BR112016028076B1

BR112016028076B1 - COMPOSITION FOR THE TREATMENT OF DIABETES MELLITTUS COMPRISING INSULIN AND A DUAL GLP-1/GLUCAGON AGONIST

Info

Publication number: BR112016028076B1
Application number: BR112016028076-8A
Authority: BR
Inventors: Sung Youb Jung; Sang Youn Hwang; Seung Su Kim; In Young Choi; Se Chang Kwon
Original assignee: Hanmi Pharm. Co., Ltd
Priority date: 2014-05-30
Filing date: 2015-06-01
Publication date: 2024-07-09

Abstract

COMPOSIÇÃO PARA O TRATAMENTO DE DIABETES MELLITTUS QUE COMPREENDE INSULINA E UM AGONISTA DUAL GLP-1/GLUCAGON. A presente invenção diz respeito a uma composição para a prevenção ou para o tratamento de diabetes mellitus, a qual compreende insulina e um agonista dual GLP-1/glucagon e a um método para a prevenção ou para o tratamento de diabetes mellitus. Mais especificamente, a presente composição pode inibir o ganho de peso e reduzir o perigo de hipoglicemia devido à administração de insulina, diminuir a dose de administração e melhorar grandemente a aceitação dos fármacos através de uma administração combinada de um conjugado de insulina de longa acção e um conjugado de agonista dual GLP- 1/glucagon de longa acção. Além disso, o conjugado de insulina de longa acção e o conjugado de agonista dual GLP-1/glucagon de longa acção de acordo com a presente invenção podem melhorar a sustentabilidade e estabilidade in vivo, uma vez que a insulina e o agonista dual GLP-1/glucagon estão ligados à região Fc de imunoglobulina através de um linker não peptidílico.COMPOSITION FOR THE TREATMENT OF DIABETES MELLITUS COMPRISING INSULIN AND A DUAL GLP-1/GLUCAGON AGONIST. The present invention relates to a composition for the prevention or treatment of diabetes mellitus, which comprises insulin and a dual GLP-1/glucagon agonist and to a method for the prevention or treatment of diabetes mellitus. More specifically, the present composition can inhibit weight gain and reduce the risk of hypoglycemia due to insulin administration, decrease the administration dose and greatly improve drug acceptance through a combined administration of a long-acting insulin conjugate and a long-acting dual GLP-1/glucagon agonist conjugate. Furthermore, the long-acting insulin conjugate and the long-acting dual GLP-1/glucagon agonist conjugate according to the present invention can improve in vivo sustainability and stability, since insulin and the dual GLP-1/glucagon agonist are linked to the immunoglobulin Fc region via a non-peptidyl linker.

Description

[001] Campo técnico[001] Technical field

[002] A presente invenção diz respeito a uma composição para o tratamento de diabetes mellitus, incluindo insulina e um agonista dual GLP-1/glucagon, e a um método para a prevenção e para o tratamento de diabetes mellitus, incluindo a administração da composição.[002] The present invention relates to a composition for the treatment of diabetes mellitus, including insulin and a dual GLP-1/glucagon agonist, and to a method for the prevention and treatment of diabetes mellitus, including the administration of the composition.

[003] Técnica anterior[003] Prior art

[004] A insulina é um peptídeo secretado pelas células betas pancreáticas, que desempenha um papel importante na regulação do açúcar do sangue no corpo. A Diabetes mellitus é um tipo de doença metabólica em que a secreção de insulina é insuficiente ou em que as funções normais não são efetuadas, o que dá origem a níveis aumentado de glicose no sangue. A diabetes de tipo 2 é o caso em, que a insulina não é segregada adequadamente ou que a insulina segregada não é adequadamente processada no corpo e os níveis de glicose no sangue não são controlados e, assim, são elevados. O diabetes de tipo 2 é convenientemente tratada utilizando um agente hiperglicêmico que contém um material químico, tal como um ingrediente ativo, ou, para alguns pacientes, é tratada através da administração de insulina. Por outro lado, na diabetes de tipo 1, a administração de insulina é essencialmente necessária.[004] Insulin is a peptide secreted by pancreatic beta cells, which plays an important role in regulating blood sugar in the body. Diabetes mellitus is a type of metabolic disease in which insulin secretion is insufficient or normal functions are not performed, which gives rise to increased blood glucose levels. Type 2 diabetes is the case in which insulin is not secreted properly or the secreted insulin is not properly processed in the body and blood glucose levels are not controlled and thus are elevated. Type 2 diabetes is conveniently treated using a hyperglycemic agent containing a chemical material as an active ingredient, or for some patients, it is treated by administering insulin. On the other hand, in type 1 diabetes, insulin administration is essentially necessary.

[005] A terapia com insulina, que é presentemente utilizada de uma forma ampla, é um método de administração de insulina por via de injeção, antes e após as refeições. A insulina encontra-se agora disponível sob a forma de uma injeção e é, principalmente, administrada por injeção por via subcutânea e o método de administração é diferente de acordo com o tempo de ação. A administração de insulina parece ter um efeito hiperglicêmico mais rápido do que os fármacos tomados e pode ser utilizada em segurança mesmo em ambientes em que os fármacos não se encontrem disponíveis. Além disso, não existe limitação à quantidade de dose, mas a administração de insulina deverá ter lugar três vezes ao dia. Assim sendo, existem desvantagens, tais como o medo do paciente de agulhas, a dificuldade de administração, os sintomas de hipoglicemia e o aumento de peso devia à administração prolongada de insulina. O ganho de peso aumenta o risco de doença cardiovascular, a qual pode dar origem ao efeito secundário de uma função reduzida de controlo do açúcar no sangue.[005] Insulin therapy, which is currently widely used, is a method of administering insulin by injection before and after meals. Insulin is now available in the form of an injection and is mainly administered by subcutaneous injection, and the method of administration differs according to the time of action. Insulin administration appears to have a faster hyperglycemic effect than drugs taken and can be used safely even in settings where drugs are not available. In addition, there is no limitation on the dose amount, but insulin administration should take place three times a day. Therefore, there are disadvantages, such as the patient's fear of needles, difficulty in administration, symptoms of hypoglycemia, and weight gain due to prolonged insulin administration. Weight gain increases the risk of cardiovascular disease, which may give rise to the side effect of reduced blood sugar control function.

[006] Um agonista dual capaz de se ligar a GLP-1 e dois receptores de peptídeo glucagon está presentemente a ser estudado como mecanismo para tratar em simultâneo a diabetes e a obesidade. A GLP-1 e o agonista dual de glucagon inibem a ingestão de alimentos de GLP-1, promovem a saciedade, mostram a função lipolítica de glucagon, mantêm a redução de açúcar no sangue e apresentam um efeito elevado sobre a redução do peso corporal, apresentando, assim, uma possibilidade elevada de utilização como novos agentes terapêuticos.[006] A dual agonist capable of binding to GLP-1 and two glucagon peptide receptors is currently being studied as a mechanism to simultaneously treat diabetes and obesity. GLP-1 and the dual glucagon agonist inhibit GLP-1 food intake, promote satiety, show the lipolytic function of glucagon, maintain blood sugar reduction and have a high effect on body weight reduction, thus presenting a high possibility of use as new therapeutic agents.

[007] As requerentes da presente invenção concluíram que a insulina e o agonista dual são inconvenientes pelo facto se ser necessário efetuar a administração diariamente ao paciente devido a um curto período de semivida e sugeriram, como técnica para manter a atividade do fármaco proteico e alcançar uma estabilidade melhorada em simultâneo para resolver os problemas supramencionados, um conjugado de proteína de longa ação em que um polipeptídio fisiologicamente ativo convencional uma região Fc de imunoglobulina são covalentemente combinados entre si através de um linker não peptidílico (patente de invenção coreana No. 10-0725315). Em particular, as requerentes confirmaram que a sustentabilidade dos efeitos in vivo do conjugado de insulina de longa ação e do conjugado de agonista dual de longa ação é dramaticamente aumentada (patente de invenção coreana No. 10-1058290, pedido de patente de invenção coreana No. 10-2014-0022909 e publicação do pedido de patente de invenção coreana No. 10-2012-0139579).[007] The present inventors concluded that insulin and dual agonist are inconvenient in that they need to be administered daily to the patient due to a short half-life, and suggested, as a technique for maintaining the activity of the protein drug and achieving improved stability simultaneously to solve the above-mentioned problems, a long-acting protein conjugate in which a conventional physiologically active polypeptide and an immunoglobulin Fc region are covalently combined together via a non-peptidyl linker (Korean Patent No. 10-0725315). In particular, the applicants confirmed that the sustainability of the in vivo effects of the long-acting insulin conjugate and the long-acting dual agonist conjugate is dramatically increased (Korean Patent No. 10-1058290, Korean Patent Application No. 10-2014-0022909 and Korean Patent Application Publication No. 10-2012-0139579).

[008] No entanto, existem problemas pelo facto de efeitos secundários, tais como o ganho de peso, ocorrerem durante a administração do agonista dual GLP- 1/glucagon. Assim sendo, permanece ainda a necessidade de desenvolver um agente terapêutico para a diabetes que apresente efeitos secundários, frequência e dosagem reduzidos.[008] However, there are problems in that side effects, such as weight gain, occur during administration of the dual GLP-1/glucagon agonist. Therefore, there remains a need to develop a therapeutic agent for diabetes that has reduced side effects, frequency and dosage.

[009] Descrição[009] Description

[010] Problema técnico[010] Technical problem

[011] As requerentes fizeram muitos esforços para desenvolver um agente terapêutico para a diabetes que possa reduzir níveis elevados de glicose no sangue, suprimir o ganho de peso e reduzir o risco de hipoglicemia, os quais são necessários para o tratamento da diabetes. Como resultado, as requerentes tentaram uma administração combinada na qual é administrado simultaneamente um receptor de insulina e um agonista dual GLP-1/glucagon, e concluíram, especificamente, que quando uma administração combinada de uma insulina de longa ação e uma GLP- 1/glucagon de longa ação podem maximizar a aceitação por parte do paciente, reduzir a dosagem do fármaco de insulina, reduzir o risco de hipoglicemia e auxiliar a reduzir o nível de glicose no sangue e de peso corporal, completando assim a presente invenção.[011] Applicants have made great efforts to develop a therapeutic agent for diabetes that can reduce high blood glucose levels, suppress weight gain and reduce the risk of hypoglycemia, which are necessary for the treatment of diabetes. As a result, Applicants have attempted a combined administration in which an insulin receptor and a dual GLP-1/glucagon agonist are administered simultaneously, and have specifically concluded that when a combined administration of a long-acting insulin and a long-acting GLP-1/glucagon can maximize patient compliance, reduce the dosage of the insulin drug, reduce the risk of hypoglycemia and help reduce blood glucose level and body weight, thus completing the present invention.

[012] Solução técnica[012] Technical solution

[013] Um objetivo da presente invenção consiste em proporcionar uma composição para o tratamento de diabetes mellitus, incluindo insulina e um agonista dual GLP-1/glucagon.[013] An object of the present invention is to provide a composition for the treatment of diabetes mellitus, including insulin and a dual GLP-1/glucagon agonist.

[014] Um outro objetivo da presente invenção consiste em proporcionar um método para a prevenção ou para o tratamento de diabetes, incluindo a administração de composição a um sujeito em risco elevado de diabetes mellitus ou que sofra de diabetes mellitus.[014] Another object of the present invention is to provide a method for preventing or treating diabetes, including administering the composition to a subject at high risk of diabetes mellitus or suffering from diabetes mellitus.

[015] Efeitos vantajosos[015] Advantageous effects

[016] A insulina de longa ação ou o seu conjugado análogo e o conjugado do agonista GLP-1/glucagon de longa ação exibem um excelente efeito terapêutico sobre a diabetes e, em particular, a administração combinada é eficaz como agente terapêutico para diabetes que pode estimular, em simultâneo, dois receptores de peptídeos do receptor de insulina e GLP-1 e glucagon para melhorar a sustentabilidade e estabilidade in vivo, reduzir dramaticamente a dosagem de administração, reduzir a hipoglicemia e o ganho de peso devido a um controlo estável dos níveis de glicose no sangue e conseguir uma aceitação do fármaco. Em particular, a presente invenção pode melhorar dramaticamente a estabilidade no sangue, ter um efeito de fármaco prolongado e diminuir a frequência de administração, maximizando assim a conveniência para o paciente.[016] Long-acting insulin or its analog conjugate and long-acting GLP-1 agonist/glucagon conjugate exhibit excellent therapeutic effect on diabetes, and in particular, the combined administration is effective as a therapeutic agent for diabetes which can simultaneously stimulate two peptide receptors of insulin receptor and GLP-1 and glucagon to improve in vivo sustainability and stability, dramatically reduce the administration dosage, reduce hypoglycemia and weight gain due to stable control of blood glucose levels, and achieve drug acceptance. In particular, the present invention can dramatically improve blood stability, have prolonged drug effect and decrease the frequency of administration, thereby maximizing patient convenience.

[017] Descrição das figuras[017] Description of figures

[018] A Fig. 1 representa um gráfico da ASC (área sob a curva) que mostra a alteração de glicose em jejum medida durante a administração por via subcutânea de um conjugado de agonista dual GLP/glucagon-Fc de imunoglobulina de longa ação e um conjugado análogo de insulina-Fc a murganhos db/db uma vez a cada dois dias durante 4 semanas, através de uma administração única ou de uma administração combinada.[018] Fig. 1 is an AUC (area under the curve) graph showing the change in fasting glucose measured during subcutaneous administration of a dual agonist GLP/glucagon-long-acting immunoglobulin Fc conjugate and an insulin analogue-Fc conjugate to db/db mice once every other day for 4 weeks, either as a single administration or as a combined administration.

[019] A Fig. 2 representa um gráfico que mostra a alteração do peso corporal medido antes e após a administração por via subcutânea de um conjugado de agonista dual GLP/glucagon-Fc de imunoglobulina de longa ação e um conjugado análogo de insulina-Fc a murganhos db/db uma vez a cada dois dias durante 4 semanas, através de uma administração única ou de uma administração combinada.[019] Fig. 2 is a graph showing the change in body weight measured before and after subcutaneous administration of a dual agonist GLP/glucagon-long-acting immunoglobulin Fc conjugate and an insulin analogue-Fc conjugate to db/db mice once every other day for 4 weeks, either by a single administration or by a combined administration.

[020] Melhor forma de realização da invenção[020] Best embodiment of the invention

[021] Para se atingir os objetos supramencionados, a presente invenção, de acordo com um aspecto, proporciona uma composição para o tratamento de diabetes mellitus, incluindo insulina e uma agonista dual GLP-1/glucagon.[021] To achieve the aforementioned objects, the present invention, according to one aspect, provides a composition for the treatment of diabetes mellitus, including insulin and a dual GLP-1/glucagon agonist.

[022] A insulina referida antes é um conjugado de longa ação no qual a insulina e um material biocompatível ou veículo são ligados por meio de uma ligação covalente ou de um linker. A agonista dual GLP-1/glucagon é um agonista dual GLP-1/glucagon de longa ação e pode ser um conjugado de agonista dual GLP-1/glucagon de longa ação em que o agonista dual GLP-1/glucagon e um material biocompatível ou veículo são ligados por meio de uma ligação covalente ou de um linker. A composição da presente invenção é caracterizada por uma administração combinada de insulina e de um agonista dual GLP-1/glucagon. A insulina e o agonista dual GLP-1/glucagon da presente invenção são caracterizados por serem do tipo de longa ação.[022] The insulin referred to above is a long-acting conjugate in which insulin and a biocompatible material or carrier are linked by a covalent bond or a linker. The dual GLP-1/glucagon agonist is a long-acting dual GLP-1/glucagon agonist and may be a long-acting dual GLP-1/glucagon conjugate in which the dual GLP-1/glucagon agonist and a biocompatible material or carrier are linked by a covalent bond or a linker. The composition of the present invention is characterized by a combined administration of insulin and a dual GLP-1/glucagon agonist. The insulin and the dual GLP-1/glucagon agonist of the present invention are characterized by being of the long-acting type.

[023] Na composição da presente invenção, a proporção molar de agonista dual GLP-1/glucagon: insulina pode estar compreendida entre 1:0,05 e 1:50, mas sem que isso constitua qualquer limitação, desde que mostre o efeito da presente invenção. De preferência, a insulina e o agonista dual GLP-1/glucagon são do tipo de longa ação e pode estar sob a forma de um conjugado, ao qual um material biocompatível, ou um veículo, está ligado.[023] In the composition of the present invention, the molar ratio of dual GLP-1/glucagon agonist: insulin may be between 1:0.05 and 1:50, but this does not constitute any limitation, as long as it shows the effect of the present invention. Preferably, the insulin and the dual GLP-1/glucagon agonist are of the long-acting type and may be in the form of a conjugate, to which a biocompatible material, or a vehicle, is linked.

[024] De acordo com a presente invenção, a insulina inclui todos os peptídeos ou peptídeos modificados que possuam um efeito estimulador sobre os receptores de insulina. Por exemplo, a insulina pode ser uma insulina nativa, uma insulina de ação rápida, uma insulina de base, um análogo de insulina que é um material preparado por uma qualquer substituição, adição, supressão e modificação ou pode ser uma combinação de alguns aminoácidos da insulina nativa ou pode ser um seu fragmento. Além disso, na presente invenção a insulina pode ser uma insulina de longa ação utilizando técnicas de longa ação para ultrapassar o curto período de semivida. De preferência, pode ser uma insulina de longa ação ou um análogo de insulina de longa ação que pode ser administrado uma vez por semana. Alguns exemplos específicos da insulina de acordo com a presente invenção incluem insulina ou análogo de insulina e o seu tipo de longa ação conforme descrito na patente de invenção coreana No. 10- 1058290 e nos pedidos de patente de invenção coreanas Nos. 10-2014-0022909 e 10-2014-0006938, mas sem que isso constitua qualquer limitação.[024] According to the present invention, insulin includes all peptides or modified peptides that have a stimulatory effect on insulin receptors. For example, insulin may be a native insulin, a rapid-acting insulin, a base insulin, an insulin analogue which is a material prepared by any substitution, addition, deletion and modification or may be a combination of some amino acids of native insulin or may be a fragment thereof. Furthermore, in the present invention insulin may be a long-acting insulin using long-acting techniques to overcome the short half-life. Preferably, it may be a long-acting insulin or a long-acting insulin analogue which can be administered once a week. Some specific examples of the insulin according to the present invention include insulin or insulin analogue and its long-acting type as described in Korean Patent No. 10-1058290 and Korean Patent Applications Nos. 10-2014-0022909 and 10-2014-0006938, but without this constituting any limitation.

[025] Tal como aqui utilizado, o termo “análogo de insulina” designa um peptídeo que possui uma alteração de um ou mais aminoácidos de uma sequência nativa.[025] As used herein, the term “insulin analogue” refers to a peptide that has an alteration of one or more amino acids from a native sequence.

[026] O análogo de insulina pode ser um análogo de insulina no qual a cadeia A ou a cadeia B de aminoácidos da insulina é alterada, apresentando um limite reduzido de insulina e uma afinidade de ligação ao receptor de insulina reduzida em comparação com o tipo selvagem. As sequências de aminoácidos de insulina nativa são as seguintes.[026] The insulin analogue may be an insulin analogue in which the amino acid chain A or chain B of insulin is altered, exhibiting a reduced insulin threshold and reduced insulin receptor binding affinity compared to wild type. The amino acid sequences of native insulin are as follows.

[027] Cadeia A[027] Chain A

[028] Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu- Asn-Tyr-Cys-Asn (SEQ ID NO: 37)[028] Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn (SEQ ID NO: 37 )

[029] Cadeia B[029] Chain B

[030] Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu- Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr (SEQ ID NO: 38)[030] Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe -Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr (SEQ ID NO: 38)

[031] Embora a insulina utilizada na variante da invenção seja um análogo de insulina preparado por recombinação genética, a presente invenção não se encontra limitada a este. De preferência, a insulina inclui insulina invertida, variantes de insulina, fragmentos de insulina, etc., e o seu método de preparação inclui recombinação de genes bem como um método em fase sólida, embora não esteja limitado a estes.[031] Although the insulin used in the embodiment of the invention is an insulin analogue prepared by genetic recombination, the present invention is not limited thereto. Preferably, the insulin includes inverted insulin, insulin variants, insulin fragments, etc., and its preparation method includes gene recombination as well as a solid phase method, but is not limited thereto.

[032] O análogo de insulina é um peptídeo que tem uma funcionalidade de controlo da glicose no sangue in vivo, que é a mesma da insulina. Um tal peptídeo inclui agonistas, derivados, fragmentos, mutantes de insulina e semelhantes.[032] Insulin analogue is a peptide that has an in vivo blood glucose control functionality that is the same as insulin. Such a peptide includes insulin agonists, derivatives, fragments, mutants and the like.

[033] O agonista de insulina da presente invenção diz respeito a um material que exiba a mesma atividade biológica que a insulina por ligação ao receptor de insulina in vivo, independentemente da estrutura de insulina.[033] The insulin agonist of the present invention relates to a material that exhibits the same biological activity as insulin by binding to the insulin receptor in vivo, regardless of the structure of insulin.

[034] O análogo de insulina da presente invenção apresenta uma homologia de sequência de aminoácidos com a cadeia A e a cadeia B da insulina nativa, respectivamente, e pelo menos um resíduo aminoácido pode ser uma forma alterada selecionado entre o conjunto constituído por substituição (v.g., alfa-metilação, alfa- hidroxilação), supressão (v.g., desaminação) ou modificação (v.g., N-metilação), e uma sua combinação, e pode dizer respeito a um peptídeo capaz de controlar o nível de glicose no sangue.[034] The insulin analogue of the present invention has an amino acid sequence homology with the A chain and B chain of native insulin, respectively, and at least one amino acid residue may be an altered form selected from the group consisting of substitution (e.g., alpha-methylation, alpha-hydroxylation), deletion (e.g., deamination) or modification (e.g., N-methylation), and a combination thereof, and may relate to a peptide capable of controlling blood glucose level.

[035] Tal como aqui utilizado, o análogo de insulina pode dizer respeito a um mímico de peptídeo e a um composto de baixo peso molecular ou um polímero que pode ser ligado a um receptor de insulina para controlar os níveis de glicose no sangue, embora uma insulina nativa e uma sequência de aminoácidos não tenham homologia.[035] As used herein, insulin analogue may refer to a peptide mimic and a low molecular weight compound or polymer that can be linked to an insulin receptor to control blood glucose levels, although a native insulin and amino acid sequence have no homology.

[036] O fragmento de insulina da presente invenção diz respeito a um fragmento que tem um ou mais aminoácidos adicionados ou suprimidos na insulina. O aminoácido adicionado pode ser um aminoácido que não esteja presente num estado nativo (v.g., aminoácido de tipo D). Um tal fragmento de insulina tem uma função para controlar os níveis de glicose no sangue.[036] The insulin fragment of the present invention relates to a fragment having one or more amino acids added or deleted from insulin. The added amino acid may be an amino acid that is not present in a native state (e.g., D-type amino acid). Such an insulin fragment has a function in controlling blood glucose levels.

[037] A variante de insulina da presente invenção diz respeito a um peptídeo que possui uma ou mais sequências de aminoácidos diferentes daquelas da insulina e tem uma função para controlar os níveis de glicose no sangue no corpo.[037] The insulin variant of the present invention relates to a peptide that has one or more amino acid sequences different from those of insulin and has a function to control blood glucose levels in the body.

[038] Os métodos para a preparação do agonista, derivado, fragmento e variante de insulina podem ser utilizados por si sós ou em combinação. Por exemplo, a presente invenção inclui um peptídeo que tem um ou mais aminoácidos diferentes daqueles do peptídeo nativo, tem desaminação do resíduo aminoácido terminal e tem uma função para controlar os níveis de glicose no sangue no corpo.[038] The methods for preparing the insulin agonist, derivative, fragment and variant can be used alone or in combination. For example, the present invention includes a peptide that has one or more amino acids different from those of the native peptide, has deamination of the terminal amino acid residue and has a function to control blood glucose levels in the body.

[039] Especificamente, o análogo de insulina pode ser aquele em que um ou mais aminoácidos selecionados entre o conjunto constituído pelos aminoácidos na posição 1, aminoácidos na posição 2, aminoácidos na posição 3, aminoácidos na posição 5, aminoácidos na posição 8, aminoácidos na posição 10, aminoácidos na posição 12, aminoácidos na posição 16, aminoácidos na posição 23, aminoácidos na posição 24, aminoácidos na posição 25, aminoácidos na posição 26, aminoácidos na posição 27, aminoácidos na posição 28, aminoácidos na posição 29, aminoácidos na posição 30 da cadeia B; aminoácidos na posição 5, aminoácidos na posição 8, aminoácidos na posição 10, aminoácidos na posição 12, aminoácidos na posição 14, aminoácidos na posição 16, aminoácidos na posição 17, aminoácidos na posição 18, aminoácidos na posição 19 e aminoácidos na posição 21 da cadeia A, foram substituídos com outros aminoácidos e, de preferência, aqueles substituídos com alanina, ácido glutâmico, asparagina, isoleucina, valina, glutamina, glicina, lisina, histidina, cisteína, fenilalanina, triptofano, prolina, serina, treonina, ou ácidos aspárticos. Além disso, um análogo de insulina com uma supressão de pelo menos um aminoácido é incluído no âmbito da presente invenção, mas qualquer análogo de insulina pode ser incluído sem limitação.[039] Specifically, the insulin analogue may be one in which one or more amino acids selected from the set consisting of amino acids at position 1, amino acids at position 2, amino acids at position 3, amino acids at position 5, amino acids at position 8, amino acids at position 10, amino acids at position 12, amino acids at position 16, amino acids at position 23, amino acids at position 24, amino acids at position 25, amino acids at position 26, amino acids at position 27, amino acids at position 28, amino acids at position 29, amino acids at position 30 of the B chain; amino acids at position 5, amino acids at position 8, amino acids at position 10, amino acids at position 12, amino acids at position 14, amino acids at position 16, amino acids at position 17, amino acids at position 18, amino acids at position 19 and amino acids at position 21 of the A chain, have been substituted with other amino acids and, preferably, those substituted with alanine, glutamic acid, asparagine, isoleucine, valine, glutamine, glycine, lysine, histidine, cysteine, phenylalanine, tryptophan, proline, serine, threonine, or aspartic acids. In addition, an insulin analog with a deletion of at least one amino acid is included within the scope of the present invention, but any insulin analog may be included without limitation.

[040] O análogo de insulina preferido é um análogo de insulina que é combinado um com material biocompatível ou um veículo de forma a ter um período de semivida aumentado em comparação com o da insulina de tipo selvagem, e tal pode ser o análogo de insulina descrito nos pedidos de patente de invenção coreana Nos. 102014-0022909 e 10-2014-0006938, embora não estando limitado a estes.[040] The preferred insulin analogue is an insulin analogue that is combined with a biocompatible material or a carrier so as to have an increased half-life compared to that of wild-type insulin, and such may be the insulin analogue described in Korean Patent Application Nos. 102014-0022909 and 10-2014-0006938, but is not limited to them.

[041] Na presente invenção, o agonista dual GLP-1/glucagon inclui todos os peptídeos ou seus fragmentos, precursores, variantes ou derivados, que tenham atividade dual GLP-1/glucagon, tais como oxintomodulina, um agonista dual GLP- 1/glucagon nativo. Na presente invenção, o agonista dual GLP-1/glucagon pode ser um agonista dual GLP-1/glucagon utilizando a técnica de longa ação para ultrapassar o curto período de semivida e, de preferência, um agonista dual GLP-1/glucagon de longa ação que pode ser administrado uma vez por semana. Como exemplos específicos do agonista dual GLP-1/glucagon de acordo com a presente invenção refere-se, por exemplo, o agonista dual GLP-1/glucagon e um seu derivado e um tipo de longa ação, tal como descrito nos pedidos de patente de invenção coreana Nos. 10-2012-0137271 e 10-2012-0139579, cuja seu conteúdo na totalidade se considera aqui incorporado por referência.[041] In the present invention, the GLP-1/glucagon dual agonist includes all peptides or their fragments, precursors, variants or derivatives, which have GLP-1/glucagon dual activity, such as oxyntomodulin, a native GLP-1/glucagon dual agonist. In the present invention, the GLP-1/glucagon dual agonist may be a GLP-1/glucagon dual agonist using the long-acting technique to overcome the short half-life, and preferably a long-acting GLP-1/glucagon dual agonist that can be administered once a week. Specific examples of the GLP-1/glucagon dual agonist according to the present invention include, for example, the GLP-1/glucagon dual agonist and a derivative thereof and a long-acting type as described in Korean Patent Applications Nos. 10-2012-0137271 and 10-2012-0139579, the entire contents of which are hereby incorporated by reference.

[042] Tal como aqui utilizado, o termo “oxintomodulina" designa um peptídeo obtido a partir de um precursor de glucagon, pré-glucagon, e inclui uma oxintomodulina nativa e seus precursores, derivados ou fragmentos e suas variantes. De preferência, pode ter a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO. 39 (HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNTKRNRNNIA).[042] As used herein, the term "oxyntomodulin" means a peptide obtained from a glucagon precursor, pre-glucagon, and includes a native oxyntomodulin and its precursors, derivatives or fragments and variants thereof. Preferably, it may have the amino acid sequence of SEQ ID NO. 39 (HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNTKRNRNNIA).

[043] O termo “variante de oxintomoulina” designa um peptídeo que possui uma ou mais sequências de aminoácidos diferentes daquelas da oxintomodulina nativa e designa um peptídeo que mantém a função de ativação dos receptores de GLP-1 e de glucagon, e pode ser preparada por qualquer uma das operações selecionadas entre substituição, adição, supressão e modificação ou por uma combinação das mesmas numa parte das sequências de aminoácidos da oxintomodulina nativa.[043] The term “oxyntomodulin variant” designates a peptide that has one or more amino acid sequences different from those of native oxyntomodulin and designates a peptide that maintains the activation function of GLP-1 and glucagon receptors, and can be prepared by any of the operations selected from substitution, addition, deletion and modification or by a combination thereof in a part of the amino acid sequences of native oxyntomodulin.

[044] O termo “derivado de oxintomodulina” inclui peptídeos, derivados de peptídeos ou miméticos de peptídeos que são preparados por adição, supressão ou substituição de aminoácidos de oxintomodulina, de modo a ativar o receptor de GLP- 1 e o receptor de glucagon a um nível elevado, em comparação com a oxintomodulina nativa. De preferência, o derivado de oxintomodulina tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID No. 40 e, mais preferencialmente, os seus 16° e 20° aminoácidos formam um anel.[044] The term “oxyntomodulin derivative” includes peptides, peptide derivatives or peptide mimetics that are prepared by adding, deleting or substituting amino acids of oxyntomodulin so as to activate the GLP-1 receptor and the glucagon receptor at a high level compared to native oxyntomodulin. Preferably, the oxyntomodulin derivative has an amino acid sequence of SEQ ID No. 40 and, more preferably, its 16th and 20th amino acids form a ring.

[045] O termo “fragmento de oxintomodulina” designa um fragmento que possui um ou mais aminoácidos adicionados ou suprimidos no terminal N ou no terminal C da oxintomodulina nativa, em que aminoácidos que não ocorrem naturalmente (por exemplo, aminoácidos de tipo D) podem ser adicionados, e tem uma função de ativar o receptor de GLP-1 e o receptor de glucagon.[045] The term “oxyntomodulin fragment” designates a fragment that has one or more amino acids added or deleted at the N-terminus or C-terminus of native oxyntomodulin, in which non-naturally occurring amino acids (e.g., D-type amino acids) may be added, and has a function of activating the GLP-1 receptor and the glucagon receptor.

[046] Cada um dos métodos de preparação para as variantes, derivados e fragmentos de oxintomodulina podem ser utilizados individualmente ou em combinação. Por exemplo, a presente invenção inclui um peptídeo que tem um ou mais aminoácidos diferentes daqueles do peptídeo nativo e desaminação do resíduo aminoácido do terminal N e tem uma função de ativar o receptor de GLP-1 e o receptor de glucagon.[046] Each of the preparation methods for the oxyntomodulin variants, derivatives and fragments can be used individually or in combination. For example, the present invention includes a peptide having one or more amino acids different from those of the native peptide and deamination of the N-terminal amino acid residue and has a function of activating the GLP-1 receptor and the glucagon receptor.

[047] De acordo com uma variante da presente invenção, o tipo de longa ação da insulina e do agonista dual GLP-1/glucagon pode ser numa forma de conjugado, em que um material biocompatível ou veículo é ligado à insulina ou agonista dual por meio de uma ligação covalente ou de um linker. De acordo com outra variante, tal tipo de longa ação pode estar sob uma forma, em que um material biocompatível ou veículo não pode ser ligado diretamente à insulina ou agonista dual por meio de uma ligação covalente. O tipo de longa ação da insulina ou agonista dual GLP-1/glucagon supramencionados pode melhorar o período de semivida ou biodisponibilidade em comparação com uma forma em que a sequência de insulina ou de agonista dual não é do tipo de longa ação sendo na restante parte a mesma. De acordo com uma variante da presente invenção, a insulina de longa ação encontra-se numa forma em que a região Fc de imunoglobulina está ligada ao análogo de insulina em que o aminoácido na posição 14 da cadeia A de insulina é substituído com ácidos glutâmicos, via o polímero não peptídílico como linker. O agonista dual GLP- 1/glucagon de longa ação pode ser uma composição em que a região Fc de imunoglobulina está ligada ao aminoácido na posição 30 do agonista dual GLP- 1/glucagon pelo polímero não peptidílico como linker, mas não se encontra limitado a este.[047] According to one embodiment of the present invention, the long-acting type of insulin and the dual GLP-1/glucagon agonist may be in a conjugate form, in which a biocompatible material or carrier is linked to the insulin or dual agonist by a covalent bond or a linker. According to another embodiment, such a long-acting type may be in a form, in which a biocompatible material or carrier cannot be linked directly to the insulin or dual agonist by a covalent bond. The aforementioned long-acting type of insulin or dual GLP-1/glucagon agonist may improve the half-life or bioavailability compared to a form in which the insulin or dual agonist sequence is not of the long-acting type and is otherwise the same. According to an embodiment of the present invention, the long-acting insulin is in a form in which the immunoglobulin Fc region is linked to the insulin analogue in which the amino acid at position 14 of the insulin A chain is replaced with glutamic acids, via the non-peptidyl polymer as a linker. The long-acting GLP-1/glucagon dual agonist may be a composition in which the immunoglobulin Fc region is linked to the amino acid at position 30 of the GLP-1/glucagon dual agonist by the non-peptidyl polymer as a linker, but is not limited thereto.

[048] As requerentes concluíram que a administração combinada de insulina e de agonista dual GLP-1/glucagon pode prevenir o ganho de peso associados a uma administração individual de insulina, o risco de hipoglicemia pode ser reduzido através da redução da quantidade de insulina e, ainda, para exibir um efeito excelente de redução dos níveis de glicose no sangue superior ao da administração individual do agonista dual, a administração combinada dos dois fármacos pode reduzir os efeitos secundários e aumentar os efeitos em comparação com a administração individual de cada fármaco. As requerentes confirmaram também que a composição para a administração combinada pode ser utilizada como agente terapêutico eficaz, reduzindo em simultâneo os efeitos secundários do agente terapêutico convencional para a diabetes.[048] The applicants concluded that the combined administration of insulin and dual GLP-1/glucagon agonist can prevent weight gain associated with single administration of insulin, the risk of hypoglycemia can be reduced by reducing the amount of insulin, and furthermore, to exhibit an excellent blood glucose lowering effect superior to that of single administration of dual agonist, the combined administration of the two drugs can reduce side effects and enhance the effects compared to single administration of each drug. The applicants also confirmed that the composition for combined administration can be used as an effective therapeutic agent while reducing the side effects of conventional therapeutic agent for diabetes.

[049] Tal como aqui utilizado, o termo “material biocompatível” ou “veículo” diz respeito a materiais que podem aumentar a duração da atividade da insulina ou análogo de insulina ou do agonista dual GLP-1/glucagon, quando o material biocompatível e o veículo estão covalentes ou não covalentemente ligados à insulina ou análogo de insulina ou agonista dual GLP-1/glucagon da presente invenção direta ou indiretamente para formar um conjugado. Por exemplo, quando formam o conjugado, um material que pode aumentar o período de semivida in vivo da insulina ou análogo de insulina ou agonista dual GLP-1/glucagon pode ser um material biocompatível ou veículo de acordo com a presente invenção. O tipo do material biocompatível ou do veículo que é possível utilizar para aumentar o período de semivida pode variar e seus exemplos incluem polietileno-glicol, ácido gordo, colesterol, albumina e seus fragmentos, substância de ligação a albumina, um polímero de unidades de repetição de uma sequência de aminoácidos específica, anticorpos, fragmentos de anticorpo, materiais de ligação ao receptor neonatal Fc (FcRn), tecido conectivo in vivo, nucleotídeos, fibronectina, transferrina, sacarídeos, polímeros, e semelhantes. Como é evidente, podem ser utilizados em combinação com um ou mais dos veículos ou materiais biocompatíveis supramencionados. O material biocompatível ou veículo inclui um material biocompatível que estenda o período de semivida in vivo através de uma ligação covalente ou não covalente.[049] As used herein, the term “biocompatible material” or “carrier” refers to materials that can increase the duration of activity of insulin or insulin analogue or dual GLP-1/glucagon agonist when the biocompatible material and the carrier are covalently or non-covalently linked to the insulin or insulin analogue or dual GLP-1/glucagon agonist of the present invention directly or indirectly to form a conjugate. For example, when forming the conjugate, a material that can increase the in vivo half-life of insulin or insulin analogue or dual GLP-1/glucagon agonist may be a biocompatible material or carrier according to the present invention. The type of biocompatible material or carrier that may be used to extend the half-life may vary, and examples include polyethylene glycol, fatty acid, cholesterol, albumin and its fragments, albumin-binding substance, a polymer of repeating units of a specific amino acid sequence, antibodies, antibody fragments, neonatal Fc receptor (FcRn) binding materials, in vivo connective tissue, nucleotides, fibronectin, transferrin, saccharides, polymers, and the like. Of course, they may be used in combination with one or more of the above-mentioned biocompatible materials or carriers. The biocompatible material or carrier includes a biocompatible material that extends the in vivo half-life by covalent or non-covalent bonding.

[050] Na presente invenção, os métodos em que o material biocompatível ou o veículo são ligados à insulina ou ao agonista dual incluem um método de recombinação genética e uma ligação in vivo utilizando polímeros ou químicos de baixo peso molecular, embora não estejam limitados a estes. O material de ligação ao FcRn pode ser uma região Fc de imunoglobulina. Por exemplo, quando polietileno- glicol é utilizado como veículo, então pode ser incluída uma técnica Recode da Ambrx Inc., que pode ligar de um modo específico da posição ao polietileno-glicol. Também pode estar incluída uma técnica de glicopegilação da empresa Neose, a qual pode ligar especificamente ao resíduo glicosilado. Além do mais, pode ser incluída uma técnica de PEG libertável, na qual polietileno-glicol é suprimido, mas sem estar limitada a este. Podem ser incluídas técnicas que aumentam a biodisponibilidade utilizando PEG. Além disso, podem ser incluídos polímeros, tais como polietileno- glicol, polipropileno-glicol, copolímero de etileno-glicol/propileno-glicol, poliol polioxietilado, álcool polivinílico, polissacáridos, dextrano, éter polivinil-etílico, polímero biodegradável, polímero lipídico, quitinas ou ácido hialurónico.[050] In the present invention, methods in which the biocompatible material or carrier is linked to insulin or the dual agonist include, but are not limited to, a genetic recombination method and in vivo linkage using low molecular weight polymers or chemicals. The FcRn binding material may be an immunoglobulin Fc region. For example, when polyethylene glycol is used as the carrier, then a Recode technique from Ambrx Inc., which can link in a position-specific manner to polyethylene glycol, may be included. A glycopegylation technique from Neose, which can specifically link to the glycosylated residue, may also be included. Furthermore, a releasable PEG technique, in which polyethylene glycol is deleted, may be included, but is not limited to this. Techniques that increase bioavailability using PEG may be included. Additionally, polymers such as polyethylene glycol, polypropylene glycol, ethylene glycol/propylene glycol copolymer, polyoxyethylated polyol, polyvinyl alcohol, polysaccharides, dextran, polyvinyl ethyl ether, biodegradable polymer, lipid polymer, chitins or hyaluronic acid may be included.

[051] Quando se utiliza albumina como veículo, é possível incluir uma técnica na qual as albuminas ou os fragmentos de albumina podem ser diretamente ligados de forma covalente aos peptídeos da insulina para aumentar a estabilidade in vivo. Mesmo no caso de a albumina não estar diretamente ligada, pode ser incluída uma técnica na qual os materiais de ligação a albumina, por exemplo, anticorpo ou fragmento de anticorpo de ligação específico para albumina, são ligados a peptídeos para ligar a albumina, e uma técnica na qual um determinado peptídeo/proteína que possui afinidade de ligação a albumina é ligado aos peptídeos. Além disso, pode ser incluída uma técnica em que um ácido gordo que possui afinidade de ligação a albumina é ligado aos peptídeos, embora não esteja limitado a estes. Qualquer técnica ou método de ligação que possa aumentar a estabilidade in vivo utilizando albumina pode ser aqui incluído.[051] When albumin is used as a carrier, a technique in which albumins or albumin fragments can be directly covalently linked to insulin peptides to increase in vivo stability may be included. Even in the case where albumin is not directly linked, a technique in which albumin-binding materials, e.g., albumin-specific binding antibody or antibody fragment, are linked to peptides to bind albumin, and a technique in which a particular peptide/protein that has binding affinity for albumin is linked to the peptides may be included. In addition, a technique in which a fatty acid that has binding affinity for albumin is linked to the peptides may be included, but is not limited to these. Any binding technique or method that can increase in vivo stability using albumin may be included herein.

[052] A técnica para ligação ao peptídeo utilizando o anticorpo ou fragmento de anticorpo como veículo para aumentar o período de semivida in vivo também pode ser incluído na presente invenção. É possível utilizar um anticorpo ou fragmento de anticorpo que possuo um local de ligação de FcRn e qualquer fragmento de anticorpo que não contém nenhum local de ligação de FcRn pode ser utilizado. A técnica ‘CovX- body’ da empresa CovX, utilizando um anticorpo catalítico, pode ser aqui incluída, e a técnica que aumenta o período de semivida in vivo utilizando fragmentos Fc poe ser incluída na presente invenção. Quando se utiliza o fragmento Fc, o linker que se liga ao fragmento Fc e o peptídeo e o seu método de ligação podem incluir uma ligação peptídica ou um polietileno-glicol ou semelhante, mas sem que isso constitua qualquer limitação, e qualquer método de ligação química está disponível. Além disso, a proporção de ligação do fragmento Fc e de insulina da presente invenção pode ser de 1:1 ou 1:2, mas sem que isso constitua qualquer limitação.[052] The technique for linking the peptide using the antibody or antibody fragment as a carrier to increase the in vivo half-life can also be included in the present invention. An antibody or antibody fragment having an FcRn binding site can be used, and any antibody fragment that does not contain any FcRn binding site can be used. The ‘CovX-body’ technique of the CovX company using a catalytic antibody can be included herein, and the technique that increases the in vivo half-life using Fc fragments can be included in the present invention. When using the Fc fragment, the linker that binds the Fc fragment and the peptide and its linking method can include a peptide bond or a polyethylene glycol or the like, but this is not limited to any chemical linking method. Furthermore, the binding ratio of the Fc fragment and insulin of the present invention may be 1:1 or 1:2, but this is not intended to be a limitation.

[053] A técnica em que os peptídeos ou fragmentos de proteína são utilizados como veículos para efetuar a ligação ao análogo de insulina pode ser incluída na presente invenção para aumentar o período de semivida in vivo. Os peptídeos ou fragmentos de proteína utilizados pode ser uma elastina tipo polipeptídio (ELP), que é constituída por unidades de repetição de uma combinação de um determinado aminoácido. A técnica de PEG Xten polipeptídio artificial da empresa Versartis é incluída na presente invenção. Além disso, a estrutura que induz a técnica de sonda (SIP) da empresa Zealand, que aumenta o período de semivida in vivo utilizando multiLisina, também está incluída na presente invenção. A técnica de fusão da empresa Prolor é aqui incluída. A transferrina, que se saber ter uma estabilidade elevada in vivo, ou a fibronectina e seus derivados que são um componente do tecido conectivo, podem ser aqui incluídas. Os peptídeos ou proteínas que estão ligados à insulina da presente invenção não são limitados a estes e quaisquer peptídeos ou proteínas que aumentem o período de semivida in vivo da insulina estão incluídos no âmbito da presente invenção. A ligação entre a insulina da presente invenção e os peptídeos ou proteínas que aumentam o período de semivida in vivo pode ser através de uma ligação covalente. Os tipos de linker e o método de ligação utilizados podem ser uma ligação peptídica ou polietileno-glicol e semelhante, embora não limitados a estas, e é também possível qualquer método de ligação química.[053] The technique in which peptides or protein fragments are used as carriers to effect binding to the insulin analogue can be included in the present invention to increase the in vivo half-life. The peptides or protein fragments used can be an elastin-like polypeptide (ELP), which is composed of repeating units of a combination of a certain amino acid. The PEG Xten artificial polypeptide technique of the company Versartis is included in the present invention. In addition, the structure inducing probe (SIP) technique of the company Zealand, which increases the in vivo half-life using multiLysine, is also included in the present invention. The fusion technique of the company Prolor is included herein. Transferrin, which is known to have high stability in vivo, or fibronectin and its derivatives which are a component of connective tissue, can be included herein. The peptides or proteins that are linked to the insulin of the present invention are not limited to these and any peptides or proteins that increase the in vivo half-life of insulin are included within the scope of the present invention. The linkage between the insulin of the present invention and the peptides or proteins that increase the in vivo half-life may be through a covalent bond. The types of linker and the linkage method used may be a peptide bond or polyethylene glycol bond and the like, but are not limited to these, and any chemical linkage method is also possible.

[054] Além disso, o veículo que é utilizado para aumentar o período de semivida in vivo pode ser um material não peptidílico, tal como um polissacárido ou um ácido gordo.[054] Furthermore, the vehicle that is used to increase the in vivo half-life may be a non-peptidyl material, such as a polysaccharide or a fatty acid.

[055] O linker que se liga ao veículo que é utilizado para aumentar o período de semivida in vivo pode incluir peptídeos, polietileno-glicóis, ácidos gordos, açúcares, polímeros, compostos de baixo peso molecular, nucleotídeos e uma sua combinação, e podem ter qualquer ligação química, tal como uma ligação química não covalente ou uma ligação química covalente, mas sem que isso constitua qualquer limitação.[055] The linker that attaches to the carrier that is used to increase the in vivo half-life may include, but is not limited to, peptides, polyethylene glycols, fatty acids, sugars, polymers, low molecular weight compounds, nucleotides, and a combination thereof, and may have any chemical bond, such as a non-covalent chemical bond or a covalent chemical bond.

[056] A formulação que pode aumentar a biodisponibilidade ou manter continuamente a atividade pode incluir uma formulação de libertação prolongada por micropartículas, nanopartículas e semelhantes, utilizando PLGA, ácido hialurónico, quitosano, etc.[056] The formulation that can increase bioavailability or continuously maintain activity may include a sustained release formulation by microparticles, nanoparticles and the like, using PLGA, hyaluronic acid, chitosan, etc.

[057] Além do mais, a formulação de diferentes aspectos que pode aumentar a biodisponibilidade ou manter continuamente a atividade pode ser uma formulação tal como implantes, inalantes, formulações trans-nasais ou adesivos.[057] Furthermore, the formulation of different aspects that can increase bioavailability or continuously maintain activity can be a formulation such as implants, inhalants, trans-nasal formulations or patches.

[058] De acordo com uma variante exemplificativa da invenção, exemplos de insulina administrada em combinação com o agonista dual GLP-1/glucagon podem incluir uma insulina nativa, um análogo de insulina, uma insulina de longa ação e semelhante (v.g., é possível incluir uma insulina nativa, tal como humulina, novolina, uma insulina de ação rápida, tal como Novolog, Humalog, Apidra, uma insulina de longa ação, tal como Lantus, Levemir, Tresiba).[058] According to an exemplary embodiment of the invention, examples of insulin administered in combination with the dual GLP-1/glucagon agonist may include a native insulin, an insulin analogue, a long-acting insulin, and the like (e.g., a native insulin such as humulin, novolin, a rapid-acting insulin such as Novolog, Humalog, Apidra, a long-acting insulin such as Lantus, Levemir, Tresiba may be included).

[059] De acordo com outra variante exemplificativa da presente invenção, exemplos do agonista dual GLP-1/glucagon que podem ser administrados em combinação com a insulina ou análogo de insulina e uma sua formulação de longa ação podem incluir um agonista dual GLP-1/glucagon nativo, tal como oxintomodulina e um seu derivado e uma sua formulação de longa ação e semelhantes.[059] According to another exemplary embodiment of the present invention, examples of the dual GLP-1/glucagon agonist that can be administered in combination with insulin or insulin analogue and a long-acting formulation thereof can include a native dual GLP-1/glucagon agonist, such as oxyntomodulin and a derivative thereof and a long-acting formulation thereof, and the like.

[060] O material veículo utilizável na presente invenção pode ser selecionado entre o conjunto constituído por um anticorpo, uma região Fc de imunoglobulina, uma albumina, um ácido gordo, um hidrato de carbono, um polímero com uma unidade de repetição de peptídeo, uma transferrina e um PEG e, de preferência, uma região Fc de imunoglobulina. De acordo com uma variante exemplificativa da presente invenção, o agonista dual GLP-1/glucagon de longa ação está ligado a um veículo por meio de um polímero não peptidílico, como um linker. De acordo com outra variante exemplificativa, o material veículo ligado ao linker polimérico não peptidílico é um fragmento Fc de imunoglobulina.[060] The carrier material usable in the present invention may be selected from the group consisting of an antibody, an immunoglobulin Fc region, an albumin, a fatty acid, a carbohydrate, a polymer with a peptide repeating unit, a transferrin and a PEG, and preferably an immunoglobulin Fc region. According to an exemplary embodiment of the present invention, the long-acting dual GLP-1/glucagon agonist is linked to a carrier via a non-peptidyl polymer as a linker. According to another exemplary embodiment, the carrier material linked to the non-peptidyl polymeric linker is an immunoglobulin Fc fragment.

[061] De acordo com a presente invenção, o conjugado de insulina de longa ação (ou, por questões de brevidade, conjugado de insulina) ou o agonista dual GLP- 1/glucagon de longa ação (por questões de brevidade, conjugado de agonista dual) é uma foram em que a insulina ou o agonista dual é ligado a uma região Fc de imunoglobulina e exibe sustentabilidade e segurança. A ligação da região Fc de imunoglobulina com a insulina ou o agonista dual pode ser uma fusão no quadro sem um linker ou pode ser uma ligação utilizando um polímero não peptídico como linker. Na presente invenção, o Fc de imunoglobulina pode ser utilizado inter- permutavelmente com fragmentos de imunoglobulina.[061] According to the present invention, the long-acting insulin conjugate (or, for brevity, insulin conjugate) or the long-acting GLP-1/glucagon dual agonist (for brevity, dual agonist conjugate) is a form in which the insulin or dual agonist is linked to an immunoglobulin Fc region and exhibits sustainability and safety. The linkage of the immunoglobulin Fc region to the insulin or dual agonist may be an in-frame fusion without a linker or may be a linkage using a non-peptide polymer as a linker. In the present invention, the immunoglobulin Fc may be used interchangeably with immunoglobulin fragments.

[062] O termo “polímero não peptidílico” designa um polímero biocompatível que inclui duas ou mais unidades de repetição ligadas entre si por meio de qualquer ligação covalente, excluindo uma ligação peptídica. De acordo com a presente invenção, o polímero não peptídico pode ser utilizado interpermutavelmente com linker não peptídico.[062] The term “non-peptidyl polymer” means a biocompatible polymer that includes two or more repeating units linked together by any covalent bond, excluding a peptide bond. According to the present invention, the non-peptidic polymer can be used interchangeably with non-peptide linker.

[063] O polímero não peptídico útil na presente invenção pode ser selecionado entre o conjunto constituído por um polímero biodegradável, um polímero lipídico, quitina, ácido hialurônico e uma sua combinação. O polímero biodegradável pode ser polietileno-glicol, polipropileno-glicol, copolímero de etileno-glicol/propileno-glicolpoliol polioxietilado, álcool polivinílico, polissacárido, dextrano, éter polivinil-etílico, ácido poliláctico (PLA) ou ácido poliláctico-glicólico (PLGA) e, de preferência, um polietileno- glicol. Além disso, os seus derivados conhecidos na especialidade e derivados preparados facilmente através de um método conhecido na especialidade podem ser incluídos no âmbito da presente invenção.[063] The non-peptide polymer useful in the present invention can be selected from the group consisting of a biodegradable polymer, a lipid polymer, chitin, hyaluronic acid and a combination thereof. The biodegradable polymer can be polyethylene glycol, polypropylene glycol, polyoxyethylated ethylene glycol/propylene glycolpolyol copolymer, polyvinyl alcohol, polysaccharide, dextran, polyvinyl ethyl ether, polylactic acid (PLA) or polylactic glycolic acid (PLGA) and, preferably, a polyethylene glycol. In addition, their derivatives known in the art and derivatives readily prepared by a method known in the art can be included within the scope of the present invention.

[064] O linker peptídico utilizado na proteína de fusão obtido através de um método de fusão no quadro convencional apresenta desvantagens pelo facto de ser facilmente clivado in vivo por uma enzima proteolítica e, assim, não ser possível obter um efeito suficiente de aumento do período de semivida no soro do fármaco ativo por um veículo, conforme esperado. No entanto, na presente invenção, o polímero que tem resistência contra a enzima proteolítica pode ser utilizado para manter o período de semivida no soro de um peptídeo semelhante ao veículo. Assim sendo, qualquer polímero não peptídico pode ser utilizado na presente invenção sem limitação, desde que seja um polímero que tenha a função supramencionadas, isto é, um polímero que tenha resistência contra a enzima proteolítica in vivo. O polímero não peptídico tem um peso molecular compreendida entre 1 e 100 kDa e, de preferência, entre 1 e 20 kDa. O polímero não peptídico da presente invenção, ligado à região Fc de imunoglobulina, pode ser um tipo de polímero ou uma combinação de diferentes tipos de polímero.[064] The peptide linker used in the fusion protein obtained by a conventional fusion method has disadvantages in that it is easily cleaved in vivo by a proteolytic enzyme, and thus it is not possible to obtain a sufficient effect of increasing the serum half-life of the active drug by a carrier as expected. However, in the present invention, the polymer having resistance against the proteolytic enzyme can be used to maintain the serum half-life of a carrier-like peptide. Therefore, any non-peptide polymer can be used in the present invention without limitation, as long as it is a polymer having the above-mentioned function, that is, a polymer having resistance against the proteolytic enzyme in vivo. The non-peptide polymer has a molecular weight between 1 and 100 kDa, and preferably between 1 and 20 kDa. The non-peptide polymer of the present invention linked to the Fc region of immunoglobulin can be one type of polymer or a combination of different types of polymer.

[065] O polímero não peptídico utilizado na presente invenção tem um grupo reativo capaz de se ligar à região Fc de imunoglobulina e ao fármaco proteico. O polímero não peptídico tem um grupo reativo em ambas as extremidades dos terminais, o qual é selecionado, de preferência, entre o conjunto constituído por um grupo aldeído, um grupo propionaldeído, um grupo butiraldeído, um grupo maleimida e um derivado de succinimida reativos. O derivado de succinimida pode ser propionato de sucinimidilo, hidroxi-sucinimidilo, carboximetil-sucinimidilo ou carbonato de sucinimidilo. Em particular, quando o polímero não peptídico tem um grupo reativo do tipo grupo aldeído reativo em ambas as suas extremidades do terminal, este é eficaz em se ligar, em ambas as extremidades, com um polipeptídio fisiologicamente ativo e uma imunoglobulina com reações não específicas mínimas. Um produto final produzido por alquilação redutiva através de uma ligação aldeído é muito mais estável do aquele ligado por uma ligação amida. O grupo reativo aldeído reage seletivamente num terminal N a um pH reduzido e liga-se a um resíduo lisina para formar uma ligação covalente a pH elevado, tal como pH 9.0. Os grupos reativos em ambas as extremidades do terminal do polímero não peptídico podem ser iguais ou diferentes entre si. Por exemplo, o polímero não peptídico pode ter um grupo maleimida numa extremidade e um grupo aldeído, um grupo propionaldeído ou um grupo butiraldeído na outra extremidade. Quando é utilizado um polietileno-glicol com um grupo hidroxi reativo em ambas as extremidades como polímero não peptídico, então o grupo hidroxi pode ser ativado para vários grupos reativos por reações químicas conhecidas, ou é possível utilizar um polietileno-glicol com um grupo reativo modificado comercialmente disponível para preparar o conjugado GLP-1/glucagon de longa ação da presente invenção.[065] The non-peptide polymer used in the present invention has a reactive group capable of binding to the immunoglobulin Fc region and the protein drug. The non-peptide polymer has a reactive group at both terminal ends, which is preferably selected from the group consisting of an aldehyde group, a propionaldehyde group, a butyraldehyde group, a maleimide group and a reactive succinimide derivative. The succinimide derivative may be succinimidyl propionate, hydroxysuccinimidyl, carboxymethylsuccinimidyl or succinimidyl carbonate. In particular, when the non-peptide polymer has a reactive aldehyde group type reactive group at both its terminal ends, it is effective in binding, at both ends, with a physiologically active polypeptide and an immunoglobulin with minimal non-specific reactions. A final product produced by reductive alkylation through an aldehyde bond is much more stable than one linked by an amide bond. The aldehyde reactive group selectively reacts at the N-terminus at low pH and binds to a lysine residue to form a covalent bond at high pH, such as pH 9.0. The reactive groups at both ends of the non-peptide polymer terminus may be the same or different from each other. For example, the non-peptide polymer may have a maleimide group at one end and an aldehyde group, a propionaldehyde group, or a butyraldehyde group at the other end. When a polyethylene glycol with a reactive hydroxy group at both ends is used as the non-peptide polymer, then the hydroxy group can be activated to various reactive groups by known chemical reactions, or a commercially available polyethylene glycol with a modified reactive group can be used to prepare the long-acting GLP-1/glucagon conjugate of the present invention.

[066] Além disso a região Fc de imunoglobulina é vantajosa em termos da preparação, purificação e rendimento do conjugado, uma vez que o peso molecular é relativamente pequeno em comparação com o peso molecular total, bem como a homogeneidade dos materiais é bastante aumentada e o potencial para induzir antigenicidade no sangue é reduzido uma vez que as sequências de aminoácidos são diferentes para cada anticorpo e a porção Fab que apresenta uma elevada não homogeneidade é suprimida.[066] Furthermore, the immunoglobulin Fc region is advantageous in terms of preparation, purification and yield of the conjugate, since the molecular weight is relatively small compared to the total molecular weight, as well as the homogeneity of the materials is greatly increased and the potential to induce antigenicity in the blood is reduced since the amino acid sequences are different for each antibody and the Fab portion that presents a high inhomogeneity is suppressed.

[067] Além disso, o termo "região Fc de imunoglobulina", tal como aqui utilizado, diz respeito à região constante de cadeia pesada 2 (CH2) e à região constante de cadeia pesada 3 (CH3) de uma imunoglobulina, excluindo as regiões variáveis das cadeias pesada e leve, a região constante de cadeia pesada 1 (CH1) e a região constante de cadeia leve 1 (CL1) da imunoglobulina. Pode ainda incluir uma região charneira na região constante de cadeia pesada. Além disso, a região Fc de imunoglobulina da presente invenção pode conter uma parte ou a totalidade da região Fc, incluindo a região constante de cadeia pesada 1 (CH1) e/ou região constante de cadeia leve 1 (CL1), exceto as regiões variáveis das cadeias pesada e leve da imunoglobulina, desde que tenha um efeito fisiológico substancialmente idêntico ou melhor do que a proteína nativa. Além do mais, a região Fc de imunoglobulina pode ser um fragmento com uma supressão numa porção relativamente longa da sequência de aminoácidos da CH2 e/ou CH3. Isto é, a região Fc de imunoglobulina da presente invenção pode incluir 1) um domínio CH1, um domínio CH2, um domínio CH3 e um domínio CH4, 2) um domínio CH1 e um domínio CH2, 3) m domínio CH1 e um domínio CH3, 4) um domínio CH2 e um domínio CH3, 5) uma combinação de um ou mais domínios e uma região charneira de imunoglobulina (ou uma porção da região charneira), e 6) um dímero de cada domínio das regiões constantes de cadeia pesada e da região constante de cadeia leve. Além disso, a região Fc de imunoglobulina da presente invenção inclui uma sequência de aminoácidos nativa, bem como uma sua sequência derivada (mutante). Uma sequência de aminoácidos derivada tem uma sequência diferente devido a uma supressão, uma inserção, uma substituição não conservativa ou conservativa ou suas combinações de um ou mais resíduos aminoácidos das sequências de aminoácidos nativas. Por exemplo, num Fc de IgG, os resíduos aminoácido que se sabe serem importantes na ligação, nas posições 214 a 238, 297 a 299, 318 a 322 ou 327 a 331, podem ser utilizados como alvo adequado para uma modificação.[067] Furthermore, the term "immunoglobulin Fc region" as used herein refers to the heavy chain constant region 2 (CH2) and heavy chain constant region 3 (CH3) of an immunoglobulin, excluding the variable regions of the heavy and light chains, the heavy chain constant region 1 (CH1) and the light chain constant region 1 (CL1) of the immunoglobulin. It may further include a hinge region in the heavy chain constant region. Furthermore, the immunoglobulin Fc region of the present invention may contain a part or all of the Fc region, including the heavy chain constant region 1 (CH1) and/or light chain constant region 1 (CL1), excluding the variable regions of the heavy and light chains of the immunoglobulin, provided that it has a physiological effect substantially identical to or better than the native protein. Furthermore, the immunoglobulin Fc region may be a fragment with a deletion in a relatively long portion of the amino acid sequence of CH2 and/or CH3. That is, the immunoglobulin Fc region of the present invention may include 1) a CH1 domain, a CH2 domain, a CH3 domain, and a CH4 domain, 2) a CH1 domain and a CH2 domain, 3) a CH1 domain and a CH3 domain, 4) a CH2 domain and a CH3 domain, 5) a combination of one or more domains and an immunoglobulin hinge region (or a portion of the hinge region), and 6) a dimer of each domain of the heavy chain constant regions and the light chain constant region. In addition, the immunoglobulin Fc region of the present invention includes a native amino acid sequence as well as a derived (mutant) sequence thereof. A derived amino acid sequence has a different sequence due to a deletion, an insertion, a non-conservative or conservative substitution, or combinations thereof of one or more amino acid residues from the native amino acid sequences. For example, in an IgG Fc, amino acid residues known to be important in binding, at positions 214 to 238, 297 to 299, 318 to 322, or 327 to 331, can be used as a suitable target for a modification.

[068] Além disso, são possíveis vários tipos de derivados, incluindo um em que uma região capaz de formam uma ligação dissulfureto é suprimida ou determinados resíduos aminoácido são eliminados na extremidade do terminal N de uma forma Fc nativa ou um resíduo metionina é adicionado a esta. Além disso, para remover funções efetoras, pode ocorrer uma supressão num local de ligação de complemento, tal como um local de ligação de Clq e um local ADCC (citotoxicidade mediada por células dependentes do anticorpo). As técnicas para a preparação de tais derivados de sequência da região Fc de imunoglobulina encontram-se descritas nas publicações internacionais WO 97/34631 e WO 96/32478. As permutas de aminoácidos em proteínas e peptídeos, as quais não alteram totalmente as atividades das moléculas são conhecidas na especialidade (H. Neurath, R. L. Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). As permutas que ocorrem mais habitualmente são Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu e Asp/Gly, em ambas as direções. Além disso, a região Fc, se desejado, pode ser modificada por fosforilação, sulfação, acrilação, glicosilação, metilação, farnesilação, acetilação, amidação e semelhante. Os derivados de Fc descritos antes são derivados que exibem atividades biológicas idênticas à região Fc da presente invenção ou uma estabilidade estrutural melhorada, por exemplo, contra calor, pH, etc., em comparação com a região Fc.[068] In addition, several types of derivatives are possible, including one in which a region capable of forming a disulfide bond is deleted or certain amino acid residues are deleted at the N-terminal end of a native Fc form or a methionine residue is added thereto. In addition, to remove effector functions, a deletion of a complement binding site, such as a Clq binding site and an ADCC (antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity) site may occur. Techniques for preparing such sequence derivatives of the immunoglobulin Fc region are described in international publications WO 97/34631 and WO 96/32478. Amino acid exchanges in proteins and peptides which do not totally alter the activities of the molecules are known in the art (H. Neurath, R. L. Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). The most commonly occurring exchanges are Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, and Asp/Gly, in both directions. In addition, the Fc region, if desired, can be modified by phosphorylation, sulfation, acrylation, glycosylation, methylation, farnesylation, acetylation, amidation, and the like. The Fc derivatives described above are derivatives that exhibit biological activities identical to the Fc region of the present invention or improved structural stability, e.g., against heat, pH, etc., compared to the Fc region.

[069] Além disso, estas regiões Fc podem ser obtidas a partir de formas nativas isoladas a partir de seres humanos e de outros animais, incluindo vacas, cabras, porcos, murganhos, coelhos, hamsters, ratos ou cobaias, ou podem ser seus recombinantes ou derivados, obtidos a partir de células animais transformados ou microrganismos. Aqui, podem ser obtidos a partir de uma imunoglobulina nativa por isolamento de imunoglobulinas completas a partir de seres humanos ou de organismos animais e depois tratamento destas com uma enzima proteolítica. A papaína digere a imunoglobulina nativa em regiões Fab e Fc e o tratamento com pepsina resulta na produção de fragmentos pFc' e F(ab)2. Estes fragmentos podem ser submetidos, por exemplo, a cromatografia de exclusão por tamanho para isolar os fragmentos Fc ou pFc'. De preferência, uma região Fc proveniente de um ser humano é uma região Fc de imunoglobulina recombinante obtida a partir de um m microrganismo.[069] Furthermore, these Fc regions may be obtained from native forms isolated from humans and other animals, including cows, goats, pigs, mice, rabbits, hamsters, rats or guinea pigs, or may be recombinants or derivatives thereof, obtained from transformed animal cells or microorganisms. Here, they may be obtained from a native immunoglobulin by isolating whole immunoglobulins from humans or animal organisms and then treating them with a proteolytic enzyme. Papain digests the native immunoglobulin into Fab and Fc regions and treatment with pepsin results in the production of pFc' and F(ab)2 fragments. These fragments may be subjected, for example, to size exclusion chromatography to isolate the Fc or pFc' fragments. Preferably, an Fc region from a human is a recombinant immunoglobulin Fc region obtained from a microorganism.

[070] Além disso, a região Fc de imunoglobulina pode estar sob a forma de ter cadeias de açúcar nativas, cadeias de açúcar aumentadas em comparação com uma forma nativa ou cadeias de açúcar diminuídas em comparação com a forma nativa, ou pode estar sob uma forma desglicosilada. O aumento, diminuição ou remoção de cadeias de açúcar de Fc de imunoglobulina pode ser alcançado por métodos habitualmente utilizados na especialidade, tais como um método químico, um método enzimático e um método de engenharia genética utilizando um microrganismo. A remoção de cadeias de açúcar a partir de uma região Fc resulta numa diminuição acentuada na afinidade de ligação à parte C1q do primeiro complemento componente C1 e uma diminuição ou perda na citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpo ou citotoxicidade dependente do complemento, não induzindo assim respostas imunes desnecessárias in vivo. A este respeito, uma região Fc de imunoglobulina numa forma desglicosilada ou aglicosilada pode ser mais adequada para o objetivo da presente invenção como veículo do fármaco.[070] Furthermore, the immunoglobulin Fc region may be in a form having native sugar chains, increased sugar chains compared to a native form or decreased sugar chains compared to the native form, or may be in a deglycosylated form. The increase, decrease or removal of immunoglobulin Fc sugar chains may be achieved by methods commonly used in the art, such as a chemical method, an enzymatic method and a genetic engineering method using a microorganism. Removal of sugar chains from an Fc region results in a marked decrease in binding affinity to the C1q part of the first complement component C1 and a decrease or loss in antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity or complement-dependent cytotoxicity, thereby not inducing unnecessary immune responses in vivo. In this regard, an immunoglobulin Fc region in a deglycosylated or aglycosylated form may be more suitable for the purpose of the present invention as a drug carrier.

[071] Tal como aqui utilizado, o termo “desglicosilação” diz respeito a remover enzimaticamente resíduos açúcar a partir de uma região Fc e o termo “aglicosilação” designa que uma região Fc é produzida de uma forma não glicosilada através de um procariota, de preferência, E. coli.[071] As used herein, the term “deglycosylation” refers to enzymatically removing sugar residues from an Fc region and the term “aglycosylation” refers to an Fc region being produced in a non-glycosylated form by a prokaryote, preferably E. coli.

[072] Entretanto, a região Fc de imunoglobulina pode ser proveniente de seres humanos ou de outros animais, incluindo vacas, cabras, porcos, murganhos, coelhos, hamsters, ratos e cobaias e, de preferência, de seres humanos.[072] However, the immunoglobulin Fc region may be derived from humans or other animals, including cows, goats, pigs, mice, rabbits, hamsters, rats and guinea pigs, and preferably from humans.

[073] Além disso, a região Fc de imunoglobulina pode ser uma região Fc que é proveniente de IgG, IgA, IgD, IgE e IgM, ou que é feita de suas combinações ou de seus híbridos. De preferência, é proveniente de IgG ou de IgM, que se encontram entre as proteínas mais abundantes no sangue humano e, mas preferencialmente, de IgG, quês e sabe aumentar os períodos de semivida de proteínas de ligação a ligandos, embora não esteja limitada a estes.[073] Furthermore, the immunoglobulin Fc region may be an Fc region that is derived from IgG, IgA, IgD, IgE, and IgM, or that is made of combinations or hybrids thereof. Preferably, it is derived from IgG or IgM, which are among the most abundant proteins in human blood, and most preferably from IgG, which is known to increase the half-lives of ligand-binding proteins, but is not limited to these.

[074] Por outro lado, o termo “combinação”, tal como aqui utilizado, significa que os polipeptídios que codificam as regiões Fc de imunoglobulina de cadeia simples com a mesma origem estão ligados a um polipeptídio de cadeia simples de uma origem diferente para formar um dímero ou multímero. Isto é, um dímero ou multímero pode ser formado a partir de dois ou mais fragmentos selecionados entre o conjunto constituído por fragmento Fc de IgG, Fc de IgA, Fc de IgM, Fc de IgD e Fc de IgE.[074] On the other hand, the term “combination” as used herein means that polypeptides encoding single-chain immunoglobulin Fc regions of the same origin are linked to a single-chain polypeptide of a different origin to form a dimer or multimer. That is, a dimer or multimer may be formed from two or more fragments selected from the group consisting of IgG Fc, IgA Fc, IgM Fc, IgD Fc, and IgE Fc fragment.

[075] Tal como aqui utilizado, o termo “híbrido” significa que uma sequência que corresponde a pelo menos dois fragmentos Fc de uma origem diferente está presente numa região Fc de imunoglobulina de cadeia simples. De acordo com a presente invenção, são possíveis vários tipos de híbridos. Isto é, é possível um híbrido constituído por 1 a 4 domínios selecionados entre o conjunto constituído por CH1, CH2, CH3 e CH4 de Fc de IgG, Fc de IgM, Fc de IgA, Fc de IgE e Fc de IgD Fc e pode incluir uma charneira.[075] As used herein, the term "hybrid" means that a sequence corresponding to at least two Fc fragments of a different origin is present in a single-chain immunoglobulin Fc region. According to the present invention, several types of hybrids are possible. That is, a hybrid consisting of 1 to 4 domains selected from the group consisting of CH1, CH2, CH3 and CH4 of IgG Fc, IgM Fc, IgA Fc, IgE Fc and IgD Fc is possible and may include a hinge.

[076] Por outro lado, a IgG também pode ser dividida em subclasses de IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4, e, na presente invenção, é possível uma sua combinação ou hibridação. São preferíveis as subclasses de IgG2 e IgG4 e, mais preferidas, a região Fc de IgG4 que tem uma função efetora substancial, tal como uma citotoxicidade dependente do complemento (CDC).[076] On the other hand, IgG can also be divided into subclasses of IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4, and in the present invention a combination or hybridization thereof is possible. The subclasses of IgG2 and IgG4 are preferable, and most preferred is the Fc region of IgG4 which has a substantial effector function, such as complement-dependent cytotoxicity (CDC).

[077] Isto é, a região Fc de imunoglobulina para o veículo do fármaco da presente invenção pode ser, por exemplo, uma região Fc aglicosilada derivada de IgG4 humana, mas sem que isso constitua qualquer limitação. A região Fc derivada de humanos é preferida em comparação com uma região Fc derivada não humana, que pode provocar respostas imunes indesejadas, por exemplo, pode atuar como um antígeno no corpo humano para produzir um novo anticorpo.[077] That is, the immunoglobulin Fc region for the drug carrier of the present invention may be, for example, an aglycosylated Fc region derived from human IgG4, but this is not limited to this. The human-derived Fc region is preferred over a non-human-derived Fc region, which may elicit undesirable immune responses, for example, it may act as an antigen in the human body to produce a new antibody.

[078] O método para a preparação de uma insulina de longa ação da presente invenção não é particularmente limitado. Por exemplo, os pormenores do método de preparação e dos seus efeitos encontram-se descritos, por exemplo, nas patentes de invenção coreanas nos. 10-1330868, 10-1324828, 10-1058290, na publicação do pedido de patente de invenção coreana n°. 10-2011-0111267 e no pedido de patente de invenção coreana n°. 10-2014-0022909.[078] The method for preparing a long-acting insulin of the present invention is not particularly limited. For example, the details of the preparation method and its effects are described, for example, in Korean Patent Nos. 10-1330868, 10-1324828, 10-1058290, Korean Patent Application Publication No. 10-2011-0111267, and Korean Patent Application No. 10-2014-0022909.

[079] De acordo com uma variante da presente invenção, o conjugado do análogo de insulina de longa ação foi preparado efetuando uma mono-PEGilação no terminal N da região Fc de imunoglobulina e modificando o mesmo para fenil-alanina na posição 1 da cadeia B de insulina e do análogo de insulina (exemplo 8).[079] According to a variant of the present invention, the long-acting insulin analogue conjugate was prepared by performing a mono-PEGylation at the N-terminus of the immunoglobulin Fc region and modifying the same to phenyl-alanine at position 1 of the insulin B chain and the insulin analogue (Example 8).

[080] O método para a preparação de um agonista dual GLP-1/glucagon de longa ação da presente invenção não é particularmente limitado. Por exemplo, os pormenores do método de preparação e dos seus efeitos encontram-se descritos, por exemplo, na publicação do pedido de patente de invenção coreana n°. 10-20120139579. De acordo com uma variante da presente invenção, o conjugado do análogo de insulina de longa ação foi preparado efetuando uma mono-PEGilação no terminal N da região Fc de imunoglobulina e modificando o mesmo para um resíduo cisteína na posição 30 do agonista dual GLP-1/glucagon.[080] The method for preparing a long-acting GLP-1/glucagon dual agonist of the present invention is not particularly limited. For example, the details of the preparation method and its effects are described, for example, in Korean Patent Application Publication No. 10-20120139579. According to an embodiment of the present invention, the long-acting insulin analogue conjugate was prepared by performing mono-PEGylation at the N-terminus of the immunoglobulin Fc region and modifying it to a cysteine residue at position 30 of the GLP-1/glucagon dual agonist.

[081] De acordo com outro aspecto, a presente invenção proporciona uma composição que contém um conjugado de insulina de longa ação e um agonista dual GLP-1/glucagon de longa ação.[081] According to another aspect, the present invention provides a composition containing a long-acting insulin conjugate and a long-acting dual GLP-1/glucagon agonist.

[082] Quando tal conjugado de insulina de longa ação e um agonista dual GLP- 1/glucagon de longa ação são administrados numa combinação dos mesmos, o conjugado de insulina de longa ação atua sobre o receptor de insulina e o conjugado do agonista dual GLP-1/glucagon atua sobre o receptor do peptídeo 1 tipo glucagon e sobre o receptor de glucagon em simultâneo para reduzir os níveis de glicose no sangue em comparação com a administração individual de cada um deles e apresenta um progresso de alteração estável. Além disso, uma administração combinada dos conjugados descritos antes pode reduzir o risco de hipoglicemia que pode ocorrer no caso e administração individual de insulina, e reduzir a dosagem total de insulina pelo peptídeo secretor de insulina. A utilização do conjugado de insulina de longa ação e do agonista dual GLP-1/glucagon de longa ação tem grandes vantagens pelo facto do número de administrações a um paciente crónico, que de outra forma necessitaria de administrações diárias, poder ser dramaticamente reduzido devido a um aumento no período de semivida no sangue e sustentabilidade in vivo, melhorando assim a qualidade de vida do paciente. Assim sendo, tal é muito eficaz no tratamento de diabetes. A composição farmacêutica da presente invenção apresenta uma sustentabilidade e limite de dosagem in vivo excelentes reduz significativamente a dosagem utilizada na administração combinada.[082] When such a long-acting insulin conjugate and a long-acting GLP-1/glucagon dual agonist are administered in a combination thereof, the long-acting insulin conjugate acts on the insulin receptor and the GLP-1/glucagon dual agonist conjugate acts on the glucagon-like peptide-1 receptor and the glucagon receptor simultaneously to reduce blood glucose levels compared with the individual administration of each of them, and shows a stable change progress. In addition, a combined administration of the above-described conjugates can reduce the risk of hypoglycemia that may occur in the case of individual administration of insulin, and reduce the total insulin dosage by the insulin secretory peptide. The use of the long-acting insulin conjugate and the long-acting dual GLP-1/glucagon agonist has great advantages in that the number of administrations to a chronic patient, who would otherwise require daily administrations, can be dramatically reduced due to an increase in the blood half-life and in vivo sustainability, thus improving the patient's quality of life. Therefore, it is very effective in the treatment of diabetes. The pharmaceutical composition of the present invention has excellent in vivo sustainability and dosage limit and significantly reduces the dosage used in the combined administration.

[083] O conjugado de insulina de longa ação e o agonista dual GLP-1/glucagon de longa ação podem ser administrados em simultâneo, sequencial ou inversamente, e administrados simultaneamente numa combinação com uma quantidade eficaz adequada. Além disso, de preferência, o conjugado de insulina de longa ação e o conjugado do agonista dual GLP-1/glucagon de longa ação podem ser administrados em simultâneo, sequencial ou inversamente, após armazenamento em contentores separados.[083] The long-acting insulin conjugate and the long-acting dual GLP-1 agonist/glucagon may be administered simultaneously, sequentially or inversely, and administered simultaneously in a combination in a suitable effective amount. Furthermore, preferably, the long-acting insulin conjugate and the long-acting dual GLP-1 agonist/glucagon conjugate may be administered simultaneously, sequentially or inversely, after storage in separate containers.

[084] O conjugado de insulina de longa ação e o agonista dual GLP-1/glucagon de longa ação que constituem a composição para a administração combinada da presente invenção pode estar sob a forma de um estojo para o tratamento de diabetes, que foi incluído num contentor ou armazenado num contentor em separado. Tal estojo pode incluir um veículo farmaceuticamente aceitável e instruções para a utilização do estojo.[084] The long-acting insulin conjugate and the long-acting dual GLP-1/glucagon agonist constituting the composition for combined administration of the present invention may be in the form of a kit for the treatment of diabetes, which has been enclosed in a container or stored in a separate container. Such a kit may include a pharmaceutically acceptable carrier and instructions for use of the kit.

[085] De acordo com a presente invenção, o termo diabetes diz respeito a doença metabólicas em que a secreção de insulina é insuficiente ou em que as funções normais não são executadas, as quais são caracterizadas por níveis aumentados de glicose no sangue. A administração combinada da composição da presente invenção a um sujeito pode controlar os níveis de glicose no sangue para tratar diabetes mellitus.[085] According to the present invention, the term diabetes refers to metabolic diseases in which insulin secretion is insufficient or in which normal functions are not performed, which are characterized by increased blood glucose levels. The combined administration of the composition of the present invention to a subject can control blood glucose levels to treat diabetes mellitus.

[086] Tal como aqui utilizado, o termo “prevenção” diz respeito a todas as ações que inibem ou que retardam a diabetes por administração combinada da composição da presente invenção. O “tratamento” diz respeito a todas as ações que aliviem ou melhorem os sintomas da diabetes através da administração combinada da composição da presente invenção. O tratamento de diabetes é aplicável a qualquer animal que experimente diabetes mellitus e como seus exemplos é possível referir não só seres humanos e primatas, mas também gado, tal como vacas, porcos, ovelhas, cavalos, cães e gatos, mas sem que isso constitua qualquer limitação, e, de preferência, seres humanos.[086] As used herein, the term “prevention” refers to all actions that inhibit or delay diabetes by combined administration of the composition of the present invention. “Treatment” refers to all actions that alleviate or improve the symptoms of diabetes by combined administration of the composition of the present invention. Treatment of diabetes is applicable to any animal experiencing diabetes mellitus and examples thereof include, but are not limited to, humans and primates, but also livestock such as cows, pigs, sheep, horses, dogs and cats, and preferably humans.

[087] Tal como aqui utilizado, o termo “administração” diz respeito à introdução de uma quantidade de uma substância pré-determinada a um paciente através de um método adequado. A composição da presente invenção pode ser administrada por meio de qualquer uma das vias habituais, desde que seja capaz de atingir o tecido desejado. Por exemplo, a administração pode ser por via intraperitoneal, intravenosa, intramuscular, subcutânea, intradérmica, oral, tópica, intranasal, intrapulmonar ou intra-rectal, mas sem que isso constitua qualquer limitação. No entanto, uma vez que os peptídeos são digeridos após administração por via oral, os ingredientes ativos de uma composição para administração por via oral deverão ser revestidos ou formulados para proteção contra degradação no estômago. De preferência, a composição pode ser administrada sob a forma de injeções. Além disso, a formulação de longa ação pode ser administrada por qualquer dispositivo em que um material ativo possa ser transportado para uma célula alvo.[087] As used herein, the term “administration” refers to the introduction of a predetermined quantity of a substance to a patient by a suitable method. The composition of the present invention may be administered by any of the usual routes, provided that it is capable of reaching the desired tissue. For example, administration may be intraperitoneal, intravenous, intramuscular, subcutaneous, intradermal, oral, topical, intranasal, intrapulmonary or intrarectal, but this is not limited to. However, since peptides are digested after oral administration, the active ingredients of a composition for oral administration should be coated or formulated to protect against degradation in the stomach. Preferably, the composition may be administered in the form of injections. In addition, the long-acting formulation may be administered by any device in which an active material can be transported to a target cell.

[088] A dose e a frequência de administração da composição farmacêutica da presente invenção são determinadas pelo tipo de ingrediente ativo em conjunto com vários fatores, tais como a doença que se pretende tratar, a via de administração, a idade do paciente, o sexo, o peso corporal e a gravidade da doença.[088] The dose and frequency of administration of the pharmaceutical composition of the present invention are determined by the type of active ingredient together with several factors, such as the disease to be treated, the route of administration, the patient's age, sex, body weight and the severity of the disease.

[089] A composição farmacêutica da presente invenção pode ainda incluir um veículo farmaceuticamente aceitável. De acordo com a presente invenção, o termo “veículo farmaceuticamente aceitável” diz respeito a um diluente ou veículo que não iniba a atividade biológica e as propriedades do composto administrado sem estimular o organismo. Para a administração por via oral, o veículo pode incluir um aglutinante, um lubrificante, um desintegrante, um excipiente, um solubilizador, um agente de dispersão, um estabilizador, um agente de suspensão, um corante e um agente edulcorante. Para preparações injetáveis, o veículo pode incluir um agente de tamponamento, um agente conservante, um analgésico, um solubilizador, um agente isotônico e um estabilizador. Para preparações para administração por via tópica, o veículo pode incluir uma base, um excipiente, um lubrificante e um agente conservante.[089] The pharmaceutical composition of the present invention may further include a pharmaceutically acceptable carrier. According to the present invention, the term “pharmaceutically acceptable carrier” refers to a diluent or vehicle that does not inhibit the biological activity and properties of the compound administered without stimulating the organism. For oral administration, the carrier may include a binder, a lubricant, a disintegrant, an excipient, a solubilizer, a dispersing agent, a stabilizer, a suspending agent, a colorant and a sweetening agent. For injectable preparations, the carrier may include a buffering agent, a preservative agent, an analgesic, a solubilizer, an isotonic agent and a stabilizer. For preparations for topical administration, the carrier may include a base, an excipient, a lubricant and a preservative agent.

[090] A composição da presente invenção pode ser formulada numa variedade de formas de dosagem em combinação com os veículos farmaceuticamente aceitáveis supramencionados. Por exemplo, para a administração por via oral, a composição farmacêutica pode ser formulada em comprimidos, trociscos, cápsulas, elixires, suspensões, xaropes ou bolachas. Para as preparações injetáveis, a composição farmacêutica pode ser formulada numa ampola com forma de dosagem individual ou num recipiente multidose. A composição farmacêutica também pode ser formulada em soluções, suspensões, comprimidos, pílulas, cápsulas e preparações de ação prolongada.[090] The composition of the present invention may be formulated in a variety of dosage forms in combination with the aforementioned pharmaceutically acceptable carriers. For example, for oral administration, the pharmaceutical composition may be formulated as tablets, troches, capsules, elixirs, suspensions, syrups or wafers. For injectable preparations, the pharmaceutical composition may be formulated in an ampoule as a single dosage form or in a multidose container. The pharmaceutical composition may also be formulated as solutions, suspensions, tablets, pills, capsules and long-acting preparations.

[091] Por outro lado, como exemplos do veículo, do excipiente e do diluente adequados para as formulações farmacêuticas é possível referir lactose, dextrose, sacarose, sorbitol, manitol, xilitol, ertritol, maltitol, amido borracha de acácia, alginato, gelatina, fosfato de cálcio, silicato de cálcio, celulose, metil-celulose, celulose microcristalina, polivinilpirrolidona, água, metil-hidroxibenzoato, propil- hidroxibenzoato, talco, estearato de magnésio e óleos minerais. Além disso, as formulações farmacêuticas podem ainda incluir cargas, agentes anti-coagulantes, lubrificantes, humectantes, edulcorantes e antissépticos.[091] On the other hand, examples of the vehicle, excipient and diluent suitable for pharmaceutical formulations include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, acacia starch, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, water, methyl hydroxybenzoate, propyl hydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oils. In addition, pharmaceutical formulations may also include fillers, anticoagulant agents, lubricants, humectants, sweeteners and antiseptics.

[092] De acordo com outro aspecto, a presente invenção proporciona um método para a prevenção ou para o tratamento de diabetes, incluindo a administração da composição que contém insulina e um agonista dual GLP-1/glucagon a um sujeito com risco elevado de apresentar diabetes mellitus ou que sofre de diabetes mellitus.[092] According to another aspect, the present invention provides a method for preventing or treating diabetes, including administering the composition containing insulin and a dual GLP-1/glucagon agonist to a subject at high risk of developing diabetes mellitus or who has diabetes mellitus.

[093] A composição e a doença de fígado gordo não alcoólico são a mesma, tal como descrito antes.[093] The composition and nonalcoholic fatty liver disease are the same as described above.

[094] De acordo com outro aspecto, a presente invenção proporciona um método para a prevenção ou para o tratamento de diabetes, que inclui a administração da composição que contém insulina e um agonista dual GLP-1/glucagon a um sujeito com risco elevado de apresentar diabetes mellitus ou que sofre de diabetes mellitus.[094] According to another aspect, the present invention provides a method for preventing or treating diabetes, which includes administering the composition containing insulin and a dual GLP-1/glucagon agonist to a subject at high risk of developing diabetes mellitus or who has diabetes mellitus.

[095] A composição e a doença de fígado gordo não alcoólico são a mesma, tal como descrito antes.[095] The composition and nonalcoholic fatty liver disease are the same as described above.

[096] O passo de administração pode ser efetuado por administração combinada do conjugado de insulina de longa ação e do conjugado do agonista dual GLP- 1/glucagon de longa ação, mas não está limitado a este. Cada uma delas pode ser administrada em simultâneo, sequencial ou inversamente, e pode ser administrada em simultâneo numa quantidade eficaz adequada.[096] The administration step may be effected by combined administration of the long-acting insulin conjugate and the long-acting dual GLP-1/glucagon conjugate, but is not limited thereto. Each of them may be administered simultaneously, sequentially or inversely, and may be administered simultaneously in a suitable effective amount.

[097] A composição da presente invenção, incluindo um conjugado de insulina de longa ação e um conjugado de agonista dual GLP-1/glucagon de longa ação, pode reduzir bastante os níveis de glicose no sangue e não presentar efeitos secundários de ganho de peso, embora sejam administrados uma vez por semana e, assim, podem ser utilizados para a prevenção e para o tratamento de diabetes.[097] The composition of the present invention, including a long-acting insulin conjugate and a long-acting dual GLP-1/glucagon agonist conjugate, can greatly reduce blood glucose levels and have no side effects of weight gain, although they are administered once a week, and thus can be used for the prevention and treatment of diabetes.

[098] Forma de realização da invenção[098] Embodiment of the invention

[099] Doravante, a presente invenção será descrita mais minuciosamente por meio de exemplos. Estes exemplos são apenas apresentados para ilustrar a presente invenção e o âmbito da presente invenção não deverá ser considerado limitado a estes exemplos.[099] Hereinafter, the present invention will be described in more detail by means of examples. These examples are presented only to illustrate the present invention and the scope of the present invention should not be considered limited to these examples.

[100] Exemplo 1[100] Example 1

[101] Produção dos vectores de expressão do análogo de insulina de cadeia individual[101] Production of single-chain insulin analogue expression vectors

[102] Para se preparar um análogo de insulina em que a cadeia A ou a cadeia B de aminoácidos de insulina é alterada, utilizando um vector de expressão de insulina nativa coo matriz, sintetizou-se oligonucleótidos diretos e inversos (quadro 2) e depois efetuou-se a PCR, amplificando assim o respectivo gene análogo.[102] To prepare an insulin analogue in which the insulin amino acid chain A or chain B is altered, using a native insulin expression vector as the template, forward and reverse oligonucleotides (Table 2) were synthesized and then PCR was performed, thereby amplifying the respective analogue gene.

[103] As sequências alteradas de aminoácidos da cadeia A ou da cadeia B e o seu nome análogo são apresentados no quadro 1. Isto é, o análogo 1 é uma forma em que a glicina na posição 1 da cadeia A foi substituída com alanina e o análogo 4 é uma forma em que a glicina na posição 8 da cadeia B é substituída com alanina.[103] The altered amino acid sequences of the A chain or B chain and their analogue name are shown in Table 1. That is, analogue 1 is a form in which the glycine at position 1 of the A chain has been replaced with alanine and analogue 4 is a form in which the glycine at position 8 of the B chain is replaced with alanine.

[104] Quadro 1 [104] Table 1

[105] Os iniciadores para a amplificação do análogo de insulina são apresentados no quadro 2.[105] Primers for insulin analogue amplification are shown in Table 2.

[106] Quadro 2 [106] Table 2

[107] As condições de PCR para a amplificação do análogo de insulina foram de 95°C durante 30 segundos, 55°C durante 30 segundos e 68°C durante 6 minutos e este procedimento foi repetido 18 vezes. O fragmento de análogo de insulina obtido sob estas condições foi inserido no vector de expressão pET22b para ser expresso sob a forma de corpos de inclusão dentro da célula. O vector de expressão assim obtido foi designado por pET22b-análogos de insulina 1-9. O vector de expressão inclui um ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácidos dos análogos de insulina 1 a 9 sob o controlo do promotor T7 e o vector de expressão foi expresso sob a forma de corpos de inclusão no hospedeiro.[107] The PCR conditions for the amplification of the insulin analogue were 95°C for 30 seconds, 55°C for 30 seconds and 68°C for 6 minutes and this procedure was repeated 18 times. The insulin analogue fragment obtained under these conditions was inserted into the pET22b expression vector to be expressed as inclusion bodies within the cell. The expression vector thus obtained was designated pET22b-insulin analogues 1-9. The expression vector includes a nucleic acid encoding the amino acid sequence of insulin analogues 1 to 9 under the control of the T7 promoter and the expression vector was expressed as inclusion bodies in the host.

[108] As sequências de ADN e as sequências de proteínas de cada um dos análogos de insulina 1 a 9 são apresentadas no quadro 3 seguinte.[108] The DNA sequences and protein sequences of each of insulin analogues 1 to 9 are presented in Table 3 below.

[109] Quadro 3 [109] Table 3

[110] Exemplo 2: expressão de polipeptídio de fusão do análogo de insulina recombinante[110] Example 2: Expression of recombinant insulin analogue fusion polypeptide

[111] A expressão do análogo de insulina recombinante foi efetuada sob o controlo do promotor T7. Transformou-se BL21-DE3 de E. coli (E coli B F-dcm ompT hsdS (rB-mB-) gal DE3.); Nova Zen) com cada vector de expressão do análogo de insulina recombinante. A transformação foi efetuada de acordo com o método recomendado por Novagene. Recolheu-se as colónias singulares individuais em que cada vector de expressão recombinante foi transformado, inoculou-se em meio 2X caldo de Luria (LB) que contém ampicilina (50/mL), e manteve-se a incubar a 37°C durante 15 horas. Misturou-se a cultura da estirpe recombinante e o meio 2X LB que contém 30% de glicerol numa proporção de 1:1 (v/v). Dispensou-se então 1 mL de cultura em crio-tubos e manteve-se a -140°C. Utilizou-se tal como solução de reserva de células para a produção de uma proteína de fusão recombinante.[111] Expression of recombinant insulin analogue was carried out under the control of T7 promoter. E. coli BL21-DE3 (E coli B F-dcm ompT hsdS (rB-mB-) gal DE3.); Nova Zen) was transformed with each recombinant insulin analogue expression vector. Transformation was performed according to the method recommended by Novagene. Individual single colonies into which each recombinant expression vector was transformed were picked, inoculated into 2X Luria broth (LB) medium containing ampicillin (50 µg/mL), and incubated at 37°C for 15 hours. The recombinant strain culture and 2X LB medium containing 30% glycerol were mixed in a 1:1 (v/v) ratio. 1 mL of culture was then dispensed into cryovials and kept at -140°C. It was used as a cell stock solution for the production of a recombinant fusion protein.

[112] Para a expressão de um análogo de insulina recombinante, cada frasco de 1 mL de solução de reserva de células foi dissolvido, inoculado com 500 mL de 2X caldo de Luria e desenvolvido em cultura sob agitação a 37°C durante 14 a 16 horas. Quando o valor de OD600 indica um valor de 5,0 ou superior, completou-se a cultura e utilizou-se como cultura de semeio. Inoculou-se a cultura de semeio em 17 L de meio de fermentação utilizando um fermentador de 50 L (MSJ-U2, BEMARUBISHI, Japão), e deu-se início à fermentação do banho inicial. As condições de cultura foram: temperatura de 37°C, volume de ar de 20 L/minuto (1 vvm) e uma velocidade de agitação de 500 r.p.m. e manteve-se a pH 6,70 utilizando amónia a 30% em água. Quando os nutrientes no meio de cultura eram limitados no decorrer da fermentação, a cultura em banho foi efetuada por adição de uma solução de alimentação. O crescimento das estirpes foi monitorizado através dos valores de OD e introduzido em IPTG com uma concentração final de 500 M a valores de OD de 100 ou superiores. Efetuou-se ainda a cultura durante cerca de 23 a 25 horas após a introdução. Depois de se completar a cultura, colheu-se uma estirpe recombinante por centrifugação e armazenou-se a -80°C até à sua utilização.[112] For expression of a recombinant insulin analogue, each 1 mL vial of cell stock solution was dissolved, inoculated with 500 mL of 2X Luria broth, and cultured under shaking at 37°C for 14 to 16 hours. When the OD600 value indicated a value of 5.0 or higher, the culture was completed and used as a seed culture. The seed culture was inoculated into 17 L of fermentation medium using a 50 L fermenter (MSJ-U2, BEMARUBISHI, Japan), and initial bath fermentation was started. The culture conditions were: temperature of 37°C, air volume of 20 L/min (1 vvm), and stirring speed of 500 rpm, and maintained at pH 6.70 using 30% ammonia in water. When nutrients in the culture medium were limited during fermentation, bath culture was performed by adding a feeding solution. The growth of the strains was monitored by OD values and introduced into IPTG at a final concentration of 500 M at OD values of 100 or higher. Further cultivation was performed for approximately 23 to 25 h after introduction. After completion of the cultivation, a recombinant strain was harvested by centrifugation and stored at −80°C until use.

[113] Exemplo 3: número e redobramento do análogo de insulina recombinante[113] Example 3: Number and refolding of recombinant insulin analogue

[114] Para se alterar os análogos de insulina recombinantes expressos no exemplo 2 numa forma solúvel, as células foram esmagadas e redobradas. Colocouse novamente em suspensão 100 g (peso húmido) de aglomerado de células em tampão de lise 1 L (Tris-HCl 50 mM (pH 9,0), EDTA 1 mM (pH 8,0), EDTA 1 mM (pH 8.0), NaCl 0,2 M e 0,5% de Triton X-100). As células foram esmagadas utilizando um processador microfluidizador M-110EH (AC Technology Corp. Model M1475C) a uma pressão de 15000 psi. O lisado de células esmagadas foi submetido a centrifugação a 7000 r.p.m. a 4°C durante 20 minutos para se deitar fora o sobrenadante e colocar novamente em suspensão em 3L de tampão de lavagem (0,5% de Triton X-100 e Tris- HCl 50 mM (pH 8,0), NaCl 0,2 M, EDTA 1 mM). Centrifugou-se o aglomerado a 7000 r.p.m. a 4°C durante 20 minutos, suspendeu-se novamente em água destilada e, depois, centrifugou-se do mesmo modo. Recolheu-se o aglomerado, suspendeu-se novamente em 400 mL de solução tampão (glicina 1 M, 3,78 g de cisteína-HCl, pH 10,6) e depois agitou-se à temperatura ambiente durante 1 hora. Para se recolher o análogo de insulina recombinante re-suspenso, adicionou-se 400 mL de ureia 8 M e depois agitou-se a 40°C durante 1 hora. Para se redobrar o análogo de insulina recombinante solubilizado, centrifugou-se a 7000 r.p.m. a 4°C durante 30 minutos. A seguir, retomou-se o sobrenadante, adicionou-se 2 L de água destilada a um caudal de 1000 mL/hora, utilizando uma bomba peristáltica, e agitou-se a 4°C durante 16 horas.[114] To convert the recombinant insulin analogs expressed in Example 2 into a soluble form, the cells were crushed and refolded. 100 g (wet weight) of cell pellet was resuspended in 1 L lysis buffer (50 mM Tris-HCl (pH 9.0), 1 mM EDTA (pH 8.0), 1 mM EDTA (pH 8.0), 0.2 M NaCl, and 0.5% Triton X-100). The cells were crushed using a M-110EH microfluidizer processor (AC Technology Corp. Model M1475C) at a pressure of 15,000 psi. The crushed cell lysate was centrifuged at 7000 rpm at 4°C for 20 min to discard the supernatant and resuspended in 3 L of wash buffer (0.5% Triton X-100 and 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 0.2 M NaCl, 1 mM EDTA). The pellet was centrifuged at 7000 rpm at 4°C for 20 min, resuspended in distilled water, and then centrifuged in the same manner. The pellet was collected, resuspended in 400 mL of buffer solution (1 M glycine, 3.78 g cysteine-HCl, pH 10.6), and then shaken at room temperature for 1 h. To collect the resuspended recombinant insulin analogue, 400 mL of 8 M urea was added and then stirred at 40°C for 1 hour. To refold the solubilized recombinant insulin analogue, it was centrifuged at 7000 rpm at 4°C for 30 minutes. The supernatant was then collected, 2 L of distilled water was added at a rate of 1000 mL/hour using a peristaltic pump, and stirred at 4°C for 16 hours.

[115] Exemplo 4: purificação cromatográfica de ligação catiônica[115] Example 4: Chromatographic purification of cationic binding

[116] Combinou-se a amostra redobrada ligada a uma coluna ‘Source S’ (GE healthcare, Inc.), equilibrada com citrato de sódio 20 mM contido no local, que é equilibrada com tampão de etanol a 45% (pH 2,0) que contém 4% de etanol. Efetuou então a eluição da proteína análoga de insulina com 10 volumes de coluna de um gradiente linear utilizando tampão de citrato de sódio 20 mM (pH 2,0) que contém 45% de etanol e cloreto de potássio 0,5 M, de modo que a concentração seja 0% a 100%.[116] The refolded sample was combined with a Source S column (GE healthcare, Inc.) equilibrated with in-house 20 mM sodium citrate, which is equilibrated with 45% ethanol buffer (pH 2.0) containing 4% ethanol. The insulin analogue protein was then eluted with 10 column volumes of a linear gradient using 20 mM sodium citrate buffer (pH 2.0) containing 45% ethanol and 0.5 M potassium chloride, such that the concentration is 0% to 100%.

[117] Exemplo 5: tratamento de tripsina e carboxipeptidase B[117] Example 5: Trypsin and carboxypeptidase B treatment

[118] Removeu-se o sal a partir de uma amostra eluída com uma coluna de dessalinização e substituiu-se com uma solução tampão (Tris-HCl 10 mM, pH 8,0). Adicionou-se tripsina que corresponde a uma proporção molar de 1000 da quantidade de proteína da amostra resultante e carboxi-peptidase B que corresponde a uma proporção molar de 2000 e depois agitou-se a 16°C durante 16 horas. Para se completar a reação, reduziu-se o pH até 3,5 utilizando citrato de sódio 1 M (pH 2,0).[118] Salt was removed from a sample eluted with a desalting column and replaced with a buffer solution (10 mM Tris-HCl, pH 8.0). Trypsin corresponding to a molar ratio of 1000 of the protein amount of the resulting sample and carboxy-peptidase B corresponding to a molar ratio of 2000 were added and then stirred at 16 °C for 16 h. To complete the reaction, the pH was reduced to 3.5 using 1 M sodium citrate (pH 2.0).

[119] Exemplo 6: purificação cromatográfica acoplada catiônica[119] Example 6: Cationic coupled chromatographic purification

[120] Combinou-se novamente a amostra da reação completada com uma coluna ‘Source S’ (GE healthcare, Inc.) equilibrada com tampão de citrato de sódio 20 mM (pH 2,0) que contém 45% de etanol. Efetuou-se então a eluição da proteína análoga de insulina com 10 volumes da coluna de gradiente linear, utilizando tampão de citrato de sódio 20 mM (pH 2,0) que contém 45% de etanol e cloreto de potássio 0,5 M, de mofo que a concentração seja 0% a 100%.[120] The completed reaction sample was back-combined with a Source S column (GE healthcare, Inc.) equilibrated in 20 mM sodium citrate buffer (pH 2.0) containing 45% ethanol. The insulin analogue protein was then eluted with 10 linear gradient column volumes using 20 mM sodium citrate buffer (pH 2.0) containing 45% ethanol and 0.5 M potassium chloride to a concentration ranging from 0% to 100%.

[121] Exemplo 7: purificação cromatográfica de ligação aniônica[121] Example 7: Chromatographic purification of anionic binding

[122] Removeu-se o sal a partir da amostra eluída com uma coluna de dessalinização e substituiu-se com uma solução tampão (Tris-HCl 10 mM, pH 7,5). Para se separar um análogo de insulina puro da amostra obtida no exemplo 6, combinou-se a amostra com uma coluna de permuta aniônica (Source Q: GE healthcare, Inc.) equilibrada com uma solução de tampão tris 10 mM (pH 7,5). Efetuou- se então a proteína do análogo de insulina a eluição com 10 volumes de coluna de gradiente linear, utilizando sou tampão de tris 10 mM (pH 7,5) que contém cloreto de sódio 0,5 M, de mofo que a concentração seja 0% a 100%.[122] The eluted sample was desalted with a desalting column and replaced with a buffer solution (10 mM Tris-HCl, pH 7.5). To separate a pure insulin analogue from the sample obtained in Example 6, the sample was combined with an anion exchange column (Source Q: GE healthcare, Inc.) equilibrated with a 10 mM Tris buffer solution (pH 7.5). The insulin analogue protein was then eluted with 10 linear gradient column volumes using a 10 mM Tris buffer (pH 7.5) containing 0.5 M sodium chloride, ensuring that the concentration is 0% to 100%.

[123] Analisou-se a pureza do análogo de insulina purificado utilizando eletroforese de proteínas (SDS-PAGE) e cromatografia de elevado rendimento (HPLC), e confirmou-se as alterações de aminoácidos através de mapeamento de peptídeos e de uma análise do peso molecular de cada pico.[123] The purity of the purified insulin analogue was analyzed using protein electrophoresis (SDS-PAGE) and high-performance liquid chromatography (HPLC), and amino acid changes were confirmed by peptide mapping and molecular weight analysis of each peak.

[124] Como resultado, confirmou-se que a sequência de aminoácidos tinha sido alterada de acordo com o propósito desejado do respectivo análogo de insulina.[124] As a result, it was confirmed that the amino acid sequence had been altered according to the desired purpose of the respective insulin analogue.

[125] Exemplo 8: preparação do conjugado de insulina de longa ação[125] Example 8: Preparation of long-acting insulin conjugate

[126] Neste exemplo, preparou-se o conjugado de insulina de longa ação da sequência análoga (Glu na posição 14 da cadeia A) de um análogo de insulina nativa, um análogo de insulina típico.[126] In this example, the long-acting insulin conjugate was prepared from the analogous sequence (Glu at position 14 of the A chain) of a native insulin analog, a typical insulin analog.

[127] Para se submeter a PEGilação 3.4K ALD2 PEG (NOF, Japão) no terminal N da cadeia beta do análogo de insulina, deixou-se reagir o análogo de insulina e PEG entre si numa proporção molar de 1:4, a uma concentração de análogo de insulina de 5 mg/mL, a 4°C-8°C durante cerca de 2 horas. Nesse momento, efetuou-se a reação em citrato de sódio 50 mM pH 6,0, 40% a 60% de isopropanol, e efetuou-se a reação por adição de uma concentração de 3,0 a 20,0 mM de um agente redutor de ciano- boro-hidreto de sódio. Purificou-se a solução de reação utilizando uma coluna SP-HP (GE Healthcare, USA) que contém etanol em citrato de sódio (pH 3,0).[127] To undergo 3.4K ALD2 PEG (NOF, Japan) PEGylation at the N-terminus of the insulin analogue beta chain, the insulin analogue and PEG were allowed to react with each other in a molar ratio of 1:4 at an insulin analogue concentration of 5 mg/mL at 4°C-8°C for about 2 hours. At that time, the reaction was carried out in 50 mM sodium citrate pH 6.0, 40% to 60% isopropanol, and the reaction was carried out by adding a 3.0 to 20.0 mM concentration of a sodium cyanoborohydride reducing agent. The reaction solution was purified using a SP-HP column (GE Healthcare, USA) containing ethanol in sodium citrate (pH 3.0).

[128] Para se preparar um conjugado de análogo de insulina-fragmento Fc de imunoglobulina, deixou-se reagir o análogo de insulina mono-PEGilado purificado e o fragmento Fc de imunoglobulina entre si, numa proporção molar de 1:1 a 1:2, a uma concentração total de proteína de 20 mg/mL, a 2°C durante cerca de 12 a 16 horas. Nesse momento, a condição de tampão de reação era HEPES 100 mM, pH 8,2, ao qual se adicionou 20 mM de ciano-boro-hidreto de sódio como agente redutor para preparar um conjugado do análogo de insulina modificado com PEG no terminal N do fragmento Fc.[128] To prepare an insulin analogue-immunoglobulin Fc fragment conjugate, purified mono-PEGylated insulin analogue and immunoglobulin Fc fragment were allowed to react with each other in a molar ratio of 1:1 to 1:2 at a total protein concentration of 20 mg/mL at 2°C for approximately 12 to 16 hours. At this time, the reaction buffer condition was 100 mM HEPES, pH 8.2, to which 20 mM sodium cyanoborohydride was added as a reducing agent to prepare an insulin analogue conjugate modified with PEG at the N-terminus of the Fc fragment.

[129] Depois de se completar a reação, aplicou-se a solução de reação a uma coluna Q HP (GE Healthcare, USA) e purificou-se, em primeiro lugar, o conjugado de análogo de insulina-fragmento Fc de imunoglobulina utilizando tampão Tris-HCl (pH 7,5) com um gradiente de concentração de NaCl.[129] After the reaction was completed, the reaction solution was applied to a Q HP column (GE Healthcare, USA), and the insulin analogue-immunoglobulin Fc fragment conjugate was first purified using Tris-HCl buffer (pH 7.5) with a NaCl concentration gradient.

[130] Subsequentemente, obteve-se o conjugado do análogo de insulina- fragmento Fc de imunoglobulina utilizando, como segunda coluna, uma coluna Source 15ISO (GE Healthcare, USA). Neste momento, efetuou-se a eluição do conjugado do análogo de insulina-fragmento Fc de imunoglobulina utilizando um gradiente de concentração de sulfato de amónio que contém Tris-HCl (pH 7,5).[130] Subsequently, the insulin analogue-immunoglobulin Fc fragment conjugate was obtained using a Source 15ISO column (GE Healthcare, USA) as the second column. At this point, the insulin analogue-immunoglobulin Fc fragment conjugate was eluted using a concentration gradient of ammonium sulfate containing Tris-HCl (pH 7.5).

[131] Exemplo 9: síntese de derivados de oxintomodulina[131] Example 9: Synthesis of oxyntomodulin derivatives

[132] No exemplo, foram sintetizados derivados de oxintomodulina que possuem as seguintes sequências de aminoácidos (quadro 4).[132] In the example, oxyntomodulin derivatives were synthesized that have the following amino acid sequences (Table 4).

[133] Quadro 4 [133] Table 4

[134] No quadro 4, os aminoácidos em negrito e sublinhados em cada uma das SEQ ID NOs: 40, 58, 59, 61, 64, 65, 70, 71 e 72, considerados em conjunto, formam um anel, e os aminoácidos representados por X designam um aminoácido não nativo, ácido alfa-metil-glutâmico. Além disso, CA representa 4-imidazoacetilo e DA representa desamino-histidilo.[134] In Table 4, the bold and underlined amino acids in each of SEQ ID NOs: 40, 58, 59, 61, 64, 65, 70, 71, and 72, taken together, form a ring, and the amino acid represented by X designates a non-native amino acid, alpha-methyl-glutamic acid. Additionally, CA represents 4-imidazoacetyl and DA represents desamino-histidyl.

[135] Exemplo 10: produção do conjugado de agonista dual GLP-1/ /glucagon de longa ação[135] Example 10: Production of long-acting dual GLP-1/glucagon agonist conjugate

[136] Neste exemplo, preparou-se um conjugado de longa ação de uma variante de oxintomodulina nativa, um típico agonista dual GLP-1/glucagon.[136] In this example, a long-acting conjugate of a native oxyntomodulin variant, a typical dual GLP-1/glucagon agonist, was prepared.

[137] Em primeiro lugar, para submeter a PEGilação MAL-10K-ALD PEG no resíduo cisteína na posição 30 da sequência de aminoácidos do agonista dual GLP- 1/glucagon (SEQ ID NO: 40: HAibQGTFTSDYSKYLDEKRAKEFVQWLMNTC, aminoácidos apresentados a negrito designa uma formação de anel, Aib é 2- metilalanina), deixou-se reagir o agonista dual GLP-1/glucagon e MAL-10K-ALD (NOF, Japão) PEG entre si numa proporção molar de 1:1 a 1:3, a uma concentração em proteína de 3 a 5 mg/mL, à temperatura ambiente durante cerca de 3 horas. Nesse momento, efetuou-se a reação num ambiente em que se adicionou isopropanol a tampão Tris 50 mM (pH 8,0). Depois de se completar a reação, aplicou-se a solução de reação a uma coluna SP HP (GE, EUA) e purificou-se o agonista dual GLP- 1/glucagon mono-pegilado com cisteína. Efetuou-se o método de purificação utilizando um tampão de citrato de sódio pH 3,0 que contém etanol e um gradiente de concentração de cloreto de potássio.[137] First, to subject MAL-10K-ALD PEG to PEGylation at the cysteine residue at position 30 of the amino acid sequence of GLP-1/glucagon dual agonist (SEQ ID NO: 40: HAibQGTFTSDYSKYLDEKRAKEFVQWLMNTC, amino acids shown in bold designate a ring formation, Aib is 2-methylalanine), GLP-1/glucagon dual agonist and MAL-10K-ALD (NOF, Japan) PEG were allowed to react with each other in a molar ratio of 1:1 to 1:3 at a protein concentration of 3 to 5 mg/mL at room temperature for about 3 hours. At that time, the reaction was carried out in an environment where isopropanol was added to 50 mM Tris buffer (pH 8.0). After the reaction was completed, the reaction solution was applied to a SP HP column (GE, USA) and the cysteine-monopegylated GLP-1/glucagon dual agonist was purified. The purification method was performed using a pH 3.0 sodium citrate buffer containing ethanol and a potassium chloride concentration gradient.

[138] A seguir, deixou-se reagir o agonista dual GLP-1/glucagon moo-pegilado purificado com Fc de imunoglobulina a uma proporção molar de cerca de 1:2 a 1:5, a uma concentração em proteína de cerca de 20 mg/mL, a 4°C-8°C durante 12 a 16 horas. Efetuou-se a reação num ambiente em que se adicionou SCB 20 mM com agente redutor a tampão fosfato de potássio 100 mM (pH 6,0). Depois de se completar a reação, enquanto solução de reação, SOURCE Q (GE, USA) foi utilizada em primeiro lugar para purificar o conjugado do agonista dual GLP-1/glucagon-fragmento Fc de imunoglobulina. A purificação foi efetuada utilizando tampão bis-tris 20 mM pH 6,8 e um gradiente de concentração de cloreto de sódio. A seguir, o conjugado do agonista dual GLP-1/glucagon-fragmento dFc de imunoglobulina foi finalmente purificado utilizando uma coluna de purificação ‘Source ISO’. O conjugado do agonista dual GLP-1/glucagon-fragmento Fc de imunoglobulina foi purificado utilizando tampão Tris 20 mM pH 7,5 que contém sulfato de amónio 1 M e um gradiente de concentração de tampão Tris 20 mM, pH 7,5.[138] Then, the purified moo-pegylated GLP-1/glucagon dual agonist was reacted with immunoglobulin Fc at a molar ratio of about 1:2 to 1:5 at a protein concentration of about 20 mg/mL at 4°C-8°C for 12 to 16 hours. The reaction was carried out in an environment where 20 mM SCB was added as reducing agent to 100 mM potassium phosphate buffer (pH 6.0). After the completion of the reaction, SOURCE Q (GE, USA) was used as the reaction solution first to purify the GLP-1/glucagon dual agonist-immunoglobulin Fc fragment conjugate. The purification was carried out using 20 mM bis-tris buffer pH 6.8 and a sodium chloride concentration gradient. Next, the dual agonist GLP-1/glucagon-immunoglobulin dFc fragment conjugate was finally purified using a Source ISO purification column. The dual agonist GLP-1/glucagon-immunoglobulin Fc fragment conjugate was purified using 20 mM Tris buffer pH 7.5 containing 1 M ammonium sulfate and a concentration gradient of 20 mM Tris buffer pH 7.5.

[139] Exemplo 11: avaliação do efeito de uma administração combinado do conjugado de agonista dual GLP-1/glucagon-Fc de imunoglobulina e um conjugado de análogo de insulina-Fc de imunoglobulina[139] Example 11: Evaluation of the effect of combined administration of a dual GLP-1/glucagon agonist-immunoglobulin Fc conjugate and an insulin analogue-immunoglobulin Fc conjugate

[140] O presente teste foi efetuado para determinar o progresso do nível de glicose no sangue e da alteração do peso corporal durante a administração combinada do conjugado de agonista dual GLP-1/glucagon de longa ação e do conjugado de análogo de insulina de longa ação, preparados nos exemplos 9 e 10. Aclimatizou-se 42 ratos db/db (7 semanas de idade) durante 2 semanas sob condições de dieta e água de acesso livre e depois dividiu-se 6 ratos por grupo num total de 7 ratos. Os grupos de acordo com os materiais de administração são 7 grupos no total, que incluem m veículo, grupo tratado apenas com conjugado de agonista dual GLP- 1/glucagon-Fc de imunoglobulina (1,4 nmol/kg), grupo tratado apenas com conjugado do análogo de insulina-Fc de imunoglobulina (8,8 e 17,6 nmol/kg), grupo tratado com conjugado combinado de agonista dual GLP-1/glucagon-Fc de imunoglobulina de longa ação (2,2, 4,4 e 8,8 nmol/kg). Todos os materiais testados foram administrados por via subcutânea duas vezes ao dia. Exceto no dia em que é efetuada a administração, os níveis de glicose no sangue foram medidos com um glicômetro após jejum durante 4 horas aleatoriamente duas vezes por semana. O nível de glicose no sangue de cada grupo foi comparado por meio de um gráfico de ASC (área sob a curva) que mostra a alteração de glicose em jejum durante 4 semanas em comparação com o grupo tratado com veículo (fig. 1). As alterações no peso foram comparadas após a administração do fármaco durante 4 semanas em cada grupo, comparativamente com a pré-dose (fig. 2)[140] The present test was performed to determine the progress of blood glucose level and body weight change during combined administration of the long-acting dual GLP-1 agonist/glucagon conjugate and the long-acting insulin analogue conjugate prepared in Examples 9 and 10. 42 db/db rats (7 weeks old) were acclimatized for 2 weeks under free diet and water conditions and then 6 rats per group were divided for a total of 7 rats. The groups according to the administration materials are 7 groups in total, which include vehicle, GLP-1 dual agonist/glucagon-immunoglobulin Fc conjugate treated group only (1.4 nmol/kg), insulin analogue-immunoglobulin Fc conjugate treated group only (8.8 and 17.6 nmol/kg), GLP-1 dual agonist/glucagon-immunoglobulin Fc long-acting conjugate treated group (2.2, 4.4 and 8.8 nmol/kg). All tested materials were administered subcutaneously twice a day. Except on the day of administration, blood glucose levels were measured with a glucometer after fasting for 4 hours randomly twice a week. The blood glucose level of each group was compared using an AUC (area under the curve) graph showing the change in fasting glucose over 4 weeks compared with the vehicle-treated group (Fig. 1). Weight changes were compared after drug administration for 4 weeks in each group compared with pre-dose (Fig. 2).

[141] Tal como apresentado na fig. 1, comparativamente com um grupo de administração individual do conjugado do agonista dual GLP-1/glucagon-Fc de imunoglobulina (1,4 nmol/kg) ou conjugado de análogo de insulina-Fc de imunoglobulina (8,8 nmol/kg), foi observado um efeito sinergético num grupo de administração combinada dos dois materiais na mesma quantidade (conjugado de agonista dual GLP-1/glucagon-Fc de imunoglobulina (1,4 nmol/kg) ou conjugado do análogo de insulina-Fc de imunoglobulina Fc (8,8 nmol/kg)). Além disso, o grupo de administração combinada exibiu o efeito de redução do nível de glicose no sangue semelhantes ao do conjugado de análogo de insulina-Fc de imunoglobulina (17,6 nmol/kg), administrado numa dose superior.[141] As shown in Fig. 1, compared with a single administration group of GLP-1 dual agonist/glucagon-immunoglobulin Fc conjugate (1.4 nmol/kg) or insulin analogue-immunoglobulin Fc conjugate (8.8 nmol/kg), a synergistic effect was observed in a combined administration group of the two materials in the same amount (GLP-1 dual agonist/glucagon-immunoglobulin Fc conjugate (1.4 nmol/kg) or insulin analogue-immunoglobulin Fc conjugate (8.8 nmol/kg)). Furthermore, the combined administration group exhibited the similar blood glucose level lowering effect as the insulin analogue-immunoglobulin Fc conjugate (17.6 nmol/kg) administered at a higher dose.

[142] Na alteração do peso corporal (fig. 2), o conjugado de análogo de insulina- Fc de imunoglobulina exibiu um peso corporal aumentado devido à administração repetida durante 4 semanas, ao passo que o grupo de administração combinada e o grupo de administração individual do conjugado de agonista dual GLP-1/glucagon-Fc de imunoglobulina de longa ação exibiu um peso corporal reduzido.[142] In body weight change (Fig. 2), the insulin analogue-immunoglobulin Fc conjugate exhibited an increased body weight due to repeated administration for 4 weeks, whereas the combined administration group and the single administration group of the long-acting GLP-1/glucagon dual agonist-immunoglobulin Fc conjugate exhibited a reduced body weight.

[143] Além disso, comparando o grupo tratado individualmente do conjugado de análogo de insulina-Fc de imunoglobulina em que foi administrada a mesma quantidade de análogo de insulina-imunoglobulina com um grupo de tratamento combinado de conjugado de agonista dual GLP-1/glucagon-Fc de imunoglobulina/insulina, o ganho de peso devido à administração de insulina pode ser evitado por meio da administração conjunta do conjugado de agonista dual GLP- 1/glucagon-Fc de imunoglobulina. Além disso, mesmo no caso de um grupo tratado individualmente do conjugado de análogo de insulina-Fc de imunoglobulina (17,6 nmol/kg) ser comparado com um grupo tratado com combinação (conjugado de agonista dual GLP-1/glucagon-Fc de imunoglobulina (1,4 nmol/kg), conjugado de análogo de insulina-Fc de imunoglobulina (8,8 nmol/kg)), foi possível observar um efeito de redução do peso corporal.[143] Furthermore, comparing the individually treated group of the insulin analogue-immunoglobulin Fc conjugate in which the same amount of insulin analogue-immunoglobulin was administered with a combined treatment group of GLP-1/glucagon dual agonist-immunoglobulin Fc conjugate/insulin, weight gain due to insulin administration could be avoided by co-administration of the GLP-1/glucagon dual agonist-immunoglobulin Fc conjugate. Furthermore, even in the case of an individually treated group of the insulin analogue-immunoglobulin Fc conjugate (17.6 nmol/kg) being compared with a combination treated group (GLP-1/glucagon dual agonist-immunoglobulin Fc conjugate (1.4 nmol/kg), insulin analogue-immunoglobulin Fc conjugate (8.8 nmol/kg)), a body weight reduction effect could be observed.

[144] A partir destes resultados, observou-se que a composição que inclui um conjugado de insulina de longa ação e um conjugado do agonista dual GLP- 1/glucagon de longa ação apresenta uma excelente aptidão para controlar os níveis de glicose no sangue e não apresenta efeitos secundários de ganho de peso devido à administração de insulina, exibiu um efeito terapêutico superior ao do grupo em que a insulina convencional e o fármaco agonista dual foram administrados, respectivamente.[144] From these results, it was observed that the composition that includes a long-acting insulin conjugate and a long-acting dual GLP-1/glucagon agonist conjugate has an excellent ability to control blood glucose levels and does not present side effects of weight gain due to insulin administration, exhibiting a superior therapeutic effect than the group in which conventional insulin and the dual agonist drug were administered, respectively.

[145] A partir da descrição anterior, um especialista na matéria será capaz de apreciar que a invenção pode apresentar outras formas específicas sem alterar o espírito técnico ou as características essenciais. Neste sentido, as variantes descritas antes deverão ser entendidas com ilustrativas e não como restritivas em todos os aspectos. O âmbito da invenção deverá ser interpretado como dizendo respeito ao significado e âmbito das reivindicações anexas e não da descrição pormenorizada e todas as alterações ou variações obtidas a partir de conceitos equivalentes pertencem ao âmbito da presente invenção.[145] From the above description, a person skilled in the art will be able to appreciate that the invention may present other specific forms without altering the technical spirit or the essential characteristics. In this sense, the variants described above should be understood as illustrative and not as restrictive in all respects. The scope of the invention should be interpreted as relating to the meaning and scope of the appended claims and not of the detailed description and all modifications or variations obtained from equivalent concepts belong to the scope of the present invention.

Claims

1. Pharmaceutical composition characterized by comprising a long-acting insulin conjugate and a long-acting GLP-1/glucagon dual agonist conjugate, in which the long-acting insulin is a conjugate in which an insulin analog comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 34 and an immunoglobulin Fc region are linked by a non-peptide polymeric linker, and the long-acting GLP-1/glucagon dual agonist is a conjugate in which a GLP-1/glucagon dual agonist comprising an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 40, 63 and 64 and an immunoglobulin Fc region are linked by a non-peptide polymeric linker; and in which the non-peptide polymeric is polyethylene glycol.

2. Composition according to claim 1, characterized in that the immunoglobulin Fc region is aglycosylated.

3. Composition according to claim 2, characterized in that the immunoglobulin Fc region comprises one to four regions selected from the set consisting of the CH1, CH2, CH3 and CH4 domains.

4. Composition according to claim 3, characterized in that the immunoglobulin Fc region further comprises a hinge region.

5. Composition according to claim 4, characterized in that the immunoglobulin Fc region is an Fc region originating from IgG, IgA, IgD, IgE or IgM.

6. Composition according to claim 5, characterized in that each domain of the immunoglobulin Fc region is a hybrid of domains with a different origin selected from the group consisting of IgG, IgA, IgD, IgE and IgM.

7. Composition according to claim 6, characterized in that the immunoglobulin Fc region is a dimer or a multimer consisting of single-chain immunoglobulins consisting of domains with the same origin.

8. Composition according to claim 1, characterized in that the composition further comprises a pharmaceutically acceptable vehicle.

9. Composition according to claim 1, characterized in that the long-acting dual GLP-1/glucagon agonist is a conjugate in which a dual GLP-1/glucagon agonist represented by SEQ ID NO: 40 and an immunoglobulin Fc region are linked by means of a non-peptide polymeric linker.

10. Composition according to claim 9, characterized in that the 16th and 20th amino acids of a dual agonist of the glucagon-like peptide-1 (GLP-1)/long-acting glucagon receptor represented by SEQ ID NO: 40 form a ring.

11. Composition, according to claim 1, characterized by being used in the treatment of diabetes mellitus.