AT511130A2 - Polypeptidmaterial mit flexiblen Poreneigenschaften - Google Patents

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AT511130A2 ATA9496/2009A AT94962009A AT511130A2 AT 511130 A2 AT511130 A2 AT 511130A2 AT 94962009 A AT94962009 A AT 94962009A AT 511130 A2 AT511130 A2 AT 511130A2
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Abstract

Die Erfindung ist das Polypeptidmaterial mit flexiblen Poreneigenschaften, das durch das zwei- oder dreidimensionale Zusammenfügen von Fusionsproteinen aus mindestens zwei Proteindomänen entsteht, wobei mindestens eine Domäne ein Doppelwendel und mindestens eine die Protein-Oligomerisationsdomäne darstellt. Die Erfindung bezieht sich auf das Polypeptidmaterial, das z.B. bei der chemischen Katalyse und bei der Trennung der Moleküle auf Grundlage ihrer Eigenschaften verwendet wird.

Description

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(38588)HEL
Polypeptidmaterial mit flexiblen Poreneigenschaften Gegenstand der Erfindung
Der Gegenstand dieser Erfindung ist das Bionanomaterial, ein neues Material, das durch das zwei- oder dreidimensionale Zusammenfügen von Fusionsproteinen aus mindestens zwei Proteindomänen entsteht, wobei mindestens eine Domäne ein doppelwendiges Segment und mindestens eine die P rotein-Oligomerisationsdomäne darstellt. Der Gegenstand der Erfindung ist auch das Fusionsprotein, aus dem Polypeptidmaterial und DNA mit dem Kode für dieses Protein zubereitet sind. Der Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung von Polypeptidmaterial zur Trennung der Moleküle nach ihrer Eigenschaften und für die chemische oder enzymatische Katalyse.
Stand der Technik
Die auf Membranen basierenden Filtrationssysteme werden für die Zubereitung von Trinkwasser verwendet, immer mehr jedoch auch in der Nahrungsindustrie, z.B. zur Beseitigung von Verunreinigungen aus dem Wasser, in der Pharmaindustrie zur Beseitigung infektiöser Mikroorganismen und ungewollten Komponenten, zur Konzentration der gewählten Komponenten sowie für die membranischen chemischen Reaktoren und Bioreaktoren.
Zur Zubereitung von Ultrafiltrationssystemen für die Trennung von Makromolekülen werden allgemein organische Polymere verwendet, die Porengröße wird durch physikalische Verfahren zur Erstellung von Poren mit beliebigen Dimensionen definiert, zum Beispiel Querbin- • ♦ · · * · • · · · φ * · • * ♦ · ff « 2 düng von Fasern oder Ausdämpfung von Lösemitteln. Die Membranen, die aus dichten Proteinschichten bestehen, wurden aus der Bakterien-S-Schicht (S-Layer) zubereitet. Peng et al, (Peng et al., 2009, Nature Nanotechnology, 4, 353-357) beschreibt die aus dem Protein Ferritin zubereitete Ultrafiltrationsmembrane. Während sich der Filtrationserfolg je nach pH-Wert, der die Ladung des Analyten und der Membrane bestimmt, verändert, bleibt die Porengröße konstant und wird durch die Dichte der Proteinmoleküle bestimmt. Eine Pore, die von drei Ferritin-Molekülen mit einem Durchmesser von je 12 nm umgeben ist und einen Durchmesser von 2,2 nm hat, was die Verwendbarkeit dieses Systems einschränkt. Die auf der Stapelung der Protein-Moleküle basierende Zubereitung der Membrane beschränkt die Spannweite der möglichen Porendimensionen sowie auch ihre Geometrie und die chemischen Eigenschaften. U.S. Patent Nr. 6,756,039 B1 berichtet über regelmäßige Strukturen, die durch Selbstzusammensetzung der Fusionsproteine gewonnen werden, die aus steif verbundenen Monomeren mit der Fähigkeit, sich selbst zu Oligomeren zusammenzusetzen, bestehen. Das Patent präsentiert die Produktion des diskreten Käfigs und der eindimensionalen Faser und schlägt ein dreidimensionales Netz aus Fusionsproteinen vor, bei dem jedes Fusionsprotein aus zwei Monomeren besteht, die zu Dimer und Trimer verbunden werden. Die Wahl der entsprechenden Monomere ist relativ komplex, denn die Monomere werden durch die Helix mit der Orientierung vom C-Termi-nus des ersten bis zum N-Terminus des zweiten Monomers verbunden. Eine solche steife Verbindung definiert die Orientierung der Monomere im Fusionsprotein und folglich definiert und beschränkt auch die Strukturen, die ein solches Fusionsprotein bilden kann, sowie auch ihre Verwendung. WO/2004/033487 and U.S. Patent Application 2008/0097080 A1 präsentiert das Proteinnetz und aus Fusionsproteinen bestehende Strukturen, genannt Protomere. Diese bestehen aus Monomeren, die sich zu Oligomeren mit rationalen Symmetrieachsen des N-Ranges verbinden. Der Mangel der potentiellen Verwendung des Netzes, beschrieben im Patent WO/2004/033487, als Trägers für die Proteinkristallisation und die Elektromikroskopie, ist die Unfähigkeit der Veränderung der Poreneigenschaften mit nur kleinen Bausteinmanipulationen. Weder 6,756,039 B1 noch WO/2004/033487 oder U.S. Patent Application 2008/0097080 A1 beschreiben die Methode für die Zubereitung der proteinischen Filtrationsmembranen.
Die hier präsentierte Erfindung beschreibt die selbstzusammensetzenden Proteine als Bausteine, deren Veränderungen die Poreneigenschaften beeinflussen, wodurch die Materialen mit verschiedenen technologischen Eigenschaften zubereitet werden können. Eine der Domänen, die die Bausteine bilden, ist explizit als Doppelwendel definiert. Sie kann je nach Länge gewählt werden, denn diese beeinflusst direkt die Porengröße, oder je nach Nebengruppen der Aminosäure-Reste auf den an der Oberfläche ausgesetzten Positionen, wenn sie die Bildung der Doppelwendel nicht verhindern. Diese Aminosäure-Reste, meistens an den Positionen b, c und f, bestimmen die chemischen Eigenschaften der Pore und verleihen dem Material neue technologische Eigenschaften.
Zusammenfassung der Erfindung
Die Erfindung bezieht sich auf das Polypeptidmaterial mit flexiblen Poreneigenschaften, das durch das zwei- oder dreidimensionale Zusammenfügen von Fusionsproteinen aus mindestens zwei Proteindomänen entsteht, wobei mindestens eine Domäne eine Doppelwendel bildet und mindestens eine die Protein-Oligomerisationsdomäne mit mindestens der Oligomerisationsstufe 3.
Die Oligomerisationsstufe befindet sich gemäß der Erfindung zwischen 3 und 12, meistens zwischen 3 und 6.
Die Erfindung bezieht sich auf das Polypeptidmaterial, bei dem die Porenform und -Größe durch die Verbindungsart der Proteindomänen des genannten Fusionsproteins bestimmt werden und die Porengröße auch durch die Länge des Doppelwendelbildenden Segments.
Die Erfindung bezieht sich auf das Polypeptidmaterial, bei dem die Länge des Doppelwendel-bildenden Segments zwischen 2 bis 100 Heptaden umfasst (14 bis 700 Ami nosäure-Reste).
Die Erfindung bezieht sich auf das Polypeptidmaterial, dessen technologische Eigenschaften unter anderem durch die Einfuhr positiv geladener, negativ geladener, hydrophober, hydrophiler, zysteinischer, histidinischer und sonstiger Aminosäure-Reste, die spezifische Interaktionen mit den an der Oberfläche ausgesetzten Segmenten ermöglichen, definiert werden, während die für die Bildung der Doppelwendel benötigten Segmente erhalten werden. Die Aminosäure-Reste, die die technologischen Poreneigenschaften bestimmen, werden meistens an die Positionen b, c und f des Doppelwendel-bildenden Segments eingeführt.
Die Erfindung bezieht sich außerdem auch auf das Polypeptidmaterial, bei dem die chemischen Eigenschaften der Poren auch durch die Eigenschaften der Proteindomänen des genannten Fusionsproteins definiert werden. Diese Eigenschaften sind unter anderem auch die Nettoladung, an der Oberfläche ausgesetzten hydrophoben Aminosäure-Reste und die Größe der Proteindomänen.
Die Erfindung bezieht sich auf das Polypeptid material mit flexiblen Poreneigenschaften, das durch das zwei- oder dreidimensionale Zusammenfügen von Fusionsproteinen aus mindestens zwei Proteindomänen entsteht, wobei mindestens eine Domäne eine Doppelwendel bildet und mindestens eine die Protein-Oligomerisationsdomäne und die Domänen untereinander in einer beliebigen Reihenfolge durch den flexiblen Linker aus 1 bis 20 Aminosäure-Resten verbunden werden, vorzugsweise 1 bis 6, das Fusionsprotein kann jedoch auch sie Signalsequenz zur Lenkung des Proteinausschusses außerhalb der Zelle und der Polypeptid-Kennzeichnung enthalten.
Die Erfindung bezieht sich auf das Polypeptidmaterial mit flexiblen Poreneigenschaften, bei dem das Doppelwendel-bildende Segment auf der Sequenz SEQ ID Nr. 2, SEQ ID Nr. 4 oder SEQ ID Nr. 6 oder den geplanten Peptiden mit funktional ähnlichen Eigenschaften basiert.
Die Erfindung bezieht sich auf das Polypeptid material mit flexiblen Poreneigenschaften, bei dem die Protein-Oligomerisationsdomäne vorzugsweise unter den Sequenzen SEQ ID Nr. 8, SEQ ID Nr. 10, SEQ ID Nr. 12, SEQ ID Nr. 14, SEQ ID Nr. 84 und den Sequenzen mit einer mehr als 50-%-Homologie mit diesen Sequenzen, die die Fähigkeit zur Bildung von Oligomeren des gleichen Typs erhalten, gewählt wird.
Die Erfindung bezieht sich auf das Polypeptid material mit flexiblen Poreneigenschaften, das durch die Zusammensetzung von unter den Sequenzen SEQ ID Nr. 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82 gewählten Fusionsproteinen zubereitet wurde.
Die Erfindung bezieht sich auf das Polypeptid material mit flexiblen Poreneigenschaften, zubereitet mit der Vermischung von zwei Fusionsproteinen gemäß den Patentansprüchen 1 bis 10, wobei sich die Segmente der beiden Fusionsproteine, die die Doppelwendel bilden, zu einem Parallel-Doppelwendel verbinden. Die Oligomerisations-domäne des einen Fusionsproteins befindet sich am N-Terminus und im anderen am C-Terminus, die Oligomerisationsdomänen haben jedoch die gleiche Oligomerisati-onsstufe.
Die Erfindung bezieht sich auf das Polypeptidmaterial mit flexiblen Poreneigenschaften, für dessen Zubereitung die Doppelwendel-bildenden Segmente unter natürlichen oder den geplanten Parallel-Doppelwendeln oder unter den folgenden Paaren ausgewählt werden SEQ ID Nr.: 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32.
Die Erfindung bezieht sich auf das Polypeptidmaterial mit flexiblen Poreneigenschaften, für dessen Zubereitung die Protein-Oligomerisationsdomänen unter den tetrame-ren Proteinen gewählt werden, vorzugsweise unter den Sequenzen SEQ ID Nr. 10 und SEQ ID Nr. 12 oder unter den trimeren Proteinen, vorzugsweise unter SEQ ID Nr.: 8 und SEQ ID Nr. 84.
Die Erfindung bezieht sich auf die DNA mit der Information für das Polypeptidmaterial mit flexiblen Poreneigenschaften, die die operativ mit Regelungselementen, dem Promotor und dem Terminator, die die Äußerung der Fusionsproteine in der Zelle des Wirten regulieren, verbunden ist.
Die Erfindung bezieht sich auf das Polypeptidmaterial mit flexiblen Poreneigenschaften zur Trennung und Konzentration von Molekülen, Molekül-Komplexen, Viren oder Nanoteilchen gemäß ihrer Eigenschaften.
Die Erfindung bezieht sich auf das Polypeptidmaterial mit flexiblen Poreneigenschaften für die chemische Katalyse.
Beschreibung der Bilder
Bild 1: A) Das Schema des antiparallelen Doppelwendel-Dimers mit der Anordnung der Aminosäure-Resten im peptidischen Heptaden-Motiv. Die Aminosäure-Reste an Positionen b, c und f sind an der Oberfläche ausgesetzt und können somit modifiziert werden, wodurch auch die Poreneigenschaften verändert werden können. B) Das Schema des Polypeptidmaterials, das durch das Zusammenfügen von Fusionsproteinen aus einer Tetramerisationsdomäne und einer Domäne, die ein antiparalleles Doppelwendel-Dimer bildet, besteht. C) Das Schema des Materials aus Punkt B), das zeigt, dass die Veränderung der Länge des Doppelwendel-bildenden Segments und die Einführung der positiven Ladung an die ausgesetzten Stellen im Doppelwendel-Dimer die physikalisch-chemischen und die technologischen Poreneigenschaften beeinflussen.
Bild 2: A) Isolation des Fusionsproteins Dimtetra-A1. Die Äußerung des Fusionsproteins Dimtetra-A1 im Zelllysat (Linie 1) und der unlöslichen Fraktion {Inklusionskörperchen) (Linie 2) wurde geprüft. Reines Dimtetra-A1 -Protein wurde durch Ausspülung von Inklusionskörperchen, Auflösung in 6M GdnHCI und Milli-Q-Wasser-Dialyse (Linie 3) gewonnen. Auf Linie 4 befindet sich der Polypeptid-Standard. B) Das langwellige UV CD-Spektrum der Aufschlämmung des Polypeptidmaterials aus dem Protein Dirn- • * · * · * · ··* • · * · « * * * · t • · B | 4 * · · V ί * • t t · f · · · 9 · * 4» » * · · «* » ·· · * 7 tetra-A1 weist eine sekundäre Alphahelix-Struktur auf, was die entsprechende Wendung des Dimtetra-Al im Material bestätigt.
Bild 3: Die Filtration von M13-Bakteriofagen (A) und des Farbstoffs Dextranblau (B) durch die Membrane, die aus dem Fusionsprotein Dimtetra-Al zubereitet wurde. Nach der Filtration der Bakteriophage wurden diese im Filtrat nicht nachgewiesen (n. n.).
Die Farbstoffkonzentration wurde durch die Absorbanz-Messung bei 625 nm ermittelt.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Vor der weiteren Beschreibung muss klargestellt werden, dass die Erfindung nicht nur auf die präsentierten Beschreibungen beschränk ist, den die Modifikationen bestimmter Beschreibungen können auch noch im Bereich der Patentansprüche liegen.
Sofern nicht anders festgelegt, haben alle hier verwendeten technischen und wissenschaftlichen Begriffe die gleiche Bedeutung wie sie allgemein den Fachexperten aus dem Bereich der Erfindung bekannt ist. Der Zweck der Terminologie, die bei der Beschreibung der Erfindung verwendet wird, ist die Erläuterung eines bestimmten Segments der Erfindung und nicht die Einschränkung der Erfindung. Sämtliche in der Beschreibung genannten Veröffentlichungen sind als Referenzen angeführt. Die Beschreibung der Erfindung und die Patentansprüche sind in der Einzahl geschrieben, sie inkludieren jedoch auch die Mehrzahl, was aber in der Beschreibung zwecks der Einfachheit nicht speziell betont wird.
Polypeptidmaterial
Die Grundlage dieser Erfindung ist die Entdeckung, dass durch das Zusammenfügen von aus einer Doppelwendel-bildenden Domäne bestehenden Fusionsproteinen und der Protein-Oligomerisationsdomäne zwei- oder dreidimensionale Polypeptidmaterialien mit flexiblem Poreneigenschaften gewonnen werden können. Die Verwendbarkeit solcher Materialen ist hoch, von der Trennung von Molekülen bis zur chemischen Katalyse. • · • · • » t » · »ft · * · • · · · « « 9 *<·'* r | « t · · · 0 9 9 · Ψ* 4 9 #♦ »» »» ·* 8
Die Bezeichnung ’Polypeptidmaterial mit flexiblen Poreneigenschaften’ bezieht sich auf das Material mit Poren in bestimmter Form, Größe und physikalisch-chemischen Eigenschaften. Die Erfindung bezieht sich auf das Polypeptidmaterial, zubereitet aus Fusionsproteinen, die aus mindestens zwei Proteindomänen bestehen, wobei mindestens eine der Domänen die Doppelwendel bildet und mindestens eine Domäne die proteinische Oligomerisationsdomäne ist. Die Domänen können einzeln oder vereint auf der Ebene der Proteine mit der chemischen Reaktion auftreten, sie können aber auch als Fusionsprotein genetisch kodiert sein. Die Domänen können von natürlichen Proteinen stammen oder sie werden gemäß der bekannten Informationen über die Eigenschaften der Doppelwendel-Proteine (Patent US 7,045,537 B1) so geplant, dass sie die gewünschten Eigenschaften entwickeln.
Doppelwendel-bildende Segmente
Mindestens eine Domäne des genannten Fusionsproteins, das sich zu Polypeptidmaterial verbindet, ist ein Doppelwendel-bildendes Segment. Die Bezeichnung 'Doppelwendel-bildendes Segment' bezieht sich auf das Motiv der Heptadenwiederholungen der Aminosäuresequenz, wobei die Aminosäure-Reste einer Heptade mit abcdef gekennzeichnet sind, die Reste a und d sind vonwiegend hydrophob und e und g vorwiegend geladen. Bei Interaktion von zwei oder mehrerer solchen Polypeptidketten (Doppelwendel-bildende Segmente) nehmen diese die Wendel-Form an, die sich umeinander wickeln und somit das 'Doppelwendel' bilden. In der einzelnen Wendel wiederholt sich das Heptaden-Motiv ungefähr alle zwei Windungen. Wenn die Polypeptidketten einen Dimer in Form von Doppelwendel bilden, stellen die Aminosäure-Reste an den Positionen a und d an jeder Heptade-Wiederholung einen hydrophoben Kern der Doppelwendel dar und die Reste an den Positionen e und g interagieren durch die elektrostatische Interkation (Bild 1A). In solchen Komplexen wirken Aminosäure-Reste an den Positionen b, c und f nicht mehr im größeren Umfang bei den intermolekularen Interaktionen im entstandenen Dimer mit. So können sich an den Positionen b, c und f Aminosäure-Reste mit verschiedenen Eigenschaften befinden, z.B. geladen, hydrophob, Zysteine und andere, die die chemische Modifikation, Metall-Chelation, spezifische Interaktionen usw. ermöglichen und über die die Erfinder herausgefunden ha- • * · • · 9 ben, dass sie zur Modifikation der chemischen Poreneigenschaften verwendet werden können.
Die Aminosäuresequenzen für Doppelwendei können geplant oder unter den natürlichen Doppelwendel-bildenden Peptiden oder Doppelwendel-bildenden Proteindomänen gewählt werden. Solche Domänen sind in zahlreichen solchen Proteinen zu finden, z.B. Transkriptionsfaktoren, Onkoproteinen, Tropomyosin, Virusproteinen usw.
Die Basis dieser Erfindung ist die Feststellung, dass die physikalisch-chemischen Poreneigenschaften (die durch mit Oligomerisationsdomänen verbundene Doppelwendel beschränkt sind) mit der Veränderung der Länge des Doppelwendel-bildenden Segments definiert und angepasst werden können sowie durch Veränderung und Modifikation der Aminosäure-Resten an den Positionen b, c und f. Diese Reste können positiv oder negativ geladen sein, hydrophob oder hydrophil sowie Chelatoren für Metalltone, und zwar solche, die chemische Modifikationen (Asn, Gin, Cys) oder spezifische Interaktionen ermöglichen; die einzige Beschränkung ist die, dass diese Veränderungen die Bildung der Doppelwendel nicht verhindern könne.
Das Wesentliche an dieser Erfindung ist die Möglichkeit der Definition und der Modifikation der Porengröße mit Hilfe der Länge des Doppelwendel-bildenden Segments. Der Begriff ’Porengröße' bezieht sich auf die Dimensionen der Pore, die von den Fusionsproteinen gemäß der Erfindung umgeben ist. Die Länge des Doppelwendelbildenden Segments kann 2 bis mehr als 150 Heptaden (14 bis 1050 Aminosäure-Reste) umfassen, meistens 2 bis 100 Heptaden (14 bis 700 Aminosäure-Reste).
Die Doppelwendel gemäß der Erfindung (das durch das Zusammenführen der genannten Segmente entsteht) kann aus identischen (homologe Doppelwendel) oder unterschiedlichen Segmenten (heterologe Doppelwendel) bestehen. Identische Doppelwendel-bildende Segmente sind Proteione mit der gleichen Primärstruktur. Unterschiedliche Doppelwendel-bildende Segmente sind Proteine mit unterschiedlicher Primärstruktur, die sich zu Doppelwendel verbinden können, wobei sich in einem Doppelwendel immer mindestens zwei verschiedene Segmente verbinden. Wenn alle
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Polypeptidketten (Doppelwendel-bildende Segmente) im Doppelwendel in gleiche Richtung verlaufen, ist die Kettenorientierung parallel, wenn sie jedoch in entgegengesetzte Richtungen verlaufen, ist sie antiparallel. Die Grundsätze, die die Eigenschaften der Doppelwendel bestimmen, sind den Fachexperten aus dem Bereich allgemein bekannt.
In der Tabelle 1 sind ein paar natürliche Doppelwendel-bildende Segmente angeführt und auch einige Sequenzen, die von den Erfindern designet wurden.
Tabelle 1: Doppelwendel-bildende Segmente
Bezeichnung SEQ ID Nr. (Sequenznr. für) DNA, Proteinsequenz Oligomerisationsstufe Doppelwendel-T yp Bcr 5, 6 2 antiparalleles Homodimer APH 3,4 2 antiparalleles Homodimer APH-1 1,2 2 antiparalleles Homodimer GCN 19, 20 2 paralleles Homodimer P1 15, 16 2 paralleles Heterodimer mit P2 P2 17, 18 2 paralleles Heterodimer mit P1 P3 21,22 2 paralleles Heterodimer mit P4 P4 23,24 2 paralleles Heterodimer mit P3 P5 25,26 2 paralleles Heterodimer mit P6 P6 27,28 2 paralleles Heterodimer mit P5 P7 29, 30 2 paralleles Heterodimer mit P8 P8 31,32 2 paralleles Heterodimer mit P7
Protein-Oligomerisationsdomäne
Die Grundlage dieser Erfindung ist auch, dass mindestens eine Fusionsprotein-Domäne die Oligomerisationsdomäne ist. Der Begriff ’Oligomerisationsdomäne' bezeichnet meistens, jedoch nicht ausschließlich, die natürlichen Proteine oder deren Teile, die die Tendenz zum Verbinden mit gleichen oder unterschiedlichen Proteinen oder deren Teilen aufweisen. Damit bilden sie homologe oder heterologe Dimere oder 11
Oligomere mit einer höheren Oligomerisationsstufe. Das Homodimer {homologes Dimer) bilden zwei identische Proteindomänen und das Heterodimer (heterologes Dimer) zwei unterschiedliche Proteindomänen. Der Begriff 'identische Proteindomänen' bedeutet, dass die Proteine die gleiche Primärstruktur aufweisen und 'unterschiedliche Proteindomänen' sind Proteine mit verschiedener Primärstruktur. Die Strukturen mit einer höheren Oligomerisationsstufe bestehen aus mindestens drei Proteindomänen, die die gleiche {homologe Oligomere) oder verschiedene (heterologe Oligomere) Primärstruktur haben können. Die Strukturinformationen über die gewählten natürlichen Protein-Oligomerisationsdomänen sind den Fachexperten aus diesem Bereich gut bekannt. Die Anzahl der Aminosäure-Reste, die die Domänen gemäß der Erfindung enthalten, beträgt meistens 5 bis 400, häufiger 15 bis 200. Der Begriff ’Oligomerisations-stufe’ bezieht sich auf die Anzahl der Proteindomänen, die das Oligomer bilden und kann 3 bis 12, meistens 3 bis 6 betragen. In der Tabelle 2 sind einige Beispiele der Protein-Oligomerisationsdomänen angeführt.
Die Basis dieser Erfindung ist, dass auch die Eigenschaften Oligomerisationsdomä-nen, zum Beispiel der isoelektrische Punkt und Domänengröße, die Poreneigenschaften bestimmen und dass die Poreneigenschaften auch durch die Oligomerisationsstufe des Oligomers beeinflusst werden.
Tabelle 2: Protein-Oligomerisationsdomänen
Bezeichnung DNA/Proteinsequenz SEQ ID Nr. Oligomerisationsstufe CutA1 83, 84 3 p53 Tetramerisationsdomäne 9, 10 4 Shaker Tetramerisationsdomäne {Tshak) 11, 12 4 Verotoxin Pentamerisationsdomäne (Vero5) 13, 14 5
Linker
Im Gegensatz zu den Fusionsproteinen im Patent U.S. Patent No. 6,756,039, bei denen die Proteindomänen untereinander mit dem steifen Linker verbunden sind (wie z.B. alfa-Wendel), ist der Linker, der die Proteindomänen im Fusionsprotein dieser Erfindung verbindet, flexibel. 12 • *
Der Begriff 'Linker’ bezeichnet eine kürzere Aminosäuresequenz, deren einziger Aufgabe es ist, die einzelnen Domänen oder Proteinsegmente zu trennen. Die Aufgabe des Linker-Peptids im Fusionsprotein konnte auch die Unterbrechung der regelmäßigen Sekundärstrukturen sein, das Verleihen von Flexibilität sowie Posttranslationsmodifikationen und besseres Prozessieren. Die Länge des Linkers ist nicht beschränkt, sie ist durch erwünschte technologische Materialeigenschaften bestimmt und meistens umfasst er nicht mehr als 30 Aminosäure-Reste, vorzugsweise beträgt die Länge jedoch 1 bis 20 Aminosäure-Reste, meistens 1 bis 6. Die Wahl der Aminosäure-Reste im Linker ist nicht beschränkt, trotzdem sind jedoch kleine oder hydrophile Aminosäuren bzw. Aminosäuren, die spezielle Konformations- oder Funktionseigenschaften einführen, wie Serin, Glycin, Threonyn, Prolin, Valin, Alanin, Zystein und andere, am häufigsten.
Fusionsproteine und aus ihnen bestehendes selbstzusammensetzendes Material Die Fusionsproteine im Rahmen dieser Erfindung bestehen aus den Beschriebenen Proteindomänen, die mit dem oben beschriebenen Linker verbinden sind. Die Proteindomänen können im Fusionsprotein in unterschiedlicher Reihenfolge auftreten, wodurch jedoch die technologischen Materialeigenschaften beeinflusst werden können. Die Anzahl der Proteindomänen (der Segmente, die die Doppelwendel und die Protein-Oligomerisationsdomänen bilden können) im Fusionsprotein kann bis zu 8 betragen, meistens 2 bis 4.
Die Basis dieser Erfindung ist, dass die gewählten Proteindomänen des genannten Fusionsproteins bei entsprechenden Bedingungen die Tendenz dazu aufweisen, sich zu zwei- oder dreidimensionalem Polypeptidmaterial zu verbinden. Der Begriff 'zweidimensionales Material' bezieht sich auf die Planarstruktur aus Fusionsproteinen (die Größe des Zusammengesetzen Materials kann in zwei Dimensionen größer sein als in der dritten). Der Begriff 'dreidimensionales Material· bezieht sich auf das Material, in dem sich die Fusionsproteine in drei Dimensionen zusammensetzen. Damit die zwei-oder dreidimensionale Proteinzusammenfügung überhaupt möglich ist, muss mindes- 13 tens eine Proteindomäne (Doppelwendel-bildenden Segments oder die Oligomerisati-onsdomäne) Oligomere mit der Oligomerisationsstufe 3 oder mehr bilden.
Die wichtigsten Eigenschaften des Polypeptidmaterials sind: a) die Porenform und -Größe werden durch die Selbstzusammensetzung der genannten Domänen des Fusionsproteins gemäß der Erfindung bestimmt b) die Porengröße wird durch die Länge des Segments, das die Doppelwendel bildet und im Fusionsprotein mit der Oligomerisationsdomäne verbunden ist, bestimmt c) die Poreneigenschaften werden durch physikalisch-chemischen Eigenschaften der Aminosäure-Reste an den Positionen b, c in f im Doppelwendel-bildenden Segment bestimmt d) die Poreneigenschaften werden auch durch die Eigenschaften der genannten Oli-gomerisationsdomänen im Fusionsprotein bestimmt
Durch die Selbstzusammensetzung eines Fusionsproteins, dessen Eigenschaften durch die Wahl der Proteindomänen, die durch das Design des Fusionsproteins gemäß der Erfindung bestimmt werden, variiert werden können, können verschiedene Versionen des Polypeptidmaterials mit flexiblen Poreneigenschaften zubereitet werden. Wenn jedoch Fusionsproteine, deren Domänen heterogen verbunden sind (wie z.B. homologe Doppelwendel) verwendet werden, muss zur Zubereitung des Polypeptidmaterials mehr als ein Fusionsprotein-Typ verwendet werden. Die Anzahl der verwendeten Fusionsproteine beträgt in diesem Fall 1 bis 10, meistens 1 bis 3.
Die Porenerstellung aus einem oder zwei verschiedenen Fusionsproteinen Das Polypeptidmaterial kann gemäß der Erfindung aus einem einzigen oder zwei oder mehrerer verschiedenen Fusionsprotein-Typen bestehen, wobei jedes Fusionsprotein aus einem Doppelwendel-bildenden Segment und der Oligomerisationsdomäne besteht. Die Erfinder entdeckten, dass im Fall der Zubereitung des Materials aus nur einem Fusionsprotein-Typ das Doppelwendel-bildende Segment ein antiparalleles Homodimer sein muss, im Fall der Zubereitung des Materials aus mehreren Fusionsprotein-Typen kann das Doppelwendel-bildende Segment jedoch ein antiparalleles Hete- 14 »I · • « ♦ · rodimer oder ein paralleles Heterodimer sein. Wenn die genannte Doppelwendel ein paralleles Heterodimer ist, muss sich die Oligomerisationsdomäne in einem Fusionsprotein am N-Terminus und im zweiten Fusionsprotein am C-Terminus des Proteins befinden. Wenn man die richtige Verbindung der Fusionsproteine zu Proteinmembra-nen erreichen möchte, müssen die Oligomerisationsdomänen die gleiche Oligomerisa-tionsstufe haben, zum Beispiel das Trimer (die Beispiele für die Trimerisationsdomäne sind CutA1 SEQ ID Nr.: 84 und Foldon, SEQ ID Nr.: 8) oder das Tetramer (die Beispiele für die Tetramerisationsdomäne sind p53 SEQ ID Nr.: 10 und die Tetramerisati-onsdomäne des Shaker-Kanals, SEQ ID Nr.: 12). Wenn die Doppelwendel stabiler ist als die Oligomerisationsdomäne, können die Oligomerisationsdomänen in beiden Fusionsproteinen am C- oder N-Terminus gleich sein.
Signalpeptid, Peptidkennzeichnungen
Die verschiedenen Aminosäuresequenzen an den zwei Terminus oder zwischen den Fusionsproteinsegmenten, die zur Bildung des Polypeptidmaterials nicht benötigt werden, können dem Fusionsprotein zur leichteren Reinigung und zur Proteindetektion sowie zur Einführung zusätzlicher funktionaler Eigenschaften für das Polypeptidmaterial zugefügt werden.
Die Begriffe 'Signalsequenz' oder 'Signalpeptid' beziehen sich auf die Aminosäuresequenz, die das Protein zur bestimmten Stelle in der Zelle lenkt. Signalsequenzen unterscheiden sich je nach Organismus, in dem das Fusionsprotein geäußert wird. Welche Signalsequenz in welchem Organismus wirkt sowie auch die Aminosäuresequenzen der genannten Signalsequenzen sind den Fachexperten aus diesem Bereich gut bekannt.
Der Begriff ’Peptidkennzeichnungen’ bezieht sich auf die Aminosäuresequenz, die zur leichteren Reinigung/zur Isolation/zur Proteindetektion dem Protein zugefügt wird.
Die Position der Signalsequenz und der Peptidkennzeichnungen ist beliebig, wenn sie die Proteinäußerung nicht beeinträchtigt und die Funktion, für die die Aminosäurese-quenz gewählt wurde, was den Fachexperten aus diesem Bereich bekannt ist, behält. 15 t t ff • «
Fusionsproteine mit Nukleinsäuren-Kodierung und Wirtsorganismen
Die Erfindung bezieht sich auch auf das Fusionsprotein des Polypeptidmaterials und die DNA.
Der Begriff ’DNA/Nukleinsäure' bezeichnet die Polynukleotid-Moleküle wie DNA und RNA, einschließlich cDNA, genomische DNA, synthetische DNA, hymerische DNA und RNA. Die Nukleinsäuren können einsträngig oder doppelsträngig sein. Sie können nukleinische Analoge oder Derivate enthalten.
Der Wirtsorganismus synthetisiert das mit der DNA-kodierte Fusionsprotein gemäß der Erfindung mit Hilfe der heterologen DNA mit der Information für das Fusionsprotein.
Der Begriff "homologes Protein" bezeichnet Proteine mit erhaltenen funktionalen Eigenschaften und den erhaltenen Aminosäuresequenzen, die meistens mindestens bis zu 50 % erhalten sind, wobei das Erhaltungsminimum bei 20 % liegt. Die Ähnlichkeit (Erhaltungszustand) der Sequenzen wird durch die Methode des Anliegens der Aminosäuresequenzen, die den Fachexperten aus diesem Bereich bekannt sind, bestimmt.
Die heterologe Nukleinsäure ist allgemein im Expressionsvektor eingebunden. Der Expressionsvektor enthält allgemein die operativ verbundenen Kontrollelemente, die operativ mit der DNA der Erfindung, die die Information des Fusionsproteins trägt, verbunden sind. Die Kontrollelemente werden natürlich auf eine Weise, die der Äußerungsmenge entspricht, gewählt. Der Promotor kann je nach gewünschtem Äußerungsmuster konstitutiv oder induzibil sein. Der Promotor kann nativ sein oder eine fremde Abstammung haben (in den verwendeten Zellen nicht vertreten) und kann auch natürlich oder synthetisch sein. Der Promotor wird so gewählt, dass er in den Zielzellen des Wirtsorganismus funktioniert. Es sind auch Initiationssignale für eine wirksame Translation des Fusionsproteins eingebunden, dazu gehören auch ATG und die zugehörigen Sequenzen. 16 • c · * • *
Die entsprechenden Vektoren inkludieren: Plasmide, Virusvektoren und Sonstiges, sind jedoch nicht auf sie beschränkt. Der Expressionsvektor kann für die Äußerung in prokaryotischen und eukaryotischen Zellen zubereitet werden. Zum Beispiel; prokary-otische Zellen sind Bakterien, vor allem Escherichia coli. Gemäß der Erfindung dient die Verwendung von prokaryotischen Zellen der Zubereitung der entsprechenden Menge an Nukleinsäure und für die Proteinproduktion.
Die Erfindung umfasst auch die Nukleinsäure enthaltenden Wirtszellen und -Organismen, die für das Fusionsprotein gemäß der Erfindung kodiert werden. Der Begriff "Wirtsorganismus" bezeichnet einen Organismus, in den die DNA mit dem Protein-Code mit der Absicht eingeführt wird, dass dieses sich äußert. Die dafür entsprechenden Wirtszellen sind allgemein bekannt und können prokaryotisch und eukaryo-tisch sein. Der Vektoren-Transport in die Wirtsorganismen verläuft mit Hilfe konventioneller Methoden, wobei die Methoden sich auf die Transformation und Transfektion beziehen, die Folgendes umfassen: den chemischen Transport, die Elektroporation, Mikroinjektion, DNA-Lipofektion, die Sonikation der Zellen, Partikelbombardierung, den Transport der Virus-DNA und sonstige.
Die Übergangsexpression bezieht sich auf die Zufuhr der Vektor-DNA, die nicht im Zellgenom inkludiert ist. Eine stabile Zufuhr wird durch das Einschließen der DNA in den Wirtsorganismus gemäß der Erfindung erreicht. Der DNA-Transfer, vor allem für die Zubereitung des Wirtsorganismus mit integrierter stabiler DNA, kann durch Marker kontrolliert werden. Die Marker-kodierende DNA bezieht sich auf die Widerstandsfähigkeit gegen Medikamente, z.B. Antibiotika, und kann im Vektor gemäß der Erfindung oder in einem getrennten Vektor integriert sein.
Der Wirtsorganismus kann prokaryotisch und eukaryotisch sein. Die eukaryotischen Zellen für die Expression der Fusionsproteine müssen so ausgebildet sein, dass die Zelllinien mit den Methoden der Propagierung des Expressionsvektors und mit der Expression des Fusionsproteins kompatibel sind. Unter geeignete, jedoch nicht einzi- 17 t * · · · · · · • · « · *· · · · ψ · ·« · • · · ♦ Μ · · · ♦ ge Zelllinien gehören Pilze, Hefepilze und pflanzliche sowie Säugetier-Zellen, wie z.B. Fibroblasten von Mäusen, Ratten, Affen und Menschen. Für die DNA-Expression kann gemäß der Erfindung ein beliebiger bakterieller Wirt verwendet werden. Für die Protein-Expression ist gemäß der Erfindung jedoch die Verwendung von Bakterien und Hefepilzen erwünscht. Das Protein kann sich in den Bakterien E. Coli oder B. Subtilis oder in Hefepilzen S. Cerevisiae oder P. Pastoris äußern. Für die Protein-Expression ist die am meisten erwünschte Bakterie E. Coli.
Die Erfindung bezieht sich auf die Protein-Expression in Bakterien und Hefepilzen. Die Erfindung bezieht sich auf Bakterien und Hefepilze, die das Protein äußern, wobei die am meisten erwünschten die Bakterie E. Coli und der Hefepilz P. Pastoris sind.
Zubereitung und Verwendung von Polypeptidmaterial für die Trennung der Moleküle gemäß ihrer Eigenschaften
Die Eigenschaft, die die Proteine gemäß der Erfindung haben müssen, ist das Verbinden zu Polypeptidmaterial bei entsprechenden Bedingungen. Wenn das Polypeptidmaterial aus einem Fusionsprotein entsteht, werden entsprechende Bedingungen gesucht, und zwar durch Beobachtung der Löslichkeit, des makromolekularen Aufbaus, der Bestimmung der Sekundärstruktur des löslichen Teils sowie vor allem der Ausfällungen in Puffern mit verschiedenen pH-Werten {meistens pH 3 bis pH 9), der ionischen Stärke in Anwesenheit verschiedener organischer Lösemittel (wie DMSO, Acetonitril, Trifluoroethanol, Hexafluoroisopropanol).
Bei der Zubereitung des Filtersystems für die Trennung der Moleküle ist es wichtig, dass das Material sich mit möglichst wenigen Verbindungsfehlern verbindet. Dies kann durch stufenweise erneute Wendelformung weg von den Bedingungen, die die Monomer- und die löslichen Strukturen favorisieren, hin zu den Bedingungen, die die Formung einer intermolekularen Interaktion über die Doppelwendel und proteinische Oligomerisationsdomänen ermöglichen, erreicht werden. Wichtige Faktoren bei der Selbstzusammensetzung sind auch die Konzentration des Fusionsproteins und die Temperatur. Das für die Filtration geeignete Polypeptidmaterial bildet sich, wenn die
Protein-Konzentration zwischen 0.1 _g/mL und 20 mg/mL liegt, meistens zwischen 0.05 und 10 mg/mL. Die Selbstzusammensetzung des Polypeptidmaterials kann durch langsames Abkühlen des Fusionsproteins von der Temperatur über dem Schmelzpunkt bis zu den Temperaturen unter der Temperaturschwelle, meistens bis zur Raumtemperatur, ausgelöst werden.
Beim Polypeptidmaterial, das so entworfen ist, dass es durch das Zusammensetzen mehrerer Fusionsproteine entsteht, kommt es zum Zusammensetzen nach der Verbindung der Fusionsproteine im entsprechenden Mol-Verhältnis und bei Bedingungen, die das Zusammensetzen ermöglichen.
Bildung von Filtrationseinheiten
Wenn das Polypeptidmaterial fertig gebildet ist, kann er noch zusätzlich mit Verbindungsreagenzien vernetzt werden, ein solches ist zum Beispiel Glutaraldehyd. Dieses Polypeptidmaterial kann zur Trennung von Molekülen in der Größe von ungefähr 1 nm bis ungefähr 100 nm verwendet werden, je nach Porengröße und -Eigenschaften. Die potentiellen Applikationen sind zum Beispiel die Filtration der pharmazeutischen Zubereitungen, das Entfernen von Unreinheiten aus medizinischen Präparaten, das Entfernen von Krankheitserregern wie Viren, Prionen usw., das Reinigen von Abwasser, die Trennung von Nanoteilchen nach Größe usw. Eine zusätzliche wichtige Eigenschaft des Polypeptidmaterials mit Poren mit flexiblen Eigenschaften ist auch, dass neben der Porengröße auch andere Poreneigenschaften, z.B. die Ladung, die an Poren immobilisierten spezifischen Reagenzien usw., die Trennung von Molekülen ähnlicher Größe ermöglichen, die unterscheiden sich jedoch durch andere Eigenschaften, wie Polarität, Ladung, Form, spezifische Oberflächeneigenschaften usw., unterscheiden.
Verwendung des Polypeptidmaterials mit flexiblen Poreneigenschaften für die Katalyse
Die Einfuhr bestimmter Aminosäure-Reste, wie z.B. Histidin und Zystein, an die Positionen b, c und f der Doppelwendel wird durch die Bindung der Metalle an die Poren, die dadurch als Katalysatoren fungieren, ermöglicht. An das Polypeptid material mit breiteren Poren können auch Enzyme gebunden werden, das Polypeptidmaterial dient
19 somit als ein Werkzeug für die enzymische Katalyse. Durch die Einfuhr der aktiven Positionen (z.B. der katalytischen Triaden) in entsprechender Geometrie in die Poren des genannten Materials können auch künstliche Enzyme gebildet werden.
Im Weiteren sind Erstellungsbeispiele angeführt, deren Zweck es ist, die Erfindung zu verbildlichen. Die Beschreibung einzelner Erstellungsbeispiele dient nicht der Einschränkung der Erfindung, sondern wird als Demonstration der Wirkungsweise der Erfindung dargestellt.
Anwendungsbeispiele
Beispiel 1. Zubereitung von DNA-Konstrukten
Die DNA-Sequenzen für die oben genannten Proteindomänen wurden aus Aminosäuresequenzen der gewählten Domänen mit Hilfe von Designer {DNA2.0. Inc.) erstellt. Dieses Programm ermöglicht dem Benutzer, die DNA-Fragmente zu erstellen sowie die Expression-Optimierung für den gewählten Wirt (z.B. E. Coli) mittels Kodonoptimierung. Die Gene wurden bei Mr. Gene GmbH (Im Gewerbepark B32, D-93059 Regensburg) bestellt, sie wurden mit Restriktions-Endonukleasen ausgeschnitten und in den geeigneten Vektor mit sämtlichen erforderlichen Regulierungssequenzen, die den Fachexperten aus diesem Bereich bekannt sind, eingeklont. Zu den gewählten Vektoren gehören die handelsüblichen Vektoren pET, pRSET A und pSB1A2 (pSB1A2 https://partsregistry.Org/Part:pSB1A2), die alle erforderlichen Eigenschaften besitzen, zum Beispiel die Resistenz gegen Antibiotika, die Stelle des Verdoppelungsbeginns, den Bereich mit mehreren Stellen für das Klonen. Für die Zubereitung von DNA-Konstrukten wurden die Methoden der Molekularbiologie verwendet (das Schneiden von DNA mit Restriktionsendonukleasen, die Vermehrung von DNA durch Kettenreaktion mit Hilfe von Polymerase - PCR, PCR - Ligation, Detektion der DNA-Konzentration, Agarose-Gelelektrophorese, Reinigung der DNA-Fragmente aus den Agarose-Gels, die Ligation der DNA-Fragmente in den Vektor, die Transformation der chemisch kompetenten Zellen E.coli DH5..., die Isolation der Plasmid-DNA mit handelsüblichen Kitts sowie Selektion). Alle Verfahren wurden bei 20 sterilen Bedingungen durchgeführt. Die DNA-Segmente wurden durch Restriktionsanalyse und Sequenzierung charakterisiert.
Die Verfahren des molekularen Klonens sind im Handbuch für Molekularbiologie genau beschrieben (Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. 1989. Molecular cloning: A laboratory manual. 2nd ed. New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1659 p.).
Beispiel 2. Die Produktion von Fusionsproteinen, die aus dem antiparallelen Homodimer-Doppelwendel und der Tetramerisationsdomäne bestehen Zur Darstellung der Durchführbarkeit der Produktion des Fusionsproteins, das aus dem antiparallelen Homodimer-Doppelwendel und der Tetramerisationsdomäne besteht, haben wir mehrere DNA-Konstrukte vorbereitet (Tabelle 3).
Tabelle 3: Fusionsproteine, bestehend aus dem antiparallelen Homodimer-Doppelwendel und der Tetramerisationsdomäne p53 oder der Tetramerisationsdomäne des Shaker-Kanals.
Nr. Bezeichnung Zusammensetzung des Konstrukts SEQ ID Nr: 1 Dimtetra-Al APH1 p53T 34 2 Dimtetra-AIGSGS APH1 GSGS p53T 36 3 Dimtetra-A APH p53T 38 4 Dimtetra-B Bcr p53T 40 5 Tetradim-Al p53T APH1 42 6 Tetradim-A p53T APH 44 7 Tetradim-B p53T Bcr 46 8 A1-Tshak APH1 TShak 48 9 A-Tshak APH TShak 50 10 B-Ts hak Bcr TShak 52 11 Tshak-A1 TShak APH 1 54 12 Ts hak-A TShak APH 56 13 Tshak-B TShak Bcr 58
Zusätzlich zur Veränderung der Orientierung von Proteindomänen im Fusionsprotein kann auch die Länge des Linkers verändert werden, und zwar von 2 bis 20 Aminosäure-Resten, und die His6-Peptid-Kennzeichnung kann sich am N-Terminus oder C-Terminus des Proteins befinden.
Die Plasmiden, die die geöffneten Leserahmen für Fusionsproteine aus der Tabelle 3 kodieren, wurden von den Erfindern zu chemisch kompetenten Zellen E.coli BL21 (DE3) pLysS transformiert. Die gewählten Bakterienkolonien, die auf LB-Platten unter Zugabe des Antibiotikums (Ampicillin, Kanamycin) gewachsen sind, wurden auf 100mL Nährmedium LB unter Zugabe des Antibiotikums gegeben und über Nacht bei 37 °C gebrütet. Die entstandene Kultur wurde am nächsten Tag 20-50-Mal verdünnt, um das OD600 der verdünnten Kultur zwischen 0,1 und 0,2 zu erreichen. Als die Bakterienkultur auf OD600 zwischen 0,6 und 0,8 gewachsen ist, folgte die Induktion der Protein-Äußerung durch den Induktor IPTG (0.4 mM bis 1 mM). In manchen Beispielen wurde 0,5 Stunden vor der Induktion die Bebrütungstemperatur der Bakterien reduziert (25 aC-30 °C). Zwei bis fünf Stunden nach der Induktion folgte das Schleudern der Bakterienbrühe. Die Zellen wurden danach im Puffer für die Lyse resuspendiert (Tris pH 8.0, 0.1 % Desoxycholat mit Zusatz von Protease-Inhibitoren) und auf -80 eingefroren. Die aufgetaute Zellaufschlämmung wurde durch Sonikation und Schleudern lysiert. Mit Hilfe der SDS-PAGE-Techniken und bei Bedarf der Western blot-Analyse, wobei als primäre Antikörper die anti-His-tag Antikörper verwendet wurden, wurde die Äußerung der Konstrukte im Präzipitat bzw. Supernatant geprüft. Sämtliche Konstrukte mit p53T waren allgemein in unlöslichen Fraktionen enthalten (Inklusionskörperchen), wo das gewünschte Protein > 80 % der gesamten Proteine darstellte.
Die Inklusionskörperchen wurden mehrmals mit Lysepuffer ausgespült, zweimal mit 2M Harnstoff und 10 mM Trisom pH 8.0 und einmal mit Mili-Q-Wasser. Meistens ergab eine solche Behandlung ein zu mehr als 95 % gereinigtes Protein. Wenn das Protein trotz der Behandlung noch immer Unreinheiten enthielt, wurden die Inklusionskörperchen in 6 M GdnHCI pH 8,0 aufgelöst und auf die Ni2+-NTA-Säule (Qui-agen, GE) aufgetragen. Die Reinigung unter Vergällungsbedingungen wurde gemäß den Herstellerhinweisen durchgeführt. Nach der Elution mit 250 mM Imidazol pH 5,8 22 • · • * wurden die Fraktionen, die Proteine enthielten, zusammengeführt und zweimal dialy-siert mit 10 mM HEPES pH 7,5 odereinem anderen entsprechenden Puffer.
Wenn das Fusionsprotein im Supernatant enthalten war, wurde es von den Erfindern auf Ni2+-NTA-Säule aufgetragen und unter nativen Bedingungen gereinigt. Nach der Elution mit 250 mM Imidazol pH 5,8 oder 500 mM Imidazol pH 8,0 wurden die Fraktionen, die das gewünschte Proteine enthielten, zusammengeführt und zweimal dialy-siert mit 10 mM HEPES pH 7,5 odereinem anderen entsprechenden Puffer.
Beispiel 3. Die Produktion von Fusionsproteinen, die aus dem antiparalleler Homodimer-Doppelwendel und der Trimerisationsdomäne bestehen Zur Darstellung der Durchführbarkeit der Produktion des Fusionsproteins, das aus dem antiparallelen Homodimer-Doppelwendel und der Trimerisationsdomäne besteht, haben wir mehrere DNA-Konstrukte vorbereitet (Tabelle 4).
Tabelle 4.: Fusionsproteine, die aus der antiparallelen Homodimer-Doppelwendel und der Trimerisationsdomäne bestehen
Nr. Bezeichnung Zusammensetzung des Konstrukts SEQ ID: Nr. 1 Foldon-Al Foldon APH1 60 2 Foldon-A Foldon APH 62 3 Foldon-B Foldon Bcr 64 4 A1 -Foldon APH1 Foldon 66 5 A-Foldon APH Foldon 68 6 B -Foldon Bcr Foldon 70 7 A1 -CutA1 APH1 CutA1 72 8 A-CutA1 APH CutAl 74 9 B-CutA1 Bcr CutAl 76 10 CutA1 -A1 CutAl APH1 78 11 CutA1 -A CutAl APH 80 12 CutA1 -B CutAl Bcr 82
Zusätzlich zur Veränderung der Orientierung von Proteindomänen im Fusionsprotein kann auch die Länge des Linkers verändert werden, und zwar von 2 bis 20 Aminosäu- re-Resten, und die His6-Peptid-Kennzeichnung kann sich am N-Terminus oderC-Terminus des Proteins befinden.
Die Produktion und die Isolation der Proteine wurden wie im Beispiel 2 angeführt durchgeführt.
Beispiel 4: Die Zubereitung des selbstzusammensetzenden Polypeptidmaterials mit erneuter Wendel des auf Verdünnung, Dialyse oder Temperatur-Tempern basierenden Proteins
Die anfänglichen Versuche zur Ermittlung der Bedingungen, bei denen die Fusionsproteine die Wendelform sowie die Fähigkeit zur Selbstzusammensetzung aufweisen, wurden mit der Protein-Verdünnung im Vergällungsmittel - 6 M GdnHCI - im Verhältnis 1 : 1 00 in Puffern mit verschiedenen pH-Werten (Zitratpuffer pH 2 und pH 3, Acetatpuffer pH 4, pH 5, Phosphatpuffer pH 5, pH 6, pH 7, Hepes-Puffer pH 7.5, Tris-Puffer pH 8, Karbonat-Puffer pH 9 und pH 10), mit verschiedenen lonstärken (100 mM, 300 mM, 1 Μ, 2M Salz) und mit bis zu 20 % organischen Lösemitteln, wie Acetonitril, DMSO, Methanol, bzw. in bis zu 50 % im Fall von Trifluoroethanol, durchgeführt. Man konnte die makroskopischen Proteinverbindungen in Form von feinem Präzipitat oder des eher erwünschten Polypeptid-Aggregats erkennen - Gel-ähnliche Strukturen. Zur Ermittlung der Löslichkeit des Fusionsproteins wurden die proteinischen Absorptionsspektren aufgenommen.
Mit Hilfe der CD-Spektroskopie wurden die sekundären Strukturen und die thermische Stabilität des löslichen Teiles ermittelt.
Als die für die Selbstzusammensetzung entsprechenden Bedingungen festgelegt wurden, folgte die Dialyse größerer Mengen, z.B. von 1 mg vergällten Proteins zum gewählten Puffer, wobei durch das langsame Entfernen des Vergällungsmittels die Selbstzusammensetzung des Fusionsproteins bewirkt wurde.
Wenn das Fusionsprotein APH-1 enthalten hat, war auch die Temperatur dabei ein wichtiger Faktor, denn das Homodimer APH-1 ist bei höheren Temperaturen unbeständiger. Dieser Typ des Fusionsproteins war bei Raumtemperatur relativ Löslich. Seine CD-Spektren und die Schmelzpunkte entsprachen den Messungen im Rahmen der Tetramerisationsdomäne p53T. Bei diesen Beispielen wurde das langsame Anliegen durch langsame Temperaturreduktion von δΟ'Ό auf 4°C Grad in zehn Stunden erreicht, und zwar bei einer Protein-Konzentration von 0,5 mg/ml.
Beispiel 5: Erneute Wendelbildung der Fusionsproteine und Membranenzubereitung Die Membranen aus Fusionsproteinen wurden mit Hilfe verschiedener Selbstzusammensetzungsmethoden mit erneuter Wendelbildung mit der anfänglichen Auflösung der Fusionsproteine in: a) 6 M GdnHCI, b) 9M LiBr, c) Hexafluoroisopropanol zubereitet.
Die Probe des isolierten Proteins SEQ ID: 34 wurde in 6 M LiBr bei einer Konzentration von 0,1 mg/ml aufgelöst. Bei dieser Konzentration wurde die Sekundärstruktur des Proteins zerstört und es war bis zu mehr als 10 mg/ml löslich. Der Zusammensetzungsprozess der Proteine begann mit der Auflösung des Proteins in 9 M LiBr, es folgte die Verdünnung in den Puffer, vorzugsweise mit nativem Proteinzustand, Doppelwendel-Bildung und Tetramerisation der Domäne p53 (Puffer 20 mM HEPES bei pH 7.5. Währen der erneuten Wendelbildung entstand eine sichtbare Proteinverbindung. Die Protein-Aufschlämmung wurde langsam auf den PVDF-Membranfilter mit einer Porengröße von 0,22 Im (Millipore) und einem Durchmesser von 13 mm aufgetragen und wirkte als Unterlage für die verbundene Proteinmembrane. Nach dem Aufträgen des verbundenen Proteins auf den Stützfilter folgte die Ausspülung der Lösung mit 10 ml 20 mM HEPES-Puffer mit dem pH-Wert 7,5. Die mechanische Resistenz der Proteinmembrane wurde durch das kovalente kreuzweise Verbinden des selbstzu-sammensetzenden Proteinmaterials mit Hilfe von 10 % Glutaraldehyd verbessert. Eine Stunde nach dem Aufträgen von Glutaraldehyd wurde die Membrane mit 10 ml 1 M Tris mit einem pH-Wert von 8,0 gespült, dieses wirkte als Blockreagenz zum Entfernen von nicht reagiertem Glutaraldehyd, und mit 10 ml deionisiertem Wasser. Die Pro- teinmembrane wurde im Wasser gelassen, damit sie nicht austrocknet, bevor sie als Filter verwendet wird.
Alternativ wurde die Proteinmembrane durch die Bebrütung des Trägerfilters mit der Polypeptid-Lösung bei 80 °C und dem Aufträgen mit langsamer Abkühlung auf 4 °C, wie im Beispiel 4 angeführt, zubereitet.
Der im Hexafluoroisopropanol aufgelösten Probe wurde Wasser bis zu 5 % zugegeben, das Hexafluoroisopropanol ist verdunstet, übergeblieben ist ein Proteinmineral in einer kleinen Menge Wasser.
Beispiel 6: Die Verwendung des verbundenen Polypeptidmaterials für die Trennung großer Moleküle und Teilchen (Bakteriophage) Für das Testen der Filtrationsfähigkeiten des entstandenen Polypeptidmaterials (Membranen) wurden M13-Bakteriophage und Dextranblau verwendet. Die Aufschlämmung der Bakteriophage M13 wurde durch den Filter aus Polypeptidmaterial auf der Unterlage gefiltert. Der Phagentiter der anfänglichen Aufschlämmung wurde in einem den Fachexperten aus dem einschlägigen Bereich gut bekannten Verfahren bestimmt. Der anfängliche Titer war 3x 1010 pfu/ml, im Filtrat wurde jedoch kein Phag detektiert, was bedeutet, dass es zur Titer-Reduktion um mindestens 6 Größenordnungen (weniger als 104 pfu/ml) gekommen ist (Bild 3A). Auch Dextranblau (0,5 mg/ml) wurde gefiltert und der Filtrationserfolg wurde mit der Absorbanzmessung bei 625 nm bestimmt (Bild 3B). 26 SEQUF.NZEN-LISTF <160> 84 <1 70> Patentin Version 3.4 <210> 1 <211 > 93 < 2 12> DNA <2 13 > synthetische Sequenz <2 2C > <221 > CDS <222> (1)--(93} <223> ΑΡΗ 1 <400> 1 atg aaa cag ctg gaa aaa gaa ctg Met Lys Gin Leu Glu Lys Glu Leu 1 5 caa ctg caa tgg aag get caa get Gin Leu Gin Trp Lys Ala Gin Ala 20 <210> 2 <211> 31 <212> PRT <2 13> synthetische Sequenz <400> 2 Met Lys ; Gin Leu Glu Lys Glu Leu 1 5 Gin Leu i Gin Trp Lys Ala Gin Ala 2C <210> 3 < 211 > 135 <212> DNA <213> syntheti sehe Sequenz <22C > <221 > CDS <222> (1) - - (135) <223> APH <400> 3 atg aaa [ cag ctg gaa aaa gag ctg Met Lys i Gin Leu Glu Lys Glu Leu 1 5 gca att Cfclä 353 Cc3Cj ctg gca cag Ala Ile : Glu Lys Gin Leu Ala Gin 20 aaa aaa . aaa clg gcc cag ctg aaa Lys Lys Lys Leu Ala Gin Leu Lys 35 4C <210> 4 <2 11 > 45 <2 1 2> PRT <213> svnthet:sehe Sequenz < 4 0 0 > 4 caa Gin gca Ai a 1 0 atc Ile gaa Glu aaa Lys cag Gin ctg gca Leu Ala 1 5 ege Arg 25 aag Lys aaa Lys aag Lys ctg Leu gca Ala 30 cag Gin 4 8 93
Gin Ala 10 lle Glu Lys Gin Leu Ala 15 Arg 25 Lys Lys Lys Leu Ala 30 Gin aaa Lys cag Gin 10 rta Leu gaa Glu aaa Lys gaa Glu ctg Leu 15 caa Gin ctg Leu 25 caa Gin tgg Trp aaa Lys gca Ala cag Gin 3 0 gca Ala cgL Arg aaa Lys aaa Lys ett Leu cag Gin gcc Ala 45 48 96 135 27 • · · · * * φ « · 9
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Met 1 Lys Gin Leu Glu 5 Lys Glu Leu Lys Gin 10 Leu Glu Lys Glu Leu 15 Gin Ala Ile Glu Lys 20 Gin Leu Ala Gin Leu 25 Gin T rp Lys Ala Gin 30 Ala Arg T,y s Lys Lys Leu Ala Gin T,eu Lys Lys Lys Leu Gin Ala 35 40 45 <210> 5
<211> 111 <212> DNA <213> synthetisches Protein <220>
<221> CDS <222> (1).,(111)
<223> BCR <400> 5 atg Met 1 gat Asp att Tie gaa Glu cag Gin 5 gaa Glu ctg T.eu gaa Glu ege Arg gca Al a 1 0 aaa T.ys gca Ala agc Ser att Ile egt Arg 15 egt Arg 48 ctg Leu gaa Glu cag Gin gaa Glu 20 gtt Val aat Asn caa Gin gaa Glu egt Arg 25 agc Ser egt Arg atg Met gca Ala tat Tyr 30 ctg Leu caa Gin 96 acc Thr ccq Leu ctg Leu 35 gca Ala aaa Lys 111 <21 0> <21 1 > <21 2> <21 3 > 6 37 PRT synthetisches . Protein < 4 0 0 > 6 Met 1 Asp Ile Glu Gin 5 Glu Leu Glu Arg Ala 10 Lys Ala Ser Ile Arg 15 Arg Leu Glu Gin Glu 20 Va 1 Asn Gin Glu Arg 2 5 Ser Arg Met. Ala Tyr 30 Leu Gin Thr Leu Leu Ala l.ys 35 <210> 7 <211> 84
<212> DNA <213> synthetisches Protein <220> <221> CDS <22 2> (1) .. (84) <22 3> Folcon <4C0> 7 atg ggt tat att. cct gaa gca cca egt gat ggc caa gca tue gtt egt 48
Met Gly Tyr Ile Pro Glu Ala Pro Arg Asp Gly Gin Ala Tyr Val Arg 15 10 15 aaa gac ggt gaa egg gtc ctg ctg tcc act ttc ctg
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<210> 8 <211> 28 <2 1 2> PRT <213> synthetisches Protein <400> 8
Met Gly Tyr Ile Pro Glu Ala Pro Arg Asp Gly Gin Ala Tyr Val Arg 1 5 10 '15 lys Asp Gly Glu Trp Val Leu Leu Ser Thr Phe Leu 20 25 <210> 9 <211> 96
<212> DNA <213> synthetisches Protein <220> <221> CDS <222> (1) .. (96)
<223> p53T <40 0> 9 atg gaa tac ttt acc c Lg cac atc cg L ggc cg L gag cgL t LC gag aLg 48 Ket 1 Glu Tyr Phe Thr 5 Leu His Ile Arg Gly 10 Arg Glu Arg Phe Glu 15 MeL ttc cgc gaa ctg aat gaa qcc ctg gaa ctg aas gat gct caa gca ggt 96 Phe Arg Glu Leu 20 Asn Glu Ala Leu Glu 25 Leu Lys Asp Ala C-ln 30 Ala Gly <210> 10 <211> 32
<212> PRT <213> synthetisches Protein < 4 0 0 > 10
Met Glu Tyr Phe Ihr Leu His Ile Arg Gly Arg Glu Arg Phe Glu Met 1 5 10 15
Phe Arg Glu Leu Asn Glu Ala Leu Giu Leu Lys Asp Ala Gin Ala Gly
20 25 3C <210> 11 <211> 285
<212> DNA <213> synthetisches Protein < 2.2 0 > <221 > CDS <222> (1)..(285) <223> TetShak <40 0> 11 atg gaa egt gtt gtt aLL aat gtg agc ggt ctg egt ttt gaa acc cag 48 Met 1 Glu Arg Val Vc 1 5 Ile Asn Val Ser Gly 10 Leu Arg Phe Giu Thr 15 Gin ctg aaa acc ctg S ri tl cag ttc ccg gat acc ctg ctg ggt aat ccg cag 96 Leu Lys ihr Leu 20 Asn Gin Phe Pro Asp 25 Thr Leu Leu Gly Asn 30 Pro Gin aas egt aat egt. t- Ü t taz gat ccg ctg cgc aac gaa tat ttt ttt gat 144 Lys Arg Asn Arg Tyr Tvr Asp Pro Leu Arg Asn Glu Tyr Phe Phe Asp 29 35 40 4 5 cgc Arg aat Asn 50 egz Arg ccg Pro agc Ser ttt Phe gat Asp 55 gcc Ala att Ile ctg Leu tat Tyr ttt Phe 60 tat Tyr cag Gin agc Ser ggt Gly 192 ggt Gly 65 egt Arg ctg Leu egt Arg egt Arg ccg Pro 70 gtt Val aat Asn gtt Val ccg Pro ctg Leu 75 gat Asp gtg Val ttt Phe agc Ser gaa Glu 80 240 gag Glu ate 1 le aaa Lys Ltt Phe tat Tyr 85 gaa Glu ctg Leu gqc Gly gaa Glu aac Asn 90 gcc Ala ttt Phe gaa Glu cgc Arg tat Tyr 9 5 285 <21 0> <2 11 > <2 1 2> <2 1 3 > 1 2 95 PRT synthetisches ; Protei i Ί <400> 12 Mer. 1 Gl.u Arg Val Val 5 1 le Asn Val Ser Gly 10 Leu Arg Phe Glu Thr 15 Gin Leu Lys Thr Leu 20 Asn Gin Phe Pro Asp 25 ihr Leu Leu Gly Asn 30 Pro Gin Ly s Arg Asn 35 Arg Tyr Tyr Asp Pro 40 Leu Arg Asn Gl u Tyr 45 Phe Phe Asp Arg Asn 50 Arg Pro Ser Phe Asp 55 Ala Ile Leu Tyr Phe 60 Tyr Gl n Ser Gly Glv 65 Arg Leu Arg Arg Pro 70 val Asn Val Pro Leu 75 Asp Val Phe Ser Glu 80 Glu Ile Lys Phe Tyr 85 Glu Leu Gly Glu Asn 90 Ala Phe Glu Arg Tyr 9 5 <210> <211 > <212> <213> 13 21C UNA synthetisches i ProLein <220> <221 > <222> <223> CDS (1) .. Verof (21C) <40C> atg aca Met Thr 1 13 c cg Pro gat Asp tgt Cys 5 gtt Val acc Thr ggc G'-y aaa lys gtg Val 10 gaa Glu Lat Tyr acc Thr aaa Lys tat Tyr 15 aac Asn 48 gat Asp gac Asp gat Asp täCC Thr 20 tz t Phe acc Thr gtg Val 33ö Lys gtg Val 25 ggt Gly gat ASp d itä. Lys gaa Glu ctg Leu 30 ttt Phe acc Thr 9 6 aat 7\sn egt Arg Lgg Trp 3 5 3 d. L Asn c zq Leu Caä Gin agc Ser ctg Leu 40 ctg Leu ctg Leu agc Ser gca Ala cag Gin 45 at t Ile aeg Thr ggt Gly 144 atg Met acc Thr 5 0 gtt Val Thr ar_ t I le add Lys dC C Thr 55 aat Asn gca Ala tgc Cys c, a t His aat Asn 60 ggt Gly ggt Gly ggc Gly ttt Phe 192 agc gaa gtt dt t trt egt 210 30 • * • m
Ser Glu Val Ile Phe Arg 65 70 <210> 14 <211> 70
<212> PRT <213> synthetisches Protein <400> 14
Met 1 Thr Pro Asp Cys 5 Val Thr Gly Lys Val 10 Glu Tyr Thr Lys Tyr 15 Asn Asp Asp Asp Thr 20 Phe Thr Val Lys Val 25 Gly Asp T.ys Glu Leu 30 Phe Thr Asn Arg Trp 35 Asn _,eu Gin Ser Leu 40 Leu Leu Ser Ala Gin 45 Ile Thr Gl y Met Thr 50 Val Thr Ile Lys Thr 55 Asn Ala Cys His Asn 60 Gly Gly Gly Phe Ser Glu Val Ile Phe Arg 65 70 <210> 15 <211> 99
<212> DNA <213> synthetische Herkunft <220> <2 21> CDS <222> ¢1)..(99)
<223 > PI <400> 15 agc Ser 1 cca Pro gaa C-lu gar. Asp gaa Glu 5 at.t Ile cag Gin g ca A'. a ctg Leu gaa Gl u 10 gaa Glu gaa Glu aat Asn gct Ala caa Gin 15 ctg Leu 48 gaa Glu cag Gin gaa Glu aac Asn 20 gcg Ala gcg Ala ctq Leu gaa Glu gaa Glu 25 gaa Glu atc Ile gca Al a cag Gl n ctg Leu 30 gaa Glu Lac Tyr 96 ggc 99
Gly <210> 16 <211> 33
<212> PRT <213> synthetische Herkunft <4 00 > 16
Ser Pro Glu Asp Glu Ile Gin Ala Leu Glu Glu Glu Asn Ala Gin Leu 1 5 10 15
Glu Gin Glu Asn Ala Ala Leu Glu Glu Glu Ile Ala Gin Leu Glu Tyr 20 25 30
Gly <210> 17 <211> 99
<212> DNA 48 31 <213> synthetische Herkunft <22C> <221> CDS <222> (1) . . (39 ) <223> P2 <40C> 17 t. c L cca gaa gac aaa atc gca cag ctg aaa gaa aag aac gcg gcc ctg Ser 1 Pro Gl u Asp Lys 5 Ile Ala Gin Leu LVS 10 Glu Lys Asn Ala Ala 15 Leu aaa gaa aaq aat caa cag ctg aa q gag aaa atc caa gca ctg aaa tat Lys Glu Lys Asn 20 C-ln Gin Leu Lys Glu 25 Lys lle Gin a: a Leu 30 Lys Tyr 96 99 ggc
Gly <210> 18 <211> 33
<212> PRT <213> synthetIsche Herkunft <4 00> 18
Ser Pro Glu Asp Lys lle Ala Gin Leu Lys Glu lys Asn Ala Ala Leu 15 10 15
Lys Glu Lys Asn Gin Gin Leu Lys Glu Lys Ile Gin A_a Leu Lys Tyr 20 25 30
Gl y <210> 19 <211> 99
<212> DNA <213> synthetische Herkunft <22C> <221> CDS <222> (1)..(99)
<223> GCN <40C> 19 egt atg aaa cag ctg gaa gat. aaa atc gag gag ctg ctg tcc d c g atc Arg 1 Met Lys Gin Leu 5 Glu Asp Lys lle G1 u 10 Glu Leu Leu Ser Lys 15 : le *L.dC cac ctg gaa aac gaa az t. get cgc ctg aaa aag ctg att qgt gaa Tyr H:.s Leu Glu 20 Asn Glu 71 e Ala Arg 25 Leu Lys Lys Leu Ile 3C Gly Gl u cgc Arg 8 96 <210> 20 <211> 33
<212> PRT <213> synthetische Herkunft <4C0> 20
Leu Leu Ser Lys Tie
Arg Met Lys Gin Leu Glu Asp Lys tle Glu Gnl 99 32 • « # · 1 5 10 15
Tyr His Leu Glu Asn Glu Ile Al«! Arg Leu Lys I.ys Leu Ile Gly Glu 20 25 30
Arg <210> 21 <211> 99
<2l2> DNA <213> synthetische Herkunft <220>
<221> CDS < 2 2 2 > (1)..(99) < 2 2 3 > P3 <400> 21 tcc ccg Ser Pro 1 gaa Glu gaL Asp gag Glu 5 atc Ile cag Gin caa G' n ccg Leu gaa Glu 10 gaa Glu gaa Glu atc Ile gcc Ala cag Gin 15 ctg Leu 48 gaa cag Glu Gin aaa lys aac Asn 2C gca Ala geg Ala ctg Leu aaa T.ys gag Glu 25 aaa Lys aac Asn cag Gin geg Ala ctg Leu 30 aaa Lys tac Tyr 96 ggL Gl y 99 <210> <211 > <21 2> <213> 22 33 PRT synlhetrs che Herkunf t <400> 22 Ser Pro 1 Glu Asp Glu 5 ile Gl n Gin _eu Glu 10 Glu Glu Ile Ala Gin 15 Leu Glu Gln Lys Asn A 1 a Ala Leu Lys Gl u Lys Asn Gl n Ala Leu Lys Tyr 20 25 30
Gly <210> 23 <211> 99
<212> DNA <213> synthetische Herkunft <22 0> <22l> CDS <22 2> (1)..(99) <223> P4 <400> 23 agc Ser 1 ccg Pr o Qari Glu gar Asp 3 3 ci I VS 5" ütt Ile Id- Ala caq Gin ctg Leu aaa T.ys IC caa Gin aaa Lys atc Ile caa Gin geg Λ1 a 15 ctg ^ei] 48 a a n Lys cag Gin gaa Glu aac Asn 20 cag Gin r:ag Gl π ccg Leu tjdd Glu gag Glu 2 5 gaa Glu aac Asn gcc A! a gca A1 a ctg Leu 3C gaa Glu ca t Tyr 96 ggt. 99 33
Gly <210> 24 <211> 33
<212> PRT <213> synthetische Herkunft <400> 24 Ser Pro Glu Asp Lys 2 le Ala Gin Leu 1 5 Lys Gin Glu Asn Gin Gin Leu Glu Glu 20 25 Gly <210> 25 <211> 99 <212> DNA <213> syntl istis ;che Herkunft <220> <22 1> CDS <222> (1) . . (99) <223> P5 <400> 25 tct cct gaa gac gaa aac gca gct c Lg Ser Pro Gl u Asp Glu Asn Ala Ala Leu 1 5 aaa caa aag aac gcg gca ctg aaa gaa Lys GJ n Lys Asn Ala A 1 a Leu Lys Glu 20 2 5 ggc Gl y <210> 26 <211> 3 3 <212> PRT <2 13> synthetische Herkunf t. <400> 26 Ser Pro Glu Asp Glu Asn Ala Ala Leu 1 5 Lys Gin L.ys Asn Ala Ala Leu Lys Glu 20 25 Gly gaa gag aaa att gca caa ctg 48 Glu Glu Lys Ile Ala Gin Leu 10 15 gaa ata caa gca ctg gaa tat 96 Glu Ile Gin Ala Leu Glu Tyr 3 0 99
Lys Gin Lys Ile Gin Ala Leu IC 15
Glu Asn Ala Ala Leu Glu Tyr 30
Glu Glu Lys Ile Ala Gin Leu 10 15
Glu Tie Gin Ala Leu Glu Tyr 30 < 21 0 > 27 <211> 99 <21 2> DNA < 21 3 > synthetische Herkunft <220 > <2 21 > CDS <222> (1) - - (99) < 2 2 3 > P6 48 34 <4 0 0 > agc ccg Ser Pro 1 27 gaa Glu gat Asp a a 3. Lys 5 aac Asn gcc Ala gct Ala ctg Leu aaa Lys 10 gag Glu gaa Glu atc Ile cag Gin gcg Ala 15 ctq Leu gaa Glu gaa Glu gaa Glu aac Asn 2 0 cag Gin gcr Ala ctg Leu gaa Glu gag Glu 25 aaa Lys atc Ile gca Ala cag Gin ctg Leu 30 aaa Lys Lat Tyr 96 99 ggt
Gly <210> 28 <211> 33
< 212 > PRT <213> synthetische Herkunft <40C> 28
Ser Pro Glu Asp Lys Asn Ala Ala Leu Lys Glu Glu Ile Gin Ala Leu 15 10 15
Glu Glu Glu Asn Gin Ala Leu Glu Glu Lys Ile Ala Gin Leu Lys Tyr 20 25 30
Gly <210> 29 <211> 99
<21 2> DNA <21 3> synthetische Herkunft <22Q>
<2 21> CDS < 2 2 2 > (1)..(99) < 2 2 3 > P7 <400 > 29 Lee ccg gag gat. gag ar.c cag gcg ctg gaa gaa aag aac gcc cag ctq Ser 1 Pro Glu Asp Glu 5 Ile Gin Ala Leu Glu 10 Glu Lys Asn Ala Gin 15 Leu aag cag gaa atr. gcg gca ctg gaa gag aag aac cag gcc ctg aag Lac Lys Gin Glu I le 20 Ala Ala Leu Glu Glu 25 Lys Asn Gin Ala Leu 30 Lys Tyr 48 96 99 ggt
Gly <210> 30 <211> 33
<212> PRT <213> synthetische Herkunft <4 00> 30
Ser Pro Glu Asp Glu Ile Gin Ala Leu Glu Glu Lys Asn Ala Gin Leu 1 5 10 15
Lys Gin Glu Ile Ala Ala Leu Glu Glu Lys Asn Gin Ala Leu Lvs Tyr 20 25 30
Gly 35 <210> 31 <211> 39
<212> DNA <213> synthetische Herkunft <220> <221> CD3 <222> (1)..(99) <223> P8 <4C 0 > 31 tcc ccg gaa gac aaa atc gen cag ctg aaa gaa gaa aac cag cag ctg 48 Ser 1 Pro Glu Asp Lys 5 Ile Ala Gin Leu Lys 10 Glu Glu Asn Gin Gin 15 Leu gaa caa aag att cag gcc ctg aag gag gaa aac gca get ctg gaa Lac 96 Glu Gin ;.ys Ile 20 Gl n Ala Leu T.ys Glu 25 Glu Asn Ala Ala Leu 30 Gl u Tyr ggc 99
Gly <210> 32 <211> 33
<212> PRT <213> synthetische Herkunft <4C0> 32
Ser 1 Pr o Glu Asp Lys 5 Tie Ala Gin Leu Lys 10 Glu Glu Asn Gin Gin 15 Leu Glu Gl n Lys Tie 20 Gin Ala Leu Lys Glu 25 Glu Asn Ala Ala Leu 30 Glu Tyr
Gly <210> 33 <211> 192
<212> DNA <213> synthetische Herkunft <22C> <221> CDS <222> (1)..(192) <223> Dimtetra Al <40C> 33 atg Met 1 aaa Lys cag Gin ctg Leu gaa Glu 5 aaa Lys gaa Gl u ctg Leu caa Gin gca Ai a 10 atc T le gaa Glu aaa Lys cag Gl n ctg I eu 15 gca Ala 48 caa Gl n ctg Leu caa Gl n tgg l'rp 20* aag Lys get Ala caa Gin get Ala ege Arg 25 aag Lys aaa Lys aag Lys ctg Leu gca Ala 3 0 cag Gin tcc Ser 96 ggc Gly gaa G.Lu tac Tyr 35 r.tn Phe acc Thr eng Leu cac H.is Q L.C 71 e 4C egt Arg ggc Gly egt Arg gag Gl u egt Arg 4 5 ttc Phe gag Glu atq Met 144 ttc Phe ege Arg gaa Glu ctg Leu aat Asn gaa Gl u gcc Ala ctg Leu gaa G ·. u ctg I.eu aaa -ys gat Asp get Al a caa Gin gca Ala ggt Gly 192 50 55 60 36 <2 1 0> 34 <2ll> 64
<212> PRT <213> synthetische Herkunft <4 0 0> 34
Met 1 Ly s Gin Leu Glu 5 T ys Glu Leu Gin Ala 10 Ile Glu Lys Gin Leu 15 Ala Gin Leu Gl n Trp 20 Lys Ala Gin Ala Arg 25 Lys Lys Lys Leu Ala 30 Gin Ser Gly Glu Tyr 35 Phe Thr Leu His I le 40 Arg Gly Arg Glu Arg 45 Phe Glu Met Phe Arg 50 Glu Leu Asn G1 u Ala 5 5 Leu Glu Leu Lys ASp 60 Ala Gin Ala Gly <210> 35 <211> 198
<212> DNA <213> synthetische Herkunft <22C>
< 2 2 1 > CDS <27 2> (1)..(198)
<223> Dimtetra-Al GSGS <400> 35 atg Met 1 3 g cl Lys cag Gin ctg Leu gaa Glu 5 aaa Lys gaa Glu ctg Leu caa Gin gca Al a 10 atc Tie gaa Glu aaa Lys cag Gin ctg Leu 15 gca Ala 48 caa Gin ctg Leu caa Gin tgg Trp 20 aag Lys get Ala caa Gin get Ala cgc Arg 25 aag Lys aaa Lys aag Lys ctg Leu gca Ala 30 cag Gin tcc Ser 96 ggg Gly tcc Ser ggc Gly 35 gaa Glu tac Tyr LLL Phe acc Thr ctg Leu 40 cac Hls atc Ile egt Arg ggc Gly egt Arg 45 gag Glu cqt Arg ttc Phe 144 gag Glu atg Met 50 t. tc Phe cgc Arg gaa Glu ctg Leu aat Asn 55 gaa Glu gcc Ala ctg Leu gaa Glu ctg Leu 50 aaa Lys gat Asp get Ala caa Gl n 1 92 gca Al a 65 ggt Gly 198 <210> <211> <212> <2 1 3> 36 66 PRT syntheti; sehe Herkunft < 4 C 0 > 3 6 Met 1 Lys Gl n Leu Glu 5 Lys Glu Leu Gin Ala 1 0 Tie Glu Lys Gin Leu 15 Al a Gin Leu Gl n Trp 20 Lys Ala Gin A 1 a Arg 2 5 Lys Lys Lys Leu Ala 30 Gin Ser Gl y Ser Gly Glu Tyr Phe Thr Leu H: s Tie Arg Gl V Arg Glu Arg Phe 35 40 45 37 37 Glu
Glu Met Phe Arg Glu 50
Leu Asn Glu Ala Leu 55
Leu Lys Asp Ala Gin 60
Ala G1 y 6 5 <210> 37 <211> 234
<212> DNA <213> synthetische Herkunft <220> <221> CDS <222> (1)..(234)
<223> DimLeLra-A <400> 37 atg Met 1 S cD <3 Lys cag Gin ctg Leu gaa Glu 5 aaa Lys gag Glu ct.g Leu aaa Lys cag Gin 10 tza Leu gaa Glu aaa Lys gaa Glu ctg Leu 15 caa Gl n 48 gca Ala att Ile gaa Glu ä3ä Lys 20 cag Gin ctg Leu gca Ala cag Gl n ctg Leu 2 5 caa Gin tgg Trp aaa Lys gca Ala cag Gin 30 gca Ala egt Arg 96 äää Lys öäd Lys aaa Lys 35 ctg Leu gcc Ala cag Gin ctg Leu aaa Lys 40 aaa Lys aaa Lys ett Leu cag Gin gcc Ala 45 tcc Ser ggc Gly gaa Glu 1 44 tac Tyr ttt Phe 50 acc Ihr ctg Leu cac His at.c Ile egt Arg 55 ggc Gly egt Arg gag Glu egt Arg ttc Phe 60 gag Glu atg Met tue Phe ege Arg 192 gaa Glu 6 5 ctg Leu aat Asn gaa Glu gcc Ala ctg Leu 70 gaa Glu ctg Leu aaa Lys ga t Asp get Ala 75 caa Gl n gca Al a ggt Gly 234 <210> <211> <212> <2 13 > 38 78 PRT syn the Li sehe Herkunft <4 00 > 38 Met 1 Lys Gin Leu Glu 5 Lys Glu Leu JYS Gin 1C Leu Glu Lys Glu Leu 15 Gin Al a Ile Glu Lys 20 Gl n Leu Ala Gl n Leu 2 5 Gl n Trp Lys A1 a Gl n 30 Ala Arg Lys lys Lys 35 Leu Ala Gin Leu Lys 40 -ys Lys Leu Gin Ala 45 Ser Gly Glu Tyr Phe 5C Thr Leu Hi s Tie Arg 55 Gly Arg Glu Arg Phe 60 Glu MeL Phe Arg Gl u 65 Leu Asn Glu Ala Leu 7C Glu Leu Lys Asp Ala 75 Gin Ala Gly < 210 > 39
<211> 21C
<212> DNA <213> synthetische Herkunft <220>
<2 21> CDS <222> (1)..(210) 38 • * · · · • · * · 38 • * · · · • · * · <223> Dimtetra-B <400> 39 atg Met 1 gat Asp att Ile gaa Glu cag Gin 5 gaa Glu ctg Leu gaa Glu ege Arg gca Ala io cl cl c3 Lys gca Ala agc Ser att 1 le egt Arg 15 egt Arg 48 ctg Leu gaa Glu cag Gin gaa Glu 20 gtt Val aat Asn caa Gin gaa Glu egt Arg 25 agc Ser egt Arg atg Met gca Al a tat Tyr 3 Ö ctg heu caa Gin 96 acc Thr ctg Leu ctg Leu 35 gca Ala aaa Lys tcc Ser ggc Gly gaa Glu 40 tac Tyr ttt Phe acc Thr ctg Leu cac His 45 atc Ile egt Arg ggc Gly 14 4 egt Arg gag Glu 50 egt Arg ttc Phe gag Glu atg Met ttc Phe 55 ege Arg gaa Glu ctg Leu aat Asn gaa Glu 60 gcc Aia ctg T.eu gaa Glu ctg Leu 192 aaa Lys 65 gat Asp get Ala caa Gin gca Ala ggt Gly 70 210 <210> 40 <211> 70
<212> PRT <213> synthetische Herkunft <4 00> 4 0
Met 1 Asp Ile Glu Gin 5 Glu Leu Glu Arg Ala 10 Lys Ala Ser Ile Arg 1 5 Arg Leu Glu Gin Glu 20 Val Asn Gl n Gl u Arg 25 Ser Arg Met Ala Tyr 30 Leu Gin Thr Leu Leu 3 5 Ala Lys Ser Gly Gl u 40 Tyr Phe Thr Leu His 45 Ile Arg Gly Arg Glu 5 0 Arg Phe Gl u Met Phe 55 Arg Glu Leu Asn Glu 6 C Ala Leu Glu Leu
Lvs Asp Ala Gin Ala Gly 60 7C <210> 41 <211> 195
<212> DNA <213> synthetische Herkunft <220> <221> CDS <222> (1)..(195) <223> Tetradim-Al < 4 0 0 > 41 atg gaa tac ttt acc ctg cac atc cg L ggc cg t gag egt ttc gag atg Met 1 Gl u Tyr Phe Thr 5 Leu His Ile Arg Gly 10 Arg Gl u Arg Phe Glu 15 Met ttc ege gaa ctg aat gaa gcc ctg cl ctg aaa gat get caa gca gqt Phe Arg Glu Leu 20 Asn Glu Ala Leu Glu 25 Leu Lys Asp Ala Gin 3 0 Ala Glv tcc ggc atg cag ctg gaa aaa g ää ctg caa gca atc gaa aaa cag Ser Gly Met 3 5 Lys Gin Leu Glu Lys 40 Glu Leu Gin Ala Ile 45 Glu 1 ys Gin 48 96 144 192 39 192 39 ctg gca Leu Ala 50 Caä Gin cLg Leu caa Gin tgg Trp aag Lys 55 get Al a caa Gl n get Ala cgc Arg aag Lvs 60 3 c) 3 Lys aag Lys ctg Leu gca Ala cag Gin 65 <210> <211> <212> < 213 > 42 65 FRT synrhetische Herkunft <400> 42 Met Glu 1 Tyr Phe Thr 5 Leu His Ile Arg Gly 10 Arg Glu Arg Phe Glu 15 Met Phe Arg Glu Leu 20 Asn Glu Ala Leu Glu 25 Leu Lys Asp Ala Gin 30 Ala Gly Ser Gly Met 35 Lys Gin Leu Glu Lys 40 Glu Leu Gin Ala Ile 45 Glu Lys Gin Leu Ala 50 Gin Leu Gin Trp Lys 55 Ala Gin Ala Arg Lys 60 Lys Lys Leu Ala Gin 6 5 <21 0> <21 1 > <21 2> <21 3> 43 237 DNA syntheris che Herkunft <220> <221> <222> <223> CDS (1) . . (237 Tetr adirr- ) A < 4 0 0 > atg gaa Met Glu 1 43 tac Tyr ILL Phe acc Thr 5 c.tg Leu cac. His acc Ile egt Arg ggc Gly 10 egr Arg g=g Glu egt Arg ttc Phe gag Gl u 1 5 atg Met ttc cgc Phe Arg gaa Glu ctg Leu 20 aat Asn gaa Glu qcc Ala erg Leu gaa Glu 25 ctg Leu ciclcä. Lys gat Asp get Ala caa Gin 30 gca Ala ggt Gly Lee ggc Ser Gly atg Met 35 aaa Lys cag Gin ctg Leu gaa Glu aaa Lys 40 gag Glu erg Leu aaa Lys cag Gin tta Leu 45 gaa Glu aaa Lys gaa Glu ctg caa Leu Gin 5C gca Ala att I _e gaa Glu äää Lys cag Gin 55 erg Leu gca Ala cag C-ln ctq Leu caa Gin 60 tgg Trp äää Lys gca Ala cag Gin qca egt Ala Arg clcLH Ly s aaa Lys aaa Lys ctg Leu gcc Ala cag Gl n ctg Leu aaa Lys aaa Lys aaa T.ys ett Leu cag Gin gcc Al a 65 70 75 195 48 96 144 192 23 7 <21G> 44 <211> 79
<212> PRT <213> synthetische Herkunft 40 <400> 44 Met Glu Tyr 1 Phe Thr 5 Leu His Ile Arg Gly 10 Arg Glu Arg Phe Glu 15 Met Phe Arg Glu Leu 20 Asn Glu Ala Leu Glu 25 Leu Lys Asp Ala Gin 30 Ala Gly Ser Gly Met 35 Lys Gin Leu Glu Lys 40 Glu Leu Lys Gin Leu 4 5 Glu Lys Glu Leu Gin Ala 5 0 Ile Glu Lys Gin 55 Leu Al a Gl n Leu Gin 60 Trp Lys Ala Gin Ala Arg Lys 65 Lys Lys Leu 70 Ala Gin Leu Lys Lys 75 Lys Leu Gin Ala <210> 45 <211> 210 <212> DNA <213> synthetische Herkunft <220> <221> CDS <222> (1)..(210} <223> Tetradiir. B < 4 0 0 > 4 5 atg gaa tac Met Glu Tyr 1 ttt Phe acc Thr 5 ctg Leu cac His atc Ile egt Arg ggc Gly 10 egt Arg gag Glu egt Arg ttc Phe gag Glu 15 atg Met ttc cqc gaa Phe Arg Glu erg Leu 20 aat Asn gaa Glu gcc Ala ctg Leu gaa Glu 25 ctg Leu aaa Lys gat Asp gct. Al a caa Gl n 30 gca Ala ggt Gly icc ggc gat Ser Gly Asp 35 att Tie gaa Glu cag Gin gaa Glu ctg Leu 40 gaa Glu ege Arg gca A_a aaa Lys gca Ala 45 agc Ser att Ile egt Arg egt ctg gaa Arg Leu Glu 50 cag Gin gaa Glu gtr Val aat Asn 55 Caä Gin gaa Glu cqt Arg agc Ser egt Arg 60 atg Met gca Ala tat Tyr ctg Leu caa acc ctg Gin Thr Leu 6 5 ctg Leu gca Ala aaa Lys 70 <210> 46 < 211> 70 <212> PRT <213> syntheti sehe Herkunf1 < 4 0 0 > 46 Met Glu Tyr 1 Phe Thr 5 Leu His 1 le Arg Gly 10 Arg Glu Arg Phe Glu 15 Met Phe Arg Glu Leu 20 Asn G . u Ala Leu Glu 25 Leu Lys Asp Ala Gin 30 Ala Gly Ser Gly Asp 3 5 Ile Glu G" n Glu Leu 40 Glu Arg Ala Lys Ala 45 Ser- Ile Arg Arg Leu Glu 5C Gin Glu Val Asn 55 Gin Glu Arg Ser Arg 60 Met Ala Tyr Leu 48 96 144 192 210 41 • · • · # * • *
Gin Thr Leu Leu Ala Lys 65 70 <210> 47 <211> 384
<212> DNA <213> synthetische Herkunft <220 > <221> CDS <222> (1)..(384) <223> Al-Tshak gca atc gaa aaa cag ctg gca 48 A! a 10 Ile Glu lys Glu Leu 15 Ala aag aaa aag ctg gca cag tcc 96 Lys Lys Lys Leu Ala 30 Gin Ser agc ggt ctg egt. ttt gaa acc 144 Ser Gly Leu Arg 45 Phe Glu Thr gat acc ctg ctg ggt aat ccg 1 92 Asp Thr Leu 60 Leu Gly Asn Pro ctg cgc aac gaa Lat ttt ttt 240 Leu Arg 75 Asn Glu Tyr Phe Phe 80 att ctg tat ttt tat cag agc 288 Ile 90 Leu Tyr Phe Tyr Gl n 95 Ser gtt ccg ctg gat gtg ttt agc 336 Val Pro Leu Asp Val 110 Phe Ser gaa aac gcc ttt gaa cgc tat 384 Glu Asn Ala Phe 125 Glu Arg Tyr
Ala 10 TI e Gl u Lys Gin Leu 15 Al a Lys Lys Lys Leu Ala 3 0 Gin Ser Ser Gly Leu Arg 4 5 Phe Glu Thr Asp Thr Leu 60 Leu Gly Asn Pro <400> 47 atg Met 1 aaa Lys cag Gin ctg Leu gaa Glu 5 aaa Lys gaa Glu ctg Leu caa Gin caa Gin ctg Leu caa Gin tgg Trp 20 aag Lys get Ala caa Gin get Ala cgc Arg 2 5 ggc Glv atg xet gaa Glu 35 egt Arg gtt Val gtt Val att I le aat Asn 40 gtg Val cag Gin ctg Leu 50 aaa Lys acc Thr ctg Leu aal Asn cag Gin 5 5 ttc Phe ccg Pro cag Gin 65 aaa Lys egt Arg aat Asn egt Arg tat Tyr 7C Lat Tyr gat Asp ccg Pro gat Asp cgc Arg aat Asn egt Arg ccg Pro 85 agc Ser ttt Phe qa L Asp gcc Ala ggt C-ly ggt. Gly egt Arg ctg Leu 1 00 egt Arg cg L Arg ccg Pro get Val aat Asn 105 gaa Glu gag Glu ctC Ile 115 aaa Lys ttc Phe tat Tyr gaa Glu ctg T.eu 1 20 ggc Gl y <210> <211> <212> <213> 48 128 PRT synthetische Herkunf t <400> 48 Met 1 Lys Gin Leu Glu 5 Lys Glu Leu Gin Gin Leu Gin Trp 20 Lys Ala Gin Ala Arg 25 Gly Met Glu 3 5 Arg Val Val 1 le Asn 40 Va .1 Gin Leu 50 Lys Thr Leu Asn Gin 55 Phe P ro Gin 6 5 Lys Arg Asn Arg Tyr 70 Tyr Asp Pro Leu Arg 75
Asn Glu Tyr Phe Phe 80 42
Asp Arg Asn Arg Pro 85 Ser Phe Asp Gly Gly Arg Leu 100 Arg Arg Pro Val Glu Glu Ile 115 Lys Phe Tyr Glu heu 1 20
Ala Ile 9C Leu Tyr Phe Tyr Gl n 95 Ser Asn 105 Val Pro Leu Asp Val 110 Phe Ser Gly Glu Asn Ala Phe 125 Glu Arg Tyr <210> 49 <211> 426
<212> DNA <213> synthetische Herkunft <220>
<221> COS <222> (1 ) . . (426) <223> A-Tshak <40 0> 49 atg aaa cag ctg gaa 3.0.3. gag ctg Met 1 Lys Gin Leu Glu 5 Lys Glu Leu gca att gaa aaa cag ctg gca cag Ala I le Glu Lys 20 Gin Leu Ala Gl n aaa aaa aaa ctg gcc cag ctg 3 da Lys Lys Lvs 35 Leu Ala Gin Leu Lys 4 C gaa egt gtt gtt atL aat gtg agc Gl u Ara so' val Val Tie Asn Val 55 Ser sas acc ctg aat cag ctc ccg gat Lys 65 Thr Leu Asn Gin Phe 70 Pro Asp egt aat egt tat tat gat ccg erg Arg Asn Arg Tyr Tyr 85 Asp Pro Leu ä 31 egt ccg agc ttt gar gcc att Asn Arg Pro Ser 100 Phe Asp Al a 7 le egt ctg egt egt ccg gtt aat gtt Arg Leu Arg 115 Arg Pro Val Asn val 120 atc aaa t nt- L at gaa ctg ggc gaa 11 e I.ys 13 0 Phe Tyr Glu I.eu Gly 1 35 Glu <21 0> 50 <2 1 1 > 142
<212> PRT <213> synthetische Herkunft < 4 0 0 > 50
Met. Lys Gin heu Glu Lys Glu Leu 1 5 48 96 144 192 240 288 336 .384 aaa cag tta gaa aaa gaa ctg caa Lys Gin Leu Glu Lys Glu Leu Gin 10 15 ctg caa tgg aaa gca cag gca egt. Leu Gin Trp Lys Al a Gin Al a Arg 25 3 0 333 aaa ett cag gcc tcc ggc atg Lys Lys Leu Gin Ala Ser Gly Met 45 ggt. ccg cgL ttt gaa acc cag ctg G ] y Leu Arg Phe Glu Thr Gin Leu 60 acc erg ctg gqt aat ccg cag aaa Thr Leu Leu Gly Asn Pro Gin Lys 75 80 ege aac gaa tat ttt ttt gat ege Arg Asn Glu Tyr Phe Phe Asp Arg 90 9 5 c Lg tat t.tt tat cag agc ggt ggL Leu Tyr Phe Tyr Gin Ser Gl y Gly 105 1 10 ccg ctg gat gtg ttt agc gaa gag Pro Leu Asp Val Phe Sei Glu Glu 1 25 aac gcc ttt gaa ege tat Asn Ala Phe Glu Arg Tyr 140 Lyn Gin Leu Glu Lys Glu ^eu Gin 1 0 15 426 A _L a 1 le Glu Lys 20 Gin Leu Ala Gin Leu 25 Lys Lys Lys 35 Leu Ala Gin Leu Lys 40 Lys Glu Arg 50 Val Val Ile Asn Val 55 Ser Gly Lys 65 Thr Leu Asn Gin Phe 70 Pro Asp Thr Arg Asn Arg Tyr Tyr 85 Asp Pro Leu Arg Asn Arg Pro Ser 100 Phe Asp Ala Ile Leu 105 Arg Leu Arg 115 Arg Pro Val Asn Val 120 Pro ILe Lvs 130 Phe Tyr Glu Leu Gly 1 35 Glu Asn <210> <211 > <212> <213> 51 402 DNA synthetische Herkunft <220> <2 21> <222> <223> CDS U) . . (402) B-'i'shak <400> atg g a t Met Asp 1 51 act Ile gaa Glu cag C-ln 5 gaa Glu ctg Leu gaa Glu ege Arg erg Leu gaa Glu cag Gin gaa Glu 20 gtt Val aat Asn caa Gin gaa Glu egt Arg 25 acc Thr ctg Leu ctg Leu 3 5 gca Al a aaa T.ys tcc Ser ggc Gly atg Met 40 gaa Glu ggt. Gly ctg Leu 50 egt Arg ttt Phe gaa Glu acc Thr cag Gin 55 ctg ^eu aaa Lys acc Thr 6.5 ctg Leu ctg Leu ggt Gly aat Asn ccg Pro 70 cag Gin aaa Lys egt Arg ege Arg aac Asn gaa Glu tat Tyr ttt Phe 85 ttt Phe gat Asp ege Arg aat Asn ctg Leu tat Tyr ttt Phe tat Tyr ICO cag Gin agc Ser ggt Gly ggt Gly egt Arg 105 ccg Pro ctg Leu gat Asp 1 15 gtg Val ttt Phe agc Ser gaa Glu gag Glu 120 atc Ile *·«« • « • # « » • · * » • · • · * * • · • · • » «··* ♦ · * • « « t t • · • · · • • · * ♦ ♦ • m ♦ · · • · « * * • ♦ » • « * • • · ♦ • • · 43 Gin Trp Lys Ala Gin 3C Ala Arg Lys Leu Gin Ala 45 Ser Gly Met Leu Arg Phe 60 Glu Ihr Gin Leu Leu Leu 75 Gly Asn Pro Gin Lys 80 Asn 90 Glu Tyr Phe Phe Asp 95 Arg Tyr Phe Tyr Gin Ser 110 Gly Gly Leu Asp Val Phe 125 Ser Glu Glu Ala Phe Glu 140 Arg Tyr gca cl cl S gca agc att egt egt 48 Ala 10 Lys Ala Ser Ile Arg 15 Arg agc egt atg gca tat ctg caa 96 Ser Arg Met Ala Tyr 30 Leu Gin egt gtt gtt att. aat gtg agc 144 Arg Val Val Τ', e 4 5 Asn Val Ser acc ctg aat cag ttc ccg gat 192 Thr Leu Asn 60 Gin Phe Pro Asp aat egt tat tat gat ccg ctg 24C Asn Arg Tyr Tyr Asp Pro Leu
8C egt ccg agc ttt gat gcc at L Arg 90 Pro Ser Phe Asp A_a 9 5 Ile ctg egt Ca L ccg 91 L aat gtt Leu Arg Arg Pro Val 110 Asn Val 33a ttt tat gaa ctg ggc gaa Lys Phe Tyr Giu 125 Leu Gly Glu 384 402 44 aac gcc ttt gaa cgc tat Asn Ala Phe Glu Arg Tyr 130 <210> 52 <211> 134
<212> PRT <213> synthetische Herkunft <4C0> 52
Met Asp 1 Ile Glu Gin 5 Glu Leu Glu Arg Ala 1 0 Lys Ala Ser Ile Arg 15 Arg Leu Glu Gin Glu 20 Val Asn Gin Gl u Arg 25 Ser Arg Met Ala Tyr 30 Leu Gin Thr Leu Leu 35 Ala Lys Ser Gly Met 40 Glu Arg Val Val Ile 45 Asn Val Ser G1y Leu 50 Arg Phe Glu Thr Gin 55 Leu Lys Thr Leu Asn 60 Gl n Phe Pro Asp Thr Leu 65 Leu Gly Asn Pro 70 Gin Lys Arg Asn Arg 75 Tyr Tyr Asp Pro Leu 80 Arg Asn Glu Tyr- Phe 85 Phe Asp Arg Asn Arg 90 Pro Ser- Phe Asp A_L ci 95 Ile Leu Tyr Phe Tyr 100 C-ln Ser Gly Gly Arg 105 Leu Arg Arg Pro Val 110 Asn Val Pro Leu Asp 115 Val Phe Ser- Glu Glu 120 Ile Lys Phe Tyr Glu 125 Leu Gly Glu Asn Ala 130 Phe Glu Arg Tyr <210> <21 1 > <212> <2 13 > 53 384 DMA svntheci: sehe Herkunft <220> <221 > <222> <223> CDS (1).·(384) Tshak-Al <4 0C > atg gaa Met Glu 1 53 egt Arg gcL Val gtt Val 5 att Ile aat Asn gtg Val agc Ser ggt Gly 1 0 ctg Leu egt Arg ttt Phe gaa Glu acc Thr 15 cag Gin ctg aaa Leu Lys acc Thr ctg Leu 20 aat Asn cag Gin ttc Phe ccg Pro gat Asp 25 acc Thr ctg Leu ctg Leu ggt Gly aat Asn 3C ccg Pro cag Gin aaa egt Lys Arg aa t Asn 35 egt Arg Lat Tyr tat Tyr gat Asp ccg Pro 40 ctg Leu ege Arg aac Asn g cj a Glu t a t Tyr 45 ttt Phe ttt Phe gat Asp cgc aal Arg Asn 50 egt Arg ccg Pro agc .Ser ttt Phe gat Asp 5 5 gcc Ala att Ile ctg Leu tat Tyr ttt Phe 60 IgL Tyr cag Gin agc Ser ggt Gly ggt egt Gly Arg ctg Leu egt Arg egt Arg ccg Pro gt t Val aac Asn gtt Val ccg Pro ctg jeu gat Asp gtg Val ttt Phe agc Ser gaa Gl u 48 96 144 192 240 45 f« ···· • « · 65 70 75 80 gag atc aaa ttt tat Qäa ctg ggc gaa ci 5-C gCC ttt gaa cgc tat tcc 288 Glu I le Lvs Phe Tyr 85 Glu Leu Gly Glu Asn 90 A_a Phe Glu Arg Tyr 95 Ser ggc atg aaa cag ctg gaa 333 gaa ctg caa gca atc gaa aaa cag ctg 336 Gly Met 3ys Gin 100 Leu Glu LVS Glu Leu 105 Gin A': a Tie Glu Lys 110 Gin Leu gca caa ctg caa tgg aag gct caa gct cgc aag aaa aag ctg gca cag .384 Ala Gin Leu 115 Gin Trp Lys Ala Gin 120 Ala Arq Lys Lys Lys 125 Leu Al a Gl n <210> 54
<211> 128 <212> PKT <213> synthetische Herkunft <400> 54
Met 1 Glu Arg Val Val 5 Ile Asn Val Ser Gly 10 Leu Arg Phe Glu Thr 15 Gin Leu Lys Thr Leu 20 Asn Gin Phe Pro Asp 25 Thr Leu Leu Gly Asn 30 Pro Gin Lys Arg Asn 35 Arg Tyr Tyr Asp Pro 40 Leu Arg Asn Glu Tyr 45 Phe Phe Asp Arq Asn 5C Arg Pro Ser Phe Asp 55 Air) Ile Leu Tyr Phe 60 Tyr Gin Ser Gly Gly 6 5 Arg Leu Arg Arg Pro 70 Val Asn Val Pro Leu 7 5 Asp val Phe Ser G1 u 80 Gl u Tie Lys Phe Tyr 85 Glu Leu Gly Glu Asn 90 Ala Phe Glu Arg Tyr 95 Ser Gly Met Lys Gin ICO Leu Glu Lys Glu Leu 105 Gin Ala I le Glu Lys 110 Gin Leu Ala Gin Leu 115 Gin Trp Lys Ala Gin 1 2 0 Ala Arg Lys Lys Lys 1 25 Leu Ala Gin < 210 > d 5 <211> 426
<212> DNA <213> synthetische Herkunft <220> <221> COS <222> (1)..(426)
<223> Tshak-A < 4 0 0 > 5 5 atg Met 1 gaa Glu egt Arg gtt Val g L L Val 5 aat Ile a a t Asn gtg Val agc Ser ggt Gly 1 0 ctg Leu egt Arg ut.t Phe gaa Gl u acc Th r 15 cag Gl n ctg Leu 5 L y s acc Thr ctg Leu 20 aat Asn cag Gin ttc Phe ccg Pro gat Asp 25 acc Thr ctg Leu ctg Leu ggt Gly aat Asn 30 ccg Pro cag Gin aaa Lys cgL Arg aat Asn 3 5 egt Arg tat Tyr tat Tyr gat Asp ccg Pro 40 ctg Leu cgc Arg aac Asn gaa Glu tat Tyr 45 ttt Phe ttt Phe gat Asp 48 96 144 46 cgc aat Arg Asn 50 egt Arg ccg Pro agc Ser t.rt Phe gat. Asp 5 5 gcc A1 a ci Γ. L Ile Ctg Leu tat Tyr ttr Phe 60 Lat Tyr cag Gin agc Ser ggt Gly 192 ggt egt Gly Arg 65 ctg Leu egt Arg egr Arg ccg Pro 70 gtt Val aat Asn gtr Val ccg Pro ctg Leu 75 gat Asp gtg Val ttt Phe agc Ser gaa Gl u 8C 240 gag atc Glu Ile aaa Lys r. 11. Phe t.at Tyr 85 gaa Glu ctg Leu ggc Gly gaa G'.u aac Asn 90 gcc Ala ttr Phe gaa Glu ege Arg tat Tyr 95 tcc Ser 288 ggc atg Gly Mer aaa Lys cag Gl n 100 ctg Leu gaa Glu aaa Lys gag Glu ctg Leu 105 aaa Lys cag Gin tta Leu gaa Glu clSol Lvs lio gaa Glu ctg Leu 336 caa gca Gin Ala atL Ile 1 1 5 gaa Glu aaa Lys C aC| Gin ctg Leu gca Ala 120 cag Gin erg Leu caa Gl n tgg Trp aaa Lys 125 gca Ala cag Gin gca Ala 384 egr aaa Arg Lys 130 aaa Lys aaa Lys ctg Leu gcc Ala cag Gin 135 ctg Leu aaa Lys aaa Lys aaa Lys ett Leu 140 cag Gin gcc Ala 426 <210> <211> <212> <213> 56 112 PRT syntheti: sehe Herkunft <4C0> 56 Met Glu 1 Arg Val Va 1 5 ile Asn V a i Ser Gly 10 Leu Arg Phe Gl u Thr 15 Gin Leu [ys Thr Leu 20 Asn Gin Phe Pro Asp 25 Thr Leu Lei] Gly Asn 30 Pro Gin Lys Arg Asn 35 Arg Tyr Tyr Asp Pro 40 Leu Arg Asn Glu Tyr 45 Phe Phe Asp Arg Asn 50 Arg Pro Ser Phe Asp 55 A^a Ile Leu Tyr Phe 60 Tyr Gin Ser Gly Gly .Arg 65 Leu Arg Arg Pro 10 Val Asn Va 1 Pro Leu 75 Asp Val Phe Ser Glu 8C Glu Ile T ys Phe Tyr 85 Glu Leu Gl y Glu Asn 90 A : a Phe Glu Arg Tyr 95 Ser Gly Mer Lys Gin 100 Leu Glu lys G'.u Leu 1 05 Lys Gl n Ieu Glu Lys 110 Glu Leu Gin Ala Ile 115 Glu Lys Gin Leu Aid 120 Gin Leu Gin Trp Lys 1 25 Ala C-ln Ala Arg Lys 1 3 C Lys Lys Leu Al a Gin 135 jGU Lys Lvs Lys Leu i /;o Gin Ala <210> <211> <212> <213> 51 39 9 DNA synl.hei i sehe Herkunf <:220> <221> <222> CD3 (1 ) . . . (399) 47 • » • « • · * < 2 2 3 > Tshak -B <400> atg gaa Met G.l li 1 57 egt Arg gtt Val gtt Val 5 at.t Ile aat Asn gtg Val agc Ser ctg Leu aaa Lys acc Thr ctg Leu 20 aat Asn caq Gin ttc Phe ccg Pro gat Asp 25 aaa Lys egt Arg aat Asn 35 egt Arg tat Tyr tat Tyr gat Asp ccg Pro 40 ctg Leu cgc Arg aat Asn 50 egt Arg ccg Pro agc Ser ttt Phe gat Asp 55 gcc Ala att I le ggt Gly 65 egt Arg ctg Leu egt Arg egt Arg ccg Pro 70 gtt Val aat Asn gut Val gag Glu atc Ile aaa Lys ttt Phe tat Tyr 85 gaa Glu ctg Leu ggc Gly gaa Glu ggc Gly gaL Asp act Ile gaa Glu ICO cag Gin gaa Glu ctg Leu gaa Glu cgc Arg 1 05 ctg Leu gaa Glu cag Gin 115 gaa Glu gtt Val aat Asn caa Gin gaa Glu 120 egt Arg acc Thr ctg Leu 130 ctg Leu gca Ala aaa Lys <210> < 211 > <21 2> <21 3 > 5 8 133 PRT synth letlsche Herkunft <40C > 58 Met 1 Glu Arg Val Val 5 Ile Asn Val Ser Leu Lys Thr Leu 20 Asn Gin Phe Pro Asp 25 Lys Arg Asn 35 Arg Tyr Tyr Asp Pro 40 Leu Arg Asn 50 Arg Pro Ser Phe Asp 55 Ala Ile Glv 65* Arg Leu Arg Arg Pro 70 Val Asn Val Glu Ile Lys Phe Tyr 85 Glu Leu Gly Glu Gly Asp Ile Glu 100 Gin Glu Leu Glu Arg 1C5 ggt ctg egt ttt gaa acc cag 48 Gly io“ Leu Arg Phe Glu Thr 15 Gin acc ctg ctg ggt aat ccg cag 96 Thr Leu Leu Gl y Asn 30 Pro Gin cgc aac gaa tat ttt ttt gat 144 Arg Asn Glu Tyr 45 Phe Phe Asp ctg tat ttt tat cag agc. ggt 192 Leu Tyr Phe 60 Tyr Gin Ser Gly ccg ctg gat gtg ttt agc gaa 240 Pro Leu 75 Asp Val Phe Ser Glu 80 aac gcc ttt gaa cgc tat tcc 288 k£ > ο ω D Ala Phe Glu Arg Tyr 95 Ser gca aaa gca agc att egt egt 336 Ala Lys Ala Ser Ile 110 Arg Arg agc egt atg gca tat ctg caa 384 Se r Arg Met Ala 125 Tyr Leu Gin 399
Gly 1 0 Leu Arg Phe Glu Thr 15 Gin Thr Leu Leu Gl y Asn 30 Pro Gin Arg Asn Glu Tyr 4 5 Phe Phe Asp Leu Tyr Phe 60 Tyr Gin Ser Gly Pro Leu 75 Asp Val Phe Ser- Glu 80 Asn 90 Ala Phe Glu Arg Tyr 95 Ser Ala Lys Ala Ser Ile 110 Arg Arg 48 • * • η * * t · * *
41 I
Leu Glu Gin 115 Glu Val Asn Gin Glu Arg Ser Arg Met 120 Ala Tyr Leu Gin 125 Thr Leu 130 Leu Ala Lys <210 > 59 <211> 183
<212 > DNA <213> synthetische Herkunft < 2 2 Ο > <221> CDS <222> (1),.(183) <223> foldon-Al <40C > 59 atg Met 1 ggt Gly tat Tyr att Ile cct Pro 5 gaa Glu gc.a Ala cca Pro egt Arg gat Asp 10 ggc Gly caa Gin gca Ala ~ O.C Tyr gtt Val 15 egt. Arg 48 aaa Lys gac Asp ggt Gly gaa Glu 20 Lgg Trp gtc Val ctg Leu ctg Leu tcc Ser 25 act Thr ttc Phe ctg Leu tcc Ser ggc Gly 30 atg Met aaa Lys 96 cag Gin ctg Leu gaa Glu 35 aaa Lys gaa Glu ctg Leu caa Gin gca Ala 40 ac:c Tie gaa Glu öl 3 3 Lvs cag Gin ctg Leu 45 gca Ala caa Gin ctg Leu 144 caa Gin tgg Trp 50 aag Lys get Ala caa Gin get Ala ege Arg 5 5 aag Lys aaa Lys aag Lys ctg Leu gca Ala 60 cag Gin 183
<210> 60 < 211> 61 <212> PRT <213> synthetische Herkunft <400> 60
Mel 1 Gly Tyr Ile Pro 5 Glu Ala Pro Arg Asp 10 Gl y Gin Ala Tyr Val 15 Arg Lys Asp Gly Glu 20 Trp Val Leu Leu Ser 25 Thr Phe Leu Ser Gly 30 Met Lys Gin Leu Gl u 3 5 Lys Glu Leu Gin Ala 40 1 le Glu Lys Gin Leu 45 Ala Gin Leu Gin Trp 50 Lys Al a Gl n Ala Arg 55 Lys Lys Lys Leu Ala 60 Gin < 210 > 61 <211> 225
<212> DNA <213> synthetische Herkunft <220> <221> CDS <222> (1)..(225)
<223> Foldon A <40 0> 61 atg ggt tat att cct gaa gca cca egt gat ggc caa gca tac gtt egt
Met G]v Tyr ile Pro Glu Ala Pro Arg Asp Glv Gin Ala Tyr Val Arg 1 5 10 15 48 49 aaa gac Lys Asp ggt Gly gaa Glu 20 Lgg Trp gtc Val ctg Leu ctg Leu tcc Ser 25 dCt Thr tcc Phe ctg Leu tcc Ser ggc Gly 30 atg Met aaa Lys 95 cag ctg Gin Leu gaa Glu 35 aaa Lys gag Glu ctg Leu aaa Lys cag Gl n 40 ita Leu gaa GLu aaa Lys gaa Glu ctg Leu 45 Ccicl Gin gca Ala att Ile 144 gaa aaa Glu Lys 50 cag Gin ctg Leu gca Ala cag Gl n ctg Leu 55 caa Gin tgg Irp aaa Lys gca Ala cag Gin 60 gca Ala cg t Arg aaa Lys aaa Lys 192 aaa ctg Lys Leu 65 gcc Ala cag Gin ctg Leu aaa Lys 70 aaa Lys aaa Lys ett Leu cag Gin gcc Ala 75 225 <21 0> <21 1 > <21 7> <21 3> 62 75 PKT synthetische Herkunft < 4 0 0 > 62 MeL Gly 1 Tyr T le Pro 5 Glu Ala Pro Arg Asp 1.0 Gly Gin Ala Tyr Val 15 Arg Lys Asp Gly Glu 20 Trp Val Leu Leu Ser 25 Thr Phe Leu Ser Gly 30 Yet Lys Gin Leu Glu 35 Lys Glu Leu Lys Gin 40 Leu Glu Lys Glu Leu 45 Gin Ala Ile Glu Lys 50 Gin Leu A1 a Gin Leu 5 5 Gl n Trp Lys Ala Gin 60 Ala Arg Lys Lys Lvs Leu 65 Ala Gin Leu Lvs 7 0 Lys Lys Leu Gin Ala 75 <210> <211> <212> < 213 > 6 3 198 DNA synchet1: sehe Herkunft. <220> <221 > <222> < 2 2 3 > CDS (1)-·(198) Foldon-B <4 00> atg ggt. Me t Gly 1 63 tat Tyr aut Ile ccz Pro 5 gaa Glu gca Ala cca Pro egt Arg gat Asp 1 0 qgc Gly caa C-ln gca Ala tac Tyr gtt Val 15 egt Arg 4 8 aaa gac Lys Asp ggt. Gly gaa Glu 20 tgg Trp gtc Va 1 ctg Leu ctg Leu Lee Ser 2 5 dCt Thr 1.1. o Phe c Lg Leu tcc Ser ggc Gly 30 gat. Asp att Tie 96 gaa cag Glu Gin gaa Glu 3 5 ctg Leu gaa Glu ege Arg gca A _ cl aaa Lys 40 gca A ·£ agc Ser atr. 1 Le egt Arg egt Arg 45 ctg Leu gaa Glu cag Gin 144 gaa gtt Glu Va : 5C aat As n Cää Gin gaa Glu egt Arg agc Ser 55 egt. A rg aLg Met gca Ala na t Tyr ctg Leu 60 g: n acc Th r ctg Leu ctg Leu 192 gca aaa A’a I.ys 198 50 65 <210> 64
<211> 66 <212> PRT <213> synthetische Herkunft <40C> 64
Met 1 G.l. y Tyr Ile Pro 5 Glu Ala Pro Arg Asp 10 Gly G.1 n Ala Tyr Val 15 Arg >1 Asp Gly Glu 20 Trp Val Leu Leu Ser 25 Thr Phe Leu Ser Gly 30 Asp Ile Glu Gin Gl u 35 T.eu Glu Arg Ala Lys 40 Ala Ser Ile Arg Arg 45 Leu Glu G.l n Glu Val 50 Asn Gl.n Glu Arg Ser 55 Arg Met Ala Tyr Leu 60 Gin Thr Leu Leu
Ala Lys 65 <210> 65
<211> ISO <212> DNA <213> synthetische Herkunft <220> <221> CDS <?22> (1)..(ISO) <?23> Al -t'oldon <400> 65 arg Met 1 aaa T.ys cag Gin ctg Leu gaa Glu 5 aaa Lys gaa Glu ctg Leu caa Gin gca Ala 10 acc Ile gaa Glu aaa T.ys cag Gin ctg Leu 15 gca Ala 48 caa Gin ctg Leu caa Gl n Lgg T rp 20 aag iys gct Ala caa Gin gct Ala cgc Arg 25 aag Lys aaa lys aag Lys ctg Leu gca Ala 30 cag Gin tcc Ser 96 ggc Gly ggt G] y tat. Tyr 3 5 stt ile cc L Pro gaa Glu gca Ala cca Pro 4C egt. Arg ga l. Asp ggc Gly caa Gin gca Ala 45 tac Tyr gtt. Val egt Arg 144 aaa Lys gac Asp 50 ggt Gly gaa Glu tgg T rp gtc Val ctg Leu 55 ctg Leu LCC Ser act. Thr ttc Phe ctg Leu 60 1.80
<210> 66 <211 > 60 <212> PRT <213> synthetische Herkunft <4 00> 66
Met 1 Lys Gin T.eia Glu 5 Lys Glu Leu Gin Ala 10 Ile Gl u Lys Gin T.eu 15 Ala Gin Leu Gin Trp 20 T VS Al a Gin A _ a Arg 25 Lys Lys I ys Leu Ala 30 Gin Ser Gly Gly Tyr Ile Pro Gl u Ala Pro Arg Asp Gly Gin Ala Tyr Val Arg 51
Lys Asp Gly Glu Trp Val Leu Leu Ser Ihr Phe Leu 50 55 50 <21. 0> 67
<211> 222 <212> DNA <213> synther.isehe Herkunft <220>
<221> CDS <222> (1)..(222) <223> A- Foldon <40 Q> 67 atg aaa cag ctg gaa aaa gag ctg aaa cag tta gaa aaa gaa ctg caa 48 Met Lys Gin Leu Glu Lys Glu Leu Lys Gin Leu Glu Lys Glu Leu Gin 1 5 10 15 gca att gaa aaa cag ctg gca caq ctg caa tgg aaa gca cag gca egt 96 Ala Ile Glu Lys Gin Leu Ala Gin Leu Gin Trp Lys Ala Gin Ala Arg 20 25 3C aaa aaa aaa ctg gcc cag ctg aaa aaa aaa ett cag gcc tcc ggc ggt 144 Lys Lys Lys Leu Ala Gin Leu Lys Lys Lys Leu G.1 n Al a Ser Gly Gly 35 40 45 tat att cct gaa gca cca egt gat ggc caa gca tac gtt egt aaa gac 192 Tyr Ile Pro Glu Ala Pro Arg Asp Gly Gin Ala Tyr Val Arg Lys Asp 50 55 60 ggt gaa tgg g Lc ctg ctg tcc act ttc ctg 222 Gly Glu Trp Val Leu Leu Ser Thr Phe Leu 65 70 <210> 68 <211> 74
<212> PRT <213> synthetische Herkunft <40C> 68
Met 1 Lys Gin ^eu Gl u 5 Lys Glu Leu Lys Gin 10 Leu Glu Lys Glu Leu 15 Gin A'. a Ile Glu Lys 20 Gin Leu Ala Gin Leu 25 Gin Trp Lys Ala Gin 3 0 Ala Arg Lys Lys Lys 35 Leu Ala Gin Leu Lys 40 Lys Lys Leu Gin Ala 45 Ser Gly Gly Tyr I] e 50 Pro Glu Ala Pro Arg 5 5 Asp Gly Gin Ala Tyr 6 0 Val Arg Lys Asp Gly 65 Glu Trp Va 1 Leu Leu 70 Ser Thr Phe Leu <210 > 69 <211> 198
<212> DNA <213> synthetische Herkunft <220> <221> CDS <222> (1) .. (198) <223> B- Foldon 69 <400> 52 atg Met 1 gat Asp alt Ile gaa Glu cag Gin 5 gaa Glu ctg Leu gaa Glu ege Arg gca Ala 10 aaa Lys gca Ala agc Ser att Ile egt Arg 15 egt Arg 48 ctg Leu ga a Glu cag Gin gaa Glu 20 gtt Val aat Asn caa Gin gaa Glu egt Arg 25 agc Ser egt Arg atg Met gca Ala tat Tyr 30 cLg Leu caa Gin 96 acc Thr ctg Leu ctg Leu 35 gca Ala Lys tcc Ser ggc Gly ggt Gly 40 tat Tyr att I le cct Pro gaa Glu gca Ala 45 cca Pro egt Arg gat Asp 144 ggc Gly caa Gin 50 gca Ala tac Tyr gtt Val egt Arg aaa Lys 55 gac Asp ggt Gly gaa Glu tgg Trp gtc Val 60 ctg Leu ctg Leu tcc Ser act Thr 192 tac Phe 65 ctg Leu 198 <210> <211> <21 2> <213> 70 66 PRT synthetische Herkunft <40 0> 70 Met 1 Asp Ile Glu Gin 5 Glu Leu Glu Arg Ala 1 0 Lys Ala Ser Ile Arg 15 Arg Leu Glu Gl n Glu 20 Val Asn Gl n Glu Arg 25 Ser Arg Me L Ala Tyr 30 Leu Gin Thr Leu T,eu 35 A1 a Lys Ser Gly Gly 40 Tyr Ile Pro Glu Ala 45 Pro Arg Asp Gly Gin 50 Ala Tyr Val Arg Lys 55 Asp Gly Glu Trp Val 60 Leu Leu Ser Thr Phe 65 Leu <210> <2 11> <2 12> <213 > 71 432 LINA synthet.i: sehe Herkunft <22C > <221 > <222> <223 > CD5 (1)··(432) Al-CutAl < 4 0 0 > atg aaa Met I.ys 1 71 cag Gin ctg Leu gaa Glu 5 aaa T.ys gaa Glu ctg Leu caa Gin gca Ala 10 atc Ile gaa Glu aaa Lys cag Gin ctg Leu 15 gca Ala 48 caa Gin ctg Leu caa Gl n egg Trp 20 aag Lys get AI 3 caa Gin get Ala cqc Arg 25 aag Lys aaa Lys aag Lys ctg Leu gca A1 a 30 cag Gl n tcc Ser 96 ggc Gly ctt Leu gar. Asp 35 gaa Glu aaa Lys agt. Ser teg Ser aat Asn 40 acc Thr geg A1 a tet Ser gtc Val gtg Val 45 gtg Val cta Leu tgt Cys 144 acg Thr gca Ala cca Pro gat Asp gaa Glu geg ALa a c a Thr gcc Ala cag Gin gat Asp tta Leu gcc Ala gcc Ala aaa Lys gtg Val ctg Leu 1 9 2. 53 53 50 5o 60 gcg Ala 55 gaa Glu aaa Lys ctg Leu gcg Ala gcc Ala 70 tgc Cys gcg Ala acc Thr ttg Leu atc i. le 75 ccc Pro gqc Gly gcc Ala acc Thr cct Ser 80 240 ctc Leu tat Tyr tac Tyr tgg Trp gaa Glu 8 5 ggt Gly aag Lys erg Leu gag G 1 u caa Gl n 90 gaa Glu tac Tyr gaa Glu gtg Val cag Gin 95 atg Ket 288 att I le tta Leu aaa Lys act Thr 100 dCC Thr gta Val tct Ser cac His cag Gin 105 cag Gin gca Ala ctg Leu ccg Leu gaa Glu 110 ege Cys ctg Leu 336 aag J.ys tct Ser cat His 115 cat Hi s cca Pro tat Tyr ca a Gin acc Thr 120 ccg Pro gaa Gl u ert Leu ctg Leu gtt Val 125 tca Leu ccc Pro gLL Va 1 384 aca Thr cac His 130 gga Gly gac Asp aca Thr gat Asp tac Tvr 135 ctc Leu cca Ser tgg Trp ctc Leu aac Asn 140 gca Ala tct Ser tta Leu ege Arg 432 <210> <211 > <212> <213> 72 144 FRT synthetische Kerkunf L <400> 72 Mec 1 Lys Gin Leu Glu 5 Lys Gl u Leu Gin Ala 10 1.1 e Glu Lys Gin Leu 15 Ala Gin Leu Gin Trp 20 Lys Ala Gin Ala Arg 25 Lys Lys Lys Leu Ala 30 Gl n Ser Gly Leu Asp 35 Glu Lys Ser Ser Asn 40 Thr Ala Ser- Val Val 45 Val Leu Cys Thr Ala 50 Pro Asp Glu Ala Thr 55 Ala Gin Asp Leu Ala 60 Ala Lys Val Leu Ala 65 Glu Lys Leu Ala Ala 70 Cys A±a Thr Leu 1 le 7 5 Pro Gly Ala Thr Ser 80 Leu Tyr Tvr Trp Glu 85 Gly Lys Leu Gl u G_n 90 Glu Tyr Glu Val Gin 95 Met I le Leu T.ys Thr IOC Thr Val Ser His Gin 105 Gin Ala Leu Leu Glu 110 Cys Leu Lys Ser His 1 15 His Pro Tyr Gin Thr 120 Pro Glu Leu Leu Val 125 Leu Pro Val Thr His 130 Gly Asp Thr Asp Tyr 135 Leu Ser Trp Leu Asn 140 Ala Ser T.eu Arg <210> 73 <2Π> 474
<2 1 2> DKA <213> synthecische Herkunft <220> <221> CDS < 2 2 2 > (1)..(474) <223> A CutAl 73 < 4 OC > 54 atg Mer. 1 aaa Lys cag Gin ctg Leu gaa Glu 5 a aa Lys gag Glu ctg Leu aaa Lys cag Gin 10 tra Leu gaa Glu aaa Lys gaa Glu ctg Leu 15 caa Gin 48 gca Ala att Tie gaa Glu aaa Lys 20 cag Gin ctg Leu gca Ala cag Gin ctg Leu 25 caa Gin tgg Trp aaa Lys gca Ala cag Gin 30 gca Ala egt Arg 96 aaa Lys aaa Lys a aa Lys 35 ctg Leu gcc Ala cag Gin erg Leu aaa Lys 40 aaa Lys aaa Lys CtL Leu cag G.l n gcc Al a 45 Lee Ser ggc Gly ett Leu 144 gat Asp gaa Glu 5C aaa Lys agt Ser tcg Ser aat Asn acc Thr 55 gcg Ala r ct Ser gtc Val gtg Val gtg Val 60 cta Leu tqt Cys aeg Thr gca Ala 192 cca Pro 65 gat Asp gaa Glu gcg Ala aca Thr gcc Ala 70 cag Gin gar Asp t La Leu gcc Ala gcc Ala 7 5 aaa Lys gtg Val cLg Leu gcg Ala gaa Glu 80 240 aaa Lys ctg Leu gcg Ala gcc Ala tgc Cys 85 gcg Ala acc Thr ttg Leu atc Ile ccc Pro 90 ggc Gly get Ala acc Thr tct Ser ctc Leu 95 tat Tyr 238 IcC Tyr tag Trp gaa Glu ggt Gly 100 aag Lys ctg Leu gag Gl u caa Gin gaa Glu 105 rac Tyr gaa Glu gtg Val cag G^n atg Met 110 att Ile tta Leu 336 aaa Lys act Thr acc Thr 115 gta Val tct Ser cac His cag Gin cag Gin 120 gca Ala ctg Leu ctg Leu gaa Glu tgc Cys 125 ctg Leu aag Lys tct Ser 384 cat His cat His 130 cca Pro rar Tyr caa Gin acc Thr ccg Pro 135 gaa Glu ett Leu ctg Leu gt.e Val rLa T.eu 1 40 cc L Pro gtt Val aca Thr cac His 432 gga Gly 145 gac Asp aca Thr gat Asp Lac Tyr ctc Leu 1 5 0 tca Ser tgg Trp ctc Leu aac Asn gca Ala 155 r.ct Ser tta Leu ege Arg 474 < 2 10 > < 2 11 > <212> ' < 213 > 74 158 PRT syntheti sehe Herkunft < 4 0 0 > 74 Met 1. Lys Gin Leu Glu 5 Lys Glu Leu Lys Gl n 1 0 Leu Glu Lys Glu Leu 1 5 Gl n Ala T le Glu Lys 20 Gin Leu Ala Gin Leu 2 5 Gin Trp Lys Ala Gin 30 Ala Arg lys Lys Lys 35 Leu Ala Gin Leu Lys 40 Lys Lys Leu Gin Ala 4 5 Ser Gly Leu Asp Glu 50 Lys Ser Ser Asn Thr 55 Ala Ser Val Val Val 60 Leu C y s Thr Ala Pro 65 Asp Glu Ala Thr Ala 70 Gin Asp Leu Ala Ala 7 5 Lys Val Leu Ala Glu 80 Lys Leu Ala Ala Cys 85 Ala Thr Leu Ile Pro 90 Gly Ala Thr Ser Leu 9 5 Tyr- Tyr Trp Glu Gly 100 Lys Leu Glu Gin Glu 105 Tyr Glu Val Gin Met 1 1 0 Ile Leu 55
Lys Thr Thr 115 Val Ser His Gin Gin 120 Ala His His 130 Pro Tyr Gin Thr Pro 135 Glu Leu Gly 1 4 5 Asp Thr Asp Tyr Leu 150 Ser Trp Leu <210> <211 > <212> <213> 75 450 DNA syntheti: sehe Herkunft <220> <221> <222> <223> CDS (1)..(450) B-CutAl <400> atg gat Met Asp 1 75 att Ile gaa Glu cag Gin 5 gaa Glu ctg Leu gaa Glu ege Arg ctg Leu gaa Glu cag Gin gaa Glu 2C gtt Va_ aat Asn caa Gin gaa Glu egt Arg 25 acc Thr ctg Leu ctg Leu 3 5 gca Ala aaa Lys tcc Ser ggc Gly ett Leu 40 gat Asp t'.CL Ser gtc Val 50 gtg Val gtg Val cta len tg 1 Cys aeg Thr 5 5 gca AI a cca Pro tta Leu 65 gcc Ala gcc Ala aaa Lys gtg Val ctg Leu 70 geg Ala gaa Glu aaa Lys ctG Ile ccc Pro ggc Gly get Ala acc Thr 85 tet Ser ctc Leu tat Tyr tac Tyr gaa Glu tac Tyr gaa Glu gtg Val 100 cag Gin atg Met 3. L *„ Ile L" α Leu aaa Lys 105 gca Ala ctg Leu ctg Leu 115 gaa Glu tgc Cys ctg Leu aag Lys tet Ser 1 20 cat His cct Leu ctg Leu 130 gLt Val tta Leu cct Pro gLL Val äCä Thr 135 cac Hi s gga Gly c Lc Leu 145 aac Asn gca Ala tc: Ser tta Leu ege Arg 150 <21C> <211> <212> <213> 76 150 PRT synthelische Herkunf L < 4 0 C > 76
Leu Leu Glu Cys 125 Leu T.ys Ser Leu Val Leu 140 Pro Val Thr His Asn Ala 155 Ser Leu Arg gca ääd gca agc att egt egt 48 Ala 10 Lys Ala Ser Ile Arg 15 Arg agc egt atg gca tat ctg caa 96 Ser Arg Met Al a Tyr 3 0 Leu Gin gaa aaa agt teg aat acc geg 144 Glu Lys Ser Ser 45 Asn Thr Ala gal gaa geg aca gcc cag gal 192 Asp G1 u Ala 60 Thr Ala Gin Asp ctg geg gcc tgc geg acc ttg 240 Leu Ala 75 Ala Cys A1 a Thr Leu 80 tgg gaa ggt aag ctg gag caa 288 Trp 90 Glu Gly Lys Leu Glu 95 Gl.n act acc gLa tet cac cag cag 336 Thr Thr Val Ser His 110 Gin Gin cat cca tat caa acc ccg gaa 384 His Pro Tyr Gin 125 Thr Pro Glu gac c-ca gal Lac ctc tca tgg 432 Asp Thr Asp 140 Tyr Leu Ser Trp 450 56
Met 1 Asp I le Glu Gin 5 Glu Leu Glu Arg Ala 10 ijys Ala Ser i le Arg 15 Arg Leu Glu Gin Glu 20 Val Asn Gin Glu Arg 25 Ser Arg Met Ala Tyr 30 Leu Gin Ihr Leu Leu 35 Ala Lys Ser G'-Y Leu 40 Asp Glu Lys Ser Ser 45 Asn Thr Ala Ser Val 50 Val Val Leu Cys Thr 5 5 Ala Pro Asp Glu Ala 60 Thr Ala Gin Asp Leu 65 Ala Ala Lys Val Leu 70 Ala Glu Lys Leu Ala 75 Ala Cys Ala Thr Leu 80 Ile Pro C-ly Ala Thr 85 Ser Leu Tyr Tyr T rp 90 Glu Gl y Lys Leu Glu 95 Gin Glu Tyr Glu Val 100 Gin Met Ile Leu Lys 105 Thr Thr Val Ser Kis 110 Gin Gin Ala Leu Leu 115 Glu Cys Leu Lys Ser 120 Hi s His Pro Tyr Gin 125 Thr Pro Glu Leu Leu 130 Val Leu Pro Val Thr 135 Hi s Gly Asp Thr Asp 140 Tyr Leu Ser Trp Leu 145 Asn Ala Ser Leu Arg 150 <210> <211 > <21 2> < 213 > 77 435 DNA syntheti sehe Herkunft <220> <2 21 > <222> <223> CDS (1) . (435) CutAl-Al <400> atg ctt Met Leu 1 77 gat Asp gaa Glu aaa Lys 5 agt Ser teg Ser äät Asn acc Thr gcg A 1 a 10 Lct Ser gtc Val gtg Val gtg Val cta Leu 15 tgt Cys 48 acg Thr gca Ala cca Pro gat Asp 20 gaa Glu gcg Al a aca Thr gcc Ala cag Gin 25 gat Asp tta Leu gcc Ala gcc Ala aaa Lys 30 gtg Val ctg Leu 96 gcg Ala gaa Glu aaa Ly 5 35 ctg Leu gcg Ala gcc Ala tgc Cys gcg Ala 40 acc Thr ttg Leu atc Ile ccc Pro qgc Glv 45 qct Ala acc Thr tot Ser 144 c Lc Leu tat Tyr 50 tac Tyr tgg Trp gaa Glu ggt Glv aag Lys 55 ctg Leu gag Glu caa Gin gaa Glu tac Tvr 6 0 <2 <ä<ä Glu gtg Val cag Gin alg Met 192 att Ile 65 tta leu a a a iy3 act Thr acc Th ί gt.a Val 70 tcc Ser cac Hi s cag Gin cag Gin gca Ala 75 ctg Leu ctg Leu gaa Glu tgc Cys ctg Leu 80 240 aag Lvs zcz Ser c a r Kis cat Hi s α ca Pro 85 tat Tyr caa Gin acc Thr ccg Pro gaa Glu 90 ctt Leu ctg Leu gtt Val tta Leu cct Pro 95 gtt Val 288 aca ca c gga gac aca gat tac ctc tca tgg ctc aac gca ict t w C. ege 336 57
Thr His Gly Asp 100 Thr Asp Tyr T.eu Ser 105 Trp Leu Asn Ala Ser 110 Leu Arg tcc ggc atg aaa cag ctg gaa aaa gaa ctg caa gca atc gaa aaa cag 384 Ser Gly Met 115 Lys Gin Leu Glu Lys 120 Glu Leu Gin Ala Ile 125 Glu Lys Gin ctg gca caa ctg caa tgg aag gct caa gct cgc aag aaa aag ctg gca 432 Leu Ala 130 Gin Leu Gin Trp Lys 135 Ala Gin Ala Arg Lys 140 T,y n Lys Leu Ala 435 cag
Gin 145 <210> 78 <211> 145
<212> PRT <213> synthetische Herkunft <40 0> 78
Met 1 Leu Asp Glu Lys 5 Ser Ser Asn Thr Ala 10 Ser Val Val Val i,eu 15 Cys Thr Ala Pro Asp 20 Glu Ala Thr Ala Gin 25 Asp Leu Ala Ala Lvs 30 Val Leu Al a Gl u Lys 35 Leu Al a Ala Cys Ala 40 Thr Leu Ile Pro Gly 45 Ala Thr Ser Leu Tyr 50 Tyr Trp Glu Gly Lys 5 5 Leu Gl u Gin Glu Tyr 60 Glu Val Gin Met Ile 65 Leu Lys Thr Thr Val 70 Ser His Gin Gin Ala 75 Leu Leu Glu Cys Leu 80 Lys Ser His His Pro 85 Tyr Gin Thr Pro Glu 90 Leu Leu Val Leu Pro 95 Val Thr HiS Gly Asp 100 Thr Asp Tyr Leu Ser 105 Trp Leu Asn Ala Ser 110 Leu Arg Ser Gly Met 115 Lys Gin Leu G_u Lys 120 Glu Leu Gl n Ala Ile 125 Glu Lys Gin Leu Ala 130 Gin Leu Gin Trp Lys 135 Ala Gin ALa Arg Lvs 14C Lys Lys Leu Ala
Gin 1 4 5 <210> 79 <211> 477
<212> DNA <213> synthetische Herkunft <2 2 C >
<2 21> CDS <2 2 2 > (1)..(477)
<223> CutAl-A <4 00> 79 atg crt gat gaa aaa agt reg aat acc gcg tct gtc gtg gtg cta egt Met Leu Asp Glu Lys Ser Ser Asn Thr Ala Ser Val Val Val Leu Cys 15 10 15 48 58
acg Ihr gca Ala cca Pro gat Asp 20 gaa Glu gcg Ala aca Thr gcc Ala cag Gin 25 gat Asp tta Leu gcc A_a gcc Ala Lys 30 gtg Val ctg Leu 96 gcg Ala gaa Glu aaa Lys 35 ctg Leu gcg Ala gcc Ala Lgc Cys gcg Ala 40 acc Thr ttg Leu atc I le ccc Pro ggc Gly 45 get Ala acc Thr tet Ser 144 ctc Leu tat Tyr 50 tac Tyr tgg Trp gaa Glu ggt Gly aag Lys 55 ctg Leu gag G l.u caa Gin gaa G~;u tac Tyr 60 gaa Glu gtg Val cag Gin atg Met 192 att Ile 65 tta Leu aaa Lys act Thr acc Thr gta Val 70 tet Ser cac His cag Gin cag Gin qca Ala 75 ctg Leu ctg Leu gaa Glu tgc Cys ctg Leu 80 240 aag Ly s Lc L Ser cat H i s cat His cca Pro 85 tat Tyr caa Gin acc Thr ccg Pro gaa Glu 90 cLt Leu ctg Leu gtt Va^ tta Leu cct Pro 9 5 gtt Val 288 aca Thr cac His gga Gly gac Asp 1 0 0 aca Thr gat Asp Lac Tyr ctc Leu tca Ser 105 tgg Trp ctc Leu aac Asn gca Ala rct Ser 110 tta Leu ege Arg 336 tcc Ser ggc C-ly arg Met 115 aaa Lys cag Gin ctg Leu gaa Glu aaa Lys 120 gag Glu ctg Leu aaa Lys cag Gl n tta Leu 125 gaa Glu aaa Lys gaa Glu 384 ctg Leu caa Gin 130 gca Ala att Ile gaa Glu aaa Lys cag Gin 135 ctg Leu gca Ala csg Gin ctg Leu caa Gin 140 tgg Trp aaa Lys gca Ala cag Gin 432 gca Al a 145 egt Arg aaa Lys aaa Lys aaa Lys ctg T.eu 150 gcc Ala cag Gl n ctg Leu aaa Lys aaa Lys 155 aaa Lys ett Leu cag Gin gcc A^a 477 <210> <211 > <212> <213> 80 159 PRT synLheti: sehe Herk :unf' <400> 80 Met. 1 Leu Asp Glu Lys 5 Se r Ser Asn Thr Ala 10 Ser Val Va 1 Val Leu 15 Cys Th r Ala Pro Asp 20 Glu Ala Thr Ala Gin 25 Asp Leu Ala ALa Lys 30 Val Leu Ala Glu Lys 35 Leu Ala Ala Cys Ala 40 Thr Leu Ile Pro Gly 45 Ala Thr Ser Leu Tyr 50 Tyr Trp Glu Gl.y Lys 5 3 Leu Glu Gin Glu Tyr 60 Glu Val Gl n Met Ile 6 5 Leu Lys Thr Thr Val 70 Ser His Gin Gin Al a 7 5 Leu Leu Gl u Cys Leu 80 Lys Ser His His Pro 85 Tyr Gin Thr Pro Glu 90 Leu Leu Val Leu Pro 9 5 Va 1 Ihr Hin Gly Asp 100 Thr Asp Tyr I ,eu Ser 105 Trp Leu Asn Ala Ser 110 Leu Arg Ser Glv Met 115 Lys Gl n Leu Glu Lys 1 20 Glu Leu Lys Gin Leu 125 Gl u Lys Glu 59
Leu Gin Ala 130 He Glu Lys Gin 135 Leu Ala Ala 145 Arg Lys T,y s luVS Leu 150 Ala Gin Leu <210> 81 <211> 450 < 212 > DNA <213> synthetische Herkunf i L <220> <221> CDS <222> (1).. <223> CutAl (450) -B <40C > 81 atg ett gat Met Leu Asp 1 gaa Glu aaa Lys 5 agt Ser teg Ser a^L Asn acc Thr aeg Th r gca cca Ala Pro gat Asp 20 gaa Glu gcg Ala aca Thr gcc Ala cag Gin 25 gcg Ala gaa aaa Glu Lys 35 c Lg Leu gcg Ala gcc Ala tgc Cys gcg Ala 40 acc Thr ctc Leu tat tac Tyr Tyr 50 tgg Trp gaa Glu ggt Gl y aag Lys 55 ctg Leu gag Glu att Ile 65 tta aaa Leu Lys act Thr acc Thr gta Val 70 tct Ser cac His cag Gin aag Lys tct cat Ser His cat His cca Pro 85 tat Tyr caa Gin acc Thr ccg Prc aca Thr cac gga His Gly gac Asp 1 00 clC c Thr ga t Asp tac Tyr ctc Leu Lea Ser 1 05 tcc Ser ggc gat Gly Asp 115 ar. L Ile gaa Glu cag Gin gaa Glu ctg Leu 120 gaa Glu egt Arg ctg gaa Leu Glu 130 cag Gin gaa Glu gtt Val aat Asn 135 C 3 ci Gin gaa G_u caa C-ln 145 acc ctg Thr Leu ctg Leu gca Ala aaa Lys 1 50 <210> 82 <211> 150 <212> PRT <213 > synthet1 sehe Herkunft < 4 C 0 > 82 Met Leu Asp Glu Lys Ser Ser Asn Ihr 1 5
Gin Gen Gin Trp Lys Ala Gin 14C
Lys Lys Lys Leu Gin Ala 1 5 5 gcg tct gtc gtg gtg cta tgt 48
Ala Ser Val Val Val Leu Oys 10 15 gat tta gcc gcc aaa gtg ctg 96
Asp Leu Ala Ala Lys Val Leu 30 ttg atc ccc ggc gct acc tct 144
Leu Ile Pro Gly Ala Thr Ser 45 caa gaa tac gaa gtg cag atg 192
Gin Glu Tyr Glu Val Gin Met 60 cag gca ctg ctg gaa tgc ctg 240
Gin Ala Leu Leu Glu Cys Leu 75 80 gaa clt ctg gtt tta cct gtt 288
Glu Leu Leu Val Leu Pro Val 90 95 tgg ctc aac gca tct tta cgc 336
Trp Leu Asn Ala Ser Leu Arg 110 cgc gca aaa gca agc att egt 384
Arg Ala Lys Ala Ser Ile Arg 125 egt agc egt aLg gca tat ctg 432
Arg Ser Arg Met Ala Tyr Leu 140
Ala Ser Val Val Val Leu Cys 10 1 5 450 60
Ihr Ala Pro ÄSp 20 Glu Ala Thr Ala Gin 25 Asp Leu Ala Ala Lys 30 Val Leu Ala Glu Lys 3 5 i eu Ala Al a Cys Ara 40 Thr Leu Ile Pro Gly 45 Ala Thr Ser Leu Tyr 50 Tyr Trp Glu Gly Lys 55 Leu Glu Gin Glu Tyr 60 Glu Val Gin Met Ile 65 Leu Lys Thr Thr Val 70 Ser His Gin Gl n A1. a 75 Leu Leu Glu Cys Leu 80 Lys Ser His His Pro 85 Tyr Gin Thr Pro Glu 90 Leu Leu Val Leu Pro 95 Val Thr His Gly Asp 100 Thr Asp Tyr Leu Ser 105 Trp Leu Asn Ala Ser 110 Leu Arg Ser Gly Asp 115 Ile Glu Gin Glu Leu 120 Glu Arg Ala I.ys Al a 125 Ser Ile Arg Arg Leu 13C Glu Gin Glu Val Asn 135 Gin Glu Arg Ser Arg 140 Met Ala Tyr Leu Gin 145 Thr Leu Leu Ala Lys 150 <210> <211 > <21 2> <21 3> 83 336 DNA synthet.i : sehe Herkunft <220> <221> <222> <223> CDS (1) .. CuLAl (336) <4 0 0 > atg ctt Met Leu 1 83 gat Asp gaa Glu aaa Lvs 5 agt Ser teq Ser aat Asn acc Thr gcg Ala 10 cct Ser gtc Val gtg Val gtg Val cta Leu 15 tgt Cys 48 acg Thr gca Al a cca Pro gat Asp 20 gaa Glu gcg Ala aca Thr gcc Ala cag Gin 25 gat Asp tta Leu gcc Ala gcc Ala aaa Lys 30 gtg Val ctg Leu 96 gcg Ala gaa Glu aaa Lvs 35 ctg Leu gcg Ala gcc Ala ege Cys gcg Ala 40 acc Thr ttg Leu atc Tie ccc Pro ggc Gly 45 gez Ala acc Thr Lei Ser 144 ctc Leu Zaz Tyr 50 tac Tyr tgg Trp gaa Glu ggt Gly aag Lys 55 ctg Leu gag Glu caa Gin gaa Glu tac Tyr 60 gaa Glu gtg Val cag Gin atg Met 192 att Ile 65 ;ta Leu aaa Lys act Thr acc Thr gca Val 70 tet Ser cac H.i s cag Gin cag Gl n gca A1 a 7 5 ctg Teu ctg Leu gaa Glu tgc Cys ctg Leu 80 240 aag Lys zcz Ser cat His cat His cca Pro 85 tat Tvr caa Gl n acc Thr ccg Pro CJ ca fi Glu 90 ctt Leu ctg Leu gtt Val tta Leu cd Pro 95 gtL Val 288 aca Thr cac His gga Gly gac Asp 100 aca Thr gat, Asp tac Tyr ctc Leu tca Ser 105 tgg T rp ctc Leu α ciC Asn gca Ala tet Ser 110 tta Leu ege Arg 336 <210 > 84 61
< 211> 112 < 212 > PRT <213> synthetische Herkunft <400> 84
Met 1 Leu Asp Glu T.ys 5 Ser Ser Asn Thr Ata Pro Asp 20 Giu 7ila Thr Ala Ala Glu Lys 35 Leu Ala Ala Cys Ala 40 Leu Tyr 50 Tyr Trp Glu Gly Lys 55 Leu Ile 65 Leu Lys Thr Thr Val 70 Ser His Lys Ser His His Pro 85 Tyr Gin Thr Thr H i.s Gly Asp 100 Thr Asp Tyr Leu
Thr Ala 10 Ser Val Val Val Leu 15 Cys Gin 25 Asp Leu Ala Ala Lys 30 Val Leu Thr Leu Ile Pro Gly 45 Ala Thr Ser Glu Gl n Glu Tyr 60 Glu Val Gin Met Gin Gin Ala 75 Leu Leu Giu Cys Leu 80 Pro Glu 90 Leu Leu Val Leu Pro 95 Val Ser 105 Trp Leu Asn Ala Ser 110 Leu Arg

Claims (16)

  1. Patentanwälte Dipl.-Ing. Helmut Hübscher Dipl.-Ing. Karl Winfried Hellmich Spittelwiese 7, A 4020 Linz (38588) HEL Patentansprüche: 1. Polypeptidmaterial mit flexiblen Poreneigenschaften, das durch das zwei- oder dreidimensionale Zusammenfügen von Fusionsproteinen aus mindestens zwei Proteindomänen entsteht, wobei mindestens eine Domäne eine Doppelwendel bildet und mindestens eine die Protein-Oligomerisationsdomäne mit mindestens der Oligomeri-sationsstufe 3.
  2. 2. Das Polypeptidmaterial gemäß Anspruch 1 mit der Eigenschaft, dass die Oli-gomerisationsstufe der Oligomerisationsdomäne zwischen 3 und 12 liegt, meistens zwischen 3 und 6.
  3. 3. Das Polypeptidmaterial gemäß einem der Ansprüche 1 bis 2, bei dem die Porenform und -Größe durch die Verbindungsart der Proteindomänen des Fusionsproteins gemäß der Erfindung und die Porengröße durch die Länge des Doppelwendelbildenden Segments bestimmt sind.
  4. 4. Das Polypeptidmaterial gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem die Länge des Doppelwendel-bildenden Segments zwischen 2 und mehr als 100 Heptaden (14 bis 700 Aminosäure-Reste) umfasst.
  5. 5. Polypeptidmaterial gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dessen technologische Eigenschaften unter anderem durch die Einfuhr positiv geladener, negativ geladener, hydrophober, hydrophiler, zysteinischer, histidinischer und sonstiger Aminosäure-Reste, die spezifische Interaktionen mit den an der Oberfläche ausgesetzten Segmenten ermöglichen, definiert sind, während die Fähigkeit zur Bildung der Doppelwendel erhalten wird und die Aminosäure-Reste, die die technologischen Poreneigen- • · · « 2 schäften bestimmen, werden meistens an die Positionen b, c und f des Doppelwendelbildenden Segments eingeführt.
  6. 6. Polypeptidmaterial gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, bei dem die chemischen Poreneigenschaften auch durch die Eigenschaften der Proteindomänen des genannten Fusionsproteins bestimmt sind, wie unter anderem auch die Nettoladung, an der Oberfläche ausgesetzten hydrophoben Aminosäure-Reste und die Größe der Proteindomänen.
  7. 7. Das aus dem Polypeptidmaterial gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 bestehende Fusionsprotein, das aus mindestens zwei Proteindomänen besteht, wobei mindestens eine Domäne eine Doppelwendel bildet und mindestens eine die Protein-Oligomerisationsdomäne ist und die Domänen untereinander durch den flexiblen Linker aus 1 bis 20 Aminosäure-Resten verbunden werden, vorzugsweise 1 bis 6, das Fusionsprotein kann jedoch auch sie Signalsequenz zur Lenkung des Proteinausschusses und der Polypeptid-Kennzeichnung enthalten.
  8. 8. Polypeptidmaterial gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, bei dem das Doppelwendel-bildende Segment auf der Sequenz SEQ ID Nr. 2, SEQ ID Nr. 4 oder SEQ ID Nr. 6 oder den geplanten Peptiden mit funktional ähnlichen Eigenschaften basiert.
  9. 9. Polypeptidmaterial gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, bei dem die Protein-Oligomerisationsdomäne vorzugsweise unter den Sequenzen SEQ ID Nr. 8, SEQ ID Nr. 10, SEQ ID Nr. 12, SEQ ID Nr. 14, SEQ ID Nr. 84 und den Sequenzen mit einer mehr als 50-%-Homologie mit diesen Sequenzen, die die Fähigkeit zur Bildung von Oligomeren des gleichen Typs erhalten, gewählt wird.
  10. 10. Polypeptidmaterial gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, das durch die Zusammenfügung der Fusionsproteine zubereitet wurde, die unter den Sequenzen SEQ ID Nr. 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82 gewählt wurden. ·*·* II I II · »··« * * « III 3
  11. 11. Polypeptidmaterial gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10, zubereitet durch die Vermischung von zwei Fusionsproteinen gemäß einem der Patentansprüche 1 bis 10, wobei das Segment aus dem ersten Fusionsprotein zusammen mit dem Segment aus dem zweiten Fusionsprotein die parallele Doppelwendel bildet. Die Oligomerisations-domäne des einen Fusionsproteins befindet sich am N-Terminus und im anderen am C-Terminus, die Oligomerisationsdomänen der beiden Proteine haben jedoch die gleiche Oligomerisationsstufe.
  12. 12. Das Polypeptidmaterial gemäß Anspruch 11 mit der Eigenschaft, dass die Doppelwendel-bildenden Segmente unter natürlichen oder den geplanten Parallel-Doppelwendeln oder unter den folgenden Paaren ausgewählt werden SEQ ID Nr.: 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32.
  13. 13. Polypeptidmaterial gemäß einem der Ansprüche 11 bis 12 mit der Eigenschaft, dass die Protein-Oligomerisationsdomänen unter den Tetramer-Proteinen gewählt werden, vorzugsweise unter den Sequenzen SEQ ID Nr: 10 und SEQ ID Nr.: 12 oder unter den trimeren Proteinen, vorzugsweise unter SEQ ID Nr: 8 und SEQ ID Nr. 84.
  14. 14. Fusionsprotein mit der DNA-Information gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13, bei dem die DNA operativ mit Regulierungselementen, dem Promotor und dem Terminator, die die Äußerung der Fusionsproteine in der Zelle des Wirten regulieren, verbunden ist.
  15. 15. Die Verwendung des Polypeptidmaterials gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13 zur Trennung und Konzentration von Molekülen, Molekül-Komplexen, Viren oder Na-noteilchen gemäß ihrer Eigenschaften.
  16. 16. Die Verwendung von Polypeptidmaterial gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13 für die chemische Katalyse. Linz, am 12. April 2012 Kemijski in£titut durch: VL^·'
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