WO2006046751A1 - 糖鎖改変抗グリピカン３抗体 - Google Patents

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WO2006046751A1
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antibody
cells
cell
vector
glypican
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Kiyotaka Nakano
Izumi Sugo
Masamichi Sugimoto
Takahiro Ishiguro
Megumi Tanaka
Shigeyuki Iijima
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Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
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    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]

Definitions

  • the present invention relates to an antibody against anti-Daripican 3 antigen (anti-glypican 3 antibody) having enhanced cytotoxic activity, especially antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC), and a method for producing the same.
  • anti-Daripican 3 antigen anti-glypican 3 antibody
  • ADCC antibody-dependent cellular cytotoxicity
  • Glypican 3 (GPC 3) is one of the family of heparan sulfate proteoglycans present on the cell surface and may be involved in cell division during development and cancer cell growth. It has been suggested, but its function is not well understood.
  • GPC 3 Certain antibodies that bind to GPC 3 have been found to have cytostatic effects due to AD CC (antibody dependent cytotoxicity) activity and CDC (complement dependent cytotoxicity) activity (WO2003 / 000883). ) In addition, it has been suggested that GPC 3 is cleaved in vivo and secreted into the blood as soluble GPC 3, and an antibody capable of detecting this can be used to diagnose cancer (WO2004 / 022739, WO2003 / 100429> WO2004 / 018667).
  • the antibody used has a high ADCC activity. Therefore, even an antibody that recognizes GPC 3 has an anti-GPC 3 antibody that has a high cytotoxic activity. Was desired.
  • WO 99/54342 describes improving ADCC activity by modifying antibody glycosylation.
  • WO 00/61739 describes that ADCC activity is regulated by the presence or absence of fucose in the sugar chain of an antibody.
  • WO 02/31140 describes preparing an antibody having a sugar chain that does not contain -1,6-core fucose by producing the antibody in YB2 / 0 cells.
  • WO 02/79255 has a sugar chain with bisecting GlcNAc.
  • Antibodies are described. However, an anti-glypican 3 antibody whose ADCC activity is enhanced by sugar chain modification is not known.
  • the present invention seeks to provide an anti-glypican 3 antibody composition in which ADCC activity is enhanced by changing the sugar chain composition and a method for producing the same. Disclosure of the invention
  • the present inventor has lost ⁇ -1,6 core fucose even when Darican 3 is the target. It has been found that an antibody having a sugar chain has high cytotoxic activity. Therefore, the present invention provides an anti-glybican 3 antibody composition having an altered sugar chain composition, more specifically an antibody composition having an increased proportion of anti-glypican 3 antibody deficient in fucose. Since the sugar chain-modified anti-glibican 3 antibody composition of the present invention has high cytotoxic activity, it is useful as a cell growth inhibitor such as an anticancer agent.
  • the present invention also provides a method for producing an antibody having a modified sugar chain, wherein a nucleic acid encoding an anti-glypican 3 antibody is introduced into a host cell having reduced ability to add fucos such as a YB2 / 0 cell.
  • a method for producing an anti-glypican 3 antibody composition is provided, wherein the antibody is obtained by culturing the host cell.
  • the cell having a reduced ability to add fucose to a sugar chain is a fucospore transport cell-deficient cell.
  • Figure 1 shows the basic structure of an N-glycosyl-linked sugar chain.
  • Figure 2 shows the ADCC activity of each chimeric antibody using human PBMC and HepG2 as the target cell.
  • Figure 3 shows the ADCC activity of each chimeric antibody when human PBMC is used and HuH7 is the target cell.
  • Figure 4 shows the ADCC activity of each antibody when using human PBMC and targeting HuH-7.
  • FIG. 5 shows a normal phase HPLC chromatogram of agaractosyl 2-AB-glycan prepared from FT-KO cell-producing antibody (a, b, c) and CHO cell-producing antibody.
  • FIG. 6 shows the estimated structures of the peaks G (0) and G (0) -Fuc shown in FIG.
  • FIG. 7 shows a DSC (Differential Scanning Calorimetry) measurement chart for the FT-KO cell-producing antibody (a) and the CHO cell-producing antibody (b).
  • DSC Different Scanning Calorimetry
  • the present invention is characterized by an anti-glibican 3 antibody composition with altered sugar chain composition. It is known that the structure of the sugar chain bound to the antibody has a great influence on the expression of the cytotoxic activity of the antibody.
  • the sugar chain that binds to the antibody includes the N-daricoside-linked sugar chain that binds to the N atom of the side chain of the asparagine of the antibody molecule, and the O-daricosyl-linked sugar that binds to the serine or threonine side chain hydroxyl group of the antibody molecule.
  • the presence or absence of fucose is a problem for N-glycoside-linked sugar chains.
  • Figure 1 shows the basic structure of the N-glycoside-linked sugar chain that binds to the antibody.
  • the N-daricosyl-linked glycan is composed of one mannose (Man) and two N-acetylcylcosamines (GlcNAc) as shown in Fig. 1 as basic IgG glycans (1) and (3). It has a basic structure (core) “—Man jS 1—4 GlcNAC jS 1 _ 4 GlcNAc—”, the right GlcNAc of this structure is called the reducing end, and the left Man is the non-reducing end Called.
  • the glycans with bisecting N-acetyl darcosamine are O-glycosyl glycans or N-glycosyl glycans, and N-acetyl dalcosaminyl transferase III
  • an antibody composition (sugar chain-modified antibody composition) having an altered sugar chain group is: An antibody composition having a sugar chain composition different from that of an antibody composition produced in a reference host cell.
  • whether or not the sugar chain composition has changed can be determined based on an antibody composition produced in a reference host cell.
  • the antibody composition is an antibody composition having a changed sugar chain composition.
  • the reference host cell in the present invention is CHO DG44.
  • CHO DG44 can be obtained from Invitrogen, for example.
  • Antibodies with altered glycan composition examples include antibodies with an increased proportion of fucose (eg, a-1,6 core fucose) deficient antibodies in antibody compositions.
  • Examples of the composition include an antibody composition in which the ratio of bisecting N_acetyl glucosamine (GlcNAc) added antibody in the antibody composition is increased.
  • An antibody composition in which the ratio of fucose-deficient antibody is higher than that of the reference antibody composition can be mentioned.
  • the antibody since the antibody may have a plurality of N-glycosyl sugar chains, the number of fucose added to the fucoose-deficient antibody of the present invention is reduced only with an antibody to which no fucose is added.
  • Antibodies antibodies to which fucose is not added in at least one sugar chain are also included.
  • the antibody composition having a changed sugar chain composition is an antibody composition having an increased proportion of fucose-deficient antibodies
  • the antibody composition having a changed sugar chain composition of the present invention includes fucose-deficient antibodies and fucose.
  • the percentage of antibodies that are deficient in fucoses is higher than antibody compositions made in the reference host cell.
  • the fucose-deficient ratio is not particularly limited, but is preferably 20% or more, more preferably 50% or more, and still more preferably 90% or more. .
  • the bisecting N-acetildarcosamine-added antibody having a high ratio of the bisecting N-acetildarcosamine-added antibody of the present invention
  • the ratio is not particularly limited, but is preferably 20% or more, more preferably 50% or more, and still more preferably 90% or more.
  • the anti-glibican 3 antibody composition with altered sugar chain composition of the present invention can be obtained by methods known to those skilled in the art.
  • fucose-deficient antibodies can be expressed by expressing anti-glypican 3 antibodies in host cells that have no or low ability to add ⁇ -1,6 core fucose. Can be manufactured.
  • Host cells that do not have the ability to add fucose or have a low ability to add fucose are not particularly limited, but examples include host cells that are deficient or low in fucose transfer activity, hosts that have a low fucose concentration in the Golgi Cell, etc. More specifically, rat myeloma YB2 / 3HL.P2.G11.16Ag.20 cells (abbreviated as YB2 / 0 cells) (stored as ATCC CRL 1662), FTVIII knockout CHO cells (WO 02 / 31140), Lecl3 cells (WO03 / 035835), fucose transport deficient cells (WO 2005/017155), and the like.
  • YB2 / 3HL.P2.G11.16Ag.20 cells (abbreviated as YB2 / 0 cells) (stored as ATCC CRL 1662), FTVIII knockout CHO cells (WO 02 / 31140), Lecl3 cells (WO03 /
  • a fucose transporter-deficient cell is a cell in which the function of the fucose transporter is reduced because the fucose transporter is present in a smaller amount than normal cells or because the fucose transporter structure has a mutation.
  • Examples of fucospore transporter-deficient cells include cells in which the fucose transporter gene is knocked out (hereinafter referred to as “FT-KO cells”), and part of the fucose transporter gene is defective.
  • FT-KO cells cells in which the fucose transporter gene is knocked out
  • cells that are mutated, cells that are defective in the expression system of the fucose transport gene, and the like can be mentioned.
  • the nucleotide sequence of the gene encoding the Chinese hamster fucosse transport and the amino acid sequence of fucose transport are shown in SEQ ID NOs: 1 26 and 1 27, respectively.
  • RNAi interference (RNAi interference
  • RNAi is a phenomenon in which when a double-stranded RNA (dsRNA) is introduced into a cell, the mRNA in the cell corresponding to that RNA sequence is specifically degraded and is no longer expressed as a protein.
  • dsRNA double-stranded RNA
  • usually double-stranded RNA is used.
  • the region that forms a double strand may form a double strand in all regions, or a part of the region (for example, both ends or one end) may be a double strand. Good.
  • the length of the oligo RNA used for RNAi is not limited.
  • the length of the oligo RNA of the present invention is, for example, 5 to 1000 bases (5 to L000 bp in the case of double strands), preferably 10 to 100 bases (in the case of double strands). 10 to 100 bp), more preferably 15 to 25 bases (15 to 25 bp in the case of double strands), and particularly preferably 19 to 23 bases (19 to 23 in the case of double strands). bp).
  • the RNAi method uses double-strand RNA (dsRNA) consisting of sense RNA and antisense RNA that is homologous to a gene, destroying the homologous portion of the transcript (mRNA) of that gene.
  • dsRNA double-strand RNA
  • mRNA transcript
  • This is a method using the phenomenon of Double-stranded RNA corresponding to the full-length sequence of the fucois transporter gene to be used may be used, or a short (eg, 21-23 bp) dsRNA (small interfering RNA; siRNA) corresponding to a part of the sequence may be used. It may be used.
  • the double-stranded RNA may be directly taken into a cell, or a vector that produces double-stranded RNA may be prepared and introduced into a host cell to produce double-stranded RNA in the cell.
  • all or part of the DNA encoding the focus transporter of the present invention may be incorporated into a vector so as to form a repetitive sequence in the reverse direction, and the vector may be introduced into a host cell.
  • RNAi method is described in FireA. Et al., Nature (1998), 391, 806-811, Montgomery MK et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1998), 95, 15502-15507, Timmons L. et al., Nature (1998), 395, 854, Sanchez A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1999), 96, 5049-5054, Misquitta L. et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA (1999), 96,
  • RNAi method Screening of fucose transporter-deficient cells obtained by RNAi method etc. may be performed using the activity of fucose transporter as an index, or Western blotting or fucose transport gene by Northern plotting. Transcription and expression can be used as an index.
  • (GlcNAc) -added bodies can be produced by expressing anti-glypican 3 antibodies in host cells that have the ability to form a bisecting N-acetyldarcosamine (GlcNAc) structure on the sugar chain. it can.
  • the host cell having the ability to form an N-acetyl dalcosamine (GlcNAc) structure is not particularly limited.
  • a host cell having an expression vector containing DNA encoding GnTIII is used. Is possible. Therefore, a host cell having an expression vector comprising DNA encoding GnTIII and an expression vector encoding anti-glibican 3 antibody has a sugar chain to which bisecting N-acetyl darcosamine is added. Anti-glibican 3 antibody can be produced.
  • the gene encoding NA encoding GnTIII and anti-glypican 3 antibody may be present on the same vector or on different vectors.
  • Glycosidase F (Roche) or the like is allowed to act to release the sugar chain from the antibody. After that, solid phase extraction using cellulose force trige (Shimizu Y. et al., Carbohydrate
  • PA glycan is removed by solid phase extraction using cellulose cartridge and centrifugate, and then concentrated by centrifugation to obtain a purified PA glycan. Thereafter, it can be measured by reverse-phase HPLC analysis using an ODS column. In addition, after preparation of PA sugar chain, two-dimensional mapping was performed by combining reverse phase HPLC analysis using ODS column and normal phase HPLC analysis using amine column. It is also possible to do this.
  • the anti-glibican 3 antibody whose sugar chain is modified is not particularly limited as long as it is an antibody that binds to darpican 3. Binding to darpican 3 is preferably specific.
  • Preferred anti-glypican 3 antibodies in the present invention include antibodies having CDR sequences shown in Table 1 below. table 1
  • OAV Antibodies having the CDR sequences listed in the above table have high cytotoxic activity.
  • the antibody having the CDR sequence shown in the above table recognizes an epitope of amino acid numbers 5 2 4 1 5 6 3 on darapine 3.
  • An antibody recognizing the amino acid number 5 2 4— 5 6 3 epitope is preferred as the anti-glypican 3 antibody of the present invention because of its high cytotoxic activity.
  • an antibody composition having a changed sugar chain composition on the first day of the month is characterized by enhanced ADCC activity.
  • whether or not ADCC activity is enhanced is determined that ADCC activity is enhanced when ADCC activity is higher than that of the reference antibody composition. .
  • ADCC activity can be measured by methods known to those skilled in the art. For example, it can be measured by mixing effector cells, target cells and anti-glipine 3 antibody, and examining the degree of ADCC. . More specifically, for example, mouse spleen cells or mononuclear cells isolated from human peripheral blood or bone marrow are used as effector cells, and Daripican 3 of human hepatocyte cell line HuH-7 ⁇ is expressed as target cells. Use a human cell line. Pre-label target cells with 5 iCr, incubate with anti-glypican 3 antibody, and then incubate with the appropriate ratio of effector cells to target cells. After incubation, the supernatant is collected, and the ADCC activity can be measured by counting the radioactivity in the supernatant. Anti-glibican 3 antibody
  • Anti-glibican 3 antibody can be prepared by methods known to those skilled in the art. That is, using glypican 3 as a sensitizing antigen, this is exempted according to the usual immunization method, and the resulting immune cells are fused with known parental cells by the usual cell worm method, and by the usual screening method It can be produced by screening monoclonal antibody-producing cells. Specifically, monoclonal antibodies can be prepared as follows. First, human anti-glypican 3 used as a sensitizing antigen for antibody acquisition was converted to the glypican 3 (MXR 7) gene / amino acid sequence disclosed in Lü, H. et al., Gene 188 (1997), 151-156.
  • MXR 7 glypican 3
  • the desired human glypican 3 protein is purified from the host cell or in culture by a known method. To do. Next, this purified glypican 3 protein is used as a sensitizing antigen.
  • a partial peptide of glypican 3 can be used as a sensitizing antigen. In this case, the partial peptide can be obtained from the amino acid sequence of human glypican 3 by chemical synthesis.
  • Anti-glypican 3 antibody inhibits cell growth inhibitory activity by the action of ADCC, action by CDC, and inhibition of growth factor activity.
  • anti-glypican 3 antibody contains anti-glypican 3 antibody such as radioisotopes, chemotherapeutic agents, bacterial toxins, etc. Since cell proliferation can be suppressed by binding a cytotoxic substance, the epitope on the three anti-glypican 3 antibodies recognized by the anti-glypican 3 antibody of the present invention is not limited to a specific one. Any epitopes that exist above may be recognized. Therefore, any fragment can be used as the antigen for producing the anti-glypican 3 antibody of the present invention as long as it is a fragment containing an epitope present on the darpican 3 molecule.
  • a peptide containing amino acid numbers 5 2 4-5 6 3 is used as a sensitizing antigen. Can do.
  • the mammal immunized with the sensitizing antigen is not particularly limited, but is preferably selected in consideration of compatibility with the parent cell used for cell fusion, and is generally rodent. Animals such as mice, rats, hamsters, rabbits, sals, etc. are used. In order to immunize an animal with a sensitizing antigen, a known method is used. For example, as a general method, a sensitizing antigen is injected into a mammal intraperitoneally or subcutaneously.
  • the sensitizing antigen is diluted to an appropriate amount with PBS (Phosphate-Buffered Saline) or physiological saline, etc., and mixed with an appropriate amount of an ordinary adjuvant, for example, Freund's complete adjuvant, if necessary. Give mammals several times every 4-21 days.
  • An appropriate carrier can also be used during immunization with the sensitizing antigen.
  • epithelial cells include spleen cells.
  • Mammalian myeloma cells are used as the other parent cell to be fused with the immune cells. This myeloma cell is known in various known cell lines such as P3 (P3x63Ag8.653) (J. Immnol. (1979) 123, 1548-1550), P3x63Ag8U.l (Current Topics in Microbiology and
  • the cell fusion between the immune cell and the myeloma cell is basically performed by a known method, for example, the method of Kohler and Milstein, C., Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46) etc.
  • the cell fusion is performed in a normal nutrient culture medium in the presence of a cell fusion promoter, for example.
  • a cell fusion promoter for example, polyethylene glycol (PEG), Sendai virus (HVJ) and the like are used, and an auxiliary agent such as dimethyl sulfoxide can be added and used to enhance the fusion efficiency as desired.
  • PEG polyethylene glycol
  • HVJ Sendai virus
  • the ratio of use of immune cells and myeloma cells can be set arbitrarily.
  • the number of immune cells is preferably 1 to 10 times that of myeloma cells.
  • the culture solution used for the cell fusion for example, suitable for the growth of the Myechioma cell line; RPMI1640 culture solution, MEM culture solution, and other normal culture solutions used for this type of cell culture can be used.
  • serum supplements such as fetal calf serum (FCS) can be used in combination.
  • FCS fetal calf serum
  • a predetermined amount of the immune cells and myeloma cells are mixed well in the culture medium, and a PEG solution (for example, an average molecular weight of about 1000-6000) pre-warmed to about 37 ° C. is usually 30-
  • the target fusion cell (hypridoma) is formed by adding and mixing at a concentration of 60% (w / v).
  • Hypridoma thus obtained can be obtained by using a normal selective culture medium such as HAT culture medium (hypoxanthine, aminopterin and And a thromidine-containing culture medium). Culturing with the above HAT culture solution is continued for a sufficient time (usually several days to several weeks) to kill cells (non-fusion cells) other than the desired hyperpridoma. Next, the usual limiting dilution method is performed, and a screening and single cloning of a hyperidoma producing the target antibody is performed.
  • HAT culture medium hyperxanthine, aminopterin and And a thromidine-containing culture medium
  • human lymphocytes are sensitized to glypican 3 in vitro, and the sensitized lymphocytes are combined with human-derived myeloma cells having permanent mitotic potential. It is also possible to obtain a desired human antibody having a binding activity to darpican 3 by fusion (see Japanese Patent Publication No. 1-59878). Furthermore, anti-glibican 3 antibody-producing cells are obtained by administering anti-glibican 3 antibody-producing cells to transgenic animals having all repertoires of human antibody genes, and human antibodies against darpican 3 are obtained from the immortalized cells. It may be obtained (see International Patent Application Publication Nos.
  • the hybridoma producing the monoclonal antibody thus produced can be subcultured in a normal culture solution and can be stored for a long time in liquid nitrogen. .
  • an antibody gene is cloned from a hybridoma, incorporated into an appropriate vector, introduced into a host, and produced using a gene recombination technique.
  • a gene recombination technique See, for example, Vandamme, AM et al., Eur. J. Biochem. (1990) 192, 767-775, 1990.
  • mRNA encoding the variable (V) region of anti-glypican 3 antibody is isolated from a hyperidoma that produces anti-glycican 3 antibody.
  • Isolation of mRNA can be performed by known methods such as guanidine ultracentrifugation (Chirgwin, JM et al., Biochemistry (1979) 18, 5294-5299), AGPC (Chomczynski, Ret al., Anal. Biochem. 1987) 162, 156-159) etc. to prepare all: NA, mRNA Purification Kit
  • mRNA can be prepared directly using the QuickPrep mRNA Purification Kit (Pharmacia).
  • mRNA can be prepared directly using the QuickPrep mRNA Purification Kit (Pharmacia).
  • cDNA synthesis is performed using AMV Reverse Transcriptase First-stx ⁇ nd cDNA Synthesis Kit (Seikagaku Corporation).
  • 5'-Ampli FINDER RACE Kit (Clontech) and 5'-EACE method using PCR (Frohman, MAet al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA ( 1988) 85, 8998-9002, Belyavsky, A.
  • the antibody gene is incorporated into the current vector so that it is expressed under the control of an expression control region such as an enhancer or a promoter.
  • the host cell is transformed with this expression vector to express the antibody.
  • Expression of the antibody gene may be accomplished by co-transforming the host cell by separately incorporating DNA encoding the antibody heavy chain (H chain) or light chain (L chain) into the expression vector, or The host cell may be transformed by incorporating DNA encoding the L chain into a single expression vector (see WO 94/11523).
  • transgenic animals can be used for the production of recombinant antibodies.
  • an antibody gene is inserted in the middle of a gene encoding a protein (such as goat ⁇ -casein) produced in milk and prepared as a fusion gene.
  • a DA fragment containing the fusion gene into which the antibody gene has been inserted is injected into a goat embryo and the embryo is introduced into a female goat.
  • a desired antibody is obtained from milk produced by a transgenic goat or its offspring produced from a goat that has received the embryo.
  • hormones may be used as appropriate in Transgene goats to increase milk yield containing the desired antibodies produced from Transgenic goats (Ebert, KM et al., Bio / Technology ( 1994) 12, 699-702).
  • Modified antibody i in addition to the above-mentioned antibody, a genetically engineered antibody that has been artificially modified for the purpose of reducing heteroantigenicity to humans, such as a chimeric antibody or a humanized antibody.
  • a genetically engineered antibody that has been artificially modified for the purpose of reducing heteroantigenicity to humans such as a chimeric antibody or a humanized antibody.
  • These modified antibodies can be produced using known methods.
  • a chimeric antibody is obtained by ligating the DNA encoding the antibody V region obtained as described above with the DNA encoding the human antibody C region, incorporating it into an expression vector and introducing it into a host for production. Using this known method, a chimeric antibody useful in the present invention can be obtained.
  • Humanized antibodies are also referred to as reshaped human antibodies, which complement the complementarity deterniindng region (CDR) of non-human mammal L animals, eg, mouse antibodies. It is transplanted to a sex-determining region, and its general gene recombination technique is also known (see European Patent Application Publication No. EP 125023, WO 96/02576). Specifically, a region that overlaps the terminal region of both CDR and FR of a DNA ⁇ S sequence designed to link the CDR of a mouse antibody and the framework region (FR) of a human antibody.
  • CDR complementarity deterniindng region
  • the framework region of the human antibody that is ligated via CDR is selected such that the complementarity determining region forms a good antigen binding site. If necessary, the amino acid in the frame region of the variable region of the antibody may be substituted so that the complementarity-determining region of the reshaped human antibody forms an appropriate antigen-binding site (Sato, K. et. al., Cancer Res. (1993) 53, 851-856).
  • human antibodies are used, for example, C Y 1, C Y 2, C Y 3, C Y 4 for the H chain and CK, CX for the L chain. Can be used.
  • the human antibody C region may be modified to improve the stability of the antibody or its production.
  • a chimeric antibody consists of a variable region of an antibody derived from a mammal other than a human and a constant region derived from a human antibody.
  • the humanized antibody is composed of a complementarity determining region of a non-human mammal-derived antibody and a frame region and C region derived from a human antibody. Since humanized antibodies have reduced antigenicity in the human body, they are useful as active ingredients of the therapeutic agent of the present invention. Modified antibody
  • the body used in the present invention is not limited to the whole antibody molecule, and may be an antibody fragment or a modified product thereof as long as it binds to Dari.bican 3 and inhibits Dalipican 3 activity. Both monovalent and monovalent antibodies are included.
  • antibody fragments include Fab, F
  • the antibody is treated with an enzyme such as papain or pepsin to generate antibody fragments, or genes encoding these antibody fragments are constructed and generated.
  • scF is obtained by linking the H chain V region and L chain V region of an antibody.
  • the H chain V region and the L chain V region are linked via a linker, preferably a peptide linker (Huston, JS et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988). 85, 5879-
  • the H chain V region and the L chain V region in scFv may be derived from any of those described as antibodies herein.
  • As the peptide linker linking the V region for example, any single chain peptide consisting of amino acid residues 12-19 is used.
  • the DNA encoding scFv is a DNA encoding the H chain or H chain V region of the antibody, and a DNA encoding the L chain or L chain V region.
  • scFv can be obtained according to a conventional method.
  • These antibody fragments can be produced by the host by obtaining and expressing the gene in the same manner as described above.
  • the “antibody” in the present invention includes these antibody fragments.
  • an anti-glypican antibody conjugated with various molecules such as polyethylene glycol (PEG) can also be used.
  • PEG polyethylene glycol
  • the “antibody” in this description includes these modified antibodies. Such an antibody repair can be obtained by chemically modifying the obtained antibody. 3.
  • the antibody used in this laugh can be a bispecific antibody 1 ⁇ .
  • the bispecific antibody may be a bispecific antibody having an antigen binding site that recognizes different epitopes on the three molecules of Daripican, or one antigen binding site recognizes glypican 3 and binds to the other antigen.
  • the site may recognize a cytotoxic substance such as a chemotherapeutic agent or cell-derived toxin. In this case, it is possible to suppress the proliferation of tumor cells by causing a cytotoxic agent to act on the cells expressing glypican 3 to specifically damage tumor cells.
  • Bispecific antibodies can be made by combining HL pairs of two types of antibodies, or by creating a fusion antibody that produces bispecific antibodies by fusing hyperidomas that produce different monoclonal antibodies. You can also get. Furthermore, bispecific antibodies can be produced by genetic engineering techniques. Expression and production of recombinant or modified antibodies
  • the antibody gene constructed as described above can be expressed and obtained by a known method.
  • it can be expressed by linking a useful function of a commonly used promoter, an antibody gene to be expressed, and a poly ligament signal functionally linked to the 3 'downstream side.
  • promoters / enhancers include human cytomegalovirus immediate early promoter / enhancer).
  • Virus promoters / enhancers such as Rus, Polomavirus, Adenovirus, Simian Virus 40 (SV40), etc., or promoters from mammalian cells such as Heronguession la Yue la (HEFla), etc.
  • Rus a viral promoter
  • Polomavirus adenovirus
  • Adenovirus adenovirus
  • Simian Virus 40 SV40
  • HEFla Heronguession la Yue la
  • SV40 promoter Zenhansa use the method of Mulligan et al. (Nature (1979) 277, 108).
  • HEFla Promoted Yuen Zenhansa use the method of Mizushima et al. (Nucleic Acids Res (1990) 18, 5322), gene expression can be easily performed.
  • any eukaryotic expression system having a function of adding a sugar chain to the expressed antibody can be used.
  • eukaryotic cells include established mammalian cell lines, insect cell lines, fungal cells, and animal cells such as yeast cells.
  • the antibodies used in the present invention are expressed in mammalian cells such as CHO, COS, Myechima, BHE :, Vero, HeLa cells.
  • mammalian cells such as CHO, COS, Myechima, BHE :, Vero, HeLa cells.
  • the transformed host cell is cultured in vitro or in vivo to produce the desired antibody.
  • the host cells are cultured according to a known method. For example, DMEM,
  • MEM fetal serum
  • RPMI1640 RPMI1640
  • IMDM fetal serum
  • FCS fetal serum
  • the antibody expressed and produced as described above can be separated from cells and host products and purified to homogeneity.
  • Antibody fractionation and purification used in the present invention can be performed using an affinity column.
  • an affinity column For example, as a column using a protein A column, Hyper D, POROS, Sepharose EE (manufactured by Pharmacia) and the like can be mentioned. Any other separation and purification methods used for ordinary proteins may be used, and the method is not limited.
  • antibodies can be separated and purified by appropriately selecting and combining a column chromatography column other than the above-mentioned affinity column, a filter, ultrafiltration, salt, dialysis, etc. (Antibodies A Laboratory Manual. Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). Separation of an antibody having a desired sugar chain using a lectin column is known to those skilled in the art. For example, the method described in WOO2 / 30954 can be used. Confirmation of antibody activity
  • Antigen binding activity of antibodies used in the present invention Antibodies A Laboratory
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • EIA Enzyme immunoassay
  • RIA radioimmunoassay
  • a sample containing anti-glypican 3 antibody for example, a culture supernatant of an anti-glypican 3 antibody-producing cell or a purified antibody is added to a plate coated with glypican 3.
  • Add a secondary antibody labeled with an enzyme such as alkaline phosphatase incubate the plate, wash it, add an enzyme substrate such as P-nitrophenyl phosphate, and measure the absorbance to evaluate the antigen-binding activity. be able to.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition comprising the gubican 3 antibody composition with altered sugar chain composition of the present invention.
  • the pharmaceutical composition containing the antibody composition of the present invention is useful for the treatment and / or prevention of diseases associated with cell proliferation such as cancer, and is particularly useful for the treatment and prevention or prevention of liver cancer.
  • the antibody of the present invention can be formulated by methods known to those skilled in the art. For example, it can be used parenterally in the form of a sterile solution with water or other pharmaceutically acceptable liquid, or in the form of a suspension injection.
  • a pharmacologically acceptable carrier or medium such as sterilized water or physiological saline, vegetable oil, emulsifier, suspending agent, surfactant, stabilizer, flavoring agent, excipient, vehicle, It is conceivable to formulate by combining with preservatives, binders, etc., in a unit dosage form generally required for pharmaceutical practice. This The amount of active ingredient in these preparations is such that an appropriate volume within the indicated range is obtained.
  • Sterile compositions for injection can be formulated according to normal pharmaceutical practice using a vehicle such as distilled water for injection.
  • aqueous solutions for injection include isotonic solutions containing, for example, physiological saline, glucose and other adjuvants, such as D-sorbitol, D-mannose, D-mannitol, and sodium chloride.
  • isotonic solutions containing, for example, physiological saline, glucose and other adjuvants, such as D-sorbitol, D-mannose, D-mannitol, and sodium chloride.
  • physiological saline such as glucose and other adjuvants, such as D-sorbitol, D-mannose, D-mannitol, and sodium chloride.
  • alcohol specifically ethanol
  • polyalcohol such as propylene glycol
  • polyethylene glycol polyethylene glycol
  • nonionic surfactant such as polysorbate 80 ( ⁇ )
  • oily liquid examples include sesame oil and soybean oil, which may be used in combination with benzyl benzoate or benzyl alcohol as a solubilizing agent.
  • a buffer such as phosphate buffer, sodium acetate buffer, soothing agent such as hydrochloric acid pro-in, stabilizer, for example, benzyl alcohol, phenol, antioxidant may be added.
  • the prepared injection is usually filled in a suitable ampoule.
  • Administration is preferably parenteral administration, and specific examples include injection, trans-administration, pulmonary administration, and transdermal administration.
  • Examples of the injection form can be administered systemically or locally by, for example, intravenous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, subcutaneous injection, and the like.
  • the administration method can be appropriately selected depending on the patient's age and symptoms.
  • the dose of the pharmaceutical composition containing the antibody or the polynucleotide encoding the antibody can be selected, for example, in the range of O.OOOlmg to lOOOmg per lkg body weight.
  • the dose can be selected in the range of 0.001 to 100000 mg body per patient, but is not necessarily limited to these values.
  • the dose and administration method vary depending on the patient's weight, age, symptoms, etc., but those skilled in the art can appropriately select them.
  • a soluble GPC3 protein lacking (564-580 amino acids) was prepared and used for immunization.
  • MRLMp JUmmCrj-lpr / lpr mouse (hereinafter referred to as MRL / lpr mouse, purchased from Charles River, Japan), an autoimmune disease mouse, was used as an immunized animal. Start immunization at 7 or 8 weeks of age, and prepare the soluble GPC3 at 100 g / head for the first immunization.
  • Emulsion using FCA was administered subcutaneously. After 5 immunizations, the final immunization was diluted in PBS to 50 g head and administered into the tail vein. Four days after the final immunization, the spleen cells were removed, mixed with mouse myeloma—ma cells P3-X63Ag8Ul (P3U1, purchased from ATCC) at a ratio of 2: 1, and PEG1500 (Roche Diagnostics) was gradually added. Cell fusion was performed by adding to the cell. Screening was performed by ELISA using an immunoplate in which soluble GPC3 core protein was immobilized. Positive clones were monocloned by the limiting dilution method. As a result, 11 clones (M3C11, M13B3, M1E7, M3B8, M11F1, L9G11,
  • mice were subjected to final immunization (50 mg / head) in the tail vein for cell fusion. Screening was performed by ELISA using an immunoplate on which a soluble GPC3 core protein lacking the C-terminal hydrophobic region (564-580 amino acids) was immobilized. Positive clones were converted to monochrome using the limiting dilution method. As a result, 5 clones (GC199, GC202, GC33, GC179, GC194) having strong binding activity to GPC3 were obtained.
  • variable regions of the H and L chains of the antibody thus obtained were cloned by a conventional method to determine the sequence. Furthermore, the CDR region was determined by examining homology in comparison with a database of known antibody amino acid sequences. The sequence of the CDR region is shown in Tables 1 and 2.
  • Example 2
  • the heavy chain and light chain variable region sequences of anti-GPC3 antibody GC33 were linked to human IgGl and ⁇ chain constant region sequences.
  • PCR was performed using a synthetic oligonucleotide complementary to the 5 'terminal base sequence of the antibody variable chain region and having a Kozak sequence and a synthetic oligonucleotide complementary to the 3' terminal base sequence having a Nhel site.
  • the PCR product obtained was cloned into the pB-CH vector in which the human IgGl constant region was inserted into the pBluescript KS + vector (Toyobo).
  • the mouse H chain variable region and human H chain (a 1 chain) constant region are linked by the Nhel site.
  • the prepared H chain gene fragment was cloned into the expression vector PCXND3.
  • PCR was performed using a synthetic oligonucleotide complementary to the 5 'terminal nucleotide sequence of the antibody L chain variable region and having a Kozak sequence and a synthetic oligonucleotide complementary to the 3' terminal nucleotide sequence having a BsiWI site.
  • the PCR product obtained was cloned into the pB-CL vector in which the human kappa chain constant region was inserted into pBluescript KS + Vector I (Toyobo).
  • the human L chain variable region and the constant region are linked by the BsiWI position. ing.
  • the prepared L chain gene fragment was cloned into expression vector pUCAG.
  • This vector, pUCAG ligates the 2.6 kbp fragment obtained by digesting pCXN (Niwa et al., Gene 1991; 108: 193-200) with the restriction enzyme BamHI to the restriction enzyme BamHI site of the pUC19 vector (Toyobo). And it is a closed vector.
  • the gene fragment obtained by digesting the pUCAG vector with the L chain gene fragment inserted with the restriction enzyme ffindlll is used as the H chain gene.
  • PCXND3 was inserted into the restriction enzyme Hin lll cleavage site and cloned.
  • This plasmid is a neomycin resistance gene, DHFR gene, anti-GPC3 mouse-one human chimeric antibody gene in animal cells. As shown in 4.)).
  • YB2 / 0 (ATCC, CRL-1662) is used as the host cell and contains 10% FBS
  • the cells were cultured in RPMI1640 medium.
  • the anti-GPC3 chimeric antibody expression vector prepared in Example 2 was 7.5 106 / 0.75. Introduced into 13 ⁇ 48 (-) ⁇ 62/0 (ATCC CRT-1662) under the conditions of 1.4 kV and 25 F by the mouth-to-poration method. After a recovery period of 10 minutes at room temperature, the cells treated with electoporation were suspended in 40 mL of RPMI 1640 medium containing 10% FBS. A 10-fold diluted solution was prepared in the same medium and dispensed at 100 1 / well onto a 96-well culture plate.
  • Peripheral blood collected from normal subjects with heparin was diluted 2-fold with PBS (-) and overlaid on FicoU-PaqueTMPLUS (Amersham). After centrifugation (500 ⁇ g, 30 minutes, 20 ° C.), the intermediate layer, which is a mononuclear cell fraction, was collected. 10% after 3 washes
  • HepG2 cells ATCC
  • HuH_7 cells Human Science Research Resource Punk
  • Each well of (Falcon) was dispensed at 1 ⁇ 10 4 cells / well and cultured for 1 day. After incubation, 5.55 MBq of Cr51 is added, and the cells are cultured at 37 ° C for 1 hour in 5% carbon dioxide gas. The cells are washed once with medium, and 50 L of 10% FBS / RPMI1640 medium is added to form cells. did.
  • A is the average value of radioactivity (cpm) in each well
  • B is 2% NP-40 aqueous solution (Nonidet P-40, Code ⁇ .252.23, Nacalai Tesque Co., Ltd.) 100
  • C represents the mean value of Ikatsu property (cpm) in Ueru added 10% FBS / RPMI medium 0.99 L to a target cell .
  • the test was performed in triplicate, and the average value and standard deviation were calculated for ADCC activity (%).
  • Figures 2 and 3 show ADCC activity of human anti-GPC3 chimeric antibody using human PBMC.
  • the vertical axis represents the cytotoxic activity (%), and the horizontal axis represents the concentration of the added antibody (xg Zm L).
  • Figure 2 shows the case where HepG2 was used as the target cell, and Figure 3 shows HuH-7. The results when used are shown.
  • White indicates the activity of the CHO cell-producing chimeric GC33 antibody, and black indicates the activity of the YB2 / 0-producing chimeric GC33 antibody.
  • the low-fucose type YB2 / 0-producing GC33 chimeric antibody showed stronger ADCC activity compared to the CHO cell-produced GC33 chimeric antibody, which suggests that the ADCC activity of the anti-GPC3 antibody is enhanced by modification of the sugar chain. It became clear.
  • Example 5 The low-fucose type YB2 / 0-producing GC33 chimeric antibody showed stronger ADCC activity compared to the CHO cell-produced GC33 chimeric antibody, which suggests that the ADCC activity of the anti-GPC3 antibody is enhanced by modification of the sugar chain. It became clear.
  • the final concentration of hygromycin B was adjusted to 1 mg / ml in SFMII (+) medium, and the fucose transport evening deficient strain (clonal name 3F2) was passaged. 8 ⁇ 10 6 3F2 were suspended in 0.8 mL Dulbecco's phosphate buffer. 25 antibody expression vectors (Reference Examples 1 and 2) were added to the cell suspension, and the cell suspension was transferred to a Gene Pulser Cuvette. After standing on ice for 10 minutes, a vector was introduced into the cells by electroporation with GE TE-PULSER II under the conditions of 1.5 kV and 25 FD. After introducing the vector, the cells were suspended in 40 mL of SFMI +) medium and seeded at 100!
  • Hitrap rProtein A (Pharmacia CA # 17-508001). After washing with a binding buffer (20 mM sodium phosphate (pH 7.0)), elution was performed with an elution buffer (0.1 M Glycin-HCl (pH 2.7)). The eluate was immediately neutralized with a neutralization buffer (lM Tris-HCl (pH 9.0)). Select and elute antibody elution fractions by DC protein assay (BIO-RAD CA # 500-0111), then use CentripreirYMlO (MiUipore CAT # 4304) and concentrated to about 2 mL.
  • Figure 4 shows the in vitro ADCC activity of FT-KO cell-producing anti-GPC3 antibody using human PBMC. The method was performed as described in Example 4. In the figure, the vertical axis represents cytotoxic activity.
  • Glycosidase F (Roche diagnostics) was allowed to act on the FKO cell-producing antibody of the present invention and the CHO cell-producing antibody as a control sample to release sugar chains from the protein (Weitzhandler M. et ai "Journal of Pharmaceutical Sciences 83 : 12 (1994), 1670-1675) After deproteinization with ethanol (Schenk B. et al_, The
  • a 20 mol / L sodium acetate buffer solution (pH 6.0) containing 200 mmol / L sodium chloride is used as a dialysis vessel, and a dialysis membrane containing an antibody solution equivalent to 700 g is immersed in the dialysis membrane. A sample solution was obtained.
  • AB064105 homo sapiens IGK mRNA ior immunoglobulin kappa light chain VLJ region, partial cds, clone The signal sequence of Accession Number S40357 having high homology with AB064105 was used for the signal sequence of the L chain.
  • Humanized antibodies were prepared by grafting a complementary antigen-determining region (hereinafter CDR) into the frame region (hereinafter FR) of these antibodies. Specifically, about 50 bases of synthetic oligo DNA was designed to hybridize about 20 bases, and these synthetic oligo DNAs were assembled by PCR to produce genes encoding each variable region.
  • CDR complementary antigen-determining region
  • FR frame region
  • Both H chain and L chain ver.a humanized GC33 showed lower binding activity compared to the mouse GC33 variable region antibody (mouse I mouse).
  • the mouse GC33 variable region antibody mouse I mouse.
  • a decrease in binding activity was observed, and it was found that the decrease in binding activity due to amino acid substitution was due to the heavy chain. Therefore, H chain variants ver.c, ver.f, ver.h, ver.i, vei'.j, and ver.k were prepared. All humanized GC33 showed binding activity equivalent to that of the chimeric antibody with mouse GC33 variable region.
  • Humanized GC33 heavy chain variable region ver.a ver.c, ver.f, ver.h, ver ⁇ ver.j.
  • the base sequence of ver.k is SEQ ID NO: 7 4, 7 5, 7 6, 7 7, 7 8, 7 9, 80, and the mino acid sequence is SEQ ID NO: 8 1, 8 2, 8 3, 8 4, 8 Shown in 5, 8 6 and 8 7
  • the nucleotide sequence of the humanized GC33 L chain variable region ver.a is shown in SEQ ID NO: 88, and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 89.
  • the 6th glutamic acid was replaced by dulyumin, but these antibodies showed a marked increase in thermal stability.
  • reaction rate constant of the first order sequence-dependent deamidation is known, and Asn-Gly is known as a particularly easily deamidated sequence.
  • a modified antibody in which Asn33 was replaced with Asp was prepared.
  • Quick Change Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene) was used. That is, 125 ng sense primer (CTT GTA CAC AGT GAC GGAAAC ACC TAT: SEQ ID NO: 1 2 4), 125 n antisense primer (ATA GGT GTT TCC GTC ACT GTG TAC AAG: SEQ ID NO: 1 2 5), 5 L 10x reaction buffer ⁇ 1 L dNTP mix, lO ng humanized GC33 L chain ver.a cloned HEFg K, 1
  • a 50 L reaction solution containing L Pfu Turbo DNA Polymerase was subjected to 12 cycles of 95 seconds for 30 seconds, 55 ° C for 1 minute, and 68 ° C for 9 minutes. Then, the restriction enzyme Dpnl was added and digested with 37 for 2 hours and introduced into the attached XLl-Blue competent cells to obtain transformants. For the clone with the correct mutations, the variable region was excised and re-cloned into HEFg /. The culture supernatant that was transiently expressed by introduction into COS 7 cells using Fugene6 (Roche) together with HEFgA 1 in which the GC33 H chain ver.k was cloned was collected. Using anti-human IgG antibody The antibody concentration was quantified by sandwich ELISA, and the binding activity of the modified antibody was evaluated by ELISA using a soluble GPC3 core protein as a solid phase. Replace Asn33 with Asp
  • G34A, G34D, G34E, G34L, G34K> G34L, G34V, G34W, G34Y, G34R , G34S and G34T were prepared and the binding activity was evaluated using the COS 7 cell transient expression culture supernatant. As a result, it was found that amino acid substitutions other than Pro (G34P) and Val (G34V) maintained binding activity.
  • amino acid coordinates U of the light chain CDR 1 of the above-described modified antibody are respectively represented by SEQ ID NO: 90 (G34A), SEQ ID NO: 91 (G34D), SEQ ID NO: 92 (G34E), SEQ ID NO: 93 (G34F).
  • SEQ ID NO: 94 G34H
  • SEQ ID NO: 95 G34N
  • SEQ ID NO: 9 6 G34T
  • SEQ ID NO: 9 7 G34Q
  • SEQ ID NO: 9 8 G34 I
  • SEQ ID NO: 9 9 (G34K) SEQ ID NO: No.
  • Hygr Hygromycin resistance gene
  • the fucosal transboater evening-getting vector ver.l (hereinafter referred to as K01 vector evening) is the pMClD A vector (Yagi T, Proc. Natl. Acad. Sci. USA vol.87, p9918-9922, 1990) )
  • K01 vector evening is the pMClD A vector (Yagi T, Proc. Natl. Acad. Sci. USA vol.87, p9918-9922, 1990)
  • pMClD A vector Yagi T, Proc. Natl. Acad. Sci. USA vol.87, p9918-9922, 1990)
  • the fucose transporation No. 2,780 Sma I to BamH I of ⁇ ⁇ ⁇ 4,232 in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 2 6
  • Hygr fragment were inserted respectively.
  • Hygr Since the vector is characterized in that no promoter is added to Hygr, Hygr is expressed by a promoter of the fucose transporator when homologous recombination occurs. However, even if only one copy of a vector is introduced into a cell by homologous recombination, Hygr is not always expressed enough to acquire resistance to hygromycin B. In addition,
  • KO1 vector causes the fucose transporter to lose 41 base pairs of exon 1 including the start codon and lose function.
  • Hygr (EcoT22 I-BamH I) fragment was inserted into the Pst I-BamH I site of pBSK-pgk-1 to prepare pBSK-pgk-l-Hygr.
  • the fucose transport target vector 1 (hereinafter referred to as KO2 vector) is the pMClDT-A vector on the 5 'side of the fucos transporter (the nucleotide sequence U shown in SEQ ID NO: 1 2 6). No.2, 780 Sma I to No.4,232 BamH I), 3 'side (from No.4,284 to No.10,934 Sac l) and pgk-1- Hygr fragment did.
  • the KO2 vector has a pgk-1 gene promoter added to Hygr, so even when only one copy of the vector is introduced into the cell by homologous recombination, it gains resistance to hygromycin B. .
  • the KO2 vector was cut with Not I and introduced into cells.
  • the KO2 vector causes the fucose transpo overnight to lose 46 base pairs of exon 1 including the start codon, thus losing function.
  • the fucos transport transport evening ver.3 (hereinafter referred to as KO3 vector) is the pMClD A vector and the 5 'side of the fucose transporter (SEQ ID NO: 1 2 6). 2,780 Sma I to No.4,232 BamHI), 3 ′ side (from No.4,284 to No.10,934 Sac l), and pgk′l-Puror fragment were inserted respectively. A sequence to which the screening primer shown below was bound was added in advance to the 3 ′ end of pgk-1-Puror.
  • the K03 vector was digested with Not I and introduced into cells. According to the K03 vector, the fucosal transpoin is deprived of 46 base pairs of exon 1 including the start codon and is considered to lose its function.
  • the cell suspension was transferred to Pulser Cuvette (4 mm) (Bio-Rad cat. 1652088). After leaving on ice for 10 minutes, a vector was introduced into the cells by the electrovolatility method using GENE-PULSER II (BioRad code No. 340BR) under the conditions of 1.5 kV and 25 FD. After introducing Vector 1, cells are suspended in 200 ml of SFMIIW medium. Then, 100 1 / well IT cells were seeded in 20 96-well flat-bottomed plates (Yuki cat. 1860-096). Pre Ichito in a C0 2 incubator, after incubation for 24 hours, 37 ° C, was added drug.
  • Each of the K01 vector and the KO2 vector was introduced into CHO cells, and selection with hygromycin B (Invitrogen cat. 10687-010) was performed 24 hours after the introduction of vector.
  • Hygromycin B was dissolved in SFMI +) to a concentration of 0.3 mg / ml, and 100 well was added.
  • CHO cells used for screening are cultured in a 96-well flat-bottom plate, and after removing the culture supernatant, heat the cell lysis buffer at 50 1 well and 55 for 2 hours. By heating for 5 minutes, proteinase K was inactivated to form a PCR-type kit.
  • Slow L5 buffer for fine lysis is 10 XLA buffer per well (supplied with Yukara Co. LATaq) 5 1, 10% NP-40 (Roche cat. 1 332 473) 2.5 l, Proteinase K ( 20mg / ml, evening color cat. 9033) 4 l and distilled water (Nacalai Tesque cat. 36421-35).
  • PCR reaction mixture is the above PCR sample: l, 10 X LA buffer II 51,
  • TP-F4 and THygro-Fl were screened for screening of cells transfected with TP-F4 and THygro-Rl KO2 vector.
  • PCR of the cells into which the KO1 vector was introduced was carried out at 95 ° C for 1 minute in front mouth heat, 95 ° C for 30 seconds, 60 ° C for 30 seconds, and 60 ° C for 2 minutes. Cycle and double heating at 72 ° C for 7 minutes.
  • preheat at 95 ° C for 1 minute, at 95 ° C for 30 seconds, and at 70 ° C. 3 Amplification cycle of 40 minutes and double heating at 70 ° C for 7 minutes.
  • Primers are as follows.
  • a sample of cells that have undergone homologous recombination approximately 1.6 kb of DNA is amplified for the KO1 vector, and approximately 2.0 kb of DNA is amplified for the KO2 vector.
  • the primer is set in the genome region of TP-F4 outside the vector and 5'-side fucose trans, and THygro-Fl and THygro-Rl are set in Hygr in the vector. did.
  • a total of 918 cells into which the KOI vector was introduced were analyzed, of which only one cell was considered to be a homologous recombinant (the homologous recombination efficiency was approximately 0.1%).
  • 537 cells into which the K02 vector was introduced were analyzed, of which 17 cells were considered to be homologous recombinants (homologous recombination efficiency was approximately 3.2%).
  • Reverse primer s Bgl-R 5 '-CTA CTT GTC TGT GCT TTC TTC C -3' (SEQ ID NO: 1 3 7)
  • One of the cells obtained with the KO2 vector was named 6E2.
  • Vectors and cell combinations are as follows. Method 1. K02 vector and 5C1 cell (K01), Method 2. K02 vector and 6E2 cell (K02), Method 3. ⁇ 3 vector and 6 ⁇ 2 cell ( ⁇ 2). The vector was introduced into each cell, and selection with hygromycin: ⁇ , puromycin (Nacalai Tesque, cat. 29455-12) was started 24 hours after the introduction of the vector.
  • Idaromycin B was adjusted to a final concentration of 1 mg / ml in Method 1 and 7 mg / ml in Method 2. Furthermore, in Method 3, the final concentration of nogromycin B was 0.15 mg / mL and the final concentration of pyumycin was 8 g / ml.
  • This PCR primer amplifies 350 bp of the gene region of the fucose transporter that is deleted by the KO2 vector. Therefore, in PCR screening in Method 2, Those in which 350 bp were not amplified were considered as cells completely lacking the fucose transporter gene. PCR conditions were preheating at 95 ° C for 1 minute, 95 ° C for 30 seconds, 35 cycles of 1 minute at 70 ° C, and double heating at 70 ° C for 7 minutes. . -5 forward primers
  • TPS-F1 5 '-CTC GAC TCG TCC CTA TTA GGC AAC AGC -3' (surface S row number 1 3 8)
  • SHygro-Rl 5 '-TCA GAG GCA GTG GAG CCT CCA GTC AGC -3' (sequence
  • TP-F4 was used as the forward primer and RSGR-A was used as the reverse primer.
  • PCR conditions include preheating at 95 ° C for 1 minute, 95 ° C for 30 seconds, 60 ° C for 30 seconds, 72 ° C for 2 minutes for 35 cycles, and 72 ° C 7 minutes double heating.
  • approximately 1.6 kb of DNA is amplified. This PCR detected cells that had undergone homologous recombination with K03 vector, and confirmed that homologous recombination with the K02 vector remained.
  • Method 1 616 cells were analyzed, of which 18 10 cells were considered to be homologous recombinants (homologous recombination efficiency was 2.9%). In Method 2, 524 cells were analyzed, and 2 cells were considered to be homologous recombinants (homologous recombination efficiency was approximately 0.4%). In Method 3, 382 cells were analyzed, of which 7 cells were considered to be homologous recombination (homologous recombination efficiency was approximately 1.8%).

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Abstract

糖鎖が改変された抗グリピカン３抗体、より具体的にはフコースが欠損した抗グリピカン３抗体が開示される。本発明の抗グリピカン３抗体は、上記の糖鎖が修飾された抗体の製造方法において、YB2/0細胞などのフコース付加能が低下した宿主細胞やフコーストランスポーター欠損細胞に抗グリピカン３抗体をコードする核酸を導入し、該宿主細胞を培養することにより製造することができる。本発明の糖鎖改変抗グリピカン３抗体は、高い細胞障害活性を有しているので、抗癌剤などの細胞増殖抑制剤として有用である。

Description

明細書
糖鎖改変抗グリピカン 3抗体 技術分野
本発明は、 細胞障害活性、 特に抗体依存性細胞傷害性 (Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity； ADCC) が増強された、 ダリピカン 3抗原に対する抗体 (抗グリピカン 3抗体） およびその製造方法に関する。 背景技術
グリピカン 3 (G P C 3 ) は、 細胞表面上に存在するへパラン硫酸プロテオグ リカンのファミリ一の 1つであり、 発生における細胞分裂や、 癌細胞の増殖に関 与している可能性があることが示唆されているが、 その機能はまだよく解明され ていない。
G P C 3に結合するある種の抗体が、 AD C C (抗体依存性細胞障害） 活性お よび C D C (補体依存性細胞障害） 活性により細胞増殖抑制作用を有することが 見いだされている （WO2003/000883) 。 また、 G P C 3が生体内で切断されて 可溶型 G P C 3として血中に分泌され、 これを検出しうる抗体を用いて癌の診断 が可能であることが示唆されている （WO2004/022739、 WO2003/100429> WO2004/018667) 。
抗体の細胞傷害活性を利用した抗癌剤を開発する場合、 用いられる抗体は高い AD C C活性を有していることが好ましい為、 G P C 3を認識する抗体において も高い細胞傷害活性を有する抗 G P C 3抗体が望まれていた。
抗体の ADCC活性を増強する方法としては、 抗体の糖鎖を改変する方法が知 られている。 例えば、 WO 99/54342には、 抗体のグリコシル化を修飾すること により ADCC活性を改良することが記載されている。 また、 WO 00/61739には、 抗体の糖鎖におけるフコースの存否により ADCC活性を調節することが記載さ れている。 WO 02/31140には、 YB2/0細胞において抗体を産生せしめることに より、 ひ- 1,6コアーフコースを含まない糖鎖を有する抗体を調製することが記載 されている。 WO 02/79255には、 バイセクティング GlcNAcを有する糖鎖を有 する抗体が記載されている。 しかしながら、 糖鎖の修飾によって ADCC活性が 増強された抗グリピカン 3抗体は知られていない。
従って、 本発明は糖鎖組成の変化によって ADCC活性が増強された抗グリピ カン 3抗体組成物およびその製造方法を提供しょうとするものである。 発明の開示
本発明者は上記の課題を解決すべく種々検討した結果、 ダリピカン 3をタ一ゲ ットとした場合においても、 α -1,6コア一フコース （Qi -l,6 core fucose) が欠損 した糖鎖を有する抗体が高い細胞障害活性を有することを見出した。 従って、 本 発明は、 糖鎖組成が変化した抗グリビカン 3抗体組成物、 より具体的にはフコー スが欠損した抗グリピカン 3抗体の割合が増加した抗体組成物を提供する。 本発 明の糖鎖改変抗グリビカン 3抗体組成物は、 高い細胞障害活性を有しているので、 抗癌剤などの細胞増殖抑制剤に有用である。
本発明はまた、 上記の糖鎖が修飾された抗体の製造方法において、 YB2/0細 胞などのフコ一ス付加能が低下した宿主細胞に抗グリピカン 3抗体をコ一ドする 核酸を導入し、 該宿主細胞を培養することにより当該抗体を取得することを特徴 とする、 抗グリピカン 3抗体組成物の製造方法を提供する。 好ましくは、 糖鎖へ のフコース付加能が減少した細胞はフコ一ストランスポー夕一欠損細胞である。 図面の簡単な説明
図 1は、 N—グリコシル結合糖鎖の基本構造を示す。
図 2は、 各キメラ抗体の、 ヒト PBMCを用い HepG2を標的細胞とした場合の ADCC活性を示す。
図 3は、 各キメラ抗体の、 ヒト PBMCを用い HuH7を標的細胞とした場合の ADCC活性を示す。
図 4は、 各抗体の、 ヒト PBMCを用い HuH-7を標的細胞とした場合の ADCC活 性を示す。
図 5は、 FT-KO細胞産生抗体 (a, b, c) および CHO細胞産生の抗体から調製 したァガラクトシル 2-AB化糖鎖の順相 HPLCクロマトグラムを示す。 図 6は、 図 5で示したピーク G(0)および G(0)-Fucの推定構造を示す。
図 7は、 FT-KO細胞産生抗体 (a)および CHO細胞産生の抗体 (b)について DSC (示差走査熱量計） 測定チャートを示す。 発明の詳細な説明
本発明は、 糖鎖組成が変化した抗グリビカン 3抗体組成物を特徴とする。 抗体 の細胞障害活性の発現には、 抗体に結合した糖鎖の構造が大きな影響を及ぼすこ とが知られている。 抗体に結合する糖鎖には、 抗体分子のァスパラギンの側鎖の N原子に結合する N—ダリコシド結合糖鎖と、 抗体分子のセリンまたはスレオニ ンの側鎖ヒドロキシル基に結合する〇—ダリコシル結合糖鎖があり、 本発明にお いてフコースの存否が問題となるのは N—グリコシド結合糖鎖である。
抗体に結合する N—グリコシド結合糖鎖の基本構造を図 1に示す。 N—ダリコ シル結合糖鎖は図 1の IgG基本糖鎖 ( 1 ) および （3 ) に示すごとく、 1個の マンノース (Man)と 2個の N—ァセチルダルコサミン (GlcNAc)が β 1,4結合で結 合した基本構造 （コア） 「― Man jS 1— 4 GlcNAC jS 1 _ 4 GlcNAc―」 を有し、 この構造の右の GlcNAcを還元末端と称し、 左側の Manを非還元末端と称する。 フコース (Fuc)が結合している場合、 これは主として、 還元末端の N—ァセチル ダルコサミンの 6位とフコースの 1位とがひ結合している。 他方、 図 1の IgG 基本糖鎖 ( 2 ) に示す糖鎖においては、 基本構造 （コア一） の非還元末端に、 前 記 2個の糖鎖のほかに、 1個の N—ァセチルダルコサミン (GlcNAc) が ]3 1,4 結合により結合している。 この N—ァセチルダルコサミン （GlcNAc) が、 「パ イセクテング N—ァセチルダルコサミン」 である。 バイセクティング N—ァセチ ルダルコサミンを有する糖鎖は、 O—グリコシル結合糖鎖または N—グリコシル 結合糖鎖であり、 N—ァセチルダルコサミニルトランスフェラ一ゼ III
(GnTIII ) により、 N—ァセチルダルコサミンを糖鎖に転移させることにより 形成される。 この酵素をコードする遺伝子は既にクロ一ニングされており、 その アミノ酸配列およびそれをコードする DNAの塩基配列は記載されている
(NCBIデータ一ベース （ACCESSION D13789) ) 。
本発明において、 糖鎖組 が変化した抗体組成物 （糖鎖改変抗体組成物） とは、 基準となる宿主細胞で産生される抗体組成物とは異なる糖鎖組成を有する抗体組 成物のことをいう。
本発明において、 糖鎖組成が変化したか否かは、 基準となる宿主細胞で産生さ れる抗体組成物を基準として判断することができる。 基準となる抗体組成物と異 なる糖鎖組成を有する抗体組成物の場合、 その抗体組成物は糖鎖組成が変化した 抗体組成物となる。
本発明において基準となる宿主細胞は CHO DG44である。 CHO DG44は、 例えばィンビトロジェン社から入手することが可能である。
糖鎖組成が変化した抗体.組成物の例としては 抗体組成物中のフコース （例え ば、 a -1,6コア一フコ一ス（ a -l，6core fucose)欠損抗体の割合が増加した抗体組 成物や、 抗体組成物中のバイセクティング (bisecting) N _ァセチルグルコサミ ン (GlcNAc)付加抗体の割合が増加した抗体組成物などを挙げることができる。 本発明の好ましい態様としては、 フコース欠損抗体の割合が、 基準となる抗体 組成物と比較して高い抗体組成物を挙げることができる。
なお、 抗体には複数の N—グリコシル糖鎖を有することもあるので、 本発明の フコ一ス欠損抗体には、 フコースが全く付加していない抗体だけでなぐ 付加し ているフコースの数が減少している抗体 （少なくとも 1つ以上の糖鎖において フコースが付加されていない抗体） なども含まれる。
宿主細胞で糖鎖改変抗体を製造する場合、 全て同一の糖鎖を有する均一な抗体 を含有する組成物を得ることは困難なことが多い。 従って、 例えば、 糖鎖組成が 変化した抗体組成物がフコース欠損抗体の割合が増加した抗体組成物である場合、 本発明の糖鎖組成が変化した抗体組成物にはフコースが欠損した抗体とフコ一ス 欠損していない抗体の両方が含まれることがあるが、 フコ一スが欠損した抗体の 割合が、 基準となる宿主細胞で作製された抗体組成物よりも高い。 本発明のフコ ース欠損抗体の割合が高い抗体組成物において、 フコ一ス欠損割合は特に限定さ れないが好ましくは 20%以上、 より好ましくは 50%以上、 さらに好ましくは 90%以上である。
また、 本発明のバイセクティング N—ァセチルダルコサミン付加抗体の割合が 高い抗体組成物において、 バイセクティング N—ァセチルダルコサミン付加抗体 の割合は特に限定されないが、 好ましくは 20%以上、 より好ましくは 50%以上、 さらに好ましくは 90%以上である。
本発明の糖鎖組成が変化した抗グリビカン 3抗体組成物は、 当業者に公知の方 法により得ることが可能である。 - 例えば、 フコース欠損抗体は、 α -1,6コアーフコース （a -l,6core fucose) を 付加する能力を有しないかまたはその能力が低い宿主細胞中で抗グリピカン 3抗 体を発現させることにより製造することができる。
フコースを付加する能力を有しないまたはその能力が低い宿主細胞は特に限定 されないが、 例としては、 フコース転移活性が欠損または低くなつている宿主細 胞、 ゴルジ体内のフコース濃度が低くなつている宿主細胞、 などを挙げることが できる。 より具体的には、 ラットミエロ一マ YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20細胞 (YB2/0細胞と略される） （ATCC CRL 1662として保存されている)、 FTVIII ノックアウト CHO細胞 (WO 02/31140)、 Lecl3細胞 (WO03/035835)、 フコー ストランスポー夕一欠損細胞 （WO 2005/017155) などを挙げることができる。 フコーストランスポーター欠損細胞とは、 フコーストランスポーターの存在量 が正常細胞より少ないか、 またはフコーストランスポ一ターの構造に変異を有す ることにより、 フコーストランスポーターの機能が低下している細胞である。 フ コ一ストランスポー夕一欠損細胞としては、 例えば、 フコーストランスポーター 遺伝子がノックアウトされている細胞 （以下、 「FT-KO細胞」 と呼ぶ。 ） 、 フ コーストランスポ一夕一遺伝子の一部が欠損または変異している細胞、 フコース トランスポー夕一遺伝子の発現系に欠陥を有する細胞などが挙げられる。 チヤィ ニーズハムスターのフコ一ストランスポー夕一をコードする遺伝子の塩基配列お よびフコーストランスポ一夕一のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号 1 2 6および 1 2 7に示す。
また、 配列番号 1 2 6に示す塩基配列を利用して、 RNAi干渉 (RNA
interference: RN^i) を用いても本発明のフコーストランスポーター欠損細胞を 取得することができる。 RNAiは二本鎖 RNA (dsRNA) を細胞内に導入した際 に、 その RNA配列に対応する細胞内の mRNAが特異的に分解され、 タンパク 質として発現されなくなる現象をいう。 RNAiの場合、 通常、 二本鎖 RNAが用 いられるが、 特に限定されず、 例えば、 自己相補的な一本鎖 RNA中で形成され る二本鎖を用いることも可能である。 二本鎖を形成する領域は、 全ての領域にお いて二本鎖を形成していてもよいし、 一部の領域 （例えば両末端又は片方の末 端） がー本鎖になっていてもよい。 RNAiに用いられるオリゴ RNAは、 その長 さは限定されない。 本発明のオリゴ RNAの長さとしては、 例えば、 5〜1000塩 基 （二本鎖の場合には 5〜： L000 bp) であり、 好ましくは 10〜： 100塩基 （二本鎖 の場合には 10〜 100 bp) であり、 さらに好ましくは 15〜25塩基 （二本鎖の場 合には 15〜25 bp) であり、 特に好ましくは 19〜23塩基 （二本鎖の場合には 19 〜23 bp) である。
上述のように RNAi法は、 ある遺伝子と相同な、 センス RNAとアンチセンス RNAからなる二本鎖 RNA (double-strand RNA; dsRNA) が、 その遺伝子の転 写産物 （mRNA) の相同部分を破壊する、 という現象を利用した方法である。 用いるフコ一ストランスポーター遺伝子の全長配列に対応する二本鎖 RNAを用 いてもよいし、 一部の配列に対応する短い （例えば、 21〜23 bpの） dsRNA (small interfering RNA; siRNA)を用いてもよい。 該ニ本鎖 RNAは、 直接細胞 に取り込ませてもよいし、 二本鎖 RNAを産生するベクターを作製し、 宿主細胞 に導入して細胞内で二本鎖 RNAを産生させてもよい。 例えば、 本発明のフコー ストランスポ一ターをコードする DNAの全部又は一部を逆向きの反復配列とな るようにべクタ一に組み込み、 該ベクタ一を宿主細胞に導入すればよい。 RNAi 法は、 FireA. et al.， Nature (1998), 391, 806-811、 Montgomery M. K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1998), 95, 15502-15507、 Timmons L. et al., Nature (1998), 395, 854、 Sanchez A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1999), 96， 5049-5054、 Misquitta L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1999)， 96，
1451-1456、 Kennerdell J. R. et al., Cell (1998), 95, 1017-1026、 Waterhouse P. M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1998), 95， 13959-13964、 Wianny F. et al., Nature Cell Biol. (2000), 2， 70-75等の記載に従って行うことができる。
RNAi法等により取得されるフコーストランスポーター欠損細胞のスクリ一二 ングはフコーストランスポーターの活性を指標に行ってもよいし、 ウエスタンブ ロッティングゃノーザンプロッティングによるフコーストランスポ—夕—遺伝子 の転写、 発現を指標にして行うこともできる。
また、 糖鎖にバイセクティング (bisecting) N—ァセチルグルコサミン
(GlcNAc)が付加した坊体は、 糖鎖にバイセクティング （bisecting) N—ァセチ ルダルコサミン （GlcNAc) 構造を形成する能力を有する宿主細胞中で抗グリピ カン 3抗体を発現させることにより製造することができる。
バイセクティング N—ァセチルダルコサミンが付加した糖鎖を有する抗体の製 造方法は既に公知である （WO 02/79255) 。 糖鎖にバイセクティング
(bisecting) N—ァセチルダルコサミン （GlcNAc) 構造を形成する能力を有す る宿主細胞は特に限定されず、 例えば、 GnTIII をコードする DNAを含んでな る発現ベクターを有する宿主細胞を用いることが可能である。 従って、 GnTIII をコードする DNAを含んでなる発現べクタ一および抗グリビカン 3抗体をコ一 ドする発現べクタ一を有する宿主細胞を用いて、 バイセクティング N—ァセチル ダルコサミンが付加した糖鎖を有する抗グリビカン 3抗体を製造することができ る。 GnTIIIをコードする NAと抗グリピカン 3抗体をコ一ドする遺伝子は同 一のベクタ一上に存在してもよいし、 異なるベクター上に存在してもよい。
また、 抗体組成物中のフコース欠損抗体またはバイセクティング N—ァセチル ダルコサミン付加抗体の割合を増加される他の方法として、 フコース欠損抗体ま たはバイセクティング N—ァセチルダルコサミン付加抗体を精製することにより 組成物中のそれらの抗体の割合を増加させる方法を挙げることができる。
糖鎖の解析は当業者に公知の方法で行うことができる。 例えば、 抗体に N-
Glycosidase F(Roche)等を作用させ、 糖鎖を抗体から遊離させる。 その後、 セル ロース力一トリッジを用いた固相抽出 (Shimizu Y. et al.， Carbohydrate
Research 332(2001), 381-388)による脱塩後に濃縮乾固し、 2-ァミノピリジンに よる蛍光標言载を行う (Kondo A. et al., Agricultural and Biological Chenxistry 54:8(1990), 2169-2170)。 得られた PA化糖鎖を、 セルロースカートリ、ンジを用 いた固相抽出により脱試薬した後遠心濃縮し、 精製 PA化糖鎖とする。 その後、 ODSカラムによる逆相 HPLC分析を行うことにより測定することが可能である。 また、 P A化糖鎖の調製を行った後、 ODSカラムによる逆相 HPLC分祈および アミンカラムによる順相 HPLC分析を組み合わせた、 二次元マツピングを実施 することにより行うことも可能である。 ； 本発明において糖鎖が改変される抗グリビカン 3抗体は、 ダリピカン 3に結合 する抗体であれば特に限定されない。 ダリピカン 3への結合は特異的であること が好ましい。 本発明において好ましい抗グリピカン 3抗体としては、 以下の表 1 に示される C D R配列を有する抗体を挙げることができる。 表 1
配列 抗体 CDR アミノ酸配列 せ τ=5"
M13B3(H) CDR1 NYAMS 5
CDR2 AINNNGDDTYYLDTVKD 6
CDR3 QGGAY 7
M3B8(H) CDR1 TYGMGVG 8
CDR2 NIWWYDAKYYNSDLKS 9
CDR3 MGLAWFAY 10
M11 F1 (H) CDR1 IYGMGVG 11
CDR2 NIWWNDDKYYNSALKS 12
CDR3 IGYFYFDY 13
M5B9(H) CDR1 GYWMH 14
CDR2 AIYPGNSDTNYNQKFKG 15
CDR3 SGDLTGGLAY 16
M6B1 (H) CDR1 SYAMS 17
CDR2 AINSNGGTTYYPDTMKD 18
CDR3 HNGGYENYGWFAY 19
M10D2(H) CDR1 SYWMH 20
CDR2 EIDPSDSYTYYNQKFRG 21
CDR3 SNLGDGHYRFPAFPY 22
L9G 11 (H) CDR1 SYWMH 20
CDR2 TIDPSDSETHYNLQFKD 23
CDR3 GAFYSSYSYWAWFAY 24
GC33(H) CDR1 DYE H 25
CDR2 ALDPKTGDTAYSQKFKG 26
CDR3 FYSYTY 27
GC179(H) CDR1 INAMN 28
CDR2 RIRSESNNYATYYGDSVKD 29
CDR3 EVTTSFAY 30
GC194(H) CDR1 ASAMN 31
CDR2 RIRSKSNNYAIYYADSVKD 32
CDR3 DPGYYGNPWFAY 33
GC199(H) CDR1 DYSMH 34
CDR2 WINTETGEPTYADDFKG 35
CDR3 LY 36
Figure imgf000011_0001
i^W) 1：拏
6
.S00Z0/£00Zdf/X3d Ϊ5.9170/900Ζ: OAV 上記の表に記載の C D R配列を有する抗体は高 細胞障害活性を有する。 上記 の表に記載の C D R配列を有する抗体は、 ダリピ^ン 3上のアミノ酸番号 5 2 4 一 5 6 3のェピト一プを認識する。 アミノ酸番号 5 2 4— 5 6 3のェピ! プを 認識する抗体は細胞障害活性が高いので、 本発明の抗グリピカン 3抗体として好 ましい。
本発明の 1つの好ましい態様においては、 本発日月の糖鎖組成が変化した抗体組 成物は ADCC活性が増強していることを特徴とする。 本発明において ADCC活 性が増強しているか否かは、 基準となる抗体組成物と比較して、 該基準よりも高 い ADCC活性を示す場合には ADCC活性が増強ざれていると判断される。
ADCC活性の測定は当業者に公知の方法により行うことが可能であり、 例え ば、 エフェクター細胞、 標的細胞および抗グリピねン 3抗体を混合し、 ADCC の程度を調べることにより測定することができる。 より具体的には、 例えば、 ェ フエクタ一細胞としてマウス脾細胞やヒト末梢血や骨髄から分離した単核球等を 利用し、 標的細胞としてはヒト肝細胞株 HuH-7筝のダリピカン 3を発現するヒ ト株化細胞を用いる。 標的細胞をあらかじめ5 iCrにより標識し、 これに抗グリ ピカン 3抗体を加えィンキュベーションを行い、 その後、 標的細胞に対し適切な 比のエフェクタ一細胞を加えインキュベーションを行う。 インキュべ一ション後 上清を採取し、 上清中の放射活性をカウントすることにより ADCC活性を測定 することができる。 抗グリビカン 3抗体
抗グリビカン 3抗体の作製は当業者に公知の方法により行うことが可能である。 すなわち、 グリピカン 3を感作抗原として使用して、 これを通常の免疫方法にし たがって免 し、 得られる免疫細胞を通常の細胞 S虫合法によって公知の親細胞と 融合させ、 通常のスクリーニング法により、 モノクローナルな抗体産生細胞をス クリーニングすることによって作製できる。 具体的には、 モノクローナル抗体を 作製するには次のようにすればよい。 まず、 抗体取得の感作抗原として使用され るヒ卜グリピカン 3を、 Lage, H. et al.， Gene 188 (1997) ， 151-156に開示さ れたグリピカン 3 (MXR 7 ) 遺伝子/アミノ酸配冽を発現することによって得 る。 すなわち、 グリピカン 3をコードする遺伝子配列を公知の発現ベクター系に 挿入して適当な宿主細胞を形質転換させた後、 その宿主細胞中または培養上 中 から目的のヒトグリピカン 3タンパク質を公知の方法で精製する。 次に、 この精 製グリピカン 3タンパク質を感作抗原として用いる。 あるいは、 グリピカン 3の 部分ペプチドを感作抗原として使用することもできる。 この際、 部分ペプチドは ヒトグリピカン 3のァミノ酸配列より化学合成により得ることができる。 抗グリ ピカン 3抗体が ADCCの作用、 CDCによる作用、 増殖因子活性の阻害により細 胞増殖抑制活性を阻害することから、 また抗グリピカン 3抗体に放射性同位元素、 化学療法剤、 細菌由来トキシン等の細胞傷害性物質を結合させることにより、 細 胞増殖を抑制し得ることから、 本発明の抗グリピカン 3抗体の認識するグリピ力 ン 3分子上のェピトープは特定のものに限定されず、 グリピカン 3分子上に存在 するェピトープならばどのェピトープを認識してもよい。 従って、 本発明の抗グ リピカン 3抗体を作製するための抗原は、 ダリピカン 3分子上に存在するェピト 一プを含む断片ならば、 如何なる断片も用いることが可能である。
特に好ましい態様において、 グリピカン 3のアミノ酸番号 5 2 4— 5 6 3のェ ピトープを認識する抗体を取得する場合には、 感作抗原としてアミノ酸番号 5 2 4 - 5 6 3を含むペプチドを用いることができる。
感作抗原で免疫される哺乳動物としては、 特に限定されるものではないが、 細 胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、 一般的に はげつ歯類の動物、 例えば、 マウス、 ラット、 ハムスター、 あるいはゥサギ、 サ ル等が使用される。 感作抗原を動物に免疫するには、 公知の方法にしたがって行 われる。 例えば、 一般的方法として、 感作抗原を哺乳動物の腹腔内または皮下に 注射することにより行われる。 具体的には、 感作抗原を PBS (Phosphate- Buffered Saline) や生理食塩水等で適当量に希釈、 懸濁したものに所望により 通常のアジュバント、 例えばフロイント完全アジュパントを適量混合し、 乳化後、 哺乳動物に 4-21日毎に数回投与する。 また、 感作抗原免疫時に適当な担体を使 用することもできる。
このように哺乳動物を免疫し、 血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認 した後に、 哺乳動物から免疫細胞を採取し、 細胞融合に付されるが、 好ましい免 疫細胞としては、 特に脾細胞が挙げられる。 前記免疫細胞と融合される他方め親 細胞として、 哺乳動物のミエローマ細胞を用いる。 このミエローマ細胞は、 知 の種々の細胞株、 例えば、 P3 (P3x63Ag8.653) (J. Immnol. (1979) 123, 1548-1550) 、 P3x63Ag8U.l (Current Topics in Microbiology and
Immunology (1978) 81, 1-7) 、 NS-1 (Kohler. G. and Milstein, C. Eur. J. Immunol. (1976) 6, 511.519) 、 MPC-11 (Margulies. D.H. et al., Cell
(1976) 8, 405-415) 、 SP2/0 (Shulman, M. et al, Nature (1978) 276, 269-270) 、 FO (de St. Groth, S. F. et al., J. Immunol. Methods (1980) 35, 1-21) 、 S194 (Trowbridge, I. S. J. Exp. Med. (1978) 148, 313-323) 、 R210 (Galfre, G. et al., Nature (1979) 277, 131-133) 等が好適に使用される。 前 記免疫細胞とミエローマ細胞との細胞融合は、 基本的には公知の方法、 たとえば、 ケ一ラーとミルスティンらの方法 (Kohler. G. and Milstein, C.、 Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46) 等に準じて行うことができる。 より具体的には、 前記細胞融合は、 例えば細胞融合促進剤の存在下に通常の栄養培養液中で実施さ れる。 融合促進剤としては、 例えばポリエチレングリコール （PEG) 、 センダ ィウィルス （HVJ) 等が使用され、 更に所望により融合効率を高めるためにジ メチルスルホキシド等の補助剤を添加使用することもできる。 免疫細胞とミエ口 一マ細胞との使用割合は任意に設定することができる。 例えば、 ミエローマ細胞 に対して免疫細胞を 1-10倍とするのが好ましい。 前記細胞融合に用いる培養液 としては、 例えば、 前記ミエ口一マ細胞株の増殖に好適な； RPMI1640培養液、 MEM培養液、 その他、 この種の細胞培養に用いられる通常の培養液が使用可能 であり、 さらに、 牛胎児血清 (FCS) 等の血清補液を併用することもできる。 細胞融合は、 前記免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を前記培養液中でよく混 合し、 予め 37°C程度に加温した PEG溶液 （例えば平均分子量 1000-6000程 度） を通常 30-60% (w/v) の濃度で添加し、 混合することによって目的とする 融合細胞 （ハイプリドーマ） を形成する。 続いて、 適当な培養液を逐次添加し、 遠心して上清を除去する操作を繰り返すことによりハイプリドーマの生育に好ま しくない細胞融合剤等を除去する。 このようにして得られたハイプリドーマは、 通常の選択培養液、 例えば HAT培養液 （ヒポキサンチン、 アミノプテリンおよ びチミジンを含む培養液） で培養することにより選択される。 上記 HAT培養液 での培養は、 目的とするハイプリドーマ以外の細胞 （非融合細胞） が死滅す の に十分な時間 （通常、 数日〜数週間） 継続する。 ついで、 通常の限界希釈法を実 施し、 目的とする抗体を産生するハイプリドーマのスクリーニングおよび単一ク ローニングを行う。 また、 ヒト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイブリド一マ を得る他に、 ヒトリンパ球を in vitroでグリピカン 3に感作し、 感作リンパ球を ヒト由来の永久分裂能を有するミエローマ細胞と融合させ、 ダリピカン 3への結 合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもできる （特公平 1-59878号公報参 照） 。 さらに、 ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニッ ク動物に抗原となるダリピカン 3を投与して抗グリビカン 3抗体産生細胞を取得 し、 これを不死化させた細胞からダリピカン 3に対するヒト抗体を取得してもよ レ （国際特許出願公開番号 WO 94/25585号公報、 WO 93/12227号公報、 WO 92/03918号公報、 WO 94/02602号公報参照） 。 このようにして作製されるモ ノクロ一ナル抗体を産生するハイプリド一マは、 通常の培養液中で継代培養する ことが可能であり、 また、 液体窒素中で長期保存することが可能である。 組換え型抗体
本発明では、 モノクローナル抗体として、 抗体遺伝子をハイブリド一マからク ローニングし、 適当なベクタ一に組み込んで、 これを宿主に導入し、 遺伝子組換 え技術を用いて産生させた組換え型のものを用いる （例えば、 Vandamme, A. M. et al., Eur. J. Biochem. (1990) 192, 767-775， 1990参照) 。 具体的には、 抗グ リビカン 3抗体を産生するハイプリドーマから、 抗グリピカン 3抗体の可変 (V) 領域をコードする mRNAを単離する。 mRNAの単離は、 公知の方法、 例 えば、 グァニジン超遠心法 (Chirgwin, J. M. et al., Biochemistry (1979) 18, 5294-5299) 、 AGPC法 （Chomczynski, Ret al.， Anal. Biochem. (1987) 162, 156-159) 等により行って全: NAを調製し、 mRNA Purification Kit
(Pharmacia製） 等を使用して目的の mRNAを調製する。 また、 QuickPrep mRNA Purification Kit (Pharmacia製） を用いることにより. mRNAを直接 調製することもできる。 得られた mRNAから逆転写酵素を用いて抗体 V領域の cDNAを合成する。 cDNAの合成は、 AMV Reverse Transcriptase First-stx^nd cDNA Synthesis Kit (生化学工業社製） 等を用いて行う。 また、 cDNAの合 および増幅を行うには、 5'-Ampli FINDER RACE Kit (Clontech製） および PCRを用いた 5'-EACE法 （Frohman, M. A.et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85, 8998-9002、 Belyavsky, A.et al., Nucleic Acids Res. (1989) 17, 2919-2932) 等を使用することができる。 得られた PCR産物から目的とする DNA断片を精製し、 ベクタ一 DNAと連結する。 さらに、 これより組換えべク 夕一を作製し、 大腸菌等に導入してコロニ一を選択して所望の組換えべクターを 調製する。 そして、 目的とする DNAの塩基配列を公知の方法、 例えば、 ジデォ キシヌクレオチドチェイン夕一ミネ一シヨン法等により確認する。 目的とする抗 グリピカン 3抗体の V領域をコ一ドする DNAを得たのち、 これを、 所望の抗 体定常領域 （C領域） をコードする DNAを含有する発現ベクターへ組み込む。 本発明で使用される抗グリピカン 3抗体を製造するには、 抗体遺伝子を発現制御 領域、 例えば、 ェンハンサ一、 プロモーターの制御のもとで発現するよう 現べ クタ一に組み込む。 次に、 この発現ベクターにより、 宿主細胞を形質転換し、 抗 体を発現させる。 抗体遺伝子の発現は、 抗体重鎖 （H鎖） または軽鎖 （L鎮） をコードする DNAを別々に発現べクタ一に組み込んで宿主細胞を同時形質転換 させてもよいし、 あるいは H鎖および L鎖をコードする DNAを単一の発現べ クタ一に組み込んで宿主細胞を形質転換させてもよい （WO 94/11523号公 参 照） 。 また、 組換え型抗体の産生には上記宿主細胞だけではなく、 トランスジェ ニック動物を使用することができる。 例えば、 抗体遺伝子を、 乳汁中に固^に産 生される蛋白質 （ャギ βカゼインなど） をコードする遺伝子の途中に挿入して 融合遺伝子として調製する。 抗体遺伝子が挿入された融合遺伝子を含む D A断 片をャギの胚へ注入し、 この胚を雌のャギへ導入する。 胚を受容したャギから生 まれるトランスジエニックャギまたはその子孫が産生する乳汁から所望の抗体を 得る。 また、 トランスジエニックャギから産生される所望の抗体を含む乳 量を 増加させるために、 適宜ホルモンをトランスジエニックャギに使用してもよい (Ebert, K.M. et al., Bio/Technology (1994) 12, 699-702) 。 改変抗体 i 本発明では、 上記抗体のほかに、 ヒトに対する異種抗原性を低下させるこ 等 を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、 例えば、 キメラ抗体、 ヒト 型化 （Humanized) 抗体を使用できる。 これらの改変抗体は、 既知の方法を用 いて製造することができる。 キメラ抗体は、 前記のようにして得た抗体 V領域 をコードする DNAをヒト抗体 C領域をコードする DNAと連結し、 これを発現 ベクタ一に組み込んで宿主に導入し産生させることにより得られる。 この既知の 方法を用いて、 本発明に有用なキメラ抗体を得ることができる。 ヒ ト型化抗体は、 再構成 （reshaped) ヒト抗体とも称され、 これは、 ヒト以外の哺孚 L動物、 例え ばマウス抗体の相補性決定領域 （CDR; complementarity deterniindng region) をヒト抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、 その一般的な遺伝子組換え 手法も知られている （欧州特許出願公開番号 EP 125023号公報、 WO 96/02576 号公報参照） 。 具体的には、 マウス抗体の CDRとヒト抗体のフレームワーク領 域 （framework region； FR) とを連結するように設計した DNA酉 S列を、 CDR および FR両方の末端領域にオーバーラップする部分を有するように作製した数 個のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて PCR法により合成する (WO98/13388号公報に記載の方法を参照） 。 CDRを介して連結されるヒト抗 体のフレームワーク領域は、 相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するも のが選択される。 必要に応じ、 再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結 合部位を形成するように、 抗体の可変領域におけるフレームヮ一ク領域のァミノ 酸を置換してもよい （Sato, K.et al.， Cancer Res. (1993) 53, 851- 856) 。 キメ ラ抗体およびヒト型化抗体の C領域には、 ヒト抗体のものが使用され、 例えば H 鎖では、 CY 1、 CY 2、 CY 3、 CY4を、 L鎖では CK、 CXを使用することが できる。 また、 抗体またはその産生の安定性を改善するために、 ヒト抗体 C領域 を修飾してもよい。 キメラ抗体は、 ヒト以外の哺乳動物由来抗体の可変領域とヒ ト抗体由来の定常領域とからなる。 一方、 ヒト型化抗体は、 ヒト以外の哺乳動物 由来抗体の相補性決定領域と、 ヒト抗体由来のフレームヮ一ク領竑および C領域 とからなる。 ヒト型化抗体はヒト体内における抗原性が低下されているため、 本 発明の治療剤の有効成分として有用である。 抗体修飾物
本発明で使用される坊体は、 抗体の全体分子に限られずダリ.ビカン 3に結合し、 ダリピカン 3の活性を阻害する限り、 抗体の断片またはその修飾物であってもよ 5 く、 二価抗体も一価抗体も含まれる。 例えば、 抗体の断片としては、 Fab、 F
' (ab 2、 Fv、 1個の Fabと完全な Fcを有する Fab/c、 または H鎖若しくはし 鎖の Fvを適当なリンカ一で連結させたシングルチエイン Fv (scFv) が挙げら れる。 具体的には、 抗体を酵素、 例えばパパイン、 ペプシンで処理し抗体断片を 生成させるか、 または、 これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、 これを発
10 現べクタ一に導入した後、 適当な宿主細胞で発現させる （例えば、 Co, M.S. et al., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976, Better, M. & Horwitz, A. H.
Methods in Enzymology (1989) 178, 476-496, Academic Press, Inc.,
Plueckthun, A. & Skerra, A. Methods in Enzymology (1989) 178, 476-496, Academic Press, Inc.、 Lamoyi, E.， Methods in Enzymology (1989) 121, 652-
15 663、 Ro sseaux, J. et al., Methods in Enzymology (1989) 121， 663.669、
Bird, R. E. et al., TIBTECH (1991) 9, 132-137参照） 。 scF は、 抗体の H鎖 V領域と L鎖 V領域とを連結することにより得られる。 この scFvにおいて、 H 鎖 V領域と L鎖 V領域は、 リンカ一、 好ましくはペプチドリンカ一を介して連 結される (Huston, J. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85, 5879-
20 5883) 。 scFvにおける H鎖 V領域および L鎖 V領域は、 本明細書に抗体とし て記載されたもののいずれの由来であつてもよい。 V領域を連結するべプチドリ ンカ一としては、 例えばアミノ酸 12-19残基からなる任意の一本鎖べプチドが 用いられる。 scFvをコードする DNAは、 前記抗体の H鎖または H鎖 V領域 をコードする DNA、 および L鎖または L鎖 V領域をコードする DNAのうち、
25 それらの配列のうちの全部または所望のアミノ酸配列をコ一ドする DNA部分を 铸型とし、 その両端を規定するプライマー対を用いて PCR法により増幅し、 次 いで、 さらにペプチドリンカ一部分をコ一ドする DNA、 およびその両端が各々
、 H鎖、 L鎖と連結されるように規定するプライマ一対を組み合せて増幅するこ とにより得られる。 また、 一旦 scFvをコードする DNAが作製されると、 それ らを含有する突現ベクター、 および該発現べクタ一により形質転換された宿主を 常法に従って得ることができ、 また、 その宿主を用いることにより、 常法に従つ て scFvを得ることができる。 これら抗体の断片は、 前記と同様にしてその遺伝 子を取得し発現させ、 宿主により産生させることができる。 本発明における 「抗 体」 にはこれらの抗体の断片も包含される。 抗体の修飾物として、 ポリエチレン グリコール （PEG) 等の各種分子と結合した抗グリピカン抗体を使用すること もできる。 本突明における 「抗体」 にはこれらの抗体修飾物も包含される。 この ような抗体修 物は、 得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ること ができる。 な 3、 抗体の修飾方法はこの分野においてすでに確立されている。 さらに、 本笑明で使用される抗体は、 二糞特異性抗体 (bispecific antibody) であってもよ 1^。 二重特異性抗体はダリピカン 3分子上の異なるェピトープを認 識する抗原結合部位を有する二重特異性抗体であってもよいし、 一方の抗原結合 部位がグリピカン 3を認識し、 他方の抗原結合部位が化学療法剤、 細胞由来トキ シン等の細胞傷害性物質を認識してもよい。 この場合、 グリピカン 3を発現し ている細胞に逭接細胞傷害性物質を作用させ腫瘍細胞に特異的に傷害を与え、 腫 瘍細胞の増殖 抑えることが可能である。 二重特異性抗体は 2種類の抗体の HL 対を結合させて作製することもできるし、 異なるモノク口一ナル抗体を産生する ハイプリドーマを融合させて二重特異性抗体産生融合細胞を作製し、 得ることも できる。 さら ίこ、 遺伝子工学的手法により二重特異性抗体を作製することも可能 である。 組換え型抗体または改変抗体の発現および産生
前記のように構築した抗体遺伝子は、 公知の方法により発現させ、 取得するこ とができる。 喃乳類細胞の場合、 常用される有用なプロモー夕一、 発現させる抗 体遺伝子、 その 3'側下流にポリ Αシグナルを機能的に結合させて発現させるこ とができる。 例えばプロモーター/ェンハンサ一としては、 ヒトサイトメガロウ ィルス刖期フ 一夕一 エノノヽノサー 、 human cytomegalovirus immediate early promoter/enhancer) を挙げることができる。 また、 その他に本発明で使 用される抗体突現に使用で'きるプロモー夕一/ェンハンサ一として、 レトロウイ ルス、 ポリォーマウィルス、 アデノウイルス、 シミアンウィルス 40 (SV40) 等 のウィルスプロモータ一 /ェンハンサー、 あるいはヒ卜ェロンゲ一ションファク 夕一 la (HEFla) などの哺乳類細胞由来のプロモーター Zェンハンサ一等が挙 げられる。 SV40プロモーター Zェンハンサ一を使用する場合は Mulliganらの 方法 （Nature (1979) 277, 108) により、 また、 HEFlaプロモー夕一 Zェン ノヽンサ一を使用する場合は Mizushimaらの方法 （Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322) により、 容易に遺伝子発現を行うことができる。
本発明で使用される坊体の製造のためには、 発現された抗体に糖鎖を付加する 機能を有する任意の真核細胞発現系を使用することができる。 真核細胞としては、 例えば樹立された哺乳類細胞系、 昆虫細胞系、 真糸状菌細胞および酵母細胞など の動物細胞等が挙げられる。
好ましくは、 本発明で使用される抗体は、 哺乳類細胞、 例えば CHO、 COS, ミエ口一マ、 BHE：、 Vero、 HeLa細胞中で発現される。 次に、 形質転換された 宿主細胞を in vitroまたは in vivoで培養して目的とする抗体を産生させる。 宿 主細胞の培養は公知の方法に従い行う。 例えば、 培養液として、 DMEM、
MEM、 RPMI1640, IMDMを使用することができ、 胎児血清 （FCS) 等の血 清補液を併用することもできる。 抗体の分離、 精製
前記のように発現、 産生された抗体は、 細胞、 宿主 1¾物から分離し均一にまで 精製することができる。 本発明で使用される抗体の分雛、 精製はァフィ二ティー カラムを用いて行うことができる。 例えば、 プロテイン Aカラムを用いたカラ ムとして、 Hyper D、 POROS、 Sepharose EE (Pharmacia製） 等が挙げられ る。 その他、 通常のタンパク質で使用されている分離、 精製方法を使用すればよ く、 何ら限定されるものではない。 例えば、 上記ァフ 二ティーカラム以外のク 口マトグラフィ一カラム、 フィルタ一、 限外濾過、 塩ネ斤、 透析等を適宜選択、 組 み合わせることにより、 抗体を分離、 精製することができる （Antibodies A Laboratory Manual. Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988) 。 レクチンカラムを'用いた所望の糖鎖を有する抗体の分離は当業者に公 知の方法により行うことができ、 例えば WOO2/30954に記載の方法で行う と ができる。 抗体の活性の確認
本発明で使用される抗体の抗原結合活性 （Antibodies A Laboratory
Manual.Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988 、 リ ガンドレセプ夕一結合阻害活性 （Harada, A. et al.， International Immunology (1993) 5, 681-690) の測定には公知の手段を使用することができる。 本発明 で使用される抗グリピカン 3抗体の抗原結合活性を測定する方法として、 ELISA (酵素結合免疫吸着検定法） 、 EIA. (酵素免疫測定法） 、 RIA (放射免疫 測定法) .あるいは蛍光抗体法を用いることができる。 例えば、 酵素免疫測定法を 用いる場合、 グリピカン 3をコーティングしたプレートに、 抗グリピカン 3抗体 を含む試料、 例えば、 抗グリピカン 3抗体産生細胞の培養上清や精製抗体を加え る。 アルカリフォスファタ一ゼ等の酵素で標識した二次抗体を添加し、 プレート をインキュベートし、 洗浄した後、 P-ニトロフエニル燐酸などの酵素基質を加え て吸光度を測定することで抗原結合活性を評価することができる。 医薬組成物
本発明は、 本発明の糖鎖組成が変化したグ υビカン 3抗体組成物を含む医薬組 成物を提供する。
本発明の抗体組成物を含有する医薬組成物は癌などの細胞増殖に関連する疾患 の治療および/または予防に有用であり、 特に肝癌の治療および Ζまたは予防に 有用である。 本発明の抗体を医薬組成物として用いる場合には、 当業者に公知の 方法で製剤化することが可能である。 例えば、 水もしくはそれ以外の薬学的に許 容し得る液との無菌性溶液、 または懸濁液剤の注射剤の形で非経口的に使用でき る。 例えば、 薬理学上許容される担体もしくは媒体、 具体的には、 滅菌水や生理 食塩水、 植物油、 乳化剤、 懸濁剤、 界面活性剤、 安定剤、 香味剤、 賦形剤、 べヒ クル、 防腐剤、 結合剤などと適宜組み合わせて、 一般に認められた製薬実施に要 求される単位用量形態で混 i口することによって製剤化することが考えられる。 こ れら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにす るものである。
注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のようなべヒクルを用いて通常の製剤 実施に従って処方することができる。
注射用の水溶液としては、 例えば生理食塩水、 ブドウ糖やその他の補助薬を含 む等張液、 例えば D-ソルビトール、 D-マンノース、 D-マンニトール、 塩化ナト リウムが挙げられ、 適当な溶解補助剤、 例えばアルコール、 具体的にはェタノ一 ル、 ポリアルコール、 例えばプロピレング υコール、 ポリエチレングリコール、 非イオン性界面活性剤、 例えばポリソルべ一ト 80 (ΤΜ) 、 HCO-50と併用し てもよい。
油性液としてはゴマ油、 大豆油があげられ、 溶解補助剤として安息香酸ベンジ ル、 ベンジルアルコールと併用してもよい。 また、 緩衝剤、 例えばリン酸塩緩衝 液、 酢酸ナトリウム緩衝液、 無痛化剤、 例えば、 塩酸プロ力イン、 安定剤、 例え ばべンジルアルコール、 フエノール、 酸化防止剤と配合してもよい。 調製された 注射液は通常、 適当なアンプルに充填させる。
投与は好ましくは非経口投与であり、 具体的には、 注射剤型、 経 投与剤型、 経肺投与剤型、 経皮投与型などが挙げられる。 注射剤型の例としては、 例えば、 静脈内注射、 筋肉内注射、 腹腔内注射、 皮下注射などにより全身または局部的に 投与することができる。
また、 患者の年齢、 症状により適宜投与方法を選択することができる。 抗体ま たは抗体をコードするポリヌクレオチドを含有する医薬組成物の投与量としては、 例えば、 一回につき体重 lkgあたり O.OOOlmgから lOOOmgの範囲で選ぶこと が可能である。 あるいは、 例えば、 患者あたり 0.001〜100000mg bodyの範囲 で投与量を選ぶことができるが、 これらの数値に必ずしも制限されるものではな い。 投与量、 投与方法は、 患者の体重や年齢、 症状などにより変動するが、 当業 者であれば適宜選択することが可能である。
本明細書において明示的に引用される全ての特許および参考文献の内容は全て 本明細書の一部としてここに引用する。 また， 本出願が有する優先権主張の基礎 となる出願である日本特許 願 2 0 0 4 - 3 1 1 3 5 6号の明細書および図面に 記載の内容は全て本明細書の一部としてここに引用する。 実施例
以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが、 本発明はこれらの実施例 により限定されるものではない。 実施例 1
マウス抗ヒトグリビカン 3坊体の作製
抗 GPC3抗体作製のための免疫タンパク質として、 C末端側の疎水性領域
(564-580アミノ酸） を欠損させた可溶型 GPC3タンパク質を作製し、 これを 用いて免疫を行つた。 自己免疫疾患マゥスである MRLMp JUmmCrj-lpr/lprマ ウス （以下、 MRL/lprマウス、 日本チャールズ ·リバ一より購入） を免疫動物 として用いた。 7週齢、 もしくは 8週齢より免疫を開始し、 初回免疫には可溶型 GPC3を 100 g/headとなるように調製し、 フロイント完全アジュパント
(FCA,べクトンディツキンソン社) を用いてェマルジヨン化したものを皮下に 投与した。 5回免疫の後、 最終免疫として 50 g headとなるように PBSに希 釈し尾静脈内に投与した。 最終免疫の 4日後、 脾臓細胞を摘出し、 マウスミエ口 —マ細胞 P3-X63Ag8Ul (P3U1、 ATCCより購入） と 2:1になるように混合し、 PEG1500 (ロシュ ·ダイァグノスティック社） を徐々に加える事により細胞融 合を行った。 スクリ一ニングは可溶型 GPC3コアタンパク質を固相化したィム ノプレ一トを用いた ELISAにより行つた。 陽性クローンについては限界希釈法 によりモノクローン化した。 その結果、 GPC3に対して強い結合活性を有する抗 体を 1 1クローン （M3C11、 M13B3、 M1E7、 M3B8、 M11F1, L9G11、
M19B11、 M6B1、 M18D4、 M5B9、 M10D2) 取得した。
得られた抗 GPC3抗体のうち、.特に M11F1、 M3B8が強い CDC活性を示し たことから、 M11F1、 M3B8のェピトープを含む GST融合タンパク質である、 ダリピカン 3の 524番目の Alaから 563番目の Lysまでのべプチドと GSTの 融合タンパク質 （GC-3)を免疫原として、 Balb/c (日本チャールズリバ一より 購入） 3匹、 MRL/lpr 3匹に対して免疫を行った。 初回免疫には GC-3を 100 g/headとなるように調製し、 FCAを用いてェマルジヨン化したものを皮下は投 与した。 2週間後に 50 g/headとなるように調製したものを FIAでェマルジョ ン化したものを皮下に投与した。 5回免疫の後、 全マウスに対し最終免疫 (50 M g/head) を尾静脈内に行い細胞融合を行った。 スクリーニングは、 C末端側の 疎水性領域 （564-580アミノ酸） を欠損させた可溶型 GPC3コアタンパク質を 固相化したィムノプレートを用いた ELISAにより行った。 陽性クローンについ ては限界希釈法によりモノクロ一ン化した。 その結果、 GPC3に対して強い結合 活性を有する抗体を 5クロ一ン （GC199、 GC202 GC33、 GC179、 GC194) 取得した。
このようにして得られた抗体の H鎖、 L鎖の可変領域を定法によりクロ一二 ングし、 配列を決定した。 さらに、 既知の抗体のアミノ酸配列のデータベースと 比較して相同性を調べることにより、 C D R領域を決定した。 C D R領域の配列 は表 1および 2に示される。 実施例 2
抗 GPC3抗体マウス—ヒトキメラ抗体の作製
抗 GPC3抗体 GC33の H鎖および L鎖可変領域配列をヒト IgGlおよび κ鎖 定常領域配列に連結した。 抗体の Η鎖可変領域の 5 ' 末端側塩基配列に相補的で コザック配列を有する合成ォリゴヌクレオチドおよび Nhel部位を有する 3 ' 末 端側塩基配列に相補的な合成ォリゴヌクレオチドを用いて PCRを行い、 得られ た PCR産物をヒト IgGl定常領域が pBluescript KS +ベクター （東洋紡社） に 挿入されている pB-CHベクタ一にクローニングした。 Nhel部位により、 マウ ス H鎖可変領域とヒト H鎖 （ァ 1鎖） 定常領域が連結している。 作製された H鎖 遺伝子断片を発現ベクター PCXND3にクローニングした。 また、 抗体の L鎖可 変領域の 5 ' 末端側塩基配列に相補的でコザック配列を有する合成オリゴヌクレ ォチドおよび BsiWI部位を有する 3 ' 末端側塩基配列に相補的な合成オリゴヌ クレオチドを用いて PCRを行い、 得られた PCR産物をヒト kappa鎖定常領域 が pBluescript KS +ベクタ一 （東洋紡社） に挿入されている pB-CLベクターに クローニングした。 BsiWI 位により、 ヒト L鎖可変領域と定常領域が連結し ている。 作製された L鎖遺伝子断片を発現べクタ一 pUCAGクローニングし 。 本べクタ一 pUCAGは、 pCXN (Niwaら、 Gene 1991;108:193-200) を制限酵 素 BamHIで消化して獰られる 2.6kbpの断片を pUC19ベクター （東洋紡社） の制限酵素 BamHI部位に連結し、 クロー二.ングしたべクタ一である。
抗 GPC3マウスーヒトキメラ坊体発現ベクターを作製するために、 L鎖遺ィ云 子断片が挿入された pUCAGベクタ一を制限酵素 ffindlll (宝酒造社） で消化し て得られる遺伝子断片を H鎖遺伝子が揷入された pCXND3の制限酵素 Hin lll 切断部位に連結し、 クローニングした。 本プラスミドは動物細胞内でネオマ シ ン耐性遺伝子、 DHFR遺伝子、 抗 GPC3マウス一ヒトキメラ抗体遺伝子 （H鎖 可変領域のアミノ酸配列は酉己列番号 3に、 L鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番 号 4に示される。 ） を発現する。 実施例 3
低フコ一ス型抗 GPC3キメラ抗体の作製
宿主細胞として YB2/0 (ATCC, CRL-1662) を用い、 10%FBSを含む
RPMI1640培地にて培養した。 実施例 2で作製した抗 GPC3キメラ抗体発現べ クタ一 を 7.5 106/0.75
Figure imgf000025_0001
1¾8(-)の¥62/0 (ATCC CRT- 1662) へ、 ェ レクト口ポレーション法で 1.4kV， 25 Fの条件で導入した。 室温にて 10分間 の回復期間の後、 エレクト口ポレーシヨン処理された細胞を、 10%FBSを含む RPMI1640培地 40mLに懸濁した。 同様の培地で 10倍希釈溶液を作製し、 96 ゥエル培養用プレートに 100 1 /ゥエルで分注した。 C02インキュベータ一 ( 5 %CO2) で 24時間培養後、 Geneticin (Invitrogen社） を 0.5mg/niLにな るように添加して 2週間培養した。 抗ヒト IgG抗体を用いたサンドイッチ ELISAによりキメラ抗体髙発現株のスクリーニングを実施し、 定常発現株を樹 立した。 各抗 GPC3マウス——ヒトキメラ抗体の精製は、 Hi Trap ProteinG HP (Amersham社) を用いて tつた。 実施例 4
ヒト末梢血由来 PBMCを用'いた ADCC活性の測定 ヒト PBMC溶液の調製
健常人よりへパリン加採血した末梢血を、 PBS (-)で 2倍に希釈し、 FicoU- PaqueTMPLUS (Amersham社)に重層した。 これを遠心 （500X g、 30分間、 20°C) した後、 単核球画分である中間層を分取した。 3回洗浄後、 10%
FBS/RPMIに懸濁し、 ヒト PBMC溶液とした。
標的細胞の調製
10%FBS/RPMI1640培地で培養した HepG2細胞 (ATCC)および HuH_7細胞 (ヒューマンサイエンス研究資源パンク） を、 Cell Dissociation Buffer
(Invitrogen社)を用いてディッシュから剥離し、 96ゥエル U字底プレート
(Falcon)の各ゥエルに 1 X 104細胞/ゥエルで分注し、 1日間培養した。 培養後、 5.55MBqの Cr51を加え、 5%炭酸ガスィンキュベ一夕中 37°C1時間培養し、 この細胞を培地で 1回洗浄し、 50 Lの 10%FBS/RPMI1640培地を加え檩的細 胞とした。
クロム遊離試験 （ADCC活性）
標的細胞に各濃度に調製した抗体溶液 50 Lを添加し、 氷上で 15分反 させ た後に、 ヒト PBMC溶液 100 L ( 5 X 105細胞/ゥエル） を加え、 5%炭酸ガス インキュベータ中 37°C4時間培養し、 培養後、 プレートを遠心分離し、 培養上 清 100 L中の放射活性をガンマカウンタ一で測定した。 下式により特異旳ク口 ム遊離率を求めた。
特異的ク口ム遊離率 (％)=(A-C) X 100/(B-C)
Aは各ゥエルにおける放射活性 (cpm)の平均値、 Bは標的細胞に 2% NP-40水溶 液 (Nonidet P-40、 Code Νο.252·23、 ナカライテスク株式会社)を 100 、 10%FBS/RPMI培地を 50 L添加したゥエルにおける放射活性 (cpm)の5 P均値、 Cは標的細胞に 10%FBS/RPMI培地を 150 L添加したゥエルにおける 射活 性 (cpm)の平均値を示す。 試験は三重に行い、 ADCC活性 （％) について平均値 および標準偏差を算出した。
抗 GPC3キメラ抗体のヒト PBMCを用いた ADCC活性を図 2および 3に示 す。 図中、 縦軸は細胞傷害活性 （％) を、 横軸は添加した抗体の濃度 （ x g Zm L) を示す。 図 2は標的細胞として HepG2を用いた場合の、 図 3は HuH-7を 用いた場合の結果を示す。 白抜きは CHO細胞産生キメラ GC33抗体の活性を、 黒塗りは YB2/0産生キメラ GC33抗体の活性をそれぞれ示す。 低フコース型で ある YB2/0産生 GC33キメラ抗体は、 CHO細胞産生 GC33キメラ抗体に比較 して強い ADCC活性を示したことより、 糖鎖の改変によって抗 GPC3抗体の ADCC活性が増強されることが明らかとなった。 実施例 5
抗体産生細胞の樹立
SFMII (+)培地にハイグロマイシン Bの最終濃度が 1 mg/mlになるように調 製し、 フコーストランスポー夕一欠損株 （クロ一ン名 3F2) を継代した。 8 X 106個の 3F2を 0.8 mLのダルベッコリン酸緩衝液に懸濁した。 細胞懸濁液に 25 の抗体発現べクタ一 （参考実施例 1 ¾び 2 ) を加え、 Gene Pulser Cuvetteに細胞懸濁液を移した。 氷上で 10分間放置した後に、 GE TE- PULSER IIで 1.5 kV，25 FDの条件で、 エレクトロポレ一ション法によりべ クタ一を細胞に導入した。 ベクターを導入後、 細胞を SFMI +)培地 40 mLに 懸濁して 96穴平底プレート （イワキ社） に 100 !/ゥエルで細胞を播きこんだ。 プレートを Co2インキュベータ内で、 24時間、 37°Cで培養した後、 Geneticin (インビトロジェン社、 cat. 10131-027) を終濃度 0.5 mg/mLになるように添 加した。 薬剤に耐性になった細胞の抗体産生量を測定し、 ヒト化抗 GPC3抗体 産生細胞株をそれぞれ樹立した。 実施例 6
抗体の精製
抗体発現株より培養上清を回収し、 P-1ポンプ （Pharmacia) を用いて
Hitrap rProtein A (Pharmacia CA # 17-508001)にチャージした。 結合バッフ ァー （20mM Sodium phosphate (pH7.0)) にて洗浄後、 溶出バッファー （0.1M Glycin-HCl (pH2.7)) で溶出した。 溶出液は直ちに中和バッファー （lM Tris- HCl(pH9.0)) で中和した。 DC protein assay (BIO-RAD CA # 500-0111)によ り抗体の溶出画分を選択し:—ルした後、 CentripreirYMlO (MiUipore CAT# 4304) にて 2 mL程度まで濃縮した。 次に、 20 mM酢酸バッファ一， 150 mM NaCl, (pH6.0)にて平衡化した Superdex200 26/60 (Pharmacia)を用レ てゲルろ 過により分離した。 モノマー画分のピークを回収し、 Centriprep-YMIOにて濃 縮後、 MILLEX-GW 0.22 u m Filter Unit (Millipore CAT# SLGV 013SL)を用 いて Filtrationした後、 4°Cで保管した。 精製された抗体の濃度は、 280nmの吸 光度を測定し、 モル吸光計数から換算した。 実施例 7
FT-KO細胞産生ヒト化坊 GPC3抗体の in vitro ADCC活性
FT-KO細胞産生抗 GPC3抗体のヒト PBMCを用いた in vitro ADCC活性を 図 4に示す。 方法は実施例 4に記載の方法で行った。 図中、 縦軸は細胞傷害活性
(%) を、 横軸は添加した抗体の濃度 g/mL) を示す。 標的細胞としては HuH-7を用いた。 白抜きは Wild Typeの CHO細胞産生抗 GPC3抗体の活性を、 黒塗りは F KO細胞産生抗 GPC3抗体の活性をそれぞれ示す。 低フコース型で ある FT-KO細胞産生抗 GPC3抗体は、 Wild Typeの CHO細胞産生抗 GPC3抗 体に比較して強い ADCC活性を示した。 このことにより F KO細跑産生抗 GPC3抗体では ADCC活性が増強されることが明らかとなった。 実施例 8
F^KO細胞産生ヒト化抗 GPC3抗体糖鎖の解析
1. 2-ァミノべンズアミド標識糖鎖 （2-AB化糖鎖） の調製' '
本発明の F KO細胞産生抗体、 及び対照試料として CHO細胞産生の抗体に、 Glycosidase F (Roche diagnostics)を作用させ、 糖鎖を蛋白質から遊離させた (Weitzhandler M. et ai" Journal of Pharmaceutical Sciences 83:12(1994)， 1670-1675) 。 エタノールを用いた除タンパク質後 （Schenk B. et al_, The
Journal of Clinical Investigation 108:11(2001)， 1687-1695) 、 濃縮乾固し、 2- アミノビリジンによる蛍光標識を行つた (Bigge J. C. et al.， Analytical
Biochemistry 230:2(1995), 229-238)。 得られた 2_AB化糖鎖を、 セリレロース力 —トリッジを用いた固相抽 により脱試薬した後遠心濃縮し、 精製 2-ΑΒ化糖鎖 とした。 次に， i3 -Galactosidase (生化学工業)を精製 2-AB化糖鎖に作用させ, i ァガラクトシル 2-AB化糖鎖とした。
2. ァガラクトシル 2-AB化糖鎖の順相 HPLCによる分析
前項の方法で、 本発明の F KO細胞産生抗体、 及び対照試料と ϋて CHO細 胞産生抗体についてァガラクトシル 2-ΑΒ化糖鎖の調製を行った後、 アミドカラ ム （東ソ一製 TSKgelAmide-80) による順相 HPLC分析を行い、 クロマトグ ラムを比較した。 CHO細胞産生抗体では G(0)が主成分として存在しており、 G(0)-Fucはピ一ク面積比として 4%程度であった。 一方， FT-KO細胞産生抗体 では G(0)-Fucが主成分であり， いずれの産生株においてもピーク面積比として 90%以上存在していた （図 5および表 2 )。 ピーク G(0)および G(0)-Fucの推定 構造を図 6に示す。 表 2
ァガラクトシル 2-AB化糖鎖の順相 HPLC分析から推定された各糖鎖の相対比
Figure imgf000029_0001
実施例 9
FT-KO細胞産生ヒト化抗 GPC3抗体の熱安定性分析
1. DSC測定用試料溶液の調製
200 mmol/Lの塩化ナトリゥムを含む 20 mol/Lの酢酸ナトリゥム緩衝溶液 (pH6.0) を透析外裤とし， これに 700 g相当量の抗体溶液を封入した透析 膜を浸して一昼夜透析し， 試料溶液とした。
2. DSCによる熱変性温度測定
試料溶液およびリファレンス溶液 （透析外液） を十分に脱気した後、 これらを それぞれ熱量計セルに封入し 20°Cでの熱平衡化を十分に行つた。 次に DSC走 査を 20°C〜100°Cで約 1K/分走査速度で行った。 結果は、 温度の関数としての変 性ピークの頂点として表される （図 7 ) 。 本測定より， CHO細胞産生抗体およ び FT-KO細胞産生抗体における熱変性温度は同等であった。 参考実施例 1
GC33のヒト化
公開されている Kabat Database (ftp:https://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/kabat/) 、 および ImMunoGeneTics Database (IMGT)より抗体の配列デ一夕を入手し、 H 鎖可変領域、 L鎖可変領域に分けてホモロジ一検索を行った。 その結果、 H鎖 可変領域は DN13(Smithsonら、 Mol Immunol. 1999； 36： 113-124)と高い相 同性を持つことが分かった。 また、 L鎖可変領域は Accession number
AB064105の homo sapiens IGK mRNA ior immunoglobulin kappa light chain VLJ region, partial cds, clone : 64と高い相同性を持つことが分かつた。 また、 L鎖のシグナル配列については AB064105と相同性の高い Accession Number S40357のシグナル配列を利用した。 これらの抗体のフレームヮ一ク領域 (以下、 FR)に相補性抗原決定領域 （以下、 CDR) を移植したヒト化抗体を作製した。 具体的には、 50 base程度の合成ォリゴ DNAを約 20 base程度ハイブリダイ ズするように設計し、 これらの合成オリゴ DNAを PCR法によりアッセンブリ させて各可変領域をコードする遺伝子を作製した。 5 ' 端の合成オリゴ DNAの 末端に揷入した Hindlll配列、 および 3 ' 端の合成オリゴ DNAの末端に挿入し た BamHI配列で切断し、 ヒト IgGl定常領域がクローニングされた発現べクタ — HEFgr l、 ヒト κ鎖定常領域がクロ一ニングされた発現べクタ一 HEFgKへ クローニングした （Satoら、 Mol Immunol. 1994； 371-381) 。 このようにし て作製したヒト化 GC33は H鎖、 L鎖それぞれ ver.aと命名した。 H鎖、 L鎖 ともに ver.aのヒト化 GC33 (ver.a I ver.a) はマゥス GC33可変領域の抗体 (mouse I mouse) と比較して結合活性が低かった。 H鎖と L鎖についてマウ ス GC33配列と ver.a配列をキメラに組み合わせた抗体 (mouse I ver.a、 ver.a I mouse) を作製し結合活性を評価した結果、 ver.a / mouseで結合活性の低下が 認められ、 アミノ酸置換による結合活性の低下は H鎖に起因する事が判明した。 そこで、 H鎖の改変体 ver.c、 ver.f、 ver.h、 ver.i、 vei'.j、 ver.kを作製した。 全 てのヒト化 GC33はマウス GC33可変領域を有するキメラ抗体と同等の結合活 性を示した。 ヒト化 GC33H鎖可変領域 ver.a、 ver.c、 ver.f、 ver.h、 ver丄 ver.j. ver.kの塩基配列を配列番号 7 4、 7 5、 7 6、 7 7、 7 8、 7 9、 8 0に、 ミノ酸配列を配列番号 8 1、 8 2、 8 3、 8 4、 8 5、 8 6、 8 7に示す。 ヒト 化 GC33L鎖可変領域 ver.aの塩基配列を配列番号 8 8に、 ァミノ酸配列を配列 番号 8 9に示す。 ヒト化 GC33H鎖可変領域 ver丄 ver.j, ver.kでは、 6番目の グルタミン酸がダル夕ミンに置換されているが、 これらの抗体は熱安定性が顕著 に増加していた。 参考実施例 2
ヒト化 GC33L鎖の改変
蛋白質の脱アミド化については一次配列依存的な脱アミド化の反応速度定数が 知られており、 Asn-Glyが特に脱アミド化し易い配列として知られている
(Rocinsonら、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2001； 98； 944-949.) 。 配列番号 8 8に示されるヒト化 GC33L鎖 ver.a可変領域の CDR1内にある Asn33につ いては、 一次配列が Asn-Glyであることから、 脱アミド化が容易に起きやすい 配列である事が予想された。
Asn33の脱アミド化による結合活性に対する影響を評価する為に、 Asn33を Aspに置換した改変抗体を作製した。 点変異の導入には、 Quick Change Site- Directed Mutagenesis Kit (Stratagene社） を使用した。 すなわち、 125 ngの センスプライマー （CTT GTA CAC AGT GAC GGAAAC ACC TAT：配列番号 1 2 4 ) 、 125 n のアンチセンスプライマ一 (ATA GGT GTT TCC GTC ACT GTG TAC AAG：配列番号 1 2 5 ) 、 5 Lの 10x reaction buffer^ 1 Lの dNTP mix, lO ngのヒト化 GC33L鎖 ver.aがクローニングされた HEFg K、 1
Lの Pfu Turbo DNA Polymeraseを含む 50 Lの反応液を、 95 で 30秒、 55°Cで 1分、 68°Cで 9分からなるサイクルを 12回行った。 その後制限酵素 Dpnlを加え 37 で 2時間消化したものを添付の XLl-Blueコンピテント細胞に 導入し形質転換体を得た。 正しく変異の導入されたクロ一ンについて、 可変領域 を切り出し、 再度 HEFg /へクロ一エングし直した。 ヒ卜化 GC33H鎖 ver.kが クロ一ニングされた HEFgァ 1と共に Fugene6 (Roche社） を用いて COS 7細 胞へ導入し一過性に発現させた培養上清を回収した。 抗ヒト IgG抗体を用いた サンドィッヂ ELISAにより抗体濃度を定量し、 可溶型 GPC3コア蛋白質を固相 化した ELISAにより改変抗体の結合活性を評価した。 Asn33を Aspに置換し
ノ た改変抗体 (N33D) では結合活性が消失しており、 Asn33で脱アミド化が起き た場合結合活性に与える影響は大きいと考えられた。
Asn33の脱アミド化を抑制する方法として、 Gly34を他のアミノ酸に改変す る方法が報告されている （WO03057881A1) 。 上記方法に従い、 Quick
Change Site-Directed Mutagenesis Kitを用い Cys、 Metを除く他の 17ァミノ 酸に置換した改変抗体 G34A、 G34D、 G34E、 G34F、 G34H G34N、 G34P、 G34Q, G34L G34K> G34L、 G34V、 G34W、 G34Y、 G34R, G34S、 G34T を作製し、 COS 7細胞一過性発現培養上清を用いて結合活性の評価を行った。 その結果、 Pro (G34P)、 Val (G34V)以外へのアミノ酸置換は結合活性を維持し ている事が判明した。
上述の改変抗体の軽鎖 C D R 1のァミノ酸配 Uを、 それぞれ配列番号 9 0 ( G 34A)、 配列番号 9 1 (G34D) 、 配列番号 9 2 (G34E) 、 配列番号 9 3 (G 34F) 、 配列番号 94 (G34H) 、 配列番号 9 5 (G34N) 、 配列番号 9 6 (G34T) 、 配列番号 9 7 (G34Q) 、 配列番号 9 8 (G34 I ) 、 配列番号 9 9 (G34K) 、 配列番号 1 0 0 (G34L) 、 酉己列番号 1 0 1 (G34S) 、 配列番 号 1 0 2 (G34W) 、 配列番号 1 0 3 (G34Y) 、 配列番号 1 0 4 (G34R) 、 配列番号 1 0 5 (G34V) 、 配列番号 1 0 6 (G34P) に記載する。 また、 上述 の改変抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を、 それぞれ配列番号 1 0 7 (G34 A)、 配列番号 1 0 8 (G34D) 、 配列番号 1 0 9 (G34E) 、 配列番号 1 1 0 (G34F) 、 配列番号 1 1 1 (G34H) 、 配列番号 1 1 2 (G34N) 、 配列番 号 1 1 3 (G34T) 、 配列番号 1 1 4 (G34Q) 、 配列番号 1 1 5 (G34I ) 、 配列番号 1 1 6 (G34K) 、 配列番号 1 1 7 (G34L) 、 配列番号 1 1 8 (G 34S) 、 配列番号 1 1 9 (G34W) 、 配列番号 1 2 0 (G34Y) 、 配列番号 1 2 1 (G34R) 、 配列番号 1 22 (G34V) 、 配列番号 1 2 3 (G34P) に記 載する。 参考実施例 3 CHO細胞におけるフコ一ストランスポーター遺伝子の破壊
1 . 夕一ゲッティングベクタ一の構築
( 1 ) KO1ベクターの作製
pcDNA3.1/Hygro (インビトロジェン社） より Hyg5-BHと Hyg3'NTのプラ イマ一で PCRすることによって、 Hygromycin耐性遺伝子 （Hygr) の開始コド ンの 5' 側に BamH Iサイトと TGCGCの配列を付加することで、 フコースト ランスポ一夕一遺伝子の開始コドンの 5' 側と同じ配列にし、 SV40 polyA付加 シグナルまでの領域を含む 3' 側には Not Iサイトを付加して Hygrを抜き出し た。
フォヮ一ドプライマ一
Hyg5-BH 5' - GGATCC TGC GCATGAAAAAGC CTG AAC TCA CC - 3' (配列番号 1 2 8 )
リバ一スプライマ一
Hyg3-NT 5 ' - GCG GCC GCC TAT TCC TTT GCC CTC GGA CG -3' (配列番号 1 2 9 )
フコーストランスボーターの夕一ゲッティングベクタ一 ver.l (以下、 K01ベ ク夕一と称する） は pMClD Aベクター （Yagi T, Proc. Natl. Acad. Sci. USA vol.87, p9918-9922, 1990) に、 フコーストランスポ一夕一の 5' 側 （配列番号 1 2 6に示す塩基配列の No.2,780の Sma Iから Νο·4，232の BamH I) 、 3' 側 ^0.4，284から 0.10，934の8&01まで） 、 及び Hygrフラグメントを各々揷 入することで構築した。 ベクターの特徴としては、 Hygrにプロモーターが付加 されていないことから、 相同組み換えを起こしたときにフコーストランスポ一タ 一のプロモータ一によって、 Hygrが発現することとなる。 しかしながら、 相同 組み換えによって 1コピーのみベクターが細胞に導入されても、 ハイグロマイ シン Bに対する耐性を獲得するほど Hygrが発現するとは限らない。 なお、
ΚΟ ベクタ一は Not Iで切断して細胞に導入した。 KO1ベクターによって、 フ コーストランスポーターは開始コドンを含むェクソン 1の 41塩基対を欠損する ことになり、 機能を失うものと考えられる。
( 2 ) pBSK'pgk-1-Hygrの作製 pKJ2ベクタ一 （Popo H, Biochemical Genetics vol.28, p299'308， 1990) よ りマウス pgk-1遺伝子のプロモーターを EcoR I-Pst Iによって切り出し、 pBIuescript (ストラタジーン社)の EcoR I_Pst Iサイトにクローニングして pBSK-pgk-1を作製した。 Hygr ¾ pcDNA3:l/Hygroより Hyg5_AVと Hyg3_ BHのプライマ一で PCRすることによって、 Hygrの 5' 側に EcoT22 Iサイト と Kozak配列を付加し、 SV40 polyA付加シグナルまでの領域を含む 3' 側には BamH Iサイトを付加して Hygr を抜き出した。
フォワードプライマ一
Hyg5-AV 5' - ATG CAT GCC ACC ATG AAA AAG CCT GAA CTC ACC - 3' (配列番号 1 3 0 )
リバースプライマ一
Hyg3-BH 5' - GGA TCC C G GCT TTA CAC TTT ATG CTT C -3 ' (配列 番号 1 3 1 )
この Hygr (EcoT22 I-BamH I) フラグメントを pBSK-pgk-1の Pst I-BamH Iサイトに揷入し、 pBSK-pgk-l-Hygrを作製した。
( 3 ) KO2ベクタ一の作製
フコーストランスポ一夕一のターゲッティングベクタ一ver.2 (以下、 KO2ベ クタ一と称する） は pMClDT-Aベクターにフコ一ストランスポーターの 5' 側 (配列番号 1 2 6に示す塩基配歹 Uの No.2，780の Sma Iから. No.4,232の BamH I) 、 3' 側 （No.4,284から No.10,934の Sac lまで） 、 及び pgk-1- Hygrフラ グメントを各々挿入することで構築した。 KO1ベクタ一と異なり、 KO2ベクタ —は Hygrに pgk-1遺伝子のプロモーターが付加されていることから、 相同組み 換えによって 1コピーのみベクターが細胞に導入されても、 ハイグロマイシン Bに対する耐性を獲得する。 なお、 KO2ベクターは Not Iで切断して細胞に導 入した。 KO2ベクターによって、 フコーストランスポ一夕一は開始コドンを含 むェクソン 1の 46塩基対を欠損することになり、 機能を失うものと考えられる。
( 4) pBSK-pgk-1-P rorの作製
pPURベクタ一 （BD Biosciences社） を Pst Iと BamH Iで切断し、 切り出 されたフラグメント （Puror) を pBSK-pgk-1の Pst I-BamH Iサイトに揷入し、 pBSK-pgk-l-Purorを作製した。
( 5 ) K03ベクターの作製
フコーストランスポー夕一の夕ーゲッティングベクタ一 ver.3 (以下、 KO3ベ クタ一と称する） は pMClD Aベクターにフコーストランスポーターの 5' 側 (配列番号 1 2 6に示す塩基配列の No.2,780の Sma Iから No.4,232の BamH I) 、 3' 側 (No.4,284から No.10,934の Sac lまで) 、 及び pgk'l- Purorフラ グメントを各々挿入することで構築した。 なお、 pgk-1- Purorの 3' 末端には、 以下に示すスクリーニング用のプライマーが結合する配列を予め付加しておいた。 なお、 K03ベクターは Not Iで切断して細胞に導入した。 K03ベクターによつ て、 フコ一ストランスポ一夕一は開始コドンを含むェクソン 1の 46塩基対を欠 損することになり、 機能を失うものと考えられる。
リバースプライマー
RSGR-A 5' - GCT GTC TGG AGT ACT GTG CAT CTG C -3' (配列番号
1 3 2 )
以上の 3種類の夕ーゲッティングベクタ一を用いて、 フコーストランスポ一 夕一遺伝子のノックアウトを試みた。
2 . CHO細胞へのベクタ一の導入
CHO-S-SFMII HT- (インビトロジェン社、 cat 12052-098)に HT
Supplement(lOOX) (インビトロジェン社 cat. 11067-030) とぺニシリンスト レプトマイシン （インビトロジェン社 cat. 15140-122) を CHO-S-SFMII Ή. の容量に対して、 それぞれ 1/100量を加えた。 これを培養用の培地 （以下、 SFMII (+)と称する） として CHO細胞の DXB11株を継代し、 さらに遺伝子導 入後の培養もこの SFMI +)で行った。 8 X 106個の CHO細胞を 0.8mLのダル ベッコリン酸緩衝液 (以下、 PBSと略す。 インビトロジェン社 cat 14190-144) に懸濁した。 細胞懸濁液に 30 gの夕一ゲッティングベクタ一を加え、 Gene
Pulser Cuvette(4mm) (バイオラッド社 cat. 1652088) に細胞懸濁液を移した。 氷上で 10分間放置した後に、 GENE-PULSER II (バイオラッド社 code No. 340BR) で 1.5kV，25 FDの条件で、 エレクトロボレ一シヨン法によりべクタ 一を細胞に導入した。 ベクタ一を導入後、 細胞を 200mlの SFMIIW培地に懸濁 して 20枚の 96穴平底プレ一ト （ィヮキ社 cat. 1860-096) に 100 1/ゥェル IT 細胞を播きこんだ。 プレ一トを C02インキュベータ内で、 24時間、 37°Cで培養 した後、 薬剤を添加した。
3 . ノックアウトの第一段階
5 K01ベクタ一、 もしくは KO2ベクタ一をそれぞれ CHO細胞に導入し、 べク 夕一導入から 24時間後にハイグロマイシン B (インビトロジェン社 cat. 10687-010) による選抜を行った。 ハイグロマイシン Bは 0.3mg/mlになるよう に SFMI +)に溶解し、 100 ゥエル添加した。
4. PCRによる相同組み換え体のスクリーニング
L0 ( 1 ) PCR用のサンプルの調整
相同組み換え体は PCR法によってスクリーニングした。 スクリーニングで用 いる CHO細胞は 96穴平底プレ一トで培養し、 培養上清除去後に細胞溶解用の 緩衝液を 50 1ゥェル加ぇて55で、 2時間加温し、 続いて 95で、 L 5分加熱する ことで、 プロティナーゼ Kを失活させて PCRの铸型とした。 細 溶解用の緩 L5 衝液は、 1ゥエルあたり 10 XLA緩衝液 Π(夕カラ社 LATaqに添付） 5 1、 10% NP-40 (ロッシュ社 cat. 1 332 473) 2.5 l、 プロティナ一ゼ K (20mg/ml、 夕カラ社 cat. 9033) 4 l 及び蒸留水 （ナカライテスク社 cat. 36421-35) で構成されている。
( 2 ) PCRの条件
20 PCR反応混合物は上記の PCRサンプル： l、 10 X LA緩衝液 II 5 1、
MgC12 (25mM) 5 L dNTP(2.5mM) プライマー （各 ΙΟ^Μ) 2 L LA Taq(5 IU/ 1 cat.RR002B) 0.5 1、 及び蒸留水 29.5 1(全 50 1)とした。 KOI ベクタ一を導入した細胞のスクリーニングには、 TP-F4と THygro-Rl KO2ベ クタ一を導入した細胞のスクリ一二ングには、 TP-F4と THygro-Flを PCRプ
15 ライマーに用いた。
KO1ベクターを導入した細胞の PCRは、 95°Cにて 1分間の前方口熱、 95°Cに て 30秒間、 60°Cにて 30秒間、 及び 60°Cにて 2分間の増幅サイクリレ 40サイク ル、 並びに 72°Cにて 7分の複加熱とした。 KO2ベクタ一を導入した細胞のスク リ一ニングには 95°Cにて 1分間の前加熱、 95°Cにて 30秒間、 及び 70°Cにて 3 分間の増幅サイクル 40サイクル、 並びに 70°Cにて 7分の複加熱とした。 s プライマーは以下の通りで、 相同組み換えを起こした細胞のサンプルでは、 KO1ベクタ一では、 約 1.6kb、 KO2ベクタ一では約 2.0kbの DNAが増幅され る。 プライマ一は TP-F4がべクタ一の外側で、 かつ 5 ' 側のフコーストランス 5 ポ一夕一のゲノム領域に設定し、 THygro-Fl、 及び THygro-Rlはベクター内の Hygrの中に設定した。
フォワードプライマー （ΚΟ1，Κ02)
TP-F4 5 ' - GGA ATG CAG CTT CCT CAA GGG ACT CGC -3 ' (配列番号 1 3 3 )
L0 リバ一スプライマ一 (KOI)
THygro-Rl 5， - TGC ATC AGG TCG GAG ACG CTG TCG AAC -3 ' (酉己列 番号 1 3 4 )
リバースプライマ一 (KO2)
THygro-Fl 5 ' - GCA CTC GTC CGA GGG CAA AGG AAT L5 AGC -3 ' (配列番号 1 3 5 )
5 . PCRスクリーニング結果
KOIベクターを導入した細胞は 918個を解析し、 そのうち相同組み換え体と 考えられる細胞は 1個であった （相同組み換え効率は約 0.1%) 。 また、 K02ベ クタ一を導入した細胞は 537個を解析し、 そのうち相同組み換え体と考えられ 10 る細胞は 17個であった （相同組み換え効率は約 3.2%) 。
6 . サザンブロット解析
さらに、 サザンブロット法によっても確認を行った。 培養した細胞から定法に 従ってゲノム DNAを 10 g調整し、サザンブロットを行った。 配列番号 1 2 6 に示す塩基配列の No.2，113-No.2，500の領域から、 以下の二種類のプライマ一 ίδ を用いて PCR法により 387bpのプローブを調整し、 これをサザンプロット法に よる確認に用いた。 ゲノム DNAは Bgl llで切断した。
フォワードプライマー
Bgl-F： 5， · TGT GCT GGG AAT TGAACC CAG GAC -3 ' (配列番号 1 3
6 ) リバースプライマ一 s Bgl-R： 5' - CTA CTT GTC TGT GCT TTC TTC C -3' (配列番号 1 3 7 )
Bgl llによる切断によって、フコーストランスポーターの染色体；^らは約
3.0kb KOIベクタ一で相同組み換えを起こした染色体からは約 4.6kb、 KO2 ベクタ一で相同組み換えを起こした染色体からは約 5.0kbのバンドがそれぞれ 出現する。 K01ベクタ一、 及び K02ベクターによって相同組み換えを起こした 細胞のそれぞれ 1、 7種類を実験に用いた。 KO1ベクタ一で唯一獲得された細胞 は 5C1と名づけたが、 その後の解析により複数の細胞集団から構成されること が明らかになつたので、 限界希釈によってクローン化し、 その後の実験に用いる ことにした。 また、 KO2ベクタ一で獲得された細胞の一つを 6E2 と名付けた。
7 . ノックアウトの第二段階
KO1ベクタ一、 及び KO2ベクタ一によって相同組み換えが成功した細胞に対 し、 3種類のベクタ一を用いて、 フコ一ストランスポ一夕一遺伝子が完全に欠損 した細胞株の樹立を試みた。 ベクタ一と細胞の組み合わせは、 以下の通りである。 方法 1. K02ベクターと 5C1細胞 （K01) 、 方法 2. K02ベクタ一と 6E2細胞 (K02)、 方法 3. ΚΟ3ベクタ一と 6Ε2細胞 (ΚΟ2)。 ベクターをそれぞれの細胞に 導入し、 ベクター導入から 24時間後にハイグロマイシン： Β、 ピューロマイシ ン （ナカライテスク社、 cat.29455-12) による選抜を開始した。 /、イダロマイシ ン Bは方法 1では最終濃度が lmg/ml、 方法 2では最終濃度が 7mg/mlになるよ うにした。 さらに方法 3では、 ノ、ィグロマイシン Bの最終濃度が 0.15mg/mL ピュー口マイシンの最終濃度が 8 g/mlになるように添加した。
8 . PCRによる相同組み換え体のスクリーニング
サンプルの調整は前述の通り。 方法 1に関するスクリーニングは、 前述の KO1ベクタ一、 及び KO2ベクターで相同組み換えを起こした細胞を検出する PGRを両方行った。 方法 2に関しては、 下記の PCRプライマ一を設計した。 配列番号 1 2 6に示す塩基配列の No.3,924-3,950の領域に TPS-F1を、
No.4,248-4,274に SHygro-Rlを設定した。 この PCRプライマ一によって、 KO2ベクターにより欠損するフコーストランスポーターの遺伝子領域の 350bp が増幅される。 従って、 方法 2における PCRスクリーニングにおいては、 350bpが増幅されないものを、 フコーストランスポーター遺伝子が完 に欠損 した細胞とみなすことにした。 PCRの条件は、 95°Cにて 1分間の前加熱、 95°C にて 30秒間、 70°Cにて 1分間の増幅サイクル 35サイクル、 並びに 70 °Cにて 7 分の複加熱とした。 - 5 フォワードプライマー
TPS-F1： 5 ' - CTC GAC TCG TCC CTA TTA GGC AAC AGC -3 ' (面 S列番号 1 3 8 )
リバースプライマー
SHygro-Rl： 5 ' - TCA GAG GCA GTG GAG CCT CCA GTC AGC -3' (配列
-0 番号 1 3 9 )
方法 3に関しては、 フォワードプライマーに TP-F4、 リバ一スプライマーに RSGR-Aを用いた。 PCRの条件は、 95°Cにて 1分間の前加熱、 95°Cにて 30秒 間、 60°Cにて 30秒間、 72°Cにて 2分間の増幅サイクル 35サイクル、 並びに 72°Cにて 7分の複加熱とした。 K03ベクターによって相同組み換えを起こした L5 細胞のサンプルでは、 約 1.6kbの DNAが増幅される。 この PCRで K03べク 夕一によって相同組み換えを起こした細胞を検出するとともに、 K02ベクタ一 での相同組み換えが残っていることも確認した。
9 . PCRスクリーニング結果
方法 1では 616個を解析し、 そのうち相同組み換え体と考えられる細胞は 18 10 個であった （相同組み換え効率は 2.9%) 。 方法 2では 524個を解析し、 そのう ち相同組み換え体と考えられる細胞は 2個であった （相同組み換え効率は約 0.4%) 。 さらに、 方法 3では 382個を解析し、 そのうち相同組み換えィ本と考え られる細胞は 7個であった （相同組み換え効率は約 1.8%) 。
1 0 . サザンブロット解析
5 前述の方法に準じて解析を行った。 その結果、 解析できた細胞のうち、 フコー ストランスポー夕一の遺伝子が完全に欠損している細胞を 1つ見出した。 第一 段階のノックァゥトでは、 PCRとサザンプロットの解析結果が一致したが、 こ の第二段階のノックアウトでは、 一致しなかった。 この原因としては、 1.例え ば、 方法 1で ΚΟ1、 Κ02のそれぞれ単独で相同組み換えを起こした田胞が混在 している、 2. フコ一ストランスポ一夕一遺伝子が一対 （2遣伝子） ではなく複 数対 （あるいは 3遺伝子以上） 存在する、 3.第一段階のノックアウトが成功し た細胞株を培養していると、 継代中に残ったフコーストランスポー夕一遺伝子が コピ一数を増やすことなどの可能性が考えられた。
1 1 . フコースの発現解析
さらに、 PCRで相同組み換え体と判断された 26の細胞【こおけるフコ一スの発 現を解析した。 5 β g/mLの Lens culinaris Agglutinin, FITC Conjugate (ベクタ —ラボラトリ一社 cat. FL-1041)、 2.5% の FBS、 0.02%のアジ化ナトリウムを 含む PBS (以下、 FACS溶解液と称する） 100 1で I X 106個の細胞を氷冷中で 1時間染色した。 その後、 FACS溶解液で細胞を 3回洗浄して FACSCalibur
(べクトンディツキンソン社） で測定を行つた。 その結果、 サザンブロット解析 でフコーストランスポ一夕一の遺伝子が完全に欠損していると判断された細胞の み、 フコ一スの発現が低下していることが明らかになった。
以上の結果より以下のことが判明した。
フコ一ストランスポー夕一の遺伝子が完全に欠失している細胞は 1株しかなぐ スクリーニングした数が 616個であったことを考えると、 相同組み換えの頻度 は約 0.16%と低い結果になった。 第二段階のノックアウトで、 PCRとサザンブ ロットの解析結果が一致しなかった理由は、 前述のようにいくつか考えられるが、 方法 3においては、 2種類の薬剤で選抜しているため、 得られた細胞株が KO2 ベクタ一、 K03ベクタ一のそれぞれ単独で相同組み換えを起こした細胞が混在 しているとは考えられない。 また、 その他の PCRで相同組み換えを起こしたと 判断された細胞株もすベて、 複数の細胞集団から構成されているとは考えにくい。 前述のようにフコーストランスポー夕一遺伝子が 3以上存在した場合には、 細 胞における夕一ゲッティングは格段に難しくなり、 KO 1ベクタ一のような Hygr が発現しにくいもの使用し、 なおかつ数多くのスクリーニングを行わないと相同 組み換え体が得られないものと考えられた。

Claims

請求の範囲
1 . 糖鎖組成が変化した抗グリビカン 3抗体組成物。
2 . 抗体依存性細胞傷害性 (Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity； ADCC) が增強されていることを特徴とする請求項 1に記載の抗体組成物。
3 . 前記抗体組成物中の抗体がモノクローナル抗体である、 請求項 1または 2 に記載の抗体組成物。
4. 糖鎖組成の変化が、 フコースが欠損した抗体の割合の増加であることを特 徴とする請求項 1〜 3のいずれか 1項に記載の抗体組成物。
5 . 抗グリピカン 3抗体をコードする遺伝子が導入され、 かつ糖鎖へのフコー ス付加能が減少した細胞を用いることを特徴とする、 抗グリビカン 3抗体の製造 方法。
6 . 糖鎮へのフコース付加能が減少した細胞がフコーストランスポー夕一欠損 細胞である、 請求項 5に記載の抗グリピカン 3抗体の製造方法。
7 . 以下の工程を含む抗グリビカン 3抗体の製造方法：
(a)抗グリピカン 3抗体をコードする遺伝子を糖鎖へのフコース付加能が減少し た細胞に導入する工程、
(b)該細胞を培養する工程。
8 . 請求項 1〜 4のいずれかに記載の抗体組成物を有効成分として含む抗癌剤。
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