BR112013008333A2 - Anticorpos, peptídeo de ligação, polinucleotídeo, composição farmacêutica, método para o tratamento de uma doença ou distúrbio neurodegenerativo, método para a indução de uma resposta imune passiva, métodos de diagnóstico, método para o monitoramento da doença, método para predizer a responsividade, kits, epítopo, linhagens celulares, fragmento e métodos para a produção do anticorpo uso do anticorpo - Google Patents

Anticorpos, peptídeo de ligação, polinucleotídeo, composição farmacêutica, método para o tratamento de uma doença ou distúrbio neurodegenerativo, método para a indução de uma resposta imune passiva, métodos de diagnóstico, método para o monitoramento da doença, método para predizer a responsividade, kits, epítopo, linhagens celulares, fragmento e métodos para a produção do anticorpo uso do anticorpo Download PDF

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Abstract

ANTICORPO, PEPTÍDEO, POLINUCLEOTÍDEO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, MÉTODO PARA O TRATAMENTO, MÉTODO PARA INDUZIR UMA RESPOSTA IMUNE, MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO, MÉTODO PARA MONITORAMENTO, MÉTODO PARA PREDIZER A RESPONSIVIDADE, KIT, EPÍTOPO, LINHAGENS CELULARES, FRAGMENTO, MÉTODOS PARA PRODUZIR UM ANTICORPO E USOS DO ANTICORPO. A presente invenção está relacionada aos métodos e composições na utilização terapêutico e diagnóstica para o tratamento de doenças e distúrbios que são causados por, ou associados aos emaranhados neurofibrilares. Em particular, a invenção refere-se a anticorpos que reconhecem especificamente e se ligam aos confôrmeros patológicos de proteína Tau fosforilada e a métodos e composições envolvendo os referidos anticorpos para o uso terapêutico e diagnóstico no tratamento de tauopatias, incluindo a doença de Alzheimer (AD).

Description

“ANTICORPO, PEPTÍDEO, POLINUCLEOTÍDEO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, MÉTODO PARA O TRATAMENTO, MÉTODO PARA INDUZIR UMA RESPOSTA IMUNE, MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO, MÉTODO PARA MONITORAMENTO, MÉTODO PARA PREDIZER A RESPONSIVIDADE, KIT, EPÍTOPO, LINHAGENS CELULARES, FRAGMENTO, MÉTODOS PARA PRODUZIR UM ANTICORPO E USOS DO ANTICORPO”
[001] A presente invenção está relacionada com métodos e composições na utilização terapêutica e diagnóstica para o tratamento de doenças e distúrbios que são causados por, ou associados aos emaranhados neurofibrilares. Em particular, a invenção refere-se a anticorpos que reconhecem especificamente e se ligam aos confôrmeros patológicos de proteína Tau fosforilada e a métodos e composições envolvendo os referidos anticorpos para o uso terapêutico e diagnóstico no tratamento de tauopatias, incluindo a Doença de Alzheimer (DA).
[002] Os emaranhados neurofibrilares e filamentos do neurópilo (NTs) são as principais características neuropatológicas da Doença de Alzheimer (DA). Eles são compostos da proteína Tau associada aos microtúbulos que sofreu modificações pós-traducionais, incluindo a desamidação, fosforilação e isomerização dos resíduos de asparaginila ou aspartila. Eles se originam pela agregação da proteína Tau hiperfosforilada e de seus confôrmeros. A DA compartilha esta patologia com muitas tauopatias neurodegenerativas, em particular com determinados tipos de demência frontotemporal (DFT).
[003] A proteína Tau é uma proteína livremente solúvel “naturalmente não enovelada” que se liga avidamente aos microtúbulos (MT) para promover a sua montagem e estabilidade. Os MTs são de grande importância para a integridade do citoesqueleto dos neurônios - e, desse modo,
para a adequada formação e funcionamento dos circuitos neuronais, portanto, para o aprendizado e memória. A ligação da Tau ao MT é controlada pela fosforilação e desfosforilação dinâmica, tal como demonstrado in vitro e, principalmente, em células não neuronais. Devido ao grande número de possíveis sítios de fosforilação (> 80), a contribuição exata e a identidade de cada uma das quinases responsáveis permanecem bastante indefinidas in vivo.
[004] No cérebro com DA, a patologia Tau se desenvolve mais tardiamente do que, e, consequentemente, provavelmente em resposta à patologia amiloide, que constitui a essência da hipótese da cascata amiloide.
Isto baseia-se e é indicado por estudos em DA e em pacientes com síndrome de Down, e é corroborado por estudos em camundongos transgênicos com patologia amiloide e Tau combinada (Lewis et al, 2001;. Oddo et al, 2004,..
Ribe et al, 2005; Muyllaert; et al, 2006; 2008; Terwel et al, 2008).
[005] O tempo exato de ambas as patologias em pacientes humanos com DA, bem como os mecanismos que ligam a patologia amiloide com a Tau são ainda desconhecidos, mas propõe-se que a ativação das vias de sinalização neuronais esteja envolvida; e que tal ativação atue sobre; ou pela GSK3 e cdk5 como as principais “tau-quinases” (revisado por Muyllaert et al, 2006, 2008).
[006] A hipótese de que tauopatia não é um efeito colateral inocente, mas um grande executor patológico na DA é baseada em observações de acorodo com princípios genéticos, patológicos e experimentais bem estabelecidos que corroboram totalmente entre si:
[007] -em casos de DA familiar de início precoce que são causadas por mutações na proteína precursora amiloide (APP) ou presenilina, a causa patogênica obrigatória é o acúmulo de amiloide, mas, invariavelmente, a patologia compreende tauopatia colateral, idêntica aquelas encontradas nos casos de DA esporádicas de início tardio;
[008] -a severidade da disfunção cognitiva e demência se correlaciona com tauopatia, não com a patologia amiloide, mais recentemente exemplificado por diversos estudos clínicos de fase 1 e 2 que incluem a imagiologia PIB-PET para amiloide e identifica muitos “falsos positivos”: indivíduos cognitivamente normais com alta carga amiloide no cérebro;
[009] -na DFT familiar, a tauopatia é provocada pela Tau mutante e causa a neurodegeneração diretamente, sem patologia amiloide;
[010] -em modelos experimentais de camundongos os defeitos cognitivos causados pela patologia amiloide são quase completamente atenuados pela ausência da proteína Tau (Roberson et al, 2007).
[011] Os argumentos combinados suportam a hipótese de que a proteína Tau desempenha um importante papel no desaparecimento cognitivo na DA e nas tauopatias neurodegenerativas relacionadas.
[012] Um tratamento emergente proeminente da DA é a imunoterapia passiva com mAbs específicos, para limpar peptídeos amiloides e seus agregados, os quais se presume que sejam neurotóxicos ou sinaptotóxico.
[013] A imunoterapia direcionada para a patologia tau, tal como proposto no presente, é antecipada para neutralizar os confôrmeros de proteína Tau patológicos, que são conhecidos ou postulados por provocarem disfunção sináptica e neurodegeneração. A patologia amiloide presente e agregados intraneuronal da proteína Tau hiperfosforilada são propostos por agirem sinergicamente na cascata cognitiva e degenerativa de eventos patológicos que levam do comprometimento cognitivo leve (MCI) para a demência grave da Doença de Alzheimer. A combinação de medicamentos direcionados para Tau com medicamentos direcionados para a amiloide (ou qualquer outra), consequentemente, irá constituir um tratamento da DA substancialmente mais eficaz e preferido, em oposição à atual monoterapia.
[014] Outras abordagens terapêuticas direcionadas a proteína Tau são escassas e compostas principalmente por:
[015] -Inibidores das quinases, os quais acredita-se que aumentam a fosforilação da Tau para níveis patológicos
[016] -Compostos que bloqueiam a agregação citoplasmática da proteína Tau hiperfosforilada.
[017] Estas abordagens sofrem vários inconvenientes de especificidade e eficácia, um problema que eles compartilham com tentativas de modificar o metabolismo da APP e amiloide, todos enfatizando a importância de uma contínua busca por opções de tratamento, incluindo a imunoterapia contra a tau.
[018] Praticamente nenhum esforço foi dedicado para definir - e muito menos objetivar - os confôrmeros patológicos de proteína Tau in vivo. No ensaio clínico de fase II Aß42, a patologia pelo emaranhado não pareceu ser bem considerada e nem analisada em profundidade (Nicoll, et al, 2003, Masliah et al, 2005). Por outro lado, a imunoterapia experimental direcionada para amiloide no modelo de camundongo pré-clínico com patologia semelhante à DA demonstrou também um efeito sobre a patologia Tau apesar dos agregados de Tau persistirem (Oddo et al., 2004).
[019] Algumas dúvidas foram lançadas sobre a viabilidade de se abordar a proteína Tau intracelular por imunoterapia. Estas foram contrariadas pelo estudo experimental mais recente em um modelo de tauopatia em camundongo (Asuni et al., 2007). Os autores demonstraram redução no emaranhado patológico e melhoras funcionais através da vacinação com o fosfopeptídeo derivado da proteína Tau. Estes dados corroboram com os relatos anteriores da imunoterapia direcionada a -sinucleína na Doença de Parkinson (DP) e nos modelos da doença do corpo de Lewy (Masliah et al., 2005, 2011) e da superóxido dismutase no modelo de esclerose lateral amiotrófica (ALS) (Urushitiani et al. , 2007). Estas doenças são exemplos nas quais proteínas intracelulares levam aos defeitos sinápticos e de neurodegeneração por mecanismos ainda não totalmente compreendidos. Por outro lado, proteína Tau recombinante de comprimento total produzida e isolada a partir de bactérias não parece apropriado como vacina, apesar dos adjuvantes utilizados, ou seja, completo de Freund e toxina pertússis, e poderia ter contribuído para o resultado negativo daquele estudo (Rosenmann et al. , 2006).
[020] Existe a necessidade não atendida de uma imunoterapia passiva e/ou ativa, que trabalhe neutralizando os confôrmeros patológicos de proteína Tau que são conhecidos - ou presumidos- por causarem distúrbios neurodegenerativos, tais como a patologia amiloide na DA causada, por exemplo, agregados intraneuronais de proteína Tau hiperfosforilada que são tão típicos para a DA como amiloide.
[021] Esta necessidade não satisfeita poderia ser atingida dentro do escopo da presente invenção pelo fornecimento de proteínas de ligação que reconhecem e se ligam aos principais fosfo-epítopos patológicos da proteína Tau. Em particular, a presente invenção fornece anticorpos específicos contra fosfo-epítopos lineares e conformacionais, simples e complexos da proteína Tau, e em particular da proteína Tau agregada a qual se acredita ser a responsável pela sinapto- e neuro-toxicidade nas tauopatias, incluindo a DA.
[022] Consequentemente, a presente invenção refere-se em um exemplo de realização a um peptídeo ou proteína de ligação ou uma parte funcional do mesmo, em particular um anticorpo, especialmente um anticorpo monoclonal ou uma parte funcional do mesmo, em que a proteína ou peptídeo de ligação ou anticorpo reconhece e se liga especificamente a um fosfo-epítopo em um mamífero, particularmente na proteína Tau humana ou fragmento desta, particularmente, a um fosfo-epítopo na proteína Tau agregada, particularmente no confôrmero da proteína Tau patológico, mas, em um exemplo de realização, não se liga ao epítopo correspondente não fosforilado e/ou epítopos não relacionados, em que o referido peptídeo de ligação ou anticorpo tem uma alta afinidade de ligação à proteína Tau solúvel e insolúvel, e modula os níveis de Tau solúvel e insolúvel, em especial no cérebro, em particular, com uma constante de dissociação de pelo menos 10 nM, particularmente de pelo menos 8 nM, particularmente de pelo menos 5 nm, particularmente de pelo menos 2 nm, particularmente de pelo menos 1 nM, particularmente de pelo menos 500 pM, particularmente de pelo menos 400 pM, particularmente de pelo menos 300 pM , particularmente de pelo menos 200 pM, particularmente de pelo menos 100 pM e particularmente de pelo menos 50 pM.
[023] Em um segundo exemplo de realização, a presente invenção refere-se a um peptídeo ou proteína de ligação ou uma parte funcional do mesmo, particularmente um anticorpo, especialmente um anticorpo monoclonal ou uma parte funcional do mesmo, em particular um anticorpo ou peptídeo de ligação de qualquer um dos exemplos de realização anteriores, em que peptídeo de ligação ou anticorpo reconhece e se liga especificamente a um fosfo-epítopo em um mamífero, particularmente na proteína Tau humana ou um fragmento desta, particularmente a um confôrmero patológico de proteína Tau, mas, em um exemplo de realização, não se liga ao epítopo não fosforilado correspondente e/ou epítopos não relacionados, em que o referido peptídeo de ligação ou anticorpo tem uma constante de associação de 104 M-1s-1 ou maior, particularmente entre 3 - 5 x 104 M-1s-1 ou maior, particularmente de 105 M-1s-1 ou maior; particularmente de 2 – 9 x 105 M- 1 -1 s ou maior; particularmente de 106 M-1s-1 ou maior, particularmente de 1 – 4 x 106 M-1s-1 ou maior, particularmente de 107 M-1s-1 ou maior.
[024] Em um terceiro exemplo de realização, a presente invenção refere-se a um peptídeo ou proteína de ligação ou uma parte funcional desta,
particularmente, um anticorpo, especialmente um anticorpo monoclonal ou uma parte funcional do mesmo, em particular um anticorpo ou peptídeo de ligação de qualquer um dos exemplos de realização anteriores, em que peptídeo de ligação ou anticorpo reconhece e se liga especificamente a um fosfo-epítopo em um mamífero, particularmente na proteína Tau humana ou um fragmento desta, particularmente no confôrmero patológico de proteína Tau, mas, em um exemplo de realização, não se liga ao epítopo não fosforilado correspondente e/ou a epítopos não relacionados, em que o referido peptídeo de ligação ou anticorpo tem uma alta afinidade de ligação com uma constante de dissociação de pelo menos 4 nM e uma constante de velocidade de associação de 105 M- 1 -1 s ou maior, particularmente uma constante de dissociação de pelo menos 3 nM e uma constante de velocidade de associação106 M-1s-1 ou maior, particularmente uma constante de dissociação de pelo menos 2 nM e uma constante de velocidade de associação104 M-1s-1 ou maior, particularmente uma constante de dissociação de pelo menos 1 nM e uma constante de velocidade de associação105 M-1s-1 ou maior, particularmente uma constante de dissociação de pelo menos 200 pM e uma constante de velocidade de associação105 M-1s-1 ou maior, particularmente uma constante de dissociação de pelo menos 100 pM e uma constante de velocidade de associação106 M-1s-1 ou maior.
[025] Em um exemplo de realização (4) a presente invenção refere-se a um peptídeo ou proteína de ligação ou uma parte funcional do mesmo, em particular um anticorpo, especialmente um anticorpo monoclonal ou uma parte funcional do mesmo, especialmente um peptídeo de ligação ou anticorpo de qualquer um dos exemplos de realização anteriores, cujo peptídeo de ligação ou anticorpo reconhece e se liga especificamente a um fosfo-epítopo em um mamífero, particularmente na proteína Tau humana ou fragmento desta, particularmente a uma confôrmero patológico de proteína Tau, mas, em um exemplo de realização ele não se liga ao epítopo não fosforilado correspondente e/ou a epítopos não relacionados, em que o referido peptídeo de ligação ou anticorpo se liga a um epítopo em um mamífero, particularmente na proteína Tau humana conforme exibido na SEQ ID NO: 67, selecionado a partir do grupo consistindo em aa Tau 15-20 compreendendo uma Tyr fosforilada na posição 18 (Y18), aa Tau 405-412 compreendendo uma Ser fosforilada na posição 409 (pS409), aa Tau 405-411 compreendendo uma Ser fosforilada na posição 409 (pS409) e aa Tau 208-218 compreendendo um Thr fosforilada na posição 212 (pT212) e uma Ser fosforilada na posição 214 (pS214).
[026] Um exemplo de realização (5) diz respeito à ligação do peptídeo ou anticorpo de qualquer um dos exemplos de realização anteriores, em que o referido peptídeo se liga a um epítopo em um mamífero, particularmente na proteína Tau humana, mas especialmente a proteína Tau humana conforme exibido na SEQ ID NO: 67, compreendendo aa Tau 15-20 com uma Tyr fosforilada na posição 18 (Y18).
[027] Um exemplo de realização (6) diz respeito à ligação do peptídeo ou anticorpo de qualquer um dos exemplos de realização anteriores, em que o referido peptídeo se liga a um epítopo em um mamífero, particularmente na proteína Tau humana, mas especialmente a proteína Tau humana conforme exibido na SEQ ID NO: 67, compreendendo aa Tau 405-412 com uma Ser fosforilada na posição 409 (pS409).
[028] Um exemplo de realização (7) diz respeito à ligação do peptídeo ou anticorpo de qualquer um dos exemplos de realização anteriores, em que o referido peptídeo se liga a um epítopo em um mamífero, particularmente na proteína Tau humana, mas especialmente a proteína Tau humana conforme exibido na SEQ ID NO: 67, compreendendo aa Tau 405-411 com uma Ser fosforilada na posição 409 (pS409).
[029] Um exemplo de realização (8) diz respeito à ligação do peptídeo ou anticorpo de qualquer um dos exemplos de realização anteriores, em que o referido peptídeo se liga a um epítopo em um mamífero, particularmente na proteína Tau humana, mas especialmente a proteína Tau humana conforme exibido na SEQ ID NO: 67, compreendendo aa Tau 208-218 com uma Thr fosforilada na posição 212 (pT212) e uma Ser fosforilada na posição 214 (pS214).
[030] Em outro exemplo de realização (9), a presente invenção refere-se a um peptídeo ou proteína de ligação ou uma parte funcional do mesmo, particularmente um anticorpo, especialmente um anticorpo monoclonal ou uma parte funcional do mesmo, especialmente um peptídeo de ligação ou anticorpo de qualquer um dos exemplos de realização precedentes, cujo peptídeo de ligação ou anticorpo reconhece e se liga especificamente a um fosfo-epítopo em um mamífero, particularmente na proteína Tau humana ou fragmento desta, particularmente em um confôrmero patológico de proteína Tau, mas, em um exemplo de realização o dito peptídeo ou proteína de ligação não se liga a um epítopo não fosforilado correspondente e/ou a epítopos não relacionados, em que o referido peptídeo de ligação ou anticorpo compreende um primeiro domínio de ligação, que contém, particularmente em sequência, uma CDR1 com a sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID NO: 21, 24, 27, 28, 29, 32, 73, 81, 93, 101, 106, ou uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70%, particularmente pelo menos 80%, particularmente pelo menos 85%, particularmente pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, particularmente pelo menos 95%, particularmente pelo menos 96 %, particularmente pelo menos 97%, particularmente pelo menos 98%, particularmente pelo menos 99% ou 100% idêntica à mesma, uma CDR2 com a sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID NO: 22, 25, 30, 33, 74, 82, 94, 102, 107, ou uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, particularmente pelo menos 95%,
particularmente pelo menos 96%, particularmente pelo menos 97%,
particularmente pelo menos 98%, particularmente pelo menos 99% ou 100%
idêntica à mesma; e uma CDR3 com a sequência de aminoácidos exibida na
SEQ ID NO: 23, 26, 31, 34, 75, 83, 95, 103, 108, ou uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 60%, particularmente pelo menos 70%,
particularmente pelo menos 80%, particularmente pelo menos 85%,
particularmente pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93% , pelo menos 94%, particularmente pelo menos 95%,
particularmente pelo menos 96%, particularmente pelo menos 97%,
particularmente pelo menos 98%, particularmente pelo menos 99% ou 100%
idêntica à mesma, e/ou um segundo domínio de ligação que cotem na sequência uma CDR1 com a sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID
NO: 12, 15, 18, 70, 78, 89, 98, ou uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos
94%, particularmente pelo menos 95%, particularmente pelo menos 96%,
particularmente pelo menos 97%, particularmente pelo menos 98%,
particularmente pelo menos 99% ou 100% idêntica à mesma, uma CDR2 com a sequência aminoácido exibida na SEQ ID NO: 13, 16, 19, 71, 79, 90, 99, 115,
ou uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80%, particularmente pelo menos 85%, particularmente pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, particularmente pelo menos
95%, particularmente pelo menos 96%, particularmente pelo menos 97%,
particularmente pelo menos 98%, particularmente pelo menos 99% ou 100%
idêntica a mesma; e uma CDR3 com a sequência de aminoácidos exibida na
SEQ ID NO: 14, 17, 20, 72, 80, 91, 100, ou uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, particularmente pelo menos 85%, particularmente pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, particularmente pelo menos 95%, particularmente pelo menos 96%, particularmente pelo menos 97%, particularmente pelo menos 98%, particularmente pelo menos 99% ou 100% idêntica à mesma.
[031] Em um exemplo de realização (10) a presente invenção refere-se a um peptídeo ou proteína de ligação ou uma parte funcional do mesmo, particularmente um anticorpo, especialmente um anticorpo monoclonal ou uma parte funcional do mesmo, especialmente um peptídeo de ligação ou anticorpo de qualquer um dos exemplos de realização precedentes, cujo peptídeo de ligação ou anticorpo reconhece e se liga especificamente a um fosfo-epítopo em um mamífero, particularmente na proteína Tau humana ou fragmento desta, particularmente em um confôrmero patológico de proteína Tau, mas, em um exemplo de realização, não se liga ao epítopo não fosforilado correspondente e/ou a epítopos não relacionados em que o referido peptídeo de ligação ou anticorpo compreende um primeiro domínio de ligação, que contém em sequência uma CDR1 com a sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID NO: 21, 24, 27, 28, 29, 32, 73, 81, ou uma sequência de aminoácidos é pelo menos 85% idêntica às mesmas, uma CDR2 com a sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID NO: 22, 25, 30, 33, 74, 82, ou uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95% idêntica à mesma e uma CDR3 com a sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID NO: 23, 26, 31, 34, 75, 83, ou uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80% idêntica às mesmas, e/ou um domínio de anticorpo que contém uma CDR1 com a sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID NO: 12, 15, 18, 70, 78, ou uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95% idêntica às mesmas, uma CDR2 com a sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID NO: 13, 16, 19, 71, 79, ou uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 85% idêntica às mesmas e uma
CDR3 com a sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID NO: 14, 17, 20, 72, 80, ou uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 85% idêntica às mesmas.
[032] Em um exemplo de realização (11) a presente invenção refere-se a um peptídeo ou proteína de ligação ou uma parte funcional do mesmo, particularmente um anticorpo, especialmente um anticorpo monoclonal ou uma parte funcional do mesmo, especialmente um peptídeo de ligação ou anticorpo de qualquer um dos exemplos de realização precedentes, cujo peptídeo de ligação ou anticorpo reconhece e se liga especificamente a um fosfo-epítopo em um mamífero, particularmente na proteína Tau humana ou fragmento desta, particularmente em um confôrmero patológico de proteína Tau, mas, em um exemplo de realização, não se liga ao epítopo não fosforilado correspondente e/ou a epítopos não relacionados em que o referido peptídeo de ligação ou anticorpo compreende um primeiro domínio de ligação, que contém em sequência uma CDR1 com a sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID NO: 21, 24, 27, 28, 29, 32, 73, 81, ou uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica às mesmas, uma CDR2 com a sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID NO: 22, 25, 30, 33, 74, 82, ou uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95% idêntica às mesmas e uma CDR3 com a sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID NO: 23, 26, 31, 34, 75, 83, ou uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica às mesmas, e/ou um segundo domínio de ligação, que contém em uma sequência CDR1 com a sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID NO: 12, 15, 18, 70, 78, ou uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95% idêntica às mesmas, uma CDR2 com a sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID NO: 13 , 16, 19, 71, 79, ou uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95% idêntica às mesmas e uma CDR3 com a sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID
NO: 14, 17, 20, 72, 80, ou uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica às mesmas.
[033] Em um exemplo de realização (12) a presente invenção refere-se a um peptídeo ou proteína de ligação ou uma parte funcional do mesmo, particularmente um anticorpo, especialmente um anticorpo monoclonal ou uma parte funcional do mesmo, especialmente um peptídeo de ligação ou anticorpo de qualquer um dos exemplos de realização precedentes, cujo peptídeo de ligação ou anticorpo reconhece e se liga especificamente a um fosfo-epítopo em um mamífero, particularmente na proteína Tau humana ou fragmento desta, particularmente em um confôrmero patológico de proteína Tau, mas, em um exemplo de realização, não se liga ao epítopo não fosforilado correspondente e/ou a epítopos não relacionados em que o referido peptídeo de ligação ou anticorpo compreende um primeiro domínio de ligação (domínio de anticorpo) que contém em sequência uma CDR1 com a sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID NO: 21, 24, 27, 28, 29, 32, 73, 81, ou uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica às mesmas, uma CDR2 com a sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID NO: 22, 25, 30, 33, 74, 82, e uma com a CDR3 sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID NO: 23, 26, 31, 34, 75, 83, ou uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica às mesmas, e/ou um segundo domínio de ligação, que contém em sequência uma CDR1 com o aminoácido sequência exibida na SEQ ID NO: 12, 15, 18, 70, 78, uma CDR2 com a sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID NO: 13, 16, 19, 71, 79, ou uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95% idêntica às mesmas e uma CDR3 com a sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID NO: 14, 17, 20, 72, 80, ou uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica às mesmas.
[034] Em um exemplo de realização (13) a presente invenção refere-se a um peptídeo ou proteína de ligação ou uma parte funcional do mesmo, particularmente um anticorpo, especialmente um anticorpo monoclonal ou uma parte funcional do mesmo, especialmente um peptídeo de ligação ou anticorpo de qualquer um dos exemplos de realização precedentes, cujo peptídeo de ligação ou anticorpo reconhece e se liga especificamente a um fosfo-epítopo em um mamífero, particularmente na proteína Tau humana ou fragmento desta, particularmente em um confôrmero patológico de proteína Tau, mas, em um exemplo de realização, não se liga ao epítopo não fosforilado correspondente e/ou a epítopos não relacionados em que o referido peptídeo de ligação ou anticorpo compreende um primeiro domínio de ligação que contém em sequência uma CDR1 com a sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID NO: 21, 24, 27, 28, 29, 32, ou uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica às mesmas, uma CDR2 com a sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID NO: 22, 25, 30, 33, e uma CDR3 com a sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID NO: 23, 26, 31, 34, ou uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95% idêntica às mesmas, e/ou um segundo domínio de ligação, que contém em sequência uma CDR1 com a sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID NO: 12, 15, 18; uma CDR2 com a sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID NO: 13, 16, 19, ou uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95% idêntica às mesmas e uma CDR3 com a sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID NO: 14, 17, 20, ou uma sequência de aminoácido que é pelo menos 90% idêntica às mesmas.
[035] Em um exemplo de realização (14) a presente invenção refere-se a um peptídeo ou proteína de ligação ou uma parte funcional do mesmo, particularmente um anticorpo, especialmente um anticorpo monoclonal ou uma parte funcional do mesmo, especialmente um peptídeo de ligação ou anticorpo de qualquer um dos exemplos de realização precedentes, cujo peptídeo de ligação ou anticorpo reconhece e se liga especificamente a um fosfo-epítopo em um mamífero, particularmente na proteína Tau humana ou fragmento desta, particularmente em um confôrmero patológico de proteína Tau, mas, em um exemplo de realização, não se liga ao epítopo não fosforilado correspondente e/ou a epítopos não relacionados em que o referido peptídeo de ligação ou anticorpo compreende um primeiro domínio de ligação que contém em sequência uma CDR1 com a sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID NO: 21, 24, 27, 28, 29, 32, ou uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica às mesmas, uma CDR2 com a sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID NO: 22, 25, 30, 33, e uma CDR3 com a sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID NO: 23, 26, 31, 34, ou uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica às mesmas, e/ou um segundo domínio de ligação, que contém em sequência uma CDR1 com a sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID NO: 12, 15, 18, uma CDR2 com a sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID NO: 13, 16, 19, ou uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica às mesmas, e uma CDR3 com a sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID NO: 14, 17, 20, ou um sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica às mesmas.
[036] Em um exemplo de realização (15) a presente invenção refere-se a um peptídeo ou proteína de ligação ou uma parte funcional do mesmo, particularmente um anticorpo, especialmente um anticorpo monoclonal ou uma parte funcional do mesmo, especialmente um peptídeo de ligação ou anticorpo de qualquer um dos exemplos de realização precedentes, cujo peptídeo de ligação ou anticorpo reconhece e se liga especificamente a um fosfo-epítopo em um mamífero, particularmente na proteína Tau humana ou fragmento desta, particularmente em um confôrmero patológico de proteína Tau, mas, em um exemplo de realização, não se liga ao epítopo não fosforilado correspondente e/ou a epítopos não relacionados em que o referido peptídeo de ligação ou anticorpo compreende um primeiro domínio de ligação que contém em sequência uma CDR1 com a sequência de aminoácidos exibida na
SEQ ID NO: 21, 24, 27, 28, 29, 32, 73, 81, 93, 101, ou 106, uma CDR2 com a sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID NO: 22, 25, 30, 33, 74, 82, 94, 102, ou 107, e uma CDR3 com a sequência de aminoácido exibida na SEQ ID NO: 23, 26, 31, 34, 75, 83, 95, 103, ou 108, e/ou um segundo domínio de ligação, que contém em sequência uma CDR1 com a sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID NO: 12, 15, 18, 70, 78, 89, ou 98, uma CDR2 com a sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID NO: 13, 16, 19, 71, 79, 90, 99, ou 115, e uma CDR3 com a sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID NO: 14, 17, 20, 72, 80, 91, ou 100.
[037] Em um exemplo de realização (16) a presente invenção refere-se a um peptídeo ou proteína de ligação ou uma parte funcional da mesma, em particular um anticorpo, especialmente um anticorpo monoclonal ou uma parte funcional do mesmo, especialmente um peptídeo de ligação ou anticorpo de qualquer um dos exemplos de realização precedentes, cujo peptídeo de ligação ou anticorpo reconhece e se liga especificamente a um fosfo-epítopo em um mamífero, particularmente na proteína Tau humana ou fragmento desta, particularmente em um confôrmero patológico de proteína Tau, mas, em um exemplo de realização, não se liga ao epítopo não fosforilado correspondente e/ou a epítopos não relacionados em que o referido peptídeo de ligação ou anticorpo compreende um primeiro domínio de ligação, que contém em sequência uma CDR1 com a sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID NO: 21, ou uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 76%, particularmente pelo menos 80%, particularmente pelo menos 85%, particularmente pelo menos 90%, particularmente pelo menos 95%, particularmente pelo menos 98%, particularmente pelo menos 99% idêntica a mesma, uma CDR2 com a sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID NO: 22, ou uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95%, particularmente 98%, particularmente 99% idêntica à mesma, e uma CDR3 com a sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID NO: 23, ou uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 66%, particularmente pelo menos 70%, particularmente pelo menos 75%, particularmente pelo menos 80%, particularmente pelo menos 85%, particularmente pelo menos 90%, particularmente pelo menos 95%, particularmente pelo menos 98%, particularmente pelo menos 99% idêntica à mesma, e/ou um segundo domínio de ligação, que contém em sequência uma CDR1 com a sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID NO: 12, ou uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95%, particularmente 98%, particularmente 99% idêntica à mesma, uma CDR2 com a sequência de aminoácido exibida na SEQ ID NO: 13, ou uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 88%, particularmente pelo menos 90%, particularmente pelo menos 95%, particularmente pelo menos 98%, particularmente pelo menos 99% idêntica à mesma, e uma CDR3 com a sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID NO: 14, ou uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 66%, particularmente pelo menos 70%, particularmente pelo menos 75%, particularmente pelo menos 80%, particularmente pelo menos 85%, particularmente pelo menos 90 %, particularmente pelo menos 95%, particularmente pelo menos 98%, particularmente pelo menos 99% idêntica à mesma.
[038] Em um exemplo de realização (17) a presente invenção refere-se a um peptídeo ou proteína de ligação ou uma parte funcional da mesma, em particular um anticorpo, especialmente um anticorpo monoclonal ou uma parte funcional do mesmo, especialmente um peptídeo de ligação ou anticorpo de qualquer um dos exemplos de realização precedentes, cujo peptídeo de ligação ou anticorpo reconhece e se liga especificamente a um fosfo-epítopo em um mamífero, particularmente na proteína Tau humana ou fragmento desta, particularmente em um confôrmero patológico de proteína Tau, mas, em um exemplo de realização, não se liga ao epítopo não fosforilado correspondente e/ou a epítopos não relacionados em que o referido peptídeo de ligação ou anticorpo compreende um primeiro domínio de ligação, que contém em sequência uma CDR1 com a sequência de aminoácidos exibida na
SEQ ID NO: 24, ou SEQ ID NO: 27, ou SEQ ID NO: 28, ou uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 88%, particularmente pelo menos 85%,
particularmente pelo menos 90%, particularmente pelo menos 95%,
particularmente pelo menos 98%, particularmente pelo menos 99% idêntica às mesmas, uma CDR2 com a sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID NO:
25, ou uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95%, particularmente
98%, particularmente 99% idêntica e uma CDR3 com a sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID NO: 26, ou uma sequência de aminoácidos em menos 66%, particularmente pelo menos 70%, particularmente pelo menos
75%, particularmente pelo menos 80%, particularmente pelo menos 85%,
particularmente pelo menos 90%, particularmente pelo menos 95%,
particularmente pelo menos 98%, particularmente pelo menos 99 % idêntica às mesmas e/ou um segundo domínio de ligação, que contém em sequência uma
CDR1 com a sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID NO: 12, ou uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95%, particularmente 98%,
particularmente 99% idêntica a mesma, uma CDR2 com a sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID NO: 13, ou uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 88%, particularmente pelo menos 90%, particularmente pelo menos 95%, particularmente pelo menos 98%, particularmente pelo menos
99% idêntica a mesma, e uma CDR3 com a sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID NO: 14, ou uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 66%,
particularmente pelo menos 70%, particularmente pelo menos 75%,
particularmente pelo menos 80%, particularmente pelo menos 85%,
particularmente pelo menos 90%, particularmente pelo menos 95%,
particularmente pelo menos 98%, particularmente pelo menos 99% idêntica à mesma.
[039] Em um exemplo de realização (18) a presente invenção refere-se a um peptídeo ou proteína de ligação ou uma parte funcional da mesma, em particular um anticorpo, especialmente um anticorpo monoclonal ou uma parte funcional do mesmo, de acordo com o exemplo de realização (15) que compreende um primeiro domínio de ligação, em que a CDR1 tem a sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID NO: 27, ou uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 88% idêntica à mesma.
[040] Em um exemplo de realização (19) a presente invenção refere-se a um peptídeo ou proteína de ligação ou uma parte funcional da mesma, em particular um anticorpo, especialmente um anticorpo monoclonal ou uma parte funcional do mesmo, de acordo com o exemplo de realização (15) que compreende um primeiro domínio de ligação, em que a CDR1 tem a sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID NO: 28, ou uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 88% idêntica à mesma.
[041] Em um exemplo de realização (20) a presente invenção refere-se a um peptídeo ou proteína de ligação ou uma parte funcional do mesmo, particularmente um anticorpo, especialmente um anticorpo monoclonal ou uma parte funcional do mesmo, especialmente um peptídeo de ligação ou anticorpo de qualquer um dos exemplos de realização precedentes, cujo peptídeo de ligação ou anticorpo reconhece e se liga especificamente a um fosfo-epítopo em um mamífero, particularmente na proteína Tau humana ou fragmento desta, particularmente em um confôrmero patológico de proteína Tau, mas, em um exemplo de realização, não se liga ao epítopo não fosforilado correspondente e/ou a epítopos não relacionados em que o referido peptídeo de ligação ou anticorpo compreende um primeiro domínio de ligação que contém em sequência uma CDR1 com a sequência de aminoácidos exibida na
SEQ ID NO: 29, uma CDR2 com a sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID NO: 30, e uma CDR3 com a sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID NO: 31, ou uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95%, particularmente 98%, particularmente 99% idêntica às mesmas e/ou um segundo domínio de ligação, que contém em uma sequência CDR1 com a sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID NO: 15, ou uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95%, particularmente 98%, particularmente 99% idêntica às mesmas, uma CDR2 com a sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID NO: 16, ou uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a mesma, e uma CDR3 com a sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID NO: 17, ou uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 36%, particularmente pelo menos 40%, particularmente pelo menos 50%, particularmente pelo menos 60%, particularmente pelo menos 70%, particularmente pelo menos 75%, particularmente pelo menos 80%, particularmente pelo menos 85%, particularmente pelo menos 90%, particularmente pelo menos 95%, particularmente pelo menos 98%, particularmente pelo menos 99% idêntica à mesma.
[042] Em um exemplo de realização (21) a presente invenção refere-se a um peptídeo ou proteína de ligação ou uma parte funcional do mesmo, particularmente um anticorpo, especialmente um anticorpo monoclonal ou uma parte funcional do mesmo, especialmente um peptídeo de ligação ou anticorpo de qualquer um dos exemplos de realização precedentes, cujo peptídeo de ligação ou anticorpo reconhece e se liga especificamente a um fosfo-epítopo em um mamífero, particularmente na proteína Tau humana ou fragmento desta, particularmente em um confôrmero patológico de proteína Tau, mas, em um exemplo de realização, não se liga ao epítopo não fosforilado correspondente e/ou a epítopos não relacionados em que o referido peptídeo de ligação ou anticorpo compreende um primeiro domínio de ligação que contém em sequência uma CDR1 com a sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID NO: 32, uma CDR2 com a sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID NO: 33, e uma CDR3 com a sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID NO: 34, ou uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95%, particularmente 98%, particularmente 99% idêntica às mesmas e/ou um segundo domínio de ligação que contém em sequência de uma CDR1 com a sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID NO: 18, ou uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95%, particularmente 98%, particularmente 99% idêntica à mesma, uma CDR2 com a sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID NO: 19, ou uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à mesma, e uma CDR3 com a sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID NO: 20, ou uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 63%, particularmente pelo menos 70%, particularmente pelo menos 75%, particularmente pelo menos 80%, particularmente pelo menos 85%, particularmente pelo menos 90%, particularmente pelo menos 95%, particularmente pelo menos 98%, particularmente pelo menos 99% idêntica à mesma.
[043] Em um exemplo de realização (22) a presente invenção refere-se a um peptídeo ou proteína de ligação ou uma parte funcional da mesma, em particular um anticorpo, especialmente um anticorpo monoclonal ou uma parte funcional do mesmo, especialmente um peptídeo de ligação ou anticorpo de qualquer um dos exemplos de realização precedentes, cujo peptídeo de ligação ou anticorpo reconhece e se liga especificamente a um fosfo-epítopo em um mamífero, particularmente na proteína Tau humana ou fragmento desta, particularmente em um confôrmero patológico de proteína Tau, mas, em um exemplo de realização, não se liga ao epítopo não fosforilado correspondente e/ou a epítopos não relacionados em que o referido peptídeo de ligação ou anticorpo compreende um primeiro domínio de ligação, que contém em sequência uma CDR1 com a sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID NO: 73, uma CDR2 com a sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID NO: 74, e uma CDR3 com a sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID NO: 75, ou uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, particularmente pelo menos 85%, particularmente pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, particularmente pelo menos 95%, particularmente pelo menos 96%, particularmente pelo menos 97%, particularmente pelo menos 98%, particularmente pelo menos 99% ou 100% idêntica à mesma e/ou um segundo domínio de ligação, que contém em sequência uma CDR1 com a sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID NO: 70, ou uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95%, particularmente 98%, particularmente 99% idêntica à mesma, uma CDR2 com a sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID NO: 71, ou uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à mesma, e uma CDR3 com a sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID NO: 72, ou uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, particularmente pelo menos 85%, particularmente pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, particularmente pelo menos 95%, particularmente pelo menos 96%, particularmente pelo menos 97%, particularmente pelo menos 98%, particularmente pelo menos 99% ou 100% idêntica à mesma.
[044] Em um exemplo de realização (23) a presente invenção refere-se a um peptídeo ou proteína de ligação ou uma parte funcional da mesma, em particular um anticorpo, especialmente um anticorpo monoclonal ou uma parte funcional do mesmo, especialmente um peptídeo de ligação ou anticorpo de qualquer um dos exemplos de realização precedentes, cujo peptídeo de ligação ou anticorpo reconhece e se liga especificamente a um fosfo-epítopo em um mamífero, particularmente na proteína Tau humana ou fragmento desta, particularmente em um confôrmero patológico de proteína Tau, mas, em um exemplo de realização, não se liga ao epítopo não fosforilado correspondente e/ou a epítopos não relacionados em que o referido peptídeo de ligação ou anticorpo compreende um primeiro domínio de ligação, que contém em sequência uma CDR1 com a sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID NO: 81, uma CDR2 com a sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID NO: 82, e uma CDR3 com a sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID NO: 83, ou uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, particularmente pelo menos 85%, particularmente pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, particularmente pelo menos 95%, particularmente pelo menos 96%, particularmente pelo menos 97%, particularmente pelo menos 98%, particularmente pelo menos, 99% ou 100% idêntica às mesmas e/ou um segundo domínio de ligação que contém em sequência uma CDR1 com a sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID NO: 78, uma CDR2 com a sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID NO: 79, e uma CDR3 com a sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID NO: 80, ou uma sequência de aminoácidos que é pelo menos, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, particularmente pelo menos 85%, particularmente pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, particularmente pelo menos 95%, particularmente pelo menos 96%, particularmente pelo menos 97%, particularmente pelo menos 98%, particularmente pelo menos 99% ou 100% idêntica às mesmas.
[045] Em um exemplo de realização (24) a presente invenção refere-se a um peptídeo ou proteína de ligação ou uma parte funcional da mesma, em particular um anticorpo, especialmente um anticorpo monoclonal ou uma parte funcional do mesmo, especialmente um peptídeo de ligação ou anticorpo de qualquer um dos exemplos de realização precedentes, cujo peptídeo de ligação ou anticorpo reconhece e se liga especificamente a um fosfo-epítopo em um mamífero, particularmente na proteína Tau humana ou fragmento desta, particularmente em um confôrmero patológico de proteína
Tau, mas, em um exemplo de realização, não se liga ao epítopo não fosforilado correspondente e/ou a epítopos não relacionados em que o referido peptídeo de ligação ou anticorpo compreende um primeiro domínio de ligação, que contém em sequência uma CDR1 com a sequência de aminoácidos exibida na
SEQ ID NO: 93, uma CDR2 com a sequência de aminoácidos exibida na SEQ
ID NO: 94, e uma CDR3 com a sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID
NO: 95, ou uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 60%, pelo menos
70%, pelo menos 80%, particularmente pelo menos 85%, particularmente pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos
94%, particularmente pelo menos 95%, particularmente pelo menos 96%,
particularmente pelo menos 97%, particularmente pelo menos 98%,
particularmente pelo menos 99% ou 100% idêntica a qualquer uma das CDRs acima e/ou um segundo domínio de ligação, que contém em sequência uma
CDR1 com a sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID NO: 89, uma CDR2 com a sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID NO: 90, e uma CDR3 com a sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID NO: 91, ou uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%,
particularmente pelo menos 85%, particularmente pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%,
particularmente pelo menos 95%, particularmente pelo menos 96%,
particularmente pelo menos 97%, particularmente pelo menos 98%,
particularmente pelo menos, 99% ou 100% idêntica a qualquer uma das CDRs acima.
[046] Em um exemplo de realização (25) a presente invenção refere-se a um peptídeo ou proteína de ligação ou uma parte funcional da mesma, em particular um anticorpo, especialmente um anticorpo monoclonal ou uma parte funcional do mesmo, especialmente um peptídeo de ligação ou anticorpo de qualquer um dos exemplos de realização precedentes, cujo peptídeo de ligação ou anticorpo reconhece e se liga especificamente a um fosfo-epítopo em um mamífero, particularmente na proteína Tau humana ou fragmento desta, particularmente em um confôrmero patológico de proteína
Tau, mas, em um exemplo de realização, não se liga ao epítopo não fosforilado correspondente e/ou a epítopos não relacionados em que o referido peptídeo de ligação ou anticorpo compreende um primeiro domínio de ligação, que contém em sequência uma CDR1 com a sequência de aminoácidos exibida na
SEQ ID NO: 101, uma CDR2 com a sequência de aminoácidos exibida na SEQ
ID NO: 102, e uma CDR3 com a sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID
NO: 103, ou uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, particularmente pelo menos 85%,
particularmente pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, particularmente pelo menos 95%,
particularmente pelo menos 96%, particularmente pelo menos 97%,
particularmente pelo menos 98%, particularmente pelo menos 99% ou 100%
idêntica a qualquer uma das CDRs acima e/ou um segundo domínio de ligação,
que contém em sequência uma CDR1 com a sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID NO: 98, uma CDR2 com a sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID NO: 99, e uma CDR3 com a sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID NO: 100, ou uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, particularmente pelo menos
85%, particularmente pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%,
pelo menos 93%, pelo menos 94%, particularmente pelo menos 95%,
particularmente pelo menos 96%, particularmente pelo menos 97%, particularmente pelo menos 98%, particularmente pelo menos, 99% ou 100% idêntica a qualquer uma das CDRs acima.
[047] Em um exemplo de realização (26) a presente invenção refere-se a um peptídeo ou proteína de ligação ou uma parte funcional da mesma, em particular um anticorpo, especialmente um anticorpo monoclonal ou uma parte funcional do mesmo, especialmente um peptídeo de ligação ou anticorpo de qualquer um dos exemplos de realização precedentes, cujo peptídeo de ligação ou anticorpo reconhece e se liga especificamente a um fosfo-epítopo em um mamífero, particularmente na proteína Tau humana ou fragmento desta, particularmente em um confôrmero patológico de proteína Tau, mas, em um exemplo de realização, não se liga ao epítopo não fosforilado correspondente e/ou a epítopos não relacionados em que o referido peptídeo de ligação ou anticorpo compreende um primeiro domínio de ligação, que contém em sequência uma CDR1 com a sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID NO: 106, uma CDR2 com a sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID NO: 107, e uma CDR3 com a sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID NO: 108, ou uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, particularmente pelo menos 85%, particularmente pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, particularmente pelo menos 95%, particularmente pelo menos 96%, particularmente pelo menos 97%, particularmente pelo menos 98%, particularmente pelo menos 99% ou 100% idêntica a qualquer uma das CDRs acima e/ou um segundo domínio de ligação, que contém em sequência uma CDR1 com a sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID NO: 89, uma CDR2 com a sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID NO: 115, e uma CDR3 com a sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID NO: 91, ou uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, particularmente pelo menos 85%, particularmente pelo menos 90 %, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, particularmente pelo menos 95%, particularmente pelo menos 96%, particularmente pelo menos 97%, particularmente pelo menos 98%, particularmente pelo menos 99 % ou 100% idêntica a qualquer uma das CDRs acima.
[048] Em outro exemplo de realização (27), a presente invenção refere-se a um peptídeo ou proteína de ligação ou uma parte funcional desta, particularmente, um anticorpo, especialmente um anticorpo monoclonal ou uma parte funcional do mesmo, especialmente um peptídeo de ligação ou anticorpo de qualquer um dos exemplos de realização precedentes, cujo peptídeo de ligação ou anticorpo reconhece e se liga especificamente a um fosfo-epítopo em um mamífero, particularmente na proteína Tau humana ou fragmento desta, particularmente em um confôrmero patológico de proteína Tau, mas, em um exemplo de realização, não se liga ao epítopo não fosforilado correspondente e/ou a epítopos não relacionados, em que o referido peptídeo de ligação ou anticorpo compreende um primeiro domínio de ligação que contém a sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID NO: 6, 7, 8, 9, 10, 11, ou uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica às mesmas, e/ou um segundo domínio de ligação, que contém a sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, ou uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 85% idêntica às mesmas.
[049] Em um exemplo de realização (28), a presente invenção refere-se a um peptídeo ou proteína de ligação ou uma parte funcional desta, particularmente, um anticorpo, especialmente um anticorpo monoclonal ou uma parte funcional do mesmo, especialmente um peptídeo de ligação ou anticorpo de qualquer um dos exemplos de realização precedentes, cujo peptídeo de ligação ou anticorpo reconhece e se liga especificamente a um fosfo-epítopo em um mamífero, particularmente na proteína Tau humana ou fragmento desta, particularmente em um confôrmero patológico de proteína Tau, mas, em um exemplo de realização, não se liga ao epítopo não fosforilado correspondente e/ou a epítopos não relacionados, em que o referido peptídeo de ligação ou anticorpo compreende um primeiro domínio de ligação que contém a sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID NO: 6, 7, 8, 9, 10, 11, ou uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica às mesmas, e/ou um segundo domínio de ligação, que contém a sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, ou uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 91% idêntica às mesmas.
[050] Em um exemplo de realização (29), a presente invenção refere-se a um peptídeo ou proteína de ligação ou uma parte funcional desta, particularmente, um anticorpo, especialmente um anticorpo monoclonal ou uma parte funcional do mesmo, especialmente um peptídeo de ligação ou anticorpo de qualquer um dos exemplos de realização precedentes, cujo peptídeo de ligação ou anticorpo reconhece e se liga especificamente a um fosfo-epítopo em um mamífero, particularmente na proteína Tau humana ou fragmento desta, particularmente em um confôrmero patológico de proteína Tau, mas, em um exemplo de realização, não se liga ao epítopo não fosforilado correspondente e/ou a epítopos não relacionados, em que o referido peptídeo de ligação ou anticorpo compreende um primeiro domínio de ligação (domínio de anticorpo) que contém a sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID NO: 6, 7, 8, 9, 10, 11, ou uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95% idêntica às mesmas, e/ou um segundo domínio de ligação, que contém a sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, ou uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 91% idêntica às mesmas.
[051] Em outro exemplo de realização (30), a presente invenção refere-se a um peptídeo ou proteína de ligação ou uma parte funcional desta,
particularmente, um anticorpo, especialmente um anticorpo monoclonal ou uma parte funcional do mesmo, especialmente um peptídeo de ligação ou anticorpo de qualquer um dos exemplos de realização precedentes, cujo peptídeo de ligação ou anticorpo reconhece e se liga especificamente a um fosfo-epítopo em um mamífero, particularmente na proteína Tau humana ou fragmento desta, particularmente em um confôrmero patológico de proteína Tau, mas, em um exemplo de realização, não se liga ao epítopo não fosforilado correspondente e/ou a epítopos não relacionados, em que o referido peptídeo de ligação ou anticorpo compreende um primeiro domínio de ligação que contém a sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID NO: 69, 77, 116, 92, 97, 105, ou uma sequência de aminoácidos que é particularmente pelo menos 85%, particularmente pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, particularmente pelo menos 95%, particularmente pelo menos 96%, particularmente pelo menos 97%, particularmente pelo menos 98%, particularmente pelo menos 99% ou 100% idêntica às mesma, e/ou um segundo domínio de ligação que contém a sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID NO: 68, 76, 88, 96, 104, ou um sequência de aminoácidos que é pelo menos 80%, particularmente pelo menos 85%, particularmente pelo menos 86%, particularmente pelo menos 87%, particularmente pelo menos 88%, particularmente pelo menos 89%, particularmente pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, particularmente pelo menos 95%, particularmente pelo menos 96%, particularmente pelo menos 97%, particularmente pelo menos 98%, particularmente pelo menos 99% ou 100% idêntica às mesmas.
[052] Um exemplo de realização (31) da presente invenção está relacionado a um peptídeo ou proteína de ligação ou uma parte funcional desta, particularmente, um anticorpo, especialmente um anticorpo monoclonal ou uma parte funcional do mesmo, especialmente um peptídeo de ligação ou anticorpo de qualquer um dos exemplos de realização precedentes, cujo peptídeo de ligação ou anticorpo reconhece e se liga especificamente a um fosfo-epítopo em um mamífero, particularmente na proteína Tau humana ou fragmento desta, particularmente em um confôrmero patológico de proteína Tau, mas, em um exemplo de realização, não se liga ao epítopo não fosforilado correspondente e/ou a epítopos não relacionados, em que o referido peptídeo de ligação ou anticorpo compreende um primeiro domínio de ligação que contém a sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 7, ou uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% e 94%, respectivamente, idêntica às mesma, e/ou um segundo domínio de ligação que contém a sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID NO: 1, ou uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 91% idêntica à mesma.
[053] Um exemplo de realização (32) da presente invenção está relacionado a um peptídeo ou proteína de ligação ou uma parte funcional desta, particularmente, um anticorpo, especialmente um anticorpo monoclonal ou uma parte funcional do mesmo, especialmente um peptídeo de ligação ou anticorpo de qualquer um dos exemplos de realização precedentes, cujo peptídeo de ligação ou anticorpo reconhece e se liga especificamente a um fosfo-epítopo em um mamífero, particularmente na proteína Tau humana ou fragmento desta, particularmente em um confôrmero patológico de proteína Tau, mas, em um exemplo de realização, não se liga ao epítopo não fosforilado correspondente e/ou a epítopos não relacionados, em que o referido peptídeo de ligação ou anticorpo compreende um primeiro domínio de ligação que contém a sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID NO: 8, ou uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95% idêntica à mesma, e/ou um segundo domínio de ligação, que contém a sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID NO: 2, ou uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntico à mesma.
[054] Um exemplo de realização (33) da presente invenção está relacionado a um peptídeo ou proteína de ligação ou uma parte funcional desta, particularmente, um anticorpo, especialmente um anticorpo monoclonal ou uma parte funcional do mesmo, especialmente um peptídeo de ligação ou anticorpo de qualquer um dos exemplos de realização precedentes, cujo peptídeo de ligação ou anticorpo reconhece e se liga especificamente a um fosfo-epítopo em um mamífero, particularmente na proteína Tau humana ou fragmento desta, particularmente em um confôrmero patológico de proteína Tau, mas, em um exemplo de realização, não se liga ao epítopo não fosforilado correspondente e/ou a epítopos não relacionados, em que o referido peptídeo de ligação ou anticorpo compreende um primeiro domínio de ligação que contém a sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID NO: 9, ou uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95% idêntica à mesma, e/ou um segundo domínio de ligação, que contém a sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID NO: 3, ou uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntico à mesma.
[055] Um exemplo de realização (34) da presente invenção está relacionado a um peptídeo ou proteína de ligação ou uma parte funcional desta, particularmente, um anticorpo, especialmente um anticorpo monoclonal ou uma parte funcional do mesmo, especialmente um peptídeo de ligação ou anticorpo de qualquer um dos exemplos de realização precedentes, cujo peptídeo de ligação ou anticorpo reconhece e se liga especificamente a um fosfo-epítopo em um mamífero, particularmente na proteína Tau humana ou fragmento desta, particularmente em um confôrmero patológico de proteína Tau, mas, em um exemplo de realização, não se liga ao epítopo não fosforilado correspondente e/ou a epítopos não relacionados, em que o referido peptídeo de ligação ou anticorpo compreende um primeiro domínio de ligação que contém a sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID NO: 10, ou uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 99% idêntica à mesma, e/ou um segundo domínio de ligação, que contém a sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID NO: 4, ou uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 89% idêntico à mesma.
[056] Um exemplo de realização (35) da presente invenção está relacionado a um peptídeo ou proteína de ligação ou uma parte funcional desta, particularmente, um anticorpo, especialmente um anticorpo monoclonal ou uma parte funcional do mesmo, especialmente um peptídeo de ligação ou anticorpo de qualquer um dos exemplos de realização precedentes, cujo peptídeo de ligação ou anticorpo reconhece e se liga especificamente a um fosfo-epítopo em um mamífero, particularmente na proteína Tau humana ou fragmento desta, particularmente em um confôrmero patológico de proteína Tau, mas, em um exemplo de realização, não se liga ao epítopo não fosforilado correspondente e/ou a epítopos não relacionados, em que o referido peptídeo de ligação ou anticorpo compreende um primeiro domínio de ligação que contém a sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID NO: 11, ou uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica à mesma, e/ou um segundo domínio de ligação, que contém a sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID NO: 5, ou uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 87% idêntico à mesma.
[057] Um exemplo de realização (36) da presente invenção está relacionado a um peptídeo ou proteína de ligação ou uma parte funcional desta, particularmente, um anticorpo, especialmente um anticorpo monoclonal ou uma parte funcional do mesmo, especialmente um peptídeo de ligação ou anticorpo de qualquer um dos exemplos de realização precedentes, cujo peptídeo de ligação ou anticorpo reconhece e se liga especificamente a um fosfo-epítopo em um mamífero, particularmente na proteína Tau humana ou fragmento desta, particularmente em um confôrmero patológico de proteína Tau, mas, em um exemplo de realização, não se liga ao epítopo não fosforilado correspondente e/ou a epítopos não relacionados, em que o referido peptídeo de ligação ou anticorpo compreende um primeiro domínio de ligação que contém a sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID NO: 69, ou uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 98% ou 99% idêntica à mesma; e/ou um segundo domínio de ligação, que contém a sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID NO: 68, ou uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90%, 91%, 92% ou 93% idêntica à mesma.
[058] Um exemplo de realização (37) da presente invenção está relacionado a um peptídeo ou proteína de ligação ou uma parte funcional desta, particularmente, um anticorpo, especialmente um anticorpo monoclonal ou uma parte funcional do mesmo, especialmente um peptídeo de ligação ou anticorpo de qualquer um dos exemplos de realização precedentes, cujo peptídeo de ligação ou anticorpo reconhece e se liga especificamente a um fosfo-epítopo em um mamífero, particularmente na proteína Tau humana ou fragmento desta, particularmente em um confôrmero patológico de proteína Tau, mas, em um exemplo de realização, não se liga ao epítopo não fosforilado correspondente e/ou a epítopos não relacionados, em que o referido peptídeo de ligação ou anticorpo compreende um primeiro domínio de ligação que contém a sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID NO: 77, ou uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 93%, 94% ou 95% idêntica à mesma, e/ou um segundo domínio de ligação, que contém a sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID NO: 76, ou uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 88%, 89%, ou 90% idêntica à mesma.
[059] Um exemplo de realização (38) da presente invenção está relacionado a um peptídeo ou proteína de ligação ou uma parte funcional desta, particularmente, um anticorpo, especialmente um anticorpo monoclonal ou uma parte funcional do mesmo, especialmente um peptídeo de ligação ou anticorpo de qualquer um dos exemplos de realização precedentes, cujo peptídeo de ligação ou anticorpo reconhece e se liga especificamente a um fosfo-epítopo em um mamífero, particularmente na proteína Tau humana ou fragmento desta, particularmente em um confôrmero patológico de proteína Tau, mas, em um exemplo de realização, não se liga ao epítopo não fosforilado correspondente e/ou a epítopos não relacionados, em que o referido peptídeo de ligação ou anticorpo compreende um primeiro domínio de ligação que contém a sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID NO: 116, 92, ou 118, ou uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 93%, 94% ou 95% idêntica às mesmas, e/ou um segundo domínio de ligação, que contém a sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID NO: 88, ou uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90%, 91%, 92% ou 93% idêntica às mesmas.
[060] Um exemplo de realização (39) da presente invenção está relacionado a um peptídeo ou proteína de ligação ou uma parte funcional desta, particularmente, um anticorpo, especialmente um anticorpo monoclonal ou uma parte funcional do mesmo, especialmente um peptídeo de ligação ou anticorpo de qualquer um dos exemplos de realização precedentes, cujo peptídeo de ligação ou anticorpo reconhece e se liga especificamente a um fosfo-epítopo em um mamífero, particularmente na proteína Tau humana ou fragmento desta, particularmente em um confôrmero patológico de proteína Tau, mas, em um exemplo de realização, não se liga ao epítopo não fosforilado correspondente e/ou a epítopos não relacionados, em que o referido peptídeo de ligação ou anticorpo compreende um primeiro domínio de ligação que contém a sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID NO: 97, ou uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 99% idêntica à mesma, e/ou um segundo domínio de ligação, que contém a sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID NO: 96, ou uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 86%, 87%, 88% ou 90% idêntica à mesma.
[061] Um exemplo de realização (40) da presente invenção está relacionado a um peptídeo ou proteína de ligação ou uma parte funcional desta, particularmente, um anticorpo, especialmente um anticorpo monoclonal ou uma parte funcional do mesmo, especialmente um peptídeo de ligação ou anticorpo de qualquer um dos exemplos de realização precedentes, cujo peptídeo de ligação ou anticorpo reconhece e se liga especificamente a um fosfo-epítopo em um mamífero, particularmente na proteína Tau humana ou fragmento desta, particularmente em um confôrmero patológico de proteína Tau, mas, em um exemplo de realização, não se liga ao epítopo não fosforilado correspondente e/ou a epítopos não relacionados, em que o referido peptídeo de ligação ou anticorpo compreende um primeiro domínio de ligação que contém a sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID NO: 105, ou uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 98%, ou 99% idêntica à mesma, e/ou um segundo domínio de ligação, que contém a sequência de aminoácidos exibida na SEQ ID NO: 104, ou uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 88%, 89%, ou 90% idêntica à mesma.
[062] Em outro exemplo de realização (41), a presente invenção refere-se a um peptídeo ou proteína de ligação ou uma parte funcional dos mesmos, particularmente, um anticorpo, especialmente um anticorpo monoclonal ou uma parte funcional do mesmo, de acordo com os exemplos de realização (22) - (24), em que o referido primeiro domínio de ligação compreende as CDR, tal como mostrado nas SEQ ID NOs: 21-34 e o segundo domínio de ligação compreende as CDR, tal como mostrado nas SEQ ID NOs: 12-20.
[063] Em um exemplo de realização (42) a presente invenção refere-se a um peptídeo ou proteína de ligação ou uma parte funcional desta,
particularmente, um anticorpo, especialmente um anticorpo monoclonal ou uma parte funcional do mesmo, de acordo com o exemplo de realização (31), em que o referido primeiro domínio de ligação contém as CDR, conforme mostrado nas SEQ ID NOs: 21-23 e SEQ ID NOs: 24-26, respectivamente, e o referido segundo domínio de ligação compreende as CDR, conforme mostrado nas SEQ ID NOs: 12-14.
[064] Um exemplo de realização (43) da presente invenção refere- se a um peptídeo ou proteína de ligação ou uma parte funcional dos mesmos, particularmente, um anticorpo, especialmente um anticorpo monoclonal ou uma parte funcional do mesmo, de acordo com o exemplo de realização (32), em que o referido primeiro domínio de ligação compreende as CDRs, conforme mostrado nas SEQ ID NOs: 27, 25 e 26 e o segundo domínio de ligação compreende as CDRs, conforme mostrado nas SEQ ID NOs: 12-14.
[065] Um exemplo de realização (44) da presente invenção refere- se a um peptídeo ou proteína de ligação ou uma parte funcional dos mesmos, particularmente, um anticorpo, especialmente um anticorpo monoclonal ou uma parte funcional do mesmo, de acordo com o exemplo de realização (33), em que o referido primeiro domínio de ligação compreende as CDRs, conforme mostrado nas SEQ ID NOs: 28, 25 e 26 e o segundo domínio de ligação compreende as CDRs, conforme mostrado nas SEQ ID NOs: 12-14.
[066] Um exemplo de realização (45) da presente invenção refere- se a um peptídeo ou proteína de ligação ou uma parte funcional dos mesmos, particularmente, um anticorpo, especialmente um anticorpo monoclonal ou uma parte funcional do mesmo, de acordo com o exemplo de realização (34), em que o referido primeiro domínio de ligação compreende as CDRs, conforme mostrado nas SEQ ID NOs: 29-31; e o segundo domínio de ligação compreende as CDRs, conforme mostrado nas SEQ ID NOs: 15-17.
[067] Um exemplo de realização (46) da presente invenção refere- se a um peptídeo ou proteína de ligação ou uma parte funcional dos mesmos, particularmente, um anticorpo, especialmente um anticorpo monoclonal ou uma parte funcional do mesmo, de acordo com o exemplo de realização (35), em que o referido primeiro domínio de ligação compreende as CDRs, conforme mostrado nas SEQ ID NOs: 32-34; e o segundo domínio de ligação compreende as CDRs, conforme mostrado nas SEQ ID NOs: 18-20.
[068] Um exemplo de realização (47) da presente invenção refere- se a um peptídeo ou proteína de ligação ou uma parte funcional dos mesmos, particularmente, um anticorpo, especialmente um anticorpo monoclonal ou uma parte funcional do mesmo, de acordo com o exemplo de realização (27), em que o referido primeiro domínio de ligação compreende as CDRs, conforme mostrado nas SEQ ID NOs: 73-75; e o segundo domínio de ligação compreende as CDRs, conforme mostrado nas SEQ ID NOs: 70-72.
[069] Um exemplo de realização (48) da presente invenção refere- se a um peptídeo ou proteína de ligação ou uma parte funcional dos mesmos, particularmente, um anticorpo, especialmente um anticorpo monoclonal ou uma parte funcional do mesmo, de acordo com o exemplo de realização (27), em que o referido primeiro domínio de ligação compreende as CDRs, conforme mostrado nas SEQ ID NOs: 81-83; e o segundo domínio de ligação compreende as CDRs, conforme mostrado nas SEQ ID NOs: 78-80.
[070] Um exemplo de realização (49) da presente invenção refere- se a um peptídeo ou proteína de ligação ou uma parte funcional dos mesmos, particularmente, um anticorpo, especialmente um anticorpo monoclonal ou uma parte funcional do mesmo, de acordo com o exemplo de realização (27), em que o referido primeiro domínio de ligação compreende as CDRs, conforme mostrado nas SEQ ID NOs: 101-103; e o segundo domínio de ligação compreende as CDRs, conforme mostrado nas SEQ ID NOs: 98-100.
[071] Um exemplo de realização (50) da presente invenção refere- se a um peptídeo ou proteína de ligação ou uma parte funcional dos mesmos, particularmente, um anticorpo, especialmente um anticorpo monoclonal ou uma parte funcional do mesmo, de acordo com o exemplo de realização (27), em que o referido primeiro domínio de ligação compreende as CDRs, conforme mostrado nas SEQ ID NOs: 89, 115 e 91; e o segundo domínio de ligação compreende as CDRs, conforme mostrado nas SEQ ID NOs: 106-108.
[072] Ainda em outro exemplo de realização (51), a presente invenção refere-se a um peptídeo ou proteína de ligação ou uma parte funcional desta, particularmente, um anticorpo, especialmente um anticorpo monoclonal ou uma parte funcional do mesmo, em particular um anticorpo ou peptídeo de ligação de qualquer exemplo de realização precedente, em que o peptídeo de ligação ou anticorpo reconhece e se liga especificamente a um fosfo-epítopo em um mamífero, particularmente na proteína Tau humana ou fragmento desta, particularmente em um confôrmero patológico de proteína Tau, mas, em um exemplo de realização, não se liga a o epítopo não fosforilado correspondente e/ou a epítopos não relacionados em que o referido peptídeo de ligação ou anticorpo compreende um:
[073] a. primeiro domínio de ligação que contém a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 6 e/ou um segundo domínio de ligação que contém a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1; ou um
[074] b. primeiro domínio de ligação que contém a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 7 e/ou um segundo domínio de ligação que contém a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1; ou um
[075] c. primeiro domínio de ligação que contém a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 8 e/ou um segundo domínio de ligação que contém a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2; ou um
[076] d. primeiro domínio de ligação que contém a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 9 e/ou um segundo domínio de ligação que contém a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 3; ou um
[077] e. primeiro domínio de ligação que contém a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 10 e/ou um segundo domínio de ligação que contém a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 4; ou um
[078] f.primeiro domínio de ligação que contém a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 11 e/ou um segundo domínio de ligação que contém a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 5; ou em
[079] g. primeiro domínio de ligação que contém a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 69 e/ou um segundo domínio de ligação que contém a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 68; ou um
[080] h. primeiro domínio de ligação que contém a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 77 e/ou um segundo domínio de ligação que contém a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 76; ou um
[081] i. primeiro domínio de ligação que contém a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 116 e/ou um segundo domínio de ligação que contém a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 88; ou um
[082] j. primeiro domínio de ligação que contém a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 92 e/ou um segundo domínio de ligação que contém a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 88; ou um
[083] k. primeiro domínio de ligação que contém a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 97 e/ou um segundo domínio de ligação que contém a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 6; ou um
[084] l. primeiro domínio de ligação que contém a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 105 e/ou um segundo domínio de ligação que contém a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:
104.
[085] Em um exemplo de realização (52) da invenção, o peptídeo de ligação de qualquer um dos exemplos de realização precedentes é um anticorpo, especialmente um anticorpo do isotipo IgG2a, IgG2b ou IgG3, particularmente um anticorpo policlonal, um anticorpo monoclonal, um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizado ou anticorpo totalmente humano.
[086] Em um exemplo de realização (48) a invenção refere-se a um polinucleotídeo que codifica o peptídeo de ligação de qualquer um dos exemplos de realização anteriores.
[087] Em um exemplo de realização (53), o referido polinucleotídeo compreende uma molécula de ácido nucleico selecionada a partir do grupo consistindo em;
[088] a. uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeos codificante de um polipeptídeo que compreende a sequência de aminoácidos tal como representado nas SEQ ID NOs: 35-45; SEQ ID NOs: 84-87, SEQ ID NOs: 109-112 e 117;
[089] b. uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeos que tem pelo menos 85% de identidade de sequência com a sequência apresentada em SEQ ID NOs: 35-45; SEQ ID NOs: 84-87, SEQ ID NOs: 109-112 e 117;
[090] c. uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeos que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência apresentada em SEQ ID NOs: 35-45; SEQ ID NOs: 84-87, SEQ ID NOs: 109-112 e 117;
[091] d. uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeos que tem pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência apresentada em SEQ ID NOs: 35-45; SEQ ID NOs: 84-87, SEQ ID NOs: 109-112 e 117;
[092] e. uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeos que tem pelo menos 98% de identidade de sequência com a sequência apresentada em SEQ ID NOs: 35-45; SEQ ID NOs: 84-87, SEQ ID NOs: 109-112 e 117;
[093] f.uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeos que tem pelo menos 99% de identidade de sequência com a sequência apresentada em SEQ ID NOs: 35-45; SEQ ID NOs: 84-87, SEQ ID NOs: 109-112 e 117;
[094] g. uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeos cuja fita complementar se hibridiza à uma molécula de ácido nucleico de qualquer um dos itens de a) - f);
[095] h. uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeos que diverge da sequência de nucleotídeos definida em qualquer um dos itens de a) - g) pela degeneração do código genético;
[096] em que a referida molécula de ácido nucleico tal como definido em qualquer um dos itens a) - h) reconhece e se liga especificamente a um fosfo-epítopo em um mamífero, particularmente na proteína Tau humana ou fragmento desta, particularmente na proteína Tau humana conforme apresentado na SEQ ID NO: 67, selecionada a partir do grupo consistindo em aa Tau 15-20 compreendendo uma Tyr fosforilada na posição 18 (Y18), aa Tau 405-412 compreendendo uma Ser fosforilada na posição 409 (pS409), aa Tau 405-411 compreendendo uma Ser fosforilada na posição 409 (pS409) e aa Tau 208-218 compreendendo uma Thr fosforilada na posição 212 (pT212) e uma Ser fosforilada na posição 214 (pS214), aa Tau 393-401 compreendendo uma Ser fosforilada na posição 396 (pS396), aa Tau 396-401 compreendendo uma Ser fosforilada na posição 396 (pS396), aa Tau 394-400 compreendendo uma Ser fosforilada na posição 396 (pS396), aa Tau 402-406 compreendendo uma Ser fosforilada na posição 404 (pS404) e aa Tau 393-400 compreendendo um Ser fosforilada na posição 396 (pS396), em que, em um exemplo de realização, o referido peptídeo de ligação tem uma alta afinidade de ligação com uma constante de dissociação de pelo menos 10 nM, especialmente de pelo menos 8 nM, particularmente de pelo menos 5 nM, particularmente de pelo menos 2 nM, particularmente de pelo menos 1 nM, particularmente de pelo menos 500 pM, especialmente de pelo menos 400 pM, especialmente de pelo menos 300 pM, especialmente de pelo menos 200 pM, especialmente de pelo menos 100 pM, especialmente de pelo menos 50 pM e/ou tem uma velocidade de constante de associação de 104 M-1s-1 ou maior, particularmente entre 3 - 5 x 104 M-1s-1 ou maior, particularmente de 105 M-1s-1 ou maior; particularmente de 6 – 9 x 105 M-1s-1 ou maior; particularmente de 106 M-1s-1 ou maior, particularmente de 1 – 4 x 106 M-1s-1 ou maior, particularmente de 107 M-1s-1 ou maior; mas, em um exemplo de realização, não se ligam ao epítopo não fosforilado correspondente e/ou a epítopos não relacionados.
[097] Em diversos exemplos de realização (54) da invenção, um peptídeo de ligação é fornecido ou uma parte funcional do mesmo, em particular um anticorpo, especialmente um anticorpo monoclonal ou uma parte funcional do mesmo, ou um polinucleotídeo, de acordo com qualquer um dos exemplos de realização anteriores, ou um combinação de ambos, que é capaz de reconhecer especificamente e se ligar a um fosfo-epítopo em um mamífero, particularmente na proteína Tau humana, particularmente uma proteína Tau associada a microtúbulos, em particular, um agregado de proteínas Tau hiperfosforiladas e associadas a microtúbulos tal como aquelas presentes nos filamentos helicoidais pareados (PHF), que são as estruturas predominantes nos emaranhados neurofibrilares, filamentos de neurópilo e neurites distróficas, mas, em um exemplo de realização, não se ligam ao epítopo não fosforilado correspondente e/ou a epítopos não relacionados.
[098] Em um exemplo de realização específico (55) da invenção, a proteína Tau humana é a proteína Tau humana conforme mostrado na SEQ ID NO: 67.
[099] Os peptídeos de ligação e anticorpos de acordo com qualquer um dos exemplos de realização anteriores podem ser utilizados (56) para reduzir os níveis de proteína Tau solúvel total, particularmente da proteína Tau fosforilada solúvel no cérebro, particularmente no córtex cerebral e/ou hipocampo, de um mamífero ou humano que contêm níveis elevados de proteína Tau solúvel e/ou proteína Tau fosforilada solúvel.
[0100] Os peptídeos de ligação e anticorpos de acordo com qualquer um dos exemplos de realização precedentes podem também ser utilizados (57) para reduzir os níveis de filamentos helicoidais pareados que contêm a proteína Tau hiperfosforilada (PHF pTau) no cérebro, particularmente no córtex cerebral e/ou hipocampo de um mamífero ou humano que contêm níveis elevados dos referidos filamentos helicoidais pareados pTau (pTau PHF).
[0101] A redução do nível de proteína Tau solúvel total e/ou proteína Tau fosforilada solúvel e/ou filamentos helicoidais pareados pTau (PHF pTau) no cérebro, particularmente no córtex cerebral e/ou hipocampo de um mamífero ou humano que contêm níveis aumentados das referidas variantes da proteína Tau, que contribui para as doenças, condições ou distúrbios associados com a proteína Tau no dito mamífero ou humano, pode conduzir a uma melhoria e/ou alivio dos sintomas associados com essas doenças, condições ou distúrbios associados à proteína Tau (58).
[0102] Os peptídeos de ligação e anticorpos de acordo com qualquer um dos exemplos de realização podem, portanto, ser utilizados na terapia (59), particularmente na terapia humana, para retardar ou interromper a progressão de uma doença, condição ou distúrbio associados com a proteína Tau.
[0103] Os peptídeos de ligação e anticorpos de acordo com qualquer um dos exemplos de realização anteriores podem ainda ser utilizados (60) na terapia, particularmente na terapia humana, para melhorar ou aliviar os sintomas associados com as doenças, condições ou distúrbios associados à proteína Tau, tal como, por exemplo, deterioração ou perda de funções cognitivas como raciocínio, juízo situacional, capacidade de memória, aprendizagem, navegação especial, e etc.
[0104] Em um exemplo de realização (61), a invenção refere-se a peptídeos e anticorpos de ligação de acordo com qualquer um dos exemplos de realização anteriores para a utilização na terapia, particularmente para a utilização no tratamento de tauopatias, um grupo de doenças e distúrbios associados com a proteína Tau, ou para aliviar os sintomas associados com as tauopatias.
[0105] Em um exemplo de realização (62), a invenção refere-se a peptídeos e anticorpos de ligação de acordo com qualquer um dos exemplos de realização anteriores para conservar ou aumentar a capacidade da memória cognitiva em um mamífero sofrendo de uma tauopatia.
[0106] Em um exemplo de realização específico (63) da invenção, os peptídeos de ligação e anticorpos que compreendem pelo menos uma ou todas as CDRs de cadeia leve de anticorpos de ACI-36-2B6-Ab1, ACI-36-2B6- Ab2, ACI-36-3A8-Ab1, e ACI-36-3A8-Ab2 conforme fornecido nas SEQ ID NOs: 25, 26, 27, e SEQ ID NOs: 21, 22, 23, respectivamente, e/ou pelo menos uma ou todas as CDRs de cadeia pesada de anticorpos ACI-36-2B6-Ab1, ACI-36- 2B6-Ab2, ACI-36-3A8-Ab1, e ACI-36-3A8-Ab2 conforme fornecido nas SEQ ID NOs: 12, 13, 14, são utilizados na terapia, particularmente na terapia humana, para melhorar ou aliviar os sintomas associados com as doenças, condições ou distúrbios associados à proteína Tau, tal como, por exemplo, a deterioração ou perda das funções cognitivas, incluindo raciocínio, juízo situacional, memória, aprendizagem, navegação especial, e etc.
[0107] Em outro exemplo de realização (64) da invenção, os anticorpos compreendendo a cadeia leve de anticorpos ACI-36-2B6-Ab1, ACI- 36-2B6-Ab2, ACI-36-3A8-Ab1, e ACI-36-3A8-Ab2 conforme fornecido na SEQ ID NO: 8_, e SEQ ID NOs: 6 e 7 respectivamente, e/ou pelo menos a cadeia pesada de anticorpos ACI-36-2B6-Ab1, ACI-36-2B6-Ab2, ACI-36-3A8-Ab1, e ACI-36-3A8-Ab2 conforme fornecido na SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2, respectivamente, são utilizados na terapia, particularmente na terapia humana, para melhorar ou aliviar os sintomas associados com as doenças, condições ou distúrbios associados à proteína Tau, tal como, por exemplo, a deterioração ou perda das funções cognitivas, incluindo raciocínio, juízo situacional, memória, aprendizagem, navegação especial, e etc.
[0108] Em outro exemplo de realização específico (65) da invenção, os peptídeos de ligação e anticorpos compreendendo pelo menos uma ou todas as CDRs de cadeia leve de anticorpos ACI-33-6C10-Ab1 e ACI- 33-6C10-Ab2 conforme fornecido nas SEQ ID NOs: 29, 30, 31, e/ou pelo menos uma ou todas as CDRs de cadeia pesada de anticorpos ACI-33-6C10-
Ab1 e ACI-33-6C10-Ab2 conforme fornecido nas SEQ ID NOs: 15, 16, 17, são utilizados na terapia, particularmente na terapia humana, para melhorar ou aliviar os sintomas associados com as doenças, condições ou distúrbios associados à proteína Tau, tal como, por exemplo, a deterioração ou perda das funções cognitivas, incluindo raciocínio, juízo situacional, memória, aprendizagem, navegação especial, e etc.
[0109] Em outro exemplo de realização específico (66) da invenção, os peptídeos de ligação e anticorpos compreendendo pelo menos uma ou todas as CDRs de cadeia leve de anticorpos ACI-41-7C2-Ab1 e ACI- 41-7C2-Ab2 conforme fornecido nas SEQ ID NOs: 32, 33, 34, e/ou pelo menos uma ou todas as CDRs de cadeia pesada de anticorpos ACI-41-7C2-Ab1 e ACI-41-7C2-Ab2 conforme fornecido nas SEQ ID NOs: 18, 19, 20, são utilizados na terapia, particularmente na terapia humana, para melhorar ou aliviar os sintomas associados com as doenças, condições ou distúrbios associados à proteína Tau, tal como, por exemplo, a deterioração ou perda das funções cognitivas, incluindo raciocínio, juízo situacional, memória, aprendizagem, navegação especial, e etc.
[0110] Em um exemplo de realização específico (67) da invenção, os peptídeos de ligação e anticorpos que compreendem pelo menos uma ou todas as CDRs de cadeia leve de anticorpos ACI-35-2A1-Ab1; ACI-35-2A1- Ab2; ACI-35-4A6-Ab1; ACI-35-4A6-Ab2; ACI-35-1D2-Ab1; ACI-35-2G5-Ab1; conforme fornecido nas SEQ ID NOs: 73-75, 81-83, 93-95, 101-103, 106-108; e/ou pelo menos uma ou todas as CDRs de cadeia pesada de anticorpos ACI- 35-2A1-Ab1; ACI-35-2A1-Ab2; ACI-35-4A6-Ab1; ACI-35-4A6-Ab2; ACI-35-1D2- Ab1; ACI-35-2G5-Ab1; conforme fornecido nas SEQ ID NOs: 70-72, 78-80, 89- 91, 98-100, são utilizados na terapia, particularmente na terapia humana, para melhorar ou aliviar os sintomas associados com as doenças, condições ou distúrbios associados à proteína Tau, tal como, por exemplo, a deterioração ou perda das funções cognitivas, incluindo raciocínio, juízo situacional, memória, aprendizagem, navegação especial, e etc.
[0111] Em outro exemplo de realização específico (68) da invenção, os peptídeos de ligação e anticorpos compreendendo pelo menos uma ou todas as CDRs de cadeia leve de anticorpos ACI-35-2G5-Ab2; ACI-35- 2G5-Ab3; conforme fornecido nas SEQ ID NOs: 106-108; e/ou pelo menos uma ou todas as CDRs de cadeia pesada de anticorpos ACI-35-2G5-Ab2; ACI-35- 2G5-Ab3; conforme fornecido nas SEQ ID NOs: 89, 115 e 91, são utilizados na terapia, particularmente na terapia humana, para melhorar ou aliviar os sintomas associados com as doenças, condições ou distúrbios associados à proteína Tau, tal como, por exemplo, a deterioração ou perda das funções cognitivas, incluindo raciocínio, juízo situacional, memória, aprendizagem, navegação especial, e etc.
[0112] Os peptídeos de ligação ou anticorpos de acordo com os exemplos de realização anteriores para os emaranhados de Tau e pTau em cérebros podem ser determinados mediante o emprego de ensaios de imunorreatividade de proteína em cortes de cérebro selecionados e por Western blot de homogeneizados de cérebro, respectivamente, tal como descrito nos Exemplos.
[0113] Em outro exemplo de realização (69), a presente invenção fornece uma composição farmacêutica compreendendo um peptídeo de ligação ou uma parte funcional deste, especialmente um anticorpo, especialmente um anticorpo monoclonal ou uma parte funcional do mesmo, ou um polinucleotídeo, de acordo com qualquer exemplo de realização precedente, ou uma combinação destes, em uma quantidade terapeuticamente eficaz juntamente com um veículo farmaceuticamente aceitável.
[0114] Em um exemplo de realização (70), o peptídeo de ligação ou uma parte funcional deste, especialmente um anticorpo, especialmente um anticorpo monoclonal ou uma parte funcional do mesmo, ou um polinucleotídeo, ou composição farmacêutica, de acordo com qualquer exemplo de realização anterior, ou uma combinação dos mesmos, é utilizada na terapêutica, em particular na terapia humana para o tratamento ou alívio dos sintomas de doenças e distúrbios associados à proteína Tau, incluindo distúrbios ou doenças neurodegenerativas, tais como tauopatias.
[0115] Os peptídeos de ligação, anticorpos e/ou composições farmacêuticas de acordo com qualquer um dos exemplos de realização pode, assim, ser utilizado (71) para retardar ou interromper a progressão de uma doença, condição ou distúrbio associados à proteína Tau, após a administração dos referidos peptídeos de ligação, anticorpos e/ou composições farmacêuticas a um animal, particularmente um mamífero, e especialmente um humano, sofrendo da tal doença ou condição.
[0116] Os peptídeos de ligação, anticorpos e/ou composições farmacêuticas de acordo com qualquer exemplo de realização anterior podem ainda ser utilizados (72) para melhorar ou aliviar os sintomas associados com as doenças, condições ou distúrbios associados à proteína Tau, tais como, por exemplo, insuficiência ou perda das funções cognitivas, incluindo o raciocínio, juízo situacional, capacidade de memória, aprendizagem, navegação especial, e etc, pela administração dos referidos peptídeos de ligação, anticorpos e/ou composições farmacêuticas a um animal, particularmente um mamífero, particularmente um humano, sofrendo de tal doença ou condição.
[0117] Em um exemplo de realização (73), o peptídeo de ligação ou uma parte funcional deste, especialmente um anticorpo, especialmente um anticorpo monoclonal ou uma parte funcional do mesmo, ou um polinucleotídeo ou composição farmacêutica, de acordo com qualquer exemplo de realização anterior, ou uma combinação destes, é utilizado no tratamento de doenças e distúrbios que são causados por, ou associados com a formação de lesões neurofibrilares, a patologia cerebral predominante em tauopatia que compreende um grupo heterogêneo de doenças ou distúrbios neurodegenerativos, incluindo as doenças ou distúrbios que apresentam coexistência de patologias Tau e amiloides, incluindo, mas não limitado a: Doença de Alzheimer, doença de Creutzfeldt-Jacob, Demência pugilística, Síndrome de Down, doença de Gerstmann-Sträussler-Scheinker, miosite de corpos de inclusão, e angiopatia amiloide cerebral de proteína do prião, lesão cerebral traumática e, adicionalmente, doenças ou distúrbios que não apresentam uma patologia amiloide distinta, incluindo, mas não limitado a, esclerose lateral amiotrófica/complexo parkinsonismo-demência de Guam, doença do neurônio motor não-Guam (Non-Guamanian) com emaranhados neurofibrilares, demência por grãos argirofílicos, degeneração córtico-basal, emaranhados neurofibrilares difusos com calcificação, demência frontotemporal com parkinsonismo ligado ao cromossomo 17, doença de Hallevorden-Spatz, atrofia de múltiplos sistemas, doença de Niemann-Pick, tipo C, degeneração Pallido-ponto-nigral, doença de Pick, gliose subcortical progressiva, paralisia supranuclear progressiva, panencefalite esclerosante subaguda, demência apenas por emaranhado (tangle-only), Parkinsonismo pós-encefalítico, distrofia miotônica.
[0118] Em um exemplo de realização (74), o peptídeo de ligação ou uma parte funcional deste, especialmente um anticorpo, especialmente um anticorpo monoclonal ou uma parte funcional do mesmo, ou um polinucleotídeo, ou composição farmacêutica, de acordo com qualquer exemplo de realização precedente, ou uma combinação destes, é(são) utilizado(s) no tratamento da Doença de Alzheimer.
[0119] Em um exemplo de realização (75) da invenção, é fornecido um método para modular os níveis solúveis e/ou insolúveis tau, particularmente no cérebro, em particular no córtex do cérebro e/ou do hipocampo, de um animal, em particular um mamífero ou humano, compreendendo a administração ao referido animal, particularmente ao referido mamífero ou humano, do peptídeo de ligação, ou uma parte funcional deste, especialmente um anticorpo, especialmente um anticorpo monoclonal ou uma parte funcional do mesmo, ou um polinucleotídeo ou uma composição farmacêutica, de acordo com qualquer um dos exemplos de realização precedentes, ou uma combinação dos mesmos.
[0120] Um aspecto refere-se à redução da modulação dos níveis de proteína Tau solúvel, particularmente da proteína Tau fosforilada solúvel no cérebro, particularmente no córtex cerebral e/ou hipocampo de um animal, particularmente um mamífero ou humano que contêm níveis elevados de proteína Tau solúvel e/ou proteína Tau fosforilada solúvel.
[0121] Em um exemplo de realização (76) da invenção, é fornecido um método para reduzir os níveis proteína Tau insolúvel, particularmente de filamentos helicoidais pareados que contêm a proteína Tau hiperfosforilada (PHF pTau) no cérebro, particularmente no córtex cerebral e/ou hipocampo de um animal, particularmente de um mamífero ou humano, que contêm níveis elevados de proteína Tau insolúveis, particularmente filamentos helicoidais pareados pTau (PHF pTau), compreendendo a administração ao referido animal, em particular ao referido mamífero ou humano, o peptídeo de ligação, ou uma parte funcional deste, especialmente um anticorpo, em particular um anticorpo monoclonal ou uma parte funcional do mesmo, ou um polinucleotídeo ou composição farmacêutica, de acordo com qualquer um dos exemplos de realização anteriores, ou uma combinação destes.
[0122] Em um exemplo de realização (77), a presente invenção refere-se a um método para retardar ou interromper a progressão de uma doença, condição ou distúrbio associados à proteína Tau em um animal, particularmente um mamífero ou humano, compreendendo a administração ao referido animal, em particular o referido mamífero ou humano, que sofre de tal doença ou condição, o peptídeo de ligação ou uma parte funcional deste, especialmente um anticorpo, especialmente um anticorpo monoclonal ou uma parte funcional do mesmo, ou um polinucleotídeo ou composição farmacêutica, de acordo com qualquer um dos exemplos de realização precedentes, ou uma combinação destes.
[0123] Em um exemplo de realização (78), a presente invenção refere-se a um método para melhorar ou aliviar os sintomas associados com as doenças, condições ou distúrbios associados à proteína Tau, como, por exemplo, a deterioração ou perda das funções cognitivas, incluindo o raciocínio, juízo situacional, capacidade de memória, aprendizagem, navegação especial, etc, a um animal, particularmente um mamífero ou humano, compreendendo a administração ao referido animal, particularmente ao referido mamífero ou humano, que sofre de tal doença ou condição, do peptídeo de ligação, ou uma parte funcional deste, em particular de um anticorpo, em particular um anticorpo monoclonal ou uma parte funcional do mesmo, ou um polinucleotídeo ou composição farmacêutica, de acordo com qualquer um dos exemplos de realização anteriores, ou uma combinação destes.
[0124] Em outro exemplo de realização (79), a presente invenção refere-se a um método para conservação ou aumento da capacidade de memória cognitiva em um mamífero que sofre de uma tauopatia.
[0125] Ainda em outro exemplo de realização (80) da invenção, é fornecido um método para o tratamento de uma doença ou distúrbio associados à proteína Tau, incluindo uma doença ou distúrbio neurodegenerativos, tal como um tauopatia, compreendendo a administração a um animal, particularmente, a um mamífero, mas especialmente ao humano que sofre de tal doença ou distúrbio, do peptídeo de ligação ou uma parte funcional deste, especialmente um anticorpo, especialmente um anticorpo monoclonal ou uma parte funcional do mesmo, ou um polinucleotídeo ou composição farmacêutica, de acordo com qualquer um dos exemplos de realização anteriores, ou uma combinação destes.
[0126] Em um exemplo de realização (81) da invenção, é fornecido um método para o tratamento de doenças e distúrbios que são causados por, ou associados com a formação de lesões neurofibrilares, a patologia cerebral predominante em tauopatia que compreende um grupo heterogêneo de doenças ou distúrbios neurodegenerativos, incluindo as doenças ou distúrbios que apresentam coexistência de patologias Tau e amiloides, incluindo, mas não limitado a: Doença de Alzheimer, doença de Creutzfeldt-Jacob, Demência pugilística, Síndrome de Down, doença de Gerstmann-Sträussler-Scheinker, miosite de corpos de inclusão, e angiopatia amiloide cerebral de proteína do prião, lesão cerebral traumática e, adicionalmente, doenças ou distúrbios que não apresentam uma patologia amiloide distinta, incluindo, mas não limitado a, esclerose lateral amiotrófica/complexo parkinsonismo-demência de Guam, doença do neurônio motor não-Guam com emaranhados neurofibrilares, demência por grãos argirofílicos, degeneração córtico-basal, emaranhados neurofibrilares difusos com calcificação, demência frontotemporal com parkinsonismo ligado ao cromossomo 17, doença de Hallevorden-Spatz, atrofia de múltiplos sistemas, doença de Niemann-Pick, tipo C, degeneração Pallido-ponto-nigral, doença de Pick, gliose subcortical progressiva, paralisia supranuclear progressiva, panencefalite esclerosante subaguda, demência apenas por emaranhado, Parkinsonismo pós-encefalítico, distrofia miotônica, em que o referido método compreende a administração a um animal, particularmente a um mamífero, especialmente ao humano, sofrendo de tal doença ou distúrbio, do peptídeo de ligação, ou uma parte funcional deste, em particular de um anticorpo,
especialmente um anticorpo monoclonal ou uma parte funcional do mesmo, ou um polinucleotídeo ou composição farmacêutica de acordo com qualquer um dos exemplos de realização anteriores, ou uma combinação destes.
[0127] Em outro exemplo de realização (82) da invenção, é fornecido um método para induzir uma resposta imune passiva em um animal, particularmente um mamífero ou humano, que sofre de um distúrbio neurodegenerativo tal como a tauopatia pela administração ao referido animal ou humano do peptídeo de ligação ou uma parte funcional do mesmo, especialmente um anticorpo, especialmente um anticorpo monoclonal ou uma parte funcional do mesmo, ou um polinucleotídeo, ou uma composição farmacêutica, de acordo com qualquer um dos exemplos de realização anteriores, ou uma combinação destes.
[0128] Ainda em outro exemplo de realização (83) da invenção, é fornecido um método de diagnóstico de doença, distúrbio ou condição associados à proteína Tau em um paciente, em que o dito método compreende a detecção da ligação de um imunopeptídeo de ligação ou um fragmento ativo deste, em particular um anticorpo, em particular um anticorpo monoclonal ou uma parte funcional do mesmo, de acordo com qualquer um dos exemplos de realização anteriores, a um epítopo da proteína Tau em uma amostra ou in situ, que inclui as etapas de;
[0129] a. colocar a amostra, ou uma parte do corpo ou área do corpo específicas, suspeitas de conter a proteína Tau, em contato com um peptídeo de ligação, ou um seu fragmento, particularmente um anticorpo, especialmente um anticorpo monoclonal ou uma parte funcional do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, cujo peptídeo ou seu fragmento se liga a um epítopo da proteína Tau;
[0130] b. permitindo que o referido peptídeo de ligação, em particular o referido anticorpo, em particular o referido anticorpo monoclonal, ou parte uma funcional do mesmo, se ligue à proteína Tau, para formar um complexo imunológico;
[0131] c. detectar a formação do complexo imunológico; e
[0132] d. correlacionar a presença ou ausência do complexo imunológico com a presença ou a ausência de proteína Tau na amostra ou parte ou área do corpo específicas.
[0133] Ainda em outro exemplo de realização (84) da invenção, é fornecido um método para diagnosticar a predisposição a uma doença, condição ou distúrbio associados à proteína Tau em um paciente, em que o dito método compreende a detecção da ligação de um imunopeptídeo de ligação ou um fragmento ativo deste, em particular um anticorpo, em particular um anticorpo monoclonal ou uma parte funcional do mesmo, de acordo com qualquer um dos exemplos de realização anteriores, a um epítopo da proteína Tau em uma amostra ou in situ, que inclui as etapas de;
[0134] a. colocar a amostra, ou uma parte do corpo ou área do corpo específicas, suspeitas de conter o antígeno Tau, em contato com um peptídeo de ligação, ou um fragmento ativo deste, particularmente um anticorpo, especialmente um anticorpo monoclonal ou uma parte funcional do mesmo, de acordo com qualquer uma dos exemplos de realização precedentes, cujo peptídeo ou fragmento deste se liga a um epítopo da proteína Tau;
[0135] b. permitindo que o referido peptídeo de ligação, em particular o referido anticorpo, em particular o referido anticorpo monoclonal, ou parte uma funcional do mesmo, se ligue ao antígeno tau, para formar um complexo imunológico;
[0136] c. detectar a formação do complexo imunológico; e
[0137] d. correlacionar a presença ou ausência do complexo imunológico com a presença ou a ausência de antígeno Tau na amostra ou parte ou área do corpo específicas;
[0138] e. comparar da quantidade do referido complexo imunológico com um valor controle normal;
[0139] em que um aumento da quantidade do referido agregado em comparação com um valor controle normal indica que o referido paciente sofre de, ou possui risco de desenvolver uma doença ou condição associadas à proteína Tau.
[0140] em um exemplo de realização (85) da invenção, é fornecido um método para o monitoramento da doença residual mínima em um paciente após o tratamento com o peptídeo de ligação ou uma parte funcional deste, especialmente um anticorpo, especialmente um anticorpo monoclonal ou uma parte funcional do mesmo, ou um polinucleotídeo, ou composição farmacêutica, de acordo com qualquer um dos exemplos de realização anteriores, em que o referido método compreende:
[0141] a. colocar a amostra, ou uma parte do corpo ou área do corpo específicas, suspeitas de conter o antígeno Tau, em contato com um peptídeo de ligação ou uma parte funcional do mesmo, particularmente um anticorpo, especialmente um anticorpo monoclonal ou uma parte funcional do mesmo, de acordo com qualquer uma dos exemplos de realização precedentes, cujo peptídeo ou fragmento deste se liga a um epítopo da proteína Tau;
[0142] b. permitindo que o referido peptídeo de ligação, em particular o referido anticorpo, em particular o referido anticorpo monoclonal, ou uma parte funcional do mesmo, se ligue ao antígeno tau, para formar um complexo imunológico;
[0143] c. detectar a formação do complexo imunológico; e
[0144] d. correlacionar a presença ou ausência do complexo imunológico com a presença ou a ausência de antígeno Tau na amostra ou parte ou área do corpo específicas.
[0145] e. comparar da quantidade do referido complexo imunológico com um valor controle normal,
[0146] em que um aumento da quantidade do referido agregado em comparação com um valor controle normal, indica que o referido paciente ainda sofre de uma doença residual mínima.
[0147] Em um exemplo de realização (86) da invenção, é fornecido um método para predizer a responsividade de um paciente sendo tratado com o peptídeo de ligação ou uma parte funcional deste, especialmente um anticorpo, especialmente um anticorpo monoclonal ou uma parte funcional do mesmo, ou um polinucleotídeo, ou uma composição farmacêutica, de acordo com qualquer um dos exemplos de realização anteriores, compreendendo:
[0148] a. colocar a amostra, ou uma parte do corpo ou área do corpo específicas, suspeitas de conter o antígeno Tau, em contato com um peptídeo de ligação, ou um fragmento ativo deste, particularmente um anticorpo, especialmente um anticorpo monoclonal ou uma parte funcional do mesmo, de acordo com qualquer uma dos exemplos de realização precedentes, cujo peptídeo ou fragmento deste se liga a um epítopo da proteína Tau;
[0149] b. permitindo que o referido peptídeo de ligação, em particular o referido anticorpo, em particular o referido anticorpo monoclonal, ou uma parte funcional do mesmo, se ligue ao antígeno tau, para formar um complexo imunológico;
[0150] c. detectar a formação do complexo imunológico; e
[0151] d. correlacionar a presença ou ausência do complexo imunológico com a presença ou a ausência de antígeno Tau na amostra ou parte ou área do corpo específicas.
[0152] e. comparar a quantidade do referido complexo imunológico antes e após o início do tratamento,
[0153] em que uma diminuição na quantidade do referido agregado indica que o referido paciente tem um alto potencial de ser responsivo ao tratamento.
[0154] Em outro exemplo de realização (87), a invenção refere-se a um kit de ensaio para a detecção e diagnóstico de doenças, condições ou distúrbios associados à proteína Tau que compreende um peptídeo de ligação ou um fragmento ativo deste, em particular um anticorpo, especialmente um anticorpo monoclonal ou uma parte funcional do mesmo, de acordo com qualquer um dos exemplos de realização anteriores.
[0155] Em um exemplo de realização (88) o referido kit de ensaio compreende um recipiente que carrega um ou mais peptídeos de ligação ou fragmentos ativos dos mesmos, em particular um anticorpo, em particular um anticorpo monoclonal, ou uma parte funcional do mesmo, de acordo com qualquer um dos exemplos de realização anteriores, e as instruções para o uso dos peptídeos de ligação ou anticorpos com o propósito de se ligarem ao antígeno Tau para formar um complexo imunológico e a detecção da formação do complexo imunológico de modo que a presença ou ausência dos complexos imunológicos se correlacione com a presença ou ausência de antígeno tau.
[0156] Ainda em outro exemplo de realização (89), a presente invenção refere-se a um epítopo selecionado a partir do grupo consistindo em aa Tau 15-20 da proteína Tau humana exibida na SEQ ID NO: 67 que compreende uma Tyr fosforilada na posição 18 (Y18), aa Tau 405-412 compreendendo uma Ser fosforilada na posição 409 (pS409), aa Tau 405-411 compreendendo uma Ser fosforilada na posição 409 (pS409) e aa Tau 208-218 compreendendo uma Thr fosforilada na posição 212 (pT212) e uma Ser fosforilada na posição 214 (pS214).
[0157] Em um exemplo de realização (90), o referido epítopo consiste em aa Tau 15-20 com uma Tyr fosforilada na posição 18 (Y18).
[0158] Em um exemplo de realização (91), o referido epítopo consiste em aa Tau 405-412 com uma Ser fosforilada na posição 409 (pS409).
[0159] Em um exemplo de realização (92), o referido epítopo consiste em aa Tau 405-411 com uma Ser fosforilada na posição 409 (pS409).
[0160] Em outro exemplo de realização (93), a invenção refere-se a uma linhagem celular de produção de um peptídeo de ligação ou fragmento ativo deste, em particular um anticorpo, especialmente um anticorpo monoclonal ou uma parte funcional do mesmo de acordo com qualquer um dos exemplos de realização anteriores.
[0161] Em um exemplo de realização (94), a invenção refere-se a uma linhagem de células, que é a linhagem de células de hibridoma 6C10F9C12A11 depositada em 25 de agosto de 2010, como DSM ACC3079.
[0162] Em um exemplo de realização (95), a invenção refere-se a uma linhagem de células, que é a linhagem de células de hibridoma 6C10E5E9C12 depositada em 25 de agosto de 2010, como DSM ACC3081.
[0163] Em um exemplo de realização (96), a invenção refere-se a uma linhagem de células, que é a linhagem de células de hibridoma 6H1A11C11 depositada em 25 de agosto de 2010, como DSM ACC3080.
[0164] Em um exemplo de realização (97), a invenção refere-se a uma linhagem de células, que é a linhagem de células de hibridoma 6H1G6E6 depositada em 25 de agosto de 2010, como DSM ACC3088.
[0165] Em um exemplo de realização (98), a invenção refere-se a uma linhagem de células, que é a linhagem de células de hibridoma 2B6A10C11 depositada em 25 de agosto de 2010, como DSM ACC3084.
[0166] Em um exemplo de realização (99), a invenção refere-se a uma linhagem de células, que é a linhagem de células de hibridoma 2B6G7A12 depositada em 10 de março de 2010, como DSM ACC3087.
[0167] Em um exemplo de realização (100), a invenção refere-se a uma linhagem de células, que é a linhagem de células de hibridoma 3A8A12G7 depositada em 25 de agosto de 2010, como DSM ACC3086.
[0168] Em um exemplo de realização (101), a invenção refere-se a uma linhagem de células, que é a linhagem de células de hibridoma 3A8E12H8 depositada em 25 de agosto de 2010, como DSM ACC3085.
[0169] Em um exemplo de realização (102), a invenção refere-se a uma linhagem de células, que é a linhagem de células de hibridoma 7C2(1)F10C10D3 depositada em 25 de agosto de 2010, como DSM ACC3082.
[0170] Em um exemplo de realização (103), a invenção refere-se a uma linhagem de células, que é a linhagem de células de hibridoma 7C2(2)B9F11D5 depositada em 25 de agosto de 2010, como DSM ACC3083.
[0171] Em um exemplo de realização (103a), a invenção refere-se a uma linhagem de células, que é a linhagem de células de hibridoma A4-4A6- 48 depositada em 30 de agosto de 2011, como DSM ACC3136.
[0172] Em um exemplo de realização (103b), a invenção refere-se a uma linhagem de células, que é a linhagem de células de hibridoma A6-2G5- depositada em 30 de agosto de 2011, como DSM ACC3137.
[0173] Em um exemplo de realização (103c), a invenção refere-se a uma linhagem de células, que é a linhagem de células de hibridoma A6-2G5- 41 depositada em 30 de agosto de 2011, como DSM ACC3138.
[0174] Em um exemplo de realização (103d), a invenção refere-se a uma linhagem de células, que é a linhagem de células de hibridoma A4-2A1- 18 depositada em 30 de agosto de 2011, como DSM ACC3139.
[0175] Em um exemplo de realização (103e), a invenção refere-se a uma linhagem de células, que é a linhagem de células de hibridoma A4-2A1- 40 depositada em 30 de agosto de 2011, como DSM ACC3140.
[0176] Em um exemplo de realização (103e), a invenção refere-se a uma linhagem de células, que é a linhagem de células de hibridoma A6-1D2- 12 depositada em 6 de setembro de 2011, como DSM ACC3141.
[0177] Em um exemplo de realização (104), a invenção refere-se a um anticorpo monoclonal ou uma parte funcional do mesmo, que compreende um domínio de cadeia leve (VL) e/ou cadeia pesada (VH), que é codificado por um polinucleotídeo localizado em um fragmento de nucleotídeos que pode ser obtido pela amplificação por PCR de DNA de linhagem celular de hibridoma 6C10F9C12A11 depositada em 25 de agosto de 2010, como DSM ACC3079 usando;
[0178] a. um par de primers compreendendo um primer 5' de SEQ ID NO: 54 e um primer 3' de SEQ ID NO: 51 para a amplificação de um primeiro domínio de ligação; e/ou
[0179] b. uma mistura de primers compreendendo um primer 5' de SEQ ID NO: 53 e SEQ ID NO: 54 e um primer 3' de SEQ ID NO: 47 para a amplificação de um segundo domínio de ligação.
[0180] Em um exemplo de realização (105), a invenção refere-se a um anticorpo monoclonal ou uma parte funcional do mesmo, que compreende um domínio de cadeia leve (VL) e/ou cadeia pesada (VH), que é codificado por um polinucleotídeo localizado em um fragmento de nucleotídeos que pode ser obtido pela amplificação por PCR de DNA de linhagem celular de hibridoma 6C10E5E9C12 depositada em 25 de agosto de 2010, como DSM ACC3081 usando;
[0181] a. uma mistura de primers compreendendo um primer 5' de SEQ ID NO: 48 e SEQ ID NO: 49 e um primer 3' de SEQ ID NO: 51 para a amplificação de um primeiro domínio de ligação; e/ou
[0182] b. uma mistura de primers compreendendo um primer 5' de SEQ ID NO: 53 e SEQ ID NO: 54 e um primer 3' de SEQ ID NO: 47 para a amplificação de um segundo domínio de ligação.
[0183] Em um exemplo de realização (106), a invenção refere-se a um anticorpo monoclonal ou uma parte funcional do mesmo, que compreende um domínio de cadeia leve (VL) e/ou cadeia pesada (VH), que é codificado por um polinucleotídeo localizado em um fragmento de nucleotídeos que pode ser obtido pela amplificação por PCR de DNA de linhagem celular de hibridoma 6H1A11C11 depositada em 25 de agosto de 2010, como DSM ACC3080 usando;
[0184] a. um par de primers compreendendo um primer 5' de SEQ ID NO: 50 e um primer 3' de SEQ ID NO: 51 para a amplificação de um primeiro domínio de ligação; e/ou
[0185] b. um par de primers compreendendo um primer 5' de SEQ ID NO: 46 e um primer 3' de SEQ ID NO: 47 para a amplificação de um segundo domínio de ligação.
[0186] Em um exemplo de realização (107), a invenção refere-se a um anticorpo monoclonal ou uma parte funcional do mesmo, que compreende um domínio de cadeia leve (VL) e/ou cadeia pesada (VH), que é codificado por um polinucleotídeo localizado em um fragmento de nucleotídeos que pode ser obtido pela amplificação por PCR de DNA de linhagem celular de hibridoma 6H1G6E6 depositada em 25 de agosto de 2010, como DSM ACC3088 usando;
[0187] a. um par de primers compreendendo um primer 5' de SEQ ID NO: 50 e um primer 3' de SEQ ID NO: 51 para a amplificação de um primeiro domínio de ligação; e/ou
[0188] b. um par de primers compreendendo um primer 5' de SEQ ID NO: 46 e um primer 3' de SEQ ID NO: 47 para a amplificação de um segundo domínio de ligação.
[0189] Em um exemplo de realização (108), a invenção refere-se a um anticorpo monoclonal ou uma parte funcional do mesmo, que compreende um domínio de cadeia leve (VL) e/ou cadeia pesada (VH), que é codificado por um polinucleotídeo localizado em um fragmento de nucleotídeos que pode ser obtido pela amplificação por PCR de DNA de linhagem celular de hibridoma 2B6A10C11 depositada em 25 de agosto de 2010, como DSM ACC3084 usando;
[0190] a. um par de primers compreendendo um primer 5' de SEQ ID NO: 50 e um primer 3' de SEQ ID NO: 51 para a amplificação de um primeiro domínio de ligação; e/ou
[0191] b. uma mistura de primers compreendendo um primer 5' de SEQ ID NO: 46 e SEQ ID NO: 52 e um primer 3' de SEQ ID NO: 47 para a amplificação de um segundo domínio de ligação.
[0192] Em um exemplo de realização (109), a invenção refere-se a um anticorpo monoclonal ou uma parte funcional do mesmo, que compreende um domínio de cadeia leve (VL) e/ou cadeia pesada (VH), que é codificado por um polinucleotídeo localizado em um fragmento de nucleotídeos que pode ser obtido pela amplificação por PCR de DNA de linhagem celular de hibridoma 2B6G7A12 depositada em 25 de agosto de 2010, como DSM ACC3087 usando;
[0193] a. um par de primers compreendendo um primer 5' de SEQ ID NO: 50 e um primer 3' de SEQ ID NO: 51 para a amplificação de um primeiro domínio de ligação; e/ou
[0194] b. uma mistura de primers compreendendo um primer 5' de SEQ ID NO: 46 e SEQ ID NO: 52 e um primer 3' de SEQ ID NO: 47 para a amplificação de um segundo domínio de ligação.
[0195] Em um exemplo de realização (110), a invenção refere-se a um anticorpo monoclonal ou uma parte funcional do mesmo, que compreende um domínio de cadeia leve (VL) e/ou cadeia pesada (VH), que é codificado por um polinucleotídeo localizado em um fragmento de nucleotídeos que pode ser obtido pela amplificação por PCR de DNA de linhagem celular de hibridoma 3A8A12G7 depositada em 25 de agosto de 2010, como DSM ACC3086 usando;
[0196] a1. uma mistura de primers compreendendo um primer 5' de SEQ ID NO: 48 e SEQ ID NO: 49 e um primer 3' de SEQ ID NO: 51 para a amplificação de um primeiro domínio de ligação; ou
[0197] a2. um par de primers compreendendo um primer 5' de SEQ ID NO: 50 e um primer 3' de SEQ ID NO: 51 para a amplificação de um primeiro domínio de ligação; e/ou
[0198] b. um par de primers compreendendo um primer 5' de SEQ ID NO: 46 e um primer 3' de SEQ ID NO: 47 para a amplificação de um segundo domínio de ligação.
[0199] Em um exemplo de realização (111), a invenção refere-se a um anticorpo monoclonal ou uma parte funcional do mesmo, que compreende um domínio de cadeia leve (VL) e/ou cadeia pesada (VH), que é codificado por um polinucleotídeo localizado em um fragmento de nucleotídeos que pode ser obtido pela amplificação por PCR de DNA de linhagem celular de hibridoma 3A8E12H8 depositada em 25 de agosto de 2010, como DSM ACC3085 usando;
[0200] a1. uma mistura de primers compreendendo um primer 5' de SEQ ID NO: 48 e SEQ ID NO: 49 e um primer 3' de SEQ ID NO: 51 para a amplificação de um primeiro domínio de ligação; ou
[0201] a2. um par de primers compreendendo um primer 5' de SEQ ID NO: 50 e um primer 3' de SEQ ID NO: 51 para a amplificação de um primeiro domínio de ligação; e/ou
[0202] b. um par de primers compreendendo um primer 5' de SEQ ID NO: 46 e um primer 3' de SEQ ID NO: 47 para a amplificação de um segundo domínio de ligação.
[0203] Em um exemplo de realização (112), a invenção refere-se a um anticorpo monoclonal ou uma parte funcional do mesmo, que compreende um domínio de cadeia leve (VL) e/ou cadeia pesada (VH), que é codificado por um polinucleotídeo localizado em um fragmento de nucleotídeos que pode ser obtido pela amplificação por PCR de DNA de linhagem celular de hibridoma 7C2(1)F10C10D3 depositada em 25 de agosto de 2010, como DSM ACC3082 usando;
[0204] a. uma mistura de primers compreendendo um primer 5' de SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 56 e SEQ ID NO: 57 e um primer 3' de SEQ ID NO: 51 para a amplificação de um primeiro domínio de ligação;
[0205] b. uma mistura de primers compreendendo um primer 5' de SEQ ID NO: 53 e SEQ ID NO: 55 e um primer 3' de SEQ ID NO: 47 para a amplificação de um segundo domínio de ligação.
[0206] Em um exemplo de realização (113), a invenção refere-se a um anticorpo monoclonal ou uma parte funcional do mesmo, que compreende um domínio de cadeia leve (VL) e/ou cadeia pesada (VH), que é codificado por um polinucleotídeo localizado em um fragmento de nucleotídeos que pode ser obtido pela amplificação por PCR de DNA de linhagem celular de hibridoma 7C2(2)B9F11D5 depositada em 25 de agosto de 2010, como DSM ACC3083 usando;
[0207] a. um par de primers compreendendo um primer 5' de SEQ ID NO: 57 e um primer 3' de SEQ ID NO: 51 para a amplificação de um primeiro domínio de ligação;
[0208] b. uma mistura de primers compreendendo um primer 5' de SEQ ID NO: 53 e SEQ ID NO: 55 e um primer 3' de SEQ ID NO: 47 para a amplificação de um segundo domínio de ligação.
[0209] Em um exemplo de realização (114), a invenção refere-se a um anticorpo monoclonal ou uma parte funcional do mesmo, que compreende um domínio de cadeia leve (VL) e/ou cadeia pesada (VH), que é codificado por um polinucleotídeo localizado em um fragmento de nucleotídeos que pode ser obtido pela amplificação por PCR de DNA de linhagem celular de hibridoma A4-2A1-18 depositada em 30 de agosto de 2011, como DSM ACC3139 usando;
[0210] a. um par de primers compreendendo um primer 5' de SEQ ID NO: 149 e um primer 3' de SEQ ID NO: 51 para a amplificação de um primeiro domínio de ligação; e/ou
[0211] b. uma mistura de primers compreendendo um primer 5' selecionado a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 120, 123, 124, 136, 137, 138, 139, e 140; e um primer 3' selecionado a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 131, 134, e 141-148, para a amplificação de um segundo domínio de ligação.
[0212] Em um exemplo de realização (115), a invenção refere-se a um anticorpo monoclonal ou uma parte funcional do mesmo, que compreende um domínio de cadeia leve (VL) e/ou cadeia pesada (VH), que é codificado por um polinucleotídeo localizado em um fragmento de nucleotídeos que pode ser obtido pela amplificação por PCR de DNA de linhagem celular de hibridoma A6-2G5-30 depositada em 30 de agosto de 2011, como DSM ACC3137 usando;
[0213] a. uma mistura de primers compreendendo um primer 5' selecionado a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO: 51 e 169-174 e um primer 3' de SEQ ID NO: 51 para a amplificação de um primeiro domínio de ligação; e/ou
[0214] b. uma mistura de primers compreendendo um primer 5' selecionado a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 124, 127 e 150-158; e um primer 3' selecionado a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 130 e 159-168, para a amplificação de um segundo domínio de ligação.
[0215] Em um exemplo de realização (116), a invenção refere-se a um anticorpo monoclonal ou uma parte funcional do mesmo, que compreende um domínio de cadeia leve (VL) e/ou cadeia pesada (VH), que é codificado por um polinucleotídeo localizado em um fragmento de nucleotídeos que pode ser obtido pela amplificação por PCR de DNA de linhagem celular de hibridoma A4-2A1-40 depositada em 30 de agosto de 2011, como DSM ACC3140 usando;
[0216] a. uma mistura de primers compreendendo um primer 5' selecionado a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO: 178 179 e 180 e um primer 3' de SEQ ID NO: 51 para a amplificação de um primeiro domínio de ligação; e/ou
[0217] b. uma mistura de primers compreendendo um primer 5' selecionado a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 121, 127, 139, 154, 155 e 175 ; e um primer 3' selecionado a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 128, 129, 147, 176, e 177, para a amplificação de um segundo domínio de ligação.
[0218] Em um exemplo de realização (117), a invenção refere-se a um anticorpo monoclonal ou uma parte funcional do mesmo, que compreende um domínio de cadeia leve (VL) e/ou cadeia pesada (VH), que é codificado por um polinucleotídeo localizado em um fragmento de nucleotídeos que pode ser obtido pela amplificação por PCR de DNA de linhagem celular de hibridoma A6-2G5-41 depositada em 30 de agosto de 2011, como DSM ACC3138 usando;
[0219] a. uma mistura de primers compreendendo um primer 5' selecionado a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO: 51 e 188-192 e um primer 3' de SEQ ID NO: 51 para a amplificação de um primeiro domínio de ligação; e/ou
[0220] b. uma mistura de primers compreendendo um primer 5' selecionado a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: , 124, 126, 181, 182 e 183 ; e um primer 3' selecionado a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 144, 145 e 184-187, para a amplificação de um segundo domínio de ligação.
[0221] Em um exemplo de realização (118), a invenção refere-se a um anticorpo monoclonal ou uma parte funcional do mesmo, que compreende um domínio de cadeia leve (VL) e/ou cadeia pesada (VH), que é codificado por um polinucleotídeo localizado em um fragmento de nucleotídeos que pode ser obtido pela amplificação por PCR de DNA de linhagem celular de hibridoma A4-4A6-48 depositada em 30 de agosto de 2011, como DSM ACC3136 usando;
[0222] a. uma mistura de primers compreendendo um primer 5' selecionado a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO: 50 e 201-204 e um primer 3' de SEQ ID NO: 51 para a amplificação de um primeiro domínio de ligação; e/ou
[0223] b. uma mistura de primers compreendendo um primer 5' selecionado a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 121, 137, 151 e 193-197; e um primer 3' selecionado a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 131, 141, 144, 166, 198, 199 e 200, para a amplificação de um segundo domínio de ligação.
[0224] Em um exemplo de realização (119), a invenção refere-se a um anticorpo monoclonal ou uma parte funcional do mesmo, que compreende um domínio de cadeia leve (VL) e/ou cadeia pesada (VH), que é codificado por um polinucleotídeo localizado em um fragmento de nucleotídeos que pode ser obtido pela amplificação por PCR de DNA de linhagem celular de hibridoma A6-1D2-12 depositada em 6 de setembro de 2011, como DSM ACC3141 usando;
[0225] a. uma mistura de primers compreendendo um primer 5' selecionado a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO: 209-214, e 219-221 e um primer 3' de SEQ ID NO: 215 para a amplificação de um primeiro domínio de ligação; e/ou
[0226] b. uma mistura de primers compreendendo um primer 5' selecionado a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO: 216, 217 e 218 e um primer 3' de SEQ ID NO: 208 para a amplificação de um segundo domínio de ligação.
[0227] Em um exemplo de realização (120), o anticorpo de acordo com qualquer um dos exemplos de realização anteriores pode ser um anticorpo policlonal, um anticorpo monoclonal, um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizado, um anticorpo humano, um anticorpo camelídeo, um diacorpo ou um anticorpo modificado ou desenvolvido por engenharia genética.
[0228] Em um exemplo de realização (121), o peptídeo ou parte funcional do mesmo pode ser um fragmento que compreende uma cadeia pesada e/ou uma cadeia leve, em particular uma cadeia pesada conforme apresentado nas SEQ ID NOs: 1-5 e/ou uma cadeia leve conforme apresentado nas SEQ ID NOs: 6-11, particularmente um fragmento Fab ou fragmento F(ab')2.
[0229] Em um exemplo de realização específico (122), a invenção refere-se a uma cadeia pesada conforme exibido nas SEQ ID NOs: 1-5.
[0230] Em outro exemplo de realização específico (123), a invenção refere-se a uma cadeia leve conforme exibido nas SEQ ID NOs: 6-11.
[0231] Em um exemplo de realização (124), a invenção fornece um método para a produção dos peptídeos de ligação ou anticorpos de qualquer um dos exemplos de realização anteriores, compreendendo a etapa de cultivar a linhagem celular de qualquer um dos exemplos de realização anteriores, em um meio de cultura adequado e, facultativamente, a purificação dos peptídeos de ligação ou anticorpos a partir da linhagem celular ou meio de cultura.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS E LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS FIGURAS
[0232] A Figura 1 exibe a ligação da fosfo-Tau em cortes cerebrais a partir de camundongos BigT (Tau bigênico) usando o anticorpo TAUPIR.
[0233] A Figura 2 exibe a ligação do anticorpo a fosfo-Tau em cortes cerebrais de pacientes com DA e tauopatia usando TAUPIR usando o anticorpo ACI-36-3A8-Ab1.
[0234] A Figura 3 exibe o efeito do tratamento com o anticorpo anti-Tau após 1 semana de estudo in vivo sobre o epítopo pTau: pT231 usando MSD.
[0235] A Figura 4 exibe um diagrama demonstrando como os cérebros foram preparados para as frações solúvel e insolúveis com sarkosyl (SinT) da proteína Tau.
[0236] A Figura 5 exibe os resultados do Western blot do epítopo pTau após tratamento com anticorpo anti-Tau durante 1 mês (Figura 5A, 5B, 5C, 5G, 5H, 5I) ou 3 meses do estudo in vivo (Figura 5D, 5E, 5F).
[0237] A Figura 6 exibe os resultados do Western blot para o epítopo pTau após o tratamento com o anticorpo anti-Tau durante 3 meses no estudo in vivo usando camundongos bigênicos biGT.
[0238] A Figura 7 exibe a IHQ após tratamento com anticorpo anti-Tau ACI-36-2B6-Ab1 durante 3 meses do estudo in vivo.
[0239] A Figura 8 exibe a IHQ após tratamento com anticorpo anti-Tau ACI-36-3A8-Ab1 durante 3 meses do estudo in vivo.
[0240] A Figura 9 exibe os resultados do teste do labirinto aquático de Morris (Morris Water-Maze) após tratamento com anticorpo anti- Tau ACI-36-2B6-Ab1 durante 3 meses no estudo in vivo.
[0241] A Figura 10 exibe os resultados do teste do labirinto aquático de Morris (Morris Water-Maze) após tratamento com anticorpo anti- Tau ACI-36-3A8-Ab1 durante 3 meses no estudo in vivo.
SEQUÊNCIAS
[0242] A SEQ ID NO: 1 ilustra a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada (VH) do anticorpo monoclonal ACI-36-3A8- Ab1 produzido pela linhagem celular de hibridoma 3A8A12G7.
[0243] A SEQ ID NO: 2 ilustra a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada (VH) do anticorpo monoclonal ACI-36-2B6- Ab1 produzido pela linhagem celular de hibridoma 2B6A10C11.
[0244] A SEQ ID NO: 3 ilustra a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada (VH) do anticorpo monoclonal ACI-36-6H1- Ab1 e ACI-36-6H1-Ab2 produzidos pelas linhagens celulares de hibridoma 6H1A11C11 e 6H1G6E6, respectivamente.
[0245] A SEQ ID NO: 4 ilustra a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada (VH) do anticorpo monoclonal ACI-33-6C10- Ab2 e ACI-33-6C10-Ab1 produzidos pelas linhagens celulares de hibridoma 6C10E5E9C12 e 6C10F9C12A11, respectivamente.
[0246] A SEQ ID NO: 5 ilustra a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada (VH) do anticorpo monoclonal ACI-41-7C2- Ab1 e ACI-41-7C2-Ab2 produzidos pelas linhagens celulares de hibridoma 7C2(1)F10C10D3 e 7C2(2)B9F11D5, respectivamente.
[0247] A SEQ ID NO: 6 ilustra a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve (VK) do anticorpo monoclonal ACI-36-3A8-Ab1VK- AD e ACI-36-3A8-Ab2VK-AD produzidos pelas linhagens celulares de hibridoma 3A8A12G7 e 3A8E12H8, respectivamente.
[0248] A SEQ ID NO: 7 ilustra a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve (VK) do anticorpo monoclonal ACI-36-3A8-Ab1VK- G e ACI-36-3A8-Ab2VK-G produzidos pelas linhagens celulares de hibridoma 3A8A12G7 e 3A8E12H8, respectivamente.
[0249] A SEQ ID NO: 8 ilustra a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve (VK) do anticorpo monoclonal ACI-36-2B6-Ab1 e ACI-36-2B6-Ab2 produzidos pelas linhagens celulares de hibridoma 2B6A10C11 e 2B6G7A12, respectivamente.
[0250] A SEQ ID NO: 9 ilustra a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve (VK) do anticorpo monoclonal ACI-36-6H1-Ab1 e ACI-36-6H1-Ab2 produzidos pelas linhagens celulares de hibridoma 6H1A11C11 e 6H1G6E6, respectivamente.
[0251] A SEQ ID NO: 10 ilustra a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve (VK) do anticorpo monoclonal ACI-33-6C10-Ab2 e ACI-33-6C10-Ab1 produzidos pelas linhagens celulares de hibridoma 6C10E5E9C12 e 6C10F9C12A11, respectivamente.
[0252] A SEQ ID NO: 11 ilustra a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve (VK) do anticorpo monoclonal ACI-41-7C2-Ab1 e ACI-41-7C2-Ab2 produzidos pelas linhagens celulares de hibridoma 7C2(1)F10C10D3 e 7C2(2)B9F11D5, respectivamente.
[0253] A SEQ ID NO: 12 ilustra a sequência de aminoácidos da CDR1 da região variável de cadeia pesada (VH) do anticorpo monoclonal ACI- 36-3A8-Ab1, ACI-36-3A8-Ab2, ACI-36-2B6-Ab1, ACI-36-2B6-Ab2, ACI-36-6H1- Ab1 e ACI-36-6H1-Ab2 produzidos pelas linhagens celulares de hibridoma 3A8A12G7, 3A8E12H8, 2B6A10C11, 2B6G7A12, 6H1A11C11 e 6H1G6E6, respectivamente.
[0254] A SEQ ID NO: 13 ilustra a sequência de aminoácidos da CDR2 da região variável de cadeia pesada (VH) do anticorpo monoclonal ACI- 36-3A8-Ab1, ACI-36-3A8-Ab2, ACI-36-2B6-Ab1, ACI-36-2B6-Ab2, ACI-36-6H1- Ab1 e ACI-36-6H1-Ab2 produzidos pelas linhagens celulares de hibridoma 3A8A12G7, 3A8E12H8, 2B6A10C11, 2B6G7A12, 6H1A11C11 e 6H1G6E6, respectivamente.
[0255] A SEQ ID NO: 14 ilustra a sequência de aminoácidos da CDR3 da região variável de cadeia pesada (VH) do anticorpo monoclonal ACI- 36-3A8-Ab1, ACI-36-3A8-Ab2, ACI-36-2B6-Ab1, ACI-36-2B6-Ab2, ACI-36-6H1- Ab1 e ACI-36-6H1-Ab2 produzidos pelas linhagens celulares de hibridoma 3A8A12G7, 3A8E12H8, 2B6A10C11, 2B6G7A12, 6H1A11C11 e 6H1G6E6, respectivamente.
[0256] A SEQ ID NO: 15 ilustra a sequência de aminoácidos da CDR1 da região variável de cadeia pesada (VH) do anticorpo monoclonal ACI- 33-6C10-Ab2 e ACI-33-6C10-Ab1 produzidos pelas linhagens celulares de hibridoma 6C10E5E9C12 e 6C10F9C12A11, respectivamente.
[0257] A SEQ ID NO: 16 ilustra a sequência de aminoácidos da CDR2 da região variável de cadeia pesada (VH) do anticorpo monoclonal ACI-
33-6C10-Ab2 e ACI-33-6C10-Ab1 produzidos pelas linhagens celulares de hibridoma 6C10E5E9C12 e 6C10F9C12A11, respectivamente.
[0258] A SEQ ID NO: 17 ilustra a sequência de aminoácidos da CDR3 da região variável de cadeia pesada (VH) do anticorpo monoclonal ACI- 33-6C10-Ab2 e ACI-33-6C10-Ab1 produzidos pelas linhagens celulares de hibridoma 6C10E5E9C12 e 6C10F9C12A11, respectivamente.
[0259] A SEQ ID NO: 18 ilustra a sequência de aminoácidos da CDR1 da região variável de cadeia pesada (VH) do anticorpo monoclonal ACI- 41-7C2-Ab1 e ACI-41-7C2-Ab2 produzidos pelas linhagens celulares de hibridoma 7C2(1)F10C10D3 e 7C2(2)B9F11D5, respectivamente.
[0260] A SEQ ID NO: 19 ilustra a sequência de aminoácidos da CDR2 da região variável de cadeia pesada (VH) do anticorpo monoclonal ACI- 41-7C2-Ab1 e ACI-41-7C2-Ab2 produzidos pelas linhagens celulares de hibridoma 7C2(1)F10C10D3 e 7C2(2)B9F11D5, respectivamente.
[0261] A SEQ ID NO: 20 ilustra a sequência de aminoácidos da CDR3 da região variável de cadeia pesada (VH) do anticorpo monoclonal ACI- 41-7C2-Ab1 e ACI-41-7C2-Ab2 produzidos pelas linhagens celulares de hibridoma 7C2(1)F10C10D3 e 7C2(2)B9F11D5, respectivamente.
[0262] A SEQ ID NO: 21 ilustra a sequência de aminoácidos da CDR1 da região variável de cadeia leve (VK) do anticorpo monoclonal ACI-36- 3A8-Ab1VK-AD e ACI-36-3A8-Ab2VK-AD produzidos pelas linhagens celulares de hibridoma 3A8A12G7 e 3A8E12H8, respectivamente.
[0263] A SEQ ID NO: 22 ilustra a sequência de aminoácidos da CDR2 da região variável de cadeia leve (VK) do anticorpo monoclonal ACI-36- 3A8-Ab1VK-AD e ACI-36-3A8-Ab2VK-AD produzidos pelas linhagens celulares de hibridoma 3A8A12G7 e 3A8E12H8, respectivamente.
[0264] A SEQ ID NO: 23 ilustra a sequência de aminoácidos da CDR3 da região variável de cadeia leve (VK) do anticorpo monoclonal ACI-36-
3A8-Ab1VK-AD e ACI-36-3A8-Ab2VK-AD produzidos pelas linhagens celulares de hibridoma 3A8A12G7 e 3A8E12H8, respectivamente.
[0265] A SEQ ID NO: 24 ilustra a sequência de aminoácidos da CDR1 da região variável de cadeia leve (VK) do anticorpo monoclonal ACI-36- 3A8-Ab1VK-G e ACI-36-3A8-Ab2VK-G produzidos pelas linhagens celulares de hibridoma 3A8A12G7 e 3A8E12H8, respectivamente.
[0266] A SEQ ID NO: 25 ilustra a sequência de aminoácidos da CDR2 da região variável de cadeia leve (VK) do anticorpo monoclonal ACI-36- 3A8-Ab1VK-G, ACI-36-3A8-Ab2VK-G, ACI-36-2B6-Ab1, ACI-36-2B6-Ab2, ACI-36- 6H1-Ab1 e ACI-36-6H1-Ab2 produzidos pelas linhagens celulares de hibridoma 3A8A12G7, 3A8E12H8, 2B6A10C11, 2B6G7A12, 6H1A11C11 e 6H1G6E6, respectivamente.
[0267] A SEQ ID NO: 26 ilustra a sequência de aminoácidos da CDR3 da região variável de cadeia leve (VK) do anticorpo monoclonal ACI-36- 3A8-Ab1VK-G, ACI-36-3A8-Ab2VK-G, ACI-36-2B6-Ab1, ACI-36-2B6-Ab2, ACI-36- 6H1-Ab1 e ACI-36-6H1-Ab2 produzidos pelas linhagens celulares de hibridoma 3A8A12G7, 3A8E12H8, 2B6A10C11, 2B6G7A12, 6H1A11C11 e 6H1G6E6, respectivamente.
[0268] A SEQ ID NO: 27 ilustra a sequência de aminoácidos da CDR1 da região variável de cadeia leve (VK) do anticorpo monoclonal ACI-36- 2B6-Ab1 e ACI-36-2B6-Ab2produzidos pelas linhagens celulares de hibridoma 2B6A10C11 e 2B6G7A12, respectivamente.
[0269] A SEQ ID NO: 28 ilustra a sequência de aminoácidos da CDR1 da região variável de cadeia leve (VK) do anticorpo monoclonal ACI-36- 6H1-Ab1 e ACI-36-6H1-Ab2 produzidos pelas linhagens celulares de hibridoma 6H1A11C11 e 6H1G6E6, respectivamente.
[0270] A SEQ ID NO: 29 ilustra a sequência de aminoácidos da CDR1 da região variável de cadeia leve (VK) do anticorpo monoclonal ACI-33-
6C10-Ab2 e ACI-33-6C10-Ab1 produzidos pelas linhagens celulares de hibridoma 6C10E5E9C12 e 6C10F9C12A11, respectivamente.
[0271] A SEQ ID NO: 30 ilustra a sequência de aminoácidos da CDR2 da região variável de cadeia leve (VK) do anticorpo monoclonal ACI-33- 6C10-Ab2 e ACI-33-6C10-Ab1 produzidos pelas linhagens celulares de hibridoma 6C10E5E9C12 e 6C10F9C12A11, respectivamente.
[0272] A SEQ ID NO: 31 ilustra a sequência de aminoácidos da CDR3 da região variável de cadeia leve (VK) do anticorpo monoclonal ACI-33- 6C10-Ab2 e ACI-33-6C10-Ab1 produzidos pelas linhagens celulares de hibridoma 6C10E5E9C12 e 6C10F9C12A11, respectivamente.
[0273] A SEQ ID NO: 32 ilustra a sequência de aminoácidos da CDR1 da região variável de cadeia leve (VK) do anticorpo monoclonal ACI-41- 7C2-Ab1 e ACI-41-7C2-Ab2 produzidos pelas linhagens celulares de hibridoma 7C2(1)F10C10D3 e 7C2(2)B9F11D5, respectivamente.
[0274] A SEQ ID NO: 33 ilustra a sequência de aminoácidos da CDR2 da região variável de cadeia leve (VK) do anticorpo monoclonal ACI-41- 7C2-Ab1 e ACI-41-7C2-Ab2 produzidos pelas linhagens celulares de hibridoma 7C2(1)F10C10D3 e 7C2(2)B9F11D5, respectivamente.
[0275] A SEQ ID NO: 34 ilustra a sequência de aminoácidos da CDR3 da região variável de cadeia leve (VK) do anticorpo monoclonal ACI-41- 7C2-Ab1 e ACI-41-7C2-Ab2 produzidos pelas linhagens celulares de hibridoma 7C2(1)F10C10D3 e 7C2(2)B9F11D5, respectivamente.
[0276] A SEQ ID NO: 35 ilustra a sequência de nucleotídeos da região variável de cadeia pesada (VH) do anticorpo monoclonal ACI-36-3A8- Ab1 e ACI-36-3A8-Ab2 produzidos pelas linhagens celulares de hibridoma 3A8A12G7 e 3A8E12H8, respectivamente.
[0277] A SEQ ID NO: 36 ilustra a sequência de nucleotídeos da região variável de cadeia pesada (VH) do anticorpo monoclonal ACI-36-2B6-
Ab1 e ACI-36-2B6-Ab2 produzidos pelas linhagens celulares de hibridoma 2B6A10C11 e 2B6G7A12, respectivamente.
[0278] A SEQ ID NO: 37 ilustra a sequência de nucleotídeos da região variável de cadeia pesada (VH) do anticorpo monoclonal ACI-36-6H1- Ab1 e ACI-36-6H1-Ab2 produzidos pelas linhagens celulares de hibridoma 6H1A11C11 e 6H1G6E6, respectivamente.
[0279] A SEQ ID NO: 38 ilustra a sequência de nucleotídeos da região variável de cadeia pesada (VH) do anticorpo monoclonal ACI-33-6C10- Ab2 e ACI-33-6C10-Ab1 produzidos pelas linhagens celulares de hibridoma 6C10E5E9C12 e 6C10F9C12A11, respectivamente.
[0280] A SEQ ID NO: 39 ilustra a sequência de nucleotídeos da região variável de cadeia pesada (VH) do anticorpo monoclonal ACI-41-7C2- Ab1 e ACI-41-7C2-Ab2 produzidos pelas linhagens celulares de hibridoma 7C2(1)F10C10D3 e 7C2(2)B9F11D5, respectivamente.
[0281] A SEQ ID NO: 40 ilustra a sequência de nucleotídeos da região variável de cadeia leve (VK) do anticorpo monoclonal ACI-36-3A8-Ab1 e ACI-36-3A8-Ab2 produzidos pelas linhagens celulares de hibridoma 3A8A12G7 e 3A8E12H8, respectivamente.
[0282] A SEQ ID NO: 41 ilustra a sequência de nucleotídeos da região variável de cadeia leve (VK) do anticorpo monoclonal ACI-36-3A8-Ab1 e ACI-36-3A8-Ab2 produzidos pelas linhagens celulares de hibridoma 3A8A12G7 e 3A8E12H8, respectivamente.
[0283] A SEQ ID NO: 42 ilustra a sequência de nucleotídeos da região variável de cadeia leve (VK) do anticorpo monoclonal ACI-36-2B6-Ab1 e ACI-36-2B6-Ab2 produzidos pelas linhagens celulares de hibridoma 2B6A10C11 e 2B6G7A12, respectivamente.
[0284] A SEQ ID NO: 43 ilustra a sequência de nucleotídeos da região variável de cadeia leve (VK) do anticorpo monoclonal ACI-36-6H1-Ab1 e
ACI-36-6H1-Ab2 produzidos pelas linhagens celulares de hibridoma 6H1A11C11 e 6H1G6E6, respectivamente.
[0285] A SEQ ID NO: 44 ilustra a sequência de nucleotídeos da região variável de cadeia leve (VK) do anticorpo monoclonal ACI-33-6C10-Ab2 e ACI-33-6C10-Ab1 produzidos pelas linhagens celulares de hibridoma 6C10E5E9C12 e 6C10F9C12A11, respectivamente.
[0286] A SEQ ID NO: 45 ilustra a sequência de nucleotídeos da região variável de cadeia leve (VK) do anticorpo monoclonal ACI-41-7C2-Ab1 e ACI-41-7C2-Ab2 produzidos pelas linhagens celulares de hibridoma 7C2(1)F10C10D3 e 7C2(2)B9F11D5, respectivamente.
[0287] A SEQ ID NO: 46 – 57 ilustra as sequências de nucleotídeos dos primers VH/VK diretos (forward) e reversos (reverse).
[0288] A SEQ ID NO: 58 ilustra a sequência de aminoácidos da Tau 379-408 [pS396, pS404]
[0289] A SEQ ID NO: 59 ilustra a sequência de aminoácidos da Tau 5-20 [pY18 ]
[0290] A SEQ ID NO: 60 ilustra a sequência de aminoácidos da Tau 206-221 [pT212, pS214]
[0291] A SEQ ID NO: 61 ilustra a sequência de aminoácidos da Tau 196-211 [pS202, pT205]
[0292] A SEQ ID NO: 62 ilustra a sequência de aminoácidos da Tau 393-408 [pS396, pS404]
[0293] A SEQ ID NO: 63 ilustra a sequência de aminoácidos da Tau 401-418 [pS404, pS409]
[0294] A SEQ ID NO: 64 ilustra a sequência de aminoácidos da Tau 200-216 [pS202+ pT205 & pT212+pS214]
[0295] A SEQ ID NO: 65 ilustra a sequência de aminoácidos da Tau 407-418 [pS409]
[0296] A SEQ ID NO: 66 ilustra a sequência de aminoácidos da Tau 399-408 [pS404]
[0297] A SEQ ID NO: 67 ilustra a sequência de aminoácidos da isoforma mais longa da Tau humana (441 aa), também denominada de Tau40
[0298] A SEQ ID NO: 68 ilustra a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada (VH) do anticorpo monoclonal ACI-35-4A6- Ab1 produzido pela linhagem celular de hibridoma A4-4A6-18.
[0299] A SEQ ID NO: 69 ilustra a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve (VK) do anticorpo monoclonal ACI-35-4A6-Ab1 produzido pela linhagem celular de hibridoma A4-4A6-18.
[0300] A SEQ ID NO: 70 ilustra a sequência de aminoácidos da CDR1 da região variável de cadeia pesada (VH) do anticorpo monoclonal ACI- 35-4A6-Ab1
[0301] A SEQ ID NO: 71 ilustra a sequência de aminoácidos da CDR2 da região variável de cadeia pesada (VH) do anticorpo monoclonal ACI- 35-4A6-Ab1
[0302] A SEQ ID NO: 72 ilustra a sequência de aminoácidos da CDR3 da região variável de cadeia pesada (VH) do anticorpo monoclonal ACI- 35-4A6-Ab1
[0303] A SEQ ID NO: 73 ilustra a sequência de aminoácidos da CDR1 da região variável de cadeia leve (VK) do anticorpo monoclonal ACI-35- 4A6-Ab1
[0304] A SEQ ID NO: 74 ilustra a sequência de aminoácidos da CDR2 da região variável de cadeia leve (VK) do anticorpo monoclonal ACI-35- 4A6-Ab1
[0305] A SEQ ID NO: 75 ilustra a sequência de aminoácidos da CDR3 da região variável de cadeia leve (VK) do anticorpo monoclonal ACI-35- 4A6-Ab1
[0306] A SEQ ID NO: 76 ilustra a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada (VH) do anticorpo monoclonal ACI-35-1D2- Ab1 produzido pela linhagem celular de hibridoma A6-1D2-12.
[0307] A SEQ ID NO: 77 ilustra a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve (VK) do anticorpo monoclonal ACI-35-1D2-Ab1 produzido pela linhagem celular de hibridoma A6-1D2-12.
[0308] A SEQ ID NO: 78 ilustra a sequência de aminoácidos da CDR1 da região variável de cadeia pesada (VH) do anticorpo monoclonal ACI- 35-1D2-Ab1.
[0309] A SEQ ID NO: 79 ilustra a sequência de aminoácidos da CDR2 da região variável de cadeia pesada (VH) do anticorpo monoclonal ACI- 35-1D2-Ab1.
[0310] A SEQ ID NO: 80 ilustra a sequência de aminoácidos da CDR3 da região variável de cadeia pesada (VH) do anticorpo monoclonal ACI- 35-1D2-Ab1
[0311] A SEQ ID NO: 81 ilustra a sequência de aminoácidos da CDR1 da região variável de cadeia leve (VK) do anticorpo monoclonal ACI-35- 1D2-Ab1
[0312] A SEQ ID NO: 82 ilustra a sequência de aminoácidos da CDR2 da região variável de cadeia leve (VK) do anticorpo monoclonal ACI-35- 1D2-Ab1
[0313] A SEQ ID NO: 83 ilustra a sequência de aminoácidos da CDR3 da região variável de cadeia leve (VK) do anticorpo monoclonal ACI-35- 1D2-Ab1
[0314] A SEQ ID NO: 84 ilustra a sequência de nucleotídeos da região variável de cadeia pesada (VH) do anticorpo monoclonal ACI-35-4A6- Ab1 produzido pela linhagem celular de hibridoma A4-4A6-18.
[0315] A SEQ ID NO: 85 ilustra a sequência de nucleotídeos da região variável de cadeia leve (VK) do anticorpo monoclonal ACI-35-4A6-Ab1 produzido pela linhagem celular de hibridoma A4-4A6-18.
[0316] A SEQ ID NO: 86 ilustra a sequência de nucleotídeos da região variável de cadeia pesada (VH) do anticorpo monoclonal ACI-35-1D2- Ab1 produzido pela linhagem celular de hibridoma A6-1D2-12.
[0317] A SEQ ID NO: 87 ilustra a sequência de nucleotídeos da região variável de cadeia leve (VK) do anticorpo monoclonal ACI-35-1D2-Ab1 produzido pela linhagem celular de hibridoma A6-1D2-12.
[0318] A SEQ ID NO: 88 ilustra a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada (VH) do anticorpo monoclonal ACI-35-2A1- Ab1, ACI-35-2A1-Ab2, e ACI-35-4A6-Ab2, respectivamente, produzidos pelas linhagens celulares de hibridoma A4-2A1-18, A4-2A1-40 e A4-4A6-48, respectivamente.
[0319] A SEQ ID NO: 89 ilustra a sequência de aminoácidos da CDR1 da região variável de cadeia pesada (VH) do anticorpo monoclonal ACI- 35-2A1-Ab1, ACI-35-2A1-Ab2, ACI-35-4A6-Ab2, ACI-35-2G5-Ab2 e ACI-35- 2G5-AB3, respectivamente.
[0320] A SEQ ID NO: 90 ilustra a sequência de aminoácidos da CDR2 da região variável de cadeia pesada (VH) do anticorpo monoclonal ACI- 35-2A1-Ab1, ACI-35-2A1-Ab2, e ACI-35-4A6-Ab2, respectivamente.
[0321] A SEQ ID NO: 91 ilustra a sequência de aminoácidos da CDR3 da região variável de cadeia pesada (VH) do anticorpo monoclonal ACI- 35-2A1-Ab1, ACI-35-2A1-Ab2, ACI-35-4A6-Ab2, ACI-35-2G5-Ab2 e ACI-35- 2G5-AB3, respectivamente.
[0322] A SEQ ID NO: 92 ilustra a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve (VK) do anticorpo monoclonal ACI-35-2A1-Ab2 produzido pela linhagem celular de hibridoma A4-2A1-40
[0323] A SEQ ID NO: 93 ilustra a sequência de aminoácidos da CDR1 da região variável de cadeia leve (VK) do anticorpo monoclonal ACI-35- 2A1-Ab2.
[0324] A SEQ ID NO: 94 ilustra a sequência de aminoácidos da CDR2 da região variável de cadeia leve (VK) do anticorpo monoclonal ACI-35- 2A1-Ab2.
[0325] A SEQ ID NO: 95 ilustra a sequência de aminoácidos da CDR3 da região variável de cadeia leve (VK) do anticorpo monoclonal ACI-35- 2A1-Ab2.
[0326] A SEQ ID NO: 96 ilustra a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada (VH) do anticorpo monoclonal ACI-35-2G5- Ab1 produzido pela linhagem celular de hibridoma A6-2G5-08.
[0327] A SEQ ID NO: 97 ilustra a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve (VK) do anticorpo monoclonal ACI-35-2G5-Ab1 produzido pela linhagem celular de hibridoma A6-2G5-08.
[0328] A SEQ ID NO: 98 ilustra a sequência de aminoácidos da CDR1 da região variável de cadeia pesada (VH) do anticorpo monoclonal ACI- 35-2G5-Ab1.
[0329] A SEQ ID NO: 99 ilustra a sequência de aminoácidos da CDR2 da região variável de cadeia pesada (VH) do anticorpo monoclonal ACI- 35-2G5-Ab1.
[0330] A SEQ ID NO: 100 ilustra a sequência de aminoácidos da CDR3 da região variável de cadeia pesada (VH) do anticorpo monoclonal ACI- 35-2G5-Ab1.
[0331] A SEQ ID NO: 101 ilustra a sequência de aminoácidos da CDR1 da região variável de cadeia leve (VK) do anticorpo monoclonal ACI-35- 2G5-Ab1.
[0332] A SEQ ID NO: 102 ilustra a sequência de aminoácidos da CDR2 da região variável de cadeia leve (VK) do anticorpo monoclonal ACI-35- 2G5-Ab1.
[0333] A SEQ ID NO: 103 ilustra a sequência de aminoácidos da CDR3 da região variável de cadeia leve (VK) do anticorpo monoclonal ACI-35- 2G5-Ab1.
[0334] A SEQ ID NO: 104 ilustra a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada (VH) do anticorpo monoclonal ACI-35-2G5- Ab2 e ACI-35-2G5-AB3, respectivamente, produzidos pelas linhagens celulares de hibridoma A6-2G5-30 e A6-2G5-41, respectivamente.
[0335] A SEQ ID NO: 105 ilustra a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve (VK) do anticorpo monoclonal ACI-35-2G5-Ab2 e ACI-35-2G5-AB3, respectivamente, produzidos pelas linhagens celulares de hibridoma A6-2G5-30 e A6-2G5-41, respectivamente.
[0336] A SEQ ID NO: 106 ilustra a sequência de aminoácidos da CDR1 da região variável de cadeia leve (VK) do anticorpo monoclonal ACI-35- 2G5-Ab2 e ACI-35-2G5-AB3, respectivamente.
[0337] A SEQ ID NO: 107 ilustra a sequência de aminoácidos da CDR2 da região variável de cadeia leve (VK) do anticorpo monoclonal ACI-35- 2G5-Ab2 e ACI-35-2G5-AB3, respectivamente.
[0338] A SEQ ID NO: 108 ilustra a sequência de aminoácidos da CDR3 da região variável de cadeia leve (VK) do anticorpo monoclonal ACI-35- 2G5-Ab2 e ACI-35-2G5-AB3, respectivamente.
[0339] A SEQ ID NO: 109 ilustra a sequência de nucleotídeos da região variável de cadeia pesada (VH) do anticorpo monoclonal ACI-35-2A1- Ab1, ACI-35-2A1-Ab2, e ACI-35-4A6-Ab2, respectivamente, produzidos pelas linhagens celulares de hibridoma A4-2A1-18, A4-2A1-40 e A4-4A6-48, respectivamente.
[0340] A SEQ ID NO: 110 ilustra a sequência de nucleotídeos da região variável de cadeia leve (VK) do anticorpo monoclonal ACI-35-2A1-Ab2 produzido pela linhagem celular de hibridoma A4-2A1-40.
[0341] A SEQ ID NO: 111 ilustra a sequência de nucleotídeos da região variável de cadeia pesada (VH) do anticorpo monoclonal ACI-35-2G5- Ab1 produzido pela linhagem celular de hibridoma A6-2G5-08.
[0342] A SEQ ID NO: 112 ilustra a sequência de nucleotídeos da região variável de cadeia leve (VK) do anticorpo monoclonal ACI-35-2G5-Ab1 produzido pela linhagem celular de hibridoma A6-2G5-08.
[0343] A SEQ ID NO: 113 ilustra a sequência de nucleotídeos da região variável de cadeia pesada (VH) do anticorpo monoclonal ACI-35-2G5- Ab2 e ACI-35-2G5-AB3, respectivamente, produzidos pelas linhagens celulares de hibridoma A6-2G5-30 e A6-2G5-41, respectivamente.
[0344] A SEQ ID NO: 114 ilustra a sequência de nucleotídeos da região variável de cadeia leve (VK) do anticorpo monoclonal ACI-35-2G5-Ab2 e ACI-35-2G5-AB3, respectivamente, produzidos pelas linhagens celulares de hibridoma A6-2G5-30 e A6-2G5-41, respectivamente.
[0345] A SEQ ID NO: 115 ilustra a sequência de aminoácidos da CDR2 da região variável de cadeia pesada (VH) do anticorpo monoclonal ACI- 35-2G5-Ab2 e ACI-35-2G5-AB3.
[0346] A SEQ ID NO: 116 ilustra a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve (VK) do anticorpo monoclonal ACI-35-2A1-Ab1 produzido pela linhagem celular de hibridoma A4-2A1-18.
[0347] A SEQ ID NO: 117 ilustra a sequência de nucleotídeos da região variável de cadeia leve (VK) do anticorpo monoclonal ACI-35-2A1-Ab1 produzido pela linhagem celular de hibridoma A4-2A1-18.
[0348] A SEQ ID NO: 118 ilustra a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve (VK) do anticorpo monoclonal ACI-35-4A6-Ab2 produzido pela linhagem celular de hibridoma A4-4A6-48.
[0349] A SEQ ID NO: 119 ilustra a sequência de nucleotídeos da região variável de cadeia leve (VK) do anticorpo monoclonal ACI-35-4A6-Ab2 produzido pela linhagem celular de hibridoma A4-4A6-48.
[0350] A SEQ ID NO: 120 – 221 ilustra as sequências de nucleotídeos dos primers VH/VK diretos (forward) e reversos (reverse)
DEFINIÇÔES DOS TERMOS
[0351] Os termos “polipeptídeo”, “peptídeo” e “proteína”, conforme utilizado no presente são usados de forma alternada e são definidos para significarem uma biomolécula composta de aminoácidos ligados por uma ligação peptídica.
[0352] O termo “peptídeos” ou “peptídeo de ligação” são aqui utilizados de forma indiferente e referem-se a cadeias de aminoácidos (tipicamente L-aminoácidos), cujos átomos de carbono alfa estão ligados por meio de ligações peptídicas formadas por uma reação de condensação entre o grupo carboxila do carbono alfa de um aminoácido e o grupo amino do carbono alfa de outro aminoácido. O aminoácido terminal em uma extremidade da cadeia (ou seja, o amino-terminal) tem um grupo amino livre, enquanto que o aminoácido do terminal na outra extremidade da cadeia (ou seja, carboxi- terminal) tem um grupo carboxila livre. Assim, o termo “amino–terminal” (abreviado como N-terminal) refere-se ao grupo alfa-amino livre no aminoácido na extremidade amino-terminal do peptídeo, ou ao grupo alfa-amino (grupo imino ao participar de uma ligação peptídica) de um aminoácido em qualquer outro local dentro do peptídeo. Da mesma forma, o termo “carbóxi terminal” (abreviado como C-terminal) refere-se ao grupo carboxila livre no aminoácido no carboxi–terminal de um peptídeo, ou a um grupo carboxila de um aminoácido em qualquer outro local dentro do peptídeo. Um peptídeo de ligação pode constituir anticorpos, tais como anticorpos policlonais ou monoclonais, anticorpos humanos ou humanizados, diacorpos, anticorpos de camelídeos, e etc, ou partes funcionais destes, conforme definido no presente.
[0353] Os termos “fragmento do mesmo”, “fragmento deste” ou “fragmento”, conforme utilizado no presente referem-se a um fragmento peptídico funcional, que tem essencialmente a mesma atividade (biológica) tal como os peptídeos definidos no presente, (por exemplo, conforme mostrado na SEQ ID NOs: 59-66 na Tabela 1, respectivamente), ou seja, os referidos fragmentos são ainda capazes de induzir uma resposta imune altamente específica, especialmente conformação-específica, em um organismo, mas especialmente dentro de um animal, particularmente um mamífero ou um humano, o qual é altamente eficaz e capaz de prevenir ou aliviar tauopatias, ou sintomas associados com as tauopatias. Em particular, os referidos fragmentos contêm ainda o fosfo-epítopo(s) patológico(s) específico(s) da tau, conforme definido e utilizado no presente.
[0354] Normalmente, os aminoácidos que constituem um peptídeo estão numerados em ordem, a partir da extremidade amino-terminal e aumentam na direção para a extremidade carbóxi-terminal do peptídeo. Assim, quando um aminoácido é dito que “segue” outro aminoácido, significa que ele está posicionado mais próximo da extremidade carboxi-terminal do peptídeo do que o aminoácido precedente.
[0355] O termo “resíduo” é utilizado no presente para se referir a um aminoácido que é incorporado em um peptídeo através de uma ligação amida. Como tal, o aminoácido pode ser um aminoácido que ocorre naturalmente ou, a menos que de outro modo limitado, pode incluir análogos conhecidos de aminoácidos naturais que funcionam de um modo semelhante aos aminoácidos de ocorrência natural (ou seja, aminoácidos miméticos). Além disso, uma ligação amida mimética inclui modificações na cadeia peptídica principal bem conhecida pelos técnicos hábeis no assunto.
[0356] A expressão “consistindo essencialmente em” é utilizada no presente para excluir quaisquer elementos que alterem substancialmente as propriedades essenciais dos peptídeos ao qual esta expressão se refere.
Assim, a descrição de um peptídeo “que consiste essencialmente em...” exclui quaisquer substituições de aminoácidos, adições ou deleções que alterem substancialmente a atividade biológica daquele peptídeo.
[0357] Além disso, um técnico hábil no assunto reconhecerá que, tal como mencionado acima, as substituições individuais, deleções ou adições que alteram, adicionam ou deletam um único aminoácido ou uma pequena percentagem de aminoácidos (tipicamente menos de 5%, mais tipicamente menos de 1%) em uma sequência codificada são variações modificadas de forma conservadora, onde a alteração resulta na substituição de um aminoácido por um aminoácido quimicamente semelhante. Tabelas de substituição conservadoras que fornecem aminoácidos funcionalmente semelhantes são bem conhecidas no estado da técnica. Cada um dos seis grupos seguintes contêm aminoácidos que são substituições conservadoras entre si:
[0358] 1) Alanina (A), Serina (S), Treonina (T);
[0359] 2) Ácido aspártico (D), ácido glutâmico (E);
[0360] 3) Asparagina (N), Glutamina (Q);
[0361] 4) Arginina (R), Lisina (K);
[0362] 5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V); e
[0363] 6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptofano (W).
[0364] As expressões “isolado” ou “biologicamente puro” referem- se ao material que é substancialmente ou essencialmente livre de componentes que normalmente o acompanham conforme encontrado no seu estado nativo. Desse modo, os peptídeos descritos na presente invenção não contêm materiais normalmente associados com eles em seus ambientes in situ.
Normalmente, os peptídeos isolados, imunogênicos descritos no presente são, no mínimo, cerca de 80% puros, geralmente pelo menos cerca de 90%, e preferencialmente pelo menos cerca de 95%, conforme mensurado pela intensidade de banda em um gel corado com prata.
[0365] A pureza da proteína ou homogeneidade pode ser indicada por diversos métodos bem conhecidos no estado da técnica, tais como, eletroforese em gel de poliacrilamida de uma amostra proteica, seguido pela visualização após a coloração. Para certos fins serão necessárias técnicas de alta resolução e HPLC ou um meio similar para a purificação utilizada.
[0366] Quando os peptídeos imunogênicos são relativamente curtos em comprimento (ou seja, menos do que cerca de 50 aminoácidos), eles são frequentemente sintetizados utilizando técnicas de síntese química de peptídeos convencionais.
[0367] A síntese em fase sólida na qual o aminoácido C-terminal da sequência está ligado a um suporte insolúvel, seguido pela adição sequencial dos aminoácidos restantes da sequência é um método preferido para a síntese química de peptídeos imunogênicos descritos no presente. As técnicas para a síntese em fase sólida são bem conhecidas pelos técnicos hábeis no assunto.
[0368] Alternativamente, os peptídeos imunogênicos descritos na presente invenção são sintetizados utilizando a metodologia recombinante de ácido nucleico. Geralmente, isso envolve a criação de uma sequência de ácido nucleico que codifica o peptídeo, a colocação do ácido nucleico em um cassete de expressão sob o controle de um promotor específico, a expressão do peptídeo em um hospedeiro, o isolamento do peptídeo ou polipeptídeo expresso e, se necessário, a renaturação do peptídeo. Técnicas suficientes para orientar um especialista através de tais processos encontram-se na literatura.
[0369] Uma vez expressos, os peptídeos recombinantes podem ser purificados de acordo com procedimentos convencionais, incluindo a precipitação com sulfato de amônio, colunas de afinidade, cromatografia de coluna, eletroforese em gel e técnicas similares. São preferidas composições substancialmente puras de cerca de 50% a 95% de homogeneidade, e é mais preferido de 80% a 95% ou mais de homogeneidade para a utilização como agentes terapêuticos.
[0370] Um técnico do assunto reconhecerá que após a síntese química, a expressão ou purificação biológica, os peptídeos imunogênicos podem ter uma conformação substancialmente diferente da conformação nativa dos peptídeos constituintes. Neste caso, muitas vezes é necessário desnaturar e reduzir o peptídeo antiproliferativo e, em seguida, fazer com que o peptídeo faça o reenovelamento na conformação preferida. Métodos para reduzir e desnaturar as proteínas e induzindo o reenovelamento são bem conhecidos pelos técnicos hábeis no assunto.
[0371] A antigenicidade da proteína purificada pode ser confirmada, por exemplo, através da demonstração de reação com soro imunitário ou com anti-soros produzidos contra a própria proteína.
[0372] Os termos “um”, “uma” e “o/a”, conforme utilizado no presente são definidos para significar “um ou mais” e incluem o plural a menos que no contexto seja inadequado.
[0373] Os termos “detecção” ou “detectado” conforme utilizado no presente significa o uso de técnicas conhecidas para a detecção de moléculas biológicas, tais como métodos imunoquímicos ou histológicos e referem-se a determinação qualitativa ou quantitativa da presença ou concentração da biomolécula sob investigação.
[0374] Por “isolado” entende-se uma molécula biológica isenta de, pelo menos, alguns dos componentes com os quais ocorre naturalmente.
[0375] Os termos “anticorpo”, “anticorpos” ou “partes funcionais destes” conforme utilizado na presente invenção é um termo reconhecido na técnica e refere-se a moléculas ou fragmentos ativos de moléculas que se ligam a antígenos conhecidos, particularmente, moléculas de imunoglobulina e porções imunologicamente ativas de moléculas de imunoglobulina, ou seja, moléculas que contêm um sítio de ligação que se liga a um antígeno de maneira imunoespecífica. As moléculas de imunoglobulinas de acordo com a presente invenção podem ser de qualquer tipo (IgG, IgM, IgD, IgE, IgA e IgY) ou classe (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) ou subclasse de molécula de imunogobulina.
[0376] A expressão “anticorpos” visa também ser abrangida no escopo da presente invenção incluindo anticorpos monoclonais, policlonais, quiméricos, de cadeia única, anticorpos biespecíficos, simianizados, humanos e humanizados, anticorpos de camelídeos, diacorpos, bem como partes funcionais dos mesmos ou fragmentos ativos dos mesmos. Exemplos de fragmentos ativos de moléculas que se ligam a antígenos conhecidos incluem fragmentos Fab e fragmentos F(ab')2, incluindo os produtos de uma biblioteca de expressão de imunoglobulina Fab e fragmentos de ligação ao epítopo de qualquer um dos anticorpos e fragmentos mencionados acima.
[0377] Tais fragmentos ativos podem ser derivados de um anticorpo da presente invenção por diversas técnicas. Por exemplo, os anticorpos monoclonais purificados podem ser cortados com uma enzima, tal como a pepsina, e submetidos à filtração em gel por HPLC. A fração apropriada contendo fragmentos Fab pode então ser coletada e concentrada por filtração em membrana e técnicas similares. Para uma descrição mais detalhada das técnicas gerais para o isolamento de fragmentos ativos de anticorpos, vide, por exemplo, Khaw, B.A. et al. J. Nucl. Med. Chem. 23:1011- 1019 (1982); Rousseaux et al.Methods Enzymology, 121:663-69, Academic Press, (1986).
[0378] Um “anticorpo humanizado” refere-se a um tipo de anticorpo modificado possuindo as suas CDRs derivadas de uma imunoglobulina doadora não humana, e as partes remanescentes da imunoglobulina da molécula que é derivada de uma (ou mais) imunoglobulina(s) humana (s).
[0379] Um anticorpo humanizado pode referir-se ainda a um anticorpo possuindo uma região variável, onde uma ou mais de suas regiões de arcabouço (framework) têm aminoácidos humanos ou de primatas. Além disso, o arcabouço (framework) que suporta os resíduos pode ser alterado para conservar a afinidade de ligação. Métodos para a obtenção de “anticorpos humanizados” são bem conhecidos pelos técnicos hábeis no assunto. (vide, por exemplo, Queen et al., Proc. Natl Acad Sci USA, 86:10029-10032 (1989), Hodgson et al., Bio/Technoloy, 9:421 (1991)).
[0380] Um “anticorpo humanizado”, também pode ser obtido por uma nova abordagem de engenharia genética, que permite a produção de anticorpos policlonais semelhantes aos de humanos maturados por afinidade em grandes animais, como, por exemplo, coelhos (https://www.rctech.com/bioventures/therapeutic. php).
[0381] O termo “anticorpo totalmente humano” ou “anticorpo humano” refere-se a um anticorpo obtido a partir de camundongos transgênicos portadores de genes de anticorpos humanos, ou a partir de células humanas.
Para o sistema imunológico humano, no entanto, a diferença entre os anticorpos “completamente humanos”, “humanos”, e “humanizados” pode ser insignificante ou inexistente e desse modo todos os três podem ser de igual eficácia e segurança.
[0382] O termo “anticorpo monoclonal” também é bem reconhecido na técnica e refere-se a um anticorpo que é produzido em massa no laboratório a partir de um único clone, e que reconhece apenas um antígeno. Os anticorpos monoclonais são normalmente produzidos pela fusão de uma célula de curta duração, células B produtoras de anticorpos, a uma célula de rápido crescimento, tal como uma célula de câncer (por vezes referida como célula “imortal”). A célula híbrida resultante, ou hibridoma, multiplica-se rapidamente, criando um clone que produz grandes quantidades do anticorpo.
[0383] O termo “antígeno” refere-se a uma entidade ou um fragmento deste, que pode induzir uma resposta imunitária em um organismo, em particular um animal, mais particularmente, um mamífero, incluindo um humano. O termo inclui imunógenos e regiões responsáveis pela antigenicidade ou determinantes antigênicos.
[0384] Conforme utilizado no presente, o termo “solúvel” significa que é parcialmente ou completamente dissolvido em solução aquosa.
[0385] Também conforme utilizado no presente, o termo “imunogênico” refere-se a substâncias que estimulam ou aumentam a produção de anticorpos, células T e outras células imunorreativas direcionadas contra um agente imunogênico e contribui para uma resposta imune em seres humanos ou animais.
[0386] Uma resposta imune ocorre quando um indivíduo produz anticorpos suficientes, células T e outras células imuno-reativas contra composições imunogênicas administradas da presente invenção para moderar ou aliviar o distúrbio a ser tratado.
[0387] O termo “hibridoma” é reconhecido na técnica e é entendido pelos técnicos do assunto para se referir a uma célula produzida pela fusão de uma célula produtora de anticorpos e uma célula imortal, por exemplo, uma célula de mieloma múltiplo. Esta célula híbrida é capaz de produzir um fornecimento contínuo de anticorpo. Vide a definição de “anticorpo monoclonal”, acima e nos Exemplos a seguir para uma descrição mais detalhada do método de fusão.
[0388] O termo “veículo” conforme utilizado no presente, significa uma estrutura na qual um peptídeo ou construção supramolecular antigênica pode ser incorporado ou pode ser associado, apresentando ou expondo assim os peptídeos antigênicos ou parte do peptídeo para o sistema imune de um humano ou animal. Qualquer partícula que pode ser convenientemente utilizada na terapia humana ou animal, tal como, por exemplo, uma vesícula, uma partícula ou um corpo de partículas, pode ser utilizado como veículo dentro do contexto da presente invenção.
[0389] O termo “veículo” compreende ainda métodos de entrega, em que as composições da construção antigênica supramolecular compreendendo o peptídeo antigênico podem ser transportadas para locais desejados por mecanismos de entrega. Um exemplo de tal sistema de liberação utiliza metais coloidais como o ouro coloidal.
[0390] Proteínas de transporte que podem ser usadas nas composições da construção supramolecular antigênica da presente invenção incluem, mas não estão limitados a, peptídeo de ligação à maltose “MBP”, albumina de soro bovino “BSA”; conjugado de hemocianina (keyhole limpet hemocyanin)“KLH”; ovalbumina, flagelina, tireoglobulina , albumina do soro de qualquer espécie, gamaglobulina de qualquer espécie, células singeneicas; células singeneicas que ostentam antígenos Ia, polímeros de D- e/ou L- aminoácidos.
[0391] Além disso, o termo “quantidade terapeuticamente eficaz” ou “quantidade farmaceuticamente eficaz” refere-se à quantidade de peptídeo de ligação que, quando administrada a um humano ou animal, é suficiente para resultar em um efeito terapêutico no referido humano ou animal. A quantidade eficaz é prontamente determinada por um técnico do assunto seguindo os procedimentos de rotina.
[0392] “PHF pTau”, “PHF”, e “filamentos helicoidais pareados” são utilizados na presente invenção como sinônimos e referem-se a pares de filamentos enrolados em hélice de aproximadamente 10 nm, com uma periodicidade de 160 nm visíveis na microscopia eletrônica. A largura varia entre 10 e 22 nm. Os PHF são as estruturas predominantes nos emaranhados neurofibrilares da Doença de Alzheimer (DA) e nos Filamentos do Neurópilo.
Os PHF também podem ser vistos em algumas, mas não todas, neurites distróficas associadas com placas neuríticas. O componente principal do PHF é uma forma hiperfosforilada de proteína Tau associada aos microtúbulos. Os PHF são compostos por proteína Tau hiper-fosforiladas ligadas por pontes de dissulfeto de forma antiparalela. Os PHF Tau podem ser truncados nos 20 resíduos de aminoácidos C-terminais. Os mecanismos de formação dos PHF são incertos, mas a hiperfosforilação da Tau pode desacopla-los a partir dos microtúbulos, aumentando o pool solúvel de tau.
[0393] Dentro do escopo da presente invenção, foi demonstrado que a resposta de indução de anticorpos à composição antigênica de acordo com a invenção é em grande parte independente de células. Um modelo em camundongo nude foi utilizado a este respeito e os camundongo nude foram vacinados e as respostas de anticorpos mensuradas para avaliar a resposta do anticorpo A -específica induzida pela composição antigênica de acordo com a invenção nos camundongos nude imunizados. Os camundongos nude portadores da mutação Foxn1nu, consequentemente, tiveram uma redução na função das células T devido à ausência de um timo adequado.
[0394] Uma “quantidade farmaceuticamente eficaz”, conforme utilizado no presente refere-se a uma dose de ingrediente ativa em uma composição farmacêutica adequada para curar, ou pelo menos bloquear parcialmente os sintomas da doença, distúrbio ou condição a ser tratada ou quaisquer complicações associadas com estes.
[0395] A presente invenção fornece peptídeos de ligação que reconhecem e se ligam aos principais fosfo-epítopos patológicos da proteína Tau. Em particular, a presente invenção fornece anticorpos específicos contra fosfo-epítopos lineares e conformacionais, simples e complexos da proteína Tau sobre a proteína Tau a qual se acredita ser a responsável pela sinapto- e neuro-toxicidade nas tauopatias, incluindo a DA.
[0396] Consequentemente, a presente invenção refere-se em um exemplo de realização a um peptídeo ou proteína de ligação ou uma parte funcional do mesmo, em particular um anticorpo, especialmente um anticorpo monoclonal ou uma parte funcional do mesmo, em que o peptídeo de ligação ou anticorpo reconhece e se liga especificamente a um fosfo-epítopo de uma proteína Tau de mamífero, particularmente de um humano ou fragmento desta, particularmente a um confôrmero patológico de proteína Tau, mas, em um exemplo de realização, não se liga ao epítopo não fosforilado correspondente e/ou a epítopos não relacionados, em que o referido peptídeo de ligação ou anticorpo tem uma alta afinidade de ligação com uma constante de dissociação de pelo menos 10 nM, especialmente de pelo menos 8 nM, especialmente de pelo menos 5 nM, especialmente de pelo menos 2 nM, especialmente de pelo menos 1 nM, em particular de pelo menos 500 pM , em particular de pelo menos 400 pM particularmente de pelo menos 300 pM, especialmente de pelo menos 200 pM, especialmente de pelo menos 100 pM, especialmente de pelo menos 50 pM.
[0397] Proteína “Tau solúvel”, conforme utilizada no presente refere-se a proteínas que consistem tanto em proteína/peptídeo monômeros completamente solubilizados como em peptídeos/proteínas tau-like, ou peptídeos/proteínas Tau modificados ou truncados ou outros peptídeos/proteínas Tau derivados de monômeros de peptídeos/proteínas Tau e oligômeros de peptídeos/proteínas tau. ”Tau solúvel” exclui especificamente emaranhados neurofibrilares (NFT).
[0398] “Tau insolúvel”, conforme utilizado no presente refere-se a diversos monômeros agregados de peptídeos ou proteínas tau, ou peptídeos/proteínas similares a Tau (tau-like), ou peptídeos/proteínas Tau modificados ou truncados ou outros derivados de peptídeos/proteínas Tau formando estruturas oligoméricas ou poliméricas que são insolúveis tanto in vitro em meio aquoso como in vivo no corpo de um mamífero ou humano, mais particularmente, no cérebro, mas especialmente múltiplos monômeros agregados de Tau ou de peptídeos/proteínas Tau truncados ou modificados ou seus derivados, que são insolúveis no corpo de um mamífero ou humano, mais particularmente, no cérebro, respectivamente. ”Tau insolúvel” inclui especificamente os emaranhados neurofibrilares (NFT).
[0399] “Tau monomérica” ou “monômero de tau” conforme utilizado no presente referem-se às proteínas Tau completamente dissolvidas, sem complexos agregados em meio aquoso.
[0400] “Tau agregada”, “Tau oligomérica” e “oligômero tau” refere- se a diversos monômeros agregados de peptídeos ou proteínas tau, ou peptídeos/proteínas similares a Tau (tau-like), ou peptídeos/proteínas Tau modificados ou truncados ou outros derivados de peptídeos/proteínas Tau formando estruturas oligoméricas ou poliméricas que são insolúveis tanto in vitro em meio aquoso como in vivo no corpo de um mamífero ou humano, mais particularmente, no cérebro, mas especialmente múltiplos monômeros agregados de Tau ou de peptídeos/proteínas Tau truncados ou modificados ou seus derivados, que são insolúveis no corpo de um mamífero ou humano, mais particularmente, no cérebro, respectivamente.
[0401] Em um exemplo de realização, a presente invenção fornece uma composição farmacêutica compreendendo um peptídeo de ligação ou uma parte funcional deste, especialmente um anticorpo, especialmente um anticorpo monoclonal ou uma parte funcional do mesmo, ou um polinucleotídeo compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica o dito peptídeo de ligação ou anticorpo, de acordo com qualquer exemplo de realização descritos e reivindicados na presente invenção, ou uma combinação destes, em uma quantidade terapeuticamente eficaz juntamente com um veículo farmaceuticamente aceitável.
[0402] Os veículos farmacêuticos, diluentes e/ou excipientes adequados são bem conhecidos no estado da técnica e incluem, por exemplo, soluções salinas tamponadas, água, emulsões, tais como óleo/água, vários tipos de emulsões de agentes umectantes, soluções estéreis, e etc.
[0403] Os peptídeos de ligação de acordo com a invenção, incluindo anticorpos, especialmente anticorpos monoclonais e os fragmentos ativos dos mesmos, podem ser preparados em uma formulação fisiologicamente aceitável e podem compreender um veículo, diluente e/ou excipiente farmaceuticamente aceitável, utilizando técnicas conhecidas. Por exemplo, os peptídeos de ligação de acordo com a invenção e conforme descrito no presente, incluindo quaisquer peptídeos de ligação funcionalmente equivalentes ou partes funcionais destes, em particular, os anticorpos monoclonais da invenção, incluindo quaisquer anticorpos funcionalmente equivalentes ou partes funcionais destes, são combinados com um veículo, diluente e/ou excipiente farmaceuticamente aceitável para formar uma composição terapêutica. Os veículos farmacêuticos, diluentes e/ou excipientes adequados são bem conhecidos no estado da técnica e incluem, por exemplo, soluções salinas tamponadas, água, emulsões, tais como óleo/água, vários tipos de emulsões de agentes umectantes, soluções estéreis, e etc.
[0404] As formulações da composição farmacêutica de acordo com a invenção podem ser realizadas de acordo com a metodologia-padrão conhecida pelos técnicos hábeis no assunto.
[0405] As composições da presente invenção podem ser administradas a um sujeito na forma de um sólido, líquido ou aerossol, em uma dose adequada, farmaceuticamente eficaz. Exemplos de composições sólidas incluem pílulas, cremes e unidades de dosagem implantáveis. As pílulas podem ser administradas por via oral. Os cremes terapêuticos podem ser administrados topicamente. As unidades de dosagem implantáveis podem ser administradas localmente, por exemplo, em um local do tumor ou podem ser implantadas para libertação sistemática da composição terapêutica, por exemplo, por via subcutânea. Como exemplos de composições líquidas incluem formulações adaptadas para injeção intramuscular, subcutânea, intravenosa, intra-arterial, e formulações para a administração tópica e intraocular. Exemplos de formulações em aerosol incluem formulações de inalação para a administração aos pulmões.
[0406] As composições podem ser administradas por vias normais de administração. Em geral, a composição pode ser administrada por via tópica, oral, retal, nasal, interdermal, intraperitoneal ou parenteral (por exemplo, intravenosa, subcutânea ou intramuscular).
[0407] Além disso, a composição pode ser incorporada em uma matriz de liberação controlada, tais como polímeros biodegradáveis, sendo os polímeros implantados na vizinhança do local desejado de entrega, por exemplo, no local de um tumor. O método inclui a administração de uma dose única, a administração de doses repetidas em intervalos de tempo predeterminados, e a administração contínua por um período de tempo predeterminado.
[0408] Uma matriz de libertação contínua, conforme utilizado na presente invenção, é uma matriz feita de materiais, normalmente polímeros, que são degradáveis por enzimas ou por hidrólise ácido/base ou por dissolução. Uma vez inserida no corpo, a matriz sofre ação de enzimas e fluidos corporais. A matriz de libertação contínua (controlada) é desejavelmente escolhida por materiais biocompatíveis como lipossomas, polilactídeos (ácido poliláctico), poliglicolídeos (polímero de ácido glicólico), polilactídeo co- glicolídeo (copolímeros de ácido láctico e ácido glicólico), polianidridos, poli (orto ésteres), polipeptídeos, ácido hialurônico, colágeno, sulfato de condroitina, ácidos carboxílicos, ácidos graxos, fosfolípidos, polissacarídeos, ácidos nucleicos, poliaminoácidos, aminoácidos como a fenilalanina, tirosina, isoleucina, polinucleotídeos, propileno polivinílico, polivinilpirrolidona e silicone.
Uma matriz biodegradável preferida é uma matriz selecionada entre qualquer um dentre polilactídeo, poliglicolído ou polilactídeo co-glicolídeo (co-polímeros de ácido láctico e ácido glicólico).
[0409] É bem conhecido dos técnicos do assunto na arte pertinente que a dosagem da composição irá depender de diversos fatores, tais como, por exemplo, a condição de ser tratada, a composição especifica utilizada, e outros fatores clínicos como o peso, tamanho, sexo e estado geral de saúde do paciente, a área de superfície corporal, o composto ou a composição específica que será administrada, outros medicamentos sendo administrados concomitantemente, e a via de administração.
[0410] A composição de acordo com a invenção pode ser administrada em combinação com outras composições que compreendem uma substância ou composto biologicamente ativo, tal como, por exemplo, um composto conhecido e utilizado na medicação de tauopatias e/ou de amiloidoses, um grupo de doenças e distúrbios associados com a proteína amiloide ou similar à amiloide, tal como a proteína amiloide envolvida na Doença de Alzheimer.
[0411] A outra substância ou composto biologicamente ativo pode exercer o seu efeito biológico por um mesmo mecanismo ou por um mecanismo semelhante ao da vacina terapêutica de acordo com a invenção; ou por um mecanismo de ação não relacionado ou por uma multiplicidade de mecanismos de ação relacionados e/ou não relacionados.
[0412] Geralmente, o outro composto biologicamente ativo pode incluir potenciadores de transmissão de nêutron, drogas psicoterapêuticas, inibidores da acetilcolinesterase, bloqueadores dos canais de cálcio, aminas biogênicas, tranquilizantes benzodiazepínicos, síntese de acetilcolina, intensificadores de armazenamento ou liberação de acetilcolina, agonistas dos receptores pós-sinápticos, monoamina oxidase-A ou -B, inibidores de antagonistas dos receptores de N-metil-D-aspartato glutamato, drogas anti- inflamatórias não esteroides, anti-oxidantes e antagonistas dos receptores serotoninérgicos.
[0413] Em particular, o agente biologicamente ativo ou composto pode compreender pelo menos um composto selecionado de entre o grupo consistindo em compostos contra o estresse oxidativo, compostos anti- apoptóticos, quelantes metálicos, inibidores de reparação do DNA como pirenzepina e metabolitos, ácido 3-amino-1-propanosulfônico (3APS), 1,3- propanedisulfonato (1,3 PDS), ativadores da secretase, inibidores -[beta] e da 7-secretase, proteínas tau, neurotransmissor, separadores de folha , moléculas anti-inflamatórias, “antipsicóticos atípicos”, por exemplo, clozapina, ziprasidona, inibidores da risperidona, olanzapina ou aripiprazol ou colinesterases (ChEIs), tais como tacrina, rivastigmina, donepezila, e/ou galantamina e outros medicamentos e suplementos nutritivos, tais como, por exemplo, a vitamina B 12, cisteína, precursor de acetilcolina, lecitina, colina,
Ginkgo biloba, acetil-L-carnitina, idebenona, propentofilina, ou um derivado da xantina, em conjunto com um peptídeo de ligação de acordo com a invenção, incluindo anticorpos, especialmente anticorpos monoclonais e fragmentos ativos dos mesmos, e, opcionalmente, um veículo e/ou um diluente e/ou um excipiente farmaceuticamente aceitável e instruções para o tratamento de doenças.
[0414] Em um exemplo de realização, a composição de acordo com a invenção pode compreender niacina ou memantina em conjunto com um peptídeo de ligação de acordo com a invenção, incluindo anticorpos, especialmente anticorpos monoclonais e fragmentos ativos dos mesmos, e, opcionalmente, um transportador e/ou diluente e/ou um excipiente farmaceuticamente aceitável.
[0415] Ainda em outro exemplo de realização são fornecidas composições que compreendem os “antipsicóticos atípicos”, tais como, por exemplo, a clozapina, ziprasidona, risperidona, olanzapina ou aripiprazol para o tratamento de sintomas psicóticos positivos e negativos, incluindo alucinações, delírios, distúrbios do pensamento (manifestado por notável incoerência, desestabilização, tangencialidade), e comportamento bizarro ou desorganizado, bem como anedonia, desânimo, apatia, reclusão social e, em conjunto com o peptídeo de ligação de acordo com a invenção, incluindo anticorpos, especialmente anticorpos monoclonais e fragmentos ativos dos mesmos, e, opcionalmente, um veículo e/ou um diluente e/ou um excipiente farmaceuticamente aceitável.
[0416] Outros compostos que podem ser adequadamente utilizados em composições além do peptídeo de ligação de acordo com a invenção, são aqueles descritos, por exemplo, no documento WO 2004/058258 (vide especialmente as páginas 16 e 17), incluindo os fármacos terapêuticos alvo (pág. 36-39), ácidos alcanossulfônicos e ácidos alcanolsulfúricos (páginas
39-51), inibidores de colinesterase (páginas 51-56), antagonistas do receptor de NMDA (páginas 56-58), estrogênios (páginas 58-59), fármacos anti- inflamatórios não esteroides (páginas 60 -61), antioxidantes (páginas 61-62), agonistas de receptores ativados por proliferadores de peroxissoma (PPAR) (páginas 63-67), agentes redutores do colesterol (páginas 68-75), inibidores de amiloide (páginas 75-77), inibidores da formação de amiloide (páginas 77-78), quelantes de metais (páginas 78-79), antipsicóticos e antidepressivos (páginas 80-82), suplementos nutricionais (páginas 83-89) e compostos para aumentar a disponibilidade de substâncias biologicamente ativas no cérebro (páginas 89- 93) e pró-drogas (páginas 93 e 94), cujo documento é incorporado ao presente pela referência, mas em especial os compostos mencionados nas páginas indicadas acima.
[0417] Os matérias farmaceuticamente ativas proteicas podem estar presentes em quantidades compreendidas entre 1 ng e 10 mg por dose.
Geralmente, o regime de administração deve estar na faixa entre 0,1 g e 10 mg do anticorpo de acordo com a invenção, especialmente em uma faixa de 1,0 g a 1,0 mg, e mais particularmente, no intervalo entre 1,0 mg e 100 mg, de modo que todos os números individuais que se encontram entre estes intervalos também fazem parte da invenção. Se a administração ocorre por meio de uma infusão contínua uma administração mais adequada pode estar no intervalo entre 0,01 mg e 10 mg de unidades por quilograma de peso corporal por hora, de modo que todos os números individuais que se encontram entre estes intervalos também fazem parte da invenção.
[0418] A administração será geralmente por via parenteral, por exemplo, por via intravenosa. As preparações para administração parenteral incluem solução aquosa estéril ou soluções não aquosas, suspensões e emulsões. Os solventes não aquosos incluem, mas não se limitam a, propilenoglicol, polietileno glicol, óleo vegetal tal como azeite, e ésteres orgânicos injetáveis como oleato de etila. Os solventes aquosos podem ser escolhidos entre o grupo que consiste em água, soluções álcool/aquosas, emulsões ou suspensões incluindo soluções salinas e meios tamponados. Os veículos parenterais incluem a solução de cloreto de sódio, dextrose de Ringer, dextrose e cloreto de sódio, sol. de Ringer com lactato, ou óleos fixos. Os veículos intravenosos incluem reabastecedores de fluidos e nutrientes, reabastecedores de eletrólitos (tais como aqueles baseados na dextrose de Ringer), dentre outros. Podem estar presentes conservantes, tais como, por exemplo, agentes antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes, e gases inertes e etc.
[0419] A composição farmacêutica pode compreender ainda veículos proteicos, como, por exemplo, albumina do soro ou imunoglobulina, em particular de origem humana. Além disso, os agentes biologicamente ativos podem estar presentes na composição farmacêutica da invenção depende do seu uso pretendido.
[0420] Quando o alvo de ligação está localizado no cérebro, certos exemplos de realização da invenção fornecem o peptídeo de ligação de acordo com a invenção, incluindo anticorpos, especialmente anticorpos monoclonais e fragmentos ativos dos mesmos, que atravessa a barreira hematoencefálica. Certas doenças neurodegenerativas estão associadas a um aumento da permeabilidade da barreira hematoencefálica, de tal modo que o peptídeo de ligação de acordo com a invenção, incluindo anticorpos, especialmente anticorpos monoclonais ou um fragmento ativo dos mesmos pode ser facilmente introduzido no cérebro. Quando a barreira hematoencefálica permanece intacta, existem diversas abordagens conhecidas no estado da técnica para o transporte de moléculas através dela, incluindo, mas não limitando a, métodos físicos, métodos baseados em lipídeos, e métodos baseados em receptores e canais.
[0421] Os métodos físicos de transporte do peptídeo de ligação de acordo com a invenção, incluindo os anticorpos, especialmente anticorpos monoclonais, ou um fragmento ativo dos mesmos através da barreira hematoencefálica incluem, mas não estão limitados, ao completo contorno da barreira hematoencefálica, ou pela criação de aberturas na barreira hematoencefálica. Métodos para contornar a barreira hematoencefálica incluem, mas não estão limitados a, injeção direta no cérebro (vide, por exemplo, Papanastassiou et al, Gene Therapy 9:398-406 (2002)) e implantação de um dispositivo de administração no cérebro (vide, por exemplo, Gill et al, Nature Med. 9:589-595 (2003), e Gliadel Wafers (TM), Guildford Pharmaceutical). Métodos para a criação de aberturas na barreira incluem, mas não estão limitados a, ultrassom (vide, por exemplo, a Publicação da Patente US 2002/0038086), pressão osmótica (por exemplo, através da administração de manitol hipertônico (Neuwelt, E.A., Implication of the Blood-Brain Barrier and its Manipulation, Vols 1 & 2, Plenum Press, Nova Iorque (1989)), permeabilização, por exemplo, por bradicinina ou permeabilizante A-7 (vide, por exemplo, Patentes US 5.112.596, US 5.268.164, US 5.506.206 e US
5.686.416), e transfecção de neurônios que atravessam a barreira hematoencefálica com vetores contendo genes que codificam o peptídeo de ligação, ou fragmento de ligação ao antígeno (vide, por exemplo, a Publicação de Patente US 2003/0083299).
[0422] Métodos de transporte baseados em lipídeos do peptídeo de ligação, incluindo os anticorpos, particularmente anticorpos monoclonais, ou fragmento ativo dos mesmos de acordo com a invenção através da barreira hematoencefálica incluem, mas não estão limitados ao, encapsulamento do peptídeo de ligação de acordo com a invenção, incluindo anticorpos, especialmente anticorpos monoclonais, ou fragmentos ativo dos mesmos em lipossomas, que são acoplados aos fragmentos ativos dos mesmos e que se ligam aos receptores no endotélio vascular da barreira hematoencefálica (vide, por exemplo, a Publicação do Pedido de Patente US 20020025313) e revestimento do peptídeo de ligação de acordo com a invenção, incluindo anticorpos, particularmente anticorpos monoclonais, ou um fragmento ativo dos mesmos em partículas de lipoproteína de baixa densidade (vide, por exemplo, a Publicação do Pedido de Patente US 20040204354) ou em apolipoproteína E (vide, por exemplo, a Publicação do Pedido de Patente US 20040131692) .
[0423] Os métodos de transporte baseados em receptor e canal do peptídeo de ligação de acordo com a invenção, incluindo anticorpos, particularmente anticorpos monoclonais, ou um fragmento ativo dos mesmos através da barreira hematoencefálica incluem, mas não estão limitados a, utilização bloqueadores de glucocorticóides para aumentar a permeabilidade da barreira hematoencefálica no cérebro (vide, por exemplo, as Publicações US 2002/0065259, US 2003/0162695 e US 2005/0124533); ativadores de canais de potássio (vide, por exemplo, a Publicação do Pedido de Patente dos US 2005/0089473), fármacos inibidores de transportadores ABC (vide, por exemplo, a Publicação do Pedido de Patente US 2003/0073713), anticorpos de revestimento com uma transferrina e atividade de modulação de um ou mais receptores da transferrina (vide, por exemplo, a Publicação do Pedido de Patente US 2003/0129186), e a cationização de anticorpos (vide, por exemplo, as Patente US 5.004.697).
[0424] As administrações únicas ou repetidas do peptídeo de ligação de acordo com a invenção, incluindo os anticorpos, particularmente anticorpos monoclonais, ou um fragmento ativo dos mesmos, ou uma composição farmacêutica de acordo com a invenção podem ser fornecidas a um paciente durante um período prolongado de tempo. A duração da administração pode estar entre 1 semana e até 12 meses ou mais. Durante este tempo, o peptídeo de ligação, anticorpo ou composição farmacêutica pode ser administrado uma vez por semana, uma vez a cada duas semanas, a cada três semanas, a cada quatro semanas, etc, ou com uma frequência maior ou menor, dependendo das necessidades do sujeito sendo tratado.
[0425] Em outro exemplo de realização a presente invenção fornece métodos e kits para a detecção e diagnóstico de doenças, condições ou distúrbios associados à proteína Tau, incluindo doenças neurodegenerativas ou distúrbios como as tauopatias compreendendo um grupo heterogêneo de doenças ou distúrbios neurodegenerativos, incluindo as doenças ou distúrbios que mostram coexistência de patologias Tau e amiloides, incluindo, mas não limitado a: Doença de Alzheimer, doença de Creutzfeldt-Jacob, Demência pugilística, Síndrome de Down, doença de Gerstmann-Sträussler-Scheinker, miosite de corpos de inclusão, e angiopatia amiloide cerebral de proteína do prião, lesão cerebral traumática e, adicionalmente, doenças ou distúrbios que não apresentam uma patologia amiloide distinta, incluindo, mas não limitado a, esclerose lateral amiotrófica/complexo parkinsonismo-demência de Guam, doença do neurônio motor não-Guam com emaranhados neurofibrilares, demência por grãos argirofílicos, degeneração córtico-basal, emaranhados neurofibrilares difusos com calcificação, demência frontotemporal com parkinsonismo ligado ao cromossomo 17, doença de Hallevorden-Spatz, atrofia de múltiplos sistemas, doença de Niemann-Pick, tipo C, degeneração Pallido- ponto-nigral, doença de Pick, gliose subcortical progressiva, paralisia supranuclear progressiva, panencefalite esclerosante subaguda, demência apenas por emaranhado, Parkinsonismo pós-encefalítico, distrofia miotônica.
As alterações patológicas podem ser causadas ou associadas com a formação de lesões neurofibrilares, a patologia cerebral predominante em tauopatia.
[0426] Além disso, a presente invenção fornece métodos e kits para o diagnóstico de uma predisposição para doenças, condições ou distúrbios associados à proteína Tau, incluindo doenças ou distúrbios neurodegenerativos, tais como tauopatias compreendendo um grupo heterogêneo de doenças ou distúrbios neurodegenerativos, incluindo as doenças ou distúrbios que mostram uma coexistência de patologias Tau e amiloides, ou para o monitoramento da doença residual em um doente ou para a predição da responsividade de um paciente a um tratamento com um peptídeo de ligação de acordo com a invenção, incluindo anticorpos, especialmente anticorpos monoclonais e fragmentos ativos dos mesmos, ou uma composição de acordo com a invenção e conforme descrito no presente.
Estes métodos incluem métodos imunológicos vulgarmente conhecidos e utilizados para a detecção ou quantificação de substâncias em amostras biológicas ou em uma condição in situ.
[0427] O diagnóstico de uma doença ou condição associadas com a proteína Tau ou da predisposição para uma doença ou condição associadas com a proteína Tau em um sujeito com essa necessidade, particularmente em um mamífero, mais particularmente em um humano, incluindo as doenças ou distúrbios neurodegenerativos, tais como tauopatias compreendendo um grupo heterogêneo de doenças ou distúrbios neurodegenerativos, incluindo as doenças ou distúrbios que mostram a coexistência de patologias Tau e amiloides, pode ser conseguido pela detecção da ligação imunoespecífica de um peptídeo de ligação da invenção, em particular um anticorpo, especialmente um anticorpo monoclonal ou um fragmento ativo do mesmo, a um epítopo da proteína Tau em uma amostra ou in situ, o que inclui a colocação da amostra ou uma parte do corpo ou área do corpo específicas, suspeitas conter a proteína Tau, em contacto com um anticorpo que se liga a um epítopo da proteína Tau, permitindo que o anticorpo se ligue à proteína Tau e forme um complexo imunológico, e detectando a formação do complexo imunológico e correlacionando a presença ou ausência do complexo imunológico com a presença ou ausência da proteína Tau na amostra ou parte ou área do corpo específicas, e opcionalmente, comparando a quantidade do complexo imunológico a um valor de controle normal, em que um aumento na quantidade do complexo imunológico em comparação com um valor de controle normal indica que o sujeito sofre de tem risco de desenvolver uma doença ou condição associadas à proteína Tau.
[0428] O monitoramento da doença residual mínima em um sujeito, especialmente um mamífero, mais particularmente um humano, após o tratamento com o peptídeo de ligação de acordo com a presente invenção, ou parte funcional deste, especialmente um anticorpo, especialmente um anticorpo monoclonal ou fragmento ativo do mesmo, ou uma composição de acordo com a presente invenção, pode ser conseguido pela detecção da ligação imunoespecífica de um peptídeo de ligação de acordo com a presente invenção, especialmente um anticorpo, especialmente um anticorpo monoclonal ou fragmento ativo do mesmo a um epítopo da proteína Tau em uma amostra ou in situ, o que inclui a colocação da amostra ou uma parte do corpo ou área do corpo específicas, suspeitas de conter a proteína Tau, em contacto com um peptídeo de ligação de acordo com a invenção, incluindo anticorpos, especialmente anticorpos monoclonais e fragmentos ativos dos mesmos, que se liga a um epítopo da proteína Tau, permitindo que o peptídeo de ligação de acordo com a invenção, incluindo anticorpos, particularmente anticorpos monoclonais e fragmentos ativos dos mesmos, se liguem à proteína Tau, podendo formar um complexo imunológico, e detectando a formação do complexo imunológico e correlacionando a presença ou ausência do complexo imunológico com a presença ou ausência da proteína Tau na amostra ou parte ou área do corpo específicas, e opcionalmente, comparando a quantidade do referido complexo imunológico com um valor de controle normal, em que um aumento na quantidade do referido complexo imunológico em comparação com um valor de controle normal indica que o sujeito pode ainda sofrer de uma doença residual mínima.
[0429] A predição de responsividade de um sujeito, especialmente um mamífero, mais particularmente um humano, ao tratamento com o peptídeo de ligação de acordo com a presente invenção incluindo anticorpos, especialmente anticorpos monoclonais e fragmentos ativos dos mesmos, ou uma composição de acordo com a presente invenção, pode ser conseguida pela detecção da ligação imunoespecífica de um peptídeo de ligação, especialmente um anticorpo, especialmente um anticorpo monoclonal ou fragmento ativo do mesmo a um epítopo da proteína Tau em uma amostra ou in situ, o que inclui a colocação da amostra ou uma parte do corpo ou área do corpo específicas, suspeitas conter a proteína Tau, em contacto com um peptídeo de ligação de acordo com a invenção, incluindo anticorpos, especialmente anticorpos monoclonais e fragmentos ativos dos mesmos, que se liga a um epítopo da proteína Tau, permitindo que o peptídeo de ligação de acordo com a invenção, incluindo anticorpos, particularmente anticorpos monoclonais e fragmentos ativos dos mesmos, se liguem à proteína Tau, podendo formar um complexo imunológico, e detectando a formação do complexo imunológico e correlacionando a presença ou ausência do complexo imunológico com a presença ou ausência da proteína Tau na amostra ou parte ou área do corpo específicas, e opcionalmente, comparando a quantidade do referido complexo imunológico, antes e após o início do tratamento, em que uma diminuição na quantidade do referido complexo imunológico indica o referido paciente tem um elevado potencial de ser responsivo ao tratamento.
[0430] As amostras biológicas que podem ser utilizadas no diagnóstico de uma doença ou condição associadas à proteína Tau, no diagnóstico de uma predisposição para uma doença ou condição associadas à proteína Tau, incluindo doenças ou distúrbios neurodegenerativos como as tauopatias que compreendem um grupo heterogêneo de doenças ou distúrbios neurodegenerativos incluindo doenças ou distúrbios que exibem a coexsistência de patologias Tau e amiloides, no monitoramento da doença residual mínima em um paciente ou na predição da responsividade de um paciente a um tratamento com um peptídeo de ligação de acordo com a invenção, incluindo anticorpos, particularmente anticorpos monoclonais e fragmentos ativos dos mesmos, ou uma composição de acordo com a invenção e conforme descrito no presente, são, por exemplo, fluidos como soro, plasma, saliva, secreções gástricas, muco, fluido cerebrospinal, fluido linfático e similares ou amostras de tecido ou células obtidas a partir de um organismo, tal como o tecido neural, cerebral, cardíaco ou vascular. Para determinar a presença ou ausência da proteína Tau em uma amostra, qualquer imunoensaio conhecido pelos técnicos hábeis no assunto pode ser utilizado, tal como, por exemplo, ensaios que utilizam métodos de detecção indireta utilizando reagentes secundários para a detecção, ELISA e imunoprecipitação e ensaios de aglutinação. Uma descrição detalhada destes ensaios é dada, por exemplo, em Harlow e Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Nova Iorque 1988 555-612, WO96/13590 a Maertens e Stuyver, Zrein et al (1998). e WO96/29605.
[0431] Para o diagnóstico in situ, os peptídeos de ligação de acordo com a invenção, incluindo anticorpos, especialmente anticorpos monoclonais e fragmentos ativos dos mesmos, da presente invenção ou qualquer parte ativa e funcional dos mesmos, podem ser administrados ao organismo a ser diagnosticado através de métodos conhecidos no estado da técnica como, por exemplo, injeção intranasal, intravenosa, intraperitoneal, intracerebral, intra-arterial de tal modo que uma ligação específica entre um anticorpo de acordo com a invenção e uma região epitópica na proteína amiloide pode ocorrer. O complexo de ligação peptídeo/antígeno pode ser convenientemente detectado por meio de um marcador acoplado ao peptídeo de ligação de acordo com a invenção, incluindo anticorpos, particularmente anticorpos monoclonais, ou um fragmento funcional dos mesmos ou qualquer outro método conhecido nas técnicas de detecção.
[0432] Os imunoensaios utilizados em aplicações diagnósticas ou aplicações para o diagnóstico de uma predisposição para uma doença ou condição associadas à proteína Tau, incluindo distúrbios ou doenças neurodegenerativos, tais como as tauopatias que compreendem um grupo heterogêneo de doenças ou distúrbios neurodegenerativos, incluindo as doenças ou distúrbios que apresentam co-existência de patologias Tau e amiloides, ou para o monitoramento da doença residual mínima em um paciente ou para predizer a responsividade de um paciente a um tratamento com um peptídeo de ligação de acordo com a invenção, incluindo anticorpos, especialmente anticorpos monoclonais e fragmentos ativos dos mesmos, ou uma composição de acordo com a invenção e conforme descrito no presente eles baseiam-se tipicamente em antígenos marcados, peptídeos de ligação, ou reagentes secundários para a detecção. Estas proteínas ou reagentes podem ser marcados com os compostos geralmente conhecidos pelos técnicos do assunto, incluindo enzimas, radioisótopos, substâncias fluorescentes, luminescentes e cromogênicas, incluindo, mas não se limitando a partículas coloridas, como o ouro coloidal e esferas de látex. Dentre estes, a marcação radioativa pode ser utilizada para quase todos os tipos de ensaios e com a maioria das variações. Os marcadores enzimáticos conjugados são particularmente úteis quando a radioatividade deve ser evitada ou quando são necessários resultados rápidos. Os fluorocromos apesar de exigirem equipamentos caros para a sua utilização, proporcionam um método muito sensível de detecção. Os peptídeos de ligação úteis nestes ensaios são aqueles descritos e reivindicados na presente invenção, incluindo anticorpos,
especialmente anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais purificados por afinidade, e anticorpos policlonais.
[0433] Alternativamente, o peptídeo de ligação de acordo com a invenção, incluindo anticorpos, especialmente anticorpos monoclonais e fragmentos ativos dos mesmos, podem ser marcados indiretamente pela reação com substâncias marcadas que possuem uma afinidade para a imunoglobulina, tal como a proteína A ou G ou anticorpos secundários. O peptídeo de ligação de acordo com a invenção, incluindo anticorpos, especialmente anticorpos monoclonais e fragmentos ativos dos mesmos, pode ser conjugado com uma segunda substância e detectado com uma terceira substância marcada possuindo uma afinidade para a segunda substância conjugada ao anticorpo. Por exemplo, o peptídeo de ligação de acordo com a invenção, incluindo anticorpos, especialmente anticorpos monoclonais e fragmentos ativos dos mesmos, pode ser conjugado com a biotina e o conjugado peptídeo de ligação/biotina é detectado utilizando a avidina ou estreptoavidina marcada. Da mesma forma, o peptídeo de ligação pode ser conjugado com um hapteno e o conjugado peptídeo de ligação/hapteno é detectado utilizando um peptídeo de ligação anti-hapteno marcado.
[0434] Os técnicos no assunto conhecerão estes e outros marcadores adequados que podem ser empregados de acordo com a presente invenção. A ligação destes marcadores aos peptídeos ou fragmentos de ligação pode ser conseguida utilizando técnicas-padrão normalmente conhecidas pelos técnicos peritos no assunto. Técnicas típicas são descritas por Kennedy, J.H., et al., 1976 (Clin. Chim. Acta 70:1-31), e Schurs, A.H.W.M., et al. 1977 (Clin. Chim Acta 57:1-40). As técnicas de acoplamento mencionadas neste último são o método de glutaraldeído, o método de periodato, o método de dimaleimida, e outros, todos os quais são incorporados ao presente pela referência.
[0435] Os imunoensaios atuais utilizam um método de duplo anticorpo para a detecção da presença de um analito, em que o anticorpo é indiretamente marcado pela reatividade com um segundo anticorpo que foi marcado com um marcador detectável. O segundo anticorpo é preferencialmente um que se liga aos anticorpos do animal a partir do qual o anticorpo monoclonal é derivado. Em outras palavras, se o anticorpo monoclonal é um anticorpo de camundongo, então o segundo anticorpo marcado é um anticorpo anti-camundongo. Para o anticorpo a ser utilizado no ensaio descrito no presente, este marcador é, preferencialmente, uma esfera revestida com anticorpos, particularmente uma esfera magnética. Para o anticorpo a ser utilizado no imunoensaio descrito na presente invenção, a etiqueta é preferencialmente uma molécula detectável tal como uma substância radioativa, fluorescente ou eletroquimioluminescente.
[0436] Um sistema alternativo de duplo anticorpo, muitas vezes referidos como sistemas no formato rápido devido ao fato de serem adaptados para determinações rápidas da presença de um analito, também pode ser empregado dentro do escopo da presente invenção. O sistema exige uma alta afinidade entre o anticorpo e o analito. De acordo com um exemplo de realização da presente invenção, a presença da proteína amiloide é determinada utilizando um par de anticorpos, cada um específico para a proteína amiloide. Um dos referidos pares de anticorpos é referido no presente como um “anticorpo detector”, e o outro par de anticorpos é referido no presente como um “anticorpo de captura”. O anticorpo monoclonal da presente invenção pode ser utilizado como um anticorpo de captura, ou um anticorpo detector. O anticorpo monoclonal da presente invenção também pode ser usado tanto como anticorpo de captura como detector, em um único ensaio.
Em um exemplo de realização, a presente invenção utiliza o método de sanduíche de duplo anticorpo para a detecção da proteína amiloide em uma amostra de fluido biológico. Neste método, o analito (proteína amiloide), é colocado entre o anticorpo detector e o anticorpo de captura (sanduíche), sendo o anticorpo de captura irreversivelmente imobilizado sobre um suporte sólido. O anticorpo detector conteria um marcador detectável, a fim de identificar a presença do sanduíche ‘anticorpo-analito’ e, desse modo, a presença do analito.
[0437] Exemplos de substâncias de fase sólida incluem, mas não estão limitadas a, placas de microtitulação, tubos de ensaio de poliestireno, esferas magnéticas, de plástico ou de vidro e lâminas que são bem conhecidas no campo do radioimunoensaio e imunoensaios enzimáticos. Os métodos para o acoplamento de anticorpos sobre as fases sólidas também são bem conhecidos pelos técnicos hábeis no assunto. Mais recentemente, uma diversidade de materiais porosos, tais como o nylon, nitrocelulose, acetato de celulose, fibras de vidro e outros polímeros porosos têm sido utilizados como suportes sólidos.
[0438] A presente invenção também se refere a um kit diagnóstico para detectar a proteína Tau em uma amostra biológica compreendendo uma composição conforme definido acima. Além disso, a presente invenção relaciona-se com o kit diagnóstico segundo o qual, além de uma composição tal como definido acima, também compreende um reagente de detecção conforme definido anteriormente. O termo “kit diagnóstico” refere-se em geral a qualquer kit diagnóstico conhecido no estado da técnica. Mais especificamente, o último termo refere-se a um kit diagnóstico, tal como descrito em Zrein et al.
(1998).
[0439] É ainda outro objeto da presente invenção fornecer novas sondas imunológicas (imunosondas) e kits de ensaio para a detecção e diagnóstico de doenças e condições associadas às proteínas tau, compreendendo peptídeos de ligação de acordo com a presente invenção.
Para as imunosondas, os peptídeos de ligação são direta ou indiretamente acoplados a uma molécula repórter adequada, por exemplo, uma enzima ou radionuclídeo. O kit de ensaio inclui um recipiente que carrega um ou mais peptídeos de ligação de acordo com a presente invenção e instruções para o uso dos peptídeos de ligação com o propósito de se ligarem ao antígeno Tau para formar um complexo imunológico, e detectar a formação do complexo imunológico de modo que a presença ou ausência do complexo imunológico se correlacione com a presença ou ausência da proteína Tau.
EXEMPLOS EXEMPLO 1
GERAÇÃO E SELEÇÃO DE HIBRIDOMAS E ANTICORPOS
[0440] O objetivo deste estudo foi o de gerar e selecionar mAbs (anticorpos monoclonais) anti-Tau. Os hibridomas foram gerados pela fusão de células do baço de camundongos imunizado com a vacina Tau com uma linhagem de células de mieloma. Os hibridomas foram analisados quanto à reatividade contra a proteína Tau fosforilada e não fosforilada de comprimento total, bem como os peptídeos antigênicos fosforilados e não fosforilados da Tau utilizados na preparação da vacina. A triagem do hibridoma também foi realizada pela reatividade do sobrenadante dos hibridomas sobre os emaranhados da Tau usando a imunoquímica em cortes histológicos de cérebro de camundongo transgênicos para Tau.
[0441] 1.1Métodos
[0442] 1.1.1 Fusão
[0443] Um camundongo tipo selvagem (wt) C57BL/6 vacinado com ACI-33 (Tau5-20 [pY18]) foi utilizado para a produção do hibridoma. O camundongo foi submetido a imunizações intensificadoras com a vacina ACI- 33 no dia 0, em seguida, novamente no dia 4 e a fusão foi realizada no dia 7.
173x106 (ACI-33), esplenócitos a partir de camundongos imunizados foram fundidos com células de mieloma SP2-O-AG14, na proporção de 5 esplenócitos / 1 célula de mieloma.
[0444] Um camundongo tipo selvagem C57BL/6 vacinado com ACI-35 (Tau393-408 [pS396, pS404]) foi utilizado para a produção do hibridoma. O camundongo foi submetido a imunizações intensificadoras com a vacina ACI-35 no dia 0, em seguida, novamente no dia 4 e a fusão foi realizada no dia 6 (ACI-35), esplenócitos a partir de camundongos imunizados foram fundidos com 2 x 107 células de mieloma O-SP2 AG14 em uma proporção de 3 esplenócitos / 1 célula de mieloma.
[0445] Um camundongo tipo selvagem C57BL/6 vacinado com ACI-36 (Tau401-418 [pS404/S409]) foi utilizado para a produção do hibridoma.
O camundongo foi submetido a imunizações intensificadoras com a vacina ACI- 36 no dia 0, em seguida, novamente no dia 4 e a fusão foi realizada no dia 7.
84x106 esplenócitos a partir de camundongos imunizados foram fundidos com células de mieloma SP2-O-Ag14, na proporção de 5 esplenócitos / 1 célula de mieloma.
[0446] Um camundongo tipo selvagem C57BL/6 vacinado com ACI-41 (mistura de Tau206-221 [pT212/pS214] e Tau196-211 [pS202/pT205]) foi utilizado para a produção do hibridoma. O camundongo foi submetido a imunizações intensificadoras com a vacina ACI-41 no dia 0, em seguida, novamente no dia 4 e a fusão foi realizada no dia 8. 162x106 esplenócitos a partir de camundongos imunizados foram fundidos com células de mieloma SP2-O-Ag14, na proporção de 5 esplenócitos / 1 célula de mieloma.
[0447] As quatro fusões resultaram em de 8 placas de 96 poços e os clones foram denominados de acordo com a placa (1-8), a linha do poço (A- G) e, finalmente a coluna do poço (1-12).
[0448] 1.1.2 Método de triagem para selecionar clones
[0449] As 8 placas de 96 poços foram primeiro triadas por duas vezes para a expressão IgG. Os clones positivos que expressavam IgG foram então transferidos para placas de 24 poços e os sobrenadantes celulares (= clones) das células em crescimento foram testadas em um ensaio Tau ELISA e um ensaio de imunohistoquímica TAUPIR. Os sobrenadantes positivos no(s) ensaio(s) ELISA e/ou TAUPIR foram transferidos para frascos T25 e os clones foram novamente triados para a expressão IgG em um ensaio Tau ELISA e TAUPIR.
[0450] 1.1.3 Ensaio de IgGPlacas de ELISA foram revestidas com 50 l/poço de anticorpo anti-IgG de camundongo (CER Groupe Marloie, Bélgica), em tampão de revestimento durante 16 horas a 4 ° C. Após a lavagem das placas com PBS/Tween, 100 l/poço de uma solução de bloqueio foi aplicada durante 1 hora em temperatura ambiente. 50 L de sobrenadante de hibridoma não diluído foram incubados durante 1 hora em temperatura ambiente. Após uma etapa de lavagem, uma mistura de anti-IgG1, IgG2a, IgG2b e IgG3 de camundongo conjugado com peroxidase de rábano (HRP) (Ab Serotec, Raleigh, NC, EUA) foi aplicada sobre as placas durante 1 hora em temperatura ambiente. Após a lavagem final, a detecção foi realizada com TMB (3-3',5,5'-tetrametilbenzidina), e o substrato da fosfatase para a HRP, e a leitura das placas foi realisada 405 nm utilizando um leitor de placas de ELISA. Os resultados são expressos como OD (Densidade Óptica).
[0451] 1.1.4 Ensaio dos hibridomas por Tau ELISA
[0452] A análise dos Hibridomas por ELISA foi realizada sobre o peptídeo pTau (ACI-33, T1.5: Tau5-20 [pY18]; ACI-35, T3.5: Tau393- 408[pS396/pS404]; ACI-36, T4.5: Tau401-418 [pS404/S409]; ACI-41, T8.5: Tau206-221 [pT212/pS214] e T9.5: Tau196-211 [pS202/pT205] PolyPeptide Laboratories, Hillerød, Dinamarca), peptídeo Tau correspondente (ACI-33, T1.6: Tau5-20; ACI-36, T4.6: Tau401-4; ACI-41, T8.6: Tau206-221 e T9.6:
Tau196-211, PolyPeptide Laboratories, Hillerød, Dinamarca) proteína Tau fosforilada de comprimento total (441 aa) (proteína pTau, Vandebroek et al., 2005) e proteína Tau de comprimento total (441 aa) (proteína Tau, SignalChem, Richmond, Canadá). Finalmente a Albumina de Soro Bovino (BSA) foi utilizada como controle negativo.
[0453] As placas foram revestidas com 10 g/ml de peptídeo Tau correspondente e 1 g/ml de proteína Tau correspondente durante a noite a 4 ºC. Após a lavagem de cada poço com 0,05% de PBS-Tween 20 e bloqueio com BSA 1% em PBS-Tween 20 - 0,05%, o sobrenadante do hibridoma não diluído ou meio controle negativo foram adicionados às placas e incubados a 37 ºC durante 2 horas. Após lavagem as placas foram incubadas com um anticorpo anti-IgG total de camundongo conjugado com fosfatase alcalina (AP) (Jackson Laboratories, Baltimore, PA, EUA) durante 2 horas a 37 ºC. Após a lavagem as placas foram incubadas com pNPP (para-nitro-fenil-fosfato), o substrato fosfatase para a AP, e a leitura foi realisada a 405 nm utilizando um leitor de placas de ELISA. Os resultados são expressos como OD (Densidade Óptica).
[0454] 1.1.5 Ensaio dos hibridomas por IHQ: ligação de anticorpos anti-Tau para emaranhados em cortes cerebrais de camundongos transgênicos (TAUPIR)
[0455] Os experimentos TAUPIR foram realizados de acordo com o protocolo do Exemplo 3.1.2.
[0456] 1.1.6 Ensaio da IgG em frascos T25
[0457] As placas de ELISA foram revestidas com 5 g/ml de anticorpo específico anti-fragmento F(ab')2 de IgG de camundongo (Jackson Laboratories, Baltimore, PA, EUA) em tampão de revestimento carbonato- bicarbonato pH 9,6 (Sigma, Buchs, Suiça) durante a noite a 4 ºC. Após a lavagem das placas, o sobrenadante do hibridoma não diluído, o controle positivo anticorpo IgG1 (6E10 em 1 g/ml: Covance, Emeryville, CA, EUA) ou controle negativo (apenas meio de cultura) foram incubados durante 1 hora em temperatura ambiente. Após um etapa de lavagem, o anticorpo secundário de cabra específico anti-fragmento de anticorpo IgG (subclasses 1 +2 a +2 b 3) Fc conjugado com AP (Jackson Laboratories, Baltimore, PA, EUA), foi incubado nas placas durante 2 horas a 37 ºC. Após um etapa de lavagem final, as placas foram incubadas com pNPP (para-nitro-fenil-fosfato), o substrato fosfatase para a AP, e a leitura foi realisada a 405 nm utilizando um leitor de placas de ELISA. Os resultados são expressos como OD (Densidade Óptica).
[0458] 1.2Resultados
[0459] 1.2.1 Hibridomas ACI-33
[0460] Os sobrenadantes de células a partir das 8 placas de 96 poços resultantes da fusão foram selecionados para a produção de anticorpos IgG. Dos 768 poços (8x96 poços) testados 277 poços foram positivos quanto à expressão de IgG e foram transferidos para placas de 24 poços. Nas placas de 24 poços 79 clones foram cultivados a partir de sobrenadantes e as células foram analisadas. Os clones positivos foram então transferidos em frascos T25 e os sobrenadantes triados para a produção de IgG, por ELISA e TAUPIR (Tabela 2).
[0461] O clone 6C10 foi o único positivo nos três ensaios e foi selecionado para a subclonagem.
[0462] 1.2.2 Hibridomas ACI-36
[0463] Os sobrenadantes de células a partir das 8 placas de 96 poços resultantes da fusão foram selecionados para a produção de anticorpos IgG. Dos 768 poços (8x96 poços) testados 333 poços foram positivos quanto à expressão de IgG e foram transferidos para placas de 24 poços. Nas placas de 24 poços 75 clones foram cultivados a partir de sobrenadantes e as células foram analisadas. Os clones positivos foram então transferidos em frascos T25 e os sobrenadantes triados para a produção de IgG, por ELISA e TAUPIR (Tabela 3).
[0464] A fim de selecionar clones para as próximas etapas uma classificação de todos os sobrenadantes positivos para os ensaios IgG/ELISA/TAUPIR foi realizada com base nos resultados de ELISA e TAUPIR.
A classificação dos resultados dos ensaios ELISA e TAUPIR foi realizada como explicado na seção Métodos. A coloração TAUPIR foi quase idêntica para os cinco primeiros clones e isto correspondia aos resultados do ELISA. O 4C12 foi descartado, uma vez que foi encontrado na mesma placa como 4C1 o que aumentou a probabilidade de que os dois clones fossem o mesmo (que reconhecem o mesmo epítopo). Os 4 melhores clones selecionados foram 3A8, 2B6, 4C1 e 6H1. Os outros 6 clones (4C12, 2G1, 2F9, 7D6, 3B9, 4E12) foram mantidos como back-up.
[0465] Uma classificação dos 10 clones que apresentaram positividade nos ensaios ELISA e TAUPIR foi realizada para selecionar os melhores (Tabela 4). Os 5 melhores clones estão realçados em cinza.
[0466] 1.2.3 Hibridomas ACI-41
[0467] Os sobrenadantes de células a partir das 8 placas de 96 poços resultantes da fusão foram selecionados para a produção de anticorpos IgG. Dos 768 poços (8x96 poços) testados 215 poços foram positivos quanto à expressão de IgG e foram transferidos para placas de 24 poços. Nas placas de 24 poços 81 clones foram cultivados a partir de sobrenadantes e as células foram analisadas. Os clones positivos foram então transferidos em frascos T25 e os sobrenadantes triados para a produção de IgG, por ELISA e TAUPIR (Tabela 5).
[0468] Os clones 5D10 e 7C2 foram os únicos positivos nos três ensaios e foram selecionados para a subclonagem. O clone 5D10 liga-se apenas ao peptídeo T8.5, enquanto que o clone 7C2 liga-se a dois peptídeos da vacina ACI-41 (T8.5 e T9.5) (vide a Figura 10, no pedido PCT EP2010/054418).
[0469] O subclone 5D10A4 proveniente do 5D10 foi específico para o peptídeo pTau.
[0470] 1.3Conclusão
[0471] Os anticorpos gerados demonstraram elevada especificidade para peptídeos pTau com apenas ligação marginal para peptídeos não fosforilados.
[0472] A partir das quatro fusões (ACI-33, ICA-36, ICA-35 e ACI- 41), um total de 16 clones foram depositados na DSMZ (Tabela 1) e selecionados para posterior subclonagem.
[0473] Os clones matrizes positivos referidos acima foram adicionalmente cultivados em placas de 96 poços, em seguida, em placas de 24 poços e, finalmente, em frascos T25. Em cada etapa, os sobrenadantes dos clones de hibridoma foram triados por ELISA, Taupir e Western Blot.
EXEMPLO 2
CLONAGEM DE REGIÕES VARIÁVEIS DE CADEIA LEVE E CADEIA PESADA DE ANTICORPO
[0474] Os genes da região variável de cadeia leve e pesada de anticorpo a partir de células de hibridoma são clonados e as sequências de DNA e localização das regiões determinantes de complementaridade (CDRs) são determinadas, bem como as características de ligação dos anticorpos.
[0475] O RNA total foi preparado a partir de 3 x 106 células de hibridoma (1 frasco), utilizando o Kit Qiagen RNeasy mini kit (Cat No: 74104). O RNA foi eluído em 50 mL de água e verificado em gel de agarose 1,2%.
[0476] Os cDNAs da VH e VK foram preparados utilizando a transcriptase inversa com primers para IgG e região constante kappa. Os primeiros filamentos de cDNAs foram amplificados por PCR utilizando um grande conjunto de primers de sequências de sinal. Os DNAs amplificados foram purificados em gel e clonados no vector pGem® T-Easy (Promega). O clones VH e VK obtidos foram rastreados para inserções de tamanho esperado.
A sequência de DNA dos clones selecionados foi determinada em ambas as direções através do sequenciamento de DNA automatizado. As localizações das regiões determinantes de complementaridade (CDRs) das sequências foram determinadas com referência a outras sequências de anticorpos (Kabat EA et al., 1991).
EXEMPLO 3
ESTUDOS DE LIGAÇÃO I
[0477] O objetivo era mensurar a ligação à fosfo-Tau (pTau) dos anticorpos gerados a partir dos hibridomas subclonados derivados de camundongos imunizados com as vacinas de lipossomas tau. Para testar isto, um ensaio imunoadsorvente enzima-associado (ELISA) foi usado para mensurara a ligação dos anticorpos purificados à proteína Tau fosforilada e não fosforilada de comprimento total, bem como os peptídeos antigênicos da Tau fosforilados e não fosforilados utilizados para a preparação da vacina lipossomal.
[0478] A triagem foi completada por dois outros métodos. Foi realizada a imunohistoquímica (IHQ) em cortes de cérebro de um animal transgênico Tau (TAUPIR), utilizando um anticorpo anti-Tau como anticorpo primário. Adicionalmente, um Western blot (WB) nos homogeneizados de cérebro de camundongos transgênicos para proteína Tau foi executado, utilizando um anticorpo anti-Tau como anticorpo de blotting.
[0479] 3.1Métodos
[0480] 3.1.1 Ensaio de ligação fosfo-Tau
[0481] Os anticorpos anti-fosfo Tau (isotipo IgG3 de camundongo) foram gerados a partir de camundongos vacinados com lipossomas de tau. As vacinas lipossomais são preparações fosforilados de um peptídeo fosfo-Tau (pTau). Os subclones de hibridoma produzindo os anticorpos anti-Tau foram selecionados por diluição limitante a partir dos clones matrizes. A isotipagem foi realizada para indicar a presença de um único isotipo de clone. Os anticorpos foram produzidos em garrafas de cultivo rotatórias, purificados por cromatografia de afinidade, submetidos à filtração estéril de 0,22 m, e quantificados. Para testar a ligação do anticorpo a Tau e pTau, um ensaio de ELISA foi utilizado. Resumidamente, placas Nunc MaxiSorp de 96 poços (Nunc, Roskilde, Dinamarca) foram revestidas com 1 g/mL de proteína Tau de comprimento total (441 aa), (SignalChem, Richmond, Canadá) ou proteína Tau fosforilada de comprimento total (441 aa) (Vandebroek et al., 2005). Além disso, as placas foram revestidas com 10 g/mL do peptídeo derivado da tau.
Para testar a reatividade cruzada com sequências Tau e pTau que não foram utilizadas na preparação de vacina, as placas foram revestidas com 10 g/ml dos seguintes peptídeos: Tau5-20 (fosforilado ou não na Y18), Tau393-408 (fosforilado ou não na S396 e S404), Tau401-418 (fosforilada ou não na S404 e S409), Tau206-221 (fosforilada ou não na T212 e S214), e Tau196-211 (fosforilada ou não na S202 e T205). O revestimento foi feito durante a noite em solução salina tamponada com fosfato (PBS) a 4 ºC. As placas foram lavadas com 0,05% de Tween20/PBS e depois bloqueadas com 1% de albumina de soro bovino (BSA) a 0,05% em Tween20/PBS durante 1 hora a 37 ºC. O anticorpo a ser testado foi então adicionado através de uma diluição seriada em diluições de 8 ou 16 vezes entre 20 e 0 g/mL, e deixado incubar durante 2 horas a 37 ºC. As placas foram então lavadas conforme descrito anteriormente, e o anticorpo segundário anti-IgG de camundongo conjugado com AP (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Suffolk, Inglaterra) foi adicionada a um diluição de 1/6000 em Tween-20/PBS 0,05% durante 2 horas a 37 ºC. Após a lavagem, as placas foram incubadas com p-nitrofenil fosfato dissódico hexahidratado (pNPP, Sigma-Aldrich, Buchs, Suíça), solução de substrato da fosfatase, e a leitura foi realizada a 405 nm após 2 ou 16 horas de incubação utilizando um leitor de placas de ELISA. Os resultados são expressos como Densidade Óptica (OD).
[0482] 3.1.2 Ligação do anticorpo anti-Tau para emaranhados de Tau em cortes de cérebro de um animal transgênico Tau (TAUPIR)
[0483] Cortes do cérebro utilizados eram de camundongos (> 18 meses de idade) duplos transgênicos BigT (camundongos transgênicos GSK- 3 cruzados com camundongos transgênicos TPLH, contendo a isoforma mais longa (441aa) da Tau humana com a mutação P301L). Adicionalmente, cortes histológicos de camundongos nocautes para Tau (TKO; 6 meses de idade) também foram utilizados. Os cortes cerebrais foram lavados durante 5 min em PBS, em seguida, incubados durante 15 min em temperatura ambiente com 1,5% de H2O2 em PBS:MeOH (1:1), para bloquear a atividade da peroxidase endógena. Após lavagem dos cortes por 3 vezes em PBST (PBS/0,1% TritonX100) eles foram incubados durante 30 min em temperatura ambiente na solução de bloqueio PBST e 10% de SBF (soro bovino fetal). A incubação com o anticorpo anti-Tau testada foi feita durante a noite a 4 ºC nas diluições indicadas no PBST/10% de FCS. Os cortes foram lavados por três vezes em PBST antes da incubação com um anticorpo secundário de cabra anti- camundongo conjugado com HRP (adquirido da Dako, Glostrup, Dinamarca), em PBST/10% de FCS durante 1 hora em temperatura ambiente. Antes da detecção, os cortes foram lavados por três vezes com PBST e incubados em Tris/HCl pH 7,6 a 50 mM durante 5 min. A detecção foi feita pela incubação dos cortes histológicos por 3 min em diaminobenzidina (DAB: 1 comprimido em 10 ml de Tris.HCl 50 mM + 3 L de H2O2 a 30%; MP Biomedicals, Solon, OH, EUA). A reação foi bloqueada pela lavagem dos cortes por 3 vezes em PBST.
Os cortes foram então transferidos para placas de vidro silanizadas e secos ao ar sobre uma placa aquecida a 50 ºC durante 2 horas. A contracoloração foi realizada pela incubação com hematoxilina de Mayer (Fluka Chemie, Buchs, Suíça) durante 1 min, seguido por uma etapa de lavagem durante 4 minutos em água corrente da torneira. Os cortes foram desidratados pela passagem em banho de etanol a 50%, 70%, 90% e duas vezes em 100%, em seguida, em dois banhos de xilol durante 1 min. Finalmente, os cortes foram montados com DePeX (BDH Chemicals Ltd., Poole, Inglaterra), e cobertos com lamínulas de vidro.
[0484] Adicionalmente, os sobrenadantes de hibridoma na diluição 1/10 (todos os anticorpos derivados do ICA-35 mostrado na Tabela 1) foram usados para as membranas de blot contendo proteínas Tau de homogenatos de cérebro separadas por SDS-PAGE a partir de camundongos transgênicos, camundongos tipo selvagem, ou camundongo nocautes para tau.
[0485] 3.1.3 Ligação do anticorpo anti-Tau para emaranhados de Tau em cortes de cérebro de Pacientes com DA e Taupatias (TAUPIR)
[0486] O ensaio para a imunorreação do anticorpo anti-pTau ACI- 36-3A8-Ab1 para pTau no cérebro humano foi realizado por TAUPIR. Cortes histológicos de cérebro emblocado em parafina foram desparafinados fazendo duas passagens em xilol durante 5 minutos e duas vezes durante 1 min em EtOH 100%, seguido por 1 minuto de lavagem em EtOH 90%, 70%, e 50% e água destilada, seguido por duas lavagens de 5 min em PBS. Para a recuperação antigênica, os cortes foram tratados com aquecimento durante 10 minutos em solução de ácido cítrico 0,01 M em água (pH 6,0) e resfriados durante 20 min. Os cortes foram incubados durante 15 min em temperatura ambiente em 1,5% de H2O2 em PBS:MeOH (1:1), para bloquear a atividade da peroxidase endógena. Após lavagem dos cortes por 3 vezes em PBST (PBS/0,05% Tween-20) eles foram incubados durante 30 min em temperatura ambiente na solução de bloqueio PBST e 10% de soro bovino fetal (SBF). A incubação com o anticorpo primário anti-pTau ACI-36-3A8-Ab1 (410 ng/mL em tampão de bloqueio) foi feita durante a noite a 4 ºC. Os cortes foram então lavados por três vezes em PBST antes da incubação com um anticorpo secundário de cabra anti-camundongo conjugado com HRP (Dako, Glostrup, Dinamarca), diluído 1/500 em PBST/10% de FCS durante 1 hora em temperatura ambiente. Antes da detecção, os cortes foram lavados por três vezes com PBST e incubados em Tris/HCl 50 mM pH 7,6 durante 5 min. A detecção foi feita pela incubação dos cortes histológicos por 3 min em diaminobenzidina (DAB: 1 comprimido em 10 ml de Tris-HCl 50 mM + 3 L de H2O2 a 30%; MP Biomedicals, Solon, OH, EUA). A reação foi bloqueada pela lavagem dos cortes por 3 vezes em PBST. A contracoloração foi realizada pela incubação com hematoxilina de Mayer (Fluka Chemie, Buchs, Suíça) durante 1 min, seguido por uma etapa de lavagem durante 4 minutos em água corrente da torneira. Os cortes foram desidratados pela passagem em banho de etanol a 50%, 70%, 90% e duas vezes em 100%, em seguida, em 2 banhos de xilol durante 1 min.
[0487] Finalmente, os cortes foram montados com DePeX (BDH Chemicals Ltd., Poole, Inglaterra), e cobertos com lamínulas de vidro. Os cortes corados foram examinados por microscopia de luz branca e imagens digitais foram tiradas com uma câmera de 3CCDs (Leica, Wetzlar, Alemanha).
As imagens foram capturadas e analisadas utilizando o software dedicado (IM500, Leica). As imagens são mostradas em aumentos de 20x1.6.
[0488] 3.1.4 Western Blot (WB)
[0489] A ligação do anticorpo teste ao pTau no extrato de cérebro do animal transgênico foi realizada por WB. A homogeneização do cérebro a partir dos camundongos tipo selvagem FVB, TPLH, biGT e TKO foi realizada no seguinte tampão: Tris/HCl 25 mM pH 7,6, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, NaF 30 mM, Na3VO4 0,2 mM, ácido ocadaico 1 nM, fluoreto de fenilmetilsulfonila (PMSF) 1 mM, Na4P2O7 5 mM, 1 comprimido de coquetel inibidor de protease completo (CPIC) por 12 mL no total. Para obter o homogeneizado de cérebro total o cérebro foi homogeneizado em gelo em 1 vol/peso hemisfério (ml/g) com um pilão de teflon/tubo de vidro rotatório motorizado a 700 rpm. Os homogeneizados de cérebro total foram diluídos pela metade em tampão de amostra (Tris/HCl 125 mM a pH 6,8, 4% (p/v) em dodecil sulfato de sódio (SDS), 20% de glicerol, 0,01% de azul de bromofenol e 5% de beta-mercapto-etanol), em seguida, aquecidos rapidamente até 95 ºC.
As amostras foram mantidas 5 min, diluídos ¼ em tampão de amostra, aquecidas novamente a 95 ºC e depois arrefecidas e centrifugadas a 14.000 rpm durante 5 min para eliminar os restos que não foram solubilizados. Os sobrenadantes foram coletados e carregados em um gel de SDS-PAGE. A transferência para a membrana de nitrocelulose (Hybond-ECL) foi realizada em tampão de transferência (Tris 25 mM pH 8,6, glicina 190 mM, metanol a 20%).
As membranas foram transferidas para a solução de bloqueio (0,1% de Tween em TBS (Tris-HCl 50 mM, pH 7,6, NaCl 150 mM, e 5% de leite em pó) antes da incubação durante a noite a 4 ºC com o anticorpo teste diluído na solução de bloqueio. A incubação com o anticorpo secundário de cabra anti-camundongo conjugado com HRP (Dako, Glostrup, Dinamarca) diluído 1/10000 em solução de bloqueio foi realizada em temperatura ambiente durante 1 hora. A detecção foi feita utilizando os reagentes ECl Western Blotting Detection Reagents da GE Healthcare.
[0490] 3.2Resultados
[0491] 3.2.1 Ensaios ELISA e TAUPIR usando cortes cerebrais de camundongos transgênicos Tau positivos para emaranhados.
[0492] A ligação de anticorpos foi mensurada contra o peptídeo Tau fosforilado utilizado como imunógeno, e contra a proteína Tau humana fosforilada de comprimento total. Esta é a maior isoforma da proteína Tau humana e consiste em 441 aminoácidos. O peptídeo não fosforilado correspondente à proteína Tau humana de comprimento total também foi incluído. Conforme indicado na tabela 6 os anticorpos demonstraram elevada ligação ao peptídeo Tau fosforilado, apenas com pouca ou nenhuma ligação à proteína Tau humana fosforilada de comprimento total. Nenhuma ligação foi observada para o peptídeo Tau não fosforilado correspondente ou para a proteína Tau humana não fosforilada de comprimento total. Isto demonstra elevada ligação dos anticorpos anti-Tau para os peptídeos da Tau humana fosforilada.
[0493] Para testar a ligação não específica a outras sequências da Tau fosforilada e não fosforilada, o anticorpo foi testado para a ligação a cinco peptídeos Tau fosforilados e não fosforilados; e um destes foi usado como a sequência de peptídeo antígeno. Nenhuma reatividade cruzada com peptídeos Tau fosfo e não fosfo, com exceção do peptídeo utilizado na vacina, foi observada, mesmo em elevadas concentrações de peptídeo.
[0494] A ligação dos anticorpos anti-Tau para pTau nos cérebros de camundongos Tau transgênicos foi avaliada pela coloração TAUPIR (Figura 1) e Western Blot (Figura 1). Os anticorpos demonstraram ligação com emaranhados da Tau e filamentos do neurópilo presentes no córtex e no hipocampo no cérebro de camundongos Tau transgênicos (BigT). As diluições de anticorpos utilizadas para o TAUPIR variaram entre 0,05 a 0,0033 g/ml. Os anticorpos anti-Tau também foram utilizados como anticorpo primário, em um WB utilizando homogeneizados de cérebro total a partir de camundongos tipo selvagem FVB, TPLH, biGT, TKO e separados por SDS-PAGE. Dois anticorpos anti-pTau comerciais foram utilizados como controles, MC1 e Tau5. Todos os anticorpos anti-Tau se ligaram a pTau presente nos cérebros de camundongos Tau transgênicos.
[0495] Blotting
[0496] Sobre as membranas contendo homogeneizados de proteína Tau separadas por SDS-PAGE de camundongos transgênicos, camundongos tipo selvagem e camundongos nocautes para Tau, todos os 35 anticorpos ACI (divulgados na Tabela 1) se ligaram às bandas de proteínas possuindo padrão de migração de 46 kDa idêntico ao da Tau e pTau (dados não mostrados).
[0497] 3.2.2 Estudo TAUPIR nos cortes de cérebro de pacientes com DA e tauopatia
[0498] A capacidade do anticorpo ACI-36-3A8-Ab1 de se ligar a agregados-tau, apresentados nos cortes de cérebro humano de pacientes diagnosticados com tauopatias, incluindo DA, FAD, AGD, FTDP-17, CBD, e PSP, foi examinada por imunohistoquímica TAUPIR (Figura 2). O anticorpo anti-pTau ACI-36-3A8-Ab1 se ligou a pTau contendo emaranhados neurofibrilares (NFTs), e Filamentos do Neurópilo nos cortes histológicos de cérebro humano, e outras formas de acumulações de pTau presentes em neurônios e tipos de células da glia. Mais especificamente, o ACI-36-3A8-Ab1 corou de maneira proeminente os NFTs, Filamentos do Neurópilo e neurites distróficas em torno de placas amiloides em cérebros de pacientes com DA, que era facilmente perceptível nos indivíduos diagnosticados com DA e FAD.
Nos cortes de cérebro a partir de AGD, o ACI-36-3A8-Ab1 corou tanto NFTs como filamentos do neurópilo, com múltiplos grãos/grânulos argilofílicos claramente visíveis (Figura 2). A coloração dos cortes de cérebro a partir de PSP com o ACI-36-3A8-Ab1 mostrou NFTs, Filamentos do Neurópilo e neurites distróficas. Além disso, inclusões similares ao corpo de Pick, e tufos de astrócitos pTau positivos foram claramente observados, sendo um recurso abundante na PSP, onde a coloração pTau estende-se por toda a célula, inclusive nos processos distais. No FTDP-17, o padrão de coloração também ilustrada a heterogeneidade conhecida da doença, não apenas nos NFTs, mas também neurônios acromáticos “balonizados” foram detectados. O anticorpo ACI-36-3A8-Ab1 também corou neurônios acromáticos turgidos que estavam levemente positivos para Tau, a principal característica da CBD. Outra característica patológica proeminente da CBD, ou seja, inclusões oligodendrogliais, chamados de corpos enrolados, também foram bem detectadas pelo anticorpo ACI-36-3A8-Ab1. Não foi detectada coloração em um sujeito controle AT8 negativo enquanto que uma coloração fraca foi identificada em um sujeito controle AT8 positivo.
[0499] Usando TAUPIR nos cortes de cérebro humano a partir de indivíduos previamente diagnosticados com diferentes formas de tauopatias, o anticorpo anti-pTau ACI-36-3A8-Ab1 demonstrou boa ligação nas várias características patológicas ricas em pTau conhecidas presentes nos cérebros desses sujeitos.
EXEMPLO 4
ESTUDOS DE LIGAÇÃO II
[0500] O objetivo do estudo foi de determinar a afinidade de ligação entre os anticorpos anti-tau, e o peptídeo fosfo-Tau utilizando a ressonância plasmônica de superfície (SPR). O peptídeo fosfo-Tau corresponde à sequência peptídica utilizada na preparação da vacina para gerar o anticorpo anti-tau. Para estudar esta interação, os fosfopeptídeos foram imobilizados na superfície de um chip sensor e a ligação foi monitorada em tempo real usando a SPR na passagem do anticorpo sobre o chip.
[0501] 4.1Métodos
[0502] 4.1.1 Ensaio de ligação SPR
[0503] Todos os experimentos SPR foram efetuados em um instrumento Biacore X (GE Healthcare). Os reagentes para a imobilização (EDC, SNS e etanolamina), o chip sensor CM5 (carboximetil dextrano), assim como tampão de corrida HBS-EP foram adquiridos da GE Healthcare. Os peptídeos fosfo-Tau foram solubilizados em tampão PBS/acetato de sódio (10mM, pH 5,0) em uma proporção de 1:1 (v/v) para dar uma concentração de 250 g/ml de peptídeo final. Esta solução de peptídeo foi então acoplada através de célula de fluxo (fc) 2 de um chip sensor CM5, que foi pré-ativado com EDC/NHS. Após o acoplamento, a etanolamina foi passada sobre a superfície que forneceu um nível de imobilização final de 218 RUs. Cinco concentrações de anticorpos anti-Tau foram ensaiadas por diluições seriadas usando tampão de corrida. As injeções foram realizadas a partir da concentração mais baixa e foram passadas sobre ambos fc, 1 e 2, em uma velocidade de fluxo de 30 mL/min durante 180 segundos. Célula de fluxo 1 foi não derivatizada e as respostas foram subtraídas a partir da fc 2 para corrigir ruído do instrumento e as alterações de refração de volume. Após a injeção terminar, as superfícies foram imediatamente lavadas com tampão de corrida por 300 s. para remover o restante do anticorpo ligado a partir do chip, e a regeneração da superfície foi realizada pela injeção de um impulso (tipicamente de 3 l) de NaOH a 8 mM em água contendo NaCl 1M. A análise cinética foi realizada utilizando algoritmos para a integração numérica e análise global, usando o programa BIAevaluation 3.0. Os sensogramas obtidos para as injeções de anticorpos em diferentes concentrações foram sobrepostos e as bases de referência ajustadas em zero. Para o método de ajuste de curva, todos os dados foram ajustados simultaneamente para o modelo homogêneo 1:1 (Langmuir).
[0504] Alternativamente, o peptídeo T3 biotinilado imobilizado (T3.30) foi imobilizado au um chip BiacoreTM SA de estreptoavidina (GE Healthcare) utilizando um instrumento Biacore X. Os anticorpos foram diluídos em tampão de corrida HBS-EP (GE Healthcare) e injetados a 50 l/min por 120s, seguido por 100s de dissociação. A regeneração da superfície foi realizada com um pulso (1-3 l) de NaOH 16 mM. O ajuste foi realizado utilizando BIAevaluation e assumindo uma interação de ligação 1:1 de Langmuir.
[0505] Peptídeos utilizados H-K(Ac)K(Ac)-RQEFEVMEDHAGTY[PO3H2]GL- T1.5 lot AW11309D K(Ac)K(Ac)-NH2 H-K(Ac)K(Ac)- T4.5 GDTS[PO3H2]PRHLS[PO3H2]NVSSTGSID- lot CF09168 K(Ac)K(Ac)-NH2 T3.30 Biotin-LC linker- lot MI89P9- GVYKS[PO3H2]PVVSGDTS[PO3H2]PRHL-NH2 P12-2
[0506] 4.2Resultados
[0507] A ligação dos anticorpos anti-Tau ao peptídeo Tau fosforilado foi monitorado em tempo real usando a SPR. As análises das fases de associação e dissociação da ligação do anticorpo podem ser utilizadas para determinar a constante de velocidade de associação (ka), constante de velocidade de dissociação (Kd), bem como a constante de dissociação KD. O anticorpo ACI-33-6C10-Ab1 se liga especificamente ao peptídeo T1.5 sobre a superfície carboximetil dextrano não derivatizada na faixa de 3,7 367 nM de anticorpo. As análises cinéticas dos sensogramas revelou uma rápidas constante de velocidade de associação de 9,46 x 105 M-1 s-1 e uma constante de velocidade de dissociação de 3,27 x 10-3 s-1 (Tabela 7). Consequentemente a constante de dissociação KD foi determinada como sendo de 3,46 nM, mostrando que o anticorpo reconhece o fosfopeptídeo T1.5 com uma afinidade muito alta. Todos os anticorpos testados apresentaram uma afinidade alta para os seus respectivos fosfopeptídeos usados para a imunização e produção do hibridoma, mas demonstraram pouca afinidade para os não fosfopeptídeos.
EXEMPLO 5 MAPEAMENTO DE EPÍTOPOS DE ANTICORPOS ANTI-PTAU
[0508] 5.1Métodos
[0509] O mapeamento de epítopos de anticorpos monoclonais anti-fosfo Tau de camundongos foi realizado por ELISA, utilizando diferentes bibliotecas de peptídeos fosfo e não fosforilados. As sequências de aminoácidos das bibliotecas de peptídeos utilizadas são exibidas na Tabela 8.
Cada biblioteca consistia em peptídeos biotinilados curtos abrangendo sequências fosfo e não fosfo presentes na vacina de peptídeos. As bibliotecas de peptídeos foram adquiridos da ANAWA Trading SA. O mapeamento de epítopo foi realizado de acordo com as instruções do fabricante (Mimotopes).
Resumidamente, placas revestidas com estreptoavidina (NUNC) foram bloqueadas com BSA a 0,1% em tampão fosfato (PBS) durante a noite a 4 ºC.
Após a lavagem com PBS-0,05% de Tween 20, as placas foram revestidas durante 1 hora em temperatura ambiente com os diferentes peptídeos de cada biblioteca, diluídos em BSA 0,1%, azida sódica a 0,1% em PBS para uma concentração final de 10 M. Após a lavagem, as placas foram incubadas durante 1 hora em temperatura ambinente com o anticorpo a ser testado diluído para 40 ng/ml em BSA 2%, e azida sódica a 0,1% em PBS. As placas foram novamente lavadas e incubadas com anticorpo secundário anti-IgG de camundongo conjugado com AP (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Suffolk, Inglaterra) em uma diluição de 1/6000 durante 1 hora em temperatura ambiente. Após a lavagem final, as placas foram incubadas com p-nitrofenil fosfato dissódico hexahidratado (pNPP, Sigma-Aldrich, Buchs, Suíça), solução de substrato da fosfatase, e a leitura foi realizada a 405 nm após 2 horas de incubação utilizando um leitor de placas de ELISA. A ligação foi considerada positiva se a densidade óptica (OD) foi de pelo menos duas vezes a OD de fundo.
[0510] 5.2Resultados
[0511] Como resultado dos experimentos de mapeamento de epítopos, os epítopos podem ser identificados, incluindo o resíduo de aminoácido fosforilado necessário (vide a tabela 9) ao qual os anticorpos descritos na presente invenção se ligam especificamente.
[0512] -aa Tau 15-20, com a exigência para pY18 (6C10F9C12A11; 6C10E5E9C12)
[0513] -aa Tau 405-412, com a exigência para pS409 (6H1A11C11; 6H1G6E6)
[0514] -aa Tau 405-411, com a exigência para pS409 (2B6A10C11; 2B6G7A12; 3A8A12G7; 3A8E12H8)
[0515] -aa Tau 208-218, com a exigência para pT212 e pS214 (7C2(1)F10C10D3)
[0516] -aa Tau 393-401, com exigência para pS396 (A4-2A1-18, A4- 2A1-40)
[0517] -aa Tau 396-401, com a exigência para pS396 (A4-4A6-18)
[0518] -aa Tau 394-400, com a exigência para pS396 (A6-1D2-12)
[0519] -aa Tau 402-406, com a exigência para pS404 (A6-2G5-08)
[0520] -aa Tau 393-400, com exigência para p396 (A6-2G5-30; A6- 2G5-41) EXEMPLO 6 IMUNIZAÇÃO PASSIVA DE 1 SEMANA DE CAMUNDONGOS TAU TRANSGÊNICOS
[0521] 6.1Métodos
[0522] Para todos os estudos in vivo, os camundongos transgênicos Tau foram usados e os anticorpos de tratamento foram administrados conforme indicado na Tabela abaixo.
CAMUNDONGOS TRANSGÊNICOS E ANTICORPOS USADOS PARA ESTUDOS IN VIVO Idade dos Número Modelo camundongo Duração anticorpos de Estudo Dosagens transgênico s no início do estudo administrado administ Leitura nº (mg/kg) Tau do estudo semanas s rações (meses) (ip) ACI-36-2B6- 0*, 3 ou TMHT MSD, V337M/R Ab1 10 1 (hTau 6,3 1 2 IHQ, 406W ACI-36-3A8- ) 0 ou 3 WB Ab1 ACI-36-2B6- MSD, TMHT Ab1 V337M/R IHQ, 2 (hTau 4,2 4 ou 0, 1 ou 3 4 406W WB, ) ACI-36-3A8-
MWM Ab1 ACI-36-2B6- MSD, TMHT Ab1 V337M/R IHQ, 3 (hTau 3,0 12 ou 0, 1 ou 3 13 406W WB, ) ACI-36-3A8-
MWM Ab1 ACI-36-2B6- biGT Ab1 P301L 4 (hTau x 4,5 12 ou 0, 1 ou 3 13 WB hGSK3 ) ACI-36-3A8- Ab1 * Veículo controle para todos os estudos; intraperitoneal (ip)
[0523] 6.1.1 Camundongos e tratamentos
[0524] Camundongos Tg fêmeas e machos de 6,3 meses de idade (± 3 dias) superexpressando a isoforma Tau humana de comprimento total TAU4 41, carregando mutações missense V337M e R406W sob o controle do promotor murino Thy-1 (camundongos TMHT), foram usados para o Estudo nº 1 (vide a tabela acima). Os camundongos foram sacrificados 1 dia após a última administração para determinar a patologia TAU no cérebro.
[0525] 6.1.2 Identificação e Acomodação Animal
[0526] No decurso da coleta pela cauda para genotipagem, os animais foram numerados consecutivamente pela marcação auricular clássica.
Todos os animais foram regenotipados antes do início do estudo. Os camundongos foram mantidos de acordo com os Procedimentos Operacionais
Padrão JSW baseados em padrões internacionais. Os animais foram alojados em gaiolas individuais ventiladas em leitos para roedores padronizados fornecidos pela Rettenmaier®. A temperatura foi mantida a aproximadamente 24 ºC e a umidade relativa foi mantida entre 40 e 70%. Os animais foram alojados em um ciclo de luz constante (12 horas de luz/escuro). A ração seca, padrão, peletizada para roedores (Altromin®) e água de torneira normal estavam disponíveis aos animais ad libitum. Cada animal foi regularmente verificado para detectar quaisquer sinais clínicos que eram anotados na ficha individual de cada animal.
[0527] 6.1.3 Sangramento In Vivo
[0528] Sete dias antes da primeira imunização, foram realizados sangramentos in vivo por amostragem mandibular na veia/artéria facial inferior.
As amostras de sangue são uma mistura de sangue venoso e arterial. Para obter o plasma, o sangue foi coletado em tubos com heparina e centrifugado (1000 x g, 10 minutos, temperatura ambiente). O plasma foi congelado em duas alíquotas até ser usado.
[0529] 6.1.4 Quantificação da Imunohistoquímica (IHQ)
[0530] Todos os hemisférios cerebrais crio-congelados foram analisados. 15 crio-cortes por nível (total de 5 níveis), cada um com 10 m de espessura (Leica CM 3050S) foram cortados sagitalmente. Os níveis cerebrais foram escolhidos de acordo com o atlas morfológico “The Mouse Brain” de Paxinos e Franklin (2ª edição). O corte dos cinco níveis iniciados com uma fatia de amostragem aleatória, em seguida, continuou de maneira uniforme e sistemática, sempre mantendo 15 fatias por nível em série e descartando 150 m entre os níveis. Para a determinação da patologia TAU no hipocampo e as fatias da amígdala (1 a partir de cada nível) por região do cérebro e animal foram coradas usando os anticorpos AT180 (# MN1040, Thermo Scientific) e HT7 (# MN1000, Thermo Scientific). Os anticorpos primários foram visualizados pelo anticorpo secundário acoplado à Cy-3 (Jackson Laboratories) e, posteriormente, a área imunorreativa foi avaliada usando o software Image Pro plus (v6.2).
[0531] Os objetos imunorreativos foram medidos acima de uma restrição de tamanho (30 m2 na amígdala, 7 m² no hipocampo) e acima de um limiar de intensidade dinâmica. A área total e a intensidade de objetos e o limite individual foram automaticamente arquivados. Se utilizado, um limiar dinâmico foi definido como “intensidade média dentro AOI mais o fator de vezes do desvio padrão da intensidade dos pixels dentro da AOI”. Em qualquer caso, os valores tiveram de ultrapassar um limiar mínimo definido. Os níveis limiares exatos são fornecidos na tabela abaixo.
Limiares Mínimo Fator Dinâmico AT180 Amígdala 25 2 AT180 Hipocampo 28 - HT7 Amígdala 35 2 HT7 Hipocampo 25 0,5
[0532] O tamanho da região foi mensurado pela delineação manual do hipocampo e da amígdala. Os dados da área HT7 e AT180 IR foram normalizados para os tamanhos das regiões.
[0533] Todos os dados relacionados com a IHQ com n > 4 seguiram uma distribuição Gaussiana de acordo com teste de normalidade de Kolmogorov Smirnov e são representados como média ± EPM. Para o grupo veículo consistindo em apenas quatro animais, assim, muito poucos para o teste de normalidade, a distribuição de Gauss foi assumida. As diferenças entre os grupos foram calculadas utilizando o teste de ANOVA paramétrico seguido pelo teste post hoc de Newman Keuls, calculado com o software GraphPadPrism. O nível de erro alfa foi de 0,05.
[0534] A patologia TAU cerebral foi determinada no hipocampo e na amígdala pela quantificação imunohistoquímica (IHQ) utilizando os anticorpos AT180 (anti-pTAU) e HT7 (anti-TAU). Além disso, os efeitos do tratamento sobre a pTAU solúvel e TAU no córtex e hipocampo foi medido na fração solúvel do homogenato usando a tecnologia MesoScale Discovery (MSD) duplex, sondando para pTAU e TAU total.
[0535] Nenhum dos anticorpos usados, tanto para os ensaios de IHQ quanto para os ensaios MSD tinham um epítopo que se sobrepusesse com os dois anticorpos de tratamento utilizado no presente estudo.
[0536] 6.1.5 Geração da fração para a quantificação do nível de proteína Tau solúvel nas frações cerebrais solúveis de camundongos Tg
[0537] Os camundongos tratados de acordo com o método 6.1.1 foram sacrificados 1 dia após a segunda administração para determinar a patologia TAU no cérebro. Resumidamente, as amostras de córtex solúveis de um hemisfério do cérebro foram homogeneizadas em 100-200 mL de tampão de extração frio (Tris-HCl 25 mM, pH = 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, -glicerofosfato 10 mM, NaF 30 mM, Na3VO4 2 mM, coquetel de inibidores de protease e fosfatase). Os homogenatos foram centrifugados (74.200 x g durante 15 minutos a 4 ºC) e os sobrenadantes foram utilizados para a análise da Tau solúvel. A concentração de proteína total nas frações solúveis de amostras de córtex foi determinada através de um ensaio de quantificação de proteína BCA (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, EUA).
[0538] 6.1.6 Análise da presença de pTau por Western Blot
[0539] Para sondar a imunorreatividade nos cérebros de camundongos que receberam ACI-36-2B6-Ab2 e ACI-36-3A8-Ab2, dois anticorpos que se ligam aos epítopos PHF pTau (Greenberg et al, 1992,. Reig et al, 1995;. Hoffmann et al., 1997) foram usadas nos ensaios Western-Blot (WB). As frações solúveis do córtex foram diluídas pela adição de um volume igual de tampão de amostra A (125 mM de Tris-HCl, pH 6,8, 4% [p/v] de dodecilsulfato de sódio [SDS], 20% de glicerol, 0,01% de azul de bromofenol, 5% de -mercaptoetanol), e as amostras foram aquecidas a 95 ºC durante 10 min. 30 g de amostra foram carregados em um gel 4-12% de Bis-Tris (Invitrogen, Basel, Suíça) e executados em tampão MOPS SDS (Invitrogen). As proteínas foram transferidas para uma membrana de PVDF de 0,45 m em tampão de transferência (Tris 25 mM pH 8,6, glicina 190 mM, metanol 20%).
Para verificar a transferência de proteína, as membranas foram coradas com Ponceau S durante 5 min, lavadas e bloqueadas durante 1 hora com tampão de bloqueio (BSA 5% em TBS [Tris-HCl 50 mM, pH 7,6, NaCl 150 mM]). As membranas foram submetidas ao blotting durante a noite a 4 ºC com os anticorpos primários em tampão de bloqueio e 0,1% de Tween. Os dois anticorpos primários específicos para a PHF pTau utilizados para os WBs foram: anti-pS396 (epítopo PHF-13; Abcam, Cambridge, Reino Unido; usado a 3 ng/mL), específico para a Ser396 fosforilada (pS396) da pTau humana ou murina (Hoffmann et al, 1997), e AD2 (epítopo PHF-1,. BioRad, Reinach, Suíça; utilizado a 0,4 g/ml), específico para a pS396 humana e murina e Ser404 fosforilada (pS404; Reig et al, 1995). Para os WBs da Tau total, Tau5 (0,5 g/ml), foi utilizado um anticorpo que se liga tanto a Tau humana como murina (BD Biosciences, Allschwil, Suiça). Após a incubação com o anticorpo primário, as membranas foram lavadas com 0,1% de Tween em TBS, e incubadas com os anticorpos secundários: de cabra anti-camundongo- IRDye800 ou de cabra anti-coelho-IRDye680 (ambos a partir da LI-Cor Biosciences, NE, EUA); diluídos 1:15000 em BB e 0,1% Tween. As membranas foram então incubadas por 1 hora em temperatura ambiente protegidas da luz, lavadas durante 15 minutos por 3 vezes com 0,1% de Tween em TBS, e durante 5 min duas vezes com TBS, e as bandas quantificadas utilizando o sistema de imagem Li-Cor Odyssey near-infrared imaging system (Li-Cor). As bandas foram normalizadas para expressão da -actina (Abcam, utilizado a 0,4 g/ml). Para verificar a identificação do transgênico humano contra as bandas Tau endógenas de camundongo, os blots foram sondados com um anticorpo específico para Tau humana total (Tau13, Abcam, não mostrado).
Adicionalmente, as membranas foram sondadas com um anticorpo primário anti-camundongo, para verificar que os anticorpos de tratamento, ACI-36-2B6- Ab2 e ACI-36-3A8-Ab2, não estavam presentes nas amostras teste desnaturados em quantidade suficiente para interferir com a ligação do anti- pS396 ou AD2. Não foram detectados anticorpos de tratamento intactos ou desnaturados (resultados não apresentados) nas amostras utilizadas para este estudo.
[0540] 6.1.7 Análise Estatística
[0541] Os dados foram analisados usando o teste de soma de postos de Kruskal-Wallis não paramétrico, e se significativo a um p < 0,05, um teste post-hoc de Dunn foi utilizado comparando todos os grupos (GraphPad Prism, GraphPad Software, CA, EUA). Os resultados são apresentados como pontos de dados individuais que exibem a média ± EPM. Diferenças com P < 0,05 foram consideradas estatisticamente significantes.
[0542] 6.2Resultados
[0543] 6.2.1 Patologia TAU no cérebro por quantificação imunohistoquímica (IHQ)
[0544] Duas injeções i.p. do ACI-36-2B6-Ab2 e ACI-36-3A8-Ab2 não exibiram efeitos adversos graves durante o período de estudo. A coloração para pT231 e pS235 usando AT180 por IHQ, mostrou aumento da área imunorreativa (IR) na amígdala após o tratamento com ACI-36-3A8-Ab2(). Os camundongos tratados com 3 mg/kg de ACI-36-2B6-Ab2 tiveram significativamente menos área IR para AT180 no hipocampo (). O tratamento com ACI-36-3A8-Ab2 aumentou a IR AT180 pTAU em comparação com o grupo PBS na amígdala. No hipocampo o tratamento com ACI-36-2B6-Ab2 diminuiu a pTAU. O AT180 marca especificamente a pTAU. A frequência de células IR AT180 foi reduzida nos camundongos tratados com ACI-36-2B6- Ab2. Este efeito foi mais forte na dose baixa (3 mg/kg), grupo (ACI-36-2B6-Ab2 LD). O padrão de coloração autossômica não diferiu entre os grupos.
[0545] Na dose mais elevada de 10 mg/kg, uma tendência não significativa para a menos IR por AT180 foi observada no hipocampo para ACI- 36-2B6-Ab2 e ACI-36-3A8-Ab2, quando comparada com camundongos tratados com veículo controle. Qualitativamente, os animais tratados com 36- 2B6-Ab2 apresentaram um menor número de neurônios no hipocampo com marcação pelo AT180 muito intensa.
[0546] 6.2.2 Redução do nível de Tau total na fração do cérebro após a imunização passiva
[0547] O efeito dos tratamentos sobre a pTAU e TAU na fração cerebral contendo proteínas solúveis foi medida utilizando um ensaio MSD duplex. Os níveis de Tau solúvel total no córtex estavam significativamente reduzidos nos camundongos tratados com ACI-36-2B6-Ab2 e ACI-36-3A8-Ab2 (p < 0,01, Figura 3 painel superior). Os níveis de pTAU solúvel também estavam reduzidos de forma significativa (p <0,05, Figura 3 painel inferior), com a dose de 3 mg/kg de ACI-36-2B6-Ab2 demonstrando a maior diminuição (p <0,01). A relação de pTAU por TAU total permaneceu inalterada. Os níveis de Tau solúvel e pTAU não se alteraram nas amostras do hipocampo (dados não mostrados).
[0548] 6.2.3 Efeitos da administração de ACI-36-2B6-Ab2 e ACI- 36-3A8-Ab2 na presença de epítopos fosfo-Tau presentes em filamentos helicoidais pareados (PHFs)
[0549] Estruturalmente, os emaranhados neurofibrilares (NFTs) consistem em filamentos helicoidais pareados (PHF) compostos da proteína
Tau associada a microtúbulos, encontrada principalmente no estado hiperfosforilado (Alonso et al., 1997). O objetivo deste estudo foi utilizar anticorpos que reconhecem PHF pTau para investigar e quantificar esses epítopos PHF pTau nos cérebros de camundongos transgênicos para Tau, após a administração de ACI-36-2B6-Ab2 e ACI-36-3A8-Ab2.
[0550] Para medir os efeitos de duas administrações ACI-36-2B6- Ab2 ou ACI-36-3A8-Ab2 sobre a quantidade de fosfo-epítopos PHF Tau bem documentados, frações solúveis do córtex cerebral a partir de camundongos TAU Tg tratados foram sondadas com AD2 (epítopo PHF-1, pS396/pS404) e anticorpo anti-pS396 (epítopo PHF-13, pS396) utilizando WBs. A imunorreatividade foi quantificada utilizando um sistema de imagem em infravermelho. Os efeitos do tratamento com ACI-36-3A8-Ab2 e ACI-36-2B6- Ab2 sobre a imunorreatividade do AD2 PHF no córtex de camundongos Tau Tg foram determinados utilizando AD2 que sonda pS396 e pS404, dois fosfo resíduos PHF anteriormente documentados da Tau (Greenberg et al, 1992,.
Reig et al, 1995).
[0551] As bandas, indicando pTau fosforilada humana e de camundongo no S396 e S404 usando o anticorpo AD2 (PHF-1), foram quantificadas utilizando um sistema de imagem de infravermelhos Li-Cor. Os valores para camundongos individuais, bem como a média ± EPM são determinados.
[0552] Uma tendência não significativa foi observada pela redução na imunorreatividade pTau AD-2-positiva para a banda pTau humana transgênica. No entanto, uma redução significativa na quantidade pTau AD2- positiva em camundongo foi observada nos camundongos tratados com 3 mg/kg de ACI-36-2B6-Ab2, e uma tendência não significativa quando tratados com 10 mg/kg de ACI- 36-2B6-Ab2 ou ACI-36-3A8-Ab2.
[0553] Quando um anticorpo diferente que reconhece especificamente a pTau pS396 foi utilizado para a coloração (Hoffmann et al., 1997), observou-se um efeito ainda maior. Os camundongos tratados com 3 mg/kg de ACI-36-2B6-Ab2 tiveram significativamente menos pS396 positivo humano transgênico e pTau endógeno de camundongo, com uma tendência para a redução quando tratados com 10 mg/kg, ACI-36-2B6-Ab2 ou ACI- 36-3A8-Ab2.
Para avaliar os efeitos sobre a Tau total de humano e camundongo, que inclui a não fosforilada e todas pTau, blots foram sondados com o anticorpo Tau5. Comparado com o controle com veículo, a Tau total não foi modulada pelo ACI-36-2B6-Ab2 ou ACI-36-3A8-Ab2 administrado a 10 mg/kg, contudo, uma tendência para a redução da Tau total foi observada nos camundongos que receberam ACI-36-2B6-Ab2 a 3 mg/kg.
[0554] 6.2.4Resumo
[0555] Duas administrações periféricas em camundongos Tau Tg com com o anticorpo anti-pTAU ACI-36-3A8-Ab2 reduziu significativamente a TAU solúvel e pTAU solúvel no córtex cerebral. Duas administrações periféricas em camundongos Tau Tg com com o anticorpo anti-pTAU ACI-36-3B6-Ab2 reduziu significativamente a TAU solúvel e pTAU solúvel no córtex cerebral. Além disso, o ACI-36-2B6-Ab2 reduzida de maneira significante a imunorreatividade da pTAU no hipocampo. Estes resultados demonstram a capacidade de imunização anti-pTAU passiva, utilizando anticorpos ACI-36-2B6-Ab2 e ACI-36-3A8-Ab2 na redução tauopatia.
[0556] Duas administrações periféricas de ACI-36-2B6-Ab2 a 3 mg/kg aos camundongos Tau Tg reduziram a presença de epítopos PHF pTau no córtex conforme mensurado por Western-blot. A uma dose mais elevada de 10 mg/kg, tanto de ACI-36-2B6-Ab2 como de ACI-36-3A8-Ab2 mostrou uma tendência para a redução da imunorreatividade do epítopo PHF pTau. Estes resultados mostram que os anticorpos ICA-36-2B6-Ab2 e ACI-36-3A8-Ab2 podem ser adequadamente utilizados na imunoterapia passiva contra tauopatias, tal como a Doença de Alzheimer.
EXEMPLO 7 TRATAMENTO DE 1 MÊS EM CAMUNDONGOS SUPEREXPRESSANDO TAU HUMANA
[0557] 7.1Métodos
[0558] 7.1.1 Camundongos e tratamentos
[0559] Os camundongos Tau transgênicos foram usados e receberam aos anticorpos de tratamento conforme exibido na tabela do método
6.1. (Estudo nº 2.)
[0560] 7.1.2 Testes comportamentais – teste do labirinto aquático de Morris (Morris water-maze (MWM))
[0561] Após a última administração, um teste no labirinto de água (MWM) foi realizado para testar o desempenho de memória espacial nos camundongos tratados de acordo com 6.1.1. Os testes MWM foram realizados com todos os animais fechados 4 semanas após o início. O MWM consiste em uma piscina circular branca com um diâmetro de 100 cm, cheia com água a uma temperatura de 21 ± 2 ºC. A piscina é praticamente dividida em quatro setores. Uma plataforma transparente (8 cm de diâmetro) é colocado cerca de 0,5 cm abaixo da superfície da água. Durante todas as sessões de teste, a plataforma está localizada no quadrante sudoeste da piscina. Cada camundongo teve de realizar três ensaios em cada um dos quatro dias consecutivos. Uma tentativa única durou no máximo um minuto. Durante este tempo, o rato teve a chance de encontrar o alvo escondido, translúcido. Após cada ensaio os camundongos foram deixados descansar na plataforma por 10- seg para se orientarem. Pelo menos uma hora depois do último ensaio, no dia 4, os camundongos tinham que cumprir um ensaio chamado de ensaio de sonda (PT). Durante o PT, a plataforma foi removida da piscina e o número de cruzamentos sobre a antiga posição do alvo foi registrado pelo experimentador,
juntamente com a permanência neste quadrante. Para a quantificação da latência de escape (o tempo [segundos] que o camundongo necessita para encontrar a plataforma escondida e, portanto, para escapar a partir da água), de uma via (o comprimento da trajetória [metros] para atingir o alvo), dos cruzamentos na zona do alvo e da permanência no quadrante do alvo no PT, foi utilizado um sistema de monitoramento computadorizado (Biobserve Software). Todos os animais tiveram de realizar um teste visual após o PT no último dia para excluir a influência das capacidades insuficientes de visão nos resultados comportamentais.
[0562] 7.1.3 Determinação da Patologia TAU no cérebro por quantificação imunohistoquímica (IHQ)
[0563] Os camundongos foram sacrificados 1 dia após o MWM (1 semana após a última administração) para determinar a patologia TAU no cérebro. A patologia TAU cerebral foi determinada no hipocampo e na amígdala pela quantificação imunohistoquímica (IHQ) utilizando os anticorpos AT180 (anti-pTAU, pT231/pS235) e HT7 (anti-TAU especifico humano). Além disso, os efeitos do tratamento sobre a pTau e TAU solúvel no córtex e hipocampo foi medido na fração solúvel homogeneizada usando a tecnologia MesoScale Discovery (MSD) duplex , sondando pela pTau (pT231) e Tau total.
Nenhum dos anticorpos usados, tanto para os ensaios de IHQ quanto para os ensaios MSD tinham um epítopo que se sobrepusesse com o anticorpo de tratamento utilizado neste estudo.
[0564] 7.1.4 Preparação das amostras para a análise da Tau solúvel no córtex e hipocampo
[0565] Os camundongos foram sacrificados para coleta de tecido uma semana após a última administração de tratamento. O córtex e hipocampo foram homogeinizado em 100-200 mL de tampão de extração frio (Tris-HCl 25 mM, pH = 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, -glicerofosfato 10 mM, NaF 30 mM, Na3VO4 2 mM, coquetel de inibidores de protease e fosfatase). Os homogenatos foram centrifugados (74.200 x g durante 15 minutos a 4 ºC) e os sobrenadantes foram utilizados para a análise da Tau solúvel no córtex e hipocampo (Figura 4). Os sedimentos foram resuspensos em 100-200 mL de tampão de extração 2 (Tris-HCl 10 mM pH = 7,4, NaCl 800 mM, sacarose 300 mM, EGTA 1 mM, coquetel de inibidores da protease e fosfatase) e transferidos para um tubo de 1,5 mL. As soluções foram centrifugadas (4000 g durante 20 min a 4 ºC), e os sobrenadantes transferidos para tubos de ultracentrifugação. Sarkosyl (uma solução aquosa a 30%) foi então adicionada a uma concentração final de 1% e incubada durante 1,5 horas em temperatura ambiente. Após a centrifugação (74.200 g durante 30 min a 4 ºC), os sobrenadantes foram descartados e os sedimentos foram resuspensos em 100 L de tampão 3 (Tris-HCl 50 mM, pH = 7,4). Os sedimentos resuspensos foram usados como Tau insolúvel em sarcosil (SinT) no córtex e no hipocampo. A concentração de proteína total nas frações solúveis e SinT de amostras foi determinada através de um ensaio de quantificação de proteína BCA (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, EUA).
[0566] 7.1.5 Western Blot para PHF pTau e Tau
[0567] Para avaliar o efeito da administração de ACI-36-2B6-Ab1 na presença de PHF pTau no córtex cerebral e hipocampo, dois anticorpos relatados por se ligarem aos epítopos PHF pTau (Greenberg et al, 1992,. Reig et al, 1995;. Hoffmann et al., 1997) foram usados nos ensaios de Western-Blot (WB). As frações solúveis e SinT de córtex e hipocampo foram diluídas pela adição de um volume igual de tampão de amostra A (125 mM de Tris-HCl, pH 6,8, 4% [p/v] de dodecilsulfato de sódio [SDS], 20% de glicerol, 0,01% de azul de bromofenol, 5% de -mercaptoetanol), e as amostras foram aquecidas a 95 ºC durante 10 min. 30 g de amostra foram carregados em um gel 4-12% de Bis-Tris (Invitrogen, Basel, Suíça) e executados em tampão MOPS SDS
(Invitrogen). As proteínas foram transferidas para uma membrana de PVDF de 0,45 m em tampão de transferência (Tris 25 mM pH 8,6, glicina 190 mM, metanol 20%). Para verificar a transferência de proteína, as membranas foram coradas com Ponceau S durante 5 min. As membranas foram lavadas e bloqueadas durante 1 hora com tampão de bloqueio (BSA 5% em TBS [Tris- HCl 50 mM, pH 7,6, NaCl 150 mM]). As membranas foram submetidas ao blotting durante a noite a 4 ºC com os anticorpos primários em tampão de bloqueio e 0,1% de Tween.
[0568] Os dois anticorpos primários específicos para a PHF pTau utilizados para os WBs foram: anti-pS396 (epítopo PHF-13; Abcam, Cambridge, Reino Unido; usado a 3 ng/mL), específico para a Ser396 fosforilada (pS396) da pTau humana ou murina (Hoffmann et al, 1997), e AD2 (epítopo PHF-1,. BioRad, Reinach, Suíça; utilizado a 0,4 g/ml), específico para a pS396 humana e murina e Ser404 fosforilada (pS404; Reig et al, 1995). Para a detecção dos efeitos-alvo, o ACI-36-2B6-Ab1 foi usado no blotting a 1,6 g/mL. Para os WBs de Tau total, o Tau5 (0,5 g/ml) foi utilizado a 0,5 g/mL, um anticorpo que se liga tanto a Tau humana como murina (BD Biosciences, Allschwil, Suiça). Todas as membranas foram adicionalmente submetidas ao blotting para -actina (Abcam, utilizado a 0,4 g/mL) para normalizar para a carga de proteína.
[0569] Após a incubação com o anticorpo primário, as membranas foram lavadas com 0,1% de Tween em TBS, e incubadas com os anticorpos secundários: de cabra anti-camundongo-IRDye800 ou de cabra anti-coelho- IRDye680 (ambos a partir da LI-Cor Biosciences, NE, EUA); diluídos 1:15000 em BB e 0,1% Tween. As membranas foram então incubadas por 1 hora em temperatura ambiente protegidas da luz, lavadas durante 15 minutos por 3 vezes com 0,1% de Tween em TBS, e durante 5 min duas vezes com TBS, e as bandas quantificadas utilizando o sistema de imagem Li-Cor Odyssey near-
infrared imaging system (Li-Cor). As bandas de interesse foram normalizadas pela expressão de -actina. Para verificar a identificação do transgênico humano contra as bandas Tau endógenas de camundongo, os blots foram sondados com um anticorpo específico para Tau humana total e não reagiu cruzadamente com a Tau murina (Tau13, Abcam, não mostrado).
Adicionalmente, as membranas foram sondadas com um anticorpo primário anti-camundongo para verificar se os anticorpos de tratamento não estavam presentes nas amostras teste desnaturados em quantidade suficiente para interferir com a ligação dos anticorpos primários do blotting. Não foram detectados anticorpos de tratamento intactos ou desnaturados (resultados não apresentados) nas amostras utilizadas para este estudo. Os valores são expressos como imunorreatividade (IR) arbitrária corrigida pela -actina.
[0570] 7.1.6 Análise Estatística
[0571] Os dados foram analisados utilizando um teste de ANOVA one-way, seguido pelo teste post-hoc de Dunnett de múltipla comparação (GraphPad Prism, GraphPad Software, CA, EUA), comparando cada tratamento com os camundongos Tg tratados controle. Os resultados são apresentados como pontos de dados individuais que exibem a média ± EPM.
Diferenças com P < 0,05 foram consideradas estatisticamente significantes.
Valores únicos que foram identificados como significativamente discrepantes (p <0,05) pelo teste de desvio ‘studentizado’ extremo de Grubb, foram excluídos.
[0572] 7.2Resultados
[0573] 7.2.1 Testes comportamentais – teste do labirinto aquático de Morris (Morris water-maze (MWM)) após a imunização passiva
[0574] Quatro injeções ip de ACI-36-2B6-Ab1 administradas semanalmente a 3 mg/kg ou 1 mg/kg ao longo de um período de quatro semanas não apresentaram efeitos adversos graves.
[0575] Durante a última semana de tratamento, foram avaliadas a aprendizagem espacial e a memória de navegação dos animais. Os animais tiveram de cumprir quatro dias de treinamento com três ensaios por dia, seguido por um ensaio de sonda e teste visual. A latência de escape (o tempo [segundos] que o camundongo necessita para encontrar a plataforma escondida e, portanto, para escapar a partir da água), uma via (o comprimento da trajetória [metros] para atingir o alvo), a velocidade de natação (quociente calculado da via e latência de escape), o número de cruzamentos na zona alvo e a permanência no quadrante do alvo foram avaliados.
[0576] Os animais Tg (grupo A), bem como os animais controle nTg (F) tratados com veículo mostraram as curvas de aprendizagem esperadas quando se avalia a latência de escape e comprimento do percurso de natação para atingir a plataforma ao longo dos quatro dias de ensaio. Os animais Tg controle (A) tinham uma significativa deficiência de aprendizagem, conforme mostrado por uma curvas de aprendizagem plana nas latências de escape e comprimento do percurso de natação em comparação com os animais nTg do grupo controle (F). As latências de escape e o percurso de natação foram significativamente maiores (Two Way ANOVA) nos treinos dos dias 3 e 4 (p <0,001; pós-teste de Bonferroni). O tratamento com ACI-36-2B6-Ab1 e ACI-36- 3A8-Ab1, em doses baixa ou alta (grupos B e C e D e E, respectivamente) não conduziram a uma melhoria significativa da capacidade de aprendizagem espacial em comparação com animais Tg controle (grupo A) e exibiu curvas de aprendizagem semelhantes. Quando ajustado o dia 1 de desempenho de cada grupo para 100% todos os outros dias, como percentagem do dia 1, a melhora pode ser observada para os camundongos tratados com ACI-36-3A8-Ab1 (em ambas as doses). O efeito atingiu significância estatística para o comprimento do percurso nadado no dia 3 (p <0,01 grupo D e p <0,05 grupo E), e dia 4 (p <0,05 grupo D).
[0577] Para os camundongos tratados com ACI-36-2B6-Ab1 (ambas as doses) uma ligeira melhora pode ser observada no comprimento do percurso de natação, embora sem significância estatística.
[0578] Não houve diferenças entre os grupos de tratamento detectadas em termos de velocidade de natação em todos os quatro dias de treinamento.
[0579] Os resultados do teste MWM demonstraram tendências para a melhoria da aprendizagem espacial nos camundongos tratados com ACI-36-2B6-Ab1 e ACI-36-3A8-Ab1.
[0580] 7.2.2 Patologia TAU no cérebro por quantificação imunohistoquímica (IHQ)
[0581] As colorações usando anticorpo AT180 para pTAU endógena e humana (duplamente fosforilada na Tre231 e Ser235).
[0582] A IR pelo AT180 na amígdala e hipocampo após a imunização com ACI-36-2B6-Ab1 e ACI-36-3A8-Ab1 foi determinada. A percentagem de área IR do AT180 na amígdala e hipocampo foi mensurada.
[0583] A quantidade de intrasomal de pTAU nos controles nTg foi significativamente menor em comparação com os grupos Tg (p <0,001). Na amígdala, uma tendência para aumentar pTAU somal foi observada para o tratamento com 3 mg/kg de ACI-36-2B6-Ab1. Em contrapartida, ambas as doses de ACI-36-2B6-Ab1 tenderam a diminuir a pTAU em comparação com animais tratados com veículo no hipocampo. As médias das intensidades de coloração foram comparáveis em todos os grupos transgênicos.
[0584] O tratamento ACI-36-3A8-Ab1 não alterou a pTAU somal no hipocampo e amígdala e níveis pTAU neuronais no hipocampo e amígdala não diferiram significativamente entre os grupos transgênicos tratados. As médias e somas das intensidades de coloração foram comparáveis em todos os grupos transgênicos.
[0585] Uma vez que o anticorpo HT7 é específico para a TAU humana, apenas um pequeno sinal foi mensurado nos controles nTg, que deriva da autofluorescência de pontos de lipofuscina acima de sete pixels de tamanho. O tratamento com ACI-36-2B6-Ab1 não alterou a área IR positiva para HT7 somal no hipocampo () em comparação com o controle apenas com veículo (PBS). Na amidala, os camundongos que receberam a dose mais baixa de ACI-36-2B6-Ab1 tenderam a ter níveis mais altos de TAU total humana (teste T: p = 0,0954), em termos de área IR (). Este aumento também foi qualitativamente visível como aumento da área de coloração e intensidade de coloração em somas neuronais individuais. Não houve diferenças estatisticamente significativas induzidas pelo tratamento observadas nos neurônios do hipocampo.
[0586] O tratamento com ACI-36-3A8-Ab1 não alterou significantemente a área IR positiva para HT7 somal na amígdala () e hipocampo () em comparação com o controle apenas com veículo (PBS). As médias e somas das intensidades de coloração foram comparáveis em todos os grupos transgênicos (dados não mostrados).
[0587] A patologia Tau no cérebro não exibiu uma alteração nos níveis de Tau total ou pTau na fração solúvel cerebral, no entanto a imunocoloração de cortes de cérebro demonstraram uma redução da pTau no hipocampo de camundongos tratados com ACI-36-2B6-Ab1.
[0588] 7.2.3 Efeitos da administração de anticorpo anti-Tau em epítopos Fosfo-Tau presente nos filamentos helicoidais pareados (PHFs)
[0589] A Doença de Alzheimer (DA) é caracterizada neuropatologicamente por emaranhados neurofibrilares (NFTs; Braak, Braak, & Bohl, 1993). Estruturalmente, os NFTs consistem em filamentos helicoidais pareados (PHF) compostos da proteína Tau associada a microtúbulos, encontrada principalmente no estado hiperfosforilado (Alonso et al., 1997). O objetivo deste estudo foi o de reduzir estes epítopos PHF pTau nos cérebros de camundongos Tau transgênicos por quatro administrações dos anticorpos anti- pTau ACI-36-2B6-Ab1 e ACI-36-3A8-Ab1.
[0590] Para medir os efeitos de quatro administrações de ACI-36- 2B6-Ab1 sobre a quantidade de fosfo epítopos PHF Tau bem documentados, frações solúveis e SinT do córtex cerebral e hipocampo a partir de camundongos TAU Tg tratados foram sondadas com AD2 (epítopo PHF-1, pS396/pS404) e anticorpo anti-pS396 (epítopo PHF-13, pS396) utilizando WBs.
Como marcadores de PHFs tau, a presença de pS396/pS404 foi previamente documentada (Greenberg et al, 1992, Reig et al, 1995) e, mais especificamente, o sítio pS396 (Hoffmann et al, 1997). Nos camundongos Tau Tg, a Tau é expressa como Tau murina endógena e, como Tau humana transgênica, com uma diferença de peso molecular que pode ser claramente identificada em WBs, quando um anticorpo do blotting se liga na Tau de ambas as espécies e Tau de dois transcritos diferentes expressos em quantidades suficientes. Portanto, quando possível, as bandas da Tau de camundongo endógena e humana transgênica foram identificadas para cada anticorpo do blotting e quantificadas separadamente. Para verificar os padrões de migração dessas bandas Tau em nossos ensaios de WB, um anticorpo anti-Tau que se liga a total tau, mas é específico para a humana (Tau13), e, portanto, mostra apenas a Tau humana transgênica em cérebros de Tg foi usado para amostras controle da Tau Tg para verificar os padrões de migração da Tau humana e Tau de camundongo em camundongos transgênicos. Adicionalmente, todas as bandas quantificadas foram normalizadas pela -actina.
[0591] A presença de epítopos PHF, sondados quanto pela fração solúvel do córtex cerebral estava reduzida nos camundongos tratados com ACI-36-2B6-Ab1 e ACI-36-3A8-Ab1. Esta redução foi significativa para as bandas de camundongo e humana, usando o anticorpo pS396 (PHF-13) para os WBs (Figura 5A e B).
[0592] Quando o anticorpo AD2 (PHF-1, pS396/pS404) foi utilizado para os WBs de extratos de camundongos tratados com ACI-36-2B6- Ab1 e ACI-36-3A8-Ab1, foi observado uma redução significativa (Figura 5C).
[0593] Deve-se notar que embora os dois anticorpos específicos para PHF que foram utilizados para estes WBs possuíam epítopos semelhantes e boa especificidade para o seu(s) alvo(s) fosforilado(s), o anticorpo pS396 (PHF-13) parece ter uma melhor relação sinal - ruído e foi o melhor anticorpo para estes WBs.
[0594] O efeito sobre o alvo direto do anticorpo de tratamento foi sondado no córtex utilizando ACI-36-2B6-Ab1 e ACI-36-2B6-Ab1, respectivamente, como o anticorpo de blotting. Este anticorpo anti-pTau se liga ao mesmo epítopo fosfo-Tau que o anticorpo de tratamento utilizado no presente estudo. As membranas (blots) foram previamente sondadas apenas com um anticorpo secundário anti-IgG de camundongo.
[0595] As bandas foram quantificadas utilizando um sistema de imagem em infravermelho. Os valores para camundongos individuais, bem como a média ± EPM são determinados.
[0596] Nenhum sinal acima do fundo foi detectado, verificando a ausência de efeitos de bloqueio ou interferência pelo anticorpo de tratamento nestas amostras (dados não mostrados).
[0597] Nos camundongos tratados com ACI-36-2B6-Ab1, foi observada uma tendência no sentido de redução do sinal em relação ao nível de camundongos nTg controle tratados, indicando um efeito alvo direto (Figura 5G). Nos camundongos tratados com ACI-36-3A8-Ab1 não foram observados efeitos significativos pelo tratamento (Figura 5G) ..
[0598] Foi observado efeito significativo de tratamento do ACI-36- 2B6-Ab1 em Tau total no córtex solúvel de camundongos Tau Tg, utilizando um anticorpo Tau5 para o blotting que se liga tanto a Tau endógena de camundongo quanto a Tau transgênica humana (Figura 5H e 5I). Observou-se uma redução significativa na Tau total para Tau endógena de camundongo e Tau transgênica humana na fração solúvel do córtex cerebral.
[0599] As bandas indicando a Tau (Tau5) de camundongo A) e humana B), foram quantificadas utilizando um sistema de imagem em infravermelho. Os valores para camundongos individuais, bem como a média ± EPM são determinados.
[0600] A presença de epítopos PHF na fração Tau insolúvel em detergente foi feita pela preparação de frações cerebrais insolúveis em sarcosil (SinT).
[0601] As bandas foram quantificadas utilizando um sistema de imagem em infravermelho. Os valores para camundongos individuais, bem como a média ± EPM são determinados.
[0602] Muito menos Tau estava presente nesta fração em relação à fração de Tau solúvel, tanto no córtex quanto no hipocampo. Isto pode ser devido à idade dos camundongos Tau Tg utilizados neste estudo, que em 4 meses podem não ter acumulado uma quantidade significativa de Tau insolúvel agregada no hipocampo e córtex. Portanto, quando feita a sondagem de epítopos PHF na fração SinT, apenas o anticorpo AD2 (PHF-1, pS396/pS404) forneceu um sinal que foi suficiente para a quantificação fiável das bandas.
[0603] Os camundongos tratados com 1 mg/kg de ACI-36-2B6- Ab1 e com 1 mg/kg de ACI-36-3A8-Ab1, respectivamente, tiveram uma redução significativa no epítopo PHF-1 em bandas representando a Tau de camundongo endógena (Figura 5C). Os sinais observados para a banda humana transgênica não foram intensos o suficiente para serem quantificados com fiabilidade.
[0604] O hipocampo também foi sondado utilizando os mesmos anticorpos e frações descritos para o córtex. Sinais mais baixos para todos os anticorpos de blotting foram detectados nas frações do hipocampo, em comparação com o córtex.
[0605] Os efeitos do tratamento com ACI-36-2B6-Ab1 e ACI-36- 3A8-Ab1 sobre a imunorreatividade de pS396 (PHF-13) no hipocampo solúvel de camundongos Tau Tg foram determinados. As bandas indicando os epítopos da pTau pS396 (PHF-13) de camundongo A) e humana B) foram quantificadas utilizando um sistema de imagem em infravermelho. Os valores para camundongos individuais, bem como a média ± EPM são determinados.
[0606] O tratamento ACI-36-2B6-Ab1 não alterou significativamente a presença do epítopo pS396 (PHF-13) na fração solúvel do hipocampo da Tau de camundongo, com uma pequena tendência para a redução na banda com o Tau humana transgênica.
[0607] O tratamento com ACI-36-3A8-Ab1 mostrou tendências no sentido de uma redução da presença do epítopo pS396 (PHF-13) na fração solúvel do hipocampo da banda Tau de camundongo e humana trangênica.
[0608] De modo similar ao que foi observado para os WBs com pS396 (PHF-13), uma tendência para uma redução do sinal foi detectada nos extratos de camundongos tratados com ACI-36-2B6-Ab1 e ACI-36-3A8-Ab1 para a Tau total na fração solúvel do hipocampo da Tau humana.
[0609] Semelhante às amostras SinT do córtex, a fração SinT do hipocampo possuía níveis de pTau muito baixos. Os camundongos tratados com ACI-36-2B6-Ab1 e ACI-36-3A8-Ab1, respectivamente, não exibiram alteração no epítopo PHF-1 (pS396/pS404) em bandas representando a Tau de camundongo endógena. Os sinais observados para a banda humana transgênica não foram intensos o suficiente para uma quantificação fiável.
[0610] 7.2.4 Resumo
[0611] O estudo indica que a imunização passiva, utilizando quatro administrações de um anticorpo anti-pTau fosfosítio-específico, ACI-36- 2B6-Ab1 e ACI-36-3A8-Ab1, melhora a aprendizagem espacial e reduz a patologia pTau no cérebro.
[0612] Quatro administrações periféricas do anticorpo anti-pTau ACI-36-2B6-Ab1 a 3 mg/kg aos camundongos Tau Tg reduziram a presença de epítopos PHF pTau no córtex conforme mensurado por Western-blot. Uma tendência para redução foi observada no hipocampo. Da mesma forma, também foi observada uma redução na Tau total. Uma redução significativa na imunorreatividade da PHF-1 pTau foi observada na fração insolúvel do córtex, e uma tendência também foi observada, o que indicou efeitos diretos sobre o alvo do anticorpo de tratamento. Estes resultados fornecem mais apoio para os anticorpos anti-pTau ACI-36-2B6-Ab1 e ACI-36-3A8-Ab1 na imunoterapia passiva contra tauopatias, tal como a Doença de Alzheimer.
EXEMPLO 8 TRATAMENTO DE 3 MÊS EM CAMUNDONGOS SUPEREXPRESSANDO TAU HUMANA
[0613] 8.1Métodos
[0614] 8.1.1 Camundongos e tratamentos
[0615] Os camundongos Tau transgênicos foram usados e receberam aos anticorpos de tratamento conforme exibido na tabela do método
6.1 (estudo nº 3.) E os camundongos foram divididos em quatro grupos diferentes de tratamento, tal como descrito na tabela abaixo.
Cepa de Idade no Grupo Genótipo Sexo: n Tratamento. camundongos início
Cepa de Idade no Grupo Genótipo Sexo: n Tratamento. camundongos início i.p. 10 3 meses (±2 15+ PBS semana A TMHT Tg misturado l/ semanas) 1 (controle) l g b.w.
ACI-36- i.p. 10 3 meses (±2 15+ semana B TMHT Tg misturado 2B6-Ab1 l/ semanas) 1 l (1 mg/kg) g b.w.
ACI-36- i.p. 10 3 meses (±2 15+ semana C TMHT Tg misturado 2B6-Ab1 l/g semanas) 1 l (3 mg/kg) b.w.
i.p. 10 3 meses (±2 15+ PBS semana F TMHT nTg misturado l/g semanas) 1 (controle) l b.w.
[0616] No total, 45 camundongos Tg mais 3 reservas atribuídos aos grupos de tratamento de A a C e 15 camundongos nTg além de um reserva (grupo F) foram tratados no dia 0, 7, 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70, 77 e 84, por injeção i.p. de PBS (controle com veículo) ou anticorpo anti- pTAU, ACI-36-2B6-Ab1 ou ACI-36-3A8-Ab1. Os animais foram colocados aleatoriamente em cinco grupos diferentes de partida (escalas) que compreende animais de todos os grupos de tratamento. O número de animais em uma escala foi limitado para assegurar a mesma idade e tratamento uniforme. Após a 12ª administração, um teste no labirinto aquático (MWM) foi realizado para avaliar o desempenho da memória espacial. Após o MWM, os camundongos receberam o artigo teste adicional (13ª injeção), antes de serem submetidos à eutanásia 24 horas depois para determinar a patologia Tau. A patologia Tau cerebral foi determinada no hipocampo e amígdala pela quantificação imunohistoquímica (IHQ) utilizando o anticorpo AT180 (anti-pTau, pT231/pS235). Além disso, os efeitos do tratamento sobre a Tau solúvel e sarcosil-insolúvel e pTau no córtex e hipocampo foram mensurados utilizando a tecnologia MesoScale Discovery (MSD), sondando pTau (pT231 e pS396) e Tau total.
[0617] 8.1.2 Testes comportamentais – teste do labirinto aquático de Morris (Morris water-maze (MWM))
[0618] Este experimento foi realizado de acordo com o protocolo descrito no Exemplo 7.1.2. Na semana 12, a navegação espacial foi testada no labirinto de água de Morris (MWM) para avaliar a aprendizagem e memória.
[0619] 8.1.3 Biologia Molecular
[0620] A TAU Total e Tau fosforilada na Tre231 e pS396 foram quantificadas em homogeneizados de cérebro de animais Tg usando um ensaio imunoenzimático a partir do MesoScale Discovery (MSD)
[0621] 8.1.4 Determinação da Patologia TAU no cérebro por quantificação imunohistoquímica (IHQ)
[0622] Este experimento foi realizado de acordo com o protocolo descrito no Exemplo 7.1.3. A patologia TAU foi determinada pela imunorreatividade do AT180 no hipocampo e amígdala de 8 animais por grupo.
[0623] 8.1.5 Efeitos da administração de anticorpo anti-Tau por três meses sobre epítopos Fosfo-Tau presente nos filamentos helicoidais pareados (PHFs)
[0624] Este experimento foi realizado de acordo com os protocolos descritos no em 7.1.4., 7.1.5. e 7.1.6. Para medir os efeitos de quatro administrações de ACI-36-2B6-Ab1 e ACI-36-3A8-Ab1 sobre a quantidade de fosfo-epítopos PHF Tau bem documentados, frações solúveis e SinT do córtex cerebral e hipocampo a partir de camundongos TAU Tg tratados foram sondadas com AD2 (epítopo PHF-1, pS396/pS404) e anticorpo anti-pS396 (epítopo PHF-13, pS396) e AT180 (pT231/pS235) utilizando WBs.
[0625] 8.1.6 Efeitos de três meses de administração de anticorpo anti-Tau sobre os epítopos Fosfo-Tau utilizando camundongos bigênicos Tau biGT
[0626] O estudo nº 4 foi realizado usando camundongos bigênicos Tau conforme mostrado no Método 6.1. As amostras de córtex cerebral foram preparadas tal como mostrado na figura abaixo, utilizando o homogeneizado total (TH) ou a fração solúvel (S1) por Western blotting.
As membranas foram sondadas utilizando os seguintes anticorpos de blotting para pTau ou Tau total:
[0627] - HT-7 (26ng/ml), específico para Tau total humana
[0628] - PHF-13 (pS396) na diluição de 1/7500
[0629] - AT180 (pT231) a 2,47 g/ml
[0630] - AT8 (pS202) a 3 g/ml
[0631] - pS404 na diluição de 1:5000
[0632] - pS400 na diluição de 1:5000
[0633] Todas as quantificações foram normalizados pela - actina.
[0634] 8.2Resultados para o anticorpo ACI-36-2B6-Ab1
[0635] Treze injeções ip de ACI-36-2B6-Ab1 administradas semanalmente a 1 ou 3 mg/kg ao longo de um período de vinte semanas não apresentaram efeitos adversos graves.
[0636] 8.2.1 Resultados comportamentais - labirinto aquático de Morris
[0637] Os resultados do teste MWM demonstraram fortes tendências para a melhoria da aprendizagem espacial nos camundongos tratados com ACI-36-2B6-Ab1 (Figura 9).
[0638] Durante a última semana de tratamento, foram avaliadas a aprendizagem espacial e a memória de navegação dos animais. Os animais tiveram de cumprir quatro dias de treinamento com três ensaios por dia, seguido por um ensaio de sonda e teste visual. A latência de escape (o tempo
[segundos] que o camundongo necessita para encontrar a plataforma escondida e, portanto, para escapar a partir da água), uma via (o comprimento da trajetória [metros] para atingir o alvo), a velocidade de natação (quociente calculado da via e latência de escape), o número de cruzamentos na zona alvo e a permanência no quadrante do alvo foram avaliados.
Os animais controle Tg tratados com veículo (grupo A) e nTg (grupo F) mostraram curvas de aprendizagem esperadas quando avaliado em termos de latência de escape e comprimento do percurso de natação para atingir a plataforma ao longo dos quatro dias de ensaio.
Os animais Tg controle (A) exibiram uma significativa deficiência de aprendizagem refletindo em uma curvas de aprendizagem plana da latência de escape e comprimento do percurso de natação em comparação com os animais nTg do grupo controle (F). As latências de escape e o percurso de natação foram significativamente diferentes (ANOVA Two Way) nos treinos dos dias 3 e 4 (p <0,01 para latência e p <0,001 para comprimento do caminho;
pós-teste de Bonferroni). O tratamento com ACI-36-2B6-Ab1, em dose baixa ou alta (B e C) não melhorou significativamente as capacidades de aprendizagem espacial em comparação com animais controle Tg (A). Ao ajustar o desempenho de cada grupo para 100% no dia de treinamento 1 e todos os outros dias em percentagem em relação ao dia 1, uma ligeira melhoria pode ser observada nos camundongos tratados com ACI-36-2B6-Ab1 (em baixa e alta dose) no comprimento do percurso da natação, embora sem significância estatística.
Não houve diferenças entre os grupos de tratamento quando foi calculada a velocidade de natação em todos os quatro dias de treinamento.
No ensaio de sonda (PT), a permanência no quadrante do alvo (quadrante sudoeste), bem como os cruzamentos na zona-alvo foram registrados.
Os controles nTg (grupo F) passaram mais tempo no quadrante alvo e cruzaram com a zona alvo mais vezes em relação aos controles Tg (grupo A), mas sem significância estatística.
[0639] Nem o tratamento com a dose baixa nem com a dose alta conduziu a uma melhora da capacidade de aprendizagem espacial, em comparação com camundongos controle Tg tal como avaliado no PT.
[0640] 8.2.2 Biologia Molecular
[0641] 8.2.2.1 TAU na fração solúvel de homogeneizados de córtex
[0642] A Tau total, p231TAU, p396TAU, e as relações entre pTAU e TAU total, foram avaliadas na fração solúvel dos homogeneizados de córtex de n = 16 animais do grupo A (grupo Tg veículo; PBS), B (Tg, ACI-36-2B6-Ab1 a 1 mg/kg), e C (Tg, ACI-36-2B6-Ab1 a 3 mg/kg). Um tratamento com ACI-36- 2B6-Ab1 não afetou significativamente a Tau total e pTAU nos homogeneizados de córtex solúveis. Entretanto, observou-se um ligeiro aumento (sem significância) da média da TAU total, p231TAU e p396TAU sobre o tratamento com ACI-36-2B6-Ab1. A fosforilação da TAU avaliada como as relações de pTAU pata Tau total não foi afetada.
[0643] 8.2.2.2 TAU na fração sarcosil-insolúvel de homogeneizados de córtex
[0644] A Tau total, p231TAU, p396TAU, e as relações entre pTAU e TAU total, foram avaliadas na fração insolúvel em sarcosil dos homogeneizados de córtex de n = 16 animais do grupo A (grupo Tg veículo; PBS), B (Tg, ACI-36-2B6-Ab1 a 1 mg/kg), e C (Tg, ACI-36-2B6-Ab1 a 3 mg/kg).
Um tratamento com ACI-36-2B6-Ab1 não afetou significativamente a Tau total e pTAU nos homogeneizados de córtex sarcosil-insolúveis. Entretanto, observou-se uma ligeira diminuição (sem significância) da média da TAU total e p231TAU no tratamento com ACI-36-2B6-Ab1. A fosforilação da TAU avaliada como as relações de pTAU pata Tau total não foi afetada.
[0645] 8.2.2.3 TAU na fração solúvel de homogeneizados de hipocampo
[0646] A Tau total, p231TAU, p396TAU, e as relações entre pTAU e TAU total, foram avaliadas na fração solúvel dos homogeneizados de hipocampo de n = 16 animais do grupo A (grupo Tg veículo; PBS), B (Tg, ACI- 36-2B6-Ab1 a 1 mg/kg), e C (Tg, ACI-36-2B6-Ab1 a 3 mg/kg). Um tratamento com ACI-36-2B6-Ab1 não afetou significativamente a Tau total e pTAU nos homogeneizados de hipocampo solúveis. Uma ligeira diminuição (sem significância) da fosforilação da TAU avaliada como as relações de pTAU para TAU total foi observada após o tratamento com ACI-36-2B6-Ab1.
[0647] 8.2.2.4 TAU na fração sarcosil-insolúvel de homogeneizados de hipocampo
[0648] A Tau total, p231TAU, p396TAU, e as relações entre pTAU e TAU total, foram avaliadas na fração insolúvel em sarcosil dos homogeneizados de hipocampo de n = 16 animais do grupo A (grupo Tg veículo; PBS), B (Tg, ACI-36-2B6-Ab1 a 1 mg/kg), e C (Tg, ACI-36-2B6-Ab1 a 3 mg/kg). Um tratamento com ACI-36-2B6-Ab1 não afetou significativamente a Tau total e pTAU nos homogeneizados de hipocampo insolúveis em sarcosil.
Foi observado no tratamento com 3 mg/kg um aumento na média da TAU total, p231TAU bem como da p396TAU, embora sem atingir significância, enquanto que uma ligeira redução na média da Tau total, bem como da p231TAU e p396TAU no tratamento com 1 mg/kg foi observada. A fosforilação da TAU avaliada como as relações da pTAU pela TAU total estava ligeiramente aumentada após o tratamento com 3 mg/kg de ACI-36-2B6-Ab1.
[0649] 8.2.2.5 Western Blots para o córtex solúvel
[0650] O tratamento com ACI-36-2B6-Ab1 reduziu de maneira dose-dependente a presença dos epítopos pTau pS396/pS404 (Figura 5D) e pT181 (Figura 5E e 5F) na fração solúvel do córtex cerebral, com um efeito significativo na dose de 3 mg/kg.
[0651] 8.2.2.6 TAU em camundongos Tau bigênicos BigT
[0652] Os camundongos BigT tratados com ACI-36-2B6-Ab1 por 3 meses reduziu significativamente a Tau total na fração solúvel do córtex cerebral (Figura 6A e 6B). Observou-se uma redução significativa dos epítopos pTau: pT231/AT180 (Figura 6C e 6D), pS202/AT8 (Figura 6E) e pS396 (Figura 6F e 6G). Uma redução significativa também foi observada no homogeneizado total (AT) para os epítopos pTau: PS400 (Figuras 6H e 6I) e pS404 (Figuras 6D e 6M). Além disso, também foi observada uma redução significativa na fração solúvel para epítopos pTau PS400 (Figura 6J e 6K) e uma tendência para a redução do epítopo pTau pS404 (Figura 6N e 6O).
[0653] 8.2.3 Histologia
[0654] 8.2.3.1 Morfometria - determinação de áreas da região
[0655] A medição de áreas da região do hipocampo e da amígdala não diferiu significativamente em todos os cérebros estudados, o que exclui os efeitos negativos sobre o tecido durante a dissecção e a IHQ ou coloração (por exemplo, encolhimento inequívoco, corte diferente) e um certo grau de atrofia induzida pelo tratamento. Os cortes individuais podem desviar- se a partir da média individual e de grupo, por exemplo, devido ao dobramento do tecido ou perda de partes do corte durante a execução do protocolo de marcação. Portanto, a área imunorreativa total [em m2] de qualquer marcação foi normalizada para a área da região individual do corte [em mm2], calculando a percentagem da área marcada na área da região [área marcada/(área de região * 10.000)].
[0656] 8.2.3.2 Resultados da IH AT180
[0657] O anticorpo AT180 detecta a pTAU endógena e humana (duplamente fosforilada na Tre231 e Ser235). A quantidade de intrasomal de pTAU nos controles nTg foi significativamente menor em comparação com os grupos Tg (p<0.01 bem como p<0.001). Nas amígdalas, a dose mais elevada de ACI-36-2B6-Ab1 (3 mg/kg - grupo C) reduziu significativamente a pTAU
Somal em comparação com animais tratados com veículo (Figura 7, à esquerda). A dose mais baixa (1 mg/kg - grupo C) exibiu a mesma tendência mas não alcançaram significância. O mesmo efeito foi detectado no hipocampo, onde ACI-36-2B6-Ab1 reduziu a pTAU de maneira dose- dependente, significativo para a dose mais elevada e tendencialmente para a dose mais baixa (Figura 7, à direita). Esta diminuição também foi qualitativamente visível como diminuição da área de coloração e intensidade de coloração em somas neuronais individuais. Os resultados da soma das intensidades de coloração normalizados pelo tamanho AOI da IR AT180 mensurada nos somas neuronais foram comparáveis com a percentagem da área IR AT180 mensurada, incluindo um maior efeito significativo dose- dependente da dose mais elevada na amígdala. No hipocampo as comparações post hoc não alcançaram o nível de significância.
[0658] 8.2.4 Resumo
[0659] A patologia Tau no cérebro conforme mensurado pelo MSD não exibiu uma modificação significativa, no entanto a imunocoloração dos cortes de cérebro demonstrou uma redução dose-dependente de até 60% na imunomarcação AT180 (pT231/pS235) em somas neuronais.
[0660] O estudo mostra que a imunização passiva, utilizando treze administrações de um anticorpo anti-pTau fosfosítio-específico, ACI-36- 2B6-Ab1, pode melhorar a aprendizagem espacial e reduzir a patologia pTau no cérebro.
[0661] 8.3Resultados para o anticorpo ACI-36-3A8-Ab1
[0662] Treze injeções ip de ACI-36-3A8-Ab1 administradas semanalmente a 1 ou 3 mg/kg ao longo de um período de vinte semanas não apresentaram efeitos adversos graves.
[0663] 8.3.1 Resultados comportamentais - labirinto aquático de Morris
[0664] Os resultados do teste MWM demonstraram um efeito significante para a melhoria da aprendizagem espacial nos camundongos tratados com ACI-36-3A8-Ab1 na dosagem de 3 mg/kg (Figura 10).
[0665] Os animais controle Tg tratados com veículo (grupo A) e nTg (grupo F) mostraram curvas de aprendizagem esperadas quando avaliado em termos de latência de escape e comprimento do percurso de natação para atingir a plataforma ao longo dos quatro dias de ensaio. Os animais Tg controle (A) exibiram uma significativa deficiência de aprendizagem refletindo em uma curvas de aprendizagem plana da latência de escape e comprimento do percurso de natação em comparação com os animais nTg do grupo controle (F). As latências de escape e percurso de natação foram significativamente diferentes (ANOVA Two Way) nos treinos dos dias 3 e 4 (p <0,01 para latência e p <0,001 para comprimento do caminho; pós-teste de Bonferroni). O tratamento com ACI-36-3A8-Ab1, em dose baixa ou alta (D e E) não melhorou significativamente as capacidades de aprendizagem espacial em comparação com animais controle Tg (A) quando os valores absolutos foram analisados.
Quando ajustado o desempenho de cada grupo para 100% no dia de treinamento 1 e todos os outros dias como uma percentagem do dia 1, uma melhora da aprendizagem e capacidade de memória pode ser observada para os camundongos tratados com ACI-36-3A8-Ab1 (nas doses alta e baixa). Os animais tratados com a dose baixa de ACI-36-3A8-Ab1 (grupo D) realizaram um MWM apenas ligeiramente melhor na comparação com os controle Tg (grupo A). O efeito do tratamento semanal com 3 mg/kg de ACI-36-3A8-Ab1 (grupo E) foi muito mais pronunciado e quase restabeleceu o desempenho dos animais nTg. Em comparação com os controles TG (A) o efeito de 3 mg/kg, ACI-36-3A8-Ab1 foi estatisticamente significativo para o comprimento do percurso de natação no dia 3 e dia 4 (p <0,05). Não houve diferenças entre os grupos de tratamento quando foi calculada a velocidade de natação em todos os quatro dias de treinamento.
[0666] No ensaio de sonda (PT), a permanência no quadrante do alvo (quadrante sudoeste), bem como os cruzamentos na zona-alvo foram registrados. Os controles nTg (grupo F) passaram mais tempo no quadrante alvo e cruzaram com a zona alvo mais vezes em relação aos controles Tg (grupo A), mas sem significância estatística. Nem o tratamento com a dose baixa nem com a dose alta melhorou de maneira significante em comparação com camundongos controle Tg tal como avaliado no PT. Entretanto, os animais tratados com ACI-36-3A8-Ab1 tinham - embora estatisticamente insignificante - mais passagens na zona alvo em comparação com os animais controle Tg, ou seja, este resultado está de acordo com o resultado do comprimento do percurso de natação ao longo dos 4 dias de treino.
[0667] 8.3.2 Biologia Molecular
[0668] 8.3.2.1 TAU na fração solúvel de homogeneizados de córtex
[0669] A Tau total, p231TAU, p396TAU, e as relações entre pTAU e TAU total, foram avaliadas na fração solúvel dos homogeneizados de córtex de n = 16 animais do grupo A (grupo Tg veículo; PBS), D (Tg, ACI-36-3A8-Ab1 a 1 mg/kg), e de 15 animais do grupo E (Tg, ACI-36-3A8-Ab1 a 3 mg/kg). Um tratamento com ACI-36-3A8-Ab1 não afetou significativamente a Tau total e pTAU nos homogeneizados de córtex solúveis. Entretanto, observou-se um ligeiro aumento (sem significância) da média da TAU total, p231TAU e p396TAU sobre o tratamento com ACI-36-3A8-Ab1. A fosforilação da Tau no resíduo 231 avaliada pela relação entre p231TAU e Tau total foi ligeiramente reduzida após tratamento com 3 mg/kg de ACI-36-3A8-Ab1.
[0670] 8.3.2.2 TAU na fração sarcosil-insolúvel de homogeneizados de córtex
[0671] A Tau total, p231TAU, p396TAU, e as relações entre pTAU e TAU total, foram avaliadas na fração sarcosil-insolúvel dos homogenatos de córtex de n = 16 animais do grupo A (grupo Tg veículo; PBS), D (Tg, ACI-36- 3A8-Ab1 a 1 mg/kg), e de 15 animais do grupo E (Tg, ACI-36-3A8-Ab1 a 3 mg/kg). Um tratamento com ACI-36-3A8-Ab1 não afetou significativamente a Tau total e pTAU nos homogeneizados de córtex insolúveis em sarcosil.
Entretanto, observou-se uma ligeira diminuição (sem significância) na média da TAU total, p231TAU e p396TAU no tratamento com 1 mg/kg de ACI-36-3A8- Ab1. Além disso, a relação p231TAU para TAU total nos animais tratados com 1 mg/kg de ACI-36-3A8-Ab1 exibiu um variabilidade ligeiramente menor em comparação com animais tratados com veículo (sem significância no F-teste: p = 0,184), sem alterar a média para a relação p231TAU / TAU total dos dois grupos. Para os grupos tratados com 1 mg/kg e 3 mg/kg de ACI-36-3A8-Ab1 foi observado um ligeiro aumento na fosforilação p396TAU.
[0672] 8.3.2.3 TAU na fração solúvel de homogeneizados de hipocampo
[0673] A Tau total, p231TAU, p396TAU, e as relações entre pTAU e TAU total, foram avaliadas na fração solúvel dos homogeneizados de hipocampo de n = 16 animais do grupo A (grupo Tg veículo; PBS), D (Tg, ACI- 36-3A8-Ab1 a 1 mg/kg), e de 15 animais do grupo E (Tg, ACI-36-3A8-Ab1 a 3 mg/kg). Os níveis Tau e pTAU nas frações solúveis do hipocampo de IRN6301 (grupo D) foram discrepantes e foram excluídos. Um tratamento com ACI-36- 3A8-Ab1 não afetou significativamente a Tau total e pTAU nos homogeneizados de hipocampo solúveis. Uma ligeira diminuição (sem significância) da fosforilação da TAU no resíduo 231 avaliada como as relações de pTAU / TAU total foi observada após o tratamento com ACI-36-3A8-Ab1.
[0674] 8.3.2.4 TAU na fração sarcosil-insolúvel de homogeneizados de hipocampo
[0675] A Tau total, p231TAU, p396TAU, e as relações entre pTAU e TAU total, foram avaliadas na fração insolúvel em sarcosil dos homogeneizados de hipocampo de n = 16 animais do grupo A (grupo Tg veículo; PBS), B (Tg, ACI-36-3A8-Ab1 a 1 mg/kg), e C (Tg, ACI-36-3A8-Ab1 a 3 mg/kg). Um tratamento com ACI-36-3A8-Ab1 não afetou significativamente a Tau total e pTAU nos homogeneizados de hipocampo insolúveis em sarcosil.
Entretanto, observou-se um ligeiro aumento (sem significância) da média da TAU total, p231TAU bem como da p396TAU sobre o tratamento com ACI-36- 3A8-Ab1. A fosforilação da TAU avaliada como a relação entre p231TAU e TAU total não foi afetada e o tratamento com 1mg/kg de ACI-36-3A8-Ab1 reduziu ligeiramente a relação p396TAU / TAU total.
[0676] 8.3.2.5 Western Blots para o córtex solúvel
[0677] Houve uma redução significativa do epítopo pTau pS396/pS404 no córtex cerebral solúvel em camundongos tratados com 1 ou 3 mg/kg de ACI-36-3A8-Ab1 (Figura 5D). A presença do epítopo pTau pT181 humano/transgênico foi reduzida na fração solúvel do córtex, com um efeito significativo nos camundongos tratados com 1 mg/kg e com uma tendência nos camundongos tratados com 3 mg/kg (Figura 5E). Uma tendência para redução foi observada na quantidade de pTau pT181 endógena (Figura 5F).
[0678] 8.3.2.6 TAU em camundongos Tau bigênicos BigT
[0679] Os camundongos BigT tratados com ACI-36-3A8-Ab1 por 3 meses reduziu significativamente a Tau total na fração solúvel do córtex cerebral (Figura 6A e 6B). Observou-se uma redução significativa dos epítopos pTau: pT231/AT180 (Figura 6C e 6D), pS202/AT8 (Figura 6E) e pS396 (Figura 6F e 6G). Uma redução significativa também foi observada no homogeneizado total (AT) para os epítopos pTau: PS400 (Figuras 6H e 6I) e pS404 (Figuras 6D e 6M). Além disso, também foi observada uma redução significativa na fração solúvel para epítopos pTau PS400 (Figura 6J e 6K) e uma tendência para a redução do epítopo pTau pS404 (Figura 6N e 6O).
[0680] 8.3.3 Histologia
[0681] 8.3.3.1 Morfometria - determinação de áreas da região
[0682] Vide o exemplo 8.2.3.1
[0683] 8.3.3.2 Resultados da IH AT180
[0684] O anticorpo AT180 detecta a pTAU endógena e humana (duplamente fosforilada na Tre231 e Ser235). A quantidade de intrasomal de pTAU nos controles nTg foi significativamente menor em comparação com os grupos Tg (p <0,001). Nas amígdalas, tanto a ambas as doses de ACI-36-3A8- Ab1 [1 mg/kg (grupo C) e 3 mg/kg (grupo E)] reduziram significativamente a pTAU somal em comparação com animais tratados com veículo (Figura 8, à esquerda). Um efeito similar foi detectado no hipocampo, onde a dosagem menor de ACI-36-3A8-Ab1 reduziu a pTAU, entretanto, neste caso, a dose mais elevada foi menos eficaz e apenas conduziu a um decréscimo tendencioso (Fig. 8, direita). Esta diminuição também foi qualitativamente visível como diminuição da área de coloração e intensidade de coloração em somas neuronais individuais. Os resultados da soma normalizada das intensidades IR do AT180 mensuradas nos somas neuronais foram comparáveis na amígdala com a percentagem da área IR AT180 medida, mas atingiu significância apenas para a dosagem mais elevada. No hipocampo, o resultado foi totalmente comparável com as percentagens da área IR.
[0685] 8.3.4 Resumo
[0686] A patologia Tau no cérebro conforme mensurado pelo MSD não exibiu uma modificação significativa, no entanto a imunocoloração dos cortes de cérebro demonstrou uma redução dose-
dependente de até 40% na imunomarcação AT180 (pT231/pS235) em somas neuronais.
[0687] O estudo mostra que a imunização passiva, utilizando treze administrações de um anticorpo anti-pTau fosfosítio-específico, ACI- 36-3A8-Ab1, melhora a aprendizagem espacial e reduz a patologia pTau no cérebro.
DEPÓSITOS
[0688] As seguintes linhagens de células de hibridoma foram depositadas em nome da AC Imune SA, PSE-EPFL edifício B, 1015 Lausanne, Suiça e Universidade Católica de Leuven (Katholieke Universiteit Leuven) , Minderbroedersstraat 8a - Caixa Postal 5105, B-3000 Leuven na Coleção Alemã de Microrganismos e Cultura de Células (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, GmbH (DSMZ)), em Braunschweig, Inhoffenstrasse 7B, 38124 Braunschweig, de acordo com as disposições do Tratado de Budapeste: Nome do Número de Data do depósito Hibridoma Depósito 6C10F9C12A11 DSM ACC3079 25 de agosto de 2010 6C10E5E9C12 DSM ACC3081 25 de agosto de 2010 6H1A11C11 DSM ACC3080 25 de agosto de 2010 6H1G6E6 DSM ACC3088 25 de agosto de 2010 2B6A10C11 DSM ACC3084 25 de agosto de 2010 2B6G7A12 DSM ACC3087 25 de agosto de 2010 3A8A12G7 DSM ACC3086 25 de agosto de 2010 3A8E12H8 DSM ACC3085 25 de agosto de 2010 7C2(1)F10C10D3 DSM ACC3082 25 de agosto de 2010 7C2(2)B9F11D5 DSM ACC3083 25 de agosto de 2010
Nome do Número de Data do depósito Hibridoma Depósito
A4-4A6-48 DSM ACC3136 30 de agosto de 2011
A6-2G5-30 DSM ACC3137 30 de agosto de 2011
A6-2G5-41 DSM ACC3138 30 de agosto de 2011
A4-2A1-18 DSM ACC3139 30 de agosto de 2011
A4-2A1-40 DSM ACC3140 30 de agosto de 2011
A6-1D2-12 6 de setembro de DSM ACC3141 2011
TABELA 1
SEQUÊNCIA DA TAU, VACINA E DESCRIÇÃO DO ANTICORPO Descrição Vacina Sequência*, comprimento (n), SEQ ID NO Hibridomas Anticorpos ACI-33-6C10- 6C10F9C12A11 RQEFEVMEDHAGTY(p)GL (n = 16) (SEQ ID NO: Ab1 T1: Tau 5-20 [pY18 ] ACI-33 59) ACI-33-6C10- 6C10E5E9C12 Ab2 T8: Tau 206-221 [pT212, PGSRSRT(p)PS(p)LPTPPTR (n = 16) (SEQ ID 7C2(1)F10C10 ACI-41-7C2- pS214] NO: 60) D3 Ab1 ACI-41 T9: Tau 196-211 [pS202, GYSSPGS(p)PGT(p)PGSRSR (n = 16) (SEQ ID 7C2(2)B9F11D ACI-41-7C2-
172/213 pT205] NO: 61) 5 Ab1 ACI-36-6H1- 6H1A11C11 Ab1 ACI-36-6H1- 6H1G6E6 Ab2 ACI-36-2B6- T4: Tau 401-418 [pS404, GDTS(p)PRHLS(p)NVSSTGSID (n = 18) (SEQ ID 2B6A10C11 ACI-36 Ab1 pS409] NO: 63) ACI-36-2B6- 2B6G7A12 Ab2 ACI-36-3A8- 3A8A12G7 Ab1 ACI-36-3A8- 3A8E12H8 Ab2 ACI-35-4A6- A4-4A6-48 T3: Tau 393-408 [pS396, VYKS(p)PVVSGDTS(p)PRHL (n = 16) (SEQ ID Ab2 ACI-35 pS404] NO: 62) ACI-35-2G5- A6-2G5-30 Ab2
Descrição Vacina Sequência*, comprimento (n), SEQ ID NO Hibridomas Anticorpos ACI-35-2G5- A6-2G5-41 Ab3 ACI-35-2A1- A4-2A1-18 Ab1 ACI-35-2A1- A4-2A1-40 Ab2 ACI-35-1D2- A6-1D2-12 Ab1 T5: Sequência Controle: RENAKAKTDHGAEIVYKS(p)PVVSGDTS(p)PRHL Tau 379-408 [pS396, ACI-37 (n = 30) (SEQ ID NO: 58) pS404]
173/213 T8: Tau 206-221 [pT212, PGSRSRT(p)PS(p)LPTPPTR (n = 16) (SEQ ID NO: ACI-39 pS214] 60) T9 : Tau 196-211 [pS202, GYSSPGS(p)PGT(p)PGSRSR (n = 16) (SEQ ID ACI-40 pT205] NO: 61) T2: Tau 200-216 [pS202+ PGS(p)PGT(p)PGSRSRT(p)PS(p)LP (n = 17) (SEQ ACI-34 pT205 & pT212+pS214] ID NO: 64) T10: Tau 407-418 [pS409] ACI-42 HLS(p)NVSSTGSID (n = 12) (SEQ ID NO: 65) T11: Tau 399-408 [pS404] ACI-43 VSGDTS(p)PRHL (n = 10) (SEQ ID NO: 66)
* Com base na maior isoforma da Tau humana (Tau441). p indica o resíduo fosforilado.
TABELA 2
RESULTADOS DA TRIAGEM DO HIBRIDOMA ACI-33 Triagem na placa de 24 Triagem em frascos T25 poços Positivo Positivo Positivo no na Positivo Positivo no no ELISA TAUPIR triagem no ELISA TAUPIR IgG 1A7 1A7 1A11 1C11 1C11 2C9 2C9 3C3 3C3 3C3 3C5 3C5 3E8 3E8 3G10 3G10 3G10 3G10 6C10 6C10 6C10 6C10 6C10 6F3 6F3 6F8 6F8
TABELA 3
RESULTADOS DA TRIAGEM DO HIBRIDOMA ACI-36 Triagem na placa de 24 Triagem em frascos T25 poços Positivo Positivo Positivo no na Positivo Positivo no no ELISA TAUPIR triagem no ELISA TAUPIR IgG 2B6 2B6 2B6 2B6 2B6 2F9 2F9 2F9 2F9 2F9 2G1 2G1 2G1 2G1 3A8 3A8 3A8 3A8 3A8 3B9 3B9 3B9 3B9 3F11 3F11 3F11 3F11 4A3 4A3 4C1 4C1 4C1 4C1 4C12 4C12 4C12 4C12 4E12 4E12 4E12 4E12
Triagem na placa de 24 Triagem em frascos T25 poços Positivo Positivo Positivo no na Positivo Positivo no no ELISA TAUPIR triagem no ELISA TAUPIR IgG 5E10 5E10 5E10 5F5 5F5 5F5 7D6 7D6 7D6 7D6 7D6 6H1 6H1 6H1 6H1 TABELA 4 CLASSIFICAÇÃO DE CLONES POSITIVOS NO ELISA E TAUPIR DE ACI-36 TABELA 5 RESULTADOS DA TRIAGEM DO HIBRIDOMA ACI-41 Triagem na placa de 24 Triagem em frascos T25 poços Positivo Positivo Positivo Positivo na Positivo no no ELISA no TAUPIR triagem no ELISA
TAUPIR IgG 3D11 3D11 3D11 4H6 4H6 4H6 5D10 5D10 5D10 5D10 5D10 5E6 5E6 5F10 5F10 6B7 6B7 6B7 7C2 7C2 7C2 7C2 7C2
Triagem na placa de 24 Triagem em frascos T25 poços Positivo Positivo Positivo Positivo na Positivo no no ELISA no TAUPIR triagem no ELISA
TAUPIR IgG 8G8 8G8 8H8 8H8 8H8 TABELA 6
TRIAGEM DE HIBRIDOMAS PARA LIGAÇÃO AO ALVO
ELISA pTau p- Tau de Western Hibridomas Anticorpos Peptídeo de TAUPIR peptídeo comp. Blot Tau comp. Tau total total 6C10F9C12A ACI-33- + - +/- - + - 11 6C10-Ab1 6C10E5E9C1 ACI-33- + - +/- - + - 2 6C10-Ab2 ACI-36- 6H1A11C11 + - + - + + 6H1-Ab1 ACI-36- 6H1G6E6 + - + - + + 6H1-Ab2 ACI-36- 2B6A10C11 + - + - + + 2B6-Ab1 ACI-36- 2B6G7A12 + - + - + + 2B6-Ab2 ACI-36- 3A8A12G7 + - + - + + 3A8-Ab1 ACI-36- 3A8E12H8 + - + -/+ + + 3A8-Ab2 7C2(1)F10C1 ACI-41- + - + - + - 0D3 7C2-Ab1 7C2(2)B9F11 ACI-41- + - + - + - D5 7C2-Ab2 ACI-35- A4-2A1-18 + - + - 2A1-Ab1 ACI-35- A4-2A1-40 + - + - 2A1-Ab2 ACI-35- A4-4A6-18 + - - + 4A6-Ab1 ACI-35- A4-4A6-48 4A6-Ab2
ELISA pTau p- Tau de Western Hibridomas Anticorpos Peptídeo de TAUPIR peptídeo comp.
Blot Tau comp.
Tau total total ACI-35- A6-1D2-12 + - + - 1D2-Ab1 ACI-35- A6-2G5-08 + - - - 2G5-Ab1 ACI-35- A6-2G5-30 + - + - 2G5-Ab2 ACI-35- A6-2G5-41 + - + - 2G5-Ab3
TABELA 7
AFINIDADE DE LIGAÇÃO DOS ANTICORPOS ANTI-TAU Constante de Constante de Constante velocidade de velocidade de de Hibridomas Anticorpos associação (Kd) dissociação dissociação (1/Ms) (ka) (1/s) (KD) (nM) 6C10F9C12A ACI-33-6C10-Ab1 9,46 x 105 3,27 x 10-3 3,46 11 6H1A11C11 ACI-36-6H1-Ab1 3,53 x 104 6,80 x 10-5 1,93 6H1G6E6 ACI-36-6H1-Ab2 9,99 x 104 9,58 x 10-5 0,96 2B6A10C11 ACI-36-2B6-Ab1 6,90 x 105 1,63 x 10-4 0,24 2B6G7A12 ACI-36-2B6-Ab2 9,11 x 105 1,11 x 10-4 0,12 3A8A12G7 ACI-36-3A8-Ab1 1,01 x 106 1,09 x 10-4 0,11 3A8E12H8 ACI-36-3A8-Ab2 8,43 x 105 1,43 x 10-4 0,17 A4-4A6-18 ACI-35-4A6-Ab1 2,00 x 105 3,10 x 10-3 16 A6-1D2-12 ACI-35-1D2-Ab1 1,60 x 103 9,30 x 10-6 6 A6-2G5-08 ACI-35-2G5-Ab1 4,80 x 105 5,30 x 10-3 10
TABELA 8
BIBLIOTECAS DE PEPTÍDEO UTILIZADAS NO MAPEAMENTO DE EPÍTOPOS 178/213
TABELA 8 (CONTINUAÇÃO)
179/213
TABELA 8 (CONTINUAÇÃO)
180/213
TABELA 8 (CONTINUAÇÃO)
181/213 TABELA 8 (CONTINUAÇÃO)
TABELA 9
AMINOÁCIDOS TAU E FOSFO-RESÍDUOS NECESSÁRIOS PARA A LIGAÇÃO DE ANTICORPO Vacina Hibridoma Epítopo*
ACI-33 6C10F9C12A11 aa Tau 15-20, com a exigência para pY18 ACI-33 6C10E5E9C12 aa Tau 15-20, com a exigência para pY18 ACI-36 6H1A11C11 aa Tau 405-412, com a exigência para pS409 ACI-36 6H1G6E6 aa Tau 405-412, com a exigência para pS409 ACI-36 2B6A10C11 aa Tau 405-411, com a exigência para pS409
183/213 ACI-36 2B6G7A12 aa Tau 405-411, com a exigência para pS409 ACI-36 3A8A12G7 aa Tau 405-411, com a exigência para pS409 ACI-36 3A8E12H8 aa Tau 405-411, com a exigência para pS409 ACI-41 7C2(1)F10C10D3 aa Tau 208-218, com a exigência para pT212 e pS214 ACI-35 A4-2A1-18 aa Tau 393-401, com a exigência para pS396 ACI-35 A4-2A1-40 aa Tau 393-401, com a exigência para pS396 ACI-35 A4-4A6-18 aa Tau 396-401, com a exigência para pS396 ACI-35 A6-1D2-12 aa Tau 394-400, com a exigência para pS396 ACI-35 A6-2G5-08 aa Tau 402-406, com a exigência para pS404 ACI-35 A6-2G5-30 aa Tau 393-400, com a exigência para pS396 ACI-35 A6-2G5-41 aa Tau 393-400, com a exigência para pS396
* Com base na maior isoforma da Tau humana (Tau 441).
TABELA 10 SEQUÊNCIA DE AMINOÁCIDOS DAS REGIÕES VARIÁVEIS DE CADEIA LEVE E CADEIA PESADA (VH E VK) E AS CDRS Vacina Hibridoma Primer VH Primer VK VH VK VH VH VH VK VK VK (mistura) (mistura) CDR1 CDR2 CDR3 CDR1 CDR2 CDR3 ACI-36 3A8A12G7 SEQ ID VK_AD EVQLQQSGPELVKPG DIVMTQSPSSLAMSV GYTFT DINPN YYAVG KSSQS FASTR QEHYT * NO: 46 e (SEQ ID ASVKISCKASGYTFTD GQKVTMSCKSSQSV DYYMN RGGTT Y (SEQ VFNSG ES TPPT SEQ ID NO: 48/ YYMNWVKQSHGKSL FNSGNQKNSLAWYQ (SEQ ID YNQKF ID NO: NQKNS (SEQ ID (SEQ ID NO: 47 SEQ ID EWIGDINPNRGGTTY QKPGQSPKLLVYFA NO: 12) KG 14) LA NO: 22) NO: 23) NO: 49/ e NQKFKGKATLTVDKS STRESGVPDRFIGS (SEQ ID (SEQ ID SEQ ID SSTAYMELRSLTSED GSGTDFSLTISSVQA NO: 13) NO: 21) NO: 51) SAVYYCASYYAVGY EDLADYFCQEHYTT WGQGTTLTVSS (SEQ PPTFGTGTKLELK 184/213 ID NO: 1) (SEQ ID NO: 6) ACI-36 3A8A12G SEQ ID VK_G EVQLQQSGPELVKP DVVMTQTPLSLPVSL GYTFT DINPN YYAVG RSSQR KVSNR SQTAH 7* NO: 46 e (SEQ ID GASVKISCKASGYTFT GDQASISCRSSQRL DYYMN RGGTT Y (SEQ LVHSH FS FPYT SEQ ID NO: 50 e DYYMNWVKQSHGKS VHSHGKTYLHWYLQ (SEQ ID YNQKF ID NO: GKTYL (SEQ ID (SEQ ID NO: 47 SEQ ID LEWIGDINPNRGGTT KPGQSPKLLIYKVSN NO: 12) KG 14) H (SEQ NO: 25) NO: 26) NO: 51) YNQKFKGKATLTVDK RFSGVPDRFSGSGS (SEQ ID ID NO: SSSTAYMELRSLTSE GTDFTLKISRVEAED NO: 13) 24)
DSAVYYCASYYAVGY LGVYFCSQTAHFPY WGQGTTLTVSS (SEQ TFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 1 ID NO: 7) ACI-36 3A8E12H8 SEQ ID VK_AD EVQLQQSGPELVKPG DIVMTQSPSSLAMSV GYTFT DINPN YYAVG KSSQS FASTR QEHYT * NO: 46 e (SEQ ID ASVKISCKASGYTFTD GQKVTMSCKSSQSV DYYMN RGGTT Y (SEQ VFNSG ES TPPT SEQ ID NO: 48/ YYMNWVKQSHGKSL FNSGNQKNSLAWYQ (SEQ ID YNQKF ID NO: NQKNS (SEQ ID (SEQ ID NO: 47 SEQ ID EWIGDINPNRGGTTY QKPGQSPKLLVYFA NO: 12 KG 14) LA NO: 22) NO: 23) NO: 49 e NQKFKGKATLTVDKS STRESGVPDRFIGS (SEQ ID (SEQ ID SEQ ID SSTAYMELRSLTSED GSGTDFSLTISSVQA NO: 13) NO: 21) NO: 51) SAVYYCASYYAVGY EDLADYFCQEHYTT WGQGTTLTVSS (SEQ PPTFGTGTKLELK
Vacina Hibridoma Primer VH Primer VK VH VK VH VH VH VK VK VK (mistura) (mistura) CDR1 CDR2 CDR3 CDR1 CDR2 CDR3 ID NO: 1) (SEQ ID NO: 6) ACI-36 3A8E12H SEQ ID VK_G EVQLQQSGPELVKPG DVVMTQTPLSLPVSL GYTFT DINPN YYAVG RSSQR KVSNR SQTAH 8* NO: 46 e (SEQ ID ASVKISCKASGYTFTD GDQASISCRSSQRL DYYMN RGGTT Y (SEQ LVHSH FS FPYT SEQ ID NO: 50 e YYMNWVKQSHGKSL VHSHGKTYLHWYLQ (SEQ ID YNQKF ID NO: GKTYL (SEQ ID (SEQ ID NO: 47 SEQ ID EWIGDINPNRGGTTY KPGQSPKLLIYKVSN NO: 12 KG 14) H (SEQ NO: 25) NO: 26) NO: 51) NQKFKGKATLTVDKS RFSGVPDRFSGSGS (SEQ ID ID NO: 185/213 SSTAYMELRSLTSED GTDFTLKISRVEAED NO: 13) 24)
SAVYYCASYYAVGY LGVYFCSQTAHFPY WGQGTTLTVSS (SEQ TFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 1) ID NO: 7) ACI-36 2B6A10C1 SEQ ID SEQ ID EVQLQQSGPELVKPG DVVMTQTPLSLPVSL GYTFT DINPN YYAVG RSSQS KVSNR SQTAH 1 NO: NO: 50 e TSVKISCKASGYTFTD GDQASISCRSSQSL DYYMN RGGTT Y (SEQ LVHSH FS FPYT 46/SEQ ID SEQ ID YYMNWVKQSHGKSL VHSHGKTYLHWYLQ (SEQ ID YNQKF ID NO: GKTYL (SEQ ID (SEQ ID NO: 52 e NO: 51 EWIGDINPNRGGTTY KPGQSPKLLIYKVSN NO: 12) KG 14) H (SEQ NO: 25) NO: 26) SEQ ID NQKFKGKATLTVDKS RFSGVPDRFSGSGS (SEQ ID ID NO: NO: 47 SSTAYMELRSLTSED GTDFTLKISRVEAED NO: 13) 27)
SAVYYCASYYAVGY LGVYFCSQTAHFPY WGQGTTLTVSS (SEQ TFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 2) ID NO: 8)
Vacina Hibridoma Primer VH Primer VK VH VK VH VH VH VK VK VK (mistura) (mistura) CDR1 CDR2 CDR3 CDR1 CDR2 CDR3 ACI-36 2B6G7A12 SEQ ID SEQ ID EVQLQQSGPELVKPG DVVMTQTPLSLPVSL GYTFT DINPN YYAVG RSSQS KVSNR SQTAH NO: NO: 50 e TSVKISCKASGYTFTD GDQASISCRSSQSL DYYMN RGGTT Y (SEQ LVHSH FS FPYT 46/SEQ ID SEQ ID YYMNWVKQSHGKSL VHSHGKTYLHWYLQ (SEQ ID YNQKF ID NO: GKTYL (SEQ ID (SEQ ID NO: 52 e NO: 51 EWIGDINPNRGGTTY KPGQSPKLLIYKVSN NO: 12) KG 14) H (SEQ NO: 25) NO: 26) SEQ ID NQKFKGKATLTVDKS RFSGVPDRFSGSGS (SEQ ID ID NO: NO: 47 SSTAYMELRSLTSED GTDFTLKISRVEAED NO: 13) 27)
SAVYYCASYYAVGY LGVYFCSQTAHFPY WGQGTTLTVSS (SEQ TFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 2) ID NO: 8) ACI-36 6H1A11C1 SEQ ID SEQ ID EVQLQQSGPELVKPG DVVMTQTPLSLPVSL GYTFT DINPN YYAVG RSSQS KVSNR SQTAH 1 NO: 46 e NO: 50 e ASVKISCKASGYTFTD GDQASISCRSSQSLL DYYMN RGGTT Y (SEQ LLHSH FS FPYT 186/213 SEQ ID SEQ ID YYMNWVKQSHGKSL HSHGNTYLHWYLQK (SEQ ID YNQKF ID NO: GNTYL (SEQ ID (SEQ ID NO: 47 NO: 51 EWIGDINPNRGGTTY PGQSPKLLIYKVSNR NO: 12) KG 14) H (SEQ NO: 25) NO: NQKFKGKATLTVDTS FSGVPDRFSGSGSG (SEQ ID ID NO: 26)) SSTAYMELRSLTSED TDFTLKISRVEAEDL NO: 13) 28)
SAVYYCASYYAVGY GVYFCSQTAHFPYT WGQGTTLTVSS (SEQ FGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 3) ID NO: 9) ACI-36 6H1G6E6 SEQ ID SEQ ID EVQLQQSGPELVKPG DVVMTQTPLSLPVSL GYTFT DINPN YYAVG RSSQS KVSNR SQTAH NO: 46 e NO: 50 e ASVKISCKASGYTFTD GDQASISCRSSQSLL DYYMN RGGTT Y (SEQ LLHSH F (SEQ FPYT SEQ ID SEQ ID YYMNWVKQSHGKSL HSHGNTYLHWYLQK (SEQ ID YNQKF ID NO: GNTYL ID NO: (SEQ ID NO: 47 NO: 51 EWIGDINPNRGGTTY PGQSPKLLIYKVSNR NO: 12) KG 14) H (SEQ 25) NO: 26) NQKFKGKATLTVDTS FSGVPDRFSGSGSG (SEQ ID ID NO: SSTAYMELRSLTSED TDFTLKISRVEAEDL NO: 13) 28)
SAVYYCASYYAVGY GVYFCSQTAHFPYT WGQGTTLTVSS (SEQ FGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 3) ID NO: 9)
Vacina Hibridoma Primer VH Primer VK VH VK VH VH VH VK VK VK (mistura) (mistura) CDR1 CDR2 CDR3 CDR1 CDR2 CDR3 ACI-33 6C10E5E9 SEQ ID SEQ ID EVQLVESGGGLVKPG DIVMTQSHKFMSTS GFTFS YISSGS RGQLR KASQD SASYR QQHYT C12 NO: NO: GSLKLSCAPSGFTFS VGDRVSITCKASQD DYGMH STIYYG LRLFAY VSTAV YT TPLT 53/SEQ ID DYGMHWVRQAPEKG 48/SEQ ID VSTAVAWYQQKPG (SEQ ID DTVKG (SEQ ID A (SEQ (SEQ ID (SEQ ID NO:54 e NO:49 e LEWVAYISSGSSTIYY QSPKLLIYSASYRYT NO: 15) (SEQ ID NO: 17) ID NO: NO: 30) NO: 31) SEQ ID SEQ ID GDTVKGRFTISRDNA GVPDRFTGSGSGTD NO: 16) 29) NO: 47 NO: 51 KNTLFLQ FTFTISSVQAEDLAV
MTSLRSEDTAMYYCA YYCQQHYTTPLTFG RRGQLRLRLFAYWG AGTKLELK (SEQ ID QGTLVTVSA (SEQ ID NO: 10) NO: 4) ACI-33 6C10F9C1 SEQ ID SEQ ID EVQLVESGGGLVKPG DIVMTQSHKFMSTS GFTFS YISSGS RGQLR KASQD SASYR QQHYT 187/213 2A11 NO: NO: 54 e GSLKLSCAPSGFTFS VGDRVSITCKASQD DYGMH STIYYG LRLFAY VSTAV YT TPLT 53/SEQ ID SEQ ID DYGMHWVRQAPEKG VSTAVAWYQQKPG (SEQ ID DTVKG (SEQ ID A (SEQ (SEQ ID (SEQ ID NO:54 e NO: 51 LEWVAYISSGSSTIYY QSPKLLIYSASYRYT NO: 15) (SEQ ID NO: 17) ID NO: NO: 30) NO: 31) SEQ ID GDTVKGRFTISRDNA GVPDRFTGSGSGTD NO: 16) 29) NO: 47 KNTLFLQMTSLRSED FTFTISSVQAEDLAV
TAMYYCARRGQLRLR YYCQQHYTTPLTFG LFAYWGQGTLVTVSA AGTKLELK (SEQ ID (SEQ ID NO: 4) NO: 10) ACI-41 7C2(1)F10 SEQ ID SEQ ID EVKLMESGGGLVHP DIVMSQSPSSLAVSV GFTFT LIRNKA ALGRY KSSQS WASTR QQYYS C10D3 NO: 53/ NO: GASLRLYCAASGFTF GEKVTMSCKSSQSL DYYMS NGYTT FDV LLYSS ES YPFT SEQ ID 49/SEQ ID TDYYMSWVRQPPGK LYSSNQKNYLAWYQ (SEQ ID EYTAS (SEQ ID NQKNY (SEQ ID (SEQ ID NO:55 e NO:56/SE APEWLALIRNKANGY QKPGQSPKLLIYWA NO: 18) VKG NO: 20) LA NO: 33) NO: 34) SEQ ID Q ID NO: TTEYTASVKGRFTISR STRESGVPDRFTGS (SEQ ID (SEQ ID NO: 47 57 e SEQ DNSQNILYLQMNTLR GSGTDFTLTISSVKA NO: 19) NO: 32) ID NO: 51 AEDSATYYCVKALGR EDLAVYYCQQYYSY
YFDVWGTGTTVTVSS PFTFGSGTKLEIK (SEQ ID NO: 5) (SEQ ID NO: 11)
Vacina Hibridoma Primer VH Primer VK VH VK VH VH VH VK VK VK (mistura) (mistura) CDR1 CDR2 CDR3 CDR1 CDR2 CDR3 ACI-41 7C2(2)B9F SEQ ID SEQ ID EVKLMESGGGLVHP DIVMSQSPSSLAVSV GFTFT LIRNKA ALGRY KSSQS WASTR QQYYS 11D5 NO: 53/ NO: 57 e GASLRLYCAASGFTF GEKVTMSCKSSQSL DYYMS NGYTT FDV LLYSS ES YPFT SEQ ID SEQ ID TDYYMSWVRQPPGK LYSSNQKNYLAWYQ (SEQ ID EYTAS (SEQ ID NQKNY (SEQ ID (SEQ ID NO:55 e NO: 51 APEWLALIRNKANGY QKPGQSPKLLIYWA NO: 18) VKG NO: 20) LA(SEQ NO: 33) NO: 34) SEQ ID TTEYTASVKGRFTISR STRESGVPDRFTGS (SEQ ID ID NO: NO: 47 DNSQNILYLQMNTLR GSGTDFTLTISSVKA NO: 19) 32)
AEDSATYYCVKALGR EDLAVYYCQQYYSY
YFDVWGTGTTVTVSS PFTFGSGTKLEIK (SEQ ID NO: 5) (SEQ ID NO: 11) ACI-35 A4-4A6-18 QVQLQQPGAELLKPG DVLMTQTPLSLPVSL GYTFT RIDPNS DDYAW RSSQSI KLSNR FQGSH
ASVKLSCKASGYTFT GDQASISCRSSQSIV SYWM DRTKY FAY VHSNG FS VPPT 188/213 SYWMHWVKQRPGR HSNGNTYLEWYLQK H NEKFK (SEQ ID NTYLE (SEQ ID (SEQ ID GLEWIGRIDPNSDRT PGQSPKLLIYKLSNR (SEQ ID R NO: 72) (SEQ ID NO: 74) NO: 75) KYNEKFKRKATLTVD FSGVPDRFSGSGSG NO: 70) (SEQ ID NO: 73) KSSSTAYMQLSSLTS TDFTLKISRVEAEDL NO: 71)
EDSAVYYCARDDYA GVYYCFQGSHVPPT WFAYWGQGTLVTVS FGGGTKLEIK (SEQ A (SEQ ID NO: 68) ID NO: 69) ACI-35 A6-1D2-12 QVTLKESGPGILQSS NILMTQSPSSLAVSA GFSLS HIYWD LLRPY KSSQS WASTR LQYLS
QTLSLTCSFSGFSLST GEKVTMSCKSSQSV TSGMG DDKRY ALDY VLYSS ES SLT SGMGVSWIRQPSGK LYSSNQKNYLAWYQ VS NASLK (SEQ ID NQKNY (SEQ ID SEQ ID GLEWLAHIYWDDDKR QKPGQSPKLLIYWA (SEQ ID S NO: 80) LA NO: 82) NO: 83) YNASLKSRLTISKDTS STRESGVPDRFTGS NO: 78) (SEQ ID (SEQ ID RNQVFLKITCVDTADT GSGTDFTLTISSVQA NO: 79) NO: 81)
ATYYCARLLRPYALD EDLAVYYCLQYLSSL YWGQGTSVTVSS TFGAGTKLELK (SEQ (SEQ ID NO: 76) ID NO: 77)
Vacina Hibridoma Primer VH Primer VK VH VK VH VH VH VK VK VK (mistura) (mistura) CDR1 CDR2 CDR3 CDR1 CDR2 CDR3 ACI-35 A4-2A1-18 EVQLQQSGPELVKPGDIVMTQAAPSVPVTP GYTFT DINPN EGRFA RSSKS RMSNL MQHLK
GESVSISCRSSKSLL DYYMN
ASVKISCKASGYTFTD NGGTS Y LLHSN AS SPYT YYMNWVKQSHGKSL HSNGNTYLYWFLQR (SEQ ID YNQKF (SEQ ID GNTYL (SEQ ID (SEQ ID EWIGDINPNNGGTSYPGQSPQLLIHRMSNL NO: 89) KG NO: 91) Y NO: 94) NO: 95) NQKFKGKATLTVDKSASGVPDRFSGSGSG (SEQ ID (SEQ ID SSTAYMELRSLTSEDTAFTLRISRVEAEDV NO: 90) NO: 93)
SAVYYCVREGRFAY GVYYCMQHLKSPYT FGGGTKLEIK (SEQ WGHGTLVTVSA (SEQ ID NO: 88) ID NO: 116) ACI-35 A4-2A1-40 EVQLQQSGPELVKPGDIX*MTQAAPSVPVT GYTFT DINPN EGRFA RSSKS RMSNL MQHLK
PGESVSISCRSSKSL DYYMN
ASVKISCKASGYTFTD NGGTS Y LLHSN AS SPYT 189/213 YYMNWVKQSHGKSL LHSNGNTYLYWFLQ (SEQ ID YNQKF (SEQ ID GNTYL (SEQ ID (SEQ ID EWIGDINPNNGGTSYRPGQSPQLLIYRMS NO: 89) KG NO: 91) Y NO: 94) NO: 95) NQKFKGKATLTVDKSNLASGVPDRFSGSG (SEQ ID (SEQ ID SSTAYMELRSLTSEDSGTAFTLRISRVEAE NO: 90) NO: 93)
SAVYYCVREGRFAY DVGVYYCMQHLKSP
YTFGGGTKLEIK WGHGTLVTVSA (SEQ ID NO: 88) (SEQ ID NO: 92) *X = M ou V ACI-35 A4-4A6-48 EVQLQQSGPELVKPG DIVMTQAAPSVPVTP GYTFT DINPN EGRFA RSSKS RMSNL MQHLK
ASVKISCKASGYTFTD GESVSISCRSSKSLL DYYMN NGGTS Y LLHSN AS SPYT YYMNWVKQSHGKSL HSNGNTYLYWFLQR (SEQ ID YNQKF (SEQ ID GNTYL (SEQ ID (SEQ ID EWIGDINPNNGGTSY PGQSPQLLIYRMSNL NO: 89) KG NO: 91) Y NO: 94) NO: 95) NQKFKGKATLTVDKS ASGVPDRFSGSGSG (SEQ ID (SEQ ID SSTAYMELRSLTSED TAFTLRISRVEAEDV NO: 90) NO: 93)
SAVYYCVREGRFAY GVYYCMQHLKSPYT WGHGTLVTVSA (SEQ FGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 88) ID NO: 118)
Vacina Hibridoma Primer VH Primer VK VH VK VH VH VH VK VK VK (mistura) (mistura) CDR1 CDR2 CDR3 CDR1 CDR2 CDR3 ACI-35 A6-2G5-08 QVQLKQSGAELVRPG DVLMTQTPLSLPVSL GYTFT RIYPG FWDVT RSSQSI KVSNR FQGSH
ASVKLSCKASGYTFT GDQASISCRSSQSIV DYYIN RGNIY Y VHSNG FS VPYT DYYINWVKQRPGQGL HSNGNTYLEWFLQK (SEQ ID YNEKF (SEQ ID NTYLE (SEQ ID (SEQ ID EWIARIYPGRGNIYYN PGQSPKLLIYKVSNR NO: 98) KG NO: (SEQ ID NO: NO: EKFKGKATLTAEKSS FSGVPDRFSGSGSG (SEQ ID 100) NO: 102) 103) STAYMQLSSLTSEDS TDFTLKISRVEAEDL NO: 99) 101)
AVYFCARFWDVTYW GVYYCFQGSHVPYT
GQGTLVTVSA FGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 96) (SEQ ID NO: 97) ACI-35 A6-2G5-30 EVQLQQSGPELVKPG DIVMTQSQKFMSTS GFTFT DINPN EGRFA KASQN SASYR QQYNS
ASVKISCKASGFTFTD VGDRVSVTCKASQN DYYMN NGGTS Y VGTNV YS YPYT 190/213 YYMNWVKQSHGKSL VGTNVAWYQQKPG (SEQ ID YHQKF (SEQ ID A (SEQ ID (SEQ ID EWIGDINPNNGGTSY QSPKALIYSASYRYS NO: 89) KG NO: 91) (SEQ ID NO: NO: HQKFKGKATLTVDKS GVPDRFTGSGSGTD (SEQ ID NO: 107) 108) SSTAYMELRSLTSED FTLTISNVQSEDLAE NO: 106) SAVYYCVREGRFAY YFCQQYNSYPYTFG 115)
WGQGTLVTVSA GGTKLEIK (SEQ ID NO: 104) (SEQ ID NO: 105) ACI-35 A6-2G5-41 EVQLQQSGPELVKPG DIVMTQSQKFMSTS GFTFT DINPN EGRFA KASQN SASYR QQYNS
ASVKISCKASGFTFTD VGDRVSVTCKASQN DYYMN NGGTS Y VGTNV YS YPYT YYMNWVKQSHGKSL VGTNVAWYQQKPG (SEQ ID YHQKF (SEQ ID A (SEQ ID (SEQ ID EWIGDINPNNGGTSY QSPKALIYSASYRYS NO: 89) KG NO: 91) (SEQ ID NO: NO: HQKFKGKATLTVDKS GVPDRFTGSGSGTD (SEQ ID NO: 107) 108) SSTAYMELRSLTSED FTLTISNVQSEDLAE NO: 106) SAVYYCVREGRFAY YFCQQYNSYPYTFG 115)
WGQGTLVTVSA GGTKLEIK (SEQ ID NO: 104) (SEQ ID NO: 105) * Duas sequências produtoras de VK (sequências 6 e 7 na Tabela 10, sequências 40 e 41 na Tabela 11) foram isoladas a partir das linhagens de células 3A8A12G7 e 3A8E12H8, as sequências “VK _G” foram preparadas a partir de clones feitos usando a mistura de primers “G” e as sequências “Vk_ AD” a partir de clones feitos utilizando as misturas de primers “A” e “D”. Assim, são produzidos dois anticorpos com diferentes sequências kappa por esses hibridomas.
TABELA 11 SEQUÊNCIA DE NUCLEOTÍDEOS DAS REGIÕES VARIÁVEIS DE CADEIA LEVE E CADEIA PESADA (VH E VK) Primer Primer
VH VK Vacina Hibridoma VH VK (mistur (mistur a) a)
GAGGTCCAGCTGCAACAATCTGGACCTGAACTG GACATTGTGATGACACAGTCTCCATCCTCCCTG VK_AD GTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATATCCTGT GCTATGTCAGTAGGACAGAAGGTCACTATGAGC (SEQ AAGGCTTCTGGATATACGTTCACTGACTACTACA TGCAAGTCCAGTCAGAGTGTTTTTAATAGTGGCA 191/213 SEQ ID ID NO: TGAACTGGGTGAAGCAGAGCCATGGAAAGAGCC ATCAAAAGAACTCTTTGGCCTGGTACCAGCAGA NO: 46 48/ TTGAGTGGATTGGAGATATTAATCCTAACCGTGG AACCAGGACAGTCTCCTAAACTTCTGGTATACTT ACI-36 3A8A12G7* e SEQ SEQ ID TGGAACTACTTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAA TGCATCCACTAGGGAATCTGGGGTCCCTGATCG ID NO: NO: 49/ GGCCACGTTGACTGTAGACAAGTCCTCCAGCAC CTTCATAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCAG 47 e SEQ AGCCTACATGGAACTCCGCAGCCTGACATCTGA TCTTACCATCAGCAGTGTGCAGGCTGAGGACCT ID NO: GGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGTTACTAC GGCAGATTACTTCTGTCAGGAACATTATACCACT 51) GCCGTGGGCTACTGGGGCCAAGGCACCACTCT CCTCCCACGTTCGGTACTGGGACCAAGCTGGAG CACAGTCTCCTCA (SEQ ID NO: 35) CTGAAA (SEQ ID NO: 40)
GAGGTCCAGCTGCAACAATCTGGACCTGAACTG GATGTTGTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTG
GTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATATCCTGT CCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTT VK_G AAGGCTTCTGGATATACGTTCACTGACTACTACA GCAGATCTAGTCAGAGGCTTGTACACAGTCATG SEQ ID (SEQ TGAACTGGGTGAAGCAGAGCCATGGAAAGAGCC GAAAAACCTATTTACATTGGTACCTGCAGAAGCC NO: 46 ID NO: TTGAGTGGATTGGAGATATTAATCCTAACCGTGG AGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTT ACI-36 3A8A12G7* e SEQ 50 e TGGAACTACTTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAA TCCAACCGGTTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTC ID NO: SEQ ID GGCCACGTTGACTGTAGACAAGTCCTCCAGCAC AGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTC 47 NO: AGCCTACATGGAACTCCGCAGCCTGACATCTGA AAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGG 51) GGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGTTACTAC AGTTTATTTCTGTTCTCAAACTGCACATTTTCCGT
GCCGTGGGCTACTGGGGCCAAGGCACCACTCT ACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAA CACAGTCTCCTCA (SEQ ID NO: 35) AA (SEQ ID NO: 41)
Primer Primer
VH VK Vacina Hibridoma VH VK (mistur (mistur a) a)
GAGGTCCAGCTGCAACAATCTGGACCTGAACTG GACATTGTGATGACACAGTCTCCATCCTCCCTG VK_AD GTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATATCCTGT GCTATGTCAGTAGGACAGAAGGTCACTATGAGC (SEQ AAGGCTTCTGGATATACGTTCACTGACTACTACA TGCAAGTCCAGTCAGAGTGTTTTTAATAGTGGCA SEQ ID ID NO: TGAACTGGGTGAAGCAGAGCCATGGAAAGAGCC ATCAAAAGAACTCTTTGGCCTGGTACCAGCAGA NO: 46 48/ TTGAGTGGATTGGAGATATTAATCCTAACCGTGG AACCAGGACAGTCTCCTAAACTTCTGGTATACTT ACI-36 3A8E12H8* e SEQ SEQ ID TGGAACTACTTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAA TGCATCCACTAGGGAATCTGGGGTCCCTGATCG ID NO: NO: 49 GGCCACGTTGACTGTAGACAAGTCCTCCAGCAC CTTCATAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCAG 47 e SEQ AGCCTACATGGAACTCCGCAGCCTGACATCTGA TCTTACCATCAGCAGTGTGCAGGCTGAGGACCT ID NO: GGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGTTACTAC GGCAGATTACTTCTGTCAGGAACATTATACCACT 51) GCCGTGGGCTACTGGGGCCAAGGCACCACTCT CCTCCCACGTTCGGTACTGGGACCAAGCTGGAG CACAGTCTCCTCA (SEQ ID NO: 35) CTGAAA (SEQ ID NO: 40) 192/213
GAGGTCCAGCTGCAACAATCTGGACCTGAACTG GATGTTGTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTG
GTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATATCCTGT CCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTT VK_G AAGGCTTCTGGATATACGTTCACTGACTACTACA GCAGATCTAGTCAGAGGCTTGTACACAGTCATG SEQ ID (SEQ TGAACTGGGTGAAGCAGAGCCATGGAAAGAGCC GAAAAACCTATTTACATTGGTACCTGCAGAAGCC NO: 46 ID NO: TTGAGTGGATTGGAGATATTAATCCTAACCGTGG AGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTT ACI-36 3A8E12H8* e SEQ 50 e TGGAACTACTTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAA TCCAACCGGTTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTC ID NO: SEQ ID GGCCACGTTGACTGTAGACAAGTCCTCCAGCAC AGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTC 47 NO: AGCCTACATGGAACTCCGCAGCCTGACATCTGA AAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGG 51) GGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGTTACTAC AGTTTATTTCTGTTCTCAAACTGCACATTTTCCGT
GCCGTGGGCTACTGGGGCCAAGGCACCACTCT ACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAA CACAGTCTCCTCA (SEQ ID NO: 35) AA (SEQ ID NO: 41)
GAGGTCCAGCTGCAACAATCTGGACCTGAACTG GATGTTGTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTG SEQ ID GTGAAGCCTGGGACTTCAGTGAAGATATCCTGT CCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTT NO: AAGGCTTCTGGATATACGTTCACTGACTACTACA GCAGATCTAGTCAGAGCCTTGTACACAGTCATG
SEQ ID 46/SE TGAACTGGGTGAAGCAGAGCCATGGAAAGAGCC GAAAAACCTATTTACATTGGTACCTGCAGAAGCC NO: 50 2B6A10C1 Q ID TTGAGTGGATTGGAGATATTAATCCTAACCGTGG AGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTT ACI-36 e SEQ 1 NO: 52 TGGAACTACTTACAACCAGAAGTTTAAGGGCAAG TCCAACCGGTTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTC ID NO: e SEQ GCCACGTTGACTGTAGACAAGTCCTCCAGCACA AGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTC 51 ID NO: GCCTACATGGAACTCCGCAGCCTGACATCTGAG AAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGG 47 GACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGTTACTACG AGTTTATTTCTGTTCTCAAACTGCACATTTTCCGT
CCGTGGGCTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCA ACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAA
Primer Primer
VH VK Vacina Hibridoma VH VK (mistur (mistur a) a) CAGTCTCCTCA (SEQ ID NO: 36) AA (SEQ ID NO: 42)
GAGGTCCAGCTGCAACAATCTGGACCTGAACTG GATGTTGTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTG
GTGAAGCCTGGGACTTCAGTGAAGATATCCTGT CCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTT 193/213
SEQ ID AAGGCTTCTGGATATACGTTCACTGACTACTACA GCAGATCTAGTCAGAGCCTTGTACACAGTCATG NO:
SEQ ID TGAACTGGGTGAAGCAGAGCCATGGAAAGAGCC GAAAAACCTATTTACATTGGTACCTGCAGAAGCC 46/SE NO: 50 TTGAGTGGATTGGAGATATTAATCCTAACCGTGG AGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTT
Q ID ACI-36 2B6G7A12 e SEQ TGGAACTACTTACAACCAGAAGTTTAAGGGCAAG TCCAACCGGTTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTC NO: 52 ID NO: GCCACGTTGACTGTAGACAAGTCCTCCAGCACA AGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTC e SEQ 51 GCCTACATGGAACTCCGCAGCCTGACATCTGAG AAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGG ID NO:
GACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGTTACTACG AGTTTATTTCTGTTCTCAAACTGCACATTTTCCGT 47
CCGTGGGCTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCA ACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAA CAGTCTCCTCA (SEQ ID NO: 36) AA (SEQ ID NO: 42)
GATGTTGTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTG GAGGTCCAGCTGCAACAATCTGGACCTGAACTG CCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTT GTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATATCCTGT GCAGATCTAGTCA AAGGCTTCTGGATACACGTTCACTGACTACTACA GAGCCTTCTACACAGTCATGGAAACACCTATTTA SEQ ID SEQ ID TGAACTGGGTGAAGCAGAGCCATGGAAAGAGCC
CATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCA NO: 46 NO: 50 TTGAGTGGATTGGAGATATTAATCCTAACCGTGG 6H1A11C1 AAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGGTTTT ACI-36 e SEQ e SEQ TGGAACTACTTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAA 1 CTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGAT ID NO: ID NO: GGCCACGTTGACTGTAGACACGTCCTCCAGCAC
CAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAG 47 51 AGCCTACATGGAGCTCCGCAGCCTGACATCTGA
TGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTTCTGCT GGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGTTACTAC CTCAAACTGCACATTTTCCGTACACGTTCGGAG
GCCGTGGGCTACTGGGGCCAAGGCACCACTCT GGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA (SEQ ID NO: CACAGTCTCCTCA (SEQ ID NO: 37) 43)
Primer Primer
VH VK Vacina Hibridoma VH VK (mistur (mistur a) a)
GATGTTGTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTG GAGGTCCAGCTGCAACAATCTGGACCTGAACTG CCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTT GTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATATCCTGT GCAGATCTAGTCA AAGGCTTCTGGATACACGTTCACTGACTACTACA GAGCCTTCTACACAGTCATGGAAACACCTATTTA SEQ ID SEQ ID TGAACTGGGTGAAGCAGAGCCATGGAAAGAGCC
CATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCA NO: 46 NO: 50 TTGAGTGGATTGGAGATATTAATCCTAACCGTGG
AAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGGTTTT ACI-36 6H1G6E6 e SEQ e SEQ TGGAACTACTTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAA
CTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGAT ID NO: ID NO: GGCCACGTTGACTGTAGACACGTCCTCCAGCAC
CAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAG 47 51 AGCCTACATGGAGCTCCGCAGCCTGACATCTGA
TGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTTCTGCT GGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGTTACTAC CTCAAACTGCACATTTTCCGTACACGTTCGGAG
GCCGTGGGCTACTGGGGCCAAGGCACCACTCT GGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA (SEQ ID NO: CACAGTCTCCTCA (SEQ ID NO: 37) 194/213 43)
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTT AGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTG GACATTGTGATGACCCAGTCTCACAAATTCATGT
SEQ ID SEQ ID TGCACCCTCTGGATTCACTTTCAGTGACTATGGA CCACATCAGTAGGAGACAGGGTCAGCATCACCT NO: NO: ATGCACTGGGTTCGTCAGGCTCCAGAGAAGGGA GCAAGGCCAGTCAGGATGTGAGTACTGCTGTAG 53/SE 48/SE CTGGAGTGGGTTGCATACATTAGTAGTGGCAGT CCTGGTATCAACAGAAACCAGGACAATCTCCTAA 6C10E5E9 Q ID Q ID AGTACCATCTACTATGGAGACACAGTGAAGGGC ACTACTGATTTACTCGGCATCCTACCGGTACACT ACI-33 C12 NO:54 NO:49 CGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAAC GGAGTCCCTGATCGCTTCACTGGCAGTGGATCT e SEQ e SEQ ACCCTGTTCCTGCAAATGACCAGTCTGAGGTCT GGGACGGATTTCACTTTCACCATCAGCAGTGTG ID NO: ID NO: GAGGACACGGCCATGTATTACTGTGCAAGAAGG CAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGTCAG 47 51 GGACAGCTCAGGCTACGCCTGTTTGCTTACTGG CAACATTATACTACTCCGCTCACGTTCGGTGCTG GGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA GGACCAAGCTGGAGCTGAAA (SEQ ID NO: 44) (SEQ ID NO: 38)
Primer Primer
VH VK Vacina Hibridoma VH VK (mistur (mistur a) a)
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTT AGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTG GACATTGTGATGACCCAGTCTCACAAATTCATGT SEQ ID TGCACCCTCTGGATTCACTTTCAGTGACTATGGA CCACATCAGTAGGAGACAGGGTCAGCATCACCT NO: ATGCACTGGGTTCGTCAGGCTCCAGAGAAGGGA GCAAGGCCAGTCAGGATGTGAGTACTGCTGTAG
SEQ ID 53/SE CTGGAGTGGGTTGCATACATTAGTAGTGGCAGT CCTGGTATCAACAGAAACCAGGACAATCTCCTAA NO: 54 6C10F9C1 Q ID AGTACCATCTACTATGGAGACACAGTGAAGGGC ACTACTGATTTACTCGGCATCCTACCGGTACACT ACI-33 e SEQ 2A11 NO:54 CGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAAC GGAGTCCCTGATCGCTTCACTGGCAGTGGATCT ID NO: e SEQ ACCCTGTTCCTGCAAATGACCAGTCTGAGGTCT GGGACGGATTTCACTTTCACCATCAGCAGTGTG 51 ID NO: GAGGACACGGCCATGTATTACTGTGCAAGAAGG CAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGTCAG 47 GGACAGCTCAGGCTACGCCTGTTTGCTTACTGG CAACATTATACTACTCCGCTCACGTTCGGTGCTG 195/213 GGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA GGACCAAGCTGGAGCTGAAA (SEQ ID NO: 44) (SEQ ID NO: 38)
GAGGTGAAGCTGATGGAATCTGGAGGAGGCTTG GACATTGTGATGTCACAGTCTCCATCCTCCCTAG SEQ ID GTACACCCTGGGGCTTCTCTGAGACTCTACTGT CTGTGTCAGTTGGAGAGAAGGTTACTATGAGCT NO: GCAGCTTCTGGATTCACCTTTACTGATTACTACA
SEQ ID GCAAGTCCAGTCAGAGCCTTTTATATAGTAGCAA 49/SE TGAGCTGGGTCCGCCAGCCTCCAGGGAAGGCA NO: 53/ TCAAAAGAACTACTTGGCCTGGTACCAGCAGAA
Q ID CCTGAGTGGTTGGCTTTGATTAGAAACAAAGCTA
SEQ ID ACCAGGGCAGTCTCCTAAACTGCTGATTTACTG 7C2(1)F10 NO:56/ ATGGTTACACAACAGAGTATACTGCATCTGTTAA ACI-41 NO:55 GGCATCCACTAGGGAATCTGGGGTCCCTGATCG C10D3 SEQ ID GGGTCGGTTCACCATCTCCAGAGATAATTCCCA e SEQ CTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCAC NO: 57 AAACATCCTCTATCTTCAAATGAACACCCTGAGG ID NO: TCTCACCATCAGCAGTGTGAAGGCTGAAGACCT e SEQ GCTGAGGACAGTGCCACTTATTACTGTGTAAAAG 47 GGCAGTTTATTACTGTCAGCAATATTATAGCTAT ID NO: CTCTGGGACGTTACTTCGATGTCTGGGGCACAG
CCATTCACGTTCGGCTCGGGGACAAAGTTGGAA 51 GGACCACGGTCACCGTCTCCTCA (SEQ ID NO: ATAAAA (SEQ ID NO: 45) 39)
Primer Primer
VH VK Vacina Hibridoma VH VK (mistur (mistur a) a)
GAGGTGAAGCTGATGGAATCTGGAGGAGGCTTG GACATTGTGATGTCACAGTCTCCATCCTCCCTAG GTACACCCTGGGGCTTCTCTGAGACTCTACTGT CTGTGTCAGTTGGAGAGAAGGTTACTATGAGCT GCAGCTTCTGGATTCACCTTTACTGATTACTACA SEQ ID GCAAGTCCAGTCAGAGCCTTTTATATAGTAGCAA
TGAGCTGGGTCCGCCAGCCTCCAGGGAAGGCA NO: 53/ SEQ ID TCAAAAGAACTACTTGGCCTGGTACCAGCAGAA
CCTGAGTGGTTGGCTTTGATTAGAAACAAAGCTA SEQ ID NO: 57 ACCAGGGCAGTCTCCTAAACTGCTGATTTACTG 7C2(2)B9F ATGGTTACACAACAGAGTATACTGCATCTGTTAA ACI-41 NO:55 e SEQ GGCATCCACTAGGGAATCTGGGGTCCCTGATCG 11D5 GGGTCGGTTCACCATCTCCAGAGATAATTCCCA e SEQ ID NO: CTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCAC
AAACATCCTCTATCTTCAAATGAACACCCTGAGG ID NO: 51 TCTCACCATCAGCAGTGTGAAGGCTGAAGACCT
GCTGAGGACAGTGCCACTTATTACTGTGTAAAAG 47 GGCAGTTTATTACTGTCAGCAATATTATAGCTAT
CTCTGGGACGTTACTTCGATGTCTGGGGCACAG
CCATTCACGTTCGGCTCGGGGACAAAGTTGGAA GGACCACGGTCACCGTCTCCTCA (SEQ ID NO: ATAAAA (SEQ ID NO: 45) 196/213 39)
CAGGTCCAACTGCAGCAGCCTGGGGCTGAGCTT GATGTTTTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGC CTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAACTGTCCTGC CTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTG AAGGCTTCTGGCTACACCTTCACCAGCTACTGG CAGATCTAGTCAGAGCATTGTACATAGTAATGGA ATGCACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACGAGG AACACCTATTTAGAATGGTACCTGCAGAAACCAG
CCTTGAGTGGATTGGAAGGATTGATCCTAATAGT GCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAACTTTC A4-4A6-18 ACI-35 GATCGTACTAAGTACAATGAGAAGTTCAAGCGCA CAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAG
AGGCCACACTGACTGTAGACAAATCCTCCAGCA TGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAA CAGCCTACATGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTG GATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAG AGGACTCTGCGGTCTATTATTGTGCAAGGGATG TTTATTACTGCTTTCAAGGTTCACATGTTCCTCC
ATTACGCCTGGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGA GACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAA CTCTGGTCACTGTCTCTGCA (SEQ ID NO: 84) A (SEQ ID NO: 85)
CAGGTTACTCTGAAAGAGTCTGGCCCTGGGATA AACATTTTGATGACACAGTCGCCATCATCTCTGG TTGCAGTCCTCCCAGACCCTCAGTCTGACTTGTT CTGTGTCTGCAGGAGAAAAGGTCACTATGAGCT CTTTCTCTGGGTTTTCACTGAGCACTTCTGGTAT GTAAGTCCAGTCAAAGTGTTTTATACAGTTCAAA
GGGTGTGAGCTGGATTCGTCAGCCTTCAGGAAA TCAGAAGAACTACTTGGCCTGGTACCAGCAGAA A6-1D2-12 ACI-35 GGGTCTGGAGTGGCTGGCACACATTTACTGGGA ACCAGGGCAGTCTCCTAAACTGCTGATCTACTG
TGATGACAAGCGCTATAACGCATCCCTGAAGAG GGCATCCACTAGGGAATCTGGTGTCCCTGATCG CCGGCTCACAATCTCCAAGGATACCTCCAGAAA CTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTTAC CCAGGTATTCCTCAAGATCACCTGTGTGGACACT TCTTACCATCAGCAGTGTACAAGCTGAAGACCT GCAGATACTGCCACATACTACTGTGCTCGGTTAC GGCAGTTTATTACTGTCTTCAATACCTCTCCTCG
Primer Primer
VH VK Vacina Hibridoma VH VK (mistur (mistur a) a)
TGCGTCCTTATGCTTTGGACTACTGGGGTCAAG CTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTG GAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA (SEQ ID NO: AAA (SEQ ID NO: 87) 86)
GAGGTCCAGCTGCAACAATCTGGACCTGAGCTG GATATTGTGATGACTCAGGCTGCACCCTCTGTA
GTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATATCCTGT CCTGTCACTCCTGGAGAGTCAGTATCCATCTCCT 197/213
AAGGCTTCTGGATACACGTTCACTGACTACTACA GCAGGTCTAGTAAGAGTCTCCTGCATAGTAATG TGAACTGGGTGAAGCAGAGCCATGGAAAGAGCC GCAACACTTACTTGTATTGGTTCCTGCAGAGGC
TTGAGTGGATTGGAGATATTAATCCTAACAATGG CAGGCCAGTCTCCTCAGCTCCTGATACATCGGA ACI-35 A4-2A1-18 TGGTACTAGCTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAA TGTCCAACCTTGCCTCAGGAGTCCCAGACAGGT
GGCCACATTGACTGTAGACAAGTCCTCCAGCAC TCAGTGGCAGTGGGTCAGGAACTGCTTTCACAC AGCCTACATGGAGCTCCGCAGTCTGACATCTGA TGAGAATCAGTAGAGTGGAGGCTGAGGATGTGG GGACTCTGCAGTCTATTATTGTGTAAGAGAGGG GTGTTTATTACTGTATGCAACATCTAAAATCTCC
GCGGTTTGCTTACTGGGGTCATGGGACTCTGGT GTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAA CACTGTCTCTGCA (SEQ ID NO: 109) TAAAA (SEQ ID NO: 117) GATATTR*TGATGACTCAGGCTGCACCCTCTGTA
GAGGTCCAGCTGCAACAATCTGGACCTGAGCTG CCTGTCACTCCTGGAGAGTCAGTATCCATCTCCT GTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATATCCTGT GCAGGTCTAGTAAGAGTCTCCTGCATAGTAATG AAGGCTTCTGGATACACGTTCACTGACTACTACA GCAACACTTACTTGTATTGGTTCCTGCAGAGGC TGAACTGGGTGAAGCAGAGCCATGGAAAGAGCC CAGGCCAGTCTCCTCAGCTCCTGATATATCGGA TTGAGTGGATTGGAGATATTAATCCTAACAATGG
TGTCCAACCTTGCCTCAGGAGTCCCAGACAGGT ACI-35 A4-2A1-40 TGGTACTAGCTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAA
TCAGTGGCAGTGGGTCAGGAACTGCTTTCACAC GGCCACATTGACTGTAGACAAGTCCTCCAGCAC TGAGAATCAGTAGAGTGGAGGCTGAGGATGTGG AGCCTACATGGAGCTCCGCAGTCTGACATCTGA GTGTTTATTACTGTATGCAACATCTAAAATCTCC GGACTCTGCAGTCTATTATTGTGTAAGAGAGGG GTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAA
GCGGTTTGCTTACTGGGGTCATGGGACTCTGGT TAAAA (SEQ ID NO: 110) CACTGTCTCTGCA (SEQ ID NO: 109) R* = A ou G
Primer Primer
VH VK Vacina Hibridoma VH VK (mistur (mistur a) a)
GAGGTCCAGCTGCAACAATCTGGACCTGAGCTG GATATTGTGATGACTCAGGCTGCACCCTCTGTA GTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATATCCTGT CCTGTCACTCCTGGAGAGTCAGTATCCATCTCCT AAGGCTTCTGGATACACGTTCACTGACTACTACA GCAGGTCTAGTAAGAGTCTCCTGCATAGTAATG TGAACTGGGTGAAGCAGAGCCATGGAAAGAGCC GCAACACTTACTTGTATTGGTTCCTGCAGAGGC
TTGAGTGGATTGGAGATATTAATCCTAACAATGG CAGGCCAGTCTCCTCAGCTCCTGATATATCGGA ACI-35 A4-4A6-48 TGGTACTAGCTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAA TGTCCAACCTTGCCTCAGGAGTCCCAGACAGGT
GGCCACATTGACTGTAGACAAGTCCTCCAGCAC TCAGTGGCAGTGGGTCAGGAACTGCTTTCACAC AGCCTACATGGAGCTCCGCAGTCTGACATCTGA TGAGAATCAGTAGAGTGGAGGCTGAGGATGTGG GGACTCTGCAGTCTATTATTGTGTAAGAGAGGG GTGTTTATTACTGTATGCAACATCTAAAATCTCC
GCGGTTTGCTTACTGGGGTCATGGGACTCTGGT GTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAA CACTGTCTCTGCA (SEQ ID NO: 109) TAAAA (SEQ ID NO: 119) 198/213
CAGGTCCAGCTGAAGCAGTCTGGGGCTGAGCT GATGTTTTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGC GGTGAGGCCTGGGGCTTCAGTGAAACTGTCCTG CTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTG CAAGGCTTCTGGCTACACTTTCACTGACTACTAT CAGATCTAGTCAGAGCATTGTACATAGTAATGGA ATAAACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAGGGA AACACCTATTTAGAATGGTTCCTGCAGAAACCAG
CTTGAGTGGATTGCAAGGATTTATCCTGGAAGA GCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTC ACI-35 A6-2G5-08 GGTAATATTTACTACAATGAGAAGTTCAAGGGCA CAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAG
AGGCCACACTGACTGCAGAAAAATCCTCCAGCA TGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAA CTGCCTACATGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTG GATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAG AGGACTCTGCTGTCTATTTCTGTGCAAGATTCTG TTTATTACTGCTTTCAAGGTTCACATGTTCCGTA
GGACGTGACTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGT CACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAA CACTGTCTCTGCA (SEQ ID NO: 111) A (SEQ ID NO: 112)
GAGGTCCAGCTGCAACAATCTGGACCTGAGCTG GACATTGTGATGACCCAGTCTCAAAAATTCATGT GTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATATCCTGT CCACATCAGTAGGAGACAGGGTCAGCGTCACCT AAGGCTTCTGGATTCACGTTCACTGACTACTACA GCAAGGCCAGTCAGAATGTGGGTACTAATGTAG TGAACTGGGTGAAGCAGAGCCATGGAAAGAGCC CCTGGTATCAACAGAAACCAGGGCAATCTCCTA
TTGAGTGGATTGGAGATATTAATCCTAACAATGG AAGCACTGATTTACTCGGCATCCTACCGGTACA ACI-35 A6-2G5-30
TGGTACTAGCTACCACCAGAAGTTCAAGGGCAA GTGGAGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGAT GGCCACATTGACTGTAGACAAGTCCTCCAGCAC CTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAATGT AGCCTACATGGAGCTCCGCAGCCTGACATCTGA GCAGTCTGAAGACTTGGCAGAGTATTTCTGTCA GGACTCTGCAGTCTATTACTGTGTAAGAGAGGG GCAATATAACAGCTATCCGTACACGTTCGGAGG AAGATTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGT GGGGACCAAGCTGGAAATAAAA (SEQ ID NO:
Primer Primer
VH VK Vacina Hibridoma VH VK (mistur (mistur a) a) CACTGTCTCTGCA (SEQ ID NO: 113) 114)
GAGGTCCAGCTGCAACAATCTGGACCTGAGCTG GACATTGTGATGACCCAGTCTCAAAAATTCATGT
GTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATATCCTGT CCACATCAGTAGGAGACAGGGTCAGCGTCACCT 199/213
AAGGCTTCTGGATTCACGTTCACTGACTACTACA GCAAGGCCAGTCAGAATGTGGGTACTAATGTAG TGAACTGGGTGAAGCAGAGCCATGGAAAGAGCC CCTGGTATCAACAGAAACCAGGGCAATCTCCTA
TTGAGTGGATTGGAGATATTAATCCTAACAATGG AAGCACTGATTTACTCGGCATCCTACCGGTACA ACI-35 A6-2G5-41 TGGTACTAGCTACCACCAGAAGTTCAAGGGCAA GTGGAGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGAT
GGCCACATTGACTGTAGACAAGTCCTCCAGCAC CTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAATGT AGCCTACATGGAGCTCCGCAGCCTGACATCTGA GCAGTCTGAAGACTTGGCAGAGTATTTCTGTCA
GGACTCTGCAGTCTATTACTGTGTAAGAGAGGG GCAATATAACAGCTATCCGTACACGTTCGGAGG AAGATTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGT GGGGACCAAGCTGGAAATAAAA (SEQ ID NO: CACTGTCTCTGCA (SEQ ID NO: 113) 114) * Duas sequências produtoras de VK (sequências 6 e 7 na Tabela 10, sequências 40 e 41 na Tabela 11) foram isoladas a partir das linhagens de células 3A8A12G7 e 3A8E12H8, as sequências “VK _G” foram preparadas a partir de clones feitos usando a mistura de primers “G” e as sequências “Vk_ AD” a partir de clones feitos utilizando as misturas de primers “A” e “D”. Assim, são produzidos dois anticorpos com diferentes sequências kappa por esses hibridomas. TABELA 12
PRIMERS UTILIZADOS PARA O SEQUENCIAMENTO DA CDR DE REGIÕES VARIÁVEIS DE ANTICORPO
Ac SEQ ID Subclone Sequência do Primer isotípico NO 3A8A 12G7 IgG2b Primers VH 5’ GGGAATTCATGRAATGSASCTGGGTYWTYCTCTT 46 3’ CCCAAGCTTCCAGGGRCCARKGGATARACIGRTGG 47 Primers VK 5’ GGGAATTCATGRAGWCACAKWCYCAGGTCTTT 48 AD ACTAGTCGACATGGGCWTCAAGATGRAGTCACAKWYYCWGG 49 5’ G ACTAGTCGACATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCT 50 3’ CCCAAGCTTACTGGATGGTGGGAAGATGGA 51 3A8E 12H8 IgG2b Primers VH 5’ GGGAATTCATGRAATGSASCTGGGTYWTYCTCTT 46 3’ CCCAAGCTTCCAGGGRCCARKGGATARACIGRTGG 47 Primers VK 5’ GGGAATTCATGRAGWCACAKWCYCAGGTCTTT 48
200/213 AD ACTAGTCGACATGGGCWTCAAGATGRAGTCACAKWYYCWGG 49 5’ G ACTAGTCGACATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCT 50 3’ CCCAAGCTTACTGGATGGTGGGAAGATGGA 51 2B6A 10C11 IgG2b Primers VH 5’ GGGAATTCATGRAATGSASCTGGGTYWTYCTCTT 46 ACTAGTCGACATGGGATGGAGCTRTATCATSYTCTT 52 3’ CCCAAGCTTCCAGGGRCCARKGGATARACIGRTGG 47 Primers VK 5’ ACTAGTCGACATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCT 50 3’ CCCAAGCTTACTGGATGGTGGGAAGATGGA 51 2B6G 7A12 IgG2b Primers VH 5’ GGGAATTCATGRAATGSASCTGGGTYWTYCTCTT 46 ACTAGTCGACATGGGATGGAGCTRTATCATSYTCTT 52 3’ CCCAAGCTTCCAGGGRCCARKGGATARACIGRTGG 47 Primers VK 5’ ACTAGTCGACATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCT 50 3’ CCCAAGCTTACTGGATGGTGGGAAGATGGA 51 6H1A11C11 IgG2b Primers VH 5’ GGGAATTCATGRAATGSASCTGGGTYWTYCTCTT 46 3’ CCCAAGCTTCCAGGGRCCARKGGATARACIGRTGG 47 Primers VK 5’ ACTAGTCGACATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCT 50
Ac SEQ ID Subclone Sequência do Primer isotípico NO 3’ CCCAAGCTTACTGGATGGTGGGAAGATGGA 51 6H1G 6E6 IgG2b Primers VH 5’ GGGAATTCATGRAATGSASCTGGGTYWTYCTCTT 46 3’ CCCAAGCTTCCAGGGRCCARKGGATARACIGRTGG 47 Primers VK 5’ ACTAGTCGACATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCT 50 3’ CCCAAGCTTACTGGATGGTGGGAAGATGGA 51 6C10F9 IgG3 Primers VH 5’ GGGAATTCATGRASTTSKGGYTMARCTKGRTTT 53 C12A11 ACTAGTCGACATGGACTCCAGGCTCAATTTAGTTTTCCT 54 3’ CCCAAGCTTCCAGGGRCCARKGGATARACIGRTGG 47 Primers VK 5’ ACTAGTCGACATGGACTCCAGGCTCAATTTAGTTTTCCT 54
201/213 3’ CCCAAGCTTACTGGATGGTGGGAAGATGGA 51 6C10E5E IgG3 Primers VH 5’ GGGAATTCATGRASTTSKGGYTMARCTKGRTTT 53 9C12 ACTAGTCGACATGGACTCCAGGCTCAATTTAGTTTTCCT 54 3’ CCCAAGCTTCCAGGGRCCARKGGATARACIGRTGG 47 Primers VK 5’ GGGAATTCATGRAGWCACAKWCYCAGGTCTTT 48 ACTAGTCGACATGGGCWTCAAGATGRAGTCACAKWYYCWGG 49 3’ CCCAAGCTTACTGGATGGTGGGAAGATGGA 51 7C2(1)F10C IgG2b Primers VH 5’ GGGAATTCATGRASTTSKGGYTMARCTKGRTTT 53 10D3 ACTAGTCGACATGAAGWTGTGGBTRAACTGGRT 55 3’ CCCAAGCTTCCAGGGRCCARKGGATARACIGRTGG 47 Primers VK 5’ ACTAGTCGACATGGAGWCAGACACACISCTGYTATGGGT 56 ACTAGTCGACATGGGCWTCAAGATGRAGTCACAKWYYCWGG 49 ACTAGTCGACATGGTYCTYATVTTRCTGCTGCTATGG 57 3’ CCCAAGCTTACTGGATGGTGGGAAGATGGA 51
Ac SEQ ID Subclone Sequência do Primer isotípico NO 7C2(2)B9F IgG2b Primers VH 5’ GGGAATTCATGRASTTSKGGYTMARCTKGRTTT 53 11D5 ACTAGTCGACATGAAGWTGTGGBTRAACTGGRT 55
3’ CCCAAGCTTCCAGGGRCCARKGGATARACIGRTGG 47 Primers VK 5’ ACTAGTCGACATGGTYCTYATVTTRCTGCTGCTATGG 57
3’ CCCAAGCTTACTGGATGGTGGGAAGATGGA 51
A6-2G5-08 IgG2a Primers VH 5’ GGGAATTCATGGAATGCAGCTGGGTTTTTCTCTT 120 GGGAATTCATGGAATGGAGCTGGGTCTTTCTCTT 121
202/213 GGGAATTCATGGAATGCAGCTGGGTCATTCTCTT 122 GGGAATTCATGGAATGGAGCTGGGTTTTTCTCTT 123 GGGAATTCATGGAATGGAGCTGGGTTATTCTCTT 124 GGGAATTCATGAAATGGAGCTGGGTCTTTTCTT 125 GGGAATTCATGGAATGCAGCTGGGTCTTCCTCTT 126 GGGAATTCATGGAATGGAGCTGGGTTTTCCTCTTC 127 3’ CCCAAGCTTCCAGGGACCAATGGATAACGGGTGG 128 CCCAAGCTTCCAGGGACCAATGGATAAACGATGG 129 CCCAAGCTTCCAGGGACCAATGGATAAACGGTGG 130 CCCAAGCTTCCAGGGACCAATGGATAAACGGATGG 131 CCCAAGCTTCCAGGGACCAGTGGATAGACGGGTGG 132 CCCAAGCTTCCAGGGACCAAGGGATAGATGATGG 133 CCCAAGCTTCCAGGGGCCAATGGATAAACGGGTGG 134 CCCAAGCTTCCAGGGGCCAATGGATAAACGATGG 135 Primers VK 5’ ACTAGTCGACATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCT 50 3’ CCCAAGCTTACTGGATGGTGGGAAGATGGA 51
Ac SEQ ID Subclone Sequência do Primer isotípico NO A4-2A1-18 IgG2b Primers VH 5’ GGGAATTCATGGAATGGAGCTGGGTCATTCTCTT 136 GGGAATTCATGGAATGCAGCTGGGTTTTTCTCTT 120 GGGAATTCATGGAATGGAGCTGGGTTTTTCTCTT 123 GGGAATTCATGGAATGCACCTGGGTTTTCCTCTT 137 GGGAATTCATGGAATGGAGCTGGGTCTTCCTCTT 138 GGGAATTCATGGAATGGAGCTGGGTCATCCTCTT 139 GGGAATTCATGGAATGGAGCTGGGTTATTCTCTT 124 ACTAGTCGACATGGGATGAGCTTATCATCCTCTT 140 3’ CCCAAGCTTCCAGGGGCCAATGGATAACGGTGG 141
203/213 CCCAAGCTTCCAGGGACCAGTGGGATAAACGGGTGG 142 CCCAAGCTTCCAGGGGCCAATGGATAAACGGGTGG 134 CCCAAGCTTCCAGGGACCAAGGGATAGACGGGTGG 143 CCCAAGCTTCCAGGGACCAAGGGATAAACGGATGG 144 CCCAAGCTTCCAGGGACCAGGGGATAAACGGATGG 145 CCCAAGCTTCCAGGGACCAATGGATAAACGGATGG 131 CCCAAGCTTCCAGGGGCCAGGGATAAACGGGTGG 146 CCCAAGCTTCCAGGGGCCAATGGATAAACCGGTGG 147 CCCAAGCTTCCAGGGACCAGTGGATAAACGGTGG 148 Primers VK 5’ ACTAGTCGACATGGTGTCCACAGCTCAGTTCCTTG 149 3’ CCCAAGCTTACTGGATGGTGGGAAGATGGA 51
Ac SEQ ID Subclone Sequência do Primer isotípico NO A6-2G5-30 IgG2b Primers VH 5’ GGGAATTCATGAAATGGAGCTGGGTCTTCCTCTT 150 GGGAATTCATGGAATGCAGCTGGGTTATTCTCTT 151 GGGAATTTATGGAATGGAGCTGGGTCTTCCTCTT 152 GGGAATTCATGGAATGGAGCTGGGTTTTCCTCTT 127 GGGAATTCATGGAATGCAGCTGGGTCATCCTCTT 153 GGGAATTCATGGAATGGAGCTGGGTTATTCTCTT 124 GGGAATTCATGGAATGCAGCTGGGTTTTCCTCTT 154 GGGAATTCATGGAATGCAGCTGGGTCTTTCTCTT 155 ACTAGTCGACATGGGATGGAGCTATATCATCCTCTT 156 ACTAGTCGACATGGGATGGAGCTTATCATCTTCTT 157
204/213 ACTAGTCGACATGTAGATGTGGTTAAACTGGGT 158 3’ CCCAAGCTTCCAGGGGCCAGGGGATAAACGGATGG 159 CCCAAGCTTCCAGGGGCCAAGGGATAGACGGATGG 160 CCCAAGCTTCCAGGGACCAGGGGATAGACGGGTGG 161 CCCAAGCTTCCAGGGACCAGGGGATAGACGGATGG 162 CCCAAGCTTCCAGGGGCCAGTGGATAAACGGATGG 163 CCCAAGCTTCCAGGGGCCAATGGATAACGATGG 164 CCCAAGCTTCCAGGGGCCAGTGGATAAACGATGG 165 CCCAAGCTTCCAGGGACCAATGGATAAACGGTGG 130 CCCAAGCTTCCAGGGACCAGTGGATAAACGATGG 166 CCCAAGCTTCCAGGGACCAATGGATAACGATGG 167 CCCAAGCTTCCAGGGACCATGGATAAACGGGTGG 168
Ac SEQ ID Subclone Sequência do Primer isotípico NO Primers VK 5’ ACTAGTCGACATGGGCATCAAGATGAAGTCACATACTCTGG 169 ACTAGTCGACATGGGCATCAAGATGAGTCACATACTCTGG 170 ACTAGTCGACTGGGCATCAGATGAGTCACATACTCTGG 171 ACTAGTCGACATGGGCATCAAGATGAAGTCACAGACCCAGG 172 ACTAGTCGACATGGGCTTCAAGATGAAGTCACATTCTCTGG 173 ACTAGTCGACATGGGCTTCAAGATGAAGTCACATATTCAGG 174 CCCAAGCTTACTGGATGGTGGGAAGATGGA 51 3’ CCCAAGCTTACTGGATGGTGGGAAGATGGA 51 A4-2A1-40 IgG2b Primers VH 5’ GGGAATTCATGGAATGGAGCTGGGTCATCCTCTT 139 205/213 GGGAATTCATGGAATGCAGCTGGGTTTTCCTCTT 154 GGGAATTCATGGAATGCAGCTGGGTCTTTCTCTT 155 GGGAATTCATGGAATGGAGCTGGGTTTTCCTCTT 127 GGGAATTCATGGAATGGAGCTGGGTCTTTCTCTT 121 ACTAGTCGACATGGATGGAGCTTATCATCCTCTT 175 3’ CCCAAGCTTCCAGGGACCAAGGGATAAACGGTGG 176 CCCAAGCTTCCAGGGGCCAATGGATAAACCGGTGG 147 CCCAAGCTTCCAGGGACCAATGGATAAACGATGG 129 CCCAAGCTTCCAGGGGCCAGTGGATAAACGGGTGG 177 CCCAAGCTTCCAGGGACCAATGGATAACGGGTGG 128 Primers VK 5’ ACTAGTCGACATGAGGTACTCGGCTCAGTTCCTGGG 178
ACTAGTCGACATGAGGTCCCCGGCTCAGTTCCTGGG ACTAGTCGACATGAGGACGTCGATTCAGTTCTTGGG 179 180 3’ CCCAAGCTTACTGGATGGTGGGAAGATGGA 51
Ac SEQ ID Subclone Sequência do Primer isotípico NO A6-2G5-41 IgG2b Primers VH 5’ GGGAATTCATGGAATGGACCTGGGTCATCCTCTT 181 GGGAATTCATGGAATGCAGCTGGGTTTTTCTCTT 120 GGGAATTCATGGAATGCAGCTGGGTTATCCTCTT 182 GGGAATTCATGGAATGGAGCTGGGTTATTCTCTT 124 GGGAATTCATGGAATGCAGCTGGGTCTTCCTCTT 126 GGGAATTCATGAATGGATCTGGGTTATTCTCTT 183 3’ CCCAAGCTTCCAGGGACCAGGGGATAAACGGGTGG 184 CCCAAGCTTCCAGGGACCAAGGGACGGGTGG 185 CCCAAGCTTCCAGGGACCAATGGATAAACAGATGG 186
206/213 CCCAAGCTTCCAGGGACCAAGGGATAAACGGATGG 144 CCCAAGCTTCCAGGGACCAGGGGATAAACGGATGG 145 CCCAAGCTTCCAGGGACCAAGGGATAAACGGGTGG 187 Primers VK 5’ GGGAATTCATGGAGACACATTCCCAGGTCTTT 188 GGGAATTCATGGAGTCACAGTCTCAGGTCTTT 189 ACTAGTCGACATGGGCTTCAAGATGGAGTCACATTTTCAGG 190 ACTAGTCGACATGGGCATCAAGATGAAGTCACATATTCAGG 191 ACTAGTCGACATGGGCTTCAAGATGAAGTCACATTCTCAGG 192 CCCAAGCTTACTGGATGGTGGGAAGATGGA 51 3’ CCCAAGCTTACTGGATGGTGGGAAGATGGA 51
Ac SEQ ID Subclone Sequência do Primer isotípico NO A4-4A6-48 IgG2b Primers VH 5’ ACTAGTCGACATGGGATGGAGCTTATCATGTTCTT 193 ACTAGTCGACATGGGATGGAGCTTATCATGCTCTT 194 GGGAATTCATGGAATGCACCTGGGTTTTCCTCTT 137 GGGAATTCATGGAATGGACCTGGGTTTTCCTCTT 195 GGGAATTCATGGAATGGACCTGGGTCTTTCTCTT 196 GGGAATTCATGAAATGGAGCTGGGTTATTCTCTT 197 GGGAATTCATGGAATGCAGCTGGGTTATTCTCTT 151 GGGAATTCATGGAATGGAGCTGGGTCTTTCTCTT 121 3’ CCCAAGCTTCCAGGGGCCAATGGATAGACGATGG 198
207/213 CCCAAGCTTCCAGGGACCAAGGGATAGACGGATGG 199 CCCAAGCTTCCAGGGACCAAGGGATAGACGATGG 200 CCCAAGCTTCCAGGGGCCAATGGATAACGGTGG 141 CCCAAGCTTCCAGGGACCAGTGGATAAACGATGG 166 CCCAAGCTTCCAGGGACCAATGGATAAACGGATGG 131 CCCAAGCTTCCAGGGACCAAGGGATAAACGGATGG 144 Primers VK 5’ ACTAGTCGACATGATGTACCCGGCTCAGTTTCTGGG 201 ACTAGTCGACATGAGGACTTCGATTCAGTTCTTGGG 202 ACTAGTCTACATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCT 203 ACTAGTCGACATGAAGTTGTCTGTTAGGCTGTTGGTGCT 204 ACTAGTCGACATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCT 50 3’ CCCAAGCTTACTGGATGGTGGGAAGATGGA 51
Ac SEQ ID Subclone Sequência do Primer isotípico NO A4-4A6-18 IgG2b Primers VH 5’ 205 206
ATGGGATGGAGCTRTATCATSYTCTT 207
ATGAAGWTGTGGBTRAACTGGRT
ATGGRATGGASCKKIRTCTTTMTCT 3’ CCAGGGRCCARKGGATARACIGRTGG 208 Primers VK 5’ ATGGAGACAGACACACTCCTGCTAT 209 ATGGAGWCAGACACACTSCTGYTATGGGT 210 208/213 ATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCT 211 ATGGATTTWCARGTGCAGATTWTCAGCTT 212 ATGGTYCTYATVTCCTTGCTGTTCTGG 213 ATGGTYCTYATVTTRCTGCTGCTATGG 214 3’ ACTGGATGGTGGGAAGATGGA 215 A6-1D2-12 IgG2a Primers VH 5’ 216 217 ATGAAATGCAGCTGGRTYATSTTCTT 218
ATGGRCAGRCTTACWTYYTCATTCCT
ATGATGGTGTTAAGTCTTCTGTACCT 3’ CCAGGGRCCARKGGATARACIGRTGG 208
Ac SEQ ID Subclone Sequência do Primer isotípico NO Primers VK 5’ ATGRAGWCACAKWCYCAGGTCTTT 219 ATGGAGACAGACACACTCCTGCTAT 209 ATGGAGWCAGACACACTSCTGYTATGGGT 210 ATGAGGRCCCCTGCTCAGWTTYTTGGIWTCTT 220 ATGGGCWTCAAGATGRAGTCACAKWYYCWGG 221 ATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCT 211 ATGGATTTWCARGTGCAGATTWTCAGCTT 212 ATGGTYCTYATVTCCTTGCTGTTCTGG 213 ATGGTYCTYATVTTRCTGCTGCTATGG 214
209/213 3’ ACTGGATGGTGGGAAGATGGA 215
CÓDONS DEGENERADOS: R = A ou G S = C ou G D = A ou G ou T B = C ou G ou T Y = C ou T M = A ou C H = A ou C ou T
K = G ou T W = A ou T V = A ou G ou C
TABELA 13 A ISOFORMA DA TAU HUMANA MAIS LONGA (441AA), TAMBÉM DENOMINADA DE TAU40 Isoforma mais longa da Tau humana MAEPRQEFEV MEDHAGTYGL (441 aa), também chamada de Tau40 GDRKDQGGYT MHQDQEGDTD (SEQ ID NO: 67) AGLKESPLQT PTEDGSEEPG
SETSDAKSTP TAEDVTAPLV Proteína Tau associada à DEGAPGKQAA AQPHTEIPEG microtúbulos isoforma 2 [Homo TTAEEAGIGD TPSLEDEAAG sapiens] HVTQARMVSK SKDGTGSDDK
KAKGADGKTK IATPRGAAPP Referência da Sequência no NCBI: GQKGQANATR IPAKTPPAPK NP_005901.2 TPPSSGEPPK SGDRSGYSSP
GSPGTPGSRS RTPSLPTPPT REPKKVAVVR TPPKSPSSAK SRLQTAPVPM PDLKNVKSKI GSTENLKHQP GGGKVQIINK KLDLSNVQSK CGSKDNIKHV PGGGSVQIVY KPVDLSKVTS KCGSLGNIHH KPGGGQVEVK SEKLDFKDRV QSKIGSLDNI THVPGGGNKK IETHKLTFRE NAKAKTDHGA EIVYKSPVVS
GDTSPRHLSN VSSTGSIDMV DSPQLATLAD EVSASLAKQG L (SEQ ID NO: 67)
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Claims (58)

REIVINDICAÇÕES
1. ANTICORPO, ou uma parte funcional do mesmo, caracterizado pelo fato de que o anticorpo reconhece e se liga especificamente a um fosfo-epítopo na proteína Tau de mamífero ou a um fragmento da mesma, em que dito anticorpo ou fragmento de anticorpo tem uma alta afinidade de ligação à proteína Tau solúvel e insolúvel, e modula os níveis de Tau solúvel e insolúvel.
2. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1, ou um fragmento funcional do mesmo, caracterizado pelo fato de que dito anticorpo ou fragmento de anticorpo modula os níveis de Tau solúvel e insolúvel no cérebro de um mamífero.
3. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 2, ou um fragmento funcional do mesmo, caracterizado pelo fato de que dito anticorpo ou fragmento de anticorpo modula os níveis de Tau solúvel e insolúvel no córtex cerebral e/ou hipocampo.
4. ANTICORPO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 3, ou um fragmento funcional do mesmo, caracterizado pelo fato de que dito anticorpo ou fragmento de anticorpo reduz os níveis de proteína Tau solúvel total.
5. ANTICORPO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 4, ou um fragmento funcional do mesmo, caracterizado pelo fato de que dito anticorpo ou fragmento de anticorpo reduz os níveis de proteína Tau fosforilada solúvel.
6. ANTICORPO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 5, ou um fragmento funcional do mesmo, caracterizado pelo fato de que dito anticorpo ou fragmento de anticorpo reduz os níveis de filamentos helicoidais pareados contendo proteína Tau hiperfosforilada.
7. ANTICORPO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 6, ou um fragmento funcional do mesmo, caracterizado pelo fato de que dito anticorpo ou fragmento de anticorpo reduz os níveis de proteína Tau solúvel total, proteína Tau fosforilada solúvel e filamentos helicoidais pareados pTau.
8. ANTICORPO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 7, ou um fragmento funcional do mesmo, caracterizado pelo fato de que dito mamífero é um humano.
9. ANTICORPO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 8, ou um fragmento funcional do mesmo, caracterizado pelo fato de que dito anticorpo ou fragmento de anticorpo tem uma constante de dissociação menor que 10 nM.
10. ANTICORPO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 9, ou um fragmento funcional do mesmo, caracterizado pelo fato de que dito anticorpo ou fragmento de anticorpo tem uma constante de dissociação menor que 5 nM, menor que 2 nM, menor que 1 nM, menor que 500 pM, menor que 300 pM , menor que 200 pM, menor que 100 pM.
11. ANTICORPO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 10, ou um fragmento funcional do mesmo, caracterizado pelo fato de que dito anticorpo ou fragmento de anticorpo tem uma constante de velocidade de associação de 104 M-1s-1 ou maior; de 105 M-1s-1 ou maior, de 106 M-1s-1 ou maior.
12. ANTICORPO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 11, ou um fragmento funcional do mesmo, caracterizado pelo fato de que dito anticorpo ou fragmento de anticorpo tem uma alta afinidade de ligação com uma constante de dissociação menor que 4 nM e uma constante de velocidade de associação de 105 M-1s-1 ou maior; ou uma constante de dissociação menor que 3 nM e uma constante de velocidade de associação de 106 M-1s-1 ou maior; ou uma constante de dissociação menor que 2 nM e uma constante de velocidade de associação de 104 M-1s-1 ou maior; ou uma constante de dissociação menor que 1 nM e uma constante de velocidade de associação de 105 M-1s-1 ou maior; ou uma constante de dissociação menor que 200 pM e uma constante de velocidade de associação de 105 M-1s-1 ou maior; ou uma constante de dissociação menor que 100 pM e uma constante de velocidade de associação de 106 M-1s-1 ou maior.
13. ANTICORPO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 12, ou um fragmento funcional do mesmo, caracterizado pelo fato de que dito anticorpo ou fragmento de anticorpo se liga a um epítopo selecionado a partir do grupo que consiste em aa Tau 15-20 compreendendo uma Tyr fosforilada na posição 18 (Y18), aa Tau 405-412 compreendendo uma Ser fosforilada na posição 409 (pS409), aa Tau 405-411 compreendendo uma Ser fosforilada na posição 409 (pS409); aa Tau 208-218 compreendendo uma Thr fosforilada na posição 212 (pT212) e uma Ser fosforilada na posição (pS214); aa Tau 393-401 compreendendo uma Ser fosforilada na posição 396 (pS396), aa Tau 396-401 compreendendo uma Ser fosforilada na posição 396 (pS396), aa Tau 394-400 compreendendo uma Ser fosforilada na posição 396 (pS396 ), aa Tau 402-406 compreendendo uma Ser fosforilada na posição 404 (pS404), e aa Tau 393-400 compreendendo uma Ser fosforilada na posição 396 (pS396).
14. ANTICORPO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 13, ou um fragmento funcional do mesmo, caracterizado pelo fato de que dito anticorpo ou fragmento de anticorpo se liga a um epítopo compreendendo aa Tau 405-412 ou aa Tau 405-411 com uma Ser fosforilada na posição 409 (pS409).
15. ANTICORPO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 14, ou um fragmento funcional do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende um primeiro domínio de ligação que contém,
particularmente em sequência, uma CDR1 com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 21, 24, 27, 28, 29, 32, 73, 81, 93, 101, 106, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 70%, particularmente pelo menos
80%, particularmente pelo menos 85%, particularmente pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%,
particularmente pelo menos 95%, particularmente pelo menos 96%,
particularmente pelo menos 97%, particularmente pelo menos 98%,
particularmente pelo menos 99% ou 100% idêntica à mesma; uma CDR2 com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 22, 25, 30, 33, 74,
82, 94, 102, 107, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%,
particularmente pelo menos 95%, particularmente pelo menos 96%,
particularmente pelo menos 97%, particularmente pelo menos 98%,
particularmente pelo menos 99% ou 100% idêntica à mesma; e uma CDR3 com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 23, 26, 31, 34,
75, 83, 95, 103, 108, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 60%,
particularmente pelo menos 70%, particularmente pelo menos 80%,
particularmente pelo menos 85%, particularmente pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%,
particularmente pelo menos 95%, particularmente pelo menos 96%,
particularmente pelo menos 97%, particularmente pelo menos 98%,
particularmente pelo menos 99% ou 100% idêntica à mesma; e/ou um segundo domínio de ligação que contém em sequência uma CDR1 com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 12, 15, 18, 70, 78, 89, 98, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos
92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, particularmente pelo menos 95%,
particularmente pelo menos 96%, particularmente pelo menos 97%,
particularmente pelo menos 98%, particularmente pelo menos 99% ou 100% idêntica à mesma; uma CDR2 com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 13, 16, 19, 71, 79, 90, 99, 115, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 80%, particularmente pelo menos 85%, particularmente pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, particularmente pelo menos 95%, particularmente pelo menos 96%, particularmente pelo menos 97%, particularmente pelo menos 98%, particularmente pelo menos 99% ou 100% idêntica à mesma; e uma CDR3 com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 14, 17, 20, 72, 80, 91, 100, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, particularmente pelo menos 85%, particularmente pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, particularmente pelo menos 95%, particularmente pelo menos 96%, particularmente pelo menos 97%, particularmente pelo menos 98%, particularmente pelo menos 99% ou 100% idêntica à mesma.
16. ANTICORPO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 15, ou um fragmento funcional do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) um primeiro domínio de ligação que contém em sequência uma CDR1 com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 21, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 76% idêntica à mesma; uma CDR2 com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 22, e uma CDR3 com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 23, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 66% idêntica à mesma, e/ou um segundo domínio de ligação que contém em sequência uma CDR1 com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 12, uma CDR2 com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 13, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 88% idêntica à mesma, e uma CDR3 com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 14, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 66% idêntica à mesma; ou
(b) um primeiro domínio de ligação que contém em sequência uma CDR1 com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 24,
27, ou 28, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 88% idêntica à mesma, uma CDR2 com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID
NO: 25, e uma CDR3 com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ
ID NO: 26, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 66% idêntica à mesma, e/ou um segundo domínio de ligação que contém em sequência uma
CDR1 com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 12, uma
CDR2 com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 13, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 88% idêntica à mesma, e uma
CDR3 com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 14, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 66% idêntica à mesma; ou
(c) um primeiro domínio de ligação que contém em sequência uma CDR1 com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 29,
uma CDR2 com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 30,
e uma CDR3 com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO:
31, e/ou um segundo domínio de ligação que contém em sequência uma CDR1 com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 15, uma CDR2 com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 16, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 94% idêntica à mesma, e uma CDR3 com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 17, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 36% idêntica à mesma; ou
(d) um primeiro domínio de ligação que contém em sequência uma CDR1 com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 32,
uma CDR2 com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 33,
e uma CDR3 com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO:
34, e/ou um segundo domínio de ligação que contém em sequência uma CDR1 com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 18, uma CDR2 com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 19, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 95% idêntica à mesma, e uma CDR3 com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 20, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 63% idêntica à mesma;
(e) um primeiro domínio de ligação que contém em sequência uma CDR1 com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 73,
uma CDR2 com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 74,
e uma CDR3 com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO:
75, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, particularmente pelo menos 85%, particularmente pelo menos
90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%,
particularmente pelo menos 95%, particularmente pelo menos 96%,
particularmente pelo menos 97%, particularmente pelo menos 98%,
particularmente pelo menos 99% ou 100% idêntica à mesma, e/ou um segundo domínio de ligação, que contém em sequência uma CDR1 com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 70, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 95%, particularmente 98%, particularmente 99%
idêntica à mesma, uma CDR2 com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 71, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 94%, 95%,
96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à mesma, e uma CDR3 com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 72, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%,
particularmente pelo menos 85%, particularmente pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%,
particularmente pelo menos 95%, particularmente pelo menos 96%,
particularmente pelo menos 97%, particularmente pelo menos 98%,
particularmente pelo menos 99% ou 100% idêntica à mesma; ou
(f) um primeiro domínio de ligação que contém em sequência uma CDR1 com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 81,
uma CDR2 com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 82,
e uma CDR3 com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO:
83, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, particularmente pelo menos 85%, particularmente pelo menos
90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%,
particularmente pelo menos 95%, particularmente pelo menos 96%,
particularmente pelo menos 97%, particularmente pelo menos 98%,
particularmente pelo menos 99% ou 100% idêntica à mesma, e/ou um segundo domínio de ligação que contém em sequência uma CDR1 com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 78, uma CDR2 com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 79, e uma CDR3 com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 80, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%,
particularmente pelo menos 85%, particularmente pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%,
particularmente pelo menos 95%, particularmente pelo menos 96%,
particularmente pelo menos 97%, particularmente pelo menos 98%,
particularmente pelo menos 99% ou 100% idêntica à mesma; ou
(g) um primeiro domínio de ligação que contém em sequência uma CDR1 com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 93,
uma CDR2 com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 94,
e uma CDR3 com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO:
95, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, particularmente pelo menos 85%, particularmente pelo menos
90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%,
particularmente pelo menos 95%, particularmente pelo menos 96%,
particularmente pelo menos 97%, particularmente pelo menos 98%,
particularmente pelo menos 99% ou 100% idêntica a qualquer uma das CDRs acima, e/ou um segundo domínio de ligação que contém em sequência uma
CDR1 com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 89, uma
CDR2 com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 90, e uma CDR3 com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 91,
ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, particularmente pelo menos 85%, particularmente pelo menos
90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%,
particularmente pelo menos 95%, particularmente pelo menos 96%,
particularmente pelo menos 97%, particularmente pelo menos 98%,
particularmente pelo menos 99% ou 100% idêntica a qualquer uma das CDRs acima; ou
(h) um primeiro domínio de ligação que contém em sequência uma CDR1 com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO:
101, uma CDR2 com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID
NO: 102, e uma CDR3 com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ
ID NO: 103, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 60%, pelo menos
70%, pelo menos 80%, particularmente pelo menos 85%, particularmente pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos
94%, particularmente pelo menos 95%, particularmente pelo menos 96%,
particularmente pelo menos 97%, particularmente pelo menos 98%,
particularmente pelo menos 99% ou 100% idêntica a qualquer uma das CDRs acima, e/ou um segundo domínio de ligação que contém em sequência uma
CDR1 com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 98, uma
CDR2 com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 99, e uma CDR3 com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO:
100, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 60%, pelo menos 70%,
pelo menos 80%, particularmente pelo menos 85%, particularmente pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos
94%, particularmente pelo menos 95%, particularmente pelo menos 96%,
particularmente pelo menos 97%, particularmente pelo menos 98%,
particularmente pelo menos 99% ou 100% idêntica a qualquer uma das CDRs acima; ou
(i) um primeiro domínio de ligação que contém em sequência uma CDR1 com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO:
106, uma CDR2 com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID
NO: 107, e uma CDR3 com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ
ID NO: 108, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 60%, pelo menos
70%, pelo menos 80%, particularmente pelo menos 85%, particularmente pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos
94%, particularmente pelo menos 95%, particularmente pelo menos 96%,
particularmente pelo menos 97%, particularmente pelo menos 98%,
particularmente pelo menos 99% ou 100% idêntica a qualquer uma das CDRs acima, e/ou um segundo domínio de ligação que contém em sequência uma
CDR1 com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 89, uma
CDR2 com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 115, e uma CDR3 com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 91,
ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, particularmente pelo menos 85%, particularmente pelo menos
90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%,
particularmente pelo menos 95%, particularmente pelo menos 96%,
particularmente pelo menos 97%, particularmente pelo menos 98%,
particularmente pelo menos 99% ou 100% idêntica a qualquer uma das CDRs acima.
17. ANTICORPO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 16, ou um fragmento funcional do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende um primeiro domínio de ligação que contém a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 6, 7, 8, 9, 10, 11, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% ou pelo menos 95% idêntica à mesma, e/ou um segundo domínio de ligação que contém a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5 ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 85% ou pelo menos 91% idêntica à mesma.
18. ANTICORPO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 17, ou um fragmento funcional do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende um primeiro domínio de ligação que contém a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 69, 77, 116, 92, 118, 97, 105, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, particularmente pelo menos 85%, particularmente pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, particularmente pelo menos 95%, particularmente pelo menos 96%, particularmente pelo menos 97%, particularmente pelo menos 98%, particularmente pelo menos 99% ou 100% idêntica à mesma, e/ou um segundo domínio de ligação que contém a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 68, 76, 88, 96, 104, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, particularmente pelo menos 85%, particularmente pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, particularmente pelo menos 95%, particularmente pelo menos 96%, particularmente pelo menos 97%, particularmente pelo menos 98%, particularmente pelo menos 99% ou 100% idêntica à mesma.
19. ANTICORPO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 18, ou um fragmento funcional do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende:
(a) um primeiro domínio de ligação que contém a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 7, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% e 94%, respectivamente, idêntica à mesma; e/ou um segundo domínio de ligação que contém a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 1, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 91% idêntica à mesma; ou
(b) um primeiro domínio de ligação que contém a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 8, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 95% idêntica à mesma; e/ou um segundo domínio de ligação que contém a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO:
2, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à mesma; ou
(c) um primeiro domínio de ligação que contém a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 9, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 95% idêntica à mesma; e/ou um segundo domínio de ligação que contém a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO:
3, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à mesma; ou
(d) um primeiro domínio de ligação que contém a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 10, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 99% idêntica à mesma; e/ou um segundo domínio de ligação que contém a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO:
4, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 89% idêntica à mesma; ou
(e) um primeiro domínio de ligação que contém a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 11, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 98% idêntica à mesma; e/ou um segundo domínio de ligação que contém a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 5, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 87% idêntica à mesma.
20. ANTICORPO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 19, ou um fragmento funcional do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) um primeiro domínio de ligação que contém a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 6 e/ou um segundo domínio de ligação que contém a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 1; ou (b) um primeiro domínio de ligação que contém a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 7 e/ou um segundo domínio de ligação que contém a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 1; ou (c) um primeiro domínio de ligação que contém a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 8 e/ou um segundo domínio de ligação que contém a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 2; ou (d) um primeiro domínio de ligação que contém a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 9 e/ou um segundo domínio de ligação que contém a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 3; ou (e) um primeiro domínio de ligação que contém a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 10 e/ou um segundo domínio de ligação que contém a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 4; ou (f) um primeiro domínio de ligação que contém a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 11 e/ou um segundo domínio de ligação que contém a sequência de aminoácidos apresentada em
SEQ ID NO: 5; ou
(g) um primeiro domínio de ligação que contém a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 69 e/ou um segundo domínio de ligação que contém a sequência de aminoácidos apresentada em
SEQ ID NO: 68; ou
(h) um primeiro domínio de ligação que contém a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 77 e/ou um segundo domínio de ligação que contém a sequência de aminoácidos apresentada em
SEQ ID NO: 76; ou
(i) um primeiro domínio de ligação que contém a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 116 e/ou um segundo domínio de ligação que contém a sequência de aminoácidos apresentada em
SEQ ID NO: 88; ou
(j) um primeiro domínio de ligação que contém a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 118 e/ou um segundo domínio de ligação que contém a sequência de aminoácidos apresentada em
SEQ ID NO: 88; ou
(k) um primeiro domínio de ligação que contém a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 92 e/ou um segundo domínio de ligação que contém a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO:
88; ou
(l) um primeiro domínio de ligação que contém a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 97 e/ou um segundo domínio de ligação que contém a sequência de aminoácidos apresentada em
SEQ ID NO: 96; ou
(m) um primeiro domínio de ligação que contém a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 105 e/ou um segundo domínio de ligação que contém a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 104.
21. ANTICORPO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 20, ou um fragmento funcional do mesmo, caracterizado pelo fato de que é um anticorpo policlonal, um anticorpo monoclonal, um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizado ou um anticorpo completamente humano ou um fragmento funcional do mesmo.
22. ANTICORPO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 21, ou um fragmento funcional do mesmo, caracterizado pelo fato de que é do isotipo IgG2b, IgG2a ou IgG3.
23. PEPTÍDEO ou proteína de ligação, caracterizado pelo fato de que é do anticorpo, conforme definido em uma das reivindicações 1 a 22.
24. PEPTÍDEO ou proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 23, ou o anticorpo, de acordo com uma das reivindicações 1 a 22, ou fragmento funcional do mesmo, caracterizados pelo fato de que ditos peptídeo ou proteína de ligação, anticorpo ou fragmento de anticorpo reconhecem e se ligam especificamente a um fosfo-epítopo no mamífero, particularmente na proteína Tau humana ou em um fragmento da mesma, particularmente a um fosfo-epítopo na proteína Tau agregada, mas não se ligam ao epítopo não fosforilado correspondente e/ou a epítopos não relacionados.
25. POLINUCLEOTÍDEO, caracterizado pelo fato de que codifica o anticorpo, conforme definido em uma das reivindicações 1 a 22 e 24, ou um fragmento funcional do mesmo.
26. POLINUCLEOTÍDEO, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que compreende uma molécula de ácido nucleico selecionada a partir do grupo que consiste em:
(a) uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos como representada em SEQ ID NOs: 35 a 45;
SEQ ID NOs: 84 a 87; SEQ ID NOs: 109 a 114 e 117 a 119;
(b) uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeos que tem pelo menos 85% de identidade de sequência com a sequência apresentada em SEQ ID NOs: 35 a 45; SEQ ID
NOs: 84 a 87, SEQ ID NOs: 109 a 114 e 117 a 119;
(c) uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeos que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência apresentada em SEQ ID NOs: 35 a 45; SEQ ID
NOs: 84 a 87, SEQ ID NOs: 109 a 114 e 117 a 119;
(d) uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeos que tem pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência apresentada em SEQ ID NOs: 35 a 45; SEQ ID
NOs: 84 a 87, SEQ ID NOs: 109 a 114 e 117 a 119;
(e) uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeos que tem pelo menos 98% de identidade de sequência com a sequência apresentada em SEQ ID NOs: 35 a 45; SEQ ID
NOs: 84 a 87, SEQ ID NOs: 109 a 114 e 117 a 119;
(f) uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeos cuja fita complementar se hibridiza à molécula de ácido nucleico de qualquer um de (a) a (f);
(g) uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeos que diverge da sequência de nucleotídeos definida em qualquer um de (a) a (g) pela degeneração do código genético:
em que dita molécula de ácido nucleico, conforme definida em qualquer um de (a) a (g), reconhece e se liga especificamente a um fosfo-epítopo em um mamífero, particularmente na proteína Tau humana ou em um fragmento da mesma, particularmente a um confôrmero patológico de proteína Tau, mas não se liga ao epítopo não fosforilado correspondente e/ou a epítopos não relacionados, em que dito anticorpo tem uma alta afinidade de ligação à proteína Tau agregada, e modula níveis de Tau solúvel e insolúvel.
27. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, caracterizada pelo fato de que compreende um peptídeo ou proteína de ligação, conforme definidos em uma das reivindicações 23 ou 24, ou um anticorpo, conforme definido em uma das reivindicações 1 a 22 e 24, ou um fragmento funcional do mesmo, ou um polinucleotídeo, conforme definido em uma das reivindicações ou 26, ou uma combinação dos mesmos, em uma quantidade terapeuticamente eficaz juntamente com um veículo farmaceuticamente aceitável.
28. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 27, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos dois peptídeos ou proteínas de ligação, conforme definidos em uma das reivindicações 23 ou 24, anticorpos, conforme definidos em uma das reivindicações 1 a 22 e 24, ou fragmentos funcionais dos mesmos, ou polinucleotídeos, conforme definidos em uma das reivindicações 25 ou 26, que reconhecem e se ligam a dois fosfo- epítopos diferentes na proteína Tau de mamífero.
29. COMPOSIÇÃO, de acordo com uma das reivindicações 27 ou 28, caracterizada pelo fato de que compreende um anticorpo adicional ou um fragmento funcional do mesmo que reconhece e se liga a um peptídeo ou proteína amiloidogênica diferente.
30. ANTICORPO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 22 e 24, ou um fragmento funcional do mesmo, um peptídeo ou proteína de ligação, de acordo com uma das reivindicações 23 ou 24, um polinucleotídeo, de acordo com uma das reivindicações 25 ou 26, ou uma composição farmacêutica, de acordo com uma das reivindicações 27 a 29, ou uma combinação dos mesmos, caracterizados pelo fato de que são para uso em terapia, particularmente para o uso no tratamento de distúrbios neurodegenerativos tais como tauopatias em um mamífero, particularmente um humano com necessidade de tal tratamento.
31. ANTICORPO, ou um fragmento funcional do mesmo, um peptídeo ou proteína de ligação, um polinucleotídeo ou uma composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 30, caracterizados pelo fato de que são para uso no tratamento ou alívio de déficits cognitivos em um mamífero, particularmente um humano que sofre de tal déficit.
32. ANTICORPO, ou um fragmento funcional do mesmo, um peptídeo ou proteína de ligação, um polinucleotídeo, ou uma composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 31, caracterizados pelo fato de que o tratamento ou alívio de déficits cognitivos em um mamífero, particularmente um humano, conduz a uma parada na progressão dos déficits cognitivos.
33. ANTICORPO, ou um fragmento funcional do mesmo, um peptídeo ou proteína de ligação, um polinucleotídeo, ou uma composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 32, caracterizados pelo fato de que o tratamento ou alívio de déficits cognitivos em um mamífero, particularmente um humano, conduz a um aumento na retenção, particularmente um restabelecimento completo de capacidade de memória cognitiva no sujeito tratado.
34. ANTICORPO, ou um fragmento funcional do mesmo, um peptídeo ou proteína de ligação, um polinucleotídeo, ou uma composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 33, caracterizados pelo fato de que são para uso no tratamento de doenças e distúrbios que são causados por ou associados com a formação de lesões neurofibrilares, a patologia cerebral predominante em tauopatia que compreende um grupo heterogêneo de doenças ou distúrbios neurodegenerativos, incluindo doenças ou distúrbios que apresentam coexistência de patologias Tau e amiloides incluindo, mas não limitado a: Doença de Alzheimer, doença de Creutzfeldt- Jacob, Demência pugilística, Síndrome de Down, doença de Gerstmann- Sträussler-Scheinker, miosite de corpos de inclusão, angiopatia amiloide cerebral de proteína do prião, lesão cerebral traumática e, adicionalmente, doenças ou distúrbios que não apresentam uma patologia amiloide distinta incluindo, mas não limitado a: esclerose lateral amiotrófica/complexo parkinsonismo-demência de Guam, doença do neurônio motor não-Guam (Non-Guamanian) com emaranhados neurofibrilares, demência por grãos argirofílicos, degeneração córtico-basal, emaranhados neurofibrilares difusos com calcificação, demência frontotemporal com parkinsonismo ligado ao cromossomo 17, doença de Hallevorden-Spatz, atrofia de múltiplos sistemas, doença de Niemann-Pick, tipo C, degeneração Pallido-ponto-nigral, doença de Pick, gliose subcortical progressiva, paralisia supranuclear progressiva, panencefalite esclerosante subaguda, demência apenas por emaranhado (tangle-only), Parkinsonismo pós-encefalítico, distrofia miotônica.
35. ANTICORPO, ou um fragmento funcional do mesmo, um peptídeo ou proteína de ligação, um polinucleotídeo, ou uma composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 34, caracterizados pelo fato de que são para uso no tratamento de Doença de Alzheimer.
36. MÉTODO PARA O TRATAMENTO de uma doença ou distúrbio neurodegenerativo tal como tauopatia, caracterizado pelo fato de que compreende administrar a um animal, particularmente a um mamífero, mas especialmente um humano que sofre de tal doença ou distúrbio, um anticorpo, conforme definido em uma das reivindicações 1 a 22, 24 e 30 a 35, ou um fragmento funcional do mesmo, um peptídeo ou proteína de ligação, conforme definido em uma das reivindicações 23, 24 e 30 a 35, um polinucleotídeo, conforme definido em uma das reivindicações 25, 26 e 30 a 35, ou uma composição farmacêutica, conforme definida em uma das reivindicações 27 a 29 e 30 a 35, ou uma combinação dos mesmos.
37. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que é para o tratamento de doenças e distúrbios que são causados por ou associados com a formação de lesões neurofibrilares, a patologia cerebral predominante em tauopatia que compreende um grupo heterogêneo de doenças ou distúrbios neurodegenerativos, incluindo doenças ou distúrbios que apresentam coexistência de patologias Tau e amiloides incluindo, mas não limitado a: Doença de Alzheimer, doença de Creutzfeldt- Jacob, Demência pugilística, Síndrome de Down, doença de Gerstmann- Sträussler-Scheinker, miosite de corpos de inclusão, e angiopatia amiloide cerebral de proteína do prião, lesão cerebral traumática e outras doenças ou distúrbios que não apresentam uma patologia amiloide distinta incluindo, mas não limitado a, esclerose lateral amiotrófica/complexo parkinsonismo-demência de Guam, doença do neurônio motor não-Guam com emaranhados neurofibrilares, demência por grãos argirofílicos, degeneração córtico-basal, emaranhados neurofibrilares difusos com calcificação, demência frontotemporal com parkinsonismo ligado ao cromossomo 17, doença de Hallevorden-Spatz, atrofia de múltiplos sistemas, doença de Niemann-Pick, tipo C, degeneração Pallido-ponto-nigral, doença de Pick, gliose subcortical progressiva, paralisia supranuclear progressiva, panencefalite esclerosante subaguda, demência apenas por emaranhado, Parkinsonismo pós-encefalítico, distrofia miotônica.
38. MÉTODO PARA INDUZIR UMA RESPOSTA IMUNE passiva em um animal, particularmente um mamífero ou um humano, que sofre de um distúrbio neurodegenerativo, tal como tauopatia, caracterizado pelo fato de que é por administrar a dito animal ou humano um anticorpo,
conforme definido em uma das reivindicações 1 a 22, 24 e 30 a 35, ou um fragmento funcional do mesmo, um peptídeo ou proteína de ligação, conforme definidos em uma das reivindicações 23, 24 e 30 a 35, ou uma composição farmacêutica, conforme definida em uma das reivindicações 27 a 29 e 30 a 35, ou uma combinação dos mesmos.
39. MÉTODO DE DIAGNÓSTICO de uma doença, distúrbio ou condição associados à proteína Tau em um paciente, caracterizado pelo fato de que compreende detectar a ligação imunoespecífica de um anticorpo ou um fragmento ativo do mesmo a um epítopo da proteína Tau em uma amostra ou in situ, que inclui as etapas de: (a) colocar a amostra, ou uma parte do corpo ou área do corpo específicas, suspeitas de conter a proteína Tau, em contato com um anticorpo, conforme definido em uma das reivindicações 1 a 22, 24 e 30 a 35, ou um fragmento do mesmo, cujo peptídeo ou fragmento do mesmo se liga a um epítopo da proteína Tau; (b) permitir que o anticorpo se ligue à proteína Tau para formar um complexo imunológico; (c) detectar a formação do complexo imunológico; e (d) correlacionar a presença ou ausência do complexo imunológico com a presença ou ausência de proteína Tau na amostra ou parte ou área do corpo específicas.
40. MÉTODO DE DIAGNÓSTICO de uma predisposição a doença, distúrbio ou condição associados à proteína Tau em um paciente, caracterizado pelo fato de que compreende detectar a ligação imunoespecífica de um anticorpo ou um fragmento ativo do mesmo a um epítopo da proteína Tau em uma amostra ou in situ, que inclui as etapas de: (a) colocar a amostra, ou uma parte do corpo ou área do corpo específicas, suspeitas de conter o antígeno Tau, em contato com um anticorpo, conforme definido em uma das reivindicações 1 a 22, 24 e 30 a 35, ou um fragmento do mesmo, cujo peptídeo ou fragmento do mesmo se liga a um epítopo da proteína Tau; (b) permitir que o anticorpo se ligue ao antígeno Tau para formar um complexo imunológico; (c) detectar a formação do complexo imunológico; e (d) correlacionar a presença ou ausência do complexo imunológico com a presença ou ausência de antígeno Tau na amostra ou parte ou área do corpo específicas; (e) comparar a quantidade de dito complexo imunológico com um valor controle normal, em que um aumento na quantidade de dito agregado em comparação com um valor controle normal, indica que dito paciente sofre de, ou possui risco de desenvolver uma doença ou condição associada à proteína Tau.
41. MÉTODO PARA MONITORAMENTO da doença residual mínima em um paciente após o tratamento com um anticorpo, conforme definido em uma das reivindicações 1 a 22, 24 e 30 a 35, ou uma composição farmacêutica, conforme definida em uma das reivindicações 27 a 29 e 30 a 35, caracterizado pelo fato de que dito método compreende: (a) colocar a amostra, ou uma parte do corpo ou área do corpo específicas, suspeitas de conter o antígeno Tau, em contato com um anticorpo, conforme definido em uma das reivindicações 1 a 22, 24 e 30 a 35, ou um fragmento do mesmo, cujo peptídeo ou fragmento do mesmo se liga a um epítopo da proteína Tau; (b) permitir que o anticorpo se ligue ao antígeno Tau para formar um complexo imunológico; (c) detectar a formação do complexo imunológico; e
(d) correlacionar a presença ou ausência do complexo imunológico com a presença ou ausência de antígeno Tau na amostra ou parte ou área do corpo específicas; (e) comparar a quantidade de dito complexo imunológico com um valor controle normal, em que um aumento na quantidade de dito agregado em comparação com um valor controle normal, indica que dito paciente ainda sofre de uma doença residual mínima.
42. MÉTODO PARA PREDIZER A RESPONSIVIDADE de um paciente sendo tratado com um anticorpo, conforme definido em uma das reivindicações 1 a 22, 24 e 30 a 35, ou composição farmacêutica, conforme definida em uma das reivindicações 27 a 29 e 30 a 35, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) colocar a amostra, ou uma parte do corpo ou área do corpo específicas, suspeitas de conter o antígeno Tau, em contato com um anticorpo, conforme definido em uma das reivindicações 1 a 22, 24 e 30 a 35, ou um fragmento do mesmo, cujo peptídeo ou fragmento do mesmo se liga a um epítopo da proteína Tau; (b) permitir que o anticorpo se ligue ao antígeno Tau para formar um complexo imunológico; (c) detectar a formação do complexo imunológico; e (d) correlacionar a presença ou ausência do complexo imunológico com a presença ou ausência de antígeno Tau na amostra ou parte ou área do corpo específicas; (e) comparar a quantidade de dito complexo imunológico antes e após o início do tratamento, em que uma diminuição na quantidade de dito agregado indica que dito paciente tem um alto potencial de ser responsivo ao tratamento.
43. KIT de ensaio para a detecção e diagnóstico de doenças, condições ou distúrbios associados à proteína Tau, caracterizado pelo fato de que compreende anticorpo, conforme definido em uma das reivindicações 1 a 22, 24 e 30 a 35.
44. KIT, de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pelo fato de que compreende um recipiente que carrega um ou mais anticorpos ou fragmentos funcionais do mesmo, de acordo com a presente invenção, e instruções para uso dos anticorpos com o propósito de se ligarem ao antígeno Tau para formar um complexo imunológico, e detectar a formação do complexo imunológico de modo que a presença ou ausência do complexo imunológico se correlaciona com a presença ou ausência de antígeno Tau.
45. EPÍTOPO, caracterizado pelo fato de que é selecionado a partir do grupo que consiste em aa Tau 15-20 compreendendo uma Tyr fosforilada na posição 18 (Y18), aa Tau 405-412 compreendendo uma Ser fosforilada na posição 409 (pS409), aa Tau 405-411 compreendendo uma Ser fosforilada na posição 409 (pS409); aa Tau 208-218 compreendendo uma Thr fosforilada na posição 212 (pT212) e uma Ser fosforilada na posição (pS214); aa Tau 393-401 compreendendo uma Ser fosforilada na posição 396 (pS396), aa Tau 396-401 compreendendo uma Ser fosforilada na posição 396 (pS396), aa Tau 394-400 compreendendo uma Ser fosforilada na posição 396 (pS396 ), aa Tau 402-406 compreendendo uma Ser fosforilada na posição 404 (pS404), e aa Tau 393-400 compreendendo uma Ser fosforilada na posição 396 (pS396).
46. LINHAGEM CELULAR, caracterizada pelo fato de que produz um anticorpo, conforme definido em uma das reivindicações 1 a 22, 24 e 30 a 35.
47. LINHAGEM CELULAR, de acordo com a reivindicação 46, caracterizada pelo fato de que é: (a) linhagem celular de hibridoma 6C10F9C12A11 depositada em 25 de agosto de 2010 como DSM ACC3079; ou (b) linhagem celular de hibridoma 6C10E5E9C12 depositada em de agosto de 2010 como DSM ACC3081; ou (c) linhagem celular de hibridoma 6H1A11C11 depositada em 25 de agosto de 2010 como DSM ACC3080; ou (d) linhagem celular de hibridoma 6H1G6E6 depositada em 25 de agosto de 2010 como DSM ACC3088; ou (e) linhagem celular de hibridoma 2B6A10C11 depositada em 25 de agosto de 2010 como DSM ACC3084; ou (f) linhagem celular de hibridoma 2B6G7A12 depositada em 10 de março de 2010 como DSM ACC3087; ou (g) linhagem celular de hibridoma 3A8A12G7 depositada em 25 de agosto de 2010 como DSM ACC3086; ou (h) linhagem celular de hibridoma 3A8E12H8 depositada em 25 de agosto de 2010 como DSM ACC3085; ou (i) linhagem celular de hibridoma 7C2(1)F10C10D3 depositada em 25 de agosto de 2010 como DSM ACC3082; ou (j) linhagem celular de hibridoma 7C2(2)B9F11D5 depositada em 25 de agosto de 2010 como DSM ACC3083.
48. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1, ou um fragmento funcional do mesmo, caracterizado pelo fato de que é codificado por um polinucleotídeo localizado em um fragmento de nucleotídeos que pode ser obtido por:
(a) amplificação por PCR de DNA de linhagem celular de hibridoma 6C10F9C12A11 depositada em 25 de agosto de 2010, como DSM
ACC3079 utilizando:
(i) um par de primers compreendendo um primer 5' de
SEQ ID NO: 54 e um primer 3' de SEQ ID NO: 51, para amplificação de um primeiro domínio de ligação; e/ou
(ii) uma mistura de primers compreendendo um primer
5' de SEQ ID NO: 53 e SEQ ID NO: 54 e um primer 3' de SEQ ID NO: 47, para amplificação de um segundo domínio de ligação; ou
(b) amplificação por PCR de DNA de linhagem celular de hibridoma 6C10E5E9C12 depositada em 25 de agosto de 2010, como DSM
ACC3081 utilizando:
(i) uma mistura de primers compreendendo um primer
5' de SEQ ID NO: 48 e SEQ ID NO: 49 e um primer 3' de SEQ ID NO: 51, para amplificação de um primeiro domínio de ligação; e/ou
(ii) uma mistura de primers compreendendo um primer
5' de SEQ ID NO: 53 e SEQ ID NO: 54 e um primer 3' de SEQ ID NO: 47, para amplificação de um segundo domínio de ligação; ou
(c) amplificação por PCR de DNA de linhagem celular de hibridoma 6H1A11C11 depositada em 25 de agosto de 2010, como DSM
ACC3080 utilizando:
(i) um par de primers compreendendo um primer 5' de
SEQ ID NO: 50 e um primer 3' de SEQ ID NO: 51, para amplificação de um primeiro domínio de ligação; e/ou
(ii) um par de primers compreendendo um primer 5' de
SEQ ID NO: 46 e um primer 3' de SEQ ID NO: 47, para amplificação de um segundo domínio de ligação; ou
(d) amplificação por PCR de DNA de linhagem celular de hibridoma 6H1G6E6 depositada em 25 de agosto de 2010, como DSM
ACC3088 utilizando:
(i) um par de primers compreendendo um primer 5' de
SEQ ID NO: 50 e um primer 3' de SEQ ID NO: 51, para amplificação de um primeiro domínio de ligação; e/ou
(ii) um par de primers compreendendo um primer 5' de
SEQ ID NO: 46 e um primer 3' de SEQ ID NO: 47, para amplificação de um segundo domínio de ligação; ou
(e) amplificação por PCR de DNA de linhagem celular de hibridoma 2B6A10C11 depositada em 25 de agosto de 2010, como DSM
ACC3084 utilizando:
(i) um par de primers compreendendo um primer 5' de SEQ ID
NO: 50 e um primer 3' de SEQ ID NO: 51, para amplificação de um primeiro domínio de ligação; e/ou
(ii) uma mistura de primers compreendendo um primer
5' de SEQ ID NO: 46 e SEQ ID NO: 52 e um primer 3' de SEQ ID NO: 47, para amplificação de um segundo domínio de ligação; ou
(f) amplificação por PCR de DNA de linhagem celular de hibridoma 2B6G7A12 depositada em 25 de agosto de 2010, como DSM
ACC3087 utilizando:
(i) um par de primers compreendendo um primer 5' de
SEQ ID NO: 50 e um primer 3' de SEQ ID NO: 51, para amplificação de um primeiro domínio de ligação; e/ou
(ii) uma mistura de primers compreendendo um primer
5' de SEQ ID NO: 46 e SEQ ID NO: 52 e um primer 3' de SEQ ID NO: 47, para amplificação de um segundo domínio de ligação; ou
(g) amplificação por PCR de DNA de linhagem celular de hibridoma 3A8A12G7 depositada em 25 de agosto de 2010, como DSM
ACC3086 utilizando:
(i) uma mistura de primers compreendendo um primer
5' de SEQ ID NO: 48 e SEQ ID NO: 49 e um primer 3' de SEQ ID NO: 51, para amplificação de um primeiro domínio de ligação; ou
(ii) um par de primers compreendendo um primer 5' de
SEQ ID NO: 50 e um primer 3' de SEQ ID NO: 51, para amplificação de um primeiro domínio de ligação; e/ou
(iii) um par de primers compreendendo um primer 5' de
SEQ ID NO: 46 e um primer 3' de SEQ ID NO: 47, para amplificação de um segundo domínio de ligação; ou
(h) amplificação por PCR de DNA de linhagem celular de hibridoma 3A8E12H8 depositada em 25 de agosto de 2010, como DSM
ACC3085 utilizando:
(i) uma mistura de primers compreendendo um primer
5' de SEQ ID NO: 48 e SEQ ID NO: 49 e um primer 3' de SEQ ID NO: 51, para amplificação de um primeiro domínio de ligação; ou
(ii) um par de primers compreendendo um primer 5' de
SEQ ID NO: 50 e um primer 3' de SEQ ID NO: 51, para amplificação de um primeiro domínio de ligação; e/ou
(iii) um par de primers compreendendo um primer 5' de
SEQ ID NO: 46 e um primer 3' de SEQ ID NO: 47, para amplificação de um segundo domínio de ligação; ou
(i) amplificação por PCR de DNA de linhagem celular de hibridoma 7C2(1)F10C10D3 depositada em 25 de agosto de 2010, como
DSM ACC3082 utilizando:
(i) uma mistura de primers compreendendo um primer
5' de SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 56 e SEQ ID NO: 57 e um primer 3' de SEQ
ID NO: 51, para amplificação de um primeiro domínio de ligação;
(ii) uma mistura de primers compreendendo um primer
5' de SEQ ID NO: 53 e SEQ ID NO: 55 e um primer 3' de SEQ ID NO: 47, para amplificação de um segundo domínio de ligação; ou
(j) amplificação por PCR de DNA de linhagem celular de hibridoma 7C2(2)B9F11D5 depositada em 25 de agosto de 2010, como
DSM ACC3083 utilizando:
(i) um par de primers compreendendo um primer 5' de
SEQ ID NO: 57 e um primer 3' de SEQ ID NO: 51, para amplificação de um primeiro domínio de ligação;
(ii) uma mistura de primers compreendendo um primer
5' de SEQ ID NO: 53 e SEQ ID NO: 55 e um primer 3' de SEQ ID NO: 47, para amplificação de um segundo domínio de ligação; ou
(k) amplificação por PCR de DNA de linhagem celular de hibridoma A4-2A1-18 depositada em 30 de agosto de 2011, como DSM
ACC3139 utilizando:
(i) um par de primers compreendendo um primer 5' de
SEQ ID NO: 149 e um primer 3' de SEQ ID NO: 51, para amplificação de um primeiro domínio de ligação; e/ou
(ii) uma mistura de primers compreendendo um primer
5' selecionado a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 120, 123, 124,
136, 137, 138, 139, e 140; e um primer 3' selecionado a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 131, 134, e 141 a 148, para amplificação de um segundo domínio de ligação; ou
(l) amplificação por PCR de DNA de linhagem celular de hibridoma A6-2G5-30 depositada em 30 de agosto de 2011, como DSM
ACC3137 utilizando:
(i) uma mistura de primers compreendendo um primer
5' selecionado a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 51 e 169 a 174 e um primer 3' de SEQ ID NO: 51, para amplificação de um primeiro domínio de ligação; e/ou
(ii) uma mistura de primers compreendendo um primer
5' selecionado a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 124, 127 e 150 a 158, e um primer 3' selecionado a partir do grupo que consiste em SEQ ID
NOs: 130 e 159 a 168, para amplificação de um segundo domínio de ligação;
ou
(m) amplificação por PCR de DNA de linhagem celular de hibridoma A4-2A1-40 depositada em 30 de agosto de 2011, como DSM
ACC3140 utilizando:
(i) uma mistura de primers compreendendo um primer
5' selecionado a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 178, 179 e 180 e um primer 3' de SEQ ID NO: 51, para amplificação de um primeiro domínio de ligação; e/ou
(ii) uma mistura de primers compreendendo um primer
5' selecionado a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 121, 127, 139,
154, 155 e 175, e um primer 3' selecionado a partir do grupo que consiste em
SEQ ID NOs: 128, 129, 147, 176, e 177, para amplificação de um segundo domínio de ligação; ou
(n) amplificação por PCR de DNA de linhagem celular de hibridoma A6-2G5-41 depositada em 30 de agosto de 2011, como DSM
ACC3138 utilizando:
(i) uma mistura de primers compreendendo um primer
5' selecionado a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 51 e 188 a 192 e um primer 3' de SEQ ID NO: 51, para amplificação de um primeiro domínio de ligação; e/ou
(ii) uma mistura de primers compreendendo um primer
5' selecionado a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 120, 124, 126,
181, 182 e 183, e um primer 3' selecionado a partir do grupo que consiste em
SEQ ID NOs: 144, 145 e 184 a 187, para amplificação de um segundo domínio de ligação; ou
(o) amplificação por PCR de DNA de linhagem celular de hibridoma A4-4A6-48 depositada em 30 de agosto de 2011, como DSM
ACC3136 utilizando:
(i) uma mistura de primers compreendendo um primer
5' selecionado a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 50 e 201 a 204 e um primer 3' de SEQ ID NO: 51, para amplificação de um primeiro domínio de ligação; e/ou
(ii) uma mistura de primers compreendendo um primer
5' selecionado a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 121, 137, 151 e
193 a 197; e um primer 3' selecionado a partir do grupo que consiste em SEQ
ID NOs: 131, 141, 144, 166, 198, 199 e 200, para amplificação de um segundo domínio de ligação; ou
(p) amplificação por PCR de DNA de linhagem celular de hibridoma A6-1D2-12 depositada em 06 de setembro de 2011, como DSM
ACC3141 utilizando:
(i) uma mistura de primers compreendendo um primer
5' selecionado a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 209 a 214, e
219 a 221 e um primer 3' de SEQ ID NO: 215, para amplificação de um primeiro domínio de ligação; e/ou
(ii) uma mistura de primers compreendendo um primer 5' selecionado a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 216, 217 e 218 e um primer 3' de SEQ ID NO: 208, para amplificação de um segundo domínio de ligação.
49. ANTICORPO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 22, 24, 30 a 35 e 48, ou um fragmento funcional do mesmo, caracterizado pelo fato de que dito anticorpo é um anticorpo do isotipo IgG2a, IgG2b ou IgG3, um anticorpo policlonal, um anticorpo monoclonal, um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizado ou um anticorpo completamente humano.
50. FRAGMENTO ou proteína de ligação ou um anticorpo, caracterizado pelo fato de que é conforme definido em uma das reivindicações 1 a 24, 30 a 35 e 48 a 49.
51. LINHAGEM CELULAR, caracterizada pelo fato de que produz o anticorpo, conforme definido em uma das reivindicações 1 a 22, 24 e 48 a 49.
52. LINHAGEM CELULAR, caracterizada pelo fato de que compreende o polinucleotídeo, conforme definido em uma das reivindicações 25 ou 26.
53. MÉTODO PARA PRODUZIR UM ANTICORPO, conforme definido em uma das reivindicações 1 a 22, 24 e 48 a 49, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de cultivar a linhagem celular, conforme definida na reivindicação 52, em um meio de cultura adequado.
54. MÉTODO PARA PRODUZIR UM ANTICORPO, conforme definido em uma das reivindicações 1 a 22, 24 e 48 a 49, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de cultivar a linhagem celular, conforme definida em uma das reivindicações 46 ou 47, em um meio de cultura adequado.
55. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 53 ou 54, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente a etapa de purificar o anticorpo a partir da linhagem celular ou meio de cultura.
56. USO DO ANTICORPO, conforme definido em uma das reivindicações 1 a 22, 24 e 48 a 49, incluindo quaisquer partes funcionais do mesmo, caracterizado pelo fato de que é na preparação de um medicamento para o tratamento de tauopatias, um grupo de doenças e distúrbios associados à proteína Tau.
57. USO DO ANTICORPO, conforme definido em uma das reivindicações 1 a 22, 24 e 48 a 49, incluindo quaisquer partes funcionais do mesmo, caracterizado pelo fato de que é na preparação de um medicamento para o tratamento ou alívio dos sintomas associados com tauopatias, um grupo de doenças e distúrbios associados à proteína Tau.
58. USO DO ANTICORPO, conforme definido em uma das reivindicações 1 a 22, 24 e 48 a 49, incluindo quaisquer partes funcionais do mesmo, caracterizado pelo fato de que é na preparação de um medicamento para a conservação ou aumento da capacidade de memória cognitiva em um mamífero que sofre de uma tauopatia.
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Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 20 (VINTE) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 07/10/2011, OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS. PATENTE CONCEDIDA CONFORME ADI 5.529/DF, QUE DETERMINA A ALTERACAO DO PRAZO DE CONCESSAO.