WO2021084814A1 - 微小粒子回収方法、微小粒子分取用マイクロチップ、微小粒子回収装置、エマルションの製造方法、及びエマルション - Google Patents

微小粒子回収方法、微小粒子分取用マイクロチップ、微小粒子回収装置、エマルションの製造方法、及びエマルション Download PDF

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真寛 松本
達巳 伊藤
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Definitions

  • This technology relates to a fine particle recovery method, a microchip for separating fine particles, a fine particle recovery device, an emulsion production method, and an emulsion. More specifically, the present technology includes a fine particle recovery method for recovering fine particles in an emulsion, a microchip for separating fine particles, a fine particle recovery device, and an emulsion production method including steps performed in the recovery method. , As well as emulsions.
  • Non-Patent Document 1 describes a method of randomly capturing particles in an emulsion.
  • the cell-containing solution is diluted to ⁇ 100 cells / ⁇ l or less so that one emulsion contains one cell.
  • the efficiency of producing emulsion particles containing one cell follows the Poisson distribution, so that the proportion of empty emulsion particles (emulsion particles containing no cells) is high, which is inefficient. Therefore, in Non-Patent Document 1 below, in order to increase the ratio of cell-containing emulsion particles to empty emulsion particles, it is possible to sort the emulsion by controlling the particles or fluid by, for example, an electric field, dielectrophoresis, or local heating. Proposed.
  • An object of this technique is to provide a new method for more efficiently producing emulsion particles containing one fine particle.
  • the present inventors have found that the above problems can be solved by a specific fine particle recovery method. That is, in this technology, the main flow path through which fine particles pass, and Of the fine particles, a recovery flow path in which the recovery target particles are recovered, and A connecting flow path connecting the main flow path and the recovery flow path, A flow step of flowing a first liquid containing fine particles to the main flow path in a fine particle sorting mechanism having a flow path structure including a liquid supply flow path that is connected so that a liquid can be supplied to the connection flow path.
  • a method for recovering fine particles is provided. By carrying out the fine particle recovery method, an emulsion using the second liquid as a dispersion medium and the first liquid as a dispersoid can be formed in the recovery flow path. An emulsion is formed by carrying out the fine particle recovery method, and at least a part of the droplets constituting the emulsion may contain one of the recovery target particles.
  • the first liquid may be hydrophilic and the second liquid may be hydrophobic.
  • the kinematic viscosity of the second liquid can be 1/100 to 100 times the kinematic viscosity of the first liquid.
  • the flow step, the determination step, and the recovery step can be performed while supplying the second liquid from the liquid supply flow path to the connection flow path.
  • the main flow path may branch into at least one waste flow path through which fine particles other than the connection flow path and the particles to be collected flow.
  • the liquid supply flow path may supply the liquid to the connection flow path.
  • the connection flow path may be provided with a valve that prevents the first liquid from advancing into the recovery flow path. In the flow step, the fine particles can flow in a substantially row in the main flow path toward the connection flow path.
  • a sample flow path through which a liquid containing fine particles flows and a sheath flow path through which a liquid containing no fine particles flows are connected to the main flow path at a confluence, and fine particles are connected to the main flow path after the confluence.
  • the flow path structure can form a laminar flow containing fine particles flowing in substantially a row.
  • the fine particles flowing in the main flow path are irradiated with light, and it can be determined whether the fine particles are recovery target particles based on the light generated by the irradiation.
  • the particles to be recovered can be recovered into the recovery flow path through the connection flow path due to the pressure fluctuation in the recovery flow path.
  • the main flow path, the connection flow path, and the recovery flow path may be arranged in a straight line.
  • the fine particles may be cells or cell masses, and the first liquid may be a culture solution of the fine particles.
  • the microparticles may be cells, cell clumps, or synthetic particles, and the microparticles may be destroyed after the recovery step.
  • the recovered fine particles in the recovery flow path may be subjected to a further fine particle preparative treatment.
  • the microchip for separating fine particles may include one or more of the flow path structures.
  • this technology has a main flow path through which fine particles pass, and Of the fine particles, a recovery flow path in which the recovery target particles are recovered, and A connecting flow path connecting the main flow path and the recovery flow path, It has a flow path structure including a liquid supply flow path that is connected to the connection flow path so that a liquid can be supplied.
  • the main flow path has a determination region used for determining whether the fine particles flowing in the first liquid are recovery target particles.
  • the fine particles determined to be the particles to be recovered are recovered in the second liquid which is immiscible with the first liquid in the recovery flow path while being contained in the first liquid.
  • this technology has a main flow path through which fine particles pass, and Of the fine particles, a recovery flow path in which the recovery target particles are recovered, and A connecting flow path connecting the main flow path and the recovery flow path, A liquid supply flow path that is connected so that a liquid can be supplied to the connection flow path, A microchip for collecting fine particles having a flow path structure including A first liquid supply unit that supplies a first liquid containing fine particles to the main flow path, A second liquid supply unit that supplies a second liquid that is immiscible with the first liquid to the liquid supply flow path, A determination unit for determining whether the fine particles flowing in the main flow path are the particles to be collected, and Also provided is a microparticle recovery device equipped with. The microchip for separating fine particles may be removable from the fine particle recovery device.
  • this technology has a main flow path through which fine particles pass, and Of the fine particles, a recovery flow path in which the recovery target particles are recovered, and A connecting flow path connecting the main flow path and the recovery flow path, A flow step of flowing a first liquid containing fine particles to the main flow path in a fine particle sorting mechanism having a flow path structure including a liquid supply flow path that is connected so that a liquid can be supplied to the connection flow path.
  • a method for producing an emulsion containing fine particle-containing emulsion particles is also provided.
  • the present technology also provides an emulsion containing fine particle-containing emulsion particles in which the ratio of the number of emulsion particles containing one fine particle is 70% or more with respect to the total number of emulsion particles.
  • FIG. 1 It is a figure which shows the structural example of the microchip for separating fine particles used in the fine particle recovery method of this technique. It is a figure which shows an example of the flow of the fine particle recovery method of this technology. It is an enlarged view of an example of a particle sorting part. It is a block diagram of an example of a control unit. It is a figure which shows the structural example of the microchip for separating fine particles to which a container is connected. It is an enlarged view of the connection flow path part. It is an enlarged view of the connection flow path part. It is an enlarged view of the connection flow path part. It is an enlarged view of the connection flow path part. It is an enlarged view of the connection flow path part. It is an enlarged view of the connection flow path part. It is a photograph which shows that the emulsion particle containing one fine particle is formed in the recovery flow path.
  • the fine particle recovery method of the present technology connects a main flow path through which fine particles pass, a recovery flow path in which the particles to be recovered are collected among the fine particles, and the main flow path and the recovery flow path. This is performed by using a fine particle sorting mechanism having a flow path structure including a flow path and a liquid supply flow path that is connected to the connection flow path so that liquid can be supplied.
  • the fine particle recovery method of the present technology determines in the fine particle sorting mechanism a flow step of flowing a first liquid containing fine particles into the main flow path and whether the fine particles flowing through the main flow path are recovery target particles.
  • the determination step and the recovery step of recovering the recovery target particles into the recovery flow path are included, and in the recovery step, the recovery target particles are contained in the first liquid. It is recovered in the second liquid which is immiscible with the first liquid in the recovery flow path.
  • the particles to be recovered are recovered in the second liquid which is immiscible with the first liquid in the recovery flow path while being contained in the first liquid.
  • emulsion particles containing recovery target particles can be formed in the recovery flow path.
  • the fine particles recovered into the recovery flow path are determined to be recovery target particles in the determination step, and the recovery operation is performed at an appropriate timing. Further, when the fine particles do not flow or when the fine particles determined not to be the recovery target particles in the determination step come, the recovery operation is not performed. Therefore, the emulsion particles or the emulsion particles that do not contain the fine particles in the recovery flow path. Emulsion particles containing particles other than the particles to be recovered are not formed.
  • the probability that one particle to be recovered is contained in the emulsion particles is extremely high.
  • the success rate of emulsion particles containing one fine particle is, for example, 70% or more, particularly 80% or more, more particularly 90% or more, and further 95% or more.
  • the recovery target particles refer to fine particles determined to be recovered in the determination step.
  • the number of analyzed cells contained in clinical samples is often less, for example the number of analysis targets cells in one sample may be, for example, 10 4 to 10 5.
  • the number of available cells is limited.
  • the proportion of emulsion particles containing one fine particle can be increased. Therefore, this technique is extremely effective for performing single cell analysis using emulsions.
  • a single cell analysis is performed using a cell sorting device such as a cell sorter.
  • the target cells are sorted and the target cells are purified. Therefore, in order to perform the single cell analysis, a cell sorter is required in addition to the emulsifying device. It is not desirable from the viewpoint of cost, for example, to use more devices.
  • a cell sorting step is required in addition to the emulsion forming step. Increasing the number of steps is not desirable from the viewpoint of time and cost, for example.
  • an emulsion is formed by carrying out the fine particle recovery method, and at least a part of the droplets (hereinafter, also referred to as "emulsion particles") constituting the emulsion is recovered.
  • emulsion particles Contains one target particle. More preferably, of all the droplets constituting the emulsion, preferably 70% or more, more preferably 80% or more, and even more preferably 90% or more of the droplets contain one particle to be recovered.
  • the fine particle recovery method according to the present technology can form an emulsion having a high proportion of emulsion particles containing one recovery target particle in this way.
  • the present technology also provides a method for producing an emulsion containing emulsion particles containing one fine particle.
  • the step included in the production method may be the same as the step of the fine particle recovery method.
  • the present technology also provides an emulsion in which the ratio of the number of emulsion particles containing one cell is 70% or more with respect to the total number of emulsion particles.
  • the ratio may be preferably 75% or more, and even more preferably 80% or more, 85% or more, or 90% or more.
  • the present technology provides an emulsion containing one emulsion particle in an extremely high content ratio.
  • the main flow path and the recovery flow path are connected via the connection flow path, and the connection flow path is connected to the connection flow path.
  • the liquid supply flow path is connected.
  • an emulsion having the second liquid as a dispersion medium and the first liquid as a dispersoid is formed in the recovery flow path.
  • the emulsion formed by the fine particle recovery method according to the present technology has a high content ratio of emulsion particles containing one recovery target particle in the total emulsion particles. Therefore, this technique can be applied even when the number of cells to be analyzed is small.
  • the kinematic viscosity of the second liquid is preferably 1/1000 to 1000 times, more preferably 1/100 to 100 times, and even more preferably 1/10 times the kinematic viscosity of the first liquid. It is up to 10 times, more preferably 1/5 times to 5 times, and particularly preferably 1/2 to 2 times. In the present technology, it is preferable that the kinematic viscosities of the first liquid and the second liquid are about the same. This facilitates the formation of emulsions.
  • the densities of the first liquid and the second liquid at 25 ° C. are, for example, 0.5 g / cm 3 to 5 g / cm 3 , preferably 0.6 g / cm 3 to 4 g / cm 3 , and more preferably 0.
  • the density of the second liquid is preferably 1/100 to 100 times, more preferably 1/10 to 10 times, and even more preferably 1/5 times the density of the first liquid. It is up to 5 times, and particularly preferably 1/2 to 2 times. In the present technology, it is preferable that the densities of the first liquid and the second liquid are about the same. This facilitates the formation of emulsions.
  • the kinematic viscosities of the first liquid and the second liquid at 25 ° C. can be, for example, 0.3 cSt to 5 cSt, preferably 0.4 cSt to 4 cSt, and more preferably 0.5 cSt to 3 cSt.
  • the first liquid may be a hydrophilic liquid and the second liquid may be a hydrophobic liquid.
  • an emulsion having a hydrophobic liquid as a dispersion medium and a hydrophilic liquid as a dispersoid can be formed in the recovery flow path.
  • biological particles such as cells exist in a hydrophilic liquid such as a buffer or a culture solution. Therefore, this embodiment is suitable for recovering fine particles, particularly biological particles, more particularly cells, which are desirable to be present in a hydrophilic liquid.
  • the hydrophilic liquid includes, for example, water and a liquid miscible with water.
  • the hydrophilic liquid is one or a mixture of two or more selected from the group consisting of water, hydrophilic alcohols, hydrophilic ethers, ketones, nitrile solvents, dimethyl sulfoxide, and N, N-dimethylformamide. It may be a liquid as a main component.
  • the main component is, for example, 50% by mass or more, particularly 60% by mass or more, more particularly 70% by mass or more, and even more particularly 80% by mass or more, 85% by mass or more, or A component that accounts for 90% by mass or more.
  • hydrophilic alcohol examples include ethanol, methanol, propanol, and glycerin.
  • hydrophilic ether examples include tetrahydrofuran, polyethylene oxide, 1,4-dioxane and the like.
  • ketone examples include acetone and methyl ethyl ketone.
  • nitrile solvent examples include acetonitrile and the like.
  • the hydrophilic liquid is preferably a liquid containing water as a main component, and may be, for example, water, an aqueous solution, or an aqueous dispersion.
  • the hydrophilic liquid may be, for example, a sheath liquid and / or a sample liquid.
  • the hydrophilic liquid is preferably a hydrophilic liquid that does not adversely affect fine particles (for example, biological particles, particularly cells).
  • the hydrophilic liquid may be, for example, a liquid containing a biomolecule.
  • the biomolecule may be, for example, one or a combination of two or more selected from amino acids, peptides, and proteins.
  • the hydrophilic liquid may contain, for example, a surfactant, particularly a nonionic surfactant.
  • nonionic surfactants include, for example, triblock copolymers of polyethylene oxide and polypropylene oxide, and the triblock copolymers are also called poloxamers or pluronic surfactants.
  • Pluronic TM F68 A more specific example of a Pluronic surfactant is Pluronic TM F68.
  • the hydrophilic liquid examples include, but are not limited to, a culture solution and a buffer.
  • the buffer is preferably a good buffer.
  • the hydrophilic liquid contains a cell stimulating component, the cells recovered as the recovery target particles can be stimulated while being held in the emulsion particles.
  • the characteristics of the stimulated cells eg, morphology, etc.
  • it may also include an assay system that allows the hydrophilic liquid (eg, the sheath fluid or the sample fluid) to observe the response of cell stimulation.
  • the assay system With the assay system, the response from the cells recovered as the recovery target particles can be detected, for example, optically while being retained in the emulsion particles.
  • the assay system is preferably a wash-free assay system, and is preferably a system utilizing, for example, fluorescence resonance energy transfer (FRET) or bioluminescence resonance energy transfer (BRET).
  • FRET fluorescence resonance energy transfer
  • BRET bioluminescence resonance energy transfer
  • the density of the hydrophilic liquid at 25 ° C. is, for example, 0.5 g / cm 3 to 5 g / cm 3 , preferably 0.6 g / cm 3 to 4 g / cm 3 , and more preferably 0.7 g / cm 3 to 3 g. / Cm 3 can be.
  • the kinematic viscosity of the hydrophilic liquid at 25 ° C. can be, for example, 0.3 cSt to 5 cSt, preferably 0.4 cSt to 4 cSt, and more preferably 0.5 cSt to 3 cSt.
  • the hydrophobic liquid may be any liquid selected from liquids that are immiscible with the hydrophilic liquid.
  • the hydrophobic liquid includes, for example, aliphatic hydrocarbons, fluorine-based oils, small molecules or polymers containing fluorine atoms, silicone oils, aromatic hydrocarbons, aliphatic monovalent alcohols (for example, n-octanol, etc.), and It may be a liquid containing one or a mixture of two or more selected from the group consisting of fluoropolysaccharides as a main component.
  • the aliphatic hydrocarbon is preferably an aliphatic hydrocarbon having 7 or more and 30 or less carbon atoms.
  • the kinematic viscosity of the hydrophobic liquid is suitable for flowing in the microchannel.
  • aliphatic hydrocarbons are mineral oils; oils derived from animals and plants such as squalane oil and olive oil; paraffinic hydrocarbons having 10 to 20 carbon atoms such as decane and hexadecane; and 10 to 20 carbon atoms. Olefin hydrocarbons can be mentioned.
  • the hydrophobic liquid is preferably a fluorinated oil from the viewpoint of good immiscibility with the hydrophilic liquid.
  • fluorine-based oil examples include perfluorocarbon (PFC), perfluoropolyether (PFPE), and hydrofluoroether (HFE).
  • PFC perfluorocarbon
  • PFPE perfluoropolyether
  • HFE hydrofluoroether
  • perfluorocarbons examples include Fluorinert TM FC40 and Fluorinert FC-770 (manufactured by 3M).
  • perfluoropolyether include Krytox (manufactured by DuPont).
  • hydrofluoroether examples include HFE7500 (manufactured by 3M).
  • the density of the hydrophobic liquid at 25 ° C. is, for example, 0.5 g / cm 3 to 5 g / cm 3 , preferably 0.6 g / cm 3 to 4 g / cm 3 , and more preferably 0.7 g / cm 3 to 3 g. / Cm 3 can be.
  • the kinematic viscosity of the hydrophobic liquid at 25 ° C. can be, for example, 0.3 cSt to 5 cSt, preferably 0.4 cSt to 4 cSt, and more preferably 0.5 cSt to 3 cSt.
  • one or both of the first liquid and the second liquid may contain a surfactant.
  • one or both of the hydrophobic liquid and the hydrophilic liquid contains a surfactant, and more particularly the hydrophobic liquid contains a surfactant.
  • the surfactant facilitates the formation of emulsion particles, and the emulsion particles can be stably maintained.
  • the surfactant include nonionic surfactants and fluorine-based surfactants.
  • the nonionic surfactant include, but are not limited to, Span80 and Avil EM. The type of surfactant may be appropriately selected by those skilled in the art.
  • fluorine-based surfactant examples include a perfluoropolyether-based surfactant and a pseudophase surfactant (pseudosurfactant).
  • a perfluoropolyether-based surfactant examples include Krytox (manufactured by DuPont)
  • a pseudophase surfactant pseudosurfactant
  • Krytox manufactured by DuPont
  • perfluorooctanol can be mentioned.
  • the surfactant may be present in the hydrophobic liquid, for example, at a concentration equal to or higher than the critical micelle concentration of the surfactant.
  • the critical micelle concentration can be, for example, 1 ⁇ M to 1000 ⁇ M, particularly 10 ⁇ M to 100 mM.
  • the interfacial tension of the surfactant may be, for example, 40 mN / m or less, and in particular, 20 mN / m or less.
  • the first liquid may be a hydrophobic liquid and the second liquid may be a hydrophilic liquid.
  • an emulsion having a hydrophilic liquid as a dispersion medium and a hydrophobic liquid as a dispersoid can be formed in the recovery flow path.
  • the present technique may be used to recover fine particles in the emulsion. Examples of the hydrophobic liquid and the hydrophilic liquid are as described above. Further, this embodiment can be applied, for example, when the dispersion medium and the dispersoid are a hydrophobic liquid and a hydrophilic liquid, respectively, and the emulsion particles are further recovered from the emulsion containing the fine particles. ..
  • the determination for the fine particles may be performed, the determination for the emulsion particles may be performed, or the determination for both the fine particles and the emulsion particles. May be done.
  • the flow step, the determination step, and the recovery step are performed while supplying the second liquid from the liquid supply flow path to the connection flow path.
  • FIG. 1 showing a microchip for fine particle sorting which is a configuration example of the fine particle sorting mechanism used in the fine particle collecting method of the present technology
  • FIG. 2 showing an example of the flow of the fine particle collecting method of the present technology. An example of one embodiment of the method of the present technology will be described with reference to.
  • the microchip 150 for collecting fine particles used in the method of the present technology has a main flow path 155 through which the fine particles flow and a recovery flow path in which the particles to be collected among the fine particles are collected. Including 159 and.
  • the microchip 150 for preparating fine particles is provided with a particle preparative unit 157.
  • An enlarged view of the particle sorting unit 157 is shown in FIG.
  • the particle sorting unit 157 includes a connecting flow path 170 that connects the main flow path 155 and the recovery flow path 159.
  • a liquid supply flow path 161 capable of supplying a liquid to the connection flow path 170 is connected to the connection flow path 170.
  • the microchip 150 for sorting fine particles has a flow path structure including a main flow path 155, a recovery flow path 159, a connection flow path 170, and a liquid supply flow path 161.
  • the microchip 150 for collecting fine particles includes a part of the fine particle recovery device 100 including a light irradiation unit 101, a detection unit 102, and a control unit 103 in addition to the microchip.
  • the control unit 103 may include a signal processing unit 104, a determination unit 105, and a preparative control unit 106.
  • the flow step S101 for flowing the first liquid containing the fine particles into the main flow path 155 and the fine particles flowing through the main flow path 155 are It includes a determination step S102 for determining whether or not the particles are recovery target particles, and a recovery step S103 for recovering the recovery target particles into the recovery flow path 159. Each step will be described below.
  • the first liquid containing fine particles is passed through the main flow path 155.
  • the first liquid flows in the main flow path 155 from the merging portion 162 toward the particle sorting portion 157.
  • the first liquid may be a laminar flow formed from a sample liquid containing fine particles and a sheath liquid, and in particular, a laminar flow in which the sample liquid is surrounded by the sheath liquid may be used.
  • the flow path structure for forming the laminar flow will be described below.
  • the microchip 150 for collecting fine particles is provided with a sample liquid inlet 151 and a sheath liquid inlet 153. From these inlets, a sample liquid containing fine particles and a sheath liquid containing no fine particles are introduced into the sample liquid flow path 152 and the sheath liquid flow path 154, respectively.
  • the microchip 150 for collecting fine particles has a flow path structure in which the sample flow path 142 through which the sample liquid flows and the sheath liquid flow path 154 through which the sheath liquid flows merge at the confluence portion 162 to form a main flow path 155.
  • the sample liquid and the sheath liquid merge at the confluence 162 to form, for example, a laminar flow in which the sample liquid is surrounded by the sheath liquid.
  • the fine particles are arranged in a substantially row in the laminar flow. As described above, in the present technology, the laminar flow containing fine particles flowing in a substantially row is formed by the flow path structure.
  • the laminar flow flows through the main flow path 155 toward the particle sorting unit 157.
  • the fine particles flow in a row in the main flow path 155.
  • the determination step S102 it is determined whether the fine particles flowing through the main flow path 155 are the particles to be collected.
  • the determination can be made by the determination unit 105.
  • the determination unit 105 can make the determination based on the light generated by the light irradiation of the fine particles by the light irradiation unit 101. An example of the determination step S102 will be described in more detail below.
  • the light irradiation unit 101 irradiates the fine particles flowing through the main flow path 155 (particularly the detection region 156) in the microchip 150 for sorting fine particles with light (for example, excitation light), and irradiates the light.
  • the detection unit 102 detects the light generated by the above.
  • the determination unit 105 included in the control unit 103 determines whether the fine particles are the particles to be collected, according to the characteristics of the light detected by the detection unit 102. For example, the determination unit 105 may make a determination based on scattered light, a determination based on fluorescence, or a determination based on an image (for example, a dark-field image and / or a bright-field image).
  • the control unit 103 controls the flow in the microchip 150 for sorting fine particles, so that the particles to be recovered are recovered into the recovery flow path 159.
  • the light irradiation unit 101 irradiates the fine particles flowing in the flow path in the microchip 150 for sorting fine particles with light (for example, excitation light).
  • the light irradiation unit 101 may include a light source that emits light and an objective lens that collects excitation light for fine particles flowing in the detection region.
  • the light source may be appropriately selected by a person skilled in the art depending on the purpose of analysis, and may be, for example, a laser diode, an SHG laser, a solid-state laser, a gas laser, a high-intensity LED, or a halogen lamp, or two of them. The above combination may be used.
  • the light irradiation unit may include other optical elements, if necessary, in addition to the light source and the objective lens.
  • the detection unit 102 detects scattered light and / or fluorescence generated from the fine particles by light irradiation by the light irradiation unit 101.
  • the detection unit 102 may include a condenser lens and a detector that collect the fluorescence and / or scattered light generated from the fine particles.
  • the detector PMT, photodiode, CCD, CMOS and the like can be used, but the detector is not limited thereto.
  • the detection unit 102 may include other optical elements, if necessary, in addition to the condenser lens and the detector.
  • the detection unit 102 may further include, for example, a spectroscopic unit.
  • Examples of the optical component constituting the spectroscopic unit include a grating, a prism, and an optical filter.
  • the spectroscopic unit can detect, for example, light having a wavelength to be detected separately from light having another wavelength.
  • the detection unit 102 can convert the detected light into an analog electric signal by photoelectric conversion.
  • the detection unit 102 can further convert the analog electric signal into a digital electric signal by AD conversion.
  • the signal processing unit 104 included in the control unit 103 processes the waveform of the digital electric signal obtained by the detection unit 102 to generate information (data) regarding the characteristics of light used for the determination by the determination unit 105. sell.
  • the signal processing unit 104 may use one, two, or three of the width of the waveform, the height of the waveform, and the area of the waveform from the waveform of the digital electric signal. Can be obtained.
  • the information regarding the characteristics of the light may include, for example, the time when the light is detected.
  • the above processing by the signal processing unit 104 can be performed particularly in the embodiment in which the scattered light and / or fluorescence is detected.
  • the determination unit 105 included in the control unit 103 determines whether or not the fine particles are recovery target particles based on the light generated by irradiating the fine particles flowing in the flow path with light.
  • the waveform of the digital electrical signal obtained by the detection unit 102 is processed by the control unit 103, and based on the information regarding the characteristics of the light generated by the processing.
  • the determination unit 105 determines whether the fine particles are recovery target particles. For example, in the determination based on the scattered light, the characteristics of the outer shape and / or the internal structure of the fine particles may be specified, and it may be determined whether the fine particles are the particles to be recovered based on the characteristics.
  • pretreating fine particles such as cells in advance it is possible to determine whether the fine particles are recovery target particles based on the same characteristics as those used in flow cytometry. it can. Further, for example, by labeling fine particles such as cells with an antibody or a dye (particularly a fluorescent dye), it is determined whether or not the fine particles are recovery target particles based on the characteristics of the surface antigen of the fine particles. You can also do it.
  • the detection unit 102 may acquire a bright field image generated by light irradiation by the light irradiation unit 101.
  • the light irradiation unit 101 may include, for example, a halogen lamp
  • the detection unit 102 may include a CCD or CMOS.
  • the halogen lamp irradiates the fine particles with light
  • the CCD or CMOS can acquire a bright-field image of the irradiated fine particles.
  • the determination unit 105 included in the control unit 103 determines whether the fine particles are the particles to be recovered based on the acquired bright field image. For example, it can be determined whether a microparticle is a particle to be recovered based on a combination of one or more of the morphology, size, and color of the microparticles (particularly cells).
  • the detection unit 102 may acquire a dark field image generated by light irradiation by the light irradiation unit 101.
  • the light irradiation unit 101 may include, for example, a laser light source, and the detection unit 102 may include a CCD or CMOS.
  • the fine particles are irradiated with light by a laser, and a dark field image (for example, a fluorescent image) of the irradiated fine particles can be acquired by a CCD or CMOS.
  • the determination unit 105 included in the control unit 103 determines whether the fine particles are the particles to be recovered based on the acquired dark field image. For example, it can be determined whether a microparticle is a particle to be recovered based on a combination of one or more of the morphology, size, and color of the microparticles (particularly cells).
  • the detection unit 102 may be, for example, an image sensor in which a substrate incorporating a CMOS sensor and a substrate incorporating a DSP (Digital Signal Processor) are laminated.
  • the DSP of the image sensor By operating the DSP of the image sensor as a machine learning unit, the image sensor can operate as a so-called AI sensor.
  • the detection unit 102 including the image pickup device can determine whether or not the fine particles are recovery target particles, for example, based on a learning model.
  • the learning model may be updated in real time while the method according to the present technology is being performed.
  • the DSP may perform machine learning processing while resetting the pixel array unit in the CMOS sensor, exposing the pixel array unit, or reading a pixel signal from each unit pixel of the pixel array unit.
  • an image pickup device that operates as an AI sensor
  • the image pickup device described in International Publication No. 2018/051809 can be mentioned.
  • the AI sensor is used as an image sensor, the raw data acquired from the image array is learned as it is, so the speed of the preparative discrimination process is high.
  • the determination can be made, for example, by whether the information about the characteristics of the light meets a predetermined criterion.
  • the standard can be a standard indicating that the fine particles are the particles to be recovered.
  • the criteria may be appropriately set by one of ordinary skill in the art and may be criteria relating to light characteristics, such as those used in technical fields such as flow cytometry.
  • One light may be irradiated to one position in the detection area 156, or light may be irradiated to each of a plurality of positions in the detection area 156.
  • the microchip 150 may be configured such that light is applied to each of two different positions in the detection area 156 (ie, there are two positions in the detection area 156 that are irradiated with light). In this case, for example, it can be determined whether or not the fine particles are recovery target particles based on the light (for example, fluorescence and / or scattered light) generated by irradiating the fine particles at one position with light.
  • the velocity of the fine particles in the flow path is calculated based on the difference between the detection time of the light generated by the light irradiation at the one position and the detection time of the light generated by the light irradiation at the other position. You can also do it.
  • the distance between the two irradiation positions may be determined in advance, and the velocity of the fine particles can be determined based on the difference between the two detection times and the distance.
  • the arrival time at the particle sorting unit 157 described below can be accurately predicted. By accurately predicting the arrival time, the timing of formation of the flow entering the recovery flow path 159 can be optimized.
  • the difference between the arrival time of a certain fine particle to the particle preparative unit 157 and the arrival time of the fine particle before or after the certain fine particle to the particle preparative unit 157 is equal to or less than a predetermined threshold value. Can also determine that the certain fine particles are not recovered.
  • the distance between the certain fine particles and the fine particles before or after the fine particles is small, the possibility that the fine particles before or after the fine particles are collected together with the suction of the certain fine particles is increased. ..
  • Specific examples of a microchip in which light is irradiated to each of two different positions in the detection region 156 and a device including the microchip are described in, for example, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2014-202573.
  • control unit 103 may control the light irradiation by the light irradiation unit 101 and / or the light detection by the detection unit 102. Further, the control unit 103 can control the drive of the pump for supplying the fluid into the microchip 150 for sorting fine particles.
  • the control unit 103 may be composed of, for example, a hard disk, a CPU, and a memory in which a program and an OS for causing the fine particle recovery device to execute the fine particle recovery method according to the present technology are stored.
  • the function of the control unit 103 can be realized in a general-purpose computer.
  • the program may be recorded on a recording medium such as a microSD memory card, an SD memory card, or a flash memory.
  • the program recorded on the recording medium is read by a drive (not shown) provided in the fine particle recovery device 100, and the control unit 103 reads the program according to the read program. You may have 100 perform a fine particle recovery method according to the present technology.
  • the fine particles determined to be the recovery target particles in the determination step S102 are recovered into the recovery flow path 159.
  • the particles to be recovered are recovered in the second liquid which is immiscible with the first liquid in the recovery flow path while being contained in the first liquid.
  • an emulsion using the second liquid as a dispersion medium and the first liquid as a dispersoid can be formed in the recovery flow path 159, and one particle to be recovered is contained in each emulsion particle of the emulsion. include. Therefore, the emulsion is suitable for single cell analysis. The recovery process will be described in more detail below.
  • the recovery step S103 is performed in the particle sorting unit 157 in the microchip 150.
  • the particle sorting unit 157 In the particle sorting unit 157, the laminar flow that has flowed through the main flow path 155 separately flows into the two waste flow paths 158.
  • the particle sorting unit 157 shown in FIG. 1 has two waste flow paths 158, but the number of branch flow paths is not limited to two.
  • the particle sorting unit 157 may be provided with, for example, one or a plurality (for example, two, three, or four) branch flow paths.
  • the branch flow path may be configured to branch in a Y shape on one plane as shown in FIG. 1, or may be configured to branch three-dimensionally.
  • a flow is formed from the main flow path 155 to the recovery flow path 159 through the connection flow path 170 only when the recovery target particles flow, and the recovery target particles are inside the recovery flow path 159. Will be collected.
  • An enlarged view of the particle sorting unit 157 is shown in FIG.
  • the main flow path 155 and the recovery flow path 159 communicate with each other via a connection flow path 170 coaxial with the main flow path 155.
  • the particles to be collected flow through the connection flow path 170 to the recovery flow path 159. Fine particles that are not recovery target particles flow into the waste flow path 158 as shown in FIG. 3C.
  • FIGS. 6A and 6B Enlarged views of the vicinity of the connection flow path 170 are shown in FIGS. 6A and 6B.
  • FIG. 6A is a schematic perspective view of the vicinity of the connecting flow path 170.
  • FIG. 7B is a schematic cross-sectional view on a plane passing through the center line of the liquid supply flow path 161 and the center line of the connection flow path 170.
  • the connection flow path 170 includes a flow path 170a on the detection region 156 side (hereinafter, also referred to as an upstream side connection flow path 170a) and a flow path 170b on the recovery flow path 159 side (hereinafter, also referred to as a downstream side connection flow path 170b).
  • connection portion 170c between the connection flow path 170 and the liquid supply flow path 161 is included.
  • the liquid supply flow path 161 is provided so as to be substantially perpendicular to the axis of the flow path of the connection flow path 170.
  • the two liquid supply flow paths 161 are provided so as to face each other at substantially the center position of the connection flow path 170, but only one liquid supply flow path may be provided.
  • the shape and dimensions of the cross section of the upstream connecting flow path 170a may be the same as the shape and dimensions of the downstream connecting flow path 170b.
  • both the cross section of the upstream connecting flow path 120a and the cross section of the downstream connecting flow path 120b may be substantially circular with the same dimensions.
  • both of these two cross sections may be rectangles (eg, squares or rectangles) having the same dimensions.
  • the second liquid is supplied from the two liquid supply flow paths 161 to the connection flow path 170 as shown by the arrows in FIG. 6B.
  • the second liquid flows from the connection portion 170c to both the upstream side connection flow path 170a and the downstream side connection flow path 170b.
  • the second liquid flows as follows.
  • the second liquid that has flowed to the upstream connection flow path 170a exits from the connection surface of the connection flow path 170 with the main flow path 155, and then flows separately into the two waste flow paths 158.
  • the first liquid and fine particles that do not need to be collected into the recovery flow path 159 enter the recovery flow path 159 through the connection flow path 170. You can prevent that.
  • the second liquid that has flowed into the downstream connection flow path 170b flows into the recovery flow path 159.
  • the inside of the recovery flow path 159 is filled with the second liquid, and the second liquid becomes, for example, a dispersion medium for forming an emulsion.
  • the second liquid can be supplied from the two liquid supply flow paths 161 to the connection flow path 170.
  • a flow flowing from the main flow path 155 to the recovery flow path 159 through the connection flow path 170 is formed.
  • a flow is formed from the main flow path 155 through the upstream side connection flow path 170a, the connection portion 170c, and the downstream side connection flow path 170b in this order to the recovery flow path 159.
  • the particles to be recovered are recovered in the second liquid in the recovery flow path 159 in a state of being wrapped in the first liquid.
  • an emulsion can be formed in the recovery flow path 159 or in a container connected to the recovery flow path end 163, for example, via a flow path.
  • connection flow path 180 includes a flow path 180a on the detection region 156 side (hereinafter, also referred to as an upstream connection flow path 180a) and a flow path 180b on the recovery flow path 159 side (hereinafter, downstream). It also includes a side connection flow path 180b) and a connection portion 180c between the connection flow path 180 and the liquid supply flow path 161.
  • Both the cross section of the upstream side connecting flow path 180a and the cross section of the downstream side connecting flow path 180b have a substantially circular shape, but the diameter of the latter cross section is larger than the diameter of the former cross section.
  • the area of the latter cross section is made larger than the area of the former cross section.
  • the particles to be recovered are recovered into the recovery flow path through the connection flow path due to the pressure fluctuation in the recovery flow path 159.
  • the recovery may be performed, for example, by generating a negative pressure in the recovery flow path 159 as described above.
  • the negative pressure can be generated by, for example, an actuator 107 (particularly a piezo actuator) attached to the outside of the microchip 150 deforming the wall defining the recovery flow path 159.
  • the negative pressure can form the flow into the recovery channel 159.
  • the actuator 107 can be attached to the outside of the microchip 150 so that the wall of the recovery flow path 159 can be deformed.
  • the actuator 107 can be, for example, a piezo actuator.
  • the sample liquid constituting the laminar flow or the sample liquid and the sheath liquid constituting the laminar flow can also flow into the recovery flow path 159. In this way, the particles to be recovered are sorted by the particle sorting unit 157 and recovered into the recovery flow path 159.
  • the particles to be recovered are collected in the second liquid which is immiscible with the first liquid in the recovery flow path 159 in a state of being wrapped in the first liquid.
  • an emulsion having the second liquid as a dispersion medium and the first liquid as a dispersoid is formed in the recovery flow path 159.
  • connection flow path 170 is provided with a liquid supply flow path 161 in order to prevent fine particles that are not recovery target particles from entering the recovery flow path 159 through the connection flow path 170.
  • a second liquid immiscible with the liquid (sample liquid and sheath liquid) flowing through the main flow path 155 is introduced into the connection flow path 170 from the liquid supply flow path 161.
  • a part of the second liquid introduced into the connecting flow path 170 forms a flow from the connecting flow path 170 to the main flow path 155, thereby preventing fine particles other than the particles to be collected from entering the recovery flow path 159. It comes off.
  • the second liquid formed by the flow from the connecting flow path 170 to the main flow path 155 is the first liquid that does not flow in the main flow path 155 due to the flow of the first liquid flowing through the main flow path 155 to the waste flow path 158. It flows through the waste flow path 158 in the same manner as above. The rest of the second liquid introduced into the connection flow path 170 flows into the recovery flow path 159. As a result, the inside of the recovery flow path 159 can be filled with the second liquid.
  • the recovery flow path 159 may be filled with a second liquid that is immiscible with the first liquid.
  • the second liquid can be supplied from the liquid supply flow path 161 to the connection flow path 170 in order to fill the inside of the recovery flow path 159 with the second liquid.
  • the second liquid flows from the connecting flow path 170 to the recovery flow path 159, whereby the inside of the recovery flow path 159 can be filled with the second liquid.
  • the laminar flow flowing into the waste flow path 158 can be discharged to the outside of the microchip at the end 160 of the waste flow path. Further, the particles to be recovered collected in the recovery flow path 159 can be discharged to the outside of the microchip at the end of the recovery flow path 161.
  • a container 171 can be connected to the recovery flow path end 163 via a flow path such as a tube 172, for example, as shown in FIG.
  • a flow path such as a tube 172
  • the fine particle recovery device 100 may include a flow path for recovering the emulsion containing the recovery target particles in the container.
  • a plurality of emulsion particles can be held in the recovery flow path 159. After the recovery operation is completed, an assay such as single cell analysis can be continuously performed in the recovery channel 159.
  • the main flow path may branch to the connection flow path and the at least one disposal flow path.
  • the at least one waste channel is a channel through which fine particles other than the particles to be collected flow.
  • the main flow path, the connection flow path, and the recovery flow path may be linearly arranged. ..
  • the connection flow path and the recovery flow path are arranged at an angle with respect to the main flow path, for example.
  • the recovery process can be performed more efficiently. For example, the amount of suction required to guide the particles to be collected to the connecting flow path can be reduced.
  • the fine particles are arranged substantially in a line in the main flow path and flow toward the connection flow path. Therefore, the suction amount in the recovery step can be reduced.
  • the liquid supply flow path supplies a liquid (particularly a second liquid) to the connection flow path.
  • a flow is formed in the connection flow path from the connection position between the liquid supply flow path and the connection flow path toward the main flow path, and the liquid flowing through the main flow path reaches the connection flow path. It is possible to prevent fine particles other than the particles to be collected from flowing into the recovery flow path through the connection flow path.
  • the recovery step is performed, as described above, for example, due to the negative pressure generated in the recovery flow path, the first liquid containing one recovery target particle passes through the connection flow path and the recovery flow. Recovered in the second liquid of the road. As a result, emulsion particles containing one recovery target particle are formed in the second liquid.
  • the fine particles determined to be the particles to be collected in the determination step are recovered by, for example, driving the piezo actuator at an appropriate timing (for example, when the particle sorting unit 157 is reached).
  • the hydrophilic solution containing the target particles is recovered in the recovery flow path 159 to form emulsion particles.
  • a peak signal and an area signal are used to determine whether the particles are to be recovered, so that the particles are one fine particle (singlet) or two fine particles are combined (doublet). It is also possible to determine whether it is a triplet of three fine particles. Therefore, it is possible to avoid the formation of emulsion particles containing two or more fine particles in one emulsion particle.
  • emulsion particles containing one fine particle can be formed with high probability and high efficiency. Further, since it is possible to avoid the formation of emulsion particles containing those in which two or more fine particles are bonded in this way, for example, a cell sorter or the like is used to bond two or more fine particles before the emulsion formation operation. The operation of removing an object can be omitted. On the contrary, it is possible to determine the characteristics of each of the two or more fine particles that are close enough to be drawn into the connecting flow path at the same time by one recovery operation. For example, two microparticles having the same characteristics can be confined in one emulsion particle, or a combination of microparticles having different specified characteristics can be confined in one emulsion particle.
  • emulsion particles containing one fine particle were formed as follows.
  • the operation for forming the emulsion particles will be described with reference to FIG.
  • a piezo element (piezo actuator) is connected to the microchip 150 for collecting fine particles so that the volume in the recovery flow path 159 can be varied, and is connected to the outer surface of the microchip (particularly, in the recovery flow path 159). It was attached to the outer surface corresponding to the bulging portion near the connecting portion with the flow path 170).
  • a hydrophilic sample liquid containing beads having a diameter of 10 ⁇ m was introduced from the sample liquid inlet 151 into the sample liquid flow path 152, and the hydrophilic sheath liquid was introduced from the sheath liquid inlet 153 into the sheath liquid flow path 154.
  • the introduced hydrophilic sample liquid and the hydrophilic sheath liquid merged at the confluence 162, and a laminar flow was formed in which the hydrophilic sample liquid was surrounded by the hydrophilic sheath liquid.
  • the laminar flow contained beads that were approximately aligned in a row, and the laminar flow flowed through the main flow path 155 toward the connecting flow path 170.
  • a hydrophobic liquid was supplied from the liquid supply flow path 161 to the connection flow path 170.
  • the recovery channel 159 was filled with the hydrophobic liquid.
  • the beads pass through the irradiation position of the laser beam irradiating the detection region 156 of the main flow path 155, the beads are irradiated with the laser beam to generate light. The generated light was detected, and it was determined whether to collect each bead based on the characteristics of the detected light.
  • the piezo element is driven at the timing when the beads determined to be collected reach the vicinity of the connection flow path 170, and the lumen of the recovery flow path 159 is deformed, whereby the beads are collected through the connection flow path 170. It was recovered into Road 159.
  • the operation for the recovery was as follows: (i) deforming the recovery flow path 159 over 10 ⁇ s to apply negative pressure into the recovery flow path 159, (ii) after the deformation for 10 ⁇ s. The state is maintained, and (iii) takes 10 ⁇ s to release the negative pressure and restore the deformation.
  • an emulsion containing emulsion particles containing one bead in the hydrophobic liquid was formed in the recovery flow path 159.
  • the emulsion used the hydrophobic liquid as a dispersion medium and emulsion particles containing the hydrophilic liquid as a dispersoid.
  • FIG. 8A is a photograph showing a state in which beads (indicated by white arrows) are flowing toward the connection flow path 170.
  • the hydrophilic liquid flows through the main flow path 155 toward the particle sorting portion 157, and then to the two waste flow paths 158 branching from the main flow path 155 without flowing to the connection flow path 170. Flowing.
  • the hydrophobic liquid is supplied from the liquid supply flow path 161 to the connection flow path 170 and flows to both the main flow path 155 and the recovery flow path 159.
  • the hydrophobic liquid flows separately into the two waste flow paths 158 by the flow of the hydrophilic liquid (in FIG. 8A). It flows along the wall of the waste flow path 158 in the vicinity indicated by a).
  • FIG. 8A (b) is a photograph of the beads as they approach the connecting flow path. At this point, the operation for collecting beads is started. That is, by driving the piezo element, the deformation of the cavity of the recovery flow path 159 is started.
  • FIG. 8A (c) is a photograph showing a state in which the hydrophilic liquid is advancing into the recovery flow path 159. From the photograph, it can be seen that at the time of FIG. 8C, the beads are surrounded by the hydrophilic liquid, and the hydrophilic liquid is further surrounded by the hydrophobic liquid. That is, emulsion particles P containing one bead are formed.
  • FIG. 8A (d) is a photograph immediately before the emulsion particles P enter the recovery flow path 159 from the connection flow path 170.
  • FIG. 8A (e) is a photograph immediately after the emulsion particles P have entered the recovery flow path 159. It can be confirmed that one bead is contained in the emulsion particle P.
  • FIG. 8A (f) is a photograph showing that the emulsion particles P flowed further downstream in the ocean current flow path 159. As described above, emulsion particles containing one bead were formed by the method according to the present technology.
  • the size of the emulsion particles can be adjusted by controlling the time and the amount of deformation of each of the above operations (i) to (iii). That is, the size of the emulsion particles in the recovery flow path can be controlled by the flow path volume in which the recovery flow path is deformed and expanded. Therefore, it can be easily controlled by the amount of deformation of the piezo element, that is, the electrical drive waveform of the piezo element. For example, by increasing the amount of deformation of the recovery flow path lumen by the piezo element, the amount of the hydrophilic liquid sucked into the recovery flow path 159 increases, and thus the size of the emulsion particles can be increased.
  • FIG. 8B is a photograph showing the size of emulsion particles when the holding time of (ii) is 10 ⁇ sec, 15 ⁇ sec, 25 ⁇ sec, and 35 ⁇ sec. From this photograph, it can be seen that the size of the emulsion particles can be adjusted by changing the holding time of (ii) above. Further, the drawing of the emulsion particles can be adjusted by adjusting the volume of the connection flow path 170 (particularly, each of the upstream side connection flow path 170a, the connection portion 170c, and the downstream side connection flow path 170b).
  • a valve is provided in the connection flow path to prevent the first liquid from advancing into the recovery flow path. You can. Only when the recovery step is performed can the valve be released and the first liquid flow through the connecting flow path into the recovery flow path.
  • the fine particle recovery method of the present technology may further include other steps in addition to the flow flow step, the determination step, and the recovery step described above. Examples of the other steps will be described below.
  • the microparticles are cells or cell clusters
  • the first liquid is a culture solution of the microparticles.
  • an emulsion can be formed in which the culture solution is a dispersoid and a second liquid that is immiscible with the culture solution is used as a dispersion medium.
  • One cell or cell mass may be contained in each emulsion particle formed by the dispersoid. Thereby, one cell or cell mass can be cultured in each emulsion particle.
  • the microparticle recovery method further cultivates the recovery target particles (that is, cells or cell clusters) recovered in the recovery step in the emulsion particles formed from the culture solution. May include steps.
  • the type of culture medium can be appropriately selected by those skilled in the art depending on the cells to be cultured. This embodiment is suitable, for example, when it is required to culture each cell or cell mass separately in single cell analysis.
  • the microparticles are cells, cell clusters, or synthetic particles, and the microparticles can be destroyed after the recovery step.
  • an emulsion is formed by the recovery step, and each cell, cell mass, or synthetic particle in the emulsion particles constituting the emulsion can be destroyed.
  • the method for recovering fine particles of the present technology may include a breaking step of destroying the recovered fine particles after the recovery step. Particles other than cells, cell clumps, and synthetic particles may be destroyed according to other preferred embodiments of the art. That is, the method for recovering fine particles of the present technology may include a breaking step of destroying the recovered target particles after the recovery step.
  • the destruction can preferably be carried out while maintaining the emulsion particles.
  • a cell component for example, an intracellular component, a cell membrane component, a cell wall component, etc.
  • a component contained in synthetic particles is released into the emulsion particles, and the cell component or the component is separated from the components of other fine particles. It can be processed separately.
  • the treatment can be, for example, analysis, separation, or amplification of the cellular component or component.
  • the cell component or the component include, but are not limited to, DNA, RNA, protein, peptide, amino acid, lipid, saccharide, or organelle.
  • a sample for DNA barcoding can be prepared by the disruption step or by further processing the emulsion particles obtained by the disruption step. it can.
  • the detection or analysis of the component contained in the recovery target particle, or the reaction between the component contained in the recovery target particle and another component may be performed.
  • Emulsion particles formed according to, for example, the present technology can be merged with other emulsion particles to carry out the detection or the reaction.
  • the detection or analysis of the component contained in the recovery target particle, or the reaction between the component and another component can be performed in the emulsion particle after the merging.
  • the merge enables, for example, Cellular Indexing of Transcriptomes and Epitopes by Sequencing (also referred to as CITE-seq).
  • the particle to be collected is a cell to which an antibody to which an oligo barcode having a poly-A sequence is bound is bound.
  • emulsion particles containing the cells are formed.
  • the emulsion particles are then merged with the emulsion particles containing beads or gels having a barcode arrangement.
  • the cell surface protein or intracellular mRNA of the cell can be detected.
  • the emulsified cells or cell mass (for example, spheroids or organoids) may be reacted with the drug. This makes it possible to detect or analyze the response of the cell or cell mass to the drug.
  • biomolecules may be detected in the detection. Detection of biomolecules can be performed, for example, by wash free assay. In the wash free assay, for example, the LOCI, FRET, BRET, or FlimPIA methods can be used.
  • the chemical substance can be synthesized by the particles to be recovered after the recovery step.
  • the synthesis may be carried out within the emulsion particles formed in the recovery step.
  • a cell-free expression reagent for example, linear DNA and E.I. Colli S30 Extract system for linear DNA (promega) can be mentioned.
  • protein synthesis by a cell-free protein synthesis system may be performed in the emulsion particles.
  • the microparticle sorting mechanism used in the microparticle sorting method of the present technology may be a structure or device having the flow path structure described above, for example, a chip having a microchannel, and particularly fine particles. It may be a preparative microchip.
  • micro means that at least a part of the flow path included in the microchip for microparticle sorting has a dimension of ⁇ m order, particularly a cross-sectional dimension of ⁇ m order. .. That is, in the present technology, the “microchip” refers to a chip including a flow path on the order of ⁇ m, particularly a chip including a flow path having a cross-sectional dimension on the order of ⁇ m.
  • a chip including a particle sorting portion composed of a flow path having a cross-sectional dimension of ⁇ m order can be called a microchip according to the present technology.
  • the cross section of the main flow path 155 is, for example, a rectangle, and the width of the main flow path 155 is, for example, 100 ⁇ m to 500 ⁇ m, and particularly 100 ⁇ m to 300 ⁇ m in the particle sorting section 157. sell.
  • the width of the branch flow path branching from the main flow path 155 may be smaller than the width of the main flow path 155.
  • the cross section of the connecting flow path 170 is, for example, circular, and the diameter of the connecting flow path 170 at the connection portion between the connecting flow path 170 and the main flow path 155 can be, for example, 10 ⁇ m to 60 ⁇ m, particularly 20 ⁇ m to 50 ⁇ m. These dimensions with respect to the flow path may be appropriately changed depending on the size of the fine particles, particularly the size of the particles to be collected.
  • the microchip 150 for preparative fine particles can be manufactured by a method known in the art.
  • the bioparticle preparative microchip 150 can be manufactured by laminating two or more substrates on which a predetermined flow path is formed.
  • the flow path may be formed on all of, for example, two or more substrates (particularly two substrates), or a part of two or more substrates (particularly two substrates). It may be formed only on one sheet). It is preferable that the flow path is formed on only one substrate in order to make it easier to adjust the position when the substrates are bonded.
  • a material for forming the microchip 150 for preparative fine particles a material known in the art can be used. Examples include, but are not limited to, polycarbonate, cycloolefin polymers, polypropylene, PDMS (polydimethylsiloxane), polymethylmethacrylate (PMMA), polyethylene, polystyrene, glass, and silicon.
  • polymer materials such as polycarbonate, cycloolefin polymer, and polypropylene are particularly preferable because they are excellent in processability and can be inexpensively manufactured using a molding apparatus.
  • the microchip 150 for sorting fine particles is preferably transparent.
  • the microchip 150 for preparative fine particles at least a portion through which light (laser light and scattered light) passes is transparent, for example, a detection region may be transparent.
  • the entire microchip 150 for sorting fine particles may be transparent.
  • the flow path group is not formed on the microchip 150.
  • the flow path group may be formed in a substrate such as plastic or glass.
  • the flow path group may have a two-dimensional or three-dimensional structure.
  • the fine particles may be particles having dimensions capable of flowing in the flow path in the fine particle sorting mechanism (for example, a microchip for fine particle sorting).
  • fine particles may be appropriately selected by those skilled in the art.
  • the fine particles include biological fine particles such as cells, cell clumps, microorganisms, and liposomes, and synthetic fine particles such as gel particles, beads, latex particles, polymer particles, and industrial particles.
  • biological microparticles also called biological particles
  • Cells can include animal cells (such as blood cell lineage cells) and plant cells.
  • the cells can be blood-based cells or tissue-based cells in particular.
  • the blood line cell may be a floating line cell such as T cell and B cell.
  • the tissue-based cells may be, for example, adherent cultured cells or adherent cells separated from the tissue.
  • Cell clusters can include, for example, spheroids and organoids.
  • Microorganisms may include bacteria such as Escherichia coli, viruses such as tobacco mosaic virus, and fungi such as yeast.
  • biological microparticles can also include biological macromolecules such as nucleic acids, proteins, and complexes thereof. These biological macromolecules may be, for example, those extracted from cells or may be contained in blood samples or other liquid samples.
  • Synthetic fine particles can be fine particles made of, for example, an organic or inorganic polymer material or a metal.
  • Organic polymer materials may include polystyrene, styrene / divinylbenzene, polymethylmethacrylate and the like.
  • Inorganic polymer materials may include glass, silica, magnetic materials and the like.
  • the metal may include colloidal gold, aluminum and the like.
  • the synthetic microparticles may be, for example, gel particles or beads, and more particularly gel particles or beads to which one or more combinations selected from oligonucleotides, peptides, proteins, and enzymes are bound. You can.
  • the shape of the fine particles may be spherical, substantially spherical, or non-spherical.
  • the size and mass of the fine particles can be appropriately selected by those skilled in the art depending on the size of the flow path of the microchip.
  • the size of the flow path of the microchip can also be appropriately selected depending on the size and mass of the fine particles.
  • the microparticles may be optionally attached with chemical or biological labels such as fluorescent dyes or fluorescent proteins.
  • the label may facilitate the detection of the microparticles.
  • the sign to be attached can be appropriately selected by those skilled in the art.
  • Molecules that specifically react with microparticles eg, antibodies, aptamers, DNA, or RNA, etc.
  • the microparticles can be biological particles, especially cells.
  • the fine particles recovered in the recovery flow path may be subjected to a further fine particle preparative treatment.
  • the further fine particle sorting treatment may be performed using, for example, the microparticle sorting microchip 150 described above, or may be carried out using another microparticle sorting microchip. ..
  • any one or a combination of two or more of the steps described in the above (2-1) to (2-4) may be performed.
  • the determination step described in (2-2) above is performed in the further fine particle preparative treatment, in order to recover the emulsion particles containing the fine particles, the determination for the fine particles is performed in the determination step.
  • the determination may be made for the emulsion particles, or the determination for both the fine particles and the emulsion particles may be made. In this way, even in the further fine particle preparative treatment, it may be determined whether the fine particles or the emulsion particles are to be recovered based on the information obtained from the fine particles and / or the emulsion particles. Further, in the further fine particle preparative treatment, an emulsion containing fine particle-containing emulsion particles may be subjected to the preparative treatment.
  • the connecting flow path and the collecting flow path do not have to be linearly aligned with the main flow path.
  • An example of a microchip for separating fine particles in this embodiment will be described below with reference to FIG.
  • FIG. 9 shows a schematic diagram of a detection region and a region including the particle sorting portion of the microchip for microparticle sorting according to the present technology.
  • the sample liquid flow path 352 and the sheath liquid flow path 354 meet at the confluence portion 362, similarly to the microparticle sorting microchip 150 described with reference to FIG. It has a flow path structure in which a detection region 356 is provided in the main flow path 355 and becomes a main flow path 355. A laminar flow in which the sample liquid containing the fine particles P is surrounded by the sheath liquid flows through the main flow path 355.
  • the microchip 350 for collecting fine particles includes a recovery flow path 359 in which particles to be collected are collected, a connection flow path 370 connecting the main flow path 355 and the recovery flow path 359, and a connection flow. Includes a liquid supply flow path 361 connected to the path 370 so that the liquid can be supplied.
  • the main flow path 355 further includes a waste flow path 358 through which fine particles that are not recovery target particles flow.
  • a waste flow path 358 through which fine particles that are not recovery target particles flow.
  • two waste flow paths 158 are branched from the main flow path 155, and the connection flow path 170, the recovery flow path 159, and the main flow path 155. They are lined up in a straight line.
  • the main flow path 355 and the disposal flow path 358 are linearly arranged, and the connection flow path 370 and the recovery flow path 359 branch from the main flow path 355. It has a flow path structure.
  • connection flow path and the recovery flow path do not have to be linearly aligned with the main flow path.
  • the main flow path and the waste flow path may be linearly arranged, and the connection flow path and the recovery flow path may have a flow path structure in which the main flow path branches from the main flow path.
  • the microchip for collecting fine particles includes a main flow path through which the fine particles are passed, a recovery flow path in which the particles to be collected are collected among the fine particles, and the main flow path. It may include one or more flow path structures including a connection flow path connecting the recovery flow path and a liquid supply flow path connected to the connection flow path so that liquid can be supplied to the connection flow path.
  • the microchip for fine particle sorting described with reference to FIG. 1 above has one of the flow path structures.
  • the microchip for collecting fine particles used in the fine particle recovery method of the present technology has two or more of the flow path structures. May be good.
  • FIG. 10 shows a schematic diagram of a detection region and a region including the particle sorting portion of the microchip for microparticle sorting according to the present technology.
  • the sample liquid flow path 452 and the sheath liquid flow path 454 meet at the confluence portion 462, similarly to the microparticle sorting microchip 150 described with reference to FIG. It has a flow path structure in which a detection region 456 is provided in the main flow path 455 to form a main flow path 455. A laminar flow in which the sample liquid containing the fine particles P is surrounded by the sheath liquid flows through the main flow path 455.
  • the microchip 450 for collecting fine particles in addition to the main flow path 455, the recovery flow path 459-1 in which the particles to be collected are collected, and the connection flow path 470 connecting the main flow path 455 and the recovery flow path 459-1. -1, and a liquid supply flow path 461-1 connected so as to be able to supply liquid to the connection flow path 470-1.
  • the microchip 450 for collecting fine particles is further connected to a recovery flow path 459-2 in which the particles to be collected are collected, and a connection flow path 470-2 connecting the main flow path 455 and the recovery flow path 459-2. Includes a liquid supply flow path 461-2 connected to the flow path 470-2 so that the liquid can be supplied.
  • the microchip 450 for sorting fine particles has two of the flow path structures.
  • the main flow path 455 is shared by these two flow path structures.
  • the connection flow path 470-1 is connected to the main flow path 455 downstream of the connection flow path 470-2.
  • the microchip 450 for preparative fine particles can form, for example, two emulsions containing different particles to be collected.
  • the determination step it is determined whether the fine particles are, for example, either of the two types of recovery target particles A and B, or neither of the two types of recovery target particles.
  • the criteria for belonging to the particles A or B to be recovered may be appropriately selected by the user.
  • the fine particles are the recovery target particles A
  • the fine particles are recovered to the recovery flow path 459-1 through the connection flow path 470-1.
  • the fine particles, which are the particles A to be recovered are recovered in the second liquid in the recovery flow path 459-1 in a state of being contained in the first liquid.
  • the fine particles are the recovery target particles B
  • the fine particles are recovered to the recovery flow path 459-2 through the connection flow path 470-2.
  • the fine particles which are the particles B to be recovered, are recovered in the second liquid in the recovery flow path 459-2 in a state of being contained in the first liquid.
  • the fine particles if the fine particles are neither the recovery target particles A nor B, the fine particles flow into the waste flow path 458. As described above, an emulsion containing the recovery target particles A and an emulsion containing the recovery target particles B are formed.
  • FIG. 11 shows a schematic diagram of a detection region and a region including the particle sorting portion of the microchip for microparticle sorting according to the present technology.
  • the microchip 450 for fine particle sorting described with reference to FIG. 10 and the two connecting flow paths 570-1 and 570-2 are the main flow paths 555. It is the same as the microchip 450 for microparticle sorting described with reference to FIG. 10, except that it is connected at the same position. That is, the microchip 550 for sorting fine particles has two of the flow path structures, and the main flow path 555 is shared by these two flow path structures.
  • the microchip 550 for preparative fine particles can also form two emulsions containing different particles to be collected. Also in this case, in the determination step, it is determined whether the fine particles are, for example, either of the two types of recovery target particles A and B, or neither of the two types of recovery target particles. The criteria for belonging to the particles A or B to be recovered may be appropriately selected by the user.
  • the fine particles are the recovery target particles A
  • the fine particles are recovered to the recovery flow path 559-1 through the connection flow path 570-1.
  • the fine particles, which are the particles A to be recovered are recovered in the second liquid in the recovery flow path 559-1 in a state of being contained in the first liquid.
  • the fine particles are the recovery target particles B
  • the fine particles are recovered to the recovery flow path 559-2 through the connection flow path 570-2.
  • the fine particles which are the particles B to be recovered, are recovered in the second liquid in the recovery flow path 559-2 in a state of being contained in the first liquid.
  • the fine particles if the fine particles are neither the recovery target particles A nor B, the fine particles flow into the waste flow path 558. As described above, an emulsion containing the recovery target particles A and an emulsion containing the recovery target particles B are formed.
  • a microchip for preparating fine particles having a flow path structure including a liquid supply flow path that is connected so that liquid can be supplied to the connection flow path.
  • the main flow path in the microchip has a determination region used for determining whether the fine particles flowing in the first liquid are recovery target particles, and is determined to be recovery target particles.
  • the fine particles are collected in the second liquid which is immiscible with the first liquid in the recovery flow path while being contained in the first liquid.
  • the microchip for sorting fine particles is described in 1. above. It is the same as the microchip for separating fine particles described in the above, and the description also applies to this embodiment.
  • the first liquid supply unit, the second liquid supply unit that supplies the second liquid that is immiscible with the first liquid to the liquid supply flow path, and the fine particles flowing in the main flow path are the particles to be collected.
  • a fine particle recovery device including a determination unit for determining the presence or absence is also provided.
  • the fine particle recovery device is described in the above 1. It is the same as the fine particle recovery device described in the above, and the description thereof also applies to the present embodiment.
  • the microchip for sorting fine particles also has the above 1. It is the same as the microchip for separating fine particles described in the above, and the description also applies to this embodiment.
  • the first liquid supply unit is, for example, the above 1. It may be at least one component for forming the laminar flow described in (2), and may include, for example, a sample liquid flow path 152 and a sheath liquid flow path 154. Further, the first liquid supply unit is connected to a flow path (for example, a tube) and the flow path connected to the sample liquid inlet 151 and the sheath liquid inlet 153 to introduce the sample liquid and the sheath liquid, respectively. It may also include a connected sample liquid-containing container and sheath liquid-containing container.
  • the second liquid supply unit is, for example, the above 1.
  • It may be at least one component for supplying the second liquid to the liquid supply flow path 161 described in (2), and for example, a container for containing the second liquid to be supplied to the liquid supply flow path 161 and a container.
  • a flow path connecting the container and the liquid supply flow path (for example, a tube connecting the chip and the container) may be included.
  • the determination unit is based on the above 1. It is the same as the determination unit described in the above, and the description also applies to the present embodiment.
  • the microchip for collecting fine particles may be removable from the fine particle recovery device. Since the microchip for fine particle sorting can be removed from the device, a new microchip for fine particle sorting can be used for each sample, thereby preventing contamination between samples. it can.
  • the present technology also provides a method for producing an emulsion, which comprises the flow-through step, the determination step, and the recovery step described in the above "1.
  • First embodiment fine particle recovery method
  • the manufacturing method may include the other steps described in the above “(2-4) Other steps”.
  • First embodiment microwave recovery method
  • First embodiment also applies to the emulsion production method of the present technology.
  • the emulsion production method of the present technology it is possible to produce an emulsion containing emulsion particles containing one fine particle (particularly the particle to be recovered) in a high content ratio.
  • the ratio of the number of emulsion particles containing one fine particle is, for example, 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, and further more than the total number of emulsion particles.
  • Emulsions that are preferably 95% or more can be produced.
  • the production method of the present technology is extremely useful for the single cell analysis because it can produce an emulsion having a high proportion of emulsion particles containing one fine particle.
  • the present technology also provides an emulsion containing fine particle-containing emulsion particles in which the ratio of the number of emulsion particles containing one fine particle is 70% or more with respect to the total number of emulsion particles.
  • the ratio is preferably 80% or more, more preferably 90% or more, and even more preferably 95% or more. Since the emulsion of the present technology contains emulsion particles containing one fine particle in such a high content ratio, it is suitable for, for example, single cell analysis.
  • the emulsion particles containing the one fine particle can be formed as described in the above "1.
  • First embodiment fine particle recovery method
  • the emulsion can be produced, for example, as described in "1.
  • Fourth embodiment emulsion production method
  • the emulsion may be, for example, an emulsion in which the second liquid is used as a dispersion medium and the first liquid is used as a dispersoid.
  • the description in the above “1. First embodiment (microparticle recovery method)” applies to these liquids.
  • the description in the above “1. First embodiment (microparticle recovery method)” also applies to the fine particles contained in the emulsion particles, and the fine particles may be, for example, cells, cell clusters, synthetic particles, or the like. ..
  • the present technology can also have the following configuration.
  • Fine particle recovery method [2] The method according to [1], wherein an emulsion having the second liquid as a dispersion medium and the first liquid as a dispersoid is formed in the recovery flow path by carrying out the fine particle recovery method. Fine particle recovery method.
  • an emulsion is formed by carrying out the fine particle recovery method, and at least a part of the droplets constituting the emulsion contains one of the recovery target particles.
  • the method for recovering fine particles according to the above method [4] The method for recovering fine particles according to any one of [1] to [3], wherein the first liquid is hydrophilic and the second liquid is hydrophobic. [5] The method for recovering fine particles according to any one of [1] to [4], wherein the kinematic viscosity of the second liquid is 1/100 to 100 times the kinematic viscosity of the first liquid.
  • the determination step light is irradiated to the fine particles flowing in the main flow path, and it is determined whether the fine particles are recovery target particles based on the light generated by the irradiation.
  • the main flow path has a determination region used for determining whether the fine particles flowing in the first liquid are recovery target particles.
  • the fine particles determined to be the particles to be recovered are recovered in the second liquid, which is immiscible with the first liquid, in the recovery flow path while being contained in the first liquid.
  • Microchip for fine particle sorting are used for fine particle sorting.
  • a method for producing an emulsion containing fine particle-containing emulsion particles [22] An emulsion containing fine particle-containing emulsion particles, wherein the ratio of the number of emulsion particles containing one fine particle is 70% or more with respect to the total number of emulsion particles.
  • Microparticle recovery device 150 Microchip for fine particle sorting 155 Main flow path 159 Recovery flow path 161 Liquid supply flow path 170 Connection flow path

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Abstract

１つの微小粒子を含むエマルション粒子をより効率的に生成するための新たな手法を提供すること。　本技術は、微小粒子が通流される主流路と、前記微小粒子のうち、回収対象粒子が回収される回収流路と、前記主流路と前記回収流路とを接続する接続流路と、前記接続流路に液体を供給可能に接続されている液体供給流路と、を含む流路構造を有する微小粒子分取機構において、微小粒子を含む第一液体を前記主流路に流す通流工程と、前記主流路を流れる微小粒子が回収対象粒子であるかを判定する判定工程と、回収対象粒子を前記回収流路内へと回収する回収工程とを含み、且つ、前記回収工程において、前記回収対象粒子は、前記第一液体に含まれた状態で、前記回収流路内の、前記第一液体と非混和性である第二液体中に回収される、微小粒子回収方法を提供する。

Description

微小粒子回収方法、微小粒子分取用マイクロチップ、微小粒子回収装置、エマルションの製造方法、及びエマルション
　本技術は、微小粒子回収方法、微小粒子分取用マイクロチップ、微小粒子回収装置、エマルションの製造方法、及びエマルションに関する。より詳細には、本技術は、エマルション内に微小粒子を回収するための微小粒子回収方法、微小粒子分取用マイクロチップ、及び微小粒子回収装置、当該回収方法において行われる工程を含むエマルション製造方法、並びにエマルションに関する。
　単一細胞解析（Single cell analysis）を行うために、各エマルション粒子中に一つの細胞を含むエマルションを用いることが検討されている。このようなエマルションを形成するための技術がこれまでにいくつか開発されてきている。
　例えば、下記非特許文献１には、ランダムに粒子をエマルション内に捕獲する方法が記載されている。この方法では、１つのエマルションが１つの細胞を含むようにするために、細胞を含む溶液を～１００ｃｅｌｌｓ／μｌ以下に希釈している。この方法において、１つの細胞を含むエマルション粒子が生成される効率はポアソン分布に従うため、空のエマルション粒子（細胞を含まないエマルション粒子）の割合が高く、非効率である。そこで、下記非特許文献１には、空のエマルション粒子に対する細胞含有エマルション粒子の割合を高めるために、例えば電場、誘電泳動、又は局所加熱などにより粒子又は流体を制御してエマルションをソーティングすることが提案されている。また、生成されるエマルション中の１細胞含有エマルション粒子の割合を高めるために、例えば下記非特許文献１に記載されるとおり、細胞により誘発されるプラトー－レイリー不安定性を利用すること、又は、高密度懸濁物がマイクロチャネルを素早く通過させられるときに生じる自己組織化を利用することが提案されている。
Agata Rakszewska et al., One drop at a time: toward droplet microfluidics as a versatile tool for single-cell analysis, NPG Asia Materials (2014) 6, e133 Linas Mazutis et al., Single-cell analysis and sorting usingdroplet-based microfluidic, Nat Protoc. 2013 May ; 8(5): 870-891
　エマルションを用いて単一細胞解析を行うためには、エマルション中の１細胞含有エマルション粒子の割合を高めることが望ましい。本技術は、１つの微小粒子を含むエマルション粒子をより効率的に生成するための新たな手法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、特定の微小粒子回収方法によって上記課題を解決できることを見出した。
　すなわち、本技術は、微小粒子が通流される主流路と、
　前記微小粒子のうち、回収対象粒子が回収される回収流路と、
　前記主流路と前記回収流路とを接続する接続流路と、
　前記接続流路に液体を供給可能に接続されている液体供給流路と、を含む流路構造を有する微小粒子分取機構において、微小粒子を含む第一液体を前記主流路に流す通流工程と、
　前記主流路を流れる微小粒子が回収対象粒子であるかを判定する判定工程と、
　回収対象粒子を前記回収流路内へと回収する回収工程とを含み、且つ、
　前記回収工程において、前記回収対象粒子は、前記第一液体に含まれた状態で、前記回収流路内の前記第一液体と非混和性である第二液体中に回収される、
　微小粒子回収方法を提供する。
　前記微小粒子回収方法を実施することによって、前記回収流路内に、前記第二液体を分散媒とし且つ前記第一液体を分散質とするエマルションが形成されうる。
　前記微小粒子回収方法を実施することによってエマルションが形成され、且つ、当該エマルションを構成する液滴の少なくとも一部が、前記回収対象粒子を１つ含みうる。
　前記第一液体が親水性であり且つ前記第二液体が疎水性であってよい。
　前記第二液体の動粘度が、前記第一液体の動粘度の１／１００倍～１００倍でありうる。
　前記通流工程、前記判定工程、及び前記回収工程は、前記第二液体を前記液体供給流路から前記接続流路へと供給しながら行われうる。
　前記主流路が、前記接続流路及び回収対象粒子以外の微小粒子が流れる少なくとも一つの廃棄流路へと分岐してよく、
　前記液体供給流路が、前記接続流路へ液体を供給しうる。
　前記接続流路に、前記第一液体が前記回収流路へと進行することを防ぐバルブが設けられていてよい。
　前記通流工程において、前記微小粒子が前記主流路内を略一列に並んで前記接続流路に向かって流れうる。
　前記微小粒子分取機構は、微小粒子を含有する液体が流れるサンプル流路及び微小粒子を含有しない液体が流れるシース流路が合流部で主流路へ連結し、合流部後の主流路に微小粒子が主流路内を略一列に並び流れるようにする流路構造を有してよく、
　当該流路構造によって、略一列に並んで流れる微小粒子を含む層流が形成されうる。
　前記判定工程において、前記主流路中を流れる微小粒子に光が照射され、当該照射により生じた光に基づき当該微小粒子が回収対象粒子であるかが判定されうる。
　前記回収工程において、前記回収流路内の圧力変動により、前記回収対象粒子が前記接続流路を通って前記回収流路内へと回収されうる。
　前記主流路、前記接続流路、及び前記回収流路は直線状に並んでいてよい。
　前記微小粒子が細胞又は細胞塊であり、且つ、前記第一液体が当該微小粒子の培養液であってよい。
　前記微小粒子が細胞、細胞塊、又は合成粒子であり、且つ、前記回収工程後に当該微小粒子が破壊されてよい。
　前記回収流路内の回収された微小粒子が、さらなる微小粒子分取処理に付されてもよい。
　前記微小粒子分取用マイクロチップは、前記流路構造を一つ又は二つ以上含みうる。
　また、本技術は、微小粒子が通流される主流路と、
　前記微小粒子のうち、回収対象粒子が回収される回収流路と、
　前記主流路と前記回収流路とを接続する接続流路と、
　前記接続流路に液体を供給可能に接続されている液体供給流路と、を含む流路構造を有し、
　前記主流路は、第一液体に含まれた状態で流れる微小粒子が回収対象粒子であるかを判定するために用いられる判定領域を有し、
　回収対象粒子であると判定された微小粒子は、前記第一液体に含まれた状態で、前記回収流路内の前記第一液体と非混和性である第二液体中に回収される、
　微小粒子分取用マイクロチップも提供する。
　また、本技術は、微小粒子が通流される主流路と、
　前記微小粒子のうち、回収対象粒子が回収される回収流路と、
　前記主流路と前記回収流路とを接続する接続流路と、
　前記接続流路に液体を供給可能に接続されている液体供給流路と、
を含む流路構造を有する微小粒子分取用マイクロチップと、
　前記主流路に、微小粒子を含む第一液体を供給する第一液体供給部と、
　前記液体供給流路に、前記第一液体と非混和性である第二液体を供給する第二液体供給部と、
　前記主流路内を流れる微小粒子が回収対象粒子であるかを判定する判定部と、
　を備えている微小粒子回収装置も提供する。
　前記微小粒子分取用マイクロチップは、前記微小粒子回収装置から取り外し可能であってよい。
　また、本技術は、微小粒子が通流される主流路と、
　前記微小粒子のうち、回収対象粒子が回収される回収流路と、
　前記主流路と前記回収流路とを接続する接続流路と、
　前記接続流路に液体を供給可能に接続されている液体供給流路と、を含む流路構造を有する微小粒子分取機構において、微小粒子を含む第一液体を前記主流路に流す通流工程と、
　前記主流路を流れる微小粒子が回収対象粒子であるかを判定する判定工程と、
　回収対象粒子を前記回収流路内へと回収する回収工程とを含み、且つ、
　前記回収工程において、前記回収対象粒子は、前記第一液体に含まれた状態で、前記回収流路内の、前記第一液体と非混和性である第二液体中に回収される、
　微小粒子含有エマルション粒子を含むエマルションの製造方法も提供する。
　また、本技術は、１つの微小粒子を含むエマルション粒子の数の割合が、エマルション粒子全数に対して７０％以上である、微小粒子含有エマルション粒子を含むエマルションも提供する。
本技術の微小粒子回収方法において用いられる微小粒子分取用マイクロチップの構成例を示す図である。 本技術の微小粒子回収方法のフローの一例を示す図である。 粒子分取部の一例の拡大図である。 制御部の一例のブロック図である。 容器が接続された微小粒子分取用マイクロチップの構成例を示す図である。 接続流路部分の拡大図である。 接続流路部分の拡大図である。 接続流路部分の拡大図である。 接続流路部分の拡大図である。 １つの微小粒子を含むエマルション粒子が回収流路内に形成されることを示す写真である。 ピエゾ素子の異なる駆動条件によって異なるサイズを有するエマルション粒子が形成されることを示す写真である。 微小粒子分取用マイクロチップの一例の模式図である。 微小粒子分取用マイクロチップの一例の模式図である。 微小粒子分取用マイクロチップの一例の模式図である。
　以下、本技術を実施するための好適な形態について説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本技術の代表的な実施形態を示したものであり、本技術の範囲がこれらの実施形態のみに限定されることはない。なお、本技術の説明は以下の順序で行う。
１．第１の実施形態（微小粒子回収方法）
（１）第１の実施形態の説明
（２）第１の実施形態の第１の例
（２－１）通流工程
（２－２）判定工程
（２－３）回収工程
（２－４）他の工程
（２－４－１）培養工程
（２－４－２）破壊工程
（２－４－３）検出工程
（２－４－４）合成工程
（２－５）微小粒子分取機構及び微小粒子
（３）流路構造の他の例
（３－１）主流路と廃棄流路とが直線状に並んでいる流路構造
（３－２）複数の回収流路を有する流路構造
２．第２の実施形態（微小粒子分取用マイクロチップ）
３．第３の実施形態（微小粒子回収装置）
４．第４の実施形態（エマルションの製造方法）
５．第５の実施形態（エマルション）
１．第１の実施形態（微小粒子回収方法）
（１）第１の実施形態の説明
　本技術の微小粒子回収方法は、微小粒子が通流される主流路と、前記微小粒子のうち、回収対象粒子が回収される回収流路と、前記主流路と前記回収流路とを接続する接続流路と、前記接続流路に液体を供給可能に接続されている液体供給流路と、を含む流路構造を有する微小粒子分取機構を用いて行われる。本技術の微小粒子回収方法は、当該微小粒子分取機構において微小粒子を含む第一液体を前記主流路に流す通流工程と、前記主流路を流れる微小粒子が回収対象粒子であるかを判定する判定工程と、前記回収対象粒子を前記回収流路内へと回収する回収工程とを含み、且つ、前記回収工程において、前記回収対象粒子は、前記第一液体に含まれた状態で、前記回収流路内の、前記第一液体と非混和性である第二液体中に回収される。
　本技術によって、回収対象粒子は、前記第一液体に含まれた状態で、前記回収流路内の前記第一液体と非混和性である第二液体中に回収される。これにより、例えば回収対象粒子を含むエマルション粒子を前記回収流路内に形成することができる。
　また、本技術において、回収流路内へと回収される微小粒子は、前記判定工程において回収対象粒子であると判定されたものであり、且つ、適切なタイミングで回収動作が実施される。さらに、微小粒子が流れて来ない時又は前記判定工程で回収対象粒子でないと判断された微小粒子が来た時には回収動作が行われないため、回収流路内に微小粒子を含まないエマルション粒子又は回収対象粒子以外の粒子を含むエマルション粒子が形成されない。そのため、エマルション粒子中に１つの回収対象粒子が含まれる確率は極めて高い。例えば、本技術に従う方法によって、１つの微小粒子（特には回収対象粒子）を含むエマルション粒子を例えば７０％以上、特には８０％以上、より特には９０％以上、さらには９５％以上の成功率で生成することができる。本技術において、回収対象粒子は、前記判定工程において回収すると判定された微小粒子をいう。
　エマルションを利用した単一細胞解析にとって、エマルション中の１細胞含有エマルション粒子の含有割合を高めることが重要である。当該含有割合を高めることは、細胞数が少ないサンプルに対して単一細胞解析を行う場合においては、特に重要である。
　しかしながら、例えば、上記非特許文献２に記載されるとおり、１つのエマルション粒子中に或る数の細胞が入る確率はポアソン分布に従うと考えられる。従来のエマルション形成技術では、１つのエマルション粒子中に１つの細胞が含まれる確率は、最大でも約６５％程度であると言われている。
　また、当該割合を高めるためには、サンプル中の細胞の数を増やすことが考えられる。しかしながら、例えばクリニカルサンプルに含まれる解析対象細胞の数はしばしば少なく、例えば１サンプル中の解析対象細胞数は例えば１０4～１０5でありうる。また、例えばＣＴＣ（血中循環腫瘍細胞）などの希少細胞を解析対象とする場合において、入手可能な細胞の数は限られる。
　本技術により、上記のとおり、１つの微小粒子（例えば細胞）を含むエマルション粒子の割合を高めることができる。そのため、本技術は、エマルションを用いて単一細胞解析を行うために極めて有効である。
　また、各エマルション粒子中に一つの細胞を含むエマルションを用いた単一細胞解析において、一般的には、当該エマルションを形成する前に、例えばセルソータなどの細胞分取装置を用いて単一細胞解析のターゲット細胞群をソートしてターゲット細胞が精製される。そのため、当該単一細胞解析を行うためには、エマルション化装置に加えてセルソータが必要である。使用する装置が増えることは、例えばコストの観点から望ましくない。また、当該エマルションを形成するためには、エマルション形成工程に加えて、セルソート工程も必要になる。工程数が増えることは、例えば時間及びコストの観点から望ましくない。
　セルソータを用いて、検出シグナルに基づきウェルプレートにシングルセルソートする技術もあるが、当該ウェルプレートのウェルの数は３８４が上限であり、解析スケール及びスループットが低い。また、ソートノズルがウェル間を移動する間はソートできないので、この間に流れてきたターゲット細胞はロスすることになる。
　本技術の方法において、前記判定工程において回収対象粒子であると判定された微小粒子をエマルションの状態で回収することができる。そのため、本技術によって、セルソート工程を別途行うことなく、エマルションを形成することができる。また、本技術の方法によって、回収対象粒子の回収率を高められる。
　本技術の好ましい実施態様において、前記微小粒子回収方法を実施することによってエマルションが形成され、且つ、当該エマルションを構成する液滴（以下、「エマルション粒子」ともいう）の少なくとも一部が、前記回収対象粒子を１つ含む。より好ましくは、当該エマルションを構成する全液滴のうち、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらにより好ましくは９０％以上の数の液滴が１つの回収対象粒子を含む。本技術に従う微小粒子回収方法はこのように１つの回収対象粒子を含むエマルション粒子の割合が高いエマルションを形成することができる。
　以上のとおりであるので、本技術は、１つの微小粒子を含むエマルション粒子を含むエマルションの製造方法も提供する。当該製造方法に含まれる工程は、前記微小粒子回収方法の工程と同じであってよい。
　また、本技術は、１つの細胞を含むエマルション粒子の数の割合がエマルション粒子全数に対して７０％以上であるエマルションも提供する。前記割合は、好ましくは７５％以上、さらにより好ましくは８０％以上、８５％以上、又は９０％以上であってもよい。このように、本技術によって、１つのエマルション粒子を極めて高い含有割合で含むエマルションが提供される。
　本技術の方法において用いられる前記微小粒子分取機構に含まれる流路構造において、前記主流路と前記回収流路とが前記接続流路を介して接続されており、当該接続流路には前記液体供給流路が接続されている。当該液体供給流路から前記第二液体を当該接続流路へと供給することによって、前記主流路を流れる前記第一液体が前記回収流路へと侵入することを防ぐことができ、且つ、必要に応じて回収流路内に前記第一液体を導くことができる。例えば、前記回収対象粒子が前記接続流路付近に到達した場合にだけ前記第一液体を回収流路内へ導くことで、前記回収対象粒子を、前記第一液体に含まれた状態で前記回収流路内に導くことができる。
　本技術の好ましい実施態様に従い、本技術に従う微小粒子回収方法を実施することによって、前記回収流路内に、前記第二液体を分散媒とし且つ前記第一液体を分散質とするエマルションが形成される。本技術に従う微小粒子回収方法により形成されるエマルションは、全エマルション粒子に占める、１つの回収対象粒子を含むエマルション粒子の含有割合が高い。そのため、本技術は、解析対象となる細胞の数が少ない場合にも適用可能である。
　前記第二液体の動粘度は、好ましくは前記第一液体の動粘度の１／１０００倍～１０００倍であり、より好ましくは１／１００倍～１００倍であり、さらにより好ましくは１／１０倍～１０倍であり、さらにより好ましくは１／５倍～５倍であり、特に好ましくは１／２倍～２倍である。本技術において、前記第一液体及び前記第二液体の動粘度は同程度であることが好ましい。これによりエマルションが形成されやすくなる。
　前記第一液体及び前記第二液体の２５℃における密度はいずれも、例えば０．５ｇ／ｃｍ３～５ｇ／ｃｍ３、好ましくは０．６ｇ／ｃｍ３～４ｇ／ｃｍ３、より好ましくは０．７ｇ／ｃｍ３～３ｇ／ｃｍ３でありうる。
　また、前記第二液体の密度は、好ましくは前記第一液体の密度の１／１００倍～１００倍であり、より好ましくは１／１０倍～１０倍であり、さらにより好ましくは１／５倍～５倍であり、特に好ましくは１／２倍～２倍である。本技術において、前記第一液体及び前記第二液体の密度は同程度であることが好ましい。これによりエマルションが形成されやすくなる。
　前記第一液体及び前記第二液体の２５℃における動粘度は、例えば０．３ｃＳｔ～５ｃＳｔ、好ましくは０．４ｃＳｔ～４ｃＳｔ、より好ましくは０．５ｃＳｔ～３ｃＳｔでありうる。
　前記第一液体及び前記第二液体が以上の物性を有することによって、前記回収流路内にエマルションが形成されやすくなる。また、このような物性によって、マイクロ流路内をこれら液体が流れやすくなる。
　本技術の一つの実施態様において、前記第一液体が親水性の液体であり、且つ、前記第二液体が疎水性の液体であってよい。この実施態様において、前記回収流路内に、疎水性の液体を分散媒とし且つ親水性の液体を分散質とするエマルションが形成されうる。例えば細胞などの生体粒子は、例えばバッファー又は培養液などの親水性の液体に含まれた状態で存在することが望ましい。そのため、この実施態様は、親水性の液体中に存在することが望ましい微小粒子、特には生体粒子、より特には細胞を回収するために適している。
　前記親水性の液体は、例えば水及び水と混和性の液体を包含する。例えば、前記親水性の液体は、水、親水性アルコール、親水性エーテル、ケトン、ニトリル系溶媒、ジメチルスルホキシド、及びＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミドからなる群より選択される１つ又は２以上の混合物を主成分とする液体であってよい。本明細書内において、主成分とは、当該液体の例えば５０質量％以上、特には６０質量％以上、より特には７０質量％以上、さらにより特には８０質量％以上、８５質量％以上、又は９０質量％以上を占める成分をいう。前記親水性アルコールとしては、例えばエタノール、メタノール、プロパノール、及びグリセリンなどを挙げることができる。前記親水性エーテルとしては、例えばテトラヒドロフラン、ポリエチレンオキサイド、及び１，４－ジオキサンなどを挙げることができる。前記ケトンとしては、例えばアセトン及びメチルエチルケトンなどが挙げられる。前記ニトリル系溶媒としては、例えばアセトニトリルなどが挙げられる。
　前記親水性の液体は、好ましくは、水を主成分とする液体であってよく、例えば水、水溶液、又は、水分散物であってよい。前記親水性の液体は、例えばシース液及び／又はサンプル液であってよい。前記親水性の液体は、好ましくは微小粒子（例えば生体粒子、特には細胞）に悪影響を及ぼさない親水性の液体である。
　前記親水性の液体は、例えば生体分子を含む液体であってよい。当該生体分子は、例えば、アミノ酸、ペプチド、及びタンパク質から選ばれる１種又は２種以上の組合せであってよい。
　また、前記親水性の液体は、例えば界面活性剤、特には非イオン性界面活性剤を含んでもよい。非イオン界面活性剤の例として、例えばポリエチレンオキシドとポリプロピレンオキシドとのトリブロック共重合体を挙げることができ、当該トリブロック共重合体は、ポロキサマー又はプルロニック系界面活性剤とも呼ばれる。プルロニック系界面活性剤のより具体的な例は、Pluronic（商標）F68である。
　前記親水性の液体として、例えば培養液及びバッファー挙げることができるがこれらに限定されない。前記バッファーは、好ましくはグッドバッファーである。
　当該親水性の液体として培養液を用いることで、回収対象粒子として回収された細胞を、エマルション粒子中に保持されたまま培養することができる。
　また、当該親水性の液体（特には当該シース液）が細胞刺激性成分を含むことによって、回収対象粒子として回収された細胞を、エマルション粒子中に保持されたまま刺激することができる。さらに、刺激された細胞の特徴（例えば形態など）を顕微鏡などによって観察することもできる。
　また、当該親水性の液体（例えば当該シース液又は当該サンプル液）が、細胞刺激の応答を観察することを可能とするアッセイ系を含んでもよい。当該アッセイ系によって、回収対象粒子として回収された細胞からの当該応答を、エマルション粒子中に保持されたまま、例えば光学的に検出することができる。当該アッセイ系は、好ましくはwash freeのアッセイ系であり、例えば蛍光共鳴エネルギー転移（FRET）又は生物発光共鳴エネルギー移動（BRET）などを利用した系が好ましい。
　以上のとおり、本技術において微小粒子が生体粒子（特には細胞）である場合、種々の単一の生体粒子の解析（特には単一細胞解析、例えば単一細胞イメージングなど）を行うことができる。
　前記親水性の液体の２５℃における密度は、例えば０．５ｇ／ｃｍ３～５ｇ／ｃｍ３、好ましくは０．６ｇ／ｃｍ３～４ｇ／ｃｍ３、より好ましくは０．７ｇ／ｃｍ３～３ｇ／ｃｍ３でありうる。
　前記親水性の液体の２５℃における動粘度は、例えば０．３ｃＳｔ～５ｃＳｔ、好ましくは０．４ｃＳｔ～４ｃＳｔ、より好ましくは０．５ｃＳｔ～３ｃＳｔでありうる。
　前記親水性の液体が以上の物性を有することによって、マイクロ流路内を流れやすくなり、また、前記回収流路内にエマルションが形成されやすくなる。
　前記疎水性の液体は、前記親水性の液体と非混和性である液体から選択されるいずれかの液体であってよい。前記疎水性の液体は、例えば脂肪族炭化水素、フッ素系油、フッ素原子を含む低分子又は高分子、シリコーンオイル、芳香族系炭化水素、脂肪族一価アルコール（例えばｎ－オクタノールなど）、及びフッ化多糖類からなる群より選択される１つ又は２以上の混合物を主成分とする液体であってよい。
　前記脂肪族炭化水素は、好ましくは炭素原子数が７以上３０以下の脂肪族炭化水素である。炭素原子数が７以上３０以下であることで、疎水性液体の動粘度がマイクロ流路内を流れるために適している。脂肪族炭化水素の例として、ミネラルオイル；例えばスクワランオイル及びオリーブオイルなどの動植物由来のオイル；例えばデカン及びヘキサデカンなどの炭素原子数１０～２０のパラフィン系炭化水素；及び、炭素原子数１０～２０のオレフィン系炭化水素を挙げることができる。
　本技術において、前記親水性の液体との良好な非混和性の観点から、前記疎水性の液体は好ましくはフッ素系油である。前記フッ素系油として、例えばパーフルオロカーボン（ＰＦＣ）、パーフルオロポリエーテル（ＰＦＰＥ）、及びハイドロフルオロエーテル（ＨＦＥ）を挙げることができる。パーフルオロカーボンとして例えばフロリナート（商標）ＦＣ４０及びフロリナートＦＣ－７７０（３Ｍ社製）などが挙げられる。パーフルオロポリエーテルとして例えばＫｒｙｔｏｘ（ＤｕＰｏｎｔ社製）を挙げることができる。ハイドロフルオロエーテルとして例えばＨＦＥ７５００（３Ｍ社製）を挙げることができる。
　前記疎水性の液体の２５℃における密度は、例えば０．５ｇ／ｃｍ３～５ｇ／ｃｍ３、好ましくは０．６ｇ／ｃｍ３～４ｇ／ｃｍ３、より好ましくは０．７ｇ／ｃｍ３～３ｇ／ｃｍ３でありうる。
　前記疎水性の液体の２５℃における動粘度は、例えば０．３ｃＳｔ～５ｃＳｔ、好ましくは０．４ｃＳｔ～４ｃＳｔ、より好ましくは０．５ｃＳｔ～３ｃＳｔでありうる。
　前記疎水性の液体が以上の物性を有することによって、前記回収流路内にエマルションが形成されやすくなる。例えば密度又は動粘度が高すぎる場合は、前記接続流路内をスムーズに流れなくなる可能性が高まる。
　本技術の好ましい実施態様において、前記第一液体及び前記第二液体のうちの一方又は両方が界面活性剤を含みうる。特には、前記疎水性の液体及び前記親水性の液体のうちの一方又は両方が界面活性剤を含み、より特には前記疎水性の液体が界面活性剤を含む。界面活性剤によって、エマルション粒子が形成されやすくなり、エマルション粒子が安定的に維持することもできる。界面活性剤として、例えば、非イオン性界面活性剤及びフッ素系界面活性剤を挙げることができる。非イオン性界面活性剤としては、例えばＳｐａｎ８０及びＡｂｉｌ　ＥＭを挙げることができるが、これらに限定されない。界面活性剤の種類は当業者により適宜選択されてよい。前記フッ素系界面活性剤として、例えばパーフルオロポリエーテルベースの界面活性剤及び偽相界面活性剤（pseudosurfactant）を挙げることができる。前者として例えばＫｒｙｔｏｘ（ＤｕＰｏｎｔ社製）を挙げることができ、後者として例えばパーフルオロオクタノールを挙げることができる。
　前記界面活性剤は、例えば前記疎水性の液体中に当該界面活性剤の臨界ミセル濃度以上で存在しうる。当該臨界ミセル濃度は、例えば１μＭ～１０００μＭ、特には１０μＭ～１００ｍＭでありうる。また、前記界面活性剤の界面張力は、例えば４０ｍＮ／ｍ以下であり、特には２０ｍＮ／ｍ以下であってよい。
　本技術の他の実施態様において、前記第一液体が疎水性の液体であり、且つ、前記第二液体が親水性の液体であってよい。
　この実施態様において、前記回収流路内に、親水性の液体を分散媒とし且つ疎水性の液体を分散質とするエマルションが形成されうる。本技術は、当該エマルション中に微小粒子を回収するために用いられてもよい。当該疎水性の液体及び当該親水性の液体の例は、上記で述べたとおりである。
　また、この実施態様は、例えば分散媒及び分散質がそれぞれ疎水性液体及び親水性液体であり且つエマルション粒子が微小粒子を含むエマルションから、さらに目的とする微小粒子だけを回収する場合に適用されうる。
　また、本技術において用いられうるアッセイ系として、微小粒子が蛍光を発する系だけでなく、エマルション粒子が蛍光を発する系も用いられうる。そのため、微小粒子を含むエマルション粒子を回収するために、前記判定工程において、微小粒子に対する判定が行われてよく、エマルション粒子に対する判定が行われてよく、又は、微小粒子及びエマルション粒子の両方に対する判定が行われてもよい。このように、本技術において、微小粒子且つ／又はエマルション粒子から得られる情報に基づき、微小粒子又はエマルション粒子が回収対象であるかが判定されてよい。
　本技術の好ましい実施態様に従い、前記通流工程、前記判定工程、及び前記回収工程は、前記第二液体を前記液体供給流路から前記接続流路へと供給しながら行われる。これにより、前記接続流路が前記第二液体によって満たされ、前記第一液体が不必要に前記回収流路へ進行することを防ぐことができる。
（２）第１の実施形態の第１の例
　本技術の微小粒子回収方法は、微小粒子分取機構を用いて行われる。以下で、本技術の微小粒子回収方法において用いられる微小粒子分取機構の構成例である微小粒子分取用マイクロチップを示す図１及び本技術の微小粒子回収方法のフローの一例を示す図２を参照しながら、本技術の方法の一実施形態の例を説明する。
　図１に示されるとおり、本技術の方法において用いられる微小粒子分取用マイクロチップ１５０は、微小粒子が通流される主流路１５５と、前記微小粒子のうち回収対象粒子が回収される回収流路１５９とを含む。微小粒子分取用マイクロチップ１５０には、粒子分取部１５７が設けられている。粒子分取部１５７の拡大図が図３に示されている。図３のＡに示されるとおり、粒子分取部１５７は、主流路１５５と回収流路１５９とを接続する接続流路１７０を含む。接続流路１７０には、接続流路１７０に液体を供給可能である液体供給流路１６１が接続されている。以上のとおり、微小粒子分取用マイクロチップ１５０は、主流路１５５、回収流路１５９、接続流路１７０、及び液体供給流路１６１を含む流路構造を有する。
　また、図１に示されるとおり、微小粒子分取用マイクロチップ１５０は、当該マイクロチップに加えて、光照射部１０１、検出部１０２、及び制御部１０３を含む微小粒子回収装置１００の一部を構成する。制御部１０３は、図４に示されるとおり、信号処理部１０４、判定部１０５、及び分取制御部１０６を含みうる。
　図２に示されるとおり、本技術の方法は、微小粒子分取用マイクロチップ１５０において、微小粒子を含む第一液体を主流路１５５に流す通流工程Ｓ１０１と、主流路１５５を流れる微小粒子が回収対象粒子であるかを判定する判定工程Ｓ１０２と、回収対象粒子を回収流路１５９内へと回収する回収工程Ｓ１０３とを含む。
　以下で各工程について説明する。
（２－１）通流工程
　通流工程Ｓ１０１において、微小粒子を含む第一液体が主流路１５５に通流される。前記第一液体は、主流路１５５内を、合流部１６２から粒子分取部１５７へ向かって流れる。前記第一液体は、微小粒子を含むサンプル液とシース液とから形成される層流であってよく、特には、前記サンプル液の周囲が前記シース液によって囲まれた層流であってよい。前記層流を形成するための流路構造について以下で説明する。
　微小粒子分取用マイクロチップ１５０には、サンプル液インレット１５１及びシース液インレット１５３が設けられている。これらインレットから微小粒子を含むサンプル液及び微小粒子を含まないシース液が、それぞれサンプル液流路１５２及びシース液流路１５４に導入される。
　微小粒子分取用マイクロチップ１５０は、前記サンプル液が流れるサンプル流路１４２及び前記シース液が流れるシース液流路１５４が合流部１６２で合流して主流路１５５となる流路構造を有する。当該サンプル液及び当該シース液が合流部１６２で合流して、例えばサンプル液の周囲がシース液で囲まれた層流が形成される。好ましくは、層流中には微小粒子が略一列に並んでいる。このように、本技術において前記流路構造によって、略一列に並んで流れる微小粒子を含む層流が形成される。
　当該層流は、主流路１５５を、粒子分取部１５７に向かって流れる。好ましくは、微小粒子は、主流路１５５内を一列に並んで流れている。これにより、以下で説明する検出領域１５６における光照射において、１つの微小粒子への光照射により生じた光と他の微小粒子への光照射により生じた光とを区別しやすくなる。
（２－２）判定工程
　判定工程Ｓ１０２において、主流路１５５を流れる微小粒子が回収対象粒子であるかが判定される。当該判定は、判定部１０５により行われうる。判定部１０５は、当該判定を、光照射部１０１による微小粒子への光照射によって生じた光に基づき行いうる。判定工程Ｓ１０２の例について、以下でより詳細に説明する。
　判定工程Ｓ１０２において、光照射部１０１が、微小粒子分取用マイクロチップ１５０中の主流路１５５（特には検出領域１５６）を流れる微小粒子に光（例えば励起光など）を照射し、当該光照射により生じた光を検出部１０２が検出する。検出部１０２により検出された光の特徴に応じて、制御部１０３に含まれる判定部１０５が、微小粒子が回収対象粒子であるかを判定する。例えば、判定部１０５は、散乱光に基づく判定、蛍光に基づく判定、又は、画像（例えば暗視野画像若しくは／且つ明視野画像など）に基づく判定を行いうる。後述の回収工程Ｓ１０３において、制御部１０３が、微小粒子分取用マイクロチップ１５０中の流れを制御することによって、回収対象粒子が回収流路１５９内へ回収される。
　光照射部１０１は、微小粒子分取用マイクロチップ１５０中の流路内を流れる微小粒子に光（例えば励起光など）を照射する。光照射部１０１は、光を出射する光源と、検出領域を流れる微小粒子に対して励起光を集光する対物レンズとを含みうる。光源は、分析の目的に応じて当業者により適宜選択されてよく、例えばレーザダイオード、ＳＨＧレーザ、固体レーザ、ガスレーザ、高輝度ＬＥＤ、若しくはハロゲンランプであってよく、又は、これらのうちの２つ以上の組み合わせであってもよい。光照射部は、光源及び対物レンズに加えて、必要に応じて他の光学素子を含んでいてもよい。
（蛍光信号或いは／及び散乱光信号に基づく分取対象の判別）
　本技術の一つの実施態様において、検出部１０２は、光照射部１０１による光照射によって前記微小粒子から生じた散乱光及び／又は蛍光を検出する。検出部１０２は、微小粒子から生じた蛍光及び／又は散乱光を集光する集光レンズと検出器とを含みうる。当該検出器として、ＰＭＴ、フォトダイオード、ＣＣＤ、及びＣＭＯＳなどが用いられうるがこれらに限定されない。検出部１０２は、集光レンズ及び検出器に加えて、必要に応じて他の光学素子を含んでいてもよい。検出部１０２は、例えば分光部をさらに含みうる。分光部を構成する光学部品として、例えばグレーティング、プリズム、及び光フィルターを挙げることができる。分光部によって、例えば検出されるべき波長の光を、他の波長の光から分けて検出することができる。検出部１０２は、検出された光を光電変換によって、アナログ電気信号に変換しうる。検出部１０２は、さらに当該アナログ電気信号をＡＤ変換によってデジタル電気信号に変換しうる。
　制御部１０３に含まれる信号処理部１０４は、検出部１０２により得られたデジタル電気信号の波形を処理して、判定部１０５による判定のために用いられる光の特徴に関する情報（データ）を生成しうる。当該光の特徴に関する情報として、信号処理部１０４は、デジタル電気信号の波形から、例えば当該波形の幅、当該波形の高さ、及び当該波形の面積のうちの１つ、２つ、又は３つを取得しうる。また、当該光の特徴に関する情報には、例えば、当該光が検出された時刻が含まれていてよい。以上の信号処理部１０４による処理は、特には、前記散乱光及び／又は蛍光が検出される実施態様において行われうる。
　制御部１０３に含まれる判定部１０５は、流路中を流れる微小粒子への光照射により生じた光に基づき、当該微小粒子が回収対象粒子であるかを判定する。
　前記散乱光及び／又は蛍光が検出される実施態様において、検出部１０２により得られたデジタル電気信号の波形が制御部１０３によって処理され、そして、当該処理によって生成された光の特徴に関する情報に基づき、判定部１０５が、当該微小粒子が回収対象粒子であるかを判定する。例えば、散乱光に基づく判定において、微小粒子の外形及び／又は内部構造の特徴が特定され、当該特徴に基づき微小粒子が回収対象粒子であるかが判定されてよい。さらに、例えば細胞などの微小粒子に対して予め前処理を施しておくことで、フローサイトメトリーにおいて用いられる特徴と同様の特徴に基づき、当該微小粒子が回収対象粒子であるかを判定することもできる。また、例えば細胞などの微小粒子を抗体又は色素（特には蛍光色素）で標識を行っておくことで、当該微小粒子の表面抗原の特徴に基づき、当該微小粒子が回収対象粒子であるかを判定することもできる。
（明視野画像に基づく分取対象の判別）
　本技術の他の実施態様において、検出部１０２は、光照射部１０１による光照射により生成される明視野画像を取得してもよい。この実施態様において、光照射部１０１は例えばハロゲンランプを含み、検出部１０２は、ＣＣＤ又はＣＭＯＳを含みうる。例えば、ハロゲンランプによって微小粒子へ光が照射され、当該照射された微小粒子の明視野画像をＣＣＤ又はＣＭＯＳが取得しうる。
　前記明視野画像が取得される実施態様において、制御部１０３に含まれる判定部１０５は、取得された明視野画像に基づき、微小粒子が回収対象粒子であるかを判定する。例えば、微小粒子（特には細胞）の形態、サイズ、及び色のうちの一つ又は二つ以上の組合せに基づき、微小粒子が回収対象粒子であるかが判定されうる。
（暗視野画像に基づく分取対象の判別）
　本技術のさらに他の実施態様において、検出部１０２は、光照射部１０１による光照射により生成される暗視野画像を取得してもよい。この実施態様において、光照射部１０１は例えばレーザ光源を含み、検出部１０２は、ＣＣＤ又はＣＭＯＳを含みうる。例えば、レーザによって微小粒子へ光が照射され、当該照射された微小粒子の暗視野画像（例えば蛍光画像）をＣＣＤ又はＣＭＯＳが取得しうる。
　前記暗視野画像が取得される実施態様において、制御部１０３に含まれる判定部１０５は、取得された暗視野画像に基づき、微小粒子が回収対象粒子であるかを判定する。例えば、微小粒子（特には細胞）の形態、サイズ、及び色のうちの一つ又は二つ以上の組合せに基づき、微小粒子が回収対象粒子であるかが判定されうる。
　上記で述べた、「蛍光信号或いは／及び散乱光信号に基づく分取対象の判別」、「明視野画像に基づく分取対象の判別」、及び「暗視野画像に基づく分取対象の判別」のいずれにおいても、検出部１０２は、例えばＣＭＯＳセンサが組み込まれた基板とＤＳＰ（Digital Signal Processor）を組み込まれた基板とが積層された撮像素子であってもよい。当該撮像素子のＤＳＰを機械学習部として動作させることによって、当該撮像素子はいわゆるＡＩセンサとして動作することができる。当該撮像素子を含む検出部１０２は、微小粒子が回収対象粒子であるかを、例えば学習モデルに基づき判定しうる。また、当該学習モデルは、本技術に従う方法が行われている間に、リアルタイムで更新されてもよい。例えば、ＣＭＯＳセンサ中の画素アレイ部のリセット中、当該画素アレイ部の露光中、又は当該画素アレイ部の各単位画素からの画素信号の読出中に、ＤＳＰが機械学習処理を行いうる。ＡＩセンサとして動作する撮像素子の例として、例えば、国際公開第２０１８／０５１８０９号に記載された撮像装置を挙げることができる。ＡＩセンサを撮像素子として用いる場合、画像アレイから取得された生データがそのまま学習されるので、分取判別処理のスピードが速い。
　前記判定は、例えば、当該光の特徴に関する情報が予め指定された基準を満たすかによって行われうる。当該基準は、微小粒子が回収対象粒子であることを示す基準でありうる。当該基準は、当業者により適宜設定されてよく、例えばフローサイトメトリーなどの技術分野において用いられる基準のような、光の特徴に関する基準でありうる。
　検出領域１５６中の１つの位置に１つの光が照射されてよく、又は、検出領域１５６中の複数の位置のそれぞれに光が照射されてもよい。例えば、検出領域１５６中の２つの異なる位置のそれぞれに光が照射されるようにマイクロチップ１５０は構成されうる（すなわち、検出領域１５６中に、光が照射される位置が２つある。）。この場合において、例えば、１つの位置での微小粒子への光照射によって生じた光（例えば蛍光及び／又は散乱光など）に基づき当該微小粒子が回収対象粒子であるかが判定されうる。さらに、当該１つの位置での前記光照射によって生じた光の検出時刻ともう一つの位置での光照射によって生じた光の検出時刻との差に基づき、流路内における微小粒子の速度を算出することもできる。当該算出のために、予め、２つの照射位置の間の距離が決定されていてよく、前記２つの検出時刻の差と前記距離に基づき微小粒子の速度が決定されうる。さらに、当該速度に基づき、以下で述べる粒子分取部１５７への到達時刻を正確に予測することができる。当該到達時刻が正確に予測されることで、回収流路１５９へ入る流れの形成のタイミングを最適化することができる。また、或る微小粒子の粒子分取部１５７への到達時刻と当該或る微小粒子の前又は後の微小粒子の粒子分取部１５７への到達時刻との差が所定の閾値以下である場合は、当該或る微小粒子を回収しないと判定することもできる。当該或る微小粒子とその前又は後の微小粒子との間の距離が狭い場合に、当該或る微小粒子の吸引の際に当該前又は後の微小粒子が一緒に回収される可能性が高まる。当該一緒に回収される可能性が高い場合には当該或る微小粒子を回収しないと判定することによって、当該前又は後の微小粒子が回収されることを防ぐことができる。これにより、回収された微小粒子のうちの目的とする微小粒子の純度を高めることができる。検出領域１５６中の２つの異なる位置のそれぞれに光が照射されるマイクロチップ及び当該マイクロチップを含む装置の具体例は、例えば特開２０１４－２０２５７３号公報に記載されている。
　なお、制御部１０３は、光照射部１０１による光照射及び／又は検出部１０２による光の検出を制御してもよい。また、制御部１０３は、微小粒子分取用マイクロチップ１５０内に流体を供給するためのポンプの駆動を制御しうる。制御部１０３は、例えば、本技術に従う微小粒子回収方法を微小粒子回収装置に実行させるためのプログラムとＯＳとが格納されたハードディスク、ＣＰＵ、及びメモリにより構成されてよい。例えば汎用のコンピュータにおいて制御部１０３の機能が実現されうる。前記プログラムは、例えばｍｉｃｒｏＳＤメモリカード、ＳＤメモリカード、又はフラッシュメモリなどの記録媒体に記録されていてもよい。当該記録媒体に記録された前記プログラムを、微小粒子回収装置１００に備えられているドライブ（図示されていない）が読み出し、そして、制御部１０３が、当該読み出されたプログラムに従い、微小粒子回収装置１００に本技術に従う微小粒子回収方法を実行させてもよい。
（２－３）回収工程
　回収工程Ｓ１０３において、判定工程Ｓ１０２において回収対象粒子であると判定された微小粒子が、回収流路１５９内へ回収される。回収工程Ｓ１０３において、前記回収対象粒子は、前記第一液体に含まれた状態で、前記回収流路内の前記第一液体と非混和性である第二液体中に回収される。これにより、回収流路１５９内に前記第二液体を分散媒とし且つ前記第一液体を分散質とするエマルションを形成することができ、当該エマルションの各エマルション粒子中には１つの回収対象粒子が含まれている。そのため当該エマルションは、単一細胞解析のために適している。
　以下で回収工程についてより詳細に説明する。
　回収工程Ｓ１０３は、マイクロチップ１５０中の粒子分取部１５７において行われる。粒子分取部１５７において、主流路１５５を流れてきた前記層流は、２つの廃棄流路１５８へと別れて流れる。図１に記載の粒子分取部１５７は２つの廃棄流路１５８を有するが、分岐流路の数は２つに限られない。粒子分取部１５７には、例えば１つ又は複数（例えば２つ、３つ、又は４つなど）の分岐流路が設けられうる。分岐流路は、図１におけるように１平面上でＹ字状に分岐するように構成されていてよく、又は、三次元的に分岐するように構成されていてもよい。
　粒子分取部１５７において、回収対象粒子が流れてきた場合にのみ、主流路１５５から接続流路１７０を通って回収流路１５９へ入る流れが形成されて、回収対象粒子が回収流路１５９内へ回収される。粒子分取部１５７の拡大図を図３に示す。図３Ａに示されるとおり、主流路１５５と回収流路１５９とは、主流路１５５と同軸上にある接続流路１７０を介して連通されている。回収対象粒子は、図３Ｂに示されるとおり、接続流路１７０を通って、回収流路１５９へと流れる。回収対象粒子でない微小粒子は、図３Ｃに示されるとおり、廃棄流路１５８へと流れる。
　接続流路１７０付近の拡大図を図６Ａ及び６Ｂに示す。図６Ａは、接続流路１７０付近の模式的な斜視図である。図７Ｂは、液体供給流路１６１の中心線と接続流路１７０の中心線とを通る平面における模式的な断面図である。接続流路１７０は、検出領域１５６側の流路１７０ａ（以下、上流側接続流路１７０ａともいう）と、回収流路１５９側の流路１７０ｂ（以下、下流側接続流路１７０ｂともいう）と、接続流路１７０と液体供給流路１６１との接続部１７０ｃとを含む。液体供給流路１６１は、接続流路１７０の流路の軸に対して略垂直になるように設けられている。図６Ａ及び６Ｂにおいて、２つの液体供給流路１６１が、接続流路１７０の略中心位置にて向かい合うように設けられているが、１つの液体供給流路だけが設けられていてもよい。
　上流側接続流路１７０ａの横断面の形状及び寸法は、下流側接続流路１７０ｂの形状及び寸法と、同じであってよい。例えば、図６Ａ及び６Ｂに示されるとおり、上流側接続流路１２０ａの横断面及び下流側接続流路１２０ｂの横断面のいずれもが、同じ寸法を有する略円形であってよい。代替的には、これら２つの横断面のいずれもが同じ寸法を有する矩形（例えば正方形又は長方形など）であってもよい。
　２つの液体供給流路１６１から、図６Ｂ中に矢印に示されるとおりに第二液体が接続流路１７０へと供給される。当該第二液体は、接続部１７０ｃから、上流側接続流路１７０ａ及び下流側接続流路１７０ｂの両方へ流れる。
　回収工程が行われない場合は、当該第二液体は以下のとおりに流れる。
　上流側接続流路１７０ａへ流れた当該第二液体は、接続流路１７０の主流路１５５との接続面から出たのち、２つの廃棄流路１５８へと別れて流れる。このように当該第二液体が当該接続面から出ていることによって、回収流路１５９内へ回収される必要のない第一液体及び微小粒子が接続流路１７０を通って回収流路１５９へ入ることを防ぐことができる。
　下流側接続流路１７０ｂへ流れた当該第二液体は、回収流路１５９内へと流れる。これによって、回収流路１５９内が当該第二液体によって満たされ、当該第二液体は例えばエマルション形成のための分散媒となる。
　回収工程が行われる場合においても、当該第二液体は、２つの液体供給流路１６１から接続流路１７０へと供給されうる。しかしながら、回収流路１５９内の圧力変動により、特には回収流路１５９内に負圧を発生させることによって、主流路１５５から接続流路１７０を通って回収流路１５９へと流れる流れが形成される。すなわち、主流路１５５から、上流側接続流路１７０ａ、接続部１７０ｃ、及び下流側接続流路１７０ｂをこの順に通って回収流路１５９へと流れる流れが形成される。これにより、回収対象粒子が、当該第一液体に包まれた状態で、回収流路１５９内の当該第二液体中に回収される。当該回収工程を行うことによって、回収流路１５９内に又は回収流路末端１６３に例えば流路を介して接続されている容器内に、例えばエマルションが形成されうる。
　上流側接続流路１２０ａの横断面の形状及び／又は寸法は、下流側接続流路１２０ｂの形状及び／又は寸法と異なっていてもよい。これら２つの流路の寸法が異なる例を図７Ａ及び７Ｂに示す。図７Ａ及び７Ｂに示されるとおり、接続流路１８０は、検出領域１５６側の流路１８０ａ（以下、上流側接続流路１８０ａともいう）と、回収流路１５９側の流路１８０ｂ（以下、下流側接続流路１８０ｂともいう）と、接続流路１８０と液体供給流路１６１との接続部１８０ｃとを含む。上流側接続流路１８０ａの横断面及び下流側接続流路１８０ｂの横断面はいずれも略円形の形状を有するが、後者の横断面の直径は、前者の横断面の直径よりも大きい。後者の横断面の直径を前者のものよりも大きくすることによって、両者の直径が同じ場合と比べて、上記で述べた負圧による微小粒子分取動作の直後に回収流路１５９内に既に分取された回収対象粒子が接続流路１８０を通って主流路１５５へと放出されることをより効果的に防ぐことができる。
　例えば、上流側接続流路１８０ａの横断面及び下流側接続流路１８０ｂの横断面がいずれも矩形である場合は、後者の横断面の面積を前者の横断面の面積よりも大きくすることによって、上記で述べたように、既に回収された微小粒子が接続流路１８０を通って主流路１５５へと放出されることをより効果的に防ぐことができる。
　回収工程Ｓ１０３において、回収流路１５９内の圧力変動により、前記回収対象粒子が前記接続流路を通って前記回収流路内へと回収される。当該回収は、例えば、上記で述べた通り、回収流路１５９内に負圧を発生させることによって行われてよい。当該負圧は、例えばマイクロチップ１５０の外部に取り付けられているアクチュエータ１０７（特にはピエゾアクチュエータ）により、回収流路１５９を規定する壁が変形されることにより生じうる。当該負圧によって、回収流路１５９へ入る当該流れが形成されうる。当該負圧を発生させるために、例えば、回収流路１５９の壁を変形させることができるように、アクチュエータ１０７がマイクロチップ１５０外部に取り付けられうる。当該壁の変形によって、回収流路１５９の内空が変化されて、負圧が発生されうる。アクチュエータ１０７は、例えばピエゾアクチュエータでありうる。回収対象粒子が回収流路１５９へと吸い込まれる際には、前記層流を構成するサンプル液又は前記層流を構成するサンプル液及びシース液も、回収流路１５９へと流れうる。このようにして、回収対象粒子は、粒子分取部１５７において分取されて、回収流路１５９へと回収される。
　回収対象粒子は、第一液体に包まれた状態で、回収流路１５９内の前記第一液体と非混和性である第二液体中に回収される。これにより、上記で述べたとおり、回収流路１５９内に前記第二液体を分散媒とし且つ前記第一液体を分散質とするエマルションが形成される。
　回収対象粒子でない微小粒子が接続流路１７０を通って回収流路１５９へと入ることを防ぐために、接続流路１７０には液体供給流路１６１が備えられている。接続流路１７０には、液体供給流路１６１から、主流路１５５を流れる液体（サンプル液及びシース液）と非混和性の第二液体が導入される。
　接続流路１７０に導入された第二液体の一部によって接続流路１７０から主流路１５５に向かう流れが形成されることで、回収対象粒子以外の微小粒子が回収流路１５９へ入ることが防がれる。接続流路１７０から主流路１５５に向かう流れが形成する第二液体は、主流路１５５を流れる第一液体が廃棄流路１５８へと流れる流れによって、主流路１５５内を流れることなく、第一液体と同様に廃棄流路１５８を流れる。
　なお、接続流路１７０に導入された第二液体の残りは、回収流路１５９へと流れる。これにより、回収流路１５９内は第二液体によって満たされうる。
　回収流路１５９内には、前記第一液体を非混和性である第二液体が充填されていてよい。当該第二液体によって回収流路１５９内を充填するために、前記液体供給流路１６１から接続流路１７０へ当該第二液体が供給されうる。当該供給によって、当該第二液体は接続流路１７０から回収流路１５９へと流れ、これにより回収流路１５９内が当該第二液体によって充填されうる。
　廃棄流路１５８へと流れた層流は、廃棄流路末端１６０にて、マイクロチップの外部へと吐出されうる。また、回収流路１５９へと回収された回収対象粒子は、回収流路末端１６１にて、マイクロチップの外部へと吐出されうる。
　回収流路末端１６３には、例えば図５に示されるとおり、チューブ１７２などの流路を介して容器１７１が接続されうる。同図に示されるとおり、容器１７１に、回収対象粒子を含む前記第一液体を分散質とし且つ前記第二液体を分散媒とするエマルションが容器１７１内に回収される。このように、本技術の一つの実施態様に従い、微小粒子回収装置１００は、回収対象粒子を含むエマルションを容器に回収するための流路を備えていてよい。
　また、回収流路末端１６３を閉じて回収動作を行うと、回収流路１５９内に複数のエマルション粒子を保持することができる。当該回収動作の終了後に回収流路１５９内で、継続して、例えば単一細胞解析などのアッセイを行うこともできる。
　以上のとおり、本技術において、前記主流路は、前記接続流路と前記少なくとも一つの廃棄流路へと分岐していてよい。前記少なくとも一つの廃棄流路は、回収対象粒子以外の微小粒子が流れる流路である。
　また、図１及び２に示されるように、本技術の方法において用いられる微小粒子分取用マイクロチップにおいて、前記主流路、前記接続流路、及び前記回収流路が直線状に並んでいてよい。これら３つの流路が直線状（特には同軸上）に並んでいる場合、例えば前記接続流路及び前記回収流路が前記主流路に対して角度を有して配置されている場合と比べて、回収工程をより効率的に行うことができる。例えば、回収対象粒子を接続流路へと導くために要する吸引量をより少なくすることができる。
　また、図１及び２に示されるように、本技術の方法において用いられる微小粒子分取用マイクロチップにおいて、微小粒子は、主流路内を略一列に並び、接続流路へ向かって流れる。そのため、回収工程における吸引量を少なくすることもできる。
　また、本技術の方法において、前記液体供給流路が、前記接続流路へ液体（特には第二液体）を供給する。これにより、前記接続流路内に、前記液体供給流路と前記接続流路との接続位置から前記主流路に向かって流れる流れが形成されて、前記主流路を流れる液体が前記接続流路へと侵入することを防ぐことができ、回収対象粒子以外の微小粒子が接続流路を通って回収流路へ流れることを防ぐこともできる。前記回収工程を行う際には、上記で述べたとおり、例えば回収流路内に生じた負圧によって、１つの回収対象粒子を含む第一液体が、前記接続流路を通って、前記回収流路の第二液体中に回収される。これにより、１つの回収対象粒子を含むエマルション粒子が第二液体中に形成される。
　また、本技術において、前記判定工程において回収対象粒子であると判定された微小粒子が、例えばピエゾアクチュエータを適切なタイミングで（例えば粒子分取部１５７に到達した時点で）駆動させることで、回収対象粒子を含む親水性溶液が回収流路１５９内に回収されてエマルション粒子が形成される。前記判定工程において例えばピークシグナル及び面積シグナルを利用して回収対象粒子であるかを判定することによって、１つの微小粒子（singlet）であるか、２つの微小粒子が結合したもの（doublet）であるか、又は３つの微小粒子が結合したもの（triplet）であるかの判定も可能である。そのため、１つのエマルション粒子中に２つ以上の微小粒子が含まれるエマルション粒子が形成されることを回避することができる。そのため、１つの微小粒子を含むエマルション粒子を高確率且つ高効率で形成することができる。また、このように２つ以上の微小粒子が結合したものが含まれるエマルション粒子が形成されることを回避することができるので、例えばセルソータなどによってエマルション形成操作前に２つ以上の微小粒子の結合物を除去する操作を省略することができる。
　逆に、１回の回収動作で同時に接続流路へ引き込まれ得るほど近接した二つ以上の微小粒子の各々の特徴も判断することができる。例えば同一の特徴を持つ二つの微小粒子を一つのエマルション粒子内に閉じ込めることができ、又は、指定した異なる特徴を持つ微小粒子の組合せを一つのエマルジョン粒子内に閉じ込めることもできる。
（実施例）
　図１に示される微小粒子分取用マイクロチップ１５０と同じ流路構造を有する微小粒子分取用マイクロチップを用いて、以下のとおりに、１つの微小粒子を含むエマルション粒子の形成を行った。以下当該エマルション粒子の形成のための操作について、図１を参照しながら説明する。
　微小粒子分取用マイクロチップ１５０には、回収流路１５９内の容積を変動させることができるようにピエゾ素子（ピエゾアクチュエータ）が、前記マイクロチップの外側表面（特には回収流路１５９のうち接続流路１７０との接続部分に近い、膨らんでいる部分に対応する外側表面）に取り付けられていた。
　直径１０μｍのビーズを含む親水性サンプル液を、サンプル液インレット１５１からサンプル液流路１５２へと導入し、且つ、親水性シース液を、シース液インレット１５３からシース液流路１５４へと導入した。導入された当該親水性サンプル液及び当該親水性シース液は合流部１６２で合流し、そして、当該親水性サンプル液が当該親水性シース液によって囲まれた層流が形成された。当該層流は、略一列に並んでいるビーズを含み、当該層流は主流路１５５内を接続流路１７０へと向かって流れた。
　また、当該親水性サンプル液及び当該親水性シース液の導入と並行して、液体供給流路１６１から接続流路１７０へと疎水性の液体が供給された。前記疎水性の液体が液体供給流路１６１から接続流路１７０へと供給されることによって、前記層流が接続流路１７０を通って回収流路１５９へと侵入することが防がれ、且つ、回収流路１５９は前記疎水性の液体によって満たされていた。
　主流路１５５のうちの検出領域１５６へと照射されているレーザ光の照射位置をビーズが通過することで、当該ビーズへレーザ光が照射されて光が生じる。当該生じた光が検出され、検出された光の特徴に基づき、各ビーズを回収するかが判定された。
　回収すると判定されたビーズが接続流路１７０付近に到達するタイミングで前記ピエゾ素子が駆動されて回収流路１５９の内腔が変形し、これにより当該ビーズが、接続流路１７０を通って回収流路１５９内へと回収された。当該回収のための操作は、以下のとおりであった：（ｉ）１０μ秒かけて回収流路１５９を変形して回収流路１５９内に負圧を与える、（ｉｉ）１０μ秒間当該変形後の状態を保持する、そして、（ｉｉｉ）１０μ秒かけて当該負圧を解消して当該変形を元に戻す。以上の（ｉ）～（ｉｉｉ）の操作を繰り返すことによって、回収流路１５９内に、前記疎水性の液体中に１つのビーズを含むエマルション粒子を含むエマルションが形成された。当該エマルションは、前記疎水性の液体を分散媒とし且つ親水性の液体を含むエマルション粒子を分散質とするものであった。
　以上の（ｉ）～（ｉｉｉ）の操作を行うことによって、１つのビーズを含むエマルション粒子が回収流路１５９内に形成されることが、図８Ａに示されている。図８Ａについて以下に説明する。
　図８Ａの（ａ）は、ビーズ（白の矢印により示されている）が接続流路１７０に向かって流れている状態を示す写真である。図８Ａの時点において、主流路１５５を親水性の液体が粒子分取部１５７へ向かって流れ、そして、接続流路１７０へ流れることなく、主流路１５５から分岐する２つの廃棄流路１５８へと流れている。疎水性の液体が液体供給流路１６１から接続流路１７０へと供給され、主流路１５５及び回収流路１５９の両方へと流れる。主流路１５５へ流れた当該疎水性の液体は、接続流路１７０から出た直後に、前記親水性の液体の流れによって、２つの廃棄流路１５８へと別れて流れている（図８Ａ中のａにより示される付近を、廃棄流路１５８の壁に沿って流れている）。
　図８Ａの（ｂ）は、ビーズがさらに接続流路に近づいた時点での写真である。この時点において、ビーズ回収のための操作が開始される。すなわち、前記ピエゾ素子を駆動することによって、回収流路１５９内腔の変形が開始される。
　図８Ａの（ｃ）は、親水性の液体が回収流路１５９内へと進行している状態を示す写真である。当該写真から、図８Ｃの時点において、ビーズは親水性の液体によって包まれており、さらに当該親水性の液体が疎水性の液体によって囲まれていることが分かる。すなわち、ビーズを１つ含むエマルション粒子Ｐが形成されている。
　図８Ａの（ｄ）は、当該エマルション粒子Ｐが、接続流路１７０から回収流路１５９へと入る直前の写真である。
　図８Ａの（ｅ）は、当該エマルション粒子Ｐが、回収流路１５９へ入った直後の写真である。当該エマルション粒子Ｐ内にビーズが１つ含まれていることが確認できる。
　図８Ａの（ｆ）は、当該エマルション粒子Ｐが、海流流路１５９内をさらに下流へと流れたことを示す写真である。
　以上のとおり、本技術に従う方法によって、１つのビーズを含むエマルション粒子が形成された。
　以上の（ｉ）～（ｉｉｉ）のそれぞれの操作の時間及び変形量を制御することで、エマルション粒子のサイズを調整することができる。すなわち、回収流路内のエマルション粒子のサイズは回収流路が変形し膨張する流路容積で制御できる。そのため、ピエゾ素子の変形量、すなわちピエゾ素子の電気的な駆動波形によって、容易に制御することができる。
　例えば、ピエゾ素子による回収流路内腔の変形量を大きくすることによって、回収流路１５９内に吸い込まれる親水性の液体の量が多くなり、これによりエマルション粒子のサイズを大きくすることができる。反対に、当該変形量を小さくすることによって、回収流路１５９内に吸い込まれる親水性の液体の量が少なくなり、これによりエマルション粒子のサイズを小さくすることができる。
　また、上記（ｉｉ）の保持時間をより長くする又はより短くすることによって、エマルション粒子のサイズをより大きくする又はより小さくすることもできる。このことを図８Ｂに示す。図８Ｂは、上記（ｉｉ）の保持時間が１０μ秒間、１５μ秒間、２５μ秒間、及び３５μ秒間である場合のエマルション粒子のサイズを示す写真である。この写真から、上記（ｉｉ）の保持時間の変更により、エマルション粒子のサイズを調整することができることが分かる。
　また、接続流路１７０の容積（特には上流側接続流路１７０ａ、接続部１７０ｃ、及び下流側接続流路１７０ｂのそれぞれ）を調整することによって、エマルション粒子の製図を調整することもできる。
　以上で説明した例では、前記液体供給流路から接続流路へ第二液体を供給することによって、主流路を流れる第一液体が前記接続流路内に入ることが防がれる。本技術において、主流路を流れる第一液体が前記接続流路内に入ることを防ぐために、前記接続流路に、前記第一液体が前記回収流路へと進行することを防ぐバルブが設けられてよい。前記回収工程が行われるときにのみ、当該バルブが解放されて、前記第一液体が前記接続流路を通って前記回収流路へと流れうる。
（２－４）他の工程
　本技術の微小粒子回収方法は、以上で述べた通流工程、判定工程、及び回収工程に加えて、さらに他の工程を含んでもよい。当該他の工程の例について以下で説明する。
（２－４－１）培養工程
　本技術の一つの好ましい実施態様に従い、前記微小粒子は細胞又は細胞塊であり、且つ、前記第一液体が当該微小粒子の培養液である。この実施態様において、培養液を分散質とし且つ培養液と非混和性である第二液体を分散媒とするエマルションが形成されうる。当該分散質により形成される各エマルション粒子中に１つの細胞又は細胞塊が含まれていてよい。これにより、各エマルション粒子内で、１つの細胞又は細胞塊を培養することができる。以上のとおり、この実施態様において、前記微小粒子回収方法はさらに、前記回収工程において回収された回収対象粒子（すなわち細胞又は細胞塊）を、当該培養液から形成されたエマルション粒子中で培養する培養工程を含みうる。培養液の種類は、培養される細胞に応じて当業者により適宜選択されうる。この実施態様は、例えば単一細胞解析において１つ１つの細胞又は細胞塊を別々に培養することが求められる場合に適している。
（２－４－２）破壊工程
　本技術の一つの好ましい実施態様に従い、前記微小粒子が細胞、細胞塊、又は合成粒子であり、且つ、前記回収工程後に当該微小粒子が破壊されうる。この実施態様において、前記回収工程によってエマルションが形成され、当該エマルションを構成するエマルション粒子内のそれぞれの細胞、細胞塊、又は合成粒子が破壊されうる。以上のとおり、本技術の微小粒子回収方法は、前記回収工程後に、回収された微小粒子を破壊する破壊工程を含みうる。
　本技術の他の好ましい実施態様に従い、細胞、細胞塊、及び合成粒子以外の粒子が破壊されてもよい。すなわち、本技術の微小粒子回収方法は、前記回収工程後に、回収された回収対象粒子を破壊する破壊工程を含みうる。
　当該破壊は、好ましくはエマルション粒子を維持したまま行われうる。これにより、例えば細胞成分（例えば細胞内成分、細胞膜成分、及び細胞壁成分など）又は合成粒子が有する成分がエマルション粒子内に放出され、当該細胞成分又は当該成分を、他の微小粒子の成分と区別して処理することができる。当該処理は、例えば当該細胞成分又は当該成分の分析、分離、又は増幅などでありうる。当該細胞成分又は当該成分として、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、脂質、糖類、又は細胞内器官を挙げることができるが、これらに限定されない。例えば、当該細胞成分又は当該成分がＤＮＡである場合、当該破壊工程によって、又は、当該破壊工程によって得られたエマルション粒子にさらに処理を行うことによって、ＤＮＡバーコーディングのための試料を調製することができる。
（２－４－３）検出工程
　本技術の一つの好ましい実施態様に従い、前記回収工程後に、回収対象粒子が有する成分の検出若しくは分析、又は、回収対象粒子が有する成分と他の成分との反応が行われうる。
　前記検出又は前記反応を行うために、例えば本技術に従い形成されたエマルション粒子が、他のエマルション粒子とマージされうる。そして、当該マージ後に、当該回収対象粒子が有する成分の検出若しくは分析、又は、当該成分と他の成分との反応が、マージ後のエマルション粒子内において行われうる。
　当該マージにより、例えばCellular Indexing of Transcriptomes and Epitopes by Sequencing（CITE-seqともいう）が可能となる。例えば、回収対象粒子が、ｐｏｌｙ－Ａ配列を有するオリゴバーコードが結合した抗体を結合した細胞である場合を想定する。前記回収工程において、当該細胞を含むエマルション粒子が形成される。そしてその後、当該エマルション粒子が、バーコード配列を有するビーズ又はゲルを含むエマルション粒子とマージされる。当該マージによって、当該細胞の細胞表面タンパク質又は細胞内ｍＲＮＡを検出することができる。
　また、エマルション化した細胞又は細胞塊（例えばスフェロイド又はオルガノイドなど）と薬剤とが反応されてもよい。これにより、当該薬剤に対する当該細胞又は細胞塊の応答を検出又は分析することができる。
　また、当該検出において、生体分子が検出されてよい。生体分子の検出は、例えばｗａｓｈ　ｆｒｅｅ　ａｓｓａｙにより行われうる。ｗａｓｈ　ｆｒｅｅ　ａｓｓａｙでは、例えばＬＯＣＩ、ＦＲＥＴ、ＢＲＥＴ、又はＦｌｉｍＰＩＡ法が用いられうる。
（２－４－４）合成工程
　本技術の一つの好ましい実施態様に従い、前記回収工程後に、回収対象粒子による化学物質の合成が行われうる。例えば、当該合成は、前記回収工程において形成されたエマルション粒子内で行われてよい。例えば、当該エマルション粒子内に、無細胞発現用試薬を封入することで、in vitro抗体作製が可能となる。前記無細胞発現用試薬として、例えば直鎖ＤＮＡ及びＥ．ｃｏｌｉ　Ｓ３０　Ｅｘｔｒａｃｔ　ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　ｌｉｎｅａｒ　ＤＮＡ（ｐｒｏｍｅｇａ）を挙げることができる。また、例えば当該エマルション粒子内において、無細胞タンパク質合成系によるタンパク質合成が行われてもよい。
（２－５）微小粒子分取機構及び微小粒子
　本技術の微小粒子分取方法において用いられる微小粒子分取機構は、上記で述べた流路構造を有する構造体又はデバイスであってよく、例えばマイクロ流路を有するチップであり、特には微小粒子分取用マイクロチップであってよい。
　本技術において、「マイクロ」とは、微小粒子分取用マイクロチップに含まれる流路の少なくとも一部が、μｍオーダの寸法を有すること、特にはμｍオーダの横断面寸法を有することを意味する。すなわち、本技術において、「マイクロチップ」とは、μｍオーダの流路を含むチップ、特にはμｍオーダの横断面寸法を有する流路を含むチップをいう。例えば、μｍオーダの横断面寸法を有する流路から構成されている粒子分取部を含むチップが、本技術に従うマイクロチップと呼ばれうる。例えば、粒子分取部１５７のうち、主流路１５５の横断面は例えば矩形であり、主流路１５５の幅は、粒子分取部１５７内において例えば１００μｍ～５００μｍであり、特には１００μｍ～３００μｍでありうる。主流路１５５から分岐する分岐流路の幅は、主流路１５５の幅よりも小さくてよい。接続流路１７０の横断面は例えば円形であり、接続流路１７０と主流路１５５との接続部における接続流路１７０の直径は例えば１０μｍ～６０μｍ、特には２０μｍ～５０μｍでありうる。流路に関するこれらの寸法は、微小粒子のサイズ、特には回収対象粒子のサイズに応じて適宜変更されてよい。
　微小粒子分取用マイクロチップ１５０は、当技術分野で既知の方法により製造されうる。例えば、当該生体粒子分取用マイクロチップ１５０は、所定の流路が形成された２枚以上の基板を貼り合わせることにより製造することができる。流路は、例えば２枚以上の基板（特には２枚の基板）の全てに形成されていてもよく、又は、２枚以上の基板の一部の基板（特には２枚の基板のうちの一枚）にのみ形成されていてもよい。基板を貼り合わせる時の位置の調整をより容易にするために、流路は、一枚の基板にのみ形成されていることが好ましい。
　微小粒子分取用マイクロチップ１５０を形成する材料として、当技術分野で既知の材料が用いられうる。例えば、ポリカーボネート、シクロオレフィンポリマー、ポリプロピレン、ＰＤＭＳ（polydimethylsiloxane）、ポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）、ポリエチレン、ポリスチレン、ガラス、及びシリコンが挙げられるがこれらに限定されない。特に、加工性に優れており且つ成形装置を使用して安価にマイクロチップを製造することができることから、例えばポリカーボネート、シクロオレフィンポリマー、及びポリプロピレンなどの高分子材料が特に好ましい。
　微小粒子分取用マイクロチップ１５０は、好ましくは透明である。例えば、微小粒子分取用マイクロチップ１５０は、少なくとも光（レーザ光及び散乱光）が通過する部分が透明であり、例えば検出領域が透明でありうる。微小粒子分取用マイクロチップ１５０全体が透明であってもよい。
　なお、以上では、使い捨て可能な微小粒子分取用マイクロチップ１５０に上記流路群が形成されている実施態様を説明したが、本技術において、上記流路群はマイクロチップ１５０に形成されていなくてもよい。例えば、上記流路群は、例えばプラスチック又はガラスなどの基板内に形成されてもよい。また、上記流路群は、２次元的又は３次元的な構造を有していてもよい。
　本技術において、微小粒子は、前記微小粒子分取機構（例えば微小粒子分取用マイクロチップ）中の流路内を流れることができる寸法を有する粒子であってよい。本技術において、微小粒子は当業者により適宜選択されてよい。本技術において、微小粒子には、細胞、細胞塊、微生物、及びリポソームなどの生物学的微小粒子、並びに、ゲル粒子、ビーズ、ラテックス粒子、ポリマー粒子、及び工業用粒子などの合成微小粒子などが包含されうる。
　生物学的微小粒子（生体粒子ともいう）には、各種細胞を構成する染色体、リポソーム、ミトコンドリア、オルガネラ(細胞小器官)などが含まれうる。細胞には、動物細胞(血球系細胞など)および植物細胞が含まれうる。細胞は、特には血液系細胞又は組織系細胞でありうる。前記血液系細胞は、例えばＴ細胞及びＢ細胞などの浮遊系細胞であってよい。前記組織系細胞は、例えば接着系の培養細胞又は組織からばらされた接着系細胞などであってよい。細胞塊には、例えばスフェロイド及びオルガノイドなどが含まれうる。微生物には、大腸菌などの細菌類、タバコモザイクウイルスなどのウイルス類、イースト菌などの菌類などが含まれうる。さらに、生物学的微小粒子には、核酸、タンパク質、これらの複合体などの生物学的高分子も包含されうる。これら生物学的高分子は、例えば細胞から抽出されたものであってよく又は血液サンプル若しくは他の液状サンプルに含まれるものであってもよい。
　合成微小粒子は、例えば有機若しくは無機高分子材料又は金属などからなる微小粒子でありうる。有機高分子材料には、ポリスチレン、スチレン・ジビニルベンゼン、及びポリメチルメタクリレートなどが含まれうる。無機高分子材料には、ガラス、シリカ、及び磁性体材料などが含まれうる。金属には、金コロイド及びアルミなどが含まれうる。前記合成微小粒子は、例えばゲル粒子又はビーズなどであってよく、より特にはオリゴヌクレオチド、ペプチド、タンパク質、及び酵素から選ばれる１つ又は２つ以上の組合せが結合されたゲル粒子又はビーズであってよい。
　微小粒子の形状は、球形若しくは略球形であってよく、又は非球形であってもよい。微小粒子の大きさ及び質量は、マイクロチップの流路のサイズによって当業者により適宜選択されうる。他方で、マイクロチップの流路のサイズも、微小粒子の大きさ及び質量によって適宜選択されうる。本技術において、微小粒子には、必要に応じて化学的又は生物学的な標識、例えば蛍光色素又は蛍光タンパクなど、が取り付けられうる。当該標識によって、当該微小粒子の検出がより容易になりうる。取り付けられるべき標識は、当業者により適宜選択されうる。当該標識には、微小粒子に特異的に反応する分子（例えば抗体、アプタマー、ＤＮＡ、又はＲＮＡなど）が結合しうる。
　本技術の一つの実施態様に従い、前記微小粒子は生体粒子であり、特には細胞でありうる。
　本技術において、前記回収流路内に回収された微小粒子が、さらなる微小粒子分取処理に付されてもよい。当該さらなる微小粒子分取処理は、例えば、上記で説明した微小粒子分取用マイクロチップ１５０を用いて行われてよく、又は、他の微小粒子分取用マイクロチップを用いて行われてもよい。
　例えば、当該さらなる微小粒子分取処理において、上記（２－１）～（２－４）において述べた工程のいずれか１つ又は２つ以上の組合せが行われてもよい。例えば、前記さらなる微小粒子分取処理において上記（２－２）で述べた判定工程が行われる場合において、微小粒子を含むエマルション粒子を回収するために、前記判定工程において、微小粒子に対する判定が行われてよく、エマルション粒子に対する判定が行われてよく、又は、微小粒子及びエマルション粒子の両方に対する判定が行われてもよい。このように、当該さらなる微小粒子分取処理においても、微小粒子且つ／又はエマルション粒子から得られる情報に基づき、微小粒子又はエマルション粒子が回収対象であるかが判定されてよい。
　また、前記さらなる微小粒子分取処理において、微小粒子含有エマルション粒子を含むエマルションが、当該分取処理に付されてよい。
（３）流路構造の他の例
（３－１）主流路と廃棄流路とが直線状に並んでいる流路構造
　本技術の一つの実施態様において、前記接続流路及び前記回収流路は、前記主流路と直線状に並んでいなくてもよい。この実施態様における微小粒子分取用マイクロチップの例を以下で図９を参照しながら説明する。
　図９は、本技術に従う微小粒子分取用マイクロチップのうちの検出領域及び粒子分取部を含む領域の模式図を示す。図９に示される微小粒子分取用マイクロチップ３５０は、図１を参照して説明した微小粒子分取用マイクロチップ１５０と同様に、サンプル液流路３５２及びシース液流路３５４が合流部３６２で合流して主流路３５５となり、主流路３５５に検出領域３５６が設けられているという流路構造を有する。主流路３５５には微小粒子Ｐを含むサンプル液がシース液に囲まれている層流が流れる。
　微小粒子分取用マイクロチップ３５０は、主流路３５５に加えて、回収対象粒子が回収される回収流路３５９と、主流路３５５と回収流路３５９とを接続する接続流路３７０と、接続流路３７０に液体を供給可能に接続されている液体供給流路３６１とを含む。
　主流路３５５は、さらに、回収対象粒子でない微小粒子が流れる廃棄流路３５８を含む。図１を参照して説明した微小粒子分取用マイクロチップ１５０は、２つの廃棄流路１５８が主流路１５５から分岐しており、且つ、接続流路１７０、回収流路１５９、主流路１５５と直線状に並んでいる。これに対し、図９の微小粒子分取用マイクロチップ３５０は、主流路３５５と廃棄流路３５８とが直線状に並んでおり、接続流路３７０及び回収流路３５９が主流路３５５から分岐しているという流路構造を有する。
　このように、本技術の微小粒子回収方法において用いられる微小粒子分取用マイクロチップは、前記接続流路及び前記回収流路が、前記主流路と直線状に並んでいなくてもよい。例えば、前記主流路と前記廃棄流路とが直線状に並んでおり、且つ、前記接続流路及び前記回収流路が前記主流路から分岐する流路構造を有していてよい。
（３－２）複数の回収流路を有する流路構造
　本技術の他の実施態様において、微小粒子分取用マイクロチップは、微小粒子が通流される主流路と、前記微小粒子のうち、回収対象粒子が回収される回収流路と、前記主流路と前記回収流路とを接続する接続流路と、前記接続流路に液体を供給可能に接続されている液体供給流路と、を含む流路構造を一つ又は二つ以上含んでよい。上記で図１を参照して説明した微小粒子分取用マイクロチップは、当該流路構造を１つ有する。これに対し、以下で図１０及び１１を参照して説明するように、本技術の微小粒子回収方法において用いられる微小粒子分取用マイクロチップは、当該流路構造を２つ以上有していてもよい。
　図１０は、本技術に従う微小粒子分取用マイクロチップのうちの検出領域及び粒子分取部を含む領域の模式図を示す。図１０に示される微小粒子分取用マイクロチップ４５０は、図１を参照して説明した微小粒子分取用マイクロチップ１５０と同様に、サンプル液流路４５２及びシース液流路４５４が合流部４６２で合流して主流路４５５となり、主流路４５５に検出領域４５６が設けられているという流路構造を有する。主流路４５５には微小粒子Ｐを含むサンプル液がシース液に囲まれている層流が流れる。
　微小粒子分取用マイクロチップ４５０は、主流路４５５に加えて、回収対象粒子が回収される回収流路４５９－１と、主流路４５５と回収流路４５９－１とを接続する接続流路４７０－１と、接続流路４７０－１に液体を供給可能に接続されている液体供給流路４６１－１とを含む。微小粒子分取用マイクロチップ４５０は、さらに、回収対象粒子が回収される回収流路４５９－２と、主流路４５５と回収流路４５９－２とを接続する接続流路４７０－２と、接続流路４７０－２に液体を供給可能に接続されている液体供給流路４６１－２とを含む。すなわち、微小粒子分取用マイクロチップ４５０は、前記流路構造を２つ有する。微小粒子分取用マイクロチップ４５０において、主流路４５５は、この２つの流路構造によって共有されている。また、接続流路４７０－１は、接続流路４７０－２よりも下流で、主流路４５５と接続されている。
　微小粒子分取用マイクロチップ４５０によって、例えば、互いに異なる回収対象粒子を含む２つのエマルションを形成することができる。
　この場合、前記判定工程において、微小粒子が、例えば２種の回収対象粒子Ａ及びＢのいずれかであるか又は当該２種の回収対象粒子のいずれでもないかが判定される。回収対象粒子Ａ又はＢに属するかに関する基準は、ユーザによって適宜選択されてよい。
　前記回収工程において、微小粒子が回収対象粒子Ａである場合は、当該微小粒子は、接続流路４７０－１を通って、回収流路４５９－１へと回収される。回収対象粒子Ａである当該微小粒子は、第一液体に含まれた状態、回収流路４５９－１内の第二液体中に回収される。
　前記回収工程において、微小粒子が回収対象粒子Ｂである場合は、当該微小粒子は、接続流路４７０－２を通って、回収流路４５９－２へと回収される。回収対象粒子Ｂである当該微小粒子は、第一液体に含まれた状態、回収流路４５９－２内の第二液体中に回収される。
　前記回収工程において、微小粒子が回収対象粒子Ａ及びＢのいずれでもない場合は、当該微小粒子は、廃棄流路４５８へと流れる。
　以上のとおりにして、回収対象粒子Ａを含むエマルション及び回収対象粒子Ｂを含むエマルションが形成される。
　図１１は、本技術に従う微小粒子分取用マイクロチップのうちの検出領域及び粒子分取部を含む領域の模式図を示す。図１１に示される微小粒子分取用マイクロチップ５５０は、図１０を参照して説明した微小粒子分取用マイクロチップ４５０と、２つの接続流路５７０－１及び５７０－２が主流路５５５の同じ位置で接続されていること以外は、図１０を参照して説明した微小粒子分取用マイクロチップ４５０と同じである。すなわち、微小粒子分取用マイクロチップ５５０は、前記流路構造を２つ有し、主流路５５５は、この２つの流路構造によって共有されている。
　微小粒子分取用マイクロチップ５５０によっても、互いに異なる回収対象粒子を含む２つのエマルションを形成することができる。
　この場合においても、前記判定工程において、微小粒子が、例えば２種の回収対象粒子Ａ及びＢのいずれかであるか又は当該２種の回収対象粒子のいずれでもないかが判定される。回収対象粒子Ａ又はＢに属するかに関する基準は、ユーザによって適宜選択されてよい。
　前記回収工程において、微小粒子が回収対象粒子Ａである場合は、当該微小粒子は、接続流路５７０－１を通って、回収流路５５９－１へと回収される。回収対象粒子Ａである当該微小粒子は、第一液体に含まれた状態、回収流路５５９－１内の第二液体中に回収される。
　前記回収工程において、微小粒子が回収対象粒子Ｂである場合は、当該微小粒子は、接続流路５７０－２を通って、回収流路５５９－２へと回収される。回収対象粒子Ｂである当該微小粒子は、第一液体に含まれた状態、回収流路５５９－２内の第二液体中に回収される。
　前記回収工程において、微小粒子が回収対象粒子Ａ及びＢのいずれでもない場合は、当該微小粒子は、廃棄流路５５８へと流れる。
　以上のとおりにして、回収対象粒子Ａを含むエマルション及び回収対象粒子Ｂを含むエマルションが形成される。
２．第２の実施形態（微小粒子分取用マイクロチップ）
　本技術は、微小粒子が通流される主流路と、前記微小粒子のうち、回収対象粒子が回収される回収流路と、前記主流路と前記回収流路とを接続する接続流路と、前記接続流路に液体を供給可能に接続されている液体供給流路と、を含む流路構造を有する微小粒子分取用マイクロチップも提供する。当該マイクロチップ中の前記主流路は、第一液体に含まれた状態で流れる微小粒子が回収対象粒子であるかを判定するために用いられる判定領域を有し、回収対象粒子であると判定された微小粒子は、前記第一液体に含まれた状態で、前記回収流路内の前記第一液体と非混和性である第二液体中に回収される。当該微小粒子分取用マイクロチップは、上記１．において述べた微小粒子分取用マイクロチップと同じであり、その説明が本実施形態においても当てはまる。
３．第３の実施形態（微小粒子回収装置）
　本技術は、微小粒子が通流される主流路と、前記微小粒子のうち、回収対象粒子が回収される回収流路と、前記主流路と前記回収流路とを接続する接続流路と、前記接続流路に液体を供給可能に接続されている液体供給流路と、を含む流路構造を有する微小粒子分取用マイクロチップと、前記主流路に、微小粒子を含む第一液体を供給する第一液体供給部と、前記液体供給流路に、前記第一液体と非混和性である第二液体を供給する第二液体供給部と、前記主流路内を流れる微小粒子が回収対象粒子であるかを判定する判定部と、を備えている微小粒子回収装置も提供する。当該微小粒子回収装置は、上記１．において述べた微小粒子回収装置と同じであり、その説明が本実施形態においても当てはまる。
　前記微小粒子分取用マイクロチップも、上記１．において述べた微小粒子分取用マイクロチップと同じであり、その説明が本実施形態においても当てはまる。
　前記第一液体供給部は、例えば、上記１．の（２）で述べた層流を形成するための少なくとも一つの構成要素であってよく、例えばサンプル液流路１５２及びシース液流路１５４を含みうる。また、前記第一液体供給部は、サンプル液インレット１５１及びシース液インレット１５３へそれぞれサンプル液及びシース液を導入するためにこれらインレットにそれぞれ接続される流路（例えばチューブなど）及び当該流路に接続されているサンプル液含有容器及びシース液含有容器も含みうる。
　前記第二液体供給部は、例えば、上記１．の（２）において述べた液体供給流路１６１へ第二液体を供給するための少なくとも一つの構成要素であってよく、例えば液体供給流路１６１へ供給される第二液体を収容する容器、及び、当該容器と液体供給流路とを接続する流路（例えばチップと当該容器とを接続するチューブなど）を含みうる。
　前記判定部は、上記１．において述べた判定部と同じであり、その説明が本実施形態においても当てはまる。
　また、前記微小粒子分取用マイクロチップは、前記微小粒子回収装置から取り外し可能であってよい。前記微小粒子分取用マイクロチップが前記装置から取り外し可能であることによって、試料毎に新しい微小粒子分取用マイクロチップを使用することができ、これにより、試料間でのコンタミネーションを防ぐことができる。
４．第４の実施形態（エマルションの製造方法）
　本技術は、上記「１．第１の実施形態（微小粒子回収方法）」において述べた通流工程、判定工程、及び回収工程を含む、エマルションの製造方法も提供する。当該製造方法は、上記「（２－４）他の工程」において述べた他の工程を含んでもよい。上記「１．第１の実施形態（微小粒子回収方法）」において述べた説明が、本技術のエマルション製造方法にも当てはまる。
　本技術のエマルション製造方法によって、１つの微小粒子（特には回収対象粒子）を含むエマルション粒子を高い含有割合で含むエマルションを製造することができる。例えば、本技術の製造方法によって、１つの微小粒子を含むエマルション粒子の数の割合が、エマルション粒子全数に対して、例えば７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上であるエマルションが製造されうる。エマルションを利用した単一細胞解析において、１つの細胞を含むエマルションの含有割合を高めることが重要であり、分析対象となる細胞の数が少ない場合においては、当該含有割合を高めることが特に重要である。本技術の製造方法は、１つの微小粒子を含むエマルション粒子の数の割合が高いエマルションを製造できるので、前記単一細胞解析のために極めて有用である。
５．第５の実施形態（エマルション）
　本技術は、１つの微小粒子を含むエマルション粒子の数の割合が、エマルション粒子全数に対して７０％以上である、微小粒子含有エマルション粒子を含むエマルションも提供する。前記割合は、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上である。本技術のエマルションは、このように高い含有割合で、１つの微小粒子を含むエマルション粒子を含むので、例えば単一細胞解析のために適している。
　当該１つの微小粒子を含むエマルション粒子は、上記「１．第１の実施形態（微小粒子回収方法）」において述べたとおりにして形成されうる。また、当該エマルションは、例えば上記「１．第１の実施形態（微小粒子回収方法）」又は「４．第４の実施形態（エマルションの製造方法）」において述べたとおりに製造されうる。
　前記エマルションは、例えば前記第二液体を分散媒とし且つ前記第一液体を分散質とするエマルションであってよい。これらの液体について、上記「１．第１の実施形態（微小粒子回収方法）」における説明が当てはまる。前記エマルション粒子に含まれる微小粒子についても、上記「１．第１の実施形態（微小粒子回収方法）」における説明が当てはまり、当該微小粒子は例えば細胞、細胞塊、又は合成粒子などであってよい。
　なお、本技術は、以下のような構成をとることもできる。
〔１〕微小粒子が通流される主流路と、
　前記微小粒子のうち、回収対象粒子が回収される回収流路と、
　前記主流路と前記回収流路とを接続する接続流路と、
　前記接続流路に液体を供給可能に接続されている液体供給流路と、を含む流路構造を有する微小粒子分取機構において、微小粒子を含む第一液体を前記主流路に流す通流工程と、
　前記主流路を流れる微小粒子が回収対象粒子であるかを判定する判定工程と、
　回収対象粒子を前記回収流路内へと回収する回収工程とを含み、且つ、
　前記回収工程において、前記回収対象粒子は、前記第一液体に含まれた状態で、前記回収流路内の、前記第一液体と非混和性である第二液体中に回収される、
　微小粒子回収方法。
〔２〕前記微小粒子回収方法を実施することによって、前記回収流路内に、前記第二液体を分散媒とし且つ前記第一液体を分散質とするエマルションが形成される、〔１〕に記載の微小粒子回収方法。
〔３〕前記微小粒子回収方法を実施することによってエマルションが形成され、且つ、当該エマルションを構成する液滴の少なくとも一部が、前記回収対象粒子を１つ含む、〔１〕又は〔２〕に記載の微小粒子回収方法。
〔４〕前記第一液体が親水性であり、且つ、前記第二液体が疎水性である、〔１〕～〔３〕のいずれか一つに記載の微小粒子回収方法。
〔５〕前記第二液体の動粘度が、前記第一液体の動粘度の１／１００倍～１００倍である、〔１〕～〔４〕のいずれか一つに記載の微小粒子回収方法。
〔６〕前記通流工程、前記判定工程、及び前記回収工程は、前記第二液体を前記液体供給流路から前記接続流路へと供給しながら行われる、〔１〕～〔５〕のいずれか一つに記載の微小粒子回収方法。
〔７〕前記主流路が、前記接続流路及び回収対象粒子以外の微小粒子が流れる少なくとも一つの廃棄流路へと分岐し、
　前記液体供給流路が、前記接続流路へ液体を供給する、
　〔１〕～〔６〕のいずれか一つに記載の微小粒子回収方法。
〔８〕前記接続流路に、前記第一液体が前記回収流路へと進行することを防ぐバルブが設けられている、〔１〕～〔７〕のいずれか一つに記載の微小粒子回収方法。
〔９〕前記通流工程において、前記微小粒子が前記主流路内を略一列に並んで前記接続流路に向かって流れる、〔１〕～〔８〕のいずれか一つに記載の微小粒子回収方法。
〔１０〕前記微小粒子分取機構は、微小粒子を含有する液体が流れるサンプル流路及び微小粒子を含有しない液体が流れるシース流路が合流部主流路へ連結し、合流部後の主流路に微小粒子が主流路内を略一列に並び流れるようにする流路構造を有し、
　当該流路構造によって、一列に並んで流れる微小粒子を含む層流が形成される、
　〔１〕～〔９〕のいずれか一つに記載の微小粒子回収方法。
〔１１〕前記判定工程において、前記主流路中を流れる微小粒子に光が照射され、当該照射により生じた光に基づき当該微小粒子が回収対象粒子であるかが判定される、〔１〕～〔１０〕のいずれか一つに記載の微小粒子回収方法。
〔１２〕前記回収工程において、前記回収流路内の圧力変動により、前記回収対象粒子が前記接続流路を通って前記回収流路内へと回収される、〔１〕～〔１１〕のいずれか一つに記載の微小粒子回収方法。
〔１３〕前記主流路、前記接続流路、及び前記回収流路が直線状に並んでいる、〔１〕～〔１２〕のいずれか一つに記載の微小粒子回収方法。
〔１４〕前記微小粒子が細胞又は細胞塊であり、且つ、前記第一液体が当該微小粒子の培養液である、〔１〕～〔１３〕のいずれか一つに記載の微小粒子回収方法。
〔１５〕前記微小粒子が細胞、細胞塊、又は合成粒子であり、且つ、前記回収工程後に当該微小粒子が破壊される、〔１〕～〔１４〕のいずれか一つに記載の微小粒子回収方法。
〔１６〕前記回収流路内の回収された微小粒子が、さらなる微小粒子分取処理に付される、〔１〕～〔１３〕のいずれか一つに記載の微小粒子回収方法。
〔１７〕前記微小粒子分取用マイクロチップが、前記流路構造を一つ又は二つ以上含む、〔１〕～〔６〕のいずれか一つに記載の微小粒子回収方法。
〔１８〕微小粒子が通流される主流路と、
　前記微小粒子のうち、回収対象粒子が回収される回収流路と、
　前記主流路と前記回収流路とを接続する接続流路と、
　前記接続流路に液体を供給可能に接続されている液体供給流路と、を含む流路構造を有し、
　前記主流路は、第一液体に含まれた状態で流れる微小粒子が回収対象粒子であるかを判定するために用いられる判定領域を有し、
　回収対象粒子であると判定された微小粒子は、前記第一液体に含まれた状態で、前記回収流路内の、前記第一液体と非混和性である第二液体中に回収される、
　微小粒子分取用マイクロチップ。
〔１９〕微小粒子が通流される主流路と、
　前記微小粒子のうち、回収対象粒子が回収される回収流路と、
　前記主流路と前記回収流路とを接続する接続流路と、
　前記接続流路に液体を供給可能に接続されている液体供給流路と、
を含む流路構造を有する微小粒子分取用マイクロチップと、
　前記主流路に、微小粒子を含む第一液体を供給する第一液体供給部と、
　前記液体供給流路に、前記第一液体と非混和性である第二液体を供給する第二液体供給部と、
　前記主流路内を流れる微小粒子が回収対象粒子であるかを判定する判定部と、
　を備えている微小粒子回収装置。
〔２０〕前記微小粒子分取用マイクロチップが、前記微小粒子回収装置から取り外し可能である、〔１９〕に記載の微小粒子回収装置。
〔２１〕微小粒子が通流される主流路と、
　前記微小粒子のうち、回収対象粒子が回収される回収流路と、
　前記主流路と前記回収流路とを接続する接続流路と、
　前記接続流路に液体を供給可能に接続されている液体供給流路と、を含む流路構造を有する微小粒子分取機構において、微小粒子を含む第一液体を前記主流路に流す通流工程と、
　前記主流路を流れる微小粒子が回収対象粒子であるかを判定する判定工程と、
　回収対象粒子を前記回収流路内へと回収する回収工程とを含み、且つ、
　前記回収工程において、前記回収対象粒子は、前記第一液体に含まれた状態で、前記回収流路内の、前記第一液体と非混和性である第二液体中に回収される、
　微小粒子含有エマルション粒子を含むエマルションの製造方法。
〔２２〕１つの微小粒子を含むエマルション粒子の数の割合が、エマルション粒子全数に対して７０％以上である、微小粒子含有エマルション粒子を含むエマルション。
１００　微小粒子回収装置
１５０　微小粒子分取用マイクロチップ
１５５　主流路
１５９　回収流路
１６１　液体供給流路
１７０　接続流路

Claims (22)

  1. 　微小粒子が通流される主流路と、
    　前記微小粒子のうち、回収対象粒子が回収される回収流路と、
    　前記主流路と前記回収流路とを接続する接続流路と、
    　前記接続流路に液体を供給可能に接続されている液体供給流路と、を含む流路構造を有する微小粒子分取機構において、微小粒子を含む第一液体を前記主流路に流す通流工程と、
    　前記主流路を流れる微小粒子が回収対象粒子であるかを判定する判定工程と、
    　回収対象粒子を前記回収流路内へと回収する回収工程とを含み、且つ、
    　前記回収工程において、前記回収対象粒子は、前記第一液体に含まれた状態で、前記回収流路内の、前記第一液体と非混和性である第二液体中に回収される、
    　微小粒子回収方法。
  2. 　前記微小粒子回収方法を実施することによって、前記回収流路内に、前記第二液体を分散媒とし且つ前記第一液体を分散質とするエマルションが形成される、請求項１に記載の微小粒子回収方法。
  3. 　前記微小粒子回収方法を実施することによってエマルションが形成され、且つ、当該エマルションを構成する液滴の少なくとも一部が、前記回収対象粒子を１つ含む、請求項１に記載の微小粒子回収方法。
  4. 　前記第一液体が親水性であり、且つ、前記第二液体が疎水性である、請求項１に記載の微小粒子回収方法。
  5. 　前記第二液体の動粘度が、前記第一液体の動粘度の１／１００倍～１００倍である、請求項１に記載の微小粒子回収方法。
  6. 　前記通流工程、前記判定工程、及び前記回収工程は、前記第二液体を前記液体供給流路から前記接続流路へと供給しながら行われる、請求項１に記載の微小粒子回収方法。
  7. 　前記主流路が、前記接続流路及び回収対象粒子以外の微小粒子が流れる少なくとも一つの廃棄流路へと分岐し、
    　前記液体供給流路が、前記接続流路へ液体を供給する、
    　請求項１に記載の微小粒子回収方法。
  8. 　前記接続流路に、前記第一液体が前記回収流路へと進行することを防ぐバルブが設けられている、請求項１に記載の微小粒子回収方法。
  9. 　前記通流工程において、前記微小粒子が前記主流路内を略一列に並んで前記接続流路に向かって流れる、請求項１に記載の微小粒子回収方法。
  10. 　前記微小粒子分取機構は、微小粒子を含有する液体が流れるサンプル流路及び微小粒子を含有しない液体が流れるシース流路が合流部で主流路へ連結し、合流部後の主流路に微小粒子が主流路内を略一列に並び流れるようにする流路構造を有し、
    　当該流路構造によって、略一列に並んで流れる微小粒子を含む層流が形成される、
    　請求項１に記載の微小粒子回収方法。
  11. 　前記判定工程において、前記主流路中を流れる微小粒子に光が照射され、当該照射により生じた光に基づき当該微小粒子が回収対象粒子であるかが判定される、請求項１に記載の微小粒子回収方法。
  12. 　前記回収工程において、前記回収流路内の圧力変動により、前記回収対象粒子が前記接続流路を通って前記回収流路内へと回収される、請求項１に記載の微小粒子回収方法。
  13. 　前記主流路、前記接続流路、及び前記回収流路が直線状に並んでいる、請求項１に記載の微小粒子回収方法。
  14. 　前記微小粒子が細胞又は細胞塊であり、且つ、前記第一液体が当該微小粒子の培養液である、請求項１に記載の微小粒子回収方法。
  15. 　前記微小粒子が細胞、細胞塊、又は合成粒子であり、且つ、前記回収工程後に当該微小粒子が破壊される、請求項１に記載の微小粒子回収方法。
  16. 　前記回収流路内の回収された微小粒子が、さらなる微小粒子分取処理に付される、請求項１に記載の微小粒子回収方法。
  17. 　前記微小粒子分取機構が、前記流路構造を一つ又は二つ以上含む、請求項１に記載の微小粒子回収方法。
  18. 　微小粒子が通流される主流路と、
    　前記微小粒子のうち、回収対象粒子が回収される回収流路と、
    　前記主流路と前記回収流路とを接続する接続流路と、
    　前記接続流路に液体を供給可能に接続されている液体供給流路と、を含む流路構造を有し、
    　前記主流路は、第一液体に含まれた状態で流れる微小粒子が回収対象粒子であるかを判定するために用いられる判定領域を有し、
    　回収対象粒子であると判定された微小粒子は、前記第一液体に含まれた状態で、前記回収流路内の前記第一液体と非混和性である第二液体中に回収される、
    　微小粒子分取用マイクロチップ。
  19. 　微小粒子が通流される主流路と、
    　前記微小粒子のうち、回収対象粒子が回収される回収流路と、
    　前記主流路と前記回収流路とを接続する接続流路と、
    　前記接続流路に液体を供給可能に接続されている液体供給流路と、
    を含む流路構造を有する微小粒子分取用マイクロチップと、
    　前記主流路に、微小粒子を含む第一液体を供給する第一液体供給部と、
    　前記液体供給流路に、前記第一液体と非混和性である第二液体を供給する第二液体供給部と、
    　前記主流路内を流れる微小粒子が回収対象粒子であるかを判定する判定部と、
    　を備えている微小粒子回収装置。
  20. 　前記微小粒子分取用マイクロチップが、前記微小粒子回収装置から取り外し可能である、請求項１９に記載の微小粒子回収装置。
  21. 　微小粒子が通流される主流路と、
    　前記微小粒子のうち、回収対象粒子が回収される回収流路と、
    　前記主流路と前記回収流路とを接続する接続流路と、
    　前記接続流路に液体を供給可能に接続されている液体供給流路と、を含む流路構造を有する微小粒子分取機構において、微小粒子を含む第一液体を前記主流路に流す通流工程と、
    　前記主流路を流れる微小粒子が回収対象粒子であるかを判定する判定工程と、
    　回収対象粒子を前記回収流路内へと回収する回収工程とを含み、且つ、
    　前記回収工程において、前記回収対象粒子は、前記第一液体に含まれた状態で、前記回収流路内の、前記第一液体と非混和性である第二液体中に回収される、
    　微小粒子含有エマルション粒子を含むエマルションの製造方法。
  22. 　１つの微小粒子を含むエマルション粒子の数の割合が、エマルション粒子全数に対して７０％以上である、微小粒子含有エマルション粒子を含むエマルション。
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