BR112015020782B1 - Agente anexado à nanopartícula à base de sílica fluorescente, seu uso e composição farmacêutica que o compreende - Google Patents

Abstract

AGENTE ANEXADO À NANOPARTÍCULA À BASE DE SÍLICA FLUORESCENTE, SEU USO E COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA QUE O COMPREENDE. A presente invenção refere-se a uma nanopartícula fluorescente à base de sílica que permite a detecção precisa, a caracterização, o monitoramento e o tratamento de uma doença tal como o câncer. A nanopartícula apresenta uma faixa de diâmetros, tem um composto fluorescente posicionado dentro da nanopartícula, e apresenta um brilho e um rendimento quântico fluorescente mais elevados do que o composto fluorescente livre, apresenta uma bioestabilidade e uma biocompatibildade elevadas, pode ser revestida com um polímero orgânico, tal como poli(etileno glicol) (PEG). O pequeno tamanho da nanopartícula, a base de sílica e o revestimento de polímero orgânico minimizam a toxicidade da nanopartícula quando administrada in vivo. A nanopartícula pode ser adicionalmente conjugada a um ligante. Um agente terapêutico pode ser anexado à nanopartícula. Adicionalmente, imagiologia por ressonância magnética (MRI), radionuclídeos / radiometais ou íons paramagnéticos podem ser conjugados à nanopartícula.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Este requerimento reivindica prioridade para o Requerimento de Patente Provisória dos estados Unidos No. 61/794.414 arquivado em 15 de março de 2013, e para o Requerimento de Patente dos Estados Unidos No. 14/215.879 arquivado em 17 de março de 2014. A descrição de cada um dos requerimentos acima identificados é incorporada por meio de referência em sua totalidade.

DECLARAÇÃO REFERENTE A ESTUDO OU DESENVOLVIMENTO PATROCINADO PELO GOVERNO FEDERAL

[002] Esta invenção foi realizada com suporte do governo federal de acordo com o NIH-NRRA, Clinical e Translational Science Center Grant; NIH-NCI R01CA161280-01A1, NSF STC Program Agreement No. ECS-9876771; ICMIC P50 CA86438; NIH SAIRP Grant No. R24 CA83084; e NHI Center Grant No. P30 CA08748.

CAMPO DA INVENÇÃO

[003] A presente invenção refere-se a nanopartículas fluorescentes à base de sílica, e métodos de uso das nanopartículas para detectar, diagnosticar, ou tratar doenças tais como o câncer.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[004] A detecção precoce do tumor e a seleção do tratamento são fundamentais para atingir o sucesso terapêutico e taxas de sobre- vida de longo termo. Em seu estágio inicial, muitos cânceres estão localizados e podem ser tratados cirurgicamente. No entanto, em situações cirúrgicas, a avaliação de disseminação de doença metastática e das margens do tumor, particularmente em áreas de anatomia complexa, é limitada por uma falta de tecnologias de imagiologia. Isto tem levado a um número desproporcional de biópsias invasivas. Sondas direcionadas molecularmente incorporando etiquetas produtoras de contraste (isto é, óticas, PET) e oferecendo especificidade aprimorada são necessárias para detecção precoce por imagiologia de diferenças moleculares entre células normais e tumorais, tais como alterações específicas do câncer em níveis de expressão de receptores. Quando combinadas com ferramentas de imagiologia de maior sensibilidade e de maior resolução, sondas direcionadas molecularmente específicas vão aumentar muito a sensibilidade da detecção, o estagiamento, e o monitoramento e/ou o tratamento do câncer.

[005] As presentes sondas de fluorescência para imagiologia tipicamente consistem em único fluoróforo convencional (por exemplo, corantes orgânicos, proteínas fluorescentes), proteínas fluorescentes (por exemplo, GFP) e pontos quânticos semicondutores (pontos Q ou Q-dots). Fluoróforos únicos de modo geral não são estáveis e têm brilho limitado para imagiologia. De modo similar aos corantes, as proteínas fluorescentes tendem a apresentar interações em estado excitado o qual pode levar a cintilações estocásticas, extinção e fotodegrada- ção. Os pontos quânticos (Q-dots) são geralmente produzidos a partir de íons de metais pesados tais como Pb2+ ou Cd2+ e, portanto, são tóxicos. Burns et al. "Fluorescent core-shell silica nanoparticles: for "Lab on a Particle" architectures for nanobiotechnology", Chem. Soc. Rev., 2006, 35, 1028-1042.

[006] Nanopartículas fluorescentes tendo uma concha eletricamente condutora e um núcleo de sílica são conhecidos e têm utilidade na liberação modulada de um agente terapêutico. As Patentes dos Estados Unidos Nos. 6.344.272, e 6.428.811. Uma deficiência das nanopartículas fluorescentes existentes é seu brilho limitado e sua baixa detectabilidade como sondas fluorescentes em sistemas dispersados.

[007] As presentes nanopartículas fluorescentes à base de sílica multifuncional oferecem muitas vantagens em relação a outras sondas de partículas de diâmetro tipicamente maior. As nanopartículas são não tóxicas, apresentam excelentes propriedades fotofísicas (incluindo eficiência da fluorescente e fotoestabilidade), e demonstram aumento da afinidade de ligação, potência, bem como uma assinatura farmaco- cinética distinta -- uma na qual o clearance renal em sua maior parte predomina sem significativa captação pelo sistema do retículo endote- lial (RES). Seu tamanho relativamente pequeno, e revestimento superficial de PEG facilita excelente clearance renal. As nanopartículas fluorescentes da presente invenção contêm um núcleo fluorescente e concha de sílica. As arquiteturas da concha e do núcleo, a grande área superficial e a química superficial diversa da nanopartícula permitem que múltiplas funcionalidades sejam liberadas simultaneamente a uma célula alvo. Por exemplo, a nanopartícula pode ser funcionalizada com porções de direcionamento, agentes de contraste para imagiologia médica, agentes terapêuticos, ou outros agentes. As porções de direcionamento sobre a superfície da nanopartícula podem ser ligantes tumorais, os quais, quando combinados com agentes terapêuticos conjugados a nanopartículas, tornam a nanopartícula um veículo ideal para direcionamento e potencialmente tratamento do câncer. Webster et al. Optical calcium sensors: development of a generic method for their introduction to the cell using conjugated cell penetrating peptides. Analyst, 2005; 130:163-70. A nanopartícula à base de sílica pode ser etiquetada com agentes de contraste para PET, SPECT, CT, MRI, e imagiologia ótica.

SUMÁRIO

[008] O presente requerimento proporciona um método para detecção de células tumorais compreendendo as etapas de: (a) administração a um paciente de uma pluralidade de nanopartículas fluorescentes à base de sílica em uma dose variando a partir de cerca de 0,01 nanomol/kg de peso corporal até cerca de 1 nanomol/kg de peso corporal, a nanopartícula compreendendo: um núcleo à base de sílica compreendendo um composto fluorescente posicionado dentro do núcleo à base de sílica; uma concha de sílica em torno de no mínimo uma porção do núcleo; um polímero orgânico anexado à nanopartícula; um ligante anexado à nanopartícula e capaz de ligar um marcador tumoral; e no mínimo um agente terapêutico; e (b) detecção das nanopartículas.

[009] A nanopartícula pode ser administrada por via subdérmica, por via peritumoral, por via oral, por via intravenosa, por via nasal, por via subcutânea, por via intramuscular ou por via transdérmica. Uma nanopartícula fluorescente à base de sílica compreendendo:

[0010] A presente invenção também proporciona uma nanopartícula fluorescente à base de sílica compreendendo: um núcleo à base de sílica compreendendo um composto fluorescente posicionado dentro do núcleo à base de sílica; uma concha de sílica em torno de no mínimo uma porção do núcleo; um polímero orgânico anexado à nanopartícula; e um ligante anexado à nanopartícula, em que a nanopartícula tem um diâmetro entre cerca de 1 nm e cerca de 15 nm, e depois da administração da nanopartícula a um sujeito, o clearance renal da nanopartícula varia a partir de cerca de 80% da DI (dose inicial) até cerca de 100% da DI em cerca de 24 horas, ou a partir de cerca de 90% da DI até cerca de 100% da DI em cerca de 24 horas.

[0011] A presente invenção proporciona uma nanopartícula fluorescente à base de sílica compreendendo um núcleo à base de sílica tendo um composto fluorescente posicionado dentro do núcleo à base de sílica; uma concha de sílica em torno de no mínimo uma porção do núcleo; um polímero orgânico anexado à nanopartícula; a partir de cerca de 1 até cerca de 30 ligantes, ou a partir de cerca de 1 até cerca de 20 ligantes anexados à nanopartícula; e um agente de contraste ou um quelato anexado à nanopartícula.

[0012] O diâmetro da nanopartícula varia a partir de cerca de 1 nm até cerca de 25 nm, ou a partir de cerca de 1 nm até cerca de 8 nm. Os polímeros orgânicos que podem ser anexados à nanopartícula incluem poli(etileno glicol) (PEG), polilactato, ácidos polilácticos, açúcares, lipídeos, ácido poliglutâmico (PGA), ácido poliglicólico, poli(láctico- co-glicólico ácido) (PLGA), Polivinil acetato (PVA), ou as combinações dos mesmos.

[0013] O ligante pode ser capaz de ligação a no mínimo um componente celular, tal como um marcador tumoral. O número de ligantes anexados à nanopartícula também pode variar a partir de cerca de 1 até cerca de 30, a partir de cerca de 1 até cerca de 25, ou a partir de cerca de 1 até cerca de 10. Exemplos do ligante incluem peptídeo, proteína, biopolímero, polímero sintético, antígeno, anticorpo, microorganismo, vírus, receptor, hapteno, enzima, hormônio, composto químico, patógeno, toxina, modificador da superfície, ou combinações dos mesmos. Peptídeos tais como tripeptídeo RGD, peptídeo cíclico cRGD, peptídeo cíclico cRGDYC, octreotato, EPPT1 e análogos peptí- dicos de alfa-MSH são englobados pela presente invenção. Qualquer peptídeo linear, cíclico ou ramificado contendo a sequência RGD ou alfa-MSH está dentro do âmbito da presente invenção.

[0014] Um agente de contraste, tal como um radionuclídeo incluindo 89Zr, 64Cu, 68Ga, 86Y, 124I e 177Lu, pode ser anexado à nanopartícula. A nanopartícula pode ser anexada a um quelato, por exemplo, DFO, DOTA, TETA e DTPA, que é adaptado para ligar um radionuclídeo.

[0015] A nanopartícula da presente invenção pode ser detectada por tomografia de emissão de pósitrons (PET), tomografia computadorizada de emissão de fóton único (SPECT), tomografia computadorizada (CT), imagiologia por ressonância magnética (MRI), imagiologia ótica (tal como imagiologia por fluorescência incluindo imagiologia por fluorescência próxima ao infravermelho (NIRF)), imagiologia por bio- luminescência, ou combinações dos mesmos.

[0016] Um agente terapêutico pode ser anexado à nanopartícula. Os agentes terapêuticos incluem antibióticos, antimicrobianos, antipro- liferativos, antineoplásicos, antioxidantes, fatores de crescimento celular endotelial, inibidores da trombina, imunossupressores, agentes an- tiagregação plaquetária, inibidores da síntese de colágeno, anticorpos terapêuticos, doadores de óxido nítrico, oligonucleotídeos antisense, agentes de cicatrização de feridas, constructos de transferência de genes terapêuticos, componentes da matriz extracelular, vasodilatado- res, trombolíticos, antimetabólitos, fator de crescimento agonistas, an- timitóticos, estatina, esteroides, agentes anti-inflamatórios esteroidais e não esteroidais, inibidores da enzima conversora de angiotensina (ACE) , eliminadores de radicais livres, PPAR-gama agonistas, RNA interferente pequeno (siRNA), microRNA, e agentes quimioterápicos anticancerígenos. Os agentes terapêuticos englobados pela presente invenção também incluem radionuclídeos, por exemplo, 90Y, 131I e 177Lu. O agente terapêutico pode ser radiomarcado, tal como marcado por ligação ao radioflúor 18F.

[0017] Depois da administração da nanopartícula a um sujeito, a meia-vida de permanência no sangue da nanopartícula pode variar a partir de cerca de 2 horas até cerca de 25 horas, a partir de cerca de 3 horas até cerca de 15 horas, ou a partir de cerca de 4 horas até cerca de 10 horas. A meia-vida de permanência no tumor da nanopartícula depois da administração da nanopartícula a um sujeito pode variar a partir de cerca de 5 horas até cerca de 5 dias, a partir de cerca de 10 horas até cerca de 4 dias, ou a partir de cerca de 15 horas até cerca de 3,5 dias. A proporção da meia-vida de permanência no tumor para a meia-vida de permanência no sangue da nanopartícula depois da administração da nanopartícula a um sujeito pode variar a partir de cerca de 2 até cerca de 30, a partir de cerca de 3 até cerca de 20, ou a partir de cerca de 4 até cerca de 15. O clearance renal da nanopartícula depois da administração da nanopartícula a um sujeito pode variar a partir de cerca de 10% da DI (dose inicial) até cerca de 100% da DI em cerca de 24 horas, a partir de cerca de 30% da DI até cerca de 80% da DI em cerca de 24 horas, ou a partir de cerca de 40% da DI até cerca de 70% da DI em cerca de 24 horas. Em uma modalidade, depois da nanopartícula ser administrada a um sujeito, a meia-vida de permanência no sangue da nanopartícula varia a partir de cerca de 2 horas até cerca de 25 horas, a meia-vida de permanência no tumor da nanopartícula varia a partir de cerca de 5 horas até cerca de 5 dias, e o cle-arance renal da nanopartícula varia a partir de cerca de 30% da DI até cerca de 80% da DI em cerca de 24 horas.

[0018] Quando as nanopartículas na quantidade de cerca de 100 vezes a dose humana equivalente são administradas a um sujeito, substancialmente nenhuma anemia, perda de peso, agitação, aumento da respiração, distúrbio gastro intestinal, comportamento anormal, disfunção neurológica, anormalidades em hematologia, anormalidades na clínica laboratorial, lesões relacionadas com fármaco em patologia de órgãos, mortalidade, ou combinações dos mesmos, é observada no sujeito em cerca de 10 até cerca de 14 dias.

[0019] A presente invenção também proporciona uma nanopartícula fluorescente à base de sílica compreendendo um núcleo à base de sílica compreendendo um composto fluorescente posicionado dentro do núcleo à base de sílica; uma concha de sílica em torno de no mínimo uma porção do núcleo; um polímero orgânico anexado à nanopartícula; e um ligante anexado à nanopartícula, em que a nanopartícula tem um diâmetro entre cerca de 1 nm e cerca de 15 nm. Depois da administração da nanopartícula a um sujeito, a meia-vida de permanência no sangue da nanopartícula pode variar a partir de cerca de 2 horas até cerca de 25 horas, ou a partir de cerca de 2 horas até cerca de 15 horas; a meia-vida de permanência no tumor da nanopartícula pode variar a partir de cerca de 5 horas até cerca de 2 dias; e clearance renal da nanopartícula pode variar a partir de cerca de 30% da DI até cerca de 80% da DI em cerca de 24 horas. O número de ligantes anexados à nanopartícula pode variar a partir de cerca de 1 até cerca de 20, ou a partir de cerca de 1 até cerca de 10. O diâmetro da nanopartícula pode ser entre cerca de 1 nm e cerca de 8 nm. Um agente de contraste, tal como um radionuclídeo, pode ser anexado à nanopartícula. Alternativamente, um quelato pode ser anexado à nanopartícula. A nanopartícula pode ser detectada por PET, SPECT, CT, MRI, imagiologia ótica, imagiologia por bioluminescência, ou combinações dos mesmos. Um agente terapêutico pode ser anexado à nanopartícula. Depois da administração da nanopartícula a um sujeito, a meia-vida de permanência no sangue da nanopartícula também pode variar a partir de cerca de 3 horas até cerca de 15 horas, ou a partir de cerca de 4 horas até cerca de 10 horas. A meia-vida de permanência no tumor da nanopartícula depois da administração da nanopartícula a um sujeito também pode variar a partir de cerca de 10 horas até cerca de 4 dias, ou a partir de cerca de 15 horas até cerca de 3,5 dias. A proporção da meia-vida de permanência no tumor para a meia-vida de permanência no sangue da nanopartícula depois da administração da nanopartícula a um sujeito pode variar a partir de cerca de 2 até cerca de 30, a partir de cerca de 3 até cerca de 20, ou a partir de cerca de 4 até cerca de 15. O clearance renal da nanopartícula também pode variar a partir de cerca de 45% da DI até cerca de 90% da DI em cerca de 24 horas depois da administração da nanopartícula a um sujeito.

[0020] Também é proporcionada na presente invenção uma nanopartícula fluorescente à base de sílica compreendendo um núcleo à base de sílica compreendendo um composto fluorescente posicionado dentro do núcleo à base de sílica; uma concha de sílica em torno de no mínimo uma porção do núcleo; um polímero orgânico anexado à nanopartícula; e um ligante anexado à nanopartícula, em que a nanopartícula tem um diâmetro entre cerca de 1 nm e cerca de 8 nm. Depois da administração da nanopartícula a um sujeito, a proporção de meia-vida de permanência no tumor para meia-vida de permanência no sangue da nanopartícula varia a partir de cerca de 2 até cerca de 30, e o clearance renal da nanopartícula varia a partir de cerca de 30% da DI até cerca de 80% da DI em cerca de 24 horas.

[0021] A presente invenção adicionalmente proporciona um método para detecção de um componente de uma célula compreendendo as etapas de: (a) contactar a célula com uma nanopartícula fluorescente à base de sílica compreendendo um núcleo à base de sílica compreendendo um composto fluorescente posicionado dentro do núcleo à base de sílica; uma concha de sílica em torno de no mínimo uma porção do núcleo; um polímero orgânico anexado à nanopartícula; a partir de cerca de 1 até cerca de 30 ligantes anexados à nanopartícula; e um agente de contraste ou um quelato anexado à nanopartícula; e (b) monitoramento da ligação da nanopartícula à célula ou a um componente celular por no mínimo uma técnica de imagiologia.

[0022] A presente invenção adicionalmente proporciona um método para direcionamento de uma célula tumoral compreendendo administração a um paciente com câncer de uma quantidade eficaz de uma nanopartícula fluorescente à base de sílica compreendendo um núcleo à base de sílica compreendendo um composto fluorescente posicionado dentro do núcleo à base de sílica; uma concha de sílica em torno de no mínimo uma porção do núcleo; um polímero orgânico anexado à nanopartícula; um ligante anexado à nanopartícula e capaz de ligar um marcador tumoral; e no mínimo um agente terapêutico. A nanopartícula pode ser radiomarcada. A nanopartícula pode ser administrada ao paciente pelas seguintes vias, mas não restrita às mesmas: via oral, intravenosa, nasal, subcutânea, local, intramuscular ou transdérmica.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0023] A patente ou o arquivo de requerimento contém no mínimo um desenho executado a cores. Cópias desta patente ou desta publicação de requerimento de patente com desenhos a cores serão proporcionadas pelo Escritório mediante solicitação e pagamento das taxas necessárias.

[0024] A Figura 1a mostra um gráfico da dispersão da luz dinâmica (DLS) (número médio) do tamanho de partícula para sílica sem revestimento (em cinzento) e nanopartículas de sílica contendo Cy5 revestidas com PEG (em preto).

[0025] A Figura 1b mostra imagiologia in vivo da fluorescência de partículas de Cy5 separadas espectralmente (pseudocolorida) sobreposta sobre imagiologia de luz visível de camundongos nude 45 min depois de injeção com nanopartículas de sílica sem revestimento.

[0026] A Figura 1c mostra imagiologia in vivo da fluorescência de partículas de Cy5 separadas espectralmente (pseudocolorida) sobreposta sobre imagiologia de luz visível de camundongos nude 45 min depois de injeção com nanopartículas de Cy5 PEG-uiladas.

[0027] A Figura 1d mostra um estudo da biodistribuição in vivo usando PET-CT co-registrada. A linha superior é imagem de PET-CT co-registrada serial 24 horas pós injeção de nanopartícula revestida com PEG com etiqueta de 124I, flanqueada pelas varreduras adquiridas de modo independente por microCT e microPET. A linha inferior é imagiologia por microPET serial.

[0028] A Figura 2a mostra dados de espectroscopia de correlação da fluorescência (FCS) e ajustes exponenciais únicos para o corante Cy5 (cinza claro), nanopartículas revestidas com PEG contendo Cy5 de 3,3±0,06 nm de diâmetro (cinza escuro, média ± desvio padrão, n=9) e 6,0±0,1 nm de diâmetro (preto, média ± desvio padrão, n=6) mostrando as diferenças no tempo de difusão resultante dos diferentes tamanhos hidrodinâmicos das diferentes espécies.

[0029] A Figura 2b mostra os espectros de absorção e de emissão de corante Cy5 (cinza claro), nanopartículas revestidas com PEG de 3,3 nm de diâmetro (cinza escuro) e 6,0 nm de diâmetro (em preto).

[0030] A Figura 2c mostra a comparação do brilho relativo do corante livre (cinza claro) com nanopartículas de 3,3 nM (cinza escuro) e 6,0 nm de diâmetro (em preto), medida como taxa de contagem por molécula / partícula conforme determinado a partir das curvas de FCS.

[0031] A Figura 2d mostra dados da fotodegradação para o corante Cy5 (cinza claro), nanopartículas revestidas com PEG de 3,3 nm de diâmetro (cinza escuro), e 6,0 nm de diâmetro (em preto) sob excitação a laser de ~3,5 mW.

[0032] A Figura 3a mostra a percentagem da dose de partícula inicial (% da DI) retida pelo sangue (em preto) e pelos tecidos: fígado (cinza claro), pulmão (cinza médio claro), baço (cinza médio), e rim (cinza médio escuro) para nanopartículas de 6,0 nm de diâmetro em vários pontos do tempo a partir de 10 min até 48 h pós injeção (n=3 camundongos, média ± desvio padrão).

[0033] A Figura 3b mostra um gráfico da concentração de partículas retidas para nanopartículas de 3,3 nM (cinza claro) e 6,0 nm (em preto) de diâmetro e os ajustes de decaimentos logarítmicos e meias- vidas associados.

[0034] A Figura 3c mostra um gráfico da excreção de partículas estimada para nanopartículas de 3,3 nM (cinza claro) e 6,0 nm (em preto) de diâmetro e os ajustes logarítmicos e meias-vidas associados (média ± desvio padrão, n=9 (três camundongos por ponto do tempo)).

[0035] A Figura 4 mostra a biodistribuição in vivo das nanopartículas em camundongos não portadores de tumor e portadores de tumor com xenoenxertos de C6 subcutâneos. (A) Partículas de sílica sem revestimento; (B) Partículas de RGD PEGuiladas.

[0036] A Figura 5 mostra dados da ligação específica total para pontos cRGD- e PEG-uilados (isto é, nanopartículas) usando citome- tria de fluxo no canal de Cy5 como uma função do tempo (a) e da concentração de partículas (b).

[0037] A Figura 6 mostra o esquema de C dot multimodal para direcionamento e caracterização de αvβ3-integrina.

[0038] Figura 6a. Representação esquemática da nanopartícula de sílica de núcleo e concha 124I-cRGDY-PEG-uilada com superfície carregando radiomarcadores e peptídeos e núcleo contendo moléculas de corante reativas (inserções).

[0039] Figura 6b. Resultados de FCS e ajustes exponenciais únicos para medições de corante Cy5 em solução (em preto), revestido com PEG (PEG-dot, vermelho), e dots com etiqueta de cRGDY revestido com PEG (azul, conjunto de dados vermelhos abaixo) mostrando diferenças do tempo de difusão como resultado de tamanhos hidrodinâmicos variáveis.

[0040] Figura 6c. Tamanhos hidrodinâmicos (média ± desvio padrão, n=15), e comparações do brilho relativo do corante livre com dots revestidos com PEG e dots de cRGDY-PEG derivados a partir das curvas de FCS, junto com as concentrações de corante e partícula correspondentes.

[0041] A Figura 7 mostra a purificação e o controle de qualidade de 124I-RGDY-PEG-dots usando cromatografia de coluna de exclusão de tamanho. Radioatividade (coluna da direita) de 124I-RGD-dots e 124I- PEG-dots detectados por contagem Y e intensidade do sinal de fluorescência correspondente (Cy5, coluna da esquerda) de 124I-RGDY- PEG-dots e 124I-PEG-dots em cada fração elutriada.

[0042] A Figura 8 mostra estudos da ligação de receptores de in- tegrina competitivos com 124I-cRGDY-PEG-dots, peptídeo cRGDY, e anticorpo anti-αvβ3 usando dois tipos de células.

[0043] Figura 8a. Alta afinidade e ligação específica de 124I- cRGDY-PEG-dots a células M21 por contagem Y. A inserção mostra análise de Scatchard de dados de ligação traçando a proporção da concentração de radioligante ligado a receptor (B) para não ligado (ou livre, F), ou a proporção de ligado para livre, B/F, versus concentração de receptor- receptor ligado, B; a inclinação corresponde à constante de dissociação, Kd.

[0044] Figura 8b. Bloqueio de células M21 por receptores de αvβ3- integrina usando citometria de fluxo e excesso de cRGD não radiomar- cado ou anticorpo anti-αvβ3 antes de incubação com cRGDY-PEG-dots.

[0045] Figura 8c. Ligação específica de cRGDY-PEG-dots a células M21 como contra células M21L carecendo de expressão de inte- grina superficial usando citometria de fluxo.

[0046] Figura 8d. Ligação específica de cRGDY-PEG-dots a células HUVEC por citometria de fluxo. Cada barra representa média ± desvio padrão de três replicatas.

[0047] A Figura 9 mostra os perfis farmacocinéticos e de excreção das sondas de partículas direcionadas e não direcionadas.

[0048] Figura 9a. Biodistribuição de 124I-cRGDY-PEG-dots em camundongos portadores de tumor M21 em vários momentos a partir de 4 até 168 h pós injeção A inserção mostra um gráfico representativo destes dados para sangue para determinar a meia vida da permanência (TI/2).

[0049] Figura 9b. Biodistribuição de 124I-PEG-dots a partir de 4 até 96 h pós injeção.

[0050] Figura 9c. Perfil do clearance de amostras de urina colhidas até 168 horas pós injeção de cRGDY-PEG-dots não radiomarcados (n=3 camundongos, média ± desvio padrão).

[0051] Figura 9d. % da DI/g cumulativa correspondente para as fezes em intervalos até 168 horas pós injeção (n=4 camundongos). Para estudos da biodistribuição, barras representam a média ± desvio padrão

[0052] A Figura 10 mostra os resultados de teste de toxicidade aguda.

[0053] Figura 10a. Fígado corado com H&E representativo a 400* (fotogramas superiores) e rins corados a 200* (fotogramas inferiores). Os camundongos foram tratados com uma dose única de ou 127I- RGDY-PEG-dots não-radiomarcados ou dots revestidos com 127I-PEG (veículo de controle) através de injeção intravenosa e os órgãos foram coletados 14 dias depois.

[0054] Figura 10b. Pesos médios diariamente para cada grupo de tratamento do estudo da toxicidade. A barra de escala na A Figura 10a corresponde a 100 μm.

[0055] A Figura 11 mostra imagiologia serial por PET in vivo de direcionamento tumor-seletivo.

[0056] Figura 11a. Imagens por microPET coronal de corpo inteiro típicas em 4 horas pós injeção demonstrando captações tumorais de M21 (à esquerda, seta) e M21L (meio, seta) de 3,6 e 0,7% da DI/g, respectivamente, e aumento da M21 tumor contraste em 24 horas (à direita).

[0057] Figura 11b. Captação in vivo de 124I-cRGDY-PEG-dots em tumores M21 superexpressando αvβ3 integrina (preto, n=7 camundongos) e M21L não-expressando (cinza claro, n=5 camundongos) e 124I- PEG-dots em M21 (cinza escuro, n=5).

[0058] Figura 11c. Proporções de M21 tumoral para muscular para 124I-cRGDY-PEG-dots (em preto) e 124I-PEG-dots (em cinzento).

[0059] Figura 11d. Correlação de captações tumorais de M21 in vivo e ex-vivo de sondas marcadas com cRGDY e não marcadas. Ca- da barra representa a média ± desvio padrão

[0060] A Figura 12 mostra um mapeamento nodal usando imagiologia por fluorescência ótica próxima ao infravermelho multiescala.

[0061] Figura 12a. Imagiologia por fluorescência de corpo inteiro do sítio tumoral (T) e linfonodos de drenagem inguinais (ILN) e axilares (ALN) e canais linfáticos comunicantes (barra, LC) 1 hora pós injeção em um animal vivo exposto cirurgicamente.

[0062] Figura 12b. Imagens de fluorescência correspondentes cor- registradas de luz branca e de alta resolução (linha superior) e imagens de fluorescência somente (linha inferior) revelando a infraestrutu- ra nodal de linfonodos locais e distantes, incluindo vênulas endoteliais altas (HEV). A maior barra de escala em (b) corresponde a 500 μm.

[0063] A Figura 13a mostra a configuração experimental do uso de modelo de melanoma de mini porco espontâneo para mapeamento das bacias dos linfonodos e drenagem linfática regional do sítio de um tumor de melanoma primário conhecido.

[0064] A Figura 13b mostra imagem de PET de pequeno campo de visão 5 minutos depois de injeção subdérmica de partículas multi- modais (124I-RGD-PEG-dots) em torno do sítio tumoral.

[0065] A Figura 14a mostra PET scan de 18F-fluorodesoxiglucose (18F-FDG) dinâmica de corpo inteiro demonstrando imagens sagitais, coronais, e axiais através do local de doença nodal no pescoço.

[0066] A Figura 14 b mostra PET-CT scans de 18F-FDG fundidas demonstrando imagens sagitais, coronais, e axiais através do sítio de doença nodal no pescoço.

[0067] A Figura 14c mostra a imagem do corpo inteiro do mini porco.

[0068] A Figura 15 mostra os mesmos conjuntos de imagens que na Figura 14, mas no nível da lesão de melanoma primário, adjacente à coluna vertebral sobre a parte de cima das costas.

[0069] A Figura 16a mostra imagens de PET dinâmica de alta resolução depois de injeção subdérmica, em 4 quadrantes de 124I-RGD- PEG-dots sobre o local do tumor durante um período de tempo de 1 hora.

[0070] A Figura 16b mostra imagens por PET-CT fundidas depois de injeção subdérmica, em 4 quadrantes de 124I-RGD-PEG-dots em torno do sítio tumoral durante um período de tempo de 1 hora.

[0071] A Figura 16c mostra imagiologia de Cy5 (imagem superior), o linfonodo ressecado (segunda imagem superior), e coloração por H&E (duas imagens inferiores).

[0072] A Figura 17 mostra um esquema para uma nanopartícula com um corante fluorescente dentro do núcleo e um revestimento superficial de PEG. A nanopartícula é decorada com ligações triplas para "química de click" ("click chemistry') subsequente com tanto DFO quanto Tyr3-octreotato funcionalizados com grupamentos de azida.

[0073] A Figura 18 mostra estruturas de derivado de PEG. Reações químicas de rotina são usadas para a produção do PEG funcio- nalizado com ligações triplas, o qual vai ser então anexado de modo covalente à nanopartícula através do grupamento de silano.

[0074] A Figura 19 mostra estruturas de derivados de DFO.

[0075] A Figura 20a mostra estruturas de Tyr3-octreotato.

[0076] A Figura 20b mostra a síntese do ácido contendo azida pa ra incorporação em Tyr3-Octreotato.

[0077] A Figura 21a mostra um esquema da produção de nanopartícula funcionalizada com um corante fluorescente próximo ao infravermelho dentro de seu núcleo, um revestimento superficial de PEG, quelatos de DFO e Tyr3-octreotato.

[0078] A Figura 21b mostra um esquema da produção de uma multimodalidade 89Zr-com etiqueta de nanopartícula (PET e fluorescência) decorada com Tyr3-octreotato.

[0079] A Figura 21c mostra a ligação de tetrazina - norborneno.

[0080] A Figura 21d mostra um esquema da estratégia para a criação de nanopartículas radiomarcadas de núcleo e concha usando a ligação de tetrazina - norborneno.

[0081] A Figura 21e mostra um esquema da estratégia para a criação de nanopartículas radiomarcadas de núcleo e concha direcionadas por peptídeo usando a ligação de tetrazina - norborneno. São mostrados tanto caminhos de uma etapa (na qual o complexo de que- lador - norborneno pré-metalado é reagido com a partícula) quanto de duas etapas (na qual o quelador é metalado depois de conjugação).

[0082] A Figura 22 mostra imagens microscópicas demonstrando a co-localização entre nanopartículas de cRGF-PEG e lysotracker red no caminho endocitótico.

[0083] Figuras 23a a 23i Mapeamento de SLN (linfonodo sentinela) guiado por imagem: Pre-operative PET imagiologia. (a,b) Imagens axiais por CT revelam uma massa de tecido mole pélvico à esquerda (a, seta) e linfonodo sentinela do franco esquerdo (b, seta). (c,d) Imagens axiais por 18F-FDG mostram atividade localizada dentro do tumor (c, seta) e linfonodo sentinela do franco esquerdo (d, seta) depois de injeção de rastreador i.v.. Imagens de PET-CT co-registradas (e) axial e (f) coronal de 124I-cRGDY-PEG-C dot mostram o sítio da local injeção em torno da lesão pélvica (e, seta). Imagens de PET-CT co- registradas (g) axial e (h) coronal correspondentes localizam a atividade para o linfonodo sentinela (g, seta). (i) Níveis de radioatividade do tumor primário, linfonodo sentinela (in vivo, ex vivo), e um sítio remoto do tumor primário (isto é, fundo), usando uma sonda gama portátil.

[0084] Figuras 24a a 24q Mapeamento do linfonodo sentinela (SLN) guiado por imagem: Imagiologia ótica intraoperatória em tempo real com histologia correlativa. Mapeamento do linfonodo sentinela in- traoperatório foi realizado sobre o animal mostrado nas Figuras 23a a 23i. (a-i) Imagiologia ótica próxima ao infra-vermelho de dois canais da bacia nodal exposta. Injeção local de partículas incorporadas com Cy5.5 apresentadas em modelo de duplo canal (a) cor RGB e (b) canais fluorescentes próximos ao infra-vermelho (em branco). (c-f) Drenagem de linfáticos distal ao sítio de injeção. Sinal de fluorescência dentro dos principais canais linfáticos de drenagem proximal (c, d), média (e), e distal (f) (setas) se estendendo em direção ao linfonodo sentinela ('N'). Canais de menor calibre também são mostrados (pontas de setas). Imagens do SLN apresentadas nos canais (g) colorido e (h) próximos ao infra-vermelho. (i) Imagem do SLN exposto. (j-m) Imagens de SLN nos canais colorido e próximos ao infra-vermelho durante (j,k) e depois da (l,m) excisão, respectivamente. (n) Visão de baixa potência de SLN corado com H&E mostra aglomerado de células pig- mentadsas (caixa preta) (barra = 1 mm). (o) Maior ampliação de (n) revela células de melanoma pigmentadas arredondadas e melanófa- gos (barra = 50 μm). (p) Visão de baixa potência de SLN corado com HMB45 confirma a presença de metástases (caixa preta, bar=500 μm). (q) Maior ampliação em (p) revela aglomerados de células de melanoma expressando HMB45+ (barra = 100 μm).

[0085] Figuras 25a a 25k Discriminação de inflamação de doença metastática: Comparação de rastreadores de dots de 18F-FDG e 124I- cRGDY-PEG C. (a-d) Imagiologia de alterações inflamatórias usando 18F-FDG-PET com correlação tecidual. (a) Varredura por CT axial do estudo de 18F-FDG-PET mostra calcificação dentro do pescoço posterior esquerdo (setas). (b) 18F-FDG PET-CT axial fundida revela atividade hipermetabólica neste mesmo sítio (setas). Aumento do sinal de PET também é visto em estruturas ósseas metabolicamente ativas (asteriscos). (c) Low- e (d) visões de maior potência de tecido calcificado corado com H&E demonstram extensiva infiltração de células inflamatórias. (e-k) Detecção de doença metastática depois de injeção de dots de 124I-cRGDY-PEG C em torno do sítio tumoral. (e) Varredura por CT axial pré-injeção de dots de 124I-cRGDY-PEG-C mostra tecidos moles calcificados dentro do pescoço posterior (setas). (f) PET-CT co- registrada não mostra atividade evidente correspondentes a áreas calcificadas (seta), mas demonstra um linfonodo hipermetabólico à direita (ponta de seta). (g) CT axial em um nível mais superior mostra linfonodos (pontas de setas) bilateralmente e um foco calcificado (seta). (h) PET-CT fundida demonstra linfonodos ávidos por PET (N) e drenagem linfática (seta curvada). Calcificação não mostra nenhuma atividade (seta). (i) Vistas Low- e (j) visões de alta potência confirmam a presença de metástases nodais. (k) ÚNico frame de uma reconstrução de imagem de PET tridimensional (3D) mostra múltiplos linfonodos metas- táticos bilaterais (pontas de setas) e canais linfáticos (seta). A atividade da bexiga é vista sem acumulação de rastreador significativa no fígado. Barras de escala: 500 μm (c, d); 100 μm (i, j).

[0086] As Figuras 26a a 26c mostra PET-CT 3D Integrada de dots de 18F-FDG e 124I-cRGDY-PEG-C. (a-c) Imagens renderizadas de Volume 3D foram geradas a partir de dados de imagiologia por CT e PET mostrados nas Figuras 7a a 7k. (a) Imagem de fusão de PET-CT (vista coronal) não mostra metástases nodais evidentes (asteriscos). É identificado aumento da atividade dentro de estruturas ósseas. (b, c) Imagens de fusão de PET-CT de alta resolução mostrando vistas coronal (b) e superior (c) de linfonodos metastáticos bilaterais (setas abertas) e canais linfáticos (setas curvadas) dentro do pescoço depois de injeção de rastreador de partículas local.

[0087] Figuras 27a a 27o. Avaliação da resposta ao tratamento depois de ablação por radiofrequência (RFA) usando dots de 124I- cRGDY-PEG-C. (a-c) Localização do linfonodo sentinela por radiotra- çador de partículas de dose única. (a) Imagens por CT coronal basal (ponta de seta branca), (b) por PET (ponta de seta preta), e (c) por PET-CT fundida (ponta de seta branca) depois de uma injeção peritu- moral. (b-d) Atividade do rastreador de partículas tumoral. (b) Massa pélvica esquerda exofítica ávida por PET (black seta). (c, d) Imagens por PET-CT combinadas mostrando uma lesão hipermetabólica (seta branca) e fluxo de rastreador de partícula dentro de um canal linfático de drenagem (asterisco) para o linfonodo sentinela (seta curvada). (e,f) Imagens por CT axial pré-ablação localizam o linfonodo sentinela (e, ponta de seta branca) antes de colocação de eletrodo de RFA (f, seta) dentro do linfonodo (mira abaixo). (g) PET-CT fundida pré-ablação revela aumento da atividade do linfonodo sentinela (posterior a miras). (h) PET-CT scan pós-ablação mostra atividade brandamente reduzida no sítio do linfonodo sentinela, anterior à ponta da agulha. (i) Coloração por H&E pré-ablação correspondente de tecido da biópsia do núcleo do linfonodo sentinela confirma infiltração tumoral pigmentada (barra = 200 μm). (j) Alta ampliação de área dentro de caixa em (i) revela grandes aglomerados de células de melanoma pigmentados e arredondados (barra = 50 μm). (k) Coloração por H&E pós-ablação mostra alterações necróticas dentro de um linfonodo parcialmente infiltrado por tumor (caixa) e hemorragias multifocais (barra = 500 μm). (l) Alta ampliação de (k) revela significativa necrose tecidual (pontas de setas) dentro do linfonodo metastático, além de tecido linfoide (barra = 50 μm). (m) Coloração por TUNEL de linfonodo sentilena metastático antes da ablação (barra = 20 μm). (n) Coloração por TUNEL pós- ablação demonstrando áreas focais de necrose com focos de tumor espalhados adjacentes e tecido nodal normal (NT) (barra = 500 μm). (o) Alta ampliação de área dentro de caixa em (n) mostra coloração por TUNEL positiva, consistente com necrose (barra = 20 μm).

[0088] Figuras 28A a 28C. Plataforma de nanopartículas de sílica híbrida de núcleo e concha (dots de 124I-cRGDY-PEG-C) e visão geral do esquema do estudo. (A) Representação esquemática sonda de imagiologia inorgânica híbrida (PET-ótica) (à direita) mostrando o contendo núcleo corante vermelho profundo e cadeias de polietileno glicol (PEG) anexado à superfície que carregam ligantes peptídicos de cRGDY e radiomarcadores para detecção de tumores expressando αvβ3 integrina humana (à esquerda). (B) Espectros combinados por absorção (esquerda: curvas vermelha, preta) e espectros de emissão (direita) para corantes livres (curva azul) e encapsulados (curva verde) revelando aumentada fluorescência de fluoróforos encapsulados. (C) Linha do tempo de eventos do teste clínico. Biol specs, amostras biológicas (sangue, urina).

[0089] Figuras 28D a 28E. Distribuição de corpo inteiro e farmaco- cinética de dots de 124I-cRGDY-PEG-C. (D) Imagens de PET de projeção de máxima intensidade (MIP) em 2 horas (esquerda), 24 horas (meio) e 72 horas (direita) pós injeção de dots de 124I-cRGDY-PEG-C revelam a atividade na bexiga (*), no coração (seta amarela), e no intestino (ponta de seta branca). (E) A percentagem de dose injetada por grama corrigida pelo decaimento (% da DI/g) de urina e plasma coletados em aproximadamente 30 min, 4 h, 24 h e 72 h depois de injeção das partículas foi determinada por contagem de raios gama; gráficos individuais foram gerados para cada paciente. Foram desenhados ROIs sobre os órgãos principais para varreduras por PET de cada paciente para cada paciente de modo a derivar os valores de captação padronizados e a % da DI/g.

[0090] Figura 29 Análises metabólicas de amostras biológicas. (A, B) Concentrações de atividade dependente do tempo (% da DI/gx100) no plasma e na urina, respectivamente, corrigidas pelo decaimento para o momento da injeção. (C a H) RadioTLC (4:1 de ácido acético : metanol como fase móvel) de amostras de plasma e urina (contagens por minuto, cpm, corrigidas pelo decaimento). (C a E) Cromatogramas do plasma mostram um único pico em 0,5 hora (C), 3 horas (D) e 24 horas (E) pós injeção (F a H). Cromatogramas de amostras de urina revelam dois picos em 0,5 hora (F), 3 horas (G), 24 horas (H) pós injeção. Inserções (G, H) apresentam respectivo dados escalados para um máximo de 50 cpm. (I a K) Cromatogramas de padrões: injetado (I), peptídeo radio-iodado (131I) (J) e 131I livre (K). Linhas verticais discriminam picos correspondentes ao rastreador de partícula (traços longos; Rf = 0,04), 131I-cRGDY (traços curtos; Rf = 0,2) e 131I (pontilhado; Rf= 0,7).

[0091] Figura 30 Biodistribuição de imagiologia de partícula por PET-CT de corpo inteiro e captação tumoral preferencial depois de injeção sistêmica de dots de 124I-cRGDY-PEG-C (A) CT coronal reformatada demonstra uma metástase do lobo hepático esquerdo hipodensa e bem definida (ponta de seta). (B) Imagem por PET coronal em 4 horas depois de injeção demonstra atividade aumentada ao longo do aspecto periférico do tumor (ponta de seta), além da bexiga, do trato gastrointestinal (estômago, intestinos), da vesícula biliar, e do coração. (C) PET-CT co-registrada localiza a atividade para a margem tumoral.

[0092] Figura 31 Imagiologia de captação de partícula multimodal em uma lesão da pituitária. (A a B) Imagens por MR axial (A) e sagital (B) reforçadas por contraste multiplanares em 72 horas pós injeção demonstram um foco cístico subcentímetro (setas) dentro do aspecto direito da glândula pituitária anterior. (C a D) Imagens por MRI-PET co- registradas axial (C) e sagital (D) revelam atividade focal aumentada (vermelho) localizada para o sítio de lesão. (E a F) Imagens por PET- CT axial (E) e sagital (F) localizam atividade para o aspecto direito da sela. (G a I) Imagens por PET axial em 3 horas (G), 24 horas (H) e 72 horas (I) pós injeção demonstram progressiva acumulação de atividade (SUVmax) dentro da região selar junto com um declínio correspon-dente na atividade de fundo em torno da lesão. (J) Proporções de atividade tumoral para cerebral (T/B) e tumoral para hepática (T/L) au- mentando como uma função dos tempos pós injeção.

[0093] Figura 32. Estrutura do peptídeo N-Ac-Cys-(Ahx)2-D-Lys- ReCCMSH (ou alfa MSH) usado para conjugação de nanopartícula.

[0094] Figura 33. Estrutura da molécula de direcionamento de Re- CCMSH original.

[0095] Figuras 34A e 34B. Estudos de ligação competitiva usando um agonista de receptor de melanocortina-1 (125I-NDP). Partículas conjugadas a N-Ac-Cys-(Ahx)2-D-Lys-ReCCMSH (ou alfa-MSH) (Figura 34A) tiveram maior afinidade por células de melanoma B16/F1 cultivadas do que uma versão da molécula de sequência misturada (Figura 34B).

[0096] Figuras 35A e 35B. Dados de dose-resposta foram obtidos como uma função das concentrações de partículas direcionadas (Figura 35A) e dos tempos de incubação (Figura 35B) para ambas as linhagens de células de melanoma B16F10 e M21.

[0097] Figura 36. Estudos da sobrevida de células M21 humanas, realizado sobre uma faixa de concentrações de partículas por um tempo de incubação fixo de 48 horas não demonstrou nenhuma perda significativa da viabilidade celular.

[0098] Figuras 37A e 37B. Nanopartículas conjugadas a alfa-MSH 125I-radiomarcadas demonstraram excreção em grande parte renal durante um período de 24 horas tanto em modelos de xenoenxerto muri- no M21 quanto B16F10.

[0099] Figuras 38A e 38B. Nem modelos de xenoenxerto murino M21 nem B16F10 mostraram significativa acumulação da sonda de partículas direcionadas no sistema retículo endotelial (isto é, não um agente do sistema retículo endotelial), nem no rim.

[00100] Figura 39. Ligação competitiva de receptores de integrina e captação dependente da temperatura usando dots de cRGDY-PEG-C e anticorpo anti-αvβ3 para 2 tipos celulares. A. Ligação específica e captação de dots de cRGDY-PEG-C em células M21 como uma função da temperatura (4° C., 25° C., 37° C.) e concentração (25 nM, 100 nM) usando anticorpo de receptor anti-αvβ3 integrina e citometria de fluxo. As concentrações de anticorpo de receptor anti-αvβ3 integrina foram 250 vezes (isto é, 250x) a concentração de partículas. B. Captação de dots de cRGDY-PEG-C em células M21, como contra células M21L carecendo de expressão de integrina superficial normal por citometria de fluxo. C. Captação de partícula seletiva em células HU- VECs usando anticorpo de receptor anti-αvββ integrina e citometria de fluxo. D. Teste de colocalização de dots de cRGDY-PEG-C (1 μM, vermelho) com marcadores endocíticos (transferrina-Alexa-488, FITC- dextrano, verde) e lisossômicos (LysoTracker Red) depois de 4 h de incubação de partículas usando células M21. Vesículas colocalizadas (amarelo), contracorante da Hoechst (azul). Barra de escala = 15 μm. Cada ponto de dados (A a C) representa a média ± desvio padrão de 3 replicatas.

[00101] Figura 40. Níveis de expressão de FAK, Src, MEK, Erk1/2, e Akt fosforiladas em células M21. A. O complexo FAK/Src transduz sinais a partir de receptores superficiais de células de integrina através da ativação de caminhos de sinalização a jusante (PI3K-Akt, Ras- MAPK) para provocar uma faixa de respostas biológicas (as caixas indicam intermediários de proteína avaliados). B. Western blots dos níveis de expressão de proteína fosforilada e de proteína total de intermediários de caminhos chave depois de exposição (2 h, 37° C.) de células M21 sincronizadas por fase G0/G1 a cRGDY-PEG-C-dots de 100 nM em relação a células em meio privado de soro (0,2% de FBS) (isto é, controle). Depois de tripsinização das células e ressuspensão do pélete em tampão de lise, as proteínas foram resolvidas por gradiente a 4 a 12% de SDS-PAGE e analisadas por anticorpos anti-FAK 397, pFAK 576/577, p-Src, pMEK, pErk1/2, e pAkt. Anticorpos contra FAK, Src, MEK, Erk, e Akt também foram usados para detectar a quantidade de proteína total. C. Sumário gráfico da percentagem de alterações da intensidade de sinal em proteína fosforilada para proteína total (Adobe Photoshop CS2; vide Methods) para células expostas a partículas versus células privadas de soro. GF, fatores de crescimento; EC, célula endotelial; ECM, matriz extracelular.

[00102] Figura 41. Estudos de indução e inibição da sinalização em células M21 usando PF-573228 (PF-228), um inibidor de FAK. A. Western blots dos níveis de expressão de proteína fosforilada e total usando o processo precedente da Figura 2 com a adição de 250 nM ou 500 nM de PF-228 (0,5 h, 37° C.) a células antes de exposição a partículas. B. Sumário da percentagem das alterações da intensidade dos níveis de expressão de proteína fosforilada para total em células expostas a partículas versus células de controle com e sem PF-228.

[00103] Figura 42. Efetio de dots de cRGDY-PEG-C sobre a migração celular de M21 usando imagiologia de lapso de tempo. A. Alterações dependentes do tempo na migração celular usando placas revestidas com colágeno ORIS® para uma faixa de concentrações de partículas (0 a 400 nM; 37° C.) em meio RPMI 1640 suplementado com 0,2% de FBS, como contra meio suplementado isolado (controles). As imagens foram capturadas em tempo t = 0 (pré-migração) e em intervalos subsequentes de 24 h depois de remoção do obturador por um microscópio invertido Zeiss Axiovert 200M (objetiva de 5x/0.25NA) e um módulo de varredura por deslizamento (Metamorph® Microscopy Automation & Image Analysis Software) por um total de 96 horas. B. Representação gráfica de alterações na área média de fechamento (%) como uma função da concentração usando o software ImageJ. A área média de fechamento representa a diferença nas áreas demarcadas pela borda de células avançando (pixels) em pontos do tempo arbitrários e depois de remoção do obturador (t = 0), dividida pela última área. Amostras em quadruplicata foram testadas estatisticamente para cada grupo usando um t-teste uni-caudado: *, p=0,011; **, p=0,049; ***, p=0,036. Barras de escala = 100 μm e 33 μm (imagens amplificadas de x e xv).

[00104] Figura 43. Efeito de dots de cRGDY-PEG-C sobre a migração de células HUVEC. A. A migração serial de HUVEC foi avaliada usando o mesmo processo que na A Figura 4 durante um intervalo de tempo de 24 horas. As imagens apresentadas e os valores das áreas de fechamento indicados são representativos de um único experimento. B. As áreas médias de fechamento (%) foram determinadas durante este intervalo de tempo para uma faixa de concentrações de partículas (0 a 400 nM) usando o software ImageJ. Foram realizados testes em triplicata para cada concentração e ponto do tempo. T-teste uni- caudado *, p<0,05. Barra de escala = 76 μm.

[00105] Figura 44. Inibição da migração de células HUVEC usando PF-228. A. Mesmo processo que na A Figura 5, com a exceção de que as células foram expostas a 250 nM e 500 nM de PF-228 (0,5 h, 37° C.) antes de exposição ou incubação de partícula em 0,2% de meio suplementado com FCS. B. Fechamento de área médio (%) para células incubadas sob as condições precedentes. C. Valores de p tabelados para cada condição de exposição usando um t-teste uni-caudado. Foram realizadas amostras em quadruplicata para cada concentração de inibidor. Barra de escala = 50 μm.

[00106] Figura 45. Modulação da disseminação e adesão de células M21 usando dots de cRGDY-PEG-C. A. Imagiologia do lapso de tempo mostrando alterações na fixação celular e na disseminação celular. As células foram pré-incubadas em 0,2% de RPMI suplementado com FBS (0,5 h, 25° C.), sem e com partículas (400 nM), seguido por semeadura em (5 μg/ml) placas de 96 cavidades revestidas com fibro- nectina. As imagens foram capturadas em t = 0, 0,5 h, 1 h, e 2 h usan do um microscópio invertido Zeiss Axiovert 200M (objetiva de 20x/0,4NA) e um módulo de varredura por deslizamento em Metamorph®. B. Representação gráfica mostrando o número médio de células arredondadas e alongadas dentro de dois grupos como uma função do tempo: não expostas a partículas (alongadas, gráfico no. 1) e expostas a partículas (arredondadas, gráfico no. 2). As células em cada uma de três cavidades de uma placa de 96 cavidades foram contadas manualmente em um mínimo de três campos de alta potência (x200 ampliação) e foi feita a média. C. Valores de absorvência (À = 650 nm; leitora de microplacas SpectroMax M5) para células fixadas com 4% de paraformaldeído, expostas ao meio ou cRGDY-PEG C- dots de 400 nM, e tratadas com reagente de azul de metileno (1 ml; 1 h, 37° C.), como uma medida da fixação celular. Barra de escala = 30 μm. Foram realizadas amostras em quadruplicata para cada grupo.

[00107] Figura 46. Influência de dots de cRGDY-PEG-C sobre o ciclo celular. A. Percentagem (%) de células viáveis nas fases G1, S, e G2 do ciclo celular como uma função da concentração de partículas (0, 100, 300 nM) adicionadas a células M21 sincronizadas para fase G0/G1 incubadas por um total de 96 horas. Números em itálico acima de cada barra representam a percentagem de células (incubadas com partículas, controle) na fase S, G1 e G2 , determinada por citometria de fluxo. B. Histogramas do ciclo celular representativos são mostrados para células sob condições de controle (isto é, sem partícula) e depois de incubação com partículas de 100 e 300 nM. ANOVA One-way: *, p<0,05; **, p<0,005 em relação a controle da fase S. Inserções: Valores médios por grupo (n = 3) ± desvio padrão para cada fase do ciclo celular. Os experimentos foram realizados em triplicata.

[00108] Figura 47. Efeitos de dose-resposta e cinética de ligação de saturação usando dots de cRGDY-PEG-C e células expressando αvβ3 integrina. A, B. Ligação / captação celular como uma função da con centração de partículas (A) e do tempo de incubação (B) por citometria de fluxo. Monocamadas de células M21 e HUVEC foram incubadas (4 h, 25° C.) com concentrações crescentes de partículas (5 a 600 nM), bem como durante uma faixa de tempos de incubação (0,5 a 4 h; 100 nM) e avaliadas por análise de sortimento celular ativado por fluorescência (FACS). É apresentada a percentagem dos eventos totais detectada. Cada ponto de dado representa média ± desvio padrão de 3 replicatas.

[00109] Figura 48. Ligação competitiva de receptores de integrina com dots de 124I-cRGDY-PEG-C e peptídeo cRGDY em dois tipos celulares. A. Ligação específica de 124I-cRGDY-PEG-dots a células M21 e HUVEC depois de incubação com excesso de peptídeo cRGDY usando contagem de radiação gama. Monocamadas de células M21 e HUVEC foram incubadas (4 h, 25° C.) com 25 nM de 124I-cRGDY-PEG- dots na presença e na ausência de peptídeo cRGDY (85, 170 nM). A ligação é expressada como uma percentagem do controle (isto é, cRGDY-PEG-dots radioiodados). B. Ligação tumor-direcionada de dots de cRGDY-PEG-C não radiomarcados. Células M21 e HUVEC foram incubadas por 4 h a 25° C. com duas concentrações de partículas direcionadas (25 nM, 100 nM) ou com controles de partícula (PEG-C dots) e avaliadas por citometria de fluxo.

[00110] Figura 49. Viabilidade e proliferação de células M21 e HUVEC como uma função da concentração de partículas e do tempo de incubação. A, B. Absorvência (Àex=440 nm) como uma medida da viabilidade em células subconfluentes, de fase G0/G1 sincronizadas M21 (A) e HUVEC (B) durante um período de 24 horas usando meio suplementado com 10% ou 2% de FBS isolado, respectivamente, ou com adição de partículas (25 a 200 nM). C, D. Atividade proliferativa celular em células M21 (C) e HUVEC (D) durante um intervalo de tempo de 93 h usando ou meio somente ou media contendo partícula, conforme es- pecificado em A, B.

[00111] Figura 50. Alterações da sinalização celular como uma função do tempo de incubação das partículas em células M21. Western blots de intermediários de proteínas fosforiladas selecionados e intermediários de proteína total durante um período de tempo de 8 h. As proporções de intensidade normalizadas (isto é, diferença de fosfo- proteína e proteína total dividida pelo último) são ilustradas graficamente.

[00112] Figura 51. Cell sinalização modulação como uma função of concentração de partículas in células M21. Western blots de intermediários de proteínas fosforiladas selecionados e intermediários de proteína total sobre uma faixa de concentrações de partículas (isto é, 0 a 400 nM).

[00113] Figura 52. Estudos de inibição da sinalização celular em células M21. A. Western blots de intermediários de proteína fosforilada selecionados e intermediários de proteína total (meio sem soro, partículas de 100 nM isoladas, ou partículas de 100 nM depois da adição de inibidor de 250 nM ou 500 nM). B. Intensidades relativas de blots de fosfo-proteína e de β-actina em A em relação a células de controle (0,2% de FBS).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[00114] A presente invenção proporciona uma nanopartícula fluorescente à base de sílica que permite a detecção precisa, a caracterização, o monitoramento e o tratamento de uma doença tal como o câncer. A invenção também proporciona um método para detecção de células tumorais. O método pode conter as seguintes etapas: (a) administração a um paciente de uma pluralidade de nanopartículas fluorescentes à base de sílica em uma dose variando a partir de cerca de 0,01 nanomol/kg de peso corporal até cerca de 1 nanomol/kg de peso corporal, a partir de cerca de 0,05 nanomol/kg de peso corporal até cerca de 0,9 nanomol/kg de peso corporal, a partir de cerca de 0,1 na- nomol/kg de peso corporal até cerca de 0,9 nanomol/kg de peso corporal, a partir de cerca de 0,2 nanomol/kg de peso corporal até cerca de 0,8 nanomol/kg de peso corporal, a partir de cerca de 0,3 nanomol/kg de peso corporal até cerca de 0,7 nanomol/kg de peso corporal, a partir de cerca de 0,4 nanomol/kg de peso corporal até cerca de 0,6 nanomol/kg de peso corporal, ou a partir de cerca de 0,2 nanomol/kg de peso corporal até cerca de 0,5 nanomol/kg de peso corporal, e (b) detecção das nanopartículas. Em uma modalidade, a nanopartícula compreende um núcleo à base de sílica tendo um composto fluorescente posicionado dentro do núcleo à base de sílica; uma concha de sílica em torno de no mínimo uma porção do núcleo; um polímero orgânico anexado à nanopartícula; um ligante anexado à nanopartícula e capaz de ligar um marcador tumoral; e no mínimo um agente terapêutico.

[00115] A nanopartícula apresenta uma faixa de diâmetros incluindo entre cerca de 0,1 nm e cerca de 100 nm, entre cerca de 0,5 nM e cerca de 50 nm, entre cerca de 1 nm e cerca de 25 nm, entre cerca de 1 nm e cerca de 15 nm, ou entre cerca de 1 nm e cerca de 8 nm. A nanopartícula tem um composto fluorescente posicionado dentro da nanopartícula, e apresenta um brilho e um rendimento quântico fluorescente mais elevados do que o composto fluorescente livre. A nanopartícula também apresenta uma bioestabilidade e uma biocompatibildade elevadas. De modo a facilitar eficiente excreção urinária da nanopartícula, pode ser revestida com um polímero orgânico, tal como po- li(etileno glicol) (PEG). O pequeno tamanho da nanopartícula, a base de sílica e o revestimento de polímero orgânico minimizam a toxicidade da nanopartícula quando administrada in vivo. De modo a ter por alvo um tipo celular específico, a nanopartícula pode ser adicionalmente conjugada a um ligante, o qual é capaz de ligação a um componen te celular (por exemplo, a membrana celular ou outro componente intracelular) associado com o tipo celular específico, tal como um marcador tumoral ou um intermediário do caminho de sinalização. Em uma modalidade, um agente terapêutico pode ser anexado à nanopartícula. De modo a permitir que a nanopartícula seja detectável por não somente imagiologia ótica (tal como imagiologia por fluorescência), mas também por outras técnicas de imagiologia, tais como tomografia de emissão de pósitrons (PET), tomografia computadorizada de emissão de fóton único (SPECT), tomografia computadorizada (CT), e imagiologia por ressonância magnética (MRI), a nanopartícula também pode ser conjugada a um agente de contraste, tal como um radionuclídeo.

[00116] As propriedades das nanopartículas levam a excreção em grande volume através dos rins, potência aumentada em relação a um ligante peptídico nativo, aumento da captação, e acumulação preferencial em tumores comparados com tecidos normais. Isto, junto com a falta de toxicidade in vivo, resultou em um produto único resultando em sua translação para a clínica.

[00117] As presentes partículas podem ser usadas para preferencialmente detectar e localizar tumores. Por exemplo, as doses de ras- treadores de partículas nanomolares administradas em um regime de microdosagem se acumulam e preferencialmente localizam em sítios de doença, embora não otimizadas para detecção direcionada.

[00118] As presentes nanopartículas podem apresentar assinaturas farmacocinéticas humanas distintas e reprodutíveis nas quais predomina o clearance renal (por exemplo, o clearance renal da nanopartícula é maior do que cerca de 90% da DI em cerca de 24 horas depois da administração da nanopartícula a um sujeito) sem significativa captação pelo sistema do retículo endotelial (por exemplo, menos de cerca de 10%).

[00119] As presentes nanopartículas são excelentes sondas diag- nósticas, apresentando ótimas propriedades fisicoquímicas em seres humanos que possibilitam que as mesmas "atinjam o alvo e sejam removidas" ("target and clear') do corpo durante intervalos de tempo relativamente curtos (por exemplo, horas, dias, etc.).

[00120] As presentes partículas carregando múltiplos ligantes ativamente direcionados (por exemplo, cRGDY e alfa-MSH) demonstram aumento da afinidade de ligação aos alvos celulares comparada com a afinidade de um ligante isolado. Em algumas modalidades, as presentes partículas ligam a um alvo celular a partir de cerca de 2 até cerca de 20 vezes mais, a partir de cerca de 3 até cerca de 15 vezes mais, a partir de cerca de 5 até cerca de 10 vezes mais do que um ligante isolado.

[00121] Em determinadas modalidades, partículas direcionadas de dupla modalidade especificamente avaliam a carga tumoral e podem discriminar tumor metastático de doença inflamatória crônica em modelos animais grandes de melanoma metastático.

[00122] As partículas direcionadas podem aumentar a afinidade de ligação e a avidez do receptor, aumentar as durações da permanência no plasma, a biodisponibilidade e a retenção no tumor, e/ou promover liberação intracelular através de internalização. A utilização de semelhantes sondas direcionadas dentro de situações cirúrgicas (ou médicas) de oncologia pode possibilitar tratamento altamente seletivo do tecidos que possuem câncer, potencialmente reduzindo as taxas de complicações concomitantes. As presentes partículas podem ser vantajosas em relação aos nanotransportadores direcionados passivamente, uma vez que os últimos penetram e se acumulam inespecifi- camente dentro do interstício do tumor por aumento da permeabilidade e efeitos de retenção (EPR).

[00123] Os sistemas de imagiologia à base de partículas para diagnóstico do câncer devem ser não tóxicos, e detectar seletivamente sítios de doença primária e metastática ao mesmo tempo que apresen- tando clearance renal relativamente rápido. Sob estas condições, a probabilidade de potencial toxicidade será reduzida dada a menor área sob a curva de concentração plasmática por tempo. Em uma modalidade, estas propriedades de clearance renal podem ser obtidas por plataformas à base de partículas ultrapequenas ou por sistemas ma- cromoleculares que satisfazem cortes de tamanho de filtração glomerular renal efecaz de 10 nm ou menos. A ausência de toxicidade aguda de dose única e a minimização de semelhantes riscos também vai ser importante. Um esquema de plataforma deve maximizar a segurança através de rápido clearance do corpo inteiro e a seleção de perfis bio- cinéticos que minimizam captação inespecífica no sistema retículo en- dotelial (RES), deste modo reduzindo potenciais exposições adversas.

[00124] Em uma modalidade, as presentes partículas são seguras e estáveis in vivo. As partículas apresentam assinaturas farmacocinéti- cas distintamente únicas e reprodutíveis definidas pela excreção renal. Junto com captação e localização preferenciais da sonda em sítios de doença, estas partículas podem ser usadas no diagnóstico do câncer.

[00125] A nanopartícula pode ter tanto um ligante quanto um agente de contraste. O ligante permite que a nanopartícula tenha por alvo um tipo celular específico através da ligação específica entre o ligante e o componente celular. Este direcionamento, combinado com imagiologia multimodal, tem múltiplas utilidades. Por exemplo, as nanopartículas podem ser usadas para o mapeamento de doença me- tastática, tal como o mapeamento de linfonodos sentinela (SLN), bem como para a identificação das margens tumorais ou das estruturas neurais, permitindo ao cirurgião ressecar lesões malignas sob visualização direta e prevenir complicações durante o procedimento cirúrgico. O ligante também pode facilitar a entrada da nanopartícula dentro da célula ou transporte de barreira, por exemplo, para avaliar o ambiente intracelular.

[00126] A nanopartícula pode ser acoplada com um ligante e um agente terapêutico com ou sem um radiomarcador. O radiomarcador pode adicionalmente servir como um agente terapêutico para criar uma plataforma teranóstica. Este acoplamento permite que partícula terapêutica seja liberada para o tipo celular específico através da ligação específica entre o ligante e o componente celular. Esta ligação específica do agente terapêutico assegura tratamento seletivo do sítio de doença com mínimos efeitos colaterais.

Estrutura da Nanopartícula

[00127] A nanopartícula fluorescente da presente invenção inclui um núcleo à base de sílica compreendendo um composto fluorescente posicionado dentro do núcleo, e uma concha de sílica sobre o núcleo. A concha de sílica pode circundar no mínimo uma porção do núcleo. Alternativamente, a nanopartícula pode ter somente o núcleo e nenhuma concha. O núcleo da nanopartícula pode conter o produto da reação de um composto fluorescente reativo e um composto de orga- no-silano co-reativo. Em outra modalidade, o núcleo da nanopartícula pode conter o produto da reação de um composto fluorescente reativo e um composto de organo-silano co-reativo, e sílica. O diâmetro do núcleo pode ter a partir de cerca de 0,05 nm até cerca de 100 nm, a partir de cerca de 0,1 nm até cerca de 50 nm, a partir de cerca de 0,5 nm até cerca de 25 nm, a partir de cerca de 0,8 nm até cerca de 15 nm, ou a partir de cerca de 1 nm até cerca de 8 nm. A concha da nanopartícula pode ser o produto da reação de um composto formador de sílica. A concha da nanopartícula pode ter uma faixa de camadas. Por exemplo, a concha de sílica pode ter a partir de cerca de 1 até cerca de 20 camadas, a partir de cerca de 1 até cerca de 15 camadas, a partir de cerca de 1 até cerca de 10 camadas, ou a partir de cerca de 1 até cerca de 5 camadas. A expressura da concha pode variar a partir de cerca de 0,01 nm até cerca de 90 nm, a partir de cerca de 0,02 nm até cerca de 40 nm, a partir de cerca de 0,05 nm até cerca de 20 nm, a partir de cerca de 0,05 nm até cerca de 10 nm, ou a partir de cerca de 0,05 nm até cerca de 5 nm.

[00128] A concha de sílica da nanopartícula pode cobrir somente uma porção da nanopartícula ou toda a partícula. Por exemplo, a concha de sílica pode cobrir cerca de 1 até cerca de 100 por cento, a partir de cerca de 10 até cerca de 80 por cento, a partir de cerca de 20 até cerca de 60 por cento, ou a partir de cerca de 30 até cerca de 50 por cento da nanopartícula. A concha de sílica pode ser ou sólida, isto é, substancialmente não porosa, meso-porosa, tal como semi-porosa, ou porosa.

Síntese da Nanopartícula

[00129] A presente nanopartícula fluorescente pode ser sintetizada pelas etapas de: conjugação de modo covalente de um composto fluorescente, tal como um corante fluorescente reativo, com as porções reativas incluindo, mas não limitadas a, maleimida, iodoacetamida, ti- ossulfato, amina, éster de N-Hidroxissuccimida, éster 4-sulfo-2,3,5,6- tetrafluorofenílico (STP), éster sulfossuccinimidílico, ésteres de sulfodi- clorofenol, cloreto de sulfonila, hidroxila, isotiocianato, carboxila, a um composto de organo-silano, tal como um composto de organo-silano co-reativo, para formar um precursor de sílica fluorescente, e reação do precursor de sílica fluorescente para formar um núcleo fluorescente; conjugação de modo covalente de um composto fluorescente, tal como um corante fluorescente reativo, com um composto de organo- silano, tal como um composto de organo-silano co-reativo, para formar um precursor de sílica fluorescente, e reação do precursor de sílica fluorescente com um composto formador de sílica, tal como tetraalco- xissilano, para formar um núcleo fluorescente; e reação do núcleo resultante com um composto formador de sílica, tal como um tetraalco- xissilano, para formar uma concha de sílica sobre o núcleo, para pro- porcionar a nanopartícula fluorescente.

[00130] A síntese das nanopartículas de núcleo e concha monodis- persas fluorescentes se baseia em um processo de duas etapas. Em primeiro lugar, as moléculas de corante orgânico próximo ao infravermelho (por exemplo, tetrametilrodamina isotiocinato (TRITC)) são conjugadas de modo covalente a um precursor de sílica e condensadas para formar um núcleo rico em corante. Em segundo lugar, os monô- meros de sílica gel são adicionados para formar uma redd de sílica mais densa em torno do material do núcleo fluorescente, proporcionando proteção contra interações de solvente que pode ser prejudicial para a fotoestabilidade. A versatilidade da via do preparativo permite a incorporação de diferentes compostos fluorescentes, tais como corantes ou compostos orgânicos fluorescentes, dependendo da aplicação das nanopartículas pretendida. Os compostos fluorescentes que podem ser incorporados no núcleo rico em corante podem cobrir todo o espectro de emissão e absorção de UV-Vis até próximo ao infravermelho. Requerimento de Patente dos Estados Unidos Ser. Nos. 10/306.614, 10/536.569 e 11/119.969. Wiesner et al., PEG-coated Core-shell Silica Nanoparticles and Methods of Manufacture and Use, PCT/US2008/74894.

[00131] Para a síntese da nanopartícula de núcleo e concha compacta, o precursor de corante é adicionado a um vaso da reação que contém quantidades apropriadas de amônia, água e solvente e deixado para reagir de um dia para o outro. O precursor de corante é sintetizado por reação de adição entre um corante próximo ao infe- vermelho específico de interesse e 3-aminopropiltrietoxissilano em proporção molar de 1:50, em exclusão de umidade. Depois da síntese do núcleo compacto rico em corante ser completada, tetraetilortossili- cato (TEOS) é em seguida adicionado para crescer a concha de sílica que circundou o núcleo.

[00132] A síntese da nanopartícula de núcleo e concha expandida é realizada por co-condensação de TEOS com o precursor de corante e permitindo que a mistura reaja de um dia para o outro. Depois da síntese do núcleo expandido ser completado, TEOS adicional é adicionado para crescer a concha de sílica que circundou o núcleo.

[00133] A síntese das nanopartículas homogêneas é realizada por co-condensação de todos os reagentes, o precursor de corante e TEOS e deixando a mistura reagir de um dia para o outro.

Composto Fluorescente

[00134] As nanopartículas podem incorporar qualquer composto fluorescente conhecido, tal como composto orgânico fluorescente, corantes, pigmentos, ou combinações dos mesmos. São conhecidos uma ampla variedade de adequados quimicamente corantes fluorescentes reativos, vide, por exemplo, MOLECULAR PROBES HANDBOOK OF FLUORESCENT PROBES AND RESEARCH CHEMICALS, 6th ed., R. P. Haugland, ed. (1996). Um típico fluoróforo é, por exemplo, um composto fluorescente aromático ou heteroaromático tal como é um pireno, um antraceno, um naftaleno, uma acridina, um estilbeno, um indol ou benzindol, um oxazol ou benzoxazol, um tiazol ou benzoti- azol, um 4-amino-7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol (NBD), uma cianina, uma carbocianina, um carboestiril, uma porfirina, um salicilato, um an- tranilato, um azuleno, um perileno, uma piridina, uma quinolina, uma cumarina (incluindo hidroxicumarinas e aminocumarinas e derivados fluorados dos mesmos), e compostos semelhantes, vide, por exemplo, as Patentes dos Estados Unidos Nos. 5.830.912, 4.774.339, 5.187.288, 5.248.782, 5.274.113, 5.433.896, 4.810.636 e 4.812.409. Em uma modalidade, Cy5, um corante fluorescente próximo ao infravermelho (NIRF), é posicionado dentro do núcleo de sílica da presente nanopartícula. Sondas de emissão próxima ao infravermelho apresentam diminuição da atenuação e da autofluorescência do tecido. Burns et al. "Fluorescent silica nanoparticles with efficient urinary excretion for nanomedicine", Nano Letters, 2009, 9 (1), 442-448.

[00135] Compostos fluorescentes não limitantes que podem ser usados na presente invenção incluem Cy5, Cy5.5 (também conhecido como Cy5++), Cy2, isotiocianato de fluoresceína (FITC), isotiocianato de tetrametilrodamina (TRITC), ficoeritrina, Cy7, fluoresceína (FAM), Cy3, Cy3.5 (também conhecido como Cy3++), Texas Red, LightCycler- Red 640, LightCycler Red 705, tetrametilrodamina (TMR), rodamina, derivado de rodamina (ROX), hexaclorofluoresceína (HEX), rodamina 6G (R6G), o derivado de rodamina JA133, Corantes Fluorescentes Alexa (tais como Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 555, e Alexa Fluor 647), 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), Iodeto de propídio, AMCA, Spectrum Green, Spectrum Orange, Spectrum Aqua, Lissamine, e complexos de metais de transição fluorescentes, tais como európio. Compostos fluorescentes que podem ser usado também incluem proteínas fluorescentes, tais como GFP (proteína flu-orescente verde), aumento da GFP (EGFP), proteína fluorescente azul e derivados (BFP, EBFP, EBFP2, Azurite, mKalama1), proteína fluorescente ciano e derivados (CFP, ECFP, Cerulean, CyPet) e proteína fluorescente amarela e derivados (YFP, Citrine, Venus, YPet). Publicação de Patente Internacional No. WO2008142571, Publicação de Patente Internacional No. WO2009056282, e Publicação de Patente Internacional No. WO9922026.

[00136] A superfície da concha de sílica das nanopartículas pode ser modificada usando agentes de reticulação conhecidos para introduzir grupamentos funcionais superficiais. Os agentes de reticulação incluem, mas não estão limitados a, divinil benzeno, dimetacrilato de etileno glicol, trimetacrilato de trimetilol propano, N,N'-metileno-bis- acrilamida, éteres alquílicos, açúcares, peptídeos, fragmentos de DNA, ou outros agentes funcionalmente equivalentes conhecidos. O ligante pode ser conjugado à nanopartícula da presente invenção, por exemplo, através de reações de ligação usando carbodiimida, carboxilatos, ésteres, alcoóis, carbamidas, aldeídos, aminas, óxidos de enxofre, nitrogênio óxidos, halogenetos, ou qualquer outro composto adequado conhecido na arte. Patente dos Estados Unidos No. 6.268.222.

Polímero Orgânico

[00137] Um polímero orgânico pode ser anexado à presente nanopartícula, por exemplo, anexado à superfície da nanopartícula. Um polímero orgânico pode ser anexado à concha de sílica da presente nanopartícula. O polímero orgânico que pode ser usado na presente invenção inclui PEG, polilactato, ácidos polilácticos, açúcares, lipídeos, ácido poliglutâmico (PGA), ácido poliglicólico, poli(láctico-co-glicólico ácido) (PLGA), polivinil acetato (PVA), e as combinações dos mesmos. A fixação do polímero orgânico à nanopartícula pode ser realizada por uma ligação covalente ou por ligação não covalente, tal como por ligação iônica, ligação de hidrogênio, ligação hidrofóbica, coordenação, adesivo, e absorção física. Em uma modalidade, a nanopartícula é conjugada de modo covalente com PEG, o qual previne a adsorção das proteínas do soro, facilita a eficiente excreção urinária e diminui a agregação das nanopartículas. Burns et al. "Fluorescent silica nanoparticles with efficient urinary excretion for nanomedicine", Nano Letters, 2009, 9 (1), 442-448.

[00138] A superfície da nanopartícula pode ser modificada para incorporar no mínimo um grupamento funcional. O polímero orgânico (por exemplo, PEG) anexado à nanopartícula pode ser modificado para incorporar no mínimo um grupamento funcional. Por exemplo, o grupamento funcional pode ser uma maleimida ou um éster de N- Hidroxissuccinimida (NHS). A incorporação do grupamento funcional torna possível anexar vários ligantes, agentes de contraste e/ou agentes terapêuticos à nanopartícula.

Ligante

[00139] Um ligante pode ser anexado à presente nanopartícula. O ligante é capaz de ligação a no mínimo um componente celular. O componente celular pode ser associado com tipos celulares específicos ou ter níveis elevados em tipos celulares específicos, tais como células cancerosas ou células específicas para tecidos e órgãos particulares. Por conseguinte, a nanopartícula pode ter por alvo um tipo celular específico, e/ou proporciona uma liberação direcionada para o tratamento e o diagnóstico de uma doença. Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "ligante" se refere a uma molécula ou entidade que pode ser usada para identificar, detectar, direcionar, monitorar, ou modificar um estado físico ou condição, tal como uma estado ou condição de doença. Por exemplo, um ligante pode ser usado para detectar a presença ou a ausência de um receptor em particular, o nível de expressão de um receptor em particular, ou níveis metabólicos de um receptor em particular. O ligante pode ser, por exemplo, um peptídeo, uma proteína, um fragmento de proteína, um hormônio peptídico, um açúcar (isto é, lectinas), um biopolímero, um polímero sintético, um antígeno, um anticorpo, um fragmento de anticorpo (por exemplo, Fab, nanobodies), um aptâmero, um vírus ou um componente viral, um receptor, um hapteno, uma enzima, um hormônio, um composto químico, um patógeno, um micro-organismo ou um componente do mesmo, uma toxina, um modificador da superfície, tal como um surfatante para alterar as propriedades superficiais ou a histocom- patibilidade da nanopartícula ou de um analito quando uma nanopartícula se associa com este, e combinações dos mesmos. Em uma modalidade, os ligantes são anticorpos, tais como anticorpos monoclonais ou policlonais. Em outra modalidade, os ligantes são ligantes de receptores. Em ainda outra modalidade, o ligante é poli-L-lisina (pLisina).

[00140] Um antígeno pode ser anexado à nanopartícula. A nanopar- tícula anexada ao antígeno pode ser usada para vacinação.

[00141] Os termos "componente de uma célula" ou "componente celular" se referem, por exemplo, a um receptor, a um anticorpo, a um ha- pteno, a uma enzima, a um hormônio, a um biopolímero, a um antígeno, a um ácido nucléico (DNA ou RNA), a um micro-organismo, a um vírus, a um patógeno, a uma toxina, combinações dos mesmos, e componentes semelhantes. O componente de uma célula pode ser posicionado sobre a célula (por exemplo, um receptor transmembrana) ou dentro da célula. Em uma modalidade, o componente de uma célula é um marcador tumoral. Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "marcador tumoral" se refere a uma molécula, entidade ou substância que é expressada ou superexpressada em uma célula cancerosa mas não em uma célula normal. Por exemplo, a superexpressão de determinados receptores é associada com miotps tipos de câncer. Um ligante capaz de ligação a um marcador tumoral pode ser conjugado à superfície da presente nanopartícula, de modo que a nanopartícula pode ter por alvo especificamente a célula tumoral.

[00142] Um ligante pode ser anexado à presente nanopartícula diretamente ou através de um encadeador. A fixação do ligante à nanopartícula pode ser realizada por uma ligação covalente ou ligação não covalente, tal como por ligação iônica, ligação de hidrogênio, ligação hi- drofóbica, coordenação, adesivo, e absorção física. O ligante pode ser revestido sobre a superfície da nanopartícula. O ligante pode ser embebido na superfície da nanopartícula. O ligante pode ser anexado à superfície da nanopartícula fluorescente, ou pode ser anexado ao núcleo quando a concha é porosa ou está cobrindo uma porção do núcleo. Quando o ligante é anexado à nanopartícula através de um en-cadeador, o encadeador pode ser quaisquer moléculas adequadas, tais como um PEG funcionalizado. Os PEGs podem ter múltiplos grupamentos funcionais para fixação à nanopartícula e ligantes. A partícu- la pode ter diferentes tipos de PEGs funcionalizados carregando diferentes grupamentos funcionais que podem ser anexados a múltiplos ligantes. Isto pode reforçar os efeitos de multivalência e/ou contraste no sítio alvo, os quais permitem o desenho e a otimização de uma plataforma multimodal complexa com detecção direcionada, tratamento, e detecção in vivo aprimorados.

[00143] Uma variedade de diferentes ligantes podem ser anexados à nanopartícula. Por exemplo, o tripeptídeo Arg-Gly-Asp (RGD) pode ser anexado à nanopartícula. Alternativamente, o peptídeo cíclico cRGD (o qual pode conter outro ou outros aminoácidos, por exemplo, cRGDY) pode ser anexado à nanopartícula. Qualquer peptídeo linear, cíclico ou ramificado contendo a sequência RGD está dentro do âmbito da presente invenção. RGD liga a αvβ3 integrina, a qual é superex- pressada na superfície de células endoteliais ativadas durante a an- giogênese e em vários tipos de células tumorais. Foi demonstrado que os níveis de expressão de αvβ3 integrina se correlacionam bem com a agressividade dos tumores. Ruoslahti et al. New perspectives in cell adhesion: RGD and integrins. Science 1987; 238:491. Gladson et al. Glioblastoma expression of vitronectin and alpha v beta 3 integrin. Adhesion mechanism for transformed glial cells. J. Clin. Invest. 1991; 88:1924-1932. Seftor et al. Role of the alpha v beta 3 integrin in human melanoma cell invasion. Proc. Natl. Acad. Sci. 1992; 89:1557-1561.

[00144] O peptídeo sintético EPPT1 pode ser o ligante anexado à nanopartícula. EPPT1, derivada a partir do sítio de ligação de anticorpos monoclonais (ASM2), tem por alvo MUC1 sub-glicosilado (uMUC1). MUC1, um receptor transmembrana, é fortemente glicosila- do em tecidos normais; no entanto, é superexpressado e aberrantemente sub0glicosilado em quase todos os adenocarcinomas de células epiteliais humanas, e está implicado na patogênese tumoral. Moore et al. In vivo targeting of underglycosilated MUC-1 tumor antigen using a multimodal imaging probe. Cancer Res. 2004; 64:1821-7. Patel et al. MUC1 plays a role in tumor maintenance in aggressive thyroid carcinomas. Surgery. 2005; 138:994-1001. Anticorpos específicos incluindo anticorpos monoclonais contra uMUC1 podem ser alternativamente conjugados à nanopartícula de modo a ter por alvo uMUC1.

[00145] Em uma modalidade, análogos peptídicos de hormônio estimulante de α-melanotropina (α-MSH) são os ligantes anexados à nanopartícula. Análogos peptídicos de α-MSH são capazes de ligação aos receptores de melanocortina-1 (MC1R), uma família de receptores acoplados à proteína G superexpressados em células de melanoma. Loir et al. Cell Mol. Biol. (Noisy-le-grand) 1999, 45:1083-1092.

[00146] Em outra modalidade, octreotato, um análogo peptídico de somatostatina de 14 aminoácidos, é o ligante anexado à nanopartícula. Octreotida, a qual tem uma meia vida mais longa do que a somatostatina, é capaz de ligação ao receptor de somatostatina (SSTR). SSTR, um membro da família de receptores acoplados a proteína G, é superexpressado sobre a superfície de vários tumores humanos. Reu- bi et al. Distribution of Somatostatin Receptors in Normal and TumorTissue. Metab. Clin. Exp. 1990; 39:78-81. Reubi et al. Somatostatin receptors and their subtypes in human tumors and in peritumoral vessels. Metab. Clin. Exp. 1996; 45:39-41. Outros análogos da somatostatina podem ser alternativamente conjugados à nanopartícula para ter por alvo SSTR, tal como Tyr3-octreotida (Y3-OC), octreotato (TATE), Tyr3-octreotato (Y3-TATE), e 111In-DTPA-OC. Estes análogos da somatostatina podem ser utilizados tanto para PET diagnostic imagiologia quanto para radioterapia direcionada do câncer. de Jong et al. In-ternalization of radiolabelled [DTPA0]octreotide e [DOTA0, Tyr3]octreotide: peptides for somatostatin receptor targeted scintigraphy and radionuclide therapy. Nucl. Med. Commun. 1998; 19:283-8. de Jong et al. Comparison of ^In-Labeled Somatostatin Analogues for Tumor Scintigraphy and Radionuclide Therapy. Cancer Res. 1998; 58:437-41. Lewis et al. Comparison of four 64Cu-labeled somatostatin analogues in vitro and in a tumor bearing rat model: evaluation of new derivatives for PET imaging and targeted radiotherapy. J Med Chem 1999; 42:1341-7. Krenning et al. Somatostatin Receptor Scintigraphy with Indium-111-DTPA-D-Phe-1-Octreotide in Man: Metabolism, Dosimetry and Comparison with Iodine-123-Tyr-3-Octreotide. J Nucl. Med. 1992; 33:652-8.

[00147] Vários ligantes podem ser usados para mapear linfonodos sentinela (SLNs). O mapeamento de linfonodos sentinela pode ser usado no diagnóstico, no estagiamento e no tratamento do câncer. J591 é um anticorpo monoclonal antiantígeno de membrana específico da próstata (isto é, anti-PSMA). J591 foi usado previamente para detectar e estagiar o câncer de próstata. Tagawa et al., Anti-prostatespecific membrane antigen-based radioimmunotherapy for prostate cancer, Cancer, 2010, 116(4 Suppl):1075-83. Bander et al., Targeting Metastatic Prostate Cancer with Radiolabeled Monoclonal Antibody J591 to the Extracellular Domain of Prostate Specific Membrane Antigen, The Journal of Urology 170(5), 1717-1721 (2003). Wernicke et al., (2011) Prostate-Specific Membrane Antigen as a Potential Novel Vascular Target for Treatment of Glioblastoma Multiforme, Arch Pathol Lab Med. 2011; 135:1486-1489. O fragmento F(ab')2 de J591 pode ser usado como uma ligante anexado à presente nanopartícula. A nanopartícula também pode ser radiomarcada para criar uma sonda de dupla-modalidade. Em uma modalidade, nanopartículas carregando o fragmento F(ab')2 de J591 (por exemplo, fragmentos HuJ591-F(ab')2, ou fragmentos J591-F(ab')2 humanizados) são usadas no diagnósico do câncer de próstata ou do câncer endometrial (por exemplo, adenocarcinoma endometrióide endometrial). Em outra modalidade, nanopartículas carregando o fragmento F(ab')2 de J591 podem ser usadas para ter por alvo a neovasculatura de tumor cerebral para tratamento, monitoramento da progressão da doença. Foi visto que a neovasculatura de tumor cerebral superexpressa PSMA, conforme mostrado a partir de avaliações imunohistoquímica anteriores de amostras de glioma de alto grau excisadas.

[00148] Peptídeos cíclicos contendo a sequência HWGF são potentes e seletivos inibidores de MMP-2 e MMP-9 mas não de vários outros membros da família de MMP. O peptídeo CTTHWGFTLC inibe a migração de células endoteliais humanas e de células tumorais. Além disso, previne o crescimento tumoral e a invasão em modelos animais e aumenta a sobrevida de camundongos carregando tumores humanos. Fago apresentando CTTHWGFTLC especificamente tem por alvo vasos sanguíneos angiogênicos in vivo. Este peptídeo e sua extensão GRENYGHCTTHWGFTLC ou GRENYGHCTTHWGFTLS podem ser usados como ligantes a serem anexados à presente nanopartícula. Os peptídeos também podem ser radiomarcados, por exemplo, radioiodados. Koivunen et al., Tumor targeting with a selective gelatinase inhibitor, Nature Biotechnology 17, 768-774 (1999). Penate Medina et al., Liposomal tumor targeting in drug delivery utilizing MMP-2- and MMP- 9-binding ligands, J. Drug Delivery, Volume 2011 (2011), Article ID 160515. Anticancer Research 21:4101-4106 (2005). Em uma modalidade, nanopartículas anexadas a inibidor do peptídeo da metaloprotei- nase da matriz (MMPI) marcado com 124I são usados para mapeamento de linfonodos sentinela para estagiar câncer endometrioide.

[00149] O número de ligantes anexados à nanopartícula pode variar a partir de cerca de 1 até cerca de 30, a partir de cerca de 1 até cerca de 20, a partir de cerca de 2 até cerca de 15, a partir de cerca de 3 até cerca de 10, a partir de cerca de 1 até cerca de 10, ou a partir de cerca de 1 até cerca de 6. O pequeno número dos ligantes anexados à nanopartícula ajuda a manter o diâmetro hidrodinâmico da presente na- nopartícula o qual satisfaz a faixa de tamanho de corte do clearance renal. Hilderbrand et al., Near-infrared fluorescence: application to in vivo molecular imaging, Curr. Opin. Chem. Biol., 14:71-9, 2010. O número de ligantes medido pode ser um número médio de ligantes anexados a mais de uma nanopartícula. Alternativamente, pode ser medida uma nanopartícula para determinar o número de ligantes anexados. O número de ligantes anexados à nanopartícula pode ser medido por quaisquer métodos adequados, os quais podem ou não ser relacionados com as propriedades dos ligantes. Por exemplo, o número de pep- tídeos cRGD ligados à partícula pode ser estimado usando medições à base de FCS das concentrações absolutas de partícula e a concentração inicial dos reagentes para o peptídeo cRGD. O número médio de peptídeos RGD por nanopartícula e a eficiência de ligação de RGD a grupamentos de PEG funcionalizados podem ser avaliados colorime- tricamente sob condições alcalinas e métodos espectrofotométricos de Biuret. O número de ligantes anexados à nanopartícula também pode ser medido por outros métodos adequados.

Agente de Contraste

[00150] Um agente de contraste pode ser anexado à presente nanopartícula para imagiologia médica ou biologica. Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "agente de contraste" se refere a uma substância, uma molécula ou um composto usado para reforçar a visibilidade de estruturas ou fluidos em imagiologia médica ou biológica. O termo "agente de contraste" também se refere a uma molécula produtora de contraste. As técnicas de imagiologia englobadas pela presente invenção incluem tomografia de emissão de pósi- trons (PET), tomografia computadorizada de emissão de fóton único (SPECT), tomografia computadorizada (CT), imagiologia por ressonância magnética (MRI), imagiologia por bioluminescência ótica, ima-giologia por fluorescência ótica, e combinações das mesmas. O agen te de contraste englobado pela presente invenção pode ser qualquer molécula, substância ou composto conhecido na arte para PET, SPECT, CT, MRI, e imagiologia ótica. O agente de contraste pode ser radionuclídeos, radiometais, emissores de pósitrons, emissores de raios beta, emissores de raios gama, emissores de raios alfa, íons de metais paramagnéticos, e íons de metais supraparamagnéticos. Os agentes de contraste incluem, mas não estão limitados a, iodo, flúor, cobre, zircônio, lutécio, astatina, ítrio, gálio, índio, tecnécio, gadolínio, disprsió, ferro, manganês, bário e sulfato de bário. Os radionuclídeos que podem ser usados como o agente de contraste anexado à nanopartícula da presente invenção incluem, mas não estão limitados a 89Zr, 64Cu,68Ga, 86Y, 124I e 177Lu.

[00151] O agente de contraste pode ser conjugado diretamente à nanopartícula. Alternativamente, o agente de contraste pode ser conjugado indiretamente à nanopartícula, por fixação a encadeadores ou quelatos. O quelato pode ser adaptado para ligar um radionuclídeo. Os quelatos que podem ser anexados à presente nanopartícula pode incluir, mas não estão limitados a, ácido 1,4,7,10-tetraazaciclododecano- 1,4,7,10-tetraacético (DOTA), ácido dietilenotriaminapentaacético (DTPA), desferrioxamina (DFO) e trietilenotetramina (TETA).

[00152] Meios adequados para imagiologia, detecção, registro ou medição das presentes nanopartículas também podem incluir, por exemplo, um citômetro de fluxo, um citômetro de varredura a laser, uma leitora de micro-placas de fluorescência, um microscópio de fluorescência, um microscópio confocal, um microscópio de campo brilhante, um sistema de varredura de alto teor, e dispositivos semelhantes. Mais de uma técnica de imagiologia podem ser usadas ao mesz- mo tempo ou consecutivamente para detectar as presentes nanopartículas. Em uma modalidade, imagiologia ótica é usada como uma fer-ramenta de triagem de alta produtividade sensível de modo a adquirir múltiplos pontos do tempo no mesmo sujeito, permitindo avaliações semi-quantitativas dos níveis dos marcadores tumorais. Isto compensa a resolução temporal relativamente reduzida obtida com PET, embora PET seja necessário para obter penetração em profundidade adequada de modo a adquirir dados volumétricos, e para detectar, quantificar, e monitorar alterações nos níveis de receptores e/ou outros marcadores celulares como um meio de avaliação da progressão ou da melhora da doença, bem como de estratificação dos pacientes para protocolos de tratamento adequados.

Agente Terapêutico

[00153] Um agente terapêutico pode ser anexado à nanopartícula fluorescente, por exemplo, para tratamento direcionado de uma doença. O agente terapêutico pode ser liberado para um sítio doente em uma maneira altamente específica ou localizada com libieração do agente terapêutico no sítio da doença. Alternativamente, o agente terapêutico pode não ser liberado. A nanopartícula fluorescente conjugada com o ligante pode ser usada para liberação direcionada de um agente terapêutico em uma localização desejada em uma variedade de sistemas, tal como sobre, ou dentro de, uma célula ou um componente celular, dentro do corpo de um organismo, tal como um ser humano, ou através da barreira hematoencefálica.

[00154] O agente terapêutico pode ser anexado à nanopartícula diretamente ou indiretamente. O agente terapêutico pode ser absorvido dentro dos interstícios ou poros da concha de sílica, ou revesti8do sobre a concha de sílica da nanopartícula fluorescente. Em outras modalidades onde a concha de sílica não está cobrindo toda a superfície, o agente terapêutico pode ser associado com o núcleo fluorescente, tal como por absorção física ou por interação de ligação. O agente terapêutico pode ser associado com o ligante que é anexado à nanopartícula fluorescente. O agente terapêutico também pode ser associado com o polímero orgânico ou com o agente de contraste. Por exemplo, o agente terapêutico pode ser anexado à nanopartícula através de PEG. Os PEGs podem ter múltiplos grupamentos funcionais para fixação à nanopartícula e ao agente terapêutico. A partícula pode ter diferentes tipos de PEGs funcionalizados carregando diferentes grupamentos funcionais que podem ser anexados a múltiplos agentes terapêuticos. O agente terapêutico pode ser anexado à nanopartícula de modo covalente ou de modo não covalente.

[00155] Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "agente terapêutico" se refere a uma substância que pode ser usada no diagnóstico, na cura, na mitigação, no tratamento, ou na prevenção de doença em um ser humano ou outro animal. Os agentes terapêuticos referidos incluem substâncias reconhecidas na Farmaco- péia dos Estados Unidos oficial (United States Pharmacopeia), na Farmacopéia Homeopática dos Estados Unidos oficial (Homeopathic Pharmacopeia of the United States), no Formulário Nacional oficial dos Estados Unidos (National Formulary), ou qualquer suplemento das mesmas.

[00156] Agentes terapêuticos que podem ser incorporados com as nanopartículas fluorescentes ou com as nanopartículas fluorescentes ligadas da invenção incluem nucleosídeos, análogos de nucleosídeos, RNA interferente pequeno (siRNA), microRNA, oligopeptídeos, poli- peptídeos, anticorpos, inibidores de COX-2, promotores de apoptose, agentes para o trato urinário, agentes vaginais, agentes neurodegene- rativos vasodilatadores (por exemplo, doença de Parkinson), agentes para obesidade, agentes oftálmicos, agentes para osteoporose, para- simpatolíticos, para-simpatomiméticos, antianestésicos, prostaglandi- nas, agentes psicoterápicos, agentes respiratórios, sedativos, hipnóticos, agentes para a pele e as membranas mucosas, antibacterianos, antifúngicos, antineoplásicos, agentes cardioprotetores, agentes cardi- ovasculares, antitrombóticos, estimulantes do sistema nervoso central, inibidores da colinesterase, contraceptivos, agonistas de receptores da dopamina, agentes para disfunção erétil, agentes de fertilidade, agentes gastrointestinais, agentes para gota, hormônios, imunomodulado- res, analgésicos convenientemente funcionalizados ou anestésicos gerais ou locais, anticonvulsivantes, agentes antidiabéticos, agentes antifibróticos, anti-infecciosos, agentes contra cinetose, relaxantes musculares, agentes imunossupressores, agentes contra enxaqueca, fármacos anti-inflamatórios não esteroidais (NSAIDs), agentes para parar de fumar, ou simpatolíticos (vide Physicians' Desk Reference, 55th ed., 2001, Medical Economics Company, Inc., Montvale, N.J., pages 201-202).

[00157] Agentes terapêuticos que podem ser anexados à presente nanopartícula incluem, mas não estão limitados a, agentes de alquila- ção de DNA, inibidores da topoisomerase, agentes de indução de stress retículo endoplasmático, um composto de platina, um antimeta- bólito, vincalcalóides, taxanos, epotilones, inibidores enzimáticos, antagonistas de receptores, anticorpos terapêuticos, inibidores da tirosina quinase, radiossensibiolizadores de boro (isto é, velcade), e terapias de combinações quimioterápicas.

[00158] Exemplos não limitantes de agentes de alquilação de DNA são mostardas de nitrogênio, tais como Mecloretamina, Ciclofosfamida (Ifosfamida, Trofosfamida), Clorambucila (Melfalano, Prednimustina), Bendamustina, Uramustina e Estramustina; nitrosouréias, tais como Carmustina (BCNU), Lomustina (Semustina), Fotemustina, Nimustina, Ranimustina e Estreptozocina; sulfonatos de alquila, tais como Busul- fan (Manossulfan, Treossulfan); Aziridinas, tais como Carboquona, ThioTEPA, Triaziquona, Trietilenomelamina; Hidrazinas (Procarbazi- na); Triazenos tais como Dacarbazina e Temozolomida; Altretamina e Mitobronitol.

[00159] Exemplos não limitantes de inibidores da Topoisomerase I incluem derivados de Campotecina incluindo CPT-11 (irinotecano), SN-38, APC, NPC, campotecina, topotecano, mesilato de exatecano, 9-nitrocamptotecina, 9-aminocamptotecina, lurtotecano, rubitecano, silatecano, gimatecano, diflomotecano, extatecano, BN-80927, DX- 8951f, e MAG-CPT conforme decrito em Pommier Y. (2006) Nat. Rev. Cancer 6(10):789-802 e na Publicação de Patente dos Estados Unidos No. 2005/10250854; alcaloides de Protoberberina e derivados dos mesmos incluindo berberrubina e coralina conforme descrito em Li et al. (2000) Biochemistry 39(24):7107-7116 e Gatto et al. (1996) Cancer Res. 15(12):2795-2800; derivados de ffenantrolina incluindo Ben- zo[i]fenantridina, Nitidina, e fagaronina conforme descrito em Makhey et al. (2003) Bioorg. Med. Chem. 11 (8): 1809-1820; Terbenzimidazol e derivados do mesmo conforme descrito em Xu (1998) Biochemistry 37(10):3558-3566; e derivados de Antraciclina incluindo Doxorrubicina, Daunorrubicina, e Mitoxantrone conforme descrito em Foglesong et al. (1992) Cancer Chemother. Pharmacol. 30(2):123-]25, Crow et al. (1994) J. Med. Chem. 37(19):31913194, e Crespi et al. (1986) Bio- chem. Biophys. Res. Commun. 136(2):521-8. Inibidores da Topoisomerase II incluem, mas não estão limitados a Etoposídeo e Teniposí- deo. Duplo inibidores das topoisomerases I e II incluem, mas não estão limitados a, Saintopin e outras Naftecenodionas, DACA e outras Acridina-4-Carboxamindas, Intoplicina e outros Benzopiridoindóis, TAS-I03 e outros 7H-indeno[2,1-c]Quinolina-7-onas, Pirazoloacridina, XR 11576 e outros Benzofenazinas, XR 5944 e outros compostos Di- méricos, 7-oxo-7H-dibenz[f,ij]Isoquinolinas e 7-oxo-7H- benzo[e]Perimidinas, e Conjugados de Antracenil-aminoácidos conforme descrito em Denny e Baguley (2003) Curr. Top. Med. Chem. 3(3):339-353. Alguns agentes apresentam Topoisomerase II e têm atividade de intercalação de DNA tais como, mas não limitados a, Antra- ciclinas (Aclarrubicina, Daunorrubicin, Doxorrubicina, Epirrubicina, Idarrubicina, Anrubicina, Pirarrubicina, Valrubicina, Zorrubicina) e An- tracenedionas (Mitoxantrone e Pixantrone).

[00160] Exemplos de agentes de indução de stress retículo endo- plasmático incluem, mas não estão limitados a, dimetil-celecoxib (DMC), nelfinavir, celecoxib, e radiossensibiolizadores de boro (isto é, velcade (Bortezomib)).

[00161] Exemplos não limitantes de composto à base de platina incluem Carboplatina, Cisplatina, Nedaplatina, Oxaliplatina, tetranitrato de Triplatina, Satraplatina, Aroplatina, Lobaplatina, e JM-216. (vide McKeage et al. (1997) J. Clin. Oncol. 201:1232-1237 e em geral, CHEMOTHERAPY FOR GYNECOLOGICAL NEOPLASM, CURRENT THERAPY AND NOVEL APPROACHES, na Series Basic and Clinical Oncology, Angioli et al. Eds., 2004).

[00162] Exemplos não limitantes de agentes antimetabólitos incluem inibidores à base de ácido fólico, isto é, inibidores da dihidrofolato redutase, tais como Aminopterina, Metotrexato e Pemetrexed; inibidores da timidilato sintase, tais como Raltitrexed, Pemetrexed; inibidor à base de Purina, isto é, um inibidor de adenosina desaminase, tal como Pentostatina, uma tiopurina, tal como Tioguanina e Mercaptopurina, um inibidor de ribonucleotídeo redutase / halogenado, tal como Cladri- bina, Clofarabina, Fludarabina, ou uma guanina / guanosina: tiopurina, tal como Tioguanina; ou à base de Pirimidina, isto é, citosina / citidina: agente hipometilante, tal como Azacitidina e Decitabina, um inibidor de DNA polimerase, tal como Citarabina, um inibidor da ribonucleotídeo redutase, tal como Gencitabina, ou uma timina / timidina: inibidor da timidilato sintase, tal como uma Fluorouracila (5-FU). Equivalentes a 5- FU incluem pró-drogas, análogos e derivado dos mesmos tais como 5'- desoxi-5-fluorouridina (doxifluroidina), 1-tetraidrofuranil-5-fluorouracila (ftorafur), Capecitabina (Xeloda), S-I (MBMS-247616, consistindo de tegafur e dois moduladores, uma 5-cloro-2,4-diidroxipiridina e oxonato de potássio), ralititrexed (tomudex), nolatrexed (Thymitaq, AG337), LY231514 e ZD9331, conforme descrito, por exemplo, em Papami- cheal (1999) The Oncologist 4:478-487.

[00163] Exemplos de vincalcaloides, incluem, mas não estão limitados a Vinblastina, Vincristina, Vinflunina, Vindesina e Vinorelbina.

[00164] Exemplos de taxanos incluem, mas não estão limitados a docetaxel, Larotaxel, Ortataxel, Paclitaxel e Tesetaxel. Um exemplo de um epotilone é iabepilone.

[00165] Exemplos de inibidores enzimáticos incluem, mas não estão limitados a inibidores da farnesiltransferase (Tipifamib); inibidor de CDK (Alvocidib, Seliciclib); inibidor do proteassoma (Bortezomib); inibidor de fosfodiesterase (Anagrelide; rolipram); inibidor de IMP desi- drogenase (Tiazofurine); e inibidor de lipoxigenase (Masoprocol). Exemplos de antagonistas de receptores incluem, mas não estão limitados a ERA (Atrasentan); receptor de retinóide X (Bexarotene); e um esteróide sexual (Testolactone).

[00166] Exemplos de anticorpos terapêuticos incluem, mas não estão limitados a anti-HER1/EGFR (Cetuximab, Panitumumab); receptor Anti-HER2/neu (erbB2) (Trastuzumab); Anti-EpCAM (Catumaxomab, Edrecolomab) Anti-VEGF-A (Bevacizumab); Anti-CD20 (Rituximab, Tositumomab, Ibritumomab); Anti-CD52 (Alemtuzumab); e Anti-CD33 (Gemtuzumab). Patentes dos Estados Unidos Nos. 5.776.427 e 7.601.355.

[00167] Exemplos de inibidores da tirosina quinase incluem, mas não estão limitados a inibidores a ErbB: HER1/EGFR (Erlotinib, Gefiti- nib, Lapatinib, Vandetanib, Sunitinib, Neratinib); HER2/neu (Lapatinib, Neratinib); RTK classe III: C-kit (Axitinib, Sunitinib, Sorafenib), FLT3 (Lestaurtinib), PDGFR (Axitinib, Sunitinib, Sorafenib); e VEGFR (Vandetanib, Semaxanib, Cediranib, Axitinib, Sorafenib); bcr-abl (Imatinib, Nilotinib, Dasatinib); Src (Bosutinib) e Janus quinase 2 (Lestaurtinib).

[00168] Agentes quimioterápicos que podem ser anexados à presente nanopartícula também podem incluir ansacrina, Trabectedin, re- tinóides (Alitretinoína, Tretinoína), trióxido arsênico, deplessor de as- paragina Asparaginase/Pegaspargase), Celecoxib, Demecolcine, Elesclomol, Elsamitrucin, Etoglucid, Lonidamina, Lucantone, Mitogua- zone, Mitotane, Oblimersen, Tensirolimo, e Vorinostato.

[00169] Exemplos de agentes terapêuticos específicos que podem ser encadeados, ligados, ou associados com as nanopartículas fluorescentes da invenção são flomoxef; fortimicina(s); gentamicina(s); gli- cossulfona solassulfona; gramicidina S; gramicidina(s); grepafloxacina; guameciclina; hetacilina; isepamicina; josamicina; canamicina(s); flomoxef; fortimicina(s); gentamicin(s); glicossulfona solassulfona; gramicidina S; gramicidina(s); grepafloxacin; guameciclina; hetacilina; isepamicina; josamicina; canamicina(s); bacitracin; bambermicina(s); bia- penem; brodimoprim; butirosin; capreomicina; carbenicilina; carbomici- na; carumonam; cefadroxil; cefamandol; cefatrizina; cefbuperazona; cefclidin; cefdinir; cefditoren; cefepime; cefetamet; cefixime; cefineno- xime; cefininox; cladribina; apalcilin; apiciclina; apramicina; arbecacin; aspoxicilina; azidanfenicol; aztreonam; cefodizime; cefonicid; cefope- razone; ceforamida; cefotaxime; cefotetan; cefotiam; cefozopran; cefpimizol; cefpiramida; cefpirome; cefprozil; cefroxadina; cefteram; ceftibuten; cefuzonam; cefalexin; cefaloglicin; cefalosporina C; cefradi- ne; cloranfenicol; clortetraciclina; clinafloxacina; clindamicina; clomoci- clina; colistin; ciclacilin; dapsone; demeclociclina; diatimossulfona; di- becacin; diidroestreptomicina; 6-mercaptopurina; tioguanina; capecita- bina; docetaxel; etoposídeo; gencitabina; topotecan; vinorelbina; vin- cristina; vinblastina; teniposídeo; melfalano; metotrexato; 2-p- sulfanilianilinoethanol; 4,4'-sulfinildianilina; ácido 4- sulfanilamidosalicílico; butorfanol; nalbufina. estreptozocina; doxorrubi- cina; daunorrubicina; plicamicina; idarrubicina; mitomicina C; pentosta- tina; mitoxantrone; citarabina; fosfato de fludarabina; butorfanol; nalbu- fina. estreptozocina; doxorrubicina; daunorrubicina; plicamicina; idarrubicina; mitomicina C; pentostatina; mitoxantrone; citarabina; fosfato de fludarabina; acediassulfona; acetossulfona; amicacina; anfotericina B; ampicilina; atorvastatina; enalapril; ranitidina; ciprofloxacina; pravasta- tina; claritromicina; ciclosporina; famotidina; leuprolida; aciclovir; paclitaxel; azitromicina; lamivudina; budesonida; albuterol; indinavir; met- formina; alendronato; nizatidina; zidovudina; carboplatina; metoprolol; amoxicilina; diclofenac; lisinopril; ceftriaxona; captopril; salmeterol; xinafoato; imipenem; cilastatina; benazepril; cefaclor; ceftazidima; morfina; dopamina; bialamicol; fluvastatina; fenamidina; 2-etilhidrazina de ácido podofilínico; acriflavina; cloroazodina; arsfenamina; amicarbilida; aminoquinurida; quinapril; oximorfona; buprenorfina; floxuridina; diri- tromicina; doxiciclina; enoxacina; enviomicina; epicilina; eritromicina; leucomicina(s); lincomicina; lomefloxacina; lucensomicina; limeciclina; meclociclina; meropenem; metaciclina; micronomicina; midecamici- na(s); minociclina; moxalactam; mupirocina; nadifloxacina; natamicina; neomicina; netilmicina; norfloxacina; oleandomicina; oxitetraciclina; p- sulfanililbenzilamina; panipenem; paromomicina; pazufloxacina; penicilina N; pipaciclina; ácido pipemídico; polimixina; primicina; quinacilina; ribostamicina; rifamida; rifampina; rifamicina SV; rifapentina; rifaximina; ristocetina; ritipenem; rocitamicina; rolitetraciclina; rosaramicina; roxi- tromicina; salazosulfadimidina; sanciclina; sisomicina; esparfloxacina; espectinomicina; espiramicina; estreptomicina; succissulfona; sulfacri- soidina; ácido sulfalóxico; sulfamidocrisoidina; ácido sulfanílico; sulfoxona; teicoplanina; temafloxacina; temocilina; tetroxoprim; tianfenicol; tiazolsulfona; tiostreptona; ticarcilina; tigemonam; tobramicina; tosu- floxacina; trimetoprim; trospectomicina; trovafloxacina; tuberactinomi- cina; vancomicina; azaserina; candicidina(s); clorfenesina; dermostati- na(s); filipina; fungicromina; mepartricina; nistatina; oligomicina(s); pe- rimicina A; tubercidina; 6-azauridina; 6-diazo-5-oxo-L-norleucina; acla- cinomicina(s); ancitabina; antramicina; azacitadina; azaserina; bleomi- cina(s); biscumacetato de etila; etilideno dicumarol; iloprost; lamifiban; taprostene; tioclomarol; tirofiban; amiprilose; bucillamina; gusperimo; ácido gentísico; glucametacina; glicol salicilato; ácido meclofenâmico; ácido mefenâmico; mesalamina; ácido niflúmico; olsalazina; oxaceprol; S-enosilmetionina; ácido salicílico; salsalato; sulfasalazina; ácido tolfe- nâmico; carubicina; carzinofillin A; clorozotocina; cromomicina(s); de- nopterina; doxifluridina; edatrexato; eflornitina; eliptínio; enocitabina; epirubicina; manomustina; menogaril; mitobronitol; mitolactol; mopida- mol; ácido micofenólico; nogalamicina; olivomicina(s); peplomicina; pi- rarubicina; piritrexim; prednimustina; procarbazina; pteropterina; puro- micina; ranimustina; estreptonigrina; tiamiprina; ácido micofenólico; procodazol; romurtida; sirolimo (rapamicina); tacrolimo; butetamina; fenalcomina; hidroxitetracaina; naepaina; ortocaina; piridocaina; álcool salicílico; ácido 3-amino-4-hidroxibutírico; aceclofenaco; alminoprofen; anfenac; bronfenac; bromosaligenina; bumadizon; carprofen; diclofenac; diflunisal; ditazol; ácido enfenâmico; etodolac; etofenamato; fen- dosal; fepradinol; ácido flufenâmico; Tomudex® (ácido N-[[5-[[(1,4- diidro-2-metil-4-oxo-6-quin-azolinil)metil]metilamino]-- 2-tienil]carbonil]- L-glutâmico), trimetrexato, tubercidina, ubenimex, vindesina, zorubici- na; argatroban; cumetarol ou dicumarol.

[00170] Listas de agentes terapêuticos adicionais podem ser encontradas, por exemplo, em: Physicians' Desk Reference, 55th ed., 2001, Medical Economics Company, Inc., Montvale, N.J.; USPN Dictionary of USAN and International Drug Names, 2000, The United States Phar- macopeial Convention, Inc., Rockville, Md.; e The Merck Index, 12th ed., 1996, Merck & Co., Inc., Whitehouse Station, N.J.

[00171] O agente terapêutico também pode incluir radionuclídeos quando a presente nanopartícula é usada em radioterapia direcionada. Em uma modalidade, radionuclídeos beta-emissores de baixa energia, tais como constructos quelados-177Lu, são associados com a nanopartícula e usados para tratar cargas tumorais relativamente pequenas ou doença micrometastática. Em outra modalidade, beta emissores de maior energia, tais como ítrio-90 (90Y), podem ser usados para tratar maiores cargas tumorais. Iodo-131 (131I) também pode ser usado para radioterapia.

[00172] A superfície da nanopartícula pode ser modificada para incorporar no mínimo um grupamento funcional. O polímero orgânico (por exemplo, PEG) anexado à nanopartícula pode ser modificado para incorporar no mínimo um grupamento funcional. Por exemplo, o grupamento funcional pode ser uma maleimida ou um éster de N- Hidroxissuccinimida (NHS). A incorporação do grupamento funcional torna possível anexar vários ligantes, agentes de contraste e/ou agentes terapêuticos à nanopartícula.

[00173] Em uma modalidade, um agente terapêutico é anexado à nanopartícula (à superfície ou ao revestimento de polímero orgânico) através de um grupamento funcional de éster de NHS. Por exemplo, um inibidor de tirosina quinase tal como dasatinib (BMS) ou um agente quimioterápico (por exemplo, taxol), pode ser acoplado através de uma ligação de éster à nanopartícula. Esta ligação de éster pode ser então clivada em um ambiente acidífero ou enzimaticamente in vivo. Esta abordagem pode ser usada para liberar uma pró-droga a um sujeito onde o fármaco é liberado da partícula in vivo.

[00174] Nós testamos a abordagem de pró-droga por acoplação do inibidor de molécula pequena dasatinib com as moléculas de PEG da nanopartícula. Com base nos resultados da biodistribuição e nos cálculos de dosagem do fármaco em humanos, foi visto que a nanopartícula tem propriedades biológicas únicas, incluindo clearance relativa mente rápido do sangue comparada com tumores e subsequente acumulação do agente terapêutico no tecido tumoral, o que sugere que uma abordagem de pró-droga é viável. A nanopartícula funcionali- zada permite que os fármacos sejam dosados múltiplas vezes, assegurando que concentração de fármaco no tumor é maior do que a especificada pela IC-50 em tecido tumoral, embora não venha a ser limi- tante da dose para órgãos de outros tecidos, tais como o coração, o fígado ou os rins. O agente terapêutico e a nanopartícula podem ser radiomarcados ou marcados oticamente separadamente, permitindo monitoramento independente do agente terapêutico e da nanopartícula. Em uma modalidade, dasatinib radiofluorado (isto é, 18F) é acoplado com porções de PEG-3400 anexadas à nanopartícula através de ligações éster NHS. Radioflúor é crucial para ser capaz de monitorar de modo independente alterações dependentes do tempo na distribuição e na liberação do fármaco a partir da nanopartícula fluorescente (Cy5) radioiodada (124I). Deste modo, nós podemos monitorar separadamente a pró-droga (dasatinib) e a nanopartícula. Isto permite otimização do design da pró-droga comparado com métodos na arte anterior onde não é usada abordagem de dupla-marcação. Em outra modalidade, moléculas de iodo radioterapêutico (isto é, I-131), ou outros emissores de raios gama ou alfa terapêuticos, são conjugadas com PEG através de um grupamento funcional de maleimida, onde o agente terapêutico pode não dissociar do PEG in vivo.

[00175] Uma abordagem generalizável referida aqui, neste requerimento de patente, como "química de click" é descrita abaixo. De modo à presente nanopartícula acomodar prontamente grandes faixas de ligantes, agentes de contraste ou quelatos, a superfície da nanopartícula pode ser modificada para incorporar um grupamento funcional. A nanopartícula também pode ser modificada com polímeros orgânicos (por exemplo, PEGs) ou quelatos que podem incorporar um grupa mento funcional. Entretanto, o ligante, o agente de contraste, ou o agente terapêutico é modificado para incorporar um grupamento funcional que é capaz de reagir com o grupamento funcional sobre a nanopartícula, ou sobre os PEGs ou os agentes quelantes anexados à nanopartícula sob condições adequadas. Por conseguinte, qualquer ligante, agente de contraste ou agente terapêutico que tem o grupamento funcional reativo é capaz de ser prontamente conjugado à nanopartícula. Esta abordagem generalizável é referida aqui, neste requerimento de patente, como "química de click", a qual vai permitir uma grande dose de versatilidade para explorar aplicações multimoda- lidades. Nas reações químicas de "química de click", dois componentes moleculares podem ser unidos através de uma reação seletiva, rápida, limpa, bioortogonal, e/ou biocompatível. Kolb et al., (2001) Click Chemistry: Diverse Chemical Function from a Few Good Reactions. Angewandte Chemie International Edition 40, 2004-2021. Lim et al., (2010) Bioorthogonal chemistry: recent progress and future directions. Chemical Communications 46, 1589-1600. Sletten et al., (2009) Bioorthogonal chemistry: fishing for selectivity in a sea of functionality. Angewandte Chemie International Edition 48, 6973-6998.

[00176] Qualquer mecanismo de reação adequado pode ser adaptado na presente invenção para "química de click", contanto que possa ser obtida fixação do ligante, do agente de contraste ou do quelato à nanopartícula de modo fácil e controlado. Em uma modalidade, uma ligação tripla livre é introduzida sobre PEG, o qual já está conjugado de modo covalente com a concha da nanopartícula. Nesse ínterim, uma ligação de azida é introduzida sobre o ligante desejado (ou agente de contraste, quelato). Quando a nanopartícula PEGuilada e o ligante (ou agente de contraste, quelato) são misturados na presença de um catalisador de cobre, vai ocorrer cicloadição de azida à ligação, resultando na conjugação do ligante com a nanopartícula. Um exemplo de química de click é a cicloadição de Huisgen entre uma azida e al- quina catalisada por Cu(I) [3+2]. Moses et al., (2007) The growing applications of click chemistry. Chemical Society Reviews 36, 1249-1262. Glaser et al., (2009) 'Click labelling' in PET radiochemistry. Journal of Labelled Compounds & Radiopharmaceuticals 52, 407-414. Mindt et al., (2009) A "Click Chemistry" Approach to the Efficient Synthesis of Multiple Imaging Probes derived from a Single Precursor. Bioconjugate Chemistry 20, 1940-1949. New et al., (2009) Growing applications of "click chemistry" for bioconjugation in contemporary biomedical research. Cancer Biotherapy and Radiopharmaceuticals 24, 289-301. Wang et al., (2010) Application of "Click Chemistry" in Synthesis of Ra-diopharmaceuticals. Progress in Chemistry 22, 1591-1602. Schultz et al., (2010) Synthesis of a DOTA-Biotin Conjugate for Radionuclide Chelation via Cu-Free Click Chemistry. Organic Letters 12, 2398-2401. Martin et al., (2010) A DOTA-peptide conjugate by copper-free click chemistry. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 20, 4805-4807. Lebedev et al., (2009) Clickable bifunctional radiometal chelates for peptide labeling. Chemical Communications 46, 1706-1708. Knor et al., (2007) Synthesis of novel 1,4,7,10-tetraazacyclodecane-1,4,7,10- tetraacetic acid (DOTA) derivatives for chemoselective attachment to unprotected polyfunctionalized compounds. Chemistry--a European Journal 13, 6082-6090. Em uma segunda modalidade, um grupamento funcional de maleimida e um grupamento tiol podem ser introduzidos sobre a nanopartícula e o ligante desejado (ou agente de contraste, quelato), com a nanopartícula tendo o grupamento funcional maleimida, o ligante (ou agente de contraste, quelato) tendo o grupamento tiol, ou vice versa. A ligação dupla de maleimida prontamente reage com o grupamento tiol para formar uma ligação de carbono e enxofre estável. Em uma terceira modalidade, um grupamento funcional de éster ativado, por exemplo, um grupamento de éster succinimidílico, e um gru- pamento de amina pode ser introduzido sobre a nanopartícula e o ligante, agente de contraste ou quelato desejado. O grupamento de éster ativado prontamente reage com o grupamento de amina para formar uma ligação de amida de carbono-nitrogênio estável. Em uma quarta modalidade, a química de click envolve a reação de Diels-Alder de demanda de elétrons inversa entre uma porção tetrazina e um al- queno deslocado (Figura 21c). Devaraj et al., (2009) Fast and Sensitive Pretargeted Labeling of Cancer Cells through a Tetrazine/trans- Cyclooctene Cycloaddition. Angewandte Chemie-International Edition 48, 7013-7016. Devaraj et al., (2008) Tetrazine-Based Cycloadditions: Application to Pretargeted Live Cell Imaging. Bioconjugate Chemistry 19, 2297-2299. Blackman et al., (2008) Tetrazine ligation: fast bioconjugation based on inverse electron demand Diels-Alder reactivity. Journal of the American Chemical Society 130, 13518-13519. A ligação pode ser seletiva, rápida, biocompatível, e/ou bioorhogonal. Diferentemente de muitas reações de Diels-Alder, a ligação é irreversível, formando alguns produtos de piridazina estáveis depois da liberação de dinitrogênio de retro-Diels-Alder pelo intermediário da reação. Uma porção tetrazina e um alqueno deslocado pode ser introduzida sobre a nanopartícula e o ligante desejado (ou agente de contraste, quelato), com a nanopartícula tendo a porção tetrazina, o ligante (ou agente de contraste, quelato) tendo o alqueno deslocado, ou vice versa. Uma série de diferentes pares de alqueno deslocado de tetrazinco podem ser usados para a reação, incluindo, por exemplo, a combinação de 3-(4- benzilamino)-1,2,4,5-tetrazina (Tz) e ou norborneno- ou trans- cicloocteno-dervados. Schoch et al., (2010) Post-Synthetic Modification of DNA by Inverse-Electron-Demand Diels-Alder Reaction. Journal of the American Chemical Society 132, 8846-8847. Devaraj et al., (2010) Bioorthogonal Turn-On Probes for Imaging Small Molecules Inside Living Cells. Angewandte Chemie International Edition 49. Haun et al., (2010) Bioorthogonal chemistry amplifies nanoparticle binding and enhances the sensibility of cell detection. Nature Nanotechnology 5, 660-665. Rossin et al., (2010) In vivo chemistry for pretargeted tumor imaging in live mice. Angewandte Chemie International Edition 49, 3375-3378. Li et al., (2010) Tetrazine-trans-cyclooctene ligation for the rapid construction of 18-F labeled probes. Chemical Communications 46, 8043-8045. Reiner et al., (2011) Synthesis and in vivo imaging of a 18F-labeled PARP1 inhibitor using a chemically orthogonal scavenger- assisted high-performance method. Angewandte Chemie International Edition 50, 1922-1925. Por exemplo, a superfície das nanopartículas pode ser decorada com porções de tetrazina, as quais podem em seguida ser conjugadas a ligante modificado com norborneno (ou agente de contraste, ou quelato) (Figuras 21d e 21e). Em um aspecto, as nanopartículas são revestidas com tetrazina, as quais pdoem ser então modificadas com os quelatos DOTA usando a ligação de tetrazina- norborneno, e radiomarcadas com 64Cu.

Duração da permanência / clearance in vivo

[00177] Depois da administração da presente nanopartícula a um sujeito, a meia-vida de permanência no sangue das nanopartículas podem variar a partir de cerca de 2 horas até cerca de 25 horas, a partir de cerca de 3 horas até cerca de 20 horas, a partir de cerca de 3 horas até cerca de 15 horas, a partir de cerca de 4 horas até cerca de 10 horas, ou a partir de cerca de 5 horas até cerca de 6 horas. Meia- vida de permanência no sangue mais longa significa circulação mais longa, a qual permite que mais nanopartículas se acumulem no sítio alvo in vivo. A meia-vida de permanência no sangue pode ser avaliada como se segue. As nanopartículas são primeiro administradas a um sujeito (por exemplo, um camundongo, um mini porco ou um ser humano). Em vários pontos do tempo depois da administração, são colhidas amostras de sangue para medir as concentrações de nanopartí- culas através de métodos adequados.

[00178] Em uma modalidade, depois da administração da nanopartícula PEGuilada (ou de controle) a um sujeito, a meia-vida de permanência no sangue da nanopartícula pode variar a partir de cerca de 2 horas até cerca de 15 horas, ou a partir de cerca de 4 horas até cerca de 10 horas. A meia-vida de permanência no tumor da nanopartícula depois da administração da nanopartícula a um sujeito pode variar a partir de cerca de 5 horas até cerca de 2 dias, a partir de cerca de 10 horas até cerca de 4 dias, ou a partir de cerca de 15 horas até cerca de 3,5 dias. A proporção de meia-vida de permanência no tumor para meia-vida de permanência no sangue da nanopartícula depois da administração da nanopartícula a um sujeito pode variar a partir de cerca de 2 até cerca de 30, a partir de cerca de 3 até cerca de 20, ou a partir de cerca de 4 até cerca de 15. O clearance renal da nanopartícula depois da administração da nanopartícula a um sujeito pode variar a partir de cerca de 10% da DI (dose inicial) até cerca de 100% da DI em cerca de 24 horas, a partir de cerca de 30% da DI até cerca de 80% da DI em cerca de 24 horas, ou a partir de cerca de 40% da DI até cerca de 70% da DI em cerca de 24 horas. Em uma modalidade, depois da nanopartícula ser administrada a um sujeito, a meia-vida de permanência no sangue da nanopartícula varia a partir de cerca de 2 horas até cerca de 25 horas, a meia-vida de permanência no tumor da nanopartícula varia a partir de cerca de 5 horas até cerca de 5 dias, e o clearance renal da nanopartícula varia a partir de cerca de 30% da DI até cerca de 80% da DI em cerca de 24 horas.

[00179] Depois da administração da presente nanopartícula a um sujeito, a meia-vida de permanência no tumor das presentes nanopartículas podem variar a partir de cerca de 5 horas até cerca de 5 dias, a partir de cerca de 10 horas até cerca de 4 dias, a partir de cerca de 15 horas até cerca de 3,5 dias, a partir de cerca de 20 horas até cerca de 3 dias, a partir de cerca de 2,5 dias até cerca de 3.1 dias, a partir de cerca de 1 dia até 3 dias, ou cerca de 73,5 horas.

[00180] A proporção da meia-vida de permanência no tumor para a meia-vida de permanência no sangue da nanopartícula pode variar a partir de cerca de 2 até cerca de 30, a partir de cerca de 3 até cerca de 20, a partir de cerca de 4 até cerca de 15, a partir de cerca de 4 até cerca de 10, a partir de cerca de 10 até cerca de 15, ou cerca de 13.

[00181] Em uma modalidade, a presente invenção proporciona uma nanopartícula fluorescente à base de sílica compreendendo um núcleo à base de sílica compreendendo um composto fluorescente posicionado dentro do núcleo à base de sílica; uma concha de sílica em torno de no mínimo uma porção do núcleo; um polímero orgânico anexado à nanopartícula; e um ligante anexado à nanopartícula, em que a nanopartícula tem um diâmetro entre cerca de 1 nm e cerca de 15 nm. Depois da administração da nanopartícula PEGuilada (de controle) a um sujeito, a meia-vida de permanência no sangue da nanopartícula pode variar a partir de cerca de 2 horas até cerca de 25 horas, ou a partir de cerca de 2 horas até cerca de 15 horas; a meia-vida de permanência no tumor da nanopartícula pode variar a partir de cerca de 5 horas até cerca de 2 dias; e clearance renal da nanopartícula pode variar a partir de cerca de 30% da DI até cerca de 80% da DI em cerca de 24 horas. O número de ligantes anexados à nanopartícula pode variar a partir de cerca de 1 até cerca de 30, ou a partir de cerca de 1 até cerca de 10. O diâmetro da nanopartícula pode ser entre cerca de 1 nm e cerca de 8 nm. Um agente de contraste, tal como um radionuclídeo, pode ser anexado à nanopartícula. Alternativamente, um quelato pode ser anexado à nanopartícula. A b nanopartícula pode ser detectada por PET, SPECT, CT, MRI, imagiologia ótica, imagiologia por bioluminescência, ou combinações dos mesmos. Um agente terapêutico pode ser anexado à nanopartícula. Depois da administração da nanopartícula dire- cionada radiomarcada a um sujeito, a meia-vida de permanência no sangue da nanopartícula também pode variar a partir de cerca de 3 horas até cerca de 15 horas, ou a partir de cerca de 4 horas até cerca de 10 horas. A meia-vida de permanência no tumor da nanopartícula depois da administração da nanopartícula a um sujeito também pode variar a partir de cerca de 10 horas até cerca de 4 dias, ou a partir de cerca de 15 horas até cerca de 3,5 dias. A proporção da meia-vida de permanência no tumor para a meia-vida de permanência no sangue da nanopartícula direcionada depois da administração da nanopartícula a um sujeito pode variar a partir de cerca de 2 até cerca de 30, a partir de cerca de 3 até cerca de 20, ou a partir de cerca de 4 até cerca de 15. O clearance renal da nanopartícula também pode variar a partir de cerca de 45% da DI até cerca de 90% da DI em cerca de 24 horas depois da administração da nanopartícula a um sujeito.

[00182] Em uma modalidade, de modo a estimar os valores da meia-vida de permanência (ou clearance) das nanopartículas radiomarcadas (TI/2) no sangue, no tumor, e em outros órgãos maiores/ tecidos, os valores da percentagem da dose injetada por grama (% da DI/g) são medidos sacrificando grupos de camundongos em momentos especificados depois da administração das nanopartículas. O sangue, o tumor, e os órgãos são colhidos, pesados, e contados em um contador de cintilação Y. Os valores da % da DI/g são corrigidos para decaimento radioativo para o momento de injeção. Os dados de concentração de tempo-atividade resultantes para cada tecido são fit ajustados para uma função monoexponencial decrescente para estimar os valores da T1/2 dos tecidos / órgãos.

[00183] Depois da administração da presente nanopartícula a um sujeito, o clearance renal das presentes nanopartículas podem variar a partir de cerca de 45% da DI (dose inicial) até mais de 90% da DI em cerca de 24 horas, a partir de cerca de 20% da DI até cerca de 90% da DI em cerca de 24 horas, a partir de cerca de 30% da DI até cerca de 80% da DI em cerca de 24 horas, a partir de cerca de 40% da DI até cerca de 70% da DI em cerca de 24 horas, a partir de cerca de 40% da DI até cerca de 60% da DI em cerca de 24 horas, a partir de cerca de 40% da DI até cerca de 50% da DI em cerca de 24 horas, about 43% da DI em cerca de 24 horas, a partir de cerca de 10% da DI até cerca de 100% da DI em cerca de 24 horas, a partir de cerca de 40% da DI até cerca de 100% da DI em cerca de 24 horas, a partir de cerca de 80% da DI até cerca de 100% da DI em cerca de 24 horas, a partir de cerca de 90% da DI até cerca de 95% da DI em cerca de 24 horas, a partir de cerca de 90% da DI até cerca de 100% da DI em cerca de 24 horas, ou a partir de cerca de 80% da DI até cerca de 95% da DI em cerca de 24 horas. O clearance renal pode ser avaliado como se segue. As nanopartículas são primeiro administradas a um sujeito (por exemplo, um camundongo, um mini porco ou um ser humano). Em vários pontos do tempo depois da administração, amostras de urina são colhidas para medir as concentrações de nanopartículas através de métodos adequados.

[00184] Em uma modalidade, o clearance renal (por exemplo, a fração de nanopartículas excretadas na urina ao longo do tempo) é avaliado como se segue. Um sujeito é administrado com as presentes nanopartículas, e amostras de urina são coletadas durante um certo período de tempo (por exemplo, por 168 horas). As concentrações de partículas em cada ponto do tempo são determinadas usando análises fluorométricas e uma curva de calibração da diluição serial gerada a partir de medições de sinais da fluorescência corrigida pelo fundo de amostras de urina misturadas com concentrações de partículas conhecidas (% da DI). Os valores de concentração, junto com estimativas dos volumes médios de urina de camundongo diariamente, são usados para computar a % cumulativa da DI/g de urina excretada. Em outra modalidade, o clearance renal de nanopartículas radiomarcadas é avaliado medindo as atividades de amostras de urina (contages por minuto) durante intervalos de tempo similares usando, por exemplo, contagem Y, e depois de administração das nanopartículas para computar a excreção de urina cumulativa.

[00185] Em uma terceira modalidade, de modo a avaliar a excreção fecal cumulativa, as fezes são coletadas em gaiolas metabólicas durante intervalos de tempo similares depois da administração das nanopartículas e as atividades das amostras são determinadas usando um contador Y-

[00186] Quando as nanopartículas na quantidade de cerca de 100 vezes da dose humana equivalente são administradas a um sujeito, substancialmente não são observadas anemia, perda de peso, agitação, aumento da respiração, distúrbio gastro intestinal, comportamento anormal, disfunção neurológica, anormalidades na hematologia, anormalidades na clínica laboratorial, lesões relacionadas com fármacos em patologia de órgãos, mortalidade, ou combinações dos mesmos em cerca de 10 até cerca de 14 dias.

[00187] Quando a presente nanopartícula contém no mínimo um ligante anexado, o reforço da nanopartícula multivalência (por exemplo, comparada com o ligante isolado) pode variar a partir de cerca de 1,5 vezes até cerca de 10 vezes, a partir de cerca de 2 vezes até cerca de 8 vezes, a partir de cerca de 2 vezes até cerca de 6 vezes, a partir de cerca de 2 vezes até cerca de 4 vezes, ou cerca de 2 vezes.

[00188] As nanopartículas da presente invenção apresentam inesperados parâmetros fisicoquímicos e biológicos in vitro e in vivo em vista da arte anterior. Por exemplo, a meia-vida de permanência no sangue estimada para as nanopartículas anexadas a ligante (por exemplo, cerca de 5,5 horas para nanopartículas anexadas a cRGD) é substancialmente mais longa do que a do ligante correspondente (por exemplo, cerca de 13 minutos para cRGD). Montet et al. Multivalent effects of RGD peptides obtained by nanoparticle display. J Med Chem. 49, 60876093 (2006). As prolongadas meias-vidas de permanência no sangue podem reforçar a biodisponibilidade da sonda, facilitam o direcionamento tumoral, e produzrm maior captação tumoral durante períodos de tempo mais longos. Em uma modalidade, a meia-vida de permanência no tumor para as nanopartículas direcionadas (isto é, nanopartículas anexadas a ligante) é cerca de 13 vezes maior do que meia-vida de permanência no sangue, ao passo que a meia-vida de permanência no tumor para as nanopartículas não-direcionadas (isto é, nanopartículas correspondentes não anexadas com ligantes) é somente cerca de 5 vezes maior do que meia-vida de permanência no sangue. Esta diferença sugere acumulação em tecido tumoral substancialmente maior das na-nopartículas direcionadas comparada com as nanopartículas não direcionadas. Em determinadas modalidades, dado o número de ligantes anexados à nanopartícula, as presentes nanopartículas apresentam inesperada ligação de alta afinidade (por exemplo, Kd de 0,51 nM e IC50 de 1,2 nM para nanopartícula anexada a cRGD), reforço multivalência (por exemplo, reforço de mais de 2 vezes para nanopartículas anexadas a cRGD comparadas com peptídeo cRGD isolado), significativa captação tumoral diferencial (por exemplo, nanopartículas de PEG anexadas a cRGD apresentam aumento de cerca de 3 a 4 vezes na captação tumoral diferencial em relação às nanopartículas revestidas com PEG durante 72 horas pós-administração), e significativo contraste tumoral em relação a músculo normal (por exemplo, cerca de 3 a 5 vezes durante 72 horas pós-administração) com base nas proporções de captação por tumor para músculo.

[00189] Em uma modalidade, foram encontrados aumentos de três vezes na atividade - concentração para nanopartículas anexadas a ligante em tumores expressando integrina em relação aos controles (por exemplo, nanopartículas anexadas a ligante em tumores não- ex-pressando integrina, ou nanopartículas correspondentes não anexadas com ligantes em tumores expressando integrina) no momento de máxima captação tumoral (cerca de 4 horas pós injeção das nanopartículas). Além disso, as proporções de captação tumoral para muscular para nanopartículas direcionadas (isto é, nanopartículas anexadas a ligante) revelam aumento do contraste do tecido tumoral em relação ao músculo normal, comparado com o reduzido contraste do tecido tumoral em relação ao músculo normal para nanopartículas não- direcionadas (isto é, nanopartículas correspondentes não anexadas com ligantes), sugerindo que as nanopartículas direcionadas são tu-mor-seletivas.

[00190] Em outra modalidade, tanto as nanopartículas direcionadas quanto as não direcionadas apresentam eficiente excreção renal durante o mesmo período de tempo. Quase metade da dose injetada é excretada durante as primeiras 24 horas pós injeção e cerca de 72% por volta de 96 horas, sugerindo que a maior parte da excreção ocorreu no primeiro dia depois de injeção. Por contraste, os perfis de excreção fecal das nanopartículas direcionadas indicam que, em média, 7% e 15% da dose injetada é eliminada durante 24 e 96 horas, respectivamente.

[00191] Os parâmetros fisicoquímicos e biológicos das nanopartículas não tóxicas, junto com suas capacidades de imagiologia multimodal (por exemplo, PET e imagiologia ótica), expandem a gama de suas potenciais aplicações biomédicas. As aplicações incluem (a) monitoramento por longo termo: o tempo de circulação sanguínea estendido e a correspondente biodisponibilidade das nanopartículas salientam sua versatilidade tanto para monitoramento precoce quanto de longo termo do manejo de vários estágios de doença (tal como diagnóstico por triagem, avaliação pré-tratamento, intervenção terapêutica, e moni toramento pós-tratamento) sem restrições impostas por considerações de toxicidade; (b) aumento da penetração tumoral: as propriedades de clearance das nanopartículas direcionadas (por exemplo, seu clearance renal pe menor do que o das sondas moleculares na arte anterior) serão úteis para vários tipos de aplicações biológicas. Por exemplo, as nanopartículas vão ser particularmente úteis em casos de tumores sólidos mal vascularizados e relativamente inacessíveis nos quais a localização de agentes é tipicamente lenta depois de administração sistêmica; (c) capacidades de imagiologia multimodal: estas modalidades podem ser combinadas em múltiplas escalas (isto é, níveis de corpo todo até celular) para adquirir informação biológica complementar, sensível à profundidade. Por exemplo, no mapeamento do linfonodo sentinela, linfonodos profundos podem ser mapeados por PET em termos de sua distribuição e número, ao passo que localização mais precisa e detalhada de linfonodos superficiais pode ser obtida por imagiologia por fluorescência; e (d) terapêuticos direcionados: clearance mais longo das nanopartículas direcionadas do tumor comparado com o do sangue pode ser explorado para aplicações diagnósticas / terapêuticas combinadas, nas quais as nanopartículas podem servir como um radioterapêutico ou como um veículo de liberação de fármaco.

Composições farmacêuticas

[00192] A presente invenção adicionalmente proporciona uma composição farmacêutica compreendendo a presente nanopartícula. As composições farmacêuticas da invenção podem ser administradas por via oral sob a forma de uma forma de unidade de dosagem farmacêutica adequada. As composições farmacêuticas da invenção podem ser preparadas em muitas formas as quais incluem comprimidos, cápsulas de gelatina dura ou mole, soluções aquosas, suspensões, e liposso- mas e outras formulações de lenta liberação, tais como géis poliméri- cos modelados.

[00193] Modos de administração adequados para a presente nanopartícula ou composição incluem, mas não estão limitados a, administração oral, intravenosa, retal, sublingual, mucosa, nasal, oftálmica, subcutânea, intramuscular, transdérmica, intradérmica, subdérmica, peritumoral, espinhal, intratecal, intra-articular, intra-arterial, subarac- noide, bronquial, e linfática, e outras formas de dosagem para liberação sistêmica de ingredientes ativos. A presente composição farmacêutica pode ser administrada por qualquer método conhecido na arte, incluindo, sem limitação, transdérmico (passivo através de emplastro, gel, creme, pomada ou iontoforético); intravenoso (bolus, infusão); subcutâneo (infusão, depósito); transmucoso (bucal e sublingual, por exemplo, comprimidos orodispersíveis, wafers, película, e formulações efervescentes; conjuntivo (gotas oculares); retal (supositório, enema)); ou intradérmico (bolus, infusão, depósito). A composição pode ser liberada topicamente.

[00194] Composições farmacêuticas líquidas orais podem estar sob a forma de, por exemplo, suspensões aquosas ou oleosas, soluções, emulsões, xaropes ou elixires, ou podem ser apresentadas como um produto seco para constituição com água ou outro veículo adequado antes do uso. As composições farmacêuticas líquidas referidas podem conter aditivos convencionais tais como agentes de suspensão, agentes emulsificantes, veículos não-aquosos (os quais podem incluir óleos comestíveis), ou preservantes.

[00195] As composições farmacêuticas de nanopartículas da invenção também podem ser formuladas para administração parenteral (por exemplo, por injeção, por exemplo, injeção de bolus ou infusão contínua) e podem ser apresentadas em forma de unidade de dosagem em ampolas, seringas previamente enchidas, recipientes de infusão de pequeno volume ou recipientes multidoses com um preservante adicionado. As composições farmacêuticas podem tomar formas tais como suspensões, soluções, ou emulsões em veículos oleosos ou aquosos, e podem conter agentes de formulação tais como agentes de suspensão, estabilizantes e/ou dispersantes. Alternativamente, as composições farmacêuticas da invenção podem estar em forma de pó, obtida por isolamento asséptico de sólido estéril ou por liofilização de solução, para constituição com um veículo adequado, por exemplo, água estéril, livre de pirogênio, antes do uso.

[00196] Para administração tópica na epiderme, as composições farmacêuticas podem ser formuladas como pomadas, cremes ou loções, ou como o ingrediente ativo de um emplastro transdérmico. Sistemas de liberção transdérmica adequados são revelados, por exemplo, em A. Fisher et al. (Patente dos Estados Unidos No. 4.788.603), ou em R. Bawa et al. (Patentes dos Estados Unidos Nos. 4.931.279; 4.668.506; e 4.713.224). Pomadas e cremes podem ser formulados, por exemplo, com uma base aquosa ou oleosa com a adição de agentes de espessamento e/ou gelificação adequados. As loções podem ser formuladas com uma base aquosa ou oleosa e em geral também vai conter um ou mais agentes emulsificantes, agentes estabilizantes, agentes dispersantes, agentes de suspensão, agentes espessantes, ou agentes colorantes. As composições farmacêuticas também podem ser liberadas através de ionoforese, por exemplo, conforme revelado in as Patentes dos Estados Unidos Nos. 4.140.122; 4.383.529; ou 4.051.842.

[00197] Composições farmacêuticas adequadas para administração tópica na boca incluem formas de unidade de dosagem tais como pastilhas compreendendo uma composição farmacêutica da invenção em uma base aromatizada, de modo geral sacarose e acacia ou tragacan- to; pastilhas compreendendo a composição farmacêutica em uma base inerte tal como gelatina e glicerina ou sacarose e acacia; géis mu- coaderentes, e colutórios compreendendo a composição farmacêutica em um suporte líquido adequado.

[00198] Para administração tópica no olho, as composições farmacêuticas podem ser administradas como gotas, géis (S. Chrai et al., Patente dos Estados Unidos No. 4.255.415), gomas (S. L. Lin et al., Patente dos Estados Unidos No. 4.136.177) ou através de uma inserção ocular de liberação prolongada (A. S. Michaels, Patente dos Estados Unidos No. 3.867.519 e H. M. Haddad et al., Patente dos Estados Unidos No. 3.870.791).

[00199] Quando desejados, as composições farmacêuticas acima descritas podem ser adaptadas para proporcionar liberação gradual de um composto terapêutico empregado, por exemplo, por combinação com determinadas matrizes de polímero hidrofílico, por exemplo, compreendendo géis naturais, géis de polímeros sintéticos ou misturas dos mesmos.

[00200] Composições farmacêuticas adequadas para administração retal em que o suporte é um sólido são de modo o mais preferencial apresentadas como supositórios de unidade de dose. Suportes adequados incluem manteiga de cacau e outros materiais comumente usados na arte, e os supositórios podem ser formados convenientemente por mistura da composição farmacêutica com o um ou mais suportes amolecidos ou fundidos seguida por arrefecimento e modelagem em moldes.

[00201] Composições farmacêuticas adequadas para administração vaginal podem ser apresentadas como pessários, tampões, cremes, géis, pastas, espumas ou sprays contendo, além das nanopartículas e o agente terapêutico, os suportes referidos são de conhecimento geral na arte.

[00202] Para administração por inalação, as composições farmacêuticas de acordo com a invenção são liberadas convenientemente a partir de um insuflador, de um nebulizador ou de uma embalada pressurizada ou outros meios convenientes de liberação de um spray de aerosol. Embaladas pressurizadas podem compreender um propelente adequado tal como diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluo- roetano, dióxido de carbono ou gás outro adequado. No caso de um aerosol pressurizado, a unidade de dosagem pode ser determinada proporcionando uma válvula para liberar uma quantidade dosada.

[00203] Alternativamente, para administração por inalação ou insuflação, as composições farmacêuticas da invenção podem tomar a forma de uma composição de pó a seco, por exemplo, uma mistura de pó da composição farmacêutica e uma base de pó adequado tal como lactose ou amido. A composição de pó pode ser apresentada em forma de unidade de dosagem, por exemplo, em cápsulas ou cartuchos ou, por exemplo, gelatina ou blister packs (pacotes de bolhas) a partir dos quais o pó pode ser administrado com o auxílio de um inalador ou um insuflador.

[00204] Para administração intranasal, as composições farmacêuticas da invenção podem ser administradas através de um spray de líquido, tal como através de um atomizador de frasco plástico. Típicos destes são o Mistometer® (inalador de isoproterenol Wintrop) e o Me- dihaler® (inalador de isoproterenol isoproterenol Riker).

[00205] Composições farmacêuticas da invenção também podem conter outros adjuvantes tais como aromatizantes, colorantes, agentes antimicrobianos, ou preservantes.

[00206] Será adicionalmente reconhecido que a quantidade das composições farmacêuticas requeridas para uso em tratamento vai variar não somente com o agente terapêutico selecionado, mas também com a via de administração, a natureza da condição sendo tratada e a idade e condição do paciente e em última análise estará à critério do clínico ou médico assistente. Para avaliações destes fatores, vide J. F. Brien et al., Europ. J. Clin. Pharmacol., 14, 133 (1978); e Physicians' Desk Reference, Charles E. Baker, Jr., Pub., Medical Economics Co., Oradell, N.J. (41st ed., 1987). Geralmente, as dosagens do agente terapêutico quando usado em combinação com as nanopartículas fluorescentes da presente invenção pode ser menor do que quando o agente terapêutico é administrado isolado ou em formas de dosagens farmacêuticas convencionais. A alta especificidade da nanopartícula fluorescente por um sítio alvo, tal como um receptor situado sobre uma superfície celular, pode proporcionar uma concentração relativamente altamente localizada de um agente terapêutico, ou alternativamente, uma liberação gradual de um agente terapêutico durante um período de tempo prolongado.

[00207] As presentes nanopartículas ou composições podem ser administradas a um sujeito. O sujeito pode ser um mamífero, de modo preferencial um humano. Mamíferos incluem, mas não estão limitados a, murinos, ratos, coelhos, símios, bovinos, ovino, suíno, caninos, felino, animais de criação, animais de competição, animais de estimação, equinos, e primatas.

Usos de Nanopartículas

[00208] A presente invenção adicionalmente proporciona um método para detecção de um componente de uma célula compreendendo as etapas de: (a) contactar a célula com uma nanopartícula fluorescente à base de sílica compreendendo um núcleo à base de sílica compreendendo um composto fluorescente posicionado dentro do núcleo à base de sílica; uma concha de sílica em torno de no mínimo uma porção do núcleo; um polímero orgânico anexado à nanopartícula; a partir de cerca de 1 até cerca de 25 ligantes (a partir de cerca de 1 até cerca de 20 ligantes, ou a partir de cerca de 1 até cerca de 10 ligantes, ou outras faixas; vide discussões inclusas) anexados à nanopartícula; e um agente de contraste ou um quelato anexado à nanopartícula; e (b) monitoramento da ligação da nanopartícula à célula ou um componen- te celular (e/ou sua potencial captação intracelular) por no mínimo uma técnica de imagiologia. A técnica de imagiologia pode ser PET, SPECT, CT, MRI, bioluminescência ótica ou imagiologia por fluorescência, e combinações das mesmas.

[00209] A localização do componente celular pode ser detectada e determinada dentro de uma célula inteira metabolicamente ativa, em um lisado de célula inteira, em uma célula permeabilizada, em uma células fixa, ou com um componente celular parcialmente purificado em um ambiente livre de células. A quantidade e a duração do contato pode depender, por exemplo, dos objetivos de diagnóstico ou terapêuticos do método de tratamento, tal como detecção mediadapo por anticorpo ou fluorescente de intermediários do caminho de sinalização hi- perregulados (isto é, Akt, NF-KB), dps estados de doença ou condições, da liberação de um agente terapêutico, ou ambos. A quantidade e a duração do contato também pode depender da concentração relativa da nanopartícula fluorescente para o analito alvo, do tempo de incubação da partícula, e do estado da célula para tratamento.

[00210] A presente invenção adicionalmente proporciona um método para direcionamento de uma célula tumoral compreendendo administração a um paciente com câncer de uma quantidade eficaz de uma nanopartícula fluorescente à base de sílica compreendendo um núcleo à base de sílica compreendendo um composto fluorescente posicionado dentro do núcleo à base de sílica; uma concha de sílica em torno de no mínimo uma porção do núcleo; um polímero orgânico anexado à nanopartícula; um ligante anexado à nanopartícula e capaz de ligar um marcador tumoral; e no mínimo um agente terapêutico.

[00211] A nanopartícula pode ser radiomarcada. A nanopartícula pode ser radiomarcada usando quaisquer técnicas adequadas. A radi- omarcação pode ser automatizada. Em uma modalidade, a nanopartícula é radiomarcada a plataforma de síntese de radioquímica FASTlab (GE Healthcare). Os parâmetros da síntese podem ser aperfeiçoados para obter altas reprodutibilidades, produção / pureza radioquímica, eficiência da marcação, e tempos de síntese relativamente curtos. Nos rastreadores de partícula podem ser acomodados no mesmo módulo FASTlab.

[00212] A nanopartícula pode ser administrada ao paciente, porém não restrita, pelas seguintes vias: oral, intravenosa, nasal, subcutânea, local, intramuscular ou transdérmica.

[00213] Em determinadas modalidades, pode ser desejável usar uma mistura de dois ou mais tipos de nanopartículas fluorescentes tendo diferentes propriedades para avaliar diferentes tipos de tecido.

[00214] Os métodos e composições da invenção podem ser usados para ajudar um médico ou cirurgião a identificar e caracterizar áreas de doença, tais como cânceres e processos inflamatórios / infecciosos, incluindo, mas não restritos a, cânceres da pele (melanoma), de cabeça e pescoço, de próstata, cerebral, e dos intestinos, a distinguir tecido doente e normal, tal como detectando margens tumorais que são difíceis de detectar usando um microscópio de operação usual, por exemplo, em cirurgia cerebral, para ajudar a prescrever uma intervenção terapêutica ou cirúrgica, por exemplo, determinando se uma lesão é cancerosa e deve ser removida ou é não cancerosa e não deve ser removida, ou no estagiamento cirúrgico de uma doença, por exemplo, estagiamento intraoperatório de linfonodos, mapeamento do linfonodo sentinela (SLN), por exemplo, procedimentos de preservação dos nervos para preservar estruturas neurais vitais (nervos intraparotídeos).

[00215] Os métodos e composições da invenção podem ser usados na detecção de doença metastática, no monitoramento da resposta ao tratamento, no mapeamento / direcionamento de linfonodos sentinela, em procedimentos de preservação de nervos, na detecção de doença residual, na liberação direcionada de terapêuticos (plataforma de diag nóstico / terapêutica combinada), na liberação local de nanopartículas não direcionadas carregando fármacos (liberação de cateter), em terapêuticos para a barreira hematoencefálica, no tratamento de doenças inflamatórias / isquêmicas (isto é, cerebrais, cardíacas, do trato urinário, da bexiga), no tratamento e detecção combinados de doença (por exemplo, detecção de pH Ratiométrica, detecção de oxigênio), etc.

[00216] Os métodos e composições da invenção também podem ser usados na detecção, caracterização e/ou determinação da localização de uma doença, especialmente doença inicial, da gravidade de uma doença ou de uma condição associada com doença, do estagia- mento de uma doença, e/ou do monitoramento uma doença. A presença, a ausência, ou o nível de um sinal emitido pode ser indicativo de um estado de doença. Os métodos e composições da invenção também podem ser usados para monitorar e/ou guiar várias intervenções terapêuticas, tais como procedimentos cirúrgicos e à base de cateter, e monitoramento de terapia de fármacos, incluindo terapias à base de células. Os métodos da invenção também podem ser usados no prognóstico de uma doença ou de uma condição de doença. Sub- populações celulares inerentes dentro do ou marginando o sítio de doença, tais como células stem-like ("células tronco cancerosas") e/ou celulas inflamatórioas / fagocíticas podem ser identificadas e caracterizadas usando os métodos e as composições da invenção. Com respeito a cada um dos precedentes, exemplos de semelhantes doença ou condições de doença que podem ser detectados ou monitorados (antes, durante ou depois de terapia) incluem câncer (por exemplo, melanoma, da tiroide, colorretal, ovariano, pulmonar, de mama, de próstata, cervical, de pele, cerebral, gastrointestinal, de boca, renal, esofageano, ósseo), que podem ser usados para identificar sujeitos que têm uma suscetibilidade aumentada para desenvolver câncer e/ou malignidades, isto é, são predispostos a desenvolver câncer e/ou ma- lignidades, inflamação (por exemplo, condições inflamatórias induzidas pela presença de lesões cancerosas), doença cardiovascular (por exemplo, aterosclerosie e condições inflamatórias dos vasos sanguíneos, isquemia, derrame, trombose), doença dermatológica (por exemplo, Sarcoma de Kaposi, psoríase), doença oftálmica (por exemplo, degeração macular, retinopatia diabética), doença infecciosa (por exemplo, infecções bacterianas, virais, fúngicas e parasitárias, incluindo a Síndrome da Imunodeficiência Adquirida), doença imunológica (por exemplo, um distúrbio autoimune, linfoma, esclerose múltipla, artrite reumatóide, diabetes mellitus), doença do sistema nervoso central (por exemplo, uma doença neurodegenerativa, tal como a doença de Parkinson ou a doença de Alzheimer), doenças hereditárias, doenças metabólicas, doenças ambientais (por exemplo, envenenamento por chumbo, mercúrio e radioativo, câncer de pele), doença relacionadas com os ossos (por exemplo, osteoporose, tumores ósseos primários e metastàticos, osteoartrite) e uma doença neurodegenerativa.

[00217] Os métodos e composições da invenção, portanto, podem ser usados, por exemplo, para determinar a presença e/ou a localização de células tumor e/ou células stem-like co-residentes ("células tronco cancerígenas"), a presença e/ou localização de células inflamatórias, incluindo a presença de macrófagos ativados, por exemplo, em regiões peritumo- rais, a presença e na localização de doença vascular incluindo áreas em risco para oclusão aguda (isto é, placas vulneráveis) em artérias coronárias e periféricas, regiões de aneurismas em expansão, placa instável em artérias carótidas, e áreas isquèmicas. Os métodos e composições da invenção também podem ser usados em identificação e avaliação de morte celular, lesão, apoptose, necrose, hipóxia e angiogênese. Publicação de Patente No. PCT/US2006/049222.

[00218] Os exemplos que se seguem são apresentados para os fins de ilustração somente e não são limitantes da invenção.

Exemplo 1 Preparação e Caracterização de Nanopartículas Revestidas com PEG

[00219] Nanopartículas contendo um corante emissor NIR (Cy-5) foram sintetizadas e funcionalizadas por PEGuilação de acordo com protocolos bem estabelecidos conforme revelado na Plubalicação de Patente No. PCT/US2008/074894 e por Stober et al. Controlled growth of monodispersed silica spheres in the micron size range. Colloid Interface Sci. 1968; 26:62-69. Ohnishi et al. J. Mol. Imaging 2005, 4:172181. Cy5 malemida foi reagido com um composto de organo silano co- reativo, (3-Mercaptopropil)trometoxissilano para formar um precursor de sílica fluorescente. Este precursor de sílica fluorescente foi co- condensado com tetraetilortossilicato para formar um núcleo à base de sílica fluorescente. Um composto de PEG-silano, com cadeias de po- li(etileno glicol) terminadas com metóxi chains (PEG, ~0,5 kDa) Meto- xi(Polietilenoóxi)Propil]-Trimetoxisilano, foi adicionado ao núcleo à base de sílica fluorescente para formar um revestimento de PEG sobre o núcleo. Nanopartículas revestidas com PEG foram dialisada para salina fisiológica (0,15 M de NaCl em H2O) através de membranas de diá- lise 3500 MWCO Snakeskin Dialysis Membranes e filtradas estéreis. Todas as amostras foram combinadas por densidade ótica em seu comprimento de onda de absorção de pico (640 nm) antes de injeção. As medições dos tamanhos hidrodinâmicos foram obtidas por Dispersão da luz dinâmica (DLS) e Espectroscopia de correlação da fluores-cência (FCS). Em resumo, partículas dialisadas para água foram medidas em um sistema da Brookhaven Instruments Company 200SM static/DLS usando um laser de HeNe (À = 632,8 nm). Devido à sobreposição da absorção do corante com a fonte de excitação, foram usados tempos de integração de 15 min para obter proporções aceitáveis de sinal para ruído. Para FCS, as partículas foram dialisadas para água, diluídas em 0,15 M de NaCl, e medidas em um Zeiss LSM 510 Confocor 2 FCS (excitação de HeNe de 633 nm). O instrumento foi calibrado por tamanho antes de todas as medições. A comparação do brilho relativo das nanopartículas PEGuiladas com corante livre foi determinada a partir de curvas de FCS, medida como taxa de contagem por molécula / partícula.

Exemplo 2 Clearance Renal de Nanopartículas Revestidas com PEG

[00220] Nanopartículas de sílica de núcleo e concha fluorescentes, tendo um raio hidrodinâmico de cerca de 3 nm, foram sintetizadas. Estas nanopartículas foram consideradas como estando na faixa de 6 a 10 nm de diâmetro, conforme mostrado pelos resultados da dispersão da luz dinâmica (DLS) (Figura 1a). Imagiologia por fluorescência próxima ao infravermelho de corpo inteiro in vivo de nanopartículas de sílica sem revestimento (sem revestimento de PEG), da ordem de 6 nm e de 3,3 nm, em camundongos nude mostrou considerávle clearance renal 45 min depois de injeção com uma acumulação significativa remanescente no fígado (Figura 1b). Excreção eventual dentro da circulação enterohepática ocorreu durante as 24 h seguintes. Com base nestes resultados, as partículas foram revestidas de modo covalente com cadeias de poli(etileno glicol) terminadas com metóxi (PEG, ~0,5 kDa), de acordo com os protocolos na Publicação de Patente No. PCT/US2008/074894, de modo a prevenir opsonização e a reforçar mais o clearance das partículas ao mesmo tempo que mantendo um pequeno tamanho hidrodinâmico. Este tratamento diminuiu a retenção pelo fígado e resultou em aumentada filtração renal para dentro da bexiga em 45 min depois de injeção por imagiologia por fluorescência próxima ao infravermelho (Figura 1c), com fluorescência da bexiga visível até 24 h. As sondas foram bem toleradas, sem efeitos adversos ou óbitos dos animais observados durante o curso do estudo. Imagiologia por PET-CT co-registrada serial 24 horas pós injeção de Nano- partículas revestidas com PEG com etiqueta de 124I (Figura 1 d, linha superior) demonstraram uma pequena quantidade de atividade na bexiga residual, bem como atividade de sobreposição no fígado / trato gastrointestinal (centro), flanqueada por microCT e microPET scans adquiridos de modo independente. Imagens por microPET serial confirmaram os achados da imagiologia por fluorescência próxima ao infravermelho. A meia-vida da permanência no sangue das nanopartículas PEGuiladas com etiqueta de 124I com base nas alterações na atividade sanguínea dependentes do tempo durante um período de 96 horas foi considerada como sendo de 7,3 horas. Para as nanopartículas ligadas a RGD, com etiqueta de 124I, a meia-vida da permanência no sangue foi considerada como sendo de 5,6 horas.

[00221] Com base nestes dados in vivo, um estudo mais detalhado de biodistribuição e clearance de nanopartículas revestidas foi empreendido sobre dois grupos de partículas contendo Cy5 PEGuiladas para avaliar os efeitos do tamanho da sonda sobre a biodistribuição. Nanopartículas com diâmetros hidrodinâmicos de 3,3 ± 0,06 e 6,0 ± 0,1 nm, conforme medido por espectroscopia de correlação da fluorescência (FCS), foram geradas (Figura 2a). Antes de estudos in vivo, as propriedades fotofísicas das partículas foram investigadas para estabelecer seus níveis de performance versus corante livre. Apesar do tamanho extremamente pequeno das partículas, moléculas de corante encapsuladas com sílica apresentaram reforços fotofísicos em relação ao corante livre que escalaram com o tamanho da partícula, incluindo au-mentos significativos no brilho, conforme determinado por espectroscopia de absorção e emissão (Figura 2b) e FCS (Figura 2c). Comparadas com corante livre, as nanopartículas de 3,3 e de 6,0 nm de diâmetro apresentaram aumentos de 2 e de 3 vezes na meia-vida de fo- todegradação, respectivamente, quando irradiadas com um laser de alta potência de 635 nm (Figura 2d). Portanto, estas sondas de nano- partículas foram consideradas como sendo tanto mais brilhantes quanto mais fotoestáveis do que suas equivalentes de corante livre.

[00222] Além de avaliação semiquantitativa do comportamento das nanopartículas in vivo a partir de imagiologia de corpo inteiro, análise ex vivo de homogenados de tecido e de fluidos foi realizada usando uma leitora de placa de fluorescência, a qual permitiu quantificação calibrada das variações observadas em imagiologia por fluorescência próxima ao infra-vermelho. As amostras foram agrupadas como fontes de fluorescência de partícula "retida" (fígado, rim, pulmão, baço homogenados, e sangue) e "excretada" (urina), foram corrigidas pelo fundo e foram convertidas para percentagem da dose inicial (% da DI) por animal com base em curvas de calibração. Análise tecidual mostrou mínima retenção de partícula nos órgãos principais, com a maior parte da fluorescência atribuída ao sangue circulante (Figura 3a). A retenção de partícula pura, calculada como a soma dos componentes "retidos", foi ajustada com uma curva de decaimento exponencial para determinar a cinética de excreção (Figura 3b). Partículas maiores apresentaram uma meia-vida tecidual mais longa (W2(3,3 nM) = 190 min, t/2(6,0 nm) = 350 min) e maior retenção orgânica inicial. Depois de 48 h, a partícula de 6 nm apresentou mínima retenção no corpo (Rtotal(6,0 nm) = 2,4 ± 0,6% da DI). Amostras de urina colhidas no momento do sacrifício, em conjunto com dados de calibração da diluição serial, foram usadas para estimar o clearance renal total com base em uma estimativa conservadora do volume urinário médio excretado por unidade de tempo. Por meio deste método, foi estimada a % da DI excretada ao longo do tempo para ambos os tamanhos das partículas (Figura 3c).

Exemplo 3 Nanopartículas de Sílica Fluorescente Conjugadas com Peptídeo de Direcionamento para αvβ3 Integrina (Modelo de Melanoma)

[00223] De modo a sintetizar uma nanopartícula multimodal (ótica- PET) com alta afinidade pelo marcador tumoral αvβ3 integrina, penta- peptídeo RGD cíclico (RGDYC) foi conjugado à nanopartícula através de uma ligação de Cys-maleimida. O encadeador de tirosina, Y, foi usado para anexar subsequentemente um radiomarcador. Camundongos nude atímicos machos foram injetados por via subcutânea em seus flancos com células de glioma de rato C6. Em ~0,5 cm de diâmetro, os camundongos foram injetados por via IV ou com nanopartículas de sílica sem revestimento (Figura 4A) ou com nanopartículas de RGD PEG-uiladas (Figura 4B, ~500 nm/kg). A Figura 4 mostra a biodistribuição in vivo em camundongos não portadores de tumor e portadores de tumor usando imagiologia ótica de corpo inteiro.

[00224] A ligação in vitro de nanopartículas direcionadas (ligadas a RGD) e não direcionadas (revestidas com PEG) a linhagens de células de melanoma humano positivo para αvβ3-integrina (M21) foi investigada como parte de um estudo de dose resposta usando citometria de fluxo (Figuras 5A, 5B). A ligação / captação de partículas foi avaliada como uma função do tempo (Figura 5A) e da concentração (Figura 5B).

Exemplo 4 Nanopartículas de Sílica Fluorescente Conjugadas com Peptídeo de Direcionamento para αvβ3 Integrina e Mapeamento Nodal (Modelo de Melanoma)

[00225] Nós utilizadmos um material biocompatível, sílica, o qual tem uma arquitetura que pode ser ajustada precisamente aos tamanhos das partículas otimizados para clearance renal. Nós anexamos pequenos peptídeos de direcionamento e uma etiqueta radioativa à superfície das partículas para medições por imagiologia por imagiologia por PET serial em um modelo de melanoma humano in vivo bem caracterizado, e mapeamos linfonodos de drenagem e canais linfáticos usando um corante próximo ao infravermelho (NIR) encapsulado e mé- todos de imagiologia por fluorescência ótica multi-escala. Ballou et al., Sentinel lymph node imaging using quantum dots in mice tumor models. Bioconjugate Chem. 18, 389-396 (2007). Kim et al., Near-infrared fluorescent type II quantum dots for sentinel lymph node maping. Nat. Biotechnol. 22, 93-97 (2003). Tanaka et al, Image-guided oncologic surgery using invisible light: completed pre-clinical development for sentinel lymph node maping. J Surg Oncol. 13, 1671-1681 (2006). Também foi realizado teste de toxicidade e foram derivadas as doses de radiação dos órgãos normais humanos. Especificamente, nós sintetizamos nanopartículas de sílica de núcleo e concha encapsulando corante próximo ao infra-vermelho (NIR) de cerca de 7 nm de diâmetro, revestidas com cadeias de PEG e funcionalizadas na superfície com um pequeno número (cerca de 6 a 7) de peptídeos de direcionamento e radiomarcadores.

[00226] Nós demonstramos que estas sondas simultaneamente são não-tóxicas, apresentam ligação de alta afinidade / avidez, eficiente excreção, e significativa captação diferencial e contraste entre tecidos tumorais e normais usando abordagens de imagiologia molecular multimodal. As sensíveis detecção, localização, e interrogação de linfonodos e canais linfáticos, possibilitada pela fluorescência do corante próximo ao infra-vermelho, salienta a distinta vantagem potencial desta plataforma multimodal para detecção e estagiamento de doença me- tastática no cenário clínico, ao mesmo tempo que estendendo a menor faixa de tamanhos nodais que podem ser detectados.

Materiais e Métodos Síntese de Nanopartículas-cRGDY-PEG e Nanopartículas-PEG

[00227] As partículas foram preparadas por uma condensação de sílica do tipo de Stober modificado conforme descrito previamente. Wiesner et al., PEG-coated Core-shell Silica Nanoparticles and Methods of Manufacture and Use, PCT/US2008/74894. Larson, et al., Silica na noparticle architecture determines radiative properties of encapsulated chromophores. Chem. Mater. 20, 2677-2684 (2008). Bogush, et al., Preparation of Monodisperse Silica Particles: Control of Size and Mass Fraction. J. Non-Cryst. Solids, 104, 95-106 (1988). Sadasivan, et al., Alcoholic Solvent Effect on Silica Synthesis--NMR and DLS Investigation. J. Sol-Gel Sci. Technol. 12, 5-14 (1998). Herz, et al., Large Stokes- Shift Fluorescent Silica Nanoparticles with Enhanced Emission over Free Dye for Single Excitation Multiplexing. Macromol Rapid Commun. 30, 1907-1910 (2009). Resíduos tirosina foram conjugados a cadeias de PEG para fixação de radioiodo ou porções de iodo estáveis. Hermanson, Bioconjugate Techniques, (Academic Press, London, ed. 2, 2008). Todas as amostras foram combinadas por densidade ótica em seu comprimento de onda de absorção de pico (640 nm) antes de ra- diomarcação. Os peptídeos cRGD foram anexados a cadeias de PEG funcionalizadas através de uma ligação de cisteína-maleimida, e o número de peptídeos cRGD ligados à partícula foi estimado usando medições à base de FCS das concentrações de partículas absolutas e da concentração de partida dos reagentes para o peptídeo cRGD.

Medições do Tamanho Hidrodinâmico e de Comparações do Brilho Relativo por Espectroscopia de Correlação da Fluorescência (FCS)

[00228] Partículas dialisadas para água foram diluídas em salina fisiológica (0,15 M de NaCl em H2O) e medidas em um Zeiss LSM 510 Confocor 2 FCS usando excitação de HeNe de 633 nm. O instrumento foi calibrado por tamanho antes de todas as medições. As diferenças do tempo de difusão foram usadas para avaliar variações nos tamanhos hidrodinâmicos do corante e das espécies de partículas. Foram realizadas comparações do brilho relativo do corante livre e das nanopartículas de PEG- e das nanopartículas de RGDY-PEG usando con-tagem de taxas por molécula / partícula.

Radiomarcação de Conjugados de C Dot

[00229] Radiomarcação das cRGDY-PEG-nanopartículas e das PEG-nanopartículas foi realizada usando o método do IODOGEN (Pierce, Rockford, Ill.). Piatyszek, et al., Iodo-gen mediated radioiodination of nucleic acids. J. Anal. Biochem. 172, 356-359 (1988). As atividades foram medidas por contagem por raios gama (Y) e a fluorescência foi medida usando um fluorômetro Varian (excitação de 650 nm / emissão de 680 nm).

Células e Cultura Celular

[00230] Linhagens celulares de melanoma humano M21 e M21 variantes (M21-L, αv negativas) foram mantidas em meio RPMI 1640 / 10% de BSA fetal, 2 mM de penicilina L-glutamina, e estreptomicina (Core Media Preparation Facility, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, New York). Células endoteliais do cordão venoso umbilical humano (HUVECs) foram cultivadas em meio M199 / 10% de soro fetal bovino, 20 μg/ml de fator de crescimento celular endotelial, 50 μg/ml de heparina, penicilina e estreptomicina.

Ligação Celular In Vitro e Especificidade Molecular de 124I-cRGD-PEG- Nanopartículas

[00231] De modo a avaliar a ligação de partículas e a especificidade para células M21, placas de 24 cavidades foram revestidas com 10 μg/ml de colágeno tipo I (BD Biosciences, Bedford, Mass.) em salina tamponada com fosfato (PBS) e incubadas (37° C., 30 min). Células M21 (3,0 a 4,0x105 células/ cavidade) foram cultivadas até a confluência e lavadas com meio RPMI 1640 / 0,5% de albumina sérica bovina (BSA). 124I-cRGD-PEG-nanopartículas (0 a 4,0 ng/ml) foram adicionadas às cavidades e células incubadas (25° C., 4 horas), lavadas com meio RPMI 1640 / 0,5% de BSA, e dissolvidas em 0,2 M de NaOH. A radioatividade foi avaliada usando um contador gama 1480 Automatic Gamma Counter (Perkin Elmer) calibrado para iodo-124. Ligação ines- pecífica foi determinada na presença de um excesso de 1000 vezes de cRGD (Peptides International, Louisville, Ky.). Foram gerados gráficos de Scatchard dos dados de ligação e analisados usando análise de regressão linear (Microsoft Excel 2007) para derivar parâmetros de ligação de receptor (Kd, Bmax, IC50).

Estudos de Ligação Celular In Vitro Usando Métodos de Detecção Ótica

[00232] Máxima ligação diferencial de cRGDY-PEG-nanopartículas e PEG-nanopartículas a células M21 foi determinada para uma faixa de tempos de incubação e concentrações de partículas usando citometria de fluxo, com valores ótimos usados em estudos de ligação competitiva e de especificidade. As células (3,0*105 células/ cavidade) foram lavadas com meio RPMI 1640 / 0,5% de BSA, destacadas usando 0,25% de tripsina / EDTA, e peletizadas em um tubo de micro- centrífuga (5 min a 1400 rpm, 25° C.). Os péletes foram ressuspendi- dos em solução BD FACSFlow (BD Biosciences, San Jose, CA.) e analisados no canal de Cy5 para determinar a percentagem de sonda ligada a partícula (FACSCalibur, Becton Dickinson, Mountain View, CA.). Estudos de ligação competitiva foram adicionalmente realizados depois de incubação de cRGDY-PEG-nanopartículas (2,5 ng/ml) com células M21, M21L, e HUVEC na presença de excesso de cRGD e/ou anticorpo conjugado a αvβ3 fluoresceína anti-integrina humana monoclonal de camundongo (Millipore, Temecula, CA.) e analisadas por citometria de fluxo. De modo a avaliar a potência das nanopartículas de RGDY-PEG em relação ao peptídeo cRGD, foram realizados testes anti-adesão. Placas de 96 cavidades foram revestidas com vitronectina em PBS (5 μg/ml), seguido por 200 μl de RPMI / 0,5% de BSA (1 h, 37° C.). As células (3*104/100 μl/ cavidade) foram incubadas em qua- druplicata (30 min, 25° C.) com várias concentrações de cRGDY-PEG- nanopartículas ou peptídeo cRGD em RPMI / 0,1% de BSA, e adicionadas a placas revestidas com vitronectina (30 min, 37° C.). As cavidades foram delicadamente enxaguadas com RPMI / 0,1% de BSA para remover células não aderentes; as células aderentes foram fixadas com 4% de PFA (20 min, 25° C.) e coradas com azul de metileno (1 h, 37° C.) para determinação das densidades óticas, medidas usando uma leitora de placas Tecan Safire (Àex = 650 nm, Àem = 680 nm, largura de banda de 12 nm). O fator de reforço multivalente foi computado como a proporção do peptídeo cRGD para valores da IC50 de cRGDY-PEG-dot. Montet, et al., Multivalent effects of RGD peptides obtained by nanoparticle display. J Med Chem. 49, 6087-6093 (2006).

Modelos Animais e Inoculação Tumoral

[00233] Todos os experimentos com animais foram feitos de acordo com protocolos aprovados pelo Institutional Animal Care and Use Committee do Memorial Sloan-Kettering Cancer Center e seguiram as diretrizes do National Institutes of Health para o bem estar dos animais. Camundongos nu/nu atímicos machos (de 6 a 8 semanas de idade, Taconic Farms Inc, Hudson, N.Y.) foram providos com água contendo solução de iodeto de potássio para bloquear captação pela glândula tiroide de qualquer radioiodo livre in vivo, e mantidos em uma dieta de Harlan Teklad Global Diet 2016, ad libitum, conforme detalhado em outra parte 10. De modo a gerar xenoenxertos de M21 ou M21L, volumes iguais de células (~5*106/100 μl) e matrigel foram co- injetados por via subcutânea na pata traseira em diferentes camundongos. Os tamanhos dos tumores foram medidos regularmente com calibradores, produzindo volumes tumorais médios de 200 mm3.

Farmacocinética In Vivo e Medições da Meia Vida de Permanência (T112)

[00234] As concentrações de atividade dependente do tempo (% da DI/g), corrigidas para decaimento radioativo no momento da injeção, foram medidas sacrificando grupos de camundongos em momentos especificados depois de injeção i.v. de 124I-cRGDY-PEG- nanopartículas ou 124I-PEG-nanopartículas (~20 μCi/ camundongo) e colhendo, pesando, e contando sangue, tumor, e órgãos em um contador de cintilação Y calibrado para 124I. Os dados de concentrações de atividade por tempo resultante para cada tecido foram ajustados para uma função monoexponencial decrescente de modo a determinar os valores de TI/2 e A, a meia vida de permanência tecidual / orgânica e interceptação da hora zero, respectivamente, da função.

[00235] A fração de partículas excretadas na urina ao longo do tempo foi estimada usando métodos previamente descritos. Burns, et al., Fluorescent Silica Nanoparticles with Efficient Urinary Excretion for Nanomedicine, Nano Letters 9, 442-8 (2009). Em resumo, os camundongos foram injetados i.v. com ou 200 μl de cRGDY-PEG-nanopartículas não marcadas ou PEG-nanopartículas, e amostras de urina colhidas durante um período de 168 horas (n = 3 camundongos por ponto do tempo). As concentrações de partículas em cada ponto do tempo foram determinadsa usando análises fluorométricas e uma curva de calibração de diluição serial gerada a partir de medições do sinal de fluorescência, corrigidas pelo fundo, de amostras de urina misturadas com concentrações de partículas conhecidas (% da DI). Os valores das concentra-ções, junto com as estimativas dos volumes urinários médios diários dos camundongos, foram em seguida usados para computar a % da DI/g de urina cumulativa excretada ao longo do tempo. De modo a avaliar a excreção fecal cumulativa, foram usadas gaiolas metabólicas para coletar as fezes durante um intervalo de tempo similar depois de injeção i.v. de 200 μl de 124I-cRGDY-PEG-nanopartículas (n = 4 camundongos por ponto do tempo). As atividades das amostras foram medidas usando um contador Y calibrado para 124I.

Dosimetria

[00236] Funções de tempo - atividade derivadas para cada tecido foram integradas analiticamente (com inclusão do efeito de decaimento radioativo) para produzir a atividade cumulativa correspondente (isto é, o número total de decaimentos radioativos). Em seguida foram calculadas as doses absorvidas pelos órgãos dos camundongos 124I multiplicando a atividade cumulativa pela dose de equilíbrio de 124I constante para radiações não penetrantes (pósitrons), presumindo completa absorção local de semelhantes radiações e ignorando a contribuição de radiações penetrantes (isto é, radiação Y). Eckerman, et al., Radionuclide Data and Decay Schemes, 2nd ed. Reston, Va.: Society of Nuclear Medicine; 1989. As atividades acumuladas pelos órgãos normais de camundongo foram convertidas para atividades acumuladas pelos órgãos normais humanos por ajuste para as diferenças no peso total e nas massas dos órgãos entre camundongos e seres humanos (Homem Padrão de 70 kg). Cristy, et al., Specific absorbed fractions of energy at various ages from internal photon sources (I-VII). Oak Ridge National Laboratory Report ORNL/TM-8381/V1-7. Springfield, Va.: National Technical Information Service, Dept of Commerce; 1987. As atividades acumuladas de órgãos normais humanos calculadas foram introduzidas no programa de computação da dosimetria OLINDA para calcular, usando o formalismo do Medical Internal Dosimetry (MIRD) Committee of the Society of Nuclear Medicine, as doses absorvidas por órgãos pelo Homem Padrão (Standard Man). Loevinger, et al., MIRD Primer for Absorbed Dose Calculations (Society of Nuclear Medicine, New York, 1991). Stabin, et al., OLINDA/EXM: the second- generation personal computer software for internal dose assessment in nuclear medicine. J Nucl Med. 46, 1023-1027 (2005).

Estudos da Toxicidade Aguda e Histopatologia

[00237] Foi realizado teste da toxicidade aguda em seis grupos de camundongos B6D2F1 machos e fêmeas (7 semanas de idade, Jackson Laboratories, Bar Harbor, Me.). O grupo de tratamento (n = 6 machos, n = 6 fêmeas) recebeu sonda direcionada não marcada (127I- RGDY-PEG-nanopartículas) e o grupo de controle (n = 6 machos, n = 6 fêmeas) recebeu PEG-nanopartículas iodadas não marcadas (veículo, 127I-RGDY-PEG-nanopartículas) em uma única injeção i.v. (200 μl). Controles não tratados (n = 2 machos, n = 2 fêmeas) foram adicionalmente testados. Os camundongos foram observados diariamente durante 14 dias pós injeção para sinais de morbidez / mortalidade e alterações do peso, e foi realizada autópsia, histopatologia, e amostragem de sangue para hematologia e avaliação da química do soro em 7 e 14 dias pós injeção (Figura 10 e Table 3).

Imagiologia por PET Serial de Direcionamento Tumoral-Específico

[00238] Foi realizada imagiologia usando um PET scanner de animais pequenos dedicados (Focus 120 microPET; Concorde Microsystems, Nashville, Tenn.). Camundongos carregando tumores de M21 ou M21L na pata traseira foram mantidas sob anestesia com 2% de isoflu- rano em oxigênio a 2 L/min durante todo o período do escaneamento. Aquisições em list-mode de uma hora foram iniciadas no momento da injeção i.v. de 200 μCi de 124I-cRGDY-PEG-nanopartículas ou 124I- PEG-nanopartículas em todos os camundongos, seguidas por imagens estáticas seriais por 30 min durante um intervalo de 96 horas. Os dados das imagens foram corrigidos para não uniformidade da resposta do scanner, perdas de contagem por tempo morto, contagens alea-tórias, e decaimento físico até o tempo de injeção. As taxas de contagem de Voxel nas imagens reconstruídas foram convertidas para concentrações de atividade (% da DI/g) por uso de um fator de calibração do sistema medido. Análise tridimensional da região de interesse (ROI) das imagens reconstruídas foi realizada por uso do software ASIPro (Concorde Microsystems, Nashville, Tenn.) para determinar a média, o máximo, e o desvio padrão de captação da sonda nos tumores. As proporções de concentração de atividade tumoral para muscular foram derivadas dividindo os valores de % da DI/g tumoral derivados por imagem pelos valores do contador Y de % da DI/g muscular.

Mapeamento Nodal Usando Imagiologia por Fluorescência NIR e Mi- croscopia Combinadas

[00239] Camundongos nude carregando tumores na pata traseira foram injetados por administração peritumoral nos 4 quadrantes, usando iguais volumes de uma amostra de 50 μl de cRGDY-PEG-dot e foram deixados para perambular livremente. Depois de um intervalo de 30 min a 1 horas, os camundongos foram anestesiados com uma mistura de 2% de isofluorine / 98% de oxigênio, e foi feita uma incisão de paramidlina superficial verticalmente ao longo do aspecto ventral do camundongo de modo a expor cirurgicamente a região da pata traseira até a axila ipsilateral ao tumor. Imagiologia ótica in situ de linfonodos locorregionais (isto é, inguinais, axilares) e linfáticos de drenagem (incluindo região axilar) foi realizada usando um microscópio de fluorescência macroscópica equipado com filtros de excitação NIR de 650 ± 20 nm e de emissão de passagem longa de 710 nm. Imagens óticas de corpo inteiro (Cambridge Research Instruments Maestro imager) foram adicionalmente adquiriras e deconvolvidas espectralmente con-forme reportado previamente. Burns, et al., Fluorescent Silica Nanoparticles with Efficient Urinary Excretion for Nanomedicine, Nano Letters 9, 442-8 (2009).

Análises Estatísticas

[00240] Análises estatísticas comparando grupos de camundongos com tumor recebendo sondas direcionadas / não direcionadas ou carregando tumores M21/M21L, foram realizadas usando um U teste de Mann-Whitney uni-caudado, com P<0,05 considerado estatisticamente significante. Para estudos da biodistribuição, os valores médios de % da DI/g tecidual-específica de 124I-cRGDY-PEG-(n = 7 camundongos) e 124I-PEG-nanopartículas (controle, n = 5 camundongos) foram comparados em cada ponto do tempo, com diferenças estatisticamente significantes nas atividades dos rastreadores observadas no sangue, no tumor, e em órgãos maiores em 4 e 96 horas pós injeção, bem como em 24 horas pós injeção para tumor e outros tecidos (Tabela 1). Para estudos de direcionamento para o tumor, diferenças em valores médios da % da DI/g entre camundongos com tumor M21 (n = 7) e M21L (n = 5), bem como camundongos recebendo sondas de controle (n = 5), foram consideradas como sendo máximas em 4 horas pós injeção (p = 0,0015 para ambos os controles), permanecendo significativamente elevados em 24 horas (p = 0,0015 e p = 0,004, respectivamente), 48 horas (p = 0,001 e p = 0,003, respectivamente), 72 horas (p = 0,015 e 0,005, respectivamente), e 96 horas (p = 0,005 para M21- M21L). As propoções de tumor para músculo para 124I-cRGDY-PEG- nanopartículas (n = 7) versus 124I-PEG-nanopartículas (n = 5) foram consideradas como sendo estatisticamente significantes em 24 horas pós injeção (p = 0,001) e 72 horas pós injeção (p = 0,006), mas não em 4 horas pós injeção (p = 0,35). A bondade dos valores de ajuste (R2), junto com seu p valores associados, foram determinadas para a curva de calibração urinária (R2 = 0,973, p = 0,01), bem como para a % da DI das curvas de excreção cumulativa urinária (R2>0,95, p = 0,047) e fecal (R2>0,995, p<0,002) usando análise de regressão não- linear (SigmaPlot, Systat, v. 11.0).

Resultados Esquema e Caracterização das Nanopartículas

[00241] Nanopartículas de sílica de núcleo e concha encapsulando corante Cy5 (emissão máxima >650 nm), revestidas com cadeias de polietileno glicol (PEG) (PEG ~0,5 kDa) terminadas com metóxi, foram preparadas de acordo com protocolos previamente publicados. Burns, et al., Fluorescent Silica Nanoparticles with Efficient Urinary Excretion for Nanomedicine, Nano Letters, 9, 442-8 (2009). Ow, et al., Bright and stable core-shell fluorescent silica nanoparticles. Nano Lett. 5, 113-117 (2005). O revestimento de PEG neutro preveniu captação inespecífica pelo sistema retículo endotelial (opsonização). O uso de PEGs bifunci- onais permitiu a fixação de pequenos números (~6 a 7 por partícula) de ligantes de peptídeos cíclicos de arginina-glicina-ácido aspártico (cRGDY) de direcionamento de αvβ3 integrina para manter um pequeno tamanho hidrodinâmico facilitando o eficiente clearance renal. Ligantes de peptídeos foram adicionalmente marcados com 124I através do uso de um encadeador de tirosina para proporcionar um sinal o qual pode ser avaliado quantitativamente por imagens em três dimensões por PET (124I-cRGDY-PEG-dots, Figura 6A); uma importante vantagem prática de 124I de vida relativamente longa (meia-vida física: 4,2 dias) é que sinal suficiente persiste por bastante tempo para permitir radiodetecção até no mínimo vários dias pós administração, quando a atividade de fundo claredou em grande parte e é maximizado o contraste entre tumor para fundo. A pureca da nanopartícula direcionada radiomarcada foi >95% por cromatografia de radio camada fina. A estabilidade da nanopartícula direcionada não-radiomarcada é de cerca de 1 ano por medições por FCS. A partícula é excretada intacta na urina por análises por FCS. Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, "dot" e "nanopartícula" são usados de modo intercambiável. Uma partícula revestida com PEG contendo um resíduo tirosina para marcação por 124I serviu como a sonda de controle (124I-PEG-dots). Purificação das amostras radiomarcadas por cromatografia de exclusão de tamanho (Figura 7) resultou em produções radioquímicas de >95%. Diâmetros hidrodinâmicos de ~7 nm de diâmetro interno (i.d.) foram medidos para cRGDY-PEG-dots e PEG-dots não-radioativos por espectroscopia de correlação da fluorescência (FCS) (Figuras 6B e 6C). O brilho relativo dos cRGDY-PEG-dots foi determinado, em média, como sendo 200% maior do que o do corante livre (Figura 6C), consistente com resultados anteriores. Burns, et al., Fluorescent Silica Nanoparticles with Efficient Urinary Excretion for Nanomedicine, Nano Letters, 9, 442-8 (2009). Larson, et al., Silica nanoparticle architecture determines radiative properties of encapsulated chromophores. Chem. Mater. 20, 2677-2684 (2008). Com base nestas propriedades fisico- químicas, nós previmos a obtenção de um equilíbrio favorável entre captação e retenção tumorais seletivas versus clearance renal da partícula direcionada, deste modo maximizando a localização para o tecido alvo ao mesmo tempo que minimizando a toxicidade para os tecidos normais e as doses de radiação.

Estudos de Ligação de Receptores In Vitro

[00242] De modo a examinar a afinidade de ligação e a especificidade in vitro de 124I-cRGDY-PEG-dots e 124I-PEGdots a superfícies en- doteliais vasculares e tumorais, foram usadas linhagens de células de melanoma superexpressando αvβ3 integrina (M21) e não expressando αvβ3 integrina (M21L) e de células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs). Ligação linear e saturável altamente específica dos cRGDY-PEG-dots foi observada sobre uma faixa de concentrações de partículas (0 a 8 ng/ml) e tempos de incubação (até 5 horas), com máxima ligação diferencial em 4 horas e ~2,0 ng/ml de concentração de partículas (dados não mostrados) usando citometria de fluxo. A especificidade de ligação de receptor de dots de 124I-cRGDY-PEG foi testada usando métodos de contagem de radiação Y depois de incubação inicial de células M21 com excesso de cRGD não-radiomarcado e em seguide adicionando várias concentrações da sonda direcionada radi- omarcada (Figura 8A). Análise de Scatchard dos dados de ligação produziu uma constante de equilíbrio de m dissociação, Kd, de 0,51 nM (Figura 8A, inserção) e concentração de receptor, Bmax, de 2,5 pM. Com base no valor da Bmax, a densidade do receptor de αvβ3 integrina foi estimada como sendo de 1,0x104 por célula M21, em razoável concordância com a estimativa previamente publicada de 5,6x104 para esta linhagem celular. Cressman, et al., Binding and uptake of RGD-containing ligands to cellular αvβ3 integrins. Int J Pept Res Ther. 15, 49-59 (2009). Aumentos incrementais na captação de células M21 integrina-específicas também foram observados sobre uma faixa de temperatura de 4 a 37° C., sugerindo que internalização celular mediada por receptor contribuiu para a captação total (dados não mostrados). Estudos adicionais de ligação competitiva usando a sonda direcionada mostraram completo bloqueio de ligação mediada por receptor com anticorpo anti-αvβ3 integrina (Figura 8B) por citometria de fluxo. Não foi vista redução significativa na magnitude de ligação de receptor (~10% de M21) com células M21L (Figura 8C) usando ou excesso de cRGDY ou anticorpo anti-αvβ3 integrina. Estes resultados foram con-firmados por estudos de contagem Y adicional, e uma concentração de inibição da ligação de 50%, IC50, de 1,2 nM foi determinada para o 124I-cRGDY-PEG-dot. Um fator de reforço multivalente associado de mais do que 2,0 foi encontrado para o cRGDY-PEG-dot em relação ao peptídeo cRGD monomérico usando um teste anti-adesão e células M21 (dados não mostrados). Montet, et al., Multivalent effects of RGD peptides obtained by nanoparticle display. J Med Chem. 49, 6087-6093 (2006). Li, et al., 64Cu-labeled tetrameric and octomeric RGD peptides for small-animal PET of tumor αvβ3 integrin expression. J. Nucl Med. 48, 1162-1171 (2007). De modo similar a células M21, excesso de anticorpo bloqueou de modo eficaz a ligação de receptor de cRGDY- PEG-dot a células HUVEC por citometria de fluxo (Figura 8D).

Estudos da Biodistribuição e do Clearance

[00243] A biodistribuição dependente do tempo, bem como o clearance renal e hepatobiliar foram avaliados por administração por via intravenosa de doses de rastreadores (~0,2 nanomoles) de 124I- cRGDY-PEGdots e 124I-PEG-dots a modelos de camundongo de xeno- enxerto de tumor M21 (Figura 9). Embora as concentrações de atividade tecidual (percentagem da dose injetada por grama (% da DI/g)) para a sonda direcionada tivessem sido medidas durante um intervalo de tempo de 196 horas pós injeção (p.i.), a comparação dos rastreado- res de 124I-cRGDY-PEGdot (Figura 9A) e 124I-PEG-dot (Figura 9B) foi restrita a uma janela de 96 horas, uma vez que os dados para o último não foram adquiridos na semana 1. Diferenças estatisticamente signi- ficantes (p<0,05) nas atividades dos rastreadores foram observadas para o sangue, o tumor, e os órgãos maiores em 4 e 96 horas pós injeção, bem como em 24 horas pós injeção para o tumor e vários outros tecidos (Tabela 1). A sonda direcionada foi quase inteiramente eliminada da carcaça em 1 semana pós injeção (~3% da DI). As meias vidas de permanência (TI/2) para o sangue, o tumor, e os órgãos maio-res para estes rastreadores são mostradas na Tabela 2 (colunas 2 e 5). Uma série de dados representativos (permanência no sangue) é mostrada na inserção da Figura 9A. Um valor da T1/2 no sangue relativamente longo de 7,3 ± 1,2 horas foi determinado para o 124I-PEG-dot. Depois de fixação do peptídeo cRGDY para sintetizar o 124I-cRGDY- PEG-dot, o valor da T1/2 diminui ligeiramente para 5,6 ± 0,15 horas, porém foi acompanhado por maior biodisponibilidade da sonda (Tabela 2, coluna 3). O valor da T1/2 do tumor para o 124I-cRGDY-PEG-dot foi considerado como sendo cerca de 13 vezes maior do que o para o sangue, versus somente uma diferença de 5 vezes para o 124I-PEG-dot (Tabela 2, colunas 2 e 5).TABELA 1p-valores de estudo de biodistribuição comparando 124I-cRGDY-PEG- e 124I-PEG-dots. T TABELA 2

[00244] Por apropriada translação ajustada pela massa dos dados de biodistribuição precedentes para o homem, as doses de radiação dos órgãos normais humanos foram derivadas e foram consideradas comparáveis às de outros radiotraçadores diagnósticos comumente usados (Tabela 2, colunas 8 e 9). Junto com a descoberta de que a sonda direcionada não foi tóxica e não resultou em efeitos patológicos tecido-específicos (isto é, nenhuma toxicidade aguda) (Figura 10 e Ta-bela 3), são planejadas aplicações de imagiologia molecular direcionada e não direcionada pela primeira vez no homem com estes agentes. TABELA 3 N: normal, U: Não disponíveis, NP: não presente, 1: mínima, 2: branda F: focal, MF: multifocal

[00245] Em outro estudo para confirmar que os pontos de 127I-RGD- PEG são não tóxicos depois de administração intravenosa em camundongos, foi realizado teste de toxicidade de dose única formal durante o curso de 2 semanas usando pontos de 127I-RGD-PEG (127I-RGD- PEG dots) em cerca de 100 vezes da dose humana equivalente. Os pontos de 127I-PEG (127I-PEG dots) serviram como a partícula de controle. Em resumo, o procedimento foi como se segue. Vinte e oito camundongos B6D2F1 de 8 semanas de idade foram usados no estudo de toxicidade aguda e foram divididos em um grupo de tratamento e um grupo de controle. O grupo de tratamento (n=6 machos + 6 fêmeas) recebeu uma dose de nanopartículas de sílica RGD 127I- PEGquiladas em uma dose de 1x10-9 moles/ camundongo por via intravenosa, e o grupo de controle (n=6 machos + 6 fêmeas) recebeu a mesma quantidade de veículo. Dois camundongos / grupo (um macho e uma fêmea / grupo) foram sacrificados no dia 7 pós dose e foram realizadas na autópsia química clínica, hematologia e histopatologia tecidual específica. Todos os animais remanescentes (n=5 machos + 5 fêmeas / grupo) foram observados por 14 dias depos do tratamento. Quatro camundongos não tratados (dois machos e duas fêmeas) foram usados como referência. A conclusão dos estudos foi que não fo ram observados eventos adversos durante dosagem ou durante o período de observação de 14 dias. Não foi observada mortalidade ou morbidez. As observações clínicas incluíram a ausência dos seguintes: anemia, perda de peso, agitação, aumento da respiração, distúrbio gastro intestinal, comportamento anormal, disfunção neurológica, anormalidades na hematologia, anormalidades nas químicas clínicas, ou lesões relacionadas com o fármaco em termos de patologia dos órgãos. Portanto, umaúynica injeção de nanopartículas de sílica RGD 127I-PEGuiladas e 1xio—9 moles/ camundongo, uma dose equivalente a um excesso de 100 vezes a dose de nanopartículas de sílica RGD PEGuiladas requeridas para estudos de imagiologia de Fase 0, é segura e não tóxica em camundongos B6D2F1.

[00246] Foi encontrada eficiente excreção renal para as sondas di-recionadas e não direcionadas de ~7 nm de diâmetro durante um período de tempo de 168 horas por análises fluorométricas de amostras de urina. Os sinais de fluorescência foram corrigidos pelo fundo e convertidos para concentrações de partículas (% da DI/μl) com base em um esquema de calibração da diluição serial (Figura 9C, inserção; Tabela 4, coluna 2). Burns, et al., Fluorescent Silica Nanoparticles with Efficient Urinary Excretion for Nanomedicine, Nano Letters, 9, 442-8 (2009). Os valores da concentração, junto com estimativas conservadoras dependentes da idade da taxa de excreção urinária média, permitiram que fosse computada a % da DI excretada cumulativa (Tabela 4, coluna 4). Drickamer, Rates of urine excretion by house mouse (mus domesticus): differences by age, sex, social status, and reproductive condition. J. Chem. Ecol. 21, 1481-1493 (1995). Observou-se que quase metade da dose injetada (cerca de 43% da DI) foi excretada durante as primeiras 24 horas pós injeção e ~72% da DI por volta de 96 horas, Figura 9C), sugerindo que a maior parte da excreção tinha ocorrido no primeiro dia pós injeção. Não pôde ser detectada fluorescência de partícula significativa na urina 168 horas pós injeção Os perfis de excreção fecal do 124I-cRGDY-PEG-dot indicaram que, em média, 7% da DI e 15% da DI da dose injetada foi eliminado durante 24 e 96 horas, respectivamente (Figura 9D). Análise por FCS de amostras de urina obtidas em múltiplos pontos do tempo depois de injeção da sonda direcionada revelaram que a partícula foi excretada intacta e sem libe-ração do corante encapsulado (dados não mostrados).TABELA 4Concentração Urinária e Dados de Excreção Cumulativa

Estudos por PET de Corpo Inteiro Serial

[00247] Imagiologia por PET scan da expressão de integrina em modelos de camundongo de xenoenxerto subcutâneo de M21 e M21L na pata traseira foi realizada em múltiplos pontos do tempo pós injeção depois de injeção i.v. de 124I-cRGDY-PEG-dots ou 124I-PEG-dots (controle). Imagens por microPET coronal de corpo inteiro representativas em 4 horas (esquerda: tumor de M21; meio: tumor de M21L) e 24 horas (direita: tumor de M21) pós injeção são mostradas na Figura 11A. O direcionamento específico do tumor M21 superexpressando αvβ3 integrina é claramente visível a partir destas imagens. A % da DI/g tumoral média e os desvios padrão são mostrados para grupos de tumores de M21 (n = 7) e de M21L (controle) (n = 5) recebendo os 124I- cRGDY-PEG-dots direcionados, bem como para camundongos com tumor de M21 (n = 5) recebendo rastreador de 124I-PEG-dot não- direcionado (Figura 11B). No momento da máxima captação tumoral (~4 horas pós injeção), foram vistos aumentos de três vezes na con-centração de atividade (em % da DI/g) nos tumores de M21 em relação aos controles. As diferenças foram estatisticamente significantes em todos os pontos do tempo pós injeção (p<0,05) com exceção de em 1 hora (p = 0,27).

[00248] As proporções de captação (% da DI/g) tumoral para muscular derivadas por imagem para os 124I-cRGDY-PEG-dots revelaram aumento do contraste tumoral nas horas posteriores (~24 a 72 horas pós injeção), ao passo que para 124I-PEG-dots declinaram (Figura 11C). Este achado sugeriu que 124I-cRGDY-PEG-dots foram, de fato, tumor- seletivos, o que se torna mais evidente à medida que a atividade no sangue foi clareada durante o período de 24 horas inicial (comparar a Figura 11C com inserção da Figura 9A). Uma correlação estatisticamente significante foi encontrada entre os valores da % da DI/g tecidual de tumores derivados por PET tanto para 124I-cRGDY-PEG-dots quanto para 124I-PEG-dots, e os valores da % da DI/g do tumor contado por radiação Y ex vivo correspondente (coeficiente de correlação r=0,94, P<0,0016; Figura 11D), confirmando a precisção de PET para dados de biodistribuição quantitativa derivados não-invasivamente.

Imagiologia por Fluorescência Próxima ao Infravermelho In Vivo e Mi- croscopia

[00249] Nós realizamos estudos de imagiologia in vivo por fluorescência usando nossas nanopartículas pequenas direcionadas para mapeamento dos linfonodos locais / regionais e dos canais linfáticos, deste modo superando a limitação precedente. De modo importante, a natureza multimodal e o pequeno tamanho de nossa sonda de partículas direcionadas podem ser explorados para visualizar uma faixa de tamanhos nodais e de ramificações linfáticas em nosso modelo de me- lanoma depois de administração peritumoral em 4 quadrantes, simulando procedimentos de mapeamento de linfonodo sentinela humano intraoperatório. Inicialmente, microscopia por fluorescência próxima ao infravermelho serial foi realizada em camundongos intactos durante um período de tempo de 4 horas usando ou as sondas de partículas direcionadas ou não-direcionadas. Administração peritumoral da sonda direcionada revelou drenagem para dentro e persistente visualização de linfonodos adjacentes inguinais e popliteais durante este intervalo, com linfonodos e linfáticos menores e/ou mais distantes mais difíceis de visualizar. Em contraste, a sonda não direcionada produziu visualização de termo mais curto (~1 hora) de linfonodos locais com sinal de fluorescência progressivamente mais fraco observado (dados não mostrados). Depois de exposição cirúrgica, esta observação foi consi-derada como sendo o resultado de difusão de partículas mais rápida do sítio tumoral, em comparação com a prolongada retenção observada com a sonda direcionada.

[00250] Em seguida nós realizamos mapeamento de linfonodo re-presentativo sobre múltiplas escalas espaciais usando imagiologia ótica de corpo inteiro em animal vivo (Figura 12A) e técnicas de microscopia por fluorescência próxima ao infravermelho (Figura 12B) para visualizar a drenagem linfática a partir da região peritumoral para os linfonodos inguinais e axilares em animais vivos cirurgicamente expostos. Além disso, imagens de fluorescência de maior resolução (Figura 12B, seta inferior) permitiram que fosse visualizada a arquitetura intra- nodal com mais detalhes, incluindo vênulas endoteliais altas, as quais facilitam a passagem de linfócitos naive circulantes para dentro do linfonodo, e as quais podem ter importantes implicações para o estagia- mento nodal e a capacidade para detectar micrometástases em estágios de doença anteriores. Também foram visualizadas ramificações linfáticas menores, e menos intensas por microscopia por fluorescên- cia na região axilar (dados não mostrados). Portanto, o pequeno tamanho da sonda direcionada não somente permite que seja visualizada a primeira drenagem (ou linfonodo sentinela), proximal ao tumor, mas também permite a visualização de linfonodos mais distantes e que seja visualizado o padrão de drenagem linfática.

Discussão

[00251] Nós reportamos sobre nanopartículas de sílica não tóxicas, de alta afinidade, e clareadas de modo eficaz para direcionamento tumor-seletivo e nodal tumor-seletivo mapeamento, tendo tratado com sucesso uma série de desafios atuais associados com outras tecnologias de partícula. Esta é a primeira nanopartícula direcionada que, com base em suas propriedades favoráveis, pode-se dizer que é tra- duível clinicamente como uma sonda ótica-PET combinada. A natureza complementar desta sonda multimodal, acoplada com seu pequeno tamanho (~7 nm de diâmetro), pode facilitar a avaliação clínica permi-tindo a integração sem emenda de dados de imagiologia adquiridos em diferentes escalas espaciais, temporais, e de sensibilidade, poten-cialmente proporcionando novos insights nos processos moleculares fundamentais que governam a biologia tumoral.

[00252] Nossos resultados in vitro mostram especificidade de ligação de receptor das sondas de partículas de ~7 nm direcionadas para células M21 e HUVEC. Achados similares foram reportadas com testes de ligação de receptor usando os mesmos tipos de céluals, mas com a forma monovalente do peptídeo. Cressman, et al., Binding and uptake of RGD-containing ligands to cellular αvβ3 integrins. Int J Pept Res Ther. 15, 49-59 (2009). De modo importante, o reforço multivalên- cia da sonda de partícula ligada a cRGDY, junto com os valores da T1/2 de duração da permanência no sangue e tumoral estendidos, são propriedades chave associadas com a plataforma de partículas que não são encontradas com a forma monovalente do peptídeo.

[00253] O valor da T1/2 no sangue relativamente longo de 7,3 ± 1,2 horas estimado para o rastreador de 124I-PEG-dot pode estar relacionado com a superfície revestida com PEG quimicamente neutra, tornando a sonda biologicamente inerte e significativamente menos suscetível a fagocitose pelo sistema retículo endotelial. Foi visto que uma redução semelhante nos valores da T1/2 até 5,6 ± 0,15 horas encontrada para o rastreador de 124I-cRGDY-PEG-dot é mais provavelmente o resultado do reconhecimento por integrinas alvo e/ou atividade de ma- crófagos mais ativos. No entanto, é substancialmente mais longa do que os valores da T1/2 no sangue publicados dos rastreadores de peptídeos cRGDY existentes (~13 minutos), e resulta em maior biodispo- nibilidade da sonda, facilitando o direcionamento tumoral e produzindo maiores captações tumorais durante períodos de tempo mais longos. Montet, et al., Multivalent effects of RGD peptides obtained by nanoparticle display. J Med Chem. 49, 6087-6093 (2006). Além disso, o valor da T1/2 tumoral para o 124I-cRGDY-PEG-dot foi cerca de 13 vezes maior do que o para o sangue, versus somente uma diferença de cinco vezes para o 124I-PEG-dot, sugerindo localização no tecido alvo substancialmente maior do primeiro do que do último. As referidas interpretações mecanísticas dos dados in vivo podem ser exploradas de modo a refinar o diagnóstico clínico, o planejamento do tratamento, e os protocolos de monitoramento do tratamento.

[00254] Os resultados deste estudo salientam as claras vantagens de corte oferecidas por PET, uma ferramenta de imagiologia poderosa, quantitativa, e altamente sensível para extrair informação molecular de modo não invasivo relacionada com os níveis de expressão de recep-tores, com a afinidade de ligação, e com a especificidade. A maior acumulação e o clearance mais lento dos tumores de M21, em relação às estruturas normais em torno, permite a discriminação de mecanismos de captação tumoral específicos de mecanismos inespecíficos (isto é, perfusão tecidual, vazamento) em tecidos normais. Um pequeno componente de captação do tumor M21, no entanto, presumivelmente pode ser atribuído às alterações da permeabilidade vascular (isto é, aumento da permeabilidade e efeitos de retenção). Seymour, Passive tumor targeting of soluble macromolecules and drug conjugates. Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 9, 135-187 (1992). Este modo de captação inespecífico reflete uma porção relativamente pequena da captação tumoral total em pontos do tempo pós injeção iniciais com base nos aumentos da % da DI/g observados em camundongos recebendo o rastreador de controle (124I-PEG-dots, Figura 11B). Em 1 horas pós injeção, não foram vistos aumentos significantivos da % da DI/g nos tumores de M21 em relação aos controles. Esta observação pode refletir os efeitos de perfusão diferencial na primeira hora, com acumulação e retençãois tumoral essencialmente vistas em tempos pós injeção posteriores (isto é, 24 horas). Adicionalmente, em comparação com o rastreador de peptídeo clinicamente aprovado, 18F- galacto RGD, foi visto quase duas vezes mais captação em tumores de M21 para os 124I-cRGDY-PEG-dots34, enquanto adicionalmente oferecendo vantagens de ligação multivalente, tempos de circulação sanguínea prolongados, e maios clearance renal.

[00255] Uma vantagem de uma sonda ótica-PET combinada é a capacidade para avaliar estruturas anatômicas tendo tamanhos em ou bem abaixo do limite de resolução do PET scanner (isto é, o chamado efeito de volume parcial), o qual pode comprometer a detecção e a quantificação da atividade em lesões. Por exemplo, em modelos de animais pequenos, a avaliação de doença metastática em pequenos linfonodos locais / regionais, importante clinicamente para o estagia-mento e o tratamento do melanoma, pode não ser resolvida adequa-damente por imagiologia por PET scan, dado que o tamanho dos linfo-nodos observados são tipicamente da ordem de resolução espacial do sistema (1 a 2 mm). Utilizando uma segunda modalidade de imagiologia complementar e sensível, imagiologia por fluorescência próxima ao infra-vermelho (NIR), podem ser obtidos mapas funcionais revelando doença nodal e padrões de drenagem linfática. Ballou, et al., Sentinel lymph node imaging using quantum dots in mice tumor models. Bioconjugate Chem. 18, 389-396 (2007). Apesar de estudos adicionais investigando a distribuição de fluorescência de cRGDY-PEG-dot intra- nodal em relação a focos metastáticos sejam necessários de modo a determinar se pode ser obtida localização sensível de semelhantes focos, estes resultados claramente demonstram as vantagens de se trabalhar com uma sonda ótica-PET combinada semelhante.

[00256] Na clínica, os benefícios de uma plataforma combinada semelhante para o estagiamento e o tratamento tumorais não podem ser exagerados. O prolongado tempo de circulação sanguínea e a bio- disponibilidade resultante desta nano-sonda salienta seu uso como uma ferramenta versátil tanto para monitoramento precoce quanto de longo termo dos vários estágios do manejo da doença (diagnóstico por triagem, avaliação pré-tratamento, intervenção terapêutica, e monitoramento pós-tratamento) sem restrições impostas por considerações de toxicidade. Uma importante vantagem adicional é que enquanto sondas rapidamente clareadas podem ser úteis para determinadas aplicações onde a própria localização do tecido é rápida, a localização de muitos agentes frequentemente é mal vascularizada e de outro modo tumores sólidos relativamente inacessíveis provavelmente serão lentos depois de administração sistêmica. Portanto, a presente plataforma de nanopartículas expande a gama de aplicações dos agentes referidos, uma vez que a cinética da localização do tecido alvo não é mais limitante. Além do mais, linfonodos profundos podem ser mapeados por PET em termos de sua distribuição e de seu número ao passo que a localização mais precisa e detalhada de linfonodos superficiais pode ser obtida por imagiologia por fluorescência próxima ao infraver-melho. Finalmente, a permanência relativamente prolongada da sonda direcionada no tumor em relação à no sangue, além de seu reforço multivalência, pode ser explorada para futuras aplicações teranósticas como um radioterápico ou um veículo de liberação de fármaco.

Exemplo 5 Nanopartículas de Sílica Fluorescente Conjugadas com Peptídeo de Direcionamento para αvβ3 Integrina e/ou Peptídeo de Direcionamento para uMUC1 (Modelos de Câncer da Tiroide e Carcinoma Celular Escamoso (SCC))

[00257] Um peptídeo cRGD (Peptides International), tendo uma funcionalidade de extremidade cisteína, será anexado à nanopartícula PEG-uilada através de uma ligação de tiol-maleimida. As nanopartículas podem ser opcionalmente adicionalmente funcionalizadas por um ligante peptídico sintético, EPPT1. As nanopartículas serão caracterizadas com base no tamanho de partícula, na distribuição de tamanho, e na fotodegradação.

Caracterização de Conjugados de Nanopartículas-Peptídeos

[00258] Para avaliação das propriedades fotofísicas em uma base por partícula, espectrofotometria, espectrofluorometria, e espectros- copia de correlação da fluorescência (FCS) multifótons será usada para determinar o tamanho de partícula, o brilho, e a distribuição de tamanho. Dados de tamanho serão corroborados por varredura por microscopia eletrônica e medições por dispersão da luz dinâmica (DLS). Ow et al. Bright and stable core-shell fluorescent silica nanoparticles. Nano Letters 2005; 5, 113. O número médio de peptídeos RGD por nanopartícula e a eficiência de ligação de RGD a grupamentos PEG funcionalizados serão avaliados colorimetricamente sob condições alcalinas e métodos espectrofotométricos de Biuret (À = 450 nm, absorvência máxima).

[00259] Os conjugados de nanopartículas serão iodados através de encadeadores de tirosina de modo a criar uma forma radiomarcada (124I)(TI/2 ~4 dias) e estável (127I) usando Iodogen (Pierce, Rockford, Ill.). O produto final será purificado usando cromatografia de exclusão de tamanho.

Avaliação da Especificidade de Direcionamento In Vitro e de Padrões de Biodistribuição das RGD- e RGD-EPPT-Nanopartículas.

[00260] Os padrões de expressão de αvβ3 integrina e uMUC1 em linhagens celulares da tiroide e de carcinoma celular escamoso (SCC) serão avaliados contra controles αvβ3 integrina-negativos e αvβ3 inte- grina-positivos (linhagens celulares de melanoma humano M21-L e M21, respectivamente) e uMUC1-negativos e uMUC1-positivos (linhagens celulares de U8728, H-29, respectivamente) conhecidos usando anticorpos anti-integrina e anti-uMUC 1. Linhagens celulares altamente expressando αvβ3-integrina e/ou MUC1 serão selecionadas para estudos de ligação diferencial com RGD- e RGD-EPPT-nanopartículas, bem como para imagiologia in vivo.

[00261] Testes de ligação celular quantitativa vão avaliar a eficiência de marcação de células tumorais, e estudos de biodistribuição vali- ando a captação no tumor, nos órgãos, e nos fluidos serão realizados usando conjugados de nanopartículas radioiodadas (124I-RGD- nanopartículas, 124I-RGD-EPPT-nanopartículas). De modo a comparar os dados de captação por PET de conjugados de nanopartícula com os observados inicialmente usando imagiologia ótica por NIRF, cada conjugado de nanopartículas também vai ser iodado para criar uma forma radiomarcada (124I) e estável (127I).

[00262] Microscopia por Fluorescência com RGD- e RGD-EPPT-C- dots. A ligação diferencial de RGD-nanopartículas e RGD-EPPT- nanopartículas a linhagens celulares de carcinoma da tiroide / SCC altamente expressando αvβ3-integrina e/ou MUC1, versus linhagens e controle será visualizada por microscopia por fluorescência.

[00263] Modelos animais. Todos os experimentos com animais serão feitos de acordo com protocolos aprovados pelo Institutional Animal Care and Use Committee e seguindo as diretrizes da NIH para bem estar dos animais.

[00264] Biodistribuição In vivo: Camundongos nude atímicos machos (6 a 8 semanas de , n = 5 por tumor) serão injetados por via subcutânea (s.c.) em ambos os flancos com tumores negativos / positivos para integrina ou negativos / positivos para uMUC1 de diferentes origens de tecido (n = 3/ cada tumor). Em 0,5 cm de diâmetro (i.d.), os camundongos vão ser injetados por via intravenosa (IV) com conjugados de nanopartículas com etiqueta de 124I (~500 nm/kg). Os animais são sacrificados em 0,5, 1, e 24 horas depois, com remoção dos tumores, dos órgãos, e dos fluidos para pesagem e contagem (contador gama). Os resultados de biodistribuição serão expressados como a percentagem da dose injetada por grama de tecido.

[00265] Teste de Ligação Celular Quantitativa. A eficiência da marcação será avaliada incubando números fixos de células de carcinoma altamente expressando αvβ3-integrina e/ou MUC1, com concentrações pré-selecionadas de conjugados de nanopartículas com etiqueta de 124I por 1 hora em uma atmosfera de CO2 umidificada a 37° C. As células são extensivamente lavadas, lisadas com 0,1% de Triton X, com os lisados celulares contados em um contador gama.

Avaliação de Diferenças Relativas no Direcionamento Tumor- Específico Usando Imagiologia Multimodalidade (PET-NIRF) In Vivo.

[00266] Como uma ferramenta de diagnóstico por triagem de alta produtividade, imagiologia por NIRF ótica pode ser usada para avaliar as diferenças relativas na biodistribuição de conjugados de nanopartículas progressivamente funcionalizadas in vivo com aumentadas sensibilidade e resolução temporal. Dados semiquantitativos sobre direcionamento tu mor-específico também podem ser derivados. Estes estudos preliminares facilitam a seleção de linhagens celulares fortemente expressando mar-cadores de interesse para quantificação detalhada adicional da biodistri- buição e de direcionamento tumor-específico usando PET.

[00267] Imagiologia ótica por NIRF e microPET® de corpo inteiro será realizada durante um período de 1 semana de modo a avaliar a captação diferencial em tumores do flanco. Os resultados destes estudos serão validados com microscopia por fluorescência de tumores ex vivo.

[00268] Imagiologia por NIRF In Vivo Serial. Os camundongos serão injetados bilateralmente com células negativas para αvβ3 integrina e positivas para αvβ3 integrina ou com células negativas para uMUC1 e positivas para uMUC1 (n = 5/ tumor). Depois dos tumores atingirem ~0,5 cm de diâmetro interno (i.d.), conjugados de nanopartículas estáveis iodados e não iodados (RGD, 127I-RGD, RDG-EPPT, 127I-RGD- EPPT) serão injetados IV. Imagiologia serial será realizada usando o sistema de imagiologia por fluorescência in vivo Maestro® (Maestro® In Vivo Fluorescence Imaging System) (CRI, Woburn, Mass.) em 0, 0,5, 1, 2, 4, 6, 12, e 24 horas. Em 24 horas, os camundongos são eu- tanizados, e os tecidos / órgãos maiores são dissecados, pesados, e colocados em placas de 6 cavidades para imagiologia ex vivo. A emissão de fluorescência será analisada usando regiões de interesse (ROIs) em relação a tumor, tecidos selecionado, e injetados de referência, empregando algoritmos de desmisturas espectrais para eliminar a autofluorescência. Dividindo as intensidades de fluorescência média dos tecidos pelos valores dos injetados vai permitir que sejam feitas comparações entre os vários tecidos / órgãos para cada conjugado de nanopartículas injetado.

[00269] Aquisição por Imagiologia por MicroPET Dinâmica e Análise. Dois grupos de camundongos portadores de tumor (n = 5/ tumor) vão ser injetados com conjugados de nanopartículas radiomarcados com 124I (radiotraçadores), e imagiologia por PET dinâmica será realizada por 1 hora usando um Focus 120 microPET® (Concorde Microsystems, TN). Aquisições em list-mode de uma hora são iniciadas no momento da injeção IV de ~25,9 MBq (700 μCi) de radiotraçadores. Os dados do list-mode resultantes são reconstruídos em uma matriz de 128x128x96 poro retro-projeção filtrada. Análise ROI das imagens reconstruídas é realizada usando o software ASIPro® (Concorde Microsystems, TN) para determinar a captação de radiotraçador (% da DI/g) média e o desvio padrão em tumores, outros órgãos / tecidos, e no ventrículo esquerdo (LV). Dados adicionais serão obtidos a partir de imagens estáticas nos pontos do tempo de 24, 48, e 72 horas pós injeção. Um modelo cinético de três compartimentos, de quatro parâmetros será usado para caracterizar o comportamento do rastreador in vivo. Para esta análise, o input arterial é medido usando uma região de interesse (ROI) colocada sobre o ventrículo esquerdo.

Exemplo 6 Mapeamento Nodal em Mini porco

[00270] Varredura intraoperatória em tempo real da bacia nodal não pode ser realizada na prática no presente momento, uma vez que estes sistemas geralmente são caros e complicados demais para uso na sala de cirurgia ou podem não ser capazes de proporcionar o campo de visão ou o contraste de tecido necessários. Adicionalmente, não há agentes contendo fluoróforo bioestáveis, clinicamente promissores, que ofereçam aprimoradas características fotofísicas e vidas úteis na circulação mais longas em relação aos corantes de origem, disponíveis para reforçar o contraste tecidual para procedimentos prolongados de mapeamento nodal / ressecção. Com este estudo em animais, nós vamos mostrar que avanços tanto em sondas de partículas multi- modais quanto em tecnologias de dispositivos de imagiologia molecular em tempo real podem ser prontamente traduzidos para uma varie- dade de testes clínicos humanos futuros. As referidas tecnologias transformativas podem impactar significativamente o atendimento ao câncer intraoperatório de rotina proporcionando ferramentas de visua-lização direcionada do estado da arte para facilitar a detecção de linfo-nodo sentinela metastático e permitindo a precisa delineação de um ou mais linfonodos a partir da anatomia adjacente de modo a minimizar o risco de lesão para estruturas cruciais. Os benefícios incluem mapea-mento intraoperatório em tempo real in vivo prolongado da disseminação doença de nodal e da extensão tumoral para cabeça e pescoço. Linfonodos profundos podem ser mapeados por PET, enquando a lo-calização precisa e detalhada de linfonodos superficiais pode ser obtida por imagiologia por fluorescência próxima ao infra-vermelho. O pequeno tamanho da sonda de partícula também pode prolongar o limite inferior de tamanhos nodais que podem ser detectados sensivelmente. O efeito líquido da plataforma multimodal não tóxica proposta, junto com a aplicação de procedimentos de diagnósticoo / tratamento combinados, tem importantes implicações para o estagiamento de doença, para o prognóstico, e para o resultado clínico para esta doença altamente letal.

Alvo da Doença.

[00271] Além de melanoma, uma série de outros tumores (isto é, de mama, pulmão, e cérebro) superexpressam receptores de αvβ3 integrina e podem servir como alvos de doença. O melanoma metastático tem um prognóstico muito ruim, com uma sobrevida mediana de menos de 1 ano. O sucesso do tratamento se baseia na identificação precoce com excisão cirúrgica adequada do câncer. A remoção cirúrgica da doença primária, a triagem, e o tratamento para disseminação para linfonodo regional é o padrão de tratamento nos Estados Unidos para estagiar com precisão a doença e personalizar o tratamento. As diretrizes de estagiamento recentemente revisadas reconhecem a presen ça de metástases nodais microscópicas como um característica mar-cante de doença em estágio avançado levando a sobrevida dramati-camente reduzida. O conhecimento do status nodal patológico é crucial para estratificação do risco precoce, previsões de desfecho aprimoradas, e seleção de subgrupos de paciente com probabilidade de se beneficiar de tratamento adjuvante (dissecção nodal terapêutica, quimioterapia) ou testes clínicos.

Mapeamento de Linfonodo Sentinela (SLN).

[00272] Técnicas de mapeamento do linfonodo sentinela, usadas rotineiramente no estagiamento do melanoma, identificam o um ou mais linfonodos específicos que estão em maior risco de metástases tumorais. Este procedimento identifica pacientes abrigando doença metastática para tratamento adicional. As técnicas de padrão de tratamento se baseiam na injeção de corante colóide de tecnécio radioativo (99mTc) enxofre em torno do tumor primário para localização do linfonodo sentinela, seguida pelo uso intraoperatório de uma sonda gama para medir a radioatividade nas estruturas linfáticas dentro de uma bacia nodal exposta. Corante azul injetado em torno do tumor primário pode ajudar a delinear pequenos linfonodos sentinelas do tecido adjacente, mas a técnica é pouco confiável e passível de complicações. As técnicas de mapeamento do linfonodo sentinela e de biópsia atuais têm limitações, e representam maiores taxas de não- localização de um ou mais linfonodos sentinela na cabeça e no pescoço comparados com outros sítios anatômicos. A região da cabeça e do pescoço é notória por seus padrões imprevisíveis de doença metastática. A íntima proximidade da doença primária com metástases nodais nesta região torna o uso intraoperatório da sonda gama difícil devido a interferência do sítio de injeção. De modo importante, a tecnologia atual não permite que o cirurgião visualize o linfonodo sentinela e o diferencie de modo confiável da gordura adjacente ou de outros teci- dos, colocando estruturas vitais (isto é, os nervos) em risco de lesão durante dissecção para identificar e colher este linfonodo. O pequeno tamanho dos linfonodos e a ampla variação nos padrões de drenagem proporcionam desafios adicionais, resultando em uma taxa de não- localização de cerca de 10%.

Nanopartículas.

[00273] A maioria dos estudos pré-clínicos têm usado radiotraçadores conjugados a peptídeo ou peptídeo RGD como ligantes de direcio-namento para imagiologia por expressão de αvβ3-integrina. 18F- galacto-RGD e 99mTc-NC100692 são rastreadores peptídicos que têm sido usados com sucesso em pacientes para diagnosticar doença. Os rastreadores peptídicos clareiam rapidamente, o que pode resultar em ligação de receptores reduzida e sinal de fundo aumentado por dispersão tecidual inespecífica. Estas propriedades limitam o potencial dos rastreadores peptídicos para monitoramento por tempo mais longo. Em contraste, sondas de nanopartículas (~10 a 100 nm), as quais também têm sido usadas para imagiologia por expressão de integrina ao longo da neovasculatura tumoral, têm meias vidas na circulação prolongadas para realizar monitoramento por tempo mais longo (isto é, dias). As nanopartículas são tipicamente maiores do que anticorpos e radiofármacos (<10 kDa), e são associadas com transporte transmem- brana mais lento, aumentada captação pelo sistema retículo endotelial (RES), e aumento da captação inespecífica devido a alteração da permeabilidade vascular tumoral. As nanopartículas direcionadas de 7 nm de diâmetro usadas para este estudo de mapeamento do linfonodo sentinela são a grosso modo comparáveis ao diâmetro médio de uma molécula de albumina e 2 a 3 vezes menores do que o diâmetro médio de um anticorpo típico. Em relação aos rastreadores peptídicos, a sonda de partículas direcionadas é menos propensa a extravasação e está associada com meias vias na circulação prolongadas que refor- çam o direcionamento tumoral. De modo importante, 124I-cRGDY- PEG-dots demonstram propriedades chave in vitro e in vivo em tumores M21 necessárias para translação para a clínica.

Materiais e Métodos.

[00274] Suínos em miniatura Sinclair com melanoma espontâneo (10 a 12 kg, Sinclair Research Center, MO) foram injetados por via intravenosa com 5 mCi de 18F-fluoro-desoxiglicose (18F-FDG) para triagem do corpo inteiro de metástases nodais e/ou de órgãos. Os mini porcos foram submetidos a PET scan de corpo inteiro por 1 hora por 18F-FDG PET dinâmico usando um PET scanner clínico 40 minutos depois de injeção para triagem de doença metastática, seguido por aquisição por CT scan para localização anatômica. Em seguida os mini porcos foram injetados por via subdérmica em um padrão de 4 quadrantes em torno do sítio tumoral (sítios de cabeça e pescoço preferencialmente) com 124I-RGD-PEG-dots multimodais 48 horas depois de 18F-FDG PET, e uma segundo PET-CT scan dinâmico foi realizado para avaliar metástases nodais adicionais.

[00275] Os mini porcos foram levados para a sala de operação para identificação de lifonodos. Imagiologia por fluorescência ótica foi reali-zada usando sistema de câmera de fluorescência próxima ao infra-vermelho de grande campo de visão, endoscópio modificado de campo de visão menor, e um estereomacroscópio modificado para a obtenção de imagens de fluorescência de maior resolução dentro do campo cirúrgico exposto.

[00276] Validação do sinal fluorescente foi realizada intraoperativa- mente por contagem de raios gama com um dispositivo manual de PET scan clinicamente aprovado dentro da cama operatória para localizar pontos direcionados por via transdérmica, adquiridos intraoperati- vamente a partir da pele e os linfonodos dentro e na bacia nodal.

[00277] A lesão de pele de melanoma primário foi excisada, e foi feita uma incisão para permitir acesso ao(s) linfonodo(s) sentinela. A identidade nodal foi confirmada usando PET manual e sistemas de imagiologia ótica multi-escala, e os linfonodos em questão foram exci- sados. As amostras foram enviadas para avaliação histológica para metástases e microscopia ótica confocal para confirmar a presença tanto de malignidade quanto de fluorescência de nanopartículas.

[00278] Depois da coleta dos linfonodos sentinela, toda a bacia de linfonodos foi excisada e adicionalmente avaliada usando métodos his-tológicos (com marcadores imunohistoquímicos para melanoma con-forme necessário), microscopia por fluorescência, e a sonda de PET manual para fins correlativos. Esta etapa ajudou a identificar quaisquer outros linfonodos malignos dentro da bacia nodal e o número de 124I- RGD-PEG-dots presentes em linfonodos adjacentes por seu aspecto na imagiologia.

[00279] 124I-RGD-PEG-dots foram administrados por via subcutânea nos membros do animal sequencialmente. O trânsito dos 124I-RGD- PEG-dots para os linfonodos inguinais / axilares foi seguido usando o sistema de imagiologia ótica e sondas de PET manuais para confirmar a duração do trânsito ao longo dos caminhos linfáticos. A drenagem das bacias nodais foi exposta cirurgicamente e o padrão de drenagem dos linfonodos foi observado. O linfonodo sentinela foi colhido de cada sítio para confirmar a natureza linfática do tecido. Os animais foram eutanizados, e quaisquer lesões adicionais notadas na imagiologia foram excisadas na sala de necrópsia da instalação animal.

Discussão

[00280] Um PET-CT scan por 18F-fluorodesoxiglucose (18F-FDG) de corpo inteiro revelou uma lesão melanomatosa primária adjacente à coluna vertebral sobre a parte superior do dorso, bem como um único linfonodo no pescoço, posteriormente sobre o lado direito do animal, os quais foram ambos ávidos por FDG, e suspeitos para doença me- tastática. Este achado foi confirmado depois de injeção subdérmica, em 4 quadrantes de 124I-RGD-PEG-dots em torno do sítio tumoral, a qual adicionalmente identificou mais dois linfonodos hipermetabólicos, bem como os linfáticos de drenagem. Interpretação da varredura final apontou para 3 potenciais linfonodos metastáticos. Foi realizada exci- são cirúrgica da lesão primária, dos linfonodos hipermetabólicos, e de tecido de outras bacias nodais no pescoço bilateralmente depois de sondas de PET manuais terem identificado e confirmado elevadas taxas de contagem na localização do(s) linfonodo(s) sentinela. O sinal de fluorescência irregular medido no tecido do linfonodo sentinela posterior direito excisado se correlacionou com sítios de metástases de melanoma por análise histológica. Todas as amostras nodais hiperme- tabólicas foram pigmentadas em preto, e foi visto que se correlacionam com a presença de aglomerados distintos de células de melanoma. Portanto, os resultados de tecido ressecado cirurgicamente submetido a patologia para H&E e coloração por outros marcadores de melanoma conhecidos confirmaram os achados da imagiologia multimodal.

[00281] A Figura 13a mostra a configuração experimental do uso de modelo de melanoma de mini porco espontâneo para mapeamento bacias dos linfonodos e drenagem linfática regional do sítio de um tumor de melanoma primário conhecido. Este modelo de mini porco de tamanho intermediário é necessário para simular a aplicação de procedimentos de biópsia do linfonodo sentinela (SLN) em seres humanos, e mais precisamente recapitula doença humana. A Figura 13b mostra imagem de PET de pequeno campo de visão 5 minutos depois de injeção subdérmica de partículas multimodais (124I-RGD-PEG-dots) em torno do sítio tumoral. A região do tumor, os linfonodos, e a drenagem linfática do sítio tumoral são vistos como áreas de atividade aumentada (em preto).

[00282] A Figura 14 mostra PET scan de 18F-fluorodesoxiglucose (18F-FDG) dinâmica de corpo inteiro (Figura 14a) e PET-CT scans de 18F-FDG fundidos (Figura 14b) demonstrando imagens sagitais, coronais, e axiais através do sítio de doença nodal no pescoço. O PET scan por 18F-FDG foi realizado para mapear sítios de doença metastática depois de administração intravenosa e antes de administração da sonda de nanopartículas radiomarcadas. Um único linfonodo hiperme- tabólico é visto no pescoço posteriormente sobre o lado direito do animal (setas, imagens axiais, painéis superior / inferior), também identificado sobre a imagem de corpo inteiro do mini porco (Figura 14c).

[00283] Figura 15 mostra os mesmos conjuntos de imagens que na Figura 14, mas no nível da lesão de melanoma primário, adjacente à coluna vertebral sobre a parte superior do dorso. A lesão ávida por PET é identificada (setas, imagens axiais, painéis superior / inferior), bem como sobre a imagem de corpo inteiro do mini porco (Figura 15c).

[00284] Figura 16 mostra imagens de PET dinâmica de alta resolução (Figura 16a) e imagens de PET-CT fundidas (Figura 16b) depois de injeção subdérmica, nos 4 quadrantes de 124I-RGD-PEG-dots em torno do sítio tumoral, simulando o protocolo clínico, durante um período de tempo de 1 hora. Três linfonodos hipermetabólicos (setas) foram encontrados no pescoço, sugerindo doença metastática. O linfonodo sentinela posterior direito excisado foi excisado e foi realizada imagiologia por fluorescência próxima ao infravermelho (NIR) de corpo inteiro. Sinal de fluorescência de Cy5 foi detectável dentro do linfonodo ressecado (Figura 16c, superior, imagiologia de Cy5) em imagiologia ótica de corpo inteiro. Análise patológica deste linfonodo pigmentado em preto (seta, SLN) demonstrou aglomerados de células de melanoma invasivas sobre visualizações transversais de baixa (setas) e de alta potência do linfonodo por coloração com H&E (duas imagens menores), e nós esperamos que a especificidade do melanoma fosse adi- cionalmente confirmada usando corantes especiais (Melan A, HMB45, PNL2, e "antígeno associado a melanoma" biogenex clone NKI/C3). Nós adicionalmente esperamos a colocalização da partícula com estes aglomerados metastáticos de células na microscopia por fluorescência confocal e autorradiografia digital de alta resolução, confirmando de-tecção da doença metastática.

Exemplo 7 Nanopartículas de Sílica Fluorescente Conjugadas com Peptídeo de Direcionamento MC1R (Modelo de Melanoma)

[00285] Para os experimentos de imagiologia diagnóstica de multi- modalidade (PET-NIRF), o peptídeo de direcionamento e o radiomarca- dor sobre a superfície da nanopartícula vão ser pemutados para deter-minar a especificidade do alvo, a afinidade / avidez de ligação, e a sen-sibilidade da detecção. Partículas terapêuticas subsequentes também vão ser sintetizadas usando radiomarcadores terapêuticos (lutécio-177, 177Lu, t1/2=6,65 dias) para morte direcionada de células de melanoma expressando MC1R. Os achados combinados de PET quantitativa e de imagiologia ótica serão correlacionados com autorradiografia do tecido tumoral e imagiologia ótica através de escalas espaciais. Para micros-copia celular, será usado um scanner de fluorescência confocal in vivo para imagiologia por reflectância e fluorescência combinadas.

Exemplo 8 Nanopartículas Fluorescentes para Radioterapia Direcionada

[00286] Dose estudos de escalonamento com nanopartículas de 131I- RGD serão realizados e a resposta ao tratamento vai ser monitorada semanalmente, durante o curso de seis semanas, usando 18F-FDG PET. Será realizada captação tumoral dependente do tempo e dosimetria da plataforma de nanopartículas usando imagiologia por câmera planar de raios gama. Dados de imagiologia in vivo serão correlacionados com a contagem de raios gama das amostras de tumor excisadas.

[00287] Camundongos nude machos (6 a 8 semanas de idade, Charles River Labs, MA) serão usados para gerar modelos de xenoen- xerto da pata posterior depois de injeção de células de melanoma humano M21 (5x105 em PBS). Os tumores serão deixados para crescer por 10 a 14 dias até 0,5 a 0,9 cm3 de tamanho.

[00288] Estudos de radioterapia direcionada à base de 131I. O ra- dionuclídeo terapêutico 131I será usado como um radiomarcador para radioterapia direcionada. Na estimativa da maior dose possível de 131I resultante em nenhnma morte animal e menos de 20% de perda de peso (MTD), será realizado um estudo de escalação da dose em camundongos nude portadores de tumor. Para uma dose de 200 rad para sangue 54, é necessária uma atividade administrada de 10 MBq, a qual vai liberar uma dose de 270 rad para o tumor. 4 doses de 10 MBq cada uma serão administradas para obter uma dose tumoral maior do que 1000 rad com fracionamento da dose projetado para permitir reparar e poupar a medula óssea. 131I permit imagiologia de câmera gama planar usando um colimador de pinhole para medir a captação tumoral dependente do tempo e a dosimetria das nanopartículas. 18F-FDG PET permite o monitoramento quantitativo da resposta tumoral, deste modo proporcionando informação complementar.

[00289] Com base nestes dados, e em dados in vivo sobre o efeito de nanopartículas carregadas com paclitaxel, será conduzido um estudo de terapia com o conjugado de 131I-RGD-nanopartícula. Dois grupos de camundongos portadores de tumor (n = 10 por grupo) vão receber cada um quatro, atividades de 10,4 MBq uma vez por semana por 4 semanas, de conjugados de nanopartículas-131I-RGD administradas por i.v. ou veículo de salina (controle, n = 10), e serão monitorados durante um período de 6 semanas. A resposta / progressão do tratamento serão quantificadas com base no volume do tumor (através de medições por calibrador). Todos os camundongos dos grupos de trata- mento também vão ser estudados por imagem uma vez por semana (sessões de ~1 hora) por imagiologia por SPECT (Gamma Medica) durante um período de 6 semanas.

[00290] Aquisição de Imagiologia por 18F-FDG PET e Análise. Dois grupos de camundongos portadores de tumor (n = 10/ grupo) vão ser submetidos a PET scan inicial antes e em seguida, em uma base se-manal depois do tratamento durante um intervalo de 6 semanas. Os camundongos serão injetados por via intravenosa (i.v.) com 500 μCi de 18F-FDG e serão adquiridas imagens estáticas por PET scan de 10 mi-nutos usando um Focus 120 microPET® (Concorde Microsystems, TN) antes e depois do tratamento. Os dados adquiridos bão ser reconstruídos em uma matriz de 128x128x96 por retro-projeção filtrada. Análises das regiões de interesse (ROI) das imagens reconstruídas vão ser realizadas usando o software ASIPro® (Concorde Microsystems, TN) para determinar a captação de radiotraçador média e o desvio padrão (% da DI/g) nos tumores. Os animais serão sacrificados no término do estudo e os tumores serão excisados para contagem de raios gama.

Exemplo 9 Nanopartículas Fluorescentes Conjugadas com Quelato de Radionu- clídeo e Peptídeo de Direcionamento para MC1R

[00291] Nanopartículas PEG-uiladas vão ser conjugadas com pep- tídeos de direcionamento e quelatos macrocíclicos ligando radiomar- cadores de alta específica atividade.

[00292] PEGs disponíveis comercialmente ativados de dois ramos de alta pureza, derivatizados com ésteres de NHS ou maleimida, serão anexados à concha de sílica da nanopartícula usando procedimentos de rotina. Qualquer um dos dois grupos de PEG funcionalizados (ésteres de NHS ou maleimida) estarão disponíveis para conjugação posterior ou com o constructo de peptídeo-quelato, peptídeo cíclico Re- [Cys3,4,10,D-Phe7]α-MSH3-13 (ReCCMSH(Arg11)), ou com quelado- res de encadeador de ácido 1,4,7,10-tetraazaciclododecano- N,N',N",N"'-tetraacético (DOTA). A fixação covalente de PEGs derivati- zados à superfície da nanopartícula será realizada em uma maneira de modo a expor diferentes grupamentos funcionais para ligação de DOTA e constructos de peptídeo-quelato, conforme discutido abaixo.

Síntese e Caracterização Fisicoquímica de Nanopartículas Funcionali- zadas.

[00293] Nanopartículas funcionalizadas vão ser sintetizadas estabe-lecendo ligações covalentes das seguintes porções com os grupamentos de PEG derivatizados:

[00294] (A) Quelatos de DOTA para subsequente radiomarcação de alta atividade específica com radiometais emissores de pósitrons (isto é, 64Cu) para permitir detecção diagnóstica com imagiologia por PET. DOTA será conjugado aos PEGs funcionalizados usando química de Fmoc de rotina, e purificação das nanopartículas queladas será realizada por cromatografia. 64Cu e 177Lu serão anexados a DOTA por incubação da mistura da reação a 60° C. por 30 min seguida por filtração por gel ou purificação por cromatografia líquida de alta pressão. Alternativamente, nuclídeos de PET, tais como 124I, 86Y,68Ga e 89Zr, podem ser conjugados à nanopartícula, quer através do PEG funciona- lizado com DOTA (radiometais) ou do PEG funcionalizado com tirosina (124I). O emissor de único fóton, 177Lu, obtido sob a forma de 177LuCh será complexado com DOTA para radioterapia.

[00295] (B) Análogo peptídico de direcionamento para melanoma αMSH (ReCCMSH(Arg11)) é ciclizado por rênio. É necessário confirmar a proporção de quelatos de DOTA para porções de ReC- CMSH(Arg11) sobre a superfície da nanopartícula PEG-uilada.

[00296] A caracterização das nanopartículas funcionalizadas preparações será realizada como se segue:

[00297] (A) O número médio de quelatos de DOTA por nanopartícu- la será determinado por teste de diluição isotópica de rotina com 64Cu. Em resumo, 64Cu será adicionado a soluções contendo uma quantidade conhecida de ReCCMSH(Arg11)-nanopartículas. As soluções incubadas serão pontilhadas sobre placas de vidro revestidas com sílica gel, desenvolvidas em 1:1 de 10% de acetato de amônio para metanol (com EDTA), e analisadas por radio-TLC. Enquanto Nanopartículas de ReCCMSH(Arg11) com etiqueta de 64Cu vão permanecer na origem, 64Cu ligado a EDTA vai migrar. A percentagem de eficiência de marcação vai ser plotada contra o total de nanomoles de 64Cu adicionado à mistura da reação. O número de quelatos anexados por nanopartícula pode ser determinado a partir do ponto de inflexão desta curva.

[00298] (B) O número médio de peptídeos ReCCMSH(Arg11) por nanopartícula e a eficiência de ligação do ReCCMSH(Arg11) aos gru-pamentos de PEG funcionalizados vão ser avaliados usando métodos espectrofotométricos (À = 435 nm, máxima absorvência) e o coeficiente de extinção conhecido de ReCCMSH(Argll). A incorporação de rê- nio oferece a vantagem de que podem ser feitas medições da absorvência altamente sensíveis das concentrações de rênio sobre uma pequena amostra de produto.

Imagiologia Ótica-PET In Vitro e In Vivo de Nanopartícula Multifuncional

[00299] Nanopartículas em Modelos de Melanoma para Avaliar o Direcionamento Tumoral-Específico e a Resposta ao Tratamento.

[00300] 64Cu-DOTA-ReCCMSH(Arg11)-nanopartículas vão ser comparadas com o constructo nativo 64Cu-DOTA-ReCCMSH(Arg11) para testar as capacidades de direcionamento das nanopartículas.

[00301] Testes de ligação competitiva. Serão usadas as linhagens de melanoma murino B16/F1 positivo para receptor MC1R. Os valores da IC50 de peptídeo ReCCMSH(Arg11), a concentração de peptídeo requerida para inibir 50% da ligação de radioligante, vão ser determi-nados usando 125I-(Tyr2)-NDP7, um análogo de α-MSH radioiodado com afinidade picomolar para o MC1R. Cavidades únicas vão ser in-cubadas a 25° C. por 3 h com aproximadamente 50.000 cpm de 125I- (Tyr2)-NDP em 0,5 ml de meio de ligação com 25 mmol/L de ácido N- (2-hidroxietil)-piperazina-N-(2-etanossulfônico), 0,2% de BSA e 0,3 mmol/L de 1,10-fenantrolina], com concentrações de (Arg11)CCMSH variando de 10 a 13 até 10 a 5 mol/L. A radioatividade nas células e no meio vão ser coletadas e medidas separadamente, e os dados serão processados para computer o valor da IC50 do peptídeo Re(Arg11)CCMSH com o pacote de software Kell (Biosoft, MO).

[00302] Teste de Quantificação de Receptor. Alíquotas de 5*105 células B16/F1 vão ser adicionadas às cavidades, cultivadas em 200 μL de meio RPMI, e incubadas a 37° C. por 1,5 h na presença de concentrações crescentes de 125I-(Tyr2)-NDP (a partir de 2,5 até 100 nCi) em 0,5 mL de meio de ligação (MEM com 25 mM de HEPES, pH 7,4). As células vão ser lavadas com 0,5 mL de gelado, pH 7,4, 0,2% de BSA/0,01 M de PBS duas vezes, e o nível de atividade associado com a fração celular vai ser medido em um contador Y. Ligação inespecífica vai ser determinada incubando as células e 125I-(Tyr2)-NDP com NDP não radioativo em uma concentração final de 10 μM. Gráficos de Scatchard vão ser obtidos traçando a proporção de ligação específica a 125I-(Tyr2)-NDP livre versus a concentração de ligação específica (fmol/milhão de células); Bmax, o número máximo de síitos de ligação, é a interceptação X da linha de regressão linear.

[00303] Linhagens de melanoma murino B16/F1 (5*105 in PBS) vão ser injetadas por via subcutânea nas patas posteriores de camundongos nude machos (6 a 8 semanas de idade). Os tumores vão ser deixados para crescer por 10 a 14 dias até 0,5 a 0,9 cm3 de tamanho.

[00304] Biodistribuição: Uma pequena quantidade do conjugado de 64Cu-DOTA-ReCCMSH(Arg11)-nanopartícula (~10 μCi, 0.20 μg) vai ser injetada por via intravenosa em cada um dos camundongos carregando tumores B16/F1 palpáveis. Os animais serão sacrificados em pontos do tempo selecionados depois de injeção (2, 4, 24, 48, 72 horas; n = 4 a 5/ ponto do tempo) e os tecidos desejados serão removidos, pesados, e contados para radioatividade acumulada. Camundongos adicionais (n = 5) injetados com o constructo radiomarcado nativo, 64Cu-DOTA- ReCCMSH(Arg11) (~10 μCi, 0,20 μg) vão servir como o grupo de con-trole, e avaliados 1 h pós injeção. De modo a examinar a especificidade da captação in vivo, um grupo adicional de camundongos (ponto do tempo de 2 h) vai ser pré-injetado com 20 μg de NDP para agir como um bloqueio de receptor imediatamente antes da injeção do conjugado de nanopartícula de 64Cu-DOTA-ReCCMSH(Arg11). Órgãos grandes e tecidos vão ser pesados e contados em contador gama, e vai ser de-terminada a percentagem de dose injetada por grama (% da DI/g).

[00305] Imagiologia por NIRF Serial In Vivo. Em paralelo com os estudos por PET abaixo, vai ser realizada NIR (imagiologia tomográfi- ca por fluorescência, FMT 225, Visen, Woburn, Mass.) usando um feixe de laser NIR de varredura a 680 nm ajustável e CCD antes e depois de injeção i.v. dos animais portadores de tumor (n = 10). Os camundongos vão ser mantidos sob anestesia contínua com isoflurano, e colocados em um cassete de imagiologia multimodal portátil (compatível com tanto nosso FMT 2500 quanto com Focus 120 microPET) para varredura por FMT antes e depois de injeção (1, 2, 4, 6, 12, 24, 48 e 72 horas). A imagem de fluorescência NIR, medida durante um período de 1 a 10 minutos, vai ser reconstruída usando o software proprietário Visen e sobreposta sobre uma fotografia normal do camundongo. Os dados de imagiologia são quantitativos, uma vez que a intensidade medida é diretamente relacionada com a concentração de fluoróforo NIR, permitindo que sejam gerados mapas paramétricos das concentrações absolutas de fluoróforo para co-registro com os dados de imagiologia por PET adquiridos.

[00306] Aquisição e Análise de Imagiologia por PET Dinâmica. Dois grupos de camundongos portadores de tumor (n = 5/ grupo) vão ser colocados no cassete de imagiologia para estudos de co-registro se-quencial por PET-óticos. Os camundongos vão ser injetados por via intravenosa (i.v.); um com conjugados de nanopartículas 64Cu-DOTA- ReCCMSH(Arg11) radiomarcadas e o segundo com constructos de 64Cu-DOTA-ReCCMSH(Arg11) nativos. Depois de injeção, imagens por PET dinâmica por 1 horas vão ser adquiridas usando um Focus 120 microPET® (Concorde Microsystems, TN). Aquisições por uma hora em list-mode são iniciadas no momento da injeção IV de sonda radiomarcada (~1 mCi). Os dados resultantes em list-mode vão ser reconstruídos em uma matriz de 128x128x96 por retro-projeção filtrada. Análises das regiões de interesse (ROI) de imagens reconstruídas são realizadas usando o software ASIPro® (Concorde Microsystems, TN) para determinar a captação de radiotraçador média e o desvio padrão (% da DI/g) em tumores, em outros órgãos / tecidos, e no ventrículo esquerdo (LV). Modelagem cinéticas dos dados dos rastreadores vai permitir estimativa dos parâmetros farmacocinéticos, incluindo liberação, clearance, e volume de distribuição. Conforme mencionado, um input de sangue arterial é medido usando uma região de interesse colocada sobre o ventrículo esquerdo (como uma medida da atividade sanguínea). Dados adicionais vão ser obtidos a partir de imagens estáticas nos pontos do tempo do 24 hr, 48 hr, 72 hr depois de injeção.

[00307] Microscopia por fluorescência e autorradiografia de tecidos. Uma combinação de tecnologias de imagiologia ótica apresentando escalas espaciais progressivamente menores (isto é, imagiologia por fluorescência do corpo inteiro, macroscopia por fluorescência, e mi-croscopia de varredura a laser confocal por fluorescência in vivo) vão ser utilizadas para imagiologia de tumores em animais intactos vivos em 72 horas pós injeção. Os camundongos vão ser mantidos sob anestesia contínua com isofluoraneo, deste modo permitindo detecção e localização do sinal de fluorescência do animal inteiro / nível de órgão para o nível celular sobre uma faixa de ampliações. Imagiologia macroscópica do animal inteiro vai ser realizada com estereomicros- cópio de fluorescência (Visen; Nikon SMZ1500) equipado com séries de filtros de fluorescência Cy5 e câmeras de CCD. Vão ser desenvolvidas capacidades de microscopia de varredura a laser confocal de fluorescência. Os camundongos vão ser em seguida eutanizados para autorradiografia de modo a mapear as biodistribuições de rastreadores em produtividade de alta resolução do volume tumoral. Os tumores vão ser excisados, congelados rapidamente, seccionados serialmente (seções de 100 μ) e montados em lâminas, com pedaços alternados colocados em contato com uma placa de fósforo em um cassete à prova de luz (até 1 semana). Coloração por H&E vai ser realizada sobre as seções consecutivas remanescentes. Os achados autorradio- gráficos vão ser correlacionados com os dados de imagiologia por PET e com os resultados histológicos.

[00308] Os radionuclídeos terapêuticos 177Lu ou 90Y podem ser al-ternativamente usados para radioterapia direcionada. Na estimativa da maior dose possível de 177Lu não resultando em morte de animais e resultando em menos de 20% de perda de peso (MTD), vai ser realizado um estudo de escalonamento de dose em camundongos nude portadores de tumor. As doses de radiofármaco suspeitas de estarem em (ou próximas) da MTD com base em valores da literatura para 177Lu vão ser avaliadas.

Exemplo 10

[00309] Nanopartículas Fluorescentes Funcionalizadas para Conjugar com Ligante e Agente de Contraste Através de "Quimica de Click"

Síntese de Nanopartículas Contendo Grupamentos Funcionais Versáteis para Subsequente Conjugação de Ligante (por exemplo, Peptí- deos) e Agente de contraste (por exemplo, Radionuclídeos).

[00310] De modo a sintetizar uma série de constructos de nanopar- tícula-peptídeo-quelato adequados para radiomarcação de atividade altamente específica, uma abordagem de "química de click" pode ser usada para funcionalizar a superfície da nanopartícula (Figura 17). Este método se baseia na cicloadição de azida catalisada por cobre para uma ligação tripla. A referida abordagem vai permitir uma grande versatilidade para explorar aplicações multimodalidades.

[00311] Síntese e caracterização de nanopartículas. Os grupamentos de PEG que vão ser anexados de modo covalente serão produzidos seguindo o esquema na Figura 14. PEG vai ser anexado de modo covalente à nanopartícula através do grupamento de silano. Caminhos químicos de rotina vão ser usados para a produção do PEG funcionali- zado com ligações triplas.

[00312] Funcionalização de nanopartículas com ligações triplas. De modo a sintetizar os PEGs bifuncionalizados, a primeira etapa vai empregar a reação bem estudada de éster carboxílico ativado com amina alifática (Figura 18). Alternativamente, pode ser usada outra amina carregando ligação tripla adequada, por exemplo, p-aminofenila- cetileno. A segunda etapa da síntese também se baseia em uma reação de conjugação de conhecimento geral.

Síntese e Caracterização Fisicoquímica de Nanopartículas Funcionali-zadas Conjugadas com Peptídeos e Quelatos de Modelo.

[00313] A nanopartícula funcionalizada contém tanto (A) desferri- oxamina B (DFO) para subsequente radiomarcação da atividade alta-mente específica com o zircônio 89 emissor de pósitrons (89Zr) quanto (B) o peptídeo de direcionamento de SSTR, octreotato.

[00314] Síntese de DFO com uma ligação de azida. DFO com um grupamento de azida vai ser produzido por reação de DFO-B com ácido pazido benzóico ) (Figura 19) e purificado. A reação de "química de click" é uma cicloadição 1,3-dipolar em temperatura ambiente e as condições são frequentemente referidas como "Condições de Huigsen". Embora as reações de modo geral possam ser completadas em temperatura ambiente em etanol, pode ser apropriado aquecer a reação. O catalisador é frequentemente Cu(I)Br, porém alternativas incluem Cu(I)I ou Cu(II)SO4 (com um redutor). Knor et al. Synthesis of novel 1,4,7,10-tetraazacyclodecane-1,4,7,10-tetraacetic acid (DOTA) derivatives for chemoselective attachment to unprotected polyfunctio-nalized compounds. Chemistry, 2007; 13:6082-90. Reações de click também podem ser realizadas na ausência de qualquer catalisador. Alternativamente, o grupamento NH3+ em DFO-B pode ser convertido diretamente em um grupamento de azida.

[00315] Síntese de Tyr3-octreotato com uma azida. Síntese de peptídeo de fase sólida (SPPS) de Tyr3-octreotato (Figura 20A) vai ser realizada em um sintetizador de peptídeo. Em resumo, a síntese vai envolver o método do Fmoc (9-fluorenilmetoxicarbonil) conforme previamente descrito para este peptídeo. Em resumo, o protocolo de instrumento requer 25 μmol de aminoácidos protegidos com Fmoc subsequentes ativados por uma combinação de 1-hidroxibenzotriazol (HOBt) e hexafluorofosfato de 2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3- tetrametilurônio (HBTU). Os aminoácidos protegidos com Fmoc vão ser adquiridos comercialmente a menos que declarado de modo diverso; os aminoácidos pré-embalados vão ser obtidos da Perkin-Elmer (Norwalk, Conn.), ao passo que os indisponíveis em forma pré- embalada, tais como os Daminoácidos e Fmoc-Cys(Acm) vão ser supridos pela BACHEM Bioscience, Inc. (King of Prussia, Pa.) ou Nova- biochem (San Diego, CA.). O grupamenot de azida (para a química de "click") vai ser introduzido na estrutura do peptídeo através de ligação de um ácido contendo azida ao N-término do peptídeo, enquanto o peptídeo ainda está protegido e anexado à resina (Figura 20B).

[00316] Síntese de nanopartículas funcionalizadas. A etapa seguinte vai ser conjugar tanto o DFO tendo uma ligação de azida quanto Tyr3- octreotato tendo uma ligação de azida (Figuras 21A e B) à nanopartícula. A "química de click" é altamente seletiva, quantitativa e pode ser rea-lizada muito rapidamente e usando condições brandas. O número de grupamentos de azida combinados de DFO e Tyr3-octreotato vai ser controlado de modo a nunca exceder o número de ligações triplas dis-poníveis; as ligações triplas vão estar sempre em <5% de excesso.

[00317] Caracterização de nanopartículas funcionalizadas. O número médio de peptídeo de quelatos DFO por nanopartícula vai ser de-terminado realizando um teste de diluição isotópica de rotina com 89Zr (ou 68Ga). 89Zr vai ser produzido em cyclotron e purificado. Em resumo, 10 concentrações de 89Zr-oxalato vão ser adicionadas a soluções contendo uma quantidade conhecida de nanopartículas derivadas de DFO. Depois de uma incubação por 30 min. em temperatura ambiente, as soluções vão ser pontilhadas sobre placas de vidro revestidas com sílica gel, desenvolvidas em 1:1 de 10% de acetato de amônio para metanol (com EDTA) e analisadas por radio-TLC. Considerando que as nanopartículas derivadas de 89Zr-DFO vão permanecer na origem, 89Zr ligado inespecificamente a EDTA vai migrar. A percentagem de eficiência de marcação vai ser plotada como uma função do total de nanomoles de 89Zr adicionado à mistura da reação. O número de quelatos anexados à nanopartícula pode ser então determinado a partir do ponto de inflexão desta curva.

[00318] O número médio de peptídeo Tyr3-octreotato por nanopartícula vai ser determinado avaliando a ponte de dissulfeto de Tyr3- octreoato. Em resumo, as ligações de dissulfeto do Tyr3-octreotato podem ser clivadas quantitativamente por excesso de sulfito de sódio em pH 9,5 e temperatura ambiente. DTNB ou reagente de Elman pode ser usado para quantificar tióis em proteínas por medições de absor- ção. Forma prontamente um dissulfeto misto com tióis, liberando o cromóforo ácido 5-merapto-2-nitrobenzóico (absorção máxima de 410 nm). Somente tióis de proteínas que estão acessíveis a este reagente hidrossol'~uvel são modificados. Alternativamente, pode ser usado o kit Measure-iT® Thiol Assay Kit da Invitrogen.

Teste In Vivo em Modelos Tumorais Adequados.

[00319] Vão ser gerados modelos de xenoenxerto subcutâneo usando camundongos SCID fêmeas portadores de tumor AR42J. Em resumo, células AR42J (1x107), vão ser injetadas por via subcutânea nos flancos de camundongos SCID fêmeas. Os tumores vão ser deixados para crescer 10 a 12 dias até 0,5 a 0,9 cm3 de tamanho.

[00320] Espera-se que radiomarcação das DFO-nanopartícula por 89Zr prossiga em <15 min. em temperatura ambiente. 89Zr ligado ines- pecificamente vai ser removido por adição de EDTA seguida por uma etapa de filtração por gel.

[00321] Testes de ligação de receptor. Os testes de ligação de receptor vão ser realizados usando 89Zr-DFO-nanopartículas sobre membranas obtidas a partir de tumores AR42J. Os ligantes concorrentes, natZr-DFO-Nanopartículas e natZr-DFO-octreotato vão ser preparados por meio da reação de oxalato de zircônio natural de alta pureza com DFO-octreotato e DFO-Nanopartículas, respectivamente. A pureza dos produtos finais vai ser confirmada por HPLC. Os valores da IC50 vão ser determinados de acordo com métodos previamente publicados, usando o sistema de teste Millipore MultiScreen (Bedford, Mass.). Análise dos dados vai ser realizada usando os programas GraFit (Erithacus Software, Reino Unido), LIGAND (NIH, Bethesda, Md.), e GraphPad PRISM® (San Diego, CA.).

[00322] Testes in vitro. As células AR42J vão ser colhidas a partir de monocamadas com solução de dissociação celular (Cell Dissociation Solution, da Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.) e ressuspendi- das em meio DMEM fresco em uma concentração de 2x106 célu- las/mL. Uma alíquota de cerca de 0,3 pmol de 89Zr-DFO- nanopartículas vai ser adicionada a 10 mL de células, incubadas a 37° C. com agitação contínua. Em 1, 5, 15, 30, 45, 60 e 120 min alíquotas de 200 μL em triplicate vão ser removidas e colocadas sobre gelo. As células vão ser isoladas imediatamente por centrifugação, e vai ser calculada a % de captação do composto dentro das células.

[00323] Biodistribuição. Uma pequena quantidade das 89Zr-DFO- nanopartículas (~10 μCi, 0,20 μg) vai ser injetada por via intravenosa em cada um dos camundongos carregando tumores palpáveis positivos para AR42J. Os animais vão ser sacrificados em pontos do tempo selecionados depois de injeção (1, 4, 24, 48, 72 horas; n = 4 a 5) e os tecidos desejados vão ser removidos, pesados, e contados para acu-mulação de radioatividade. Dois grupos de controle adicionais vão ser estudados em 1 h pós-injeções: (A) camundongos injetados com o peptídeo radiomarcada nativo 89Zr-DFO-octreotato (~10 μCi, 0,20 μg), e (B) camundongos pré-injetados com um bloqueio de Tyr3-octreotato (150 μg) para demonstrar acumulação, mediada por receptor, das 89Zr- DFO-nanopartículas. Tecidos incluindo sangue, pulmão, fígado, baço, rim, adrenais (positivo para STTR) músculo, pele, gordura, coração, cérebro, osso, pâncreas (positivo para STTR), intestino delgado, intestino grosso, e tumor AR42J vão ser contados. A percentagem de dose injetada por grama (% da DI/g) e a percentagem de dose injetada por órgão (% da DI/ órgão) vão ser calculadas por comparação com uma solução padrão pesada e contada.

[00324] Imagiologia por NIRF in vivo. limagiologia serial vai ser realizada usando o sistema Maestro® In Vivo Fluorescence Imaging System (CRI, Woburn, Mass.) em 0, 0,5, 1, 2, 4, 6, 12, 24, 48 e 72 horas. Em 72 horas, os camundongos vão ser eutanizados, e os tecidos / órgãos maiores dissecados, pesados, e colocados em palcas de 6 cavi- dades para imagiologia ex vivo. A emissão de fluorescência vai ser analisada usando regiões de interesse (ROIs) sobre tumor, tecidos se-lecionados, e injetados de referência, empregando algoritmos de des- mistura espectrais para eliminar a autofluorescência. As intensidades de fluorescência e os desvios padrão (SD) vão ser ponderados para grupos de 5 animais. Dividindo as intensidades de fluorescência médias dos tecidos pelos valores dos injetados vai permitir que sejam feitas comparações entre os vários tecidos / órgãos para cada conjugado de nanopartícula injetado.

[00325] Imagiologia por PET de animal pequeno in vivo. Imagiologia por PET de animal pequeno vai ser realizado em um sistema micro- PET®-FOCUS® (Concorde Microsystems Inc, Knoxville Tenn.). Camundongos carregando os tumores AR42J (n = 5 por grupo) vão ser anestesiados com 1 a 2% de isoflurano, colocados em uma posição supina, e imobilizados em um suporte preparado customizado. Os camundongos vão receber 200 μCi do complexo de 89Zr-DFO-octreotato- nanopartícula através da veia da cauda e vão ser estudados por imagens lado a lado. Inicialmente os animais serão estudados por imagens adquirindo múltiplas varreduras sucessivas de 10 minutos continuamente a partir do momento da injeção durante um frame de tempo de 1 hora, seguidas por aquisições de dados estáticas por 10 min em 2, 4, 24, 48 e 72 horas pós injeção. Valores de captação padrão (SUVs) serão gerados a partir de regiões de interesse (ROIs) desenhadas sobre o tumor e outros órgãos de interesse. Co-registro das imagens de PET scan vai ser obtido em combinação com uma câmera microCAT-II (Imtek Inc., Knoxville, Tenn.), a qual proporciona imagens anatômicas de alta resolução por X-ray CT. O registro de imagens entre imagens por microCT e PET scan vai ser realizado usando uma técnica de registro de referência e o software de display de imagem AMIRA (AMIRA, TGS Inc, San Diego, CA.). O método de registro prossegue por rígida transformação das imagens de microCT de refe-rências proporcionadas por marcas de referências diretamente afixadas à cama do animal.

[00326] Medições farmacocinéticas. Os dados de biodistribuição e de PET dinâmica vão proporcionar a concentração temporal de 89Zr- DFO-octreotato-nanopartícula no tecido a qual vai permitir a caracterização dos parâmetros farmacocinéticos do agente.

[00327] Microscopia por fluorescência e autorradiografia dos tecidos ex vivo. Vai ser realizada a localização de conjugados de nanopartículas em tecidos sobre seções congeladas. Imagiologia por microPET vai nos permitir avaliar totalmente a distribuição global em tumores e em outros tecidos não-alvo. Depois do estágio aguda do teste de imagiologia, também vai ser realizada autorradiografia sobre os tumores, e estes dados vão ser correlacionados tanto com a imagiologia por PET quanto com os resultados histológicos. Cortes consecutivos (~10 μm) vão ser tomados, alternando cortes para autorradiografia e para análise histológica. Estas seções também vão ser analisadas por microscopia por fluorescência multicanal no canal próximo ao infravermelho.

Exemplo 11 Estudos de Internalização de Partículas

[00328] A meta deste estudo é avaliar a ligação e a internalização das presentes nanopartículas para avaliar sua localização emorgane- las subcelulares e a exocitose. Isto vai ajudar a estudar o destino de partículas funcionalizadas com diferentes porções de direcionamento e as terapias anexadas. Por exemplo, tanto nanopartículas diagnósticas (por exemplo, revestidas com PEG não direcionadas versus nanopar-tículas revestidas com cRGD-PEG) quanto nanopartículas terapêuticas (por exemplo, cRGD-PEG-nanopartículas anexadas a iodo para radio-terapia, anexadas a inibidores de tirosina quinase, ou anexadas a fár- macos quimioterápicos tais como Taxol.)

Materiais e Métodos

[00329] Estudos de internalização / captação. Testes de internaliza- ção e de colocalização foram realizados para identificação de caminhos de captação específicos.

[00330] Células de melanoma, incluindo células humanas M21 e de camundongo B16 (~2*105 células/ cavidade), foram laminadas em lâ-minas de câmara de 8 cavidades (1,7 cm2/ cavidade) ou em placas de 24 cavidades (1,9 cm2/ cavidade) com uma sobrelâmina de vidro arre-dondada de 12 mm e incubadas a 37° C. de um dia para o outro. De modo a monitorar a internalização de nanopartículas direcionadas, as células foram incubadas com dots de cRGD-PEG (0,075 mg/ml) por 3 horas a 37° C. De modo a remover partículas não ligadas no meio, as células foram enxaguadas duas vezes com PBS. Microscopia confocal foi realizada em um microscópio confocal invertido Leica (Leica TCS SP2 AOBS) equipdao com uma objetiva HCX PL APO: 63x1.2NA Water DICD para avaliar a co-localização de cRGD-PEG-dots com anticorpos ou corantes específicos para organelas. As imagens foram analisadas usando o software ImageJ versão 1.37 (NIH Image; https://rsbweb.nih.gov/ij/).

[00331] Testes de Co-localização / Marcadores Ligados a Corante. De modo a identificar vesículas endocíticas envolvidas em internalização de C dots, foram realizados testes de colocalização em células vivas usando marcadores ligados a corante. As células foram coincu- badas com nanopartículas e diferentes corantes. Os corantes incluíram: 100 nM de Lysotracker vermelho por 30 min para marcar organelas acidíferas ao longo do caminho endossômico; 2 μg/mL de conjugado de transferrina Alexa 488 para marcar endossomas de reciclagem e triagem (caminho dependente de clatrina); 1 mg/mL70 kDa de conjugado de dextrano-FITC a 37° C. por 30 min para marcar macropinos- somas.

[00332] Co-localização / Anticorpos específicos para organelas. Vai ser realizada imunocitoquímica com marcadores conhecidos para Golgi e lisossomas. Para Golgi, Giantin (Abcam, policlonal de coelho, 1:2000) vai ser usado para células humanas; GM-130 (BD Pharmin- gen, 1 μg/ml) vai ser usado para células de camundongo. Para Lisossomas, vai ser usado LC3B (Cell Signaling, policlonal de coelho, 0.5 μg/ml).

[00333] Para coloração por Giantin ou LC3B, as células vão ser bloqueadas por 30 minutos em 10% de soro de cabra normal / 0,2% de BSA em PBS. Incubação por anticorpo primário (anticorpo policlonal de coelho anti-Giantin (Abcam catálogo no. ab24586, diluição a 1:2000) ou LC3B (Cell Signaling, C no. 2775, 0,5 ug/ml) vai ser feita por 3 horas, seguida por 60 minutos de incubação com de cabra bioti- nilado anti-IgG de coelho (Vector labs, cat no.: PK6101) em diluição a 1:200. Vai ser realizada detecção com Secondary Antibody Blocker, Blocker D, Streptavidin-HRP D (Ventana Medical Systems) e DAB Detection Kit (Ventana Medical Systems) de acordo com as instruções dos fabricantes.

[00334] Para coloração por GM-130, as células vão ser bloqueadas por 30 min in Camundongo IgG Blocking reagent (Vector Labs, Cat no.: MKB-2213) em PBS. A incubação do anticorpo primário (monoclonal anti-GM130, da BD Pharmingen; Cat no. 610822, concentração de 1 ug/mL) vai ser feita por 3 horas, seguida por 60 minutos de incubação de anticorpo secundário de camundongo biotinilado (Vector Labs, MOM Kit BMK-2202), em diluição a 1:200. Vai ser realizada detecção com Secondary Antibody Blocker, Blocker D, Streptavidin-HRP D (Ventana Medical Systems) e DAB Detection Kit (Ventana Medical Systems) de acordo com as instruções dos fabricantes.

[00335] Para estudos dependentes da temperatura, as nanopartículas vão ser incubadas com cRGD-PEG-nanopartículas a 4° C., 25° C., e 37° C. para avaliar a fração de superfície ligada versus partículas internalizadas.

[00336] Para estudos da exocitose, as nanopartículas (0,075 mg/ml) vão ser incubadas por 4 horas e lâminas de câmara lavadas com PBS, seguida por adição de meio fresco. Em intervalos de tempo de 0,5, 1,0, 1,5, 2,5, 4,5, e 8,0 horas, as células vão ser lavadas, tripsinizadas, e o sinal de fluorescência das células e do meio medido por fluorime- tria. Em estudos de dose resposta, as células vão ser incubadas sobre uma faixa de concentrações e tempos de incubação, e avaliadas usando citometria de fluxo. Em estudos da viabilidade, a viabilidade celular vai ser medida usando um teste de exclusão de azul de tripano antes e depois de incubação par avaliar para toxicidade. Em estudos de lapso de tempo, o mecanismo de internalização de nanopartícula em células vivas vai ser investigado depois de incubar as células com conjugados de nanopartículas em diferentes temperaturas de incubação (4° C., 25° C., e 37° C.) usando um microscópio confocal invertido durante um período de 12 horas em intervalos de 20 min.

Discussão

[00337] Foi visto que cRGD-PEG-dots e PEG-dots co-localizam com Lysotracker Red em células M21 e B16 sugerindo captação no caminho endossômico (Figura 22). Os dados mostraram que estas partículas colocalizam fortemente com transferrina e dextrano. Independente da funcionalidade superficial e da carga total, as nanopartículas (6 a 7 nm de diâmetro hidrodinâmico) estudadas pareceram seguir a mesma via. Imagiologia de lapso de tempo em ambos os tipos celulares demonstrou internalização das nanopartículas funcionalizadas dentro de uma pequena fração das células laminadas. As partículas foram eventualmente liberadas para estruturas vesiculares na região perinuclear. Não se espera que testes de colocalização com Giantin (ou GM-130) mostram sinal de nanopartícula fluorescente no Golgi.

Exemplo 12 Nanopartículas de Sílica de Dupla-Modalidade para Mapeamento de Linfonodo Sentinela Intraoperatório e Intervenções Guiadas por Imagem Nanopartículas de Sílica de Dupla-Modalidade para Mapeamento de Linfonodo Sentinela Intraoperatório Guiado por Imagem

[00338] Estes estudos foram expandidos para incluir e imagiologia ótica usando o sistema de câmera de fluorescência portátil ArteMIS®, junto com radiodetecção usando a sonda de radiação gama, para realizar avaliações em tempo real da drenagem dos linfáticos tumorais e de metástases nodais, bem como avaliação da carga tumoral. Em um mini porco representativo (Figuras 23a a 23i), foi realizada varredura por PET-CT pré-operatória inicial usando dots de 18F-FDG e 124I- cRGDY-PEG-C usando o procedimento de imagiologia precedente. Imagens por CT axial revelaram um tumor pélvico primário (Figura 23a) e linfonodo sentinela de drenagem (Figura 23b), os quais foram vistos como áreas de aumentada atividade sobre o 18F-FDG PET scan correspondente (Figuras 23c, 23d). Estes achados foram confirmados 2 dias depois por imagiologia por PET-CT dinâmica cerca de 5 minutos depois de injeção subdérmica em 4 quadrantes do rastreador de partícula em torno do sítio tumoral; visualições co-registradas axial (Figuras 23e, 23g) e coronal (setas, 23f, 23h) demonstram estes achados. Depois de varredura pré-operatória, a pele sobre o sítio do linfonodo sentinela foi marcda para localização intraoperatória, e o mini porco foi transportado para o conjunto intraoperatório. Medições da atividade basal, feitgas sobre os sítios do linfonodo sentinela e do tumor primário usando a sonda gama portátil (Figura 23i), mostraram um aumento de 20 vezes na atividade dentro do linfonodo sentinela em relação ao sinal de fundo.

[00339] Para imagiologia ótica em tempo real do sistema linfático, uma segunda injeção subdérmica de dots de 124I-cRGDY-PEG-C foi administrada em torno do sítio tumoral com a pele intacta, e o sinal foi visualizado nos canais colorido (Figura 24a) e fluorescente de Cy5.5 (Figura 24b). A bacia nodal adjacente foi exposta, e o sinal fluorescente foi visto no canal NIR escoando a partir do sítio de injeção (Figura 24c) para dentro dos ramos linfáticos principais proximal (Figuras 24c, 24d), mério (Figura 24e), e distal (Figura 24f), os quais drenaram para o linfonodo sentinela (Figura 24f). Canais linfáticos de menor calibre também foram visualizados (Figuras 24d, 24e). O linfonodo sentinela pigmentado de preto, visualizado em modo de duplo canal (Figuras 24g, 24h), foi adicionalmente exposto (Figura 24i) antes de excisão nodal sucessiva (Figuras 24j a 24m). O sinal de fluorescência dentro da amostra nodal in situ (Figura 24k) e ex vivo (Figura 24m) foi confirmado por emissões gama usando a sonda de radiação gama (Figura 24i), e foi visto que correspondia a aglomerados dispersos de células tumorais sobre visualizações de baixa potência (caixa, Figura 24n) e de alta potência (Figura 24o) de seções de tecido coradas com H&E. Expressão positiva de HMB45 foi identificada sobre visualizações de baixa potência (Figura 24p) e de alta potência (Figura 24q), consistente com melanoma metastático.

[00340] Surpreendentemente, e em contraste com os achados de 18F-FDG observados, dots de 124I-RGD-PEG-C foram considerados como especificamente discriminando entre infiltração por tumor metastático e processos inflamatórios nestes mini porcos. Diferenças meca- nísticas no comportamento destes agentes nos níveis celular e subce- lular, bem como a presença de uma porção de direcionamento para integrina sobre a superfície da partícula, podem representar os achados de imagiologia observados. Em múltiplos mini porcos abrigando alterações inflamatórias patologicamente comprovadas devido a doença granulomatosa (n = 3), 18F-FDG não conseguiu detectar doença metastática, ao passo que identificou sítios inflamatórios e outros sítios metabolicamente ativos. Estes achados discrepantes salientam a ca-pacidade do rastreador de partícula para seletivamente ter por alvo, localizar, e estagiar doença metastática, enquanto 18F-FDG falhou emmuitos casos para estagiar com precisão disseminação do câncer, ao invés de identificação de sítios de inflamação.

[00341] Em um estudo em mini porco representativo ilustrando estes achados, 18F-FDG PET-CT scans axiais iniciais mostraram calcificação dentro do pescoço posterior esquerdo em CT (Figura 25a), cor-respondente a uma área de intensa atividade no 18F-FDG PET (Figura 25b). Visualizações de baixa potência (Figura 25c) e de alta potência (Figura 25d) de seções de tecido coradas com H&E revelaram difusas alterações inflamatórias, consistentes com doença granulomatosa. In-tensa atividade de 18F-FDG PET foi adicionalmente vista dentro do compartimento da medula óssea metabolicamente ativo destes mini porcos jovens (Figuras 25a, 25b). Em contraste, o estudo de imagiologia de rastreador de partícula identificou linfonodos no pescoço metas- táticos bilaterais. Um linfonodo no pescoço direito na imagiologia por CT axial (Figura 25e) foi visto como sendo ávido por PET em PET-CT co-registrada (Figura 25f); linfonodos bilaterais adicionais em uma imagem por CT mais superior (Figura 25g) também foram hipermeta- bólicas em PET-CT fundida (Figura 25h). Além disso, calcificações no pescoço esquerdo (Figuras 25e, 25g) não apresentaram nenhuma atividade por PET em varreduras co-registradas (Figura 25f, 25h). Seções de tecido de SLN coradas com H&E correspondentes revelaram aglomerados melanomatosos escuros em visualizações de baixa potência (box, Figura 25i) e de alta potência (Figura 25j), vistas como consistindo de células de melanoma e melanófagos. Um único frame (Figura 25k) selecionado entre imagens reconstruídas de PET 3D novamente ilustrou múltiplos linfonodos ávidos por PET bilaterais e canais linfáticos de drenagem associados. De modo importante, a maior parte da atividade foi vista na bexiga 1 hora depois de injeção sem significativa acumulação de rastreadores sobre a região do fígado.

[00342] Foi visto que os achados acima aproveitavam melhor as imagens MIP de PET-CT fusão geradas a partir de dados de imagiologia dinâmica adquiridos durante um período de 1 hora depois de administração de 18F-FDG (Figura 26a) ou de rastreadores de partículas locais (Figuras 26b, 26c). Para 18F-FDG, é notada uma clara ausência de metástases nodais, com atividade difusamente aumentada vista dentro de estruturas ósseas metabolicamente ativas. Em contraste com estes achados, dots de 124I-cRGDY-PEG-C detectaram linfonodos do pescoço metastáticos bilaterais, junto com canais linfáticos de drenagem.

Nanopartículas de Sílica de Dupla-Modalidade para Intervenções Guiadas por Imagem: Resposta ao Tratamento.

[00343] A capacidade do rastreador de partícula para discriminar doença metastática a partir de alterações inflamatórias do tecido pode ser potencialmente explorada em uma variedade de situações terapêuticas -- quer cirurgicamente ou orientadas intervencionalmente -- uma vez que as avaliações da resposta ao tratamento são frequentemente confundidas pela presença de alterações inflamatórias, tornando difícil a interpretação. Intervenções guiadas por imagens, tais como ablações tumorais terapêuticas, podem se beneficiar especificamente da acoplagem inovadora da nova plataforma de partícula e de tecnologias de dispositivo de imagiologia para (1) permitir avaliação de resposta pós-procedural mais precoce; (2) verificar completa ablação ou detectar tumor residual representando fracasso do tratamento, e (3) aprimorar as estratégias de vigilância tumoral. Terapias localmente ablativas, incluindo ablação por microondas, crioablação, ablação por radiofre-quência (RFA), e terapia de laser intersticial, induzem lesão térmica local através de uma inserção de aplicador de energia dentro dos tumores. Estes métodos são tipicamente empregados como opções al- ternativas em pacientes considerados inelegíveis para excisão cirúrgica. Adicionalmente, pacientes submetidos a terapias ablativas são fre- quentemtente candidatos cirúrgicos pobres devido a co-morbidades. Amplamente usados na prática clínica, oferecem uma distinta vantagem, uma vez que podem ser realizados por via percutânea como pro-cedimentos ambulatoriais com significativamente menos morbidez, e podem melhorar a qualidade de vida e a sobrevida em coortes de pa-cientes selecionados.

[00344] Imagiologia pós-terapia precisa, tipicamente adquirida 1 a 3 meses depois de um procedimento de ablação, tradicionalmente utilizou aumento de contraste da imagiologia volumétrica, tal como CT ou MRI. Estas técnicas sofrem de uma série de desvantagens. Em primeiro lugar, são limitadas à identificação da presença de reforço ou crescimento anormais no tamanho da área do tumor, considerados indicadores pri-mários de tumor residual ou doença recorrente. Reforço difuso da orla em torno da zona de ablação em avaliações pós-procedurais podem ser relacionados com inflamação e hiperemia na zona de ablação, e fre-quentemente não representam necessariamente tumor residual. Reforço crescente, notavelmente irregular ou nodular, é considerado suspeito para tumor. No entanto, estas interpretações são controversas, uma vez que uma zona de ablação pode parecer maior do que o esperado por vários meses pós-procedimento, e o reforço também pode refletir granu-lação ou formação de tecido cicatricial.

[00345] Métodos funcionais, tais como 18F-FDG PET, também têm sido usados para avaliar a eficácia e os efeitos de procedimentos localmente ablativos, mas podem sofrer de uma incapacidade para discriminar com precisão tumor de alterações inflamatórias. Portanto, a interpretação de alterações em imagiologia (isto é, inflamação, tumor) no nível do tecido em resposta a procedimentos ablativos usando avaliações correntes morfológicas ou funcionais, particularmente em inter- valos de tempo iniciais, é um desafio importante. O que é necessário são desfechos confiáveis para sucesso da ablação e detecção inequívoca de doença residual no período pós-ablação.

[00346] Como um precursor para a realização de futuras ablações de lesões metastáticas do fígado, um estudo de ablação por radiofrequência (RFA) de prova de conceito de um linfonodo sentinela maior (isto é, 1 a 2 cm) foi realizado em um mini porco com melanoma metastático para avaliar resposta ao tratamento precoce na presença do rastreador de partícula. Achados de imagiologia por PET-CT antes e depois de RFA foram correlacionados histologicamente. Depois de injeção subdérmica de dots de 124I-cRGDY-PEG-C (~0,6 mCi) em torno do tumor pélvico esquerdo primário, um CT coronal basal inicial mostrou um lifonodo sentinela de 2,2*1,6 cm (Figura 27a) superior ao sítio do tumor, o qual foi ávido por PET (Figuras 27b, 27c). O tumor pélvico esquerdo hipermetabólico também é mostrado (Figura 27b), notando fluxo adicional de rastreador de partícula dentro de um canal linfático de drenagem em imagens por PET-CT fundidas (Figura 27c, 27d). Foram adquiridos CT scans seriais adicionais para localizar o linfonodo (Figura 27e) antes do procedimento de ablação e guiar a inserção da sonda de RFA (Figura 27f) para dentro do linfonodo (nível abaixo das miras). No PET-CT scan co-registrado pré-ablação correspondente, o SLN ávido por PET foi visto logo posterior às miras (Figura 27g). Foi realizada uma ablação de linfonodos parcial por 12 minutos usando uma sonda de RFA de ponta ativa de 2 cm (sistema de ablação "de ponta fria" Cool-tip, Covidien plc, Dublin, Irlanda). PET-CT scan pós- ablação mostrou atividade de rastreadores brandamente reduzida na zona de ablação, anterior à ponta do eletrodo (Figura 27h). Os achados de imagiologia pré- e pós-ablação foram confirmados histologicamente. Coloração por H&E de tecido de biópsia de núcleo pré- ablacionado do linfonodo sentinela confirmou difusa infiltração metas- tática tumoral em visualizações de baixa potência (Figura 27i) e de alta potência (Figura 27j). Pós ablação, a extensão da infiltração metastática diminuiu sobre tecido nodal corado com H&E, visto em visualizações de baixa potência (Figura 27k) e de alta potência (Figura 27l) cor-respondentes. Necrose coagulativa e tecido linfoide também foram identificados, junto com hemorragias multifocais (Figuras 27k, 27l, res-pectivamente). Visualizações de alta potência coradas com TUNEL antes de ablação revelam células neoplásicas dispersas (Figura 27m). Em coloração por TUNEL pós-ablação, foram vistas áreas focais de necrose (vermelho) tanto em visualizações de baixa potência (Figura 27n) quanto de alta potência (Figura 27o).

CONCLUSÕES

[00347] As metástases de linfonodo são um poderoso prognostica- dor do resultado para o melanoma. A detecção precoce de microme- tástases em linfonodos regionais usando mapeamento de SLN pode permitir a estratificação oportuna de pacientes para ramos de tratamento apropriados, e pode potencialmente melhorar os resultados dos pacientes. Embora as presentes técnicas de mapeamento e biópsia de SLN de padrão de tratamento se baseiem no uso de identificação de SLNs à base de radioatividade, existem uma série de limitações desta tecnologia. Estas incluem baixa resolução espacial, reduzida precisão do estagiamento, ausência de especificidade do alvo, clearance lento dos rastreadores que pode obscurecer o campo cirúrgico, e a falta de visualização intraoperatória precisa para prevenir lesão de estruturas vitais que se situam em íntima proximidade dos linfonodos sentinela.

[00348] A recente introdução de plataformas de partículas biocom- patíveis de geração mais nova, que podem ser ajustadas ativamente e refinadas para superar estas desvantagens de acordo com critérios de design chave, enquanto permitindo sondagem seletiva de alvos de câncer cruciais, pode oferecer importantes insights em processos celu lares e moleculares que governam a disseminação de doença metas- tática. A adaptação adicional de semelhantes plataformas para imagio-logia multimodalidade pode ser usada para aproveitar o cirurgião ou intervencionista para explorar estes processos em uma variedade de situações procedurais guiadas por imagens.

[00349] Uma plataforma de dupla-modalidade similar, uma nanopartícula de sílica de direcionamento para integrina traduzida clinicamente desenvolvida tanto para imagiologia ótical quanto por PET, satisfaz uma série de critérios de design chave -- tamanho pequeno, brilho superior, aumento da retenção tecidual do tumor, e baixo sinal de fundo - - que a tornam um agente ideal para localização e estagiamento de SLN durante procedimentos de biópsia de SLN quando acoplada com sistemas de câmera ótica em tempo real portáveis. A capacidade para discriminar doença metastática de alterações inflamatórias teciduais em modelos de melanoma, as quais são frequentemente processos co-existentes, pode proporcionar um marcador mais preciso e confiável para a avaliação da resposta ao tratamento no futuro. Investigação adicional em um grupo mais amplo de tipos de câncer e de tratamentos é garantida usando ou terapias de base cirúrgica ou intervencio- nalmente orientadas.

Exemplo 13 Mapeamento de Linfonodos Sentinela do Câncer de Próstata

[00350] Nanopartícula multimodal carregando fragmentos HuJ591- F(ab')2 são novas sondas diagnósticas para ligação de antígeno de membrana específico da próstata (PSMA). Ao sintetizar partículas car-regando múltiplos fragmentos F(ab')2, nós podemos (1) reforçar a afini-dade / potência de ligação devido a efeitos da multivalência e (2) alterar as distribuições in vivo, uma vez que o clearance e a captação vão ser dominados pelo comportamento cinético das partículas, ao invés do próprio anticorpo. Ao manter o tamanho das partículas abaixo ou exa- tamente no corte renal de 10 nm de diâmetro, é promovido o clearance renal. Adicionalmente, as proporções de alvo para fundo vão aumentar com base nos aprimoramentos em (1) e (2), potencialmente aprimorando a especificidade de diagnóstico e o estagiamento da doença.

Síntese / Caracterização de Partículas ligadas a 124I-J591 F(Ab')2.

[00351] De modo a gerar constructos de F(ab')2 PEGuilados, 100 ug de F(ab')2 foi adicionado a um tubo eppendorf em 100 μl de PBS, seguido por incubação com 4 μl de 2 mg/ml de reagente de Traut por 1 h em temperatura ambiente. Maleimida-PEG (6 mg) dissolvido em solução tampão foi em seguida adicionado. A solução foi incubada de um dia para o outro e purificada com uma coluna PD-10 antes da fixação de partículas. Fragmentos F(ab')2 são radiomarcados com iodo-124 (124I) para criar uma plataforma de partículas de dupla-modalidade, e a atividade específica, a pureza, e o rendimento radioquímico vão ser derivados. O tamanho e a concentração de partículas vão ser adicio-nalmente avaliados por FCS.

Exemplo 14 Nanopartículas de Sílica de Dupla-Modalidade para Direcionamento de Integrina no Melanoma em Seres Humanos

[00352] Os nanomateriais, em particular as sondas de nanopartículas, possuem propriedades fisicoquímicas e biológicas únicas, bem como versatilidade superficial. Ao explorar sua versatilidade superficial, partículas multifuncionais biocompatíveis podem ser modificadas seletivamente com marcadores moleculares que reconhecem e localizam alvos cancerígenos chave. De crescente importância em situações operativas está a necessidade de sondas de partículas multifuncionais orientadas oticamente mais robustas as quais podem aprimorar detecção em tempo real direcionada da disseminação de doença local / regional em torno do sítio tumoral primário, deste modo facilitando o tratamento. A delineação em tempo real da doença a partir de critical neural e/ou vascular estruturas em situações intraoperatórias também vai ser fundamental. Duncan, R, The dawning era of polymer therapeutics, Nat Rev Drug Discov 2, 347-360 (2003). Wagner, et al., The emerging nanomedicine landscape, Nat Biotechnol 24, 1211-1217 (2006). Scheinberg, et al., Conscripts of the infinite armada: systemic cancer therapy using nanomaterials, Nat Rev Clin Oncol 7, 266-276 (2010). Miyata et al., Polymeric micelles for nano-scale drug delivery, React. Func. Polym. 71, 227-234 (2011). Lee et al., Multifunctional me- soporous silica nanocomposite nanoparticles for theranostic applications, Acc Chem Res 44, 893-902 (2011). Schroeder et al., Treating metastatic cancer with nanotechnology, Nat Rev Cancer 12, 39-50 (2012). Rosenholm et al., Nanoparticles in targeted cancer therapy: mesoporous silica nanoparticles entering preclinical development stage, Nanomedicine (Lond) 7, 111-120 (2012). Ashley et al. The targeted delivery of multicomponent cargos to cancer cells by nanoporous parti-cle-supported lipid bilayers, Nat Mater 10, 389-397 (2011). Vivero- Escoto et al., Silica-based nanoprobes for biomedical imaging and theranostic applications, Chem Soc Rev 41, 2673-2685 (2012). Tada et al., In vivo real-time tracking of single quantum dots conjugated with monoclonal anti-HER2 antibody in tumors of mice, Cancer Res 67, 1138-1144 (2007). No entantoet, apesar dos extensivos desenvolvimentos de partículas até o momento, nenhuma sonda para imagiologia de partículas fluorescentes inorgânicas fez com sucesso a transição para a clínica como uma tecnologia de plataforma multifuncional direcionada. Altinoglu et al., Near-infrared emitting fluorophore-doped calcium phosphate nanoparticles for in vivo imaging of human breast cancer, ACS Nano 2, 2075-2084 (2008). Hilderbrand et al., Near-infrared fluorescence: application to in vivo molecular imaging, Curr Opin Chem Biol 14, 71-79 (2010). Choi et al., Design considerations for tumour- targeted nanoparticles, Nat Nanotechnol 5, 42-47 (2010). He et al., Near-infrared fluorescent nanoprobes for cancer molecular imaging: status and challenges, Trends Mol Med 16, 574-583 (2010).

[00353] Aqui nós descrevemos que uma primeira nanopartícula de fluorescência de ~7 nm, modificada como uma plataforma direcionada híbrida (ótica / PET) pela fixação de radiomarcadores e peptídeo cíclico de arginina-glicina-ácido aspártico-tirosina (cRGDY), é não somente bem tolerada em pacientes com melanoma metastático, mas podem preferencialmente detectar e localizar tumores presumidamente ex-pressando integrina em um regime de microdosagem com altas pro-porções de sinal para ruído. Não se observa significativa ligação da proteína do soro, e a integridade da partícula e de seus componentes superficiais são mantidas in vivo. Os resultados sobre segurança, far- macocinética, dosimetria e direcionamento sugerem a utilidade geral desta partícula excretada pelos rins no diagnóstico do câncer e para o planejamento de tratamento potencialmente orientador. Esta sonda de dupla modalidade constitui uma plataforma que pode ser adequada para tipos tumorais específicos os quais podem aprimorar a detecção de lesão ótica e/ou à base de PET e o estagiamento do câncer em seres humanos, bem como drug delivery, potencialmente levando a manejo do câncer melhor e mais personalizado.

[00354] Nós usamos uma sonda de nanopartícula inorgânica de dupla-modalidade (ótica / PET) ultra-pequena (~7-nm de diâmetro), para imagiologia molecular direcionada de cânceres expressando αvβ3 integrina. Esta sonda de nanopartícula é o primeiro novo fármaco in- vestigacional da agência FDA de sua classe e de propriedades apro-vadas para estudos primeiro em humanos (Figura 28a). A nanopartícula de sílica fluorescente (Cornell, ou C dots) sequestra de modo covalente moléculas de corante em um núcleo encapsulado por uma concha de sílica para prevenir filtração do corante e para reforçar o brilho e a fotoestabilidade. Ow, et al. Bright and stable core-shell fluorescent silica nanoparticles, Nano Lett 5, 113-117 (2005). Burns, et al. Fluores-cent silica nanoparticles with efficient urinary excretion for nanomedicine, Nano Lett, 9, 442-448 (2009). Espectros combinados por absorção demonstram este reforço do brilho por corante como diferenças na in-tensidade entre as emissões dos corantes encapsulados e livres (Figura 28b). Uma camada neutra de cadeias de poli(etileno glicol) (PEG) superficiais permite a fixação de um pequeno número de peptídeos cíclicos de arginina-glicina-ácido aspártico-tirosina (cRGDY) para ligação potente e seletiva de receptor de integrina. Benezra, et al. Multimodal silica nanoparticles are effective cancer-targeted probes in a model of human melanoma, J Clin Invest, 121, 2768-2780 (2011). As integrinas ativadas induem muitas alterações estruturais e de sinalização dentro da célula, além de regulação de caminhos de diferenciação, mediando as propriedades de adesão, e promoção da migração celular, da sobrevida, e da progressão do ciclo celular. Hood et al., Role of integrins in cell invasion and migration, Nat Rev Cancer, 2, 91-100 (2002). A fixação de etiquetas de imagiologia nuclear, tais como 124I, através de resíduos tirosina amplifica a sensibilidade do sinal para imagiologia por PET serial. O produto final, um rastreador de partícula altamente biocompatível e bioestável tumor-seletivo (124I-cRGDY-PEG- C-dots), proporciou previamente uma leitura do status do receptor de integrina por imagiologia por PET em xenoenxertos de melanoma humano, deste modo definindo uma classe distinta de plataformas tera- nósticas clareadas renalmente para nanomedicina. Jokerst et al., Molecular imaging with theranostic nanoparticules, Acc Chem Res, 44, 1050-1060 (2011).

[00355] Foi iniciado um teste clínico primeiro em humanos, empregando PET para avaliar quantitativamente a captação e a biodistribuição tumorais dependentes do tempo, a dosimetria da radiação, e a segurança deste agente em uma coorte de cinco pacientes com mela- noma metastático. Implícito no fundamento lógico do uso de imagiologia por PET está a evidência pré-clínica de que o radiotraçador de partícula não tem nenhum efeito farmacológico, radiogênico, ou biológico demonstrável diverso. Collins, J. M. Phase 0 clinical studies in oncology, Clin Pharmacol Ther, 85, 204-207 (2009). Kummar et al., Phase 0 clinical trials: recommendations from the Task Force on Methodology for the Development of Innovative Cancer Therapies, Eur J Cancer, 45,741-746 (2009). Depois de uma dose única de injeção intravenosa (i.v.) de aproximadamente 185 megabequerels (MBq) (~3,4 a 6,7 nanomoles, nmol) do rastreador de 124I-cRGDY-PEG-partícula (faixa de atividade específica de 27,8 a 57,4 GBq/μmol) em sujeitos humanos (Figura 28a), foram adquiridos três PET-CT scans de corpo inteiro durante um período de 72 horas para avaliar a farmacocinética, além de analisar os metabólitos em amostras de sangue e de urina durante um intervalo de duas semanas por contagem de raios gama e cromatogra- fia de radio camada fina (radioTLC).

[00356] Os cinco pacientes não tiveram eventos adversos e o agente foi bem tolerado durante o período do estudo. O comportamento farmacocinético, expressado como a percentagem da dose injetada por grama de tecido (% da DI/g), versus o tempo pós-injeção e as doses médias absorvidas pelos órgãos correspondentes (Figura 28d), foram comparáveis aos encontrados para outros radiotraçadores diagnósticos comumente usados. Imagiologia por PET serial deste paciente representativo (Figura 28d) mostrou progressiva perda da atividade do conjunto sanguíneo presumida pelos órgãos maiores e tecidos, sem atividade apreciável vista por volta de 72 horas pós injeção (p.i.). As meias-vidas de clearance do corpo inteiro nestes pacientes foram estimadas como variando de 13 a 21 horas. De modo interessante, não houve nenhuma localização notável no fígado, no baço, ou na medula óssea, em contraste com muitas moléculas hidrofóbicas, prote ínas, e plataformas de partículas maiores (>10 nm). Embora os pacientes tenham sido pré-tratados com iodeto de potássio (KI) para bloquear a captação pelo tecido da tiroide, foi obtida uma maior dose média absorvida pela tiroide neste paciente em relação a outros tecidos. As partículas também foram essencialmente excretadas pelos rins, com tanto o rim quanto a parede da bexiga (depois da tiroide e do tumor, vide abaixo), demonstrando um dos maiores valores de % da DI/g por volta de 72 horas pós injeção (Figura 28d); conforme é frequentemente o caso para radiofármacos excretados renalmente, a parede da bexiga recebeu uma maior dose média absorvida do que outros órgãos grandes e tecidos. O protocolo clínico detalhado (Figura 28C) e o fundamento lógico para este esquema, são adicionalmente descritos em Materiais e Métodos.

[00357] Estes achados salientam o fato de que excreção renal, ao invés de hepatobiliar, é a via predominante de clearance do corpo. O clearance renal eficiente será condicionado ao desenho de plataformas à base de partícula ultra-pequenas ou de sistemas macromolecu- lares que são da ordem dos cortes de tamanho de filtração glomerular renal eficaz de cerca de 10 nm ou menos. Choi, et al., Targeting kidney mesangium by nanoparticles of defined size, Proc Natl Acad Sci USA, 108, 6656-6661 (2011). Uma pequena fração da atividade administrada (menos de 5%) foi vista como captação no estômago e nas glândulas salivarys deste paciente, consistente com iodo livre, o qual foi progressivamente clareado durante o período da imagiologia. A partícula não apresenta propriedades típicas de agentes reticuloendoteli- ais (isto é, colóide de tecnécio-99m enxofre), cuja captação reflete a função dos macrófagos, principalmente no fígado. Com base em dados anteriores adquiridos para radiotraçadores de cRGD, não foram observados focos inesperados de atividade. Haubner, R., et al. Synthesis and biological evaluation of a (99m)Tc-labelled ciclic RGD peptide for imaging the alphavbeta3 expression, Nuklearmedizin, 43, 26-32 (2004).

[00358] De modo importante, estas propriedades apontam para o comportamento farmacocinético um tanto único exibido por esta partícula de imagiologia de dupla-modalidade inorgânica como um agente clareado pelos rins. Análises metabólicas de amostras de sangue (Figura 29a) e de urina (Figura 29b) por contagem de raios gama revelaram no mínimo uma queda na atividade dos rastreadores da ordem de magnitude durante um período de 72 horas, com essencialmente nenhuma atividade remanescente ao final deste intervalo. A atividade de partículas foi em grande parte confinada à fração plasmática do sangue sem evidência de significativa ligação de proteína do soro (dados não mostrados). Análises por RadioTLC de amostras de plasma revelaram um único pico durante 24 h pós injeção (Figuras 29c a 29e), correspondente à nanopartícula radiomarcada intacta. Em amostras de urina, dois picos, um correspondente à nanopartícula intacta e o outro a uma amostra mais móvel (identificada como iodo livre), foram vistos durante um período de 24 horas (Figuras 29f a 29h). Análises por RadioTLC do rastreador de partícula (Figura 29i), peptídeo radioiodado (131I-cRGDY, Figura 29j), e radioiodo çovre (131I, Figura 29k) confirmaram que o primeiro e o segundo picos nos radiocromatogramas corresponderam à nanopartícula intacta e ao iodo livre, respectivamente. Portanto, estes achados sugeriram que não ocorreu nenhuma perda mensurável de integridade das partículas durante o curso do estudo, mesmo depois de excreção através dos rins.

[00359] Embora a detecção tumoral não fosse o objetivo deste estudo de microdosagem de PET, surpreendentemente, apesar da baixa dose injetada, houve evidência de localização tumoral do rastreador de partícula. No primeiro caso, um PET-CT scan de corpo inteiro foi ad-quirido quatro horas depois de administração i.v. de 124I-cRGDY-PEG- C-dots em um paciente com melanoma da mucosa anorretal. Em ima-gens por CT coronal (Figura 30a), foi vista uma grande área arredondada de densidade reduzida (ponta de seta) no lobo esquerdo inferior do fígado, o sítio de uma lesão metastática conhecida por imagiologia por PET/CT de fluorodesoxiglucose anterior (18F-FDG) (dados não mostrados). No PET coronal (Figura 30b) e PET e CT scans co- registrados (Figura 30c), um arco de maior captação circunscreveu esta lesão (Figura 30b ponta de seta; Figura 30c) e subsequentemente clareou por volta do tempo do PET scan de 24 horas, sugerindo alguma localização preferencial nesta metástase expressando integrina presumida. Foi vista significativa atividade dentro da bexiga, do trato gastrointestinal (estômago, intestinos), do coração, e da vesícula biliar. Em um segundo sujeito, foi vista uma lesão cística bem definida no lobo anterior direito da glândula pituitária por imagiologia por ressonância magnética (MRI) axial (Figura 31a) e sagital (Figura 31b).

[00360] Esta lesão, um achado estável em varreduras por MRI an-teriores, foi presumida como sendo um microadenoma da pituitária, um neoplasma intracranial conhecido por apresentar propriedades malignas, tais como neoangiogênese e progressão para dentro de tecidos peritumorais. O preciso co-registro deste foco ávido por rastreador com imagens multiplanares por MRI (Figuras 31c, 31d) e CT (Figura 31e, 31f) confirmou sua localização dentro da glândula pituitária anterior. Inicialmente visto como um foco de intensa atividade, progressivamente aumentou de intensidade durante um intervalo de 72 horas (seta, Figuras 31g a 31i), acompanhado por uma diminuição correspondente no sinal de fundo em torno da medula, deste modo produzindo maiores proporções tumoral para fundo (isto é, tumoral para cerebral (T/B) ~6) e tumoral para hepática (T/L) ~2)) (Figura 31j). Os resultados da imagiologia por PET podem ser explicados com base nos achados em um estudo anterior mostrando aumentada expressão de αvβ3 integrina no parênquima de um subgrupo de adenomas, bem como aumento dos níveis de expressão de integrina em células estro- mais adenomatosas em relação a células do tecido conjuntivo normal. Farnoud, et al., Adenomatous transformation of the human anterior pi-tuitary is associated with alterations in integrin expression, Int J Cancer, 67, 45-53 (1996).

[00361] Nossos dados iniciais corroboram a noção de que estudos de PET scan humanos com este veículo de imagiologia direcionada são uma abordagem de fundamento lógico para detecção e localização de tumores expressando integrina presumíveis. Nós estamos planejando métodos de escalonamento de dose para determinar um ótimo equilíbrio entre segurança, clearance do corpo inteiro, e eficiência de direcionamento tumoral em testes clínicos mais avançados. Os referidos estudos orientados por PET scan também podem permitir quantificação precisa dos níveis de expressão de receptor de integrina de modo a obter máxima eficiência do direcionamento, bem como detecção de alterações nestes níveis. Adicionalmente, o uso destas ferramentas de imagiologia molecular quantitativa pode produzir informação sobre alterações dependentes do tempo na captação e acumulação de partículas dentro dos tumores. Kelloff, G. J., et al., The progress and promise of molecular imaging probes in oncologic drug development, Clin Cancer Res, 11, 7967-7985 (2005). Para o caso do adenoma da pituitária, nós fomos capazes de computar a captação cumulativa de partículas dentro desta lesão. Especificamente, nós computamos a fração da atividade injetada total e o número de partículas que se acumularam neste sítio durante um período de imagiologia de 72 horas. Usando o valor de máxim captação padronizada medida (SUVmax, vide Métodos) da lesão (isto é, 46,5) em 72 horas pós injeção (quase um fator de dez maior do que aquele no tecido da pituitária normal), corrigido para efeitos de volume parcial, bem como a massa aproximada da lesão (isto é, produto do volume da lesão e uma densidade presumida de 1 g/cm3), e a massa corporal do paciente, nós descobrimos que, em relação a uma carga de partícula injetada de 2x1015, a grosso modo 1,78x1011 partículas (0,01% da dose injetada, % da DI) ou 1 parte por 10.000 se acumularam no sítio da lesão. Os valores de captação padrão (SUV) são definidos como a atividade por grama de tecido dividida pela atividade administrada por grama de massa corporal. Alterações dependentes do tempo na % da DI/g e a dosimetria desta lesão, em relação a órgãos grandes e tecidos, são mostradas nas Figuras 28c e 28d.

[00362] Os resultados sugerem que o rastreador de partícula injetado sistemicamente foi bem tolerado e seguro. As medidas de segurança incluíram monitoramento da captação nos órgãos normais, bem como indicadores laboratoriais de toxicidade. Objetivos secundários foram estimar as doses de radiação e avaliar a atividade metabólica do plasma e da urina. As avaliações de segurança foram baseadas na dosimetria, na falta de sintomas clínicos, e na ausência de quaisquer indicações laboratoriais de toxicidade da partícula (fármaco).

[00363] Os resultados obtidos a partir deste estudo clínico primeiro em humanos apontam para um rastreador de partícula sistemicamente injetado que apresentou assinaturas farmacocinéticas favoráveis e re-produtíveis definidas pela excreção renal. Em contraste com agentes reticuloendoteliais (isto é, colóide de tecnécio-99m enxofre) e macro- moléculas, tais como anticorpos, não houve nenhuma acumulação de rastreador de partícula apreciável dentro do fígado, do baço, ou da medula óssea. Nossos dados claramente indicam que uma grande proporção da atividade administrada foi eliminada através do sistema urinário (Figuras 28E, 29B); as concentrações de atividade na bexiga urinária foram até uma ordem de magnitude maior do que as no fígado, por exemplo. Com base na hipótese conservadora de que toda a atividade hepática é essencialmente excretada através da via hepato- biliar, estes dados são consistentes com ~90% da atividade administrada sendo excretada através do sistema urinário e somente ~10% através da via hepatobiliar. Nos órgãos / tecidos remanescentes, notavelmente nos pontos do tempo iniciais (2 a 4 horas), a atividade residual reflete em grande parte a do grupo do sangue.

[00364] Detecção direcionada não serviu como um desfecho do estudo, e procedimentos de escalonamento da dose para obter máxima captação nos sítios de doença, portanto, não foram incorporados no esquema do teste (isto é, não foi feita nenhuma tentativa de ajustar as doses de partículas para otimizar o direcionamento tumoral). No entanto, apesar das baixas quantidades nanomolares usadas, ocorreu localização e acumulação preferencial do rastreador de partícula em vários tumores. Em um dos pacientes com um adenoma da pituitária presumido, os resultados da imagiologia por PET apresentaram progressiva acumulação pura da atividade do rastreador de partícula no sítio da lesão. Os resultados deste estudo sugerem que nossas partículas inje-tadas sistemicamente são bem toleradas e apresentam uma assinatura farmacocinética "macromolecular" distintamente única, onde a maior parte do clearance renal predomina sem significativa captação pelo sistema do retículo endotelial. Isto está em contraste com muitas mo-léculas hidrofóbicas, proteínas, e plataformas de partículas maiores (>10 nm). Esta característica é altamente atípica para nanopartículas (as quais geralmente apresentam diâmetros maiores do que os valores de corte renal estimados, e, portanto, pouca excreção renal e clearance mais lento) e assegura avaliação clínica de nossa plataforma de nanopartículas ultrapequenas.

[00365] Estes resultados, junto com dados essenciais sobre segurança, farmacocinética, e dosimetria da plataforma de imagiologia de C dots de dupla-modalidade, sugere a utilidade geral desta técnica de microdosagem humana em termos da produção de leituras chave tumor-específicas para o diagnóstico do câncer. As referidas cargas estimadas de rastreador de partícula acumuladas no tumor (ou concentrações), junto com o conhecimento da resposta inibitória celular (isto é, IC50 ou concentração inibitória de 50%), podem ser usadas potencialmente para prever os requisitos de dosagem terapêutica para um determinado fármaco.

Métodos Síntese e Caracterização de pontos de cRGDY-PEG-C (cRGDY-PEG- C-dots).

[00366] Para detalhes referentes à síntese e à caracterização de PEGylated e cRGDY (Peptides International, Louisville Ky.) surface- funcionalizadas núcleo fluorescente-shell silica nanopartículas (cRGDY-PEG-C-dots) encapsulating the organic dye, Cy5 (emissão maxima ~650 nm, 2 dye equivalents dentro do núcleo da partícula core), vide uma publicação anterior deste grupo e referências na mesma. Benezra, M., et al., Multimodal silica nanoparticles are effective cancer- targeted probes in a model of human melanoma, J Clin Invest, 121, 2768-2780 (2011). Em resumo, as partículas foram preparadas por uma condensação de sílica do tipo de Stober modificada. Bogush, et al., Preparation of monodisperse silica particles: Control of size and mass fraction, J Non-Cryst Solids, 104, 95-106 (1988). Herz, et al., Large stokes-shift fluorescent silica nanoparticles with enhanced emission over free dye for single excitation multiplexing, Macromol Rapid Commun, 30, 1907-1910 (2009). Sadasivan, et al., Alcoholic solvent effect on silica synthesys--NMR and DLS investigation, J Sol-Gel Sci Technol, 12, 5-14 (1998). PEGs bifuncionais foram derivatizados com silanos para fixação à superfície da sílica e para ligação de peptídeo. Peptídeos cRGDY contendo a sequência ciclo-(Arg-Gly-Asp-Tyr) e carregando resíduos cisteína (Peptide International) foram anexados a cadeias de PEG funcionalizadas através de uma ligação de cisteína- maleimida. O raio hidrodinâmico, o brilho, e as concentrações de pontos de cRGDY-PEG-C, bem como contra corante Cy5 livre, foram analisados em um Zeiss LSM 510 Confocor 2 FCS usando excitação de HeNe a 633 nm.

Radiomarcação de pontos de cRGDY-PEG-C (cRGDY-PEG-C-dots).

[00367] Resíduos tirosina foram conjugados a cadeias de PEG para fixação de porções de radioiodo (isto é, 124I, 131I). Hermanson, G, Bio-conjugate Techniques, (Academic Press, Londres, Reino Unido, 2008). Yoon, T. J., et al. Specific targeting, cell sorting, and bioimaging with smart magnetic sílica core-shell nanomaterials. Small, 2, 209-215 (2006). Radiomarcação de pontos de cRGDY-PEG-C (cRGDY-PEG-C- dots) foi realizada usando o método do IODOGEN (Pierce). Piatyszek, et al., Iodo-Gen-mediated radioiodination of nucleic acids, Anal Bio- chem, 172, 356-359 (1988). O produto radiomarcado foi elutriado de colunas de PD-10 e avaliado usando uma calibrador de dose (Capintec, Ramsey N.J.) e radioTLC; as atividades específicas das frações de partículas ligadas a 124I foram da ordem de 1450 milicuries (mCi)/μmol e a pureza radioquímica foi maior do que 95%.

Seleção de Pacientes.

[00368] Sujeitos com melanoma metastático com confirmação histológica da doença e abrigando tumor recém diagnosticado ou recorrente foram elegíveis para o estudo. Indivíduos que tinham enfermidade médica não relacionada com melanoma, o que impediria a administração do rastreador de partículas, foram excluídos do estudo. Solução de iodeto de potássio (SSKI, 130 mg por dia) foi administrada 2 dias antes e até 2 semanas depois de injeção intravenosa do rastreador de partícula radio-iodado (dots de 124I-cRGDY-PEG-C, 185 MBq/5 ml) para bloquear a função da tiroide. Este protocolo foi aprovado pelo Institutional Review Board of the Memorial Sloan Kettering Cancer Center. Os pacientes foram testados para função hemotológica, renal, e hepática antes e depois de PET e proporcionaram consentimento informado assinado.

Aquisição e Processamento de Imagem.

[00369] Varreduras por CT espiral de baixa dose foram obtidas por procedimento de rotina, seguido pela aquisição de três varreduras por PET do corpo inteiro em um scanner de GE Discovery STE PET/CT 4 dedicado, 24, e 72 horas pós-injeção do rastreador de partículas. Os dados de emissão de pósitrons foram reconstruídos usando o algoritmo de maximização da expectativa de subgrupos ordenados (OSEM). As imagens foram corrigidas para atenuação usando os dados de transmissão de CT coletados sobre a mesma região que para imagio-logia por emissão, e foi realizado registro do conjunto de dados seriais usando grupos de dados de CT.

Imagiologia e Análises Metabólicas.

[00370] Para análises farmacocinética e dosimétrica, regiões de in-teresse (ROIs) foram desenhadas sobre dados de imagiologia por PET (AW Workstation, GE Healthcare, Ridgewood, N.J.) de modo a extrair os valores de captação padrão média e máxima (SUVs) para todos os órgãos maiores e tecidos normais, incluindo cérebro, pulmão, ventrículo esquerdo, fígado, baço, intestino, rins, bexiga, músculo, mama, e tumor(es). Para avaliação farmacocinética, os SUVs foram convertidos para valores de % da DI/g (isto é, SUV = % da DI/g de tecido x massa corporal do paciente / 100). Os dados de captação dos órgãos / tecidos foi suplementado por dados de tempo - atividade do sangue e da urina. Amostras de sangue venoso e de urina foram coletadas em aproximadamente 30 min, 3 horas, 24 horas, 72 horas, e até 2 semanas depois de injeção de dots de 124I-cRGDYPEG-C. Depois de centrifugação das amostras de sangue total (4000 rpm, 10 min), o sobrena- dante plasmático, junto com amostras de urina, foram avaliados em um contador de cavidade de cintilação (1480 Automatic Gamma Counter, Perkin Elmer, Shelton Conn.) calibrado para 124I. Análises por Ra- dioTLC foram adicionalmente realizadas sobre as amostras biológicas. Análises por RadioTLC do rastreador de partículas, peptídeo nativo (cRGDY) marcado com 131I, e iodo livre (131I) serviram como controles de modo a facilitar a interpretação. As atividades (contagens por minuto, cpm) foram convertidas para microcuries, corrigidas por decaimento, e ajustadas para volumes divididos em alíquotas. Os valores finais foram expressados como % da DI/g. Valores do fator de retenção (Rf) para o rastreador foram obtidos e usados para identificação do composto de origem e de possíveis metabólitos.

Dosimetria da Radiação.

[00371] O método de dosimetria da radiação de rotina é uma adaptação do método promulgado pelo Commitê MIRD (Medical Internal Radionuclide Dosimetry), responsável pelas propriedades físicas dos radionuclídeos administrados (124I) bem como pelas propriedades bio-lógicas (farmacocinéticas e biodistribuição) do radiofármaco em paci-entes individuais. As emissões de 124I e suas respectivas frequências e energias são obtidas a partir das publicações de MIRD Radionuclede Data and Decay Scheme. PET scans seriais de corpo inteiro permitiram derivação das estimativas de dose absorvida por órgão normal (rad e rad/mCi) usando dados de tempo - atividade derivados por ROI. PET scans foram adquiridos com todos os parâmetros idênticos, incluindo o tempo de varredura. Usando a massa do corpo total do paciente (em kg) e as massas de órgãos do homem padrão de 70 kg (70-kg Standard Man), os dados de ROI de corpo total e dos órgãos (isto é, valores de captação padrão média (SUVs) foram convertidos para atividades (isto é, fração da dose injetada). Os dados de tempo - atividade derivados por imagem precedentes foram ajustados para funções exponenciais usando um algoritmo de ajuste de quadrados mínimos e as resultante funções de tempo - atividade foram integradas analitica-mente, incorporando o efeito do decaimento físico do 124I para produzir as atividades acumuladas (ou durações da permanência) em μCi ho- ras/μCi nos órgãos e no corpo total. As atividades acumuladas foram usadas para calcular doses médias absorvidas por partículas com etiqueta de 124I para os órgãos (rad/mCi) e a dose efetiva (rem/mCi) para o modelo anatômico masculino (Standard Man) padrão de 70 kg empregando o programa OLINDA EXM MIRD. Loevinger et al., MIRD Primer for Absorbed Dose Calculations, Society of Nuclear Medicine, New York, N.Y., 1991.

Testes de Ligação de Proteína Sérica.

[00372] Amostras de sangue total foram coletadas em tubos separadores de soro a partir de um modelo de mini porco de melanoma metastático (Sinclair Research Center, MO), seguido por centrifugação (4000 rpm, 10 min) de modo a isolar a fração plasmática. Uma alíquota de soro foi deixada de lado para contagem de raios gama; a fração remanescente foi tratada com etanol (200 proof, Decon Labs, King of Prussia, Pa.), turbilhonada até ficar turva, e colocada sobre gelo seco (5 min) para promover precipitação das proteínas do soro. Depois de centrifugação, o sobrenadante foi coletado para contagem de raios gama e o pélete foi lavado repetidamente com salina tamponada com fosfato e centrifugado (4000 rpm, 10 min) para coletar alíquotas de 100 μL de sobrenadante para contagem de raios gama (1480 Wizard 3'').

Exemplo 15 Alfa-MSH-PEG-Cy5-Partículas (Partículas Ligadas a Peptídeo MSH)

[00373] O peptídeo N-Ac-Cys-(Ahx)2-D-Lys-ReCCMSH (ou alfa MSH) usado para conjugação de nanopartículas tem a estrutura mostrada na Figura 32. É anexado à nanopartícula através do tiol da ciste- ína N-terminal. Um espaçador de duas unidades de ácido amino hexa- nóico separa o ponto de fixação da nanopartícula da molécula de dire- cionamento de D-Lys-ReCCMSH. A molécula de direcionamento de ReCCMSH original é mostrada na Figura 33. Foi projetada para direci-onar o radionuclídeo para tumores de melanoma para imagiologia e terapia. O peptídico análogo de MSH pode ser diretamente radiomar- cado com 99mTc ou 188Re (no sítio do Re) ou através de um quelador de metal anexado ao término amino. O análogo peptídico alfa MSH mostrado na Figura 32 é bastante diferente do análogo de MSH original mostrado na Figura 33. A molécula de MSH original não pode ser anexada a uma nanopartícula. O peptídeo MSH da nanopartícula contém um grupamento amino livre contendo cadeia lateral para radiomarcação. Esta é presentemente uma D-Lisina mas pode ser uma cadeia lateral terminada por grupamento amino de 1 a muitos carbonos de comprimento.

[00374] A conjugação do N-Ac-Cys-(Ahx)2-D-Lys-ReCCMSH (ou alfa-MSH) à nanopartícula permite que a nanopartícula tenha por alvo e ligue células e tumores de melanoma. As partículas resultantes, ou dots de alfa-MSH-PEG-Cy5-C tinham cerca de 6 a 7 nm de diâmetro interno (i.d.) usando FCS e continham, em média, cerca de 2,6 corantes por partícula. O número de ligantes de alfa-MSH por partícula foi estimado em <10.

[00375] Estudos de ligação competitiva usando partículas conjugadas a N-Ac-Cys-(Ahx)2-D-Lys-ReCCMSH (ou alfa-MSH): Em um teste d eligação competitiva com um agonista de receptor de melanocortina- 1 (125I-NDP), as nanopartículas conjugadas a alfa MSH tinham uma IC50 para células de melanoma B16/F1 cultivadas de 6,6x10-10 M (Figura 34A), ao passo que uma versão da molécula de sequência mista tinha uma IC50 de 2,3*10-7 M (Figura 34B). Além disso, houve uma diferença na ligação de 3 ordens de magnitude. Para referência no mesmo tipo de teste de ligação competitiva, o DOTA-ReCCMSH original tinha uma IC50 de 2,1*10-9 M.

[00376] O conjugado de nanopartícula ligada a peptídeo N-Ac-Cys- (Ahx)2-D-Lys-ReCCMSH (ou alfa-MSH) teve melhor afinidade para as células B16/F1 do que o DOTA-ReCCMSH original e muito maior afi-nidade do que a nanopartícula de peptídeo misto.

[00377] Dados de dose-resposta foram adicionalmente obtidos como uma função das concentrações de partículas direcionadas (Figura 35A) e dos tempos de incubação (Figura 35B) para ambas as linhagens de células de melanoma B16F10 e M21. As concentrações de saturação para estas linhagens, com base em estudos de citometria de fluxo, foram consideradas como sendo de ordem de ~100 nM para estes dois tipos celulares, e foram necessários tempos de incubação de no mínimo 2 horas para maximizar a ligação.

[00378] Estudos de sobrevida de células M21 humanas, realizado sobre uma faixa de concentrações de partículas por um tempo de incubação fixo de 48 horas não demonstrou nenhuma perda significativa da viabilidade celular (Figura 36).

[00379] Nanopartículas conjugadas a alfa-MSH radiomarcadas com 125I demonstraram excreção renal em grande volume durante um período de 24 horas em ambos os modelos de xenoenxerto murino B16F10 e M21 (Figuras 37A, 37B); não foi medido nenhum rastreador de partícula apreciável em pontos do tempo posteriores (isto é, >24 horas). Além disso, nenhum dos modelos de xenoenxerto B16F10 nem M21 apresentou acumulação significativa da sonda de partículas direcionadas no sistema retículo endotelial (isto é, não um agente do RES), nem no rim (Figuras 38A, 38B), o último órgão tipicamente um sítio que acumula alfa-MSH inespecificamente dada sua carga positiva pura. Portanto, a fixação de alfa-MSH à sonda de partículas significativamente aprimorou suas propriedades de clearance renal e eliminou a acumulação dentro dos rins.

Exemplo 16 Sinalização Mediada por Integrina e Modulação da Biologia Tumoral

[00380] A sinalização de integrina regula diversas funções em células tumourais, incluindo adesão / disseminação, migração, invasão, proliferação e sobrevida. Em vários tipos de tumores, incluindo o me-lanoma, a expressão de integrinas particulares se correlaciona com aumento da progressão da doença e diminuição da sobrevida do paci-ente. Interações de adesivo mediadas por integrina identificaram novas funções da integrina em mecanismos de sobrevida celular e na ativação de caminhos de sinalização divergentes. É de conhecimento geral que a ligação de peptídeos (ou aglomerados de peptídeos), contendo a sequência RGD, a receptores de integrina leva a reticulação ou aglomeração de integrinas a qual, por sua vez, modula os processos acima. No entanto, não está claro se nanopartículas carregando múltiplos ligantes peptídicos RGD podem adicionalmente acionar semelhantes eventos de sinalização de integrina, uma vez que isto vai refletir uma complexa dependência de múltiplos fatores com base nas partículas (tamanho, carga, composição, química de superfície, número / tipo de ligante), do tipo de células tumorais (ou endoteliais), na densidade dos receptores celulares, e na dosagem das partículas. Nossos estudos de dose resposta demonstram modesta ativação de caminhos de sinalização divergentes depos de exposição celular a concentrações de partículas maiores do que 100 nM as quais, por sua vez, promovem a migração de células M21 e HUVEC, a atividade proli- ferativa, e alteram as propriedades de adesão.

Ligação de cRGDY-PEG-C-dots a Células M21 e HUVEC

[00381] O receptor de αvβa integrina desempenha um papel chave na remodelagem vascular e na angiogênese, demonstrando aumentada expressão sobre as superfícies de células endoteliais e tumorais para uma variedade de linhagens de células tumorais. Isto leva ao uso deste receptor como um alvo para fins diagnósticos e terapêuticos. Em nosso caso, os dots de cRGDY-PEG-C foram testados por sua capa-cidade para ligar a células de melanoma (M21) ou a células endoteliais vasculares umbilicais humanas (HUVEC) como uma função da con-centração e do tempo. Eestudos de dose resposta iniciais mostraram um aumenot progressivo na ligação de dots de cRGDY-PEG-C a células M21 e HUVEC como uma função da concentração por citometria de fluxo (Figura 39, Figura 47A). Ligação de partícula demonstrou saturação a cerca de 100 nM para ambas as linhagens celulares, com % média de valores bloqueados de cerca de 80% para células M21 e de 96% para células HUVEC. O comportamento de dose-resposta foi adicionalmente investigado como uma função dos tempos de incubação de partículas para ambos os tipos celulares depois de incubação com 100 nM de dots de cRGDY-PEG-C. Foi observada máxima ligação em 2 horas pós-incubação, parmenecendo relativamente constante depois disso (Figura 47B).

Endocitose e Tráfico Intracelular de cRGDY-PEG-C-dots

[00382] De modo a elucidar a natureza do caminho ou dos caminhos utilizados por cRGDY-PEG-C-dots depois de sua incubação em células M21 -- que este seja um processo de captação mediado por receptores de αvβ3 integrina e/ou inespecífico, nós examinamos a captação destas partículas dependente da temperatura para um tempo de incubação de 4 horas em três temperaturas: 4°, 25° C. e 37° C. Os resultados, resumidos na Figura 39A, C indicam um aumento em cRGDY-PEG-C-dots associados com células a 37° C. em comparação com 25° C. ou a 4° C. em ambas as linhagens celulares testadas. Além disso, a internalização de cRGDY-PEG-C-dots foi parcialmente bloqueada na presença de excesso (*250) de anticorpo para receptor de αvβ3 em células M21 e HUVEC (Figuras 39A, 39C), sugerindo um componente de ligação mediada por receptor. Adicionalmente, a captação em células M21L negativas para αvβ3 foi a grosso modo um fator de 4 a 8 vezes menor do que a vista com células expressando αvβ3 tanto a 37° C. quanto a 25° C. (Figura 39B), respectivamente.

[00383] De modo a caracterizar adicionalmente os compartimentos celulares envolvidos na internalização de dots de cRGDY-PEG-C, nós realizados testes de colocalização em células M21 com dots de cRGDY-PEG-C e biomarcadores de diferentes vesículas endocitóticas. A internalização da partícula direcionada (~1 μM, vermelha, 4 horas incubação) foi detectada com sensibilidade por um microscópio confocal invertido (Leica TCS SP2 AOBS) equipado com uma objetiva HCX PL APO (63X1.2NA Water DIC D) (Figura 39D). Usando marcadores endocitóticos LysoTracker Red (100 nM, green) (Figura 39D) e trans- ferrina-Alexa488, foi confirmada a captação dentro de estruturas endo- cíticas acidíferas, sugerindo atividade de caminho dependente de cla- trina e acidificação gradual das vesículas. A Figura 39D mostra dados de co-localização entre a partícula e vesículas endocíticas acidíferas 30 (pontos amarelos). Também foi observada captação dentro de ma- cropinócitos com 70 kDa de dextran-FITC o qual co-localizou com dots de cRGDY-PEG-C; este achado sugeriu um segundo caminho de in-ternalização. Foi realizada contracoloração nuclear (azul) com Hoechst. Nenhuma partículas entrou no núcleo. Imagiologia de lapso de tmepo confirma a captação de partículas dentro das células M21 e colocalização com o marcador lisossômico, Lamp1.

Ligação Competitiva de Receptor de αvβ3 Integrina e Especificidade Molecular

[00384] Testes de ligação competitiva mostraram bloqueio da ligação de partículas mediada por receptor em células M21 e HUVEC (Figura 48A) por 80% a 85% nas primeiras e 30 a 40% nas últimas usando excesso (x50-x100) de peptídeo cRGDY e contagem de raios gama do rastreador de partícula radiomarcado (dots de 124I-PEG-cRGDY-C). Por contraste com dots de cRGDY-PEG-C, foram vistas significativas redu ções na magnitude da ligação de receptor em células M21 (~30% a 43%) e HUVEC (~13% a 27%) depois de incubação com sondas de partículas não-direcionadas (isto é, dots de PEG-C) por citometria de fluxo (Figura 48B).

Influência de dots de cRGDY-PEG-C sobre a Viabilidade e a Proliferação Celulares

[00385] De modo a demonstrar que dots de cRGDY-PEG-C não afetaram adversamente a sobrevida e a proliferação celulares, células M21 e HUVEC sincronizadas por fases G0/G1 foram expostas a uma faixa de concentrações de partículas (25 a 200 nM de dots de cRGDY-PEG- C; 15 min ou 24 hr) e tempos de incubação (0 a 93 horas) em meio su-plementado com soro (2%, 10% de FBS) a 37° C., e foram medidas as alterações na absorvência dependentes do tempo usando uma leitora de placas ótica (À=440 nm). Em relação aos controles (isto é, meio su-plementado com soro), as medições das absorvência foram consideradas como sendo relativamente constantes sobre a faixa de concentrações de partículas testadas, sugerindo que não houve nenhuma perda significativa de sobrevida celular (Figuras 49A, 49B). Adicionalmente, não foram vistas reduções na absorvência dependentes do tmpo depois de adição multi-dose (n = 5) de 100 nM de dots de cRGDY-PEG-C a células M21 e HUVEC, sugerindo que não houve nenhuma alteração as propriedades proliferativas das células (Figuras 49C, 49D).

Ativação do Caminho FAK por cRGDY-PEG-C-dots

[00386] A ligação de um ligante ao receptor de αvβ3 integrina é conhecida para iniciar caminhos de transdução de sinal. Depois da ligação, ocorre aglomeração de integrina, o que leva a autofosforilação da quinase FAK não-receptora na tirosina 397, um sítio de ligação para as quinases da família Src. Recrutamento da Src quinase resulta na fos- forilação de FAK na tirosina 576/577 e de FAK na tirosina 925 na região de terminal carboxila. A fosforilação de FAK na tirosina 397 também é conhecida por ativar numerosas cascatas de sinalização e interme-diários de caminhos a jusante, tais como a sinalização da Proteína Ati-vada por Mitógeno Ras (MAPK), a qual induz a ativação de caminhos de Raf/MEK/Erk e de fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K)/AKT (AKT, mTOR, S6K) (Figura 40A).

[00387] De modo a determinar se cRGDY-PEG-C-dots de ligação de αvβ3 integrina modula a atividade destes caminhos, nós tratamos células M21 privadas de soro (0,2% FCS) com cRGDY-PEG-C-dots de 100 nM por 2 horas a 37° C.; células privadas de soro tratadas com 0,2% de FCS isolado serviram como controles. Análises por Western blot dos lisados de células expostas a partículas revelaram reforço dos níveis de fosforilação de múltiplos intermediários de proteína: pFAK- 397 e pFAK-576/577, Src, pMEK, pErk, e AkT (Figura 40B), o que sugeriu a ativação de caminhos de sinalização a jusante. Esetes achados, representados graficamente como proporções de intensidade normalizada, foram expressados em relação a seus respectivos níveis de proteína total, e normalizados para valores correspondentes medidos sob condições de controle (Figura 40C). A incubação de células com dots de PEG-C não aumentou os níveis de fosforilação das proteínas testadas (dados não mostrados).

[00388] Nós avaliamos se a ativação observada de caminhos de sinalização a jusante foi dependente da fosforilação de FAK na tirosina 397 por bloqueio deste caminho com um inibidor de molécula pequena, PF-573228. Este inibidor interage com FAK no bolso de ligação de ATP e efetivamente bloqueia tanto a atividade catalítica da proteína FAK quanto a fosforilação de FAK subsequente sobre Tyr397. Depois da adição de duas concentrações de PF-573228 a células M21 privadas de soro previamente expostas a 100 nM de dots de cRGDY-PEG- C, análises por Western blot revelaram a inibição da fosforilação de FAK sobre Tyr397 e Src (Figura 41A), apresentada graficamente na Fi- gura 41B Inibição da fosforilação de MEK ou Erk foi observada somente na maior concentração de inibidor (Figuras 41A, 41B).

Efeito de dots de cRGDY-PEG-C sobre a Migração Celular

[00389] O receptor de αvβa integrina, o qual é altamente expressado sobre muitos tipos de células tumorais e angiogênicas, é conhecido por modular uma série de processos biológicos a jusante, incluindo migração celular, adesão, proliferação, invasão, e angiogênese. Nos experimentos que se seguem, nós procuramos determinar se dots de cRGDY- PEG-C alteram a migração de células M21 e HUVEC. Uma série de ex-perimentos iniciais examinaram alterações dependentes do tempo na migração de células M21, conforme refletido na área média de fecha-mento, usando imagiologia de lapso de tempo em três concentrações de partículas sucessivamente maiores (0 nM a 400 nM; 37° C.) durante um período de tempo de 96 horas (Figura 42A, i-xx). Aumentos estatis-ticamente significantes na área média de fechamento foram observados durante um período de 96 horas, como uma percentagem dos valores basais (t = 0), os quais foram relativamente constantes para a faixa de concentração de partículas usada (isto é, ~87% a 92%), em comparação com as amostras de controle (73%; p<0,05,) (Figura 42A, B). Não foram vistas alterações significativas em intervalos de tempo mais precoces (Figura 42B). Incubação de células HUVEC (37° C., 20 horas) com uma faixa de concentrações de dots de cRGDY-PEG-C (100 a 400 nM) na presença de 0,2% de FCS apresentaram um aumento estatisticamente significante na área média de fechamento para uma concentração de 400 nM (isto é, 34%) (Figuras 43A, 43B), em comparação com 19% (p<0,05) para células não-expostas a partículas. Não foi observada nenhuma alterações apreciável na migração para as menores concentrações de partículas usadas (Figuras 43A, 43B). Foi visto que as células expostas a partículas apresentam maiores taxas de migração em comparação com as células de controle.

[00390] Nós adicionalmente mostramos que os aumentos nas taxas de migração celular foram atenuados pela adição do inibidor de FAK, PF-573228. Imagens de contraste da fase inicial foram adquiridas depois de incubação de células HUVEC com partículas de 400 nM durante um intervalo de tempo de 24 horas (Figura 44A, i-viii), e a área média de fechamento foi determinada e apresentada graficamente em relação a soro isolado (Figura 44B). A percentagem de alteração nas áreas médias de fechamento em relação aos controles, e antes e depois da adição de um inibidor, foi visto que diminui de +34% para +3%. Foram encontradas diferenças estatisticamente significantes entre valores para células expostas a partículas sem inibidor (p<0,03) e partículas tratadas com diferentes concentrações de inibidor (250 nM, 500 nM; p<0,001) em relação a controles privados de soro; as diferenças entre os primeiros dois grupos também foram estatisticamente significantes (Figura 44C).

Efeito de Dots de cRGDY-PEG-C sobre a Adesão e a Disseminação Celulares

[00391] O tripeptídeo RGD é conhecido por ser um componente de constituintes da matriz extracelular, fibronectina e vitronectina. Um teste de ligação competitiva foi realizado usando células M21 (104 células/ cavidade) pré-incubadas (25° C., 30 minutes) com ou sem dots de cRGDY-PEG-C de 400 nM e fibronectina, depois de transferência das células para cavidades revestidas com fibronectina. Cerca de ~60% das células que não foram pré-incubadas com cRGDY-PEG-C-dots se ligaram e espalharam sobre as placas revestidas com fibronectina nos primeiros 30 minutos. Em contraste, uma percentagem muito baixa (15%) de células M21 pré-incubadas com cRGDY-PEG-C-dots de 400 nM foi anexada e disseminada sobre a placa revestida com fibronectina, mesmo 120 minutos depois de serem semeadas (Figuras 45A, 45B). As contagens celulares médias de células de disseminação "alongadas" versus "céllas arredondaas" durante um período de 2 horas revelou quena ausência de partículas (isto é, condição de controle), disseminação de células (células alongadas) foi observada em uma maioria das células, ao passo que um aspecto predominantemente "arredondado" foi visto no caso de células expostas a partículas (Figura 45A). Estes resultados são representados graficamente nas Figuras 45B e 45C, respectivamente. Quantificação das densidades óticas das células depois de adição de azul de metileno (absorvência) revelou que células as quais aderiram e se espalharam sobre fibronectina (isto é, sem pré-incubação de partículas) absorveram duas vezes mais azul de metileno do que as células expostas a partículas (Figura 45D). Nós observamos o mesmo fenômeno quando foram usadas cavidades revestidas com vitronectina (dados não mostrados). Em conjunto, estes dados demonstram que cRGDY-PEG-C-dots aumentam a migração e a disseminação de células através da ligação ao receptor de integrina αvβ3 encontrado em células M21 e HUVEC.

Influência de Dots de cRGDY-PEG-C sobre o Ciclo Celular em Células M21

[00392] Como os receptores de integrina estão envolvidos na so- brevida e na proliferação das células, nós analisamos o efeito de cRGDY-PEG-C-dots sobre o ciclo celular. Células M21 sincronizadas por fase G0/G1 foram incubadas por 48 horas usando duas concentrações de cRGDY-PEG-C-dots (100 nM, 300 nM) em 0,2% de meio suplementado com FCS. Nesta faixa, a percentagem de células na fase S aumentou por 11%, com significância estatística atingida em 100 nM (p<0,05) e 300 nM (p<0,005) em relação aos controles (Figuras 46A, 46B). Declínios correspondentes de 6% e 5% foram vistos nas fases G1 e G2 do ciclo celular, respectivamente. Em conjunto, estes dados indicam um reforço na fase S na presença de dots de cRGDY-PEG-C.

Materiais e Métodos Reagentes, Anticorpos e Produtos Químicos.

[00393] RPMI 1640, soro fetal bovino (FBS), penicilina, estreptomi- cina e HBSS (sem cálcio e magnésio contendo 0,25% de tripsina e 0,05% de EDTA) foram obtidos do Core Media Preparation Facility, Memorial Sloan Kettering Cancer Center (New York, N.Y.). Anti- policlonal coelho: fosfo-Erk1/2 (p-Erk1/2Thr 202/Tyr204), fosfo-AKT (p- Akt.sup.ser473)fosfo-Src (p-Src.sup.Tyr419)fosfo-p70 S6 (p-p70S6 .sup.Thr389), fosfo-MEK1/2 (p-MEK1/2 .sup.Ser217/221), fosfo-FAK- .sup.Tyr397, fosfo-FAK-.sup.Tyr576/577 fosfo-FAK .sup.Tyr925, Erk, AKT, Src, p70 S6, MEK1/2 (47E6) e FAK foram obtained from Cell Signaling Technology (Danvers, Mass.). Conjugados de cabra anti-IgG de coelho, de cabra anti-IgG de camundongo peroxidase de raiz forte (HRP) foram adquiridos da Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA.). Iodeto de propidio, RNase A, conjugado de Transferrina-Alexa Fluor 488, FITC-Dextrano, Fluoresceína, LysoTracker Red DND-99, LysoTracker Green DND-26, pHrodo Red Dextran e Hoechst foram procurados na Invitrogen-Life Technologies (Carlsbad, CA.). PF- 573228 foi obtido da TOCRIS bioscience (Ellisville, Mo.). Ciclo (Arg- Gly-Asp-D-Tyr-Cys) foi da Peptides International (Louisville, Ky.).

Síntese de Dots de cRGDY-PEG-C e PEG-dots.

[00394] Partículas fluorescentes, contendo o corante orgânico Cy5, foram preparadas por uma condensação de sílica do tipo de Stober modificada, conforme previamente descrito. Resíduos tirosina foram conjugados a cadeias de PEG para fixação de radioiodo. Peptídeos cRGDY contendo a sequência cyclo-(Arg-Gly-Asp-Tyr), e carregando resíduos cisteína (Peptide International), foram anexados a cadeias de PEG funcionalizadas através de uma ligação de cisteína - maleimida. O número de ligantes de cRGD por nanopartícula foi calculado empiri-camente.

Mecanismo de Anexação de PEG à Superfície de C Dot.

[00395] PEGs bifuncionais, éster de MAL-dPEG®12-NHS (Quanta Biodesigns, Ltd) foram derivatizados com silanos, especificamente 3- aminopropil trietoxissilano (Gelest), para fixação à superfície da sílica e para ligação de peptídeo através de reações entre os grupamentos sulfidrila e as porções de maleimida dos PEGs derivatizados. Além disso, cadeias de PEG terminadas com metóxi foram adicionadas à superfície das partículas usando compostos de organosilicio funcional (compostos de Si), especificamente (MeO)3Si-PEG (Gelest), de acordo com protocolos modificados. Em resumo, (MeO)3Si-PEG foi adicionado, em aproximadamente três excessos molares, às partículas em uma mistura de água / álcool básica (~1:5 v/v), e a mistura foi agitada de um dia para o outro em temperatura ambiente.

Medições das Comparações do Tamanho hidrodinâmico e do Brilho Relativo por Espectroscopia de Correlação da Fluorescência (FCS).

[00396] O raio hidrodinâmico, o brilho, e as concentrações de cRGDY-PEG- e PEG-dots, como contra corante Cy5 livre, foram inicialmente determinados por diálise destas amostras de partícula para água, diluindo em salina fisiológica (0,15 M de NaCl em H2O), e analisando as amostras resultantes em um Zeiss LSM 510 Confocor 2 FCS usando excitação de HeNe a 633 nm. O instrumento foi calibrado com respeito ao tamanho das partículas antes de todas as medições. Os tamanhos hidrodinâmicos médios do corante e das espécies de partícula foram estimados com base nas diferenças do tempo de difusão, ao passo que diferenças relativas no brilho foram avaliadas usando taxas de contagem por molécula / partícula.

Células e Cultura Celular:

[00397] Linhagem celular de melanoma humano M21 e M21 variante M21L (αv negativas) foram obtidas da D. A. Cheresh (University of California, San Diego, CA.). As células foram mantidas em meio RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal bovino, 2 mM de L- glutamina e Penicilina Estreptomicina. Células Endoteliais da Veia Umbilical Humana (HUVECs) foram obtidas da LONZA (Walkersville, Md.) cultivadas em meio EGM-2 contendo 2% de FBS, e fatores de crescimento LONZA.

Estudos de Ligação Celular In Vitro Usando Métodos de Detecção Ótica:

[00398] De modo a testar a ligação de partículas para células M21, M21-L ou HUVEC, placas de 24 cavidades foram revestidas com 10 μg/ml de colágeno tipo I (BD Biosciences) em PBS, incubadas a 37° C. por 30 minutes, e lavadas uma vez com PBS. As células (3,0x105 células/ cavidade até 4,0x105 células/ cavidade) foram cultivadas até a confluência. A ligação diferencial de cRGDY-PEG-C-dots a células M21 ou HUVEC foi avaliada sobre uma faixa de tempos de incubação (até 4 horas) e concentrações de partículas (10 a 600 nM) usando ci- tometria de fluxo. Depois de incubação, as células foram lavadas com meio RPMI 1640/0,5% de BSA, destacadas usando 0,25% de tripsina / EDTA, peletizadas em um tubo de microcentrífuga (5 minutos a 153 g, 25° C.), ressuspendidas em solução BD FACSFlow (BD Biosciences), e analisadas no canal de Cy-5 de modo a determinar a percentagem de sonda ligada a partículas (FACSCalibur, Becton Dickinson, Mountain View, CA).

Estudo de Internalização:

[00399] O experimento foi realizado conforme acima porém incubado por 4 horas em três diferentes temperaturas: 4° C., 25° C. e 37° C. Co-incubação de excesso (x250) de anticorpo conjugado a αvβ3 fluoresceína anti-integrina humana cRGDY (Millipore, Billerica, Mass.) com cRGDY-PEG-C-dots foi usada para bloqueio de receptor de modo a avaliar a especificidade. Os testes foram realizados com células fixadas e vivas. Para células M21 fixadas, foi usada microscopia confocal invertida (Leica TCS SP2 AOBS) equipada com uma objetiva HCX PL APO (63x1.2NA Water DIC D) e foi usada imagiologia de lapso de tempo para rastrear células M21 vivas. A imagiologia foi adquirida depois de co-incubação de partículas direcionadas (ou de controle) em várias concentrações com os seguintes marcadores de corante) por 4 horas: 70 kDa de conjugado de dextrano -- FITC (1 mg/mL, 37° C. por 30 min; Invitrogen) para marcar macropinossomas, Lysotracker Red (100 nM; Invitrogen) para mardcar o caminho endocitótico (isto é, or- ganelas acidíferas), e transferrina Alexa488 (2 μg/mL.

Estudos de Ligação Competitiva:

[00400] De modo a avaliar a ligação específica, células M21 foram incubadas (25° C., 4 horas) com 124I-cRGDY-PEG-C-dots (25 nM) e ex-cesso de peptídeo cRGDY. As céluals foram em seguida lavadas com meio RPMI 1640 / 0,5% de BSA, e dissolvidas em 0,5 ml de NaOH a 0,2 M. A radioatividade foi avaliada usando um contador gama 1480 Auto-matic Gamma Counter (Perkin Elmer) calibrado para iodo-124.

Western Blot (WB):

[00401] Células M21 (1*106 células/ placa de seis cavidades) foram cultivadas em seis cavidades revestidas com colágeno (10 mg/ml), e tornadas quiescentes por cultura sob condições privadas de soro. Em seguida o meio foi trocado para 0,2% de FCS, e diferentes concentrações (25 a 400 nM) de cRGDY-PEG-C-dots foram adicionadas (37° C., 0,5 a 8 horas). As células foram enxaguadas duas vezes em PBS gelada, coletadas por tripsinização, e o pélete foi ressuspendido em tampão de lise (10 mM de Tris, pH 8,5, 150 mM de NaCl, 1 mM de EDTA, 1% de Triton X-100; ACROS organics, NJ), 1% de desoxicolato de Na, 0,1% de SDS, inibidores de protease Complete® (Roche, Indianapolis, Ind.), e coquetel de inibidor de fosfatase Tablet--PhosSTOP (Roche, Indianapolis, Ind.). Os lisados foram centrifugados (10 min, 4° C.). As concentrações de proteína foram determinadas pelo teste do ácido bi- cinconínico (BCA, Thermo Scientific, Rockford, Ill.). Uma alíquota de proteína de 50 μg de cada fração foi separada por gradiente de 4 a 12% de dodecil sulfato de sódio - eletroforese por gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) e transferida para uma membrana de PVDF (Invitrogen, Carlsbad, CA.). As membranas foram bloqueadas com 5% de leite em pó desengordurado (Bio-Rad, Hercules, CA.) em Salina Tris Tampo- nada (TBS)-Tween a 0,1%, e o sinal foi visualizado por quimilumines- cência ECL (Thermo Scientific, Rockford, Ill.) ou Immobilon Western, (Millipore Billerica, Mass.) depois da aplicação de anticorpos primários (1:1000) e secundários (1:2000 a 1:5000).

Análise do Ciclo Celular:

[00402] Células M21 sincronizadas por fase G0/G1 foram incubadas por 48 horas usando duas concentrações (100 e 300 nM) de cRGDY- PEG-C-dots depois de modificação do meio para 0,2% de FCS. Depois de tripsinização, as células foram centrifugadas (1200 rpm, 5 min), e o pélete foi suspendido em PBS, seguido por fixação com 70% de etanol (4° C., 0,5 a 1 hora). As células foram sucessivamente ressuspendidas em 1 ml de PBS contendo 1% de FCS e 0,1% de Triton X-100, 200 μl de PBS contendo 25 μg/ml de iodeto de propídio, e 100 mg/ml de RNa- seA (4° C., 60 minutos). Foi realizada análise do ciclo celular por citometria de fluxo, FACSCalibur, (Mountain View, CA.) e software Phoenix Flow MultiCycle (Phoenix Flow Systems, Inc., San Diego, CA.).

Proliferação Celular:

[00403] As células foram divididas (1x104 células/ cavidade) em uma placa de 96 cavidades revestida com colágeno conforme descrito nos estudos de ligação celular in vitro. Diferentes concentrações de cRGDY-PEG-C-dots foram adicionadas (25 a 200 nM) por 24 a 48 horas a 37° C. Em seguida, 20 ml do reagente de proliferação WST-1 (Roche, Indianapolis, Ind.) foi adicionado à placa (37° C., 1 hora). Para determinação das densidades óticas, nós usadmos uma leitora de micro placas SpectraMax5 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA.). A absorvência foi medida a 440 nm.

Teste de Migração: Células M21:

[00404] Células M21 foram semeadas (6*104 células/ cavidade) usando um kit de migração (placa revestida com Collagen I Oris®, PLATYPUS TEC). Vinte e quatro horas depois de serem semeadas, as células, obturadores na placa foram removidos. Meio de cultura fresco (100 μl) suplementado com 0,2% de FBS foi introduzido e cRGDY-PEG- C-dots foram adicionados em várias concentrações: 25, 100 e 400 nM. A cada 24 horas depois disso, o meio foi substituído, junto com novas partículas, durante um intervalo de tempo de 72 horas. Antes de incubação da plada a 37° C. de um dia para o outro, foram capturadas imagens da hora zero pelo microscópio Axiovert 200M (Carl Zeiss) usando uma objetiva de 5* (0.15NA) e usando um módulo de varredura por deslizamento no software Metamorph (Molecular Devices, PA). Em seguida foi realizada microscopia serial e as imagens foram capturadas a cada 24 horas por um total de 96 horas pós-incubação. Os dados foram analisados usando o software ImageJ. Células HUVEC: células HUVEC foram adi-cionalmente semeadas (5*104 células/ cavidade) e, 24 horas depois, incubadas com várias concentrações de partículas (100, 200, e 400 nM) depois de substituição do meio. Um procedimento de microscopia similar foi realizado como aquele para células M21, com imagiologia serial ad-quirida 20 horas depois.

Teste de Adesão e Disseminação:

[00405] O efeito de cRGDY-PEG-C-dots sobre a ligação de células M21 a placas revestidas com fibronectina foi avaliado revestindo inicialmente placas de micro título de 96 cavidades com fibronectina em PBS (5 μg/ml), seguido por 200 μl de RPMI/0,5% de BSA (37° C., 1 hour,). As células (1-3*104 células/100 μl/ cavidade) foram incubadas (25° C., 30 minutos), com ou sem cRGDY-PEG-C-dots de 400 nM em RPMI/0,1% de BSA, e adicionadas a cavidades revestidas com fibronectina (37° C., 30 a 120 minutos). Para quantificação do número de células anexadsa, as cavidades foram enxaguadas com RPMI/0,1% de BSA para remover células não-aderentes. As células aderentes foram fixadas com 4% de PFA (25° C., 20 minutos) e coradas com azul de metileno (37° C., 1 hora). O azul de metileno foi extraído das células pela adição de 200 ml de 0,1 M de HCl (37° C., 1 hora). Para determinação das densidades óticas nós usamos uma leitora de micro placas SpectraMax5 e a absorvência foi medida a 650 nm. Para teste de dis-seminação: Foi realizado lapso de tempo (37° C., 2 horas) e as imagens foram capturadas por microscópio Axiovert 200M (Carl Zeiss) usando uma objetiva de 20* (0.15NA) e usando um módulo de varredura por deslizamento no Software Metamorph (Molecular Devices).

Análises Quantitativas:

[00406] De modo a quantificar as diferenças no tamanho e na intensidade entre bandas de Western blot, nós realizamos densitometria de intermediários de proteína fosforilada e de proteína total usando Photoshop CS2 (Adobe, San Jose, CA.). As bandas foram escaneadas a 300 dpi (Scanjet 7650, Hewlett Packard, Palo Alto, CA.), e convertidas para escala de cinza. Em seguida a ferramenta de laço foi usada para desenhar uma região de interesse (ROI) dentro dos limites de cada banda de modo a derivar os seguintes: área (número de píxeis), valor médio da escala de cinza dentro da área selecionada (0 a 255) e o desvio padrão associado. O produto dos primeiros dois valores para cada banda foi computado, e dividido pelo produto para a banda inicial em cada série (banda de controle), produzindo um valor de intensidade para cada amostra em relação ao controle. Finalmente a proporção de proteína fosforilada para proteína total e o erro propagado correspondente (erro padrão) foram computados para cada amostra usando as intensidades relativas.

[00407] Imagens de contraste de fase capturadas para estudos da migração foram analisadas usando ImageJ 1.45s (National Institutes of Health, rsbweb.nih.gov/ij/) de modo a quantificar a extensão da migração celular (isto é, fechamento da área) para células M21 e HUVECs. Em visualizações de alta potência, uma área delimitada foi desenhada adjacente à orla das células fixadas vistas em cada imagem depois de remoção do obturador. A área delimitada para cada imagem foi medida (píxeis) e usada para calcular a percentagem de fechamento em relação à hora zero (depois de adição de partícula e substituição do meio) como se segue: diferença na área em um dado ponto do tempo (24, 48, 72 ou 96 horas) e na hora zero dividida pela mesma área na hora zero multiplicada por 100. Os valores resultantes foram ponderados e foi computado um erro padrão para cada grupo.

Estatística:

[00408] Todos os valores gráficos são plotados como média ± erro padrão, exceto onde mencionado. t-Teste de Student uni-caudado foi usado para testar a importância estatística de diferenças na migração celular entre células HUVECs ou M21 incubadas com soro somente ou dots de cRGDY-PEG-C. Análise da variância one-way (ANOVA) foi usada para realizar comparações pareadas estatísticas entre a percentagem de células M21 na fase S que foram incubadas com soro somente, dots de cRGDY-PEG-C de 100 nM ou 300 nM. Nós atribuímos importância estatística para todos os testes em P<0,05.

Exemplo 17 Lipossomas de Esfingomielina para Aumento da Liberação Tumoral de Partículas de Diagnóstico / Terapêuticas de Sílica

[00409] O potencial terapêutico de partículas sub-10 nm (por exemplo, C dots) como veículos de liberação de fármaco está sob investigação. Partículas ligadas a fármaco foram desenvolvidas por fixação de fármacos a cadeias de PEG bifuncionalizadas ligadas a partículas. Fármacos de modelo utilizados para este trabalho de prova de conceito são inibidores de receptores de tirosina quinase (RTK). A liberação e a acumulação de cargas úteis terapêuticas de partículas no sítio alvo podem ser maximizadas empregando estratégias de escalonamento de dose para avaliar o aumento da captação e da distribuição de partículas dentro dos tumores por imagiologia ótica e/ou por PET. Uma abordagem alternativa para reforçar a liberação da carga de partícula utiliza formulações lipossômicas para encapsular sondas de partículas terapêuticas. Os lipossomas direcionam passivamente para os tumores através do aumento da permeabilidade e do efeito de retenção (EPR) ao mesmo tempo que protegendo as cargas úteis contra degradação na circulação. Antes de encapsulação da partícula, ou cRGDY ou conjugados de fármaco e encadeador será anexados à superfície da partícula como um mecanismo de direcionamento ativo para maximizar a liberação no sítio alvo.

[00410] Uma vez no sítio alvo, pode ocorre liberação das partículas a partir das formulações lipossômicas para dentro do interstício tumoral como resultado de sistemas enzimáticos hiperregulados presentes nos tumores. A liberação extracelular de esfingomielinase ácida (AS- Mase, SMase ácida ou SMase) a partir de células tumorais em resposta a stress celular, tal como irradiação de raios X e toxinas, leva a ráa- pid lesão celular mediada por ceramidas e, subsequentemente, apop- tose. A SMase ácida hidrolisa a esfingomielina, presente dentro das formulações lipossômicas, para ceramida. A ceramida tem um papel nos sistemas biológicos como um mensageiro secundário no processo apoptótico. A ceramide tem propriedades de membrana significativamente diferentes da molécula de oritem esfingomielina. Quando lipossomas contendo esfingomielina são clivados com SMase, há uma alteração dramática na rigidez da membrana. A esfingomielina é um lipídeo adequado para formulações de lipossomas; isto não é verdade para a ceramida, uma vez que sua incorporação como um bloco de construção de lipossoma leva a vazamento de lipossoma. Este vaza- mento vai levar a liberação do conteúdo do lipossoma. Isto abre a pos-sibilidade de direcionamento intracelular de uma grande carga útil de nanopartículas de sílica, funcionalizadas com fármacos e/ou marcadores de internalização celular (isto é, peptídeo KLAKLAC e inibidores de molécula pequena) para monitorar e/ou tratar doença.

[00411] De modo a determinar se a encapsulação pelo lipossoma significativamente aumenta a liberação de partículas para o sítio tumoral em relação a sondas de partículas não-encapsuladas, nós vamos utilizar abordagens de imagiologia ótica e por PET para monitorar a captação tanto de lotes de partículas encapsuladas por lipossoma de esfingomielinase quanto não-encapsuladas em modelos de xenoen- xerto de tumor de cérebro expressando EGFRmt+ (isto é, H1650, A431) tanto lipossomas quanto sondas de partículas vão conter marcadores óticos para visualização.

[00412] Ref: Sochanik A1, Mitrus I, Smolarczyk R, Cicho T, Snietura M, Czaja M, Szala S. Experimental anticancer therapy with vascular- disruptive peptide and liposome-entrapped chemotherapeutic agent. Arch Immunol Ther Exp (Warsz). 2010 June; 58(3):235-45.

[00413] Os métodos precedentes para detecção e direcionamento de células estressadas envolvem algumas formulações consistindo de lipossomas bicamada cada uma tendo uma camada externa inicial de lipídeos formadores de lipossomas, esfingomielina, ou uma mistura dos mesmos; uma segunda camada interna de lipídeos formadores de lipossomas, esfingomielina ou uma mistura dos mesmos; a primeira e a segunda camadas formando um lipossoma bicamada e definindo um espaço interior nas mesmas; em que o espaço interior contém uma nanopartícula de sílica. A nanopartícula de sílica e/ou lipossoma vai consistir de marcadores óticos e/ou etiquetas de PET (corante, fluoró- foro, radiomarcador, agente de contraste), um substrato enzimático, e/ou agentes terapêuticos, incluindo fármacos citotóxicos, segmentos de DNA, ou uma etiqueta de indicador de radiotraçador. As partículas de sílica com etiqueta de marcador e/ou fármaco, contidas dentro dos lipossomas de esfingomielina, contactam uma amostra celular sob condições em que a esfingomielinase está presente na célula ou é li-berada pela célula. Este contato enzimático, por sua vez, vai hidrolisar a esfingomielina no lipossoma para liberar a nanopartícula de sílica e/ou a etiqueta de marcador e/ou o fármaco pelos compartimentos hi- drofílico (interior) ou hidrofóbico (bicamada) do lipossoma.

[00414] O âmbito da presente invenção não é limitado pelo que foi especificamente mostrado e descrito acima aqui, neste requerimento de patente. Os versados na arte vão reconhecer que existem alternativas adequadas para os exemplos representados de materiais, configurações, construções e dimensões. Numerosas referências, incluindo patentes e várias publicações, são citadas e discutidas na descrição desta invenção. A citação e a discussão de semelhantes referências é proporcionada meramente para esclarecer a descrição da presente invenção e não é uma admissão de que qualquer referência é arte an-terior à invenção descrita aqui, neste requerimento de patente. Todas as referências citadas e discutidas nesta especificação são incorporadas aqui, a este requerimento de patente, por meio de referência em sua totalidade. Variações, modificações e outras implementações do que é descrito aqui, neste requerimento de patente, vão ocorrer às pessoas com conhecimento regular da arte sem se afastar do espírito e do âmbito da invenção. Apesar de determinadas modalidades da presente invenção terem sido mostradas e descritas, será óbvio para os versados na técnica que podem ser feitas alterações e modificações sem se afastar do espírito e do âmbito da invenção. O assunto estipulado na descrição precedente e nos desenhos anexados é oferecido a título de ilustração somente e não como uma limitação.

Claims (15)

1. Agente anexado à nanopartícula à base de sílica fluores-cente, caracterizado pelo fato de que compreende: um núcleo à base de sílica; um composto fluorescente dentro do núcleo; e uma concha de sílica em torno de no mínimo uma porção do núcleo, em que a nanopartícula é revestida com um polímero orgâ-nico em que a partir de 1 até 20 ligantes são anexados à nanopartícula para ligação a um marcador tumoral, em que os ligantes têm a estrutura N-Ac-Cys-(Ahx)2-D-Lys-ReCCMSH, em que a nanopartícula tem um diâmetro dentro de uma faixa partir de 1 nm até 15 nm; e em que a nanopartícula pode ser excretada por clearance renal dentro de uma faixa a partir de 90% da dose inicial (DI) até 100% da DI em 24 horas depois da administração.

2. Agente de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o agente é selecionado do grupo consistindo em anti-bióticos, antimicrobianos, antiproliferativos, antineoplásicos, antioxi- dantes, fatores de crescimento celular endotelial, inibidores da trombi- na, imunossupressores, agentes antiagregação plaquetária, inibidores da síntese de colágeno, anticorpos terapêuticos, doadores de óxido nítrico, oligonucleotídeos antisense, agentes de cicatrização de feridas, constructos de transferência de genes terapêuticos, componentes da matriz extracelular, vasodilatadores, trombolíticos, antimetabólitos, fator de crescimento agonistas, antimitóticos, estatina, esteroides, agentes anti-inflamatórios esteroidais e não esteroidais, inibidores da enzima conversora de angiotensina (ACE), eliminadores de radicais livres, PPAR-gama agonistas, RNAs interferente pequeno (siRNAs), microRNA, e agentes quimioterápicos anticancerígenos.

3. Agente de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o agente é radiomarcado.

4. Agente de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o agente é ligado ao radioflúor 18F.

5. Agente de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o agente é um radionuclídeo.

6. Agente de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o radionuclídeo é selecionado do grupo consistindo em 90Y, 131I e 177Lu.

7. Agente de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o polímero orgânico é selecionado do grupo consistindo em poli(etileno glicol) (PEG), polilactato, ácidos polilácticos, açúcares, lipídeos, ácido poliglutâmico (PGA), ácido poliglicólico, poli(láctico-co-glicólico ácido) (PLGA), Polivinil acetato (PVA), ou as combinações dos mesmos.

8. Agente de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o número de ligantes anexados à nanopartícula varia de cerca de 1 a cerca de 10.

9. Agente de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8,caracterizado pelo fato de que a nanopartícula tem um diâmetro entre cerca de 1 nm e cerca de 8 nm.

10. Agente de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o composto fluorescente é Cy5 ou Cy5.5.

11. Uso de um agente anexado à nanopartícula à base de síli-ca fluorescente, como definido na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser para uso na preparação de uma composição ou medicamento.

12. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um agente anexado à nanopartícula à base de sílica fluorescente como definido na reivindicação 1.

13. Uso de um agente anexado à nanopartícula à base de sílica fluorescente como definido na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser para uso na preparação de uma composição ou medicamento para detecção de uma célula tumoral.

14. Uso de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a abnormalidade celular ou doença compreende câncer.

15. Uso de um agente anexado à nanopartícula à base de sílica fluorescente como definido na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser para uso na preparação de uma composição ou medicamento para imagem óptica de canal duplo de uma região dentro de um indivíduo.