BR112013007944A2 - agentes de ligação ao cd33 - Google Patents

Abstract

  GENTES DE LIGAÇÃO AO CD33, SEU MÉTODO DE PRODUÇÃO, MOLÉCULA DE DNA CODIFICADORA DOS MESMOS, VETOR DE EXPRESSÃO COMPREENDENDO A REFERIDA MOLÉCULA DE DNA, BEM COMO COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA COMPREENDENDO OS REFERIDOS AGENTES E USO DA MESMA. A presente invenção refere-se a imunoterapias baseadas na depleção de células mieloides. Em particular, a presente invenção refere-se a agentes de ligação ao CD33 para uso em tais terapias, por exemplo, no tratamento de malignidades mieloides e da síndrome mielodisplásica (MDS).

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "AGENTES DE LIGAÇÃO AO CD33, SEU MÉTODO DE PRODUÇÃO, MOLÉCULA DE DNA CODIFICADORA DOS MESMOS, VETOR DE EXPRESSÃO COM- PREENDENDO A REFERIDA MOLÉCULA DE DNA, BEM COMO COM- POSIÇÃO FARMACÊUTICA COMPREENDENDO OS REFERIDOS AGEN- TES E USO DA MESMA". Campo da Invenção A presente invenção refere-se a imunoterapias baseadas na de- pleção de células mieloides.

Em particular, a presente invenção refere-se a agentes de ligação ao CD33 para uso em tais terapias, por exemplo, no tra- tamento de malignidades mieloides e da síndrome mielodisplásica (MDS). Antecedentes da Invenção No início da década de 1980 o CD33 foi identificado como um marcador de leucemias mieloides (Andrews et a/., Blood 62, 24-132, 1983). CD33é um antígeno de superfície celular expresso especificamente em cé- lulas mieloides incluindo células de leucemia mieloide.

Ele é o menor mem- bro da família das siglec (lectinas relacionadas com lg ligadoras de ácido siálico). O CD33 é expresso em células progenitoras hematopoiéticas pre- maturas multilinhagens e precursores mielomonocíticos.

Ele está ausente em células-tronco hematopoiéticas pluripotentes (Andrews et a/., Journal of Experimental Medicine 169, 1721-1731, 1989). Ele é infrarregulado em gra- nulócitos maduros mas retido em macrófagos, monócitos e células dendríti- cas (Andrews et a/l., Blood 62, 24-132, 1983). Além das células mielomonocií- ticas, foi constatado que o CD33 também é expresso em moastócitos e ba- —sófilos sanguíneos humanos (Valent et a/., Blood 15; 73(7): 1778-85, 1989). Anticorpos monoclonais dirigidos contra CD33 são usados no di- agnóstico da leucemia assim como para vetorização terapêutica e purgação in vitro de medula óssea para transplante autólogo em leucemia mieloide aguda (AML) (Duzkale et a/., Biol Blood Marrow Transplant. 9(6):364-72, 2003). Os esforços iniciais na vetorização terapêutica concentraram-se no desenvolvimento de imunotoxinas usando um anticorpo anti-CD33 conjuga- do com a toxina ricina.

Como o CD33 internaliza rapidamente mediante liga-

1a/60 ção de um anticorpo (Audran et al., J Inmunol Methods. 188(1): 147-54, 1995), a abordagem com imunotoxinas era óbvia.

CD33 é uma glicoproteína transmembrana de 67 KD.

O domínio extracelular ligador de ácido siálico do CD33 está envolvido na adesão célu-

Ç la-célula. Os motivos inibitórios baseados no imunorreceptor intracelular de y tirosina (ITIM) conferem sinais inibitórios à célula, afetando a proliferação e a sobrevivência da célula. As vias de sinalização verdadeiras do CD33 são pobremente compreendidos, mas presume-se que envolvem os ITIM e moti- vos semelhantes ao ITIM e o recrutamento de tirosina fosfatases (von Gun- ten et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 1143 : 61-82, 2008). Um ortólogo murino de CD33 foi identificado, mas sua comparabilidade funcional com o CD33 hu- mano foi questionada (Brinkman-Van der Linden et a/., Mol Cell Biol., 23(12): 4199-206, 2003). O papel funcional do CD33 humano em leucócitos normais emalignos continua desconhecido.

Diversas publicações já descreveram o CD33 com um marcador de superfície celular estável em células primárias de AML e CML expressas por 70-100% dos pacientes testados (Plesa et al., Cancer 112(3), 572-80, Í 2007; Hausvwirt et al., Eur J Clin Invest. Jan 73-82, 2007; Scheinberg et al., » 15 Leukemia Vol. 3, 440445, 1989). O CD33 é expresso em blastócitos mieloi- des malignos, que representam a maioria das células malignas no sangue periférico e na medula óssea dos pacientes com leucemia, e em células- tronco leucêmicas, um número relativamente pequeno de células menos di- ferenciadas na medula óssea que se caracterizam por sua capacidade de autorrenovação e manutenção da hierarquia clonal leucêmica. A depleção de células-tronco leucêmicas é vista como o mecanismo essencial para so- brevivência livre de tumor sustentado. A imunotoxina de vetorização para CD33 Mylotargº, um anticorpo IgG, humanizado conjugado com a toxina caliqueamicina, é usada para o tratamento de pacientes com AML distribuin- do sua carga útil tóxica para células de AML positivas para CD33 (Amadori et al., Cancer Treat Rev. 34(1):49-60, 2008). Lintuzumab (SGN-33, HuM195), um anticorpo monoclonal humanizado específico para CD33 "nu" foi avaliado em ensaios clínicos na fase |l para o tratamento de AML e MDS com sinais clínicos iniciais de eficácia em um estudo de escalonamento de dose de fase | com eventos adversos toleráveis sendo reportados (Raza et al. Abstract f983, 14"" EHA Congress, 4-7 de junho de 2009). A vetorização de linhagens celulares de AML com HuM195 es-

& pecífico para CD33 in vitro reduz a secreção induzida por TFa de citocinas * inflamatórias como IL-8, MCP-1 e RANTES (Sutherland et al., Mabs 1 :5, 481-490, 2009). A relevância deste efeito para terapia de AML não é conhe- cida, mas a modulação do ambiente da citocina do microambiente tumoral pode contribuir para a eficácia terapêutica do anticorpo. Além disso, o anti- corpo induz citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC) e fagocitose mediada por células dependente de anticorpos (ADCP) de linhagens celulares de AML in vitro (Sutherland et a/., Mabs 1 :5, 481-490, 2009). ADCC é considerada como sendo um mecanismo decisivo para ativi- dade antitumoral de anticorpos em malignidades hematológicas. Dados de ensaios clínicos com o anticorpo monoclonal específico para CD20 Rituxi- mab demonstraram a importância de mecanismos mediados por células efe- toras para o tratamento de malignidades de células B em relação à resposta , ao tratamento com anticorpos (Weng & Levy, J Clin Oncol. 21 (21): 3940-7, « 15 2003).

Concluindo, foi mostrado que o antígeno CD33 é expresso em células normais da linhagem mielomonocítica e frequentemente expresso em células tumorais em leucemias mieloides. Em um ensaio de fase | com um anticorpo contra CD33 (lintuzumab) os primeiros sinais de eficácia foram observados sem eventos adversos severos. No entanto, o desenvolvimento de lintuzumab foi descontinuado depois que os resultados de um ensaio de fase |l em combinação com quimioterapia não produziram a melhora espe- rada em termos de eficácia. Portanto, há uma clara necessidade de desen- volvimento de modalidades melhoradas do tratamento de vetorização para CDS3.

Tendo em vista a técnica anterior faz-se necessário o forneci- mento de uma nova terapia melhorada para malignidades mieloides e MDS, particularmente para leucemia mieloide aguda.

Em particular faz-se necessário o fornecimento de novos agen- tes de ligação antagonísticos melhorados para CD33 para o tratamento de câncer, em particular AML.

Sumário da Invenção é A presente invenção fornece novos agentes de ligação ao CD33 " que se ligam ao CD33 humano e são definidos por a) terem uma região variável de cadeia pesada compreendendo CDR1, CDR2 e CDR3, e uma região variável de cadeia leve compreendendo — CDRA4,CDR5 e CDR6, onde CDR1 tem uma sequência aminoacídica sele- cionada dentre SEQ ID Nº: 1-14, CDR2 tem uma sequência aminoacídica selecionada dentre SEQ ID Nº: 14-28, CDR3 tem uma sequência aminoacídica selecionada den- tre SEQ ID Nº: 29-42, CDR4 tem uma sequência aminoacídica selecionada dentre SEQ ID Nº: 43-56, CDR5 tem uma sequência aminoacídica selecio- nada dentre SEQ ID Nº: 57-70, CDR6 tem uma sequência aminoacídica se- lecionada dentre SEQ ID Nº: 71-84, ou b) reconhecerem um epitopo na sequência aminoacídica FFHPIPYYDKNSPVHGYW (SEQ ID Nº: 141) de CD33 humano. «15 A presente invenção oferece ainda agentes de ligação ao CD33 onde a cinética de internalização dos agentes de ligação ao CD33 é tal que pelo menos 30%, de preferência 40%, da quantidade inicial do anticorpo permanecem na superfície celular de células HL6O em um tempo de 4 horas depois da incubação.

A presente invenção oferece ainda agentes de ligação ao CD33, onde a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência ami- noacídica selecionada dentre SEQ ID Nº: 85-98 e a região variável de cadeia leve compreende uma sequência aminoacídica selecionada dentre SEQ ID Nº: 99-112.

A presente invenção oferece ainda agentes de ligação ao CD33, onde a cadeia pesada tem uma sequência aminoacídica selecionada dentre SEQ ID Nº: 113-126 e a cadeia leve tem uma sequência aminoacídica sele- cionada dentre SEQ ID Nº: 127-140.

A presente invenção oferece ainda agentes de ligação ao CD33 tendomutações no domínio F. que aumentam a ADCC.

Outras modalidades preferidas estão resumidas no relatório descritivo a seguir e nas reivindicações.

103, um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pe- sada de SEQ ID Nº 90 e uma região variável de cadeia leve de SEQ ID Nº 104, um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pe- sada de SEQ ID Nº 91 e uma região variável de cadeia leve de SEQ ID Nº 105, um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pe- sada de SEQ ID Nº 92 e uma região variável de cadeia leve de SEQ ID Nº 106, um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pe- sada de SEQ ID Nº 93 e uma região variável de cadeia leve de SEQ ID Nº 107, um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pe- sadade SEQ ID Nº 94 e uma região variável de cadeia leve de SEQ ID Nº 108, um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pe- sada de SEQ ID Nº 95 e uma região variável de cadeia leve de SEQ ID Nº 109, um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pe- sada de SEQ ID Nº 96 e uma região variável de cadeia leve de SEQ ID Nº 110, um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pe- sada de SEQ ID Nº 97 e uma região variável de cadeia leve de SEQ ID Nº

25. 111, um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pe- sada de SEQ ID Nº 98 e uma região variável de cadeia leve de SEQ ID Nº

112.

18. Agente de ligação ao CD33, caracterizado pelo fato de ser selecionado dentre um anticorpo compreendendo uma cadeia pesada de SEQ ID Nº 113 e uma cadeia leve de SEQ ID Nº 127,

: ticorpo. " O termo "agente de ligação ao CD33" conforme usado neste re- latório refere-se a um agente de ligação que se liga especificamente ao CD33, tipicamente uma porção do domínio extracelular do CD33 humano.

O termo "anticorpo" conforme usado neste relatório refere-se a (a) polipeptídios de imunoglobulina e porções imunologicamente ativas de polipeptídios de imunoglobulina (isto é, polipeptídios da família das imuno- globulinas, ou fragmentos dos mesmos, que contêm um sítio de ligação de antígeno que se liga imunoespecificamente a um antígeno alvo específico), ou (b) derivados conservativamente substituídos de tais polipeptídios de i- munoglobulina ou fragmentos do mesmo que se ligam imunoespecificamen- te ao antígeno alvo. Anticorpos estão descritos de um modo geral, por e- xemplo, em Harlow & Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring : Harbor Laboratory Press, 1988). O termo "anticorpo" refere-se a anticorpos . 15 monoclonais, anticorpos policlonais, anticorpos monoespecíficos e anticor- pos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos) intactos, e a fragmentos de anticorpos que exibem a atividade biológica desejada (por exemplo, ligação a antígeno). O anticorpo pode ser de qualquer tipo ou clas- se (por exemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, e IgA) ou subclasse (por exemplo, 1gGl, 19G2,19G3, IgGA4, IgAl e IgA2), de preferência da classe da IgG, mais prefe- rivelmente uma IgGl.

Um anticorpo "intacto" é aquele que compreende uma região va- riável ligadora de antígeno assim um domínio constante de cadeia leve e domínios constantes de cadeia pesada conforme apropriado para a classe do anticorpo. Os domínios constantes podem ser domínios constantes de sequência nativa (por exemplo, domínios constantes de sequência nativa humana) ou variantes de sequências aminoacídicas dos mesmos.

Um "fragmento de anticorpo" compreende uma porção de um anticorpo, incluindo a região ligadora de antígeno ou variável ou uma porção damesma. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem Fab, Fab', F(ab'), e fragmentos Fv, fragmentos ligadores de antígeno de V"y e Vi, diacorpos, triacorpos, tetracorpos, anticorpo de cadeia simples, scFv, scFv-Fc, um

+ SMTP, e anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de an- , ticorpo.

"Região variável de cadeia pesada" ou "V4" significa a parte da cadeia pesada compreendendo as CDR1, CDR2 e CDR3 e regiões de es- queleto vizinhas.

"Região variável de cadeia leve" ou "V," significa a parte da ca- deia leve compreendendo as CDRA4, CDR5 e CDRG6 e regiões de esqueleto vizinhas.

"CDR" significa as regiões hipervariáveis das cadeias pesada e leve, que determinam a complementaridade / especificidade de ligação de um anticorpo ou fragmento de anticorpo. A ordem das CDRs no presente pedido é puramente numérica.

"Epitopo" neste relatório significa uma parte de um antígeno, que À é reconhecido por um anticorpo ou fragmento de anticorpo. Em particular - 15 estetermo refere-se a partes de CD33, que podem ser reconhecidas por um anticorpo.

"mAbs" conforme usado neste relatório refere-se a anticorpos monoclonais.

Um anticorpo pode ter uma ou mais "funções efetoras" que se referem àquelas atividades biológicas atribuíveis à região Fc (uma região Fc de sequência nativa ou uma região Fc de sequência aminoacídica variante) de um anticorpo. Exemplos de funções efetoras de um anticorpo incluem ligação de Clq; citotoxicidade dependente de complementos (CDC); ligação do receptor de Fc; citotoxicidade mediada por células dependente de anti- corpos (ADCC); fagocitose; infrarregulação de receptores de superfície celu- lar (por exemplo, receptor de células B; BCR), etc.

Fragmentos de anticorpo "Fv de cadeia simples" ou "scFv" com- preendem os domínios V,y e V, de um anticorpo, onde esses domínios estão presentes em uma cadeia polipeptídica simples. O polipeptídio Fv tipicamen- te compreende ainda um ligador de polipeptídio entre os domínios de Vy e V. que permite que o scFv forme a estrutura desejada para ligação de antí- geno. Para recapitulação sobre scFv, vide Pluckthun in The Pharmacology of t Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore, eds., Springer- Ver- js lag, New York, págs. 269-315 (1994). Um agente de ligação tal como um anticorpo que é "dirigido pa- ra", "que se liga a" ou que "se liga especificamente a" um antígeno de inte- resse(isto é, um antígeno alvo) é aquele capaz de ligar aquele antígeno com afinidade suficiente de modo que o agente de ligação é útil no ataque a uma célula expressando o antígeno.

Tipicamente, o agente de ligação se liga com uma afinidade de pelo menos cerca de 1x10” M”, e se liga ao antígeno pre- determinado com uma afinidade pelo menos duas vezes maior que sua afi- —nidade para ligação a um antígeno inespecífico (por exemplo, BSA, caseína) que não o antígeno predeterminado ou um antígeno estreitamente correlato.

Um "derivado de anticorpo" conforme usado neste relatório refe- re-se a um anticorpo, já definido acima, que é modificado por ligação cova- : lente de uma molécula heteróloga tal como, por exemplo, por ligação de um « 15 polipeptídio heterólogo, ou por glicosilação, desglicosilação, acetilação ou fosforilação ou outra modificação normalmente não associada ao anticorpo.

Em algumas modalidades, a molécula heteróloga não é um agente terapêu- tico.

Em algumas modalidades, a molécula heteróloga não exibe um efeito citostático ou citotóxico por si só.

Uma outra referência completa para todos os termos e procedi- mentos usados nesta invenção é Sambrook et al/., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press; 3'* edition (15 de janeiro de 2001). Os agentes de ligação ao CD33 se ligam especificamente a um receptor, CD33, associado a uma dada população de células alvo.

CD33 é um membro da família de sialoadesão que é expresso em células da linha- gem hematopoiética, incluindo precursores mieloides, monócitos, macrófa- gos, células dendríticas, e mastócitos.

CD33 também é expresso em células tumorais associadas a doenças mieloproliferativas ou doenças proliferativas de mastócitos, incluindo leucemia mieloide aguda e síndromes mieloplási- cas,eem células-tronco leucêmicas.

Anticorpos que atacam o CD33 e seus usos já foram descritos em linhas gerais (vide, por exemplo, Pierelli et al, 1993, Br.

J.

Haematol. 84:24-30; Matutes et a/., 1985, Hemaiol.

Oncol. 3 :

é 179- 186; Taussig et al/., 2005, Blood 106:4086- 4092; Florian et a/., 2006, % Leuk. & Lymph. 47:207-222). Em algumas modalidades, o agente de ligação ao CD33 é um anticorpo (por exemplo, um anticorpo monoclonal). Anticorpos monoclonais úteis podem ser populações homogêneas de anticorpos para um CD33 (por exemplo, o domínio extracelular de CD33 humano). Um anticorpo monoclo- nal (mAb) pode ser preparado usando-se qualquer técnica conhecida na lite- ratura. Estas incluem, porém sem limitação, a técnica do hibridoma original- mente descrita por Kohler e Milstein (1975, Nature 256:495- 497), a técnica do hibridoma de células B humanas (Kozbor et a/., 1983, Immunology Today 4:72), e a técnica do hibridoma EBV (Cole et a/., 1985, Monoclonal Antibodi- es and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., págs. 77-96). Tais anticorpos po- dem ser de qualquer classe de imunoglobulina incluindo IgG, IGM, IgE, IgA e : IgD e qualquer subclasse das mesmas. O hibridoma produzindo um anticor- - 15 pomonocional pode ser cultivado in vitro ou in vivo.

Anticorpos monoclonais úteis incluem, porém sem limitação, an- ticorpos monoclonais humanos, anticorpos monoclonais humanizados, anti- corpos monoclonais quiméricos e fragmentos de anticorpo funcionalmente ativos de qualquer um destes.

Anticorpos de CD33 úteis incluem anticorpos que podem conse- guir um efeito terapêutico por vários mecanismos conhecidos na literatura, tais como citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC), fagocitose mediada por células dependente de anticorpos (ADCP) e/ou citotoxicidade dependente de complementos (CDC). Por exemplo, o anticorpo pode mediar a ADCC interagindo com células efetoras imunes tais como células NK, monócitos, e macrófagos.

Anticorpos recombinantes, tais como anticorpos monoclonais quiméricos e humanizados, compreendem porções tanto humanas quanto não humanas, que podem ser feitas por técnicas de DNA recombinante tra- dicionais. (Vide, por exemplo, Cabilly et al., Patente US Nº 4.816.567; e Boss et al., Patente US Nº 4.816.397; ambas aqui incorporadas em sua integrida- de a título de referência). "Anticorpos humanizados" são moléculas de anti-

: corpo de espécies não humanas tendo uma ou mais regiões determinantes f de complementaridade (CDRs) das espécies não humanas e uma região de esqueleto de uma molécula de imunoglobulina humana. (Vide, por exemplo, Queen, Patente US Nº 5.585.089, que está aqui incorporada em sua integri- dade a título de referência.) Tais anticorpos monoclonais quiméricos e hu- manizados podem ser produzidos por técnicas de DNA recombinante co- nhecidas na literatura, por exemplo, usando métodos descritos na Publica- ção Internacional Nº WO 87/02671 ; Publicação de Patente Europeia Nº 0184187; Publicação de Patente Europeia Nº 0171496; Publicação de Pa- tente Europeia Nº 0173494; Publicação Internacional Nº WO 86/01533; Pa- tente US Nº 4,816,567; Publicação de Patente Europeia Nº 012023; Berter et al., 1988, Science 240: 1041-1043; Liu et a/., 1987, Proc. Natl. Acad Set. USA 84:3439-3443; Liu et al., 1987, J. Immunol. 139:3521-3526; Sun el al, é 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:214-218; Nishimura et a/., 1987, Cancer. .- 15 Res. 47:999-1005; Wood et al. 1985, Nature 314:446-449; Shaw et al/., 1988, J. Natl. Cancer Inst. 80: 1553-1559; Morrison, 1985, Science 229: 1202- 1207; Oi et al., 1986, BioTechniques 4:214; Patente US Nº 5,225,539; Jones et al., 1986, Nature 321 :552-525; Verhoeyan et a/., 1988, Science 239: 1534; e Beidler et al/., 1988, J. Immunol. 141 :4053-4060: cada uma delas estando aqui incorporada em sua integridade a título de referência.

Anticorpos monoclonais humanos podem ser feitos por qualquer uma de inúmeras técnicas conhecidas na literatura (vide, por exemplo, Teng el al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 80: 7308-7312; Kozbor et a/., 1983, Immunology Today 4:72-79; Olsson et a/., 1982, Meth. Enzymol. 92:3-16; e Patentes US Nº 5.939.598 e 5.770.429).

Anticorpos completamente humanos podem ser produzidos u- sando-se camundongos transgênicos que são incapazes de expressar ge- nes de cadeias pesadas e leves de imunoglobulina endógena, mas que ex- pressam genes humanos de cadeias pesadas e leves. Os camundongos transgênicos são imunizados de maneira normal com um antígeno selecio- nado, por exemplo, todo ou parte de um polipeptídio CD33. Anticorpos mo- noclonais dirigidos contra o antígeno podem ser obtidos usando-se a tecno-

: logia do hibridoma convencional. Os transgenes da imunoglobulina humana . ancorados pelos camundongos trasngênicos rearranjam durante a diferenci- ação de células B, e subsequentemente sofrem mudança de classe e muta- ção somática. Assim sendo, usando tal técnica, é possível produzir anticor- —poslgG, IgA, IgM «e lgE ble terapeuticamente úteis. Para um panorama desta tecnologia para produzir anticorpos humanos, vide, por exemplo, Lonberg & Huszar, 1995, Int. Rev. Immunol. 13 :65-93. Para uma discussão detalhada dessa tecnologia para produzir anticorpos humanos e anticorpos monoclio- nais humanos e protocolos para a produção de tais anticorpos, vide, por e- xemplo, as Patentes US Nº 5.625.126, 5.633.425, 5.569.825, 5.661.016, e

5.545.806. Outros anticorpos humanos podem ser adquiridos comercialmen- te, por exemplo, na Medarex (Princeton, NJ), que são obtidos por meio de imunização de camundongos.

: Anticorpos totalmente humanos que reconhecem um epitopo se- - 15 lecionado também podem ser gerados usando-se uma técnica chamada "se- leção guiada". Nesta abordagem um anticorpo monocional não humano se- lecionado, por exemplo, um anticorpo de camundongo, é usado para guiar a seleção de um anticorpo totalmente humano reconhecendo o mesmo epito- po. (Vide, por exemplo, Jespers et a/., 1994, Biotechnology 12:899-903). An- ticorpos humanos também podem ser produzidos usando-se várias técnicas conhecidas na literatura, incluindo biblioteca de exibição de fagos (vide, por exemplo, Hoogenboom & Winter, 1991, J. Mol. Biol 227:381; Marks et al., 1991, J Mol Biol 222:581 ; Quan & Carter, 2002, The rise of monoclonal anti- bodies as therapeutics, In Anti-|lgE and Allergic Disease, Jardieu and Fick Jr., eds, Marcel Dekker, New York, NY, Chapter 20, págs. 427-469). Fragmentos de anticorpo úteis incluem, porém sem limitação, fragmentos F(ab'), fragmentos Fab', fragmentos Fab, Fvs, anticorpos de cadeia simples (SCAs) (por exemplo, aqueles descritos na Patente US Nº

4.946.778: Bird, 1988, Science 242:423-42; Huston et a/., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; e Ward et a/., 1989, Nature 334: 544-54), scFv, scFv-Fc, FvdsFv, minicorpos, diacorpos, triacorpos, tetracorpos, SMIPs (vide, por exemplo, Pedido de Patente US Publicado Nº 2005-

“ 0238646) e qualquer outra molécula compreendendo uma ou mais CDRs e ó que tem a mesma especificidade que o anticorpo.

Em outras modalidades, o anticorpo é uma proteína de fusão de um anticorpo, um fragmento funcionalmente ativo do mesmo, unido a uma outra proteina. Por exemplo, um anticorpo ou fragmento de anticorpo pode ser fundido via uma ligação covalente (por exemplo, uma ligação peptídica), seja no terminal N ou no terminal C, a uma sequência aminoacídica de uma outra proteína (ou porção da mesma, tipicamente pelo menos uma porção de 10, 20 ou 50 aminoácidos da proteína) que não é o anticorpo ou um fragmento de anticorpo. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento do mesmo pode ser covalentemente ligado à outra proteína no terminal C do domínio variável ou de um domínio constante. Os anticorpos podem ser modificados, por exemplo, pela ligação Ê covalente de qualquer tipo de molécula contanto que tal ligação covalente . 15 permita que o anticorpo conserve sua imunoespecificidade de ligação a antí- genos. Por exemplo, um derivado de um anticorpo pode ser um derivado que tenha sido ainda modificado, por exemplo, por glicosilação, desglicosila- ção, acetilação, peguilação, fosforilação, amidação, desrealização por gru- pos protetores/bloqueadores conhecidos, clivagem proteolítica, ligação a uma outra proteína etc. Qualquer uma de numerosas modificações químicas pode ser efetuada por técnicas conhecidas, incluindo, porém sem limitação, clivagem química específica, acetilação, formilação, síntese metabólica na presença de tunicamicina, ou similar. Adicionalmente, o derivado pode con- ter um ou mais aminoácidos não naturais.

Em modalidades específicas, pode ser desejável melhorar a afi- nidade de ligação e/ou outras propriedades biológicas do anticorpo. (Vide, por exemplo, Publicação de Patente US Nº 2006-0003412 e 2006-0008882). Variantes de sequências aminoacídicas dos anticorpos são preparadas in- troduzindo-se mudanças nucleotídicas apropriadas no ácido nucleico do an- ticorpo, ou por síntese de peptídios. Tais modificações incluem, por exemplo, deleções, e/ou inserções e/ou substituições de resíduos nas sequências a- minoacídicas do anticorpo. Qualquer combinação de deleções, inserções,

: e/ou substituições é feita para se chegar à construção final, contanto que a : construção final possua as características desejadas. As mudanças aminoa- cídicas também podem alterar os processos pós-translacionais do anticorpo, tal como alterar o número ou a posição dos sítios de glicosilação.

Um método útil para identificação de certos resíduos ou regiões do anticorpo que são localizações favorecidas para mutagênese é chamado de "mutagênese de varredura de alanina" como descrito por Cunningham & Wells (1989, Science 244: 1081-1085). Aqui, um resíduo ou grupo de resí- duos alvo são identificados (por exemplo, resíduos carregados tais como arg, asp, his, lys, e glu) e substituídos por um aminoácido neutro ou negati- vamente carregado (tipicamente alanina ou polialanina) para afetar a intera- ção dos aminoácidos com o antígeno. Aquelas localizações de aminoácidos demonstrando sensibilidade funcional às substituições são então refinados por introdução de variantes adicionais ou de outras variantes nos sítios de . 15 substituição. Portanto, embora o sítio para introdução de uma variação de uma sequência aminoacídica seja predeterminado, a natureza da mutação per se não precisa ser predeterminada. Por exemplo, para analisar o de- sempenho de uma mutação em um dado sítios, mutagênese de varredura de alanina ou aleatória é conduzida no códon ou região alvo e as variantes de anticorpo expressas são rastreadas quanto à atividade desejada.

Inserções de sequências aminoacídicas podem incluir fusões amino- e/ou carboxil-terminais variando de um resíduo de comprimento a polipeptídios contendo cem ou mais resíduos, assim como inserções intras- sequências de um único resíduo aminoacídico a múltiplos resíduos aminoa- cídicos. Exemplos de inserções terminais incluem um anticorpo com um re- síduo metionila N-terminal do anticorpo fundido a um polipeptídio citotóxico.

Um outro tipo de anticorpo é uma variante de substituição ami- noacídica de um anticorpo. Tais variantes têm pelo menos um resíduo ami- noacídico na molécula de anticorpo substituído por um resíduo diferente. Os sítios de maior interesse para mutagênese substitucional incluem as regiões hipervariáveis, mas alterações de regiões de esqueleto também são con- templadas.

: Modificações significativas nas propriedades biológicas do anti- o corpo podem ser feitas selecionando-se substituições que diferem significati- vamente em termos de seu efeito na manutenção (a) da estrutura da espi- nha dorsal polipeptídica na área da substituição, por exemplo, como uma conformação lamelar ou helicoidal, (b) da carga ou hidrofobicidade da molé- cula no sítio alvo, ou (c) o volume da cadeia lateral. Os resíduos de ocorrên- cia natural são divididos em grupos com base nas propriedades comuns das cadeias laterais: (1) hidrofóbicos: norleucina, met, ala, val, leu, ile; (2) hidrofílicos neutros: cys, ser, thr; (3) ácidos: asp, glu; (4) básicos: asn, gin, his, lys, arg; (5) resíduos que influenciam a orientação da cadeia: gly, pro; e (6) aromáticos: trp, tyr, phe. 215 Substituições não conservativas vão impor a troca de um mem- bro de uma dessas classes por um membro de uma outra classe.

É desejável modificar o anticorpo em relação à função efetora, por exemplo, para intensificar a citotoxicidade mediada por células depen- dente de anticorpos (ADCC), fagocitose mediada por células dependente de anticorpos (ADCP) e/ou citotoxicidade dependente de complementos (CDC) do anticorpo. Em particular, a atividade da ADCC pode ser intensificada in- troduzindo-se mutações aminoacídicas na região constante do anticorpo (Lazar et al., PNAS 103, 11, 4005-4010, 2006). Esta pode ser obtida por in- trodução de uma ou mais substituições aminoacídicas em uma região Fc do anticorpo, vide, por exemplo, Pedido de Patente US Publicado Nº 2006-

0160996. Alternativamente ou adicionalmente, resíduos cisteina podem ser introduzidos na região Fc, permitindo assim a formação de ligação dissulfeto intercadeias nesta região. O anticorpo homodimérico gerado dessa maneira pode ter capacidade internalização melhorada e/ou CDC e ADCC aumenta- das. (Vide, por exemplo, Caron et a/., 1992, J Exp. Med 176: 1191-1195; e Shopes, 1992, J. Immunol. 148:2918-2922.) anticorpos homodiméricos com atividade antitumoral intensificada também podem ser preparados usando-se

: reticuladores heterobifuncionais como descrito por Wolff et a/., 1993, in Can- x cer Research 53 :2560-2565. Alternativamente, é possível construir um anti- corpo que tenha regiões Fc duplas e que dessa forma pode ter capacidades intensificadas de lise de complementos e de ADCC. (Vide, por exemplo, Ste- vensonetal. 1989, Anti-Cancer Drug Design 3 :219-230.) Diversas modificações da região Fc já foram sugeridas na técni- ca, tanto na literatura científica quanto em documentos patentários, por e- xemplo, EP 0307434, WO 9304173, WO 9734631, WO 9744362, WO 9805787, WO 9943713, WO 9951642, WO 9958572, WO 02060919, WO 03074679, WO 2004016750, WO 2004029207, WO 2004063351, WO 2004074455, WO 2004035752, WO 2004099249, WO 2005077981, WO 2005092925, WO 2006019447, WO 2006031994, WO 2006047350, WO 2006053301, WO 2006088494 e WO 2007041635.

À; Em modalidades preferidas, os anticorpos da invenção são vari- .- 15 antes de Fc com substituições aminoacídicas nas posições 332 e/ou 239 e/ou 236. Em modalidades preferidas, os anticorpos da invenção têm muta- ções do domínio Fc selecionadas do grupo de i) uma única substituição na posição 332, de preferência 1332E; li) uma combinação de substituições nas posições 239 e 332, de preferência S239D/1332E; iii) uma combinação de substituições nas posições 236 e 332, de preferência G236A/ |1332E; iv) uma combinação de substituições nas posições 236, 239 e 332, de preferência G236A /S239D/1332E.

Neste contexto é particularmente preferido introduzir mutações no domínio F., em uma ou mais posições selecionadas de aminoácidos na posições 332 e/ou 239 e/ou 236 de acordo com o índice de numeração EU de Kabat. Particularmente preferidas são substituições nas posições 239 e 332, especialmente S239D/I1332E.

As variantes de Fc nos anticorpos da presente invenção são de- finidas de acordo com as modificações aminoacídicas que as compõem. As- sim, por exemplo, 1332E é uma variante de Fc com a substituição 1332E em

F relação ao polipeptídio Fc parental.

: Da mesma forma, S239D/I1332E define uma variante de Fc com as substituições S239D e 1332E e S239D/1332E/G236A define uma variante de Fc com as substituições S239D, 1332E, e G236A em relação ao polipep- tídioFc parental.

Para aumentar a meia-vida sérica do anticorpo, pode-se incorpo- rar um epitopo de ligação de receptor de salvamento no anticorpo (especi- almente um fragmento de anticorpo) como descrito na Patente US Nº

5.739.277, por exemplo. Conforme usado neste relatório, o termo "epitopo de ligação de receptor de salvamento" refere-se a um epitopo da região Fc de uma molécula de IgG (por exemplo, I9G1, I9G2, I9G3, ou I9G4) que é res- ponsável pelo aumento da meia-vida sérica in vivo da molécula de IgG.

Os anticorpos podem ser glicosilados em posições conservadas : em suas regiões constantes (vide, por exemplo, Jefferis & Lund, 1997, .- 15 Chem. Immunol. 65: 11 1-128; Wright & Morrison, 1997, Tib TECH 15:26- 32). As cadeias laterais oligossacarídicas das imunoglobulinas podem afetar a função da proteína (vide, por exemplo, Boyd et al/., 1996, MoT Immunol.

32: 1311 -1318; Wittwe & Howard, 1990, Biochem. 29: 4175-4180), e a inte- ração intramolecular entre porções da glicoproteíina que podem afetar a con- formação e apresentar uma superfície tridimensional da glicoproteína (vide, por exemplo, Jefferis & Lund, supra; Wyss & Wagner, 1996, Current Opin. Biotech. 7:409-416). Os oligossacarídeos também podem servir para vetori- zar uma dada glicoproteína para certas moléculas com base em estruturas de reconhecimento específicas. Por exemplo, já foi relatado que em uma IgG galactosilada, a porção oligossacarídica 'flips' fora do espaço inter-Cn2 e resíduos N-acetilglucosamina terminais ficam disponíveis para ligarem a pro- teína de ligação à manose (vide, por exemplo, Malhotra et a/. 1995, Nature Med. 1 :237-243). Remoção por glicopeptidase dos oligossacaríideos de CAMPATH-1H (um anticorpo IgGIl monoclonal humanizado recombinante que reconhece o antígeno CDw52 de linfócitos humanos) produzidos em células de ovário de hamster chinês (CHO) resultou em uma redução com- pleta na lise mediada por complementos (CMCL ou CDC) (Boyd et a/., 1996,

: MoT Immunol. 32: 131, 1-1318), ao passo que a remoção seletiva de resí- 2 duos ácido siálico usando neuraminidase não resultou em perda da CMCL.

Também foi relatado que a glicosilação de anticorpos afeta a ADCC. Em particular, foi relatado que células CHO com expressão regulada por tetraciclina de B(1.4)-N-acetilglucosaminiltransferase Il (GnTIII), uma glicosiltransferase que catalisa a formação de GIcNAc bissetriz, têm ativida- de de ADCC melhorada (vide, por exemplo, Umana et a/., 1999, Nature Bio- tech. 17: 176-180).

A glicosilação de anticorpos é tipicamente N-ligada ou O-ligada.

N-Higada refere-se à ligação da porção carboidrato à cadeia lateral de um resíduo asparagina. As sequências tripeptídicas asparagina-X-serina e aspa- ragina-X-treonina, onde X é qualquer aminoácido exceto prolina, são as se- quências de reconhecimento para ligação enzimática da porção carboidrato É à cadeia lateral da asparagina. Portanto, a presença de qualquer uma des- . 15 sas sequências tripeptídicas em um polipeptídio cria um sítio de glicosilação em potencial. Glicosilação O-ligada refere-se à ligação de um dos açúcares N-acetilgalaciosamina, galactose, ou xilose a um hidroxiaminoácido, mais comumente serina ou treonina, embora 5-hidroxiprolina ou 5-hidroxilisina também possam ser usadas.

Variantes de glicosilação de anticorpos são variantes nas quais o padrão de glicosilação de um anticorpo é alterado. Por alteração entende- se deleção de uma ou mais porções carboidrato encontradas no anticorpo, adição de uma ou mais porções carboidrato ao anticorpo, mudança na com- posição de glicosilação (isto é, padrão de glicosilação, a extensão de glicosi- lação,entre outras.

A adição de sítios de glicosilação ao anticorpo é conveniente- mente realizada por alteração da sequência aminoacídica de modo que ela contenha uma ou mais das sequências tripeptídicas descritas acima (para sítios de glicosilação N-ligada). A alteração também pode ser feita pela adi- ção, ou substituição, de um ou mais resíduos serina ou treonina à sequência do anticorpo original (para sítios de glicosilação O-ligada). Similarmente, a remoção de sítios de glicosilação pode ser feita por alteração aminoacídica

: nos sítios de glicosilação nativos do anticorpo.

ã A sequência aminoacídica é usualmente alterada por alteração da sequência de ácidos nucleicos subjacente. Esses métodos incluem, po- rém sem limitação, isolamento a partir de uma fonte natural (no caso de va- riantes de sequências aminoacídicas de ocorrência natural) ou preparação por mutagênese mediada por oligonucleotídeos (ou direcionada para o sítio), mutagênese por PCR, ou mutagênese de cassete de uma variante previa- mente preparada ou de uma versão não variante do anticorpo.

A glicosilação (incluindo padrão de glicosilação) de anticorpos também pode ser alterar sem alterar a sequência aminoacídica ou a se- quência nucleotídica subjacente. A glicosilação depende bastante da célula hospedeira usada para expressar o anticorpo. Como o tipo de célula usado para expressão de glicoproteínas recombinantes, por exemplo, anticorpos, : como potenciais terápicos raramente é a célula nativa, variações significati- . 15 vas no padrão de glicosilação dos anticorpos podem ser esperadas. (Vide, por exemplo, Hse et a/., 1997, Biol. Chem. 272:9062-9070.) Além da escolha das células hospedeiras, fatores que afetam a glicosilação durante a produ- ção recombinante de anticorpos incluem o modo de crescimento, a formula- ção do meio, a densidade da cultura, a oxigenação, o pH, os esquemas de purificação, entre outros. Já foram propostos vários métodos para alterar o padrão de glicosilação obtido em um organismo hospedeiro particular, inclu- indo a introdução ou a superexpressão de certas enzimas envolvidas na produção de oligossacarídeos (vide, por exemplo, Patentes US Nº

5.047.335, 5.510.261, e 5.278.299).

A glicosilação, ou certos tipos de glicosilação, pode ser removida enzimaticamente da glicoproteína, por exemplo, usando endoglicosidase H (Endo H). Além disso, a célula hospedeira recombinante pode ser construída geneticamente, por exemplo, deixada defeituosa no processamento de cer- tos tipos de polissacarídeos. Estas técnicas e técnicas similares são bastan- te conhecidas na literatura.

A estrutura de glicosilação dos anticorpos pode ser facilmente analisada por técnicas convencionais de análise de carboidratos, incluindo

: cromatografia de lectina, RMN, espectrometria de massa, HPLC, GPC, aná- e lise composicional de monossacarídeos, digestão enzimática sequencial, e HPAEC-PAD, que utiliza cromatografia por troca aniônica de pH elevado para separar oligossacarídeos com base na carga. Métodos para liberar oli- gossacarídeos com fins analíticos também são conhecidos, e incluem, sem limitação, tratamento enzimático (comumente efetuado usando peptídio-N- glicosidase F/endo-P-galactosidase), eliminação usando um ambiente alcali- no adstringente para liberar principalmente as estruturas O-ligadas, e méto- dos químicos usando hidrazina anidra para liberar oligossacarídeos tanto N- quanto O-ligados.

Os anticorpos também podem ter modificações (por exemplo, substituições, deleções ou adições) em resíduos aminoacídicos que intera- gem com receptores de Fc. Em particular, os anticorpos podem ter modifica- í ções em resíduos aminoacídicos que foram identificados como estando en- . 15 volvidos na interação entre o domínio anti-Fc e o receptor de FcRn (vide, por exemplo, Publicação Internacional Nº WO 97/34631).

Em seu aspecto mais amplo a presente invenção refere-se a a- gentes de ligação ao CD33 que se ligam ao CD33 humano e que são defini- dos por a) terem uma região variável de cadeia pesada compreendendo CDR1, CDR2 e CDR3, e uma região variável de cadeia leve compreendendo CDRA4, CDR5 e CDR6, onde CDR1 tem uma sequência aminoacídica sele- cionada dentre SEQ ID Nº: 1-14, CDR2 tem uma sequência aminoacídica selecionada dentre SEQ ID Nº: 15-28, CDR3 tem uma sequência aminoací- dica selecionada dentre SEQ ID Nº: 29-42, CDR4 tem uma sequência ami- noacídica selecionada dentre SEQ ID Nº: 43-56, CDR5 tem uma sequência aminoacídica selecionada dentre SEQ ID Nº: 57-70, CDR6 tem uma se- quência aminoacídica selecionada dentre SEQ ID Nº: 71-84, ou b) reconhecerem um epitopo na sequência aminoacídica FFHPIPYYDKNSPVHGYW (SEQ ID Nº: 141) de CD33 humano.

A presente invenção oferece ainda agentes de ligação ao CD33 onde a cinética de internalização dos agentes de ligação ao CD33 é tal que

: pelo menos 30% da quantidade inicial do anticorpo permanecem na superfi- " cie celular de células HL6O em um tempo de 4 horas depois da incubação.

Foi constatado que os agentes de ligação ao CD33 de acordo com a presente invenção se ligam a um epitopo diferente daquele do lintu- zumab, vide exemplo 4 deste relatório.

Os dois epitopos (SEQ ID Nº: 141 e SEQ ID Nº: 142) não são sobrepostos.

Acredita-se que os diferentes epito- pos no domínio exatracelular do CD33, que são reconhecidos pelos agentes de ligação ao CD33 de acordo com a presente invenção e pelo lintuzumab, são o motivo do comportamento de internalização e do desempenho de —ADCC diferentes dos agentes de ligação ao CD33 de acordo com a presente invenção e do lintuzumab (cf. exemplos 2 e 3 deste relatório). Em uma modalidade preferida pelo menos 40% da quantidade inicial dos agentes de ligação ao CD33 permanecem na superfície celular : em um tempo de 4 horas depois da incubação. .15 Em uma modalidade preferida a região variável de cadeia pesa- da compreende uma sequência aminoacídica selecionada dentre SEQ ID Nº: 85-98 e a região variável de cadeia leve compreende uma sequência amino- acídica selecionada dentre SEQ ID Nº: 99-1 12. Em uma modalidade preferida o agente de ligação ao CD33 tem uma cadeia pesada tendo uma sequência aminoacídica selecionada dentre SEQ ID Nº: 113-126 e uma cadeia leve tendo uma sequência aminoacídica selecionada dentre SEQ ID Nº: 127-140. Em uma modalidade preferida o agente de ligação ao CD33 tem uma afinidade tanto para CD33 humano quanto para CD33 cinomólogo com umkKpomenor ou iguala 10 nM.

Em uma modalidade preferida o agente de ligação ao CD33 é humanizado.

Em uma modalidade preferida o agente de ligação ao CD33 é to- talmente humano.

Em uma modalidade preferida o agente de ligação ao CD33 compreende ainda uma função efetora.

Em uma modalidade preferida a função efetora é mediada por

: um domínio Fr. - Em uma modalidade preferida o agente de ligação ao CD33 compreende uma ou mais mutações no domínio F. que modulam a função do domínio F.. Em uma modalidade preferida a modulação da função do domí- nio F. é um aumento de ADCC de pelo menos 10%, de preferência 50% ou 100%. Agentes de ligação ao CD33 particularmente preferidos de acor- do com a presente invenção estão listados na tabela 1:

as = o

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: Tratamento de Câncer Diversas publicações já descreveram o CD33 como um marca- dor de superfície celular em células de AML e CML primárias que é expresso nas células malignas de 70% a 100% dos pacientes (Scheinberg et a/., 1989; Hauswirt et al, 2007; Plesa et al., 2007; Webber et a/., 2008). CD33 é ex- presso em blastócitos mieloides malignos, que representam a maioria das células malignas no sangue periférico e na medula óssea de pacientes com leucemia, e nas células-tronco leucêmicas, um número relativamente pe- queno de células menos diferenciadas na medula óssea que se caracterizam por sua capacidade de auto-renovação e pela manutenção da hierarquia clonal leucêmica. A viabilidade clínica de atacar o CD33 usando anticorpos foi demonstrado pelo Mylotargº (Gemtuzumab ozogamizina), um conjugado de anticorpo-caliqueamicina que foi aprovado para o tratamento de pacien- ú tes com AML recidivante não elegíveis para outras opções de tratamento. . 15 Uma abordagem alternativa voltada para o CD33 é o desenvolvimento do lintuzumab (SGN-33, HuM195), um anticorpo monoclonal de IgGl humaniza- da que apresentou sinais precoces de eficácia em ensaios clínicos de fase | (Raza et al., 2009). Em conjunto, há uma abundância de dados, tanto pré- clínicos quanto clínicos, que ressaltam a importância e a viabilidade de ata- caro CD33 para o tratamento de AML e de outras malignidades positivas para CD33.

Leucemia mieloide aguda (AML) é uma malignidade da linhagem mieloide de células sanguíneas brancas. Esta neoplasia hematológica é uma doença do sangue e da medula óssea que, se não for tratada, é tipicamente fatal em questão de semanas a meses. Há uma prevalência estimada de 30000 casos de AML nos Estados Unidos e 47000 na União Europeia (da- dos de prevalência em 10 anos confirmados por Mattson-Jack, 2010). AML é a forma mais predominante de leucemia aguda no adulto (cerca de 90%), compreendendo cerca de 33% de novos casos de leucemia. A idade média dos pacientes diagnosticados com AML é de 67 anos. A AML representa cerca de 1,2% das mortes por câncer nos Estados Unidos.

A AML causa sintomas inespecíficos tais como perda de peso,

: fadiga, febre, e sudorese noturna.

A AML é diagnosticada por exames de - sangue, exame da medula óssea, e exames laboratoriais para determinar o subtipo de AML e para determinar as alternativas de tratamento.

A terapia para AML depende enormemente da idade e da tole- — rância do paciente.

Pacientes que toleram quimioterapia de indução intensi- va (e subsequente consolidação e manutenção) serão tratados intensamente com uma combinação de drogas citotóxicas.

Estes pacientes têm uma pro- babilidade de obter uma resposta completa de aproximadamente 75%. Nes- ta população de pacientes o objetivo terapêutico é a cura.

Ainda assim, reci- divade AML ocorre em cerca da metade dos pacientes dentro de um ano após obterem uma resposta completa.

Os índices de cura a longo prazo es- tão na faixa de 30%. Entretanto, o diagnóstico em idade mais avançada ou a existên- : cia de comorbidades não permite a administração de terapia de indução in- . 15 tensiva levando a um objetivo de tratamento paliativo.

Portanto, os índices de remissão caem significativamente em pacientes mais velhos com AML.

À sobrevivência média dos pacientes mais idosos com AML é inferior a 6 me- ses.

Em um aspecto, os agentes de ligação ao CD33 são úteis para tratar câncer, tal como retardando a evolução de um câncer e/ou reduzindo a caquexia associada ao câncer, ou prevenindo ou retardando a recorrência de uma malignidade hematológica (por exemplo, leucemia), em um mamiífe- ro, de preferência um paciente humano.

O agente de ligação ao CD33 pode ser administrado isolado ou coadministrado com um outro agente terapêuti- co.

Em algumas modalidades, o agente de ligação ao CD33 é coadministra- do com um padrão de cuidado quimioterapêutico.

O agente de ligação ao CD33 pode ser administrado em uma forma não conjugada (isto é, não con- jugado com uma citotoxina) ou como um conjugado.

Nesta subseção, um "paciente" é um ser humano ou outro ma- mífero que esteja recebendo tratamento para câncer, ou que tenha sido di- agnosticado com câncer.

Em algumas modalidades, os agentes de ligação ao CD33 são

. úteis para retardar a evolução de um câncer e/ou reduzir a caquexia associ- : ada ao câncer em um paciente administrando-se ao paciente com necessi- dade da mesma uma dosagem eficaz do agente de ligação ao CD33. Sem querermos nos ater a um mecanismo particular, o agente de ligação ao CD33 se liga a células efetoras ou acessórias das linhagens mieloides ou monocíticos (por exemplo, monócitos, macrófagos, células dendríticas, e neutrófilos), dessa forma inibindo ou reduzindo a produção de várias citoci- nas, quimiocinas e fatores de crescimento das células efetoras ou acessó- rios e/ou das células tumorais. Estas citocinas, quimiocinas e fatores de crescimento, que podem promover o crescimento e a proliferação de células tumorais e/ou contribuir para a caquexia associada ao câncer, incluem, po- rém sem limitação, interleucina-1B (IL-1B), fator de necrose tumoral a (TNF- a), interleucina-6 (IL-6), interleucina-8 (IL-8), interferon-y (IFN-y), fator de . crescimento endotelial vascular (VEGF), fator inibitório de leucemia (LIF), . 15 proteina-1 quimioatraente de monócitos (MCP-1), RANTES, interleucina-10 (IL-10), interleucina-12 (IL-12), metaloproteinase matricial 2 (MMP2), IP- 10 e/ou proteína inflamatória de macrófagos 1a (MIP1a). Os agentes de ligação ao CD33 também podem reduzir a migração de macrófagos para o sítio das células tumorais.

Em algumas modalidades, a administração de uma dosagem e- ficaz de um agente de ligação ao CD33 a um paciente reduz os níveis de pelo menos uma citocina, quimiocina ou fator de crescimento, citocina, qui- miocina ou fator de crescimento estes que podem promover o crescimento e a proliferação de células tumorais, promover a migração de células efetoras não malignas, tais como macrófagos associados a tumor (TAMS), para a vizinhança do sítio do tumor e/ou contribuir para a caquexia associada ao câncer. Em modalidades específicas, a citocina, quimiocina ou fator de cres- cimento é, por exemplo, interleucina- 12 (IL-18), fator de necrose tumoral a (TNF-a), interleucina-6 (IL-6), interleucina-8 (IL-8), interferon-y (IFN-y), fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), fator inibitório de leucemia (LIF), proteína-1 quimioatraente de monócitos (MCP-1), RANTES, interleucina-10 (IL-10), interleucina- 12 (IL-12), metaloproteinase matricial 2 (MMP2), IP-10

? e/ou proteína inflamatória de macrófagos 1a (MIP1a).

. Em uma outra modalidade, oferecemos um método para retardar a evolução de um câncer administrando a um paciente um regime eficaz de um agente de ligação ao CD33 que pode se ligar especificamente ao CD33.

Como resultado da administração do agente de ligação ao CD33, a evolução do câncer é retardada, tal como reduzindo o crescimento ou a proliferação das células tumorais, reduzindo a metástase, reduzindo o nível de pelo me- nos uma citocina, quimiocina ou fator de crescimento, reduzindo as células efetoras não malignas na vizinhança das células tumorais, entre outros.

Em uma outra modalidade, oferecemos um método para reduzir a carga tumoral em um paciente administrando ao paciente um regime eficaz de um agente de ligação ao CD33 que pode se ligar especificamente ao CD33. Como resultado da administração do agente de ligação ao CD33, a ã carga tumoral no paciente é suspendida ou reduzida, tal como por redução .- 15 do tamanho ou da massa do tumor, redução do nível de pelo menos uma citocina, quimiocina ou fator de crescimento, redução das células efetoras não malignas na vizinhança das células tumorais, inibição da migração de macrófagos na vizinhança das células tumorais, redução do número de célu- las efetoras não malignas (por exemplo, TAMS ou macrófagos) no tumor, entre outros.

Em uma outra modalidade, oferecemos um método para reduzir a carga tumoral ou retardar a evolução de um câncer em um paciente admi- nistrando ao paciente um regime eficaz de um agente de ligação ao CD33 que pode se ligar especificamente ao CD33. Como resultado da administra- çãodo agente de ligação ao CD33, a carga tumoral no paciente é suspendi- da ou reduzida, tal como por recrutamento de células efetoras imunes como células NK ou macrófagos ou monócitos, que pode destruir as células tumo- rais por mecanismos imunes.

Citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC) é um mecanismo mediado por células efetoras imunes que pode contribuir para a atividade antitumoral de anticorpos monoclonais (Weiner GJ. Monoclonal antibody mechanisms of action in cancer. Immunol Res. 2007,39(1-3):271-8).

x A relevância da ADCC para a eficácia antitumoral fora demonstrada em mo- : delos pré-clínicos, por exemplo em modelos tumorais em camundongos (por exemplo Clynes RA, Towers TL, Presta LG, Ravetch JV.Inhibitory Fc recep- tors modulate in vivo cytoxicity against tumor targets.

Nat Med. 2000 Apr; 6(4):443-6). Os dados dos ensaios clínicos suportam a relevância da ADCC para a eficácia clínica de anticorpos terapêuticos (por exemplo Weng WK, Levy R Two immunoglobulin G fragment C receptor polymorphisms indepen- dently predict response to rituximab in patients with follicular lIéómphoma.

J Clin Oncol. 2003 Nov 1; 21(21):3940-7. Epub 2003 Sep 15). As interações de anticorpos monoclonais com receptores de Fc em células imunes contri- buem para a ADCC.

O Fc dos anticorpos pode ser modificado de maneira a apresentar afinidade melhorada aos receptores de Fc (por exemplo Presta LG Engineering of therapeutic antibodies to minimize immunogenicity and optimize function.

Adv Drug Deliv Rev. 2006 Aug 7; 58(5-6):640-56. Epub . 15 2006 May 23). Tal afinidade melhorada para receptores de Fc resulta em atividade de ADCC aumentada que pode levar à eficácia antitumoral aumen-

tada nos pacientes.

Nas várias modalidades descritas nesta seção, o agente de liga- ção ao CD33 pode ser usado para tratar um câncer positivo para CD33 (isto é,acâncercompreendido de células cancerosas que superexpressam CD33 em sua superfície celular, ou que expressam CD33 em níveis considerados aceitáveis para terapias com anticorpos de CD33). O agente de ligação ao CD33 também pode ser usado para tratar um câncer que não superexpressa CD33 nas células efetoras não malignas em relação ao tecido normal do mesmo tipo.

O câncer pode ser, por exemplo, uma malignidade não- hematológica ou uma malignidade hematológica.

Em exemplos específicos, a malignidade hematológica pode ser positiva para CD33 e pode ser, por exemplo, leucemia linfoide aguda, leucemia mieloide aguda, leucemia mie- lomonocítica crônica, uma leucemia eritrocítica, leucemia megacarioblástica aguda, linfoma histiocítico, um sarcoma mieloide, um distúrbrio proliferativo de mastócitos ou síndrome mielodisplásica (MDS). Em algumas modalida- des, a malignidade hematológica é uma malignidade positiva para CD33, tal r como leucemia mieloide aguda ou síndrome mielodisplásica (MDS).

" Nas várias modalidades descritas nesta seção, o agente de liga- ção ao CD33 pode ser um anticorpo anti-CD33 não conjugado. Por exemplo, o anticorpo pode ser um anticorpo totalmente humano, humanizado ou qui- mérico, tal como um anticorpo quimérico ou humanizado M 195. O anticorpo também pode ser um outro anticorpo, tal como um anticorpo que compete com o anticorpo M 195 pela ligação ao CD33. O anticorpo também pode ser ligar ao mesmo epitopo que anticorpo M 195 ou a um epitopo diferente. Em outras modalidades, o agente de ligação ao CD33 pode ser ligado (isto é, conjugado) a uma citotoxina. A citotoxina pode ser, por exem- plo, uma toxina peptídica, tal como saporina, ricina, clorotoxina, exotoxina de pseudomonas, endotoxina de pseudomonas ou de toxina difteria. A citotoxi- na também pode ser uma toxina química (isto é, não peptídica), tal como S uma caliqueamicina, doxorubicina, uma camptotecina, daunorubicina, ou . 15 outros agentes de ligação a DNA. A citotoxina também pode ser uma auris- tatina, um maitansinoide, uma dolastatina, ou outros agentes bloqueadores de microtúbulos.

Um agente de ligação ao CD33 que é um anticorpo anti-CD33 pode ser administrado ao paciente por via intravenosa ou subcutânea a uma dosede0,1mg/kg ou menos a cerca de 25 mg/kg, de preferência 1,0 mg/kg a cerca de 10 mg/kg. Um agente de ligação ao CD33 que é um fragmento de um anticorpo anti-CD33 ou outra proteína de ligação ao CD33 pode ser ad- ministrado em uma dosagem equivalente a uma dose de 0,1 mg/kg a cerca de 25 mg/kg. 1,0 mg/kg a cerca de 10 mg/kg de anticorpo intacto. O agente deligaçãoao CD33 pode ser administrado por via intravenosa ou subcutâ- nea ao paciente em um programa que é, por exemplo, diário, semanal, quin- zenal, trissemanal (isto é, a cada três semanas) ou mensal, ou uma combi- nação destes, ao paciente. O agente de ligação ao CD33 pode ser adminis- trado por um período de pelo menos um mês, pelo menos dois meses, pelo menos trêsmeses, pelo menos quatro meses, pelo menos cinco meses, pelo menos seis meses, ou mais, conforme necessário. Em algumas modalida- des, uma fase de tratamento (supra) do agente de ligação ao CD33 é segui-

ã da por uma fase de manutenção, na qual as doses do agente de ligação ao CD33 são administradas com menos frequência que durante a fase de tra- tamento. Por exemplo, as doses de manutenção podem ser administradas semanalmente, quinzenalmente, trissemanalmente ou mensalmente, por um período de 1-6 meses. As dosagens na fase de manutenção podem ser as mesmas que as dosagens na fase de tratamento. Tratamento de uma malignidade hematológica em remissão Em um outro aspecto, oferecemos métodos para prevenir ou re- tardar a recorrência de uma malignidade hematológica (por exemplo, leuce- mia)em um paciente administrando ao paciente em remissão da malignida- de hematológica uma dosagem eficaz de um agente de ligação ao CD33, resultando na prevenção ou retardamento da recorrência da malignidade hematológica subjacente. O agente de ligação ao CD33 se liga especiífica- : mente ao CD33 na superfície da malignidade hematológica (isto é, célula .- 15 leucêmica) e/ou a células efetoras não-malignas.

Neste relatório, um "paciente" é tipicamente um ser humano que está fazendo tratamento de malignidade hematológica ou que tenha sido diagnosticado com uma malignidade hematológica. Em algumas modalida- des, a malignidade hematológica é uma malignidade hematológica positiva paraCD33. Malignidades hematológicas incluem, porém sem limitação, leu- cemias (por exemplo, leucemia linfoblástica aguda (ALL), leucemia mielogê- nica aguda (AML), leucemia mielogênica crônica (CML), leucemia mielomo- nocítica crônica, leucemia de células pilosas). Distúrbios sanguíneos relacio- nados incluem, porém sem limitação, síndrome mielodisplásica (MDS), mie- lofibrose, doenças mieloproliferativas (por exemplo, policitemia verdadeira (PV, PCV ou PRV), trombocitose essencial (ET)), e amiloide devido a uma doença das cadeias leves.

O termo "malignidade hematológica positiva para CD33" refere- se a uma malignidade hematológica caracterizada pela expressão de CD33 na superfície das células malignas. Malignidades hematológicas positivas para CD33 incluem, porém sem limitação, leucemia mieloide aguda (AML), leucemia mieloide crônica (CML), leucemia mielomonocítica crônica, leuce-

E mia trombocítica, uma síndrome mielodisplásica, um distúrbio mieloprolifera- tivo, anemia refratária, uma síndrome pré-leucemia, uma leucemia linfoide, ou uma leucemia não-diferenciada.

Em algumas modalidades, os métodos incluem administrar a um paciente em remissão de uma malignidade hematológica positiva para CD33 um regime eficaz de um agente de ligação ao CD33, com o que a recorrên- cia da malignidade hematológica é prevenida ou retardada. Em algumas modalidades, falta ao paciente de células detectáveis da malignidade hema- tológica. Conforme usado neste relatório, uma "falta de células dectectáveis" é determinada por métodos tradicionais de diagnóstico ou prognóstico. Um paciente em remissão de AML tipicamente exibe resolução de aspectos clí- nicos anormais, volta às contagens sanguíneas normais e hematopoiese normal na medula óssea com <5% de blastócitos, uma contagem de neutró- ê filos >1,000-1, 500, uma contagem de plaquetas >100,000, e desapareci- - 15 mentodo clone leucêmico. Vide, por exemplo, The Merck Manual, Sec. 11, Ch. 138 (17" ed. 1997): Estey, 2001, Cancer 92(5): 1059-1073.

O agente de ligação ao CD33 pode ser, por exemplo, um anti- corpo que se liga especificamente ao CD33 e a malignidade hematológica pode ser leucemia mieloide aguda (AML), leucemia mieloide crônica (CML), leucemia mielomonocítica crônica, leucemia timoide, uma síndrome mielo- displásica, um distúrbio mieloproliferativo, anemia refratária, uma síndrome pré-leucemia, uma leucemia linfoide, ou uma leucemia não-diferenciada.

Em algumas modalidades, o paciente em remissão da maligni- dade hematológica não fez transplante de medula óssea. Em outras modali- dades,o paciente em remissão da malignidade hematológica fez transplante de medula óssea. O transplante de medula óssea pode ser um transplante de medula óssea autólogo ou alogênico.

Os seguintes tipos de câncer são especialmente adequados pa- ra serem tratados com os anticorpos de acordo com a presente invenção: Cânceres transportados pelo sangue, incluindo, porém sem limi- tação: leucemia linfoblástica aguda "ALL", leucemia linfoblástica aguda de células B, leucemia linfoblástica aguda de células T, leucemia mieloblástica s aguda "AML", leucemia promielocítica aguda "APL", leucemia monoblástica . aguda, leucemia eritroleucêmica aguda, leucemia megacarioblástica aguda, leucemia mielomonocítica aguda, leucemia não-linfocítica aguda, leucemia não-diferenciada aguda, leucemia mielocítica crônica "CML", leucemia linfo- cíticacrônica "CLL", leucemia de células pilosas, mieloma múltiplo.

Leucemias agudas e crônicas, que são adequadas para serem tratadas com agentes de ligação ao CD33 incluem: leucemia linfoblástica, mielogênica, linfocítica, mielocítica e leucemia trombocítica. Além disso sín- drome mielodisplásica, distúrbios mieloproliferativos, anemia refratária, sin- drome pré-leucemia, leucemia linfoide, ou leucemia não-diferenciada podem ser tratados com agentes de ligação ao CD33.

Combinações com outras substâncias ativas Dependendo do distúrbio a ser tratado, os agentes de ligação ao : CD33 da invenção podem ser usados isolados ou em combinação com um -— 15 ou mais agentes terapêuticos adicionais, em particular selecionados dentre agentes lesionadores de DNA, agentes desmetilantes de DNA ou agentes de ligação à tubulina ou compostos terapeuticamente ativos que inibem a angi- ogênese, as vias de transdução de sinal ou pontos de verificação mitóticos em células cancerosas ou têm função imunomoduladora (IMIDs).

O agente terapêutico adicional pode ser administrado simultane- amente com, opcionalmente como um componente da mesma preparação farmacêutica, ou antes ou depois da administração do agente de ligação ao CD33.

Em certas modalidades, o agente terapêutico adicional pode ser, sem limitação, um ou mais inibidores selecionados do grupo de inibidores da família do EGFR, família do VEGFR, VEGF, IGF-1R, receptores de insulina, AuroraA, AuroraB, PLK e quinase PI3, FGFR, PDGFR, Raf, KSP ou PDK1.

Outros exemplos de agentes terapêuticos adicionais são inibido- res de CDKs, Akt, Src, Bcr-Abl, cKit, cMet/HGF, Her2, Her3, c-Myc, FIt3, HSP90, antagonistas de hedgehog, inibidores de JAK/STAT, Mek, mTor, FkappaB, o proteassoma, Rho, um inibidor da sinalização de Wnt ou da si- nalização de Notch ou um inibidor da via de ubiquitinação.

A Outros exemplos de agentes terapêuticos adicionais são inibido- - res da DNA polimerase, topoisomerase |l, inibidores da multitirosina, anta- gonistas de CXCRA, inibidores de IL3RA, antagonistas de RAR, inibidores de KIR, vacinas imunoterapêuticas, inibidores de TUB, indutores de Hsp70, inibidores da família de IAP, inibidores de DNA metiltransferase, inibidores de TNF, inibidores da tirosina quinase receptora de ErbBl, inibidores de mul- tiquinases, inibidores de JAK?2, inibidores de RR, indutores de apoptose, ini- bidores de HGPRTase, antagonistas do receptor da histamina H2 e agonis- tas do receptor de CD25.

Exemplos de inibidores de Aurora são, sem limitação, PHA- 739358, AZD-1152, AT-9283, CYC-116, R-763, VX-667, MLN-8045, PF- 3814735, SNS-314, VX-689, GSK-1070916, TTP-607, PHA-680626, MLN- 8237, BI847325 e ENMD-2076.

: Exemplos de inibidores de PLK são GSK-461364, BI2536 e BI6727.

As Exemplos de inibidores de raf são BAY-73-4506 (também um i- nibidor de VEGFR), PLX-4032, RAF-265 (também um inibidor de VEGFR), sorafenib (também um inibidor de VEGFR), XL-281, Nevavar (também um inibidor de VEGFR) e PLX4032.

Exemplos de inibidores de KSP são ispinesib, ARRY-520, AZD- 4877, CK-1122697, GSK-246053A, GSK-923295, MK-0731, SB-743921, LY- 2523355, e EMD-534085.

Exemplos de inibidores de src e/ou bcr-abl são dasatinib, AZD- 0530, bosutinib, XL-228 (também um inibidor de IGF-1R), nilotinib (também um inibidor de PDGFR e cKit), imatinib (também um inibidor de cKit), NS- 187, KX2-391, AP-24534 (também um inibidor de EGFR, FGFR, Tie2, FIt3), KM-80 e LS-104 (também um inibidor de FIt3, Jak2).

Um exemplo de um inibidor de PDK1 é AR-12. Um exemplo de um inibidor de Rho é BA-210. Exemplos de inibidores da quinase PI3 são PX-866, PX-867, BEZ-235 (também um inibidor de mTor), XL-147, e XL-765 (também um ini- bidor de mTor), BGT-226, CDC-0941.

Exemplos de inibidores de cMet ou HGF são XL- 184 (também fã um inibidor de VEGFR, cKit, FIt3), PF-2341066, MK-2461, XL-880 (também - um inibidor de VEGFR), MGCD-265 (também um inibidor de VEGFR, Ron, Tie2), SU-11274, PHA-665752, AMG-102, AV-299, ARQ-197, MetMAb, CGEN-241, BMS-777607, JNJ-38877605, PF-4217903, SGX-126, CEP- 17940, AMG-458, INCB-028060, e E-7050.

Um exemplo de um inibidor de c-Myc é CX-3543. Exemplos de inibidores de FIt3 são AC-220 (também um inibidor de cKit e PDGFR), KW-2449, LS-104 (também um inibidor de bcr-abl e Jak2), MC-2002, SB-1317, lestaurtinib (também um inibidor de VEGFR, PDGFR, PKC), TG-101348 (também um inibidor de JAK2), XL-999 (também um inibidor de cKit, FGFR, PDGFR e VEGFR), sunitinib (também um inibidor de PDGFR, VEGFR e cKit), e tandutinib (também um inibidor de PDGFR, e cKit).

& Exemplos de inibidores de HSP90 são tanespimicina, alvespimi- .- 15 cina,IPI-504, STA-9090, MEDI-561, AUY-922, C F-2024, e SNX-5422. Exemplos de inibidores de JAK/STAT são CYT-997 (também in- terage com tubulina), TG-101348 (também um inibidor de FIt3), e XL-019. Exemplos de inibidores de Mek são ARRY-142886, AS-703026, PD-325901, AZD-8330, ARRY-704, RDEA-119, e XL-518.

Exemplos de inibidores de mTor são temsirolimus, deforolimus (que também age como um inibidor de VEGF), everolimus (adicionalmente um inibidor de VEGF), XL-765 (também um inibidor da quinase PI3), e BEZ- 235 (também um inibidor da quinase PI3).

Exemplos de inibidores de Akt são perifosina, GSK-690693, RX- 0201,etriciribina.

Exemplos de inibidores de cKit são masitinib, OSI-930 (também age como um inibidor de VEGFR), AC-220 (também um inibidor de FIt3 e PDGFR), tandutinib (também um inibidor de FIt3 e PDGFR), axitinib (tam- bém um inibidor de VEGFR e PDGFR), sunitinib (também um inibidor de FIlt3, PDGFR, VEGFR), e XL-820 (também age como um inibidor de VEGFR e PDGFR), imatinib (também um inibidor de bcr-abl), nilotinib (também um inibidor de bcr-abl e PDGFR).

: Exemplos de antagonistas de hedgehog são IPI-609, CUR- 61414, GDC-0449, IPI-926, e XL-139. Exemplos de inibidores de CDK são selicíclib, AT-7519, P-276, ZK-CDK (também inibe VEGFR2 e PDGFR), PD-332991, R-547, SNS-032, PHA-690509, PHA-848125,e SCH-727965. Exemplos de inibidores de proteassoma são bortezomib, carfil- zomib, e PI-0052 (também um inibidor de FKappaB). Exemplos de inibidores de proteassoma/inibidores da via de NF- kappaB são bortezomib, carfilzomib, NPI-0052, CEP- 18770, MLN-2238, PR- 047,PR-957, AVE-8680, e SPC-839. Um exemplo de um inibidor da via de ubiquitinação é HBX-

41108. Exemplos de agentes desmetilantes são 5-azacitidina e decita- : bina.

As Exemplos de agentes antiangiogênicos são inibidores de FGFR, PDGFR e VEGF(R), e talidomidas, tais agentes sendo selecionados, sem limitação, dentre bevacizumab, motesanib, CDP-791, SU-14813, telatinib, KRN-951, ZK-CDK (também um inibidor de CDK), ABT-869, BMS-690514, RAF-265, IMC-KDR, IMC-18F1, IMiDs, talidomida, CC-4047, lenalidomida, ENMD-0995, FMC-D11, Ki-23057, brivanib, cediranib, 1B3, CP-868596, IMC-3G3, R-1530 (também um inibidor de FIt3), sunitinib (também um inibi- dor de cKit e FIt3), axitinib (também um inibidor de cKit), lestaurtinib (também um inibidor de FIt3 e PKC), vatalanib, tandutinib (também um inibidor de FIt3 e cKit), pazopanib, PF-337210, aflibercept, E-7080, CHIR-258, tosilato de sorafenib (também um inibidor de Raf), vandetanib, CP-547632, OS1-930, AEE-788 (também um inibidor de EGFR e Her2), BAY-57-9352 (também um inibidor de Raf), BAY-73-4506 (também um inibidor de Raf), XL-880 (tam- bém um inibidor de cMet), XL-647 (também um inibidor de EGFR e EphB4), XL-820 (também um inibidor de cKit), nilotinib (também um inibidor de cKit e brc-abl),), CYT-116, PTC-299, BMS-584622, CEP-11981, dovitiniby, CY- 2401401, ENMD-2976 e BIBF1120.

O agente terapêutico adicional também pode ser selecionado

: dentre inibidores de EGFR, ele pode ser um inibidor de EGFR de molécula pequena ou um anticorpo anti-EGFR.

Exemplos de anticorpos anti-EGFR são, sem limitação, cetuximab, panitumumab, nimotuzumab, zalutumumab; exemplos de inibidores de EGFR de molécula pequena são gefitinib, erloti- nib, vandetanib (também um inibidor de VEGFR) e afatinib (também um ini- bidor de Her2). Um outro exemplo de um modulador de EGFR é a toxina de fusão de EGF.

Outros inibidores de EGFR e/ou Her2 úteis para combinação com um agente de ligação ao CD33 da invenção são lapatinib, trastuzumab, pertuzumab, XL-647, neratinib, BMS-599626 ARRY-334543, AV412, mAB- 806, BMS-690514, JNJ-26483327, AEE-788 (também um inibidor de VEG- FR), AZD-8931, ARRY-380 ARRY-333786, IMC-11F8, Zemab, TAK-285, AZD-4769, e afatinib (inibidor duplo de Her2 e EGFR). : Inibidores de DNA polimerase úteis na combinação com um a- . 15 gentede ligação ao CD33 da invenção são Ara-C/citarabina, Clolar/ clofara- bina.

Um inibidor de DNA metiltransferase útil na combinação com um agente de ligação ao CD33 da invenção é Vidaza/azacitidina.

Um indutor de apoptose útil na combinação com um agente de ligaçãoao CD33 da invenção é Trisenox/trióxido de arsênio.

Inibidores de topoisomerase || úteis na combinação com um a- gente de ligação ao CD33 da invenção são idarubicina, daunorubicina e mi- toxantrona.

Um antagonista de RAR útil na combinação com um agente de ligaçãoao CD33 da invenção é Vesanoid/tretinoína.

Um inibidor de HGPRTase útil na combinação com um agente de ligação ao CD33 da invenção é Mercapto/mercaptopurina.

Um antagonista do receptor de histamina H2 útil na combinação com um agente de ligação ao CD33 da invenção é Ceplene/dicloridrato de histamina.

Um agonista do receptor de CD25 útil na combinação com um agente de ligação ao CD33 da invenção é IL-2.

: A droga adicional também pode ser selecionada dentre agentes que atacam as vias receptoras de IGF-1R e insulina. Tais agentes incluem anticorpos que se ligam ao IGF-1IR (por exemplo CP-751871, AMG-479, IMC-A12, MK-0646, AVE-1642, R-1507, BHB-022, SCH-717454, rhu Mab IGFRe novas entidades químicas que atacam o domínio quinase do IGF1-R (por exemplo OSI-906 ou BMS-554417, XL-228, BMS-754807).

Outros agentes que podem ser vantajosamente combinados em uma terapia com o agente de ligação ao CD33 da invenção são moléculas que atacam CD?20, incluindo anticorpos específicos para CD20 como rituxi- mab,LY-2469298, ocrelizumab, MEDI-552, FMMU-106, GA-101 (= R7159), XmAb-0367, ofatumumab, anticorpos radiomarcados para CD20, como tosi- tumumab e ibritumomab tiuxetan ou outras proteínas vetorizadas para CD20, como a SMIP Tru015, PRO-131921, FBT-AOS, veltuzumab, R-7159.

: Os agentes de ligação ao CD33 podem ser combinados com ini- . 15 bidores de outros antígenos superficiais expressos em leucócitos, em parti- cular anticorpos ou moléculas semelhantes a anticorpos, por exemplo anti- CD?2 (siplizumab), anti-CD4 (zanolimumab), anti-CD19 (MT-103, MDX-1342, SAR-3419, XmAb-5574), anti-CD22 (epratuzumab), anti-CD23 (lumiliximab), anti-CD30 (iratumumab), anti-CD32B (MGA-32 1 ), anti-cCD38 (HuMax- CD38), ant-CD40 (SGNA40), anti-CD52 (alemtuzumab), anti-CD80 (galixi- ma)b).

Outros agentes a serem combinados com agentes de ligação ao CD33 são imunotoxinas comoBL-22 (uma imunotoxina anti-CD22), inotuzu- mab ozogamicina (um conjugado de anticorpo anti-CD23-caliqueamicina), RFT5.dgA (cadeia A da toxina ricina anti-CD25), SGN-35 (um conjugado de anti-CD30-auristatina E), e gemtuzumab ozogamicina (um conjugado de an- ti-CD33 caliqueamicina), MDX-1411 (conjugado anti-CD70), ou anticorpos radiomarcados como *ºY-epratuzumab (radioimunoconjugado anti-CD22).

Além disso, os agentes de ligação ao CD33 podem ser combi- —nados com agentes imunomoduladores, por exemplo, anticorpos, que indu- zem a apoptose ou modificam vias de transdução de sinal como os modula- dores do receptor de TRAIL mapatumumab (um agonista do de receptor à TRAIL-1), lexatumumab (um agonista do receptor de TRAIL-2), tigatuzumab, Apomab, AMG-951 e AMG-655; um anticorpo anti-HLA-DR (como 1D09C3), um anti-CD74, um inibidor do ligando do fator de diferenciação de osteoclas- tos (como denosumab), um antagonista de BAFF (como AMG-623a) ou um agonistade receptor Toll-like (por exemplo TLR-4 ou TLR-9).

Outras drogas que podem ser usadas em combinação com os agentes de ligação ao CD33 da presente invenção são selecionadas, porém sem limitação, dentre hormônios, análogos hormonais e anti-hormonais (por exemplo tamoxifeno, toremifeno, raloxifeno, fulvestrant, acetato de meges- trol, flutamida, nilutamida, bicalutamida, acetato de ciproterona, finasterida, acetato de buserelina, fludrocortinsona, fluoximesterona, medroxiprogeste- rona, caproato de hidroxiprogesterona, dietil stilbestrol, propionato de testos- terona, fluoximesterona/equivalentes, octreotida, arzoxifeno, pasireotida, va- : preotida, adrenocorticosteroides/ antagonistas, prednisona, 225 dexametasona, ainoglutetimida), inibidores de aromatase (por exemplo anastrozole, letrozol, liarozol, exemestano, atamestano, formesta- no), agonistas e antagonistas de LHRH (por exemplo acetato de goserelina, leuprolida, abarelix, cetrorelix, deslorelina, histrelina, triptorelina), antimeta- bólitos (por exemplo antifolatos como metotrexato, trimetrexato, pemetrexed, análogos de pirimidina como 5-fluorouracil, fluordexosiuridina, capecitabina, decitabina, nelarabina, 5-azacitidina, e gemcitabina, purina e análogos de adenosina tais como mercaptopurina, tioguanina, azatioprina, cladribina e pentostatina, citarabina, fludarabina, clofarabina); antibióticos antitumorais (por exemplo antraciclinas como doxorubicina, daunorubicina, epirubicina e idarubicina, mitomicina-C, bleomicina dactinomicina, plicamicina, esplicami- cina, actimomicina D, mitoxantrona, mitoxantroneidarubicina, pixantrona, estreptozocina, afidicolina); derivados de platina (por exemplo cisplatina, o- xaliplatina, carboplatina, lobaplatina, satraplatina); agentes alquilantes (por exemplo estramustina, semustina, mecloretamina, melfalano, clorambucil, busulfano, dacarbazina, ciclofosfamida, ifosfamida, hidroxiureia, temozolo- mida, nitrosoureias tais como carmustina e lomustina, tiotepa); agentes an- timitóticos (por exemplo alcaloides da vinca como vimblastina, vindesina,

E vinorelbina, vinflunina e vincristina; e taxanos como parclitaxel, docetaxel e suas formulações, larotaxel; simotaxel, e epotilonas como ixabepilona, patu- pilona, ZK-EPO); inibidores de topoisomerase (por exemplo epipodofilotoxi- nas como etoposida e etopophos, teniposida, ansacrina, topotecano, irinote- cano, banoxantrona, camptotecina) e quimioterápicos diversos tais como derivados de ácido retinoico, amifostina, anagrelida, interferon alfa, interferon beta, interferon gama, interleucina-2, procarbazina, N-metil-hidrazina, mito- tano, e porfímero, bexaroteno, celecoxib, etilenomina/metil-melamina, trieti- lenomelamina, trietileno tiofosforamida, hexametilmelamina, e as enzimas L- asparaginase, L-arginase e metronidazol, misonidazol, desmetilmisonidazol|, pimonidazol, etanidazol, nimorazol, RSU 1069, EO9, RB 6145, SR4233, nico- tinamida, 5-bromodesoxiuridina, 5-iododesoxiuridina, bromodesoxicitidina, eritro-hidroxinonil-adenina, antracenodiona, GRN-163L (um antagonista : competitivo do padrão de telomerase), SDX-101 (um agonista de PPAR), . 15 talabostat (um inibidor de DPP), forodesina (um inibidor de PNP), atacicept (um receptor solúvel que ataca os membros BLyS e APRIL da família de TNF), agentes neutralizantes de TNF-alfa (Enbrel, Humira, Remicade), XL- 844 (um inibidor de CHK1/2 inhibitor), V P-40101M (um agente alquilante de DNA), SPC-2996 (um inibidor antissentido de bcl2), obatoclax (um inibidor de bcl2), enzastaurina (um modulador de PKC beta), vorinistat (um inibidor de HDAC), romidepsina (um inibidor de HDAC), AT-101 (um inibidor de Bcl- 2/Bcl-xL), plitidepsina (um depsipeptídio multiação), SL-11047 (um modula- dor do metabolismo de poliamina).

Os agentes de ligação ao CD33 da invenção também podem ser usadosem combinação com outras terapias que incluem cirurgia, transplan- te de células-tronco, radioterapia, terapia endócrina, modificadores de res- posta biológica, hipertermia e crioterapia e agentes para atenuar qualquer efeito adverso (por exemplo antieméticos), G-CSF, GM-CSF, fotossensibili- zadoress tais como derivadoss de hematoporfirina, fotofrina, derivados de — benzoporfirina, Npe6, etioporfirina estanhada, pheoboride-a bacterioclorofila- a, naftalocianinas, ftalocianinas, ftalocianinas Zíncicas.

Composições Farmacêuticas e Métodos de Administração

3 Os agentes de ligação ao CD33 podem estar em qualquer forma que permita que a composição seja administrada ao paciente. Por exemplo, a composição pode estar na forma de um sólido ou de um líquido. O modo de aplicação preferido é parenteral, por infusão ou injeção (intravenosa, in- tramuscular, subcutânea, intraperitoneal, intradérmica), mas outros modos de aplicação tais como por inalação, por via transdérmica, intranasal, bucal, oral e intratumoral também podem ser aplicáveis. Administração parenteral inclui injeções subcutâneas, injeção intravenosa, intramuscular, intraesternal ou técnicas de infusão. Em um aspecto, as composições podem ser adminis- tradas por via parenteral. Em um outro aspecto, os compostos são adminis- trados por via intravenosa.

As composições farmacêuticas podem ser formulados de manei- ra a permitir que um composto esteja biodisponível quando da administração : da composição ao paciente. As composições podem adquirir a forma de uma .- 15 ou mais unidades de dosagem, onde, por exemplo, um recipiente de um composto em forma aerossol pode conter uma pluralidade de unidades de dosagem.

Os materiais usados na preparação das composições farmacêu- ticas devem atóxicos nas quantidades usadas. Ficará evidente para os es- pecialistas na técnica que a dosagem ideal dos princípios ativos na compo- sição farmacêutica vai depender de diversos fatores. Fatores importantes incluem, sem limitação, o tipo de paciente (por exemplo, humano) a forma particular do composto, o modo de administração, e a composição emprega- da.

O carreador ou veículo farmaceuticamente aceitável pode ser particulado, de modo que as composições estejam, por exemplo, em forma de pó. Os carreadores podem ser líquidos, com as composições sendo, por exemplo, um líquido injetável. A composição pode estar na forma de um lí- quido, por exemplo, para injeção parenteral. Em uma composição para ad- ministração por injeção, um ou mais de um tensoativo, preservativo, agente umectante, agente dispersante, agente suspensor, tampão, estabilizante e agente isotônico também podem ser incluídos.

S As composições líquidas, sejam elas soluções, suspensões ou outra forma parecida, também podem incluir um ou mais dos seguintes: dilu- entes estéreis tais como água para injeção, solução salina, de preferência solução salina fisiológica, solução salina de Ringer, cloreto de sódio isotôni- co, óleos fixostais como monoglicerídeos ou diglicerídeos sintéticos que po- dem servir de solvente ou meio de suspensão, polietileno glicóis, glicerina, ciclodextrina, propileno glicol ou outros solventes; estabilizantes tais como aminoácidos; tensoativos tais como polissorbatos; agentes antibacterianos tais como álcool benzílico ou metil parabeno; antioxidantes tais como ácido ascórbico ou bissulfito de sódio; agentes quelantes tais como ácido etileno- diaminatetra-acético; tampões tais como acetatos, citratos ou fosfatos; e a- gentes para o ajuste tonicidade tais como cloreto de sódio ou dextrose. Uma composição parenteral pode estar encerrada em uma ampola, uma seringa : descartável ou frasco multidoses feito de vidro, plástico ou outro material.

MS Solução salina fisiológica é um adjuvante exemplificativo. Uma composição injetável é de preferência estéril. Os agentes de ligação ao CD33 também podem ser secados (secados por congelamento, secados por aspersão, secados por aspersão e congelamento, secados por gases quase críticos ou supercríticos, secados a vácuo, secados ao ar), precipitados ou cristalizados ou aprisionados em mi- crocápsulas que são preparadas, por exemplo, por técnicas de coacervação ou por polimerização interfacial usando, por exemplo, hidroximetilcelulose ou gelatina e poli-(metil metacrilato), respectivamente, em sistemas de distribui- ção de droga coloidais (por exemplo, lipossomas, microesferas de albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas), em macroemulsões ou precipitados ou imobilizados em carreadores ou superfícies, por exemplo pela tecnologia de pemc (microcristais revestidos com proteínas). Tais técni- cas estão descritas em Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21*' edition, Hendrickson R. Ed.

A quantidade de composição que é eficaz no tratamento de um distúrbio ou condição particular vai depender da natureza eo distúrbio ou condição, e pode ser determinada por técnicas clínicas tradicionais. Além

: disso, ensaios in vitro ou in vivo podem ser opcionalmente empregados para ajudar a identificar as faixas de dosagem ideais. A dose exata a ser empre- gada nas composições também vai depender da via de administração, e da gravidade da doença ou distúrbio, e deve ser decidida de acordo com o crité- riomédicoe com as circunstâncias de cada paciente.

As composições compreendem uma quantidade eficaz de uma droga(s) ou agente(s) de modo que seja obtida uma dosagem adequada. Tipicamente, esta quantidade é de preferência cerca de 0,01% de uma dro- ga ou agente em peso da composição. Quando destinada à administração oral, esta quantidade pode ser alterada de modo a variar de cerca de 0,1% a cerca de 80% em peso da composição. Em um aspecto, as composições orais podem compreender de cerca de 4% a cerca de 50% do composto em peso da composição. Em ainda um outro aspecto, as presentes composi- ções são preparadas de modo que uma unidade de dosagem parenteral — 15 contenhade cerca de 0,01% a cerca de 2% em peso do composto.

Para administração intravenosa, a composição pode compreen- der de cerca de 1 a cerca de 50 mg de uma droga ou agente por kg de peso corporal do paciente. Em um aspecto, a composição pode incluir de cerca de 1, 1,5 ou 2,5 a cerca de 50 mg de uma droga ou agente por kg de peso cor- poraldo paciente. Em um outro aspecto, a quantidade administrada vai vari- ar na faixa de cerca de 1, 1,5 ou 2,5 a cerca de 25 mg/kg de peso corporal de uma droga ou agente.

Em algumas modalidades, a dosagem administrada a um paci- ente é menor que 0,1 mg/kg a cerca de 50 mg/kg de peso corporal do paci- ente (Para conversão para mg/mm?, um BSA de 1,8 m? e um peso corporal de 80 kg podem ser usados.) Como discutido neste relatório, um agente de ligação ao CD33 pode ser administrado por via intravenosa ou subcutânea ao paciente em um programa que é, por exemplo, diário, semanal, quinzenal, trissemanal ou mensal para o paciente. Por exemplo, um agente de ligação ao CD33 pode ser administrado semanalmente, por um período de 2 a 10 semanas, tipica- mente 3-6 semanas. Em algumas modalidades, o regime de dosagem do

: agente de ligação ao CD33 mantém uma concentração sérica sanguínea de anticorpo de pelo menos 5 pg/ml ou pelo menos 10 pg/ml durante o ciclo de dosagem.

O agente de ligação ao CD33 pode ser administrado, por exem- plo, em 1-8 ciclos, ou mais.

Em algumas modalidades, um agente de ligação aoCD33é cronicamente administrado a um indivíduo.

A título de exemplo, a invenção inclui um método de tratamento de um câncer, tal como leucemia mieloide, por administração de 0,1 mg/kg a 50 mg/kg, por exemplo cerca de 1,5-8 ou 2,5-8 mg/kg, de um anticorpo anti- CD33 de acordo com a invenção semanalmente.

Este tratamento geralmen- te pode continuar por cerca de 1-3 meses, tipicamente por cerca de dois meses.

Em uma modalidade, o programa de dosagem é mantido até que seja observada uma redução no número de blastos.

Por exemplo, a dosa- gem pode continuar por até cerca de 6 meses.

Este tratamento pode ser se- ã guido por um programa de dosagem menos frequente, envolvendo por e- . 15 xemplo doses quinzenais (ou duas vezes ao mês). Este programa de dosa- gem pode ser mantido por 1, 2, 3, 4, 5, 6 meses ou mais para manter uma redução no número de blastos e/ou uma remissão.

Em algumas modalidades, um agente profilático pode ser admi- nistrado junto com um agente de ligação ao CD33 para minimizar reações de infusão.

Agentes profiláticos adequados incluem, por exemplo, metil prednisolona, difenildramina, acetaminofeno ou outro agente adequado.

O agente profilático pode ser administrado antes do agente de ligação ao CD33 ou aproximadamente ao mesmo tempo que este.

As drogas ou agentes ou composições podem ser administrados por qualquer via conveniente, por exemplo, por infusão ou injeção de bolo, por absorção através de revestimentos epiteliais ou mucocutâneos (por e- xemplo, mucosa oral, mucosa retal e intestinal, etc.). A administração pode ser sistêmica ou local.

Vários sistemas de distribuição são conhecidos, por exemplo, encapsulação em lipossomas, micropartículas, microcápsulas, — cápsulas, etc., e podem ser usados para administrar um composto.

Em cer- tas modalidades, mais de uma droga ou agente ou composição é adminis- trada ao paciente.

S Pode ser desejável administrar uma ou mais drogas ou agentes ou composições localmente à área com necessidade de tratamento, confor- me apropriado para a droga ou agente. Isto pode ser obtido, por exemplo, e não a título limitativo, por infusão local durante uma cirurgia; aplicação tópi- ca,por exemplo, junto com um curativo após uma cirurgia; por injeção; por meio de um cateter; por meio de um supositório; ou por meio de um implan- te, o implante sendo um material poroso, não-poroso, ou gelatinosa, incluin- do membranas, tais como membranas sialásticas, ou fibras. Em uma moda- lidade, a administração pode ser feita por injeção direta no sítio (ou sítio an- tigo)de um câncer, tumor ou tecido neoplásico ou pre-neoplásico.

As drogas ou agentes ou composições podem ser distribuídos por um sistema de liberação controlada, tal como uma bomba ou vários ma- teriais poliméricos. Em uma outra modalidade, um sistema de liberação con- j trolada pode ser colocado próximo ao alvo das drogas ou agentes ou com- - 15 posições, requerendo assim somente uma fração da dose sistêmica (vide, por exemplo, Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, vol. 2, págs. 115-138, 1984). Outros sistemas de liberação controlada discutidos na recapitulação feita por Langer (1990, Science 249: 1527-1533) podem ser usados.

As drogas ou agentes são formulados de acordo com procedi- mentos de rotina como uma composição farmacêutica adaptada para admi- nistração instravenosa a animais, particularmente seres humanos, conforme apropriado para a droga ou agente. Tipicamente, os carreadores ou veículos para administração intravenosa são soluções tamponantes aquosas isotôni- cas estéreis. Onde necessário, as composições também podem incluir um agente solubilizante. As composições para administração intravenosa podem compreender opcionalmente um anestésico local tal como lignocaína para acalmar a dor no sítio da injeção. Geralmente, os componentes são apresen- tadas seja separadamente ou misturados em uma forma de dosagem unitá- ria, por exemplo, tal como um pó liofilizado seco ou um concentrado livre de água em um recipiente hermeticamente fechado tal como uma ampola ou sachê indicando a quantidade do princípio ativo. Onde a droga ou agente

: deve ser administrado por infusão, ele pode ser dispensado, por exemplo, com um frasco de infusão contendo água de grau farmacêutico estéril ou solução salina. Onde a droga ou agente é administrado por injeção, uma ampola de água estéril para injeção ou solução salina pode ser fornecida paraque os componentes possam ser misturados antes da administração.

As composições de agentes terapêuticos também podem ser administradas de acordo com formas de dosagem aceitas na forma de com- primidos, pastilhas, suspensões aquosas ou oleosas, grânulos, pós, emul- sões, cápsulas, xaropes, ou elixires, por exemplo. As composições adminis- tradas por via oral podem conter um ou mais agentes opcionais, por exem- plo, agentes adoçantes tais como frutose, aspartame ou sacarina; agentes flavorizantes tais como hortelá-pimenta, óleo de gualtéria, ou cereja; agentes corantes; e agentes preservativos, para proporcionar uma preparação far- é maceuticamente saborosa. Além disso, quando na forma de comprimido ou .- 15 pílula as composições podem ser revestidas para retardar a desintegração e absorção no trato gastrointestinal proporcionando assim uma ação sistemá- tica por um período de tempo prolongado. Membranas seletivamente per- meáveis envolvendo um composto propulsor osmoticamente ativo também são adequadas para drogas ou agentes administrados por via oral. Nestas últimas plataformas, o fluido do ambiente que envolve a cápsula é absorvido pelo composto propulsor, que incha para deslocar o agente ou a composição de agente através de uma abertura. Estas plataformas de distribuição podem proporcionar um perfil de distribuição de ordem essencialmente zero ao con- trário dos perfis pontudos das formulações de liberação imediata. Um mate- rial de retardamento tal como monoestearato de glicerol ou estearato de gli- cerol também pode ser usado. A composição pode incluir vários materiais que modificam a for- ma física de uma unidade de dosagem sólida ou líquida. Por exemplo, a composição pode incluir materiais que formam um revestimento em volta dos princípios ativos. Os materiais que formam o revestimento são tipica- mente inertes, e podem ser selecionados, por exemplo, dentre açúcar, go- ma-laca, e outros agentes de revestimento entéricos. Alternativamente, os

S princípios ativos podem ser inseridos em uma cápsula de gelatina.

As composições podem ser administradas a um paciente com necessidade da mesma a uma frequência, ou durante um período de tempo, que é determinado pelo médico assistente. As composições podem ser ad- ministradas durante um período de 1 dia, 2 dias, 3 dias, 5 dias, 7 dias, 10 dias, 14 dias, 21 dias, 28 dias, um mês, dois meses, ou períodos de tempo maiores. Fica entendido que as composições podem ser administradas por qualquer período de tempo entre 1 dia e dois meses ou mais.

Produção de anticorpos Anticorpos podem ser produzidos usando-se qualquer método útil para a síntese de anticorpos, em particular, tal como por expressão re- combinante ou síntese química.

A expressão recombinante de anticorpos, ou fragmentos ou de- : rivados dos mesmos, envolve tipicamente a construção de um ácido nucleico — 15 que codifica o anticorpo. Se a sequência nucleotídica do anticorpo for co- nhecida, um ácido nucleico codificando o anticorpo ou um polipeptídio do mesmo pode ser montado a partir de oligonucleotídeos sintetizados quimi- camente (por exemplo, como descrito em Kutmeier et a/., 1994, BioTechni- ques 17: 242), que envolve a síntese de oligonucleotídeos superpostos con- tendo porções da sequência codificando o anticorpo, combinação e ligação desses oligonucleotídeos, e então amplificação dos oligonucleotídeos liga- dos, por exemplo, por PCR.

Alternativamente, uma molécula de ácido nucleico codificando um anticorpo ou um polipeptídio do mesmo pode ser gerada a partir de uma fonte adequada. Se um clone contendo o ácido nucleico codificando o anti- corpo particular não estiver disponível, mas a sequência do anticorpo for co- nhecida, um ácido nucleico codificando o anticorpo pode ser obtido de uma fonte adequada (por exemplo, uma biblioteca de cDNA de anticorpo, uma biblioteca de cDNA gerada a partir de qualquer tecido ou célula expressando a imunoglobulina), por exemplo, por amplificação por PCR usando iniciado- res sintéticos hibridizáveis para as extremidades 3' e 5' da sequência ou por clonagem usando uma sonda oligonucleotídica específica para a sequência

S gênica particular.

Se um anticorpo que reconhece especificamente um antígeno particular não estiver comercialmente disponível (ou uma fonte para uma biblioteca de cDNA para clonagem de um ácido nucleico codificando tal imu- —noglobulina não estiver disponível), anticorpos específicos para um antígeno particular podem ser gerados por qualquer método conhecido na literatura, por exemplo, por imunização de um paciente, ou um modelo animal adequa- do tal como um coelho ou camundongo, para gerar anticorpos policlonais ou, mais preferivelmente, gerando anticorpos monoclonais, por exemplo, da ma- neira descrita por Kohler & Milstein (1975, Nature 256:495-497) ou da manei- ra descrita por Kozbor et a/. (1983, Immunology Today 4:72) ou Cole et al. (1985, in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., págs. 77-96). Alternativamente, um clone codificando pelo menos a porção 5 Fab do anticorpo pode ser obtido por rastreamento de bibliotecas de expres- sãode Fab (por exemplo, da maneira descrita por Huse et a/., 1989, Science 246, 1275-1281) para clones de fragmentos Fab que se ligam ao antígeno específico ou por rastreamento de bibliotecas de anticorpos (vide, por exem- plo, Clackson et a/., 1991, Nature 352:624; Hane et a/., 1997, Proc. Natl. A- cad. Sci. USA 94:4937).

Uma vez obtida uma sequência de ácidos nucleicos codificando pelo menos o domínio variável do anticorpo, ela pode ser introduzida em um vetor contendo a sequência nucleotídica codificando as regiões constantes do anticorpo (vide, por exemplo, Publicação Internacional Nº WO 86/05807; WO 89/01036; e Patente US Nº 5.122.464). Vetores contendo a cadeia leve ou pesada completa que permitem a expressão de uma molécula de anticor- po completa encontram-se disponíveis. Então, o ácido nucleico codificando o anticorpo pode ser usado para introduzir as substituições ou deleções nucle- otídicas necessárias para substituir (ou deletar) o um ou mais resíduos ciste- ina de região variável participando em uma ligação dissulfeto intracadeias comum resíduo aminoacídico que não contém um grupo sulfidrila. Tais mo- dificações podem ser efetuadas por qualquer método conhecido na literatura para a introdução de mutações ou deleções específicas em uma sequência

S nucleotídica, por exemplo, porém sem limitação, mutagênese química e mu- tagênese direcionada para o sítio in vitro (vide, por exemplo, Hutchinson et al., 1978, J. Biol. Chem. 253 :6551).

Além disso, já foram desenvolvidas técnicas para a produção de "anticorpos quiméricos" (vide, por exemplo, Morrison et a/l., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 : 851-855; Neuberger et a/., 1984, Nature 312:604-608; Takeda et a/., 1985, Nature 314:452-454). Um anticorpo quimérico é uma molécula na qual diferentes porções são derivadas de diferentes espécies animais, tais como aquelas tendo uma região variável derivado de um anti- corpo monoclonal murino e uma região constante de imunoglobulina huma- na, por exemplo, anticorpos humanizados.

Uma vez obtida uma sequência de ácidos nucleicos codificando um anticorpo, o vetor para a produção do anticorpo pode ser produzido pela S tecnologia de DNA recombinante usando-se técnicas conhecidas na literatu- — 15 ra. Métodos que já são conhecidos pelos especialistas na técnica podem ser usados para construir vetores de expressão contendo as sequências codifi- cadoras do anticorpo e sinais de controle de transcrição e translação apro- priados. Estes métodos incluem, por exemplo, técnicas de DNA recombinan- te in vitro, técnicas sintéticas, e recombinação genética in vivo. Vide, por e- xemplo,as técnicas descritas por Sambrook et a/. (1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual. 2" Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.; e Sambrook et a/., 2001; Molecular Cloning, A Laboratory Ma- nual, 3º Ed., Cold Spring Harbor Publish., Cold Spring Harbor, N.Y.) e Au- subel et a/. (eds., 1993-2006, Current Protocols in Molecular Biology, John Wikey&Sons,N.Y.).

Um vetor de expressão compreendendo a sequência nucleotídi- ca de um anticorpo ou a sequência nucleotídica de um anticorpo pode ser transferido para uma célula hospedeira por técnicas convencionais (por e- xemplo, electroporação, translação lipossômica, precipitação por fosfato de cálciooutransdução), e as células resultantes são então cultivadas por téc- nicas convencionais para produzir o anticorpo. Em modalidades específicas, a expressão do anticorpo é regulada por um promotor constitutivo, um pro-

ã motor induzível ou um promotor específico para tecido.

As células hospedeiras usadas para expressar o anticorpo re- combinante podem ser células bacterianas tais como Escherichia coli, ou, de preferência, células eucarióticas, especialmente para a expressão de molé- —culasdeimunoglobulina recombinantes. Em particular, células de mamíferos tais como células de ovário de hamster (CHO), em conjunto com um vetor contendo o principal elemento promotor de gene precoce intermediário do citomegalovírus humano é um sistema de expressão eficaz para imunoglo- bulinas (vide, por exemplo, Foecking et a/., 1986, Gene 45: 101; Cockett el al, 1990, BioTechnology 8:2). A linhagem celular CHO pode ser, por exem- plo, DG44 ou CHO-S. Em um outro exemplo, um anticorpo pode ser expres- so usando-se o sistema CHEF. (Vide, por exemplo, Patente US Nº

5.888.809).

: Uma variedade de outros sistemas de vetor de expressão de — 15 hospedeiro pode ser utilizada para expressas anticorpos. Tais sistemas de expressão de hospedeiro representam veículos por meio dos quais as se- quências codificadoras do anticorpo podem ser produzidas e subsequente- mente purificadas, mas também representam células que, quando transfor- madas ou transfectadas com as sequências codificadoras nucleotídicas a- propriadas, podem expressar uma molécula de imunoglobulina do anticorpo in situ. Estes incluem, porém sem limitação, micro-organismos tais como bactérias (por exemplo, E. coli e B. subtilis) transformadas com vetores de expressão de DNA de bacteriofago recombinante, DNA de plasmídeo ou DNA de cosmídeo contendo sequências codificadoras de imunoglobulina; leveduras (por exemplo, Saccharomyces pichia) transformadas com vetores de expressão de levedura recombinante contendo sequências codificadoras de anticorpo; sistemas de células de insetos infectadas com vetores de ex- pressão de vírus recombinante (por exemplo, baculovírus) contendo as se- quências codificadoras de imunoglobulina; sistemas de células vegetais in- fectadas com vetores de expressão de vírus recombinante (por exemplo, vírus do mosaico da couve-flor (CaMV) e vírus do mosaico do tabaco (TMV)) ou transformadas com vetores de expressão de plasmídeo recombinante

* (por exemplo, plasmídeo Ti) contendo sequências codificadoras de anticor- po; ou sistemas de células de mamíferos (por exemplo, células COS, CHO, CHO-S, BH, 293, 293T ou 3T3) ancorando construções de expressão re- combinantes contendo promotores derivados do genoma de células de ma- miíferos (por exemplo, promotor da metalotioneína) ou de vírus de mamíferos (por exemplo, o promotor tardio do adenovírus; o promotor de 7,5K do vírus vaccinia).

Em sistemas baterianos, inúmeros vetores de expressão podem ser vantajosamente selecionados dependendo do uso pretendido para o an- ticorpo sendo expresso. Por exemplo, quando uma grande quantidade de tal proteína deve ser produzida, vetores que direcionam a expressão de níveis altos de produtos de proteínas de fusão que são facilmente purificados po- dem ser desejáveis. Tais vetores incluem, porém sem limitação, o vetor de : expressão pUR278 de E. coli (Ruther et a/., 1983, EMBO J. 2: 1791-94), no - 15 quala sequência codificadora do anticorpo pode ser ligada individualmente ao vetor em quadro ("in frame") com a região codificadora lac Z de modo que uma proteína de fusão é produzida; vetores plN (Inouye & Inouye, 1985, Nu- cleic Acids Res. 13 :3101-3109; Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 24:5503-5509); entre outros. Vetores pGEX também podem ser usados para expressar polipeptídios estranhos como proteínas de fusão com glutationa S-transferase (GST). Em geral, tais proteínas de fusão são solúveis e podem ser facilmente purificadas a partir de células lisadas por adsorção e ligação a grânulos de glutationa-agarose de matriz seguida por eluição na presença de glutationa livre. Os vetores pGEX são desenhados de forma a incluir si- tiosde clivagem da protease pela trombina ou pelo fator Xa de forma que o produto gênico alvo clonado pode ser liberado a partir da porção GST.

Em um sistema de inseto, o vírus da poliedrose nuclear de Auto- grapha californica (Ac PV) ou o vírus análogo de Drosophila melanogaster pode ser usado como um vetor para expressar genes estranhos. O vírus cresce em células de Spodopiera frugipenta. A sequência codificadora de anticorpos pode ser clonada individualmente em regiões não essenciais (por exemplo o gene da poliedrina) do vírus e colocada sob o controle de um promotor de ACNPV (por exemplo o promotor da poliedrina).

Em células hospedeiras de mamíferos, inúmeros sistemas de expressão de base viral podem ser utilizados. Nos casos em que um adeno- vírus é usado como um vetor de expressão, a sequência codificadora de an- ticorpo de interesse pode ser ligada a um complexo de controle de transcri- ção/translação de adenovírus, por exemplo o promotor tardio e sequência líder tripartida. Este gene quimérico pode ser então inserido no genoma do adenovírus por recombinação in vitro ou in vivo. A inserção em uma região não-essencial do genoma viral (por exemplo, região E1 ou E3) resulta em um vírus recombinante que é viável e capaz de expressar a molécula de i- munoglobulina em hospedeiros infectados. (Vide, por exemplo, Logan & Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 :355-359). Sinais de iniciação específicos também podem ser requeridos para a translação eficiente das t sequências codificadoras de anticorpo inseridas. Esses sinais incluem o có- 3 15 donde início de ATG e sequências adjacentes. Além disso, o códon de início é operacionalmente relacionada com a fase de leitura da sequência codifica- dora desejada para garantir a translação do inserto inteiro. Esses sinais de controle de translação e sinais de iniciação exógenos podem ter uma varie- dade de origens, tanto naturais quanto sintéticas. A eficiência de expressão pode ser aumentada pela inclusão de elementos melhoradores de transcri- ção apropriados, terminadores de transcrição, etc. (vide, por exemplo, Bittner et al., 1987, Methods in Enzymol. 153 :51-544).

Além disso, pode ser escolhida uma cepa de célula hospedeira para modular a expressão das sequências inseridas, ou para modificar e processar o produto gênico da maneira específica desejada. Tais modifica- ções (por exemplo, glicosilação) e processamento (por exemplo, clivagem) de produtos proteicos podem ser importantes para a função da proteína. Cé- lulas hospedeiras diferentes possuem mecanismos característicos e especí- ficos para o processamento e modificação pós-translacional de proteínas e — produtos gênicos. É possível escolher as linhagens celulares ou os sistemas hospedeiros apropriados para garantir a modificação e o processamento cor- retos da proteína estranha expressa. Para tanto, podem ser usadas células

: hospedeiras eucarióticas que possuem o mecanismo celular para processa- mento apropriado do transcrito primário, glicosilação, e fosforilação do pro- duto gênico. Tais células hospedeiras de mamíferos incluem, porém sem limitação, CHO (por exemplo, DG44 ou CHO-S), VERY, BH, Hela, COS, MDCK, 293, 293T, 313, WI38, BT483, Hs578T, HTB2, BT20 e T47D, CRL7030 e Hs578Bst.

Para produção de alto rendimento de longo prazo de proteínas recombinantes, expressão estável é preferida. Por exemplo, linhagens celu- lares que expressam estavelmente um anticorpo podem ser construídas ge- neticamente. Em vez de usar vetores de expressão que contêm origens de replicação virais, as células hospedeiras podem ser transformadas com DNA controlado por elementos de controle de expressão apropriados (por exem- plo, promotores, melhoradores, sequências, terminadores de transcrição, ç sítios de poliadenilação, etc.), e um marcador selecionável. Subsequente à — 15 introdução do DNA estranho, as células construídas podem ser deixadas crescer por 1-2 dias em um meio enriquecido, e então transferidas para um meio seletivo. O marcador selecionável no plasmídeo recombinante confere resistência à seleção e permite que as células integrem estavelmente o plasmídeo em seus cromossomas e cresçam para formar focos que por sua vez podem ser clonados e expandidos em linhagens celulares. Este método pode ser vantajosamente usado para construir linhagens celulares que ex- pressam o anticorpo. Tais linhagens celulares podem ser particularmente úteis no rastreamento e avaliação de antígenos tumorais que interagem dire- ta ou indiretamente com o anticorpo.

Inúmeros sistemas de seleção podem ser usados. Por exemplo, os genes de timidina quinase do vírus do hérpes simples (vide, por exemplo, Wigler et al., 1977, Cell 11 :223), hipoxantina-guanina fosforibosiltransferase (vide, por exemplo, Szybalska & Szybalski, 1992, Proc. Natl Acad. Sci. USA 48:202), e adenina fosforibosiltransferase (vide, por exemplo, Lowy et al., 1980, Cell 22:817) podem ser empregados em células tk-, hgprt- ou aprt-, respectivamente. Também, resistência antimetabólita pode ser usada como a base de seleção para os seguintes genes: DHFR, que confere resistência

S ao metotrexato (vide por exemplo, Wigler el al., 1980, Proc.

Natl.

Acad Sci.

USA 77:3567-70; O'Hare et a/., 1981, Proc.

Natl.

Acad.

Sci.

USA 78: 1527- 31); gpt, que confere resistência ao ácido micofenólico (vide, por exemplo, Mulligan & Berg, 1981, Proc.

Natl.

Acad.

Sci.

USA 78:2072-76); neo, que confere resistência ao aminoglicosídeo G-418 (vide, por exemplo, Clinical Pharmacy 12:488-505; Wu & Wu, 1991, Biotherapy 3 :87-95; Tolstoshev, 1993, Arm.

Rev.

Pharmacol.

Toxicol. 32:573-596; Mulligan, 1993, Science 260:926-932; Morgan & Anderson, 1993, Ann.

Rev.

Biochem. 62: 191-217; e May, 1993, TIB TECH 11(5): 155- 215) e hygro, que confere resistência à higromicina (vide, por exemplo, Santerre et a/., 1984, Gene 30: 147-50). Métodos comumente conhecidos na técnica de tecnologia de DNA recombinante que podem ser usados estão descritos em Ausubel et al. (eds., 1993-2006, Current Protocols in Molecular Biology.

John Wiley & : Sons, NY; Kriegler, 1990, Gene Transfer and Expression.

A laboratory Ma- 215 nual, Stockton Press, NY; e no Capítulos 12 e 13, Dracopoli et al. (eds., 1994, Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY; e Col- berre-Garapin et a/., 1981, 7. MoT Biol. 150: 1-14). Os níveis de expressão de um anticorpo podem ser aumentados por amplificação de vetores (para recapitulação, vide Bebbington & Hents- chel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Vol. 3., Academic Press, New York, 1987). Quando um marcador no sistema vetorial expressando uma anticorpo é amplificável, um aumento no nível de inibidor presente na cultura de célula hospedeira vai aumentar o número de cópias do gene mar- cador.

Como a região amplificada está associada à sequência nucleotídica do anticorpo, a produção do anticorpo também vai aumentar (vide, por e- xemplo, Crouse et a/., 1983, Mol.

Cell.

Biol. 3 :257-66). A célula hospedeira pode ser cotransfectada com dois vetores de expressão, o primeiro vetor codificando um polipeptídio derivado de ca- deia pesada eo segundo vetor codificando um polipeptídio derivado de ca- deia leve.

Os dois vetores podem conter os mesmos marcadores selecioná- veis ou marcadores selecionáveis diferentes que permitem igual expressão

: de polipeptídios de cadeia pesada e de cadeia leve. Alternativamente, um único vetor pode ser usado para codificar polipeptídios tanto de cadeia pe- sada quanto de cadeia leve. Em tais situações, a cadeia leve é tipicamente colocada antes da cadeia pesada para evitar um excesso de cadeia pesada livretóxica (vide, por exemplo, Proudfoot, 1986, Nature 322:562-65; Kohler, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:2197-9). As sequências codificadoras para a cadeia pesada e para a cadeia leve podem compreender cDNA ou DNA genômico. Depois que o anticorpo tiver sido recombinantemente expresso, ele pode ser purificado por qualquer método adequado para purificação de um anticorpo, por exemplo, por cromatografia (por exemplo, cromatografia de troca iônica, cromatografia por afinidade, particularmente por afinidade para o antígeno específico para a proteína A, e cromatografia de coluna de dimensionamento), centrifugação, solubilidade diferencial, ou por qualquer outratécnica tradicional para a purificação de proteínas. Uma referência exaustiva completa para todas as etapas usadas para fazer os anticorpos monoclionais de acordo com a presente invenção é Yokoyama et al., "Production of Monoclonal Antibodies", Current Protocols in Immunology, Unit 2,5, 2006.

Exemplos Exemplo 1: Afinidade para CD33 Os agentes de ligação ao CD33 têm um Kp para CD33 humano e cinomólogo de afinidades de 10 nM ou menos na linhagem celular HL60 e HEK293-cinomólogo CD33, respectivamente.

Quatorze agentes de ligação ao CD33 (anticorpos monocionais totalmente humanos listados na tabela 1 como Nº 1-14, respectivamente) para CD33 humano e cinomólogo foram determinados por análise por FACS Scatchard como descrito em Brockhoff et al., (Cytometry. 1994 Sep 1; 17(1):75-83) em células expressando CD33 (linhagem celular HL60 derivada de AML, linhagem celular HEK293-cinomólogoCD33 recombinante). Em re- sumo, diluições de um agente de ligação ao CD33 foram preparadas em placas de 96 poços iniciando com 100-400 nM no primeiro poço (80 ul), se-

- guido por 11 etapas de diluição (1:2, 40 + 40 ul). 50 ul de diluições do agen- te de ligação ao CD33 são adicionados aos tubos de FACS, 150 ul de célu- las (0,8x10º/ml = 1,2x10º células/tubo) são adicionados a cada tubo de FACS. As células foram delicadamente misturadas e incubadas por 1 hora em gelo Em seguida 50 ul de anticorpo secundário conjugado com FITC (concentração 15 ug/ml; IgG anti-humano de mAb de camundongo) foram adicionados, misturados, e incubados por 30 minutos em gelo. 4 ml de PBS ph7,2 contendo 0,02% de ácido foram subsequentemente adicionados, as células foram pelotizadas e ressuspendidas em 300 ul de PBS pH 7,2 e submetidas à análise por FACS usando um BD FACS Canto. Todas as eta- pas experimentais foram realizadas em gelo molhado, todas as diluições de agente de ligação ao CD33 foram feitas em PBS/ 0,5% de BSA + 0,02% de ácido. A calibração de FACS foi feita usando-se grânulos Quantum FITC * MESF (Premix) (Bangs Laboratories). Todas as amostras foram medidas — 15 usando-se os mesmos parâmetros de FACS. A relação de IgG ligada versus IgG livre foi calculada a partir dos valores MFI em diferentes concentrações do agente de ligação ao CD33 e apresentada como mancha de Scatchard. Uma linha de regressão foi traçada através dos pontos de dados resultantes, e a inclinação desta linha corresponde ao valor negativo da constante de associação. Os resultados estão listados na tabela 2.

Tabela 2 a TAM lo aee (nM) logo (nM) [Es o ras a ETEHERO E RE ERAO ca [o a eRos atm o a SJ a eee E as [E ima CT a [e aero [a ue og e

[E a AO amei É (nM) logo (nM)

EE OR A DA o a qo A Ro q | Exemplo 2: Cinética de internalização Internalização de anticorpo refere-se à redução da quantidade de complexos anticorpo/antígeno na superfície celular da célula alvo depois de incubação com o anticorpo. Testes de internalização foram realizados coma linhagem celular HL6O expressando CD33. As células foram incuba- das com uma quantidade fixa de um agente de ligação ao CD33 (10 pg/ml de anticorpos monoclonais totalmente humanos listados na tabela 1 como Nº À 1-14) por períodos de tempo definidos (0 h, 1 h, 4 h, 24 h) a 37ºC para per- mitir a internalização do complexo anticorpo/antígeno. Nos pontos de tempo - 10 indicados ácido foi adicionado à mistura de incubação para prevenir interna- lização posterior. Em seguida uma quantidade fixa de agente de ligação ao CD33 foi adicionada para saturar todos os sítios de antígeno de CD33 na superfície celular. A quantidade total de agente de ligação ao CD33 ligado à superfície celular foi determinada por análise por FACS utilizando um anti- corpo secundário de IgG anti-humana conjugada com FITC. O tempo 0 h foi usado para determinar o nível inicial de complexos anticorpo de CD33/antígeno na superfície e foi definido como 100%. Os resultados estão listados na tabela 3 e ilustrados nas Figuras 1-3. Tabela 3 as pus eateiat dee manescentes na superfície das células de- pois de 4 h de incubação com anticorpo (%) OTRA as o

EEE A ENTRIES EA Tm O O CR Eee o o nerve Oie Ra TT atOca, " manescentes na superfície das células de- pois de 4 h de incubação com anticorpo (%) OSC SERA o Bo [ETA O A EA LT aa o de ELA E AO aa [EE O AE o [EA O db Lintuzumab foi incluído como um anticorpo de referência. Com- plexos de lintuzumab/CD33 internalizaram rapidamente com a ligação do lintuzumab, o que é consistente com os dados publicados. Depois de um : período de 4 horas de incubação havia somente cerca de 20% da quantida- deinicialdos complexos CD33/lintuzumab na superfície celular. Foi possível é demonstrar que, inesperadamente, a internalização de todos os 14 agentes de ligação ao CD33 de acordo com a presente invenção foi desacelerada em relação ao lintuzumab.

Exemplo 3 : Atividade de ADCC A taxa de internalização desacelerada se traduz em atividade de ADCC aumentada in vitro. Para avaliar o efeito da internalização desacele- rada na atividade de ADCC dos agentes de ligação ao CD33 (anticorpos monoclonais totalmente humanos listados na tabela 1 como Nº 1-14), células alvo (HL60) foram incubadas com um agente de ligação ao CD33 por 0, 1,4 e 24 horas. Subsequentemente um ensaio de ADCC foi realizado com PBMC estimulado com IL-2 como células efetoras e células HL60 revestidas com anticorpo como células alvo. Para todas as experiências foi usada uma concentração de mAb de 30 pg/ml. O cocultivo de células efetoras com célu- las alvo na presença de agente de ligação ao CD33 foi efetuado em quadru- plicata ou triplicata em placas de microtitulação 96 poços de fundo redondo de em um volume final de 200 ul de meio de ensaio por poço consistindo em 10% de soro humano e 1% de BSA em RPMI em uma proporção de 1:1.

: Primeiro as células efetoras (células PBMC recém-isoladas em 100 ul de soro humano a 10% em RPMI por poço) foram plaqueadas, seguidas pelas células alvos e solução de agente de ligação ao CD33 (diluída em 50 ul de BSA a 1% em RPMI). Como controle, células efetoras foram cultivadas em —meiode ensaio puro (controle de células efetoras) e células alvo foram culti- vadas em meio de ensaio puro (lise espontânea) ou em meio de ensaio su- plementado com 1% de Triton X-100 (lise máxima). A cocultura foi incubada a 370C em uma incubadora de CO, úmida por 3 horas. Ao final da incuba- ção as células foram removidas do meio de cultura por centrifugação (200 x qg,isto é, 1000 rpm; 10 min) à temperatura ambiente. Os sobrenadantes |i- vres de células (100 ul/poço) são transferidos para poços correspondentes de uma placa de 96 poços de fundo plano. Para determinar a atividade de LDH nesses sobrenadantes, 100 ul de mistura reacional (250 ul de catalisa- S dor recém-misturados com 11,25 ml de solução de corante) são adicionados : 15 acada poço e incubados por 30 minutos à temperatura ambiente no escuro.

Em seguida a absorvência é medida da maneira descrita abaixo. O kit de detecção de citotoxicidade (LDH; Roche 11 644 793 001) foi usado para medir a atividade de ADCC. A detecção da citotoxicida- de baseia-se na medição da atividade da enzima LDH liberada de células coma membrana plasmática danificada. A LDH liberada nos sobrenadantes de cultura reduz o sal de tetrazólio do kit para formazan. A absorção máxima do corante formazan é medida a 490 nm contra uma comprimento de onda de referência de 650 nm em uma leitora de placa de ELISA. Para determinar a percentagem de citotoxicidade mediada por células, a absorvência média das quadruplicatas ou triplicatas foi calculada e o valor de referência foi sub- traído. Esses valores corrigidos foram substituídos na equação que se segue para calcular a ADCC (%): (mistura de células efetoras/alvo-controle de célu- las efetoras-liberação espontânea) dividido por (liberação máxima-liberação espontânea).

A atividade de ADCC no tempo 0 h (sem pré-incubação de célu- las alvo com anticorpo) foi definida como 100% de atividade de ADCC. A atividade de ADCC para vários tempos de pré-incubação com anticorpo foi calculada em relação ao tempo 0 h e apresentada como citotoxicidade relati- í va (%). A internalização desacelerada dos agentes de ligação ao CD33 em comparação com o lintuzumab resultou em atividade de ADCC aumen- tada em relação ao lintuzumab. Concluindo, a internalização desacelerada leva à atividade aumentada de ADCC. A internalização para os agentes de ligação ao CD33 descritos é inversamente correlacionada com a atividade de ADCC dos agentes de ligação ao CD33, o que é indicativo de vantagens em termos de atividade clínica de tais agentes de ligação ao CD33. Os resul- tados estão ilustrados na Figura 4 para a cinética de internalização nesta experiência e na Figura 5 para a atividade de ADCC. Exemplo 4: Mapeamento de epitopos O epitopo de ligação dos agentes de ligação ao CD33 descritos 7 nesta invenção em relação ao epitopo de lintuzumab foi determinado por Y 15 espectrometria de massa com troca de hidrogênio (HXMS).

Este método determinou a suscetibilidade dos hidrogênios do esqueleto amídico da proteina CD33 à troca com D2O. As experiências fo- ram conduzidas a proteina CD33 recombinante isolada e com a proteína CD33 acrescida do agente de ligação ao CD33 / lintuzumab (doravante nes- te exemplo denominada "anticorpo / anticorpos"). As regiões da proteína CD33 apresentando proteção significativa contra troca devido à ligação do anticorpo foram identificadas. A resolução do método é determinada pelo peptídios produzidos por digestão com pepsina, por exemplo a sequência aminoacídica resultante pode ser maior que o epitopo verdadeiro do anticor- po.Esses peptídios derivados de CD33 foram identificados por experiências de controle adicionais com amostras inalteradas empregando as tecnologias tradicionais de massa exata e HPLC MS/MS.

Para a amostra de proteína + anticorpo, a proteina CD33 e o an- ticorpo foram incubados por 15 minutos à temperatura ambiente. A relação molar final anticorpo/CD33 foi de 2:1. Usando um sistema robótico LEAP (placa de troca mantida a 25ºC, placa de amostra/resfriamento rápido manti- da a 4ºC), 8 ul de amostra foram adicionados a 80 ul de tampão de troca (10 mM de NaH2PO, em D2sO, pH=7 ou 10 mM de NaH,PO, em H,zO, pH=7), f misturados, e deixados trocar durante vários tempo (15, 60, 120, 240, e 600 segundos) a 25ºC. 80 ul desta solução foram então transferidos para 80 ul de tampão de resfriamento rápido (1 M de ureia, 0,1 M de TCEP-HC1) a 4ºC e misturados. 90 ul desta solução foram então transferidos para 10 ul de pepsina (4 mg/ml) a 4ºC e misturados.

Depois 2 minutos, 60 ul desta solu- ção foram injetados em um cartucho de aprisionamento Michrom C18. O cartucho foi lavado com HO + 0,1% de TFA por 2 minutos a 100 ul/min.

Uma válvula foi então ligada e o cartucho foi eluído em uma coluna Pheno- menex Jupiter C5, 1,0 x 50mm, Sum, 300A.

A fase móvel A foi á- gua/acetonitrila/TFA (99/0,95/0,05) e a fase móvel B foi acetonitri- la/água/TFA (95/4,95/0,05). A taxa de fluxo foi de 100 ul/min.

O gradiente foi: O minutos (0%B), 6 minutos (40%B), 7 minutos (40%B), 8 minutos (90%B), : 10 minutos (90% B), 11 minutos (0%B). O sistema LEAP pré-resfria a fase — 15 móvel para 4ºC e também mantém a coluna de aprisionamento e a coluna analítica a 4ºC.

Para as experiências de MS (usadas para quantificar a troca com o tampão DO), um método de varredura única de 300-2000 por 14 mi- nutos foi usado a uma resolução de 60.000. Para as experiências de MS/MS (usadas para identificar peptídios com o tampão de troca HO), um método com7 varreduras foi usado por 14 minutos.

A primeira varredura foi uma varredura da faixa completa de 300-2000 a 30.000 de resolução.

As varredu- ras subsequentes foram varreduras CID dos 6 íons mais intensos da varre- dura ff1. A largura de isolamento foi 1,5 amu, a energia de colisão foi 35V, o tempo de ativação foi 30 mseg.

Os peptídios da pepsina foram identificados usando-se dados de fragmentação e o programa Proteome Discoverer (Thermo). Os peptídios identificados foram analisados usando-se um pro-

grama interno que calcula a massa média para os peptídios trocados.

Todos os agentes de ligação ao CD33 protegeram o fragmento peptídico idêntico com a sequência aminoacídica FFHPIPYYDKNSPVHGYW (SEQID Nº: 141) (Tabela 4). A sequência de CD33 protegida pelos agentes de ligação ao CD33 descritos nesta invenção são diferentes e não se sobre- põem à sequência peptídica de CD33 protegida pela ligação de Lintuzumab

. (MDPNFWLOQVOQE, SEQ ID Nº: 142). A modelagem in silico usando a estru- tura cristalina de SIGLEC-5, um membro da família SIGLEC homólogo à CD33, revelou epitopos de ligação de todos os anticorpos no domínio proxi- mal da proteína, onde o epitopo de ligação do Lintuzumab é diferente daque- ledos agentes de ligação ao CD33 descritos nesta invenção.

Concluindo, os agentes de ligação ao CD33 descritos neste pedido de patente se ligam a um epitopo diferente daquele do Lintuzumab.

Tabela 4 [No | come | —eptopodechas — — | [OR [| 20210 | rroPPYrVDKNSPYHGYWV — | “O [6 | rs | FrHPIPYYDKNSPYHGYV | | : | a | r60s0oma | FrHPeXDKNSPYHGWN — | | o | 28067 | rFrHPIPYYDRNSPVHGWW | | 1 | 2630505 | FrHPIPYYDKNSPVHGWN — | [nn | 26050 | FrHPPYYOKNSPYHGYW — | [Rr | 2607 | FrHPPYVOKNSPVHGYWV — | [15 | rintuzumao — | MBPNFWLOVOE

Claims (28)

REIVINDICAÇÕES

1. Agente de ligação ao CD33 que se liga ao CD33 humano, caracterizado pelo fato de ser um anticorpo ou um derivado de um anticopo que se liga especificamente a um epitopo na sequência de aminoácidos — FFHPIPYYDKNSPVHGYW (SEQ ID Nº 141) do CD33 humano.

2. Agente de ligação ao CD33, caracterizado pelo fato de ser selecionado dentre: um anticorpo compreendendo uma CDR1 de SEQ ID Nº 1, uma CDR?2 de SEQ ID Nº 15, uma CDR3 de SEQ ID Nº 29, u ma CDR4 de SEQ 1IDNº43, uma CDR5 de SEQ ID Nº 57 e uma CDR6 de SEQ ID Nº 71, um anticorpo compreendendo uma CDR1 de SEQ ID Nº 2, uma CDR?2 de SEQ ID Nº 16, uma CDR3 de SEQ ID Nº 30, u ma CDR4 de SEQ ID Nº 44, uma CDR5 de SEQ ID Nº 58 e uma CDR6 de SEQ ID Nº 72, um anticorpo compreendendo uma CDR1 de SEQ ID Nº 3, uma CDR2deSEQID Nº 17, uma CDR3 de SEQ ID Nº 31, u ma CDR4 de SEQ ID Nº 45, uma CDR5 de SEQ ID Nº 59 e uma CDR6 de SEQ ID Nº 73, um anticorpo compreendendo uma CDR1 de SEQ ID Nº 4, uma CDR?2 de SEQ ID Nº 18, uma CDR3 de SEQ ID Nº 32, u ma CDR4 de SEQ ID Nº 46, uma CDR5 de SEQ ID Nº 60 e uma CDR6 de SEQ ID Nº 74, um anticorpo compreendendo uma CDR1 de SEQ ID Nº 5, uma CDR?2 de SEQ ID Nº 19, uma CDR3 de SEQ ID Nº 33, u ma CDR4 de SEQ ID Nº 47, uma CDR5 de SEQ ID Nº 61 e uma CDR6 de SEQ ID Nº 75, um anticorpo compreendendo uma CDR1 de SEQ ID Nº 6, uma CDR?2 de SEQ ID Nº 20, uma CDR3 de SEQ ID Nº 34, u ma CDR4 de SEQ IDNº“48,uma CDR5 de SEQ ID Nº 62 e uma CDR6 de SEQ ID Nº 76, um anticorpo compreendendo uma CDR1 de SEQ ID Nº 7, uma CDR?2 de SEQ ID Nº 21, uma CDR3 de SEQ ID Nº 35, u ma CDR4 de SEQ ID Nº 49, uma CDR5 de SEQ ID Nº 63 e uma CDR6 de SEQ ID Nº 77, um anticorpo compreendendo uma CDR1 de SEQ ID Nº 8, uma —CDR2deSEQID N* 22, uma CDR3 de SEQ ID Nº 36, u ma CDR4 de SEQ ID Nº 50, uma CDR5 de SEQ ID Nº 64 e uma CDR6 de SEQ ID Nº 78, um anticorpo compreendendo uma CDR1 de SEQ ID Nº 9, uma

CDR?2 de SEQ ID Nº 23, uma CDR3 de SEQ ID Nº 37, u ma CDR4 de SEQ ID Nº 51, uma CDR5 de SEQ ID Nº 65 e uma CDR6 de SEQ ID Nº 79, um anticorpo compreendendo uma CDR1 de SEQ ID Nº 10, uma CDR?2 de SEQ ID Nº 24, uma CDR3 de SEQ ID Nº 3 8, uma CDR4 de SEQIDN* 52, uma CDR5 de SEQ ID Nº 66 e uma CDR6 de SEQ ID Nº 80, um anticorpo compreendendo uma CDR1 de SEQ ID Nº 11, uma CDR?2 de SEQ ID Nº 25, uma CDR3 de SEQ ID Nº 3 9, uma CDR4 de SEQ ID Nº 53, uma CDR5 de SEQ ID Nº 67 e uma CDR6 de SEQ ID Nº 81, um anticorpo compreendendo uma CDR1 de SEQ ID Nº 12, uma CDR?2 de SEQ ID Nº 26, uma CDR3 de SEQ ID Nº 4 0, uma CDR4 de SEQ ID Nº 54, uma CDR5 de SEQ ID Nº 68 e uma CDR6 de SEQ ID Nº 82, um anticorpo compreendendo uma CDR1 de SEQ ID Nº 13, uma CDR?2 de SEQ ID Nº 27, uma CDR3 de SEQ ID Nº 4 1, uma CDR4 de SEQ ID Nº 55, uma CDR5 de SEQ ID Nº 69 e uma CDR6 de SEQ ID Nº 83, um anticorpo compreendendo uma CDR1 de SEQ ID Nº 14, uma CDR2 de SEQ ID Nº 28, uma CDR3 de SEQ ID Nº 4 2, uma CDRA4 de SEQ ID Nº 56, uma CDR5 de SEQ ID Nº 70 e uma CDR6 de SEQ ID Nº

84.

3. Agente de ligação ao CD33, caracterizado pelo fato de ser selecionado dentre: um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID Nº 85 e uma região variável de ca deia leve de SEQ ID Nº 99, um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID Nº 86 e uma região variável de ca deia leve de SEQ ID Nº100, um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID Nº 87 e uma região variável de ca deia leve de SEQ ID

Nº 101, um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID Nº 88 e uma região variável de ca deia leve de SEQ ID Nº 102, um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID Nº 89 e uma região variável de ca deia leve de SEQ ID Nº 103, um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID Nº 90 e uma região variável de ca deia leve de SEQ ID Nº104, um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID Nº 91 e uma região variável de ca deia leve de SEQ ID Nº 105, um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID Nº 92 e uma região variável de ca deia leve de SEQ ID Nº 106, um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID Nº 93 e uma região variável de ca deia leve de SEQ ID Nº 107, um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID Nº 94 e uma região variável de ca deia leve de SEQ ID Nº 108, um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID Nº 95 e uma região variável de ca deia leve de SEQ ID Nº109, um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID Nº 96 e uma região variável de ca deia leve de SEQ ID Nº 110, um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada de SEQID Nº 97 e uma região variável de ca deia leve de SEQ ID Nº 111, um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID Nº 98 e uma região variável de ca deia leve de SEQ ID Nº 112,

4. Agente de ligação ao CD33, caracterizado pelo fato de ser selecionado dentre: um anticorpo compreendendo uma cadeia pesada de SEQ ID Nº 113 e uma cadeia leve de SEQ ID Nº 127, um anticorpo compreendendo uma cadeia pesada de SEQ ID Nº 114 e uma cadeia leve de SEQ ID Nº 128, um anticorpo compreendendo uma cadeia pesada de SEQ ID Nº115e uma cadeia leve de SEQ ID Nº 129, um anticorpo compreendendo uma cadeia pesada de SEQ ID Nº 116 e uma cadeia leve de SEQ ID Nº 130, um anticorpo compreendendo uma cadeia pesada de SEQ ID Nº 117 e uma cadeia leve de SEQ ID Nº 131, um anticorpo compreendendo uma cadeia pesada de SEQ ID Nº 118 e uma cadeia leve de SEQ ID Nº 132, um anticorpo compreendendo uma cadeia pesada de SEQ ID Nº 119 e uma cadeia leve de SEQ ID Nº 133, um anticorpo compreendendo uma cadeia pesada de SEQ ID Nº120e uma cadeia leve de SEQ ID Nº 134, um anticorpo compreendendo uma cadeia pesada de SEQ ID Nº 121 e uma cadeia leve de SEQ ID Nº 135, um anticorpo compreendendo uma cadeia pesada de SEQ ID Nº 122 e uma cadeia leve de SEQ ID Nº 136, um anticorpo compreendendo uma cadeia pesada de SEQ ID Nº 123 e uma cadeia leve de SEQ ID Nº 137, um anticorpo compreendendo uma cadeia pesada de SEQ ID Nº 124 e uma cadeia leve de SEQ ID Nº 138, um anticorpo compreendendo uma cadeia pesada de SEQ ID Nº125e uma cadeia leve de SEQ ID Nº 139, um anticorpo compreendendo uma cadeia pesada de SEQ ID Nº 126 e uma cadeia leve de SEQ ID Nº 140.

5. Agente de ligação ao CD33, de acordo com qualquer uma das reivindicações | a 4, caracterizado pelo fato de que a cinética de internalização do agente de ligação ao CD33 é tal que pelo menos 30% da quantidade inicial do agente de ligação ao CD33 permanecem na superfície celulardas células HL6O em um tempo de 4 horas depois da incubação.

6. Agente de ligação ao CD33, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a cinética de internalização dos agentes de ligação ao CD33 é tal que pelo menos 40% da quantidade inicial dos agentes de ligação ao CD33 permanecem na superfície celular em um tempo de 4 horas depois da incubação.

7. Agente de ligação ao CD33 de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que tem uma afinidade tanto para CD33 humano quanto para CD33 de cynomolgus com um Kp menor que ou igual a 10 nM.

8. Agente de ligação ao CD33, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que é humanizado.

9. Agente de ligação ao CD33, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que é totalmente humano.

10. Agente de ligação ao CD33, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma função efetora.

11. Agente de ligação ao CD33, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a função efetora é mediada por um domínio F..

12. Agente de ligação ao CD33, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que compreende uma ou mais mutações no domínio F. que modulam a função do domínio F..

13. Agente de ligação ao CD33, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a modulação da função do domínio Fc é um aumento de ADCC de pelo menos 10%, de preferência 50% e mais preferivelmente 100%.

14. Agente de ligação ao CD33, de acordo com a reivindicação 12 ou 13, caracterizado pelo fato de que as mutações no domínio F, ficam localizadas em uma ou mais posições selecionadas de aminoácidos nas posições 332 e/ou 239 e/ou 236 de acordo com o índice de numeração EU de Kabat.

15, Agente de ligação ao CD33, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 14, caracterizado pelo fato de que as mutações no domínio F., são uma combinação de substituições nas posições 239 e 332, de preferência S239D/I1332E.

16. Molécula de DNA, caracterizada pelo fato de que compreende uma região codificando a região variável de cadeia pesada de um agente de ligação ao CD33, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 15.

17. Molécula de DNA, caracterizada pelo fato de que compreende uma região codificando a região variável de cadeia leve de um agente de ligação ao CD33, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 15.

18. Vetor de expressão, caracterizado pelo fato de que contém uma molécula de DNA, como definida na reivindicação 16 ou 17.

19. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de que possui um ou mais vetores como definidos na reivindicação 18.

20. Método para produzir um agente de ligação ao CD33, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato de que compreende: transfectar uma célula hospedeira com um ou mais vetores, como definidos na reivindicação 18, cultivar a célula hospedeira, e recuperar e purificar a molécula de anticorpo.

21. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende, como o princípio ativo, um ou mais agentes de ligação ao CD33, como definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 15, e pelo menos um veículo fisiologicamente aceitável.

22. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 21, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um ou mais agentes terapêuticos adicionais.

23. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 21 ou 22, caracterizada pelo fato de ser para depleção de células que expressam CD33 em sua superfície.

24. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 21 ou 22, caracterizada pelo fato de ser para o tratamento de malignidades mieloides e da síndrome mielodisplásica (MDS).

25. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 24, caracterizada pelo fato de que a referida malignidade mieloide é selecionada dentre leucemia mieloide aguda e leucemia mieloide crônica.

26. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 21 ou 22, caracterizada pelo fato de ser para o tratamento de doenças autoimunes e inflamatórias que envolvem células mieloides em sua patologia.

27. Uso de um ou mais agentes de ligação ao CD33, como definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato de ser para a preparação de uma composição farmacêutica útil para depleção de células que expressam CD33 em sua superfície; e/ou para o tratamento de malignidades mieloides e da síndrome mielodisplásica (MDS), preferencialmente em que a referida malignidade mieloide é selecionada dentre leucemia mieloide aguda e leucemia mieloide crônica; e/ou para o tratamento de doenças autoimunes e inflamatórias que envolvem células mieloides em sua patologia.

28. Invenção, caracterizada por quaisquer de suas concretizações ou categorias de reivindicação englobadas pela matéria inicialmente revelada no pedido de patente ou em seus exemplos aqui apresentados.

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