WO2007068764A1 - Verfahren zur extraktion von biomolekülen aus fixierten geweben - Google Patents

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WO2007068764A1
WO2007068764A1 PCT/EP2006/069842 EP2006069842W WO2007068764A1 WO 2007068764 A1 WO2007068764 A1 WO 2007068764A1 EP 2006069842 W EP2006069842 W EP 2006069842W WO 2007068764 A1 WO2007068764 A1 WO 2007068764A1
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WO
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biological sample
aqueous solution
nucleophilic reagent
fixed
biomolecule
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PCT/EP2006/069842
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English (en)
French (fr)
Inventor
Martin Schlumpberger
Ralf Peist
Original Assignee
Qiagen Gmbh
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor

Definitions

  • the present invention relates to a method for treating a fixed biological sample, the biological sample obtainable by this method, the use of a nucleophilic reagent for treating a fixed biological sample, a kit for isolating a biomolecule from a fixed biological sample, the use of this kit and a method of treating a disease.
  • the fixation is achieved by protein-precipitating or protein-crosslinking compounds such as acids, alcohols, ketones or other organic substances such as glutaraldehyde or formaldehyde, wherein the fixation with formaldehyde (used in the form of a designated as "formalin" 35 wt .-% retessri- QIAGEN GmbH PA180-PCT
  • FFPE formalin-fixed, paraffin-embedded
  • the mRNA coding for the thymidylate synthase can be isolated from an FFPE tumor tissue, as described in WO-A-01/46402, it is possible to infer the enzyme expression via the amount of mRNA in the tissue and thus the behavior of the tumor against certain cytotoxic agents can be drawn.
  • the biomolecules in the FFPE materials are cross-linked and cross-linked RNA is not a suitable substrate in biochemical assays, particularly in reverse transcription or polymerase chain reaction (PCR), and cross-linked proteins are often very poor antigens for immunological detection, it is required prepare the FFPE material accordingly before analysis of the biomolecules.
  • WO-A-01/46402 proposes to heat the FFPE material with a chaotropic solution containing an effective amount of a guanidinium compound at a temperature of 75 to 100 ° C. for 5 to 120 minutes.
  • the disadvantage of this method is that the conditions under which the material is heated often leads to at least partial destruction of the biomolecules, in particular sensitive biomolecules such as RNA.
  • the treatment times required for a sufficient solution of formaldehyde crosslinking are often very long.
  • US-A-2005/0014203 proposes to first heat a fixed biological sample in order to at least partially dissolve the cross-linking of the biomolecules and then to incubate the sample thus treated with a proteolytic enzyme, for example proteinase K, around the tissue and to decompose the cellular structures of the tissue.
  • a proteolytic enzyme for example proteinase K
  • the disadvantage of this method is likewise that very high temperatures are required for dissolving the crosslinking, especially in the case of short incubation times, and that this process takes place only very slowly at moderate temperatures.
  • the present invention has for its object to overcome the disadvantages resulting from the prior art.
  • the present invention the object of the invention to provide a method by which a fixed biological sample, preferably fixed with formaldehyde biological sample under the gentlest possible conditions can be treated so that the biomolecules in a simple manner isolated from the biological sample or in the biological sample can be detected.
  • the present invention was also based on the object of specifying a method for treating a preferably fixed with formaldehyde biological sample, with which compared to the known from the prior art method at a treatment temperature of preferably less than 95 ° C, the resulting by fixing Crosslinking in the biological sample can be solved faster.
  • the aqueous solution having the fixed biological sample contacted during extraction of proteins does not contain a proteolytically active compound such as a protease.
  • the fixed biological sample provided in method step i) can be a complete organism, a part of an organism, in particular a tissue fragment or a tissue section, a body fluid, a cell or a virus, cells, tissue fragments and especially tissue sections being particularly preferred biological samples.
  • animals, plants or microorganisms such as bacteria, yeasts or fungi come into consideration as an organism, a human biological sample being a particularly preferred starting material and a human tissue section, a human-isolated cell or a cultured human cell most preferred biological samples.
  • fixation of the biological sample can be carried out with all fixatives known to the person skilled in the art, in particular with acids, alcohols, ketones or other organic substances, such as glutaraldehyde or formaldehyde, with formaldehyde-fixed biological samples being particularly preferred and with an aqueous formaldehyde solution, containing 1 to 35 wt .-%, preferably 2 to 10 wt .-% formaldehyde fixed biological samples are most preferred.
  • a biological sample fixed in formaldehyde and embedded in paraffin is used as biological sample in method step i).
  • Such samples are commonly referred to as FFPE samples.
  • FFPE samples are preferably prepared by first dewatering a formalin-fixed biological sample, preferably by means of an ascending alcohol series (ie a series of water / alcohol mixtures with increasing amounts).
  • an ascending alcohol series ie a series of water / alcohol mixtures with increasing amounts.
  • the dehydrated sample is dipped in liquid paraffin, which is cured after the sample has been sufficiently penetrated by the paraffin.
  • suitable cutting devices for example by means of a microtome, tissue sections can then be produced from the paraffin block, wherein the thickness of these sections for light microscopic examination is usually about 5 to 20 ⁇ m.
  • the paraffined of the sample may also be by other methods, such as by punching with a hollow needle or by the so-called J ⁇ aser Capture "- procedure into smaller sample fragments are comminuted.
  • the fixed biological sample provided in method step i) is then brought into contact with a preferably aqueous solution containing at least one nucleophilic reagent.
  • a preferably aqueous solution containing at least one nucleophilic reagent is then brought into contact with a preferably aqueous solution containing at least one nucleophilic reagent.
  • the biological sample is a paraffin-embedded biological sample, it is preferred to at least partially, preferably completely, remove the paraffin first from the biological sample prior to contacting the sample with the preferably aqueous solution.
  • the removal of the paraffin from the biological sample can in principle be carried out by all methods of deparaffinization of biological samples known to the person skilled in the art.
  • the deparaffination is accomplished by first contacting the sample with a hydrophobic organic solvent, especially with an aromatic hydrocarbon, most preferably with xylene, to dissolve out the paraffin. It may also be advantageous to move the mixture of the biological sample and the organic solvent, for example, to shake on
  • this step of separating the paraffin from the biological sample may be repeated once, twice or even ten times.
  • other processes such as, for example, the melting of the paraffin, can be used as methods for the deparaffinization, as described by Banerjee et al., Biotechniques, 18 (1995), pages 768-773.
  • Ci- to Cs-alcohols are particularly preferred
  • ethanol, methanol and isopropanol are more preferred and ethanol is most preferred.
  • an alcohol series having a concentration range from 100% by volume to 70% by volume is used, the concentration difference between two aqueous alcohol solutions successive in their concentration preferably being less than 10% by volume, particularly preferably not more than 5% vol.
  • a descending alcohol series suitable according to the invention comprises, for example, the concentrations 100% by volume, 95% by volume, 90% by volume, 80% by volume and 70% by volume.
  • the invention may be preferred according to the invention to homogenize the optionally deparaffinized and rehydrated biological sample prior to contacting it with the preferably aqueous solution in method step ii), which may be advantageous, in particular for larger tissue fragments.
  • This homogenization can be carried out by any apparatus known to a person skilled in the art for comminuting a biological sample, in particular by high-pressure cell disruption, by means of a mechanical comminution device, for example a mill, a rotor-stator homogenizer, an Ultra-Turrax homogenizer or a fine cannula, or by ultrasonic homogenizers.
  • the fixed biological sample is then brought into contact with a preferably aqueous solution containing at least one nucleophilic reagent.
  • Lewis bases are suitable, which are able to transfer electrons into an empty orbital or in empty orbitals of a Lewis acid.
  • Particularly preferred among these Lewis bases are reagents which have at least one functional group which carries a negative charge which is negatively polarized or which has at least one free electron pair.
  • Compounds comprising a functional group having a negative charge include, for example, alkali or alkaline earth alkoxides, alkali or alkaline earth hydroxides, alkali or alkaline earth halides, alkali or alkaline earth cyanides, and the like.
  • QIAGEN GmbH PA180-PCT alkali or alkaline earth alkoxides, alkali or alkaline earth hydroxides, alkali or alkaline earth halides, alkali or alkaline earth cyanides, and the like.
  • Reagents which have at least one functional group which is negatively polarized are, in particular, those reagents which have at least one functional group in which there are two covalently linked atoms which in their electronegativity according to Alfred and Rochow are at least 0, 25, more preferably by at least 0.5 and more preferably by at least 1, 0 differ.
  • nucleophilic reagents which are particularly preferred according to the invention are those which have at least one functional group having one or two, more preferably a lone pair of electrons, of which in turn those are most preferred which contain at least one primary, secondary or tertiary amino group.
  • R 1 is a Ci to C 2 o hydrocarbon group, more preferably a C 2 - to Ci5 hydrocarbon group and more preferably a C 2 to Cio hydrocarbon group having at least one heteroatom
  • R 2 is a C 1 to C 20 alkyl group, particularly preferably a C 1 to C 10 alkyl group and moreover preferably a C 1 to C 2 alkyl group, in particular a methyl group or an ethyl group, a C 1 to C 20 hydroxyalkyl group , particularly preferably a C 1 to C 10 -hydroxyalkyl group and moreover preferably a C 1 to C 2
  • Hydroxyalkyl group or a hydrogen atom with a hydrogen atom being most preferred, and
  • R 3 is a C 1 to C 20 alkyl group, particularly preferably a C 1 to C 10 alkyl group and moreover preferably a C 1 to C 2 alkyl group, in particular a methyl group or an ethyl group, a C 1 to C 20
  • Hydroxyalkyl group particularly preferably a C 1 to C 10 -
  • Hydroxyalkyl group and moreover preferably a C 1 to C 2 -
  • Hydroxyalkyl group or a hydrogen atom with one hydrogen atom being most preferred.
  • nucleophilic reagents having a functional group of structure I shown above are those which have at least one functional group of structure I in which at least one of R 2 and R 3 , most preferably both R 2 and R 3 is a hydrogen atom or are.
  • nucleophilic reagents are preferred which have at least one functional group of the structure I, in which the nitrogen atom is covalently linked only to those atoms in the radicals R 1 , R 2 and R 3 , which are sp 3 hybridized.
  • none of the radicals R 1 , R 2 or R 3 should be able to delocalize the free electron pair on the nitrogen atom over the radicals R 1 , R 2 or R 3 .
  • nucleophilic reagents having at least one functional group of the structure I are selected from the group consisting of methylamine, ethylamine, ethanolamine, n-propylamine, n-butylamine, isobutylamine, tert-butylamine, dimethylamine, diethylamine, diethanolamine, di-methylamine.
  • aromatic amines are selected from the group consisting of aniline, toluidine, naphthylamine, benzylamine, xylides, xylenediamines, naphthalenediamines, toluene diamines, 3,3'-dimethyl-4,4 ' diphenyldiamine, phenylenediamines, 2,4'-methylenedianiline, 4,4'-methylenedianiline, sulfonyldianiline, and dimethylbenzylamine.
  • nucleophilic reagent is at least one primary amino group of
  • the nucleophilic reagent is a cis bis
  • Ci to C 15 aminoalcohol around a Ci to C 15 Aminodiol, or around a Ci to C 15 Aminocarbon Textre.
  • the nucleophilic reagent is a heterocyclic, nitrogen atom-containing compound selected from the group consisting of pyrrole, pyridine, quinoline, indole, aza-cyclopentane, aza-cyclohexane, morpholine, piperidine, imidazole or a derivative of these compounds, a derivative of these compounds preferably being understood as meaning a derivative in which one to one or more carbon atoms or to the nitrogen atom in the abovementioned compounds contains a C 1 -C 6 -alkyl group, particularly preferably a methyl group or ethyl Group is bound instead of a hydrogen atom.
  • nucleophilic reagents mentioned above, particular preference is given to those which are water-soluble, in particular those which in water at a temperature of 25 ° C. and at a pH of 7 have a solubility of at least 1 g / L, especially preferably at least 10 g / L and moreover preferably at least 100 g / L.
  • the preferably aqueous solution comprising the above-described nucleophilic reagent can be based on pure, preferably deionized water or else on other aqueous systems, in particular mixtures of water and organic solvents such as alcohols, in particular mixtures of water and ethanol or methanol, wherein the amount water, preferably at least 50% by weight, more preferably at least 75% by weight and most preferably at least 90% by weight, based in each case on the total weight of water and organic solvent, of physiological saline solutions, on buffers, in particular buffers including buffer components known to those skilled in the art, such as TRIS, HEPES, PIPES, QIAGEN GmbH PA180-PCT
  • nutrient media such as MEM medium and DMEM medium can be used as an aqueous system.
  • the preparation of the aqueous solution containing the nucleophilic reagent is preferably carried out by simply mixing water or a corresponding aqueous system with the nucleophilic reagent.
  • the concentration of the nucleophilic reagent in the aqueous solution is preferably in a range of from 0.1 to 10,000 mmol / l, more preferably from 1 to 5,000 mmol / l, still more preferably from 5 to 2,500 mmol / l, and most preferably from 20 to 1000 mmol / l.
  • the concentration of the nucleophilic reagent in the aqueous solution is more than 20 mmol / l, more preferably more than 50 mmol / l and most preferably more than 100 mmol / l.
  • the pH of the aqueous solution is preferably in a range of from 2 to 12, more preferably from 4 to 9, and most preferably from 5 to 8, each measured at room temperature.
  • the contacting of the aqueous solution with the biological sample is preferably carried out by immersing the biological sample in a simple manner in a sufficient amount of the aqueous solution. If, for example, the biological sample is in the form of a tissue section and in the form of an adherent cell on a substrate, the contact between the biological QIAGEN GmbH PA180-PCT
  • gical sample with the aqueous solution preferably by simply coating the substrate with the aqueous solution.
  • step iii) of the process according to the invention placed with the aqueous solution into contact biological sample is now heated, preferably to a temperature in a range of 50 to 100 0 C, particularly preferably from 55 to 95 ° C, more preferably of 60 is heated to 90 0 C and most preferably 65 to 85 ° C.
  • it can erfmdungsge- Gurss be advantageous, brought into contact with the aqueous solution of biological see sample to a temperature of less than 95 ° C, more preferably less than 90 0 C, and most preferably less than 80 0 C to heat.
  • the biological sample brought into contact with the aqueous solution is at a temperature in a range from 65 to 85 ° C, especially preferably heated from 75 to 85 0 C.
  • the biological sample is boiled for 5 to 40 minutes before process step iii), ie heated to about 100 ° C.
  • step iii) depends essentially on the temperature and the reactivity of the nucleophilic reagent, and the person skilled in the art will be able to ascertain by simple routine experiments when sufficient destruction of the cross-linking of the biological sample has occurred under the given treatment conditions.
  • the duration of heating is QIAGEN GmbH PA180-PCT
  • the duration of heating may be up to 16 hours.
  • any apparatus known to a person skilled in the art for comminuting biological samples may be used for comminuting.
  • the comminution can be effected by means of high-pressure cell disruption, by means of a mechanical comminution device, for example a rotor-stator homogenizer, a mill, an Ultra-Turrax homogenizer or a fine cannula, or by ultrasound homogenizers.
  • enzymes in this context are proteases, of which trypsin, proteinase K, chymotrypsin, papain, pepsin, pronase QIAGEN GmbH PA180-PCT
  • thermostable protease can also be used as the enzyme, as described for example in WO-A-91/19792 (isolated from Thermococcus celer, Therococcus sp.ANl, Thermococcus stetteri or Thermococcus litoralis) or in WO-A-91/19792 (isolated from Staphylothermus marinus).
  • WO-A-91/19792 isolated from Thermococcus celer, Therococcus sp.ANl, Thermococcus stetteri or Thermococcus litoralis
  • WO-A-91/19792 isolated from Staphylothermus marinus
  • no proteolytically active compound such as a protease
  • a nuclease such as a DNase and / or RNase, preferably a heat-stable nuclease, may be used here.
  • the concentration of the enzyme in the aqueous solution is preferably in a range of 0.001 to 5% by weight, more preferably 0.01 to 2.5% by weight, and most preferably 0.05 to 0.2% by weight. , in each case based on the total weight of the aqueous solution.
  • Preferred detergents are compounds selected from the group comprising sodium dodecyl sulfate (SDS), polyethylene glycol phenol ethers such as Triton-X-100, Tween, NP-40 or mixtures thereof, with SDS and Triton-X-100 being particularly preferred as detergents ,
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • polyethylene glycol phenol ethers such as Triton-X-100, Tween, NP-40 or mixtures thereof, with SDS and Triton-X-100 being particularly preferred as detergents
  • the amount of detergent used to lyse the cells contained in the biological sample will depend on the type and amount of biological sample and can be determined by one skilled in the art by simple routine experimentation.
  • Guanidinium isothiocyanate or guanidinium hydrochloride are particularly preferred as chaotropic substances, with guanidinium isothiocyanate being particularly preferred.
  • Chaotropic substances are used in particular when nucleic acids are to be isolated from the biological sample after the treatment according to the invention.
  • reducing compounds in particular dithiothreitol (DTT) or ß-mercaptoethanol, are used.
  • concentration of chaotropic compound in the treatment of the biological sample is preferably in a range of 0.1 to 50 mol / l, more preferably 0.5 to 20 mol / l, and most preferably 1 to 10 mol / l.
  • the incubation of the biological material with the enzyme, the detergent or the chaotropic compound can, as stated above, before, during the heating in step iii), before the process step ii) or after the process step iii) take place.
  • the incubation of the biological material with the enzyme, the detergent and / or the chaotropic compound takes place before process step ii).
  • the biological sample with an aqueous solution containing the enzyme, the detergent, the chaotropic compound QIAGEN GmbH PA180-PCT
  • a reducing compound such as .beta.-mercaptoethanol
  • the incubation of the biological material with the enzyme, the detergent or the chaotropic compound is carried out after process step iii).
  • the aqueous solution containing the nucleophilic reagent can be removed from the biological sample and this biological sample then contacted with the lysis buffer, or the aqueous solution containing the nucleophilic reagent becomes the enzyme Detergent, the chaotropic compound or at least two thereof, optionally in the form of a concentrated solution added.
  • heating takes place to a temperature necessary for adequate lysis.
  • the incubation of the biological material with the enzyme, the detergent or the chaotropic compound takes place during process step iii).
  • the aqueous solution used in process step ii) is an aqueous solution which, in addition to the nucleophilic reagent, contains the enzyme, the detergent, the chaotropic compound or at least two thereof, or the enzyme is added to the aqueous solution prior to heating in process step iii) , the detergent, the chaotrope compound or at least two thereof, optionally in the form of a concentrated aqueous solution, is added.
  • PA180-PCT PA180-PCT
  • the temperature for a satisfactory solution of the crosslinking is preferably from 50 to 100.degree. C., more preferably from 55 to 95.degree. even more preferably from 60 to 90 0 C and most preferably 65 to 85 ° C without affecting the enzyme activity can be maintained.
  • an aqueous solution is generally present in which at least part of the biological sample removed by the treatment according to the invention dissolved biomolecules is dissolved.
  • this aqueous solution may also comprise other components, such as the nucleophilic reagent, enzymes, detergents, chaotropic compounds, and the like.
  • this process also comprises the process step in addition to process steps i) to iii)
  • biomolecule is preferably a protein, a glycoprotein, a lipid, a glycolipid, an RNA or a DNA, most preferably RNA.
  • an aqueous solution which after purification of a biomolecule in one of the two aforementioned compositions Al) or A2), for example by filtration, dialysis, extraction, precipitation, chromatography or a combination of these purification methods, but preferably by adsorption obtained
  • a purification by separation of the aqueous solution Al) or A2) into a protein fraction, an RNA fraction and a DNA fraction for example by selective precipitation, extraction or adsorption is particularly preferred and a separation by adsorption on most preferred is, or
  • the analysis of the biomolecule in the respective compositions A1) to A4) is preferably carried out by the analysis methods known to the person skilled in the art.
  • immunological methods such as Western European QIAGEN GmbH PA180-PCT
  • tern blotting enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs), immunoprecipitation or affinity chromatography, mutation analyzes, polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE), in particular two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis (2D-P AGE), high performance liquid chromatography (HPLC) , Polymerase Chain Reaction (PCR), Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) Analysis, Southern Blotting, Serial Analysis of Gene Expression (SAGE), Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC), MALDI-TOFF Mass Spectrometry, SELDI Mass Spectrometry, Microarray analysis and the like into consideration.
  • PAGE polyacrylamide gel electrophoresis
  • 2D-P AGE two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • PCR Polymerase Chain Reaction
  • RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism
  • Southern Blotting Serial Analysis of Gene Expression (SAGE), Fast Protein Li
  • the biological sample may be brought into contact with at least one enzyme during heating in process step iii), before process step ii) or after process step iii).
  • the biological sample can be brought into contact with at least one enzyme prior to process step ii).
  • the enzyme When the biomolecule to be analyzed is DNA and / or RNA, the enzyme may be a protease as disclosed above. When the biomolecule to be analyzed is a protein, the enzyme may be a nuclease as disclosed above.
  • a particular embodiment of the invention comprises a method for treating a formaldehyde-fixed biological sample for later analysis of proteins contained in the sample, comprising the method steps:
  • a detergent such as SDS is particularly preferably added and / or the detergent is already present in the aqueous solution.
  • the biological sample is preferably boiled in the aqueous solution prior to step iii) for 5 to 40 minutes, and then preferably incubated in step iii) for a period of 20 minutes to 16 hours.
  • nucleophilic reagent as described above, in particular a nucleophilic reagent having at least one primary, secondary or tertiary amino group of the structure I, for treatment of a fixed biological sample, in particular for the treatment of a formaldehyde fixed with biological sample affords a contribution to the solution of the aforementioned tasks.
  • nucleophilic reagents are those reagents which have already been mentioned as preferred reagents in connection with the process according to the invention.
  • the kit also contains components for lysing a cell, in particular enzymes ( ⁇ 4), preferably one of the proteolytic enzymes mentioned above in connection with the method according to the invention, detergents or chaotropic substances ( ⁇ 5), preferably one of the chaotropic substances mentioned above in connection with the method according to the invention.
  • the enzyme and the chaotropic substance may be contained, alone or in combination, already in the buffer ( ⁇ 1) containing the nucleophilic reagent.
  • the kit comprises a corresponding lysis buffer ( ⁇ l ') in which these compounds are contained and which can be used for the digestion of a biological sample.
  • the kit according to the invention may comprise a lysing concentrate ( ⁇ l ") which contains an enzyme, a detergent or a chaotropic compound in concentrated form and which may be added to the buffer ( ⁇ l) at an appropriate time when applying the kit.
  • ⁇ 2 As a matrix ( ⁇ 2) for adsorbing a biomolecule, it is possible to use all materials known to the person skilled in the art for adsorbing a biomolecule, in particular a protein.
  • QIAGEN GmbH PA180-PCT As a matrix ( ⁇ 2) for adsorbing a biomolecule, it is possible to use all materials known to the person skilled in the art for adsorbing a biomolecule, in particular a protein.
  • teins a DNA or an RNA
  • using cellulose-based materials in particular carboxy-functional cellulosic materials or diethylaminoethyl cellulose, agarose, or mineral carriers such as silica, glass, quartz, zeolites, or metal oxides, or coated with ion exchange materials Carrier, are particularly preferred.
  • the materials mentioned can be present for example in the form of membranes or magnetic or non-magnetic particles.
  • this matrix is contained as a column material in already prefabricated columns or as a suspension in the kit.
  • the type of matrix depends decisively on the chemical structure of the biomolecules to be analyzed, it being clear to the person skilled in the art for the particular application, eg. As analysis of proteins, RNA or DNA, suitable adsorption materials are known.
  • the elution buffer is preferably an aqueous salt solution, in particular aqueous solutions containing alkali halides, such as NaCl, KCl or LiCl, alkaline earth halides, such as CaCl 2 or MgCl 2 , ammonium salts such as ammonium chloride or ammonium sulfate or mixtures of at least two optionally, buffering systems such as alkali acetate / acetic acid or tris (hydroxymethyl) aminomethane based buffer systems may also be included in the elution buffer.
  • alkali halides such as NaCl, KCl or LiCl
  • alkaline earth halides such as CaCl 2 or MgCl 2
  • ammonium salts such as ammonium chloride or ammonium sulfate or mixtures of at least two optionally, buffering systems such as alkali acetate / acetic acid or tris (hydroxymethyl) aminomethane based buffer systems may also be
  • the latter may also contain a wash buffer with which the matrix can be detected.
  • a wash buffer with which the matrix can be detected.
  • kit according to the invention in a method for isolating biomolecules from a fixed, preferably a biological sample fixed with formaldehyde.
  • FIG. 1 shows the yield of RNA (in ng) from a formalin-fixed and deparaffinized tissue section from the lung of a rat after the treatment according to the invention.
  • FIG. 2 shows the behavior of the RNA (in terms of the number of PCR cycles required to reach a specific DNA amount in a real-time RT-PCR analysis), which is determined by the method according to the invention from a formalin-fixed and deparaffinized tissue section the rat liver was isolated in a PCR analysis.
  • FIG. 3 shows the yield of RNA (in ng) from a formalin-fixed and deparaffinized tissue section from the liver of a rat after the treatment according to the invention.
  • Figure 4 shows the yield of intact protein from a formalin-fixed and deparaffinized tissue section from the gut and lung of a rat after treatment according to the invention.
  • FIG. 5 shows the yield of intact proteins from a formalin-fixed and deparaffinized tissue section from the heart of a rat after the treatment according to the invention as a function of the temperature in the incubation step.
  • Formalin-fixed and deparaffinized tissue sections (10 ⁇ m) from the lung of a rat were each treated with 250 ⁇ l of an aqueous solution containing 5 mol / l guanidine hydrochloride and different nucleophilic reagents (13 mM TRIS, 350 mM TRIS, 5% by weight). Trimethylamine, 10 mg / ml aminoguanidine or 50 mg / ml aminoguanidine), the pH of the aqueous solutions being 7.5 each.
  • the sections were incubated at 70 ° C. for 60 minutes with the appropriate solutions.
  • RNA was isolated from the obtained cell lysate.
  • genomic DNA using the gDNA eliminator Mini spin column (Qiagen, Hilden, Germany), the flow collected, mixed with 400 ul ethanol, and the thus obtained composition to an RNeasy ® MinElute spin column (Qiagen, Hilden, Germany) applied.
  • RNeasy ® kit contained in the RPE buffer
  • the membrane was dried and the RNA eluted RNase-free by means of 30 ul of water.
  • the amount of RNA in the eluate was determined by OD measurement at 260 nm. The results are shown in FIG.
  • Formalin-fixed and deparaffinized tissue slices (10 ⁇ m) from the liver of a rat were incubated with 250 ⁇ l of an aqueous solution containing different nucleophilic reagents (10 mM TRIS, 10 mM TRIS and 1% ethanolamine, 10 mM TRIS and O, 1% ethanolamine and 10 mM TRIS and 0.01% ethanolamine), the pH of each of the aqueous solutions being 7.5.
  • the cells were incubated for 60 minutes at 70 ° C. with the appropriate solutions. Guanidine hydrochloride was then QIAGEN GmbH PA180-PCT
  • the RNA was isolated from the cell lysate obtained and the behavior of the RNA in the PCR was determined by means of a TaqMan analysis using the QuantiTect Probe RT-PCR Kit from Qiagen, Hilden, Germany, and a corresponding primer / probe set.
  • genomic DNA using the gDNA eliminator Mini spin column (Qiagen, Hilden, Germany), the flow collected, mixed with 400 ul ethanol, and the thus obtained composition to an RNeasy ® MinElute spin column (Qiagen, Hilden, Germany) applied.
  • the membrane After washing twice by means of the RNeasy ® - contained Kit RPE buffer, the membrane, the RNA by 30 ul RNase-free water was dried and eluted.
  • the results of the PCR are shown in FIG.
  • the amount of isolated RNA was determined in Example 2 by means of OD measurement at 260 nm. The results are shown in FIG.
  • FIGS. 2 and 3 show that high amounts of RNA can be isolated by the treatment according to the invention of the samples and that the isolated RNA also shows a good behavior in the PCR analysis.
  • the sections were boiled for 20 min at 100 0 C and then incubated for 2 hours at 80 0 C.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Behandlung einer fixierten biologischen Probe, umfassend die Verfahrensschritte: i) Bereitstellen einer fixierten biologischen Probe, ii) In Kontakt bringen der fixierten biologischen Probe mit einer wässrigen Lösung beinhaltend mindestens ein nukleophiles Reagenz, sowie iii) Erhitzen der mit der wässrigen Lösung in Kontakt gebrachten biologischen Probe. Die Erfindung betrifft auch die durch dieses Verfahren erhältliche biologische Probe, die Verwendung eines nukleophilen Reagenzes zur Behandlung einer fixierten biologischen Probe, einem Kit zur Isolierung eines Biomoleküls aus einer fixierten biologischen Probe, die Verwendung dieses Kits sowie ein Verfahren zur Behandlung einer Krankheit.

Description

VERFAHREN ZUR EXTRAKTION VON BIOMOLEKÜLEN AUS FIXIERTEN GEWEBEN
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Behandlung einer fixierten biologischen Probe, die durch dieses Verfahren erhältliche biologische Probe, die Verwendung eines nukleophilen Reagenzes zur Behandlung einer fixierten biologischen Probe, einen Kit zur Isolierung eines Biomoleküls aus einer fixierten biologischen Probe, die Verwendung dieses Kits sowie ein Verfahren zur Behandlung einer Krankheit.
Wird einem lebenden Organismus biologisches Material wie etwa ein Gewebefragment oder isolierte Zellen entnommen, so sterben diese, sofern keine Geeigneten Maßnahmen wie etwa die Inkubation in Nährmedien erfolgt, nach kurzer Zeit ab. Die abgestorbenen Zellen werden dabei sehr schnell zunächst autolytisch- fermentativ und danach bakteriell zersetzt, so dass die ursprünglichen Zell- und Gewebestrukturen zerstört werden. Sollen daher Zellen oder Gewebefragmente für eine histologische Untersuchung aus einem Organismus entnommen werden, so ist es erforderlich, die entnommene biologische Probe zu Fixieren, um eine Zersetzung derselben zu unterbinden. Diese Fixierung soll lebende Strukturen weitgehend lebensähnlich erhalten, damit sie real beurteilt werden können. Je nach Untersuchungsziel muss das am besten geeignete Fixativ gefunden werden. Die Fixierung bietet aber auch den Vorteil, Präparate als Dokumente aufbewahren zu können. Deshalb sind viele morphologische Untersuchungen nur auf der Basis von fixiertem Material möglich.
Üblicherweise wird die Fixierung durch Eiweiß -fällende oder Eiweiß-vernetzende Verbindungen wie Säuren, Alkohole, Ketone oder andere organische Substanzen wie Glutaraldehyd oder Formaldehyd erzielt, wobei die Fixierung mit Formaldehyd (eingesetzt in Form einer als „Formalin" bezeichneten 35 gew.-%igen wässri- QIAGEN GmbH PA180-PCT
gen Lösung) gefolgt von einer Einbettung des fixierten Materials in Paraffin (sogenanntes „formalin-fixiertes, Paraffin-eingebettetes" (FFPE) Material) vor allem in der Pathologie die größte Bedeutung hat. Der Vorteil der Formalin-Fixierung gegenüber anderen Fixativen, wie etwa 96%igem vergälltem Alkohol, liegt insbe- sondere darin, dass die Zell- und Gewebestrukturen bei der Fixierung vergleichsweise gut erhalten bleiben.
Der Nachteil der Fixierung mit Formaldehyd besteht jedoch insbesondere darin, dass durch den hohen Grad der Vernetzung der Biomoleküle durch das vernetzend wirkende Formaldehyd eine Isolierung von Biomolekülen, wie etwa DNA, RNA oder Proteinen, aus einem FFPE-Material sehr schwierig, eine solche Isolierung dieser Biomoleküle jedoch für zahlreiche Untersuchungen von großer Bedeutung ist. So kann beispielsweise über die Bestimmung der Expression des Enzyms Thymidylat-Synthase in einem Tumorgewebe eine Aussage darüber getroffen werden, ob der Tumor mit bestimmten cyto toxischen Substanzen erfolgreich behandelt werden kann oder ob der Tumor möglicherweise bereits Resistenzen gegen bestimmte Zytostatika entwickelt hat. Kann zum Beispiel die mRNA, welche für die Thymidylat-Synthase kodiert, aus einem FFPE-Tumorgewebe isoliert werden, wie dies in der WO-A-01/46402 beschrieben ist, so kann über die Menge an mRNA im Gewebe ein Rückschluss auf die Enzymexpression und somit das Verhalten des Tumors gegenüber bestimmten Zytostatika gezogen werden. Da jedoch die Biomoleküle in den FFPE-Materialen vernetzt vorliegen und vernetzte RNA in biochemischen Assays, insbesondere bei der reversen Transkription oder der Polymerasekettenreaktion (PCR) kein geeignetes Substrat ist und vernetzte Prote- ine oftmals sehr schlechte Antigene für immunologische Nachweise darstellen, ist es erforderlich, das FFPE-Material vor der Analyse der Biomoleküle entsprechend aufzubereiten. QIAGEN GmbH PA180-PCT
So schlägt WO-A-01/46402 vor, das FFPE-Material mit einer chaotropen Lösung beinhaltend eine effektive Menge einer Guanidinium- Verbindung für 5 bis 120 Minuten auf eine Temperatur von 75 bis 1000C zu erhitzen. Der Nachteil dieses Verfahrens liegt jedoch darin, dass die Bedingungen, unter denen das Material erhitzt wird, oftmals zu einer zumindest teilweisen Zerstörung der Biomoleküle, insbesondere sensitiver Biomoleküle wie etwa RNA führt. Auch sind die für eine ausreichende Lösung der Formaldehyd- Vernetzung erforderlichen Behandlungszeiten oft sehr lang.
US-A-2005/0014203 schlägt vor, eine fixierte biologische Probe zunächst zu Erhitzen, um die Vernetzung der Biomoleküle zumindest teilweise zu lösen, und anschließend die so behandelte Probe mit einem proteolytischen Enzym, beispielsweise mit Proteinase K, zu inkubieren, um das Gewebe und die zellulären Strukturen des Gewebes zu zersetzen. Der Nachteil dieses Verfahrens besteht e- benfalls darin, dass insbesondere bei kurzen Inkubationszeiten sehr hohe Temperaturen für das Lösen der Vernetzung erforderlich sind und dass bei gemäßigten Temperaturen dieser Vorgang nur sehr langsam erfolgt.
Der vorliegenden Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, die sich aus dem Stand der Technik ergebenden Nachteile zu überwinden.
Insbesondere lag der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren anzugeben, mit dem eine fixierte biologische Probe, vorzugsweise eine mit Formaldehyd fixierte biologische Probe unter möglichst schonenden Bedingungen derart behandelt werden kann, dass die Biomoleküle in einfacher Weise aus der biologischen Probe isoliert oder in der biologische Probe nachgewiesen werden können. QIAGEN GmbH PA180-PCT
Der vorliegenden Erfindung lag auch die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Behandlung einer vorzugsweise mit Formaldehyd fixierten biologischen Probe anzugeben, mit dem im Vergleich zu den aus den Stand der Technik bekannten Verfahren bei einer Behandlungstemperatur von vorzugsweise weniger als 95°C die durch das Fixieren entstandenen Vernetzungen in der biologischen Probe schneller gelöst werden können.
Einen Beitrag zur Lösung der eingangs genannten Aufgaben leistet ein Verfahren zur Behandlung einer fixierten biologischen Probe, umfassend die Verfahrens- schritte:
i) Bereitstellen einer fixierten biologischen Probe, ii) In Kontakt bringen der fixierten biologischen Probe mit einer vorzugsweise wässrigen Lösung beinhaltend mindestens ein nukleophiles Reagenz, sowie iii) Erhitzen der mit der wässrigen Lösung in Kontakt gebrachten biologischen
Probe.
Überraschend wurde festgestellt, dass sich die durch die Fixierung biologischer Proben, insbesondere durch die Formaldehyd-Fixierung entstandenen Vernetzun- gen innerhalb der biologischen Proben in Gegenwart eines nukleophilen Reagenzes deutlich schneller lösen lassen.
Ferner konnte überraschenderweise auch festgestellt werden, dass in einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens eine quantitative A- nalyse von Proteinen aus Formalin fixierten Geweben möglich ist. Im Unterschied zum bekannten Stand der Technik wird bei der Behandlung die fixierte Probe bei einer Temperatur zwischen 70 und 90 0C unter Anwesenheit eines nukleophilen Reagenz inkubiert. Dies führt zu einer Freisetzung einer ausreichenden Menge an intakten Proteinen, die anschließend genau quantifiziert werden QIAGEN GmbH PA180-PCT
können. Vorzugsweise enthält die wässrige Lösung mit der die fixierte biologische Probe in Kontakt gebracht bei der Extraktion von Proteinen keine proteolytisch wirksame Verbindung wie beispielsweise eine Protease.
Die im Verfahrensschritt i) bereitgestellte fixierte biologische Probe kann ein vollständiger Organismus, ein Teil eines Organismus, insbesondere ein Gewebefragment oder ein Gewebeschnitt, eine Körperflüssigkeit, eine Zelle oder ein Virus sein, wobei Zellen, Gewebefragmente und insbesondere Gewebeschnitte besonders bevorzugte biologische Proben sind. Als Organismus kommen wiederum Tiere, Pflanzen oder Mikroorgansimen wie Bakterien, Hefen oder Pilze in Betracht, wobei eine menschliche biologische Probe ein besonders bevorzugtes Ausgangsmaterial und ein menschlicher Gewebeschnitt, eine aus dem Menschen isolierte Zelle oder eine kultivierte menschliche Zelle am meisten bevorzugte biologische Proben sind.
Die Fixierung der biologischen Probe kann mit allen den Fachmann bekannten Fixativen erfolgen, insbesondere mit Säuren, Alkoholen, Ketonen oder anderen organischen Substanzen, wie etwa Glutaraldehyd oder Formaldehyd, wobei mit Formaldehyd fixierte biologische Proben besonders bevorzugt und mit einer wäss- rigen Formaldehyd-Löung, beinhaltend 1 bis 35 Gew.-%, vorzugsweise 2 bis 10 Gew.-% Formaldehyd fixierte biologische Proben am meisten bevorzugt sind.
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird als biologische Probe im Verfahrensschritt i) eine mit Formalde- hyd fixierte, biologische Probe eingesetzt, die in Paraffin eingebettet ist. Solche Proben werden üblicherweise als FFPE-Proben bezeichnet. Hergestellt wird eine solche FFPE-Probe vorzugsweise dadurch, dass eine mit Formalin fixierte biologische Probe zunächst entwässert wird, vorzugsweise mittels einer aufsteigenden Alkoholreihe (also einer Reihe von Wasser/ Alkohol-Mischungen mit zunehmen- QIAGEN GmbH PA180-PCT
der Alkohol- Konzentration, wobei letztlich reiner Alkohol zugesetzt wird). Als Alkohole sind dabei Ci- bis Cs-Alkohole besonders bevorzugt, Ethanol, Methanol und Isopropanol darüber hinaus bevorzugt und Ethanol am meisten bevorzugt. Anschließend wird die entwässerte Probe in flüssiges Paraffin getaucht, welches, nachdem die Probe ausreichend vom Paraffin durchdrungen ist, ausgehärtet wird. Mittels geeigneter Schneidevorrichtungen, beispielsweise mittels eines Mikrotoms, können dann Gewebeschnitte aus dem Paraffinblock hergestellt werden, wobei die Dicke dieser Schnitte für lichtmikroskopische Untersuchung üblicherweise bei etwa 5 bis 20 μm liegt. Des Weiteren kann die paraffinierte Probe auch mittels anderer Verfahren, etwa durch Stanzen mit einer Hohlnadel oder durch das sogenannte ,J^aser Capture"- Verfahren in kleinere Probenfragmente zerkleinert werden.
Im Verfahrensschritt ii) wird die im Verfahrensschritt i) bereitgestellte fixierte biologische Probe dann mit einer vorzugsweise wässrigen Lösung beinhaltend mindestens ein nukleophiles Reagenz in Kontakt gebracht. Sofern es sich bei der biologischen Probe um eine in Paraffin eingebettete biologische Probe handelt, ist es bevorzugt, vor dem in Kontakt bringen der Probe mit der vorzugsweise wässrigen Lösung das Paraffin zunächst aus der biologischen Probe zumindest teilweise, vorzugsweise vollständig zu entfernen. Das Entfernen des Paraffins aus der biologischen Probe kann grundsätzlich durch alle dem Fachmann bekannten Verfahren der Deparaffinierung von biologischen Proben erfolgen. Vorzugsweise erfolgt die Deparaffinierung dadurch, dass die Probe zunächst mit einem hydrophoben organischen Lösungsmittel in Kontakt gebracht wird, insbesondere mit einem aromati- sehen Kohlenwasserstoff, am meisten bevorzugt mit Xylol, um das Paraffin herauszulösen. Dabei kann es auch vorteilhaft sein, die Mischung aus der biologischen Probe und dem organischen Lösungsmittel zu bewegen, beispielsweise auf einem Laborschüttler zu schütteln, um ein möglichst effektives Herauslösen des Paraffins sicherzustellen. Vorteilhafterweise wird die Mischung dann zentrifugiert QIAGEN GmbH PA180-PCT
und das organische Lösung vom Pellet ( = biologische Probe) abgetrennt. Gegebenenfalls kann dieser Schritt des Herauslösens des Paraffins aus der biologischen Probe ein-, zwei- drei- oder auch bis zu zehnmal wiederholt werden. Neben dem Herauslösen des Paraffins mittels eines geeigneten organischen Lösungsmittels kommen als Verfahren zur Deparaffinierung auch andere Verfahren, wie beispielsweise das Schmelzen des Paraffins in Betracht, wie von Banerjee et al, Bio- techniques, 18 (1995), Seiten 768-773 beschrieben.
Nach dem Entfernen des Paraffins kann es bevorzugt sein, die biologische Probe wieder zu rehydrieren, wobei dieses Rehydrieren vorzugsweise durch das schrittweise Waschen mit wässrigen Alkohol-Lösungen mit fallender Alkoholkonzentration erfolgt ( = absteigende Alkoholreihe), wobei wiederum Ci- bis Cs-Alkohole besonders bevorzugt, Ethanol, Methanol und Isopropanol darüber hinaus bevorzugt und Ethanol am meisten bevorzugt ist. Gemäß einer bevorzugten Ausfüh- rungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird eine Alkoholreihe mit einem Konzentrationsbereich von 100 VoI- % bis 70 VoI- % eingesetzt, wobei der Konzentrationsunterschied zwischen zwei in ihrer Konzentration aufeinanderfolgenden wässrigen Alkohol-Lösungen vorzugsweise weniger als 10 Vol-%, besonders bevorzugt höchstens 5 Vo 1-% beträgt. Eine erfindungsgemäß geeignete absteigen- de Alkoholreihe umfasst beispielsweise die Konzentrationen 100 Vol-%, 95 VoI- %, 90 Vol-%, 80 Vol-% und 70 Vol-%.
Denkbar ist grundsätzlich auch, das Deparaffinieren und das Rehydrieren mit einem einzigen Reagenz, beispielsweise mit dem kommerziell erhältlichen Produkt EZ-DEWAX® der Firma BioGenex, Kalifornien, USA, durchzuführen.
Bevor nun die gegebenenfalls deparaffinierte und rehydrierte biologische Probe im Verfahrensschritt ii) mit der vorzugsweise wässrigen Lösung beinhaltend das nukleophile Reagenz in Kontakt gebracht wird, kann es weiterhin vorteilhaft sein, QIAGEN GmbH PA180-PCT
die Probe zuvor noch zu trocknen, beispielsweise durch das Stehenlassen an der Luft oder das Inkubieren in einem Trockenschrank.
Weiterhin kann es erfindungsgemäß bevorzugt sein, die gegebenenfalls deparaffi- nierte und rehydrierte biologische Probe vor dem in Kontakt bringen mit der vorzugsweise wässrigen Lösung im Verfahrensschritt ii) noch zu homogenisieren, was insbesondere bei größeren Gewebefragmenten von Vorteil sein kann. Diese Homogenisierung kann durch jede dem Fachmann bekannte Vorrichtung zur Zerkleinerung einer biologischen Probe erfolgen, insbesondere mittels Hochdruck- zellaufschluss, mittels einer mechanischen Zerkleinerungsvorrichtung, beispielsweise einer Mühle, einem Rotor-Stator-Homogenisator, einem Ultra- Turrax- Homogenisator oder einer feinen Kanüle, oder durch Ultraschall- Homogenisatoren.
Im Verfahrensschritt ii) des erfindungsgemäßen Verfahrens wird nun die fixierte biologische Probe mit einer vorzugsweise wässrigen Lösung beinhaltend mindestens ein nukleophiles Reagenz in Kontakt gebracht.
Als nukleophiles Reagenz sind dabei alle Lewis-Basen geeignet, die in der Lage sind, Elektronen in ein Leeres Orbital bzw. in Leere Orbitale einer Lewis-Säure zu transferrieren. Unter diesen Lewis-Basen besonders bevorzugt sind Reagenzien, welche mindestens eine funktionelle Gruppe aufweisen, die eine negative Ladung trägt, die negativ polarisiert ist oder die mindestens ein freies Elektronenpaar aufweist.
Verbindung umfassend eine funktionelle Gruppe mit einer negativen Ladung sind beispielsweise Alkali- oder Erdalkalialkoxide, Alkali- oder Erdalkalihydroxide, Alkali- oder Erdalkalihalogenide, Alkali- oder Erdalkalicyanide und dergleichen. QIAGEN GmbH PA180-PCT
Reagenzien, welche mindestens eine funktionelle Gruppe aufweisen, die negativ polarisiert ist, sind insbesondere solche Reagenzien, die mindestens eine funktionelle Gruppe aufweisen, in der zwei kovalent miteinander verbundene Atome vorliegen, die sich in ihrer Elektronegativität nach Alfred und Rochow um mindes- tens 0,25, besonders bevorzugt um mindestens 0,5 und darüber hinaus bevorzugt um mindestens 1 ,0 unterscheiden.
Erfindungsgemäß besonders bevorzugte nukleophile Reagenzien sind jedoch solche, die mindestens eine funktionelle Gruppe mit einem oder zwei, besonders be- vorzugt mit einem freien Elektronenpaar aufweisen, wobei unter diesen Verbindungen wiederum solche am meisten bevorzugt sind, die mindestes eine primäre, sekundäre oder tertiäre Amino-Gruppe der Struktur I
2
R-N o SR3 I aufweisen, in der
R1 eine Ci- bis C2o-Kohlenwasserstoff-Gruppe, besonders bevorzugt eine C2- bis Ci5-Kohlenwasserstoff-Gruppe und darüber hinaus bevorzugt eine C2 bis Cio-Kohlenwasserstoffgruppe, eine mindestens ein Heteroatom aufweisende
Ci- bis C2o-Kohlenwasserstoff-Gruppe, eine mindestens ein Heteroatom aufweisende C2- bis Cis-Kohlenwasserstoff-Gruppe und darüber hinaus bevorzugt eine mindestens ein Heteroatom aufweisende C2- bis C10- Kohlenwasserstoff-Gruppe oder ein gegebenenfalls Heteroatom substituier- tes aromatisches Ringsystem ist, QIAGEN GmbH PA180-PCT
R2 eine Ci- bis C2o-Alkylgruppe, besonders bevorzugt eine Ci- bis C10- Alkylgruppe und darüber hinaus bevorzugt eine Ci- bis C2-Alkylgruppe, insbesondere eine Methyl-Gruppe oder eine Ethyl-Gruppe, eine Ci- bis C20- Hydroxyalkylgruppe, besonders bevorzugt eine Ci- bis C10- Hydroxyalkylgruppe und darüber hinaus bevorzugt eine Ci- bis C2-
Hydroxyalkyl-Gruppe oder ein Wasserstoffatom ist, wobei ein Wasserstoffatom am meisten bevorzugt ist, und
R3 eine Ci- bis C2o-Alkylgruppe, besonders bevorzugt eine Ci- bis C10- Alkylgruppe und darüber hinaus bevorzugt eine Ci- bis C2-Alkylgruppe, insbesondere eine Methyl-Gruppe oder eine Ethyl-Gruppe, eine Ci- bis C20-
Hydroxyalkylgruppe, besonders bevorzugt eine Ci- bis C10-
Hydroxyalkylgruppe und darüber hinaus bevorzugt eine Ci- bis C2-
Hydroxyalkyl-Gruppe oder ein Wasserstoffatom ist, wobei ein Wasserstoff- atom am meisten bevorzugt ist.
Erfindungsgemäß besonders bevorzugte nukleophile Reagenzien mit einer funktionellen Gruppe der vorstehend dargestellten Struktur I sind insbesondere diejenigen, welche mindestens eine funktionelle Gruppe der Struktur I aufweisen, in der mindestens einer der Reste R2 und R3, am meisten bevorzugt beide Reste R2 und R3 ein Wasserstoffatom ist bzw. sind. Darüber hinaus sind insbesondere solche nukleophilen Reagenzien bevorzugt, die mindestens eine funktionelle Gruppe der Struktur I aufweisen, in der das Stickstoffatom nur mit solchen Atomen in den Resten R1, R2 und R3 kovalent verknüpft ist, die sp3 -Hybridisiert sind. Insbeson- dere sollten keiner der Reste R1, R2 oder R3 in der Lage sein, das freie Elektronenpaar am Stickstoffatom über die Reste R1, R2 bzw. R3 hinweg zu delokalisieren. Somit ist es insbesondere bevorzugt, dass keiner der Reste R1, R2 und R3 beispielsweise die Struktur II QIAGEN GmbH PA180-PCT
H
IN H
— C-N
H
II
aufweist.
Erfindungsgemäß besonders bevorzugte nukleophile Reagenzien mit mindestens einer funktionellen Gruppe der Struktur I sind ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Methylamin, Ethylamin, Ethanolamin, n-Propylamin, n-Butylamin, iso- Butylamin, tert-Butylamin, Dimethylamin, Diethylamin, Diethanolamin, di-n- Propylamin, di-iso-Propylamin, Dibutylamin, Trimethylamin, Triethylamin, Triethanolamin, Hexamethylenetetramin, 2-Ethylhexylamin, 2-Amino-l,3- propandiol, Hexylamin, Cyclo hexylamin, 1 ,2-di-Methoxypropanamin, 1- Aminopentan, 2-Methyloxypropylamin, Tri(hydroxymethyl)-aminomethan, Ami- nocarbonsäuren, insbesondere Glycin oder Histidin, oder Aminoguanidin, wobei unter diesen Ethanolamin, Diethanolamin, Triethanolamin, Amino-1,3- propandiol, Aminoguanidin und Tri(hydroxymethyl)aminomethan am meisten bevorzugt sind. Weiterhin sind als nukleophile Reagenzien mit mindestens einer funktionellen Gruppe der Struktur I aromatische Amine ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Anilin, Toluidin, Naphthylamin, Benzylamin, Xyliden, Xyloldi- aminen, Naphthalendiaminen, Toluoldiaminen, 3,3'-dimethyl-4,4'- diphenyldiamin, Phenylendiaminen, 2,4'-Methylendianilin, 4,4'-Methylendianilin, Sulfonyldianilin, und Dimethylbenzylamin bevorzugt.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens, bei dem das nukleophile Reagenz mindestens eine primäre Aminogruppe der
Struktur I aufweist, handelt es sich bei dem nukleophilen Reagenz um ein Ci- bis
Cό-Alkylamin, um ein Ci- bis Co-Alkyldiamin, um ein Ci- bis Cό-Alkyltriamin, QIAGEN GmbH PA180-PCT
um einen Ci- bis C15 Aminoalkohol um einen Ci- bis C15 Aminodiol, oder um eine Ci- bis C15 Aminocarbonsäure.
Gemäß einer anderen besonderen Ausführungsform des erfϊndungsgemäßen Ver- fahrens ist das nukleophile Reagenz eine heterozyklische, ein Stickstoffatom beinhaltende Verbindung ausgewählt aus der Gruppe umfassend Pyrrol, Pyridin, Chinolin, Indol, Aza-Cyclopentan, Aza-Cyclohexan, Morpholin, Piperidin, Imida- zol oder einem Derivat dieser Verbindungen, wobei unter einem Derivat dieser Verbindungen vorzugsweise ein Derivat verstanden ist, bei dem an ein oder mehr Kohlenstoffatomen oder an dem Stickstoffatomen in den vorstehend genannten Verbindungen eine Ci- bis Cß-Alkylgruppe, besonders bevorzugt eine Methyl- Gruppe oder Ethyl-Gruppe anstelle eines Wasserstoffatoms gebunden ist.
Unter den vorstehend genannten nukleophilen Reagenzien sind insbesondere die- jenigen besonders bevorzugt, die wasserlöslich sind, insbesondere diejenigen, die in Wasser bei einer Temperatur von 25°C und bei einem pH- Wert von 7eine Lös- lichkeit von mindestens 1 g/L, besonders bevorzugt mindestens 10 g/L und darüber hinaus bevorzugt mindestens 100 g/L aufweisen.
Die vorzugsweise wässrige Lösung beinhaltend das vorstehend beschriebene nukleophile Reagenz kann auf reinem, vorzugsweise entionisiertem Wasser basieren oder aber auch auf anderen, wässrigen Systemen, insbesondere auf Mischungen aus Wasser und organischen Lösungsmitteln wie Alkoholen, insbesondere Mischungen aus Wasser und Ethanol oder Methanol, wobei die Menge an Wasser vorzugsweise mindestens 50 Gew.-%, besonders bevorzugt mindestens 75 Gew.- % und am meisten bevorzugt mindestens 90 Gew.-%, jeweils bezogen auf das Gesamtgewicht aus Wasser und organischem Lösungsmittel, beträgt, physiologischen Kochsalzlösungen, auf Puffern, insbesondere Puffer beinhaltend dem Fachmann bekannt Pufferkomponenten wie beispielsweise TRIS, HEPES, PIPES, QIAGEN GmbH PA180-PCT
CAPS, CHES, AMP, AMPD oder MOPS in einer Menge in einem Bereich von 0,1 bis 1.000 mMol/1, besonders bevorzugt 1 bis 500 mMol/1 und am meisten bevorzugt 10 bis 200 mMol/1, wobei gegebenenfalls eine solche Pufferkomponente, je nach deren Struktur, zugleich auch als nukleophiles Reagenz dienen kann. Wei- terhin können auch Nährmedien, wie etwa MEM-Medium und DMEM-Medium als wässriges System eingesetzt werden. Die Herstellung der wässrigen Lösung beinhaltend das nukleophile Reagenz erfolgt vorzugsweise durch einfaches Vermischen von Wasser oder einem entsprechenden wässrigen System mit dem nukleophilen Reagenz.
Die Konzentration des nukleophilen Reagenzes in der wässrigen Lösung liegt vorzugsweise in einem Bereich von 0,1 bis 10.000 mMol/1, darüber hinaus bevorzugt von 1 bis 5.000 mMol/1, darüber hinaus noch mehr bevorzugt von 5 bis 2.500 mMol/1 und am meisten bevorzugt von 20 bis 1.000 mMol/1. Gemäß einer besonders vorteilhaften Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt die Konzentration des nukleophilen Reagenzes in der wässrigen Lösung bei mehr als 20 mMol/1, besonders bevorzugt bei mehr als 50 mMol/1 und am meisten bevorzugt bei mehr als 100 mMol/1.
Der pH- Wert der wässrigen Lösung liegt vorzugsweise in einem Bereich von 2 bis 12, besonders bevorzugt von 4 bis 9 und am meisten bevorzugt von 5 bis 8, jeweils gemessen bei Raumtemperatur.
Das in Kontakt bringen der wässrigen Lösung mit der biologischen Probe erfolgt vorzugsweise dadurch, dass die biologische Probe in einfacher Weise in eine ausreichende Menge der wässrigen Lösung eingetaucht wird. Befindet sich die biologische Probe beispielsweise in Form eines Gewebeschnittes und in Form einer adhärenten Zelle auf einem Substrat, so erfolgt das in Kontakt bringen der biolo- QIAGEN GmbH PA180-PCT
gischen Probe mit der wässrigen Lösung vorzugsweise durch das einfache Beschichten des Substrates mit der wässrigen Lösung.
Im Verfahrensschritt iii) des erfindungsgemäßen Verfahrens wird nun die mit der wässrigen Lösung in Kontakt gebrachte biologische Probe erhitzt, wobei vorzugsweise auf eine Temperatur in einem Bereich von 50 bis 1000C, besonders bevorzugt von 55 bis 95°C, darüber hinaus bevorzugt von 60 bis 900C und am meisten bevorzugt 65 bis 85°C erhitzt wird. Insbesondere kann es erfmdungsge- mäß vorteilhaft sein, die mit der wässrigen Lösung in Kontakt gebrachte biologi- sehe Probe auf eine Temperatur von weniger als 95°C, besonders bevorzugt weniger als 900C und am meisten bevorzugt weniger als 800C zu erhitzen.
In einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens, die zur Analyse von Proteinen aus der fixierten Probe verwendet werden kann, wird im Verfahrensschritt iii) die mit der wässrigen Lösung in Kontakt gebrachte biologische Probe auf eine Temperatur in einem Bereich von 65 bis 85°C, besonders bevorzugt von 75 bis 85 0C erhitzt.
Vorzugsweise wird die biologische Probe in einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens, die zur Analyse von Proteinen aus der fixierten Probe verwendet werden kann, 5 bis 40 min vor Verfahrensschritt iii) gekocht, d.h. auf etwa 100 0C erhitzt.
Die Dauer des Erhitzens in Verfahrensschritt iii) hängt im wesentlichen von der Temperatur und der Reaktivität des nukleophilen Reagenzes ab und der Fachmann wird durch einfache Routineversuche feststellen können, wann unter den gegebenen Behandlungsbedingungen eine ausreichende Zerstörung der Vernetzung der biologischen Probe eingetreten ist. Üblicherweise liegt die Dauer des Erhitzens QIAGEN GmbH PA180-PCT
jedoch in einem Bereich von 60 Sekunden bis 10 Stunden, besonders bevorzugt von 2 Minuten bis 5 Stunden und am meisten bevorzugt in einem Bereich von 10 Minuten bis 2 Stunden.
In einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens, die zur Analyse von Proteinen aus der fixierten Probe verwendet werden kann, kann die Dauer des Erhitzens bis zu 16 Stunden betragen.
Je nach Art und Zusammensetzung der im Verfahrensschritt i) eingesetzten biolo- gischen Probe kann es nach dem Erhitzen im Verfahrensschritt iii) auch vorteilhaft sein, die biologische Probe zu zerkleinern (insbesondere dann, wenn die Probe vor der Behandlung mit dem nukleophilen Reagenz noch nicht zerkleinert worden ist), wobei zum Zerkleinern wiederum jede dem Fachmann zur Zerkleinerung biologischer Proben bekannte Vorrichtung eingesetzt werden kann. Insbe- sondere kann die Zerkleinerung mittels Hochdruckzellaufschluss, mittels einer mechanischen Zerkleinerungsvorrichtung, beispielsweise Rotor-Stator- Homogenisator, einer Mühle, einem Ultra- Turrax-Homogenisator oder einer feinen Kanüle, oder durch Ultraschall-Homogenisatoren erfolgen.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die biologische Probe während des Erhitzens im Verfahrensschritt iii), vor dem Verfahrensschritt ii) oder aber nach dem Verfahrensschritt iii) mit Verbindungen in Kontakt gebracht, vorzugsweise inkubiert, welche die Zerstörung eines biologischen Gewebes und/oder die Lyse von Zellen fördert, wobei es sich bei dieser Verbindung vorzugsweise um ein Enzym, ein Detergenz, eine chaotrope Substanz oder eine Mischung aus mindestens zwei dieser Komponenten handelt.
In diesem Zusammenhang bevorzugte Enzyme sind insbesondere Proteasen, wobei unter diesen Trypsin, Proteinase K, Chymotrypsin, Papain, Pepsin, Pronase QIAGEN GmbH PA180-PCT
und Endoproteinase Lys-C. besonders bevorzugt und Proteinase K am meisten bevorzugt ist. Gemäß einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens kann jedoch als Enzym auch eine hitzestabile Protease eingesetzt werden, wie sie etwa in der WO-A-91/19792 (isoliert aus Thermococcus celer, Ther- mococcus sp.ANl, Thermococcus stetteri oder Thermococcus litoralis) oder in der WO-A-91/19792 (isoliert aus Staphylothermus marinus) beschrieben ist. Der Offenbarungsgehalt dieser Druckschriften hinsichtlich hitzestabiler Proteasen wird hiermit als Referenz eingeführt und bildet einen Teil der Offenbarung der vorliegenden Erfindung.
In einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens, die zur Analyse von Proteinen aus der fixierten Probe verwendet werden kann, wird keine proteolytisch wirksame Verbindung wie eine Protease eingesetzt. In einer speziellen Ausführungsform kann jedoch hier eine Nuklease wie eine DNase und/oder RNase, vorzugsweise eine hitzstabile Nuklease verwendet werden.
Die Konzentration des Enzyms in der wässrigen Lösung liegt vorzugsweise in einem Bereich von 0,001 bis 5 Gew.-%, besonders bevorzugt 0,01 bis 2,5 Gew.-% und am meisten bevorzugt 0,05 bis 0,2 Gew.-%, jeweils bezogen auf das Gesamt- gewicht der wässrigen Lösung.
Als Detergenzien werden bevorzugt Verbindungen ausgewählt aus der Gruppe umfassend Natriumdodecylsulfat (SDS), Polyethylenglykol-pheno lether wie beispielsweise Triton-X-100, Tween, NP-40 oder Mischungen hieraus eingesetzt, wobei SDS und Triton-X-100 als Detergenzien besonders bevorzugt sind. Die Menge an Detergenz, welche zur Lyse der in der biologischen Probe enthaltenen Zellen eingesetzt wird, ist von der Art und der Menge der biologischen Probe abhängig und kann vom Fachmann durch einfache Routineversuche ermittelt werden. QIAGEN GmbH PA180-PCT
Ganz besonders bevorzugt wird in einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens, die zur Analyse von Proteinen aus der fixierten Probe verwendet werden kann als Detergenz SDS, Natrium-Deoxycholat, CHAPS, Tri- ton XlOO, Nonidet P40 oder Tween 20 verwendet. Die Konzentration an Detergenz liegt hier vorzugsweise in einem Bereich zwischen etwa 0.1-10% , besonders bevorzugt zwischen 1-5%.
Als chaotrope Substanzen sind insbesondere Guanidiniumisothiocyanat oder Guanidinium-Hydrochlorid bevorzugt, wobei Guanidiniumisothiocyanat besonders bevorzugt ist. Chaotrope Substanzen werden insbesondere dann eingesetzt, wenn aus der biologischen Probe nach der erfindungsgemäßen Behandlung Nukleinsäuren isoliert werden sollen. In diesem Zusammenhang ist es weiterhin bevorzugt, dass neben der chaotropen Verbindung auch reduzierende Verbindungen, insbesondere Dithiothretil (DTT) oder ß-Mercaptoethanol, eingesetzt werden. Die Konzentration an chaotroper Verbindung bei der Behandlung der biologischen Probe liegt vorzugsweise in einem Bereich von 0,1 bis 50 Mol/l, besonders bevorzugt 0,5 bis 20 Mol/l und am meisten bevorzugt 1 bis 10 Mol/l.
Das Inkubieren des biologischen Materials mit dem Enzym, dem Detergenz oder der chaotropen Verbindung, kann, wie vorstehend dargelegt, vor, während des Erhitzens im Verfahrensschritt iii), vor dem Verfahrensschritt ii) oder aber nach dem Verfahrensschritt iii) erfolgen.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt das Inkubieren des biologischen Materials mit dem Enzym, dem Detergenz und/oder der chaotropen Verbindung vor dem Verfahrensschrittes ii). Dazu wird beispielsweise vor dem Verfahrensschritt ii) die biologische Probe mit einer wäss- rigen Lösung beinhaltend das Enzym, das Detergenz, die chaotrope Verbindung QIAGEN GmbH PA180-PCT
oder mindestens zwei davon, gegebenenfalls zusammen mit einer reduzierenden Verbindung wie ß-Mercaptoethanol, in Form eines Lysepuffers in Kontakt gebracht, auf eine für eine ausreichende Enzymaktivität erforderliche Temperatur erwärmt und anschließend dieser Lysepuffer durch die wässrige Lösung beinhal- tend das nukleophile Reagenz ersetzt oder aber diesem Lysepuffer eine entsprechende Menge an nukleophilem Reagenz zugesetzt.
Gemäß einer anderen besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt das Inkubieren des biologischen Materials mit dem Enzym, dem Detergenz oder der chaotropen Verbindung nach dem Verfahrensschritt iii). Dazu kann entweder nach dem Erhitzen im Verfahrensschritt iii) die wässrige Lösung beinhaltend das nukleophile Reagenz von der biologischen Probe entfernt und diese biologische Probe dann mit dem Lysepuffer in Kontakt gebracht werden, oder aber es wird der wässrigen Lösung beinhaltend das nukleophile Reagenz das Enzym, das Detergenz, die chaotrope Verbindung oder mindestens zwei davon, gegebenenfalls in Form einer konzentrierten Lösung, zugesetzt. Anschließend erfolgt ein Erhitzen auf eine für eine ausreichende Lyse erforderliche Temperatur. Insbesondere bei der Verwendung chaotroper Substanzen ist es bevorzugt, wenn diese erst nach dem Verfahrensschritt iii) zugesetzt werden.
Gemäß einer weiteren besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt das Inkubieren des biologischen Materials mit dem Enzym, dem Detergenz oder der chaotropen Verbindung während des Verfahrensschrittes iii). Dazu wird als wässrige Lösung im Verfahrensschritt ii) eine wässrige Lösung eingesetzt, welche neben dem nukleophilen Reagenz das Enzym, das Detergenz, die chaotrope Verbindung oder mindestens zwei davon beinhaltet, oder aber es wird der wässrigen Lösung vor dem Erhitzen im Verfahrensschritt iii) das Enzym, das Detergenz, die chaotrope Verbindung oder mindestens zwei davon, gegebenenfalls in Form einer konzentrierten wässrigen Lösung, zugesetzt wird. In die- QIAGEN GmbH PA180-PCT
sem Zusammenhang ist es besonders bevorzugt, als Enzym eine der vorstehend genannten hitzestabilen Proteasen oder Nukleasen ein zusetzen, da auf diese Weise die für eine zufrieden stellende Lösung der Vernetzungen Temperatur von vorzugsweise 50 bis 1000C, besonders bevorzugt von 55 bis 95°C, darüber hinaus bevorzugt von 60 bis 900C und am meisten bevorzugt 65 bis 85°C ohne Beeinträchtigung der Enzymaktivität beibehalten werden kann.
Unabhängig von der Art und Weise der Behandlung des Gewebes in den Verfahrensschritten i) bis iii) liegt jedoch im Anschluss an das Erhitzen der biologischen Probe in der Regel eine wässrige Lösung vor, in der zumindest ein Teil der durch die erfindungsgemäße Behandlung aus der biologischen Probe herausgelösten Biomoleküle gelöst ist. Diese wässrige Lösung kann neben den herausgelösten Biomolekülen auch weitere Komponenten umfassen, wie etwa das nukleophile Reagenz, Enzyme, Detergenzien, chaotrope Verbindungen und dergleichen.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens umfasst dieses neben den Verfahrensschritten i) bis iii) auch den Verfahrensschritt
iv) Analyse eines aus der biologischen Probe herausgelösten Biomoleküls,
wobei es sich bei dem Biomoleküls vorzugsweise um ein Protein, ein Glykopro- tein, ein Lipid, ein Glykolipid, eine RNA oder eine DNA, am meisten bevorzugt jedoch um RNA handelt.
Dabei kann als Ausgangszusammensetzung für die Analyse des aus der biologischen Probe herausgelösten Biomoleküls QIAGEN GmbH PA180-PCT
Al) die wässrige Lösung beinhaltend das nukleophile Reagenz, welche im Verfahrensschritt ii) eingesetzt wurde und in der sich nach dem Verfahrensschritt iii) ein Teil der Biomoleküle befindet,
A2) die wässrige Lösung beinhaltend ein Enzym, ein Detergenz und/oder eine chaotrope Verbindung, sofern die wässrige Lösung beinhaltend das nukleophile Reagenz nach dem Verfahrensschritt iii) durch einen entsprechenden Lysepuffer ersetzt oder der wässrigen Lösung beinhaltend das nukleophile Reagenz vor oder nach dem Verfahrensschritt iii) entsprechende Lyse- Komponenten zugesetzt worden sind,
A3) eine wässrige Lösung, welche nach der Aufreinigung eines Biomoleküls in einer der beiden vorstehend genannten Zusammensetzungen Al) oder A2), beispielsweise mittels Filtration, Dialyse, Extraktion, Fällung, Chroma- tographie oder einer Kombination dieser Aufreinigungsverfahren, vorzugsweise jedoch mittels Adsorptionschromatographie, erhalten wurde, wobei insbesondere eine Aufreinigung durch Trennung der wässrigen Lösung Al) oder A2) in eine Protein-Fraktion, eine RNA-Fraktion und eine DNA- Fraktion, beispielsweise durch selektive Fällung, Extraktion oder Adsorpti- on besonders bevorzugt und eine Trennung durch Adsorption am meisten bevorzugt ist, oder
A4) eine wässrige Lösung, welche durch Extraktion des im Anschluss an den Verfahrensschritt iii) erhaltenen Gewebes mit einer entsprechenden wässri- gen Phase erhalten wurde, dienen.
Die Analyse des Biomoleküls in den jeweiligen Zusammensetzungen Al) bis A4) erfolgt vorzugsweise durch die dem Fachmann bekannten Analysemethoden. So kommen als Analyseverfahren insbesondere immunologische Methoden wie Wes- QIAGEN GmbH PA180-PCT
tern-Blotting, Enzyme-linked Immonosorbent-Assays (ELISAs), die Immunpräzi- pitation oder die Affinitätschromatographie, Mutationsanalysen, Polyacrylamid- Gelelektrophorese (PAGE), insbesondere zweidimensionale Polyacrylamid- Gelelektrophorese (2D-P AGE), High Performance Liquid Chromatography (HPLC), Polymerase-Kettenreaktion (PCR), RFLP-Analyse (Restriction Fragment Length Polymorphism-Analyse), Southern-Blotting, serielle Analyse der Genexpression (SAGE), Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC), MALDI- TOFF-Massenspektrometrie, SELDI-Massenspektrometrie, Mikroarray- Analyse und dergleichen in Betracht.
Abhängig vom zu Analysierenden Biomolekül kann während des Erhitzens im- Verfahrensschritt iii), vor dem Verfahrensschritt ii) oder aber nach dem Verfahrensschritt iii) die biologische Probe mit mindestens einem Enzym in Kontakt gebracht werden. Vorzugsweise kann vor dem Verfahrensschritt ii) die biologi- sehe Probe mit mindestens einem Enzym in Kontakt gebracht werden.
Wenn das zu analysierende Biomolekül DNA und/oder RNA ist, kann das Enzym eine Protease, wie oben offenbart, sein. Wenn das zu analysierende Biomolekül ein Protein ist, kann das Enzym eine Nuklease, wie oben offenbart, sein.
Eine besondere Ausführungsform des erfindungsgemäßen umfasst ein Verfahren zur Behandlung einer mit Formaldehyd fixierten biologischen Probe für eine spätere Analyse der in der Probe enthaltenden Proteine, umfassend die Verfahrensschritte:
i) Bereitstellen einer fixierten biologischen Probe, ii) In Kontakt bringen der fixierten biologischen Probe mit einer wäss- rigen Lösung beinhaltend mindestens ein nukleophiles Reagenz, sowie QIAGEN GmbH PA180-PCT
iii) Erhitzen der mit der wässrigen Lösung in Kontakt gebrachten biologischen Probe auf eine Temperatur in einem Bereich von 65 bis 85°C, iv) Analyse eines aus der biologischen Probe herausgelösten Biomole- küls.
Besonders bevorzugt wird im Verfahrensschritt ii) ein Detergenz wie SDS zugegeben und/oder das Detergenz ist bereits in der wässrigen Lösung enthalten. Die biologische Probe wird vorzugsweise in der wässrigen Lösung vor Schritt iii) 5 bis 40 min gekocht und danach vorzugsweise in Schritt iii) für eine Dauer von 20 min bis 16 h inkubiert.
Einen Beitrag zur Lösung der eingangs genannten Aufgaben leistet auch die durch das erfindungsgemäße Verfahren erhältliche biologische Probe.
Auch die Verwendung eines nukleophilen Reagenzes, wie vorstehend beschrieben, insbesondere eines nukleophilen Reagenzes, welches mindestens eine primäre, sekundäre oder tertiäre Aminogruppe der Struktur I aufweist, zu Behandlung einer fixierten biologischen Probe, insbesondere zur Behandlung einer mit For- maldehyd fixierten biologischen Probe, leistet einen Beitrag zur Lösung der eingangs genannten Aufgaben.
Einen weiteren Beitrag zur Lösung der eingangs genannten Aufgaben leistet ein Kit zur Isolierung eines Biomoleküls aus einer fixierten, vorzugsweise aus einer mit Formaldehyd fixierten biologischen Probe, umfassend
(αl) einen Puffer beinhaltend ein nukleophiles Reagenz,
(α2) eine Matrix zur Adsorption eines Biomoleküls, sowie QIAGEN GmbH PA180-PCT
(α3) gegebenenfalls einen Elutionspuffer,
(α4) gegebenenfalls ein Enzym, sowie
(α5) gegebenenfalls eine chaotrope Substanz.
Als nukleophiles Reagenz sind insbesondere diejenigen Reagenzien bevorzugt, die bereits eingangs im Zusammenhang mit dem erfindungsgemäßen Verfahren als bevorzugte Reagenzien genannt wurden.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Kits beinhaltet dieser auch noch Komponenten zur Lyse einer Zelle, insbesondere Enzyme (α4), vorzugsweise eines der proteolytischen Enzyme, die vorstehend im Zusam- menhang mit dem erfindungsgemäßen Verfahren genannt wurden, Detergentien oder chaotrope Substanzen (α5), vorzugsweise einer der chaotropen Substanzen, die vorstehend im Zusammenhang mit dem erfindungsgemäßen Verfahren genannt wurden. Insbesondere das Enzym und die chaotrope Substanz können, einzeln oder in Kombination, bereits in dem Puffer (αl) beinhaltend das nukleophile Reagenz enthalten sein. Es ist jedoch auch möglich, dass der Kit einen entsprechenden Lysepuffer (αl ') umfasst, in dem diese Verbindungen enthalten sind und der zum Aufschluss einer biologischen Probe eingesetzt werden kann. Auch kann der erfindungsgemäße Kit ein Lysekonzentrat (αl ") umfassen, das ein Enzym, ein Detergenz oder eine chaotrope Verbindung in konzentrierter Form enthält und der bei der Anwendung des Kits dem Puffer (αl) zu einem geeigneten Zeitpunkt zugesetzt werden kann.
Als Matrix (α2) zur Adsorption eines Biomoleküls können alle dem Fachmann bekannten Materialien zur Adsorption eines Biomoleküls, insbesondere eines Pro- QIAGEN GmbH PA180-PCT
teins, einer DNA oder einer RNA, verwendet werden, wobei auf Cellulose basierende Materialien, insbesondere carboxyfunktionelle Cellulosematerialien oder Diethylaminoethyl-Cellulose, Agarose, oder mineralische Träger wie Silika, Glas, Quarz, Zeolithe, oder Metalloxide, oder mit Ionenaustauscher-Materialien be- schichtete Träger, besonders bevorzugt sind. Die genannten Materialien können beispielsweise in Form von Membranen bzw. magnetischen oder nichtmagnetischen Partikeln vorliegen. Vorzugsweise ist diese Matrix als Säulenmaterial in bereits vorgefertigten Säulen oder auch als Suspension in dem Kit enthalten. Die Art der Matrix hängt entscheidend von der chemischen Struktur der zu analysie- renden Biomoleküle ab, wobei dem Fachmann für den jeweiligen Anwendungszweck, z. B. Analyse von Proteinen, RNA oder DNA, geeignete Adsorptionsmaterialien bekannt sind.
Als Elutionspuffer können ebenfalls alle dem Fachmann bekannten Puffer in dem erfindungsgemäßen Kit enthalten sein, die üblicherweise zur Elution in der Säulenchromatographie eingesetzt werden. Bei dem Elutionspuffer handelt es sich vorzugsweise um eine wässrige Salzlösung, insbesondere um wässrige Lösungen beinhaltend Alkalihalogenide, wie etwa NaCl, KCl oder LiCl, Erdalkalihalogeni- de, wie etwa CaCl2 oder MgCl2, Ammoniumsalze wie etwa Ammoniumchlorid oder Ammoniumsulfat oder Mischungen aus mindestens zwei dieser Salze, wobei der Elutionspuffer gegebenenfalls auch Puffersysteme wie etwa Alkaliace- tat/Essigsäure oder auf Tris(hydroxymethyl)aminomethan basierende Puffersysteme beinhalten kann. Sofern der Kit zur Isolierung von RNA aus einem fixierten Gewebe eingesetzt wird und als Matrix eine Silika-Membran eingesetzt wird, ist es besonders bevorzugt, als Elutionspuffer Wasser, insbesondere RNase-freies Wasser einzusetzen.
Gemäß einer weiteren, besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Kits kann dieser auch noch einen Waschpuffer beinhalten, mit dem die Matrix, nach- QIAGEN GmbH PA180-PCT
dem diese das zu analysierende Biomolekül gebunden hat, vor der Elution mit dem Elutionspuffer gewaschen wird.
Einen Beitrag zur Lösung der eingangs genannten Aufgabe leistet weiterhin die Verwendung des erfindungsgemäßen Kits in einem Verfahren zur Isolierung von Biomolekülen aus einer fixierten, vorzugsweise einer mit Formaldehyd fixierten biologischen Probe.
Einen Beitrag zur Lösung der eingangs genannten Aufgaben leistet schließlich auch ein Verfahren zur Behandlung einer Krankheit, umfassend die Verfahrensschritte:
(ßl) Entnahme einer biologischen Probe aus einem Organismus, vorzugsweise aus einem Säugetier, besonders bevorzugt aus einem Menschen oder aus ei- nem Tier,
(ß2) Fixierung der biologischen Probe, vorzugsweise mit Formaldehyd,
(ß3) Analyse eines Biomoleküls aus der fixierten biologischen Probe durch das erfindungsgemäße Verfahren umfassend den Verfahrensschritt iv),
(ß4) Diagnose einer Krankheit auf der Grundlage der Ergebnisse der Analyse, sowie
(ß5) therapeutische Behandlung der diagnostizierten Krankheit.
Als biologische Probe und als Biomolekül sind wiederum diejenigen biologischen Proben und Biomoleküle bevorzugt, die bereits eingangs im Zusammenhang mit dem erfindungsgemäßen Verfahren beschrieben wurden. QIAGEN GmbH PA180-PCT
Die Erfindung wird nun anhand nicht limitierender Figuren und Beispiele näher erläutert.
Es zeigt die Figur 1 die Ausbeute an RNA (in ng) aus einem Formalin-fixierten und deparaffinierten Gewebeschnitt aus der Lunge einer Ratte nach der erfindungsgemäßen Behandlung.
Es zeigt die Figur 2 das Verhalten der RNA (in Anzahl der zum Erreichen einer bestimmten DNA-Menge erforderlichen PCR- Zyklen in einer real-time RT-PCR- Analyse), welche durch das erfindungsgemäße Verfahren aus einem Formalin- fixierten und deparaffinierten Gewebeschnitt aus der Leber einer Ratte isoliert wurde, in einer PCR- Analyse.
Es zeigt die Figur 3 die Ausbeute an RNA (in ng) aus einem Formalin-fixierten und deparaffinierten Gewebeschnitt aus der Leber einer Ratte nach der erfindungsgemäßen Behandlung.
Figur 4 zeigt die Ausbeute an intaktem Protein aus einem Formalin-fixierten und deparaffinierten Gewebeschnitt aus dem Darm und der Lunge einer Ratte nach der erfindungsgemäßen Behandlung.
Figur 5 zeigt die Ausbeute an intakten Proteinen aus einem Formalin-fixierten und deparaffinierten Gewebeschnitt aus dem Herz einer Ratte nach der erfindungsge- mäßen Behandlung in Abhängigkeit zur Temperatur im Inkubationsschritt.
BEISPIELE QIAGEN GmbH PA180-PCT
Beispiel 1
Mit Formalin fixierte und deparaffinierte Gewebeschnitte (10 μm) aus der Lunge einer Ratte wurden mit jeweils 250 μl einer wässrigen Lösung beinhaltend 5 Mol/l Guanidin-Hydrochlorid und jeweils unterschiedliche nukleophile Reagenzien (13 mM TRIS, 350 mM TRIS, 5 Gew.-% Trimethylamin, 10 mg/ml Aminoguani- din oder 50 mg/ml Aminoguanidin) in Kontakt gebracht, wobei der pH- Wert der wässrigen Lösungen jeweils 7,5 betrug. Die Schnitte wurden für 60 Minuten bei 700C mit den entsprechenden Lösungen inkubiert.
Aus dem erhaltenen Zelllysat wurde die RNA isoliert. Dazu wurde zunächst genomische DNA mittels der gDNA-Eliminator Mini Spin Column (Qiagen, Hilden, Deutschland) entfernt, der Durchfluss gesammelt, mit 400 μl Ethanol versetzt und die so erhaltene Zusammensetzung auf eine RNeasy® MinElute Spin Column (Qiagen, Hilden, Deutschland) aufgetragen. Nach zweimaligem Waschen mittels des im RNeasy®-Kit enthaltenen RPE-Puffers wurde die Membran getrocknet und die RNA mittels 30 μl RNase-freiem Wasser eluiert. Die Menge an RNA im Eluat wurde mittels OD-Messung bei 260 nm bestimmt. Die Ergebnisse sind in der Figur 1 dargestellt.
Beispiel 2
Mit Formalin fixierte und deparaffinierte Gewebeschnitte (10 μm) aus der Leber einer Ratte wurden mit jeweils 250 μl einer wässrigen Lösung beinhaltend unter- schiedliche nukleophile Reagenzien (10 mM TRIS, 10 mM TRIS und 1 % Etha- nolamin, 10 mM TRIS und 0,1 % Ethanolamin sowie 10 mM TRIS und 0,01 % Ethanolamin) in Kontakt gebracht, wobei der pH- Wert der wässrigen Lösungen jeweils 7,5 betrug. Die Zellen wurden für 60 Minuten bei 700C mit den entsprechenden Lösungen inkubiert. Anschließend wurde Guanidin-Hydrochlorid in ei- QIAGEN GmbH PA180-PCT
ner finalen Konzentration von 5 Mol/l zugesetzt.
Aus dem erhaltenen Zelllysat wurde die RNA isoliert und das Verhalten der RNA in der PCR mittels einer TaqMan- Analyse bestimmt, wobei der QuantiTect Probe RT-PCR Kit der Firma Qiagen, Hilden, Deutschland, und ein entsprechendes Primer/Probe Set eingesetzt wurden. Dazu wurde zunächst genomische DNA mittels der gDNA-Eliminator Mini Spin Column (Qiagen, Hilden, Deutschland) entfernt, der Durchfluss gesammelt, mit 400 μl Ethanol versetzt und die so erhaltene Zusammensetzung auf eine RNeasy® MinElute Spin Column (Qiagen, Hilden, Deutschland) aufgetragen. Nach zweimaligen Waschen mittels des im RNeasy®- Kit enthaltenen RPE-Puffers wurde die Membran getrocknet und die RNA mittels 30 μl RNase-freiem Wasser eluiert. Die Ergebnisse der PCR sind in der Figur 2 dargestellt. Neben der Analyse des Verhaltens der RNA in der PCR wurde im Beispiel 2 auch die Menge an isolierter RNA mittels OD-Messung bei 260 nm bestimmt. Die Ergebnisse sind in der Figur 3 dargestellt.
Den Figuren 2 und 3 ist zu entnehmen, dass durch die erfindungsgemäße Behandlung der Proben hohe Mengen an RNA isoliert werden können und die isolierte RNA zudem ein gutes Verhalten in der PCR- Analyse zeigt.
Beispiel 3
Verifizierung des Temperaturbereichs für die quantitative Extraktion von intakten, volle Länge Proteine aus Formalin-fixierten, Paraffin-eingebetteten Gewebe
Mit Formalin fixierte und deparaffinierte Gewebeschnitte (10 μm) aus Darm und Hirn einer Ratte wurden mit jeweils 250 μl einer wässrigen Lösung beinhaltend nukleophile Reagenzien 1.25 M Tris/HCl (pH 6.8) und 4 % SDS in Kontakt ge- QIAGEN GmbH PA180-PCT
bracht. Die Schnitte wurden für 20 min bei 1000C gekocht und dann 2 Stunden bei 800C inkubiert.
Der Inkubationsschritt wurde am Beispiel von zwei verschiedenen Geweben bei unterschiedlichen Temperaturen durchgeführt. Von den erhaltenen Lysaten wurden anschließend gleiche Volumina im Western-Blot analysiert. Das Signal für Actin wurde densitometrisch mittels Easy win ermittelt und verglichen. Das Signal der 800C Proben wurden hierbei immer = 100% gesetzt.
Die Proben, die bei 800C extrahiert wurden zeigten bei den unterschiedlichen Geweben sowohl für Actin als auch für Tubulin die stärksten Signale.
Beispiel 4:
Die Temperaturunterschiede des zweiten Inkubationsschrittes wurden bei diesem Beispiel (Hirn, Ratte) kleiner gewählt. Die Experimente wurden analog dem in Beispiel 3 beschriebenen Protokoll durchgeführt.
Es ist deutlich zu erkennen, dass die stärksten Signale in den Proben zu detektie- ren sind, die in einem Bereich von 70 bis 85 0C, insbesondere bei 80° bzw. 85°C inkubiert wurden.

Claims

QIAGEN GmbH PA180-PCTPATENTANSPRÜCHE
1. Ein Verfahren zur Behandlung einer fixierten biologischen Probe, umfas- send die Verfahrensschritte:
i) Bereitstellen einer fixierten biologischen Probe, ii) In Kontakt bringen der fixierten biologischen Probe mit einer wässri- gen Lösung beinhaltend mindestens ein nukleophiles Reagenz, sowie iii) Erhitzen der mit der wässrigen Lösung in Kontakt gebrachten biologischen Probe.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die fixierte biologische Probe eine mit Formaldehyd fixierte biologische Probe ist.
3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die mit Formaldehyd fixierte biologische Probe eine mit Formaldehyd fixierte und in Paraffin eingebettete biologische Probe ist.
4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei das Paraffin vor dem in Kontakt bringen mit der wässrigen Lösung zumindest teilweise entfernt wird.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das nukle- ophile Reagenz eine Verbindung ist, welche mindestens eine funktionelle Gruppe aufweist, die eine negative Ladung trägt, die negativ polarisiert ist oder die mindestens ein freies Elektronenpaar aufweist. QIAGEN GmbH PA180-PCT
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das nukle- ophile Reagenz eine Verbindung ist, die mindestes eine primäre, sekundäre oder tertiäre Amino-Gruppe der Struktur I
2
R-N o SR3 I aufweist, in der
R1 eine Ci- bis C2o-Kohlenwasserstoff-Gruppe, eine mindestens ein Hete- roatom aufweisende Ci- bis C2o-Kohlenwasserstoff-Gruppe oder ein gegebenenfalls Heteroatom substituiertes aromatisches Ringsystem ist, R2 eine Ci- bis C2o-Alkylgruppe, eine Ci- bis C2o-Hydroxyalkylgruppe oder ein Wasserstoffatom ist, und
R3 eine Ci- bis C2o-Alkylgruppe, eine Ci- bis C2o-Hydroxyalkylgruppe oder ein Wasserstoffatom ist.
7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei mindestens einer der Reste R2 und R3 ein Wasserstoffatom ist.
8. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, wobei sowohl R2 als auch R3 ein Wasserstoffatom ist.
9. Verfahren nach Anspruch einem der Ansprüche 5 bis 8, wobei das nukle- ophile Reagenz ein Ci- bis Cό-Alkylamin oder ein Ci- bis C15 Aminoalko- hol, Aminodiol oder eine Aminocarbonsäure ist. QIAGEN GmbH PA180-PCT
10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das nukle- ophile Reagenz eine heterozyklische, ein Stickstoffatom beinhaltende Verbindung ausgewählt aus der Gruppe umfassend Pyrrol, Pyridin, Piperidin, Chinolin, Indol, Aza-Cyclopentan, Aza-Cyclohexan, Morpholin oder einem Derivat dieser Verbindungen.
11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das nukle- ophile Reagenz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Ethanolamin, Diethanolamin, Triethanolamin, Amino-l,3-propandiol, Aminoguanidin und Tri(hydroxymethyl)-amino methan.
12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das nukle- ophile Reagenz bei einer Temperatur von 25°C und bei einem pH- Wert von 7 eine Löslichkeit in Wasser von mindestens 1 g/L aufweist.
13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das nukle- ophile Reagenz in einer Konzentration in einem Bereich von 0,1 bis 10.000 mMo 1/1 in der im Verfahrensschritt ii) eingesetzten wässrigen Lösung enthalten ist.
14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei im Verfahrensschritt iii) auf eine Temperatur in einem Bereich von 50 bis 1000C erhitzt wird.
15. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei im Verfahrensschritt iii) für eine Dauer in einem Bereich von 60 Sekunden bis 10 Stunden erhitzt wird. QIAGEN GmbH PA180-PCT
16. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Verfahren neben den Verfahrensschritten i) bis iii) den Verfahrensschritt
iv) Analyse eines aus der biologischen Probe herausgelösten Biomoleküls
umfasst.
17. Verfahren nach Anspruch 19, wobei das Biomolekül RNA, DNA oder ein Protein ist.
18. Verfahren nach Anspruch 16 oder 17, wobei während des Erhitzens im Verfahrensschritt iii), vor dem Verfahrensschritt ii) oder aber nach dem Verfah- rensschritt iii) die biologische Probe mit mindestens einem Enzym in Kontakt gebracht wird.
19. Verfahren nach Anspruch 18, wobei wenn das Biomolekül DNA und/oder RNA ist, das Enzym eine Protease ist.
20. Verfahren nach Anspruch 17, wobei wenn das Biomolekül ein Protein ist, das Enzym eine Nuklease ist.
21. Eine biologische Probe, erhältlich durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 20.
22. Die Verwendung eines nukleophilen Reagenzes, wie in einem der Ansprüche 5 bis 12 definiert, zur Behandlung einer fixierten biologischen Probe.
23. Ein Kit zur Isolierung eines Biomoleküls aus einer fixierten biologischen Probe, umfassend QIAGEN GmbH PA180-PCT
(αl) einen Puffer beinhaltend ein nukleophiles Reagenz,
(α2) eine Matrix zur Adsorption eines Biomoleküls,
(α3) gegebenenfalls einen Elutionspuffer,
(α4) gegebenenfalls ein Enzym, sowie
(α5) gegebenenfalls eine chaotrope Substanz.
24. Kit nach Anspruch 23, wobei der Kit neben den Bestandteilen (αl) bis (α2) und gegebenenfalls (α3) bis (α5) einen Waschpuffer (α6) umfasst.
25. Die Verwendung des Kits nach Anspruch 23 oder 24 in einem Verfahren zur Isolierung von Biomolekülen aus einer fixierten biologischen Probe.
26. Ein Verfahren zur Behandlung einer Krankheit, umfassend die Verfahrensschritte: (ßl) Entnahme einer biologischen Probe aus einem Organismus,
(ß2) Fixierung der biologischen Probe mit Formaldehyd, (ß3) Analyse eines Biomoleküls aus der mit Formaldehyd fixierten biologischen Probe durch das Verfahren nach Anspruch 19,
(ß4) Diagnose einer Krankheit auf der Grundlage der Ergebnisse der Ana- lyse, sowie
(ß5) therapeutische Behandlung der diagnostizierten Krankheit. QIAGEN GmbH PA180-PCT
27. Ein Verfahren zur Behandlung einer mit Formaldehyd fixierten biologischen Probe für eine spätere Analyse der in der Probe enthaltenden Proteine, umfassend die Verfahrensschritte:
i) Bereitstellen einer fixierten biologischen Probe, ii) In Kontakt bringen der fixierten biologischen Probe mit einer wäss- rigen Lösung beinhaltend mindestens ein nukleophiles Reagenz, sowie iii) Erhitzen der mit der wässrigen Lösung in Kontakt gebrachten biolo- gischen Probe auf eine Temperatur in einem Bereich von 65 bis
85°C, iv) Analyse eines aus der biologischen Probe herausgelösten Biomoleküls.
28. Verfahren nach Anspruch 27, wobei die wässrigen Lösung im Verfahrensschritt ii) ein Detergenz enthält.
29. Verfahren nach Anspruch 27 oder 28, wobei die biologische Probe in der- wässrigen Lösung vor Schritt iii) 5 bis 40 min gekocht wird.
30. Verfahren nach einem der Ansprüche 27 bis 29, wobei die biologische Probe für eine Dauer von 20 min bis 16 h inkubiert wird
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