formas de realização são descritos nafigura IA. Em outras formas de realização da invenção, um sítio de ligaçãosVD é enxertado em um anticorpo IgG no término N ou término C da cadeialeve e pesada de IgG. Exemplos destas formas de realização são mostrados nafigura 1B. Os sVDs também podem ser incorporados em um anticorpo de tipode imunoglobulina em outras posições. Por exemplo, os sVDs podem serfixados ao término C dos domínios constantes Ch e/ou CL. Além disso,combinando as substituições dos sítios de ligação sVD, como na figura 1, comadições de sítios de ligação sVD ao término dos domínios constantes Ch e/ouCL, anticorpos de tipo IgG que são multiespecíficos e/ou multivalentes paraum antígeno particular podem ser produzidos.

Como se sabe, um Fv consiste de dois domínios (por exemplo,um domínio Vh e um domínio VL). Em um anticorpo padrão, os domínios Vhe Vl de Fv, embora associados para formar um sítio de ligação a antígeno,não estão diretamente ligados, mas são cada um unidos a regiões constantesde anticorpos ligados. Os domínios Vh e Vl de Fv também podem ser unidoscom um ligador sintético para formar um Fv de cadeia única (scFv).

A especificidade do anticorpo refere-se ao reconhecimentoseletivo do anticorpo por um epítopo particular de um antígeno. Anticorposnaturais, por exemplo, são monoespecíficos. Os anticorpos biespecíficos(BsAbs) são anticorpos que têm dois sítios ou especificidades de ligação aantígeno diferentes. Quando uma proteína de ligação a antígeno tem mais doque uma especificidade, os epítopos reconhecidos podem ser associados comum antígeno único ou com mais do que um antígeno.

Uma molécula de anticorpo natural é composta de duascadeias pesadas idênticas e duas cadeias leves idênticas. Cada cadeia leve écovalentemente ligada a uma cadeia pesada por uma ligação dissulfetointercadeia. As duas cadeias pesadas são ainda ligadas umas à outras porligações dissulfeto múltiplas na região de gancho. As cadeias individuaisduplicam em domínios tendo tamanhos similares (cerca de 110-125aminoácidos) e estruturas, mas funções diferentes. A cadeia leve compreendeum domínio variável (Vl) e um domínio constante (CL). A cadeia pesadacompreende um domínio variável (Vh) e, dependendo da classe ou isotipo doanticorpo, três ou quatro domínios constantes (CH1, CH2, Ch3 e Ch4). Emcamundongos e humanos, os isotipos são IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, com IgAe IgG ainda subdivididos em subclasses ou subtipos. A porção de umanticorpo consistindo de domínios Vl e Vh é designada "Fv" e constitui osítio de ligação a antígeno. Um Fv de cadeia única (scFV) é uma proteínaengenheirada contendo um domínio Vl e um domínio Vh em uma cadeia depolipeptídeo, em que o término N de um domínio e o término C do outrodomínio são unidos por um ligador flexível. "Fab" refere-se à porção doanticorpo consistindo dos domínios VL, VH, Cl e ChI .

Os domínios variáveis mostram considerável variabilidade deseqüência de aminoácidos de um anticorpo para o seguinte, particularmentena localização do sítio de ligação a antígeno. Três regiões, denominadas"hiper-variáveis" ou "regiões de determinação da complementaridade"(CDRs) são encontradas em cada um dentre Vl e VH.

"Fc" é a designação para a porção de um anticorpo quecompreende domínios constantes de cadeia pesada formados aos pares. Emum anticorpo IgGi, por exemplo, o Fc compreende domínios CH2 e CH3. O Fcde um anticorpo IgA ou IgM ainda compreende um domínio CH4. O Fc éassociado com ligação do receptor de Fc, ativação de citotoxicidade mediadapelo complemento e citotoxicidade celular dependente de anticorpo. Paraanticorpos naturais como IgA e IgM, que são complexos de proteínas de tipoIgG múltiplas, a formação do complexo requer domínios constantes de Fc.

Finalmente, a região de "gancho" separa as porções Fab e Fcdo anticorpo, provendo mobilidade de Fabs com relação um ao outro e comrelação a Fc, bem como incluindo ligações múltiplas de dissulfeto paraligação covalente das cadeias pesadas.

Anticorpos da invenção têm uma combinação de aspectosdesejáveis. Primeiramente, eles são essencialmente homogêneos. Por projeto,a formação errada de pares de cadeias leves e pesadas de anticorpos é muitoreduzida ou eliminada. Por exemplo, alguns anticorpos biespecíficos fazemuso de duas cadeias pesadas diferentes para proporcionar duasespecificidades. Quatro combinações são possíveis quando estas cadeiaspesadas são arranjadas em uma molécula tipo IgG. Duas destas consistem decadeias pesadas com formação errada de pares de modo que o produto émonoespecífico. Nos anticorpos da invenção, a formação errada de pares ésubstancialmente eliminada.

Um segundo aspecto dos anticorpos da invenção é que eles sãobivalentes para cada especificidade de ligação. Muitos anticorposbiespecíficos são monovalentes para cada um dos sítios de ligação a anticorpoque estão incluídos. Isto é significativo para a função dos anticorpos porque abivalência permite o cooperativismo de ligação e um aumento significativo naavidez de ligação com relação a uma molécula compreendendo um sítio deligação específico de antígeno.

Uma terceira vantagem dos anticorpos da invenção é que umou mais domínios constantes de cadeia pesada que constituem a região Fc(por exemplo, CH2 e/ou Ch3 para uma molécula de IgGi) de um anticorponatural e que provê outras funções de anticorpos estão presentes. Além disso,os domínios de ligação múltiplos são separados dos domínios constantes demodo que as funções providas pelos domínios constantes não são afetadas. Asfunções de domínios constantes incluem ligação a certas moléculas acessórias(por exemplo, ligação à superfície de células e receptores de Fc solúveis,associação de cadeia J para IgA, IgM, proteína S para IgA), ativação da via decomplemento (citotoxicidade dependente de complemento, CDC),reconhecimento da ligação de anticorpos a células alvos por várias populaçõesde leucócitos diferentes (citotoxicidade mediada por células dependente deanticorpos, ADCC) e opsonização (melhora de fagocitose). Também, o(s)domínio(s) constante(s) de cadeia pesada de Fc pode(m) conferir meia vidasérica aumentada.

Uma quarta vantagem das proteínas da invenção é que não énecessário o processamento ín vítro para obter o produto completo. Emborare-arranjado de um modo artificial, cada um dos domínios tem um caráternatural que permite a expressão em um sistema biológico. Por exemplo,anticorpos biespecíficos podem ser expressados em sistemas de expressãoprocarióticos e eucarióticos. As proteínas que são produzidas sãosubstancialmente biespecíficas.

Os sítios de ligação a antígeno sVD e sítios de ligaçãocontendo a região Fc para uso em um anticorpo da invenção podem serobtidos por uma variedade de métodos. As seqüências de aminoácidos dasporções Vh e/ou Vl de um domínio de ligação selecionado podem ser obtidasa partir de um anticorpo de ocorrência natural ou ser escolhidas oumodificadas, tríadas ou selecionadas para características de ligação desejadas.Por exemplo, os domínios Vh e/ou Vl podem ser obtidos diretamente a partirde um anticorpo monoclonal que tem as características de ligação desejadas.Alternativamente, os domínios Vh e/ou Vl podem ser de bibliotecas deseqüências de genes V de um mamífero de escolha. Os elementos destasbibliotecas expressam combinações aleatórias dos domínios Vh e/ou Vl e sãotriados com qualquer antígeno desejado para identificar os elementos que têmcaracterísticas de ligação desejadas. Particularmente preferida é umabiblioteca de genes V humanos. Os métodos para a triagem são conhecidos natécnica. Alternativamente, os domínios Vh e/ou Vl de uma fonte não humanaselecionada podem ser incorporados em anticorpo quimérico que compreendedomínios constantes humanos. Por exemplo, para administração a umhumano, pode-se desejar usar um anticorpo com um ou mais domíniosconstantes humanos funcionais em que os domínios Vh e Vl são selecionadosde uma fonte não humana. Para maximizar a função associada ao domínioconstante ou reduzir a imunogenicidade do anticorpo, domínios constanteshumanos são preferidos.

Alternativamente, um domínio V pode ser produzido, que é"humanizado". Domínios variáveis humanizados são construídos, em que asseqüências de aminoácidos que compreendem uma ou mais regiõesdeterminantes de complementaridade (CDRs) de origem não humana sãoenxertadas em regiões de armação humanas (FRs). Para exemplos, ver: Jones,P.T. et al., 1996, Nature 321, 522-25; Riechman, L. Et al., 1988, Nature 332,323-27; e patente US 5.530.101 para Queen et al. Uma construçãohumanizada é particularmente valiosa para a eliminação de característicasimunogênicas adversas, por exemplo, quando um domínio de ligação aantígeno de uma fonte não humana é desejado para ser usado para tratamentode um humano. Os domínios variáveis têm um alto grau de homologiaestrutural, permitindo a fácil identificação de resíduos de aminoácidos emdomínios variáveis que correspondem a CDRs e FRs. Ver, por exemplo,Kabat, E.A. et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a.edição, National Center for Biotechnology Information, National Institutes ofHealth, Bethesda, MD. Assim, os aminoácidos que participam na ligação aantígeno são facilmente identificados. Além disso, foram desenvolvidosmétodos para conservar ou para melhorar a afinidade para antígeno dedomínios de ligação humanizados compreendendo CDRs enxertados. Ummodo consiste em incluir no domínio variável do recipiente os resíduos dearmação estranhos que influenciam a conformação das regiões de CDR. Umsegundo modo é enxertar os CDRs estranhos sobre domínios variáveishumanos com a homologia mais próxima à região variável estranha. Queen,C. et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86, 10029-33. CDRs são maisfacilmente enxertados sobre FRs diferentes amplificando-se, em primeirolugar, as seqüências individuais usando iniciadores de sobreposição queincluem seqüências de CDR desejadas, e unindo os segmentos de genesresultantes em reações de amplificação subseqüentes. O enxerto de um CDRsobre um domínio variável diferente pode ainda envolver a substituição deresíduos de aminoácidos que são adjacentes ao CDR na seqüência deaminoácidos ou alocados contra o CDR na estrutura de domínio variávelduplicada que afeta a conformação do CDR. Os domínios variáveishumanizados da invenção, assim, incluem domínios humanos quecompreendem um ou mais CDRs não humanos bem como tais domínios emque outras substituições ou mudanças foram feitas para conservar ou melhoraras características de ligação.

Um anticorpo da invenção também pode empregar domíniosvariáveis que foram tornados menos imunogênicos por substituição deresíduos expostos na superfície de modo a fazer o anticorpo parecer comopertencendo ao sistema imune (Padlan, E.A., 1991, Mol. Immunol. 28, 489-98). Os anticorpos foram modificados por este processo sem perda deafinidade (Roguska et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91, 969-973).Devido ao envelope interno de resíduos de aminoácidos na proximidade dosítio de ligação a antígeno permanecer inalterada, a afinidade é conservada. Asubstituição de resíduos expostos na superfície, de acordo com a invenção,visando imunogenicidade reduzida, não significa a substituição de resíduos deCDR ou resíduos adjacentes que influenciam as características de ligação.

É preferível, com freqüência, empregar domínios variáveis quesão essencialmente humanos. Os domínios de ligação humanos podem serobtidos a partir de bibliotecas de exibição de fagos, em que as combinaçõesde domínios variáveis de cadeia leve e pesada humanos são exibidas nasuperfície de fago filamentoso (Ver, por exemplo, McCafferty et al., 1990,Nature 348, 552-54; Aujame et al., 1997, Human Antibodies 8, 155-68). Ascombinações de domínios variáveis são tipicamente exibidas no fagofilamentoso na forma de Fabs ou scFvs. A biblioteca é triada paracombinações de domínios variáveis contendo fagos tendo características deligação a antígeno desejadas. Combinações de domínio variável e de domínioúnico exibem alta afinidade para um antígeno selecionado e uma pequenareatividade cruzada para outros antígenos relacionados. Triando repertóriosmuito grandes de fragmentos de anticorpo (ver, por exemplo, Griffiths et al.,1994, EMBO J. 13, 3245-60), uma boa diversidade de domínios de ligação dealta afinidade é isolada, esperando-se que muitos tenham afinidades sub-nanomolares para o antígeno desejado.

Alternativamente, os domínios de ligação humanos podem serobtidos de animais transgênicos em que os segmentos de genes Ig nãorearranjados foram introduzidos e em que os genes Ig de camundongoendógeno foram inativados (revisto em Bruggemann e Taussig, 1997, Curr.Opin. Biotechnol. 8, 455-58). Animais transgênicos preferidos contêmfragmentos de genes Ig contíguos muito grandes que estão acima de 1 Mb emtamanho (Mendez et al., 1997, Nature Genet. 15, 146-56), mas Mabshumanos de afinidade moderada podem ser aumentados de animaistransgênicos contendo Ioci de genes menores (Ver, por exemplo, Wagner etal., Eur. J. Immunol. 42, 2672-81; Green et al., 1994, Nature Genet. 7, 13-21).Os sítios de ligação sVD podem ser obtidos de regiões Fvespecíficas (que compreendem ambos os domínios Vh e VL). Com freqüência,pode ser demonstrado que a afinidade de ligação e especificidade de umaregião Fv é dada primeiro por um dos domínios variáveis. Além disso, o scFvpode ser obtido diretamente. Fontes diretas de sVDs incluem mamíferos (porexemplo, camelídeos) que expressam naturalmente anticorpos contendosomente o domínio Vh e bibliotecas de exibição de fagos construídas paraexpressar somente um domínio variável único. Por exemplo, uma bibliotecade exibição de fagos de anticorpo de domínio humano está comercialmentedisponível de Domantis (Cambridge, Reino Unido). Como exemplificadoaqui, sítios de ligação sVD específicos para PDGFRa foram obtidos de umabiblioteca de fagos contendo variantes em que o domínio Vl foiespontaneamente deletado.

Em uma resposta imune fisiológica, mutação e seleção degenes de anticorpo expressados levam à produção de anticorpos tendo altaafinidade para seu antígeno alvo. Os domínios Vh e Vl incorporados nosanticorpos da invenção podem ser similarmente submetidos a procedimentosde mutação in vitro e triagem para obter variantes de alta afinidade. Assim, osdomínios de ligação da invenção incluem os para os quais as características deligação são melhoradas por mutação direta ou por métodos de maturação porafinidade. A afinidade e especificidade podem ser modificadas ou melhoradasmudando os CDRs e triando sítios de ligação a antígeno tendo ascaracterísticas desejadas (Ver, por exemplo, Yang et al., 1995. J. Mol. Bio.254, 392-403). Deve-se entender que os resíduos de aminoácidos que sãodeterminantes primárias da ligação de anticorpos de domínio único podemestar em CDRs definidos por Kabat, mas podem incluir outros resíduostambém, como, por exemplo, resíduos que podem ser de outro modoenterrados na interface de Vh-Vl de um heterodímero de Vh-Vl. CDRs ououtros resíduos que determinam ligação são mudados em uma variedade demodos. Um modo é randomizar os resíduos individuais ou combinações deresíduos de modo que os sítios de ligação a antígeno idênticos, todos de vinteaminoácidos, ou um subconjunto dos mesmos, são encontrados em posiçõesparticulares. Além disso, as mutações são induzidas em uma faixa de resíduosde CDR por métodos de PCR propenso a erro (Ver, por exemplo, Hawkins etai., 1992, J. Mol. Βίο. 226, 889-96). Vetores de exibição de fagos contendogenes codificando os domínios de ligação (por exemplo, genes de regiãovariável de cadeia pesada e/ou leve) podem ser propagados em cepas mutatorde E. coli (Ver, por exemplo, Low et al., 1996, J. Mol. Bio. 250, 359-68).Estes métodos de mutagenese são ilustrativos de muitos métodos conhecidospor um versado na técnica.

Cada domínio variável dos anticorpos da presente invençãopode ser um domínio variável de cadeia leve ou pesada de imunoglobulinascompleto, ou pode ser um equivalente funcional ou um mutante ou derivadode um domínio de ocorrência natural, ou um domínio sintético construído, porexemplo, in vitro usando uma técnica como a descrita em WO 93/11236(Medicai Research Council / Griffiths et al.). Por exemplo, é possívelincorporar domínios correspondendo os domínios variáveis de anticorpos emque estão faltando um ou mais aminoácidos. O aspecto característicoimportante é a capacidade de cada domínio variável de se associar com umdomínio variável complementar para formar um sítio de ligação a antígeno.

Proteínas de ligação a antígeno da invenção têm sítios deligação para qualquer epítopo, sítio antigênico ou proteína. De particularinteresse são os anticorpos que são utilizáveis para o tratamento de doença.Os anticorpos preferidos neutralizam proteínas de receptor, como receptoresque estão envolvidos em angiogenese e/ou oncogenese. Neutralizar umreceptor significa inativar a atividade de quinase intrínseca do receptor paratransduzir um sinal. Um teste confiável para a neutralização do receptor é ainibição de fosforilação do receptor. A presente invenção não está limitada aqualquer mecanismo particular de neutralização de receptor. Algunsmecanismos possíveis incluem prevenir a ligação do ligando ao domínio deligação extracelular do receptor, e prevenir a dimerização ou oligomerizaçãodo receptor. Outros mecanismos não podem, no entanto ser excluídos.

A neutralização da ativação de um receptor em uma amostrade células endoteliais ou não endoteliais, como células de tumor, pode serrealizada in vitro ou in vivo. A neutralização da ativação de um receptor emuma amostra de receptor expressando células compreende contatar as célulascom um anticorpo da invenção. In vitro, as células são contatadas com oanticorpo antes, simultaneamente com, ou após adicionar VEGF à amostra decélula. In vivo, um anticorpo da invenção é contatado com um receptor poradministração a um mamífero. Métodos de administração a um mamíferoincluem, por exemplo, administração oral, intravenosa, intraperitoneal,subcutânea ou intramuscular.

Exemplos destes receptores incluem, mas não estão limitados areceptor de fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF-R), receptoresVEGF (por exemplo, VEGFR-2/KDR/Flk-1, VEGFRl/Flt-1, VEGFR3/Flt-4),receptor de fator de crescimento epidérmico (EGFR), receptor de fator decrescimento como insulina (IGFR) e outros. Outros exemplos não limitantesde receptor tirosina quinases incluem Flt-4, HER2/neu, Tek e Tie2.

Outros fatores implicados como possíveis reguladores deangiogenese e/ou crescimento de tumores in vivo incluem o fator decrescimento de fibroblastos (FGF), e o fator de crescimento de nervos (NGF).Os receptores correspondentes são o fator de crescimento de fibroblastos(FGF-R), e o fator de crescimento de nervos (NGFR). Um outro receptorimplicado em migração celular, mudanças morfológicas e invasividade é oreceptor de proteína estimulando macrófagos ("MSP-R" ou "RON").Receptores de interesse incluem proteínas humanas e homólogos de outrosmamíferos.Anticorpos da invenção podem incorporar domínios de ligaçãoa antígeno Ig de qualquer fonte. Por exemplo, os anticorpos são conhecidospara os receptores listados acima e são fontes de domínios Vh e Vl para usonos anticorpos da presente invenção. Exemplos de domínios de ligação deregiões variáveis de scFv específicos para KDR incluem, por exemplo, osdomínios Vh e Vl de IMC-ICll (seqüências de nucleotídeos e deaminoácidos de VH: SEQ ID NOs: 1 e 2; seqüências de nucleotídeos e deaminoácidos de VL: SEQ ID Nos: 3 e 4) (ver, WO 00/44777), IMC-2C6(seqüências de nucleotídeos e de aminoácidos para VH: SEQ ID Nos: 5 e 6;seqüências de nucleotídeos e de aminoácidos de VL: SEQ ID Nos: 7 e 8) (verWO 03/075840), e IMC-1121 (seqüências de nucleotídeos e de aminoácidosde VH: SEQ ID Nos: 5 e 6; seqüências de nucleotídeos e de aminoácidos deVl: SEQ ID Nos: 9 e 10) (ver, WO 03/075840). Exemplos de domínios deligação específicos para Flt-I incluem 6.12 (seqüências de nucleotídeos e deaminoácidos de VH: SEQ ID Nos: 11 e 12; seqüências de nucleotídeos e deaminoácidos de VL: SEQ ID Nos: 13 e 14) e IMC-18F1 (seqüências denucleotídeos e de aminoácidos de VH: SEQ ID Nos: 27 e 28; seqüências denucleotídeos e de aminoácidos de VL: SEQ ID Nos: 29 e 30).

Domínios de ligação específicos para EGFR incluem, porexemplo, ERBITUX® (Cetuximab; IMC-C225) (seqüências de nucleotídeos ede aminoácidos de Vh: SEQ ID Nos: 15 e 16; seqüências de nucleotídeos e deaminoácidos de VL: SEQ ID Nos: 17 e 18) como descrito em WO 96/40210 eIMCl 1F8 (seqüências de nucleotídeos e de aminoácidos de VH: SEQ ID Nos:19 e 20; seqüências de nucleotídeos e de aminoácidos de VL: SEQ ID Nos: 21e 22). Um exemplo de um domínio de ligação específico para IGFR é IMC-A12 (seqüências de nucleotídeos e de aminoácidos de VH: SEQ ID Nos: 23 e24; seqüências de nucleotídeos e de aminoácidos de VL: SEQ ID Nos: 25 e26). Anticorpos que se ligam a receptores FGT (ver, WO 2005/037235) (ver,WO 2005/037235) incluem, por exemplo, FR1-H7 (seqüências denucleotídeos e de aminoácidos de VH: SEQ ID Nos: 31 e 32); seqüências denucleotídeos e de aminoácidos de Vl: SEQ ID Nos: 33 e 34), FRl-Al(seqüências de nucleotídeos e de aminoácidos de VH: SEQ ID Nos: 35 e 36;seqüências de nucleotídeos e de aminoácidos de VL: SEQ ID Nos: 37 e 38), eFRl-4H (seqüências de nucleotídeos e de aminoácidos de VH: SEQ ED Nos:39 e 40; seqüências de nucleotídeos e de aminoácidos de VL: SEQ ID Nos 41e 42). Anticorpos que se ligam a RON ou MSP-R (ver, WO 2005/120557)incluem IMC-41A10 (seqüências de nucleotídeos e de aminoácidos de VH:SEQ ID Nos: 43 e 44; seqüências de nucleotídeos e de aminoácidos de Vl:SEQ ID Nos: 45 e 46) e IMC-41B12 (seqüências de nucleotídeos e deaminoácidos de VH: SEQ ID Nos: 47 e 48; seqüências de nucleotídeos e deaminoácidos de VL: SEQ ID Nos: 49 e 50). Anticorpos que se ligam aPDGFRa incluem, por exemplo, 3G3 e 7G11 (Loizos et al., 2005, Mol.Câncer Ther. 4: 369).

Além disso, porções dos domínios de ligação listados acima,como as regiões de CDR, podem ser incorporadas nos domínios de ligaçãousados para produzir as proteínas de ligação aqui descritas.

Certos anticorpos preferidos ligam-se a dois dos receptoreslistados acima. Em uma forma de realização da invenção, uma proteína deligação a antígeno biespecífica liga-se a e bloqueia a ativação de doisreceptores tirosina quinases diferentes envolvidos em angiogenese. Nestaforma de realização, o anticorpo liga-se a PDGFR e um receptor VEGF como,por exemplo, VEGFR2/Flk-1/KDR. Em uma outra forma de realização, oanticorpo liga-se a KDR e FLT-I.

Em outra forma de realização, um anticorpo da invenção liga-se a HER2 e EGFR. Ainda em uma outra forma de realização, um anticorpoda invenção liga-se a EGFR e IGFR.

Em outra forma de realização, uma proteína de ligação aantígeno da invenção liga-se a EGFR e VEGFR. Em uma forma de realizaçãopreferida, o VEGFR é VEGFR2. O anticorpo é utilizável para bloquear oestímulo de células epiteliais vasculares, bloqueando a transdução de sinalatravés de ambos EGFR e VEGFR. Isto é particularmente utilizável ondeangiogenese ocorre em resposta a ligandos de EGFR, particularmente TGFa,secretados por células de tumor.

Anticorpos da invenção podem ser usados para reticularantígenos em células alvos com antígenos em células efetoras do sistemaimune. Isto pode ser utilizável, por exemplo, ao se promover respostas imunesdirigidas contra células que têm antígenos particulares de interesse sobre asuperfície de células. De acordo com a invenção, as células efetoras dosistema imune incluem células específicas de antígeno como células T queativam respostas imunes celulares e células não específicas como macrófagos,neutrófilos e células exterminadoras naturais (NK) que mediam respostasimunes celulares.

Anticorpos da invenção podem ter um sítio de ligação paraqualquer antígeno de superfície de células de uma célula efetora do sistemaimune. Estes antígenos de superfície de células incluem, por exemplo,receptores de citoquina e linfoquina, receptores Fc, CD3, CD16, CD28, CD32e CD64. Além dos sítios de ligação a antígeno providos por sVDs, osanticorpos biespecíficos podem incluir sítios de ligação providos por Fvs. OsFvs podem ser obtidos de anticorpos nos antígenos acima mencionados, apartir de bibliotecas combinatoriais, bem como por outros métodosconhecidos na técnica. Os anticorpos biespecíficos que são específicos parareceptores citoquina e linfoquina também podem incluir sítios de ligaçãocompreendendo seqüências de aminoácidos que correspondem a toda ou partedo ligando natural para o receptor. Por exemplo, quando o antígeno desuperfície de células é um receptor IL-2, um anticorpo biespecífico dainvenção pode ter um sítio de ligação a antígeno que compreende umaseqüência de aminoácidos correspondente ou IL-2. Outras citoquinas elinfoquinas incluem, por exemplo, interleucinas como interleucina-4 (IL-4) einterleucina-5 (IL-5), e fatores de estímulo de colônias (CSFs) como CSF degranulócito- macrófago (GM-CSF), e CSF de granulócito (G-CSF).

Anticorpos da invenção são produzidos expressando duascadeias de polipeptídeo que, tomadas juntas, compreendem pelo menos umsítio de ligação a antígeno de domínio único. As duas cadeias de polipeptídeocompreendem cada uma pelo menos um domínio constante de cadeia pesadaque é capaz de dimerização (por exemplo, CH2 e/ou Ch3). Os anticorpos sãoconvenientemente produzidos em E. Coli usando construções de DNA quecompreendem seqüências de sinal de secreção bacteriana no início de cadacadeia de polipeptídeo. Uma variedade de seqüências de sinal bacterianas éconhecida na técnica. Uma seqüência de sinal preferida é do gene pelB deErwinina carotovora. Os fragmentos de DNA codificando os anticorpos aserem clonados, por exemplo, em vetores empregando melhoradores epromotores de citomegalovírus humanos (HCMV) para expressão em altonível em células de mamífero, como, por exemplo, células CHO, NSO, COS-7e PER.C6, e linhagens de células de origem linfóide como células de linfoma,mieloma e hibridoma. (Ver, por exemplo, Bendig et al., patente US5.840.299; Maeda et al. (1991) Hum. Antibod. Hybridomas 2, 124-34).

Um marcador selecionável é um gene que codifica umaproteína necessária para a sobrevivência ou crescimento de célulashospedeiras transformadas cultivadas em um meio de cultura seletivo. Osmarcadores selecionáveis típicos codificam proteínas que (a) conferemresistência a antibióticos ou outras toxinas, por exemplo, ampicilina,neomicina, metotrexato ou tetraciclina, (b) complementam deficiênciasauxotróficas, ou (c) fornecem nutrientes críticos não disponíveis de meioscomplexos, por exemplo, o gene codificando D-alanina racemase parabacilos. Um marcador selecionável particularmente utilizável confereresistência a metotrexato. Por exemplo, células transformadas com o gene deseleção DHFR são primeiro identificadas cultivando todos os transformantesem um meio de cultura que contém metotrexato (Mtx), um antagonistacompetitivo de DHFR. Uma célula hospedeira apropriada quando DHFR dotipo selvagem é empregado é a linhagem de células de ovário de hamsterchinês (CHO) deficiente em atividade de DHFR, preparada e propagada comodescrito por Urlaub e Chasin (1980) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77, 4216. Ascélulas transformadas são então expostas a níveis aumentados de metotrexato.Isto leva à síntese de cópias múltiplas do gene DHFR, e, concomitantemente,cópias múltiplas de outro DNA compreendendo os vetores de expressão,como o DNA codificando o anticorpo ou fragmento de anticorpo.

Quando se deseja expressar uma construção de gene emlevedura, um exemplo de um gene de seleção apropriado para uso emlevedura é o gene trpl presente no plasmídeo de levedura YRp7. Stinchcombet al. (1979) Nature, 282, 39; Kingsman et al. (1979) Gene 7, 141. O genetrpl provê um marcador de seleção para uma cepa mutante de leveduradeficiente da capacidade de cultura em triptofano, por exemplo, ATCC no.44076 ou PEP4-1. Jones (1977) Genetics 85,12. A presença de lesão de trplno genoma de células hospedeiras de levedura então provê um ambienteefetivo para detectar a transformação por cultura na ausência de triptofano.Similarmente, cepas de levedura deficientes em Leu2 (ATCC 20.622 ou38.626) são complementadas por plasmídeos conhecidos contendo o geneLeu2.

Células hospedeiras transformadas são cultivadas por métodosconhecidos na técnica em um meio líquido contendo fontes assimiláveis decarbono, por exemplo, carboidratos como glicose ou lactose, nitrogênio, porexemplo, aminoácidos, peptídeos, proteínas ou seus produtos de degradaçãocomo peptonas, sais de amônio ou outros, e sais inorgânicos, por exemplo,sulfatos, fosfatos e/ou carbonatos de sódio, potássio, magnésio e cálcio. Omeio, além disso, contém, por exemplo, substâncias promotoras decrescimento, como elementos traço, por exemplo, ferro, zinco, manganês eoutros.

Anticorpos que se ligam a receptores de fator de crescimentosão preferivelmente capazes de bloquear a inativação da atividade do receptortirosina quinase (RTK). A inibição de tirosina quinase pode ser determinadausando métodos bem conhecidos, por exemplo, medindo o nível deautofosforilação do receptor quinase recombinante, e/ou fosforilação desubstratos naturais ou sintéticos. Assim, testes de fosforilação são utilizáveisna determinação dos antagonistas de RTK da presente invenção. Afosforilação pode ser detectada, por exemplo, usando um anticorpo específicopara fosfotirosina em um teste ELISA ou em um western blot. Alguns testespara atividade de tirosina quinase são descritos em Panek et al., J. Pharmacol.Exp. Thera. (1997) 283: 1433-44 e Batley et al., Life Sei. (1998) 62: 143-50.

Além disso, métodos para detecção da expressão de proteínaspodem ser utilizados para determinar os antagonistas de RTK, onde aexpressão de proteínas sendo medidas é mediada pelo RTK. Estes métodosincluem imuno-histoquímica (IHC) para detecção da expressão de proteína,fluorescência, hibridização in situ (FISH) para detecção da amplificação dogene, testes de ligação a radioligandos competitivos, técnicas de blotting dematriz sólida, como Northern e Southern blot, reação de cadeia de polimerasede transcriptase reversa (RT-PCR) e ELISA. Ver, por exemplo, Grandis et al.,Câncer, (1996) 78: 1284-92; Shimizu et al., Japan J. Câncer Res., (1994) 85:567-71; Sauter et al., Am. J. Path., (1996) 148: 1047-53; Collins, Glia, (1995)15: 289-96; Radinsky et al., Clin. CancerRes., (1995) 1: 19-31; Petrides et al.,Câncer Res., (1990) 50: 3934-39; Hoffmann et al., Anticancer Res., (1997)17: 4419-26; Wikstrand et al., Câncer Res. (1995) 55: 3140-48.

A capacidade de um anticorpo bloquear a ligação ao ligandopode ser medida, por exemplo, por um teste competitivo in vitro. Neste teste,um ligando de RTK (por exemplo, EGF para EGFR) é imobilizado, e um testede ligação é realizado para determinar a efetividade do anticorpo para inibircompetitivamente a ligação de RTK ao ligando imobilizado.

Testes in vivo também podem ser utilizados para determinarantagonistas de RTK. Por exemplo, a inibição do receptor tirosina quinasepode ser observada por testes mitogênicos usando linhagens de célulasestimuladas com ligando de receptor na presença ou ausência de inibidor. Porexemplo, células A431 (American Type Culture Collection (ATCC),Rockville, MD) estimuladas com EGF podem ser usadas para testar a inibiçãode EGFR. Um outro método envolve testar a inibição do crescimento decélulas de tumor expressando EGFR, usando, por exemplo, células de tumorhumanas injetadas em um camundongo. Ver patente US n°. 6.365.157(Rockwell et al.).

Anticorpos preferidos da presente invenção têm especificidadedual e são capazes de ligar-se a dois antígenos diferentes simultaneamente. Osantígenos diferentes podem estar localizados em células diferentes ou namesma célula. A reticulação do antígeno pode ser mostrada in vitro, porexemplo provendo uma superfície sólida à qual um primeiro antígeno éligado, adicionando anticorpos biespecíficos específicos para o primeiroantígeno e um segundo antígeno para o qual a proteína de ligação é tambémespecífica e detectando a presença do segundo antígeno ligado.

Anticorpos preferidos da invenção são capazes de bloquear ainteração entre dois receptores e seus respectivos ligandos. Por exemplo, umanticorpo específico para KDR e Flt-I inibe a migração de células induzidapor VEGF bem como a migração de células induzida por PIGF. Acombinação de duas especificidades de ligação ao receptor em anticorposbiespecíficos pode ser mais eficaz na inibição da migração de células do quedos anticorpos parentais individuais (ver, por exemplo, Zhu, Z., WO2004/003211).

Comparados a anticorpos que são monoespecíficos, osanticorpos biespecíficos podem ser inibidores mais potentes da função celular.Por exemplo, funções celulares estimuladas por VEGF como, por exemplo, aproliferação de células endoteliais e a migração induzida por VEGF e PlGFde células de leucemia humanas podem ser mais eficientemente inibidas poranticorpos biespecíficos mesmo quando a afinidade para um ou ambos dosdois antígenos de alvo é reduzida. Um anticorpo específico (monovalente)para ambos KDR e Flt-I pode ser mais efetivo para inibir a migração decélulas induzida por VEGF ou PlGF do que um scFv monoespecífico dirigidoa qualquer um dos antígenos de alvo (WO 2004/003211).

Em um outro exemplo, um anticorpo tendo especificidade dualpara ambos EGFR (ou Her2/neu) e IGFR que é capaz de ligar a ambos osreceptores e bloquear a interação com seus ligandos específicos é usado paraneutralizar a ativação do receptor estimulado tanto por EFG como por IGF etransdução de sinal a jusante. Observa-se que o estímulo de qualquer deEGFR ou IGFR resulta em ativação (por exemplo, fosforilação) de moléculasde transdução de sinal a jusante comuns, incluindo Akt e p44/42, embora emextensões diferentes. Em certas células de tumor, a inibição da função deEGFR pode ser compensada por regulação positiva de outras vias desinalização do receptor do fator de crescimento, e particularmente porestímulo de IGFR. Em contraste com tratamento com um anticorpo que seliga a um receptor, e não bloqueia completamente fosforilação tanto de Aktcomo p44/42, a incubação de células de tumor com um anticorpo que se liga atanto EGFR como IGFR bloqueia a fosforilação de tanto Akt como de p44/42.Conseqüentemente, a inibição da sinalização de IGFR resulta na inibição docrescimento de tumor e sensibilidade aumentada para células de tumor emdeterminados agentes terapêuticos.

A inibição de fosforilação de tais componentes da cascata detransdução de sinal comuns também é observada com anticorpos que se ligama outros RTKs, como, por exemplo, RON. Conseqüentemente, as proteínas deligação a antígeno são geralmente utilizáveis para tratar doenças neoplásicascaracterizadas pela transformação ou crescimento de células resultantes daativação de vias de transdução de sinal múltiplas.

Os anticorpos da invenção são utilizáveis para tratamento deuma variedade de distúrbios proliferativos. Por exemplo, a presente invençãoprovê tratamento de tumores que expressam e são estimulados através de maisdo que um receptor tirosina quinase. O estímulo através de mais do que umreceptor pode resultar no crescimento descontrolado que é insensível aobloqueio de cada receptor sozinho. Além disso, o estímulo de um segundoreceptor pode aumentar a ativação observada em resposta a estímulo atravésde um primeiro receptor. Alternativamente, as contribuições de receptoresindividuais podem ser multiplicativas. Em cada um dos casos acima, ainibição significativamente melhorada de crescimento de tumor é observadana presença de uma proteína de ligação a antígeno que bloqueia ambos osreceptores.

Os anticorpos da invenção são utilizáveis para o tratamento dedoenças em que o estímulo do receptor é através de uma ativação de EGFRparácrina e/ou autócrina. Por exemplo, tumores expressando EGFR sãocaracteristicamente sensíveis a EGF presente em seu ambiente, e podem aindaser estimulados por EGF ou TGF-α produzidos no tumor. Apesar de nãopretender estar limitado por qualquer mecanismo particular, as doenças econdições que podem ser tratadas ou prevenidas pelos presentes métodosincluem, por exemplo, as em que o crescimento de tumor é estimulado. Ométodo é, assim, efetivo para tratar um tumor sólido que não é vascularizado,ou ainda não está substancialmente vascularizado.

Alguns anticorpos da invenção são utilizáveis para inibir aangiogenese associada com uma doença hiperproliferativa. Por exemplo,bloqueando-se a angiogenese associada ao tumor, o crescimento do tumorpode ser inibido. Em uma forma de realização, o anticorpo liga-se a um RTKassociado ao tumor e inibe a produção de ligandos angiogênicos (isto é,VEGF) pelo tumor, e também liga-se a um receptor VEGF associado comcélulas da vasculatura para inibir a proliferação destas células. Em uma formade realização diferente, o anticorpo liga-se a receptores VEGF múltiplos, demodo que o ligando de VEGF ou outro ligando de VEGFR (por exemplo,PIGF) é impedido de se ligar a mais do que um tipo de receptor VEGF.

Os tumores que podem ser tratados incluem tumores primáriose tumores metastáticos, bem como tumores refratários. Os tumores refratáriosincluem tumores que falham em responder ou são resistentes a tratamentocom agentes quimioterapêuticos sozinhos, anticorpos sozinhos, radiaçãosozinha ou combinações dos mesmos. Os tumores refratários tambémenglobam tumores que parecem ser inibidos por tratamento com tais agentes,mas reaparecem em até cinco anos, algumas vezes em até dez anos ou maisapós o tratamento ser descontinuado. Os tumores podem expressar EGFR ououtro RTK em níveis normais ou podem superexpressar o RTK em níveis, porexemplo, que são pelo menos 10, 100, ou 1000 vezes os níveis normais.

Exemplos de tumores que expressam EGFR e são estimuladospor um ligando de EGFR incluem carcinomas, gliomas, sarcomas,adenocarcinomas, adenosarcomas, e adenomas. Estes tumores podem ocorrervirtualmente em todas as partes do corpo, incluindo, por exemplo, mama,coração, pulmão, intestino delgado, cólon, baço, rim, bexiga, cabeça epescoço, ovário, próstata, cérebro, pâncreas, pele, osso, medula óssea, sangue,timo, útero, testículos, colo do útero ou fígado. Alguns tumores que foramobservados como superexpressando EGFR que podem ser tratados de acordocom a presente invenção incluem, mas não estão limitados a, tumores colo-retais e de cabeça e pescoço, especialmente carcinoma de células escamosasde cabeça e pescoço, tumores do cérebro como glioblastomas, e tumores dopulmão, mama, pâncreas, esôfago, bexiga, rim, ovário, colo do útero epróstata. Exemplos não limitativos de tumores que tem, como observado,atividade de receptor tirosina quinase constitutivamente ativa (isto é, nãoregulados) incluem gliomas, carcinomas de pulmão de células não pequenas,carcinomas de ovário e carcinomas de próstata. Outros exemplos de tumoresincluem sarcoma de Kaposi, neoplasmas do sistema nervoso central,neuroblastomas, hemangioblastomas capilares, meningiomas e metástasecerebral, melanoma, carcinomas gastrintestinal e renal e sarcomas,rabdomiosarcoma, glioblastoma, preferivelmente glioblastoma multifòrme, eleiomiosarcoma. A superexpressão de outros RTKs pode produzir defeitos decrescimento similares. Por exemplo, cânceres ósseos mais metastáticossurgem a partir de tumores primários de próstata, mama, ou pulmão. Tumoresde próstata inicialmente podem ser dependentes de hormônio, mas a perdadesta dependência coincide com estímulo mediado por IGFR de células quemigram para os ossos.

Os anticorpos também são utilizáveis para tratamento dasdoenças hiperproliferativas diferentes de tumores compreendendo aadministração ao mamífero de uma quantidade eficaz do anticorpo dapresente invenção. Como descrito aqui, "doença hiperproliferativa" é definidacomo uma condição causada por crescimento excessivo de células nãocancerosas que expressam um membro da família EGFR ou outros receptorescitosina quinase. O excesso de células geradas por uma doençahiperproliferativa expressa o RTK em níveis normais ou podemsuperexpressar o RTK.

Exemplos de doença hiperproliferativa incluem psoríase,queratoses actínicas e queratoses seborreicas, verrugas, cicatrizes quelóides, eeczema. Também estão incluídas as doenças hiperproliferativas causadas porinfecções virais, como infecção com papilomavírus. Por exemplo, psoríaseocorre em variações e graus de severidade muito diferentes. Tipos diferentesde psoríase exibem características como bolhas com pus (psoríase pustular),escara severa da pele (psoríase eritrodérmica), pontos semelhantes gotas(psoríase gutata) e lesões inflamadas lisas (psoríase inversa). O tratamento detodos os tipos de psoríase (por exemplo, psoríase vulgaris, psoríase pustulosa,psoríase eritrodérmica, psoríase artropática, parapsoríase, pustulosepalmoplantar) é contemplado pela invenção.

De acordo com a invenção, os anticorpos podem serquimicamente ou biossinteticamente conjugados a outros agentes comoagentes antineoplásicos ou antiangiogênicos para tratamento de doença.Agentes antitumor ligados a um anticorpo incluem quaisquer agentes quedestroem ou danificam um tumor ao qual o anticorpo se ligou ou no meio dacélula em que o anticorpo se ligou. Por exemplo, um agente antitumor é umagente tóxico como um agente quimioterapêutico ou um radioisótopo. Osagentes quimioterapêuticos são conjugados ao anticorpo usando métodosconvencionais (Ver, por exemplo, Hermentin e Seiler (1988) Behring Inst.Mitt. 82, 197-215), incluindo ligadores peptídeo e não peptídeo.

Anticorpos da invenção também podem ser ligados a agentesprodutores de sinal detectável utilizáveis in vivo e in vitro para fins dediagnóstico. O agente produtor de sinal produz um sinal mensurável que édetectável por meios externos, geralmente a medição de radiaçãoeletromagnética. Para a maior parte, o agente produtor de sinal é uma enzimaou cromóforo, ou emite luz por fluorescência, fosforescência ouquimiluminescência. Os cromóforos incluem corantes que absorvem luz naregião de ultravioleta ou visível, e podem ser substratos ou produtos dedegradação de reações catalisadas por enzima.

A invenção ainda contempla o uso de anticorpos com agentesdiagnósticos ou tratamento incorporados em reagentes secundários. Porexemplo, um membro de um par de ligação é ligado ao anticorpo da invenção.Agentes antineoplásicos, por exemplo, são conjugados a segundos membrosdestes pares e são, assim, dirigidos ao sítio onde o anticorpo é ligado. Em umaforma de realização preferida, biotina é conjugada a um anticorpo dainvenção, e deste modo prove um alvo para um agente antineoplásico ou outraporção que é conjugada a avidina ou estreptavidina. Além disso, biotina ouuma outra tal porção é ligada a um anticorpo da invenção e usada como umrepórter, por exemplo em um sistema diagnóstico onde um agente produtor desinal detectável é conjugado a avidina ou estreptavidina.

Anticorpos podem ser administrados em combinação com umou mais adjuvantes apropriados, como, por exemplo, citoquinas (IL-10 e IL-13, por exemplo) ou outros estimulantes imunes, como, mas não limitados aquimioquina, antígenos associados a tumor, e peptídeos. Deve-se notar, noentanto, que a administração de um anticorpo sozinho é suficiente paraprevenir, inibir ou reduzir a progressão do tumor de um modoterapeuticamente efetivo.

Em algumas formas de realização, pode ser desejáveladministrar um anticorpo da invenção que se liga a um RTK e bloqueia aligação ao ligando em combinação com uma outra proteína de ligação aantígeno que se liga ao ligando. Os anticorpos de ligação ao ligando são bemconhecidos na técnica e incluem, por exemplo, anti-VEGF (Avastin®;bevacizumab).

Os anticorpos da invenção também devem ser usados emmétodos de tratamento combinado por administração com um agenteantineoplásico como um agente quimioterapêutico ou um radioisótopo.Agentes quimioterapêuticos apropriados são conhecidos dos versados natécnica e incluem irinotecan (CPT-11), antraciclinas (por exemplo,daunomicina e doxorrubicina), metotrexato, vindesina, neocarzinostatina,cisplatina, clorambucila, citosina arabinosida, 5-fluorouridina, melfalan,ricina e calicheamicina. Um anticorpo e um agente antiangiogênico ouantineoplásico são administrados a um paciente em quantidades eficazes parainibir a angiogenese e/ou reduzir o crescimento de tumor. Os anticorpostambém devem ser administrados em combinação com outros regimes detratamento, por exemplo, com tratamentos como terapia de radiação. Paraexemplos de terapias em combinação, ver, por exemplo, patente US6.217.866 (Schlessinger et al.) (anticorpos anti-EGFR em combinação comagentes antineoplásicos); WO 99/60023 (Waksal et al.) (anticorpos anti-EGFR em combinação com radiação).

Qualquer agente antineoplásico apropriado pode ser usado,como um agente quimioterapêutico, radiação ou combinação dos mesmos. Osagentes antineoplásicos conhecidos na técnica ou sendo avaliados podem seragrupados em classes com base em seu alvo ou modo de ação. Por exemplo,agentes alquilantes incluem, mas não estão limitados a cisplatina,ciclofosfamida, melfalan e dacarbazina. Exemplos de antimetabólitosincluem, mas não estão limitados a doxorrubicina, daunorrubicina epaclitaxel, gencitabina, e inibidores de topoisomerase irinotecan (CPT-11),aminocamptotecina, camptotecina, DX-8951f, e topotecan (topoisomerase I) eetoposida (VP-16) e tenoposida (VM-26) (topoisomerase II). Para a radiação,a fonte pode ser tanto externa (terapia de radiação de feixe externo - EBRT)ou interna (braquiterapia - BT) ao paciente sendo tratado. Estas classificaçõespodem ser utilizáveis para escolher um uso do agente antineoplásico. Porexemplo, observa-se que os anticorpos que ligam IGFR podem serparticularmente efetivos quando administrados com um inibidor detopoisomerase.

A dose do agente antioneoplásico administrado depende denumerosos fatores, incluindo, por exemplo, o tipo de agente, o tipo eseveridade do tumor sendo tratado e a via de administração do agente. Deveser enfatizado, no entanto, que a presente invenção não está limitada aqualquer dose particular.

Em uma terapia de combinação, o anticorpo é administradoantes, durante, ou após o início da terapia com um outro agente, bem comoqualquer combinação do mesmo, isto é, antes e durante, ante e após, durante aapós, ou antes, durante e após iniciar a terapia com agente antioneoplásico.Por exemplo, para tratamento de um tumor ou doença neoplásica, o anticorpopode ser administrado entre 1 e 30 dias, preferivelmente 3 e 20 dias, maispreferivelmente entre 5 e 12 dias antes de iniciar a terapia de radiação. Emuma forma de realização preferida da invenção, quimioterapia é administradasimultaneamente com, antes de, ou subseqüente à terapia com anticorpo.

Na presente invenção, qualquer via ou método apropriadopode ser usado para administrar os anticorpos da invenção e, opcionalmente,co-administrar os agentes antineoplásicos, antagonistas de receptor, ou outracomposição farmacêutica. Por exemplo, regimes de agentes antineoplásicosutilizados de acordo com a invenção incluem qualquer regime que se acreditaser otimamente apropriado para o tratamento de uma condição neoplásica dopaciente. Malignidades diferentes podem requerer o uso de anticorposantitumor específicos e agentes antineoplásicos específicos que serãodeterminados em uma base de paciente para paciente. As vias deadministração incluem, por exemplo, administração oral, intravenosa,intraperitoneal, subcutânea ou intramuscular. A dose do agente antineoplásicoadministrado depende de numerosos fatores, incluindo, por exemplo, o tipo deagente neoplásico, o tipo e severidade do tumor sendo tratado e da via deadministração do agente antineoplásico. Deve ser enfatizado, no entanto, quea presente invenção não está limitada a qualquer método ou via particular deadministração.

Entende-se que os anticorpos da invenção, quando usados emum mamífero para o fim de profilaxia ou tratamento, serão administrados naforma de uma composição compreendendo adicionalmente um veículofarmaceuticamente aceitável. Veículos farmaceuticamente aceitáveisapropriados incluem, por exemplo, um ou mais de água, solução salina,solução salina tamponada com fosfato, glicerol, etanol e outros, bem comocombinações dos mesmos. Veículos farmaceuticamente aceitáveis podemainda compreender quantidades menores de substâncias auxiliares comoagentes umectantes ou emulsificantes, conservantes ou tampões, quemelhoram a vida em prateleira ou efetividade das proteínas de ligação. Ascomposições da invenção podem, como conhecido na técnica, ser formuladasde modo a prover uma liberação sustentada ou retardada, rápida, doingrediente ativo após a administração ao mamífero.

A presente invenção também inclui kits para inibir ocrescimento de tumor e/ou angiogenese, ou tratar outras doenças,compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo dainvenção. Anticorpos humanos ou humanizados são preferidos. Os kits podemainda conter qualquer antagonista apropriado de, por exemplo, um outroreceptor de fator de crescimento envolvido em tumorigenese ou angiogenese(por exemplo, EGFR, VEGFR, VEGFR-I/Flt-1, VEGFR-2/Flk-l/KDR,IGFR, PDGFR, NGFR, FGFR, etc., como descrito acima). Alternativamente,ou além disso, os kits da presente invenção podem ainda compreender umagente antinéoplásico. Exemplos de agentes antineoplásicos apropriados nocontexto da presente invenção são descritos aqui. Os kits da presente invençãopodem ainda compreender um adjuvante; exemplos também são descritosacima.

Também está incluído dentro do escopo da presente invençãoo uso dos anticorpos da presente invenção in vivo e in vitro para métodos deinvestigação ou de diagnóstico, que são bem conhecidos na técnica. Osmétodos de diagnóstico incluem kits que contêm os anticorpos da presenteinvenção.

Portanto, os presentes anticorpos de ligação a receptor podem,assim, ser usados in vivo e in vitro para métodos de investigação, dediagnóstico, de profilaxia ou de tratamento, que são bem conhecidos natécnica. Naturalmente, deve ser entendido e esperado que variações dosprincípios da invenção aqui descrita podem ser feitas por um versado natécnica e pretende-se que estas modificações devem ser incluídas dentro doescopo da presente invenção. Todas as referências mencionadas aqui sãoincorporadas por referência em sua totalidade.

EXEMPLOS

Os seguintes exemplos ainda ilustram a invenção, mas nãodevem ser considerados como limitando o escopo da mesma de modo algum.Descrições detalhadas de métodos convencionais, como os empregados naconstrução de vetores e plasmídeos, a inserção de genes codificandopolipeptídeos em tais vetores e plasmídeos, a introdução de plasmídeos emcélulas hospedeiras, e a expressão e determinação dos mesmos de genes eprodutos de genes podem ser obtidos a partir de numerosas publicações,incluindo Sambrook , J. et ai., (1989) Molecular Cloning: A LaboratoryManual, 2a. Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press; e Coligan, J. et al.(1994) Current Protocols in Immunology, Wiley & Sons, Incorporated.

Seleção de anticorpos anti-mPDGFRa humano debiblioteca Fab de exibição de fago. Uma biblioteca de exibição de fagos Fabhumano nativo extensa de Dyax (contendo 3,7 χ IO10 clones) foi usada paraselecionar anticorpos dirigidos contra proteína mPDGFRa-Fc (R&D Systems(Minneapolis, MN). O lote da biblioteca (100 μΐ) foi cultivado na fase Iog em20 ml de meio 2YTAG, recuperado com fago auxiliar M13K07, e amplificadadurante a noite em meio 2YTAK (2YT contendo 100 μg/ml de ampicilina e50 μg/ml de canamicina) a 3 O0C. As preparações de fago foram precipitadasem 4% de PEG, NaCl 0,5 M. As preparações de fago foram recolocadas emsuspensão em 1 ml de leite desnatado a 3%/PBS contendo 240 μg de IgG nãorelacionada e incubadas a 37°C durante 1 h para bloquear a ligação nãoespecífica e a ligação à etiqueta Fc da proteína mPDGFRa.

Três ciclos de seleção foram realizados em mPDGFRa-Fccom quantidades decrescentes de proteína (50, 10 e 2 μg, respectivamente)revestidas em tubos de seleção. Para cada ciclo de seleção, tubos MaxisorpStar revestidos com mPDGFRa-Fc (Nunc, Rosklide, DenMark) foramprimeiro bloqueados com 3% de leite/PBS a 37 0C durante 1 h, e entãoincubados com a preparação de fago em temperatura ambiente durante 1 h. Ostubos foram lavados 15 vezes com PBST (PBS contendo 0,1% de Tween 20)seguido por 15 lavagens com PBS. O fago ligado foi eluído em temperaturaambiente durante 10 min com 1 ml de uma solução recentemente preparadade trietilamina 100 mM (Sigma). O fago eluído foi incubado com 10 ml decélulas TGl de fase meio-log a 37 0C durante 30 min estacionários e 30 minem agitação. As células TGl infectadas foram granuladas, depositadas em trêsplacas 2YTAG, e incubadas durante a noite a 3 O0C. Todas as colôniascultivadas nas placas foram raspadas em 3-5 ml de meio 2YTA, misturadascom glicerol (concentração final: 10%), divididas em alíquotas e armazenadasa -80°C. Para ciclos subseqüentes de seleção, o lote de fagos (100 μΐ) do cicloanterior de seleção foi amplificado e usado para seleção após o procedimentodescrito acima com quantidade diminuída de mPDGFRa/Fc para revestir ostubos Maxisorp Star.

Para estimar os fagos de entrada, 10 μΐ de fagos antes daseleção foram usados para infectar as células TG1, e então titulados em placas2YTAG. Para estimar a recuperação de fago da seleção, 10 μΐ de célulasinfectadas TGl com fago eluído, do procedimento de seleção acima, foramtitulados em placas 2YTAG. Os rendimentos de recuperação para cada ciclode seleção foram calculados e aumentados nos ciclos sucessivos (primeirociclo, 1x10%; segundo ciclo, 4xl0"6%; terceiro ciclo, 2 χ 10"4%) apesar de serdiminuído o revestimento com mPDGFRa/Fc.

Triagem ELISA para anticorpos com atividades de ligaçãoe de bloqueio. Após os 2° e 3° ciclos de seleção, 190 clones de cada cicloforam selecionados aleatoriamente e testados para atividades de ligação e debloqueio por tanto ELISA de fagos como ELISA de Fabs. Brevemente, osclones de TGl recuperados após os 2° e 3a ciclos de seleção foramselecionados aleatoriamente e cultivados a 37 0C em placas de 96 cavidades.Para produzir os fagos, as células foram resgatadas com o fago auxiliarM13K07 como descrito acima. Para produzir Fab solúvel, as células foramincubadas em meio 2YTA contendo 1 mM de IPTG. Para o ELISA deligação, as preparações de fagos e os sobrenadantes de cultura de célulascontendo Fab solúvel foram bloqueadas com 1/6 volume de 18% de leite/PBSem temperatura ambiente durante 1 h. A preparação de fagos bloqueados ousobrenadantes de cultura de células foram então adicionados a placas demicrotitulação de 96 cavidades (Nunc) revestidas com mPDGFRa/Fc (1μg/ml, 50 μΐ, a 4°C durante a noite), e incubados em temperatura ambientedurante 1 h. Após incubação em temperatura ambiente durante 1 h, as placasforam lavadas 3 vezes com PB ST.

Para o ELISA de fagos, as placas foram incubadas com umconjugado anticorpo-HRP de fago anti-M13 (Amersham Biosciences). Para oELISA de Fab, as placas foram incubadas com um conjugado anticorpo-HRPde Fab anti-humano (Jackson ImmunoResearch Laboratory). Após trêslavagens, a cor foi revelada pela adição de substrato TMB peroxidase (KPL,Gaithersburg, MD), e a absorbância foi medida a 450 nM usando uma leitorade microplaca (Molecular Device, Sunnyvale, CA). ELISAs para ligação aIgG ICll também foram realizados para eliminar os anticorpos específicosFc identificados como aglutinantes na triagem de biblioteca. Mais do que 77%dos clones selecionados após a 2~ seleção, e 99% dos clones recuperados apósa 3~ edição eram positivos em teste de ligação a mPDGFRa, sugerindo umaalta eficiência do processo de seleção.

Para o ELISA de bloqueio, preparações de 50 μΐ de fagos ousobrenadantes de cultura de Fabs foram misturadas com uma quantidade fixade mPDGFRa-Fc (0,5 μg/ml) e incubadas em temperatura ambiente durantemin. A mistura foi então transferida para placas de 96 cavidades pré-revestidas com rhPDGF-AA (0,5 μg/ml; R&D Systems, Minneapolis, MN) eincubada em temperatura ambiente durante 1 h. Para quantificar a proteína demPDGFRa-Fc ligada, as placas foram então incubadas em temperaturaambiente durante 1 h com um conjugado anticorpo-HRP anti-humano-Fc decoelho, seguido por três lavagens e adição do substrato de TMS peroxidase. Aproteína mPDGFRa-Fc ligada foi quantificada por leitura da absorbância a450 nM. A atividade de bloqueio foi indicada por sinal de ELISA diminuídodetectado por conjugado anticorpo-HRP anti-humano-Fc. Cerca de 4,2% dosclones que ligaram mPDGFRa mostraram atividade de bloqueio de PDGF-AA.

Com base nos resultados de testes de bloqueio, 14 clones,incluindo um aglutinante de não-bloqueio como um clone de controle (3F3),foram inicialmente selecionados para outro estudo. DNAs de fagemídio foramisolados e as seqüências de DNA foram determinadas por sequenciamento dedideoxinucleotídeos. A classificação e alinhamentos de genes VH e VL foramrealizados usando o sítio da web Bioinformatics de Andrew C.R. Martin'sBioinformatics Group (www.bioinf.org.uk) e MagAlign de DNAstar.

Análise de anticorpos anti- mPDGFRa selecionados.Dentre os 14 clones, 9 anticorpos distintos foram revelados (Tabela 1). Alémde IClO e IF2, não foram encontrados VHs ou V|Ls idênticos.Interessantemente, quatro dos anticorpos com atividade de bloqueio maisforte tinham cadeias leves incompletas. Os clones IF2 e IF9 tinham deleçõesde Vl na armação (seqüência de peptídeos líder seguida por seqüência de Cl).Os clones IClO e 1F2 compartilharam o mesmo gene Vh- No entanto, umavez que a seqüência de IClO codificando Vl incluía um códon de parada, esteCl não foi expressado. O clone 3G7 incluindo um códon de parada apareceuna extremidade 5' do gene VL. Tanto IClO como 3G7 demonstraram um fortebloqueio. A expressão de Fab e atividade de ligação pareceram ser muitobaixas, mas podem ser levadas em conta pela fraca ligação do reagentesecundário de Fab anti-humano.Tabela 1 - Anticorpos anti- mPDGFRa de uma biblioteca de exibição de fagos Fabs

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Seqüências de nucleotídeos e de aminoácidos para os Fabs sãocomo a seguir: domínio Vh de 1E10: SEQ ID Nos: 51 e 52; domínio Vl de1E10: SEQ ID Nos: 53 e 54; domínio Vh de 1A12: SEQ ID Nos: 55 e 56;domínio Vl de 1A12: SEQ ID Nos: 57 e 58; domínio Vh de 3B2: SEQ IDNos: 59 e 60; domínio Vl de 3B2: SEQ ID Nos: 61 e 62; domínio Vh de1C10: SEQ ID Nos: 63 e 64; domínio Vl de 1C10: SEQ ID Nos: 65 e 66;domínio Vh de 3G7: SEQ ID Nos: 67 e 68; seqüência de nucleotídeos dodomínio Vl de 3G7: SEQ ID No: 69; domínio Vl de 3G7: QAW; domínio Vhde 1F9: SEQ ID Nos: 70 e 71; domínio Vl de 1F9: SEQ ID Nos: 72 e 73;domínio Vh de 1F2: SEQ ID Nos: 74 e 75; domínio Vl de 1F2: SEQ ID Nos:76 e 77. A figura 15 mostra cada um dos domínios (incluindo as truncagensde Vl ou deleções de 3G7, 1F9 e 1F2) e as localizações das regiões de CDR.

Os fragmentos Fab de seis clones foram expressados emcélulas hospedeiras HB2151 de E. Coli, e purificados pela coluna G deproteína por cromatografia de afinidade. Os fagemídeos dos clonesselecionados individuais foram usados para transformar uma HB2151 dehospedeiro de E. Coli não supressor. A expressão de fragmentos Fabs emHB2151 foi induzida cultivando as células em meio 2YTA contendo 1 mM deIPTG a 3O0C. Um extrato periplasmático das células foi preparado comodescrito por Lu (χ). A proteína de Fab solúvel foi purificada usando umacoluna de proteína G seguindo o protocolo do fabricante (AmershamBiosciences). Para examinar a pureza e o peso molecular da preparação, osanticorpos purificados foram submetidos a eletroforese em 4-12% de gel Bis-Tris NuPAGE™ (Invitrogen) e visualizados por coloração com a solução deSimplyBlue™ SafeStain (Invitrogen).

As proteínas de ligação purificadas foram analisadas por SDS-PAGE (figura 2). Fabs com cadeias leves completas aparecem na figura 2Acom pesos moleculares de cerca de 50.000. Em contraste, fragmentos nãoreduzidos de 1F2 e 1F9 deram bandas pequenas (-DTT: MW ~ 37.500) comocomparado com um Fab de controle padrão (figura 2B). Em condições deredução (+DTT), duas bandas foram evidentes, a banda superior consistentecom o tamanho normal de fragmentos VH=CHl, e as bandas inferioresconsistentes com cadeias leves tendo fragmentos CL (MW ~ 12.500) masfaltando os domínios variáveis.

Ligação de mPDGFRa e bloqueio de mPDGFRa / PDGF-AA por anticorpos anti-mPDGFRa. Fragmentos Fabs solúveis de seisclones anti- mPDGFRa foram comparados quantitativamente em suaeficiência de ligação a antígeno e potência par bloquear a interação demPDGFRa/ PDGF-AA. No teste de ligação, o Fab foi primeiro incubado emuma placa de 96 cavidades pré-revestida com proteína de fusãomPDGFRa/Fc (1 μg/ml) em temperatura ambiente durante 1 h, seguido porincubação com um conjugado anticorpo-HRP Fab anti-anti-humano de coelhodurante mais 1 h. O anticorpo-HRP ligado à placa foi então quantificado pelaadição de substrato de peroxidase. Consistente com o resultado da triageminicial (tabela 1), Fab 1F2 liga-se muito mais eficientemente a mPDGFRa doque todas as outras proteínas Fab (figura 3A).

A cinética de ligação de vários anticorpos anti- mPDGFRa foideterminada por ressonância de plasmon de superfície usando um biossensorBIAcore 3000 e avaliada usando o programa BIA Evaluation 2.0 (Biacore,Inc., Uppsala, Suécia). A constante de afinidade, Kd, foi calculada a partir darelação da taxa de dissociação (^desligado)/ taxa de associação (Migado). Osvalores descritos representam a média ± desvio padrão, de pelo menos duasdeterminações para Fabs e três determinações para IgG. (Tabela 2).Consistente com os testes de ligação, o anticorpo sVD 1F2 tem afinidademuito maior (Kd) de cerca de 0,5 nM, mais do que 23 vezes mais alta do que oFab normal selecionado, IEl0.

Na tabela 2, Fab 1F2-2H é um Fab divalente engenheiradocontendo um segundo domínio VH idêntico expressado como uma fusão paraCL. O Fab divalente foi expressado em E. coli e purificado por cromatografiade proteína G. Análise SDS-PAGE do Fab 1F2-2H purificado demonstrouuma banda de proteína única de aproximadamente 50 kD, similar à dofragmento Fab padrão (figura 5). A afinidade do Fab divalente é 79,5 pM,comparado a 418 pM para o Fab 1F2 mono valente, indicando uma melhora de5,2 vezes (tabela 2).

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No teste de bloqueio, várias quantidades de anticorpos foramincubadas com uma quantidade fixa de fusão mPDGFRa/Fc em solução,durante 30 min, e as misturas foram então transferidas para placas de 96cavidades revestidas com rhPDGF-AA e incubadas durante 1 h. mPDGFRaligado foi então quantificado por quantificação de Fc-Ab anti-humano ligado.O Fb 1F2 bloqueou fortemente a interação de mPDGFRa/PDGF-AA (figura-3B), com o valor IC50 de 12 nM, comparado com 57, 140 e 220 nM para 1F9,IElO e IAl 1, respectivamente. Em uma base molar igual, o Fab divalentemostrou uma atividade moderadamente melhorada tanto na ligação amPDGFRa como no bloqueio da interação receptor/ligando (figura 6).

Clonagem, expressão e purificação de IgG completa. Fabsde clones selecionados foram convertidos em IgGs de comprimento completoclonando os domínios VH e VL no vetor de expressão de cadeia pesada,pDFc, e vetor de expressão de cadeia leve, pLCk, respectivamente. O pDFctem sítios de clonagem Hind III e Nhe I entre os genes de codificação de umaseqüência de peptídeo líder e CHl. O pLCk tem sítios de clonagem Hind III eBsiW I entre uma seqüência de peptídeo líder e CL. Brevemente, os genes decodificação de VH e VL foram amplificados por PCR de transcrição reversade DNAs fagemídeos e clonados em seus respectivos vetores de expressão.Os vetores de expressão de cadeia pesada e cadeia leve (VH-pDFc e VL-pLCk) foram então co-transfectados em células COS-7 para expressãotransiente como anteriormente descrito. Os meios de cultura de células foramcoletados em 48 e 96 horas após a transfecção, e reunidos. Os anticorposforam purificados do sobrenadante de culturas de células por cromatografia deafinidade usando colunas de proteína A seguindo o protocolo do fabricante(Amersham Biosciences). Após a função de IgG ser confirmada, os paresexpressados de genes VH e VL foram clonados em vetores de expressãoúnicos e transfectados em células COS-7. A purificação dos anticorpos foicomo descrito acima.

Três construções de tipo IgG foram produzidas a partir de Ig1F2 que contém somente um VH (ver figura 7), incluindo IgG de IF2-2Htetravalente com quatro VHs (A), e IF2 divalente com Vh de 1F2 expressadocomo uma fusão tanto a Ch como a Cl (B e C). Os plasmídeos para expressaras cadeias leves e pesadas foram usados para co-transfectar as células COS-7para expressão transiente. Os níveis de expressão dos anticorpos forammonitorados por ELISA usando os sobrenadantes de culturas de células. Aexpressão de 1F2-2H foi consistentemente menor do que ambos os anticorpos1F2 divalentes, cerca de um quarto de anticorpos 1F2 divalentes. Osanticorpos do sobrenadante de culturas de células foram purificados porcromatografia de afinidade usando uma coluna de proteína A.

Clone IElO, um bloqueador com componentes de anticorposnormais, também foram convertidos em uma IgG de comprimento completo.Os genes de Vh e Vl de IElO foram primeiro clonados em pDFc e pLCk,respectivamente. Como acima, após sequenciamento de DNA e confirmaçãoda atividade de ligação a IgG de IE10, o par VH/VL expressado foi clonadoem um vetor de expressão único que foi então usado para transfectar ascélulas COS-7 seguido por purificação de anticorpos.

Anticorpos purificados foram analisados por SDS-PAGE paradeterminar a pureza e o peso molecular da preparação. Os anticorposdivalentes 1F2-CH/CL e 1F2-CL/CH, com MW ~ 125.000, migraram maisrápido do que a IgG normal (1E10 e 2B4; painel à esquerda da figura 8).Quando os anticorpos foram tratados com DTT antes de eletroforese (painel àdireita da figura 8), os componentes de cadeias pesadas e leves foramresolvidos. O anticorpo 1F2-CH/CL tinha uma banda superior correlacionadacom uma cadeia pesada similar à de IElO e 2B4, e uma banda inferiormigrando rápido com uma mobilidade próxima à antecipada (MW ~ 12.500,somente CL). O anticorpo 1F2-CL/CH, por outro lado, mostrou que a bandainferior representa uma cadeia leve com mobilidade similar à de IElO e 2B4,e a banda superior correlaciona com o polipeptídeo ChI-Fc somente (MW ~37.500).

Atividades de ligação e de bloqueio dos anticorpos anti-mPDGFRa de comprimento completo. Todos os três anticorpos variantesde 1F2 purificados, 1F2-2H, 1F2-CH/CL e 1F2-CL/CH e o anticorpo IElOforam comparados para sua afinidade de ligação a mPDGFRa por ELISA.Várias quantidades de anticorpos foram incubadas na placa de ELISArevestida com mPDGFRa/Fc, anticorpos ligados a mPDGFRa foram entãodetectados por um conjugado anticorpo HRP anti-humano-κ. O resultado deELISA indica que ainda que IgG 1F2-2H tenha quatro sítios de ligação, aatividade de ligação de IF2-2H foi ~ 8x mais baixa do que ambos os IgGs de1F2 divalentes (1F2-CH/CL e 1F2-CL/CH (figura 9A). Por outro lado, ambosos 1F2 divalentes (1F2-CH/CL) e 1F2-CL/CH) tiveram afinidade de ligaçãomuito similar mostrada por ELISA (figura 9A) e análise BIAcore (tabela 2).A afinidade de IgG 1F2 divalente aumentou em cerca de uma grandeza apartir de Fab de 1F2 parental e IgG de IElO aumentou 20 vezes de seu Fab(tabela 2). No todo, as afinidades de ligação de ambos IgGs de 1F2 divalentesem mPDGFRa foram cerca de uma grandeza maior do que IgG de IElO(figura 9A e tabela 2).

Testes de bloqueio quantitativos também foram realizados paraavaliar os anticorpos anti- mPDGFRa. Como descrito acima, váriasquantidades de anticorpos foram incubadas com uma quantidade fixa de fusãode mPDGFRa/Fc em solução, durante 30 min, e as misturas foram entãotransferidas para placas de 96 cavidades revestidas com rhPDGF-AA eincubadas durante 1 h. mPDGFRa ligado foi então quantificado porquantificação de Fc-Ab anti-humano ligado. Consistente com os dados deligação, os 1F2-CH/CL e 1F2-CL/CH divalentes foram melhoresbloqueadores do que IgG de 1F2-2H e IgG de 1E10: os valores IC50 foram3,2, 2,7, 17, e 9,6 nM, para 1F2-CH/CL, 1F2-CL/CH, IgG de 1F2-2H e IgGde IEl0, respectivamente (figura 9B).

Anticorpos biespecíficos. Um anticorpo anti-Flk-1, 2B4,também foi isolado da biblioteca de fagos Fab Dyax usando o mesmoprocedimento descrito acima, exceto que os tubos Maxisorp Star foramrevestidos com proteína de fusão mVEGFR2-Fc. O Fab de 2B4 foi específicopara Flk-I e bloqueou a interação Flk-IATEGFi65. Os domínios Vh e Vl deFab de 2B4 são providos pelas SEQ ID Nos: 79 e 81, respectivamente. Afigura 15 mostra cada um dos domínios e as localizações das regiões de CDR.O Fab de 2B4 foi convertido em IgGl completo como descrito acima. Acinética de ligação de Fab de 2B4 e IgG foi determinada por análise BIA core.As afinidades de ligação de Fab de 2B4 e IgG para mVEGFR2 são 6,7 ±3,0nM e 0,39 ±0,1 nM, respectivamente. IgG de 2B4 bloqueia a interaçãoVEGFR2/VEGFi65 com um valor IC50 de aproximadamente 3,5 nM (figura13B).

Construção de anticorpos biespecíficos com base nosdomínios (anti- mPDGFRa χ anti-Flt-1) - Anticorpos biespecíficos combase nos domínios foram construídos em dois formatos, o formato scFv e oformato Fab (figura 10, A e B). No formato scFv, os fragmentos PCRcodificando os genes VH e VL de 2B4 foram primeiro reunidos usando PCRde sobreposição. O término COOH de VL de 2B4 foi ligado ao término NH2de VH 2B4 via um ligador de 5 aminoácidos (Ala-Ser-Thr-Lys-Gly, obtidosdo terminal N de um domínio CL) (figura 10A). O gene resultante,codificando VL-VH de 2B4, foi então clonado no vetor pDFc via ligaçãoHindIII/ Nhe I para expressão da fusão scFv2B4-CH (consistindo de 2B4 VL-2B4 VH - CHl - CH2 - CH3). O vetor de expressão scFv2B4-CH foi entãoformado em pares com o vetor de expressão 1F2VH-CL como descrito acimapor co-transfecção de células COS-7 para expressão transiente.

No formato Fab, o gene Vh de 1F2 e o Vl de 2B4 foramprimeiro reunidos usando PCR de sobreposição. Nesta fusão, o términoCOOH de Vh 1F2 foi ligado ao término amino de L de 2B4 via um ligador de5 aminoácidos da extremidade 5' de Ch- O gene codificando VH-2B4 VL 1F2foi então clonado no vetor pLCk via os sítios HindIII/BsiWpara expressão daproteína de fusão 1F2 VH-2B4 VL-CL. O gene Vh de 2B4 foi clonado novetor pDFc como descrito acima para expressão de VH. Os plasmídeos paraexpressar cadeias leves e pesadas, formadas em pares como descrito na figura10B, foram usados para co-transfectar células COS-7 para expressãotransiente.

Após os clores serem testados por ELISA para atividades deligação dual, as construções de expressão de Ig foram combinadas em umvetor de expressão único que foi então usado para transfectar as células COS-7 para expressão transiente do IgG projetado. Os anticorpos foram purificadosdo sobrenadante de culturas de células como descrito acima.

Expressão e purificação de anticorpos biespecíficos combase nos domínios. Os anticorpos 1F2/scFv2B4 e 1F2-2B4 foram produzidospor transfecção e expressão transiente em células COS-7 (100-200 ml deculturas de células). Os anticorpos foram purificados dos sobrenadantes deculturas de células por cromatografia de afinidade usando colunas de proteína A.

Anticorpos biespecíficos purificados (1F2/scFv e 1F2-2B4) eseus anticorpos parentais 1F2 e 2B4 foram analisados por SDS-PAGE (figura8). A mobilidade inferior dos anticorpos biespecíficos não tratados (-DTT)estava correlacionada com seu pelo molecular alto (~ 175,000), comocomparado a IgG de 2B4 e 1F2-CH/CL divalente que migraram na posição depeso molecular ~ 125.000. Os dois componentes de cada um de quatroanticorpos foram separadamente resolvidos após tratamento com DTT.Comparando com uma IgG padrão (2B4), a banda inferior do anticorpobiespecífico 1F2/scFv2B4 (a fusão VH-CL) é comparável a uma cadeia levede IgG padrão. A banda superior está correlacionada com uma proteína defusão de cadeia pesada de scFv (MW ~ 62.500). Por outro lado, a bandasuperior de 1F2-2B4 corresponde à cadeia pesada de uma IgG padrão (2B4) ea banda inferior é observada em uma posição esperada para uma fusão deVH-cadeia leve (MW ~ 37.500).

Especificidade dual de anticorpos biespecíficos com baseem domínios. Em um teste de reticulação, o anticorpo 1F2-2B4 biespecífico eos anticorpos 1F2-CH/CL e 2B4 monoespecíficos foram primeiro incubadoscom mPDGFRa ou mVEGFR2 em solução e então transferidos para umaplaca de microtitulação revestida com o segundo receptor (mVEGFR2 oumPDGFRa, respectivamente), seguido por incubação com um anticorpopoliclonal rotulado com biotina para o primeiro receptor. Somente o BsAb,mas não IgG de 2B4 monoespecífica parental e 1F2-CH/CL, foi capaz dereticular os dois receptores de alvo.

A eficiência de ligação a antígeno dos anticorpos biespecíficoscom base nos domínios foi determinada em mPDGFRa imobilizado e Flk-1.ELISA mostrou que o anticorpo biespecífico, 1F2/scFv2B4 e 1F2-2B4, ligou-se a mPDGFRa e Flk-1, mas não tão eficientemente quanto o anticorpo 1F2parental e 2B4 (figura 12). No entanto, em ambos os casos, a ligação doanticorpo 1F2-2B4 foi levemente mais eficiente comparado com1F2/scFv2B4. Como esperado, o 2B4 do anticorpo específico de Flk-I não seliga a mPDGFRa (figura 12A), nem o 1F2 do anticorpo específico demPDGFRa liga-se a Flk-I (figura 12B). A cinética de ligação dos anticorposbiespecíficos para mPDGFRa e Flk-I foi determinada por ressonância deplasmon de superfície usando um instrumento BIAcore (tabela 3). Consistentecom as observações de ELISA, o anticorpo 1F2-2B4 tem maior afinidade paratanto mPDGFRa como Flk-I em comparação com o anticorpo 1F2/scFv2B4.

<table>table see original document page 49</column></row><table><table>table see original document page 50</column></row><table>

A figura 13 mostra que ambos os anticorpos específicosinibem mPDGFRa de se ligar a PDGF-AA imobilizado (figura 13 A) comIC50 estimado de 9,9 nM e 25,3 nM para 1F2/scFv2B4 e 1F2-2B4,respectivamente. Os anticorpos também bloqueiam Flk-I de se ligar aVEGF165 imobilizado (figura 13B) com o valor IC50 de 9,5 nM e 19,5 nM,respectivamente. Como esperado, 2B4 não teve nenhum efeito sobre ainteração de mPDGFRa/PDGF-AA, enquanto 1F2 não teve nenhum efeitosobre a interação Flk-I/VEGFi65.

Apesar da afinidade de ligação do anticorpo biespecífico sermenor na ligação a mPDGFRa e ligação a VEGFR2 comparado a moléculasbivalentes monoespecíficas respectivas, 1F2-CH/CL e IgG de 2B4 (tabela 3),quando examinados para ligação a receptores expressados na superfície decélulas em células eEnd. 1 (as células que expressam tanto mPDGFRa comomVEGFR2), o BsAb demonstrou eficiência mais elevada do que qualquer umdos anticorpos bivalentes monoespecíficos parentais. A intensidade defluorescência média (MFI) nas células foi de 15,7, 31 e 36,9, para 1F2-CH/CL(ligação a mPDGFRa), IgG de 2B4 (ligação a mVEGFR2) e lF2-2B4IgG(ligação a mPDGFRa e nVEGFR2), respectivamente.

Inibição da ativação induzida por ligando de mV£GFR2 emPDGFR. A expressão de mVEGFR2 e mPDGFRa foi demonstrada emcélulas eEnd.l via análise FACS. As células foram incubadas com IgG de2B4, 1F2-CH/CL ou IgG de 1F2-2B4 (10 μ^πιΐ) a 4°C, durante 1 h, seguidopor incubação com um anticorpo Fc anti-humano de cabra rotulado com PE(Jackson ImmunoResearch Lab.) durante mais 1 h, e análise em um sistemaGuava Easycyte (Guava Technologies, Inc,,. Hayward, CA).

Para examinar a fosforilação no receptor, células eEnd. 1 foramdepositadas em placas de 6 cm e cultivadas a 70-80% de confluência, após oque as células foram lavadas duas vezes em PBS e cultivadas durante a noiteem meio isento de soro. As células foram primeiro incubadas com váriosanticorpos a 37 °C durante 30 min, seguido por estímulo com VEGF ouPDGF-AA a 37 °C durante 15 min. As células foram lisadas em tampão delise (Tris-HCl 50 mM, pH 7,4, NaCl 150 nM, 1% de Triton X-100, EDTA 1mM, fluoreto de fenilmetilsulfonila 1 mM, Na3VO4 0,5 nM, 1 μg/ml deleupeptina, 1 μg/ml de pepstatina e 1 μg/ml de aprotinina) durante 1 h,seguido por centrifugação do lisado a 12.000 rpm durante 10 min a 4°C. Osreceptores foram imunoprecipitados do sobrenadante do lisado de célulasusando o anticorpo anti- mPDGFRa (eBioscience, San Diego, CA) ou anti-mVEGFR2 (Santa Cruz, Biotech, Santa Cruz, CA), seguido pela adição de 20μl de pérolas de Pro-A/G-Sepharose (Santa Cruz Biotech). As proteínas dereceptor precipitadas foram resolvidas em um gel Nupage Bis-Tris a 4-12%(Invitrogen) e transferidas para uma membrana de difluoreto depolivinilideno. Fosfo-mVEGFR2 e fosfo- mPDGFRa foram detectados noblot usando um conjugado anticorpo - HRP anti-fosfo-tirosina (Santa CruzBiotech). As proteínas de receptor totais carregadas no gel foram testadas comanticorpos em mPDGFRa ou mVEGFR2 (ambos de Santa Cruz Biotech).

Como mostrado na figura 14, o BsAb inibiu a fosforilaçãoestimulada por tanto PDGF como VEGF de receptores mPDGFRa emVEGFR2, enquanto anticorpos parentais monoespecíficos somentebloquearam a ativação de um receptor único estimulado por seu ligandocognato. Como um controle, o anticorpo anti-EGFR, C225, não teve qualquerefeito sobre a ativação estimulada por ligando de qualquer receptor.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

<110> ImClone Systems, Inc.Zhenping, Zhu

<120> Anticorpos Funcionais

<130> 11245/54376

<140> PCT/US07/04 051

<141> 2007-02-15

<150> 60/773,994

<151> 2006-02-15

<160> 81

<170> PatentIn versão 3.3

<210> 1

<211> 351

<212> DNA

<213> Mus musculus

<220>

<221> CDS<222> (1)..(351)

<400> 1

cag gtc aag ctg cag cag tct ggg gca gag ctt gtg ggg tca ggg gcc 48

Gln Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Gly Ser Gly Ala

1 5 10 15

tca gtc aaa ttg tcc tgc aca act tct ggc ttc aac att aaa gac ttc 96

Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Thr Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Phe

20 25 30

tat atg cac tgg gtg aag cag agg cct gaa cag ggc ctg gag tgg att 144

Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45

gga tgg att gat cct gag aat ggt gat tct ggt tat gcc ccg aag ttc 192

Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Ser Gly Tyr Ala Pro Lys Phe50 55 60

cag ggc aag gcc acc atg act gca gac tca tcc tcc aac aca gcc tac 240

Gln Gly Lys Ala Thr Met Thr Ala Asp Ser Ser Ser Asn Thr Ala Tyr65 70 75 80

ctg cag ctc age age ctg aca tct gag gac act gcc gtc tat tac tgt 288

Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95

aat gca tac tat ggt gac tac gaa ggc tac tgg ggc caa ggg acc acg 336

Asn Ala Tyr Tyr Gly Asp Tyr Glu Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr100 105 110

gtc acc gtc tcc tca 351

Val Thr Val Ser Ser115<210> 2

<211> 117

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 2

Gln Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Gly Ser Gly Ala1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Thr Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Phe20 25 30

Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45

Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Ser Gly Tyr Ala Pro Lys Phe50 55 60

Gln Gly Lys Ala Thr Met Thr Ala Asp Ser Ser Ser Asn Thr Ala Tyr65 70 75 80

Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95

Asn Ala Tyr Tyr Gly Asp Tyr Glu Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr100 105 110

Val Thr Val Ser Ser115

<210> 3

<211> 324

<212> DNA

<213> Mus musculus

<220>

<221> CDS<222> (1)..(324)

<4 00> 3

gac ate gag ctc act cag tet cca geaAsp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala1 5

ate atg tet gea tet cca ggg 48

Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly10 15

gag aag gtc acc ata acc tgc agt gcc age tca agt gta agt tac atg 96

Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met20 25 30

cac tgg ttc cag cag aag cca ggc act tet ccc aaa ctc tgg att tat 144

His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr

35 40 45age aca tcc aac ctg gct tet gga gtc cct gct cgc ttc agt ggc agt 192

Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

gga tet ggg acc tet tac tet ctc aca ato age cga atg gag gct gaa 240

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu

65 70 75 80

gat gct gcc act tat tac tgc cag caa agg agt agt tac cca ttc acg 288

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Phe Thr

85 90 95

ttc ggc tcg ggg acc aag ctg gaa ata aaa cgg gcg 324

Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala

100 105

<210> 4

<211> 108

<212> PRT

<213> Mus musculus

<4 00> 4

Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly15 10 15

Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met20 25 30

His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr35 40 45

Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Phe Thr85 90 95

Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala100 105

<210> 5

<211> 348

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(348)

<4 00> 5gag gtg cag ctg gtg cag tct ggg gga ggc ctg gtc aag cct ggg ggg 48

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

tcc ctg aga ctc tcc tgt gca gcc tct gga ttc acc ttc agt age tat 96

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 30

age atg aac tgg gtc cgc cag gct cca ggg aag ggg ctg gag tgg gtc 144

Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45

tca tcc att agt agt agt agt agt tac ata tac tac gca gac tca gtg 192

Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60

aag ggc cga ttc acc ate tcc aga gac aac gcc aag aac tca ctg tat 240

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

ctg caa atg aac age ctg aga gcc gag gac acg gct gtg tat tac tgt 288

Leu Gln Met AsnSer Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

gcg aga gtc aca gat gct ttt gat ate tgg ggc caa ggg aca atg gtc 336

Ala Arg Val Thr Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val100 105 110

acc gtc tca age 348

Thr Val Ser Ser115

<210> 6

<211> 116

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<4 00> 6

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 30

Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45

Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Val Thr Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val100 105 110

Thr Val Ser Ser115

<210> 7

<211> 321

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS<222> (1)..(321)

<4 00> 7

gaa att gtg atg aca cag tct cca gcc acc ctg tct ttg tct cca ggg 48

Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly15 10 15

gaa aga gcc acc ctc tcc tgc agg gcc agt cag agt gtt age age tac 96

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr20 25 30

tta gcc tgg tac caa cag aaa cct ggc cag gct ccc agg ctc ctc ate 144

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile35 40 45

tat gat tca tcc aac agg gcc act ggc ate cca gcc aga ttc agt ggc 192

Tyr Asp Ser Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly50 55 60

agt ggg tct ggg aca gac ttc act ctc acc ate age age cta gag cct 240

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro65 70 75 80

gaa gat ttt gea act tat tac tgt cta cag cat aac act ttt cct ccg 288

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asn Thr Phe Pro Pro85 90 95

acg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gaa ate aaa 321

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105

<210> 8

<211> 107

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 8

Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly15 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr20 25 30Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile35 40 45

Tyr Asp Ser Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asn Thr Phe Pro Pro85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105

<210> 9

<211> 321

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS<222> (1)..(321)

<4 00> 9

gac ate cag atg acc cag tet cca tet tcc gtg tet gea tet ata gga 48

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Ile Gly15 10 15

gac aga gtc acc ate act tgt cgg gcg agt cag ggt att gac aac tgg 96

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Asp Asn Trp20 25 30

tta ggc tgg tat cag cag aaa cct ggg aaa gcc cct aaa ctc ctg ate 14 4

Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile.35 40 45

tac gat gea tcc aat ttg gac aca ggg gtc cca tca agg ttc agt gga 192

Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Asp Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60

agt gga tet ggg aca tat ttt act ctc acc ate agt age ctg caa gct 240

Ser Gly Ser Gly Thr Tyr Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala65 70 75 80

gaa gat ttt gea gtt tat ttc tgt caa cag gct aaa gct ttt cct ccc 288

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ala Lys Ala Phe Pro Pro85 90 95

act ttc ggc gga ggg acc aag gtg gac ate aaa 321

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys100 105

<210> 10<211> 107<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 10

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Ile Gly1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Asp Asn Trp20 25 30

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Ser Gly Ser Gly Thr Tyr Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ala Lys Ala Phe Pro Pro85 90 95

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<210> 11

<211> 348

<212> DNA

<213> Mus musculus

<220>

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<400> 11

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<210> 12

<211> 116

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<213> Mus musculus

<4 00> 12

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<210> 13

<211> 327

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<213> Mus musculus

<220>

<221> CDS<222> (1) .. (327)<4 00> 13

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<210> 14

<211> 109

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<213> Mus musculus

<400> 14

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<211> 357

<212> DNA

<213> Mus musculus

<220>

<221> CDS<222> (1)..(357)

<400> 15

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<210> 16

<211> 119

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<213> Mus musculus

<400> 16

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<210> 17

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<212> DNA

<213> Mus musculus

<220>

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<4 00> 17

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Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr85 90 95

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys100 105

<210> 19<211> 363

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS<222> (1)..(363)

<4 00> 19

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<210> 20

<211> 121

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<4 00> 20

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<210> 21

<211> 321

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

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<210> 22

<211> 107

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<4 00> 22

Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile35 40 45

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Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Gly Ser Thr Pro Leu85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Ala Glu Ile Lys100 105

<210> 23

<211> 390

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS<222> (1)..(390)

<4 00> 23

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Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser15 10 15

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gct ate age tgg gtg cga cag gcc cct gga caa ggg ctt gag tgg atgAla Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met35 40 45

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<210> 24

<211> 130

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<4 00> 24

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<210> 25

<211> 327

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS<222> (1)..(327)

<4 00> 25

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gat gag gct gac tat tac tgt aac tcc cgg gac aac agt gat aac cgt 288Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Asn Ser Asp Asn Arg85 90 95

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<210> 26

<211> 109

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 26

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Leu Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ser100 105

<210> 27

<211> 378

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS<222> (1)..(378)

<400> 27

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ggc atg cac tgg gtc cgc cag gct cca ggc aag ggg ctg gag tgg gtg 144Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45

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<210> 28

<211> 126

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<4 00> 28

Gln Ala Gln Val Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Ser Gly Arg15 10 15

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Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Glu Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95

Ala Arg Asp His Tyr Gly Ser Gly Val His His Tyr Phe Tyr Tyr Gly100 105 110

Leu Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser115 120 125<210> 29

<211> 324

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS<222> (1) .. (324)

<4 00> 29

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<211> 108

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<4 00> 30

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<210> 31<211> 363

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS<222> (1)..(363)

<4 00> 31

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<210> 32

<211> 121

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<4 00> 32Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr20 25 30

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Ala Arg Asp Asp Tyr Met Asp Val Trp Gly Lys Gly Thr Leu Val Thr100 105 110

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<210> 33<211> 330<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS<222> (1)..(330)

<4 00> 33

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<210> 34

<211> 110

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<213> Homo sapiens

<400> 34

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<210> 35

<211> 334

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS<222> (1)..(333)

<400> 35

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<210> 36

<211> 111

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<4 00> 36

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<210> 37

<211> 342

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220><221> CDS<222> (1)..(342)

<400> 37

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<210> 38

<211> 114

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<213> Homo sapiens

<400> 38

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<210> 39

<211> 372

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS<222> (1)..(372)

<400> 39

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<213> Homo sapiens

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<210> 41

<211> 333

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS<222> (1)..(333)

<4 00> 41

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<210> 42

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<213> Homo sapiens

<400> 42

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<210> 43

<211> 381

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

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<400> 43

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<210> 44

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Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 120 125<210> 45

<211> 345

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS<222> (1)..(345)

<400> 45

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<210> 46

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<213> Homo sapiens

<4 00> 46

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Leu Leu Ile Ser Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys85 90 95

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<210> 47

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<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS<222> (1) .. (372)

<400> 47

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<210> 48

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<213> Homo sapiens

<400> 48

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<210> 49

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<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS<222> (1)..(339)

<4 00> 49

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<210> 50

<211> 113

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<213> Homo sapiens

<4 00> 50

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<210> 51<211> 369<212> DNA<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS<222> (1)..(369)

<4 00> 51

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<210> 52

<211> 123

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<4 00> 52

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln15 10 15

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<210> 53

<211> 327

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS<222> (1) . . (327)

<4 00> 53

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Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Leu Glu65 70 75 80

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Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 105

<210> 54

<211> 109

<212> PRT

<213> Homo sapiens<400> 54

Glu Thr Thr Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly1 5 10 15

Glu Arg Gly Thr Leu Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Val Thr Arg Asn20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Ala Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu35 40 45

Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Leu Arg Phe Ser50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Leu Glu65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Glu Ile Ser Pro85 90 95

Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 105

<210> 55

<211> 360

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS<222> (1)..(360)

<400> 55

cag gtg cag ctg cag gag tcc ggc cca gga ctg gtg aag cct tcg gag 48

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65 70 75 80

tcc ctc aag ctg age tct gtg acc gcc gea gac acg gcc gtg tat tac 288Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr85 90 95

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<210> 56<211> 120<212> PRT<213> Homo

<400> 56

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Cys Ala Arg Ala Gly Gly Ser Ser Thr Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln100 105 110

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<210> 57<211> 339<212> DNA<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS<222> (1)..(339)

<400> 57

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1 5 10 15

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35 40 45

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<210> 58

<211> 113

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 58

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Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala85 90 95Leu Arg Thr Pro Leu Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys100 105 110

Arg

<210> 59

<211> 351

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS<222> (1)..(351)

<400> 59

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<210> 60

<211> 117

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<4 00> 60

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Arg Gly Gln Trp Leu Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu100 105 110

Val Thr Val Ser Ser115

<210> 61

<211> 327

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS<222> (1)..(327)

<4 00> 61

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<210> 62

<211> 109

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 62

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Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Leu85 90 95

Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 105

<210> 63

<211> 360

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS<222> (1)..(360)

<4 00> 63

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<210> 64

<211> 120

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<4 00> 64

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Ala Arg Gly Tyr Gly Ser Tyr Gln Lys Arg Phe Asp Tyr Trp Gly Gln100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 120

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<220>

<221> CDS<222> (1)..(384)

<400> 65

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<210> 66

<211> 127

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<4 00> 66

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Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Arg85 90 95

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Gln Thr Asn Cys Gly Cys Thr Ile Cys Leu His Leu Pro Ala Ile115 120 125

<210> 67

<211> 360

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS<222> (1)..(360)

<400> 67

gag gtc cag ctg gtg cag tct ggg gct gag gtg aag aag cct ggg gcc 4 8

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<210> 68<211> 120<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 68

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Ala Arg Ala Pro Trp Ser Gly Arg Arg Arg Phe Asp Tyr Trp Gly Gln100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 120

<210> 69

<211> 12

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(12)

<4 00> 69cag gcg tgg tgaGln Ala Trp1

<210> 70

<211> 360

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS<222> (1)..(360)<4 00> 70

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<210> 71

<211> 120

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<4 00> 71

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Glu Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala15 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr20 25 30

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Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Gly Tyr Gly Ser Tyr Gln Lys Arg Phe Asp Tyr Trp Gly Gln100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 120

<210> 72

<211> 33

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS<222> (1)..(33)

<4 00> 72

cag gtc caa ctg cag gag ctc gag ate aaa cgt 33

Gln Val Gln Leu Gln Glu Leu Glu Ile Lys Arg1 5 10

<210> 73

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<4 00> 73

Gln Val Gln Leu Gln Glu Leu Glu Ile Lys Arg15 10

<210> 74

<211> 360

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS<222> (1)..(360)

<4 00> 74

gag gtc cag ctg gta cag tet gga gct gag gtg aag aag cct ggg gcc 48

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala15 10 15

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20 25 30

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<210> 75

<211> 120

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<4 00> 75

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala15 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr20 25 30

Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met35 40 45

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Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80

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Ala Arg Gly Tyr Gly Ser Tyr Gln Lys Arg Phe Asp Tyr Trp Gly Gln100 105 110

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<210> 76

<211> 33

<212> DNA

<213> Homo sapiens<220>

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Gln Val Gln Leu Gln Glu Leu Glu Ile Lys Arg1 5 10

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<212> PRT

<213> Homo sapiens

<4 00> 77

Gln Val Gln Leu Gln Glu Leu Glu Ile Lys Arg15 10

<210> 78

<211> 351

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(351)

<4 00> 78

cag ctg cag ctg cag gag tcg ggg gga ggc ttg gtc cag cct ggg ggg 48

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85 90 95

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<211> 117

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<4 00> 79

Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly15 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 30

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Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95

Ala Thr Tyr Pro Phe Gly Val Val His Asn Trp Gly Gln Gly Thr Leu100 105 110

Val Thr Val Ser Ser115

<210> 80

<211> 339

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS<222> (1)..(339)

<400> 80

gaa att gtg ctg act cag tct cca ctc tcc ctg ccc gtc acc cct gga 48

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly15 10 15

gag ccg gcc tcc ate tcc tgc agg tct agt cag age ctc ctg cat agt 96

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser20 25 30

aat gga ttc aac tat ttg gat tgg tac ctg cag aag cca ggg cag tct 144

Asn Gly Phe Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser35 40 45cca cac ctc ttg ate tat ttc ggt tet tat cgg gcc tcc ggg gtc cct 192

Pro His Leu Leu Ile Tyr Phe Gly Ser Tyr Arg Ala Ser Gly Val Pro50 55 60

gac agg ttc agt ggc agt gga tca ggc aca gat ttt aca ctg aaa ate 240

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile65 70 75 80

age aga gtg gag gct gag gat gtt ggg att tat tac tgc atg caa aat 288

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Met Gln Asn85 90 95

ctt caa act ccg tgg acg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gat ate aaa 336

Leu Gln Thr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys100 105 110

cga 339

Arg

<210> 81

<211> 113

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 81

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly15 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser20 25 30

Asn Gly Phe Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser35 40 45

Pro His Leu Leu Ile Tyr Phe Gly Ser Tyr Arg Ala Ser Gly Val Pro50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Met Gln Asn85 90 95

Leu Gln Thr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys100 105 110

Arg- 45 -NYOl 1314242 vl

- 1 -NY01 1314242 ν1

Claims

1. Proteína de ligação a antígeno, caracterizada pelo fato decompreender um complexo de dois primeiros polipeptídeos e dois segundospolipeptídeos,cada primeiro polipeptídeo tendo um primeiro sítio de ligaçãoa antígeno localizado no término N de um domínio constante de cadeia levede imunoglobulina (domínio CL), referido domínio Cl capaz de associaçãoestável com um primeiro domínio constante de cadeia pesada deimunoglobulina (domínio CrI ),cada segundo polipeptídeo tendo um segundo sítio de ligação aantígeno localizado no término N de um domínio Ch 1, referido domínio ChIseguido por um ou mais domínios constantes de cadeia pesada capazes deuma auto-associação estável;em que pelo menos um referido primeiro sítio de ligação aantígeno e referido segundo sítio de ligação a antígeno é um domínio variávelúnico (sVD).

2. Proteína de ligação a antígeno de acordo com areivindicação 1, caracterizado pelo fato de que tanto o referido primeiro comoo segundo sítios de ligação a antígeno são domínios variáveis únicos (sVDs).

3. Proteína de ligação a antígeno de acordo com areivindicação 1, caracterizada pelo fato de que um dentre referidos primeiro esegundo sítios de ligação a antígeno é um domínio variável único (sVD) e ooutro dos referidos primeiro e segundo sítios de ligação a antígeno é umacadeia única Fv (scFv).

4. Proteína de ligação a antígeno, caracterizada pelo fato decompreender um complexo de dois primeiros polipeptídeos e dois segundospolipeptídeos;cada primeiro polipeptídeo compreendendo uma cadeia pesadade imunoglobulina composta de um domínio variável e domínios constantes;cada segundo polipeptídeo compreendendo uma cadeia leve deimunoglobulina composta de um domínio variável e um domínio constante;em que os dois primeiros polipeptídeos e os dois segundospolipeptídeos se associam estavelmente para formar uma molécula de tipo deimunoglobulina;em que os domínios variáveis das cadeias pesadas deimunoglobulina se associam estavelmente com os domínios variáveis dascadeias leves de imunoglobulina para formar primeiros sítios de ligação aantígeno; e em que um ou ambos dentre os referidos primeiro e segundopolipeptídeos ainda compreende um segundo sítio de ligação a antígeno dedomínio variável de cadeia única (sVD) no término N ou término C.

5. Proteína de ligação a antígeno de acordo com qualquer umadas reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que referidos primeirossítios de ligação a antígeno e referidos segundos sítios de ligação a antígenotem diferentes especificidades.

6. Proteína de ligação a antígeno de acordo com areivindicação 5, caracterizada pelo fato de que referidas especificidadesdiferentes são para epítopos que residem em diferentes antígenos.

7. Proteína de ligação a antígeno de acordo com areivindicação 5, caracterizada pelo fato de que as referidas diferentesespecificidades são para epítopos que residem no mesmo antígeno.

8. Proteína de ligação a antígeno de acordo com qualquer umadas reivindicações 1 e 2, caracterizada pelo fato de que referidos primeirossítios de ligação a antígeno de referidos segundos sítios de ligação a antígenotem a mesma especificidade.

9. Proteína de ligação a antígeno de acordo com qualquer umadas reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que referidos domíniosconstantes são domínios constantes humanos.

10. Proteína de ligação a antígeno de acordo com qualqueruma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que referido domíniovariável único é humano.

11. Proteína de ligação a antígeno de acordo com qualqueruma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que liga a umreceptor de Fc.

12. Proteína de ligação a antígeno de acordo com qualqueruma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que influencia acitotoxicidade dependente de complemento (CDC).

13. Proteína de ligação a antígeno de acordo com qualqueruma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que influencia acitotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC).

14. Proteína de ligação a antígeno de acordo com qualqueruma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que é ligada a umagente anti-tumor.

15. Proteína de ligação a antígeno de acordo com qualqueruma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que é ligada a umagente de produção de sinal detectável.

16. Proteína de ligação a antígeno de acordo com qualqueruma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que pelo menos umdos referidos primeiro e segundo sítios de ligação a antígeno é específico paraum receptor de tirosina quinase (RTK).

17. Proteína de ligação a antígeno de acordo com areivindicação 16, caracterizada pelo fato de que bloqueia a ligação de ligandoao receptor de tirosina quinase.

18. Proteína de ligação a antígeno de acordo com areivindicação 16, caracterizada pelo fato de que neutraliza a ativação doreceptor de tirosina quinase.

19. Proteína de ligação a antígeno de acordo com areivindicação 16, caracterizada pelo fato de que inibe a transdução de sinalpelo receptor de tirosina quinase.

20. Proteína de ligação a antígeno de acordo com areivindicação 16, caracterizada pelo fato de que o receptor de tirosina quinaseé humano.

21. Proteína de ligação a antígeno de acordo com areivindicação 16, caracterizada pelo fato de que o receptor de tirosina quinaseé selecionado dentre o grupo consistindo de PDGFRa, VEGFRl, VEGFR2,VEGFR3, EGFR, HER2, IGFR, FGFR, NGFR, RON, Tek e Tie2.

22. Proteína de ligação a antígeno de acordo com areivindicação 16, caracterizada pelo fato de que um dos referidos primeiro esegundo sítios de ligação a antígeno é específico para PDGFRa e o outro dosreferidos primeiro e segundo sítios de ligação a antígeno é específico paraVEGFR2.

23. Proteína de ligação a antígeno de acordo com areivindicação 16, caracterizada pelo fato de que um dos referidos primeiro esegundo sítios de ligação a antígeno é específico para VEGFRl e o outro dosreferidos primeiro e segundo sítios de ligação a antígeno é específico paraVEGFR2.

24. Proteína de ligação a antígeno de acordo com areivindicação 16, caracterizada pelo fato de que um dos referidos primeiro esegundo sítios de ligação a antígeno é específico para IGFR e o outro dereferidos primeiro e segundo sítios de ligação a antígeno é específico paraEGFR ou HER2.

25. Método de neutralização da ativação de um receptor detirosina quinase, caracterizado pelo fato de compreender o tratamento de umacélula com uma proteína de ligação a antígeno como definida em qualqueruma das reivindicações 1 a 4 específico para referido receptor de tirosinaquinase em uma quantidade suficiente para neutralizar a ativação do receptor.

26. Método de inibição de angiogênese, caracterizado pelo fatode compreender o tratamento de um mamífero com uma proteína de ligação aantígeno como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em umaquantidade suficiente para neutralizar a ativação do receptor.

27. Método de redução de crescimento de tumor, caracterizadopelo fato de compreender o tratamento de um mamífero com uma proteína deligação a antígeno como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 4,em uma quantidade suficiente para reduzir o crescimento do tumor.

28. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações-26 e 27, caracterizado pelo fato de que a proteína de ligação a antígeno se ligaa PDGFRa e a VEGFR2 e inibe a ativação induzida por ligando de PDGFRae a ativação induzida por ligando de VEGFR2.

29. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações-26 e 27, caracterizado pelo fato de que a proteína de ligação a antígeno se ligaa VEGFRl e a VEGFR2 e inibe a ativação induzida por ligando de VEGFRle ativação induzida por ligando de VEGFR2.

30. Método de acordo com a reivindicação 27, caracterizadopelo fato de que a proteína de ligação a antígeno se liga a EGFR e a IGFR einibe a ativação induzida por ligando de EGFR e ativação induzida porligando de IGFR.

31. Método de acordo com a reivindicação 27, caracterizadopelo fato de que a proteína de ligação a antígeno se liga a HER2 e a IGFR einibe a ativação induzida por ligando de HER2 e ativação induzida porligando de IGFR.

32. Método de acordo com a reivindicação 27, caracterizadopelo fato de ainda compreender a administração de uma quantidade eficaz deum agente anti-neoplásico.

33. Método de produção de uma proteína de ligação aantígeno, caracterizado pelo fato de compreender:a) co-expressar em uma célula hospedeirauma construção de DNA recombinante codificando umprimeiro polipeptídeo tendo um primeiro sítio de ligação a antígenolocalizado no término N de um domínio constante de cadeia leve deimunoglobulina (domínio CL), referido domínio Cl capaz de associaçãoestável com um primeiro domínio constante de cadeia pesada deimunoglobulina (domínio ChI), euma construção de DNA recombinante codificando umsegundo polipeptídeo tendo um segundo sítio de ligação a antígeno localizadono término N de um domínio Ch 1, referido domínio ChI seguido por um oumais domínios constantes de cadeia pesada capazes de auto-associaçãoestável;em que pelo menos um de referido primeiro sítio de ligação aantígeno e referido segundo sítio de ligação a antígeno é um domínio variávelúnico (sVD);durante um tempo e em um modo suficiente para permitir aexpressão dos polipeptídeos e a formação do anticorpo; eb) recuperar a proteína de ligação a antígeno.

34. Método de acordo com a reivindicação 33, caracterizadopelo fato de que as construções são no mesmo vetor de expressão de DNA.

35. Método de acordo com a reivindicação 33, caracterizadopelo fato de que as construções são em diferentes vetores de expressão deDNA.

36. Método de acordo com a reivindicação 33, caracterizadopelo fato de que a célula hospedeira é uma célula bacteriana, uma célula delevedura ou uma célula de mamífero.

37. Método de acordo com a reivindicação 33, caracterizadopelo fato de que o anticorpo é secretado da célula hospedeira.